.-\et,a histo(·lw!l1. Kil ..)\I,:-i. ~i --liO (I\Ji7)

l'ilyS:ologi,;.. h-chf·mi5ehcs Instit.ut. del' Mart.in-Luther·UniversiHit. in Halle (Saalc)

(Dirokt.or: Prof. Dr. H. HANSON)und

An l.to ni ,c;1-Histologisch·Embryologisches lnstitut

d 'J' \1 ',li7.ini-lchen Univarsitat in Debrecen (Ungarn)

(Direktor: Prof. Dr, GY, SZEKELY)

Das Vorkommen von Phenoloxidase enthaltenden ZeBen (= POZ)wahrend der embryonalen Entwicklung des Huhnes

(POZ - Zellen des Immunsystems?)

The occurrenCe of phenoloxidase containing cells (= POZ)during the embryonary development of the hen

(POZ - cells of the immunologicl;'.l system?)

\'on HANS SCHMIDT und L.(SZLO MODIS

\lit :H Abbilclungen

(Eiug<egangen am 23, Jllli 1976)

Zus1.lJmmenfassung

:VIit Hilfp dar Phenoloxidase-H,oaktion wurde nachgcwiosen, daf3 die paz nach 6tligiger Bebrii­

tung in den blutbildenden Z:)llinsoln des Dottersackes und nach IItagiger BEbriitung in embryo­

nalcn Gew"b" auftret.en, Be\·oI7.ugt,e Zdorgane sind Milz lmd Knochcnmal'k, obwohl zum gleichenZ~itpunkt aueh sehon vE'n'inzelt,e Z31lE'n im BindegewebC' des Embryos erseheimon. Die paz sindaueh in del' Rursa FABR1Cif nachwE'isbar, In del' Diskussion wird auf die miiglichc Beteiligung del''POZ an immllnologisehf'll Reaktionen hing,·wiesE'n.

Summary

By mJans of the p\::n!oxi,hs;, reaetioll it would be shown that the POZ appear in haemopocticcell islands of the yolk sac being hat,ched 6 days and being hatched Ii days, they appear in embryo­nary tissues. Favoured target organs aI''' the spleen and the bone marrow, though also at the sametime can be seen some cells in the conneetive tissue of the embryo. paz can also be found in the

bursa of FABRICIUS, The participation of the paz in immunological reactions is supposed.

Einleitung

Duel' die Funktioncn del' im Bindegewebe verschiedener Species (SCHMIDT undMODIS 1970, 1974; SCHMIDT 1971; SCHl\fiDT und STINTZ 1975) nachgewiesenen POZist bisher nichts Sicheres bekannt. Einige Moglichkeiten wurden fruher (SCHl\fiDT undMODIS 1970, 1974) diskutiert. Es wllrde damals angcnommen, daB eine wanderndeBindegewebszelle vorliegt. Diese Annahme wul'dc inzwischen dul'ch das Vel'halten del'POZ im Gebiet del' an Lichenificatio gigantea hypel'trophicans erkrankten mensch-

48 H. SCH:VIIDT und L. M6D1s

lichen Raut (SCHMIDT, STINTZ und WOZNIAK, im Druck) bestatigt. Bei dieser Er­krankung treten POZ subepidermal gehauft auf und durchwandern offensichtlich

auch das erkrankte Epithel, da sie direkt im Stratum corneum nachgewiesen werden

konnen. Aus diesem Verhalten der POZ und den fur diese Erkrankung diskutiertenatiologischen Faktoren sowie aus anderen, noch nicht verOffentlichten Befunden er­gibt sich eine Bestatigung fur die schon seit langerer Zeit vermutete Beteiligung der

POZ an immunologischen Prozessen.In den gegenwartigen Vorstellungen uber die Organisation der humoralen und

gewebsabhangigen Immunabwehr spielen die sogenannten T- und B-Lymphocyteneineentscheidende Rolle (COOPER und LAWTON III 1974). Es wird postuliert, daB sich

beide Zelltypen von den bisher nicht naher definierten hamatopoetischen Stammzellen

im Dottersack herleiten. Bei Vogeln sollen diese Stammzellen vom Dottersack indas Knochenmark wandern und sich hier zu verschiedenen Blutzellen differenzieren.Jene Zellen, die am Ende ihrer Entwicklung Lymphocyten werden, bedurfen der wei­

teren Entwicklung auBerhalb des Knochenmarks. T-Lymphocyten sollen ihre Immun­kompezenz im Thymus, B-Lymphocytenin der Bursa FABRICn (bei Vogeln) erhalten.

Diese Vorstellungen zusammen mit den bereits oben angefUhrten Grunden gaben

Veranlassung, das Verhalten der mittels der Phenoloxidase-Reaktion erkennbarenPOZ bei der embryonalen Entwicklung des Huhnes zu untersuchen.

Material und Methoden

Untsrsucht wurden 10 bis 20,um dicke Kryostatschnitte von 3, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18 undknapp 21 Tage bebriiteten Hiihnereiern1). Bis zum 14. Bebriitungstag wurden entweder der gemmteEmbryo oder Teile des Embryos mit Dottersack geschnitten. Ab 15. Bebriitungstag wurden Lunge,Leber, Milz, Darm, Dottersack und Knochenmark des Embryos untersucht. Yom KnochEDmarkwurden zumeist Fingerprints hergestellt. AuJ3erdEm wurdEn Schnitte ven Lunge, Leber, Milz undDarm 2 und 4 Tage alter Kiiken sowie 6 bis 8 Wochen alter HiihnchEn angefertigt. Bei den 4 Tageund 6 bis 8 Wochen alten Tieren wurden auJ3erdEm die BurEa FABRICII und das Knochem:nark

prapariert.Der Nachweis der Phenoloxidase (PO) erfolgte nach SCHMIDT und M6DIS (1974) in der Modifika­

tion von SCHMIDT und KISS (1975). Es wurden jeweils 1 Hauptversuch (HV) und 2 Kontrollversuche

(KV1 und KV2 ) angesetzt. Beim KV1 wurde unter gleichEn Bedingungen wie beim HV, jedoch mit10 min in 90 DC heiJ3em destilliertem Wasser inaktivierten Schnitten inkubiert. Der KV2 enthielt

kein Substrat (L-DOPA). Die Inkubation erfolgte bei 37 DC Kiivetteninnentemperatur unter Be­liiftung mittels Aquariumpumpe. Ein Teil der Schnitte wurde m.it Kresylechtviolett nech SCHMIDT

(1965) gefarbt.

Ergebnisse

Dottersack (Abb. Ibis 7)

Die ersten POZ werden im Dottersack der 6 Tage bebriiteten Ruhnereier nachweis­bar. Sie sind in der Nahe der sich formierenden oder auch in den Zellinseln selbst

1) Fiir die in Halle durchgefiihrten Untersuchungen wurden uns die bebriiteten Hiihnereierfreundlicherweise von der G3fliigelzuchtanstalt (Leiterin: Frau KLENK) des VE Gutes Seeben zurVerfiigung gestellt, wofiir wir herzlich danken.

Das Vorkommen von Phenoloxidose

4 Acta histochem. lid. 5\)

49

50

1

H. SCHMIDT und L. lVI6DIS

8

Das Vorkomrnen H)n Phenoloxidasp 51

lokalisiert, die als hiimatopoetisehe Stammzcllen angeschen werden. Die POZ sind

zuniiehst noeh klein und enthalten nur wenig Reaktionsprodukt. In del' weiteren Ent­wieklung werden sic deutlieher siehtbar. ihre Anzahl steigt - soweit dies beurtcilt

werden kann - ctwas an, und kurz VOl' del' Geburt bilden die POZ Zellgruppen in­

nerhalb del' Zellinseln.

Embryo (Abb. 8 his 31)

1m Embryo sPlbst kannen naeh Iltiigiger Bebriitung (Abb. 8 bis 10) die erstenPOZ naehgewiesen werden. Relativ hiiufig werden sie in Milz und Knoehenmark,vereinzelt abel' aueh in Lunge und Leber gefunden.

~aeh 15tiigiger Bebriitung sind POZ in del' Milz (Abb. 11) in rciehlieher Anzahlvorhandcn, wiihrend Lunge und Leber weiterhin nul' einzelne Zellen enthalten.

Eine au13crordentliche Zunahmc an POZ ist in Milz (Abb. 12) und Knochenmark(Abb. 17) nach 18tiigiger Behriitung festzustellen. Aueh die Lunge (Ahb. 16) und die

tieferen Sehichten des Darm bindegcwebes (A bb. 14) cnthalten vermehrt, die Zottenvoreinzelte (Abh. 1:3) ZeJlon, wiihrond die Leber (Abh. 15) naeh wie VOl' hauptsiiehlieh

nul' einzeJne Zellcn aufweist. ~ur selten kannen kleinc Zellgruppen in del' Leberheobaehtet werden.

Tn den bis kurz VOl" del' Geburt bebriiteten Embryonen ist die Hiiufigkeit del' Zellenin der Leber, Milz und Knoehenmark (Ahb. 18, HI, 21) iihnlieh wie naeh 18tiigigerBebriitung. 1m Bindogewebe dol' Lunge (Abb. 20) ist die Anzahl del' POZ graDer ge­wordon. Tm Darmhindegewcbe ist die Hiiufigkeit untersehiedlieh: An manehen Stellenkeine. an anderen Stellen zahlreiehc Zellen.

Bei den 2 und 4 Tage sowie 6 bis 8 Woehen alten Hiihnehen besteht in etwa noehdas gleiehe Verteilungsbild del' POZ wie kurz VOl' del' Geburt.

In del' am 4. Lehenstag untersuchten Bursa FABRICII sind zahlreiche POZ vor­handon (Abb. 22. 23). Sin sind in auffiilliger WeiRc in del' Umgebung del' Bursa-Follikellokalisiert. vernillzeJte Zellen kcmmcn in den Follikeln VOl'. 1m Vergleieh mit del'Bursa am 4. Lebcllstag ellthiilt das 6 bis 8 Woehen alto Bursa-Gewebe trotz seinerGroBe nur noeh relativ wenige POZ (Abb. 24, 25). Die Lokalisation ist iihnlieh wieam 4. Lebellstag. Die Kontrollselmittc (KV1 und KV2) des Bursagewebes sind wieaile andcren Kontrollell llegativ (Ahb. 26. 27). Tn den Abbildungen 28 bis 31 sind diePOZ in lVIilz. Lebel'. Lunge und Knochcnmark des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes dar­gestellt .

Abb. I .- i. poz im Dou,']'"""k unt"nwhip(lli("h lungp bobriitekr Hiihmlreier.

2

:3

4

naeh 6Uigiger Bebriltung. 250: I

nach !JUigiger Bl'briitung. 250: I

mwh IIUigigl'r Rdll'iitnng. l60: I

na"h l:ltiigigpr Bebriitung. 250: 1

5 nach 15tagiger Bcbriitung. 250: I

6 nach 18tiigiger Bebriiturg. 250: I7 ~. naeh knapp 2ltagiger Bebriitung

(20 Tage und 17 h). 63: 1.

Abb. 8. Einzehw POZ naeh 1 Itiigigel" Bebriitung. a im Bindegewebe des Darmes, b in del' Leber.a 500: 1; b 400: 1.

4*

52 H. SCHMIDT und L. MODIS

Abb. 9. M~hrere POZ in der Milz nach 11tagiger Bebriitung. 400: 1.

Abb. 10. M~hrere POZ im Knochenmark nach 11tagiger Bebriitung. 160: 1.

Abb. 11. POZ in der Milz nach 15tagiger Bebriitung. 125: 1.

Abb. 12. Stark vermehrte POZ in der Milz nach 18tagiger Bebriitung. 80: 1.

Abb. 13. Einzelne POZ im Bindegewebe von Darmzotten nach 18tagiger Bebriitung. 100: 1.

Abb. 14. Zahlreiche POZ im tieferen Bindegewebe des Darmes nach 18tagiger BebIiitung. 80: 1.

Abb. 15. Einzelne POZ in der Leber nach 18tagiger Bebriitung. 400: 1.

Abb. 16. Vormchrung dor POZ in der Lunge nach 18tagiger Bebriitung. 160: 1.

Abb. 17. Starke Vermehrung der POZ im Knochenmark nach 18tagiger Bebriitung. 63: 1.

Abb. 18. POZ in der Milz nach knapp 2ltagiger Bebriitung. Beginnende Anordnung der POZ urn

die ~Iilzfollikel. 63 X .

Abb. 19. Immer noch vereinzelte POZ in der Leber naoh knapp 2ltagiger Bebriitung. 63 x.

Abb. 20. Zahlreiche POZ im Lungengewebe nach knapp 2ltiigiger Bebriitung. 80: 1.

Abb.21. Sehr viele POZ im Knochenmark nach knapp 2ltagiger Bebriitung. 63: 1.

Abb.22. POZ in der Bursa FABRICII am 4. Lebenstag. Betonte Lagerung in der Peripherie der

Bursa·Follikel. 63: 1.

Abb. 23. Wie Abb. 22. 250: 1.

Abb.24. Gewebsbezirk in der 6 bis 8 Woehen alten Bursa FABRICII mit nur noeh wenigen POZ.

63: 1.

Abb.23. Gewebsbezirk in der Bursa FABRICII des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes mit noch mehreren

POZ. Rechts im Bild: Bursa-Strukturen mit Grauschleier. Ob es sich dabei urn PO-Aktivitat handelt,

ist bisher nicht erwiesen. 63: 1.

Abb.26. Kontrolle zu Abb. 22-25, KV1. 1m Bursa-Gewebe sind keine POZ nachweisbar. 63: 1.

Ab':>.27. Kontrolle zu Abb. 22~25. Nur mit Pufferliisung inkubierter Kontrollschnitt (KV2)' Keine

Reaktion. 63: 1.

Abb.28. POZ in der Milz des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. Typische Lokalisation urn die MAL­PIGHISchen Kiirp3rchen. 63: 1.

Abb. 29. Einzelne POZ und Zellhaufen von POZ in der Leber des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes.

160: 1.

Abb. 30. Zahlreiche POZ in der Lunge des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 100: 1.

Abb. 31. Zahlreiche POZ im Knochenmark des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 63: 1.

11

I)a.·, V(ll'k(lI11ll1l'l\ \-011 Ph('noloxida~e

54 H. SCHMIDT und L. ::vrODJS

Da~ VOJ'kornmcn von Phonoloxidase 55

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22

H. SCHUIDT und L. lI6DIS

25

Das VOJ'kommeIl Yon Phenoloxidase 57

58 H. ScmnDT lind L. M:6DIS

Abb. 32. AuJ3erordentlich intensive PO-Reaktion in dem das transplantierte Kllorpelgcwebe urn­

gebenden Bindegeweb3. Oben: aufgelockertJs, unten: kompaktes Binclegewebe. 63: 1.

Abb. 33. VergroJ3erung eles 8ufgelockerten Billdegewebes. Die Zellform entspricht der "on Fibro­blasten. Die Zellkerne geben eine positive PO-Reaktion. 400: l.

Abb.34. VergroJ3erung des kompakten Bindegewebes. Das Reaktiollsprodukt ist anscheinend mehrim Cytosol der Zellen lokalisiert. 400: 1.

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, daO es mit dem Ph3noloxidase-Nachweis moglich ist, den Weg der POZ

bzw. das Verhalten dieser Z311en wahrend der cmbryonalen Entwicklung des Huhnes zu verfolgen.Aus den Untersuchungen ergibt sich folgendes Verhaltensbild: Zwischen 3. und 5. Bebriitungstag

beginnen sich die POZ im Dottersack in oder in unmittelbarer Nahe der hematopoetischen Zellinseln

zu entwickeln. Sie sind hier bis unmittelbar vor dem Geburtstermin nachweisbar, wobei sie sichoffenbar in der letzten Entwicklungsphafe auch im Dottersack noch zu vermehren scheinen (s.

Ahb. 7). In den embryonalen Geweben werden die ersten POZ nach lltagiger Bebriitung sichtbar.Milz und Knochenmark scheinen dabai bavorzugte Zielorgane zu sein, obwohl zurn gleichen Zeit­punkt auch schon vereinzelte Zellen im Bindegewebe des Embryos auftreten.

Zwischen 15. und 18. Entwicklungstag des Embryos folgt dann eine intensive Vermehrung derPOZ in Milz und Knochenmark, aber offensichtlich aue:h im Bindegewehe. In der Milz beginnt sichZll diesem Zeitpunkt jenes Zustandsbild herauszubilden, wie es am geschliipften Tier zu beobachtenist, namlich eine strenge Anordnung der POZ urn die MALPIGHISchen Korperchen (SCHMIDT und M6­DIS 1974). Die Haufigkeit der POZ im Knochenmark scheint nach dem 18. Bebriitungstag im beob­achteten Entwicklungszeitraum keine wesentliche Veranderung zu erfahren. Ob dieser Zustand je­doch im weiteren Lebensverlauf des Huhnes unverandert bleibt oder nicht, bedarf noch der weiteren

Das Vorkommen von Phenoloxidase 59

Unt,3l'suehung. B.>i erwachsenen Ratten kormten beispielsweise im Knochenmark keine POZ gefun­

den werden (SCHMIDT und M6nrs 1974). Hier konnen abel' aueh Speeiesunterschiede vorliegen, da

zum BJispiel die L)ber 1,2 und 3 Tage alter Ratten (unverOffentliehte Ergebnisse) sehr viele, die des

Huhnes nUl' wenige POZ enthiilt. 1m Bindegewebe del' Lunge ist die Vermehrung del' POZ zwischen

IR. lIIHI 21. Bebriitungstag, also kurz VOl' del' Funktionsaufnahme, auffiillig.

Infolgc del' schon eingangs erwahnten Bedeutung del' Bursa FABRICII bei den heutigen Vorstel­

lungen iiber (lie Entwieklung immunkompetenter Zollen ist dom Verhalten del' POZ in diesem Organ

bosonclere Aufnwrksamkeit zu widmen. Xach OLAH, RiiHLIcH und TiiRii (1975) entwiokolt sioh die

Bursa in den erston ;3 \Vochen naeh del' Geburt. Zwisehon 3. und 8. Woehe bleibt sie dann konstant,

urn sieh danaeh zuriiekzubilden. Die Bursa \l'urdc somit zu Beginn ihrer Entwieklung (4. Lobenstag)

und kurz \"rJl' ihrel' IIl\'olution (6 bis R \Voehen alt) untel'sucht. Dio Ergebnisse weisen aus, daE die

Hiiufigkeit del' POZ in b2id(m Ent\l'ieklungsstadien vcrsehieden ist. Jm sioh entwickelnden Organ

sind viole. im involutionsnahen Organ l,,'lativ wenige Zellen vorhanden. Diesel' Befund woist auf

Beziehungen zwischen Hiillfigkeit del' I'OZ und Funktionszustand del' Bursa FABRICII hin.

Aus clem dargdegten Verhalten del' I'OZ ]wi del' Entwieklung des Huhnos ergibt sieh, daE die

POZ oino Z"llpoplliation sui generis darstellen, die in den blutbildenden Zellinseln des Dottersaekes

enbteht un(I deren Entwicklungsgang sieh teilweise zu dem del' eingangs erwahnten '1'- und B­

Lymphocyten in Beziehung setzen liif.Jt. Ais Konsequenz ergibt sieh daraus, daE zum Beispiel fUr

dif' naeh einer Bursa-Exstirpation auftretenden immunologisehen Fehlleistungen aueh die POZ ver­

antwortlich Selin k"nnen. Aus eigeIH'n, ZlllTt Tei! bisher unvoroffentliehten Untersuehungen haben

sieh sehon zahlrpi('he Hinweise el'geben, dip flir pine Beteiligung del' POZ an immunologisehen Pro­

ZeSS"Il sprechen. ~o sind zum Belispiel im Granulationsgewebe, das bei del' Implantation von Deck­

gliisehen in die BalH·hhiihle \-on Ratten auftritt, zahlreicho POZ nachweisbar. Bei del' Liehenificatio

gigantea hypcrtrophieans (~CH~llDT, STI~'l'Z und WOZXIAK) (im Druck), die als Reaktion del' Haut

auf Chemikalien, Proteine, Bakterien odeI' Pilze angesohon wirel (LEVER 1958), sind, wie sehon er­

wiihnt, vermehrt POZ vOl'handcn. Aueh die beim Melanom naehgewicsenen POZ (SCHMIDT und

STINTZ 1\)75) kbnnten als im Dienstc dc,; Immunsystems stehonde Zellen interpretiert werden, und

sehlie/3liehliefern die zahlreichen bei del' Implantation von Rindernasenseheidewandknorpel in das

subkutane Gewebe del' Hatte auftretenden POZ (Abb. :12 bis ;34) eincn direkten Nachweis fUr ihre

Mitwirktmg bei del' Abwehl' (Killerzelle'!) von Fremdgewebe.

Auf del' Basis del' gegenwiirtigen Kenntnisse iiber die 1'OZ und im Zusammenhang mit den Vor­stellungen iiber (Ii" Entwieklung immunologisch aktiver Zellen el'seheint es nieht unmbglich, daE

aueh die POZ cineI' Differenzierung llutel'liegen und in versehiedcncn Kompetenzbcreiehcn, wie beidel' gewcbsabhiingigen und humoralen Immunabwehr odeI' dcr Bildung von Granulationsgewebc,tMig Wpnlpll.

Literatur

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Anschrift der Verfasser: Doz. Dr. Dr. H. SCHlIIlDT, Physiologisch-ehernisehes Institut der Martin­Luther-Univel'sitat, DDR - 402 Halle (Saate), HoIlystraLle 1, l'Gstfiwh 184 und Dr. L. MODIS, C. Sc.,Anatomiseh-Histologiseh-Ernbryologisehes Institut der lVIedizinischen Universitat, H - 4012 De­

bl'eeen, Ungarn.