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BVDBVD--Untersuchungen bei Bullen nach Untersuchungen bei Bullen nach EUEU--SpermarichtlinieSpermarichtlinie 2003/43/EG:2003/43/EG:

Möglichkeiten und Erfahrungen in der Möglichkeiten und Erfahrungen in der serologischen und virologischen serologischen und virologischen

ÜberwachungÜberwachung

W. Gaede, M. Beer, G. Wolf, S.W. Gaede, M. Beer, G. Wolf, S. KenkliesKenklies, , B. Gehrmann, W. PeterB. Gehrmann, W. Peter

GliederungGliederung• Infektionsrisiko durch Bullensperma

(Literaturübersicht)

• Vorschriften der EU-Richtlinie• Herausforderungen für die Diagnostik

– Serologische Untersuchungen– Virusnachweis

• kritische Wertung und Zusammenfassung

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Sperma von PISperma von PI--Bullen:Bullen:• Hohe BVDV-Konzentration im Sperma:

– 105 –107,5 TCID50/ml (Meyling und Jensen, 1988)

– 107 TCID50/ml (Paton et al., 1989)

– 107 TCID50/ml (Kirkland et al., 1991)

– 20.000 TCID50/ml (Givens et al., 2003)

• Spermaqualität kann verschlechtert sein

• bei Insemination folgt (fast) immer transiente Infektion empfänglicher (sero-negativer) Rinder

• Konzeptionsrate kann verschlechtert sein

• Entstehung von PI-Kälbern(?), Inzidenz <10%

BVDVBVDV--Ausscheidung nach experimenteller Ausscheidung nach experimenteller transientertransienter Infektion von Bullen (1)Infektion von Bullen (1)

Withmore et al., 1978Infektionsversuch mit 9 Bullen oral, intranasal und i.m. mit je 104 TCID50 NADL

• BVDV in 4 von 984 von 98 Ejakulaten (entnommen vom 2.-56. Tag nach der Inokulation)

Paton et al., 1991Infektionsversuch mit 4 Bullen intranasal 4x104 TCID50 NADL

• danach 101,4 TCID50/ml BVDV im Sperma eineseines Bullen vom 10.-14. Tag

Komisrud et al., 1996 Infektionsversuch i.v. mit cpE-Virus bei 6 Bullen

• Beobachtungszeit 66 Tage

• BVDV (nCPE-Typ !) bei 2 von 62 von 6 Bullen am 7. Tag nach Inokulation

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BVDVBVDV--Ausscheidung nach experimentellerAusscheidung nach experimentellertransientertransienter Infektion von Bullen (2)Infektion von Bullen (2)

Kirkland et al., 1991Infektionsversuch mit 5 Bullen intranasal mit PI-Blut/serum

• nachfolgende Virämie max. vom 4.-6- Tag

• BVDV-Konzentration in Bullensperma :

– bei 3 von 53 von 5 transient infizierten Bullen: 5 bis 75 TCID50/ml

(7-14 Tage p.i.)

Givens et al., 2003Infektionsversuch mit 3 Bullen, intranasale Inf.

• BVDV für max. 21 dmax. 21 d anzüchtbaranzüchtbar bei 2 von 3 Bullen

• BVDV für 7 Monate mit RT7 Monate mit RT--nPCRnPCR nachweisbar bei 2 von 3 Bullen

• nach 7 Monaten Immunhistochemie in Biopsieproben: 2 von 3 Bullen positiv

• Anzüchtung aus diesen Biopsieproben: 1 von 3 Bullen positiv !

BVDVBVDV--Ausscheidung nach natürlicher Ausscheidung nach natürlicher transientertransienter Infektion von BullenInfektion von Bullen

Voges et al., 1998Ausscheidungsdauer bei natürlicher Infektion „Cumulus“

→ BVDV über 11 Monate im Sperma nachweisbar bei einem

nicht-virämischem Bullen (anschl. Schlachtung)

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Folgen für die Folgen für die RezipientenRezipienten (1):(1):Niskanen et al., 2002 Insemination von 3 Färsen mit Sperma von „CumulusCumulus“

→→ SerokonversionSerokonversion und ausbleibende Trächtigkeit bei 1 Färse

Kirkland et al., 1997Insemination von insgesamt 73 Färsen mit Sperma eines natürlich inf. Bullen

→→ SerokonversionSerokonversion bei 3 von 60 sero-negativen Färsen (davon 2 mit lokalerVirusisolierung 42 d p. insem.)

Givens et al., 2003i.v. Sperma von 1 experimentell inf. Bullen:

•• SerokonversionSerokonversion bei 1 von 3 Kälbern

(Sperma 50 d p.i. entnommen, dabei Virusisolierung negativ und RT-nPCRpositiv)

Folgen für dieFolgen für die RezipientenRezipienten (2):(2):

Wolf 2003 Tiervesuch mit natürlich infiziertem Bullen

→ Beobachtung der Serokonversion und Trächtigkeit

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Infektionsversuch in LMU MünchenInfektionsversuch in LMU München

Bulle

• Kontaktzeit: 19.8.-21.10.2003 • Brunst mit erfolgreichen Natursprüngenerfolgreichen Natursprüngen zwischen dem 27.8. und 13.9.2003• serologische Ergebnisse:

• BVDV-1 SNT negativnegativ am 08.10.03 (26.-43. Tag p. insem.) Bulle 1:400• BVD-AK.-ELISA BARVAC negativnegativ am 15.10.03 Bulle 118%

gemeinsam mit 5 Färsen

Weitere RisikenWeitere Risiken

• klinisch manifeste lokale Infektion mit Fertilitätsstörungen– bislang einmal beschrieben

• systemische Infektion mit akutem oder chronischem Krankheitsverlauf– bislang nicht beschrieben

• Entstehung von PI– bislang nicht beschrieben, wenig wahrscheinlich

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Bisheriges FazitBisheriges Fazit:

Akut BVDV-infizierte Bullen können das Virus auch nach der virämischen Phase und trotz Serokonversion mit dem Sperma ausscheiden.

Die erreichten Virustiter sowie die Dauer der Ausscheidung sind meistens nur gering.

Als wesentliche Folgen wurden vereinzelte Fälle Antikörperbildung nach (asymptomatischer) systemischer Infektion beobachtet.

Mögliche Probleme bei der Überwachung i.R. von Bekämpfungsprogrammen übertreffen die direkte Gefährdung der Tiergesundheit.

Vorschriften der EU-Richtlinie

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EUEU--Richtlinie Richtlinie RinderspermaRindersperma- RL 88 /407/ EWG -

zuletzt geändert durch

- RL 2003 / 43 / EG -vom 26. Mai 2003

- in nationales Recht zu überführen bis 1. Juli 2004- in Deutschland gültig ab 1. Januar 2004

2-Stufenprogramm für Bullen in zugelassenen Stationen:- Serologische Untersuchung- Ggf. virologische Spermauntersucung

RL RL RinderspemaRinderspema, Anhang B, Kap.I:, Anhang B, Kap.I:

Aufnahme von Bullen in Aufnahme von Bullen in zugelzugel. Stationen. Stationen• Virol. und serol. Quarantäneuntersuchungen, dabei verlängert evtl.

auftretende Serokonversion die Quarantänezeit

• serologisch positive Bullen dürfen in die Besamungsstationen, aber:

• „Vor der ersten Verwendung von Samen von serologisch positivserologisch positiv gegen

BVD/MD reagierenden Bullen muss eine Samenprobe jedes einzelnen

Tieres durch Virusisolationstest oder AntigenVirusisolationstest oder Antigen--ELISA auf BVD/MDELISA auf BVD/MD

untersucht werden. Im Falle eines Positivbefundes muss der betreffende

Bulle aus der Station entfernt und sein gesamter Samen unschädlichunschädlich

gemacht werden.“

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RL RL RinderspemaRinderspema, Anhang B, Kap.II:, Anhang B, Kap.II:

Obligatorische Routineuntersuchungen für Obligatorische Routineuntersuchungen für Rinder in Rinder in zugelzugel. Besamungsstationen. Besamungsstationen

• 2 x jährlich serologische Untersuchung sero-negativer Bullen

• „Reagiert ein Tier serologisch positivserologisch positiv, so ist jedes seit dem letzten

Negativbefund diesem Tier entnommene EjakulatEjakulat entweder zu

vernichtenvernichten oder erneut mit Negativbefund auf etwa vorhandene Viren

zu testentesten.“

• Bulle muss bei Serokonversion quarantänisiert werden.

Herausforderungen für die Diagnostik

• Serologische Untersuchungen

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Vergleichbarkeit von Vergleichbarkeit von Ergebnissen in AntikörperErgebnissen in Antikörper--ELISA´sELISA´s

Serologische BVD-Doppel-

untersuchungen 2002/2003 positiv verdächtig negativ

positiv 127 29 10 166

Bommeli verdächtig 6 10 16 32

negativ 16 77 131 224

149 116 157 422

Boehringer

• 263 Seren (63%, grün)) mit übereinstimmenden Ergebnissen,

• aber: bei 26 Seren (6%, rot) völlig divergierende Aussagen

→ klassischer VNT brachte oft nicht die nötige Klarheit

(ELISA-Durchführung nach Herstellerangaben)

Methodische Modifikationen von Methodische Modifikationen von ELISA und VNTELISA und VNT

Vorbehandlung der Seren für ELISA und VNT: 30min 56°C inaktiveren

ELISA: hier Idexx (ELISA-Durchführung nach Herstellerangaben)

VNT:

Zellstamm: Klu-R

BVDV 1: NADL

BVDV 2: München 2

anti-Pesti-mAK C16 als primärer Ak

POD-Konjugat (DAKO)

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Direkter Vergleich Direkter Vergleich von ELISA und von ELISA und

VNTVNT

25 Seren

von Bullen BVD 1 BVD 2 ELISA

8657/1 1280 160 2,278657/2 320 10 0,508657/3 640 20 2,468657/4 neg. neg. neg.8657/5 1280 5 1,598657/6 neg. neg. neg.8657/7 neg. neg. neg.8657/8 neg. neg. neg.8657/9 neg. neg. neg.8657/10 2560 160 2,118657/11 1280 20 0,728657/12 neg. neg. neg.8657/13 neg. neg. neg.8657/14 neg. neg. neg.8657/15 neg. neg. neg.8657/16 1280 40 (?) 2,048657/17 neg. neg. neg.8657/18 neg. neg. neg.8657/19 160 40 (?) 0,288657/20 320 5 1,878657/21 neg. neg. neg.8657/22 neg. neg. neg.8657/23 320 80 2,068657/24 neg. neg. neg.8657/25 10240 320 2,04

Virusneutralisationstest

BVDV1-Antikörpertiter: Korrelation von log2 SNT und ELISA

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

0 2 4 6 8 10 12

log2-SNT

ELIS

A

Keine divergierende Keine divergierende Ergebnisse !!!Ergebnisse !!!

Herausforderungen für die Diagnostik– Virusnachweis

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MethodenübersichtMethodenübersichtVirusisolierung:• Spermaverdünnung 1:10 und 1:100

• KLu-R

• IFT mit anti-Pesti-mAK C16 als primärer Ak

PCR:

Nukleinsäureextraktion mit : – High Pure Viral Nucleic Acid Isolation Kit – HPVNS (Roche)

– RNeasy Mini Kit (Qiagen)

– Modifikationen

One Tube RT-PCR: One Step Real Time RT-PCR mit Pestivirus-

Primern und TaqMan-Sonde

1. Sensitivitätsvergleich:1. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in Mediumin Medium

• RNA-Isolierung mit HPVNS

Ergebnis:

• VI und PCR mit gleicher

Sensitivität

• Antigen-ELISA wie erwartet

mit deutlich geringerer

Sensitivität

Virus-titer

0809-02 0809-06 0809-10100 positiv 22,4 21,5 22,6 positiv10-1 positiv 26,3 25,9 25,3 positiv10-2 neg. 31,1 29,9 31,1 positiv10-3 neg. 34,4 34,3 33,9 positiv10-4 neg. 36,7 35,5 36,4 positiv10-5 neg. 40,9 38,7 neg. positiv10-6 neg. 38,3 38,7 39,0 positiv10-7 neg. neg. neg. neg. neg.NK neg. neg. neg. neg. neg.

VIPCR, nach EinfrierenELISA

Medium

12

1. Sensitivitätsvergleich:1. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in in FrischFrischspermasperma

• RNA-Isolierung mit HPVNS

Ergebnis:• PCR mit geringerer PCR mit geringerer

Sensitivität als VISensitivität als VI

• unverdünntes Sperma

zelltoxisch

• Antigen-ELISA mit

geringerer Sensitivität

Virus- ELISAtiter unverd. 1:10 1:100

0709-02 0809-06 0809-10100 positiv 32,3 32,8 32,1 tox. positiv positiv10-1 positiv 37,2 37,6 34,4 tox. positiv positiv10-2 neg. 40,4 39,2 neg. tox. positiv positiv10-3 neg. neg. neg. neg. tox. positiv positiv10-4 neg. neg. neg. neg. tox. positiv positiv10-5 neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg.10-6 neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg.10-7 neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg.NK neg. neg. neg. neg. tox. neg. neg.

Frischsperma

PCR, nach Einfrieren SpermaverdünnungVI / Zellkultur

1. Sensitivitätsvergleich:1. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in in PaillettenPaillettenspermasperma

• RNA-Isolierung mit HPVNS

Ergebnis:• PCR mit geringerer

Sensitivität als VI

• aufbereitetes Sperma

nicht zelltoxisch

• Antigen-ELISA

mit geringerer

Sensitivität

Virus- ELISAtiter unverd. 1:10 1:100

0809-02 0809-06 0809-10100 positiv 36,1 36,5 33,2 positiv positiv positiv10-1 neg. 39,8 39,3 34,1 positiv positiv positiv10-2 neg. neg. neg. neg. positiv positiv positiv10-3 neg. neg. neg. neg. positiv positiv positiv10-4 neg. neg. 42,1 neg. positiv positiv positiv10-5 neg. neg. neg. neg. positiv positiv neg.10-6 neg. neg. neg. neg. positiv neg. neg.10-7 neg. neg. neg. neg. fraglich neg. neg.NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.

Pailleten

PCR, nach EinfrierenVI / Zellkultur

Spermaverdünnung

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2. Sensitivitätsvergleich:2. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in Mediumin Medium

Ergebnis:

• VI und PCR mit gleicher

Sensitivität

• Antigen-ELISA wie erwartet

mit deutlich geringerer

Sensitivität

Virusverdünnung * ** *** ****100 336 18,1 17,9 23,5 positiv positiv10-1 98 21,1 21,3 28,1 positiv positiv10-2 neg. 23,6 24,4 31,8 positiv positiv10-3 neg. 28,0 28,6 36,3 positiv positiv10-4 neg. 31,3 32,8 40,1 positiv positiv10-5 neg. 34,7 35,7 neg. neg. positiv10-6 neg. neg. 40,2 neg. positiv positiv10-7 neg. neg. 41,4 neg. positiv neg.NK neg. neg. neg. neg. positiv neg.

* HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR

Medium

VIPCRELISA

2. Sensitivitätsvergleich:2. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in in FrischFrischspermasperma

Ergebnis:• PCR mit höhererPCR mit höherer

Sensitivität als VISensitivität als VI

• Antigen-ELISA mit

geringerer Sensitivität

ELISA1:10 1:100

Virusverdünnung * ** *** ****100 336 26,7 27,7 26,5 positiv positiv positiv10-1 334 30,1 30,1 31,1 positiv positiv positiv10-2 245 32,8 32,8 31,1 positiv positiv positiv10-3 neg. 36,6 36,1 26,4 positiv neg. neg.10-4 neg. neg. 38,5 37,2 positiv neg. neg.10-5 neg. neg. 43,5 38,8 neg. neg. neg.10-6 neg. neg. neg. 40,9 neg. neg. neg.10-7 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.

* HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR

PCR

Nativsperma

VI / ZellkulturSpermaverdünnung

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2. Sensitivitätsvergleich:2. Sensitivitätsvergleich:VirustitrationVirustitration in in PaillettenPaillettenspermasperma

Ergebnis:• PCR mit gleicher

Sensitivität wie VI

• Antigen-ELISA

mit geringerer

Sensitivität

ELISAunverd. 1:10 1:100

Virusverdünnung * ** *** ****100 300 29,6 31,3 25,2 positiv positiv positiv positiv10-1 192 34,2 35,3 27,8 positiv positiv positiv positiv10-2 neg. 35,7 38,6 32,1 positiv positiv positiv positiv10-3 neg. neg. 41,4 35,5 neg. positiv positiv neg.10-4 neg. 41,7 41,3 33,8 positiv positiv pos./neg. neg.10-5 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.10-6 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.10-7 neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.NK neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg. neg.

* HPVNS, Quantitect ** HPVNS, Qiagen One Step RT-PCR Kit *** RNeasy, Qiagen One Step RT-PCR Kit **** HPVNS, nested PCR

PCR

Pailleten

VI / ZellkulturSpermaverdünnung

Der Kontrast:Der Kontrast:Ergebnisse mit Sperma eines Ergebnisse mit Sperma eines

natürlich infizierten Bullennatürlich infizierten Bullen

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BVDV BVDV -- PCR in FrischspermaPCR in Frischspermaund Paillettenund Pailletten

Real Time RT-PCR:• Bulle mit positivem Ergebnis

in 5 Ejakulaten (PaillettenPailletten)

• 20 weitere Bullen negativ

Frischsperma und Blut:• Frischsperma positiv im • Blutprobe negativ• 3 weitere Bullen negativ• Sperma kulturell negativ

Ursachen für SensitivitätsUrsachen für Sensitivitäts--unterschiede in unterschiede in gespiktem gespiktem und und natürlich infiziertem Sperma:natürlich infiziertem Sperma:

• Verwendung von zellkultur-adaptierten BVDV-Laborstamm für Titrationsversuch

• Chargenunterschiede beim Extraktionskit ?

• Freisetzung von RNasen durch das Einfrieren des Spermas vor der RNA-Isolierung im Titrationsansatz ?

• Unterschiedliche Cytotoxizität und Gehalte an PCR-Inhibitoren in verschiedenen Spermachargen ?

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kritische Wertung und Zusammenfassung

Bewertung serologischer Testverfahren:

• Generell ist Hitzeinaktivierung erforderlich !

• ELISAs:– Seren mit homologen NT-Titern von 1:2 bis 1:20 werden i.d.R. von

BVDV-Ak-ELISAs nicht detektiert

– indirekte ELISAs wenig sensitiv, Probleme mit BVD2 - Seren?

– NS3-blocking-ELISAs sind sensitiver und weniger abhängig vom BVDV-Typ, aber bislang kaum praktische Erfahrungen

• Viruneutralisationstest gegen BVDV 1 und 2 ( „Goldstandard“)– Immunperoxidase-Färbung sollte Standard sein

– evtl. Probleme mit EDTA-Plasma

Empfehlung für die Überwachung von Bullenstationen:

• Quarantäneuntersuchung mit VNT ( BVDV 1 und 2 )– Immunperoxidase-Färbung sollte dabei Standard sein

• Jahresuntersuchungen mit ELISA, Abklärungen mit VNT

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Spermauntersuchungen:

• Antigen-ELISAs, werden von Sperma-RL zwar genannt, sind aber weder geeignet noch zugelassen

• Virusisolierung/Zellkultur (Standardverfahren)– zur Vermeidung von zelltoxischer Wirkung v.a. Frischsperma verdünnen

• PCR:– von EU-Sperma-RL nicht genannt !

– aber im internationalen Handel teilweise wie Virusisolierung anerkannt

– Protokolle müssen weiter validiert werden, insbesondere im Hinblick auf

• Eliminierung von Inhibitoren

• Robustheit gegen Einfrieren (Pailletten)

Empfehlung für die Überwachung von Bullenstationen:• Zellkulturanzucht• PCR bis zum Abschluss der Validierung als ergänzende

Diagnostik

Herzlichen Dank für die Aufmerksamkeit

Herzlichen Dank für die AufmerksamkeitHerzlichen Dank für die Aufmerksamkeit