60 Ergebnisse

3 ERGEBNISSE

3.1 Vorbemerkungen Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Charakterisierung von TmHU als protei-nogenes Gentransfersystem. Damit eine einheitliche und gut charakterisierte Charge TmHU für diese und nachfolgende Untersuchungen zur Verfügung steht, wurde das Protein im Großmaßstab hergestellt. Durch die Verwendung einer einheitlichen Charge werden Fehler, die durch verschiedene Proben verursacht werden, vermieden. In den folgenden Abschnitten wird dargestellt, wie die Optimierung der Expression, die Fermentation im 10-Liter-Maßstab und die Reinigung von TmHU durchgeführt worden sind. Anschließend wird auf die Charak-terisierung der hergestellten Probe eingegangen. Das HU-Protein aus Thermotoga maritima wurde in rekombinanten E.coli exprimiert. Zur Optimierung der Expressionsbedingungen und der Steigerung der Menge des synthetisier-ten TmHU wurden verschiedene E. coli-Stämme und Expressionsvektoren getestet und die Expression von TmHU unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Unter Abschnitt 2.2.1 bis 2.2.7 sind die Methoden beschrieben, die zur Umklonierung des Plamidinserts in einen anderen Expressionsvektor und zur Transfektion verschiedener E. coli-Stämme eingesetzt worden sind. Die Expression von TmHU im 1-Liter-Maßstab ist unter Abschnitt 2.3.1.1 nä-her erläutert. Zur Herstellung einer einheitlichen, gut charakterisierten Charge des Proteins erfolgte anschließend die Synthese durch eine Fermentation im 10-Liter-Maßstab. Nach der Fermentation erfolgte die Reinigung von TmHU durch Zellaufschluss, Hitzefällung und Rei-nigung über eine Kationenaustauscher-Säule mittels FPLC. Bis zu diesem Punkt wurden die Arbeiten überwiegend von der Diplom-Biologin D. Weidensdorfer (Fa. ACGT ProGenomics) durchgeführt. Aus diesem Grund wird im Folgenden nur kurz auf die Expressionsoptimie-rung und Synthese von TmHU eingegangen. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Umpuffe-rung des gereinigten TmHU aus einem Hochsalz- in einen Niedrigsalzpuffer mit Hilfe einer Cross-Flow-Anlage (Fa. Millipore) und die Abreinigung des Endotoxins mit dem Endotrap Red-System der Fa. Profos. Anschließend wurde ein Großteil des gereinigten TmHU aliquo-tiert und lyophilisiert. Diese Schritte sind unter Abschnitt 2.3.1.2 bis 2.3.2 näher beschrie-ben. Nach Abschluss der Proteinreinigung erfolgte die Charakterisierung und Analytik der hergestellten TmHU-Charge, wobei Methoden wie Aminosäureanalytik, Reversed-Phase-Chromatographie, Massenspektrometrie, Größenausschlusschromatographie, CD-Spektros-kopie und analytische Ultrazentrifugation zur Anwendung kamen (siehe Abschnitt 2.3.3 bis 2.3.5, 2.5.3, 2.5.4 und 2.6.2). Nach der Charakterisierung von TmHU wurde die Interaktion von TmHU und Nukleinsäu-ren untersucht, wobei hier besonders die Messung der Fluoreszenzpolarisation (Abschnitt 2.5.5) und der Schutz von RNA durch den Verdau durch RNasen (Abschnitt 2.6.1) zu er-wähnen sind. Mittels Fluoreszenzmikroskopie (Abschnitt 2.4.13), konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (Abschnitt 2.4.14) und Durchflusszytometrie (Abschnitt 2.4.9) wurde die Aufnahme und Lokalisation von TmHU und TmHU-Nukleinsäurekomplexen in humanen Zelllinien näher untersucht. Bei diesen Untersuchungen wurde unter anderem der Endozy-tosemechanismus der untersuchten Zellen inhibiert. Die funktionelle Analytik erfolgte durch die Transfektion von siRNA oder Plasmiden, wobei als Detektionssystem die Expression von EGFP gewählt worden ist. Durch spezifische siRNA sollte die Inhibition von stabil exprimier-tem EGFP erfolgen. Durch die Transfektion von EGFP-Plasmiden sollte die Expression von EGFP in Wildtypzellen induziert werden. Hierbei wurden verschiedene Transfektionsbedin-gungen und der Einfluss unterschiedlicher Reagenzien getestet (Abschnitt 2.4.4 bis 2.4.7).

Ergebnisse 61

Es erfolgte ein Vergleich der Transfektionseffizienz von TmHU mit Lipofektionsagenzien, an-deren HU-Proteinen und kationischen Peptiden. Der Einfluss endosomolytischer Substan-zen auf die Transfektionseffizienz von Nukleinsäuren mit TmHU wurde untersucht. Des Wei-teren wurde mittels unterschiedlicher Tests der Einfluss von TmHU und weiterer Transfek-tionsagenzien auf die Zellviabilität geprüft (Abschnitt 2.4.16).

3.2 Proteinherstellung von Wildtyp-TmHU

3.2.1 Optimierung der Expressionsbedingungen im Maßstab

Um eine große Menge TmHU rekombinant herzustellen, wurde die Expression des Proteins vorerst im 1-Liter-Maßstab optimiert, d. h. es wurde getestet mit welcher Kombination aus Expressionsvektor und –stamm die größtmögliche Menge TmHU synthetisiert werden kann. Nach der Etablierung eines Expressionsvektors in dem entsprechenden Wirtsstamm wird die Expression der Target-DNA durch den Zusatz von IPTG zu der wachsenden Kultur indu-ziert. Hierbei beeinflussen verschiedene Faktoren die Ausbeute von rekombinantem Protein, unter anderem die Zelldichte zum Zeitpunkt der Induktion, die Konzentration von IPTG und die Dauer der Induktion. Der Einfluss dieser Faktoren auf die Menge von exprimiertem Pro-tein wurde für verschiedene Expressionsvektoren und Wirtsstämme untersucht. Für die Expression von TmHU wurde mit dem pET-Expressionssystem gearbeitet. Dabei wurden die Vektoren pET11a und pET17b verwendet. Der Vektor pET11b mit dem Insert TmHU (pTmHU/pET11b) war bereits vorhanden und ist von Dr. D. Esser (Institut für Bio-technologie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) hergestellt worden. Bei diesem Vektor erfolgt die Expression über den T7-Lac-Promotor. Um einen weiteren Expressions-vektor zu testen, wurde das TmHU-Insert in den Vektor pET17b (pTmHU/pET17b) umklo-niert. Die angewandten Methoden, die für eine Umklonierung notwendig sind, sind unter Abschnitt 2.2.1 bis 2.2.7 beschrieben. Die Kontrolle der Proteinexpression über den Vektor pET17b erfolgt über das T7-Promotorsystem. Beide Vektoren wurden in die Bakterienstäm-me JM109, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, BL21 AITM und BL21 StarTM transformiert. Die unterschiedlichen Eigenschaften dieser Bakterienstämme sind unter Ab-schnitt 2.1.4 beschrieben. Bei dem Stamm JM109 handelt es sich um einen klassischen Klonierungsstamm, bei dem keine Proteinexpression induziert werden kann. Dieser Stamm wurde jeweils als Negativkontrolle für die Expression von TmHU verwendet. Die anderen Stämme sind Wirtsstämme für das pET-Vektorsystem, hier kann durch Induktion mit IPTG (bzw. Arabinose für den Stamm BL21 AITM) die Proteinexpression induziert werden. Die Ex-pression von TmHU in den verschiedenen Vektor-Wirt-Kombinationen wurde im 1-Liter-Maßstab getestet. Hierbei wurden unterschiedliche Induktionsbedingungen für die Protein-expression untersucht. Die Induktion erfolgte bei unterschiedlich hohen Zelldichten bei ei-ner OD600 zwischen 0,4 und 1,2. Die IPTG-Konzentration lag zwischen 0,1 und 1,5 mM und die Dauer der Induktion betrug entweder 90 oder 180 Minuten. In der Abbildung 3-1 ist ein Beispiel für eine Expressionsoptimierung aufgeführt. Hier wurden die Bakterienstämme BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21 AITM und BL21 StarTM mit dem Vektor pTmHU/pET17b transformiert und hinsichtlich der Expression von TmHU nach der Induktion bei einer OD600 von 0,8 mit 0,5 mM IPTG (bzw. Arabinose) für 90 min untersucht. Zum Vergleich wurden die entsprechenden E. coli-Stämme ohne Induktion mitgeführt. Anschließend wur-den die Zellen aufgeschlossen, der Proteingehalt der Proben nach Bradford bestimmt und jeweils die gleiche Menge Gesamtprotein auf ein 15 %-iges SDS-Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Polyacrylamidgel mit Coomassie gefärbt. In der Abbildung ist zu erkennen, dass der Stamm JM109 auch nach Induktion mit IPTG nicht in der Lage ist,

62 Ergebnisse

TmHU zu exprimieren. Auch alle anderen untersuchten E. coli-Stämme exprimieren das Pro-tein nicht ohne Induktion. Nach Induktion der Expression mit IPTG (bzw. Arabinose) expri-mieren alle untersuchten Wirtsstämme TmHU in unterschiedlicher Menge. Es hat sich ge-zeigt, dass durch die Expression im 1-Liter-Maßstab über das Plasmid pTmHU/pET17 in dem Wirtsstamm BL21(DE3) mit einer Induktion bei einer OD600 von 0,8 und einer IPTG-Konzentration von 1 mM für 90 min die höchste Ausbeute an rekombinanten TmHU erzielt werden kann. Diese Expressionsbedingungen wurden dann auf die Fermentation im 10-Liter-Maßstab übertragen.

10 kDa

15 kDa

20 kDa

25 kDa

37 kDa

50 kDa

75 kDa

100 kDa150 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

TmHU

Legende: Spur 1: Precision-Plus-Protein-

Standard (Fa. Bio-Rad) Spur 2: JM109 – Spur 3: JM109 + Spur 4: BL21(DE3) – Spur 5: BL21(DE3) + Spur 6: BL21AITM – Spur 7: BL21AITM + Spur 8: BL21StarTM(DE3) – Spur 9: BL21StarTM(DE3) + Spur 10: BL21(DE3)pLysS – Spur 11: BL21(DE3)pLysS + Spur 12: 3,5 µg TmHU (Standard)

Abbildung 3-1: Expressionsoptimierung von TmHU im 1-Liter-Maßstab (- = ohne Induktion; + = mit Induktion).

3.2.2 Fermentation und Reinigung von TmHU

Die Expression von TmHU erfolgte, wie bereits erwähnt, im Protease-defizienten E. coli-Stamm BL21(DE3), der das Plasmid pTmHU/pET-17b trägt. Der Ablauf der Fermentation ist unter Absatz 2.3.1.2 genauer beschrieben. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte bei einer OD600 von 35 (nach Berechnung aus der entsprechenden Verdünnung) mit 1 mM IPTG für 2,5 Stunden. Nach Abschluss der Fermentation wurden die Zellen durch Zentrifu-gation bei 5.000 x g für 20 min geerntet. 1,6 kg Biomasse wurden während der Fermentati-on produziert. Der Aufschluss der Zellen erfolgte wie unter 2.3.1.4 beschrieben mittels Hochdruck-Dispersion mit einem konstanten Zellaufschlusssystem. Nach Spülen des Zell-aufschlussgerätes standen 7,8 l Zellrohextrakt in CIEX-A-Puffer für die weitere Aufreinigung von TmHU zur Verfügung. Nach der Fällung der Wirtsproteine durch Hitzepräzipitation (sie-he Abschnitt 2.3.1.5) erfolgte die Reinigung von TmHU mittels Kationenaustauschchroma-tographie, wie sie unter Abschnitt 2.3.1.6 beschrieben ist. Die Elution von TmHU erfolgt bei einem Puffergemisch von ca. 70 % CIEX-B zu 30 % CIEX-A. Nach Aufreinigung des Zellroh-extraktes durch Kationenaustauschchromatographie lag eine Menge von 2,4 g TmHU in 1,5 l CIEX-Puffergemisch vor. Nach der Reinigung von TmHU mittels Kationenaustauschchromatographie wurden die ein-zelnen Expressions- und Reinigungsschritte in einem vergleichenden Polyacrylamidgel ge-geneinander aufgetragen und mit Coomassie gefärbt. Dies ist in Abbildung 3-2 dargestellt. In den Spuren 2 und 3 ist der Überstand und das Zelllysat von BL21(DE3)-Zellen ohne In-duktion dargestellt. Vergleicht man das Zelllysat mit dem TmHU-Standard in Spur 11, kann man in Spur 3 erkennen, dass eine geringe Menge TmHU bereits ohne Induktion der Prote-inexpression synthetisiert wird. Das liegt daran, dass die Proteinexpression nicht durch zu-sätzliche Plasmide wie p-LysS oder pLysE inhibiert wird. Da TmHU aber keine erkennbaren toxischen Einflüsse auf die Zellen des Wirtsstammes hat, spielt die Hintergrundexpression keine wesentliche Rolle für das Expressionssystem.

Ergebnisse 63

In den Spuren 4 und 5 ist der Überstand und das Zelllysat nach Induktion der Proteinex-pression aufgetragen worden. Hier ist erkennbar, dass TmHU während der Expression nicht in den Überstand abgegeben wird, sondern sich im Zytoplasma der prokaryontischen Zellen befindet. In Spur 5 ist deutlich die Expression einer größeren Menge TmHU zu erkennen. In den Spuren 6 und 7 ist das Sediment bzw. der Überstand der induzierten BL21(DE3)-Zellen nach dem Zellaufschluss zu sehen. Erkennbar ist, dass sich ein Großteil des synthetisierten TmHU im Überstand befindet. Allerdings bleibt auch ein gewisser Anteil TmHU im Zellsedi-ment zurück. In den Spuren 8 und 9 wurde das Sediment und der Überstand nach der Hit-zefällung der Wirtsproteine aufgetragen. Es wird deutlich, dass der größte Anteil der Wirts-proteine durch Hitze ausgefällt wird. Da TmHU thermostabil ist, bleibt es im Überstand in Lösung. Allerdings wird auch hier ein kleiner Anteil TmHU mit den Wirtsproteinen ausgefällt. In Spur 10 ist das TmHU-Protein nach der Kationenaustauschchromatographie gezeigt. Durch dieses Verfahren werden auch die restlichen Wirtsproteine abgereinigt. Es sind keine Verunreinigungen zu erkennen.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

TmHU-Monomer10 kDa

15 kDa

20 kDa25 kDa

37 kDa

50 kDa75 kDa

100 kDa250 kDa150 kDa

TmHU-Dimer

Abbildung 3-2: SDS-Polyacrylamidelektrophorese verschiedener Expressions- und Reinigungsschritte von TmHU. Legende: Spur 1: Precision-Plus-Protein-Standard (Fa. Bio-Rad) Spur 2: Überstand, vor Induktion Spur 3: Zellsediment, vor Induktion Spur 4: Überstand, nach Induktion Spur 5: Zellsediment, nach Induktion Spur 6: Sediment nach Zellaufschluss Spur 7: Überstand nach Zellaufschluss Spur 8: Sediment nach Hitzepräzipitation Spur 9: Überstand nach Hitzepräzipitation Spur 10: Probe nach Kationenaustauschchromatographie Spur 11: 3,5 µg TmHU (Standard)

Nachdem das Protein mittels FPLC gereinigt worden ist, erfolgte die Umpufferung von TmHU aus dem CIEX-Puffergemisch in einen Phosphatpuffer. Dieser Schritt erfolgte mit Hilfe der Tangentialflussfiltration, wie sie unter Absatz 2.3.1.7 beschrieben ist. Nach Umpufferung der Proben durch Tangentialflussfiltration lagen 2,2 g TmHU in 660 ml 100 mM Na-Phos-phatpuffer mit 10 mM NaCl, pH 7,5 vor. Im nächsten Schritt erfolgte die Abreinigung der Endotoxine mit dem Endo Trap Red 5/1-System der Fa. Profos nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie mit dem Ziel, einen Endotoxingehalt von <10 EU/ml Probe zu erreichen. Die Gründe für die Abreinigung der Endotoxine und die Methode sind unter Absatz 2.3.1.8 genauer beschrieben. Der Endoto-xingehalt wurde mit dem quantitativen chromogenen LAL-Test QCL-1000 (Fa. Bio Whittaker, Absatz 2.6.3) bestimmt. Nach der Endotoxinabreinigung wurden zwei Fraktionen TmHU er-halten, die sich in ihrem Endotoxingehalt unterscheiden. Insgesamt wurden 1,91 g TmHU in 880 ml 100 mM Na-Phosphatpuffer mit 10 mM NaCl, pH 7,5 erhalten. Fraktion 1 (1,7 g) hat einen Endotoxingehalt von 8,54 EU/ml und Fraktion 2 (0,2 g) hat einen Endotoxinge-

64 Ergebnisse

halt von über 200 EU/ml. Die zweite Fraktion wurde nicht in Zellkulturexperimente einge-setzt. Zum Abschluss der Aufarbeitung von TmHU wurden die beiden unterschiedlichen Chargen aliquotiert. Ein großer Teil der Proben wurde lyophilisiert (Absatz 2.3.2). Der restliche Teil der Proben blieb in Lösung. Alle Proben wurden bei –20 °C gelagert.

3.3 Allgemeine biochemisch-physikochemische Charakterisie-rung des TmHU-Proteins

3.3.1 Bestimmung der TmHU-Konzentration mittels Aminosäure-Analytik

Da die Bestimmung der Konzentration von TmHU über die Absorption bei 205 nm mit Un-genauigkeiten behaftet ist, wurde die Konzentration des gereinigten Proteins mittels Amino-säure-Analytik bestimmt. Diese Konzentrationsbestimmung wurde vom Zentrum für Prote-inanalytik der Fachhochschule Bingen durchgeführt (Absatz 2.3.3). Das Ergebnis der Ami-nosäure-Analytik ist in Abbildung 3-3 dargestellt. Die Bestimmung der Proteinkonzentration von TmHU erfolgte über das Leucin-Signal des Standards.

Standard

TmHU

Ser

HisA

sp

Glu

Gly

Thr

Arg

Ala

Tyr

Cyc

-Cys

MetV

al

Phe

Ile Leu

Lys

Absorbtion[mAU]

Retentionszeit [min]

0

5

10

15

20

25

30

35

2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20

Standard

TmHU

Ser

HisA

sp

Glu

Gly

Thr

Arg

Ala

Tyr

Cyc

-Cys

MetV

al

Phe

Ile Leu

Lys

Absorbtion[mAU]

Retentionszeit [min]

0

5

10

15

20

25

30

35

2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20

Abbildung 3-3: Aminosäureanalytik der TmHU-Fraktion 1 (Standard = blau, TmHU = rot). Die Bestimmung der Menge der einzelnen Aminosäuren erfolgte durch Ver-gleich mit einem Aminosäurestandard.

Somit beträgt die Konzentration der TmHU-Fraktion 1 2,56 mg/ml. Mit der genauen Kon-zentrationsangabe konnte eine TmHU-Standardeichkurve für die RP-HPLC erstellt werden, mit der dann auch die Konzentration der Fraktion 2 bestimmt worden ist. Zum Abschluss der Proteinreinigung konnten 1,9 g TmHU für weitere Untersuchungen bereit gestellt wer-den. Nach der hier beschriebenen Aminosäure-Analytik stand eine TmHU-Standardlösung einer definierten Konzentration von 2,56 mg/ml zur Verfügung. Diese Standardlösung wurde ver-wendet, um eine Standardeichkurve für spätere TmHU-Konzentrationsbestimmungen zu erstellen (Daten nicht gezeigt). Mit dieser Standardeichkurve kann die Konzentration von TmHU-Proben in einem Bereich von 1 bis 4 µg TmHU pro Auftragung sehr genau bestimmt werden.

Ergebnisse 65

3.3.2 Analyse der Reinheit und Konzentration von TmHU mit Reversed-Phase-Chromatographie und ESI-Massenspektrometrie

Um die Reinheit von TmHU zu bestimmen, wurde eine Reversed-Phase-Chromatographie durchgeführt (siehe Absatz 2.3.4). Die Detektion von TmHU bzw. von eventuellen Verunrei-nigungen, die die Probe enthalten könnte, erfolgte bei 205 nm, 220 nm, 257 nm und 280 nm. Das Ergebnis der Reinheitsanalyse von TmHU ist in Abbildung 3-4 dargestellt. Aus dem Chromatogramm wird ersichtlich, dass das Protein bei einer Retentionszeit von 22,9 min e-luiert. Es sind keine Verunreinigungen detektierbar. Die Reinheit von TmHU liegt bei über 99 %. Die Bestimmung der Molekularmasse von TmHU erfolgte mittels ESI-Massenspektrometrie, wie sie unter Absatz 2.5.3 beschrieben worden ist. Die Injektion der Proben erfolgte permanent direkt im Anschluss an die HPLC-Analyse. Das resultierende ESI-Massenspektrum nach Dekonvolution von TmHU ist in Abbildung 3-5 dargestellt. Die theoretische Masse von TmHU liegt bei 9.993 Da. Mittels Massenspektrometrie konnte eine Molekularmasse von 9.991,5 Da bestimmt werden. Die Molekularmasse von TmHU wurde somit durch die Aufnahme von Elektrospray-Massenspektren bestätigt. Die Homogenität des Spektrums ist gleichzeitig ein Indiz für die Reinheit des Proteins.

RP-HPLC von TmHU

Retentionszeit [min]

8 10 12 14 16 18 20

Abso

rbtio

n be

i 220

nm

[mAU

]

-20

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Abbildung 3-4: Reversed-Phase-Chromatographie zur Bestimmung der Reinheit von TmHU.

Molekularmasse [Da]

Massenspektrum von TmHU (nach Dekonvolution)

Abbildung 3-5: Massenspektrum von TmHU zur Bestimmung der Molekularmasse des Proteins.

66 Ergebnisse

3.3.3 Analyse der Struktur und des Schmelzpunktes von TmHU mittels CD-Spektroskopie

Um zu überprüfen, ob das gereinigte TmHU strukturiert vorliegt, wurde es mit CD-Spektroskopie analysiert. Weiterhin wurde untersucht, ob die Lyophilisation und anschlie-ßende Rekonstitution des Proteins einen Einfluss auf dessen Stabilität hat. Die Durchfüh-rung der Methode ist unter Abschnitt 2.5.4 beschrieben. Es wurden jeweils die Spektren von TmHU in Lösung und von TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution verglichen. Das Ergebnis der CD-Spektroskopie ist in Abbildung 3-6 dargestellt.

CD-Spektren von TmHU

Wellenlänge [nm]

200 210 220 230 240 250 260

[Θ] M

RW

(Tm

HU

) [de

g ×

cm2 ×

dm

ol-1

]

-20000

-10000

0

10000

20000

30000

40000

Wellenlänge [nm]

200 210 220 230 240 250 260

Spa

nnun

g [m

V]

200300400500600700

TmHU in LösungTmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution

Abbildung 3-6: Fern-UV-CD-Spektrum von TmHU in Lösung und TmHU nach Lyo-philisation und Rekonstitution.

Es ist zu erkennen, dass sowohl TmHU in Lösung als auch TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution strukturiert sind. Es sind typische Spektren für α-helikale Strukturen zu sehen mit den charakteristischen Minima bei 209 und 222 nm, sowie einem Anstieg im Be-reich von 190 nm, die das Maximum bei 195 nm andeutet. Die Lyophilisation des Proteins hat also keinen Einfluss auf dessen Struktur nach der Rekonstitution. Somit entsprechen die Spektren beider TmHU-Spezies den theoretischen Erwartungen. Die Angabe der Span-nung am Photomultiplier im unteren Diagramm erfolgt zur Darstellung der Messgenauigkeit. Liegt die Spannung über 650 mV, so wird der Messfehler zu groß. Für beide Messungen liegt die Spannung unter diesem Wert. In einem weiteren Experiment wurde die thermische Stabilität von TmHU in Lösung und TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution ebenfalls mit Hilfe der CD-Spektroskopie un-tersucht. Um TmHU zu denaturieren, wurde die Temperatur von 20 °C auf 100 °C mit 1 °C/min erhöht. Die Änderung der Elliptizität wurde bei 220 nm gemessen (siehe Abbildung 3-7). Hier ist deutlich die Zunahme des charakteristischen Minimums bei 220 nm mit stei-gender Temperatur zu erkennen. Die Maxima und Minima der Kurven verschieben sich von der α-helikalen Struktur in Richtung Random-Coil-Struktur (Daten nicht gezeigt). Nach der Aufheizphase wurde TmHU ebenfalls mit 1 °C/min auf 20 °C abgekühlt. Durch Auftragen der molaren Elliptizität bei 220 nm gegen die Temperatur wurde die Schmelzkurve des Pro-teins ermittelt. Beide TmHU-Spezies sind nach dem Schmelzen fast vollständig renaturier-

Ergebnisse 67

bar. Die Denaturierung ist reversibel. Die Rückfaltungsrate von TmHU in Lösung beträgt 96,7 % und von lyophilisiertem TmHU 95,9 %. Eine Bestimmung der Schmelztemperatur von TmHU ist nicht möglich, da bei 100 °C immer noch nicht das gesamte Protein denaturiert vorlag. Weiterhin fällt auf, das zwischen 40 und 70 °C der Anstieg der Kurven erst leicht ansteigt, bevor er dann ab ca. 70 °C steiler wird. Aus diesen Daten geht hervor, dass die De- und Renaturierung von TmHU über mindestens zwei Stadien abläuft, die dem Aufschmelzen des Dimers sowie dem Aufschmelzen der Mo-nomere entsprechen könnte.

De- und Renaturierung von TmHU

Temperatur [°C]

20 40 60 80 100

[Θ] M

RW

(Tm

HU

) [de

g ×

cm2 ×

dm

ol-1

]

-16000

-14000

-12000

-10000

-8000

-6000

Denaturierung von lyophilisiertem TmHUDenaturierung von TmhU in LösungRenaturierung von lyophilisiertem TmHURenaturierung von TmHU in Lösung

Temperatur [°C]

20 40 60 80 100Span

nung

[mV

]

278280282284286288290292

Abbildung 3-7: De- und Renaturierung von TmHU vor und nach der Lyophilisation.

3.3.4 Untersuchung des Assoziationsgrades von TmHU mittels Größen-ausschlusschromatographie

Mit Hilfe der Gelfiltration sollte im Folgenden untersucht werden, ob TmHU in dem gewähl-ten Puffersystem als Dimer vorliegt. Der Dimerzustand von TmHU ist wichtig für die Interaktion des Proteins mit Nukleinsäuren, da die Bindung zwischen den β-Faltblättern eines TmHU-Dimers erfolgt. Auch hier wurden gelöstes und eingefrorenes TmHU und TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution miteinander verglichen. Weiterhin wurde der Einfluss der Ionenstärke des Lösungsmittels von TmHU auf den Dimerisierungszustand untersucht. Dazu wurde TmHU gegen 10 mM Tris mit 100 bzw. 300 mM NaCl, pH 7,5 dialysiert und in den Versuch eingesetzt. Die Durchführung der Methode ist im Abschnitt 2.3.5 beschrieben. In der Abbildung 3-8 ist das Chromatogramm der beiden TmHU-Spezies in 10 mM Tris mit 100 und 300 mM NaCl dargestellt. Es konnten zwei TmHU-Peaks mit Retentionszeiten von 27 und 32,5 min detektiert werden. Die Bestimmung der Molekularmasse der beiden TmHU-Peaks erfolgte mit Hilfe des Bio-Rad-Gelfiltrationsstan-dards. Der Peak mit einer Retentionszeit von 32,5 min (Retentionsvolumen von 16 ml) hat eine Molekularmasse von 8 kDa und entspricht der Größe von TmHU-Monomeren. Der zweite Peak mit einer Retentionszeit von 27 min (Retentionsvolumen von 13,8 ml) hat eine Molekularmasse von 20,7 Da und entspricht der Größe von TmHU-Dimeren. In beiden Fällen handelt es sich jedoch um TmHU-Dimere. Bei einer NaCl-Konzentration von 100 mM hat sich TmHU wie ein Monomer verhalten. Die größere Verzögerung kommt lediglich durch eine verstärkte elektrostatische Wechselwirkung mit dem Säulenmaterial zustande, die

68 Ergebnisse

selwirkung mit dem Säulenmaterial zustande, die durch den Zusatz von mehr Salz verhin-dert wird. Deshalb eluiert TmHU bei 300 mM NaCl erwartungsgemäß. Würde man die Salz-konzentration noch weiter erhöhen, würde irgendwann der Punkt kommen, an dem ver-stärkt hydrophobe Wechselwirkungen mit der Matrix auftreten. Die richtige Salzkonzentra-tion ist bei dieser Chromatographieart also entscheidend und kann sich von Protein zu Pro-tein stark unterscheiden. Sowohl lyophilisiertes als auch nicht-lyophilisiertes TmHU liegt zu 99,5 % als Dimer vor. Es ist nur ein sehr kleiner Monomer-Anteil detektierbar.

SEC von TmHU

Retentionszeit [min]

20 25 30 35 40 45 50

Abs

orbt

ion

bei 2

20 n

m [m

AU

]

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600TmHU in 100 mM NaCl TmHU in 300 mM NaCl TmHU nach Lyophilisation in 100 mM NaCl TmHU nach Lyophilisation in 300 mM NaCl

Dimer

Monomer

Abbildung 3-8: Gelfiltration von TmHU in Lösung und TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution in 10 mM Tris mit 100 bzw. 300 mM NaCl, pH 7,5.

3.3.5 Untersuchung des Assoziationsgrades von TmHU mittels analyti-scher Ultrazentrifugation

Um den Assoziationsgrad von TmHU mit einer weiteren Methode zu verifizieren, wurde eine analytische Ultrazentrifugation durchgeführt. Dazu wurde TmHU gegen 10 mM Tris, pH 7,5 dialysiert und in den Versuch eingesetzt. Auch hier erfolgte der Vergleich von TmHU in Lö-sung und TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution. Es wurden jeweils ein Sedi-mentationsgeschwindigkeitsexperiment und ein Sedimentationsgleichgewichtsexperiment durchgeführt. Die Durchführung der Experimente ist unter Abschnitt 2.6.2 beschrieben. Es wurden TmHU-Konzentrationen von 300, 150, 100, 50 und 30 µg/ml in das Experiment eingesetzt. Die Anpassung der Messdaten erfolgte durch numerisches Lösen der Lamm-Gleichung. Die Ergebnisse des Sedimentationsgeschwindigkeitslaufes von eingefrorenem TmHU in Lösung mit einer Konzentration von 300 µg/ml sind in Abbildung 3-9 dargestellt. Die Analyse der entsprechenden Sedimentationskoeffizienten- bzw. Molekularmassenvertei-lungen (siehe Abbildung 3-9, A und B) zeigt jeweils nur eine gelöste Komponente unabhän-gig von der Konzentration der eingesetzten TmHU-Proben. Aus den Messdaten der jeweils fünf eingesetzten Konzentrationen der jeweiligen TmHU-Probe wurde der Mittelwert gebildet, woraus sich die folgenden Daten ergeben. TmHU in Lösung hat einen Sedimentationskoeffi-zienten von 1,68 ± 0,02 S, ein dem TmHU-Dimer entsprechende Molekularmasse von 22,57 ± 0,33 kDa, einen Diffusionskoeffizienten von 6,87x10-7 ± 3,07x10-9 cm2/s und ein Verhält-nis der Reibungskoeffizienten f/f0 von 1,67 ± 7,71x10-3. Ähnliche Daten konnten für lyophi-lisiertes TmHU erhalten werden. Es hat einen Sedimentationskoeffizienten von 1,68 ± 0,01 S, ein dem TmHU-Dimer entsprechende Molekularmasse von 22,41 ± 0,32 kDa, einen Diffu-sionskoeffizienten von 6,97x10-7 ± 4,47x10-9 cm2/s und einem Verhältnis der Reibungskoef-fizienten f/f0 von 1,67 ± 5,487x10-3. Als Maß für die Qualität der angepassten Konzentrati-

Ergebnisse 69

onsprofile wird üblicherweise die Abweichung zwischen experimentellen und angepassten Werten (RMSD) in Kombination mit einer Auftragung dieser Differenzen gegen den Abstand vom Rotormittelpunkt verwendet. Für die Anpassung der Sedimentationsdaten von TmHU ergaben sich nur minimale statistische Abweichungen über den gesamten radialen Bereich. Der RMSD liegt hier bei 0,0058, was auf eine hohe Genauigkeit der angepassten Daten hin-weist.

Molekularmasse [kDa]

0 20 40 60 80 100

c(M

) [A

bsor

btio

n/kD

a]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Sedimentationskoeffizient [S]

0 1 2 3 4 5

c(s)

[Abs

orbt

ion/

S]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

A B

Abbildung 3-9: Analyse der molekularen Größenverteilung von gelöstem TmHU in einer Konzentration von 300 µg/ml. Die berechneten Sedimentationskoeffizienten c(s) (A) bzw. Molekularmassenverteilungen c(M) (B) sind gegen die Sedimentations-koeffizienten, bzw. Molekularmassen aufgetragen. Beide Verteilungen wurden mit einem Konfidenzniveau der Regularisierung nach der Maximum-Entropie-Methode von p = 0,95, einem Verhältnis f/f0 von 1,68 und einer Auflösung von n = 100 Se-dimentationskoeffizienten oder molekularen Massen berechnet.

Durch das Sedimentationsgleichgewichtsexperiment sollte das Vorliegen von TmHU-Dimeren in Lösung bestätigt werden. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 3-10 dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur die Daten im Konzentrationsbereich zwischen 300 und 100 µg/ml TmHU gezeigt. Der RMSD der angepassten Daten lag bei maximal 0,01 und auch die Anpassung der Sedimentationsdaten ergab nur minimale statistische Abwei-chungen über den gesamten radialen Bereich, was auf eine hohe Genauigkeit der angepass-ten Daten hinweist. Auch hier wurden die Daten aller untersuchten Konzentrationen gemit-telt. So ergibt sich für TmHU in Lösung eine Molekularmasse von 19,58 ± 0,46 kDa und für TmHU nach Lyophilisation und Rekonstitution eine Molekularmasse von 20,38 ± 0,66 kDa. Auch diese Werte entsprechen im Rahmen der bei der analytischen Ultrazentrifugation mög-lichen Genauigkeit der Molekularmasse von TmHU-Dimeren. Sowohl nach Einfrieren als auch nach Lyophilisation liegt TmHU in Lösung in 10 mM Tris, pH 7,5 als Dimer vor. Der Prozess der Lyophilisation hat also keinen Einfluss auf den Assoziationsgrad von TmHU.

70 Ergebnisse

Sedimentationsgleichgewichtsexperiment

Radius [cm]

6,4 6,6 6,8 7,0

Abs

orbt

ion

bei 2

30 n

m

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

300 µg/ml TmHU 150 µg/ml TmHU100 µg/ml TmHU300 µg/ml TmHU, lyophilisiert150 µg/ml TmHU, lyophilisiert100 µg/ml TmHU, lyophilisiert

Radius [cm]

6,4 6,6 6,8 7,0

Diff

eren

z

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

A

B

Abbildung 3-10: Sedimentationsgleichgewichtsexperiment von TmHU in Lösung bzw. nach Lyophilisation und Rekonstitution. (A) Absorptionsdaten als Funktion des Abstandes vom Rotormittelpunkt. Die angepassten Daten sind als durchgezo-gene Linie dargestellt. (B) Differenzen zwischen experimentellen und angepassten Daten als Funktion des Abstandes vom Rotormittelpunkt.

3.4 Charakterisierung der Interaktion von TmHU und RNA In den folgenden Abschnitten, wird dargestellt, wie die Interaktion von TmHU und RNA cha-rakterisiert worden ist. Es sollte festgestellt werden, ob TmHU grundsätzlich in der Lage ist, mit RNA zu interagieren. Bisher wurde nur die Bindung von TmHU an DNA nachgewiesen338. Da TmHU ein spezifisches Bindungsmotiv für die Alu-Domäne einer kleinen zytoplasmati-schen RNA besitzt, sollte geklärt werden, ob diese Domäne für eine Interaktion notwendig ist oder ob sie unabhängig von der Sequenz der RNA stattfindet.

3.4.1 RNaseschutzanalyse von RNA nach Bindung von TmHU

Mit diesem Experiment wurde untersucht, ob TmHU RNA effektiv vor dem Abbau durch Nukleasen schützt. Dazu wurde eine 273 Nukleontide lange ssRNA in Gegenwart von TmHU oder ohne TmHU einer RNase-Schutzanalyse, wie in Kapitel 2.6.1 beschrieben, unterzogen. Der Verdau der RNA erfolgt mit RNase ONE, die nur einzelsträngige RNA schneiden kann. Das Ergebnis der RNase-Schutzanalyse ist in Abbildung 3-11 dargestellt. Bei Verdau der RNA mit RNase ONE (Spur 3) erfolgt ein vollständiger Abbau des Fragmentes. Es ist keine RNA im Agarosegel detektierbar. Durch Bindung von TmHU an die Alu-siRNA erfolgt ein fast vollständiger Schutz vor dem Verdau durch RNase ONE (Spur 4). Ein großer Teil der ur-sprünglichen RNA-Menge kann detektiert werden. Die Bindung von TmHU schützt also ssRNA vor dem Verdau durch RNasen.

Ergebnisse 71

1 2 3 4 kB

0,115

0,2800,4000,530

0,780

1,2801,5201,770

Legende: Spur 1: RNA-Größenstandard Spur 2: unbehandelte RNA, 273 nt Spur 3: RNA behandelt mit RNase

ONE Spur 4: RNA + TmHU behandelt mit

RNase ONE

Abbildung 3-11: RNaseschutzanalyse von RNA nach Bindung von TmHU.

3.4.2 Untersuchung der TmHU-RNA-Interaktion mittels Fsation

luoreszenzpolari-

Zur genaueren Bestimmung der Dissoziationskonstanten von TmHU und den unterschiedli-chen RNA-Konstrukten Alu-siRNA und siRNA wurde die Methode der Fluoreszenzpolarisati-on gewählt. Es sollte geprüft werden, ob TmHU ähnlich wie HBsu, ein spezifisches Bin-dungsmotiv für die Alu-Domäne der RNA besitzt. Dazu wurde FITC-markierte Alu-siRNA o-der siRNA in einer Konzentration von 50 nM in einer rührbaren Küvette vorgelegt und TmHU mit steigender Konzentration dazutitriert. Die Änderung der Polarisation wurde durch Anregung des Fluorophors bei 490 nm und Detektion der Emission bei 525 nm be-stimmt. Die Methode ist unter Abschnitt 2.5.5 beschrieben. In Abbildung 3-12 ist die Ände-rung der Polarisation bei Titration von TmHU zu Alu-siRNA und siRNA dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die Sättigung, also keine weitere Änderung der Polarisation bei weiterer Zugabe von TmHU, für siRNA eher erreicht wird als für Alu-siRNA. Das deutet darauf hin, dass an größere RNA-Fragmente mehr TmHU-Dimere binden als an kleinere. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Bindungslänge von TmHU an doppelsträngige DNA neun bis zehn Basenpaare pro TmHU-Dimer beträgt338. Möglicherweise trifft das auch für die Inter-aktion mit dsRNA zu. Eine Interpretation der Ergebnisse ist schwierig, da nicht zwischen RNA-TmHU-Assoziaten bzw. -Aggregaten unterschieden werden kann. In einem Bereich bis ca. 40 nM TmHU-Dimer (siehe Abbildung 3-12) ist ein langsamer Anstieg des Messsignals zu detektieren. Bei höhe-ren Konzentrationen nimmt das Messsignal wesentlich stärker zu. Es besteht hier die Mög-lichkeit, dass bei geringeren TmHU-Konzentrationen eine gerichtete Interaktion vorliegt, also jeweils ein TmHU-Dimer in einem Abstand von 10 bis 11 Nukleotiden bindet. Bei höheren Konzentrationen könnte es dann zur Ausbildung von Aggregaten kommt. Hier liegt also kei-ne gerichtete Bindung mehr vor, es kommt zu einer Fällung der Komplexe aus RNA und TmHU. Diese Aggregate wurden bei höheren Konzentrationen von RNA und TmHU des öfte-ren beobachtet. Eine Optimierung der Methode, z. B. durch veränderte Pufferbedingungen, wäre notwendig gewesen, um die Aggregatbildung zu verhindern und somit die Dissoziati-onskonstanten durch Messung der Fluoreszenzpolarisation genau zu bestimmen. Im ersten Abschnitt der Messkurven, bis ca. 75 nM TmHU, ist allerdings erkennbar, dass der Anstieg des Messsignals für siRNA größer ist als für die Alu-siRNA. Das würde bedeuten, dass TmHU mit höherer Affinität an siRNA bindet als an RNA, bei der ein spezifisches Bindungs-motiv vorhanden ist.

72 Ergebnisse

Messung der Fluoreszenzpolarisation

TmHU-Dimer [nM]

1 10 100 1000

Pola

risat

ion

[a.u

.]

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

50 nM siRNA50 nM Alu-siRNA

Abbildung 3-12: Änderung der Fluoreszenzpolarisation durch Titration von TmHU zu FITC-markierter Alu-siRNA bzw. siRNA in 10 mM Tris, pH 7,5.

3.4.3 Schmelzpunktanalyse von siRNA nach Interaktion mit TmHU mittels CD-Spektroskopie

Mit Hilfe der CD-Spektroskopie wurden im folgenden Experiment die Eigenschaften von frei-er siRNA und siRNA gebunden an TmHU bei Denaturierung durch Hitze miteinander vergli-chen mit der Fragestellung, ob TmHU siRNA vor Hitzdenaturierung schützt. Die Durchfüh-rung der Methode ist unter Abschnitt 2.5.4.2 erläutert. Während der Denaturierung der siRNA oder siRNA-TmHU-Komplexe wurde die Veränderung des für Nukleinsäuren charak-teristischen Maximums bei 260 nm verfolgt. Die maximale Änderung der Elliptizität ist bei einer Wellenlänge von 260 nm detektierbar. Die Abnahme des charakteristischen Maxi-mums bei 260 nm mit steigender Temperatur ist deutlich zu erkennen. Die Veränderung der Elliptizität bei 260 nm als Funktion der Temperatur ist in Abbildung 3-13 dargestellt.

Schutz von siRNA vor thermischer Denaturierung durch TmHU

Temperatur [°C]

20 40 60 80 100

Θ b

ei 2

60 n

m (s

iRN

A) [

mde

g]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

siRNA + TmHU (1:1)siRNA

Temperatur [°C]

20 40 60 80 100Spa

nnun

g (s

iRN

A) [

mV

]

302304306308310312314316318320

siRNA + TmHU (1:1)siRNA

Θ b

ei 2

60 n

m (s

iRN

A +

Tm

HU

) [m

deg]

0

2

4

6

8

10

Spa

nnun

g (s

iRN

A +

Tm

HU

[mV

]

320

330

340

350

360

370

Abbildung 3-13: Schmelzkurven von siRNA allein und siRNA-TmHU-Komplexen. Die maximale Änderung der Elliptizität wurde bei 260 nm detektiert und mit der Änderung der Temperatur verfolgt.

Ergebnisse 73

Obwohl in beiden Proben die Konzentration der siRNA gleich hoch war, ist die Signalintensi-tät in der Probe mit TmHU wesentlich geringer (daher auch unterschiedliche Achsenskalie-rung bei der Darstellung der Schmelzkurven). Die Interpretation ist somit nicht klar möglich, da hier wiederum Aggregatbildung nicht von Komplexbildung unterschieden werden kann. Das Ausfallen der Komplexe aus TmHU und siRNA in Form von Aggrgaten könnte zu einem Signalverlust führen. Die Veränderung der Signalintensität könnte weiterhin durch die Bin-dung von TmHU an die RNA verursacht werden. Dadurch wird deren Form verändert, denn HU-Proteine knicken Nukleinsäuren bei Ihrer Bindung, wodurch diese weniger Raum ein-nimmt. Diese Formänderung wäre dann möglicherweise im CD-Spektrum erkennbar. Auf Grund der großen Schwankungen in den Messungen erfolgte die Auswertung der Messdaten manuell. Die siRNA schmilzt deutlich früher als nach Bindung von TmHU. Ohne TmHU schmilzt die siRNA bereits bei ca. 72 °C. Mit TmHU schmilzt die RNA erst bei ca. 77 °C. TmHU schützt die siRNA also vor thermischer Denaturierung.

3.5 Untersuchung der Aufnahme und Lokalisation von TmHU in eukaryontischen Zellen

3.5.1 Detektion von TmHU im Zelllysat eukaryontischer Zellen mittels Western-Blot-Analyse

Da die Aufnahme von TmHU in humane Zellen eine wichtige Voraussetzung für eine effiziente Transfektion therapeutischer Nukleinsäuren ist, wurde im Folgenden genauer untersucht, ob TmHU von humanen Zellen aufgenommen wird, wo es lokalisiert ist, und wie lange die Verweildauer in den Zellen ist. Nach Inkubation von humanen Zellen mit TmHU sollte mittels Western-Blot-Analyse unter-sucht werden, wie lange das Protein nachweisbar ist und ab wann möglicherweise ein Ab-bau erfolgt. Dazu wurden sowohl MCF-7- als auch U-373-MG-Zellen mit 100 µM TmHU in serumfreien Medium inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen gründlich mit PBS gewaschen, trypsiniert und anschließend mit RIPA-Puffer aufgeschlossen. Danach wurde TmHU mittels Western-Blot detektiert. Die Quantifizierung der Bandenintensitäten auf dem Röntgenfilm erfolgte mit Hilfe der Software GeneTools (Fa. Syngene). Um einen in-ternen Standard zu erhalten, wurde eine definierte Bande aus der Ponceaufärbung der Blotmembran quantifiziert und anschließend der Quotient aus TmHU- und Ponceaubande-nintensität gebildet. Der 0,5-Stunden-Wert wurde hier auf 100 % festgelegt. Im oberen Teil der Abbildung 3-14 ist die Detektion von TmHU in U-373-MG-Zelllysat über einen Zeitraum von 96 Stunden, also 4 Tagen, dargestellt. Im unteren Teil der Abbildung ist die Quantifizierung der Bandenintensitäten auf dem Röntgenfilm im Verhältnis zur Pon-ceaufärbung in einem Diagramm dargestellt. Es ist zu erkennen, dass bereits nach 30 min TmHU im Lysat der Zellen detektierbar ist. Das Protein wird also relativ schnell aufgenommen. Nach 4 Tagen ist TmHU immer noch gut detektierbar und selbst nach 96 Stunden Inkubation ist kein vollständiger Abbau des Prote-ins erfolgt. TmHU scheint also relativ stabil gegenüber dem Abbau durch zelluläre Proteasen zu sein. Da das Protein selbst Nukleinsäuren vor dem Verdau durch Nukleasen schützt, könnte dies, im Gegensatz zu freien Nukleinsäuren, zu einer stark erhöhten Verweildauer zu transfizierender DNA oder RNA auf oder in den Zellen führen. Die maximale Aufnahme von TmHU erfolgt über einen Zeitraum zwischen 4 und 24 Stunden, so dass Zellen nach 4-stündiger Transfektion bereits wieder in Komplettmedium überführt werden können.

74 Ergebnisse

Detektion von TmHU, Zeitreihe

Zeit [h]Kon

trolle 0,5 4 24 48 72 96

rela

tive

Ban

deni

nten

sitä

t [%

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

10 kDa

Inku

batio

noh

ne T

mH

U

0,5

h

4 h

24 h

48 h

72 h

96 h

Abbildung 3-14: Detektion von TmHU in U-373-MG-Zelllysat mittels Western-Blot nach Inkubation von U-373-MG-Zellen mit 100 µM TmHU über einen Zeitraum von 96 Stunden.

3.5.2 Untersuchung der Aufnahme von markiertem TmHU mittels Fluores-zenzmikroskopie

Um die Aufnahme von TmHU in eukaryontische Zellen näher zu untersuchen, wurden U-373-MG-Zellen für 2 Stunden mit 10 µM TmHU-91Cys inkubiert, das über eine Maleimid-Kopplung mit Alexa-Fluor-488 markiert worden ist. Zwei Stunden Inkubation der Zellen mit dem markierten TmHU sind ausreichend, da bereits mittels Western-Blot gezeigt werden konnte, dass bereits nach 30 min TmHU im Lysat von U-373-MG-Zellen detektierbar ist (siehe 3.5.1). Nach Fixierung und Kernfärbung der Zellen mit DAPI wurden diese in Mowiol eingebettet und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Aufnahmen in Abbildung 3-15 zeigen die Detektion der beiden Fluoreszenzfarbstoffe DAPI und FITC.

FITC Überlagerung DAPI/FITC Abbildung 3-15: Detektion von Alexa-Fluor-488-markiertem TmHU nach zweistün-diger Inkubation mit U-373-MG-Zellen.

Es ist zu erkennen, dass sich FITC-markiertes TmHU im Zytoplasma der Zellen befindet und sich teilweise um den Zellkern herum akkumuliert. In den Zellkernen selber ist TmHU

Ergebnisse 75

in diesem Fall nicht detektierbar. Es ist allerdings nicht auszuschließen, dass durch die Kopplung an den Fluoreszenzfarbstoff, die Eigenschaften des Proteins verändert worden sind, was sich möglicherweise auch in einer veränderten Lokalisation des Proteins zeigt.

3.5.3 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen nach Inkubation mit TmHU

Um die Lokalisation von TmHU in den Zellen genauer zu untersuchen und die bisherigen Ergebnisse mit einer weiteren Methode zu bestätigen, wurden U-373-MG-Zellen mit 2 µM TmHU für 2 Stunden in serumfreiem Medium inkubiert. Anschließend wurde das Protein nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen mittels Immunfluoreszenzfärbung, wie un-ter 2.4.12 beschrieben, detektiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-16 dargestellt. Im Teil A der Abbildung ist die Inkubation der Zellen mit TmHU gezeigt. Die FITC-Markierung des Sekundärantikörpers ist sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern detek-tierbar. Die Fluoreszenz ist über die gesamte Zelle verteilt. TmHU wird also von humanen Zellen aufgenommen. Die Lokalisation des Proteins ist zytoplasmatisch, hauptsächlich aber im Kern. Beim genaueren Betrachten der Abbildung kann man beobachten, dass TmHU teilweise punktuell detektierbar ist. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das Protein in bestimmten Vesikeln lokalisiert ist. Im Teil B ist die Hintergrundkontrolle ohne Inkubati-on von TmHU zu sehen. Diese Kontrolle soll zeigen, dass der verwendete Anti-TmHU-Antikörper spezifisch an TmHU bindet und keine unspezifischen Interaktionen mit anderen zellulären Proteinen vorhanden sind. Je höher die Spezifität des Antikörpers ist, um so ge-ringer ist die Hintergrundfärbung. Die Kontrolle ohne Inkubation mit TmHU zeigt in diesem Fall nur ein sehr schwaches FITC-Signal.

FITC Überlagerung DAPI/FITC

FITC Überlagerung DAPI/FITC

A

B

Abbildung 3-16: Immunfluoreszenzfärbung von U-373-MG-Zellen zur Detektion von TmHU. (A) Inkubation der Zellen mit 2 µM TmHU für 2 h; (B) Hintergrundkon-trolle ohne Inkubation mit TmHU, aber Inkubation mit denselben Antikörpern.

Um die intrazelluläre Lokalisation von TmHU zu verifizieren, erfolgte ein Vergleich der Im-munfluoreszenz von Zellen, die während der Fixierung mit Triton X-100 permeabilisiert worden, sind mit Zellen, die nicht permeabilisiert worden sind. Werden Zellen nicht mit Tri-ton X-100 behandelt, so ist deren Zellmembran nicht durchlässig für den Primär- und Se-kundärantikörper. Dadurch kann TmHU nur detektiert werden, falls es außen an der Zell-membran haften sollte. In Abbildung 3-17 ist der Vergleich von nicht-permeabilisierten Zel-len mit permeabilisierten Zellen dargestellt.

76 Ergebnisse

FITC

A

FITC

B

Abbildung 3-17: Detektion von TmHU mittels Immunfluoreszenz, Vergleich nicht-permeabilisierter und permeabilisierter U-373-MG-Zellen nach Inkubation mit 2 µM TmHU für 2 h. (A) Fixierung der Zellen ohne Triton X-100, (B) Fixierung der Zellen mit Triton X-100.

Es ist ein deutlicher Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den beiden Ver-suchsgruppen zu erkennen. Sie ist intensiver, nachdem die Zellen permeabilisiert worden sind (siehe Abbildung 3-17, Teil B). Es kann also ausgeschlossen werden, dass TmHU an der äußeren Zellmembran haftet, sondern es befindet sich tatsächlich im Zellinneren. Auch hier ist das Protein über die gesamte Zelle verteilt und befindet sich sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern. Ebenfalls kann man wieder die teilweise punktuelle Verteilung von TmHU sehen. Eine Positivkontrolle, bei der intrazelluläres β-Tubulin detektiert worden ist (hier nicht dargestellt), zeigte ein analoges Ergebnis. Ohne Zusatz von Triton X-100 während der Fixierung konnte β-Tubulin nicht detektiert werden, mit Zusatz von Triton X-100 wiesen die Zellen ein intensives FITC-Signal auf.

3.6 Untersuchung der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen in eukaryontische Zellen

3.6.1 Untersuchungen der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels Fluoreszenzmikroskopie

In den vorangegangenen Abschnitten konnte gezeigt werden, dass TmHU in der Lage ist, unspezifisch mit RNA zu interagieren. Des Weiteren wird es in humane Zellen aufgenommen und ist dort sowohl zytoplasmatisch als auch im Kern lokalisiert. Im Folgenden soll die Fra-ge geklärt werden, ob TmHU die gebundene RNA in die zu untersuchenden Zellen transfizie-ren kann und wo diese anschließend lokalisiert ist. Mit diesem Experiment wurde untersucht, ob es sichtbare Unterschiede zwischen der Auf-nahme von siRNA durch TmHU oder Lipofectamine 2000 gibt. Dazu wurden U-373-MG-Zellen mit 250 nM FITC-markierter siRNA (Fa. Qiagen), 1 µl Lipofectamine 2000 bzw. 1 µM TmHU für 6 h inkubiert. Die Vorbereitung für diese Transfektionsansätze wurde bereits im Abschnitt „Material und Methoden“, Absätze 2.4.4 und 2.4.5 beschrieben. Die Zellkerne wurden in diesem Fall mit Doxorubicin, einem DNA-Interkalator mit roter Fluoreszenz, ge-färbt. Das Ergebnis der Untersuchungen ist in Abbildung 3-18 dargestellt. Im Teil A der Abbildung 3-18 ist die Inkubation der Zellen mit siRNA allein dargestellt. In diesem Fall kann kein FITC-Signal detektiert werden. siRNA allein ist also nicht in der Lage, die Zell-membran zu passieren und in das Innere von Zellen zu gelangen. Nach Transfektion der Zellen mit FITC-siRNA zusammen mit Lipofectamine 2000 (Abbildung 3-18, B) sind grüne Vesikel sichtbar, bei denen es sich um Lipid-siRNA-Komplexe handelt, in denen die RNA in

Ergebnisse 77

das Innere der Liposomen eingeschlossen ist. Diese Vesikel befinden sich vorwiegend im Zy-toplasma der Zellen. Weiterhin sind Zellen erkennbar, die ein Zytoplasma mit grüner Fluo-reszenz aufweisen (in Abbildung 3-18 durch weiße Pfeile markiert), was darauf hindeutet, dass die transfizierten siRNA in das Zytoplasma entlassen worden sind. Erfolgt die Transfektion mit Hilfe von TmHU (Abbildung 3-18, C), so kann man ebenfalls Spots beobachten, bei denen es sich um TmHU-siRNA-Komplexe handelt. Diese Spots liegen ebenfalls im Zytoplasma der Zellen. Zytoplasmen mit grüner Markierung sind nicht detektierbar. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die siRNA nicht in das Zytoplasma entlassen wird, sondern am Protein gebunden bleibt oder in Zellorganellen, wie Lyso- oder Endosomen lokalisiert ist. Werden TmHU und Lipofectamine 2000 zusammen für die Transfektion verwendet (Abbildung 3-18, D), so kann wiederum beides beobachtet werden, Komplexe und Zytoplasmen mit FITC-Markierung. Die Mechanismen der Transfektion durch Lipofektion und TmHU scheinen also verschieden und unabhängig voneinander zu sein.

Doxorubicin/FITC

Transmission

A

Transmission

A

Doxorubicin/FITCDoxorubicin/FITC Überlagerung

B

Transmission

B

Transmission ÜberlagerungÜberlagerung

C

Transmission

C

Transmission Doxorubicin/FITCDoxorubicin/FITC ÜberlagerungÜberlagerung

D

Transmission

D

Transmission Doxorubicin/FITC ÜberlagerungÜberlagerung

siRNA

siRNA + Lipofectamine 2000

siRNA + TmHU

siRNA + Lipofectamine 2000 + TmHU

Abbildung 3-18: Detektion von FITC-markierter siRNA mittels Fluoreszenzmikro-skopie, Inkubation von U-373-MG-Zellen mit (A) FITC-siRNA allein, (B) FITC-siRNA und Lipofectamine 2000, (C) FITC-siRNA und TmHU, (D) FITC-siRNA, TmHU und Lipofectamine 2000. Die Pfeile markieren jeweils Zellen, in denen das Zytoplasma mit markierter siRNA gefüllt ist, also die siRNA in das Zytoplasma entlassen wor-den ist.

78 Ergebnisse

3.6.2 Untersuchungen der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

Um zu untersuchen, ob TmHU oder die Komplexe aus RNA und TmHU sich tatsächlich im Inneren der Zellen befinden oder außen an der Zytoplasmamembran haften, wurden Zellen mit Laser-Scanning-Mikroskopie untersucht. Hierbei werden die zu untersuchenden Zellen optisch in Ebenen zerlegt und einzeln gescannt. Dadurch kann eindeutig bestimmt werden, ob sich das detektierte Fluorophor im Inneren einer Zelle befindet. Für diesen Versuch wurden MCF-7-Zellen mit 6,25 µM Alexa-Fluor-633-markiertem TmHU oder mit 1,25 µM Alexa-Fluor-markierter RNA (300 nt Länge) ± unmarkiertem TmHU in 8-fachem molarem Überschuss für 24 h inkubiert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-19 dargestellt. Markiertes TmHU kann sowohl im Zytoplasma als auch im Kern lokalisiert werden (Abbildung 3-19, A). Werden Zellen mit RNA allein inkubiert (Abbildung 3-19, B), so ist keine RNA detektierbar. RNA allein vermag also nicht die Zellmembran zu passieren. In Verbindung mit TmHU (Abbildung 3-19, C) kann die markierte RNA ebenfalls wie TmHU im Zellkern und im Zytoplasma detektiert werden. Weiterhin sind Vesikel zwischen den Zellen detektierbar, bei denen es sich wahrscheinlich um RNA-TmHU-Komplexe handelt. Wenn TmHU also an RNA gebunden ist, präzipitieren diese Komplexe auf den Boden der Kulturschale, haften sich an die Zellmembran an und passieren diese schließlich. Dieser Versuch wurde ebenfalls mit BSA als Kontrollprotein durchgeführt (hier nicht dargestellt). Zusammen mit BSA konnte keine RNA in den Zellen detektiert werden.

Transmission ÜberlagerungAlexa-Fluor-633

A

Transmission ÜberlagerungAlexa-Fluor-488

B

C

Transmission ÜberlagerungAlexa-Fluor-488

Alexa—Fluor-633-TmHU

Alexa—Fluor-488-siRNA

Alexa—Fluor-488-siRNA + TmHU

Abbildung 3-19: Detektion von markiertem TmHU oder RNA mittels konfokaler La-ser-Scanning-Mikroskopie nach Inkubation von MCF-7-Zellen. (A) Inkubation von MCF-7-Zellen mit Alexa-Fluor-633-markiertem TmHU, (B) Inkubation von Zellen mit Alexa-Fluor-488-markierter RNA (300 nt Länge), (C) Inkubation von Zellen mit markierter RNA zusammen mit TmHU.

Ergebnisse 79

3.6.3 Untersuchung der Aufnahme von TmHU-RNA-Komplexen mittels Durchflusszytometrie

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde untersucht, wie hoch die Transfektionseffizienz von TmHU ist. Dazu wurden MCF-7-Zellen mit 300 nt langer und mit Alexa-Fluor-488-markierter RNA mit und ohne TmHU über Nacht inkubiert. Am Folgetag wurden die Zellen gründlich mit PBS gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert. In Abbildung 3-20 ist die Auswertung der durchflusszytometrischen Messung dargestellt. Werden die Zellen mit RNA ohne TmHU inkubiert (Abbildung 3-20, B), so können keine positiven Zellen, also Zellen, die mit Alexa-Fluor-488 markiert sind, detektiert werden. Die Population der Zellen hat die gleichen Merkmale, wie der Kontrollversuch ohne Inkubation mit markierter RNA (Abbildung 3-20, A). RNA allein ist also nicht in der Lage, in das Innere von humanen Zellen zu gelangen. Werden die Zellen mit Komplexen aus RNA und TmHU inkubiert (Abbildung 3-20, C), so sind mehr als 40 % der Zellen positiv. 40 % der untersuchten Zellen sind also mit siRNA transfiziert worden. Bei einem Vergleich mit BSA als Kontrollprotein (hier nicht dargestellt) konnten ebenfalls keine positiven Zellen detektiert werden.

FACS-Analyse markierter Zellen

43,92

2,324,15

0

10

20

30

40

50

Kontrolle RNA RNA + TmHU

% p

ositi

ver Z

elle

n

A B CA B C

Abbildung 3-20: Detektion von Alexa-Fluor-488-markierter RNA nach Inkubation über Nacht von MCF-7-Zellen mit markierter RNA ± TmHU mittels FACS. (A) Kon-trollzellen ohne Inkubation mit RNA, (B) Zellen nach Inkubation mit markierter RNA allein, (C) Zellen nach Inkubation mit Komplexen aus markierter RNA und TmHU. Die Detektion erfolgte durch Anregung von Alexa-Fluor-488 mit dem Argon-Laser des FACSCalibur.

3.7 Transfektion von Nukleinsäuren mit TmHU

3.7.1 Etablierung einer Positivkontrolle für die Transfektion von EGFP-siRNA

In den folgenden Abschnitten sind die Untersuchungen zur funktionellen Transfektion von TmHU dargestellt. Es wurde bereits gezeigt, dass TmHU den Transfer der gebundenen RNA in das Innere von humanen Zellen mit hohen Transfektionsraten vermitteln kann. Jetzt soll

80 Ergebnisse

geklärt werden, ob die transfizierte RNA auch einen funktionellen Effekt bewirkt. In diesem Fall werden siRNA für die Transfektion verwendet, mit dem Ziel, die Expression eines Ziel-gens zu inhibieren. Für die Transfektionen von EGFP-siRNA in Zelllinien, die stabil EGFP exprimieren, musste zunächst eine Positivkontrolle für das entsprechende Detektionssystem etabliert werden. Hier wurde mit den Zelllinien MCF-7-EGFP und U-373-MG-EGFP gearbeitet, die beide stabil EGFP exprimieren. Die EGFP-Expression sollte durch die Transfektion von siRNA, die spezifisch gegen EGFP-mRNA gerichtet ist, inhibiert werden. Um eine effektive Transfektion zu erreichen, wurden verschiedene Transfektionsagenzien getestet, unter anderem FuGENE 6 (Fa. Roche Applied Science) und Lipofectamine 2000 (Fa. Invitrogen). Für die Versuche wurden die Zellen mit 50 pmol EGFP-siRNA (Fa. MWG Biotech) in 500 µl Opti-MEM-Medium inkubiert. Für die Transfektion wurde jeweils 1 µl des entsprechenden Transfektionsagens eingesetzt. Das genaue Transfektionsprotokoll für Lipofectamine 2000 ist unter 2.4.4 be-schrieben. Die Transfektion mit FuGENE 6 wurde nach den Angaben des Herstellers durch-geführt. Nach 24 h erfolgte ein Mediumwechsel mit Normalmedium der entsprechenden Zelllinie. Während der Inkubation erfolgte permanent die Messung der Fluoreszenzintensität mit dem Fluoreszenzplattenleser Flx800 über insgesamt 48 h, wie unter Abschnitt 2.4.15 beschrieben. Die Auftragung der Fluoreszenzintensität gegen die Zeit nach Transfektion der Zelllinie U-373-MG-EGFP ist in Abbildung 3-21 dargestellt. Daraus geht hervor, dass nur durch die Transfektion der EGFP-siRNA mit Lipofectamine 2000 und Inkubation der Zellen für 48 h eine Reduktion der Fluoreszenzintentät von EGFP um 31 % erfolgt. Mit FuGENE 6 konnte keine Reduktion der Fluoreszenzintensität erreicht werden. Die Auswertung der Messkurven erfolgte exponentiell nach der Gleichung y = aebx für die einzelnen Abschnitte zwischen den Medienwechseln. Die Summe der einzelnen Werte für b wurden dann in einem Diagramm, siehe Abbildung 3-22, aufgetragen. Daraus geht hervor, dass durch Transfektion von EGFP-siRNA allein, keine Reduktion der EGFP-Expression er-reicht werden kann. Auch durch die Transfektion der siRNA mit FuGENE 6 wird die Expres-sion von EGFP nicht inhibiert. Nur durch die Transfektion der EGFP-siRNA mit Lipofecta-mine 2000 kann eine starke Reduktion der EGFP-Fluoreszenz in beiden Zelllinien erreicht werden. Die Transfektion mit Lipofectamine 2000 konnte somit als Positivkontrolle für die Transfektionsexperimente mit TmHU etabliert werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der EGFP-Expression durch RNAi möglich ist.

Messung der Fluoreszenzintensität von U-373-MG-EGFP über die Zeit

9000

10000

11000

12000

13000

14000

15000

0:00:00 12:00:00 24:00:00 36:00:00 48:00:00

Zeit [h]

Fluo

resz

enzi

nten

sitä

t [R

U]

EGFP-Kontrolle EGFP-siRNAEGFP-siRNA + FuGENE 6EGFP-siRNA + Lipofectamine 2000

Mediumwechsel

y=aebx

Abbildung 3-21: Messung der Fluoreszenzintensität von U-373-MG-Zellen über 48 h nach der Transfektion der Zellen mit EGFP-siRNA und jeweils 1 µl Transfektions-agens.

Ergebnisse 81

Exponentielle Auswertung der Messung der Fluoreszenzintensität über die Zeit

0,28

0,23

0,23

0,21

0,24

0,23

0,02

0,02

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

Kont

rolle

Zel

len

mit

EGFP

-Ex

pres

sion

EG

FP-s

iRN

A

EGFP

-siR

NA

+Fu

GE

NE

6

EGFP

-siR

NA

+Li

pofe

ctam

ine

2000

b of

y=a

ebx

U-373-MG-EGFPMCF-7 EGFP

Abbildung 3-22: Exponentielle Auswertung der Fluoreszenzintensität-Zeit-Kurven nach der Transfektion von MCF-7-EGFP- und U-373-MG-EGFP-Zellen mit EGFP-siRNA.

3.7.2 Transfektion von EGFP-siRNA mit TmHU

Nach der Etablierung der Positivkontrolle erfolgte die Transfektion von siRNA mit TmHU. Es wurden verschiedene Bedingungen getestet, um einen effizienten RNAi-Effekt zu erreichen. So wurde die Transfektion an aufeinanderfolgenden Tagen bis zu dreimal wiederholt. Es wurden verschiedene TmHU-siRNA-Verhältnisse getestet. Die Menge der zu transfizierenden siRNA wurde erhöht. Die Transfektion der Zellen erfolgte mit und ohne fötalem Kälberserum im Transfektionsmedium. Es wurde weiterhin versucht, durch Denaturierung von TmHU vor der Bindung an die siRNA eine definiertere Bindung zu erreichen. Es war jedoch nicht möglich, mit TmHU eine effiziente RNAi und somit eine Inhibition der EGFP-Expression zu erreichen. Ein Beispiel ist in Abbildung 3-23 dargestellt. Hier wurde die dreifache Wiederho-lung der Transfektion getestet. Dazu wurden jeweils 10.000 U-373-MG-Zellen, die stabil EGFP exprimieren, in eine Kavität einer 96-Lochplatte eingestreut. Die Transfektion erfolgte mit jeweils 20 pmol siRNA und einem 5-fach molarem Überschuss von TmHU. Die Versuche wurden in einer Vierfachbestimmung durchgeführt. Die Transfektionen 1 und 2 erfolgten an zwei direkt aufeinanderfolgenden Tagen. Am dritten Tag wurden die Zellen 1:2 geteilt und am vierten Tag erneut transfiziert. Die Messung der Fluoreszenzintensität erfolgte direkt im Inkubator für 120 Stunden. In dem Diagramm ist die Summe der einzelnen Exponenten b der Gleichung y = aebx nach exponentieller Regression der einzelnen Kurvenabschnitte dar-gestellt. Aus dem Diagramm ist ersichtlich, dass nur durch die Transfektion von EGFP-siRNA mit Lipofectamine 2000 eine deutliche Reduktion der EGFP-Expression erreicht wer-den kann. Die entsprechende Non-silencing-Kontrolle, also die Transfektion einer siRNA, die keinen Silencing-Effekt auslösen soll, ist genauso hoch, wie die unbehandelte Kontrolle. Ei-ne Reduktion der EGFP-Expression konnte durch die Transfektion mit TmHU nicht nach-gewiesen werden, obwohl die Transfektion, also das Einbringen der Nukleinsäuren in die Zellen, sehr effizient erfolgt (siehe Absatz 3.6.3).

82 Ergebnisse

Exponentielle Auswertung nach 3-facher Transfektion von U-373-MG-EGFP-Zellen

0,720,64

0,72

0,14

0,670,62

0,71

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

unbe

hand

elte

Zelle

n

EGFP

-siR

NA

Non

-sile

ncin

g-si

RN

A

EGFP

-siR

NA

+Li

pofe

ctam

ine

2000

Non

-sile

ncin

g-si

RN

A +

Lipo

fect

amin

e20

00

EGFP

-siR

NA

+ Tm

HU

Non

-sile

ncin

g-si

RN

A +

TmH

U

b au

s y=

aebx

Abbildung 3-23: Dreifache Wiederholung der Transfektion von U-373-MG-EGFP-Zellen mit 20 pmol EGFP-siRNA und 100 pmol TmHU. Die Messung der Fluores-zenzintensität erfolgte direkt im Inkubator.

Um die bisher erhaltenen Ergebnisse mit einer weiteren Methode zu verifizieren, wurden die Zellen nach zweifacher Transfektion mittels Western-Blot analysiert. Dazu wurden 150.000 Zellen pro Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Die Zellen wurden mit 200 pmol siRNA in einem Volumen von 500 µl Medium transfiziert. Nach 24 h erfolgte eine weitere Transfek-tion nach dem gleichen Schema und nach insgesamt 48 h wurden die Zellen für den Wes-tern-Blot lysiert und aufgearbeitet. Für die Quantifizierung der einzelnen Bandenintensitä-ten auf dem Blot wurde dieser nach der Detektion von EGFP gestrippt und Aktin als Refe-renzprotein detektiert. Für die Auswertung wurde dann der Quotient aus der Bandeninten-sität von EGFP und der entsprechenden Bandenintensität von Aktin gebildet. Das Ergebnis ist am Beispiel der U-373-MG-EGFP-Zelllinie in der Abbildung 3-24 dargestellt. In allen Ver-suchen ist die Menge von Aktin ähnlich hoch, d. h. dass Aktin durchaus als House Keeping-Protein verwendet werden kann und dass der RNAi-Effekt spezifisch gegen EGFP gerichtet ist. Der Quotient der unbehandelten Kontrolle wurde auf 100 % festgelegt und die anderen Werte wurden darauf bezogen. Für die Transfektion der EGFP-siRNA mit Lipofectamine 2000 ist eine deutliche Reduktion um 75 % der Menge von EGFP zu detektieren. Wird die siRNA mit TmHU transfiziert kann keine Reduktion beobachtet werden. Eine Ursache wäre, dass die Komplexe aus TmHU und siRNA, wie bereits gezeigt, in das Innere der Zellen ge-langen, dort aber abgebaut werden, so dass die siRNA nicht mehr effizient wirken kann. Weiterhin fällt auf, dass der RNAi-Effekt durch die gleichzeitige Transfektion der siRNA mit TmHU und Lipofectamine 2000 im Gegensatz zur Transfektion mit Lipofectamine 2000 al-lein verstärkt wird. Hier kann eine Reduktion um 87 % des EGFP-Proteins detektiert werden. Dieser Effekt wurde wiederholt beobachtet. Möglicherweise erfolgt die Aufnahme der liposo-malen Komplexe über einen anderen Mechanismus, wie für die der Komplexe aus RNA und TmHU. Wäre dies der Fall, könnte das der Grund für die Verstärkung der Lipofektion sein. Wenn die siRNA durch TmHU vor Abbau geschützt wird, gelangt während der Lipofektion mehr intakte siRNA in das Innere der Zellen. Für MCF-7-EGFP wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, die an dieser Stelle aber nicht aufgeführt werden sollen.

Ergebnisse 83

EGFP-Western-Blot nach Transfektion von U-373-MG EGFP-Zellen

100,

00

98,8

1 121,

14 140,

78

100,

95

24,1

4

13,0

9

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

unbe

hand

elte

Kont

rolle

EGFP

-siR

NA

Lipo

fect

amin

e20

00 TmH

U

EGFP

-siR

NA

+Li

pofe

ctam

ine

2000

EGFP

-siR

NA

+Tm

HU

EGFP

-siR

NA

+Li

pofe

ctam

ine

2000

+ T

mH

U

Rel

ativ

e Ba

nden

inte

nsitä

t [%

]

EGFP

Actin

Abbildung 3-24: Western-Blot-Analyse von U-373-MG-EGFP-Zellen nach zweifa-cher Transfektion U-373-MG-Zellen mit EGFP-siRNA, Lipofectamine 2000 und TmHU und Inkubation für insgesamt 48 h.

Die hier aufgeführten Versuche sollen nur Beispiele für die unterschiedlichen Experimente mit siRNA und TmHU sein. Verschiedene Bedingungen wurden getestet, die funktionelle Transfektion, also die Detektion von RNAi, durch TmHU zu verbessern.

1. Es wurden höhere Mengen siRNA in die Transfektionsversuche eingesetzt. 2. TmHU wurde vor der Inkubation mit der siRNA denaturiert, um eine spezifischere

Bindung zu erhalten. 3. Es wurden längere Inkubationszeiten getestet, in denen die Zellen wegen zu hoher

Dichten passagiert wurden. In keinem der Versuche konnte ein signifikanter RNAi-Effekt nach der Transfektion durch TmHU beobachtet werden und das obwohl die siRNA durch TmHU sehr effizient in die Zel-len gebracht werden.

3.7.3 Untersuchung der Zytotoxizität von TmHU im Vergleich mit Lipofec-tamine 2000

3.7.3.1 LDH-Test

Da TmHU als proteinogenes Gentransfersystem eingesetzt werden soll, wurde mit zwei ver-schiedenen Testverfahren die Zytotoxizität von TmHU untersucht. Die Zytotoxizität wurde zum einen mit dem LDH-Test (Cytotoxicity Detection Kit, Fa. Roche Applied Science) untersucht. Der Test wurde, wie unter Abschnitt 2.4.16.1 beschrieben, durchgeführt. Je höher die LDH-Aktivität in den entsprechenden Ansätzen ist, desto höher ist der zytotoxische Effekt der untersuchten Substanz. Es wurden die Zelllinien MCF-7 und U-373-MG getestet. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen TmHU, einer Non-silencing-siRNA und Lipofectamine 2000 für 24 und 48 h inkubiert. Die Konzentrationen von TmHU lagen zwischen 0,5 und 7,5 µM, wobei TmHU mit einer Konzentration von 5 µM in die jeweiligen Transfektionsversuche eingesetzt worden ist. Die Konzentration der Non-silencing-siRNA lag bei 200 nM und Lipofectamine 2000 wurde in einer Endkonzentration von 1,5 µl/ml verwendet. Die Konzentrationen der siRNA und von Lipofectamine 2000 ent-sprechen denen, die in den entsprechenden Transfektionsversuchen mit humanen Zellen

84 Ergebnisse

verwendet worden sind. Die Versuche wurden in einer Vierfachbestimmung durchgeführt. Von den vier Messergebnissen pro Versuch und Zeitpunkt wurde anschließend der Median gebildet und in einem Diagramm gegeneinander aufgetragen. Der Fehler stellt die Abwei-chung des nächsten Messpunktes vom Median dar. Die Ergebnisse des LDH-Tests sind in Abbildung 3-25 und Abbildung 3-26 dargestellt.

LDH-Test MCF-7-Zellen

12

27

100

13

28 31 28 24

45

20

100

7981212989

33

23 21

0

20

40

60

80

100

120

unbe

hand

elte

Zel

len

0,5

µM T

mH

U

1 µM

Tm

HU

2 µM

Tm

HU

4 µM

Tm

HU

5 µM

Tm

HU

7,5

µM T

mH

U

Non

-sil.

-siR

NA

Non

-sil.

-siR

NA

+Li

pofe

ctam

ine

2000

Non

-sil.

-siR

NA

+ T

mH

U

lysi

erte

Zel

len

LDH

-Akt

ivitä

t [%

]

24 h Inkubation48 h Inkubation

Abbildung 3-25: LDH-Test mit MCF-7-Zellen nach 24- und 48-stündiger Inkubati-on mit TmHU.

LDH-Test U-373-MG-Zellen

14

30

100

33

5772

61 58 64 62 66

100

18 14 16

4026 20 20 14

62

40

0

20

40

60

80

100

120

unbe

hand

elte

Zel

len

0,5

µM T

mH

U

1 µM

Tm

HU

2 µM

Tm

HU

4 µM

Tm

HU

5 µM

Tm

HU

7,5

µM T

mH

U

Non

-sil.

-siR

NA

Non

-sil.

-siR

NA

+ L

ipof

ecta

min

e20

00

Non

-sil.

-siR

NA

+ T

mH

U

lysi

erte

Zel

len

LDH

-Akt

ivitä

t [%

]

24 h Inkubation

48 h Inkubation

Abbildung 3-26: LDH-Test mit U-373-MG-Zellen nach 24- und 48-stündiger Inku-bation mit TmHU.

Man kann feststellen, dass nach 24-stündiger Inkubation der MCF-7-Zellen mit den ent-sprechenden Reagenzien keine zytotoxischen Effekte detektierbar sind (siehe Abbildung 3-25). Erst nach einer Inkubationsdauer von 48 h kann eine leicht erhöhte LDH-Aktivität von TmHU bei höheren Konzentrationen detektiert werden. Auch die Konzentration von 5 µM TmHU, die häufig in Transfektionsansätzen zu finden ist, ist bereits leicht zytotoxisch. Ebenfalls weisen die Inkubationen mit der siRNA, Lipofectamine 2000 oder TmHU erhöhte LDH-Aktivitäten auf. Die U-373-MG-Zellen reagieren in diesem Fall noch sensitiver auf die

Ergebnisse 85

Inkubation mit TmHU als die MCF-7-Zellen (siehe Abbildung 3-26). Hier ist bereits nach 24 Stunden eine erhöhte LDH-Aktivität mit höheren Mengen TmHU detektierbar. Nach 48 Stunden ist dieser Effekt wesentlich stärker ausgeprägt. Hier ist ab einer Konzentration von 1 µM TmHU eine stark erhöhte LDH-Aktivität detektierbar. Auch für diese Zelllinie sind die Inkubationen mit siRNA in der Kombination mit TmHU oder Lipofectamine 2000 zytotoxisch. Zusammenfassend kann also ein zytotoxischer Einfluss von TmHU auf die untersuchten Zellen festgestellt werden.

3.7.3.2 MTT-Test

Zur Verifikation des zytotoxischen Einflusses von TmHU auf humane Zellen wurden diese mit einem MTT-Test, wie er unter Abschnitt 2.4.16.2 beschrieben ist, untersucht. Dabei er-folgte gleichzeitig ein Vergleich mit dem Lipofektionsagens Lipofectamine 2000. Da die U-373-MG-Zellen sensitiver auf TmHU reagieren als MCF-7-Zellen, wird auf diese Zelllinie im Folgendem näher eingegangen. Für den Versuch wurden jeweils 10.000 Zellen pro Kavität einer 96-Loch-Platte eingestreut. Am folgenden Tag erfolgte die Inkubation mit TmHU oder Lipofectamine 2000 für 24 Stunden. Jeder Versuchsansatz wurde in einer Dreifachbestim-mung durchgeführt. Das Ergebnis des MTT-Test der U-373-MG-Zellen nach Inkubation mit TmHU oder Lipofectamine 2000 ist in Abbildung 3-27 dargestellt. Die Absorption bei 550 nm ist proportional zu der Zahl der vitalen Zellen in der jeweiligen Kavität. Die Konzentrati-onen, die in den Transfektionsexperimenten verwendet werden, sind durch hellere Balken im Diagramm dargestellt.

MTT-Test U-373-MG-Zellen

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

unbe

hand

elte

Zel

len

0.31

25 µ

M T

mH

U

0.62

5 µM

Tm

HU

1.25

µM

Tm

HU

2.5

µM T

mH

U

5 µM

Tm

HU

10 µ

M T

mH

U

20 µ

M T

mH

U

40 µ

M T

mH

U

80 µ

M T

mH

U

160

µM T

mH

U

0.31

25 µ

/ml L

ipof

ecta

min

e

0.62

5 µl

/ml L

ipof

ecta

min

e

1.25

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l Lip

ofec

tam

ine

2.5

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l Lip

ofec

tam

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/ml L

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ecta

min

e

10 µ

l/ml L

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ecta

min

e

20 µ

/l/m

l Lip

ofec

tam

ine

40 µ

l/ml L

ipof

ecta

min

e

80 µ

l/ml L

ipof

ecta

min

e

160

µl/m

l Lip

ofec

tam

ine

Zellz

ahl

Abbildung 3-27: MTT-Test von U-373-MG-Zellen nach Inkubation mit TmHU und Lipofectamine 2000.

Vergleicht man die Ansätze nach Inkubation mit TmHU mit den unbehandelten Zellen, so wird ersichtlich, dass mit steigender Konzentration der zytotoxische Effekt von TmHU zu-nimmt. Je höher die Konzentration von TmHU im Überstand war, desto geringer ist die Zahl der vitalen Zellen im jeweiligen Ansatz. Ab einer Konzentration von 20 µM TmHU sind kaum noch Zellen detektierbar. Auch die Konzentration von 5 µM TmHU, die für die Transfektion von siRNA verwendet wird, ist bereits zytototoxisch. Für Lipofectamine 2000 ist ein ähnli-

86 Ergebnisse

cher Effekt zu beobachten. Je mehr Lipofectamine 2000 auf die Zellen gegeben wird, desto weniger vitale Zellen sind detektierbar. Allerdings hat die Konzentration von 5 µl/ml noch keinen Einfluss auf die Zahl der vitalen Zellen. Die für die Transfektion von siRNA verwen-dete Konzentration von Lipofectamine 2000 ist also noch nicht zytotoxisch. Es konnte also auch mit einer weiteren Methode bestätigt werden, dass durch den Einfluss von TmHU die Zahl der vitalen Zellen während der Transfektion reduziert wird. Da mit dem MTT-Test die Zahl der vitalen Zellen bestimmt wird, nicht aber die Zahl der apoptotischen Zellen, kann nicht ausgeschlossen werden, dass durch TmHU oder Lipofectamine 2000 nur das Vermö-gen der Zellen, sich zu teilen inhibiert wird, dass also die Zahl der Zellen nicht auf Grund zytotoxischer Einflüsse der Reagenzien reduziert ist. Da durch den LDH-Test aber eindeutig Zytotoxizität nachgewiesen wird, wäre es möglich, dass sich zytotoxische und inhibitorische Effekte, die die Zellteilung betreffen, überlagern.

3.8 Transfektionen mit Calcium

3.8.1 Transfektion von humanen Zellen

Da trotz hoher Transfektionsraten kein effizienter RNAi-Effekt durch siRNA und TmHU er-reicht werden konnte, wurde Calciumchlorid für die nachfolgenden Transfektionen verwen-det. Die Unterstützung der Präzipitatbildung durch Calciumchlorid ist schon in früheren Arbeiten für eine funktionelle Transfektion mit TmHU verwendet worden338. Dabei erfolgt ei-ne Präzipitation der DNA. Kopräzipitate aus „Calciumphosphat“ (Calciumhydroxyapatit) und DNA werden schon seit langem für den Transfer genetischer Informationen in eukaryonti-sche Zellkulturen verwendet209,210. Diese Methode hat sich zu einer der Haupttechniken für den DNA-Transfer entwickelt211-213. Dabei gelangt DNA als Teil eines Komplexes mit Calci-umorthophosphat in den Nukleus. Die Konzentration der DNA auf der Zelloberfläche wird durch Präzipitation erhöht. In diesen Komplexen wird die DNA vor dem Verdau durch Se-rumnukleasen geschützt. Durch Calciumphosphat wird die Phagozytose der zu transfizie-renden Zellen induziert, wodurch die Komplexe in die Zellen gelangen und auch hier erfolgt ein Schutz der DNA vor dem Verdau durch intrazelluläre Nukleasen. Die Transfektionen mit Calcium wurden in dieser Arbeit nicht mit DNA durchgeführt, sondern es wurden siRNA verwendet, deren Sequenz spezifischen gegen die mRNA von EGFP gerichtet ist. Durch eine effiziente Transfektion kann damit die EGFP-Expression in Zellen, die stabil EGFP exprimie-ren, inhibiert werden. Die Transfektionen mit Calcium wurden, wie unter Abschnitt 2.4.7 beschrieben, durchgeführt. Das Ergebnis einer Calciumphosphattransfektion ist in Abbildung 3-28 dargestellt. Hier ist die Messung der Fluoreszenzintensität über die Zeit dargestellt. Hierfür wurden MCF-7-EGFP-Zellen in einer 96-Lochplatte an zwei aufeinander folgenden Tagen transfiziert. Am dritten Tag wurden die Zellen passagiert, dabei 1:2 verdünnt und am darauf folgenden Tag ein drittes Mal transfiziert. Die Messung der Fluoreszenzintensität erfolgte mit einem Fluo-reszenzplattenreader, der direkt im Inkubator installiert worden ist, über insgesamt 150 Stunden. Aus dem Diagramm ist ersichtlich, dass Calciumchlorid allein bereits einen Ein-fluss auf die Transfektion der siRNA hat. Es ist bereits eine Reduktion des EGFP-Signals in Abhängigkeit von der Calciumchloridkonzentration detektierbar. Je höher die Calciumchlo-ridkonzentration ist, um so geringer ist die EGFP-Fluoreszenz. Wird die siRNA zusammen mit TmHU und Calciumchlorid transfiziert, so wird dieser Effekt verstärkt. Hier ist der RNAi-Effekt sogar stärker als nach der Transfektion mit Lipofectamine 2000. TmHU und Calcium üben also einen synergistischen Effekt auf die Transfektionsraten von siRNA aus.

Ergebnisse 87

Des Weiteren war auffällig, dass in den Ansätzen mit TmHU, Calciumchlorid und siRNA lichtmikroskopisch ein Präzipitat zu beobachten war, dass sich auch nach mehrmaligem Waschen der Zellen nicht entfernen ließ. Dieses Präzipitat ist in der Abbildung 3-29 mit MCF-7-EGFP-Zellen dargestellt. Je höher die Konzentration von Calciumchlorid im Medium ist, desto dichter ist auch das Präzipitat, dass auf den Zellen liegt. Bei diesem Präzipitat handelt es sich wahrscheinlich um die Komplexe aus Calciumorthophosphat, TmHU und der Nukleinsäure. Die beschriebenen Ergebnisse wurden ebenfalls mit Western-Blot analysiert. Hier wurden die Zellen, in diesem Fall U-373-MG-EGFP-Zellen, in 24-Loch-Platten kultiviert und dreimal mit EGFP-siRNA transfiziert. Anschließend erfolgte die Detektion der exprimierten EGFP-Proteinmenge. Anschließend wurde der Blot gestrippt und es erfolgte die Detektion von Ak-tin für die Quantifizierung der Bandenintensität. In Abbildung 3-30 ist das Ergebnis der Quantifizierung der Bandenintensitäten von EGFP mit Aktin als Referenzprotein dargestellt. Aus der Abbildung geht hervor, dass die Reduktion der EGFP-Expression durch die Trans-fektion von siRNA mit TmHU und Calciumchlorid erreicht werden kann. Die Menge des EGFP-Proteins ist in den U-373-MG-EGFP-Zellen bis zu 88 % reduziert. Diese Reduktion des EGFP-Proteins liegt somit im gleichen Größenbereich, wie nach der Transfektion durch Lipofektion. Hier ist das EGFP-Protein um 83 % reduziert. Ein Effekt von Calciumchlorid al-lein auf die Transfektionsraten von siRNA ist nicht detektierbar. Auch hier kann ein synergistischer Effekt von Calciumchlorid und TmHU nachgewiesen werden. Weiterhin fällt auf, dass die Intensität der Aktin-Banden in den Ansätzen mit Calciumchlorid und TmHU reduziert ist, was ein Hinweis darauf sein könnte, dass die Komplexe aus siRNA, Calciu-morthophosphat und TmHU einen negativen Einfluss auf die Zellvitalität haben.

Transfektion von MCF-7-Zellen mit Calcium

0,94

0,35

0,95 0,97

0,25

0,89

0,23

0,70

0,18

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

unbe

hand

elte

Kon

trolle

EG

FP-s

iRN

A +

Lipo

fect

amin

e20

00

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U

EG

FP-s

iRN

A +

1.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

1,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

2.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

2,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

3.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

3,0

mM

CaC

l2

Sum

me

von

b au

s y=

aebx

Abbildung 3-28: Messung der Fluoreszenzintensität von MCF-7-EGFP-Zellen nach dreifacher Transfektion mit EGFP-siRNA, TmHU und Calciumchlorid.

88 Ergebnisse

Unbehandelte Zellen

siRNA + TmHU + 2 mM CaCl2 siRNA + TmHU + 3 mM CaCl2

siRNA + TmHU + 1 mM CaCl2

A B

C D

Abbildung 3-29: Lichtmikroskopisch sichtbares Präzipitat aus Calciumorthophos-phat, TmHU und der Nukleinsäure. (A) unbehandelte Zellen, (B) Inkubation der Zellen mit siRNA, TmHU und 1 mM Calciumchlorid, (C) Inkubation der Zellen mit siRNA, TmHU und 2 mM Calciumchlorid, (D) Inkubation der Zellen mit siRNA, TmHU und 3 mM Calciumchlorid.

Transfektion von U-373-MG EGFP-Zellen mit Calcium

13,8612,2417,11

134,96

27,38

97,2179,8773,09

100,00

0

50

100

150

200

Kon

trolle

EG

FP-s

iRN

A +

Lipo

fect

amin

e20

00

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U

EG

FP-s

iRN

A +

1.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

1,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

2.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

2,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

3.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A +

TmH

U +

3,0

mM

CaC

l2

Rel

ativ

e Ba

nden

inte

nsitä

t [%

]

EGFP

Actin

Abbildung 3-30: EGFP- und Aktin-Western-Blot auf U-373-MG-EGFP-Zellen nach dreimaliger Transfektion von 40 pmol siRNA und 200 pmol TmHU mit Calcium-chlorid.

3.8.2 Zytotoxizität von Calciumchlorid

Da bereits im Western-Blot ein Einfluss von Calciumchlorid auf die Zellviabilität vermutet wurde, wurden die Zellen einem LDH-Test unterzogen. Dieser Test wurde, wie unter Ab-schnitt 2.4.16.1 beschrieben, durchgeführt, wobei die Zelllinien MCF-7 und U-373-MG un-tersucht worden sind. Es wurden Calciumchloridkonzentrationen von 1 bis 3 mM getestet.

Ergebnisse 89

Diese Konzentrationen entsprechen denen, die in die Transfektionsversuche mit siRNA ein-gesetzt worden sind. Die siRNA lag in einer Endkonzentration von 200 nM und TmHU in ei-ner Endkonzentration von 1 µM vor. Die Inkubation mit den entsprechenden Reagenzien er-folgte für 48 Stunden. Anschließend wurde die LDH-Aktivität in den einzelnen Ansätzen be-stimmt. Jeder Versuch wurde in einer Vierfachbestimmung durchgeführt. Die Ergebnisse für den Test der MCF-7-Zellen sind in der Abbildung 3-31 und für den Test der U-373-MG-Zellen in der Abbildung 3-32 dargestellt.

LDH-Test MCF-7-Zellen

4 5

100

4 4 3 2 4 5 5 5

0

20

40

60

80

100

120

unbe

hand

elte

Zelle

n

EG

FP-s

iRN

A

3 m

M C

aCl2

EG

FP-s

iRN

A+

TmH

U

EG

FP-s

iRN

A

+ 1.

0 m

MC

aCl2

EG

FP-s

iRN

A+

TmH

U +

1,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A+

2.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A+

TmH

U +

2,0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A+

3.0

mM

CaC

l2

EG

FP-s

iRN

A+

TmH

U +

3,0

mM

CaC

l2

lysi

erte

Zel

len

LDH

-Akt

ivitä

t [%

]

Abbildung 3-31: LDH-Test von MCF-7-Zellen nach 48-stündiger Inkubation mit Calciumchlorid.

LDH-Test U-373-MG-Zellen

19

34

100

342727

2118191822

0

20

40

60

80

100

120

unbe

hand

elte

Zelle

n

EGFP

-siR

NA

3 m

M C

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ Tm

HU

EGFP

-siR

NA

+ 1.

0 m

MC

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ Tm

HU

+ 1

,0m

M C

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ 2.

0 m

MC

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ Tm

HU

+ 2

,0m

M C

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ 3.

0 m

MC

aCl2

EGFP

-siR

NA

+ Tm

HU

+ 3

,0m

M C

aCl2

lysi

erte

Zel

len

LDH

-Akt

ivitä

t [%

]

Abbildung 3-32: LDH-Test von U-373-MG-Zellen nach 48-stündiger Inkubation mit Calciumchlorid.

Für die MCF-7-Zellen kann kein toxischer Effekt von Calciumchlorid allein oder zusammen mit siRNA mit oder ohne TmHU festgestellt werden, wenn man die Zellen mit der unbehan-delten Kontrolle und den lysierten Zellen vergleicht. Die lysierten Zellen sind Zellen, die mit Tween-20 behandelt worden sind und stellen die maximale LDH-Aktivität dar, die bei voll-ständiger Lyse der Zellen erreicht werden kann. Trotz der sichtbaren Präzipitate, die entste-hen, wenn die Inkubation mit TmHU und Calciumchlorid erfolgt, ist auch bei höheren Kon-zentrationen von Calciumchlorid keine erhöhte LDH-Aktivität detektierbar. Die U-373-MG-

90 Ergebnisse

Zellen reagieren etwas sensitiver auf die Inkubation mit Calciumchlorid. Hier kann ab einer Konzentration von 2 mM CaCl2 eine leicht erhöhte LDH-Aktivität detektiert werden, unab-hängig davon, ob die Inkubation zusammen mit siRNA oder TmHU erfolgt. Für die Zelllinie U-373-MG ist Calciumchlorid ab einer Konzentration von 2 mM leicht toxisch.

3.9 Untersuchung des Aufnahmemechanismus von TmHU und TmHU-Nukleinsäure-Komplexen durch Inhibition der En-dozytose

Da TmHU siRNA mit hoher Effizienz in humane Zellen transferieren kann, aber kein funkti-oneller RNAi-Effekt detektiert werden konnte, liegt die Vermutung nahe, dass die Komplexe aus siRNA und TmHU endozytotisch aufgenommen und anschließend in den Endosomen abgebaut werden. Der Aufnahmemechanismus von TmHU soll im Folgenden näher unter-sucht werden. Durch Zusatz von Cytochalasin D kann die Endozytose von eukaryontischen Zellen inhibiert werden. Hierbei handelt es sich um ein membrangängiges Toxin aus Zygosporium mansonii, das die Depolymerisierung von F-Aktin induziert, indem es die Addition von G-Aktin an das Plus-Ende von Aktinfilamenten verhindert382. Durch die Inhibition aktinabhängiger Polyme-risationsprozesse wird durch Cytochalasin D spezifisch die Phagozytose von Zellen ge-hemmt383,384. Rezeptorgesteuerte Aufnahmeprozesse werden durch den Einsatz von Cyto-chalasin D nicht beeinflusst385,386. Die Zellen wurden eine Stunde vor Versuchsbeginn mit Cytochalasin D in Konzentrationen bis zu 15 µg/µl inkubiert. Anschließend wurden die entsprechenden Versuchsansätze in das Medium gegeben, ohne jedoch den Inhibitor zu entfernen. Als Kontrolle für die Inhibition der Endozytose wurde die Aufnahme von Dextran verwendet. Fluoreszenz-markierte Dextrane sind hilfreich zur Untersuchung der Aufnahme exogener Materialien durch Endo-zytose und dienen als Marker für Pinozytose und Phagozytose387,388. Für diese Untersu-chungen wurde ein Dextran mit einer Molekularmasse von 10 kDa verwendet, das mit Rho-damin-Grün markiert worden ist. Es wurden 20 µg/ml Rhodamin-Grün-Dextran und 10 µg/ml Alexa-Fluor-488-TmHU in den Überstand von U-373-MG-Zellen gegeben. Die Zellen wurden für 24 h im Inkubator belassen, anschließend mit PBS gewaschen und für die FACS-Analyse vorbereitet. Das Ergebnis der Messung ist in Abbildung 3-33 dargestellt. Die Auswertung der durchflusszytometrischen Daten erfolgte in diesem Fall über einen Histogramm-Plot, in dem die Verschiebung des Mean-Wertes (Mittelwert der gezählten Zel-len bei entsprechenden Fluoreszenz-Intensitäten) dargestellt ist. Die Verschiebung des Mean wurde dann in Diagrammen gegeneinander aufgetragen. Die unterschiedlichen Mean-Werte bei der Transfektion von Dextran (Abbildung 3-33, A) bzw. TmHU (Abbildung 3-33, B) kom-men durch die unterschiedlich intensiven Markierungen zustande. So ist die Markierung von Dextran mit Rhodamin-Grün von wesentlich geringerer Intensität als die Alexa-Fluor-488-Markierung von TmHU. Es ist in beiden Fällen, sowohl bei der Aufnahme von Dextran als auch von TmHU, eine deutliche Verschiebung der Fluoreszenzintensitäten in Richtung geringerer Fluoreszenz bei Inkubation der Zellen mit Cytochalasin D erkennbar. Das bedeu-tet, dass TmHU zumindest zum Teil über den Mechanismus der Endozytose aufgenommen wird und dann in den Endosomen lokalisiert ist. Auch die Komplexe von siRNA und TmHU werden über diesen Mechanismus in die Zellen aufgenommen (Daten nicht gezeigt). Das könnte zu einem Abbau der Komplexe aus TmHU und siRNA führen, wodurch eine funktio-nelle RNAi nicht mehr möglich wäre. Bei Einsatz von 20 mg/ml Cytochalasin D (hier nicht dargestellt) war eine weitere Steigerung des inhibitorischen Effektes nicht mehr möglich.

Ergebnisse 91

Auch in dem Kontrollexperiment mit Fluoreszenz-markiertem Dextran konnte keine voll-ständige Inhibition der Endozytose erreicht werden (Vergleich mit Kontrolle ohne Inkubation mit Dextran). Dadurch kann nicht ausgeschlossen werden, dass TmHU zusätzlich noch ü-ber einen weiteren Mechanismus die Zellmembran passieren kann.

A: Inkubation mit Dextran B: Inkubation mit TmHUKontrolle

0 µg/ml CytD

5 µg/ml CytD

10 µg/ml CytD

Kontrolle

0 µg/ml CytD

5 µg/ml CytD

10 µg/ml CytD

Hohe Aufnahme von Dextran

Hohe Aufnahme von TmHU

15 µg/ml CytD 15 µg/ml CytD

Inkubation mit Dextran

1,04

38,3

1

25,8

5

16,7

5

12,1

8

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Kon

trolle

10 µ

g D

extra

n0

µg/m

l Cyt

D

10 µ

g D

extra

n5

µg/m

l Cyt

D

10 µ

g D

extra

n10

µg/

ml

Cyt

D

10 µ

g D

extra

n15

µg/

ml

Cyt

D

Mea

n M

des

Rho

dam

in-G

rün-

Sig

nals

Inkubation mit TmHU

0

704,

4

775,

78

374,

68

263,

8

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Kon

trolle

5 µg

Tm

HU

0µg

/ml C

ytD

5 µg

Tm

HU

5µg

/ml C

ytD

5 µg

Tm

HU

10 µ

g/m

lC

ytD

5 µg

Tm

HU

15 µ

g/m

lC

ytD

Mea

n M

des

Ale

xa-F

luor

-488

-Sig

nals

Abbildung 3-33: Inhibition der Aufnahme von (A) Rhodamin-Grün-markiertem Dextran (MG 10 kDa) und (B) Alexa-Fluor-488-markiertem TmHU durch die Inku-bation von U-373-MG-Zellen mit Cytochalasin D.

3.10 Transfektionen mit dem Endosomenbrecher Chloroquin In den vorangegangenen Abschnitten wurde nachgewiesen, dass TmHU in der Lage ist, RNA in Zellen zu transfizieren. Es wurde aber auch gezeigt, dass die Aufnahme der RNA-TmHU-Komplexe endozytotisch erfolgt, was zu einem Abbau der Komplexe in den Endosomen füh-ren kann. Um den endosomalen Abbau zu umgehen und ein Entlassen der Komplexe in das Zytoplasma zu fördern, wurde in den nachstehenden Untersuchungen mit dem Endoso-menbrecher Chloroquin gearbeitet. Das Amin Chloroquin ist ein acidotrophisches Reagens389, das häufig zur Transfektion von Nukleinsäuren benutzt wird. Es führt zu einem Ausbruch der transfizierten Materialien aus den Endosomen und steigert dadurch die therapeutischen Effekte nicht-viraler Gentrans-fers390-393. Die Struktur von Chloroquin ist in Abbildung 3-34 dargestellt. Es handelt sich hierbei um eine schwache Base, die innerhalb von Sekunden in Zellen eindringt und sich in den sauren Zellorganellen, wie Lysosomen und Endosomen, anreichert. Auf Grund der An-reicherung in den Zellen, werden Vakuolen sichtbar. Die Akkumulation der Base Chloro-quin führt zu einer Inhibition der lysosomalen Enzyme, da diese nur bei einem sauren pH

92 Ergebnisse

zwischen 4 und 5 aktiv sind. Weiterhin inhibiert Chloroquin die Fusion von Endosomen und Lysosomen, wodurch verhindert wird, dass die aufgenommenen Proteine oder ähnliche Ma-terialien abgebaut werden394-396. Die Anreicherung von Chloroquin in den intrazellulären Vesikeln induziert ein osmotisches Anschwellen der Endosomen, wodurch diese destabili-siert und die internalisierten Nukleinsäuren in das Zytoplasma entlassen werden. Chloro-quin vermittelt nicht die Transfektion, also das Einbringen von Nukleinsäuren in die Zellen. Chloroquin weist aber auch toxische Effekte in den behandelten Zellen auf. Diese Effekte sind linear abhängig von der Konzentration und der Dauer der Exposition. Weiterhin inhi-biert es die zelluläre Proteinsynthese und verursacht den Abbau verschiedener zellulärer Enzyme395-397.

NCl

NH CH

CH3

CH2 CH2 CH2 CH2 N

CH2 CH3

CH2 CH3

Abbildung 3-34: Struktur von Chloroquin

3.10.1 Etablierung einer Positivkontrolle für die Transfektion von pEGFP-C3

In den folgenden Experimenten wurde ein anderes Detektionssystem angewandt. Es wurde nicht mehr die Inhibition der EGFP-Expression durch RNAi detektiert, sondern die Expres-sion von EGFP nach der Transfektion des Plasmids pEGFP-C3 (Fa. BD Biosiences, siehe Abbildung 7-8). Das Plasmid wird im Folgenden nur pEGFP bezeichnet. Die Zahl der fluo-reszierenden Zellen wurde vorerst unter dem Fluoreszenzmikroskop in einer Übersicht be-trachtet und anschließend mittels FACS-Analyse genau bestimmt. Für die Untersuchung verschiedener endosomolytischer Substanzen wurden jeweils 200.000 U-373-MG-Zellen in eine Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen mit jeweils 0,5 µg (das entspricht 161 fmol) Plasmid pEGFP-C3 und 2.000 pmol TmHU in einem Endvolumen von 500 µl serumfreien Opti-MEM-Medium transfiziert. Das entspricht einem 6750-fachem Überschuss im Verhältnis zum Plasmid, wobei theoretisch alle 1,4 Basenpaare ein TmHU-Dimer binden könnte. Da die Bindungslänge von TmHU aber 10 bis 11 bp be-trägt, liegt TmHU in hohem Überschuss vor, wodurch eine Absättigung des gesamten Plas-mids erfolgen müsste. Als Vergleichssystem wurde die Transfektion von pEGFP-C3 mit Lipo-fectamine 2000 eingesetzt. Hier wurde die gleiche Menge Plasmid mit 2,5 µl des Lipofektion-sagens ebenfalls in einem Endvolumen von ebenfalls 500 µl serumfreien Opti-MEM-Medium auf die Zellen gegeben. Nach 4-stündiger Inkubation der Zellen erfolgte ein Zusatz vom 1 ml Normalmedium mit 10 % FCS. Nach weiteren 20 Stunden Inkubation wurde das Medium komplett gewechselt. Die Analyse der Zellen erfolgte dann nach insgesamt 48 bzw. 72 Stun-den. In Abbildung 3-35 und Abbildung 3-36 sind als Beispiel für alle Experimente mit dem EGFP -Plasmid die Transfektion von Plasmid ohne weitere Zusätze, die Transfektion von Plasmid mit TmHU und die Transfektion mit Lipofectamine 2000 dargestellt.

Ergebnisse 93

pEGFP

pEGFP +Lipofectamine2000

Transmission

EGFP-Expression

Transmission EGFP-Expression

A

BEGFP-Expression

Transmission

C

pEGFP +TmHU

Abbildung 3-35: Darstellung der Kontrollen für die Transfektionen von U-373-MG-Zellen mit dem Plasmid pEGFP nach 48 h Inkubation. (A) Inkubation der Zellen mit pEGFP, (B) Inkubation mit pEGFP und TmHU, (C) Inkubation mit pEGFP und Lipofectamine 2000.

Mit der Transfektion von pEGFP (siehe Abbildung 3-35, A) und pEGFP zusammen mit TmHU (siehe Abbildung 3-35, B) kann keine effiziente Expression erreicht werden. Die Summe der Zellen mit schwacher und hoher EGFP-Fluoreszenz liegt mit unter einem Pro-zent im Bereich der Autofluoreszenz. Das Plasmid ist nicht in der Lage, die Zellmembran zu passieren und in das Zellinnere zu gelangen. Der Komplex aus TmHU und Plasmid wird ü-ber Endozytose aufgenommen und endosomolytisch abgebaut. Auch hier ist keine EGFP-Expression detektierbar. Werden die Zellen mit Lipofectamine 2000 (siehe Abbildung 3-35, C) transfiziert so ist eine deutliche EGFP-Expression zu erkennen. Bei Analyse der Zellen nach der Transfektion des Plasmids mit Lipofectamine 2000 mittels FACS, sind jeweils drei typische Zellpopulationen detektierbar (siehe Abbildung 3-36). Die Zellen ohne EGFP-Expression stellen die Kontrolle für die Autofluoreszenz dar. Die Zellen mit schwacher und hoher EGFP-Expression unterscheiden sich in der Intensität der detek-tierten Fluoreszenz. Vergleicht man EGFP-exprimierende Zellen mit Wildtyp-Zellen, so er-folgt eine deutliche Verschiebung zwischen den einzelnen Zellpopulationen in Richtung hö-herer Fluoreszenzintensität (FL1). Durch FACS-Analyse können nach 48 Stunden 30 % Zel-len mit schwacher und 25 % Zellen mit hoher EGFP-Expression (insgesamt 55 %) detektiert werden. Nach 72 Stunden sind es 38 % und 11 % der Zellen (insgesamt 49 %), die das Pro-tein exprimieren. Diese Ergebnisse stellen nur ein Beispiel dar. Die Zahl der EGFP-exprimierenden Zellen variierte zwischen 25 und 50 % nach der Transfektion mit Lipofecta-mine 2000. Aus der Abbildung 3-35 wird aber auch ersichtlich, dass die Morphologie der Zellen nach Inkubation mit Lipofectamine 2000 stark verändert ist, was darauf hindeutet, das dieses Transfektionsagens eine toxische Wirkung auf die Zellen hat. Diese Versuche wurden mehrmals (n>5) wiederholt, wobei die Zahl der Zellen, die EGFP exprimieren, immer im selben Größenbereich lagen.

94 Ergebnisse

Schwache EGFP-Expression

Hohe EGFP-Expression

pEGFP + TmHU pEGFP + Lipofectamine 2000

Keine EGFP-Expression

Abbildung 3-36: Dot Plot typischer Zellpopulationen bei der durchflusszytometri-schen Analyse EGFP-exprimierender Zellen. Bei Analyse der Zellen mittels FACS sind jeweils drei typische Zellpopulationen detektierbar.

3.10.2 Transfektion von Plasmid-DNA mit dem Endosomenbrecher Chloro-quin und TmHU

Nach der hier dargestellten Untersuchung der Kontrollansätze (Plasmid, Plasmid/TmHU) und der Etablierung der Positivkontrolle (Lipofectamine 2000), wurde Chloroquin in die Transfektionen mit TmHU eingesetzt. Die Transfektionen mit dem Endosomenbrecher Chlo-roquin wurden ebenfalls wie bereits beschrieben durchgeführt. Die Endkonzentration von Chloroquin im Medium betrug 100 µM. Chloroquin verblieb für die gesamte Versuchsdauer auf den Zellen, wobei auch nach jedem Mediumwechsel die Konzentration konstant gehal-ten wurde. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-37 bis Abbildung 3-43 dargestellt. Bei der Transfektion mit Chloroquin fällt auf, dass die Autofluoreszenz der Zellen stark an-steigt (siehe Abbildung 3-37, A und B). Dieser Effekt wird vermutlich dadurch ausgelöst, dass sich Chloroquin in den sauren Zellorganellen anreichert, wodurch Vakuolen entstehen, die zu einer Erhöhung der Autofluoreszenz beitragen. Aus diesem Grund wurden die FACS-Daten dieser Zellen nach einem anderen Verfahren ausgewertet (siehe Abbildung 3-38). Hier wurde die Autofluoreszenz der Wildtyp-Zellen nach Inkubation mit Chloroquin (Abbildung 3-38, B), die in diesem Fall weit über 1 % lag, von den entsprechenden Transfektionsversu-chen mit Chloroquin abgezogen. Nach der Transfektion von pEGFP mit TmHU und Chloro-quin kann ein hoher Anteil an grün fluoreszierenden Zellen unter dem Mikroskop detektiert werden (siehe Abbildung 3-37, C). Durch FACS-Analyse können nach 48 Stunden 14 % der Zellen mit schwacher und 9 % der Zellen mit hoher EGFP-Expression (insgesamt 23 %) de-tektiert werden. Nach 72 Stunden sind es 14 % und 12 % der Zellen (insgesamt 26 %), die das Protein exprimieren. Durch Chloroquin allein wird kein Plasmid in die Zellen transfe-riert. TmHU bindet also die DNA und transferiert sie in das Zellinnere. Aus der Abbildung 3-37 wird aber auch ersichtlich, dass die Morphologie der Zellen nach Inkubation mit Chlo-roquin stark verändert ist, was darauf hindeutet, das dieser Endosomenbrecher eine toxi-sche Wirkung auf die Zellen hat. Diese Versuche wurden mehrmals (n>5) wiederholt, wobei die Zahl der Zellen, die EGFP exprimieren immer im gleichen Größenbereich lagen.

Ergebnisse 95

Chloroquin

pEGFP + Chloroquin

pEGFP + Chloroquin + TmHU

Transmission

Transmission

Transmission

EGFP-Expression

EGFP-Expression

EGFP-Expression

A

B

C

Abbildung 3-37: Transfektion von U-373-MG-Zellen mit Chloroquin nach 48 h In-kubation; (A) Transfektion des Plasmids pEGFP, (B) Transfektion von pEGFP mit Chloroquin, (C) Transfektion von pEGFP mit TmHU und Chloroquin.

A B C A B C

Chloroquin pEGFP + TmHU + Chloroquin

Abbildung 3-38: Darstellung erhöhter Autofluoreszenz durch die Inkubation von U-373-MG-Zellen mit Chloroquin im Dot Plot. (A) Zellen ohne Chloroquin, (B) Zellen mit Chloroquin, (C) Zellen mit EGFP Expression.

96 Ergebnisse

Transfektion mit Chloroquin nach 48 und 72 h Inkubation

0

5

10

15

20

25

30

Chl

oroq

uin

48 h

Chl

oroq

uin

72 h

Chl

oroq

uin

+pE

GFP

48

h

Chl

oroq

uin

+pE

GFP

72

h

Chl

oroq

uin

+pE

GFP

+ T

mH

U48

h

Chl

oroq

uin

+pE

GFP

+ T

mH

U72

h

% d

er Z

elle

n m

it E

GFP

-Sig

nal

hohe EGFP-Expressiongeringe EGFP-Expression

Abbildung 3-39: FACS-Analyse der Transfektionen von U-373-MG-Zellen mit dem Plasmid pEGFP und dem Endosomenbrecher Chloroquin nach 48 h und 72 h In-kubation. Der hellblaue Teil des jeweiligen Balkens im Diagramm stellt den Anteil der Zellen mit schwacher Fluoreszenz dar, der dunkelblaue Teil den Anteil mit ho-her Fluoreszenz.

3.10.3 Sättigung des Plasmids mit TmHU

Nachfolgend wurde untersucht, in wie weit die Transfektionsraten einer konstanten Menge Plasmid pEGFP abhängig von unterschiedlichen Konzentrationen TmHU sind. Dazu wurde jeweils 1 µg Plasmid pEGFP, also 320 fmol, mit ansteigenden Mengen TmHU inkubiert und auf die zu untersuchenden Zellen gegeben. In der Tabelle 3-1 sind die Verhältnisse von Plasmid zu TmHU-Dimer aufgelistet, die getestet worden sind. Dazu wurde berechnet, wie viele TmHU-Dimere theoretisch pro Plasmid (Plasmidlänge beträgt 4700 bp) binden könnten und wie groß der Abstand zwischen den Dimeren wäre. Da die Bindungslänge von TmHU an DNA 10 bis 11 bp beträgt338, können nur maximal 427 bis 470 TmHU-Dimere an ein Plas-mid binden. Die Tabelle soll darstellen, wie groß die entsprechende Sättigung des Plasmids mit TmHU und wie groß die entsprechende Bindungslänge wäre.

Tabelle 3-1: Test verschiedener pEGFP-TmHU-Verhältnisse im Zellversuch mit U-373-MG-Zellen

Verhältnis Plasmid:TmHU-Dimer Bindungslänge [bp] 1: 70 89,33 1: 705 8,93 1: 6715 0,94 1:20145 0,31 1:33575 0,19

Für den Versuch wurden am Vortag 250.000 U-373-MG-Zellen pro Kavität einer 24-Lochplatte eingestreut und am folgenden Tag transfiziert. Nach nur 24 Stunden Inkubation erfolgte die Analyse der Zellen mittels FACS-Messung. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-40 dargestellt. Aus dem Diagramm ist ersichtlich, dass durch Transfektion des Plasmids pEGFP mit TmHU ohne den Zusatz eines Endosomenbrechers keine effiziente EGFP-

Ergebnisse 97

Expression erreicht werden kann. Mit unter 1 % der gemessenen Zellen liegen diese Werte im Bereich der Autofluoreszenz. Die TmHU-DNA-Komplexe werden zwar durch die Zellen in-ternalisiert, dort aber in den Endosomen abgebaut. Wird dem Transfektionsansatz zusätz-lich Chloroquin in einer Konzentration von 100 µM zugesetzt, so steigt die Expression deut-lich auf ca. 3 %. Auf Grund der kurzen Inkubationszeiten von nur 24 h werden hier nur ge-ringe Expressionsraten detektiert (eine Inkubationsdauer von 48 h wäre optimal). Chloro-quin ist notwendig, um die Komplexe von TmHU und Plasmid-DNA aus den Endosomen in das Zytoplasma zu bringen. Weiterhin ist zu erkennen, dass ab einem Verhältnis von 1:6700 die EGFP-Expression nicht mehr signifikant gesteigert werden kann. Höhere Mengen von TmHU führen nicht zu einer erhöhten Transfektionseffizienz. Würde eine gerichtete In-teraktion vorliegen, also alle 10 bis 11 bp ein TmHU-Dimer binden, so müsste das Plasmid ab einem Verhältnis von 1:427 mit TmHU-Dimeren gesättigt sein. Für eine effiziente Trans-fektion scheint jedoch ein noch größerer Überschuss von TmHU notwendig zu sein.

Sättigung des Plasmids mit TmHU

0,43 0,47 0,6 0,54 0,59

1,62

2,49

3,14

3,67 3,52

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

pEG

FP +

Tm

HU

1:7

0

pEG

FP +

Tm

HU

1:7

05

pEG

FP +

Tm

HU

1:6

715

pEG

FP +

Tm

HU

1:2

0145

pEG

FP +

Tm

HU

1:3

3575

pEG

FP +

Tm

HU

1:7

0 +

Chl

oroq

uin

pEG

FP +

Tm

HU

1:7

05 +

Chl

oroq

uin

pEG

FP +

Tm

HU

1:6

715

+ C

hlor

oqui

n

pEG

FP +

Tm

HU

1:2

0145

+ C

hlor

oqui

n

pEG

FP +

Tm

HU

1:3

3575

+ C

hlor

oqui

n

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

Abbildung 3-40: FACS-Analyse nach der Transfektion von U-373-MG-Zellen mit unterschiedlichen Plasmid-TmHU-Verhältnissen

3.10.4 Toxizität von Chloroquin

Da Chloroquin sich in den Endosomen und Lysosomen der Zellen anreichert und zu einer Destabilisierung der Membranen dieser Zellorganellen führt, sollte der Einfluss von Chloro-quin auf die Zellvitalität untersucht werden. Es wurde ein MTT-Test, wie er unter Abschnitt 2.4.16.2 beschrieben ist, durchgeführt. Dazu wurden Zellen der Zelllinie U-373-MG mit Chloroquin in einem Konzentrationsbereich zwischen 3,2 mM und 50 µM für 24 h inkubiert. Jeder Versuch wurde in einer Dreifachbestimmung durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-41 dargestellt. Die Konzentration von 100 µM Chloroquin, die für die Transfektion von siRNA oder Plasmi-den mit TmHU verwendet worden ist, ist durch einen helleren Balken gekennzeichnet. Aus dem Diagramm wird ersichtlich, dass Chloroquin bereits in geringeren Konzentrationen eine zytotoxische Wirkung hat. Bereits ab einer Konzentration von 50 µM Chloroquin ist die Zahl vitaler Zellen stark reduziert. Auch die Konzentration von 100 µM Chloroquin, wie sie für die Transfektionen verwendet wird, ist zytotoxisch. Durch den MTT-Test konnte eine hohe Zyto-

98 Ergebnisse

toxizität von Chloroquin nachgewiesen werden. Chloroquin ist somit nicht unbedingt für ei-ne Anwendung in vivo geeignet.

MTT-Test U-373-MG-Zellen

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

3200

µM

Chl

oroq

uine

1600

µM

Chl

oroq

uine

800

µMC

hlor

oqui

ne

400

µMC

hlor

oqui

ne

200

µMC

hlor

oqui

ne

100

µMC

hlor

oqui

ne

50 µ

MC

hlor

oqui

ne

unbe

hand

elte

Zelle

n

Zellz

ahl

Abbildung 3-41: MTT-Test von U-373-MG-Zellen nach Inkubation mit Chloroquin. Die Konzentration von 100 µM Chloroquin, die für die Transfektion von siRNA oder Plasmiden mit TmHU verwendet wird, ist durch einen helleren Balken gekenn-zeichnet.

3.10.5 Transfektion von humanen Zellen mit EGFP-Plasmiden mit uschiedlicher Lokalisation des Produkts

nter-

Im nachfolgenden Experiment sollte untersucht werden, ob eine unterschiedliche Lokalisa-tion der Produkte, die auf den transfizierten Plasmiden liegen, durch die Transfektion mit TmHU beeinflusst wird. Dazu wurde die Lokalisation des zytoplasmatisch-lokalisierten EGFP mit einer Fusionsvariante von EGFP, dem EGFP-Neprilysin, verglichen. Das Plasmid mit dem Fusionskonstrukt wurde mir vom Institut für Immunologie der Martin-Luther-Universität zur Verfügung gestellt. Neprilysin (auch CD10 oder Neutrale Endopeptidase 24.11) ist eine glyosylierte Zink-Metallopeptidase, die aus 749 Aminosäuren besteht398. Sie besteht aus einer kurzen zytoplasmatischen Domäne, einer hydrophoben Domäne, die das Protein in der Plasmamembran verankert, und einer großen extrazellulären Domäne, die das aktive Zentrum des Enzyms enthält399. Neprilysin spaltet vorrangig Peptide an hydro-phoben Aminosäuren (wie F, L und M)400, wodurch eine Inaktivierung von Neuropeptiden er-folgt. Für die Transfektion wurden jeweils 200.000 U-373-MG-Zellen mit 0,32 pmol Plasmid und 4.400 pmol TmHU-Dimer in einem Endvolumen von 500 µl Medium transfiziert. Zusätzlich wurde dem Versuchsansatz Chloroquin in einer Endkonzentration von 100 µM zugesetzt. Nach 48-stündiger Inkubation der Zellen wurden diese unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet (siehe Abbildung 3-42). Da EGFP keine Transmembran-Domäne besitzt, ist hier die Lokalisation von EGFP nach der Transfektion von pEGFP zytoplasmatisch. Das Protein ist über das gesamte Zytoplasma verteilt. Wird das Plasmid mit dem Fusionskonstrukt pEGFP-Neprilysin in die Zellen transfiziert, so ist hier hauptsächlich eine Akkumulation des Konstrukts in den Membranen detektierbar. Die Ausbildung der Transmembrandomäne von Neprilysin erfolgt somit korrekt. Durch die Transfektion mit TmHU und Chloroquin können also Plasmide mit unterschiedlicher Lokalisation des Expressionsproduktes transfiziert und an der korrekten Position in der Zelle detektiert werden.

Ergebnisse 99

pEGFP pEGFP-Neprilysin

A B Membranlokalisation von EGFP-Neprilysin

ZytoplasmatischeLokalisation von EGFP

Abbildung 3-42: Transfektion von U-373-MG-Zellen verschiedenen EGFP-Plas-miden. (A) Transfektion mit pEGFP (zytoplasmatische Lokalisation); (B) Transfekti-on mit pEGFP-CD-10 (membranständige Lokalisation).

3.10.6 Transfektion von Plasmid pEGFP und siRNA

Da es in den vorangegangenen Versuchen aufgrund eines fehlenden Endosomenbrechers nicht möglich war, durch die Transfektion von siRNA mit TmHU, die Expression von EGFP in stabil exprimierenden EGFP-Zellen zu inhibieren (siehe Absatz 3.7.2), sollte in diesem Experiment untersucht werden, ob es möglich ist, das über das Plasmid pEGFP transient exprimierte EGFP durch RNAi zu reduzieren. Gleichzeitig sollte der Einfluss der Zelldichte auf die Transfektionsraten untersucht werden. Dazu wurden jeweils 100.000, 175.000 und 250.000 U-373-MG-Zellen pro Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Transfiziert wurden die Zellen mit 0,5 µg, also 161 fmol, Plasmid, 75 pmol siRNA und 2 nmol TmHU in einem Endvolumen von 500 µl Medium. Die Chloroquin-Konzentration betrug 100 µM und wurde für die Dauer des Experiments in den entsprechenden Versuchsansätzen auch nach Medi-umwechsel konstant gehalten. In Abbildung 3-43 ist das Ergebnis der fluoreszenzmikrosko-pischen Untersuchung nach 48-stündiger Inkubationsdauer für die Transfektion von 100.000 Zellen dargestellt. Ohne den Zusatz von Chloroquin in das Transfektionsmedium ist es nicht möglich, Zellen mit EGFP-Fluoreszenz zu detektieren (Abbildung 3-43, A). Erst durch den Zusatz des Endosomenbrechers Chloroquin werden die Komplexe aus Plasmid und TmHU aus den Endosomen in das Zytoplasma entlassen, wodurch dann EGFP in den Zellen exprimiert werden kann (Abbildung 3-43, B). Werden jetzt EGFP-Plasmid und EGFP-siRNA gleichzeitig transfiziert, so ist es möglich, die EGFP-Expression zu inhibieren (Abbildung 3-43, C). Es sind deutlich weniger Zellen mit EGFP-Fluoreszenz sichtbar. Die di-rekte Inhibition der Translation von gleichzeitig transfiziertem Plasmid ist nur möglich, wenn durch den Endosomenbrecher Chloroquin Plasmid-DNA und siRNA aus den Endoso-men in das Zytoplasma entlassen werden. Die Transfektion von EGFP-Plasmid und einer Non-silencing-Kontrolle führt nicht zu einer Reduktion der Zellen, die EGFP exprimieren (siehe Abbildung 3-43, D).

100 Ergebnisse

TmHU + pEGFP + Chloroquine

TmHU + pEGFP + EGFP-siRNA + Chloroquine

TmHU + pEGFP + Non-siRNA + Chloroquine

TmHU + pEGFP

A B

C D

Abbildung 3-43: Transfektion von U-373-MG-Zellen mit TmHU, pEGFP, siRNA und Chloroquin. (A) Transfektion des Plasmids pEGFP mit TmHU, (B) Transfektion von pEGFP mit TmHU und Chloroquin, (C) Transfektion von pEGFP und EGFP-siRNA mit TmHU und Chloroquin, (D) Transfektion von pEGFP und Non-silencing-siRNA mit TmHU und Chloroquin.

Die Auswertung der Daten erfolgte weiterhin mittels Durchflusszytometrie ebenfalls nach 48-stündiger Inkubation der Zellen. Die Ergebnisse bewegen sich für alle getesteten Aus-gangszelldichten im gleichen Größenbereich. Ein Einfluss der Ausgangszelldichte auf die Transfektionsraten konnte nicht beobachtet werden. Im Folgenden wird ein repräsentatives Beispiel kurz erläutert. Nach der Transfektion von 100.000 Zellen mit pEGFP zusammen mit EGFP-siRNA, TmHU und Chloroquin ist eine Reduktion besonders der Zellen mit hoher EGFP-Expression detektierbar. Die Zahl der Zellen mit hoher Fluoreszenz sinkt von 9,3 % auf 4,2 %, also um über die Hälfte des Ausgangswertes. Die Transfektion der Non-silencing-Kontrolle hat eher einen positiven Einfluss auf die Zahl der Zellen mit EGFP-Expression. In allen drei Versuchsreihen, in denen unterschiedliche Ausgangszellzahlen getestet worden sind, ist zu beobachten, dass die Zahl der EGFP-exprimierenden Zellen durch die Non-silencing-siRNA leicht erhöht wird. Dieser Effekt kann bei der Transfektion durch TmHU und durch Lipofectamine 2000 reproduzierbar beobachtet werden. Um die Ergebnisse der Transfektion von pEGFP und EGFP-siRNA zusammen mit TmHU und Chloroquin mit einer weiteren Methode zu verifizieren, wurde ein Western-Blot durch-geführt. Nach der Transfektion von 250.000 U-373-MG-Zellen unter den oben beschriebe-nen Bedingungen (Transfektion von pEGFP, siRNA mit TmHU und Chloroquin, Vergleich mit Lipofectamine 2000) und Inkubation für 48 Stunden erfolgte die Analyse der EGFP-Expression. Anschließend wurde die Blot-Membran gestrippt und Aktin detektiert. Das Er-gebnis des Western-Blots ist im oberen Teil der Abbildung 3-44 dargestellt. Die Quantifizie-rung der Bandenintensitäten auf dem Autoradiographiefilm erfolgte mit Hilfe der Software GeneTools (Fa. Syngene). Es wurde der Quotient aus EGFP- und Aktinbandenintensität ge-bildet und der Wert der Transfektion von pEGFP mit TmHU und Chloroquin auf 100 % fest-gelegt. Das Ergebnis der densitometrischen Auswertung ist im Diagramm der Abbildung 3-44 gezeigt. Wird das Plasmid mit TmHU ohne Chloroquin in die Zellen transfiziert, so kann kein EGFP-Protein detektiert werden. Es ist keine Bande für EGFP auf dem Film zu erkennen. Erst

Ergebnisse 101

durch den Zusatz von Chloroquin erfolgt nach der endosomolytischen Aufnahme der Kom-plexe aus Plasmid und TmHU ein Entlassen in das Zytoplasma. Hier kann das EGFP-Protein nachgewiesen werden. Durch die gleichzeitige Transfektion von pEGFP und EGFP-siRNA mit TmHU und Chloroquin kann eine Reduktion um 34 % der Bandenintensität von EGFP beobachtet werden. Durch die Transfektion mit Chloroquin und TmHU kann also die Expression von EGFP nach Transkription von dem Plasmid pEGFP effizient durch siRNA in-hibiert werden. Die Non-silencing-siRNA hat kaum einen Einfluss auf die Expression und somit auf die Menge von EGFP. Das gleiche Ergebnis erhält man für die Transfektion mit Lipofectamine 2000. Hier ist der RNAi-Effekt allerdings noch stärker ausgeprägt. Eine Re-duktion des EGFP-Proteins um 55 % ist detektierbar. In diesem Ansatz ist auch eine Reduk-tion von Aktin detektierbar, was ein darauf hinweisen könnte, dass neben RNAi weitere Ne-beneffekte auftreten.

EGFP-Western-Blot nach Transfektion von pEGFP

0,0

90,9

87,7

66,2

100,

0

81,7

44,9

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

TmH

U+

pEG

FP

TmH

U+p

EGFP

+Chl

oroq

uin

TmH

U+p

EGFP

+siR

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oroq

uin

TmH

U+p

EGFP

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-sil.

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pEG

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e 20

00

pEG

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00

pEG

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NA+

Lipo

fect

amin

e 20

00

Rel

ativ

e Ba

nden

inte

nsitä

t [%

]

EGFP

Actin

Abbildung 3-44: EGFP- und Aktin-Western-Blot nach einmaliger Transfektion von U-373-MG-Zellen mit 0,5 µg pEGFP, 75 pmol EGFP-siRNA mit 2 nmol TmHU oder Lipofectamine 2000. Die funktionelle Transfektion mit TmHU wurde durch den Einsatz von 100 µM Chloroquin unterstützt.

3.10.7 Transfektion von siRNA mit TmHU und Chloroquin in Zellen mit d2EGFP-Expression

EGFP hat eine Halbwertszeit von 24 Stunden401. Diese relativ hohe Halbwertszeit könnte die Ursache dafür sein, dass die Transfektionen von Zellen mit stabiler EGFP-Expression mit TmHU und Chloroquin zu keinem positiven Ergebnis geführt haben (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu konnte transient exprimiertes EGFP durch die Transfektion von EGFP-siRNA mit TmHU und Chloroquin deutlich reduziert werden (siehe Abschnitt 3.10.6). Des-halb wurden für die folgende Fragestellung Zellen verwendet, die stabil d2EGFP (destabili-siertes EGFP) exprimieren. Diese destabilisierte EGFP-Variante wird in Säugerzellen schnel-ler metabolisiert. Durch Fusionierung der PEST-Sequenz (Aminosäurereste 422-461) der murinen Ornithin-Decarboxylase an den C-Terminus von EGFP402 wird d2EGFP zum zellu-lären Abbau markiert, was sich durch einen schnellen Protein-Turnover äußert403. Durch Messung der Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit dem Proteinsynthese-Inhibitor Cyclo-

102 Ergebnisse

heximid behandelt worden sind, wurde die Halbwertszeit des Proteins bestimmt404. Die Halbwertszeit von d2EGFP beträgt circa zwei Stunden. Die Zelllinie MCF-7, die stabil d2EGFP exprimiert wurde mir freundlicherweise vom Institut für Biotechnologie der Martin-Luther-Universität Halle zur Verfügung gestellt. Im Folgenden sollte getestet werden, ob es möglich, ist mit dem Transfektionssystem TmHU/Chloroquin die Expression von destabilisiertem EGFP durch die Transfektion von EGFP-siRNA zu inhi-bieren. Für die Experimente wurden 200.000 Zellen pro Kavität einer 24-Loch-Platte am Vortag des Versuchbeginns eingestreut. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 75 pmol siRNA und 375 pmol TmHU, also einem 5-fach molarem Überschuss des Proteins, in einem Endvolu-men von 500 µl transfiziert. Die Konzentration von Chloroquin betrug 100 µM. Für die Lipo-fektion wurden 2,5 µl Lipofectamine 2000 verwendet. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Transfektion wiederholt. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen für die FACS-Messungen vorbereitet. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-45 dargestellt.

Transfektion von d2EGFP-exprimierenden MCF-7

100

70

93 100

93 84

100

100

99

0

20

40

60

80

100

Lipo

fect

amin

e

EGFP

-siR

NA

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pofe

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Non

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EGFP

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NA

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HU

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HU

Chl

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uine

EGFP

-siR

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HU

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Non

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RN

A +

TmH

U +

Chl

oroq

uine

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

Abbildung 3-45: FACS-Analyse von d2EGFP-exprimierenden MCF-7-Zellen nach zweifacher Transfektion mit EGFP-siRNA.

Für die Auswertung wurde die Zahl der Zellen mit hoher und geringer EGFP-Fluoreszenz addiert und das jeweilige Kontrollexperiment auf 100 % festgelegt. Die entsprechenden Ver-suchansätze wurden dann darauf bezogen und ins Verhältnis zueinander gesetzt. Eine In-hibition der d2EGFP-Expression ist nur nach der Transfektion der siRNA mit Lipofectamine 2000 detektierbar. Hier erfolgt eine Reduktion der d2EGFP-exprimierenden Zellen um 30 %. Die Non-silencing-Kontrolle hat keinen Einfluss auf die EGFP-Expression der Zellen. In den Transfektionsexperimenten mit TmHU und TmHU zusammen mit Chloroquin kann keine Reduktion der EGFP-Fluoreszenz nach Transfektion der EGFP-siRNA detektiert werden. Die Versuche wurden dreimal wiederholt (n=3), wobei auch hier gleiche Ergebnisse erhalten worden sind.

3.11 Transfektionen mit KALA Das positiv geladenene amphipatische Peptid KALA ist in der Lage, endosomale Membranen aufzubrechen, DNA zu kondensieren und den Transfer von Plasmid-DNA zu vermitteln. Es hat eine geringe Molekularmasse und besteht aus 30 Aminosäuren mit der Sequenz WEA

Ergebnisse 103

KLA KAL AKA LAK HLA KAL AKA LKA CEA. KALA bindet Oligonukleotide oder Plasmid-DNA und verzögert deren Migration in der Gelelektrophorese. Bei einer Verschiebung des pH-Wertes von 5,0 auf 7,5 unterliegt KALA einer Konformationsänderung von Random coil zu einer amphipatischen α-helikalen Struktur, wobei eine Seite hydrophobe Leucin- und die entgegengesetzte Seite hydrophile Lysin-Seitenketten darstellt. Diese fusogenen Eigenschaf-ten des Peptides wurden vorrangig für den Gentransfer in Kombination mit Polyethylengly-col (PEG) und Poly-L-Lysin (PLL) verwendet405,406. Auf Grund seiner DNA-bindenden und endosomolytischen Eigenschaften wurde KALA zur Transfektion des Plasmids pEGFP eingesetzt. Dabei sollte geprüft werden, ob KALA wie Chloroquin bei der Transfektion mit TmHU ein effizientes Aufbrechen der Endosomen ver-mitteln kann. Die Transfektionen mit KALA wurden nach dem selben Protokoll wie die Transfektionen mit TmHU durchgeführt. Des Weiteren wurde ebenfalls Chloroquin in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt. Für die Untersuchungen wurden jeweils 200.000 U-373-MG-Zellen in ei-ne Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen mit jeweils 0,5 µg (das entspricht 161 fmol) Plasmid pEGFP und 2000 pmol KALA-Peptid in ei-nem Endvolumen von 500 µl serumfreien Opti-MEM-Medium transfiziert. Das entspricht ei-nem 13.500-fachen Überschuss im Verhältnis zum Plasmid. Als Detektionssystem wurde wiederum die Expression von EGFP in den transfizierten Zellen gewählt. In Abbildung 3-46 werden die Dot Plots der Transfektion des Plasmids mit TmHU, KALA, KALA zusammen mit Chloroquin und KALA zusammen mit TmHU miteinander verglichen. Das Ergebnis der FACS-Analyse nach 24, 48 und 96 Stunden Inkubation ist in Abbildung 3-47 dargestellt. In den Versuchsansätzen ohne Chloroquin wurden die Ereignisse der Regionen B und C zu-sammengefasst, da hier keine Autofluoreszenz vorliegt. Es ist zu erkennen, dass die Trans-fektionen mit KALA im Gegensatz zu TmHU zu einer Expression von EGFP in den unter-suchten Zellen führt. Aus dem Diagramm in der Abbildung 3-47 geht hervor, dass die Transfektion des Plasmids mit KALA zu einer EGFP-Expression in ca. 5 % der untersuchten Zellen nach 48 und 96 Stunden führt. Nach der Transfektion des Plasmids mit TmHU sind weniger als 1 % der Zellen mit EGFP-Expression detektierbar. Das bedeutet, dass KALA wie TmHU in der Lage ist, DNA zu binden und die zelluläre Aufnahme der gebundenen DNA zu vermitteln. Zusätzlich ist KALA in der Lage, ein Aufbrechen der Endosomen und somit ein Entlassen der Nukleinsäure in das Zytoplasma zu vermitteln. Wird dem Transfektionsansatz mit KALA zusätzlich noch 100 µM Chloroquin zugefügt, so ist die Zahl der EGFP-exprimierenden Zellen nach Abzug der Autofluoreszenz (nur Ereignisse in Region C) ähnlich hoch, wie nach der Transfektion mit KALA allein. Maximal 7 % der Zellen exprimieren EGFP. Die Transfektionseffizienz von KALA kann also durch den Zusatz einer weiteren endosomolytischen Substanz nicht erhöht werden. Im Gegensatz dazu exprimieren über 15 % der Zellen EGFP, nachdem sie mit TmHU und Chloroquin transfiziert worden sind. Auf Grund dieser Daten ist anzunehmen, dass durch TmHU mehr DNA in die Zellen gebracht wird als durch KALA, denn ein effizientes Aufbrechen der Endosomen durch Chlo-roquin erhöht nicht die Expressionsraten von EGFP nach der Transfektion der Plasmid-DNA mit KALA. Somit ist die Transfektion mit TmHU effizienter als die von KALA. Durch den Zusatz des endosomolytischen Peptids KALA zur Transfektion des Plasmids mit TmHU werden nicht so hohe Expressionsraten von EGFP erreicht (10 %), wie durch den Zu-satz von Chloroquin (19 %). Das heißt, dass auch das Aufbrechen der Endosomen durch KALA nicht so effizient erfolgt wie durch Chloroquin. In keinem Fall kann aber die Transfektionsrate der Lipofektion mit Lipofectamine 2000 er-reicht werden (über 50 %). Diese wird durch den zusätzlichen Einsatz von KALA inhibiert.

104 Ergebnisse

A B C A B C A B C A B C

pEGFP + TmHU pEGFP + KALA pEGFP + KALA + Chloroquin pEGFP + TmHU + KALA

Abbildung 3-46: Vergleich der Dot Plots der FACS-Analyse nach der Transfektion des Plasmids mit TmHU, KALA und KALA zusammen mit Chloroquin. (A) Zellen ohne Chloroquin, (B) Zellen mit Chloroquin, (C) Zellen mit EGFP Expression

Transfektion von U-373-MG-Zellen mit pEGFP und KALA

0,27 2,

22

1,98

1,46

7,1

31,0

4

4,52

0,43

18,7

4

4,36

3,97

9,92

50,8

1

11,1

4

0,7

15,7

9

4,99 6,

8

3,3

41,0

2

8,07

0

10

20

30

40

50

60

pEG

FP +

Tm

HU

pEG

FP +

Tm

HU

+C

hlor

oqui

n

pEG

FP +

KAL

A

pEG

FP +

KAL

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Chl

oroq

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pEG

FP +

KAL

A +

TmH

U

pEG

FP +

Lipo

fect

amin

e 20

00

pEG

FP +

KAL

A +

Lipo

fect

amin

e 20

00

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

24 h48 h96 h

Abbildung 3-47: FACS-Analyse der Transfektion von U-373-MG-Zellen mit dem Plasmid pEGFP mit KALA und TmHU nach 24, 48 h und 96 h Inkubation.

3.12 Transfektionen mit dem endosomolytischen Peptid E5

3.12.1 Das endosomolytische Peptid E5

Um eine optimalen therapeutischen Effekt zu erhalten, muss das therapeutische Agens nicht nur die Targetzelle erreichen, sondern auch die korrekte Lokalisation innerhalb dieser Zelle. Dazu müssen diese therapeutischen Agenzien in das Zytosol der Zielzelle transferiert werden. Um dies zu erreichen, werden häufig synthetische Peptide verwendet, die die Eigen-schaften von Fusionspeptiden von Viren besitzen und die Destabilisierung endosomaler Membranen hervorrufen407-410. Eines der am besten charakterisierten viralen Fusionspepti-de ist die N-terminale Domäne der Hämagglutinin-Untereinheit HA-2 des Influenza-Virus. Die Membranstruktur und die durch niedrige pH-Werte ausgelösten Konformationsände-

Ergebnisse 105

rungen des Fusionspeptids HA-2 wurden durch NMR aufgeklärt411. Synthetische Analoge dieser Fusionsdomäne lagern sich bei neutralem (pH 7,4) und saurem pH (pH 5,0) in lipo-somale Bilayer-Membranen in einer umgekehrten V-Konformation ein. Bei einem pH-Wert von pH 5,0 unterliegt der C-Terminus des V-förmigen Peptids einer Konformationsänderung durch Ausbildung einer kurzen Helix, die eine noch tiefere Einlagerung in die Membran auslöst. Diese Einlagerung ist die Ursache für die Destabilisierung der Membran. Es konnte gezeigt werden, dass Analoge des Fusionspeptids des Influenza-Virus das Austreten von Oli-gonukleotiden412,413 und durch Polykationen kondensierte DNA-Komplexe407,414,415 nach der Aufnahme in die Zelle verstärken. Da das Fusionspeptid von HA-2 sehr schlecht wasserlös-lich ist, wurde von Ishiguro et al.359 die löslichere Variante E5 des Influenza-Fusionspeptids entwickelt. Das Peptid E5 besteht aus 20 Aminosäuren mit der Sequenz GLF EAI AEF IEG GWE GLI EG. Hier wurden die Glycine 4 und 8 und das Threonin 15 gegen Glutamat-Reste ausgetauscht. Da der Endosomenbrecher Chloroquin auf Grund seiner nachgewiesenen Zytotoxizität für eine In-Vivo-Anwendung nicht einsetzbar ist, wurde für die folgenden Experimente das Pep-tid E5 für die Transfektionen von Plasmid-DNA verwendet. Dazu wurde E5 mit einer zusätz-lichen N-terminalen Lysingruppe versehen, die eine Maleimidgruppe trägt. Über diese Modi-fikation soll das Peptid an TmHU-91Cys gekoppelt werden. Das Kopplungsprodukt TmHU-E5 wurde anschließend hinsichtlich seiner Transfektionseffizienz und Zytotoxizität unter-sucht.

3.12.2 Kopplung von E5 an TmHU

Die Kopplung von E5 an TmHU-91Cys ist unter Abschnitt 2.3.10 beschrieben. Das Peptid E5 wurde im Verhältnis 1:1 und 1:5 bezogen auf TmHU in die Kopplungsreaktion gegeben. Auffällig war, dass die Probe direkt nach dem Zusetzen des Peptids E5 ausgefallen ist. Die Ursache dafür könnte in der Ladung des Peptids liegen. E5 ist noch unpolarer, also hydro-phober, als TmHU, was sich durch die höhere Retentionszeit bei der RP-HPLC im Gegensatz zu TmHU zeigt (siehe Abbildung 3-48). Wenn das hydrophobe Peptid mit den hydrophoben Bereichen von TmHU interagiert, so führt das zu einer Ladungsverschiebung an der Ober-fläche des Proteins, wodurch TmHU und E5 ausfallen. Trotzdem wurde die Kopplungsreak-tion wie beschrieben durchgeführt. Anschließend erfolgte eine getrennte Analyse des Über-standes und des Sediments des Reaktionsansatzes mittels RP-HPLC. Das Ergebnis ist in Abbildung 3-48 dargestellt. Im Überstand der Reaktion ist nur TmHU (schwarze Linie, Peak bei 12,6 min) detektierbar. Zumindest ein Teil des Proteins fällt also nicht aus. Wenn das Sediment in DMSO gelöst wird und anschließend auf die RP-Säule aufgetragen wird, kann man feststellen, dass sich im Sediment sowohl freies E5-Peptid (rote Linie, Peak bei 16,3 min) befindet, als auch das gewünschte Kopplungsprodukt TmHU-E5 (blaue Linie, Peak bei 15,5 min). Eine Aufreini-gung des Reaktionsproduktes erfolgte auf Grund zu geringer vorhandener Mengen nicht. Der Reaktionsansatz wurde direkt in die Transfektionsversuche eingesetzt.

106 Ergebnisse

RP-HPLC der Kopplung von E5 an TmHU-91Cys

Retentionszeit [min]

8 10 12 14 16 18 20

Abso

rptio

n [m

AU]

-20

0

20

40

60

80

Überstand der KopplungsreaktionSediment der KopplungsreaktionE5-Peptid

TmHU-91Cys

TmHU-E5

E5

Abso

rptio

n [m

AU]

-20

0

20

40

60

80

100

120

Abbildung 3-48: Analyse der Kopplungsreaktion von TmHU-91Cys mit E5 mittels RP-HPLC. Es erfolgte eine getrennte Analyse des Überstandes und des Sediments.

3.12.3 Transfektionen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5

Im folgenden Versuch wurde die Transfektionseffizienz des Kopplungsproduktes TmHU-E5 näher untersucht. Es wurden die beiden Zelllinien, MCF-7 und U373-MG transfiziert. Als Detektionssystem wurde wiederum die Expression von EGFP nach der Transfektion des Plasmids pEGFP gewählt. Für die Transfektion wurden am Vortag des Versuches jeweils 200.000 Zellen pro Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 0,5 µg Plasmid, also 322 fmol transfiziert. Für die Transfektion wurden 2.200 pmol TmHU, also ein 6.800-facher molarer Überschuss, in einem Endvolumen von 500 µl verwendet. Weiterhin wurde das freie Peptid E5 im Verhältnis 1:1 und 1:5 (wie in der Kopp-lungsreaktion) in Bezug auf TmHU in die entsprechenden Kontrollansätze eingesetzt. Das Kopplungsprodukt TmHU-E5 wurde direkt aus dem Reaktionsansatz, in dem sich noch frei-es TmHU und ungekoppeltes E5 befinden, in die Transfektion eingesetzt. Dabei wurde die Menge, die für die Transfektion eingesetzt werden soll über die ursprünglich in den Reakti-onsansatz eingesetzte Menge TmHU errechnet. Darauf bezogen wurden ebenfalls 2.200 pmol TmHU eingesetzt, wobei ein großer Anteil an das Peptid E5 gekoppelt vorliegt (siehe Abbildung 3-48). Wurde für die Transfektion Chloroquin eingesetzt, so betrug dessen End-konzentration 100 µM. Die Transfektion des Plasmids mit Lipofectamine 2000 wurde als Po-sitivkontrolle verwendet. Nach Zusatz der Transfektionsreagenzien zu den Zellen wurden die Zellen für 5 Stunden in 0,5 ml Opti-MEM-Medium inkubiert. Anschließend wurde 1 ml des Normalmediums der entsprechenden Zelllinien zugesetzt. Nach insgesamt 24 Stunden wur-de das Medium komplett gewechselt, die Zellen wurden jetzt ausschließlich in Normalmedi-um für insgesamt 96 Stunden inkubiert. In der Abbildung 3-49 sind fluoreszenzmikroskopi-sche Aufnahmen von U-373-MG-Zellen nach der Transfektion dargestellt. Die Analyse der Zellen erfolgte weiterhin mittels FACS-Messung, wobei jeweils 10.000 Zellen gemessen wer-den sollten. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 3-50 und Abbildung 3-51 für beide Zellli-nien dargestellt. Der Zellversuch wurde in einer Doppelbestimmung durchgeführt. In den Diagrammen sind beide Messwerte nebeneinander aufgetragen worden. Die einzelnen Mes-sungen der Doppelbestimmung weichen kaum voneinander ab. Vergleicht man die Transfektionsraten beider Zelllinien miteinander, kann man feststellen, dass sie unterschiedlich gut transfizierbar sind. Mit Lipofectamine 2000 sind 56,7 % der U-

Ergebnisse 107

373-MG-Zellen positiv, aber nur 33,3 % der MCF-7-Zellen. Bei keiner der beiden Zelllinien kann eine Expression von pEGFP nach der Transfektion mit TmHU allein detektiert werden (siehe Abbildung 3-49, A). Erst nach Zusatz von Chloroquin exprimieren 66,5 % der U-373-MG-Zellen (siehe Abbildung 3-49, C) und nur 6,1 % der MCF-7-Zellen das Protein. Die Ex-pression von EGFP nach Transfektion der Plasmid-DNA mit TmHU und Chloroquin ist also höher bei den U-373-MG-Zellen. In den Kontrollansätzen mit der Transfektion des Plasmids mit dem freien Peptid E5 im Verhältnis 1:1 oder 1:5 mit oder ohne TmHU (siehe Abbildung 3-49, B) kann keine Expres-sion von EGFP detektiert werden. Hier liegen die Werte beider Zelllinien im Bereich der Au-tofluoreszenz. Werden die Zellen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5 transfiziert, so findet man erhöhte Transfektionsraten für beide Zelllinien. 31,1 % der U-373-MG-Zellen (siehe Abbildung 3-49, D) und 25,3 % der MCF-7-Zellen exprimieren EGFP. Bei den U-373-MG-Zellen liegt diese Expressionsrate noch unter der von TmHU und Chloroquin, für MCF-7 liegt sie darüber. Dieses Ergebnis zeigt, dass tatsächlich nur das Kopplungsprodukt aus dem Reaktionsansatz und nicht das freie E5-Peptid die Ursache für diese Expressionsraten ist. Weder TmHU oder E5, noch beides zusammen lösen erhöhte EGFP-Expression aus. Nur wenn E5 an TmHU gekoppelt ist, wird es mit in die Endosomen aufgenommen und kann dort die Destabilisierung der endosomalen Membran auslösen. Wird das Plasmid zusammen mit E5 und Chloroquin transfiziert, so können bei MCF-7 leicht erhöhte Transfektionsraten beobachtet werden, erfolgt die Transfektion noch zusätz-lich mit TmHU, so sind auch bei der Zelllinie U-373-MG die Transfektionsraten erhöht, lie-gen aber nicht über der Rate, die durch das Kopplungsprodukt TmHU-E5 erreicht werden konnte (Ausnahme Transfektion von U-373-MG mit pEGFP, TmHU, E5 1:1 und Chloroquin). Werden die Zellen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5 zusammen mit Chloroquin transfi-ziert, so können bei U-373-MG 66,9 % (siehe Abbildung 3-49, E) und bei MCF-7 58,3 % der Zellen mit EGFP-Expression detektiert werden. In beiden Fällen ist diese Rate höher als nach der Transfektion mit TmHU und Chloroquin und höher als die der Transfektion mit TmHU-E5. Die endosomolytischen Eigenschaften von TmHU-E5 und Chloroquin wirken also additiv. Die gestrichelten Linien im Diagramm stellen die beiden Messwerte der Transfektion mit Lipofectamine 2000 dar. Sie sollen verdeutlichen, dass mit TmHU bzw. TmHU-E5 und Chloroquin höhere Expressionsraten als durch die Transfektion mit Lipofectamine 2000 er-reicht werden können. Diese hohen Expressionsraten nach der Transfektion der Zellen mit TmHU und Chloroquin oder TmHU-E5 wurden nach 96-stündiger Inkubation der Zellen erreicht. Bei kürzeren In-kubationszeiten ist die erreichte EGFP-Expression geringer. Werden die Zellen bereits nach 24 h analysiert, exprimieren die Zellen nur sehr wenig EGFP. Die Expression liegt dann im Bereich zwischen 3 und 5 %. Die Expression ist nach 48 oder 72 h etwas höher, das Opti-mum liegt aber bei 96 Stunden. Weiterhin fiel auf, dass bei der Analyse der MCF-7-Zellen mittels FACS in allen Ansätzen mit Chloroquin die Menge von 10.000 Zellen für die Messung nicht mehr zur Verfügung stand. In diesem Fall wurden weniger Zellen, teilweise weniger als 3.000, analysiert. Dieser Effekt kann eindeutig der zytotoxischen Wirkung von Chloroquin zugeordnet werden, wobei die MCF-7-Zellen wesentlich sensitiver auf Chloroquin reagieren als die U-373-MG-Zellen.

108 Ergebnisse

pEGFP + TmHU-E5 pEGFP + TmHU-E5 + Chloroquin

pEGFP + TmHU + ChloroquinpEGFP + TmHU pEGFP + TmHU + E5

A B C

ED

Abbildung 3-49: Transfektion von U-373-MG-Zellen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5. (A) Transfektion der Zellen mit dem Plasmid pEGFP und TmHU; (B) Transfektion der Zellen mit pEGFP, TmHU und freiem Peptid E5; (C) Transfektion mit pEGFP, TmHU und Chloroquin; (D) Transfektion von pEGFP mit dem Kopp-lungsprodukt TmHU-E5; (E) Transfektion des Plasmids mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5 und Chloroquin. Die Analyse der Zellen erfolgte nach 96 Stunden.

Transfektion von U-373-MG-Zellen mit TmHU-E5

0,8

64,2

0,3

0,5

0,6

0,4

31,3

0,1 3,

1

57,8

9,6

69,1

59,3

0,5

68,7

0,3

0,3

0,4

0,5

31,0

-1,6

2,1

62,5

5,9

64,7

54,1

-28

18283848586878

pEG

FP +

Lip

ofec

tam

ine

2000

pEG

FP +

Tm

HU

pEG

FP +

Tm

HU

+ C

hlor

oqui

n

pEG

FP +

E5

1:1

pEG

FP +

E5

1:15

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 1:

1

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 1:

15

pEG

FP +

Tm

HU

-E5

pEG

FP +

E5

+ C

hlor

oqui

n 1:

1

pEG

FP +

E5

+ C

hlor

oqui

n 1:

15

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 +

Chl

oroq

uin

1:1

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 +

Chl

oroq

uin

1:15

pEG

FP +

Tm

HU

-E5

+ C

hlor

oqui

n

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

Abbildung 3-50: FACS-Analyse der Transfektion von U-373-MG-Zellen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5. Die gestrichelten Linien stellen die beiden Messwerte der Transfektion mit Lipofectamine 2000 dar. Sie sollen verdeutlichen, dass mit TmHU bzw. TmHU-E5 und Chloroquin höhere Expressionsraten als durch die Transfektion mit Lipofectamine 2000 erreicht werden können.

Ergebnisse 109

Transfektion von MCF-7-Zellen mit TmHU-E5

32,7

0,4 5,

1

0,9

0,7

0,9 2,0

23,6

2,4

9,2

9,3

16,2

56,8

33,8

0,4

7,0

0,5

0,8

0,9 1,6

27,1

2,7

9,0 11

,0 18,1

59,9

0

10

20

30

40

50

60

70

pEG

FP +

Lip

ofec

tam

ine

2000

pEG

FP +

Tm

HU

pEG

FP +

Tm

HU

+ C

hlor

oqui

n

pEG

FP +

E5

1:1

pEG

FP +

E5

1:15

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 1:

1

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 1:

15

pEG

FP +

Tm

HU

-E5

pEG

FP +

E5

+ C

hlor

oqui

n 1:

1

pEG

FP +

E5

+ C

hlor

oqui

ne 1

:15

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 +

Chl

oroq

uin

1:1

pEG

FP +

Tm

HU

+ E

5 +

Chl

oroq

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1:15

pEG

FP +

Tm

HU

-E5

+ C

hlor

oqui

n

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

Abbildung 3-51: Transfektion von MCF-7-Zellen mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5. Sie sollen verdeutlichen, dass mit TmHU-E5 und Chloroquin höhere Expressionsraten als durch die Transfektion mit Lipofectamine 2000 erreicht werden können.

3.12.4 Untersuchung der Zytotoxizität von E5 und TmHU-E5

Da das Kopplungsprodukt einen positiven Einfluss auf die Transfektionsraten des Plasmids pEGFP hat, sollte anschließend die Zytotoxizität des Peptids E5 und des Kopplungsproduk-tes TmHU-E5 untersucht werden. Dazu wurde mit dem Cell Proliferation Kit (MTT-Test) der Fa. Roche Applied Science, wie unter 2.4.16.2 beschrieben, gearbeitet. Bei diesem Test wird die Zahl der metabolisch aktiven Zellen bestimmt, wodurch indirekt die Zytotoxizität der verwendeten Transfektionsagenzien festgestellt werden kann. Beide untersuchten Zelllinien U-373-MG und MCF-7 sind getestet worden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-52 und Abbildung 3-53 dargestellt. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen von TmHU, E5 und TmHU-E5 auf die Zellen gegeben. Diese wurden dann für 48 inkubiert und anschlie-ßend analysiert. In den Diagrammen sind die Konzentrationen, die in den Transfektionsex-perimenten mit dem Plasmid verwendet worden sind, durch einen helleren Balken gekenn-zeichnet. Vergleicht man die Zellen, die mit einem der Agenzien behandelt worden sind, mit unbehan-delten Zellen, so lässt sich Folgendes schließen. TmHU hat mit steigenden Konzentrationen einen negativen Einfluss auf die Proliferation der Zellen. Je mehr TmHU im Medium ist, des-to weniger metabolisch aktive Zellen sind detektierbar. Auch die Konzentration von 5 µM TmHU, die für die Transfektion verwendet wird, ist bereits zytotoxisch. Dieser Effekt ist bei den MCF-7-Zellen stärker ausgeprägt als bei den U-373-MG-Zellen. MCF-7-Zellen reagieren somit sensitiver auf TmHU. Weiterhin kann man erkennen, dass das Peptid E5 kaum einen zytotoxischen Einfluss auf die inkubierten Zellen hat. Die Zahl der metabolisch aktiven Zellen ist bei U-373-MG-Zellen nur leicht reduziert. Bei den MCF-7-Zellen ist die Zahl der Zellen genauso hoch, wie die der unbehandelten Zellen. Dieser Effekt ist unabhängig von der Konzentration von E5. Auch bei höheren Konzentrationen steigt die Toxizität von E5 nicht an. Nach der Inkubation der Zellen mit den Kopplungsprodukt TmHU-E5 kann wiederum ein negativer Effekt auf die Zellproliferation detektiert werden, wobei die Zahl der Zellen nicht

110 Ergebnisse

geringer ist, als nach der Inkubation mit TmHU. Bei den U-373-MG-Zellen kann festgestellt werden, dass das Kopplungsprodukt TmHU-E5 sogar eine geringere Toxizität aufweist, als TmHU allein. Da davon auszugehen ist, dass das Peptid E5 allein nicht von den Zellen auf-genommen wird, kann somit auch eine eventuell vorhandene Toxizität nicht detektiert wer-den. Gekoppelt an TmHU verstärkt E5 die zytotoxischen Effekte von TmHU nicht. Man kann also davon ausgehen, dass die zytotoxischen Effekte von TmHU-E5 von TmHU ausgehen und nicht durch das Peptid E5 ausgelöst werden. Auf Grund der hier nachgewiesenen Zytotoxizität von TmHU-E5, möchte ich darauf hinwei-sen, dass auch für das in dieser Arbeit eingesetzte Lipofektionsagens ein Einfluss auf die Zellviabilität nachgewiesen wurde. Im Abschnitt 3.7.3 wurde die Zytotoxizität von TmHU mit der von Lipofectamine 2000 verglichen. Das Lipofektionsagens wirkt ebenfalls in höheren Konzentrationen zytotoxisch. Trotzdem wird es routinemäßig für die In-Vitro-Transfektion von Zellen verwendet.

MTT-Test U-373

7625

4692

4152

3812

2732

732

6212

6192

6092

5992

5932 6275 72

25

6975

5072

4752

4512

6172

0100020003000400050006000700080009000

Unb

ehan

delte

Zel

len

1,25

µM

Tm

HU

2,5

µM T

mH

U

5 µM

Tm

HU

10 µ

M T

mH

U

20 µ

M T

mH

U

1,25

µM

E5-

Pep

tid

2,5

µM E

5-P

eptid

5 µM

E5-

Pep

tid

10 µ

M E

5-P

eptid

20 µ

M E

5-P

eptid

40 µ

M E

5-P

eptid

60 µ

M E

5-P

eptid

120

µM E

5-P

eptid

1,25

µM

Tm

HU

-E5

geko

ppel

t

2,5

µM T

mH

U-E

5 ge

kopp

elt

5 µM

Tm

HU

-E5

geko

ppel

t

10 µ

M T

mH

U-E

5 ge

kopp

elt

Zellz

ahl

Abbildung 3-52: Untersuchung des Einflusses von TmHU, E5 und TmHU-E5 auf die Zellproliferation von U-373-MG-Zellen mittels MTT-Test.

MTT-Test MCF-7

1804

0

1886

5

1721

5

1716

5

1591

5

1446

5

4326

5

4276

5

4276

5

4291

5

4451

5

4661

5

4646

5

4636

5

1976

5

1711

5

1381

5

1676

5

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Unb

ehan

delte

Zel

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1,25

µM

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Tm

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mH

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5 ge

kopp

elt

5 µM

Tm

HU

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geko

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10 µ

M T

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U-E

5 ge

kopp

elt

Zellz

ahl

Abbildung 3-53: Untersuchung des Einflusses von TmHU, E5 und TmHU-E5 auf die Zellproliferation von MCF-7-Zellen mittels MTT-Test.

Ergebnisse 111

3.13 Vergleich mit anderen DNA-bindenden hyperthermophilen Proteinen

In den folgenden Versuchen sollten die Eigenschaften von TmHU mit Proteinen verglichen werden, die wie TmHU in der Lage sind, Nukleinsäuren zu binden. Dazu wurden mir von Herrn Dipl.-Biochem. Mathias Salomo von der Universität Leipzig die Proteine Sac7d und Sac7e zur Verfügung gestellt. Die Mitglieder der Sac-Familie sind abundante, kleine, basi-sche und unspezifisch DNA-bindende Proteine, die in verschiedenen Sulfolobus-Stämmen vorkommen. Sac7d und Sac7e sind Proteine mit einer Molekularmasse über 7 kDa des hy-perthermophilen Archaebakteriums Sulfolobus acidolarius (Sac7d: 7.608 Da, Sac7e 7.469 Da). Sac-Proteine sind Monomere, die die DNA-Doppelhelix416 stabilisieren und deren Schmelztemperatur erhöhen417. Auf Grund dessen wird vermutet, dass die Proteine der Sac-Familie eine Rolle in der Organisation der Chromatin-Strukur dieser Prokaryonten spielen, die keine Histone besitzen. Ein Vergleich der Sequenzen beider Sac-Proteine mit TmHU zeigte keine Sequenzhomologie. Sac 7d und e sind somit keine Vertreter der HU-Familie. Sac7d und e sind zu 91 % homolog zueinander. Sequenzvergleich von Sac7d und e: Sac7d: 1 MVKVKFKYKG EEKEVDTSKI KKVWRVGKMV SFTYDDNGKT 40 M KV+FKYKG EEKEVDTSKI KKVWRVGKMV SFTYDDNGKT Sac7e: 1 MAKVRFKYKG EEKEVDTSKI KKVWRVGKMV SFTYDDNGKT 40 Sac7d: 41 GRGAVSEKDA PKELLDMLAR AEREK 65 GRGAVSEKDA PKEL+DMLAR AE++K Sac7e: 41 GRGAVSEKDA PKELMDMLAR AEKKKK 66 Da die Sac-Poteine, wie TmHU, sehr basisch sind, DNA kondensieren und sie vor thermi-scher Denaturierung schützen, wurden sie hinsichtlich ihrer Eigenschaften für die Trans-fektion des Plasmids pEGFP untersucht. Die Transfektion mit Hilfe der Sac-Proteine wurde wie bereits für TmHU beschrieben durchgeführt. Des Weiteren wurde ebenfalls Chloroquin in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt. Für die Untersuchung wurden jeweils 200.000 U-373-MG-Zellen in eine Kavität einer 24-Loch-Platte eingestreut. Am darauf fol-genden Tag wurden die Zellen mit jeweils 0,5 µg (das entspricht 161 fmol) Plasmid pEGFP und 2000 pmol Sac 7d und 7e in einem Endvolumen von 500 µl serumfreien Opti-MEM-Medium transfiziert. Das entspricht einem 13.500-fachen Überschuss im Verhältnis zum Plasmid. Das Ergebnis der FACS-Analyse nach 96 Stunden Inkubation ist in Abbildung 3-54 dargestellt. Die Transfektionen mit den Sac-Proteinen wurden dabei mit den Transfek-tionen mit TmHU verglichen. Aus dem Diagramm ist erkennbar, dass eine Transfektion von pEGFP mit Sac-Proteinen sowohl mit als auch ohne Chloroquin nicht möglich ist. In keinem der Versuche liegt der Anteil der Zellen mit EGFP-Signal über 1,2 %. Im Vergleich dazu liegt die Expression von EGFP nach der Transfektion mit TmHU und Chloroquin nach 96-stündiger Inkubation bei 32 %. Auf Grund ihrer Eigenschaften müssten die Sac-Proteine in der Lage sein, mit DNA oder RNA Komplexe auszubilden. Der Unterschied zu TmHU besteht darin, dass diese nicht in humane Zellen aufgenommen werden. Das Ergebnis zeigt, dass die Sac-Proteine, obwohl sie ähnliche Eigenschaften wie TmHU besitzen, nicht geeignet sind, Nukleinsäuren in das Innere von Zellen zu transportieren und unterstreicht somit die au-ßergewöhnlichen Eigenschaften von TmHU als Transfektionsagens.

112 Ergebnisse

Transfektion von pEGFP mit Sac 7d und Sac 7e

0

5

10

15

20

25

30

35

TmH

U +

pEG

FP

TmH

U +

pEG

FP +

Chl

oroq

uin

Sac

7d +

pEG

FP

Sac

7d +

pEG

FP +

Chl

oroq

uin

Sac

7e +

pEG

FP

Sac

7e +

pEG

FP +

Chl

oroq

uin

% d

er g

emes

sene

n Ze

llen

hohes EGFP-Signal

schwaches EGFP-Signal

Abbildung 3-54: FACS-Analyse zum Vergleich der Transfektion von pEGFP durch TmHU mit der Transfektion von pEGFP durch die Sac-Proteine Sac 7 e und d.