Der Einfluss von Toso bei der Effektorfunktion von · Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Institut für Immunologie der Universität Duisburg Essen

DerEinflussvonTosobeiderEffektorfunktionvon

Granulozyten

Inaugural‐Dissertation

zur

ErlangungdesDoktorgrades

Dr.rer.nat.

derFakultätfürBiologie

ander

UniversitätDuisburg‐Essen

vorgelegtvon

AndreasMerykausLeverkusen

Essen,September2012

DiedervorliegendenArbeitzugrundeliegendenExperimentewurdenamInstitutfürImmunologiederUniversitätDuisburgEssensowieanderKlinikfürGastroenterologie,HepatologieundInfektiologiederUniversitätsklinikDüsseldorfdurchgeführt.

1.Gutachter: Prof.Dr.KarlSebastianLang

2.Gutachter: Prof.Dr.UlfDittmer

VorsitzenderdesPrüfungsausschusses:Prof.Dr.ShirleyKnauer

TagdermündlichenPrüfung:21.11.2012

meiner Familie gewidmet

INHALTSVERZEICHNIS I

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS.......................................................................................................................................I

ABBILDUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................................................V‐VI

TABELLENVERZEICHNIS...............................................................................................................................VII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS...................................................................................................................VIII‐X

1. ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................................1

1. SUMMARY.................................................................................................................................................2

2. EINLEITUNG.............................................................................................................................................3

2.1. Listeriamonocytogenes...................................................................................................................3

2.1.1. Infektionszyklus.......................................................................................................................4

2.1.2. Immunabwehr..........................................................................................................................5

2.2. Granulozyten.......................................................................................................................................6

2.2.1. Granulozytopoese....................................................................................................................6

2.2.2. EliminierungderListeriendurchGranulozyten.........................................................8

2.2.2.1. ErkennungvonPathogenen...........................................................................................8

2.2.2.2. SynthesevonSauerstoffradikalen............................................................................10

2.2.2.3. RegulationderDegranulation....................................................................................11

2.2.2.4. BildungvonNETs............................................................................................................12

2.3. Toso......................................................................................................................................................13

2.3.1. StrukturdesProteins..........................................................................................................13

2.3.2. FunktionvonToso...............................................................................................................14

2.3.3. Expressionsprofil..................................................................................................................15

2.4. Zielsetzung........................................................................................................................................15

3. MATERIALUNDMETHODEN.........................................................................................................17

3.1. Material..............................................................................................................................................17

3.1.1. ChemikalienundMedien...................................................................................................17

3.1.2. Verbrauchsmaterial.............................................................................................................17

INHALTSVERZEICHNIS II

3.1.3. Geräte........................................................................................................................................18

3.1.4. Kits..............................................................................................................................................18

3.1.5. Software....................................................................................................................................19

3.1.6. LösungenundPuffer...........................................................................................................19

3.1.7. Primer........................................................................................................................................20

3.1.8. Antikörper...............................................................................................................................20

3.1.9. Listeriamonocytogenes.......................................................................................................21

3.1.10. Zellen.........................................................................................................................................21

3.1.11. Versuchstiere..........................................................................................................................21

3.1.12. Statistik.....................................................................................................................................22

3.2. Methoden...........................................................................................................................................22

3.2.1. ExperimentelleArbeiteninvivo.....................................................................................22

3.2.1.1. InfektionenmitListeriamonocytogenes...............................................................22

3.2.1.2. DepletionvonGranulozyten.......................................................................................22

3.2.1.3. VoraktivierungderGranulozyteninvivo...............................................................23

3.2.1.4. ApplikationvonBrdU.....................................................................................................23

3.2.1.5. AdoptivtransfervonGranulozyten...........................................................................23

3.2.1.6. Blutentnahme....................................................................................................................23

3.2.1.7. Organentnahme................................................................................................................24

3.2.1.8. Knochenmarkschimären...............................................................................................24

3.2.2. ArbeitenmitListerien.........................................................................................................24

3.2.2.1. KultivierungvonListerien...........................................................................................24

3.2.2.2. CFSE‐Listerien...................................................................................................................25

3.2.2.3. BestimmungbakteriellerTiterindenOrganen..................................................25

3.2.3. ExvivoArbeitenmitGranulozyten................................................................................25

3.2.3.1. GranulozytenPrimingundAktivierung.................................................................25

3.2.3.2. DetektionvonROSinvivo............................................................................................26

3.2.3.3. EinflussvonIgMaufROS..............................................................................................26

INHALTSVERZEICHNIS III

3.2.3.4. PhagozytosevonListerien...........................................................................................27

3.2.3.5. IgMabhängigePhagozytose........................................................................................27

3.2.3.6. OberflächenexpressionvonToso..............................................................................27

3.2.3.7. IntegrinExpressionimnaivenBlut..........................................................................28

3.2.3.8. Hitzeschock........................................................................................................................28

3.2.3.9. ApoptosevonGranulozyten........................................................................................28

3.2.4. ZellkulturprimärerMakrophagen................................................................................29

3.2.5. UntersuchungvonRNA......................................................................................................29

3.2.6. ELISA..........................................................................................................................................30

3.2.7. Durchflusszytometrie.........................................................................................................30

3.2.8. Immunhistochemie..............................................................................................................30

3.2.9. Zellkultur..................................................................................................................................31

3.2.9.1. ErntenvonZellen.............................................................................................................31

3.2.9.2. GenerierungvonGM‐CSFundM‐CSF......................................................................31

3.2.9.3. GenerierungvonMakrophagenausKnochenmark(MΦ)..............................32

3.2.9.4. AufreinigungvonGranulozytenmittelsMACS®Sort.........................................32

4. ERGEBNISSE..........................................................................................................................................33

4.1. CharakterisierungderToso‐/‐Maus........................................................................................34

4.2. ErhöhteSuszeptibilitätbeiDefizienzvonTosowährendderInfektionmit

Listeriamonocytogenes................................................................................................................35

4.3. TosoExpressioninGranulozyten............................................................................................37

4.4. TosounabhängigeRegulationderBlutgranulozytenpopulation...............................38

4.5. BeeinträchtigtePhagozytosederGranulozytenbeiTosoDefizienz.........................40

4.6. HerunterregulierungvonTosodurchPhagozytose........................................................46

4.7. FehlregulierteROS‐SyntheseundDegranulationvonTosodefizienten

Granulozyten...................................................................................................................................48

4.8. TosobeeinflusstdenAktivierungszustandderGranulozyten....................................55

4.9. IntrinsischerDefektTosodefizienterGranulozyten.......................................................60

INHALTSVERZEICHNIS IV

4.10. AdoptivtransfervonC57BL/6GranulozytenverbessertdieListerienkontrolle

währendderInfektion.................................................................................................................61

5. DISKUSSION..........................................................................................................................................65

5.1. FunktionvonTosoaufdieinitialeKontrollederInfektionmit

Listeriamonocytogenes................................................................................................................65

5.2. EinflüssevonTosoaufdieQuantitätderGranulozyten.................................................67

5.3. KomplementundIgMabhängigePhagozytose..................................................................68

5.4. InvolvierungvonTosobeiderROS‐Synthese....................................................................70

5.5. FolgenderfehlgesteuertenROS‐Synthese...........................................................................73

5.6. EinflussdesIntegrinsCD11b....................................................................................................74

5.7. Ausblick..............................................................................................................................................75

6. ANHANG..................................................................................................................................................76

6.1. InvivoDepletionvonMakrophagen.......................................................................................76

6.2. IgMabhängigePhagozytoseimserumfreienMedium....................................................77

6.3. KonzentrationvonC3imSerum..............................................................................................77

6.4. ROS‐SyntheseinEinzelknochenmarkchimären................................................................78

7. LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................................................79

8. DANKSAGUNG......................................................................................................................................88

9. LEBENSLAUF........................................................................................................................................89

10. PUBLIKATIONSLISTE........................................................................................................................90

11. ERKLÄRUNGEN....................................................................................................................................91

ABBILDUNGSVERZEICHNIS V

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb.2.1 IntrazellulärerLebenszyklusvonListeriamonocytogenes..........................................4

Abb.2.2 HämatopoeseimKnochenmark.............................................................................................7

Abb.2.3 InduktiondesRespiratoryburstderGranulozyten.....................................................10

Abb.2.4 ModelldesmurinenFaim3/Toso‐Moleküls...................................................................13

Abb.4.1 DeletionsnachweisvonTosoinderToso‐/‐Maus..........................................................34

Abb.4.2 ZusammensetzungdesBlutesvonnaivenToso‐/‐Mäusen.......................................35

Abb.4.3 ÜberlebenskurvederToso‐/‐MäusebeieinersublethalenInfektionmitL.monocytogenes.......................................................................................................................36

Abb.4.4 BakterientiterindenOrganen.............................................................................................36

Abb.4.5 ÜberlebenskurvebeiderDepletionvonGranulozytenwährendderInfektionmitL.monocytogenes...............................................................................................................37

Abb.4.6 OberflächenexpressionvonToso........................................................................................38

Abb.4.7 ApoptoseundNeubildungvonGranulozyten................................................................39

Abb.4.8 PhagozytosepotenzialvonListeriendurchGranulozyten........................................40

Abb.4.9 IgM‐abhängigePhagozytosevonCFSE‐Listerien.........................................................41

Abb.4.10 GranulombildunginderLeberanTagdreinachListerieninfektion....................43

Abb.4.11 KonfokaleAufnahmeListerienphagozytierenderGranulozyten...........................44

Abb.4.12 PhagozytosekapazitätvonMakrophagenwährendinvitroInkubationmitListerien.........................................................................................................................................45

Abb.4.13 PhagozytoseundEliminierungvonListeriendurchMakrophagen.....................46

Abb.4.14 ExpressionvonTosobeiderPhagozytosevonListerien..........................................47

Abb.4.15 IgMabhängigeInternalisierungvonTosobeiderPhagozytosevonListerien47

Abb.4.16 KorrelationzwischenPhagozytoseundROS‐Produktion........................................48

Abb.4.17 ROS‐SynthesewährendderPrimingphase.....................................................................49

Abb.4.18 ROS‐SynthesebeiInkubationmitdemAktivatorfMLP.............................................50

Abb.4.19 InvitroinduzierteROS‐SynthesenachderPriming‐undAktivierungsphase.51

Abb.4.20 TemperatursensitivitätderGranulozyten......................................................................52

Abb.4.21 InvivoROS‐SyntheseundDegranulationwährendeinerListerieninfektion...53

ABBILDUNGSVERZEICHNIS VI

Abb.4.22 ROS‐SyntheseinGranulozytenderMilz..........................................................................54

Abb.4.23 DerEinflussvonIgMaufdieROS‐SynthesederGranuloyzten...............................55

Abb.4.24 ExpressionvonIntegrinenaufnaivenBlutgranulozyten.........................................56

Abb.4.25 ExpressionvonCD11bnachdemPrimingmitGM‐CSFundLPS...........................56

Abb.4.26 EinflussderCD11b‐ExpressionaufdieEffektorfunktionvonGranulozyten...57

Abb.4.27 ÜberlebenskurvebeiDefizienzvonCD11bwährendeinerListerieninfektion58

Abb.4.28 PhagozytosekapazitätvoraktivierterBlutgranulozyten...........................................59

Abb.4.29 ÜberlebenskurveeinerListerieninfektionbeiVoraktivierung..............................60

Abb.4.30 UntersuchungderGranulozyteningemischtenKnochenmarkschimären........61

Abb.4.31 AufreinigungvonGranulozytenausdemKnochenmark..........................................62

Abb.4.32 ListerientiternachadoptivemTransfervonGranulozyten.....................................63

Abb.4.33 ÜberlebenskurvederToso‐/‐MäusenachadoptivenGranulozytentransferwährendderInfektionmitL.monocytogenes................................................................64

Abb.5.1 InsilicoAnalysedesTosoGenlokusaufChromosom1.............................................69

Abb.5.2 Phosphorylierungvonp47phoxüberverschiedeneMAPKinaseWege............71

Abb.6.1 ÜberlebenskurvevonC57BL/6MäuseninAbhängigkeitvongewebeständigenMakrophagenbeieinerInfektionmitL.monocytogenes...........................................76

Abb.6.2 PhagozytosevonCFSEListerieninAbhängigkeitvomkommerziellenIgM.....77

Abb.6.3 KonzentrationvonC3imSerum.........................................................................................77

Abb.6.4 UntersuchungderGranulozyteninEinzelknochenmarkchimären......................78

TABELLENVERZEICHNIS VII

TABELLENVERZEICHNIS

Tab.2.1 ÜbersichtderwichtigstenPRRsundentsprechendenLigandenbeieinerListerieninfektion...........................................................................................................................9

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

7AAD 7‐Aminoactinomycin

Abb. Abbildung

AK Antikörper

AS Aminosäure

BMMΦ KnochenmarkgenerierteMakrophagen(bonemarrowmacrophage)

bp Basenpaare

CD clusterofdifferentiation

CFSE Carboxy‐fluorescein‐diacetate‐N‐succinimidyl‐ester

CFU colonyformingunit

CLP commonlymphocytecellprogenitor

CMP commonmyeloidcellprogenitor

DAPI Diamidino‐2‐Phenylindole

DC dendritischeZelle(dendriticcell)

DHE Dihydroethidium

DHR Dihydrorhodamin123

DMEM Dulbecco`smodifiedeaglemedium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylen‐Diamin‐Tetra‐Acetylsäure

ELISA enzymelinkedimmunosobentassay

etal. undandere(etalii)

FACS fluorescenceactivatedcellsort

FAIM Fasapoptoticinhibitorymolecule

FcR Fc‐Rezeptoren

FCS fetalesKälberserum(fetalecalfserum)

FITC Fluorescein‐Isothiocyanate

fMLP N‐formyl‐methionine‐leucine‐phenylalanine

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX

GM‐CSF Granulozyten‐Makrophagen‐koloniestimulierendeFaktor

(granulocytesmacrophagescolonystimulatingfactor)

GMP granulocyte‐macrophageprogenitor

HSC HämatopoetischeStammzelle(hematopoieticstemcell)

i.p. intraperitoneal

i.v. intravenös

Ig Immunoglobin

IgV variableKettederImmunoglobine

IL Interleukin

IMDM IscovesModifiedDulbeccosMedium

kDA Kilo‐Dalton

LCMV lymphozytärenChoriomeningitisVirus

LPS Lipopolysaccharid

MACS magneticactivatedcellsort

M‐CSF MakrophagenkoloniestimulierenderFaktor(macrophagescolonystimulatingfactor)

MEP megakaryocyte‐erythrocyteprogenitor

MFI mittlereFluoreszenzintensität

MPO Myeloperoxidase

NADPH Nicotinamid‐adenin‐dinukleotid‐phosphat

ND nichtdetektierbar

NETs neutrophilextracellulartraps

NOD NucleotideOligomerizationDomain

OD optischeDichte

p Probability(Wahrscheinlichkeit)

p.i. nachInfektion(postinfection)

PAMPs pathogenassociatedmolecularpatterns

PBS Phosphatebufferedsaline

PCR polymerasechainreaction

PE Phycoerythrin

PeCy7 Phycoerythrin‐Cyanin‐7

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X

PerCP Peridin‐Chlorophyll

pH potentiahydrogenie

PRR patternrecognitionreceptor

PSG Penicilin‐Streptomycin‐LGlutamine

qRT‐PCR quantitativerealtimePCR

RNA Ribonukleinsäure

ROS reactiveoxygenspecies

rpm roundperminute

RT Raumtemperatur

SPF spezifiziertpathogenfrei

Tab Tabelle

TLR TollählicherRezeptor(toll‐likereceptor)

TNFα Tumornekrosefaktoralpha

VSV vesikulärestromatitisVirus

ZUSAMMENFASSUNG 1

1. ZUSAMMENFASSUNG

Die initiale Kontrolle einer bakteriellen Infektion ist von Zellen des angeborenen

Immunsystemsabhängig.OpsoniertdurchdasKomplementsystemundvonAntikörpern

unterschiedlicherIsotypenwerdenPathogenevonGranulozytenphagozytiertunddurch

dieintrazelluläreSynthesevonreactiveoxygenspecies(ROS)eliminiert.Störungenwiedie

chronischen granulomatösen Erkrankungen (CGD), die die Funktion von Granulozyten

beeinträchtigen, sind häufig mit chronischen und rezidivierenden Pilz und Bakterien

Infektionenassoziiert.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von fas apoptotic inhibitory

molecule 3 (Faim3/Toso) mittels einer Deletionsmutante während einer Infektion mit

dem Bakterium Listeria monocytogenes im Mausmodell betrachtet. Derzeit wird die

funktionelle Wirkungsweise dieses Transmembranproteins als anti‐apoptotisches

Molekülbzw.alsRezeptorfürIgMkontroversdiskutiert.

TosodefizienteMäusewieseninderfrühenInfektionsphaseeinehoheMortalitätauf.Die

spezifischeDepletionderGranulozytenerhöhtedieSuszeptibilitätvonC57BL/6Mäusen

fürL.monocytogenes,wohingegenderadoptiveTransfervonC57BL/6Granulozytendie

ResistenzvonToso‐/‐Mäusenwiederherstellte.ErstmalskonntedieExpressionvonToso

aufGranulozytenundeinedurchPhagozytosebedingteHerunterregulationdesProteins

beschriebenwerden. Der Einfluss von Toso auf den Phagozytoseprozess von Bakterien

unddieSynthesevonROSkonntesowohl invitroalsauch invivonachgewiesenwerden.

Die Deletion von Toso auf Blutgranulozyten verringerte die IgM abhängige

Phagozytoserate von Bakterien. Desweiteren erhöhte Toso den Schwellenwert für die

Induktion der ROS‐Synthese und verhinderte eine frühzeitige Aktivierung und

Degranulation der Granulozyten im Blut. Als Folge dieser Dysregulation wiesen Toso

defizienteMäuseverminderteEffektorfunktionenderGranulozyten imGewebeundeine

erhöhtePathogenlastindenOrganenauf.

ImRahmen dieserDissertationwurde Toso alswichtiger Regulator für die Aktivierung

unddieKoordinationderEffektorfunktionenvonGranulozytenidentifiziert.

SUMMARY 2

1. SUMMARY

The initial control of bacterial infection depends on cells of the innate immune system.

Pathogens which are opsonized by the complement system and antibodies of different

isotypes are phagocytosed by granulocytes and eliminated by intracellular synthesis of

reactiveoxygen species (ROS).Disorders suchas chronic granulomatousdisease (CGD),

whichaffectthefunctionofgranulocytes,areoftenassociatedwithchronicandrecurrent

fungalandbacterialinfections.

Inthepresentwork,theimportanceoffasapoptoticinhibitorymolecule3(Faim3/Toso)

was investigated by a knockout mice during infection with the bacterium Listeria

monocytogenes. Currently, there is a controversial discussion about the functional

mechanism of this transmembrane protein as anti‐apoptoticmolecule or a receptor for

IgM.

Tosodeficientmice succumbed in theearlyphaseof infection.The specificdepletionof

granulocytes increased susceptibility of C57BL/6 mice for L. monocytogenes, while

adoptivetransferofC57BL/6granulocytesrestoredresistanceofToso‐/mice.Forthefirst

timeexpressionofTosoongranulocytesandaphagocytosisdependingdownregulationof

thisproteinweredescribed.AninfluenceofTosoforuptakeofbacteriaandsynthesisof

ROSweredemonstratedinvitroandinvivo.ThedeletionofTosoongranulocytesreduced

the IgM‐dependentphagocytosisofbacteria.Furthermore,Toso increased the threshold

for induction of ROS synthesis and prevented early activation and degranulation of the

granulocytes in the blood. As a consequence of this dysregulation Toso deficient mice

showed reduced effector functions of granulocytes in tissue and increased bacterial

burdenintheorgans.

InthecurrentthesisTosohasbeenidentifiedasanimportantregulatorfortheactivation

andcoordinationoftheeffectorfunctionsingranulocytes.

EINLEITUNG 3

2. EINLEITUNG

Mehrzellige Organismen sind einer Vielzahl von Pathogen ausgesetzt und haben

StrategienentwickeltsichdurchschnelleErkennungundeffizienteAbwehrmechanismen

zu schützen. Im Verlauf der Evolution hat sich zunächst das phylogenetisch ältere

angeboreneImmunsystementwickelt,dasinallenvielzelligenOrganismenvorkommtund

Eindringlinge unmittelbar und pathogenunspezifisch bekämpft. Das adaptive

Immunsystemhatsicherstindenletzten500MillionenJahrenentwickeltundistbeiallen

Wirbeltierenzufinden.EsisterregerspezifischundbenötignachPathogenkontakteinige

Tage bis zur Funktionalität. Zum angeborenen Immunsystem zählen mechanische

Barrieren wie die Haut, humoralen Faktoren wie das Komplementsystem und

PlasmaproteinensowiezelluläreFaktorenwieMakrophagen,Granulozyten,dendritische

Zellen(DC)undnatürlicheKiller(NK)‐Zellen.DasadaptiveImmunsystemsetztsichausB‐

und T‐Zellen zusammen, welche durch klonale Expansion von spezifisch gegen einen

Erreger ausgerichtete Effektorzellen Pathogene bekämpfen, die sich durch

Immunevasionsmechanismendemangeborenen Immunsystemzuentziehendrohen.Die

beidenArmedes Immunsystemssinddabeiengmiteinanderverknüpft.DieAktivierung

des adaptiven Immunsystems setzt zwingenddiePräsentationvonAntigenendurchdie

ZellendesangeborenenImmunsystemsvoraus(MedzhitovandJaneway,2000).

2.1. Listeriamonocytogenes

Die Gattung Listeria besteht aus sieben Arten, von denen nur Listeria monocytogenes

sowohl tier‐ als auch humanpathogen ist (Vazquez‐Boland et al., 2001a). Listeria

monocytogenes ist ein gram‐positives, stäbchenförmiges und fakultativ intrazellulär

replizierendesBakterium,welches eineKrankheit namens Listeriose verursacht (Sixl et

al.,1978).DieseverläuftbeiimmunkompetentenMenschenmeistsymptomlos,kannaber

in seltenen Fällen zu einer Gastroenteritis führen (Cossart, 2007). Bei

immunsupprimiertenundälterenMenschenkanneineakuteInfektionmitListerieneine

Meningoenzephalitis oder Sepsis hervorrufen, wohingegen Schwangere einen Abort

erleiden können (Antal et al., 2005; Gellin and Broome, 1989). Die Listeriose ist für

weniger als 1% der über Lebensmittel erworbenen Erkrankungen verantwortlich und

weisteineMortalitätsratevonüber20%auf(Vazquez‐Bolandetal.,2001b).

EINLEITUNG 4

2.1.1. Infektionszyklus

Der typische Infektionsweg von Listeria monocytogenes ist die orale Aufnahme über

kontaminierteNahrungsmittel.NachderAufnahmederBakterienwirddasEpithelgewebe

des Gastrointestinaltraktes infiziert, welches die Interaktion von Internalin A der

Bakterienzelle mit E‐Cadherin der Enterozyten benötigt (Gaillard et al., 1991). Die

Internalisation der Bakterien in dieWirtszelle erfolgt über einen Clathrin vermittelten

Zipper‐Mechanismus (Hamon et al., 2006). Mäuse sind gegen diese Infektionsroute,

aufgrund einer einzelnen Punktmutation zwischen humanen und murinen E‐Cadherin,

relativ resistent (Lecuit et al., 2001). Diese Problematik wird umgangen, indem im

Mausmodell meist eine intravenöse oder intraperitoneale Infektion durchgeführt wird.

Bei oraler Inokulation durchbrechen die Bakterien die Epithelschicht des Darmes und

gelangen über den Blutstrom zu den anderen Organen. In der Leber werden die

Hepatozyten durch die Expression eines weiteren Oberflächenproteins, Internalin B,

welcher an denHepatocyte growth factor receptor (HGFR) bindet, befallen (Shen et al.,

2000).NachdemEintrittindieWirtszelleentkommendieListeriendurchdieExpression

desHämolysinsListeriolysinO(LLO)ausdemPhagosominsZytoplasma(Bieleckietal.,

1990).ImWirtszytoplasmaexprimierendieListeriendasactin‐assembly‐inducingprotein

(ActA),welcheszurBildungvonActin‐PolymerenführtunddenBakterienBeweglichkeit

innerhalbdesZytoplasmasundzur InfektionderNachbarzellenverleiht (Domannetal.,

1992;Kocksetal.,1992).DerInfektionszyklusistinAbbildung2.1.dargestellt.

Abbildung2.1.: IntrazellulärerLebenszyklusvonListeriamonocytogenes.(1)EindringenderBakterienin die Wirtszelle über Internalin A oder B (InIA, InIB); (2) Überleben im Phagosom; (3) Lyse desPhagosomdurchLLO; (4)Vermehrung imZytosol; (5)FortbewegungmittelsAssemblierungvonAktindurchactin‐assembly‐inducingprotein(ActA)zueinemAktinschweif;(6)EindringenindieNachbarzelle;(7)ÜberlebenimDoppelmembran‐Phagosom;(8)LysedesPhagosoms;(9)ErneuteVermehrunginderNachbarzelle.

EINLEITUNG 5

2.1.2. Immunabwehr

Listeriamonocytogenesistseitden1960erJahreneinetabliertesSystem,umdiezellulären

Komponenten des angeborenen und adaptiven Immunsystems im Mausmodell zu

untersuchen (Mackaness, 1962). Innerhalb weniger Minuten nach einer intravenösen

Injektion befallen die Bakterien die Milz und die Leber, in welchen sie von

gewebsständigen Makrophagen aufgenommen werden (Conlan, 1996). Durch

proinflammatorische Zytokine angelockt, wandern die neutrophilen Granulozyten

chemotaktisch als erste Leukozytenpopulation zum Infektionsort und verhindern die

weitereReplikationderBakterien(Czuprynskietal.,1994;RogersandUnanue,1993).Die

sezerniertenZytokinederGranulozytenförderndieMigrationvonMakrophagenausdem

Blut zum Infektionsort (Guleria andPollard, 2001;Mandel and Cheers, 1980).Das vom

entzündetenGewebe freigesetzteChemokinCCL2rekrutiertvorallem inflammatorische

Monozyten, die sich am Infektionsort zu TNFα und iNOS produzierenden dendritischen

Zellen (TIP‐DCs) entwickeln (Serbina et al., 2003). Zusammen unterdrücken diese

frühinflammatorischen Zellen die weitere Replikation der Listerien bis die Zellen des

angeborenen Immunsystems entwickelt sind. Das Fehlen von einer dieser

ZellpopulationenführtzustarkgesteigerterSuszeptibilitätundMortalität(Czuprynskiet

al., 1994; Havell, 1987; Samsom et al., 1997; Serbina et al., 2003). Die endgültige

EliminierungderListerien istentscheidendabhängigvoneinerListerienspezifischenT‐

Zell Immunantwort. Die Verknüpfung zum adaptiven Immunsystem wird über die

PräsentationvonAntigenenaufdendritischenZellenundMakrophagengeschaffen.Diese

sind Teil des angeborenen Immunsystems und essentiell für die Generierung einer

potentenT‐Zell‐Immunantwort(Jungetal.,2002).DieEntwicklungbenötigteinegewisse

Zeit, weswegen die ersten Listerien spezifischen T‐Zellen vier bis fünf Tage nach der

InfektionauftretenunddenHöhepunktinderklonalenExpansionzwischendemsiebten

undneuntenTagderInfektionerreichen(Buschetal.,1998).NachderEliminierungdes

Pathogens kontrahieren die Listerien spezifischen T‐Zellen zu der kleineren

Zellpopulation der stabilenMemoryT‐Zellen. Diese sind verglichenmit naiven T‐Zellen

größer in der Anzahl, weisen einen niedrigeren Schwellenwert für die Aktivierungmit

einem spezifischen Antigen auf und erreichen sehr schnell bei einer wiederholten

Infektion ihre Effektorfunktionen. Auf dieseWeise schützenMemory‐T‐Zellen vor einer

Reinfektion mit Listerien (Bancroft et al., 1991; Bhardwaj et al., 1998). Die humorale

Immunantwort über B‐Lymphozyten spielt während einer Infektion mit Listerien eine

untergeordnete Rolle, da sich die meisten Listerien im Zellinneren aufhalten und die

EINLEITUNG 6

Verbreitung intrazellulär über die Nachbarzelle ohne Eintritt ins extrazelluläre Milieu

abläuft(Mackaness,1962).DennochtrageninnaivenTierennatürlichvorkommendeanti‐

ListerienAntikörperzuBeginnderInfektiondazubeidieAusbreitungderListerienindie

Organezureduzieren(Ochsenbeinetal.,1999).

2.2. Granulozyten

Granulozyten(vomlat.granulum„Körnchen")sindpolymorphkernige,zumangeborenen

Immunsystem zählende, Leukozyten und charakterisiert durch die Anwesenheit von

Granula im Zytoplasma. Anhand ihres Färbeverhaltens können sie in drei Gruppen

unterteiltwerden:neutrophile,basophileundeosinophileGranulozyten.Dieneutrophilen

Granulozyten sind für die Abwehr von Bakterien und Pilzen zuständig, während

eosinophileundbasophileGranulozytenvorrangigfürdieBekämpfungvonmehrzelligen

Parasiten (z.B. Würmern) verantwortlich sind. Den größten Anteil mit 50‐60% aller

LeukozytenimBlutstellendieneutrophilenGranulozytenvondenenjedenTag1011neu

gebildeteZellendasKnochenmarkverlassen(FurzeandRankin,2008).DieLebensdauer

eines neutrophilen Granulozyten nach dem Austritt aus dem Knochenmark ins Blut

beträgt bis zu acht Stunden. Werden sie jedoch durch einen Stimulus oder Pathogen

aktiviert,verlängertsichdieLebensdaueraufbiszuzweiTage(Kobayashietal.,2005).In

der folgenden Arbeitwird der Begriff Granulozyten ausschließlich für die neutrophilen

Granulozytenverwendet.

2.2.1. Granulozytopoese

Die Blutbildung (Hämatopoese) geht von pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen

(HSC) im Knochenmark aus, die aus einer Abfolge von hierarchischer Zellteilung alle

reifen Blutzellen hervorbringen (Cantor and Orkin, 2001). Die HSC sind durch die

Expression von CD34+ gekennzeichnet und durch asymmetrische Zellteilung entstehen

aus einer Stammzelle zwei verschiedene Tochterzellen (Giebel et al., 2006). Die eine

Tochterzelle verbleibt in einem pluripotenten, undifferenzierten Zustand, wodurch der

Stammzellpool im Knochenmark aufrecht erhalten bleibt, und die zweite Tochterzelle

differenziertzueinerProgenitorzellemiteingeschränktemDifferenzierungspotenzialaus

dersichentwederdiegemeinsamelymphoideProgenitorzelle(CLP)oderdiegemeinsame

myeloideProgenitorzelle(CMP)entwickelt(Akashietal.,2000a;Akashietal.,2000b).Aus

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EINLEITUNG 8

anschließend zum Myelozyten sind nur durch Proliferation gekennzeichnet. Hierbei

entstehen aus einem Promyelozytenmindestens achtMyelozyten. Aus demMyelozyten

entstehen durch Differenzierung zunächst stabkernige und abschließend die reifen

segmentkernigenGranulozyten(Borregaardetal.,1995).

2.2.2. EliminierungderListeriendurchGranulozyten

2.2.2.1. ErkennungvonPathogenen

Pathogene werden durch den Wirt über nicht im Wirtsorganismus vorkommende

Proteine,DNAoderRNA(Pathogen‐assoziiertemolekulareMuster(PAMPs))identifiziert.

Die PAMPs sind evolutionär hoch konservierte Strukturen, die für das Überleben des

Pathogensessentiellsind(z.B.LPS),weswegendiesekeinenImmunevasionsmechanismus

bilden können (Medzhitov, 2001) Die Erkennung der PAMPs erfolgt über die sehr

heterogene Gruppe der Pattern‐Recognition Receptors (PRRs), die in lösliche,

transmembrane und zytosolische PRRs eingeteilt werden. Die löslichen PRRs sind

vorwiegendCollektin,FicolinundPentraxin,dieandieOberflächevonBakterienbinden

und das Komplementsystems aktivieren (Iwasaki and Medzhitov, 2010). Durch die

Bindung der Komplementfaktoren opsoniert, werden die Pathogene von Granulozyten

über Komplementrezeptoren wie den Komplementrezeptor 3 (CD11b/CD18)

phagozytiert, wodurch zusätzlich deren Expression durch die Mobilisierung von in

Granula gespeicherten Rezeptoren verstärktwird (Berger et al., 1984; Sengelov, 1995).

Die transmembranen PRRs sind Toll‐like Rezeptoren und entweder auf der

Plasmamembran der Zelle oder in endosomalen/lysosomalen Organellen exprimiert

(Takeda and Akira, 2005). TLRs auf der Oberfläche von Granulozyten erkennen

konservierte Zellmembranstrukturenwie Lipopolysaccharide (LPS) von gram‐negativen

Bakterien(TLR4),Lipoteichonsäurevongram‐positivenBakterien(TLR2)oderFlagellin

(TLR5),wohingegenendosomaleTLRshauptsächlichNukleinsäurenerkennen(TLR3,7,

9) (Iwasaki andMedzhitov, 2010). TLRswerden von fast allen Zellen des angeborenen

und erworbenen Immunsystem exprimiert und die Erkennung von PAMPs durch TLRs

führt zur Aktivierung von Signaltransduktionswegen und in Abhängigkeit vom TLR zu

unterschiedlichen Genexpressionsmustern von Zytokinen, Chemokinen und

antimikrobiellen Proteinen (Iwasaki and Medzhitov, 2004; Takeda and Akira, 2005;

Takeuchietal.,1999).BeidenzytosolischenPRRssindfürdieGranulozytendieNOD‐like

EINLEITUNG 9

Rezeptoren(NucleotideOligomerizationDomain)vongroßerBedeutung.Dieseerkennen

2,6 Diaminopimelinsäure (meso‐DAP), ein Peptidoglycan konstitutiv exprimiert von

gram‐negativenBakterien,oderMDP(MuramylDipeptide),einPeptidoglycanvongram‐

positiven und gram‐negativen Bakterien, und führen zur Aktivierung von

inflammatorischenSignalkaskaden(Stroberetal.,2006).

Tabelle2.1.ÜbersichtderwichtigstenPRRsundentsprechendenLigandenbeieinerListerieninfektion.

PRR Ligand VorkommendesPRR

Collektin,Ficolin,Pentraxin

(Komplementsystem)KohlenhydratresteunddiversePAMPs

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NOD2 MuramylDipeptide Intrazellulär

Die Granulozyten exprimieren außerdem zur Pathogenerkennung Formyl Peptide

Rezeptoren (fpr) die zu den G‐Protein gekoppelten Rezeptoren zählen (Migeotte et al.,

2006).ImMenschengehörenzuderfprFamilieFPR1,FPRL1undFPRL2,währendinder

Maus FPR1 und FPR2 beschrieben sind (Le et al., 2002;Migeotte et al., 2006). An FPR

bindet N‐formyl‐methionine‐leucine‐phenylalanine (fMLP), welcher ein Bestandteil

bakterieller Zellwände ist. Es wirkt chemotaktisch auf die Granulozyten und löst die

Zytokinproduktion und die Freisetzung von Granula aus (Hartt et al., 1999). Die

Bedeutung dieser Rezeptorenklasse für Granulozyten wurde in der fpr‐/‐ Maus

verdeutlicht, die eine stark erhöhte Suszeptibilität bei einer Infektion mit Listeria

monocytogenes aufweist (Gao et al., 1999). Die wichtigsten PRRs der Granulozyten

einschließlich deren Ligaden sowie deren Expression sind in der Tabelle 2.1.

zusammengefasst.

EINLEITUNG 10

2.2.2.2. SynthesevonSauerstoffradikalen

Nach der Erkennung und der Phagozytose von Pathogenen produzieren Granulozyten

große Mengen an Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species ; ROS), ein Vorgang der

auch als Respiratory Burst bezeichnet wird, und für das Eliminieren der Pathogene im

Phagolysosomessentiell ist(Segaletal.,1981).DieRadikalewerdenzunächstdurchdie

NADPH‐Oxidase, welche in der Plasmamembran und im Phagosom lokalisiert und aus

sechs Untereinheiten aufgebaut ist, durch Oxidation von NADPH auf der zytosolischen

Membranseite und Reduktion von O2 auf der Außenseite der Membran gebildet

(Abbildung2.3.).BeidiesemVorgangentstehenzunächstSuperoxide(O2‐),dieaufgrund

ihrerInstabilitätdurchdieSuperoxid‐DismutaseindasstabileWasserstoffperoxid(H2O2)

umgewandelt werden. (Segal, 2005). DasWasserstoffperoxid dient als Substrat für die

Myeloperoxidase (MPO), die die Bildung von hypochloriger Säure (HOCL) unter

Verwendung von Chloridionen katalysiert und etwa 5 % des gesamten

Neutrophilenproteins und etwa 25 % des Granulaproteins ausmacht (Hampton et al.,

1998). Dieses hochreaktive Produkt reagiert mit der DNA, Proteinen und Lipiden der

MikroorganismenundinduziertdasAbsterbenderBakterien.

Abbildung2.3.: InduktiondesRespiratoryburstderGranulozyten.DiezytosolischenKomponentenderNADPHOxidase (p47phox,p67phox,p40phox,p21rac)assemblierennachPhosphorylierung imZytoplasmamitdenmembranständigenKomponenten(gp91,p22)zumvollständigenKomplex.Dieweiterep47phoxPhosphorylierungimKomplexführtzurAktivierungderNADPHOxidase,welcheunterVerwendungvonNADPHdurchReduktionvonO2O20‐katalysiert.

EINLEITUNG 11

Die ROS‐Synthese erfolgt in einem streng regulierten zweistufigen Prozess aus Priming

und Aktivierung der Granulozyten. Im nicht aktivierten Granulozyten sind einige

Untereinheiten der NADPHOxidase im Zytoplasma verteilt undwerden erst durch das

Primingphosphoryliert,wodurchdieseausdemZytoplasmazurMembranwandernund

zumvollständigenKomplexassoziieren(Clarketal.,1990;Dangetal.,1999;DeLeoetal.,

1998;Wientjesetal.,1993)(Abbildung2.3.).DurchdasPrimingwirdindenGranulozyten

kaumROSsynthetisiert,jedochdieSensitivitätaufeinenzweitenStimuluswiebakterielle

N‐formylPeptidepotenziertundanschließendgroßeMengenanROSsynthetisiert(Elbim

etal.,1994;Moreletal.,1991).DieBedeutungderNADPHOxidase fürdieEliminierung

vonMikrobenwurdebeimMenschenbeiderdurchdieDysfunktionderNADPHOxidase

verursachten Krankheitsgruppe chronische granulomatöse Erkrankung (CGD)

beschrieben,beiderdiePatientensuszeptibelgegenBakterienundPilzInfektionensind

(Thrasheretal.,1994;Winkelsteinetal.,2000).

2.2.2.3. RegulationderDegranulation

Die Granulozyten speichern in Granula Proteine mit vorwiegend antimikrobieller

Funktion, die in die Gruppen primäre, sekundäre, tertiäre und sekretorische Granula

unterteiltwerden(BorregaardandCowland,1997;Chertovetal.,2000).IndiesenGranula

sindüber300Proteineenthalten,die indieUmgebungabgegebenwerdenkönnenoder

mitderPlasmamembranverschmelzen(Lominadzeetal.,2005).WährendderMigration

vom Blut zum Infektionsort werden die Granula in einer festgelegten Reihenfolge

ausgeschüttet. Die sekretorischen Granula werden unverzüglich bei Kontakt der

Granulozytenmit dem Endothelium entleert, die tertiären bei derMigration durch das

Endothelium und die sekundären und primären am Infektionsort (Borregaard and

Cowland,1997;FaurschouandBorregaard,2003).DiesekretorischenGranulaenthalten

eine Ansammlung von Membranrezeptoren wie β2‐Integrine, Komplementrezeptoren,

Formyl Peptide Rezeptoren (fpr), CD14 und CD16, welche durch den Einbau in die

Plasmamembran die Morphologie der Granulozyten verändern und die zuvor relativ

inaktiven Granulozyten sensitiv auf inflammatorische Signale machen (Sengelov et al.,

1993a; Sengelov et al., 1993b). Desweiteren enthalten die sekretorischen Granula

UntereinheitenderNADPHOxidase(BorregaardandTauber,1984).DietertiärenGranula

beinhaltenvorallemMatrixdegradierendeProteine,diedieExtravasationundDiapedese

der Granulozyten ermöglichen (Joiner et al., 1989; Mollinedo et al., 1997). In den

sekundären Granula sind antimikrobielle Substanzen und Proteine (z.B. Lactoferrin,

EINLEITUNG 12

NGAL, Lysozyme) enthalten, die ins Phagosom oder nach außen abgegeben werden

(Maallemetal.,1982;Ogawaetal.,1983).DieprimärenGranulasindgefülltmitProteasen

und antimikrobiellen Proteinen wie Myeloperoxidase, Defensine, Cathepsin G und

Elastase(Riceetal.,1987;Salvesenetal.,1987;Sinhaetal.,1987).DasAusschüttender

Granula ist ein streng kontrollierter Vorgang, der als "regulierte Exozytose" bezeichnet

wird. (Nusse and Lindau, 1988; Toonen and Verhage, 2003). Die Exozytose der

Granulasubtypen ist dabei durch ansteigende Schwellenwerte für aktivierende Stimuli

kontrolliert. Die sekretorische Granula weisen einen niedrigeren Schwellenwert als

tertiäreundtertiäreeinenniedrigerenalssekundäreundprimäreGranulaauf(Kjeldsen

et al., 1993; Kjeldsen et al., 1992; Sengelov et al., 1993a) Die Granulasubtypenwerden

währendderverschiedenenDifferenzierungsstadienderGranulozyten imKnochenmark

gebildet undmit denProteinen gefüllt (Borregaard et al., 1995).NachdemAustritt der

Granulozyten ins Blut werden die neusynthetisierten Proteine nicht mehr in Granula

gepackt(Theilgaard‐Monchetal.,2004).

2.2.2.4. BildungvonNETs

Die Bildung von neutrophil extracellular traps (NET) ist ein alternativer Sterbevorgang

(Netose) zwischen Apoptose und Nekrose, wodurch die Granulozyten auch nach dem

SterbennochantimikrobilleFunktionbesitzen.WährendderNetoseschwilltderZellkern

anunddasChromatinwirdaufgelöst,wodurch langeSträngevonunkondensierterDNA

anderProteineausdemZytoplasmaunddenGranulasowieHistoneangeheftetsindaus

derZelleausgestoßenwerden(Brinkmannetal.,2004;BrinkmannandZychlinsky,2007).

DieNET‐ProteinesindwegenderBindungandieDNAhauptsächlichkationischgeladen

und sind überwiegend Defensine, Elastasen, Proteinase 3, Lactoferrin und

Myeloperoxidase(Urbanetal.,2009).DieBildungvonNETsistabhängigvonderSynthese

von Hydrogenperoxid durch die NADPH Oxidase und dessen weitere Metabolisierung

durch die Myeloperoxidase (Bianchi et al., 2009; Papayannopoulos et al., 2010). Die

fibrilläreMatrix derNETs bindet die Bakterien,wodurch deren Verbreitung verhindert

wird.DieNETswerdennacheinigerZeitdurchimBlutvorkommendeDNAsenabgebaut.

Menschen mit einer Störung der DNase‐1 Aktivität weisen ein höheres Risiko für

NierenentzündungenundZellschädenauf(Fuchsetal.,2007;Hakkimetal.,2010).

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EINLEITUNG 14

2.3.2. FunktionvonToso

DieErstpublikationzuTosobeschriebeineinhibitorischeAktivitätgegenFAS,TNFαund

FADD induzierte Apoptose, jedoch nicht gegen Staurosporine und Ceramide induzierte

Apoptose(Hitoshietal.,1998).DiesersignalwegspezifischeEffektlieseineinhibitorische

Wirkung von Toso auf die Caspase 8 vermuten. Die Interaktion der intrazellulären

DomänevonTosomitFADDunddienegativeRegulationderCaspase8konnte in einer

Folgestudienachgewiesenwerden(SongandJacob,2005).Ineinerkürzlicherschienenen

Publikation wurde die intrazelluläreWirkungsweise von Toso aufgeklärt. Den Autoren

zufolge bindet RIP1 konstitutiv an Toso und bildet einen trimolekularen Komplex mit

FADD,derbeiStimulationüberdenFASRezeptorstabilisiertwird(Nguyenetal.,2011).

AlsFolgestehtFADDnichtmehrfüreffizientesApoptosesignalüberdenaktiviertenFAS

RezeptorzurVerfügungundapoptotischeVorgängewerdenverringert.Tosoerhöhtsomit

denSchwellenwert fürdieFASinduzierteApoptose(Nguyenetal.,2011).DiesesModell

derFunktionvonTosokorreliertmitdenBeobachtungendurchRichteretal. beidenen

ein Knockdown von Toso in primären humanen T‐Zell zu einer erhöhten FAS Ligand

induziertenApoptoseführte(Richteretal.,2009).

InderletztenZeitwirddieanti‐apoptotischeWirkungvonTosokontroversdiskutiertund

eineFunktionvonTosoalsRezeptorfürIgMpostuliert,weswegenTosonunauchalsFcµR

bezeichnetwird(Kubagawaetal.,2009;Shimaetal.,2010).DieIgMbindendeEigenschaft

von Toso führte zu Zweifel an der in der Erstpublikation beschriebenen anti‐

apoptotischenWirkung, da dort ein anti‐FAS Antikörper vom IgM Isotypen verwendet

wurde.Kubagawaetal. konnten in ihrenVersuchen zeigen, dassTosoper se keine anti

apototischeWirkungbesitzt,sondernnurbeiLigationdesFASRezeptorsmiteinemanti‐

FASAntikörpersvomIgM,abernichtvomIgGIsotypen(Kubagawaetal.,2009).Innerhalb

weniger Minuten führt die Bindung von IgM an Toso in humanen B‐Zellen zur

InternalisationvonTosoundIgMundnachTransportinsLysosomzurDegradation(Vire

etal.,2011).DieIgMbindendeEigenschaftvonTosokonntejedochnichtvonNguyenetal.

beobachtetwerdenundwirdzurZeitkontroversdiskutiert(Honjoetal.,2012;Nguyenet

al.,2012). Jedochstütztsichdiebeschriebeneanti‐apoptotischeWirkungvonTosonicht

nur auf den FAS‐Ligand, sondern auch auf die mit den Zytokinen TNFα und TRAIL

induzierteApoptose(Nguyenetal.,2011).

EINLEITUNG 15

2.3.3. Expressionsprofil

DasMolekülTosowurdezunächstaufaktiviertenT‐Zellenidentifiziert,wohingegennaive

T‐Zellen kaumToso auf derOberfläche exprimieren (Hitoshi et al., 1998;Nguyen et al.,

2011).DieAnalysederGenexpressionmittelsMicroarrayhingegenzeigte,dassdiemRNA

vonTosoinnaivenundMemoryT‐ZellenstarkexprimiertistundbeiAktivierungderT‐

Zellenherunterreguliertwird(Abbasetal.,2005).DietransienteExpressiondesProteins

auf aktivierten T‐Zellen wird hierbei im Zusammenhang mit der anti‐apoptotischen

Wirkung gebracht (Nguyen et al., 2011). In den folgenden Jahren konnte zusätzlich die

ExpressionvonTosoaufnaivenB‐Zellen,eineHochregulationaufaktiviertenB‐Zellenund

eineExpressionaufNKT‐Zellennachgewiesenwerden(Kubagawaetal.,2009;Nguyenet

al., 2011; Pallasch et al., 2008). Eine Akkumulation von großen Mengen des Proteins

konnte in den Vesikeln des trans Golghi Netzwerkes aufgefunden werden (Vire et al.,

2011). ImMenschen gewann Toso an Bedeutung für die Forschung, nachdem bei CLL‐

Patienten (chronische lymphatische Leukämie), einem B‐Zell‐Non‐Hodgkin‐Lymphom,

eine Überexpression von Toso auf B‐Zellen beobachtet wurde (Pallasch et al., 2008;

PallaschandWendtner,2009).DasLevelderÜberexpressionkorreliertehierbeimitder

Intensität und Aggressivität der Erkrankung. Bei T‐Zellen konnte ebenfalls eine

ÜberexpressionvonTosomitAutoimmunerkrankungeninAssoziationgebrachtwerden.

In voll aktivierten T‐Zellen wird die Toso mRNA nach einiger Zeit herunterreguliert,

wohingegen die Microarray Analyse bei autoreaktiven T‐Zellen von Patienten mit

systemischenLupuserythematodes(SLE)einekonstitutiveTosoExpressionzeigte(Deng

etal.,2006).

2.4. Zielsetzung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Relevanz von Toso im Mausmodell

während einer Infektion mit dem gram‐positiven Bakterium Listeria monocytogenes

untersucht.GranulozytensinddieerstenZellendesKörpers,diezurEindämmungeiner

bakteriellen Infektion ins entzündete Gewebemigrieren. Die Verbreitung der Bakterien

durchdieGranulozytenwirdimWesentlichendurchPhagozytoseundderanschließenden

Synthese von Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species; ROS) verhindert. Wie diese

beidenAbwehrmechanismen synchronisiert sind, istweitestgehendunklar.DasZiel der

EINLEITUNG 16

Dissertation ist die funktionelle Einordnung des Membranproteins Toso auf die

RegulationdieserProzesse.

In Vorarbeiten konnte erstmals gezeigtwerden, dass Toso auf Granulozyten exprimiert

ist.ZurBeantwortungderobigenFragestellungwirdeineTosodefiziente(Toso–/–)Maus

verwendet.DerEinfluss vonToso auf diePhagozytoseunddie Synthese vonROS sollte

hierbei sowohl durch invitro Untersuchungen von naiven Granulozyten als auch durch

AnalysenderGranulozyteninvivowährendderInfektionmitListerienbetrachtetwerden.

Zur abschließendenBeurteilungderBedeutungvonToso sollten adaptiveGranulozyten

Transfersdurchgeführtwerden.

MATERIALUNDMETHODEN 17

3. MATERIALUNDMETHODEN

3.1. Material

3.1.1. ChemikalienundMedien

Die laborüblichen Standardchemikalien wurden von AppliChem (Darmstadt), Merk

(Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma‐Aldrich (München) bezogen. Medien für die

Zellkultur wurden bei Pan Biotech (Aldenbach), Biochrom (Berlin) oder Invitrogen

(Darmstadt)bestellt.

BrainHeartInfusion BDBioscience,Heidelberg

BrainHeartInfusionAgar Fluka,München

CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster(CFSE) Invitrogen,Darmstadt

Cyclophosphamid(CY) Sigma,München

4',6‐diamidino‐2‐phenylindole(DAPI) Invitrogen,Darmstadt

dihydro‐ethidium(DHE) Invitrogen,Darmstadt

dihydro‐rhodamin123(DHR) Alexis,Lörrach

N‐Formylmethionyl‐Lencyl‐Phenylalanin(fMLP) Sigma,München

FACSLysingSolution BDBioscience,Heidelberg

FetalesKälberserum(FCS) BiochromAG,Berlin

Isofluran DeltaSelectGmbH,Pfullingen

LipopolysaccharidesvonEscherichiacoli(LPS) Sigma,München

peqGOLDTriFast™ PEQLABBiotechnologieGmbH,

Erlangen

Temozolomid Sigma,München

TNFα R&DSystems

3.1.2. Verbrauchsmaterial

Für die Zellkultur wurden Verbrauchsmaterialien von TPP (FaustLaborbedarf,

Schaffhausen)sowieCellstar(GreinerBio‐OneGmbH,Frickenhausen)verwendet.Weitere


Lieferanten von Verbrauchsmaterial waren BD Bioscience (Heidelberg), VWR

International (Darmstadt), ebioscience (Frankfurt), Qiagen (Hilden) und Eppendorf

(Hamburg).

3.1.3. Geräte

Cell‐Observer Zeiss,Jena

ELISAReader AnthosLabtecInstrumentsGmbH,

Wals‐Siezenheim

FACSCalibur BDBioscience,Heidelberg

FACSCanto™II BDBioscience,Heidelberg

Fluoreszenz‐MikroskopHSBZ‐9000 KeyenceGmbH,Neu‐Isenburg

Gefrierschrank‐80°C ThermoScientific,Schwerte

KryostatCM3050S Leica,Wetzler

NanoDropND‐1000 PeqlabBiotechnologieGmbH,

Erlangen

Neubauer‐Zählkammerimproved KarlHechtGmbH&CoKG,Sondheim

pHMessgerät WTWGmbH,Weilheim

Thermoblock OehmenGmbH,Essen

TissueLyserII QIAGEN,Hilden

Untertisch‐Zentrifuge HeraeusInstrumentsGmbH&Co.KG,

Düsseldorf

Micro220R‐Zentrifuge AndreasHettichGmbH,Tuttlingen

3.1.4. Kits

AnnexinVApoptosisDetectionKitII BDPharmigenTM,Heidelberg

BrdUFlowKit BDPharmigenTM,Heidelberg

(anti)Ly6GMicroBeadKit MiltenyiBioTech,Bergisch‐Gladbach

MouseGM‐CSFELISASetBDOptEIA™ BDBioscience,Heidelberg

MPOELISAKit HycultBiotech,Beutelsbach

QuantikineMouseM‐CSFELISAKit R&DSystems,Inc.,Minneapolis, MN,

USA

QuantiTectReverseTranscriptionKit QIAGENGmbH,Hilden


SYBR®Green AppliedBiosystems,Darmstadt

3.1.5. Software

7500Softwarev2.0.1 AppliedBiosystems,Darmstadt

AxioVisionRel.4.7 CarlZeissMicroImagingGmbH,Jena

FacsDivav&6.2.1 BDBioscience

FlowJo7.6.1 TreeStarInc.,Ashland(OR,USA)

GraphPadPrism5 GraphPadSoftware,LaJolla

(CA,USA)

MicrosoftOffice2007 MicrosoftCorporation,Redmont

(WA,USA)

PhotoshopCS3 AdobeSystems,München

3.1.6. LösungenundPuffer

Medien wurde teilweise Antibiotika aus einer Kombinationslösung bestehend aus

Penicillin, Streptomycin und L‐Glutamin (PSG; Sigma‐Aldrich, München) zugesetzt. Das

zum Ansetzen von Lösungen verwendete Wasser wurde doppelt destilliert von der

Universitätsapotheke der HHU bezogen oder über eine Millipore‐Anlage (Millipore,

Darmstadt)eigensdoppeltdestilliertundfolgendalsddH2Obezeichnet.

Zellkulturmedien

BMMΦ VLE‐DMEM 10%(v/v)FCS 50mMβ‐Mercaptoethanol

GM‐CSF VLE‐DMEM 5%(v/v)FCS 50mMβ‐Mercaptoethanol

M‐CSF VLE‐DMEM 10%(v/v)FCS


Lösungen

FACS‐Puffer PBS‐ 2%(v/v)FCS 0,1%(v/v)NaN3

2mMEDTA

MACS‐Puffer 0,5%(v/v)FCS 2mMEDTA PBS‐

EDTA‐Lösung 0,5MEDTA pH8,0

Erythrozyten‐Lyse‐Puffer 0,5MNH4Cl2 10mMKHCO3 0,1mMEDTA pH7,42

Einfriermedium 20%(v/v)DMSO 80%(v/v)FCS

Sodiumazid(100x) 10%(v/v)NaN3

3.1.7. Primer

IndieserArbeitwurdenfolgendeQuantiTectPrimerAssay(QIAGEN,Hilden)verwendet.

Mm_Rn18s_2 18SRNA

Mm_Faim3_1 FAIM3/Toso

3.1.8. Antikörper

In dieser Arbeit wurden direkt fluoreszenzgekoppelte Antikörper von BD Pharmigen

(Heidelberg) sowieeBioscience (Frankfurt)bezogenundnachAnleitungdesHerstellers

verwendet. Die Detektion von Toso erfolgte mit Toso‐spezifischen IgG anti‐Maus

Antikörper,welcherimLaborvonFrauKyeong‐HeeLeehergestelltwurde(Nguyenetal.,

2011).DiegenutztenFluorochromewarenFITC,PE,PerCP,APC,undPeCy7.


3.1.9. Listeriamonocytogenes

Listeriamonocytogenes (Stamm43251;ATTC,Wesel)BakterienwurdenvonProf.Klaus

Pfeffer (Institut fürMedizinischeMikrobiologie und Krankenhaushygiene der Heinrich‐

Heine‐UniversitätDüsseldorf)zurVerfügunggestelltundwurdenmitbrainheartinfusion

Medium(BHI‐Medium)kultiviert.

3.1.10. Zellen

In der hier vorgestellten Arbeit fanden die murine Fibroblasten‐Zelllinie L‐929 zur

Generierung von M‐CSF und die Myelom‐Zelllinie X63 zur Herstellung von GM‐CSF

Verwendung.

3.1.11. Versuchstiere

Die verwendeten Versuchstiere (Musmusculus) wurden in der zentralen

TierversuchsanlagederHeinrich‐Heine‐UniversitätDüsseldorfundderUniversitätsklinik

Essen gehalten. Die Mäuse wurden in Kunststoffkäfigen entsprechend den deutschen

Gesetzen fürdenTierschutzgehalten.DieVersuchstierewurdenmitStandardfutterund

Wasser adlibitum ernährt und in einem regelmäßigen zwölf Stunden Tag/Nacht‐

Rhythmus gehalten. Die Tierhaltung erfolgte zum Teil unter spezifisch pathogenfreien

Bedingungen (SPF). Alle in dieser Arbeit verwendeten Deletionsmutanten wurden

mindestens für zehn Generationen auf C57BL/6J‐Hintergrund zurückgekreuzt.

Experimentelle Versuche wurden ausschließlich mit Gewicht‐ und Alters‐angepassten

zwischenachtundzwanzigWochenaltenMäusendurchgeführt.

CD11b‐/‐ C57BL/6J.129S4‐Itgamtm1Myd/J

JH‐/‐ C57BL/6J.129Sv‐JHtm

Toso‐/‐ C57BL/6J‐tosotm

Toso‐/‐xCD11b‐/‐ C57BL/6.129S4‐tosotmItgamtm1Myd

sIgM‐/‐ C57BL/6.129Sv‐sIgMtm


3.1.12. Statistik

DieDatenwurdenalsMittelwerteunddieStandardabweichungalsSEMangegeben.Zur

statistischenAnalysewurdezumVergleichzweierGruppenderungepaarteStudent´sttest

verwendet. Statistische Signifikanzen der Messergebnisse über mehrere Zeitpunkte

wurden über 2‐Wege ANOVA berechnet. Für die statistische Analyse bei

ÜberlebenszeitexperimentenwurdederMantel‐Cox(Log‐Rank)Testverwendet.

3.2. Methoden

3.2.1. ExperimentelleArbeiteninvivo

3.2.1.1. InfektionenmitListeriamonocytogenes

Die Verabreichung von Listeriamonocytogenes (Listerien) wurde intravenös in die

Schwanzvene der Tiere unter einer Sterilbank durchgeführt. In der Regel wurde eine

sublethale Konzentration von 104CFU Listerien in einer Infektionsröhre mit einer 24G

Edelstahlkanüle (Terumo Neolus®, Neuwied) appliziert. Die Listerien wurden

entsprechendinPBSverdünntundineinemVolumenvon200µlverabreicht.

3.2.1.2. DepletionvonGranulozyten

DieGranulozytenwurdeneinenTagvorderInfektionmitListeriendurchdieintravenöse

Verabreichung von 200µg des anti‐Gr1 Antikörpers NimpR14 (BD Bioscience,

Heidelberg) depletiert. Die chemische Eliminierung der Leukozyten erfolgte

intraperitoneal mit Cyclophosphamid (200mg/kg Körpergewicht) und Temozolomid

(90mg/kgKörpergewicht)dreiTagevorderInfektionmitListerien.


3.2.1.3. VoraktivierungderGranulozyteninvivo

C57BL/6 Mäuse wurden mit 104CFU Listerien infiziert. Jeweils eine Gruppe blieb

unbehandeltundbekamPBS.EinerweiterenGruppewurden120ngGM‐CSFbzw.120ng

GM‐CSFund100ngfMLPanTagen1,2und3p.i.verabreicht.

3.2.1.4. ApplikationvonBrdU

BrdU wurde in einer Konzentration von 10mg/ml in PBS angesetzt und über einen

Zeitraum von zwei Tagen alle 12 Stunden jeder Maus intraperitoneal 200µl (2mg)

appliziert.DieDetektionvonBrdU inGranulozytenausdemBluterfolgtenachAngaben

desHerstellers.

3.2.1.5. AdoptivtransfervonGranulozyten

Für den adoptiven Transfer von Granulozyten wurden 8x106 aufgereinigte Zellen

intravenösinPBS‐verabreicht.HierfürwurdedasKnochenmarkausFemurundTibiader

Hinterbeine von C57BL/6 oder Toso‐/‐ Mäusen steril isoliert. Die Granulozytenwurden

anschließend durch dieMagnet assoziierte Aufreinigung (MACS)mit dem Ly6G‐Kit von

MiltenyiBiotecangereichertundnurZellfraktionenmiteinerReinheitvon>95%weiter

verwendet.

3.2.1.6. Blutentnahme

Den Versuchstieren wurde venöses Blut aus dem retrobulbären Venenplexus unter

NarkosemitIsofluran(DeltaSelect,Pfullingen)entnommen.Biszu200µlVollblutwurden

je nach Verwendungszweck in unbeschichte Röhrchen für Serum oder in

heparinbeschichte Röhrchen für Plasma gegeben. Das heparinisierte Blut wurde

vorwiegend direkt für dieDurchflusszytometrie verwendet,währenddas Serum für die

Bestimmung von Antikörpern verwendet wurde. Die Abtrennung des Serums und vom

geronnenenBluterfolgtedurch30minütigeInkubationdesentnommenenBlutesaufEis


und anschließender 10minütiger Zentrifugation bei 6000rpm. Das Serum sowie das

PlasmawurdenbiszurweiterenVerwendungbei‐20°Cgelagert.

3.2.1.7. Organentnahme

Die Entnahme von Organen erfolgte nach zervikaler Dislokation der Versuchstiere. Das

FellderTierewurdedesinfiziertunddasPeritoneumgeöffnet.DieOrganewurdenfürdie

TiterbestimmungderListerien, Immunhistologie,Untersuchungvon Immunzellen sowie

fürdieRNA‐Isolationentnommen.ZurBestimmungbakteriellerTiterimGewebewurden

die entnommenen Organe in 2ml Eppendorfgefäßen (Eppendorf GmbH, Hamburg) mit

1ml PBS und einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) überführt und 10min bei 30rps im

TissueLyser (QIAGEN, Hilden) homogenisiert. Für immunhistologische Untersuchungen

wurdenOrganstückenachderEntnahmeinHistoröhrchenmitO.C.T.Kryoeinbettmedium

(TissueTek;Weckert,Kitzingen)überschichtetundimflüssigenStickstoffschockgefroren.

BeiderUntersuchungvonZellenwurdendieOrganeimMediumaufEisbiszumGebrauch

verwahrt.FürdieRNA‐IsolationwurdenkleineOrganstückein1,5mlEppendorfgefäßen

inflüssigemStickstoffschockgefroren.

3.2.1.8. Knochenmarkchimären

C57BL/6 Mäuse wurden mit 1050rad in einer Kobalt‐Anlage in der Radiologie der

Universitätsklinik Düsseldorf bestrahlt. Am Folgetag wurden die Tiere mit einem 1:1

Gemisch (107Zellen) Knochenmarkszellen isoliert aus C57BL/6xCD45.1 sowie

Toso‐/‐xCD45.2 intravenös rekonstituiert. Die Adaptionszeit nach der Rekonstitution

betrugmindestens30Tage.

3.2.2. ArbeitenmitListerien

3.2.2.1. KultivierungvonListerien

Zur Animpfung einer Listerien‐Flüssigkultur wurden 10‐20µl Stockkultur ca. 12h bei

37°Cund200rpmin3mlautoklaviertenBHI‐MediumsimSchüttelinkubatorkultiviert,so


dasseineOD600von0,7bis1,3erreichtwurde.EineODvon1,0entspricht109Listerien

proml.

3.2.2.2. CFSE‐Listerien

109CFUListerienwurdenin10mlPBSmit50µMCarboxyfluoresceinsuccinimidylester

(CFSE)10minbei37°C inkubiert.NachzehnminütigerZentrifugationbei4000rpmund

4°C wurden die CFSE‐Listerien zunächst zweimal mit 10%FCS/PBS gewaschen und

anschließendzweimalmitDMEMgewaschen.

3.2.2.3. BestimmungbakteriellerTiterindenOrganen

Die Milz, Leber und in einigen Fällen das Gehirn wurden entnommen und in einem

Eppendorfgefäß mit 1ml PBS und einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) im TissueLyser

(QIAGEN,Hilden)für10minbei30rpshomogenisiert.AnschließendwurdendieOrgane

aufEisverwahrtundamselbenTagdieTiterbestimmungdurchgeführt.Dazuwurdenin

96‐Well Platten 135µl PBS vorgelegt und 65µl des homogenisiertenOrgans horizontal

titriert. Anschließend wurden 25µl aus jedem zweiten Well (jeweils annähernd 1:10

VerdünnungderAnfangskonzentration)aufeine24‐WellPlattemitBHI‐Agarüberführt.

DiePlattewurdeüberNachtbei37°C inkubiertundanschließenddieCFUderListerien

ausgezählt.

3.2.3. ExvivoArbeitenmitGranulozyten

3.2.3.1. GranulozytenPrimingundAktivierung

10µl peripheren Blutes entsprechender Untersuchungstiere wurden mitmTNFα (R&D

Systems, Wiesbaden), LPS (Sigma Aldrich, München) oder GM‐CSF (Kapitel3.2.9.2) für

30min bei 37°C in einem Gesamtansatz von 100µl Antikörperlösung inkubiert.

Anschließend wurden die Granulozyten für 15min mit 2µl fMLP (Sigma Aldrich,

München) aktiviert. Im Gesamtansatz befanden sich die fluoreszenzgekoppelten

Antikörper anti‐Gr1 und anti‐CD11b und zur Detektion von ROS Dihydrorhodamin


(50µg/ml;Alexis,Lörrach).AnschließendwurdedasBlutmitFACS‐Lysing‐Solution (BD

Bioscience, Heidelberg) lysiert. Für Primingstudien wurde der Ansatz bereits nach der

Inkubation mit TNFα, LPS oder GM‐CSF lysiert. Für die Detektion von ROS nach der

AktivierungmitfMLPwurdedasBlutdirektfür30minmitverschiedenenKonzentration

des Reagenz bei 37°C inkubiert. Bei der Detektion von ROS in Verbindung mit CFSE

gelabelten Listerien wurde ersatzweise Dihydroethidium (DHE; Invitrogen, Darmstadt)

anstattDihydrorhodamin(DHR)verwendet.

3.2.3.2. DetektionvonROSinvivo

C57BL/6 und Toso‐/‐Mäuse wurden mit 104CFU Listerien infiziert und an den

angegebenen Tagen Blut oder die Organe entnommen. Die ROS‐Synthesewurde in der

DurchflusszytometrieunterderVerwendungvonDihydrorhodamin(DHR)detektiertund

entwederderprozentualeAnteilderROSproduzierendenGranulozytenbezogenaufdie

Gesamtpopulation der Granulozyten oder die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von

DHRangegeben.BeiderDetektionvonROSimBlutwurdevorderDurchflusszytometrie

eineErythrozyten‐LysemitderFACS‐LysingSolutiondurchgeführt.

3.2.3.3. EinflussvonIgMaufROS

Peripheres Blut wurde zur Entfernung von löslichem IgM über eine fünfminütige

Zentrifugation bei 300g und 4°C dreimalmitMedium gewaschen. Anschließendwurde

das gewaschene Blut in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an aufgereinigtem

murinenIgMκ(BDBioscience,Heidelberg)und160ng/mlGM‐CSFfüreinehalbeStunde

undfürweitere15minmit2µMfMLPbei37°Cinkubiert.DerVersuchsansatzbestehend

ausDMEM‐Mediumversetztmitanti‐Gr1,anti‐CD11bundDHR,demBlutsowiedemfMLP

umfassteeinGesamtvolumenvon100µl.ImAnschlussandieInkubationwurdedasBlut

mitFACS‐LysingSolution(BDBioscience,Heidelberg)lysiertunddieROSproduzierenden

GranulozyteninderDurchflusszytometriedetektiert.


3.2.3.4. PhagozytosevonListerien

DasperiphereBlut(10µl)wurdefüreineStundemit106CFUCSFE‐Listerienbei37°Cin

einem Gesamtansatz von 100µl DMEM‐Medium versetzt und mit Fluoreszenz

gekoppeltem anti‐Gr1 Antikörper inkubiert. Anschließendwurde der Ansatzmit FACS‐

Lysing Solution (BD Bioscience, Heidelberg) lysiert und die CFSE‐Listerien positiven

GranulozyteninderDurchflusszytometriequantifiziert.FürdiehistologischeBetrachtung

der Phagozytose wurden 106CFU CFSE‐Listerien mit 30µl Blut für zwei Stunden in

Gegenwart von Penicilin und Streptamycin bei 37°C inkubiert. Im Inkubationsansatz

befanden sich dieAntikörper anti‐Gr1 und anti‐CD11b.Nach der Inkubationwurde das

Blutfixiert,aufObjektträgerzentrifugiertundanschließendkonfokalmikroskopiert.

3.2.3.5. IgMabhängigePhagozytose

C57BL/6undsIgM‐/‐Mäusewurdenmit104CFUListerien infiziertunddreiTagespäter

dasBlutzurGewinnungvonSerumentnommen.106CFUCFSE‐Listerienwurdenfüreine

Stundemit10µlSerumproAnsatzübereinenZeitraumvon60minbei4°Cvorinkubiert.

AnschließendwurdendieBakterienfüreineStundemitgewaschenemBlutvonC57BL/6

undToso‐/‐Mäusenbei 37°C inkubiert.DerAnsatzwurdemitFACS‐LysingSolution (BD

Bioscience, Heidelberg) lysiert und die CFSE‐Listerien positiven Granulozyten in der

Durchflusszytometriequantifiziert

3.2.3.6. OberflächenexpressionvonToso

Das Knochenmark entsprechender Versuchstiere wurde isoliert und

106Knochenmarkszellenbei37°C füreinehalbeStundemit108CFUListerien inkubiert.

AnschließendwurdendieZellenzweimal10minbei1200gund4°CmitDMEM‐Medium

gewaschen und für weitere 30min einem FC‐Block mit murinem anti‐CD16/CD32 (BD

Bioscience, Heidelberg) unterzogen. Nach erneutem Waschschritt wurden die Zellen

30minmiteinemToso‐spezifischenIgGanti‐MausAntikörper,welcherimLaborvonFrau

Kyeong‐HeeLeehergestelltwurde,undmitanti‐Gr1oderanti‐CD19Antikörperngefärbt.

AnschließendwurdederAnsatzzweifachwieobenbeschriebengewaschen,dieZellenfür

zehn Minuten mit 2µl 7AAD je Ansatz inkubiert und die Analyse in der


Durchflusszytometrie durchgeführt. Unter Ausschluss toter Zellen (7AAD+) wurde die

ExpressionvonTosoalsmittlereFluoreszenzintensitätquantifiziert.

3.2.3.7. IntegrinExpressionimnaivenBlut

FürdieDetektionderExpressionvonCD11a,CD11bundCD18aufGranulozytenwurden

10µlfrischentnommenenBlutesdirektmit2%Formalin/PBS10minfixiert.Diefixierten

Zellen wurden 30min mit anti‐Gr1 und anti‐Cd11a (BD Biosciences, Heidelberg), anti‐

CD11b, oder anti‐CD18 (eBiosciences, Heidelberg) Antikörpern bei 4°C inkubiert und

anschließend das Blut lysiert. Die Expression der Oberflächenantigene wurde in der

DurchflusszytometrieanalysiertundalsmittlereFluoreszenzintensitätquantifiziert.

3.2.3.8. Hitzeschock

10µl des peripheren Blutes von C57BL/6 undToso‐/‐ Mäusenwurden in 100µl DMEM

versetztmit2%FCSsowieanti‐Gr1undanti‐CD11b30minbei4°C,15°C,24°C,37°Cund

42°C inkubiert. Das Blut wurde anschließend mit der FACS‐Lysing Solution (BD

Bioscience, Heidelberg) lysiert und die Degranulation der Granulozyten in der

DurchflusszytometrieüberdieVerringerungderGranularitätimSeitwärtsstreulicht(SSC)

bestimmt.

3.2.3.9. ApoptosevonGranulozyten

20µlHeparinbehandeltenVollbluteswurdenmit40ng/mlGM‐CSFübereinenZeitraum

von sieben Stunden bei 37°C inkubiert oder blieben unbehandelt. Die Detektion

apoptotischerVorgängewurdeunterderVerwendungvonAnnexinVApoptosisDetection

Kit II (BD Pharmingen, Heidelberg) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt.

Apoptotische Zellen wurden in der Durchflusszytometrie als 7AAD+/‐ und AnnexinV+

definiert.


3.2.4. ZellkulturprimärerMakrophagen

C57BL/6sowieToso‐/‐MakrophagenwurdenausdemKnochenmarkderTiereunterder

Verwendung von M‐CSF generiert und am zehnten Tag nach Differenzierungsbeginn

verwendet.FürimmunhistologischeUntersuchungenwurden105lebenderMakrophagen

(Trypanblau) zwölf Stunden vor dem Beginn des Experiments auf Cover‐Slips ausgesät

undbei37°Cadhärierenlassen.AnschließendwurdedasKulturmediumgewechseltund

dieMakrophagenfürzweiStundenmitCFSEgelabeltenListerieninkubiert.ImAnschluss

wurden die Zellenmit 2% Formalin/PBS fixiert und für die konfokaleMikroskopiemit

anti‐F4/80fluoreszenzgekoppeltenAntikörpergefärbt.

Zur Ermittlung der Pathogen‐Eliminierungskapazität von Makrophagen wurden 105

lebenderZellenfürzwölfStundenunterZusatzvon10ng/mlTNFαsowie200UnitsIFNγ

in einer 24‐Well Platte ausgesät. Anschließendwurden dieMakrophagen zwei Stunden

mit 105 CFU Listerien (MOI1,0) bei 37°C inkubiert und im Anschluss die Wells zur

EntfernungverbliebenernichtphagozytierterBakterienviermalmitMediumgewaschen.

Zur Bestimmung der noch infektiösen, nicht eliminierten Bakterientiter wurden die

Makrophagen zwei Minuten mit einer 50% Saponin/PBS‐Lösung inkubiert, was eine

Permeabilisierung der Makrophagenzellmembran zufolge hatte. Anschließend konnten

diebakteriellenTiterbestimmtwerden.

3.2.5. UntersuchungvonRNA

DieRNAausGewebenwurdemitTriFast®Trizol (PeqLab,Erlangen)nachAngabendes

Herstellersisoliert.FürdieIsolationwurdeninderRegelOrganstückemiteinemGewicht

von 50‐100mg verwendet, welche mit einer Metallkugel (QIAGEN, Hilden) 5min bei

30rps im Trizol mittels TissueLyser (QIAGEN, Hilden) homogenisiert wurden. Zur

Qualitätskontrolle der isolierten RNA wurden 500ng Gesamt‐RNA elektrophoretisch

aufgetrennt. Anschließend wurde 1µg Gesamt‐RNA unter der Verwendung des

QuantiTectReverseTranscriptionKits(QIAGEN,Hilden)nachHerstellerangabenincDNA

umgeschrieben. Die relative Genexpression wurde in der quantitativen realtimePCR

unterderVerwendungvonSYBR®Green (AppliedBiosystems,Darmstadt)nachAngaben

desHerstellers quantifiziert. Hierfürwurden jeMessansatz 50ng cDNA verwendet. Die

relative Transkriptmengewurde nach 40Zyklen auf die 18S rRNA abgeglichen und als


2‐ΔCtangegeben.EinTranskript,welchesnach40Zyklennichtamplifizierbarwar,galtals

nichtdetektierbar(ND).

3.2.6. ELISA

ZytokinkonzentrationenvonGM‐CSFundM‐CSFausdenZellüberständen(KAP)wurden

mittels ELISA nach Angaben der entsprechenden Hersteller bestimmt. MPO wurde im

PlasmanachAngabendesHerstellersquantifiziert.

3.2.7. Durchflusszytometrie

Die durchflusszytometrische Untersuchung von Leukozyten heparinisierten Vollblutes

sowie Zellen isoliert aus Organen erfolgte am FACSCanto IITM oder FACSCalibur (BD

Biociences, Heidelberg). Es wurdenmaximal 2x106Zellen einer Einzelzellsuspension in

einem FACS‐Röhrchen (BD Biosciences, Heidelberg) mit 50µl Antikörperlösung,

bestehendausFACS‐PufferoderMediumundfluoreszenzgekoppeltenAntikörpern30min

bei 4°C oder 37°C im Dunkeln inkubiert. Zur Bestimmung von absoluten Zellzahlen

wurden der Antikörperlösung bei Bedarf Kallibrierungsbeads (BC CalibriteTMBeads; BD

Bioscience, Heidelberg) zugesetzt. Die Antikörper wurden nach Herstellerangaben

verwendet.AnschließendandieInkubationwurdedasBlutmitFACS‐Lysing‐Solution(BD

Bioscience) nachHerstellerangaben lysiert, durch fünfminütige Zentrifuagtionbei 300g

und4°CgewaschenundanschließendinderDurchflusszytometrieanalysiert.ToteZellen

wurdenmitDAPIgefärbt(Invitrogen,Darmstadt).

3.2.8. Immunhistochemie

Am Kryostat wurden aus den entsprechend vorbereiteten Organen (KAP) 8mm dicke

OrganschnitteaufObjektträgernangefertigt.NacheinereinstündigenTrocknungszeitbei

RTwurden die Schnitte für 10min in Aceton fixiert und nach kurzer Abdampfungszeit

unspezifische Bindungsstellen durch zehnminütige Inkubation in einer Blocklösung

(10%FCS/PBS) abgesättigt. In einer Färbekammer wurden die Kryoschnitte mit

fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gelöst und im Gesamtvolumen von 100µl

Blocklösung 30min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit


BlocklösunggewaschenundmitEindeckmedium(FluorescenceMountingMedium;Dako,

Hamburg)luftblassenfreieingedeckelt.

3.2.9. Zellkultur

3.2.9.1. ErntenvonZellen

ZumAberntenadhärenterZellenwurdedasKulturmediumverworfenundderZellrasen

zweifach mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 0,1V des Kultivierungsmediums

Trypsin/EDTA‐Lösung (Biochrom, Berlin) in die Flasche gegeben und nach einer

Inkubationszeit von 3 bis 5min bei 37°C die Zellen mit entsprechendem FCS haltigem

Medium abgestoppt. Das Abklopfen der Kulturflasche löste die Zellen ab, die dann bei

300g und 4°C 10min zentrifugiert und im frischen Medium resuspendiert werden

konnten.

3.2.9.2. GenerierungvonGM‐CSFundM‐CSF

Zur Herstellung von GM‐CSF wurde eine transgene Zelllinie (X63‐GMCSF,

Dr.Karasuyama, 1988; Basel) nach beschriebenen Protokollen verwendet (Karasuyama

andMelchers, 1988; Stockinger andHausmann, 1994; Stockinger et al., 1996; Zal et al.,

1994). Die Kultivierung erfolgte im VLE‐DMEM mit 50µM ß‐Mercaptoethanol und

5%FCS. Nach einer zweitägigen Expansion der frisch aufgetauten Zellen wurden diese

geerntet und 8x105 Zellen pro 175cm2 Zellkulturflasche in 40ml Medium über einen

Zeitraum von sieben Tagen inkubiert. Anschließend erfolgte die

KonzentrationsbestimmungüberELISA(Kapitel3.2.6).

M‐CSFwurdeausdemÜberstandvonL929Zellen,welcheinVLE‐DMEMversetztmit5%

FCSund50µMß‐Mercaptoethanol ineiner175cm2Zellkulturflaschekultiviertwurden,

gewonnen.Hierfürwurden8x105Zellenauf175cm2Zellkulturflascheverteiltundbiszur

Konfluenzinkubiert.Nachweiteren24bis48StundenwurdederÜberstandabgenommen

unddieZytokinkonzentrationübereinenELISAbestimmt(Kapitel3.2.6).

DerÜberstandbeiderZelllinienwurdenachderAbnahme20minbei4000rpmund4°C

zentrifugiertundanschließendmiteinem0,45µmFilter(VWR,Darmstadt)sterilfiltriert.


3.2.9.3. GenerierungvonMakrophagenausKnochenmark(MΦ)

Die Generierung von Makrophagen erfolgte unter dem Einfluss des Wachstumsfaktors

M‐CSF bei dem sich aus myeloiden Stammzellen im Knochenmark Makrophagen

entwickeln (Weischenfeldt and Porse, 2008). Das Differenzierungsmedium wurde mit

0,4ng/ml M‐CSF versetzt. Die Isolation und Kultivierung wurde nach bereits

beschriebenen Protokollen durchgeführt (Ehlting et al., 2011;Weischenfeldt and Porse,

2008). An Tag acht bis zehn nach Differenzierungsbeginn konnten die generierten

Makrophagenexperimentellverwendetwerden.

3.2.9.4. AufreinigungvonGranulozytenmittelsMACS®Sort

DieAufreinigungvonGranulozytenerfolgtealspositiveSelektion(MACS®CellSeparation

anti‐Ly6GMicroBeadsKit;Miltenyi,Bergisch‐Gladbach)unterderNutzungdermagnetic

assossiated cell sort (MACS®) Methode. Das Knochenmark aus Femur und Tibia wurde

isoliert und durch ein 70µm Zellsieb vereinzelt. Die Einzelzellsuspension wurde nach

Angaben des Herstellers mit den Antikörpern inkubiert. Die Trennung erfolgte mittels

LS‐Magnetsäulen (Miltenyi, Bergisch‐Gladbach) und die Reinheit wurde in der

Durchflusszytometrie überprüft. Nur Zellfraktionen mit einer Reinheit von >95%

Granulozytenwurdenweiterverwendet.

ERGEBNISSE 33

4. ERGEBNISSE

Granulozyten sind die Hauptzellpopulation des peripheren Leukozytenpools und als

Bestandteildesangeborenen ImmunsystemsfürdieBekämpfungbakteriellerPathogene

essentiell(Metcalf,1991;SennandJungi,1975).InnerhalbvonwenigenStundenwerden

diese durch frühinflammatorische Zytokine chemotaktisch an den Ort der Infektion

gelockt (Sabroe et al., 2005a; Sabroe et al., 2005b). Opsoniert durch das

KomplementsystemundAntikörperwerdendieBakterienvonGranulozytenüberpattern‐

recognition receptors (PRRs) erkannt und phagozytiert (Medzhitov, 2001). Die

aufgenommenen Bakterien werden im Phagosom eingeschlossen und zur endgültigen

Inaktivierung in einem Vorgang der als respiratory burst bezeichnet wird, eliminiert.

DieserVorgangsetztdieintrazelluläreSynthesevonreaktivenSauerstoffspezies(reactive

oxygenspecies;ROS)undhypochlorigerSäure(HOCL)voraus.

In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung von Listeriamonocytogenes der

Einfluss von fas apoptotic inhibitory molecule 3 (Faim3/Toso) auf die Granulozyten

untersucht.DiesesTransmembranproteinwurdealsanti‐apoptotischwirkendesMolekül

auf aktivierten T‐Zellen entdeckt (Hitoshi et al., 1998) und reduziert zusätzlich den

Schwellenwert für die TNFα induzierte Apoptose (Nguyen et al., 2012; Nguyen et al.,

2011). Kürzlich veröffentlichte Arbeiten beschreiben Toso als einen Rezeptor für IgM

(Kubagawa et al., 2009; Shima et al., 2010) sowie die Internalisierung der Toso/IgM

Komplexe(Vireetal.,2011).ImFokusderBetrachtungstandendiePhagozytoseunddie

InduktionvonROSinGranulozyten.

ERGEBNISSE 34

4.1. CharakterisierungderToso‐/‐Maus

Die Toso‐/‐ Maus wurde im Labor von Prof. TakMak (Toronto, Kanada) generiert und

mehralsneunGenerationenaufC57BL/6Hintergrundzurückgekreuzt.DieDeletionvon

TosowurdesowohlaufDNAalsauchaufRNAEbeneverifiziert(Abbildung4.1.).

Milz0

0.0005

0.0010

NDFAIM3/TosomRNAExpression

C

Leber0

5.010 ‐ 0 8

1.010 ‐ 0 7

1.510 ‐ 0 7

2.010 ‐ 0 7C57BL/6

Toso‐/‐

ND

D

FAIM3/TosomRNAExpression

Abbildung4.1. Deletionsnachweis vonToso inderToso‐/‐Maus A) Genomische DNAwurde aus demGewebe der Toso‐/‐ (‐/‐), Heterozygoten (+/‐) sowie Kontroll C57BL/6 (+/+) Mäusen isoliert und dieDeletionvonTosodurchPCRbestätigt.DieGrößedesPCR‐ProduktsderToso‐/‐beträgt400bpundderC57BL/6Kontrolle450bp.ZurKontrollederPCRwurdeH2Oeingesetzt.B‐D)AusderMilzundderLebervon C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen wurde die Gesamt‐RNA isoliert. B) Das quantitative real time PCR(qRT‐PCR)ProduktvonTosound18SwurdeaufeinAgarosegelaufgetragen.IndenerstenbeidenSpurenistdasqRT‐PCRProduktvonTosound18SderMilzundinSpurdreiundvierderLeberdargestellt.C+D)DieGenexpressionvonTosowurdeinderqRT‐PCRgemessenundalsrelativeExpression(2‐dCt)normiertauf18SRNAalsReferenzgenangegeben(n=4).

InderDurchflusszytometriewurdedasperiphereBlutvonToso‐/‐ MäusenmitdemBlut

der C57BL/6 Mäuse hinsichtlich der Immunzellen verglichen. Während die Anzahl der

GranulozytenkeinesignifikantenUnterschiedezeigte,konnte inTosodefizientenTieren

eine starke Reduktion an Lymphozyten detektiert werden (Abbildung 4.2.A). Die

VerringerungderLymphozytenberuhteimWesentlichenaufeinerüber50%niedrigeren

FrequenzanB‐Zellen,wohingegendieT‐Zellennichtbetroffenwaren(Abbildung4.2.B).

ERGEBNISSE 35

0

2000

4000

6000C57BL/6

Toso‐/‐

LymphozytenGranulozyten

A

AnzahlderZellenim

Blut(proµl) p=0,0001

B‐Zellen CD4+ CD8+0

1000

2000

3000

4000

5000 C57BL/6

Toso‐/‐

B

AnzahlderZellenim

Blut(proµl) p=0,0001

Abbildung4.2. ZusammensetzungdesBlutesvonnaivenToso‐/‐Mäusen.DieLeukozytenvonC57BL/6(schwarze Balken) sowie Toso-/- -Mäusen (weiße Balken) wurden in der Durchflusszytometriequantifiziert. A) Lymphozyten wurden als Gesamtzahl von CD3+ und CD19+ Zellen errechnet.Granulozyten sind als Gr1hi CD11bhi definiert (n=6). B) Die Zusammensetzung der Anzahl derLymphozyten in B‐Zellen (CD19) sowie in T‐Lymphozyten, welche aus T‐Helferzellen (CD4+) und T‐Killerzellen(CD8+)bestehen(n=6)wurdequantifiziert.

4.2. ErhöhteSuszeptibilitätbeiDefizienzvonTosowährendder

InfektionmitListeriamonocytogenes

Innerhalb der ersten Tagen einer systemischen Infektion mit dem gram‐positiven

Bakterium Listeria monocytogenes (Listerien) spielt vor allem das angeborene

Immunsystem einewichtige Rolle bei der Eindämmung des Bakteriumwachstums. Dem

adaptiven Immunsystem kommt erst im späteren Verlauf der Infektion bei der

endgültigenEliminationderBakterieneineBedeutungzu(Navarinietal.,2006;Unanue,

1997).Der Einfluss vonToso für das Immunsystemwurde durch intravenöse Infektion

mit einer sublethalen Dosis von 104CFU Listerien in Toso‐/‐ und C57BL/6 Mäusen

überprüft und das Überleben der Tiere betrachtet. Während die Kontrolltiere die

Infektionzu80%überlebten,starbendiemeistenToso‐/‐ MäuseindenerstenTagender

Infektion(Abbildung4.3.).

ERGEBNISSE 36

0 5 10 150

20

40

60

80

100C57BL/6

Toso‐/‐

p<0,0001

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Abbildung4.3. Überlebenskurve der Toso‐/‐ Mäuse bei einer sublethalen Infektion mit L.monocytogenes. C57BL/6 (n=15 schwarz ⧯) undToso‐/‐ (n=8weiß ⧮) Mäusewurdenmit 104 CFU L.monocytogenesintravenösinfiziertunddasÜberlebenunterderBerücksichtigungvonAbbruchkriterien(wieBelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet.DieInfektionderVersuchstierewurdeindreiunabhänigenVersuchsansätzendurchgeführt.

DesweiterenkonnteninderMilz,LeberundimGehirnbiszu100fachhöherebakterielle

Titer an Tag drei nach Infektion mit 104 CFU Listerien in Toso defizienten Mäusen

verglichenmitdenC57BL/6Mäusendetektiertwerden(Abbildung4.4.).

Milz

5

7

9

11

<3

p=0,004

3

A

Listerien‐Titer

(log 10CFU/Organ)

Leber

3

5

7

9

11

<3

p=0,004

B Gehirn

3

5

7

9

11

<3

C57BL/6Toso‐/‐

p=0,006

C

Abbildung4.4. BakterientiterindenOrganen.C57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐(weiß⧮)Mäusewurdenmit104CFUL.monocytogenesintravenösinfiziertundanTagdreigetötet.DieMilz,LeberunddasGehirnwurden entnommen und die Titer im Gewebe bestimmt. Jeder Datenpunkt gibt den Titer für eineindividuelleMauswieder.DiedurchgezogeneLiniezeigtdenMittelwertderGruppeunddiegestrichelteLiniedasDetektionslimit.IndreiunabhängigenAnsätzenwurdenjeweilsdreiMäuseproGruppeinfiziert(n=9).

Eine wichtige zelluläre Komponente zu Beginn der Infektion mit Bakterien sind

Granulozyten, die durch Phagozytose und anschließender Eliminierung der Bakterien

wesentlichdazubeitragendieAusbreitungdieserzuverlangsamen(RogersandUnanue,

ERGEBNISSE 37

1993). Die Bedeutung der Granulozyten als antibakterielle Barriere wird durch die

BehandlungmiteinemspezifischenDepletionsantikörper(antiGr‐1)deutlich(Czuprynski

et al., 1994). Die Depletion der Granulozyten verursachte in C57BL/6 Mäusen eine

vergleichbareSuszeptibilitätgegendie InfektionmitListerienwiebeiToso‐/‐Mäusen,so

dassbeideVersuchsgruppenwenigeTagenachderInfektionverstarben(Abbildung4.5.).

0 1 2 3 40

20

40

60

80

100C57BL/6+anti‐Gr1Toso‐/‐ +anti‐Gr1

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Abbildung4.5. ÜberlebenskurvebeiderDepletionvonGranulozytenwährendder InfektionmitL.monocytogenes. C57BL/6 (n=3, schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (n=3, weiß ⧮) Mäuse wurden zurGranulozytendepletionmit200µganti‐Gr1 (NimpR14)behandelt,umdieGranulozytenzudepletieren.AmFolgetagwurdendieTieremit104CFUL.monocytogenes intravenösinfiziert.DasÜberlebenwurdeunter der Berücksichtigung von Abbruchkriterien (wie Belastung und Gewichtsverlust der Tiere)beobachtet.

4.3. TosoExpressioninGranulozyten

IndenvergangenenJahrenkonntedieExpressionvonTosoaufaktiviertenT‐Zellensowie

eineubiquitäreExpressiondesProteinsaufB‐Zellennachgewiesenwerden(Nguyenetal.,

2011). Die Expressionsanalyse von Toso auf Granulozyten wurde in der

DurchflusszytometriemiteinemToso‐spezifischenIgGanti‐MausAntikörper,welcherim

Labor von Frau Kyeong‐Hee Lee hergestellt wurde, durchgeführt (Nguyen et al., 2011;

Vire et al., 2011). Toso defiziente Granulozyten fungierten hierbei als Negativkontrolle.

DieausdemKnochenmarkisoliertenGranulozytendesC57BL/6Ursprungsexprimierten

Toso(Abbildung4.6.A).DieB‐ZellenderMilzvonToso‐/‐undC57BL/6Mäusenwurdenzur

Verifizierung der Expressionsanalysen verwendet und wiesen erwartungsgemäß eine

ExpressionvonToso indenKontrolltierenauf,wohingegenaufTosodefizienteB‐Zellen

keineExpressiondetektiertwurde(Abbildung4.6.B).

ERGEBNISSE 38

Abbildung4.6. OberflächenexpressionvonToso. A) 106Knochenmarkszellen vonC57BL/6 (blau) undToso‐/‐ Mäusen (rot) wurden mit anti‐Gr1 (Granulozyten) zusammen mit anti‐Maus Toso Antikörperfluoreszenzgefärbt und in die Expression von Toso in der Durchflusszytometrie quantifiziert. B) 106SplenozytenvonC57BL/6(blau)sowieToso‐/‐Mäusen(rot)wurdenmitanti‐CD19(B‐Zellen)zusammenmit anti‐Maus‐Toso Antikörper fluoreszenzgefärbt und in die Expression von Toso in derDurchflusszytometriequantifiziert.ToteZellenwurdendurchVerwendungvon7AADausgeschlossen.

4.4. Toso unabhängige Regulation der Blutgranulozyten‐

population

Die Granulozyten im peripheren Blut besitzen eine Lebenszeitspanne von wenigen

Stunden ehe diese einem Vorgang unterliegen, der als spontane Apoptose bezeichnet

wird. Bei Kontakt mit Pathogenen sowie durch Wachstumsfaktoren wie GM‐CSF

verlängertsichdieLebenszeitaufbiszuzweiTage(Brachetal.,1992;Colottaetal.,1992).

Dieser Vorgang wurde in vitro durch die Verwendung von GM‐CSF imitiert. Nach

siebenstündigerInkubationohneStimulationstarbenüber50%derGranulozytensowohl

ausdenC57BL/6alsauchausdenToso‐/‐Mäusen,währenddieStimulationmitGM‐CSF

dieApoptoserateinbeidenMausstämmenimgleichenMaßreduzierte(Abbildung4.7.A).

ERGEBNISSE 39

1h 7h 7hGM‐CSF0

10

20

30

40

50

60

70C57BL/6

Toso ‐/‐

A

ApoptotischeZellen

(in%vonallenGranulozyten)

0

10

20

30 C57BL/6

Toso‐/‐

XX

BrdU+ Granulozyten

(%vonallenGranulozyten)

B

Abbildung4.7. Apoptose und Neubildung von Granulozyten. A) Das Blut von C57BL/6 (schwarzerBalken) und Toso (weißer Balken) Mäusen wurde bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wurde für eineStunde(spontaneApoptose)sowiefürsiebenStundenmitoderohneGM‐CSF(40ng/ml)durchgeführt.Anschließend wurde die Apoptose mittels AnnexinV / 7AAD Färbung in der Durchflusszytometrieanalysiert (n=4).B)C57BL/6(schwarzerBalken)undToso(weißerBalken)MäusenwurdeübereinenZeitraum von zwei Tagen alle 12 Stunden 2 mg BrdU gelöst in PBS intraperitoneal appliziert. DieFrequenz der BrdU+ Granulozyten wurde am dritten Tag nach der Behandlung im Blut in derDurchflusszytometrie quantifiziert. Eswurden je Genotyp insgesamt fünfMäuse in zwei unabhängigenVersuchsansätzenverwendet(n=10).

Die Granulozytenmenge wird durch Neubildung sowie der Migration der Granulozyten

aus dem Knochenmark ins Blut erhalten und wurde in der Durchflusszytometrie

untersucht. Hierzu wurde ein BrdU‐Assay verwendet, welcher über den Einbau der

Substanz in neusynthetisierte DNA die Zellteilung visualisiert. BrdU wurde über einen

zweitätigen Zeitraum alle 12 Stunden intraperitoneal appliziert und die Frequenz der

neugebildetenundinsBlutemigriertenGranulozyteninC57BL/6undToso‐/‐Mäusenam

drittenTagmiteinander verglichen. AmEnde derBehandlung konnten annähernd 20%

neugebildete Granulozyten in beiden Versuchsgruppen detektiert werden (Abbildung

4.7.B).

Die Regulation der Granulozytenmenge durch Apoptose und Neubildung zeigte keine

UnterschiedeindenbeidenGenotypen,weswegenimFolgendendieHauptmechanismen

der antibakteriellen Funktion der Granulozyten untersucht wurden. Nach der

Phagozytose von Pathogenen werden diese durch die Bildung von ROS innerhalb der

Granulozyten eliminiert. Im folgendenKapitelwurde zunächstdiePhagozytose genauer

untersucht.

ERGEBNISSE 40

4.5. Beeinträchtigte Phagozytose der Granulozyten bei Toso

Defizienz

Nach Pathogenkontakt haben die Granulozyten die Aufgabe diese wirkungsvoll und

schnell zu eliminieren. Über spezifische Rezeptoren wie Toll like Rezeptoren (TLR)

werdendiePathogeneerkanntundanschließendphagozytiert(Medzhitov,2001).Neben

demKomplementsystemspielenauchnatürlichvorkommendeanti‐Listerien‐Antikörper

derIgM‐KlasseeineRollebeiderPathogenaufnahme(Ochsenbeinetal.,1999;Schwartzet

al., 2012). Zur Ermittlung des Phagozytosepotentials sowie zur Untersuchung des

Einflusses von IgM auf den Phagozytoseprozess wurden in einem in vitro Assay

GranulozytenausdemperipherenBlutvonToso‐/‐MäusenmitdenBlutgranulozytenvon

Tieren ohne lösliches IgM (sIgM‐/‐) sowie mit C57BL/6‐Granulozyten verglichen. Nach

einer einstündigen Inkubation mit 106CFU Listerien, die mit CFSE angefärbt wurden

(CFSE‐Listerien), hatten knapp 60% der C57BL/6 Granulozyten Listerien phagozytiert

undwareninderDurchflusszytometriepositivfürCFSE‐Listerien(Abbildung4.8.).Toso

defizienteGranulozytenhattenzu40%CFSE‐Listerienaufgenommenundzeigteneinemit

denGranulozytenaussIgM‐/‐MäusenvergleichbarePhagozytose(Abbildung4.8.).

0

20

40

60

80

100

p=0,001

p=0,0007

N.S.

C57BL/6Toso‐/‐

sIgM‐/‐

A

CFSE‐Listerien

+Granulozyten


Abbildung4.8. Phagozytosepotenzial von Listerien durch Granulozyten. A) Peripheres Blut vonC57BL/6(schwarz⧯ ),Toso‐/‐ (weiß⧮)sowiesIgM‐/‐(weiß⧲ ;kein lösliches IgM)Mäusenwurdeübereinen Zeitraum von 60min mit 106CFU CFSE‐Listerien inkubiert und anschließend die Frequenz derCFSE‐Listerien+GranulozytenbezogenaufalleGranulozyteninderDurchflusszytometriebestimmt.JederDatenpunktgibtdenWerteiner individuellenMauswieder (n=3‐6).DiedurchgezogeneLiniezeigtdenMittelwertderGruppe.

DieAbbildung4.8zeigteinevermindertePhagozytosevonGranulozytenausTosound

sIgMdefizientenMäusen,weswegenIgMELISAmitdemSerumvonC57BL/6sowieToso‐/‐

ERGEBNISSE 41

Mäusendurchgeführtwurde.DieKonzentrationenanIgM‐AntikörpernimSerumwaren

indenbeidenVersuchsgruppenvergleichbar(Abbildung4.9.A).

0

1

2

3

4

5

6C57BL/6Toso‐/‐

TotalIgM

(µg/ml)

A

XX

0

20

40

60

XXCFSE‐Listerien

+Granulozyten


B

C57BL/6

Toso‐/‐

0

10

20

30

40

50

60

70C57BL/6

Toso‐/‐

p=0,03

p=0,03

C57BL/6 sIgM‐/‐

SerumSerum

CFSE‐Listerien

+Granulozyten


C

0

20

40

60

80C57BL/6

Toso‐/‐

CFSE‐Listerien

+Granulozyten


C57BL/6C57BL/6SerumSerum(56°C)

D

p=0,04

Abbildung4.9. IgM‐abhängigePhagozytosevonCFSE‐Listerien..A)LöslichesIgMwurdeimSerumvonC57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐ (weiß⧮)MäusenmittelsELISAquantifiziert.DiedurchgezogeneLiniegibt den Mittelwert der Gruppe wieder. Jeder Datenpunkt ist ein Wert einer individuellen Maus(n=6/Gruppe).B‐D)DasBlutvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)Mäusenwurdedreimalmit serumfreienMedium zur Entfernung der humoralenKomponenten des Blutes gewaschen.B)106 CFU CFSE‐Listerienwurden im gewaschenenBlut für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die CFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenwurdeninderDurchflusszytometriebestimmt(n=10/Gruppe). C) 106 CFU CFSE‐Listerien wurden für eine Stunde mit dem Serum (von Tag 3 nachListerieninfektion)vonC57BL/6oderToso‐/‐Mäusenvorinkubiert.DiesewurdenanschließendfüreineStundemitdemgewaschenenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenbei37°Cinkubiert.DieAnalysederCFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenerfolgteinderDurchflusszytometrie.Diehorizontale Linie zeigt die IgM unabhängige Phagozytose. Das Experiment wurde mit 2 Mäusen proGruppeinfünfunabhängigenAnsätzendurchgeführt(n=10).D)106CFUCFSE‐ListerienwurdenfüreineStundemithitzeinaktiviertem(56°C)SerumvonC57BL/6oderSerumvonC57BL/6,jeweilsanTagdreinachListerieninfektionentnommen,vorinkubiert..DiesewurdenanschließendfüreineStundemitdemgewaschenenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenbei37°Cinkubiert.DieAnalysederCFSE‐Listerien+GranulozyteninProzentvonallenGranulozytenerfolgteinderDurchflusszytometrie(n=4/Gruppe).

ERGEBNISSE 42

Die Differenz in der Phagozytosekapazität zwischenToso‐/‐ und C57BL/6Mäuse könnte

jedochdurchweiterehumoraleKomponentendesBlutesverursacht seinundwurde im

Einzelnenbetrachtet.DiehumoralenKomponentenwieAntikörperunddieBestandteile

des Komplementsystems wurden durch dreimaliges Waschen des Blutes von C57BL/6

undToso‐/‐ Mäusen entfernt. Die Granulozyten im gewaschenen Blut von C57BL/6 und

Toso‐/‐ MäusenwiesendaraufhineinestarkverringertePhagozytoseverglichenmitdem

Granulozyten aus dem ungewaschenen Blut auf (Abbildung 4.8), jedoch war die

PhagozytoserateinbeidenGenotypenaufvergleichbaremNiveau(Abbildung4.9.B).

DerEinflussvonTosoimZusammenhangmitIgMwurdemitdenGranulozytenausdem

gewaschenen Blut näher untersucht. Die CFSE‐Listerien wurden eine Stunde mit dem

Serum von C57BL/6 oder sIgM‐/‐ vorinkubiert bevor dieses Gemisch mit dem

gewaschenen Blut von Toso‐/‐ und C57BL/6 bei 37°C inkubiert wurde. Diese

Vorbehandlung gewährleistete eine Opsonierung der Bakterien mit den humoralen

FaktorendesBluteseinschließlichanti‐IgM‐ListerienAntikörpern(C57BL/6Serum)oder

ohneanti‐IgM‐ListerienAntikörpern(sIgM‐/‐Serum).DieAnwesenheitdeslöslichenIgMs

im C57BL/6 Serum steigerte die Phagozytoserate der C57BL/6 Granulozyten um über

10% gegenüber den Toso‐/‐ Granulozyten, während die Abwesenheit von IgM (sIgM‐/‐

Serum) bei Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten in einer vergleichbaren Phagozytose

resultierte (Abbildung 4.9.C). Die Aufnahmekapazität der Granulozyten für Pathogene

konnte jedoch maßgeblich unabhängig vom IgM detektiert werden (gestrichelte Linie;

Abbildung4.9.C).NebendenImmunoglubinenübtdasKomplementsystemeinenEinfluss

auf die Phagozytose aus. Das Komplementsystem wurde durch eine halbstündige

Inkubation bei 56°C inaktiviert. Das hitzeinaktivierte C57BL/6 Serum wurde für eine

StundemitCFSE‐ListerienvorinkubiertundanschließendmitdemgewaschenenBlutvon

Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten inkubiert. Die Depletion des Komplementsystems

verringerte diePhagozytose vonBakterien inGranulozytenbeiderGenotypen aufunter

10%(Abbildung4.9.D).

ERGEBNISSE 43

Abbildung4.10. Granulombildung inderLeberanTagdreinachListerieninfektion. C57BL/6 (obereZeile)undToso‐/‐(untereZeile)Mäusewurdenmit104CFULmonocytogenesinfiziertundamdrittenTagderInfektiondieLeberentnommen.DieLeberschnittewurdenzurDetektionderGranulozytenmitanti‐Gr1 (grün) unddie Listerienmit anti‐ListerienAntikörpern (rot) fluoreszenzgefärbt. Gezeigt sind zweirepräsentativeAusschnittevonjezweiMäusenproGenotypausn=3jeGruppe.

Bei einer systemischen bakteriellen Infektion bilden die ins Gewebe einwandernden

Granulozyten Zellhaufen aus hunderten Granulozyten, die als Granulome bezeichnet

werden.InvivomigriertendieGranulozyteninC57BL/6undToso‐/‐ MäusenanTagdrei

nachInfektionmit104CFUListerien indieLeberundformiertensichzuvergleichbaren

Granulomen (Abbildung 4.10.). In den Lebern der C57BL/6 Mäuse wurden in der

ImmunfluoreszenzfärbungverglichenmitdenLebernausToso‐/‐Mäusendeutlichweniger

Listerien detektiert (Abbildung 4.10). Die Verteilung der Listerien wies in beiden

GenotypeneinendeutlichenUnterschiedauf.BeidenKontrolltierenwarendieListerien

vorwiegend um die Granulome konzentriert, wohingegen bei den Toso defizienten

Mäusen die Listerien überwiegend innerhalb der Granulome konzentriert waren

(Abbildung4.10).

ERGEBNISSE 44

Abbildung4.11. KonfokaleAufnahme listerienphagozytierenderGranulozyten.DasBlut vonC57BL/6und Toso‐/‐ Mäusen wurde in vitro mit 106CFU CFSE‐Listerien zwei Stunden in Gegenwartbakteriostatischer Antibiotika bei 37°C inkubiert. Anschließend an die Fixierung wurde das Blut aufObjektträger zentrifugiert undkonfokalmikroskopiert. In blau sinddieGranulozyten (anti‐Gr1), in rotCD11b(anti‐CD11b)undingründieCFSE‐Listerienfluoreszenzgefärbt(n=3)

DieMakrophagenübenalsphagozytierendeZellpopulationeinenerheblichenEinflussauf

den Verlauf einer viralen und bakteriellen Infektion aus (Conlan, 1996). Die

Listerienphagozytose der Granulozytenwurde zudemmit der vonMakrophagen in der

konfokalen Mikroskopie verglichen. Aus dem Knochenmark von C57BL/6 und Toso‐/

Mäusen wurden unter dem Einfluss von M‐CSF als Differenzierungsstimulus

Makrophagen in vitro generiert. Die Makrophagen sowie die Blutgranulozyten beider

Genotypen wurden in vitro mit 106 CFSE‐Listerien zwei Stunden inkubiert, die Zellen

anschließendfixiertundaufObjektträgerzentrifugiert.VerglichenmitC57BL/6konntein

Toso defizienten Granulozyten kaum aufgenommene Listerien detektiert werden

(Abbildung 4.11.). Die Phagozytoserate derMakrophagen zeigte keinenUnterschiede in

AbwesenheitvonToso(Abbildung4.12.).

ERGEBNISSE 45

Abbildung4.12. PhagozytosekapazitätvonMakrophagenwährend invitro InkubationmitListerien.Das Knochenmark von C57BL/6 (obere Zeile) undToso‐/‐ (untere Zeile)Mäusenwurde isoliert und invitro unter Verwendung von M‐CSF primäre Makrophagen generiert. Diese wurden an Tag 10 nachDifferenzierungsbeginnfür12StundenaufCover‐Slipsausgesät.AnschließendwurdedasKulturmediumgewechseltunddieMakrophagenzweiStunden inAnwesenheit vonbakteriostatischenAntibiotikamit106 CFU CFSE‐Listerien inkubiert und eine Fluoreszenzfärbung durchgeführt. Die Makrophagen sind(rot),derZellkern(DAPI,blau)unddieCFSE‐Listerien(grün)dargestellt.

DiesesErgebnis fürdieMakrophagenwurdezusätzlichdurcheinweiteresPhagozytose‐

und Eliminierungsexperiment bestätigt. Die aus dem Knochenmark von C57BL/6 und

Toso‐/‐ Mäusen generierten Makrophagen wurden entweder 12 Stunden mit TNFα und

IFNγ voraktiviert, um die Effektormechanismen für die intrinsische Eliminierung der

ListerienindenMakrophagenzuverstärken,oderbliebenunbehandelt.DieMakrophagen

wurden anschließend zwei Stunden mit 105CFU Listerien inkubiert und die

intrazellulären Listerientiter bestimmt. Die nicht aktivierten Makrophagen beider

Genotypen phagozytierten vergleichbare Mengen an Listerien (Abbildung 4.13.). Die

Voraktivierung mit frühinflammatorischen Zytokinen konnte die Effektorfunktion der

Makrophagensteigern,sodassdieKonzentrationanreplikationsfähigenListerieninden

MakrophagenumFaktor10sowohlinC57BL/6alsauchinToso‐/‐Makrophagenreduziert

wurde(Abbildung4.13.).

ERGEBNISSE 46

4

5

6C57BL/6

Toso‐/‐

TNF+IFNListerienListerien

p=0,0001

p=0,006

<3

Listerientiterinden

Makrophagen(log 10CFU)

Abbildung4.13. Phagozytose und Eliminierung von Listerien durch Makrophagen. Aus demKnochenmarkvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)MäusenwurdeninvitrounterVerwendung von M‐CSF Makrophagen generiert und an Tag zehn des Differenzierungsprozessesverwendet.105Makrophagenwurdenfür12StundenohneodermitStimulationdurchTNFαundIFNγineinerPlatteausgesät.AnschließendwurdendieZellenmit105CFUListerienfür zweiStundenbei37°CinkubiertunddieWells zurEntfernungnichtphagozytierterListerienviermalmitMediumgewaschen.Durch zweiminütige Inkubation mit 50% Saponin wurden dann die Listerien aus den MakrophagenherausgelöstunddieTiterbestimmt(n=12).

4.6. HerunterregulierungvonTosodurchPhagozytose

Die Phagozytose von Listerien ist sowohl von der Tosoexpression sowie vom IgM

abhängig.DieExpressionsdynamikvonTosoaufGranulozytenwurdefolgenduntersucht.

Hierzu wurden Knochenmarkszellen von C57BL/6 mit und ohne Zugabe von 108 CFU

Listerien inkubiert und die Expression von Toso auf Granulozyten in der

Durchflusszytometrie quantifiziert. Nach der halbstündigen Inkubation mit Listerien

konnte die Oberflächenexpression des Proteins bei C57BL/6 Granulozyten reduziert

detektiertwerden(Abbildung4.14.).

ERGEBNISSE 47

Listerien0

5

10

15

20 p=0,026

TosoExpression(MFI)

B

Abbildung4.14. ExpressionvonTosobeiderPhagozytosevonListerien.106Knochenmarkzellenisoliert

aus C57BL/6 und Toso‐/‐ wurden 30min mit 108 L. monocytogenes inkubiert (blau) oder bliebenunbehandelt (rot). Anschließend wurde eine Fluoreszenzfärbung mit anti‐Maus Toso Antikörper undanti‐Gr‐1 durchgeführt. Tote Zellen wurden durch Verwendung von 7AAD ausgeschlossen. AlsNegativkontrolle dienten unbehandelte Knochenmarkszellen der Toso‐/‐ Maus (grau schattiert) (n=5).A)RepräsentativeQuantifizierungderOberflächenexpressionvonToso.B)QuantifizierungdermittlerenFluoreszenzintensität(MFI)derExpressionvonTosobeiC57BL/6mitundohneInkubationmitListerien.

Die Phagozytose von Listerien konnte in C57BL/6 Mäusen unter dem förderlichen

Einfluss von IgM detektiert werden, weswegen ein direkter Zusammenhang mit der

OberflächenexpressionvonTosountersuchtwurde.DieKnochenmarkzellenvonC57BL/6

undsIgM‐/‐MäusenwurdennacheinerhalbstündigenInkubationmit108CFUListerienin

der Durchflusszytometrie auf die relative Fluoreszenzintensität von Toso auf

Granulozyten untersucht. Die Expression des Proteins verringerte sich auf C57BL/6

Granulozyten signifikant stärker als bei Verwendung der Granulozyten aus der sIgM‐/‐

Maus(Abbildung4.15.).

Listerien0

20

40

60

80

100C57BL/6sIgM‐/‐

p=0,02

TosoExpression

(in%vonunbehandelterKontrolle)

Abbildung4.15. IgM abhängige Internalisierung von Toso bei der Phagozytose von Listerien. 106

Knochenmarkzellen isoliert aus C57BL/6 (schwarze Balken) und sIgM‐/‐ (weiße Balken) wurden für30min mit 108 L. monocytogenes inkubiert oder blieben unbehandelt. Anschließend wurde eineFluoreszenzfärbungmitanti‐MausTosoAntikörperundanti‐Gr1durchgeführt.ToteZellenwurdenmit7AAD ausgeschlossen. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Expression von Toso wurde inProzentangegebenundaufdiekorrespondierendeunbehandelteKontrollebezogen(n=8).

ERGEBNISSE 48

4.7. Fehlregulierte ROS‐Synthese und Degranulation von Toso

defizientenGranulozyten

Die phagozytierten Bakterien werden im Phagolysosom der Granulozyten durch die

Generierung von radikalen Sauerstoffspezies (ROS) eliminiert (Segal et al., 1981). Die

Verknüpfung vonPhagozytose undderBildung vonROSwurde folgenduntersucht.Die

Granulozyten aus dem peripheren Blut von C57BL/6 wurden mit 106 CFSE‐Listerien

inkubiert und die ROS‐Synthese in Granulozyten, die Listerien aufgenommen hatten

(Abbildung4.16.A+B;rot)mitGranulozytenohnePhagozytosevonListerien(Abbildung

4.16.A+B; blau) verglichen. Die Phagozytose der Listerien resultierte in der Produktion

vonROS,wohingegen inGranulozyten,diekeinePathogeneaufgenommenhatten,kaum

ROSdetektiertwerden konnte (Abbildung 4.16.B). Der Zusammenhang beider Prozesse

wird zudem durch Inkubation der Granulozyten mit ansteigenden

Listerienkonzentrationendeutlich.InAbhängigkeitvonderPathogenlastkonntedieROS‐

ProduktionbeiderhöchstenListerienkonzentrationaufnahezu100%gesteigertwerden

(Abbildung4.16.C).

0 105 106 1070

20

40

60

80

100

Listerien(CFU)

ROS+Granulozyten


C

Abbildung4.16. Korrelation zwischen Phagozytose und ROS Produktion. A+B) Peripheres Blut vonC57BL/6wurdemit106CFUCFSE‐ListerieninkubiertunddieROS‐SynthesemitDihydroethidium(DHE)detektiert.Das linkeFenster (A)zeigtdieAuftragungdesGranulozytenmarkers (Gr1)gegendie CFSE‐ListerienimDotPlotdesDurchflusszytometers.BlaugefärbtistdiePopulationderGranulozyten,welchekeine Pathogene aufgenommenen hatten, und in rot die phagozytierende Granulozytenpopulationdargestellt.KorrespondierendzurDarstellungin(A)zeigtdasmittlereHistogramm(B)dieintrazelluläreROS‐Synthese beider Zellpopulation. Ein Plot aus drei repräsentativen Experimenten ist gezeigt. C)PeriphereBlutvonC57BL/6wurdeeineStundemit105,106oder107CFUListerieninkubiert.DieROS‐SynthesederGranulozytenwurdeinderDurchflusszytometriemitDihydrorhodamin(DHR)ermittelt.AlsKontrollebliebeineGruppeunbehandelt(n=4).

ERGEBNISSE 49

DieEffektorfunktionenvonGranulozytensindpathogenunspezifischundbasierenneben

derPhagozytoseundderintrazellulärenSynthesevonROSaufderDegranulierungvonin

Granula gespeicherten antimikrobiellen Proteinen (Borregaard and Cowland, 1997;

Lominadzeetal.,2005).DieROS‐Synthesewird inzweiaufeinanderfolgendenSchritten,

der Priming‐ und Aktivierungsphase streng reguliert, welche der Verhinderung von

Gewebeschädendienen(Clarketal.,1990;Dangetal.,1999).DasEliminierungspotenzial

der Zellen in der so genanntenAktivierungsphase, der eigentlichenROS‐Synthese,wird

durchdievorrangehendePrimingphasepotenziert(Elbimetal.,1994;Moreletal.,1991).

DasPrimingalleinlöstjedochkeineProduktionvonSauerstoffradikalenaus.

0

5

10

15

20

40 80 1201600

p=0,8

A

GM‐CSF(ng/ml)

ROS+Granulozyten


0

5

10

15

20

0.1 1 10 1000

p=0,9

B

LPS(µg/ml)

0

5

10

15

20

10 100 10000

C57BL/6

Toso‐/‐

p=0,001

C

TNF (ng/ml)

Abbildung4.17. ROS‐SynthesewährendderPrimingphase.DasperiphereBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusen wurdemit verschiedenen Konzentrationen an GM‐CSF, LPS oder TNFα eine halbe Stunde bei37°Cinkubiert.AnschließendwurdedieROS‐SynthesederGranulozyteninderDurchflusszytometriemitDihydrorhodamin (DHR) bestimmt und der prozentuelle Anteil der ROS produzierendenGranulozytenbezogenaufdieGesamtheitallerBlutgranulozytenerfasst(n=6).

Die SynthesevonROSkanndurchdieVerwendungvonDihydrorhodamin (DHR) inder

Durchflusszytometriedetektiertwerden.PeripheresBlutvonnaivenC57BL/6sowieToso

defizienten Mäusenmit verschiedenen Konzentrationen einiger Primingsubstanzen wie

GM‐CSF, LPS und TNFα behandelt und die ROS‐Synthese in der Durchflusszytometrie

erfasst. Während die Granulozyten des C57BL/6 Ursprungs auch bei hohen

Konzentrationen der Primingsubstanzen kaum ROS produzierten, induzierte spezifisch

TNFαinToso‐/‐ZelleneinesignifikanteROS‐Synthese(Abbildung4.17.).

ERGEBNISSE 50

0

10

20

30

40

50

0.1 1 10 1000

C57BL/6

Toso‐/‐

p<0,0001

fMLP(µM)

ROS+Granulozyten


B

Abbildung4.18. ROS‐SynthesebeiInkubationmitdemAktivatorfMLP.DasperiphereBlutvonC57BL/6undToso‐/‐Mäusenwurdemit verschiedenenKonzentrationen an fMLP für 30min bei 37°C inkubiert.Anschließend wurde die ROS‐Synthese in der Durchflusszytometrie mit Dihydrorhodamin (DHR)bestimmt. A) Repräsentative DotPlots der durchflusszytometrischen Analyse gegatet auf Granulozyten(Gr1+) von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen mit und ohne fMLP‐Stimulation. B) ROS produzierendeGranulozyteninProzentallerGranulozytenbeiansteigendenKonzentrationvonfMLP(n=6).

Die Primingphase ist für die Ausschöpfung der Effektorfunktion der Granulozyten

entscheidend. Naive, nicht geprimte Granulozyten, welche direkt in Kontakt mit einer

Aktivierungssubstanz kommen, produzieren kaum ROS. Der Pathogenkontakt kann in

vitro mit fMLP (N‐Formylmethionyl‐Lencyl‐Phenylalanin) imitiert werden, welches ein

BestandteilebakteriellerZellwändeistundandenfMLPRezeptor(FPR)vonGranulozyten

bindet (Graves et al., 1992; Selvatici et al., 2006). Hohe Konzentrationen der Substanz

konntenohnevorrangegangenerPriminig‐Phasebeica.10%derC57BL/6Granulozyten

ROS‐Produktion induzieren (Abbildung 4.18). Toso defiziente Granulozyten reagierten

signifikantstärkeraufdieAktivierungmitfMLP.BereitsbeieinerKonzentrationvon2µM

fMLP konnte bei der Hälfte aller Granulozyten intrazelluläres ROS detektiert werden

(Abbildung4.18.A‐rechteDotPlots;Abbildung4.18.B.).

ERGEBNISSE 51

0

20

40

60

80

100C57BL/6

Toso‐/‐

p=0,0001

p=0,001

GM‐CSF (ng/ml) 160 0LPS (ng/ml) 0 500fMLP (µM) 2 2

ROS+Granulozyten


Abbildung4.19. In vitro induzierte ROS‐Synthese nach der Priming‐ und Aktivierungsphase.Peripheres Blut von C57BL/6 (schwarze Balken) und Toso‐/‐ (weiße Balken) Mäusen wurde mit160ng/mlGM‐CSFoder500ng/mlLPSeinehalbeStundebei37°C inkubiert.AnschließendwurdederAnsatz 15min mit 2µM fMLP aktiviert. Die ROS‐Synthese wurde in der Durchflusszytometrie mitDihydrorhodamin (DHR) bestimmt und die ROS produzierenden Granulozyten in Prozent allerBlutgranulozytenangegeben(n=6).

DiebishervorgestelltenDatenzeigten,dassdasFehlenvonTosodenSchwellenwert für

die ROS‐Synthese sowohl bei direkter Aktivierungmit fMLP als auch beimPrimingmit

TNFαverringerte,jedochkeinenEinflussbeiGM‐CSFundLPSausübte.DasVerhaltenbei

Priming und anschließender Aktivierung wurde in vitro mit den beiden Priming‐

SubstanzenGM‐CSFundLPSuntersucht.Diesewurdengewählt,dasiebeiTosoDefizenz

währendderPrimingphasekeinenUnterschied inderROS‐Syntheseverglichenmitden

Kontrolltieren aufgewiesen hatten. Über einen Zeitraum von 30min wurde die

GranulozytenimperipherenBlutvonC57BL/6undToso‐/‐MäusenmitGM‐CSFoderLPS

geprimt und anschließend mit 2µM fMLP aktiviert. Die Granulozyten vom C57BL/6

Ursprung produzierten bei der Induktion der ROS‐Synthese mit GM‐CSF und fMLP zu

knapp50%ROS,wohingegenderAnteil anROSproduzierendenGranulozytenbeiToso

Defizienz signifikant größerwar (Abbildung 4.19.). Die selbeBeobachtung konnte beim

PrimingmitLPSundanschließenderAktivierungdurchfMLPgemachtwerden(Abbildung

4.19).

ERGEBNISSE 52

0 7 14 21 28 35 420

10

20

30

40C57BL/6Toso ‐/‐

p=0,005

Temperatur(°C)

DegranulatierteGranulozyten


Abbildung4.20. Temperatursensitivität derGranulozyten. Das Blut von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusenwurde für 30min bei 4°C, 15°C, 24°C, 37°C und 42°C inkubiert. Die Degranulation der GranulozytenwurdeinderDurchflusszytometriedurcheineVerringerungderGranularitätdesDurchflusszytometers(SSC)bestimmt.DegranulierteGranulozytensindinProzentallerGranulozytenangegeben(n=6).

Zellulärer Stresswie zumBeispielHitzeschockkann zurAktivierungundDegranulation

der Granulozyten führen (Werz et al., 2002). Unter physiologischen Bedingungen trägt

diese Art von Stimulation zu autoinflammatorischen Erkrankungen bei (Nathan, 2006).

Zur Untersuchung der Thermorelevanz der Zellen wurden Granulozyten beider

Genotypen für 30min unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt und die Aktivierung

anhandderDegranulationquantifiziert.GranulozytendesC57BL/6Ursprungstolerierten

die Temperaturschwankungen des gesamten Untersuchungsbereichs von 4°C bis 42°C,

während Toso defiziente Granulozyten bereits bei minimalen Schwankungen

degranulierten. Eine Reduktion der Temperatur von 37°C auf 14°C führte bei Toso

defizientenGranulozytenzueiner30%igenDegranulation,währendZellendesC57BL/6

UrsprungskeineReaktionzeigten(Abbildung4.20.).

ERGEBNISSE 53

0

20

40

60

80

100

p=0,0006

C57BL/6

Toso ‐/‐

naivTag2 p.i.

ROS+Granulozyten


A

0

1000

2000

3000

4000C57BL/6,naiv

C57BL/6,Listerien

Toso‐/‐,Listerien

p=0,002

MPO(ng/ml)

B

XX

Abbildung4.21. Invivo ROS‐Synthese und Degranulation während einer Listerieninfektion. A)C57BL/6 (schwarze Balken) undToso‐/‐ (weiße Balken)Mäusewurdenmit 104 CFUL.monocytogenes(Listerien) infiziert und das Blut an Tag 2 p.i. entnommen. Naives Blut beider Genotypen wurde alsKontrolle verwendet. Die ROS‐Synthese wurde in der Durchflusszytometrie unter Verwendung vonDihydrorhodamin (DHR) gemessen und die ROS produzierenden Granulozyten in Prozent allerGranulozyten angegeben (n=4‐5). B) Die Konzentration vonMPO im Plasmawurdemittels ELISA vonuninfiziertenC57BL/6(schwarz⧳)undvonC57BL/6(schwarz⧯)sowieToso‐/‐(weiß⧮)MäusensechsStunden nach der Infektionmit 106 CFUL.monocytogenes analysiert. JederDatenpunkt gibt denWerteines individuellenTiereswieder(n=4/Gruppe).DiehorizontaleLiniestelltdenMittelwertderGruppedar.

Invitro zeigtenTosodefizienteGranulozytensowohleinenvermindertenSchwellenwert

für die ROS‐Synthese als auch eine verringerte Stresssensitivität. Die Hypersensitivität

TosodefizienterGranulozytenwurdezusätzlichinvivobetrachtet.HierzuwurdenToso‐/‐

undC57BL/6Mäusemit104CFUListerieninfiziertundimBlutdieROS‐Syntheseunddie

DegranulationvonGranulozytenanTagzweinachderInfektionuntersucht.Währendder

prozentuale Anteil der ROS produzierenden Granulozyten bei Toso Defizienz bei über

60%lag,wieseneindeutlichgeringerAnteilderBlutgranulozytenderC57BL/6Mäusen

ROS‐Synthese auf (Abbildung 4.21.A). Die erhöhte ROS‐Synthese im Blut von Toso‐/‐

MäusenkorreliertemiteinersignifikanthöherenFreisetzungderMyeloperoxidase(MPO)

ins Blut, einem Protein welches in Granula der Granulozyten gespeichert ist und als

MarkerfürdieDegranulationherangezogenwerdenkann(Abbildung4.21.B).

ERGEBNISSE 54

0

2000

4000

6000

8000

C57BL/6Toso‐/‐

p=0,0005

ROS‐Synthesevon

Granulozyten(MFI)

Abbildung4.22. ROS‐Synthese in Granulozyten der Milz. C57BL/6 (schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (weiß ⧮)

Mäuse wurden mit 104CFU L.monocytogenes intravenös infiziert und die Milzen 24 Stunden späterentnommen. Die ROS‐Synthese der Granulozyten wurde in der Durchflusszytometrie unter derVerwendungvonDihydrorhodamin(DHR)quantifiziertunddiemittlereFluoreszenzintensität(MFI)vonDHRdargestellt(n=5‐6jeGruppe).JederDatenpunktgibtdenWerteinesindividuellenTiereswieder.DiehorizontaleLiniestelltdenMittelwertderGruppedar.

TosodefizienteBlutgranulozytenzeigtenverglichenmitC57BL/6invivoimBluterhöhte

ROS‐SyntheseundverstärkteDegranulation.DieAktivierungderGranulozytenistinden

OrganenfürdasÜberlebenentscheidend.InderMilzwurdedaherdieROSSyntheseder

Granulozyten 24 Stunden nach der Infektion mit Listerien von Toso‐/‐ und C57BL/6

MäuseninderDurchflusszytometrieuntersucht.DieGranulozytendesC57BL/6Ursprung

zeigten verglichen mit Toso defizienten Zellen eine deutlich höhere ROS‐Synthese

(Abbildung4.22.).

Der Phagozytoseprozesse von Listerien ist unter anderem vom löslichen IgM abhängig

(Abbildung4.9).DerZusammenhangvonIgMmitderROS‐SynthesesowiederExpression

von Toso wurde folgend untersucht. Hierzu wurde peripheres Blut von C57BL/6 und

Toso‐/‐ Mäusen zunächst zur Entfernung aller humoralen Faktoren dreimal mit

serumfreien Medium gewaschen. Anschließend wurden die Blutzellen in Gegenwart

unterschiedlicher IgM‐Konzentrationen mit GM‐CSF geprimt und folgend mit fMLP

aktiviert.DieROS‐SynthesederGranulozytenwurdedurchflusszytometrischermittelt.Die

Titrationvon IgMzeigtebeiallenKonzentrationensowohlbeiToso‐/‐ alsauchC57BL/6

Blutgranulozyten einen vergleichbaren Einfluss, wobei die Substitution mit 200µg/ml

IgMdiePhagozytoseratederZellenbeiderGenotypenaufannäherndnullProzentsenkte

(Abbildung4.23.A).DieAbhängigkeitderROS‐SynthesevonlöslichemIgMwurdezudem

mitdemBlutvonTierendefizient für löslichesIgM(sIgM‐/‐)undfürreifeB‐Zellen(JH‐/‐)

analysiert sowie mit den Granulozyten von C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen verglichen

(Abbildung4.23.B).DieGranulozytenkeinerdergetestetenDeletionsmäusenkonnteeine

mitdenToso‐/‐Granulozytenvergleichbare,erhöhteROS‐Syntheseaufweisen(Abbildung

ERGEBNISSE 55

4.23.B). Toso defiziente Granulozyten zeigten sowohl bei der direkten Aktivierung mit

fMLPalsauchbeiderAktivierunganschließendandasPrimingsignifikanterhöhteROS‐

Produktion.

0 0.8 2.4 7.3 22 66 2000

20

40

60

80

100 C57BL/6

Toso‐/‐

IgM(µg/ml)

ROS+Granulozyten


A

0

20

40

60

80

100 C57BL/6

JH‐/‐

sIgM‐/‐

Toso‐/‐

fMLPGM‐CSF+fMLP

B

ROS+Granulozyten

(in%vonallenGranulozyten) p=0,006

p=0,04

XXX

Abbildung4.23. DerEinflussvon IgMaufdieROS‐SynthesederGranulozyten. A)PeripheresBlut vonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐ (weißeBalken) MäusenwurdezurEntfernungvonhumoralenKomponentendesBlutes dreimalmit serumfreienMedium gewaschen.Das gewascheneBlutwurde inGegenwart von verschiedenen Konzentrationen an murinem IgM mit 160ng/ml GM‐CSF eine halbeStundebei37°Cinkubiert.ImAnschlussandasPrimingwurdendieGranulozytenmit2µMfMLPweitere15minbei37°Caktiviert.DieROS‐SynthesewurdeinderDurchflusszytometrieunterVerwendungvonDHRquantifiziert und dieROSproduzierendenGranulozyten in Prozent aller Granulozyten angegeben(n=7). B)DasBlut vonC57BL/6 (schwarz),Toso‐/‐(weiß), sIgM‐/‐ (rot) und JH‐/‐ (blau)wurdemit oderohne GM‐CSF (160ng/ml) und mit oder ohne fMLP (2µM) aktiviert. Die ROS produzierendenGranulozyten wurden in der Durchflusszytometrie mittels DHR detektiert und in Prozent allerGranulozytenangegeben(n=4proGruppe).

4.8. TosobeeinflusstdenAktivierungszustandderGranulozyten

Die Ausführung der Effektorfunktionen von Granulozyten ist abhängig von deren

Aktivierung.EinwichtigerMarkerzurErmittlungdesAktivierungszustandesderZellenist

derKomplement3Rezeptor(C3R),welchersichalsHeterodimerausdenUntereinheiten

CD11b und CD18 zusammensetzt (Anderson et al., 2008;Mazzone and Ricevuti, 1995).

Anhand der Oberflächenexpression der Marker auf Granulozyten wurde der

AktivierungszustandimnaivenBlutanalysiert.HierzuwurdedasBlutvonC57BL/6und

Toso‐/‐ Mäusen direkt nach der Entnahmemit Formalin fixiert und die Expression von

CD11a, CD11b und CD18 im Durchflusszytometer quantifiziert. Toso defiziente

GranulozytenzeigtenverglichenmitdenKontroll‐GranulozytenausC57BL/6Mäuseneine

signifikant höhere Expression von CD11b und CD18 (Abbildung 4.24.B‐C), wohingegen

das zur Kontrolle gemessene Integrin CD11a keinen Unterschied aufwies (Abbildung

4.24.A).

ERGEBNISSE 56

0

50

100

150

200

250

300

350 N.S.

A

CD11aExpression(MFI)

0

2000

4000

6000

8000

10000 p=0,008

B

CD11bExpression(MFI)

0

100

200

300

400C57BL/6Toso ‐/‐

p=0,005

C

CD18Expression(MFI)

Abbildung4.24. Expression von Integrinen auf naiven Blutgranulozyten. Das periphere Blut vonC57BL/6 (schwarz ⧯) und Toso‐/‐ (weiß ⧮) Mäusen wurde direkt nach der Entnahme mit 2%Formalin/PBS fixiert. Die Granulozyten wurden mit anti‐CD11a, anti‐CD11b oder anti‐CD18fluoreszenzgefärbtunddiemittlereFluoreszenzintensitätinderDurchflusszytometriequantifiziert.JederDatenpunkt ist der Wert einer individuellen Maus und die horizontale Linie gibt den Mittelwert derGruppean(n=6).

Die Regulation der Oberflächenexpression von CD11b als Aktivierungsmarker von

Granulozytenwurde in Abhängigkeit vom Priming näher untersucht. Hierzuwurde das

periphereBlutTosodefizientersowieC57BL/6TieremitansteigendenKonzentrationen

vonGM‐CSFundLPSinkubiert.DieBlutgranulozytenvonC57BL/6erreichtendurchdas

Priming mit beiden Substanzen ein mit Toso defizienten Granulozyten vergleichbares

relativesExpressionslevelvonCD11b(Abbildung4.25.).

0

2000

4000

6000

8000

10000

+GM‐CSF+LPS[80ng/ml][100µg/ml]

p=0,0426

CD11bExpression

(MFIvonGranulozyten)

C57BL/6

Toso ‐/‐

Abbildung4.25. Expression von CD11bnachdemPrimingmitGM‐CSFund LPS. Peripheres Blut vonC57BL/6(schwarz⧯)undToso‐/‐(weiß⧮)MäusenwurdeeinehalbeStundebei37°CinGegenwartvon80ng/mlGM‐CSFbzw.100µg/mlLPSinkubiert.DiemittlereFluoreszenzintensität(MFI)derExpressionvonCD11baufGranulozytenwurde inderDurchflusszytometriequantifiziert. JederDatenpunkt istderWerteinerindividuellenMausunddiehorizontaleLiniegibtdenMittelwertan(n=5‐6).

ERGEBNISSE 57

Die Oberflächenexpression Toso defizienter Granulozyten zeigte bereits ohne

Voraktivierung erhöhte Level des Aktivierungsmarkers CD11b (Abbildung 4.24.;

Abbildung 4.25). Der Einfluss der Integrinexpression auf die Regulation des

Induktionsschwellenwerts für die Synthese von ROS wurde in der Doppel‐Mutante

(Toso‐/‐xCD11b‐/‐) untersucht. Das periphere Blut von C57BL/6, Toso‐/‐, CD11b‐/‐ sowie

Toso‐/‐xCD11b‐/‐ wurde 30minmit GM‐CSF bei 37°C geprimt und anschließend 15min

mit fMLP aktiviert. Im Anschluss wurde die ROS‐Synthese im Durchflusszytometer

analysiert. Der Anteil der ROS produzierendenGranulozyten beiCD11b‐/‐ Defizienzwar

mitC57BL/6Granulozytenvergleichbar,wohingegendieToso‐/‐ Granulozytenähnlichzu

vorigenExperimentensignifikanthöhereFrequenzenROSproduzierterZellenaufwiesen

(Abbildung 4.26.C). Die ROS‐Generierung der Granulozyten reduzierte sich bei der

Doppel‐Mutante Toso‐/‐xCD11b‐/‐ deutlich gegenüber Toso‐/‐ Granulozyten und war

vergleichbarmitdenGranulozytenvomC57BL/6Ursprung(Abbildung4.26.C).

0

20

40

60

Toso‐/‐

CD11b‐/‐

Toso‐/‐ x CD11b‐/‐

p=0,035 C57BL/6

ROS+Granulozyten


Abbildung4.26. Einfluss der CD11b‐Expression auf die Effektorfunktion von Granulozyten. Dasperiphere Blut von C57BL/6 (schwarze Balken),Toso‐/‐ (weiße Balken),CD11b‐/‐ (blaue Balken) sowieToso‐/‐xCD11b‐/‐ (rote Balken)wurdemit 160ng/ml GM‐CSF eine halbe Stunde bei 37°C geprimt. ZurAktivierungwurdedieInkubationfür15minmit2µMfMLPfortgesetzt.DieROS‐SynthesewurdeinderDurchflusszytometrie unter Verwendung von DHR quantifiziert und die ROS produzierendenGranulozytenalsprozentualerAnteilallerGranulozytenangegeben(n=4).

Die Defizienz des Integrins CD11b verringerte invitro die ROS‐Synthese von Toso‐/‐

GranulozytenaufdasLevelvonC57BL/6Granulozyten.DieAuswirkungderDeletionvon

CD11binvivowurdebeieinerListerieninfektionnäherbetrachtet.HierzuwurdenToso‐/‐

sowie Toso‐/‐xCD11b‐/‐ Mäuse mit 104CFU Listerien infiziert. Die Toso‐/‐xCD11b‐/‐

DoppelmutanteüberlebtedieInfektionzuknapp40%,während90%derTosodefizienten

Mäuseverstarben(Abbildung4.27.).DieCD11b‐/‐MausdientealsKontrolleundverhielt

sichwieC57BL/6inderAbbildung4.3.

ERGEBNISSE 58

0 5 10 15 200

20

40

60

80

100Toso‐/‐

CD11b‐/‐

p=0,038

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Toso‐/‐x CD11b‐/‐

Abbildung4.27. ÜberlebenskurvebeiDefizienzvonCD11bwährendeinerListerieninfektion.Toso‐/‐(weiß),CD11b‐/‐ (blau)Toso‐/‐xCD11b‐/‐(rot)Mäusewurdenmit 104 CFU L.monocytogenes intravenösinfiziert. und das Überleben der Tiere unter Berücksichtigung der Abbruchkriterien (Belastung undGewichtsverlustderTiere)zeitabhängigverfolgt.EswurdenindreiunabhängigenAnsätzenjeweilsdreiTiereproGenotypinfiziert(n=9).

Die Auswirkungen einer Voraktivierung der Granulozyten auf die Phagozytose wurden

invitro in der konfokalen Mikroskopie untersucht. Die Blutgranulozyten von C57BL/6

wurden 20min mit fMLP voraktiviert und die Phagozytose von CFSE‐Listerien mit

Blutgranulozyten naiver nicht geprimter C57BL/6 sowie Toso‐/‐ Tiere verglichen. Die

Inkubationmit CFSE‐Listerienwurde über einen Zeitraum von 2 Stunden durchgeführt

unddiePhagozytosederPathogenenachderFixierungundZentrifugationderZellenauf

Objektträgerkonfokalmikroskopiert.TosodefizienteGranulozytenzeigtenimVergleich

zudenKontrolltiereneine starkverminderteAufnahmevonListerien (Abbildung4.28.)

Die Voraktivierung der C57BL/6 Granulozyten mit fMLP zeigte jedoch einen

reduzierendenEffektaufdiePhagozytosederCFSE‐Listerien(Abbildung4.28)

ERGEBNISSE 59

Abbildung4.28. PhagozytosekapazitätvoraktivierterBlutgranulozyten.106CFUCFSEListerienwurdeninGegenwartvonAntibiotikazweiStundenmitdemBlutnaiver,nichtaktivierterC57BL/6(obereZeile),Toso‐/‐(mittlereZeile)sowiedemBlutvonC57BL/6,welcheszuvor20minmit2µMfMLP(untereZeile)voraktiviert wurde, inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde das Blut umgehend fixiert und aufObjektträger zentrifugiert. Die Granulozyten wurden konfokal mikroskopiert und repräsentativErgebnissevondreiVersuchstierendargestellt.DieListeriensindingrün,dieGranulozyteninblauundCD11binrotfluoreszenzgefärbt.

Die Folgen einer vorzeitigen Aktivierung der Granulozyten im Blut der Tiere während

einer Listerieninfektion wurde invivo näher charakterisiert. Hierzu wurden C57BL/6

TieremitdersublethalenDosisvon104CFUListerieninfiziertundmitunterschiedlichen

Kombinationen aus Priming und Aktivierungssubstanzen intravenös behandelt. Die

Überlebenskurve der behandelten Tiere wurde in Bezug zur infizierten

Kontrollbehandlung mit PBS gesetzt. Die Priming‐ und Aktivierungssubstanzen haben

perse ohne Infektion keinen Einfluss auf dasÜberleben der Tiere. Die Behandlung und

somit die Voraktivierung mit GM‐CSF und fMLP führte zu 100%iger Mortalität,

wohingegendieunbehandeltenTierezuknapp80%überlebten(Abbildung4.29.).

ERGEBNISSE 60

0 5 10 150

20

40

60

80

100

Listerien,PBSListerien,GM‐CSFListerien,GM‐CSF,fMLP

,GM‐CSF,fMLPn=4

n=7

n=7p=0,18

n=7p=0,002

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Abbildung4.29. Überlebenskurve einer Listerieninfektion bei Voraktivierung der Granulozyten.C57BL/6Mäusewurdenmit104CFUL.monocytogenes (Listerien) infiziert.EineKontrollgruppewurdemitPBSbehandelt(schwarz⧯),eineweiterewurdeandenTagen1,2und3p.i. intravenösmit jeweils120ng GM‐CSF (grau ⧯) bzw. 120ng GM‐CSF und 100ng fMLP (weiß ⧮) substituiert. DieSubstanzkontrolleerfolgteinderTiergruppeohneInfektion,welchemit120ngGM‐CSFund100ngfMLP(weiß ⧲) behandelt wurde. Das Überleben der Tiere wurde unter der Berücksichtigung vonAbbruchkriterien(BelastungundGewichtsverlustderTiere)verfolgt.DieSignifikanzwurdebezogenaufdiemitListerieninfzierteKontrollgruppe.

4.9. IntrinsischerDefektTosodefizienterGranulozyten

Die Voraktivierung Toso defizienter Granulozyten kann von verschiedenen humoralen

Faktoren wie den proinflammatorischen Zytokinen, den Antikörpern sowie dem

KomplementsystemjedochauchvonanderenZellenwieB‐undT‐Zellen,Endothelzellen

und Thrombozyten beeinflusst werden (Witko‐Sarsat et al., 2000). Die bereits

vorgestelltenDatenkonnten zeigen,dassTosodenSchwellenwert fürdieROSSynthese

beeinflusstundeineVoraktivierungderGranulozytenverhindert.ZurUntersuchungeiner

intrinsischen oder extrinsischen Ursache wurden zunächst Knochenmarkschimären

generiert. C57BL/6 Mäuse wurden mit 1050rad bestrahlt, um das Knochenmark und

somit alle Immunzellen zu zerstören. Anschließend wurden die bestrahlten Mäuse mit

einem 1:1 Knochenmarkgemisch aus C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäusen rekonstruiert. Zur

Unterscheidung des Genotyps wurde das CD45 Allelsysthem verwendet. Die

Knochenmarkzellen aus Toso defizienten Tieren wiesen die Allelform CD45.2 auf,

während die wildtypischen Knochenmarkszellen das Allel CD45.1 besaßen (Abbildung

4.30.A).

ERGEBNISSE 61

0

10

20

30

40 C57BL/6Toso‐/‐

p=0,03

B

Granulozyten

(in%ofallenBlutleukozyten)

0

20

40

60

80

100

0.1 1 10 100

C57BL/6

Toso‐/‐

0

p=0,0032

fMLP(µM)

ROS+Granulozyten


C

Abbildung4.30. Untersuchung der Granulozyten in gemischten Knochenmarkchimären. C57BL/6Empfängermäuse wurden mit 1050rad bestrahlt und Folgetag mit einem 1:1 Gemisch aus C57BL/6(CD45.1; blau) und Toso‐/‐ (CD45.2; rot) Knochenmarkzellen rekonstruiert. 30 Tage nach derRekonstruktion wurden die Blutgranulozyten analysiert. A) Repräsentativer DotPlot derdurchflusszytometrischen Analyse der Rekonstruktion vorselektiert auf Granulozyten. In Rot sind dieTosodefizienten,inBlaudiewildtypischenZellendargestelltB)ProzentualerAnteilderBlutgranulozytenallerLeukozyten.DiehorizontaleLiniegibtdenMittelwertderGruppean(n=8).C)DasperiphereBlutwurdemit ansteigenden Konzentrationen an fMLP inkubiert. Die Frequenz der ROS der GranulozytenwurdeinProzentallerGranulozytendesentsprechendenGenotypsangegeben(n=8).

In den gemischten Knochenmarkchimären setzte sich die Granulozytenpopulation aus

einem leicht höheren Anteil von C57BL/6 Zellen zusammen (Abbildung 4.30.B). Die

Induktion der ROS‐Synthese im peripheren Blut wurde anschließend an die

Rekonstitution durchflusszytometrisch analysiert. Hierzu wurde das Blut mit

ansteigendenKonzentrationenvonfMLPinvitroinkubiertundderprozentualeAnteilROS

produzierender Granulozyten des jeweiligen Genotyps erfasst. Der prozentuale Anteil

Toso defizienter Granulozyten, welche ROS produzierten, konnte bei allen getesteten

fMLP Konzentration verglichen mit den C57BL/6 höher detektiert werden (Abbildung

4.30.C).

4.10. Adoptivtransfer von C57BL/6Granulozyten verbessertdie

ListerienkontrollewährendderInfektion

DiePathogenkontrolleunddasÜberlebenderTierebeieinerListerieninfektionhängtvon

der effizienten Effektorfunktion der Granulozyten ab. Zur Ermittlung der Funktionalität

derGranulozytenwurdenadoptiveZelltransferexperimentedurchgeführt.Hierzuwurden

die Granulozyten des Knochenmarks unter der Verwendung von Ly6G positiv mittels

ERGEBNISSE 62

MACS‐Methode aufgereinigt und nur Zellfraktionen mit einer Reinheit von >95%

Granulozyten und einer maximalen Kontamination mit Monozyten von <0,1% weiter

verwendet(Abbildung4.31.).

Abbildung4.31. Aufreinigung von Granulozyten aus dem Knochenmark. Granulozyten aus demKnochenmarkderTierewurdenmittelsLy6GMACS‐Kits(MiltenyiBiotec)nachAnleitungdesHerstellersaufgereinigtunddieFraktionsreinheitinderDurchflusszytometrieanalysiert.DerlinkeDotPlotzeigtdasKnochenmarkvor,derrechtenachderAufreinigung.DieFluoreszenzfärbungbeiderFraktionenerfolgteunterVerwendungderAntikörpernLy6GundCD11bundwarstetsüber95%.InRotsinddieMonozyten(Ly6Gmed.CD11bhi)undinBlaudieGranulozyten(Ly6Ghi,CD11bmed)dargestellt.

Zur Eliminierung der endogenen Granulozyten wurden zunächst C57BL/6 Mäuse mit

Cyclophosphamid und Temozolomid (CY/T) vorbehandelt,wodurch drei Tage nach der

Behandlung nahezu alle Lymphozyten und Granulozyten zerstört wurden (Abbildung

4.32.A). Anschließend wurden die CY/T vorbehandelten C57BL/6 Empfängertiere mit

104CFU Listerien infiziert und an den Tagen null und eins der Infektion aufgereinigte

Granulozyten aus dem Knochenmark von Toso‐/‐ sowie C57BL/6 Mäusen adoptiv

transferiert. Die Listerientiter wurden in der Milz und der Leber am zweiten Tag der

Infektion bestimmt. Zur Kontrolle für den Transfer dienten Listerien infizierte CY/T

vorbehandelte C57BL/6 Mäuse ohne Transfer von Granulozyten sowie eine weitere

Gruppe infizierter C57BL/6Mäuse ohne vorheriger CY/T Behandlung.Während in der

Milz keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen detektiert werden konnten,

zeigte der Adoptivtransfer in der Leber deutliche Unterschiede (Abbildung 4.32.B). Der

ListerientiterzwischenunbehandeltenundmitCY/TbehandeltenMäusenwarannähernd

hundertfach höher und konnte durch den Transfer von C57BL/6 Granulozyten auf das

Niveau der unbehandelten Tiere reduziert werden. Der Transfer Toso defizienter

Granulozyten konnte dagegen eine schwächere Pathogenkontrolle erzielen, so dass fast

ERGEBNISSE 63

zehnfach höhere Titer als beim Transfer von C57BL/6 Granulozyten detektiert werden

konnten(Abbildung4.32.B).

0

1000

2000

3000

4000C57BL/6,unbehandeltC57BL/6,CY/T

LymphozytenGranulozyten

A

Leukozytenim

Blut(Zellen/µl)

XX

3

4

5

6

7

8 MilzLeber

<3

B

C57BL/6CY/T,ohnetransfer

CY/T+C57BL/6Granulozyten

CY/T+ Toso‐/‐Granulozyten

p=0,04

Listerien(log 10CFU/Organ)

Abbildung4.32. ListerientiternachadoptivemTransfervonGranulozyten.C57BL/6MäusenwurdezurDepletionvonLeukozytenCyclophosphamid (200mg/kgKörpergewicht)undTemozolomid (90mg/kgKörpergewicht) intraperitoneal appliziert. A) An Tag drei nach CY/T Behandlung (schwarze Balken)wurde den Tieren Blut entnommen und die Anzahl von Lymphozyten und Granulozyten in derDurchflusszytometrie mit unbehandelten C57BL/6 Mäusen (weiße Balken) verglichen (n=4). B) DreiTagenachCY/TBehandlungwurdenalleTieremit104CFUL.monocytogenes infiziert.AndenTagen3und4nachderBehandlungwurdeneinerGruppe jeweils8x106 C57BL/6bzw.eineranderenGruppe8x106Toso‐/‐Granulozytentransferiert.ZurKontrollebliebeineCY/TbehandelteGruppeohneTransferundeineweitereGruppevonC57BL/6wurdenurinfiziertohnemitCY/Tbehandeltwordenzusein.AnTag5wurdendieMilzundLeberderTiereentnommenunddieListerientiterderOrganebestimmt.JederDatenpunkt stellt das Ergebnis eines individuellen Tieres dar und die horizontalen Linien zeigen denMittelwertderGruppe.DasExperimentwurdeindreiunabhängigenAnsätzenmitjeweilsdreiTierenproGruppedurchgeführt(n=9).

DieSchlüsselfunktionderGranulozytenfürdasverminderteÜberlebenderTierebeiToso

DefizienzwährendeinerInfektionmitListerienwurdeebenfallsmittelsAdoptivtransfers

von C57BL/6 Granulozyten untersucht. Hierzu wurden Toso defizienten Tieren an den

Tagen null bis drei nach Infektion mit 3x103CFU Listerien aus dem Knochenmark

aufgereinigte C57BL/6 Granulozyten transferiert und das Überleben der Tiere verfolgt.

Der adoptiveTransfer inToso‐/‐MäuseerhöhtedieÜberlebensrate auf einmitC57BL/6

vergleichbares Niveau, wohingegen nahezu alleToso‐/‐ Mäuse ohne Transfer verstarben

(Abbildung4.33).

ERGEBNISSE 64

0 5 10 150

20

40

60

80

100 C57BL/6Toso‐/‐ +C57BL/6GranulozytenToso‐/‐

p=0,02

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Abbildung4.33. Überlebenskurve der Toso‐/‐Mäuse nach adoptivenGranulozytentransferwährendder Infektion mit L. monocytogenes. C57BL/6 und Toso‐/‐ Mäuse wurden mit 3x103CFU L.monocytogenes intravenös infiziert. Einer Gruppe Toso defizienter Mäuse wurde an Tag 0,1,2,3 p.i.intravenösjeweils8x106C57BL/6Granulozytentransferiert.DieübrigenGruppenbliebenunbehandelt.DasÜberlebenwurdeunterderBerücksichtigungvonAbbruchkriterien(BelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet(n=7‐14TiereproGruppe).

DISKUSSION 65

5. DISKUSSION

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von Toso im Mausmodell

während einer Infektion mit Listeriamonocytogenes untersucht. Nach der initialen

Phagozytose der Bakterien durch gewebeständige Makrophagen migrieren die

Granulozyten angelockt durch proinflammatorische Zytokine als erste

Leukozytenpopulation zum Infektionsort. Die Granulozyten phagozytieren die

opsonierten Pathogene und eliminieren diese durch die intrazelluläre Synthese von

reactiveoxygenspecies (ROS).DerEinflussvonTosoaufdieseProzessewurdemiteiner

totalenDeletionsmutanteanalysiert.

DieDeletionvonTosokonnteinderMaussowohlaufDNA‐,RNA‐sowieaufProteinebene

nachgewiesenwerden(Abbildung4.1.undAbbildung4.6.).TosodefizienteMäusewaren

fertilundzeigtennaivkeinegesundheitseinschränkendenphänotypischenAuffälligkeiten.

Die Analyse der Zusammensetzung des Blutes hinsichtlich der Immunzellen zeigte eine

über 50%ige Reduktion an B‐Zellen, was sich jedoch nicht auf die Konzentration an

löslichemIgM imBlutauswirkte (Abbildung4.2.undAbbildung4.9.A).DerEinflussvon

Toso auf das Immunsystem wurde mit dem gram‐positiven Bakterium

Listeriamonocytogenes näher untersucht. In diesem Untersuchungsmodell spielen die

B‐LymphozyteneineuntergeordneteRolle(Mackaness,1962),sodassderenverminderte

FrequenzeninTosodefizientenMäusenkeinenentscheidendenEinflussaufdenAusgang

derInfektionausübensollten.

5.1. Funktion vonToso aufdie initialeKontrolleder Infektion

mitListeriamonocytogenes

Die bakterielle Pathogenkontrolle benötigt ein effizientes Zusammenspiel der

angeborenen und adaptiven Immunantwort. Die ersten Anzeichen der adaptiven

Immunantwort durch klonale Expansion von Listerien spezifischen T‐Zellen lassen sich

frühestens vier Tage nach der Infektion im Blut nachweisen (Busch et al., 1998). Die

Mortalität tritt bei Toso defizienten Mäusen jedoch in den ersten drei Tagen nach der

Infektion ein (Abbildung 4.3.), weswegen eine Dysfunktion des angeborenen

Immunsystemsvorzuliegenscheint.ImZusammenhangmitderhohenMortalitätbeiToso

DISKUSSION 66

Defizienz sind die bakteriellen Titer in der Milz, Leber und im Gehirn stark erhöht

(Abbildung4.4.)unddeutetenaufeinevermindertebakterielleKontrollehin.

DieinitialeEindämmungderAusbreitungvonPathogenenzuBeginneinerInfektionwird

durch gewebeständige Makrophagen in der Milz und der Leber gewährleistet (Conlan,

1996). Diese sind fest mit dem Endothel assoziiert, reichen ins Lumen der Blutgefäße

hineinundsindaufgrundihrerLokalisationprädestiniertfürdieFiltrationdesBlutesvon

Pathogenen (Crispe, 2009; Lang et al., 2010).Durch spezifischeZelldepletion, unterder

Verwendung einer intravenösen Applikation von in Liposomen eingeschlossenem

Clodronat, kann der Einfluss gewebeständiger Makrophagen deutlich gemacht werden

(van Rooijen et al., 1997). Bei einer systemischen Infektion mit dem lymphozytären

Choriomeningitis Virus (LCMV) führte Untersuchungen zufolge die Depletion

gewebeständiger Makrophagen zu einer unkontrollierten viralen Replikation und der

Ausbreitung viraler Partikel in andere Organe. Die Konsequenz war eine verminderte

zytotoxische T‐Zellantwort und die Persistenz des Viruses (Lang et al., 2010). Des

WeiterenkonnteeineessentielleFunktiongewebeständigermetallophilerMakrophagen

der Milz für die Aufnahme von Pathogenen und die Präsentation ihrer Antigene bei

UntersuchungenmitdemvesikulärenstromatitisVirus(VSV)gezeigtwerden.DasFehlen

dieser Zellpopulation führte zu einer ineffektiven Aktivierung des adaptiven

ImmunsystemsundzueinererhöhtenMortalitätderTiere(Honkeetal.,2012).

DieseBeispieleverdeutlicheneinenbedeutendenEinflussgewebeständigerMakrophagen

bei einer viralen Infektion. Der Einfluss dieser Zellpopulation bei einer bakteriellen

Infektion wurde durch die spezifische Depletion mit Clodronat untersucht. Durch das

FehlengewebeständigerMakrophagenerreichtedieMortalitätinC57BL/6Mäusenselbst

beieiner Infektionmiteinernicht letalenDosisvon3x102CFUListerieneineFrequenz

von100% (Anhang6.1.).DieseBedeutungder Zellen für denVerlauf einer bakteriellen

InfektionsetztezunächstdieUntersuchungderFunktionalitätvonMakrophageninToso

defizientenMäusen voraus. Die nähere Charakterisierung dieser Zellpopulation erfolgte

zum Ausschluss exogener Einflüsse ausschließlich invitro. Toso‐/‐ Makrophagen zeigten

bei konfokaler Betrachtung hinsichtlich der Kapazität des Phagozytoseprozesses von

Listerien eine mit wildtypischen Makrophagen vergleichbare Phagozytose (Abbildung

4.12.). Eine vergleichbare Funktionalität von Makrophagen beider Genotypen konnte

zudemmittels eines Listerien‐Eliminierungsassays bestimmt werden (Abbildung 4.13.).

Insgesamt phagozytierten und eliminierten die Makrophagen beider Genotypen die

BakterienineinemvergleichbarenAusmaß.

DISKUSSION 67

Neben gewebeständigen Makrophagen nehmen die neutrophilen Granulozyten einen

gewichtigenEinflussaufdieanfänglicheKontrollederBakterienverbreitung.DieseZellen

migrieren innerhalbweniger Stunden zum Infektionsort und eliminieren die Pathogene

ähnlich zu Makrophagen durch Phagozytose und intrazelluläre Synthese von ROS. Die

Bedeutung bei einer bakteriellen Infektionwurde zahlreich beschrieben (Czuprynski et

al., 1994; Rogers and Unanue, 1993) und konnte durch die spezifische Depletion der

Granulozyten, die die Suszeptibilität in C57BL/6 Mäusen erhöhte, bestätigt werden

(Abbildung 4.5.). Der adaptive Transfer von C57BL/6 Granulozyten in Toso defiziente

Mäuse konnte dagegen die Resistenz für L.monocytogenes wiederherstellen (Abbildung

4.33.) und lässt auf Defizite bei Granulozyten in Abwesenheit von Toso schließen. Die

genauereUntersuchungderGranulozytenwurdefolglichinvivoundinvitrodurchgeführt.

5.2. EinflüssevonTosoaufdieQuantitätderGranulozyten

DieGranulozytenreifenimKnochenmarkaus,emigriereninsBlutundwandernbeieiner

Inflammation zur Bekämpfung der Pathogene am Entzündungsort in das umliegende

Gewebe. ImperipherenBluthabendieGranulozyteneineLebenszeitspannevoneinigen

Stunden bevor sie durch spontane Apoptose sterben. Toso wurde ursprünglich als

anti‐apoptotischwirkendesMolekül auf T‐Zellen beschrieben (Hitoshi et al., 1998). Die

Einflussnahme des Proteins auf die Steuerung der Apoptose und die Neubildung von

GranulozytenwurdeindiesemZusammenhanguntersucht.

Das Überleben der Granulozyten kann durch Pathogenkontakt, bakterielles

Lipopolysaccharid (LPS) sowie proinflammatorische Zytokine, Chemokine und

WachstumsfaktorenwieGM‐CSFumeinigeTageverlängertwerden(Colottaetal.,1992;

Hachiya et al., 1995; Kobayashi et al., 2005; Yamamoto et al., 1993). Zudem weisen

apoptotische Granulozyten eine Herunterregulation von an der Phagozytose beteiligten

Rezeptorenund folglicheineniedrigerePhagozytosekapazitätauf,dieursächlich fürdie

verminderteEffektorfunktionvonTosodefizientenGranulozyten seinkönnte (Whyteet

al., 1993). Eine Störung der spontanen Apoptose sowie der überlebensverlängerende

EinflussvonGM‐CSFwurdeninvitrountersuchtundeineInvolvierungvonTosoaufdiese

Prozesseausgeschlossen(Abbildung4.7.A.).

Störungen, diedieNeubildungderGranulozyten imKnochenmarkbetreffen, sinddurch

eineNeutropeniegekennzeichnetundmit chronischenundrezidivierendenbakteriellen

Erkrankungenverbunden.DieseschwerwiegendenKrankheitensindz.B.mitgenetischen

DISKUSSION 68

MutationenindenGenenELA2(Elastase2),GFI1(growthfactor‐independent1)oderdem

Kostmann‐Syndromassoziert (Ancliff et al.,2001;Kostmann,1956;Personetal.,2003).

Die Neubildung der Granulozyten und derenMigration aus demKnochenmark ins Blut

wurden jedoch nicht durch die Defizienz von Toso beeinflusst (Abbildung 4.7.B).

Korrelierend hierzu war die Populationsgröße reifer Granulozyten im peripheren Blut

naiverToso‐/‐MäusemitdemBlutvonC57BL/6Mäusenvergleichbar(Abbildung4.2.A).

EinefunktionelleRelevanzvonTosoaufdieQuantitätoderNeubildungderZellenkonnte

somit ausgeschlossen werden und nicht als Ursache für die erhöhte Mortalität

herangezogen werden. Neben der Anzahl der Granulozyten ist auch deren funktionelle

Qualität inFormvonPhagozytoseundSynthesevonROSentscheidend fürdenAusgang

einerInfektionmitBakterien.

5.3. Komplement‐undIgM‐abhängigePhagozytose

Die opsonierten Pathogene werden durch Rezeptoren auf der Oberfläche von

Granulozytenerkanntundphagozytiert(Medzhitov,2001;MedzhitovandJaneway,2000).

InzweiunabhängigenStudienmittransfiziertenHeLa‐ZellenkonnteeinedirekteBindung

vonIgManTosonachgewiesenwerden(Shimaetal.,2010;Vireetal.,2011).Dieseführte

innerhalb weniger Minuten zur Internalisierung des Toso/IgM Komplexes sowie zur

lysosomalenDegradierungderProteinkonglomerate (Vire et al., 2011).Dies stellt einen

möglichenMechanismus dar,wodurch an IgM Immunkomplexen gebundene Pathogene

zurEliminierung insZellinnere transportiertwerdenkönntenundanschließendPAMPs

intrazellulär zurVerfügunggestelltwerden.Tosobefindet sich sowohl imMenschenals

auch in der Maus in der unmittelbaren Nachbarschaft zweier bereits beschriebener

Fc‐Rezeptoren pIgR und Fcα/µR für IgM auf dem Chromosom1 (Abbildung 5.1.). Diese

weisen verglichen mit Toso einige konservierte Strukturen in der variablen

Immunoglobindomäne (IgV) auf (Shima et al., 2010), binden jedoch nicht nur IgM,

sondernauchIgAPolymere(Hamburgeretal.,2004).

DISKUSSION 69

Abbildung5.1.: InsilicoAnalysedesTosoGenlokusaufChromosom1.DargestelltisteinAusschnittdesChromosoms1 des Menschen Homosapiens (oben) und der Hausmaus Musmusculus (unten). Quellehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/DatumderRecherche15.08.2012.

DieCharakterisierungvonTosoalsRezeptor für IgMmachteeinenähereUntersuchung

des Phagozytoseprozesses notwendig. Toso defiziente Granulozyten zeigten verglichen

mitC57BL/6GranulozyteneinevermindertePhagozytoserate.DieUrsachehierfürwurde

gesondert für das Komplementsystem und anti‐Listerien‐IgM Antikörper untersucht. In

diesemProzesskommtdemKomplementsystemeinegrößereBedeutungzu (Abbildung

4.9.D). Die Hitzeinaktivierung der Komponenten verminderte die Phagozytose auf ein

zwischen Toso‐/‐ und C57BL/6 Granulozyten vergleichbar geringes Niveau (Abbildung

4.9.D).DieVerwendungvomintaktenSerumeinschließlichanti‐Listerien‐IgMAntikörper

resultiertebeiAnwesenheitvonToso inverbesserterPhagozytoseopsonierterListerien

(Abbildung 4.9.C). Eine direkte Bindung der kommerziell erwerblichen murinen anti

ListerienIgM‐PentamereanPathogeneimserumfreienMediumerbrachtejedocheinemit

C57BL/6GranulozytenvergleichbarerePhagozytosevonToso‐/‐Zellen(Anhang6.2).

DiegezeigtenVersuchesuggeriereneineaufdenPhagozytoseprozessförderlicheWirkung

der Interaktion von Tosomit löslichem IgM nur in Anwesenheit von Bestandteilen des

Komplementsystems.DasFehlenvonnureinerdieserdreiKomponentenführtezukeiner

PotenzierungderPhagozytoseratevonPathogenen(Abbildung4.9.undAnhang6.2.).Eine

mögliche Erklärung für den Zusammenhang könnte sein, dass Bestandteile des

Komplementsystems zusammen mit IgM Immunkomplexen förderlich auf die C3

Opsonierung von Bakterien wirken und dessen anschließender Phagozytose über die

Komplementrezeptoren1(C1R)und3(C3R)erlauben(Ogdenetal.,2005;Schwartzetal.,

2012). In einer Studiemit dem gram‐negativen Bakterium Francisellatularensis konnte

gezeigtwerden,dassnatürliches IgMimSerumvonnicht immunenMenschenessentiell

für die Komplement‐abhängige Phagozytose ist. Das natürliche IgM bindet an die

DISKUSSION 70

Oberfläche der Bakterien und aktiviert dadurch über C1q den klassischen Weg des

Komplementsystems. Dies erhöht die C3 Anlagerung auf der Bakterienoberfläche und

führtschließlichzurPhagozytoseüberdenKomplementrezeptor3(Schwartzetal.,2012).

Übertragen auf die Ergebnisse der durchgeführten Opsonierungsexperimente lässt die

StudievonSchwartzetal.(2012)eineInvolvierungvonTosobeidiesemVorgangmöglich

erscheinen. Toso könnte hierbei die Phagozytose opsonierter Pathogene durch direkte

oderindirekteInteraktionmitdenKomplementrezeptorenbeeinflussen.

DieBedeutungvon IgMaufdenPhagozytosevorgangkonntezusätzlichdurchdiesIgM‐/‐

Mausverdeutlichtwerden.DieBlutgranulozytenausdersIgM‐/‐Mauszeigtenähnlichzu

Toso‐/‐ Granulozyten verglichen mit C57BL/6 Zellen eine verminderte Phagozytoserate

(Abbildung 4.8.). Eine exogeneUrsache für dieMinderung derAufnahmekapazität Toso

defizienter Granulozyten durch z.B. geringere Konzentrationen humoraler Faktoren im

SerumderTierekonnteausgeschlossenwerden(Abbildung4.9.AundAbbildung6.3.).Die

HypotheseeinesintrinsischenDefektsderGranulozytenbeiTosoDefizienswurdedurch

adaptivenZelltransferToso‐/‐sowieC57BL/6GranulozyteninCY/TbehandelteC57BL/6

Empfängertiere bekräftigt. In diesem Experiment zeigten die C57BL/6 Granulozyten

verglichen mit Toso‐/‐ Granulozyten invivo eine verbesserte bakterielle Kontrolle

(Abbildung4.32.B).

5.4. InvolvierungvonTosobeiderROS‐Synthese

DiebakteriellePhagozytosedurchGranulozytenruftdieintrazelluläreSynthesevonROS

hervor. Die enge Verknüpfung beider Prozesse zeigte sich durch die Analyse der ROS‐

ProduktionphagozytierenderGranulozytengegenüberGranulozytenohneAufnahmevon

Listerien (Abbildung 4.16.). Sauerstoffradikale konnten nur in Granulozyten detektiert

werden,welcheBakterienaufgenommenhatten(Abbildung4.16.).DerEinflussvonToso

aufdieReduktiondesSauerstoffszuO•wurdeinvitrogenaueruntersucht.DieInduktion

derROS‐SyntheseistinzweiPhasen,diePriming‐unddieAktivierungsphase,gegliedert.

Die Synthese von ROS benötigt zwingend die Assemblierung der Untereinheiten der

NADPH‐Oxidase(Segal,2005).DieNADPH‐Oxidase isteinMultiproteinkomplex,welcher

aus sechs Proteinen besteht von denen zwei das in der Membran eingebaute

Flavocytochrom b558 bilden und die anderen von zytolischen Proteinen gestellt werden

(Babior,1999).DieVerteilungdieserProteinimZytosolnichtaktivierterZellensolleinen

inaktiviertenZustandderNADPH‐Oxidasegewährleisten,welchererstbeiStimulationzur

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N 71

DISKUSSION 72

mit der Schwellenwertsetzung für die TNFα induzierte Apoptose und konnte mittels

heterologer Expressionsstudien sowie invivo Untersuchungen die anti‐apoptotische

Wirkung vonToso bestätigen (Nguyen et al., 2011).Die vorgestelltenDatenpassen zur

erhöhtenTNFαSensitivitätundverstärktenROS‐SyntheseTosodefizienterGranulozyten.

DieInduktionderROS‐SynthesewarTNFαspezifischundkonntenichtbeiGM‐CSFoder

LPS beobachtet werden, weswegen eine Involvierung von Toso in den p38 Signalweg

möglichzuseinscheint.

In diesem Zusammenhang konnte in einer kürzlich veröffentlichten Arbeit ein auf den

TNFα induziertenPrimingeffekt regulatorischwirkendesProteincharakterisiertwerden

(Boussettaetal.,2010).DasPrimingmitTNFαaktiviertdieIsomerasePin1,welcheandas

phosphorylierteSerinS345vonp47phoxbindetunddieKonformationsänderungsowiedie

PhosphorylierungweitererAminosäurendurchdieProteinkinaseC(PKC)induziert.Dies

ermöglicht schließlich die Bindung von p47phox an die p22phox‐Untereinheit, was zur

Assemblierung des funktionsfähigen NADPH‐Oxidase Komplexes führt. Die Inhibierung

vonPin1konntedenPrimingeffekt vonTNFαaufheben.DieseStudien lassenvermuten,

dass Toso entweder bei der Phosphorylierung von p47phox über Moleküle des p38

SignalwegsinvolviertseinkönnteoderregulatorischaufPin1einwirkenkönnte.

Die gemischten Knochenmarkchimären konnten zudem zeigen, dass eine intrinsische

Dysfunktion der Toso‐/‐ Granulozyten in Bezug auf die Induktion der ROS‐Synthese

vorliegen muss (Abbildung 4.30.). Bei allen getesteten Konzentrationen von fMLP

reagierte in gemischtenChimären einhöhererAnteil anToso‐/‐ Granulozytenverglichen

mit C57BL/6 Granulozyten mit der Synthese von ROS. Dieser Befund konnte mit

Einzelknochenmarkchimären rekonstituiert mit Toso defizientem bzw. C57BL/6

Knochenmarkverifiziertwerden(Anhang6.4.).

InsgesamtführtedieBehandlungderGranulozytenausallenChimärenmitansteigenden

Konzentrationen von fMLP im Vergleich zu Granulozyten aus naiven, unbestrahlten

MäusenzuerhöhterROS‐Synthese(Abbildung4.18.undAbbildung4.30).Untersuchungen

zufolgekonnten imSerumbestrahlterTiereerhöhteKonzentrationenanZytokinen,von

denen einige Primingpotenzial haben, detektiert werden (Cairo et al., 1992; Lee et al.,

2004).

DISKUSSION 73

5.5. FolgenderfehlgesteuertenROS‐Synthese

Die Abwesenheit von Toso in Granulozyten führte beim Priming und anschließender

Aktivierung sowie bei direkter Aktivierungmit fMLP invitro zu erhöhter ROS‐Synthese

(Abbildung4.18.undAbbildung4.19.).Tosokönntesomiteineungeeigneteundvorzeitige

Aktivierung der Granulozyten im Blut verhindern, so dass die ROS‐Synthese erst bei

Pathogenkontakt in Organen erfolgt. Die fehlgeleitete Induktion der Radikal‐Synthese

wirdbeimdirektenVergleichderROSProduktionderGranulozytenimBlutundderMilz

deutlich(Abbildung4.21.AundAbbildung4.22.).InwildtypischenZellenvermindertedie

Expression von Toso die ROS‐Synthese im Blut, verstärkte diese jedoch im Organ. Der

zugrunde liegende funktionelleMechanismusvonTosowirdunterderBerücksichtigung

der Expressionsanalyse deutlich. Die Phagozytose von Listerien verringerte die

Oberflächenexpression von Toso deutlich (Abbildung 4.15. und Abbildung 4.16.). In

diesem Kontext würde die Expression von Toso auf Blutgranulozyten bei Kontakt mit

Primingsubstanzen wie TNFα, welche von Kupfferzellen relativ früh während der

Infektionsezerniertwerden,derVerhinderungderROS‐InduktionimBlutdienen(Havell,

1987). Nach der Migration in die Organe phagozytieren die Granulozyten die Listerien

infolge dessen Toso internalisiert werden würde. Die Herunterregulation des Proteins

würde die Sensitivität auf Primingsubstanzen in Organen verringern und die

ROS‐Syntheseerlauben.

DieKonsequenzeinerunkontrolliertenundineffizientenAktivierungderGranulozytenim

Blut konnte durch die Applikation der Tiere mit Priming‐ und Aktivierungssubstanzen

während der Infektion induziert werden. Die Behandlung der C57BL/6 Tiere, die

unbehandeltdie InfektionmitListerienüberlebten, führtezurSuszeptibilitätderMäuse

für die Pathogene (Abbildung 4.29.). Die Hyperaktivierung der Granulozyten ist zudem

häufigmitAutoimmunerkrankungenwiezumBeispielderVaskulitisassoziiert(Cascaoet

al., 2009; Kain et al., 2010; Nathan, 2006). Studien mit bereits im Blut geprimten

Granulozyten konnten diesen nachteiligen Effekt bestätigen. Eine mehrfache

Kombinationsbehandlung mit LPS und fMLP führte in Kaninchen zur verstärkten

AktivierungvonGranulozytenunddarausresultierendenGewebeschädigungderLungen

(Worthenetal.,1987).DieexvivoStimulationvonGranulozytenausLymphompatienten,

diemitGM‐CSFbehandeltwurden,zeigteeineerhöhteSensitivitätderGranulozytenauf

fMLP (Khwaja et al., 1992).DesWeiteren korreliertedie Intensität derROSProduktion

mitderKonzentrationvonTNFαimBlutvonacuteresperitorydistresssyndrome (ARDS)

PatientenundPathogenesederLungenverletzung(Chollet‐Martinetal.,1992)

DISKUSSION 74

5.6. EinflussdesIntegrinsCD11b

Das Integrin CD11b (Mac1) ist einBestandteil desKomplement 3Rezeptors (C3R) und

wird alsMarker für denAktivierungszustand der Granulozyten genutzt. Die Expression

von CD11bwirdwährend der Primingphase durch die Verschmelzung vonGranulamit

der Plasmamembran heraufreguliert. Toso defizienteGranulozytenwiesen imVergleich

zuC57BL/6GranulozyteneineerhöhtebasaleExpressionderIntegrineCD11bundCD18

auf, weshalb von einer Voraktivierung der Granulozyten im Blut ausgegangen werden

konnte (Abbildung 4.24.). Das Priming mit GM‐CSF oder LPS induzierte eine

HochregulationdesIntegrinsaufC57BL/6Granulozyten,sodassdiegeprimtenC57BL/6

Granulozyten eine mit Toso defizienten Zellen vergleichbare Expression von CD11b

aufwiesen(Abbildung4.25.).InfolgeeinesaktivierendenStimuluskorreliertedasPriming

vonC57BL/6GranulozytendurchGM‐CSFoderLPSmiteinemniedrigerenSchwellenwert

für die Induktion der ROS‐Synthese. Die ungeprimten Granulozyten produzierten beim

Kontakt mit fMLP kaum ROS, wohingegen das Priming zur Synthese von ROS führte

(Abbildung4.18.undAbbildung4.19.).

DieKorrelationdesAktivierungszustands vonGranulozytenmit derROS‐Synthesewird

beim Fehlen von CD11b deutlich. Die Deletion von CD11b in Toso defizienten Tieren

führte invitro zu einer verringerten ROS‐Synthese, die vergleichbar mit der

ROS‐Produktion von C57BL/6 Granulozyten war (Abbildung 4.26.). Der verringerte

AktivierungszustandunddiereduzierteROS‐SyntheseverminderteninvivodieMortalität

von Toso‐/‐xCD11b‐/‐ Mäusen gegenüber Toso‐/‐ Tieren während der Infektion mit

Listerien(Abbildung4.27.).

Der direkte Nachweis einer Interaktion von Toso mit CD11b bzw. ein regulatorischer

ZusammenhangbeiderProteineaufdieAssemblierungderNADPH‐Oxidasekonntejedoch

nicht erbracht werden. Ein Zusammenhang von ROS‐Synthese und der Expression von

CD11bwurdeinMakrophagendurcheineBlockierungvonCD11bmiteinemspezifischen

Antikörper verdeutlicht. Die Behandlung führte invitro zur Störung der Assemblierung

des NADPH‐Oxidase Komplexes und folglich zur kompletten Inhibierung der ROS‐

SyntheseinMakrophagen(Husemannetal.,2001).

DISKUSSION 75

5.7. Ausblick

Zusammenfassend lassen die Untersuchungen vermuten, dass Toso zwei Funktionen

ausübt. Zum einen fungiert Toso als ein exklusiver Fc‐Rezeptor für IgM und ist an der

Phagozytose von IgM opsonierten Pathogenen beteiligt, zum anderen reguliert Toso

Signale, die zum Priming und zur Aktivierung der Granulozyten beitragen. Die duale

Funktion von Toso konnte bereits für andere Rezeptoren wie das Integrin CD11b

nachgewiesenwerden.CD11bbindetverschiedeneLigandenwieICAM‐1, iC3b,Kollagen,

Fibrinogen und ist somit an der Phagozytose von Komplement opsonierten Pathogen

beteiligt (Ross,2002)sowieeinnegativerRegulatorvonTLR‐Signalen(Hanetal.,2010;

MeansandLuster,2010;Mocsaietal.,2006).

DievorliegendeArbeitkonntezeigen,dassTosodenSchwellenwertfürdieInduktionder

ROS‐Synthese sowie die Phagozytose von IgM opsonierten Bakterien beeinflusst. Die

molekularen Grundlagen für diese Funktionen konnten jedoch bisher nicht ermittelt

werden.Es istnochoffen,obTosodirektoder indirektmitanderenRezeptorenwiez.B.

CD11b auf der Oberfläche von Granulozyten sowie anderen Zellen interagiert oder in

intrazelluläreSignalwegewiedenp38MAP‐Kinasewegeingreift.DiegezielteBetrachtung

der Phosphorylierung von hierfür relevanten Proteinen sowie Interaktionsstudien mit

anderenProteinenkönntenindiesemKontexthelfen,dieFunktionvonTosogenauerzu

charakterisieren.

ANHANG 76

6. ANHANG

6.1. InvivoDepletionvonMakrophagen

3x103CFUListerien

0 5 10 150

20

40

60

80

100

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

XX

103CFUListerien

0 5 10 150

20

40

60

80

100

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

XX

3x102CFUListerien

0 5 10 150

20

40

60

80

100

C57BL/6(PBS)C57BL/6(Clodronat)

Zeit p.i.(Tage)

Überleben(%)

Abbildung6.1.: Überlebenskurve von C57BL/6 Mäusen in Abhängigkeit von gewebeständigenMakrophagenbeieinerInfektionmitL.monocytogenes.C57BL/6Mäusewurdenintravenösmit200µlClodronatbehandelt(n=6grau)oderbliebenunbehandelt(n=6schwarz).AmFolgetagwurdendieMäusemit 3x103 , 103 oder 3x102CFU L.monocytogenes intravenös infiziert und das Überleben unter derBerücksichtigungvonAbbruchkriterien (wieBelastungundGewichtsverlustderTiere)beobachtet.DieInfektionderVersuchstierewurdeinzweiunabhänigenVersuchsansätzendurchgeführt

ANHANG 77

6.2. IgMabhängigePhagozytoseimserumfreienMedium

0 10 100

1000

0

20

40

60

C57BL/6

Toso‐/‐

Mausanti‐IgM‐ListerienAntikörper[ng]

CFSE‐Listerien

+Granulozyten


Abbildung6.2.: PhagozytosevonCFSEListerieninAbhängigkeitvomkommerziellenIgM.DasBlutvonC57BL/6(schwarzeBalken)undToso‐/‐(weißeBalken)MäusenwurdedreimalmitserumfreienMediumzurEntfernungderhumoralenKomponentendesBlutesgewaschen.106CFUCFSE‐Listerienwurdenmitden angegebenen Konzentration von anti‐IgM‐Listerien Antikörpern (Santa Cruz) für eine Stundevorinkubiert.AnschließendwurdediesmitdemgewaschenenBlutfüreineStundebei37°Cinkubiert.DieCFSE‐Listerien+ Granulozyten in Prozent von allen Granulozyten wurden in der Durchflusszytometriebestimmt(n=4/Gruppe)

6.3. KonzentrationvonC3imSerum

0

2

4

6

C57BL/6naivC57BL/6Tag2 p.i.

Toso‐/‐Tag2 p.i.

C3Kom

plementimBlut(log

10ng/ml)

Abbildung6.3.: KonzentrationvonC3imSerum.C57BL/6(grau)undToso‐/‐(weiß)Mäusewurdenmit

104CFUL.monocytogenesinfiziertunddasBlutanTag2p.i.entnommen.ZurKontrollewurdeBlutnaiverC57BL/6Tieren(schwarz)verwendet.VondiesemBlutwurdedieKonzentrationvonC3mittelsELISAquantifiziert.

ANHANG 78

6.4. ROS‐SyntheseinEinzelknochenmarkchimären

0

20

40

60

80

100

0.1 1 10100

C57BL/6

0fMLP(µM)

ROS+Granulozyten


A

0

20

40

60

80

100

0.1 1 101000fMLP(µM)

ROS+Granulozyten


Toso‐/‐

B

0

20

40

60

80

100

0.1 1 10100

C57BL/6

0

Toso‐/‐

fMLP(µM)

ROS+Granulozyten


P=0,009

C

Abbildung6.4.: Untersuchung der Granulozyten in Einzelknochenmarkchimären. C57BL/6

Empfängermäusewurdenmit 1050rad bestrahlt und am folgenden Tagmit einem C57BL/6 (CD45.1;schwarz) oder Toso‐/‐ (CD45.2; weiß) Knochenmarkzellen rekonstruiert. 30 Tage nach derKnochenmarksrekonstruktionwurdendieBlutgranulozytenanalysiert.DasperiphereBlutvonC57BL/6(A) oder Toso‐/‐ (B) wurde mit ansteigenden Konzentrationen von fMLP inkubiert. C) zeigt dieÜberlagerungderErgebnisseausAundB.DieFrequenzderROSderGranulozytenwurdeinProzentallerGranulozytendesentsprechendenGenotypsangegeben(n=8).

LITERATURVERZEICHNIS 79

7. LITERATURVERZEICHNIS

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DANKSAGUNG 88

8. DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. Karl Sebastian Lang, danke ich herzlich für die Überlassung des

interessanten Themas, für die gute und intensive Betreuung sowie für die großen

gestalterischenFreiheitenwährenddesgesamtenForschungsprojekts.VielenDankfürdie

andauerndeUnterstützung.

HerrnProf.Dr.UlfDittmerdankeichfürdiefreundlicheÜbernahmedesKorreferats.

Ein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Dieter Häussinger für die Möglichkeit in seinen

Laborräumenarbeitenzudürfen.DesweiterenmöchteichmichbeiallenMitarbeiterndes

InstitutsfürGastroenterologie,HepatologieundInfektiologiebedanken.

Weiterhinmöchte ichmich bei allenMitarbeitern derHumboldt Research Group sowie

denDoktorandenundDiplomandenfürdiekollegialeZusammenarbeitbedanken.

MeinDankgiltauchdenMitarbeiternderTVADüsseldorfundEssenfürdiefortwährende

Hilfe. Ein ganz besonderer Dank gilt Konstanze Schättel für die vorbildliche Zucht der

MäusesowiedemständigenEntgegenkommen.

Den Mitarbeitern des Instituts für Zellbiologie sowie den ehemaligen Mitarbeitern der

AbteilungfürMolekulareParasitologieschuldeicheinriesigesDankeschön.Insbesondere

binichPietfürjedenoffenen,wennauchdesÖfterensehreinseitigen,Schlagabtauschund

dieständigeHilfsbereitschaftdankbar.

Den Korrekturlesern, Caro, Denis, Falk und Pauline möchte ich für den Fleiß und die

AusdauerbeimLesendesManuskriptsdanken.

Denis "Devil" Delic möchte ich besonders dafür danken, dass er mir die jugoslawische

(Tablic) Mentalität näher gebracht und mich in den letzten Jahren geformt hat. Vielen

DankfürdielangjährigeUnterstützung.

Ein ganz besonderer Dank gilt Pauline Funkner, die mich über die Jahre unermüdlich

unterstützt und stets aufgemuntert hat. Vielen Dank für den Zusammenhalt, die

HilfsbereitschaftunddieständigeGeduld.DANKE.

MeinenElterndankeichsehrfürihreUnterstützung,ihrVerständnisunddiesteteGeduld.

SiehabenmirerstdasStudiumunddiePromotionermöglicht.Danke.

DesweiterendankeichallenmeinenFreunden.

LEBENSLAUF 89

9. LEBENSLAUF

DerLebenslaufistinderOnlineversionausGründendesDatenschutznichtenthalten.

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E 90

ERKLÄRUNGEN 91

11. ERKLÄRUNGEN

Erklärung:

Hiermiterkläre ich,gem.§6Abs.2, fderPromotionsordnungderMath.‐Nat.‐Fakultäten

zurErlangungderDr.rer.nat.,dass ichdasArbeitsgebiet,demdasThema"DerEinfluss

von Toso bei der Effektorfunktion von Granulozyten“ zuzuordnen ist, in Forschung und

LehrevertreteunddenAntragvonAndreasMerykbefürworte.

Essen,den_____________________________________________________Prof.Dr.med.KarlLang

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, c und e der Promotionsordnung der Math.‐Nat.‐

Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation

selbständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel bedient

habeundallewörtlichoder inhaltlichübernommenenStellenals solchegekennzeichnet

habe.

Essen,den_______________________________________________ AndreasMeryk

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, d und f der Promotionsordnung der Math.‐Nat.‐

Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw.

Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe, dass diese Arbeit von

keineranderenFakultätabgelehntwordenist,unddassichdieDissertationnurindiesem

Verfahreneinreiche.

Essen,den__________________________________________AndreasMeryk

Documents

Der Einfluss von Toso bei der Effektorfunktion von · Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Institut für Immunologie der Universität Duisburg Essen