Reprod. Dom. him. , 29,l-11 (1994) 0 1994 Paul Parey Scientific Publishers, Berlin and Hamburg ISSN 0936-6768

Gynkolo 'sche und Ambulatorische Tierklinik der Ludwig-Maximilians-Universitat

Universitat Munchen:! Munchen P. , Lehrstuhl fix Physiologie der Fortpflanzung und Laktation, Technische

Der Einflu0 einer Langzeitapplikation dm GnREI-Agonisten Buserelin auf die Samenbeschaffenheit sowie die Konzentration von LH, Testosteron und bstradiol-17D beim Bullen

J. Braunl und E. Schallenberger2

In halt: Es wurde der EinJuJ einer chronischen Applikation des GnRH-Agonisten Buserelin auf die Samenbeschaflenheit sowie die Konzentration von LH, Testosteron und Ostradiol- 17J beim Bullen iiberpriift. Die Behandlung erfolgte in Form von subkutanen Implantaten (2,8 mg Buserelin), aus denen der Wirkstosf langsam freigesetzt wird. An zwei Bullen wurden j e zwei Implantate (5,6 mg), an zwei weitere Bullen j e vier Implantate ( I I , 2 mg) ver- abreicht, ein Bulle wurde scheinbehandelt. Zur engvnimmunologischen Hormonbestimmung dienten Serien von je sechs Blutproben, welche im stiindlichen Abstand aus der V. jugularis sieben Tage vor sowie I , 7, 35 und 93 Tage nach Einsetzen der Implantate gewonnen wurden. Bei allen funf Bullen wurden in einem Zeitraum von vier Wochen vor bis 13 Wochen nach Begrnn der Behandlung wiichentlich zwei Ejakulate gewonnen. In j e fimf Ejakulaten aus der Periode vor sowie der I . - 5. Woche @he Behandlungsphase) und 9. - 13. Woche (spiite Behandlungsphase) nach der Implantat-Applikation wurde die Spermien- Motilitat (Prozentsatz vorwartsbeweglicher Samenzellen und Durchschnittsgeschwindigkeit vorwartsbeweglicher Spermien), die Spermien-Koiuentration und die Morphologie der Samemellen untersucht. Die LH-Sekretion war nur bei zwei Bullen am ersten Tag nach Implantation signlfikant erhoht; zu allen spteren Untersuchungszeitpunkten war bei allen behandelten Bullen eine Erniedrigung der basalen LH-Sekretion festzustellen. Bei drei der vier GnRH-behandelten Bullen kam es zu einer signlfikant erhohten Testosteron- und ~stradiolsekretion an den Tagen 7 und 35. Es bestand k i n grunhdtzlicher Unterschied in der Hormonreaktion nach Applikation von zwei bzw. vier GnRH-Implantaten. Das Kontrolltier wies weder Ver- anderungen der Hormonsekretion noch der Samenbeschafenheit auJ: Die Werte f i u die Samenparameter Motilitcit, Konzentration und Morphologie iieJen wdhrend der gesamten Beobachtungdxuer keinen EiniuJ der GnRH-Applikation erkennen.

Contents: Longterm treatment with the GnRH agonist Buserelin in bulls and its influence upon semen characteristics and concentrations of LH, testosterone and oestradiol- 170. The influence of a continuous treatment with the GnRH agonist Buserelin upon semen cha- racteristics as well as concentrations of LH, testosterone and oestradiol-17J was examined in the bull. The hug was administered subcutaneously as a slow-release implant (2,8 mg Buserelin). Two bulls recieved two implants (5.6 m@, two bulls were injected with four implants (11.2 mg) and one bull was sham-treated Series of six blood samples were collec- tedfrom the jugular vein in hourly intervals seven days prior to and I , 7, 35, and 93 days after GnRH implantation, Hormone concentrations were determined in blood plasma by enzyme-immunmsqw. Ejaculates were obtained twice weekly from four weeks before until

U.S. Copyright Clearance Center Statement: 0936-6768/94/2901-001 $02.50/0

2 J. Braun und E. Schallenberger

13 weeks afrer drug implantation. Five ejaculates eachfrom the period before treatment as well from the early (week 1 - 5) and late (week 9 - 13) treatment period were used to determine the effects of GnRH administration on sperm motility (percentage of progressively motile spermatoroa, average veloci9 of progressively motile spermatozoa), sperm concentration and sperm morphology. LH concentrations were increased in two bulls on the first day aJer drug implantation, fiereafrer, LH was decreasing in all animals. 1;: three out of four treated bulls, testosterone and Oestradiol-17J were significantly higher on days 7 and 35 after GnRH implantation. There was no apparent difference in hormone secretion of bulls recieving either two or four implants. The sham-treated bull exhibited no change of hormone levels and semen charac- teristics. GnRH treatment had no effect on the semen parameters motility, concentration and morphology throughout the experimental period

Einleitung

Eine einmalige Gabe von GnRH oder GnRH-Analogen bewirkt beim Bullen eine auf mehrere Stunden befristete erhohte Ausschiittung von LH und Testosteron (Schams et al., 1974; Thibier, 1976; Schanbacher und Echternkamp, 1978; Post et al., 1987). Uber die Auswirkungen einer lager andauernden Applikation von GnRH auf die Hypothalamus- Hypophysen-Gonaden Achse ist dagegen beim Bullen bisher nur wenig bekannt. Die Gabe eines GnRH-Analogs Buserelin (109 pg/Tag) mittels einer implantierten Mini-Pumpe iiber 22 Tage oder 42 Tage fiihrte zu einer Stimulierung der Testosteron-Sekretion wahrend des gesamten Zeitraums (von Rechenberg et al., 1986). Viermal tagliche Injektionen von je 150 pg des Analogs Nafarelinacetat iiber 15 Tage bewirkten ebenfalls eine erhohte Testosteron- Ausschiittung (Melson et al., 1986), wobei die Sekretion von LH nur in den ersten Stunden nach der initialen Injektion erhoht war. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen bei anderen Spezies, bei denen eine chronische Verabreichung von GnRH-Agonisten zu einer Hemmung der Hypothalamus- Hypophysen-Gonaden Achse und, mit Ausnahme des Schafes, auch m einer Hemmung der Spermatogenese fhhrt (Ratte: Labrie et al., 1978; Hund: Sandow et al., 1980; Vickery et al., 1984; SchaJ Fraser und Lincoln, 1980; Lincoln et al., 1986; Pferd: Boyle et al., 1991; Primaten: Vickery und McRae, 1980; Bint-Akthar et al., 1983; Mensch: Faure et al., 1982; Schiirmeyer et al., 1984). Der EinfluB einer chronischen GnRH-Verabreichung auf die Samenbeschaflenheit ist beim Bullen bisher nicht untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen einer chronischen Applikation des GnRH-Analogs Buserelin auf Hormonsekretion und Hoden- hnktion zu uberpriifen.

Material und Methoden

Tiere: Die Untersuchungen wurden an 5 Bullen der Rasse Deutsches Fleckvieh im Alter zwischen 15 und 24 Monaten und einem Gewicht von 473 kg bis 578 kg durchgefhhrt. Die Bullen waren in Anbindehaltung aufgestallt, die Fiitterung bestand aus Heu, Stroh und Kraft- ktter. Die Implantate wurden mittels einer groBlumigen Kaniile mit passendem Mandrin an der linken und rechten Halsgegend nach Reinigung und Desinfektion subkutan appliziert. Es wurden keine entziindlichen Reaktionen an den Injektionsstellen beobachtet. Bei zwei Bullen wurden je zwei Implantate eingesetzt (Behandlungsdosis 5,6 mg), zwei weiteren Bullen wurden vier Implantate eingesetzt (Behandlungsdosis 1 1,2 mg). Bei einem Kontroll-Bullen

E d u B einer Langzeitapplikation von Buserelii auf die Sarnenbeschaffenheit beim Bullen 3

wurde eine Schein-Applikation an zwei Stellen durchgefiihrt. Die Versuche wurden im Zeitraum Juli bis September durchgehhrt.

Prdparut: Es wurde das GnRH-Analog Buserelin [D-Ser(B~t)6,Des-Gly1~-EA] (Hoechst AG, Fr&rt/Main) eingesetzt. Nach subkutaner Applikation des fadenformigen Imp!antates wird der Wirkstoff (2,8 mflmplantat) aus dem Tragermaterial (PolylaktidGlykolid Kopoly- mer, 75:25 molares Verhiiltnis) kontrolliert abgegeben; bei Ratten wurde eine Freisetzung iiber 12 - 15 Wochen mit einer ausgepragten Plateauphase von der dritten bis zur zehnten Woche nach Applikation beobachtet (Sandow et al., 1989). Entsprechende Untersuchungen beim Rind liegen nicht vor.

Samengewinnung: Von den Bullen wurde uber einen Zeitraum von 4 Wochen vor bis 10 Wochen nach der 4-wochigen Behandlungsdauer wochentlich zweimal im Abstand von drei bis vier Tagen Sperma mit Hilfe einer ktinstlichen Scheide gewonnen. Um eine Beeinflussung der Ejakulatzusammensetzung durch Unterschiede in der Libido (kurze oder lange Reaktions- zeit) zu vermeiden, wurden die Bullen jeweils hnf Minuten hinter dem Sprungpartner, inklusive eines Aufsprungs ohne Ejakulation, stimuliert.

Sumenuntersuchung: Von jedem Bullen wurden 15 Ejakulate in die Untersuchungen miteinbezogen, die jeweils im Abstand von einer Woche gewonnen worden waren. Funf Samenproben davon stammten aus der Periode vor der Behandlung (Kontrolle) sowie weitere finf Ejakulate aus den ersten hnf Wochen der GnRH-Behandlung (fiiihe Behandlungsphase). Die dritte Untersuchungsperiode (spate Behandlungsphase, 5 Ejakulate) erstreckte sich uber den Zeitraum der 9. bis 13. Woche nach Applikation der Implantate. In den nativen Samenproben wurden die Parameter Spermien-Konzentration (Zahlkammer nach T W ) und der Anteil morphologisch anomaler Spennien (Ausstrichpraparat, Brom- phenolblau-Nigrosin Farbung, 300 Spermien beurteilt) bestimmt. Die Beurteilung der mor- phologischen Anomalien erfolgte nach dem Schema von Leidl et al. (1971). Von verdunnten Samenproben (Endkonzentration 25 000 - 72 000 Sp./pl; TriladylB’, Stetthaimer Apotheke, Landshut) wurden Videoaufnahmen angefertigt, die spater mit einem System zur Computer- analyse der Spermienmotilitat (Stromberg-Mika, Bad Feilnbach; Version 4.3) ausgewertet wurden. Die Aufnahmen erfolgten mit einem Objektiv x20 bei Phasenkontrast-Beleuchtung in einer MAKLER-Kammer. Pro Ejakulat wurden 3 Kammerfiillungen (jeweils 5 pl) mit insgesamt 15 zufdlig ausgewahlten Gesichtsfelder aufgezeichnet. Es wurden folgende ‘Ein- stellungen verwendet: FRmin 14, FRmax 32, Zeit 20 ms, AREAmin 20 pix, AREAmax 300 pix. Vorwiirtsbewegliche Spermien hatten eine Geschwindigkeit von 2 30 p d s uber die geglattete Bahn (VAF’). Der Prozentsatz vorwtirtsbeweglicher Spermien und deren Durch- schnittsgeschwindigkeit wurden ausgewertet.

Blutentnahme: An einem Untersuchungstag wurden jeweils sechs Blutproben in stundlichem Absttinden zwischen 9 und 14 Uhr durch Punktion der V. jugularis in heparinisierten Rohrchen aufgefangen. Die Blutentnahmen erfolgten sieben Tage vor dem Einsetzen des Implantates (Kontrolle) sowie 1, 7, 35 und 93 Tage nach Applikation. Die Blutproben wurden jeweils sofort nach der Gewinnung zentrihgiert und das Plasma bei -18°C bis zur Untersuchung gelagert.

Honnomlytik: Die Bestimmung des Luteinisierungshormons (LH) wurde mittels eines Doppelantikorper-Enzymimmuntests auf Mikrotitrationsplatten unter Verwendung eines Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Systems nach Mutaboya et al. (1990) mit einer Antiserum- Endverdunnung von 1 : 750 000 durchgehhrt. Die Eichkurve umfdte den Bereich von 0,l -

4 J. Braun und E. Schallenberger

50 ndml LH-DSA. Die Intraassay-Variationskoeffizienten von vier Kontrollproben (Konzen- trationen 0,4 - 13,4 ndml) rangierten von 5,0 bis 9,7 %. Die Bestimmung von Ostradiol-178 erfolgte nach Extraktion von 1,0 ml Blutplasma mit 4 3 ml eines Gemisches aus 30 % tertiiirem Butyl-Methyl-Ather und 70 % Petrolather enzym- immunologisch mit einem Doppelantikorpersystem auf Mikrotitrationsplatten unter Verwen- dung von Carboxymethylather-Peroxidase modifiziert nach Meyer et al. (1990). Die Extrak- tionsausbeute betrug 65 - 74 %, der spezifische Antikorper wurde in einer Endverdiinnung von 1 : 200 000 verwendet. Die Intraassay-Variationskoefkienten variierten in 4 Kontroll- proben (Konzentrationen 3,O - 310 pg/ml) zwischen 4,4 und 21,l %. Der enzymimmunologische Nachweis von Testosteron erfolgte in Analogie zum Bestim- mungsverfkhren von Ostradiol-17R. Die Extraktion von Testosteron erfolgte aus 1,0 ml Blutplasma mit 1 ,O ml des Losungsmittelgemisches (siehe Ostradiol- 17B), die Ausbeute schwankte von 76 - 90 %. Der spezifische Antikorper, charakterisiert bei Karg et al. (1976), wurde einer Endverdiinnung von 1 : 225 000 verwendet, die Intraassay-Variationskoeffi- zienten von vier Kontrollproben (Konzentrationen von 2,O - 9,l ng/ml) lagen zwischen 4,9 und 10,7 %. Die Kreuzreaktionen betrugen 70 % fur 5-a-Dihydrotestosteron, 12 % fir 5-8- Dihydrotestosteron, 3 YO fir Androstendion und <0,5 % fiir Dehydroepiandrosteron, Epitestosteron und Ostradiol-178.

Statistische Berechnungen: Fur die Hormonsekretion an den funf Untersuchungstagen sowie fur die Werte der Samenuntersuchungen in den drei Untersuchungsperioden wurde eine split- plot-Varianzanalyse fir wiederholte Bestimmungen durchgefiihrt (Gill und Hafs, 1971). Die Samenparameter der einzelnen Bullen uber den ganzen Versuchszeitraum hinweg wurden mit einer einfachen Varianzanalyse bearbeitet. Ergaben sich signifikante Effekte, wurden die Mittelwerte mit Student's t-Test fur statistische Signifikanz (P < 0,05) gepriift. Prozentwerte (Motilitat, Morphologie) wurden einer arcsin-Transformation unterzogen.

Ergebnisse Weder bei einem der vier mit GnRH behandelten Bullen noch bei dem scheinbehandelten Bullen wurden fir die Parameter Spermienmotilitat, -konzentration und -morphologie signi- fikante Unterschiede zwischen den drei Untersuchungsperioden (vor der Behandlung sowie friihe und spate Behandlungsphase, jeweils 5 Ejakulate) gehnden. Auch wenn die Werte der vier mit GnRH behandelten Bullen zusammengefaDt wurden (20 Ejakulate pro Unter- suchungsperiode), ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Untersu- chungsperioden (Tabelle 1). Die gepoolten Werte (1 5 Ejakulate pro Bulle) uber den gesamten Beobachtungszeitraum zeigen, da8 teilweise signifikante Unterschiede in der Samenbeschaf- fenheit zwischen den Bullen bestanden, insbesondere bei der Durchschnittsgeschwindigkeit der vorwilrtsbeweglichen Spermien (Tabelle 2). Mit Ausnahme einer einer relativ niedrigen Spermienkonzentration beim Bullen C Wttelwert 528 000 Sp./pl) lagen die untersuchten Samenparameter bei allen Tieren im physiologischen Bereich. Nur bei zwei Bullen (Tabelle 3; Tiere C und E) war ein signifikanter Anstieg der LH- Konzentrationen am Tag nach der GnRH-Applikation gegeben. Im weiteren Verlauf trat bei allen Probanden einschliealich des Kontrolltieres eine Erniedrigung der LH-Spiegel auf, die bei den Bullen B, C und D an den Tagen 35 bzw. 93 signifikant war (P < 0,05). Die mittleren Testosteron-Konzentrationen der Tiere vor der Behandlungsphase lagen zwi- schen 2,5 und 4,6 ng/ml Blutplasma (Tabelle 4). Zwei der vier behandelten (Bulle B und D) wiesen signifikant hohere Werte am l., 7. und 35. Tag nach Beginn der GnRH-Behandlung auf, ein weiterer Bulle (C) nur am 7. und 35. Tag. Bei diesem Tier wurde am Tag 93 im Vergleich zum Ausgangswert ein signifikant niedrigerer Testosteronspiegel beobachtet. Die Mittelwerte am Tag 93 waren bei den Bullen B, C und D niedriger als am Tag 35 (P < 0,05).

EinLluD einer Langzeitapplikation von Buserelin auf die Samenbeschaffenheit beim Bullen 5

Das Kontrolkier (A) und ein mit vier Implantaten behandeltes Tier (5) hatten wiihrend des gesamten Versuchszeitraums in etwa gleichbleibende Werte zwischen 4,O nglml und 7,4 ng/d Testosteron (P > 0,05). Eine Stimulation der Ostradiol-Sekretion im Versuchs-Zeitraum war weder bei dem unbe- handelten (A) noch bei dem mit vier Implantaten behandelten Bullen E zu registrieren (Tabelle 5). Hingegen kam es bei den Bullen B, C und D zu einem signifikanten Anstieg am 7. Tag, beim Bullen D (4 Implantate) auRerdem auch am Tag 1 und 35 nach Beginn der GnRH-Applikation. Bei den Bullen B, C und D war der Ostrogenspiegel am Tag 93 signifi- kant niedriger als am Tag 35 (P < 0,OS).

Diskussion

Bei den drei mit einer erh6hten Testosteronsekretion reagierenden Bullen lagen die Blut- spiegel mindestens vier Wochen lang im oberen Schwankungsbereich physiologischer Werte (Schallenberger et al., 1991). Bei einer durchschnittlichen Dauer der Spermatogenese von 60,7 Tagen sowie 8,4 Tagen fix die Nebenhodenpassage (Amann, 1981) hatten Vertinde- rungen der Samenbeschaffenheit als Folge der erhohten Steroid-Konzentration innerhalb des Beobachtungszeitraumes (bis 93 Tage nach Beginn der Behandlung) auftreten konnen. Die Samenparameter der Bullen blieben jedoch im Versuchszeitraum nahezu konstant. Wahrend der Anteil vorwiirtsbeweglicher Spermien bei den f inf Bullen sehr ahnlich war, ergaben sich signifikante Differenzen zwischen den Bullen f i r die Geschwindigkeit der vorwiirtsbeweg- lichen Spermien. Dies bestatigt Eruhere Untersuchungen an experimentell erzeugten mono- zygoten Zwillingsbullen, in denen der Parameter "Spermiengeschwindigkeit" im Vergleich zum Parameter "Prozentsatz vorwiirtsbeweglicher Spermien" eine hohere individuell bedingte Varianz aufwies (Braun et al., 1990). Die her erzielten Ergebnisse belegen, daD die chronische GnRH-Behandlung beim Bullen keinen EinfluB auf Motilitat und Morphologie der Spermien hatte. Die Behandlung beeintluBte auch nicht die Spermienkonzentration bei einer Ejakulationsfiequenz (2x pro Woche), wie sie etwa bei Bullen in der KB iiblich ist. Ein EinfluR der Hormonbehandlung auf die tagliche Spermienproduktion bzw. den taglichen SpermienausstoR wurde nicht nachgewiesen (Amann und Almquist, 1962). Die Ergebnisse der endokrinologischen Untersuchungen dieser Arbeit stimmen mit dem bisher beim Bullen beobachteten Sekretionsmuster von LH und Testosteron nach chronischer GnRH-Gabe uberein (Melson et al., 1986; von Rechenberg et al., 1986). Die chronische Applikation des GnRH-Analogs Buserelin als Implantat fihrte nicht zu einer Stimulierung sondern eher zu einer Hemmung der basalen LH-Sekretion, was unter anderem auf einer "Downregulierung" der hypophysPen LHRH-Rezeptoren beruhen konnte. Die signifikant er- hohten LH-Konzentrationen am Tag 1 nach Behandlungsbeginn bei zwei Bullen konnten durch eine liinger andauernde initiale LH-Freisetzung bedingt sein, wie sie beim Bullen (Melson et al., 1986), Schaf (Lincoln et al., 1986), Pferd (Boyle et al., 1991) und Eber (Almond et al., 1992) beobachtet wurde. Trotz der Hinweise f i r eine LH-Hemmung konnte bei drei von vier behandelten Bullen eine signifikante Steigerung der Konzentrationen von Testosteron im peripheren Blut induziert werden (Tabelle 4). Bisher liegen keine Angaben iiber die Abgaberate und -dauer von Buserelin aus den Implantaten beim Bullen vor. Aus der Stimulierung der Testosteron- sekretion kann man schlieflen, daD der Wirkstoff in genugend hoher Dosierung liinger als 35 Tage fieigesetzt wird, aber spatestens nach 93 Tagen, wahrscheinlich schon deutlich fhiher, die Freisetzung beendet oder ungeniigend sein muR. Dies wiirde in etwa iibereinstimmen mit Ergebnissen von Sandow und Mitarbeitern (1989), die bei Verabreichung derartiger Implantate an Ratten eine Plateauphase der Freisetzung von der 2. bis 10. Woche nach Applikation beobachten konnten.

6 J. Braun und E. Schallenberger

Die durch GnRH-Applikation erzielbaren Testosteronerhohungen im Blutplasma liegen beim Bullen trotz der unterschiedlichen Praparate, Applikationsformen und Dosierungen in einem Bereich bis zu einem Maximum von ca. 30 ng/ml (Melson et al., 1986; von Rechenberg et al., 1986; Post et al., 1987). Dabei hat z.B. das von Melson et al. (1986) verwendete Analog Nafarelin eine ca. 200-fach stakere Wirkung als das natiirliche LHRH und weist iiberdies wegen seiner Bindungsfkhigkeit an Serumalbumin eine verlhgerte Halbwertszeit auf (Nestor, 1987). Eine Verdoppelung der Buserelin-Dosis bewirkte im vorliegenden Versuch keine hoheren Testosteronkonzentrationen (Tabelle 4). Eventuell wiirden auch Nedngere Dosie- rungen als bisher verwendet eine maximale Stimulierung der Testosteron-Sekretion bewirken, da eine bestimmte Obergrenze der Androgensyntheseleistung wohl nicht iiberschritten werden kann. Bei den Bullen, bei denen eine Testosteron-Stimulation im vorliegenden Versuch erzielt wurde, war auch eine erhohte Ostradiol-Konzentration wahrend der Testosteron-Stimulation nachzuweisen (Tabelle 4 und 5) . Ein teilweise paralleler Verlauf von Ostradiol-170 und Testosteron im peripheren Kreislauf von Bullen wurde bereits friiher festgestellt (Schan- bacher und Echternkamp, 1978; Schallenberger et al., 1991). Die Funktion der Ostrogene beim malnnlichen Tier, die im peripheren Kreislauf beim Bullen in hoherer Konzentration als bei weiblichen Tieren vorkommen (Hartl, 1990; Henney et al., 1990), ist bisher nicht gekliirt. Hohere Konzentrationen von Ostradiol-17D in der V. cava (nach Auhahme der V. spermatica) im Vergleich zur V. jugularis oder Aorta abdominalis weisen auf einen prima testikulken Ursprung hin (Hartl, 1990). Es wird aber auch die Auffassung vertreten, dal) ein GroRteil des peripher zirkulierenden Ostradiol-17R durch Aromatisierung von Androgenen im Fettgewebe gebildet wird (Coffey, 1988). Die Wirkung von Testosteron auf das mannliche Sexualverhalten erfolgt eventuell uber Ostrogene, die im Hypothalamus durch Aromatisierung von peripher zirkulierendem Testosteron gebildet werden (Roselli et al., 1985). Dem Verhiiltnis von Ostradiol-17D zu Testosteron im peripheren Blut konnte demnach eine Bedeutung fhr die Auspragung der Libido sexualis zukommen; bei Tieren mit einer verminderten Triebstake wurde ein weiteres Verhdtnis von Ostradiol- 178 zu Testosteron gegeniiber sehr triebstarken Bullen beobachtet (Henney et al., 1990). In den eigenen Untersuchungen hatte die chronische Applikation des GnRH-Agonisten Buserelin erhohte Konzentrationen von Testosteron und, weniger stark ausgepragt, von Ostradiol-170 im peripheren Blut und damit eine gewisse Verschiebung im relativen Quotienten zur Folge. Potentielle Auswirkungen dieses Effektes auf die Libido sexualis der Bullen (Reaktionszeit) wurden durch die Versuchsanstellung nicht erfdt, da der Samengewinnung eine einheitliche Stimulierungsperiode von 5 Minuten vorausging. Die Einsatzmoglichkeiten von GnRH-Agonisten beim Bullen sind sehr begrenzt. Beim Hund (Vickery et al., 1984) oder auch beim Hengst (Boyle et al., 1991) wurde die GnRH-Behand- lung im Hinblick auf eine reversible Unterdriickung der Reproduktionsfunktion iiberpriift. Eine bei bestimmten Mastformen wiinschenswerte "hormonelle Kastration" von Jungbullen kann nach den vorliegenden Daten durch die kontinuierliche GnRH-Applikation nicht erreicht werden. Bei Altbullen (6 bis 13 Jahre) wurden Beeintrachtigungen der Hypothalamus- Hypophysen-Gonaden Achse vergesellschaft mit Storungen der Libido durch Erkrankungen und "Stress" beobachtet (Hartl, 1990). Aufgrund der nachgewiesenen lange anhaltenden Steigerung der Steroidsynthese im Hoden konnte der Einsatz von GnRH-Agonisten beim Bullen in Fdlen von primk oder sekundk endokrin bedingten Storungen der Libido sexualis in Betracht gezogen werden. Dies solite in entsprechenden Fallen iiberpriift und mit anderen Therapieansatzen, z.B. der Behandlung mit Somatotropin (Schallenberger et al., 1993), verglichen werden.

Teile der Untersuchung wurden durch Unterstiitzung der H. Wilhelm Schaumann Stiftung durchgefihrt.

Einfld einer Langzeitapplikation von Buserelin auf die Samenbeschaffenheit b e i Bullen 7

Tabelle 1: Sprmaparameter bei den 4 behandelten Bullen vor und wdhrend einer GnRH-Langzeit- behandlung (x A s; n = 20)

Table I : Semen parameter in 4 bulls before and during longterm treatment with GnRH (x s; n =

20)

Parameter Einheit Untersuchungsperioden vor GnRH GnRH friihl GnRH spat 1

VoMBrtsbeweglich* % 78 f 10,5 79 f 7,3 77 f 6,1

Geschwindi&eit** p d s 96 f 8,7 96 *13,8 100 *10,2

Konzentration sp./pix 103 877 f 346 759 f353 825 f 402

Morph. Anomalien % 5,4 f 2,3 5,2 f 2,7 4,9 2,2

1. - 5 . bzw. 9. - 13. Woche nach Behandlungsbeginn Spermien mit einer Geschwindigkeit 2 30pds Durchschnittsgeschwindigkeit vorwartsbeweglicher Spermien

* **

Tabelle 2. Spermaparameter bei dem scheinbehandelten (n = 1; A) und den GnRH-behandelten Bullen (n = 4; B, C, 0, E) iiber den ganzen Versuchszeitrauin (x A s; n = 15)

Table 2: Semen parameter in sham-treated (n = 1; A) and GnRH-treated bulls (n = 4; B. C, 0, E) during the entire period of examination (x * s; n = 15)

Bulle AnzahlVorwiirtsbew.Geschwindigkeit Konzentration Morphologie Implantate Prozent* pds* * S ~ . / ~ I 103 % Anomalien

A 0 78 f 9,4a104 f8,2ab1242 *527a 3 3 f 2,4a

B 2 76 f 7,3a105 f 1 0,0b938 k433ab 4,2 f 2,2a

C 2 81 f 6,2a 96 *12,0ac528 f254b 7,O f 2,5b

D 4 77 f lo,* 97 f9,7=884 f313ab4,3 f 1,7a

E 4 79 f 8,2a 93 f 1 1,9c963 *349ab 5,3 f 2,2ab

abc Werte in einer Kolumne mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (P < 0,05) * Spermien mit einer Geschwindigkeit 2 3Opds ** Durchschnittsgeschwindigkeit vorwfirkbeweglicher Spermien

8

TabeIIe 3. LH-Werte (ng/ml Blurplasma) bei Bullen mil 0, 2 oder 4 GnRH-Implantaten (x f s; jeweils aus 6 Blutproben im Abstand vOn je 60 Minuten)

Table 3: LH-concentration (ng/ml blood plasma) in bulls with 0, 2 or 4 GnRH implants (x f s; mean from 6 blood samples collected in hourly intervals)

J. Braun und E. Schallenberger

Bulle - 7 Tage+ 1 l a g + 7 Tage + 35 Tage + 93 Tage

IA (Ohne 1.) 1,2 f 0,3a 1,1 f 0,5a 1,3 f 0,5a 1 , O f 0,2a 0,7 f 0,la

lB(2 Impl.) 0,s f O, la l,o f 0,2a 0,9 f O,la 0,5 f 0,2b 0,3 f O,Ob

lC(2 Impl.) 0.6 * O,la 0,9 f O,lb 0,6 f 0,2a 0,4 * 0,2a 0,3 f 0,lc

D (4 Impl.) 0,6 f 0,2a 0,6 f O,la 0,4 f 0,2& 0,4 f 0,3& 0,2 f 0,Ob

E(4 Impl.) 0,9 * 0,4a 1,9 f 0,5b 0,s f 0,2a 0,6f O , l a 0,6 f O,la

abc Werte in einer Reihe mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (P < 0,05)

Tabelle 4: Testosteron (ng/ml Blupiasma) bei Bullen mil 0, 2 oder 4 GnRH-Implantaten (x f s; jeweils aus 6 BIutproben im Abstand von je 60 Minuten)

Table 4: Testosterone (ng/ml blood plasma) in bulls with 0, 2 or 4 GnRH implants (x * s; mean from 6 blood samples collected in hourly intervals)

Untersuchungszeitpunkt vor (-) bzw. nach (+) Behmdlungsbegm Bulle - 7 Tage + 1 Tap + 7 Tage + 35 Tage + 93 Tage

A (Ohnc 1.) 4,O f 1,2a 5,6 f 3,3a 6,1 f 2,Sa 6,2 f 3,2a 4,6 f 2,5a

B (2 Impl.) 3,l f 2,Oa 5,5 f 0,7b 7,7 f 2,2c 7,5 f 1,2c 1,4 f 1,3a

C (2 Impl.) 2,5 f 2,W 4,O f 0,P 11,3 f l ,Ob 12,4 f 1,6b 0,7 f 0,7c

D(4Impl.) 2,9 f 0 , 9 a b 4 , 7 f 1 , 1 b 15,1*1,6c 19,1f2,7d I , O * O , l a

E (4 Impl.) 4,6 * 2,2a 5,9 f 0,7a 6,O f O,Sa 7,4 f 2,4a 5,2 f 1,5a

abed Werte in einer Reihe mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (P < 0,OS)

EinfluR einer Langzeitapplikation von Buserelin auf die Samenbeschaffenheit be i i Bullen 9

Tabelle 5: ostradiol-I 7p (pg/ml Blutplasma) bei Bullen mit 0, 2 oder 4 GnRH-Implantaten (x f s; jeweils aus 6 Bluproben im Abstand yon j e 40 Minuten)

Table 5: C)stradiol-li’J (pg/ml blood plasma) in bulls with 0, 2 or 4 GnRH implants (x f s; mean from 6 blood samples collected in hourly intervals)

Untersuchungszeitpunkt vor (-) bzw. nach (+) Behandlungsbeginn Bulle - 7 Tage + 1 Tag + 7 Tage + 35 Tage + 93 Tage

A (Ohne I.) 29,5 f7,5al 1 3 k3,3b20,6 &Jab l6,7 f 9,7b 18,6 f 8,3b

B(2 Impl.) 9,8 f3,8ab 10,Of 1,4b 19,l f 4,OC l3,2f 6 ,5h 6,O f I,@

c (2 Impl.) 5 3 f3,3ab 4,1 f 1,9b 9,9 f 2,4c 8,4f 5,2= 3,7 f 2,9b

D (4 Impl.) 4,O f3,5a13,7 It3,0b21,4 *5,lC16,3 *5, I& 2,6 f 1,2a

E (4 Impl.) 15,O *12,5a 7,9f 2,la 1I,O f 4,5a 10,5 f 3,fja 13,2 f 4,3a

abed Werte in einer Reihe mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (P < 0,05)

Literatur:

Almond, G.W., Esbenshade, K.L., Smith, C.A. and Richards, R.G., 1992: Effects of chronic gonadotropin-releasing hormone agonist treatment on serum luteinizing hormone and testosterone concentrations in boars. Am. J. Vet. Res. 53,22 - 25

Amann, R.P., 1981: A critical review of methods for evaluation of spermatogenesis from seminal characteristics. J. Androl. 2, 37 - 58

Amann, R.P. and Almquist J.O.,1962: Reproductive capacity of dairy bulls. VIII. Direct and indirect measurement of testicular sperm production. J. Dairy Sci. 45, 774 - 781

Bint .&tar, F., Marshall, G.R., Wickmgs, E.J. and Nieschlag, E., 1983: Reversible induction of azoospennia in rhesus monkeys by constant infusion of a gonadotropin-releasing hormone agonist using osmotic minipumps. J. clin. Endocr. Metab. 56,534 - 540

Boyle, M.S., Skidmore, J., Zhang, J. and Cox, J.E., 1991: The effects of continous treatment of stallions with high levels of a potent GnRH analogue. J. Reprod. Fert., Suppl. 44, 169 - 182

Braun, J., Schams, D. und Brem G., 1990: Zur Fortpflanzungsfunktion bei experimentell erzeugten monozygoten Zwillingsbullen. Berl. Miinch. Tierhtl. Wschr. 103,213 - 217

Coffey, D.S., 1988: Androgen action and the sex accessory tissues. In: E. Knobil and J. Neil (Ed.) The Physiology of Reproduction. pp 108 1 - 1120. Raven Press, NY.

Faure, N., Labrie, F., Lemay, A., Belanger, A., Gourdeau, Y., Laroche, B. and Robert, G., 1982: Inhibiton of serum androgen levels by chronic intranasal and subcutaneous administration of a potent luteinizing hormone-releasing hormone (LH-RH) agonist in adult men. Fert. Steril. 37,

Fraser, H.M. and Lincoln, G.A., 1980: Effects of chronic treatment with an LHRH agonist on the

Gill, J.L. and Hafs, H.D., 197 1 : Analysis of repeated measurements of animals. 1. Anim. Sci. 33, 33 1

Hartl, P. ,1990: Pulsatile Freisetzung von Sexualhonnonen und Gonadotropinen bei Besamungsbullen. Vet.-med. Diss. Miinchen

Henney, S.R., Killian, G.J. and Deaver, D.R., 1990: Libido, hormone concentrations in blood plasma and semen characteristics in Holstein bulls. J. Anim. Sci. 68, 2784 - 2792

Karg, H., Gmenez, T., Had, M., Hofhann, B., Schallenberger, E. and Schams, D. 1976: Testosterone, Luteinizing Hormone (LH) and Follicle Stimulating Hormone (FSH) in peripheral

416 - 424

secretion of LH, FSH and testosterone in the ram. Biol. Reprod. 22,269 - 276

- 336

10 J. Braun und E. Schallenberger

plasma of bulls: levels from birth through puberty and short term variations. Zbl. Vet. Med. A

Labrie, F., Auclair, C., Cusan, L., Kelly, P.A., Pelletier, G. and Ferland, L., 1978: Inhibitory effects of LHRH and its agonists on testicular gonadotropin-releash receptores and spermatogenesis in the rat. J. Androl., Suppl. 2,303 - 318

Leidl, W., Schefels, W., Stolla, R. und Metzger, E., 1971: Differenzierung und Befruchtungs- vermogen pathologischer Spermien. Dtsch. tiertirztl. Wschr. 78, 129 - 134

Lincoln, G.A., Fraser, H.M. and Abbott, M.P., 1986: Blockade of pulsatile LH, FSH and testosterone secretion in rams by constant infusion of an LHRH agonist. J. Reprod. Fert. 77,587 - 597

Melson, B.E., Brown, J.L., Schoenemann, H.M., Tamavsky, G.K. and Reeves, J.J., 1986: Elevation of serum testosterone during chronic LHRH agonist treatment in the bull. I. Anim. Sci. 62, 199

Meyer, H.H.D., Sauerwein, H. and Mutaboya, B.M., 1990: I m m u n m t y chromatography and a biotin-streptavidin amplified enzymeimmunoassay for sensitive and specific estimation of estradiol-17IJ. J. steroid. Biochem. 35,263 - 269

Mutaboya, BM., Meyer, H.H.D., Schams, D. and Schallenberger, E., 1990: Development of a sensitive enzyme immunoassay for LH determination in bovine plasma using the streptavidin- biotin technique. Acta Endocrinol. 122,227 - 232

23,793 - 803

- 207

Nestor, J.J., 1987: Design of LHRH agonist drug candidates. J. Androl. 8, S4 - S8 Post, T.B., Reich, M.M. and Bindon, B.M., 1987: Characterization of LH and testosterone responses

to intramuscular injection of GnRH in tropical postpubertal bulls. Theriogenology 27, 305 - 315

v. Rechenberg, W., Sandow, J. and Klatt, P., 1986: Effetc of long-term infusion of an LH-releasing hormone agonist on testicular function in bulls. J. Endocr. 109, R9 - R11

Roselli, C.E., Horton, L.E. and Resko, J.A., 1985: Distribution and regulation of aromatase activity in the rat hypothalamus and limbic system. Endocrinology 114,2183

Sandow, J., von Rechenberg, W., Baeder, C. and Engebart, K., 1980: Antifertility effects of an LHRH analogue in male rats and dogs. Int. J. Fert. 25,213 - 221

Sandow, J., von Rechenberg, W., Seidel, H. and Keil, M., 1989: Experimental studies on tissue tolerance and on biodegradation of polyactide/glycolide-buserelin implants in rats. Klinische und Experimentelle Urologie 20 (Urological Research, Zuckwerdt Verlag Munich), Symposium "New Aspects in the Regulation of Prostatic Cancer", eds. G. Aumiiller, M. Krieg and Th. Senge, pp. 157 - 166

Schams, D., Hofer, F., Schallenberger, E., Hartl, M. and Karg, H., 1974: Pattern of luteinizing hormone (LH) and follicle stimulating hormone (FSH) in bovine blood plasma after injection of a synthetic gonadotropin-releasing hormone (Gn-RH). Theriogenology 1, 137 - 149

Schanbacher, B.D. and Echtemkamp, S.E., 1978: Testicular steroid secretion in response to GnRH- mediated LH and FSH release in bulls. J. Anim. Sci. 47,514 - 520

Schallenberger, E., Had, P., Schams, D., Lomnann, W. und Hahn, R., 1991: Unterscheiden sich Besamungsbullen von unterschiedlichem Alter, Libido sexualis und Spermaqualitiit in h e r Hormonsekretion? Der Tierziichter 43,402 - 403

Schallenberger, E., Kiiher, G., Montag, T., Lonmann, W. und Hahn, R., 1993: Hormonsekretion und Spermaqualitiit von Altbullen nach Behandlung mit rekombinantem Somatotropin. Der Tierziichter 45,20 - 23

Schiirmeyer, T.H., Knuth, U.A., Freischem, C.W., Sandow, J., Bint Akthar, F. and Nieschlag, E., 1984: Suppression of pituitary and testicular function in normal men by constant gonadotropin- releasing hormone agonist infusion. J. Clin. Endocr. Metab. 59, 19 - 24

Thibier, M., 1976: Effect of synthetic gonadotrophin-releasing hormone (Gn-RH) on circulating luteinizing hormone (LH) and testosterone in young post-pubertal bulls. Acta Endocr. 81, 635 - 643

Vickery, B.H. and McRae, G.I., 1980: Effects of continuous treatment of male baboons with super agonists of LHRH. Int. J. Fert. 25, 179 - 184

EinfluS einer Langzeitapplikation von Buserelin auf die Samenbeschaffenheit beim Bullen 11

Vickery, B.H., McRae, G.I., Briones, W., Worden, A., Seidenberg, R., Schanbacher, B.D. and Falvo, R., 1984: Effcts of an LHRH agonist analog upon sexual function in male dogs. I. Androl. 5, 28 - 42

Eingang des Manuskriptes: 22.3.1993

Adresse der Autoren: Dr. Joachim Braun, Gyn&ologische Tierklinik der UniversiW Miinchen, Koniginstr. 12, 80539 Miinchen; Dr. Edgar Schallenkrger, Lehrstuhl ftir Physiologie der Fortpflanzung und Laktation, Technische Universitat Miinchen, 85350 Freising