W. I)I~M:.~IR, G. SCttWIh-DLI~G-MA~'DERSCtIEID: Einflul~ der UV-Bestrahlung. 179

Acad. Sei. 81,129 (1950); d. Chem. Abstr.1952, 5946.--12MILLER, C. C. : J. chem. Soc. 1941, 72. - - 12~ BRETSCtt~EIDER, G. : Diplomarbeit Hannover (1949). - - 13 VAz~ossL R.: Anales Asoc. qulm. argent. 38, 363 (1950). - - 13~ HtrDGE_~-S, J. E. jr., und L. C. N]~LSOrr: Analyt. Chemistry 24, 1472 (1952). - - ~a BocK, R. : DBP-Anmeldung B 21734 IV b/12i, (1952). - - x5 Vgl. FISeH~, W., u. R. BocK: Z. anorg, allg. Chem. 249, 146 (1942) ; vgl. diese Z. 188, 113 (1951). - - le BY]~, J. : C. 1~. Acad. France 208, 321 (1936).

Priv.-Doz. Dr. R. BOCK, Hannover, Ca]linstr. 46.

Aus dem Univer~it~tsingtitut ftir Lebensmitte!chemie •rankfurt am Main (Leiter: Prof. Dr. Dr. W. DIE.~r~m).

Der Einflul~ der UV-Bestrahlung auf die Citronens~iure der Milch.

Von ~,u DIEMAIR und G. SGHVfINDLIJNG-IM_A.NDER~CIIEID.

Mit 1 Textabbildung.

(Eingegangen am 22. Dezember 1952.)

Uber die antirachit ische Wirkung yon Citronensgure bei der mensch- lichen Spontanrachi t is und bei der Tierrachitis berichten E. HEINZ, E. MitLLv.~, E. ROMI~G~R 1 an H a n d umfangreicher chemisch-physiolo- gischer Forschungsergebnisse. I n der Zwischenzeit sind auch weitere Untersuchungen yon W. HENNIG, N. SCttMAHL U. W. THEOBALD2'er - schienen, die zum Rachi t isproblem Stellung nahmen, eine komplexe Bindung zwischen Ca und Citronensaure nachwiesen und die Zusammen- setzung solcher Komplexe aufklarten. Dami t ha t die ]3eweisffihrung fiir den Zusammenhang zwischen Knochenwachs tum und Citronensaure- ~offwechsel eine weitere experimentelle Stiitze gefunden. Die Frage, ob die Citronensaure w~hrend der iiblichen Bestrahlung der Milch im R a h m e n der molkereitechnischen Bearbei tung eine Veranderung erfahrt, ha t erhShte Bedeutung gewonnen, weft da und dor~ die MSglichkeit einer Schadigung, Inak t iv ie rung und Denatur ie rung yon wichtigen Milch- bestandteflen zwar erwogen wurde, aber experimentell nicht bewiesen werden konnte. Die vorliegende Arbeit soil zur K]arung der offenen Frage beitragen.

Experimenteller Tell. Zunachst wurde in Modellversuehen die Citronensanre nach K. Ti4UFEL

U. F. M A ~ a bes t immt und der Gehalr auf denjenigen der Milch ein- gestellt.

Dabei wurden 10 ml CitronensaurelSsung (30,2 mg Citronensaure -- 90 m/ dest. ~u -- 6 rnl PufferlSsung) mit Siedesteinchen in einen

12"

180 ~u DIE3iAIR u n d G. ~CtIWI_~'DLI~G-MANDEI~SCBEID :

Destillierkolben gebracht. Die Vorlage war beschickt mi~ 15 ml 2 n KOH- LSsung. Mit Hilfe eines Tropftrichters wurde 0,05 o~ ige KMnO4-LSsung so lange in die Citronens~urelSsung eingetragen, bis die KMnO4-Farbe mindestens 5 rain bestehen blieb. Dann wurde die Destillation noch

weitere 20 rain fortgesetzt, die Tabelle 1.

Citronens~iure (1.tt,,O) mg

vorgelegt

30,20 30,20 30,20 30,20 30,20 30,20

gefunden

26,,$8 26,85 26,8S 26.81 26,92 26.88

im Kiihler verbliebenen An- teile wurden in die Vorlage ge- spiilt, und durch tropfenweise Zugabe yon 10 ml 0,1 n Jod- 15sung wurde das Ace ton in Jodoform umgesetzt. Nach- dem der Kolbeninhalt unter h/~ufigemUmschwenken 30 rain lang stehen geblieben war, wurde mit 10 ml 25~

Schwefels/~ure anges/~uert und das ausgeschiedene Jod mit Thiosulfat- 15sung zuriicktitriert. Die Werte sind in Tab. 1 und 2 zusammengefaBt.

Bei den in Tab. 2 aufgefiihrten Werten waren .an Stelle yon 15 ml 2 n KOH-LSsung 20 ml verwendet worden und 20 ml 0,1 n JodlSsung. Man erkennt, dab die Ergebnisse im Durchschnit t um 11,14~ unterhalb der theoretischen (vorgelegten) Menge liegen. Eine l~achpriifung dieser Befunde ergab, dab Mengen yon 20---30 mg CitronensEure mindestens 4 Std nach der Zugabe der JodlSsung stehen bleiben miissen und dab nach der Oxydation die :Destillationszeit auf 8--15 rain beschr/~I~kt werden kann. Hi~lt man diese Bedingungen nicht genau ein, dann t re ten erhebliche Fehlbetrs auf, wie die Tab. 3 erkennen ls

Tabelle 2. Bestimmung der Citronens~iure nach TXUFEL U. MAY~.

Citronens~ure (1.H..O) :Fehlbetrag Felflbetrag mg

vorgelegt gefunden i. mg rag%

30,20 15,10 30,10 30,57 30,57 30,57

27,55 14,35 26,50 25,97 27,97 25,13

2,65 (--) 0,75 (--) 3,60 (--) 4,6o (--) 2,60 (--) 5,44 (--)

S,77 (--) 4,97 (--)

11,96 (---) 15,05 (--) S,50 ( - )

17.80 (--)

Verwendet wurden: 10 ml Citronens~urel6sung, 90 ml Wasser, 6 ml PufferlSsung, 50 ml 0,05 (~o ige KMnO4-LSsung, 20 ml 0,01 n JodlSsung. Die Tabelle zeigt, dab es zweckmiiBig ist, nicht 30 rain lang, sondern nur 10 min lang zu destillieren. Des weiteren verminder t sich der Vet- lust an Citronens~ure, wenn die LSsung nach der Zugabe der JodlSsung mindestens 1 Std lang steheL~ gelassen wird. In keinem Fall war bei der

Der EinfluB der UV-Bestrahhmg auf (lie Citroaensiiure der Milch. 181

nur 8 min dauernden Destillation Citronens~ure iu der Destillations- flfissigkei~ nachweisbar, was durch 15 rain langes Erhitzen des Riick- standes bewiesen werden konnte. Bei geringen Mengen Citronen's~ure (20--30 mg) kommen die Ergebnisse der Theorie am n~iehsten, wenn

Tabelle 3. Bestimm~r der Citrone~tsdtere nach TX[TFEL ~t. MA:CI~.

Ci~ronens~ure (1.tt.O) Verlust mg

bercctmct gcfunden rag%

30,24 30,24 29,98 27,20 30,24 27,20 27,20 30,24 30,05 30,05

25,73 25,90 24,92 24,15 26,95 24,50 24,50 28,35 28,24 28,28

14,91 14,31 16,88 11,21 * 10,88 * 10,00" 10,00" 6,25 * * 6,02** 5,89"*

* Diese Proben wurden 10 rain lang destilliert und 1 Std lang naeh der Jod: zugabe stehen gelassen.

** Diese Proben wurden ]0 rain lang destilliert und 4 Std lang nach der Jod- zugabe stehen gelassen.

10 min lang destilliert und 4 Std nach der jodzugabe das fiberschiissige Jod zurficktitriert wird. - - Die erheblichen Abweichungen yon den vor- gelegten Mengen und die niemals erreichbare ~bereinstimmung mit den theoretischen Werten veranlal3te, an Stelle der obigen Methode diejenige yon R. CoPPerS 4 auf ihre Eignung ffir unsere Zwecke zu iiberpriifen.

0,5

0,7

I i l ! I I I

I- i 0./ o,z a3 0,0 0,5 0,6" g7 0.8 0,9 1,0 Z/ 7,Z

Oitronen~)~re .kbb. 1. Eichkurve zur Bes t immung der Citronensiiur(,.

Diese etwas umst~ndliche nnd zeitraubende Methode, welche je naeh den Versuchsbedingungen zu guten, aber aueh zu sehleeht reproduzi'er- baren Werten fiihren kann, muBte fiir unsere Versuche abge~ndert wer- den. Dies erfolgte in der Weise, dab das gebfldete Pentabromaeeton in Petrol~ther gelSst und diese LSsung mi~ einer Na2S-GlycerinlSsuhg aus- geschiittelt wurde. Dabei ist zu bemerken, dab das Penfabromacer in

182 ~tV. DIESIAIR und G. SCttWINDLII~-G-I-~A~DERSCHEID:

kaltem Petrol~ther schwer 16slich ist, weshalb die L6sung bei dem Aus- schiitteln auf Zimmertemperatur erv~rmt werden muB. Bei grSBeren Mengen yon Pentabromaceton ist die vollst~ndige AuflSsung etwas schwierig, weshalb man zweckm~Bigerweise das Wasser aus dem Seheide- trichter in das KSlbchen flieBen liiBt, in welchem sichder noch ungel6ste Riickstand befindet. Dann 15st sich das ganze Pentabromaceton klar auf. )/Iit dieser abge~nderten Methode ]assen sieh gut reproduzierbare Werte erhalten, allerdings ist die Methode umst~ndlich und daher ffir Reihenuntersuchungen weniger geeignet. Als Filter zeigte S 47 die ge- ringste Durchl~ssigkeit.

Tabelle 4. Best~mmung der Citronensgure nach der Pentabromacetonmethode.

Citronensiiure (1.H20) mg Trocknung des :Niederschlags

bercchnet gefunden

29,98 29,98 12,00 12,00 12,00

- 12,00

,28,55 28,57 9,19 6,68 6,49 7,33

fiber Schwefels~ure

4'Std fiber ~aCl 2 12 . . . . . . 12 . . . . . . 10 . . . . . .

Da das Verfahren yon R. COPPENS fiir Reihenversuche zu umst~nd- lich war, wurde fiir die folgenden Untersuchungen die T)iUF~.L-)/IAYRsche Methode angewandt und dabei wurden die in der Tab. 3 gemachten Er- fahrungen hinsichtlich der Destillationsdauer berficksichtigt.

Bes t immung der Citronens~ure in Milch. Die Frage, ob die Citronen- s~ure bei der UV-Bestrahlung der Milch ver~ndert wird, veranlaBte zu- n~chst zur Feststellung des Citronens~uregehaltes der unbestrahlten

Tabelle 5. Bestimmung yon Citronensgure in unbestrahlter und bestrahlter FoUmilch.

Azt der u

unbestrahlt 1 maI bestrahlt 2 real bestrah~t 3 real bestrahlt M~germileh

" 3 real bestrahlt

Citronens~ure (1.H20) g/1

direkt bestimmt [ nach 10 Tagen bestimmt

1,53 1,42 1,65 1,75 1,68 1,64 ' " 1~71 1,43

2,84 2,45

Milch. 100 ml Milch wurden mit einer L6sung yon 2,0 g Trichloressig- s~ure.in 100 ml Wasser bei 40 ~ C versetzt und nach kr~ftigemSchiit te!g filtriert. Das Filtrat ~ r d anf 500 ml aufgefiillt und mit einigen Kristall~en Thymol (Bakterienschutz) versetzt. Bei s~mtlichen Versuchen wurden jeweils 10 ml des Serums verwendet. Aus den Ergebnissen in der Tab. 5

Der Einfluft der UV-Bestrahlung auf die Citronens~ure der Milch. 183

ist zu en tnehmen, dal~ der Citronens~uregehalt der Milch auch bci l~ngerer Aufbewahrung im Ki iMschrank deutl ich a b n i m m t ; d a s - selbe ist der Fall , wenn die Milch bes t rahl t 3vird~ wie die Tab. 6 zeigt. Es ist zu ersehen, dal3 die Citronens~ture~ einen A bba u erleidet, wenn d i e

Tabelle 6. Abnahme des Citronens&~tregehalte8 von bestrahlter Vollmilch nach liingerer A u/bewahrung.

mg Citronens~ur'e in 10 m] des Serums der Vollmilch Best immung Vollmilch

lmaI bcstrahlt 2mal bestrahlt 5real bestrahlt ! 6real bestrahlt

�9 lirekt bestimmt 27,82 26,95 24,67 '~!~ 24,50 nach 7 Tag. bestimmt 23,62 24,50 23,97 i __ nach 17 Tag. bestimm~ 23,10 23,97 22,92 [ 21,15

Milch nach der Bes t rah lung s tehen bleibt. Die Fr~ge aber, ob die Ci- t ronens~ure bereits durch die Bes t rahlung beeinflul]t wird, mul~ erst exper imente l l bean twor te t werden. Zu diesem Zwecke mul] ten Modell- versuehe mi t definierten Citronens~urelSsungen durchgef~hrt werden, de ren Gehal t demjenigen der Milch entspraeh.

Tabelle 7. Gitronensauregehalt von bestrahlter (ST~I~m~IL) Milch.

Citronens[ture (1.tt..O) rag/10 ml 1 real bestrahlt I 2 real bestrahlt I 3 mal bestrahlt t 4 mal bestrahlt 15 real bestrahlt ! 6 raal bestrahlt

27,82 ] 26,59 i: 27,47 25,52 24,67 24,50 - - i 23,62 i - - i 23,97 32,97 25,97

23,62 i 24,50 ! 22,93 ] - - - - - - 23,10 i 23,97 i , 24,85 I 28,35 22,92 21,53

Die Ergebnisse, die in Tab. 7 zusammengefai~t sind, lassen keinerL deut l ichen Bestrahlungseffekt erkennen, weshalb die folgenden Versuche �9 mi t dem UVM-Ger~t der Qarzlampengesellsehaft (Hanau) durchgefiihrt . wurden. Mit diesem Ger~t ist eine in tens ive Bes t rah lung mSglich. Dies geht aus der Tab. 8 hervor, welche e rkennen ] ~ t , da~ die Citronen- s~ure im Mittel e inen Verlust yon 5,11 ~ o erleidet. Bei der Bes t rah lung

)

Tabelte 8. A bnahme des Citranensiiuregehaltes dutch U V-Bestrahlung ( U V~I).

Citronens~ure (1.~.~0) rag/10 ml Verlust dutch Bestrahlung unbestrahlt I real bestrahlt mg %

27,05 27,05 27,05 27,05 27,05 27,23 27,23 27,23

25,20 26,25 25,02 29,90 25,20 26,25 26,25 26.25

1,85 0,80 2,03 1,15 1,85 0.98 0,98 0.98

6,84 2,95 7,50 4,25 6,84 3,59 3,59 3,59

184 ~V. DIE~L~II~ mid G. SCIIWI~DLING-MANDERSCHEID:

in den technischen Bestrahlungseh~richtungen (Steinheil-Vitaminator) bleibt die Citronens~ure in ~ter Milch nahezu unverAndert bzw. die Ein- flui]nahme ist so geringffigig, dab sic im Bereich der Fehlergrenze liegt.

Tabelle 9. Citronensiiurebestimmung in UVM-bestrahlter Magermilch, Vollmilch ,~nd bestrahltem Rahm.

citronensiture Probe BestrahlungsgerAt (I.H~O) g[1

Magermilch

Magermileh bestrahlt

Vollmilch

Vollmilch homogen. R ahm yon 1 1 Milch

R,~hm yon 1 1 Milch best rahlt

UVM

~ T E I N ~ I E I L

,7

unbestrahlt LWM

lmbestrahlt

STEINt IELL

Vitamflmtor 3 real bestrahlt

unbestrahlt

U~;M

1,40 1,40 1,38 0,93 0,93 0,63 1,61 1,59 1,82 1,53 1,53 1,85 2,03 1,22 1,54 1,78 1,08 1,43 1,31 1,4i 1,45 1,34 1,36 1,68 1,69 1,36 1,66 1,63 1,48 0,66

0 ,63 0,61 1,36

1,50 0,52 0,52 0,23 0,23 0,05 0,08 0,11

Der EinfluI~ der UV-Bestra.hlung auf die Citronens~ure der Milch. 185

Die Bestimmung der CitronensSure in der U VM-bestrahlten Milch. Vor der Bestrahlung wurde 1 1 Milch entfet tet und davon wurden 100 ml mit Trichloressigs~ure gef~llt und vom Serum 10 ml zur Bestimmung an- gesetzt; dazu wurden 90 ml Wasser und 6 ml PufferlSsung gegeben. Die Vorlage wurde mit 20 ml KOH-LSsung beschickt, und zur Oxydation wurden 30 ml 1 ~o ige KMnO4-LSsung verwendet. Die Destillationsdauer war. 10 rain. Bei s~mtlichen Versuehen wurde ein Blindversueh angesetzt. War die Citronens~uremenge sehr gering, so fiel unmittelbar nach der Zugabe der 20 ml JodlSsung kcin Jodoform aus. Die erhaltenen Zahlen- werte sind in der ~rab. 9 zusammengefaf~t.

Zusaminenfasslmg. Zur Kl~rung der Frage, ob die Citronensi~ure der Milch durch UV-

Bestrahlung zerstSrt wird, wurden Bestrahlungsversuche mit w~Briger Citronens~urelSsung in der STE]:SHI~ILschen Apparatur durchgeffihrt. t t ierbei land eine Citronens~urelSsung Anwendung, welche 2,0 g Ci- tronens~ure im Liter enth~lt. ~berprfift wurden verschiedene Be- stimmungsmethoden, yon denen diejenige yon CoPPErs besondere Be- achtung verdient. Sie beruht auf der F/~llung der Citronens~ure als Pentabromaceton, W~hrend die gravimetrische Methode schlecht re- produzierbare Werte liefert, ist dieses Arbeitsverfahren gu~ brauchbar, wenn das Ped tabromace ton in Petrol~ther "gelSst, mit Glycerin-Na2S ausgeschfittelt und stufenphotometrisch ausgewertet wird. Neben diesem reeh~ umst~ndliehen Verfahren ist dasjenige yon K. TXVF~L U. F. MAYR zu erw~hnen, wenn einige Ab~nderungen beriieksiehtigt wer- den. So darf die VersuehslSsung mit KMnO 4 hSchstens 10 min tang ge- kocht werdcn und es ist erforderlich, dab mindestens 4 Std lang naeh der Jodzugabe die Umsetzung zu Jodoform abgewartet wird. Tut man dies nieht, dann fallen die Werte zu niedrig aus. Die vorgelegte Citronen- s~ure wird mit einem Verlust von durehsehnittlieh 5~10~o wieder- gefunden, innerhalb einer GrSi~enordnung yon 30 rag. W~hrend die STEINH~ILsehe Bestrahlungseinrichtung infolge ihres AusmaBes mit mindestens 101 Citronens~urelSsung besehickt werden muB, um eine einwandfreie Bestrahlung zu gew~hrleisten, war ffir die Versuehe mit dem UVM-Ger~t der Quarzlampengesellsehaft (Hanau) nur i 1 Citronen- s~urelSsung notwendig. In mehreren Versuehen konnte gezeigt werden, dal~ der Vertust an Citronens~ure durch die Bestrahlung durchschnittlieh 5,1 ~ o betr~gt.

Daraus folgt, dal~ die Cit~onens~ure durch kr~ftige Bestrahlung mit UV derart ver~ndert wird, dab sie durch Oxydation mit KMn04 zu Aceton nicht erfaBt werden kann. Die Ver~nderung, welche die Citronen- saure in der Milch durch Bestrahlung mit ~ter STEINnEILschen Apparatur

186 A. CASTIGLIO~I und M. NIvoLI: Piperazinbestimmung.

in der tiblichen Weise unter Berficksichtigung der Fflmdicke, Durchlauf- geschwindigkeit , Tempera tu r usw. erf~hrt, ist so gering, daI~ die erh~lt- l ichen Zahlenwerte innerhalb der Fehlergrenze liegen.

Litera tur .

1 HEINZ, E., E. ML~LLER 11. ]~. ROMI~TGER: go Kinderheilkunde 65, 101 (1947). - - ~ H]~NNIG, W., N. SCItMAHL u. W. THEOBALD: Biochem. Z. 321, 401 (1951); vgl. W. DIEMAIR U. G. MAI~D:ERSCHEID-ScttwII~DLING: diese Z. 129, 154, 254 (1949). - -

TXUFEL, K., u. F. ]V[AYR: diese Z. 98, 1 (1933). - - ~ Co~PE~s, R. : Bull. Inst. a ~ o - nora. Star. Rech. Gembloux 17 (1948/49).

Prof. Dr. Dr. W. D[~MA~R, Frankfurt a. M., PauI-Ehrlich-Str. 40.

Aus dem Institut ffir Warenkunde der Universitat Turin.

Piperazinbestimmung. VII. Mitteilung 1.

Von AN(~ELO CASTIGLIONI und MARIA ~TIVOLI.

(Eingegangen am 6. Januar 1953.)

Bei Hinzufi igung einer I0~ igen w~l~rigen LSsung yon Chroms~ure zu einer ebenfalls w~l~rigen LSsung yon Piperazin scheidet sich beim Ab- s tehen ein kristallinischer orangegelber •iederschlag ab, der in 95 ~oigem Alkohol ganz" unlSslich und in Wasser nu t schwer 15slich ist. Seine Zu- sammense tzung entspricht der des Piperaz indichromats (C4HsN~)Cr~07, wie sich dies aus den Resu l ta ten der Analyse ergib~: �9

Ftir (C4HsN2)Cr207 : berechnet: N~ 9,33% Cry03 50,65% gefunden: 9,21% 50,63%.

Analog dem Verhal ten yon A m m o n i u m d i c h r o m a t 2 zersetzt sich das P iperaz indichromat auch unter der E i n ~ r k u n g y o n Hitze. W e n n man es im Ofen bis au f 100 ~ C erhitzt , n immt es eine br~unliche F~rbung an und verliert an Gewicht. Die Bri~unung und der Gewiehtsverlust nehmen an St~rke zu, wenn m a n ~ das Erh i tzen bei 100 ~ C ~ei ter fortse'tzt und mehr noch, wenn m a n au f hShere Tempera tu ren erhitzt. Bei e twa 160 ~ C entzfindet sich die Verbindung und brennt leicht ab unter Hinter lassung eines reichlichen Riickstandes y o n Chrom(I I I ) -oxyd . ~ b e r die Einzel- hei ten dieser thermischen Zersetzung werden wir ni~chstens berichten.

W e n n m a n in Gegenwart eines ~berschusses an Chromsi~ure arbeitet, erfolgt die F~llung des Piperazins quant i t a t iv ; die Reak t ion kann a ls dann zur P iperaz inbes t immung nu tzba r gemacht werden, wenn ma~ fol- gendermaI~en arbei tet :