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10/97 Projektkennblatt
der
Deutschen Bundesstiftung Umwelt
Az 13040/03 Referat 32 Fördersumme 688.575 DM Antragstitel Förderschwerpunkt Biotechnologie: Verbund Industrielle Nutzung von
Biokatalysatoren: Entwicklung innovativer biotechnologischer Verfahren zur mikrobiellen Reduktion von Ketoverbindungen
Stichworte Schwerpunkt-Biotechnologie , nachwachsende Rohstoffe , Produkt , Verfahren Mikrobiologie , Verfahren
Laufzeit Projektbeginn Projektende Projektphase(n)
3 Jahre 05/00 bzw. 07/01 Mitte 2004 (teilweise)
Zwischenberichte jährlich
Bewilligungsempfänger Forschungszentrum Jülich GmbH Tel 02461/61-3296 Institut für Biotechnologie 2 Fax 02461/2118 Projektleitung Postfach Prof. Wandrey Bearbeiter 52425 Jülich Fr. Menges Kooperationspartner Rhein Biotech GmbH, Düsseldorf bzw. Jülich Fine Chemicals (JFC) Technische Universität München, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Institut für Enzymtechnologie
Zielsetzung und Anlaß des Vorhabens Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone sollen Ganzzell-Verfahren entwickelt werden, um die Darstellung enantiomerreiner Alkohole bis in den technischen Maßstab zu erreichen. Dazu sollen die Eigenschaften der Mikroorganismen zur Durchführung der Hydrierreaktion durch gentechnische Methoden verbessert werden (z.B. durch Coexpression von Reduktase und einem geeigneten Coenzym-regenerierendem Enzym). Als Cosubstrate sollen verschiedene gut metabolisierbare Verbindungen wie Glucose oder Formiat vergleichend geprüft werden. Rekombinante Produktionsstämme werden im Schüttelkolbenmaßstab charakterisiert und der mikrobielle Produktionsprozess im Labormaßstab optimiert.
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden Unter Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen sollen enantioselektive Reduktionen mit ganzen Zellen realisiert werden. Dabei soll neben der gewünschten Reduktase ein System zur Coenzym-Regenerierung in E. coli co-exprimiert werden. Nach Entwicklung neuartiger Syntheserouten werden prochirale Ketone für die enantioselektive Reduktion bereitgestellt und die Ganzzell Umsetzung mit einem biologischen System charakterisiert und kinetisch quantifiziert. Es sollen neuartige Methoden und Apparate entwickelt werden, um eine effiziente Kinetikbestimmung zu erreichen. Die Daten der Kinetikbestimmung können als Grundlage für eine anlagen- und prozesstechnische Entwicklung des fermentativen Verfahrens dienen. Unter Verwendung einer dispersen Substratzufuhr soll ein scale-up-fähiger Fermentationsprozess im Labormaßstab entwickelt werden. x
Deutsche Bundesstiftung Umwelt � An der Bornau 2 � 49090 Osnabrück � Tel 0541/9633-0 � Fax 0541/9633-190 � http://www.dbu.de
Entwicklung biotechnologischer Verfahren zur mikrobiellen Reduktion von
Ketoverbindungen
Kurztitel: Biohydrierung Förderkennzeichen: 13040/03
Projektpartner Institution Teilprojekte (TP)
Prof. Dr. Ch. Wandrey
Dr. M. Müller
Dr. R. Takors
Dipl.-Ing. M. Brik Ternbach
Institut für Biotechnologie (2)
Forschungszentrum Jülich GmbH
Projektleitung
TP 2: Bioorganische Chemie
TP 3: Makrokinetik
Prof. Dr. D. Weuster-Botz
Dipl.-Ing. M. Amidjojo
Lehrstuhl für
Bioverfahrenstechnik
Technische Universität München
TP 4: Verfahrenstechnik
PD Dr. W. Hummel
Dipl.-Chem. A. Weckbecker
Institut für Enzymtechnologie
Universität Düsseldorf
TP 1: Biologische Systeme
Dr. T. Daußmann Fa. JFC – Jülich Fine Chemicals
GmbH, Jülich
TP 5: Neuer Partner anstelle der
Fa. Rhein Biotech GmbH
ZUSAMMENFASSUNG
Im Mittelpunkt der 5 Teilprojekte zur Biohydrierung steht die Reduktion von 3,5-Dioxo-
hexansäure-tert-butylester (bzw. 4-Cl-Acetophenon als Referenzedukt) zu 5-Hydroxy-3-oxo-
hexansäurederivaten mit Hilfe geeigneter mikrobieller Systeme bis in den technischen
Maßstab. Im Rahmen der Stammkonstruktion wurde ein Produktionssystem entwickelt, das
die Gene der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus sp. zusammen mit einer
heterolog aus B. subtilis stammenden Glucosedehydrogenase (GDH) plasmid-codiert zur
‚künstlichen’ NADPH-Regenerierung co-exprimiert. Entsprechende Ganzzellsysteme wurden
hinsichtlich der Genanordnung auf dem Plasmid optimiert und vergleichend getestet. Ein
Ganzzellsystem wurde in wässrig-organischen Lösungsmitteln eingesetzt und quantitativ
bewertet. Im Teilprojekt ‚Bioorganische Chemie’ gelang die durch umfangreiche
Publikationen belegte regio- und enantioselektive Reduktion von 3,5-Di-ketohexansäureestern
zu nunmehr allen vier diastereomeren Diolen bis in den 100 g Maßstab. Daneben wurden
entsprechende Analysetechniken (GC-MS, HPLC und NMR) entwickelt und den
Projektpartnern zur Verfügung gestellt. Mehrere Methoden zur modellgestützten Fed-Batch
Versuchsplanung wurden im Teilprojekt ‚Makrokinetik ’ in die MATLAB/SIMULINK
Umgebung implementiert und experimentell validiert. Die sequenzielle Überprüfung der
Versuchsplanungstechniken konnte erfolgreich anhand eines L-Valin produzierenden C.
glutamicum Stamms durchgeführt werden. Dieser Stamm wurde eingesetzt, da zum Zeitpunkt
der expermentellen Übeprüfung noch kein geeignetes E. coli-Biotransformationssystem mit
Cofaktorregenerierung einsetzbar war. Im Teilprojekt ‚Verfahrenstechnik’ konnte mit
dispersiver Bereitstellung des schlecht wasserlöslichen 6-Cl-3,5-Dioxohexansäure-tert-
butylester im Rührkesselreaktor mit ruhenden Lactobacills kefir Zellen die Raum-Zeit-
Ausbeute um den Faktor 10 auf bis zu 7.5 mmol L-1 h-1 (3R,5S)-Dihydroxyhexanoat bei
einem Enantiomerenüberschuss von über 99 % und einer Ausbeute von 55% gesteigert
werden. Für das Referenzedukt 4-Cl-Acetophenon konnte durch Einsatz von Isopropanol und
Glukose als Cosubstrat und intermittierender Edukt-Zudosierung die spezifische
Produktbildung bei der asymmetrischen Reduktion um den Faktor 2.5 auf 6.3 mmol g-1 L.
kefir gesteigert werden. Über den Einsatz der 3-dimensionalen optischen Laser-Rück-
reflexionsmessung (3-D-ORM) zur Bestimmung von Tropfengrößen und –verteilungen in
Kombination mit einer off-line Bildanalyse konnten mittlere Tropfendurchmesser für beide
Edukte bestimmt werden. Die ermittelten Tropfendurchmesser zeigen, dass für die
untersuchten Biotransformationen eine ausreichende Stoffaustauschfläche zur Verfügung
gestellt werden kann, so dass keine Stofftransportlimitierung auftritt.Bedingt durch eine
strikte Umortientierung zukünftiger Geschäftsbereiche bei dem ehemaligen Kooperations-
partner Rhein Biotech GmbH, schied die Firma im vergangen Jahr aus dem laufenden Projekt
aus, weshalb im Anschluß die Firma Jülich Fine Chemicals, JFC, deren Rechte und
Pflichten für die Projektrestlaufzeit übernahm.
Durch die gemeinsame Bearbeitung des Projekts von Seiten der Organischen Chemie
(Vorstufen-Synthese), der Mikrobiologie/Genetik (Stammkonstruktion) und der
Verfahrenstechnik (Verfahrenstechnische und Makrokinetische Bearbeitung) konnte
beispielshaft gezeigt werden, dass es möglich ist, mit einem umwelt- und
resourcenschonenden biologischen Verfahren eine stereo- und regioselektive
Reduktionsreaktion (Synthese von 3,5-Dihydroxyhexansäurederivaten) in den technischen
Maßstab zu überführen und dabei auf üblicherweise eingesetzte Schwermetall-haltige
Katalysatoren zu verzichten.
ANLASS UND ZIELSETZUNG DES PROJEKTES
Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone sollen mikrobielle Verfahren bis in den
technischen Maßstab entwickelt werden (Biohydrierungen), die die Darstellung hoch
enantiomerenreiner Alkohole erreichen und dabei auf die bei chemisch-katalysierten
Reduktionen üblicherweise eingesetzten Schwermetall-haltigen Katalysatoren, organischen
Lösungsmitteln und drastischen Reaktionsbedingungen (Druck, Temperatur) verzichten
können. Die Synthese von 3,5-Dihydroxyhexansäurederivaten steht beispielhaft im
Mittelpunkt der Untersuchungen, da sie wichtige Intermediate bei der Produktion
synthetischer HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren (Pharmazeutika zur Senkung des
Blutcholesterins-Spiegels) darstellen und z.B. industriell im Pilotmaßstab in Gegenwart eines
Schwermetallkatalysators bei 100°C und 4 bar hydriert werden.
METHODEN, ERGEBNISSE UND DISKUSSION
TP 1: Biologische Systeme
Im Teilprojekts „Biologische Systeme zur Biohydrierung“ ist die Bereitstellung von
rekombinanten E. coli-Stämmen zur Durchführung enantioselektiver Reduktionen mit ganzen
Zellen bearbeitet worden. Dabei sollte neben der gewünschten Reduktase ein System zur
Coenzym-Regenerierung in E. coli coexprimiert werden.
Zielverbindung des Projekts ist 6-Chlor-5-hydroxy-3-oxo-hexansäure-tert-butylester, das
durch regio- und enantioselektive Reduktion von 6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-tert-butylester
gebildet werden soll. 5-Hydroxy-3-oxo-hexansäurederivate stellen wichtige chirale
Pharmazeutika dar; sie sind Intermediate bei der Produktion synthetischer HMG-CoA-
Reduktase-Inhibitoren. Wegen der Verfügbarkeit, der chemischen Stabilität und der besseren
Löslichkeit diente für die meisten Reaktionen die Reduktion von Acetophenon als
Modellreaktion. Beide Reaktionen, also die des Zielprodukts und die Umsetzung von
Acetophenon, werden durch eine (R)-spezifische Alkohol-Dehydrogenase (ADH) aus
Lactobacillus kefir katalysiert. In Vorversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die
Zielverbindung 6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-tert-butylester nur von diesem Enzym in
geeigneter Weise reduziert wird, andere Enzyme setzen diese Verbindung gar nicht um oder
produzieren das falsche Enantiomere.
Zur Durchführung von Ganzzellbiotransformationen soll zusätzlich zur NADP-abhängigen
ADH ein Cofaktor-regenerierendes Enzym coexprimiert werden. Zur NADPH-Regenerierung
stehen verschiedene enzymatische Systeme wie Glucose/Glucose-Dehydrogenase,
Gluconat/Gluconat-Dehydrogenase, Malat/Malat-Dehydrogenase oder Glucose-6-
Phosphat/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase zur Auswahl [1]. Das für die NADH-
Regnerierung verwendete Formiat/Formiat-Dehydrogenase-System ist für die NADPH-
Regenerierung nicht geeignet, da die Wildtyp-FDH kein NADP akzeptiert; ein NADP-
abhängiges Mutein, das aus der Literatur bekannt ist, steht leider nicht zur Verfügung.
Das System Glucose/Glucose-Dehydrogenase (GDH) weist einige Vorteile auf: So liegen die
spezifischen Aktivitäten von ADH und GDH in der gleichen Größenordnung (jeweils ca. 400
U/mg für die homogenen Enzyme), die Gensequenz der GDH ist Literatur-bekannt, das
Enzym ist stabil und das Substrat Glucose ist preiswert und führt, ebenso wie das
Oxidationsprodukt Gluconolacton, nicht zu störenden Nebenreaktionen bei
Ganzzellbiotransformationen.
Die Gene der ADH aus L. kefir sowie der GDH aus Bacillus subtilis wurden isoliert und in
unterschiedlicher Reihenfolge in einen Expressionsvektor kloniert [2]. Das Konstrukt mit dem
Plasmid „pAW-3“ enthält hinter der ribosomalen Bindungsstelle die ADH als erstes Gen und
im Anschluss an eine weitere ribosomale Bindungsstelle die GDH, während bei „pAW-4“ die
Reihenfolge der beiden Gene umgekehrt wurde. Nach Transformation in verschiedene E. coli-
Wirtsstämme wurden die rekombinanten Stämme unter Expressionsbedingungen (1 mM
IPTG, Induktion: 3 h bei 30°C) angezogen, aufgeschlossen und die Aktivität der ADH und
GDH im Rohextrakt bestimmt. Im Konstrukt pAW-3, das die ADH als erstes Gen enthält,
weist die ADH eine etwa dreimal so hohe Aktivität auf wie die GDH, während die
Verhältnisse im System pAW-4 mit der GDH als erstem Gen umgekehrt sind (Tab. 1.1).
Tab. 1.1: Vergleich der Konstrukte pAW-3 und pAW-4; Aktivitäten und Enzymverhältnis
(Die Enzymaktivitäten (Acetophenon-Reduktion mit NADPH und Glucose-Oxidation mit NADP in Standardassays) wurden in Rohextrakten nach Zellaufschluss gemessen; sie zeigen nur das maximal mögliche intrazelluläre Enzympotential auf). pAW-3 (ADH-GDH) pAW-4 (GDH-ADH)
Expressions-
stamm
Spez. Akt.
ADH
[U/mg]
Spez. Akt.
GDH
[U/mg]
GDH
ADH
[%]
Spez. Akt.
ADH
[U/mg]
Spez. Akt.
GDH
[U/mg]
ADH
GDH
[%]
Tuner(DE3) 40,6 11,2 27,5 9,1 32,9 27,7
BL21(DE3) 41,6 12,9 31,1 13,8 58,0 23,7
Origami(DE3) 37,7 12,4 32,9 5,3 17,3 30,6
Beide Konstrukte wurden für Ganzzell-Umsetzungen eingesetzt (Acetophenon zu (R)-
Phenylethanol), dabei zeigten sich überraschenenderweise deutlichere Unterschiede in der
Produktbildungsrate als auf Grund der o.a. Enzymaktivitäten zu erwarten war (Abb. 1.1). Nur
das Konstrukt p-AW-3 mit der hohen ADH-Aktivität zeigte eine gute, vollständige
Umsetzung des Ketons, während das andere Konstrukt nahezu keine Umsetzung ergab. Der
Grund für diese schlechte Umsetzung ist zur Zeit nicht klar, möglicherweise wird durch eine
sehr leistungsfähige Coenzym-Regenerierung ein hoher Spiegel an NADPH erzeugt; bekannt
ist, dass dieser dann die ADH hemmen würde. Diese Hypothese zeigt, dass es für die
Anwendung der Ganzzell-Umsetzungen mit Coenzym-abhängigen Enzymen erforderlich ist,
Informationen über die intrazellulären Konzentrationen der beteiligten Coenzyme zu
gewinnen.
Abb 1.1. Ganzzell-Umsetzung von Acetophenon zu (R)-Phenylethanol mit rekombinan-ten E.coli-Zellen (20 mM Acetophenon und 200 mM Glucose in TEA 50 mM, pH 7.5; Proben wurden mittels Gaschromatographie analysiert).
Eine relativ einfache Möglichkeit, die schlechte Wasserlöslichkeit der Keton-Substrate zu
umgehen, stellt die Anwendung eines wässrig-organischen Zweiphasensystems dar. Wir
haben am Beispiel der Acetophenon-Reduktion rekombinante E. coli-Zellen (pAW-3) in
verschiedenen Lösungsmittelsystemen bezüglich ihrer Umsatzrate verglichen (Abb. 1.2).
0
5
10
15
20
25
0 50 100 150 200 250 300 350
t [min]
c(R
-Ph
EtO
H)
[mM
]
BL21 pAW-4
BL21 pAW-3
Abb. 1.2: Umsetzungen mit rekombinanten E.coli-Zellen (mit pAW-3) in wässrig-organischen Zweiphasensystemen. (Reaktionsbedingungen: 50 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7,5), 1 mM MgCl2, 500 mM D-Glucose, 20 mM Acetophenon und 0,1 g Zellen (pAW-3; Feuchtmasse) in einem Endvolumen von 100 mL wurden mit 50 mL verschiedener organischer Lösungsmittel (diisopropyl ether, ethyl acetate, heptane, hexane, and hexane/MTBE (methyl-t-butyl ether) (1:1)) in einem 500 mL Reaktionsgefäß gemischt; die Proben wurden mittels Gaschromatographie analysiert. Aufgetragen sind auf 1 Gramm Zellfeuchtmasse bezogene Reaktionsgeschwindigkeiten (Umax), die sich aus Kinetikmessungen (GC-Analysen) der einzelnen Systeme ergeben haben (1 U = Bildung von 1 µMol Phenylethanol pro min))
Die Abbildung 1.2 zeigt, dass das Lösungsmittelsystem Hexan/MTBE gute Umsatzraten
aufweist, man erhält Phenylethanol-Bildungsraten von nahezu 300 µMol /min x g Zellen.
Die Arbeiten werden mit weiteren Konstrukten, die sich bezüglich der Coenzym-
Regenerierung unterscheiden, fortgesetzt. Es liegen dazu bereits ein System mit einer
Transhydrogenase, durch die NADH nutzbar gemacht werden kann und ein Malat-
Dehydrogenase-System vor, die in der vorab beschriebenen Weise vergleichend
charakterisiert werden.
TP 2: Bioorganische Chemie
Zielsetzung der Arbeiten im Bereich der Bioorganischen Chemie ist die Entwicklung von
Synthesen und die Bereitstellung von prochiralen Ketonen als Substrate für enantioselektive
0
50
100
150
200
250
300
organic solvent
Um
ax/g
cel
l wet
wei
gh
t
diisopropyl ether
ethyl acetate heptane hexanehexane/MTBE
Reduktionen mit Biokatalysatoren, sowie die Ausarbeitung und Bereitstellung geeigneter
analytischer Methoden. Ausreichende Mengen des Diketons (A) und das enantiomerenreine
Zielprodukt B wurden ebenso wie das analytische know-how den Kooperationspartnern zur
Verfügung gestellt [3].
Die von uns entwickelte Methode zur regio- und enantioselektiven Reduktion von 3,5-Di-
ketohexansäureestern (A) im batch-Verfahren mittels Lactobacillus brevis Alkoholdehydro-
genase [4] (LBADH) wurde bis in den 75g-Maßstab übertragen (bis zu 80% Ausbeute an
enantiomerenreinem B, R = tBu) [5]. Dabei konnten ttn für NADP(H) von bis zu 125 erreicht
werden. Es wird erwartet, dass dieser Wert durch die Verwendung von Ganzzell-Cofaktor-
regenerierungssystemen deutlich erhöht werden kann und somit die Produktivität einen auch
produktionstechnisch interessanten Wert erreicht. In Zusammenarbeit mit Prof. Jon Stewart,
University of Florida, wird zur Zeit untersucht, welche Oxidoreduktasen aus Bäckerhefe (BY)
für die enantioselektive Bildung des (R)-Enantiomers von B genutzt werden können [6]. Eine
Übertragung dieses enzymatischen Schrittes in eine definierte Ganzzellbiotransformation mit
einem heterologen Expressionssystem analog den von der Arbeitsgruppe um Dr. Hummel für
die zuvor genannte Reduktion wird einen Zugang zu enantiomerenreinem C ermöglichen.
OR
O O O
OR
OH OH O
OR
OH O O
OR
OH OH O
OR
OH OH O
OR
OH OH OOR
OH O O
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
LBADH
BYA
C
B
G
F
E
D
Die von uns eingeführte dynamische kinetische Racematspaltung durch regio- und stereo-
selektive Reduktion von in 2-Position substituierten 1,3-Diketonen [7, 8] am Beispiel eines
alkylierten 3,5-Dioxohexanoates wurde inzwischen von anderen Arbeitskreisen auf die Che-
mokatalyse übertragen [9]. Dieses Beispiel belegt eindrucksvoll, dass die Untersuchung
biokatalytischer Verfahren zu neuen Entwicklungen auch in der rein chemischen Synthese
Anstoß geben kann.
Me OtBu
O O O
Me OtBu
OH O O
Me Me
Me OtBu
O O O
Me
i
ee 99.2%, syn:anti 97:3
Der Einsatz der von uns generierten Bausteine in der Naturstoff- und Wirkstoffsynthese
wurde durch die in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dieter Enders, RWTH
Aachen (Förderung durch den SFB 380) durchgeführten Synthesen zu S-(+)-Argentilactone,
S-(-)-Goniothalamin und zweier Callystatin-Stereoisomeren nachhaltig belegt [10-12].
Insbesondere die erste vollständig auf enantioselektiven Syntheseschritten aufbauende
Synthese des Zytotoxikums Callystatin beleuchtet die Vorteile kombinierter
chemoenzymatischer Synthesestrategien.
TP 3: Makrokinetik
Ein wichtiger Schritt der verfahrenstechnischen Prozessentwicklung ist die quantitative
Beschreibung der mikrobiellen Reaktionskinetik, um darauf aufbauend, z.B. modellgestützt
eine Prozessoptimierung durchführen zu können. Hinsichtlich der Vielzahl möglicher
Produktionsstämme, sollte die makrokinetische Analyse möglichst effizient erfolgen, was
durch die Entwicklung und den Einsatz einer modelldiskriminierenden und/oder optimalen
Versuchsplanung für fed-batch Experimente realisiert werden soll. Dabei können z.B. die
Konzentration der Kohlenstoffquelle im Feed, die zeitlich variablen Feedraten, die Vorgabe
von Probennahmezeitpunkten und vieles mehr als Parameter der Versuchsplanung dienen.
Ziel der Versuchsplanung ist die Identifizierung eines
geeigneten makrokinetischen Modellierungsansatzes
für ein biologisches System innerhalb weniger,
sequentieller Experimente. Dabei wird insbesondere
die Ausgangssituation berücksichtigt, dass vor Beginn
der makrokinetischen Versuchsreihe oftmals nur
wenige Informationen – auch über grundlegende
Reaktionsmechanismen – in dem ‚neuen’
Produktionsstamm vorhanden sind. Dies hat die
anfängliche Berücksichtigung einer Vielzahl
‚konkurrierender Modellansätze’ zur Folge, die durch
die modelldiskriminierende Versuchsplanung auf das
‚wahre’ Modell reduziert werden sollen (siehe
Abbildung 3.1).
Neben dem zunächst favorisierten modell-
diskriminierenden Versuchsplanungsansatz von Box
und Hill [13] wurden andere Versuchs-
planungsansätze von Hunter und Reiner [14], Buzzi-
Ferraris et al. [15] und Chen und Asprey [16] in der
Entwicklungsumgebung von MATLAB/SIMULINK
implementiert und an die experimentellen
Rahmenbedingungen angepasst. Während z.B. der Box und Hill Ansatz die abnehmende
Differenz der Modellsystem-Entropie in aufeinander folgenden Experimenten als Kriterium
für die modelldiskriminierende Versuchsplanung verwendet, wurde der klassische Hunter und
Reiner –Ansatz durch Hinzunahme der zeitlichen Varianz der Probennahme-Zeitpunkte zur
Versuchsplanung signifikant erweitert. Die meisten der oben genannten
Versuchsplanungskriterien verwenden zusätzlich die Covarianz der Parameterschätzung in
der Fisher-Informationsmatrix als Basis.
Nachdem erste Simulationsrechnungen erfolgreich verliefen, wurde die
Versuchsplanungstechnik experimentell getestet. Da zum Zeitpunkt der experimentellen
Überprüfung das E. coli basierte Produktionssystem mit Co-Faktorregenerierung noch nicht
einsatzbereit war, wurde alternativ ein rekombinanter, L-Valin produzierender C. glutatmicum
calculation of model probabilities
model 1 model n...
calculation of model probabilities
model 1 model n...
experiment 1
parameter regression'true' model
experimental design for model discrimination
experiment i
Experiment j
experimental design for parameter estimation
model recognised?
parameter knownexact enough?
Yes
No
YesNo
start model development
model
parameter regression
model 1 model n...
parameter regression
model 1 model n...
parameter regression
model 1 model n...
parameter regression
model 1 model n...
i=i+1
j=j+1
configuration:chose models 1..n, amount of measurements,
calculation of model probabilities
model 1 model n...
calculation of model probabilities
model 1 model n...
Abbildung 3.1: Schematisches Flussdiagramm
der experimentellen Versuchsplanung
Stamm als Testsystem eingesetzt (aus dem Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum
Jülich GmbH). Dieser Stamm war Pantothensäure und L-Isoleucin-auxotroph. .
Ausgehend von dem biologischen Verständnis über die L-Valin-Produktion in C. glutamicum
wurden vier konkurrierende Modellansätze formuliert, die die Konzentrationen an Biomasse
(cx), Glucose (cS1), dem Co-Substrat 2 (Isoleucin und Pantothensäure) (cS2) und dem Produkt
L-Valin (cP�) berücksichtigten. Im einzelnen unterschieden sich die Modelle wie folgt:
• Modell (1): Wachstumslimitierung durch eines der beiden Substrate, Maintenance-
bedarf basierend auf Glucose, Glucose-abhängige L-Valin Synthese (ohne Einfluss
durch Substrat 2)
• Modell (2): analog zu Model (1), jedoch limitiert die Verfügbarkeit von Substrat 2 die
Glucoseaufnahme. Hohe Konzentrationen an Substrat 2 können die Produktsynthese
inhibieren.
• Modell (3): Inhibierung des Wachstums durch L-Valin, keine Wachtumslimitierung
durch Substrat 2, Inhibierung der Produktbildung durch Substrat 2.
• Modell (4): Wachstumsabhängigkeit von beiden Substraten, L-Valin Synthese ist
wachstumsgekoppelt, Produktinhibierung durch L-Valin.
Wie in Abb. 3.2 dargestellt, erlauben alle Modelle eine akzeptable Wiedergabe der
experimentellen Daten, was durch vergleichsweise geringe χ² Werte von 1,1 (Modell 3) bis
2,1 (Modell 1) belegt ist. Da eine eindeutige Modellidentifizierung jedoch noch nicht möglich
war, wurde ein modelldiskriminierendes Experiment gemäß der nachfolgenden Abb. 3.3
geplant. Der Versuchsplan berücksichtigte die Startkonzentrationen beider Substrate und
deren zeitlich variablen Feed (Obergrenze: 15 ml/h) wie angegeben. Um eine einfache
Übersetzung der Feed-Trajektorien zu erreichen, wurde ein jeweils für 6 Stunden konstanter
Feed angenommen. Die maximale Dauer des Experimentes war auf 48 h begrenzt, was einer 8
fachen potenziellen Feedänderung entspricht. Alle 2 Stunden war eine Probennahme
vorgesehen.
Abbildung 3.2: Das Ergebnis der Modellierung von Fermentationen im Labormaßstab mit dem L-Valin
produzierenden Stamm C. glutamicum ist dargestellt. Die gemessenen Konzentrationen an Biomasse (CX,
[OD600], +), Glucose (CS1, [g/l], o) und Valin (CP, [mM], *) sind angegeben. Die Modellaussagen werden durch
entsprechende Linien (durchgezogen, gestrichelt und gepunktet) gezeigt.
Abbildung 3.3: Ergebnis der Versuchsplanung. Die geplanten (simulierten) Konzentrationen an Glucose und dem zweiten
Substrat waren 27 g/L bzw. 0 mM. Das linke Diagramm zeigt die geplanten Feed-Profile von Glucose (500 g/L,
durchgezogene Linie) und dem zweiten Substrat (2.9 g/L L-Isoleucin and 4.7 mg/L Panthotensäure, gestrichelte Linie).
Auf der rechten Seite sind die Modellvorhersagen für Biomasse (CX, durchgezogene Linie), Glucose (CS1, gestrichelte
Linie) und L-Valin (CP, gepunktete Linie) dargestellt. Zur Verbesserung der Übersichtlichkeit sind nur die Modelle 3 und
4 dargestellt..
Ein entsprechendes Experiment wurde durchgeführt. Dabei konnten die zuvor berechneten
Feedraten weitgehend eingehalten werden. Allerdings zeigte sich auch, dass ein manuelles
Eingreifen im Versuchsablauf durch den Experimentator teilweise notwendig war, um z.B.
eine zu starke Limitierung des Zellwachstums zu vermeiden. Dieser Fall tritt typischerweise
dann auf, wenn aufgrund einer noch ungenauen Modellidentifizierung die Modellaussage für
die Substrataufnahme zu geringe Werte prognostizierte. Ausserdem wurde festgestellt, dass
die diskriminierend geplanten fed-batch Experimente oftmals neue Systemeigenschaften
offenbaren, die in den ursprünglichen Modellansätzen nicht oder nicht ausreichend
berücksichtigt werden konnten. In Folge dessen kam es zu Modellerweiterungen und damit
verbunden zu weiteren fed-batch Experimenten.
Im folgenden ist das – aufgrund der Güte der Modellaussagegenauigkeit – ‚beste’, nicht-
strukturierte Modell für die Valin-Produktion mit C. glutamicum angegeben.
���������
�
���������
�
�
−+
−+
+=
+=
+++
=
+=+
=
=
)3SX
3S(K
�*)3SX
3S(X*
3SK
3SX**�
rrr
k*2S2SK)
Ki
P(1
2SX**�
rrr1SK
1SX**�
r
min
intminint
int3Sm,
int3Smax,intminint
3Sm,
3Smax,
int3Sx,3Sx,3Sx,
int2rxsint
2Sm,P2,rxs
2Smax,
int2Sx,2Sx,2Sx,
1Sm,
1Smax,1Sx,
ext
ext
xr
1PS
P1S
1XS
X1S Y
rX*m
Y
rr
−−−−=
2
22
XS
extXSS Y
rr =
XX
SSmrr SSS *
3*2* int
intint22int2 −−=
3
3,333
))((
XS
XSXrSextXSS Y
rrfrr
−−=
Xmrr rSSSS *)3SX
3S(* int3intmin,
intint33int3 −−−=
����
�
����
�
�
+=
−+++
=
=
int3int
int3maxint
3
1pS3
11
int2,
2
1
1max
1
1pS1
X
3S
*X
3S
*r
))(*)1(1
*1*((*r
min
int
rpS
S
XS
PS
XXSrPS
Srp
XS
rpS
S
XS
PS
p
KY
Y
rrf
KiKS
XS
Y
Y
rπ
π
Xmrr rSSSS *)3SX
3S(* int3intmin,
intint33int3 −−−=
Größe Wert Beschreibung Einheit
rX Wachstumsrate OD/h
rX,S1 S1 limitierte Wachstumsrate OD/h
rX,S2 S2 limitierte Wachstumsrate OD/h
rX,S3 S3 limitierte Wachstumsrate OD/h
rS1 S1 Aufnahmerate g/L.h
rS2 S2 Aufnahmerate mM/h
rS2int S2int Änderungsrate, mM/h
rS3 S3 Aufnahmerate µM/h
rS3int S3int Änderungsrate µM/h
rP P Produktionsrate mM/h
rPS1 S1 limitierte Produktionsrate mM/h
rPS3 S3 limitierte Produktionsrate mM/h
X Biomassekonzentration OD600
S1 Glukosekonzentration g/L
S2 Isoleucinkonzentration mM
S3 Pantothenatkonzentration µM
S2int Intrazellulare Isoleucine Konzentration bezogen auf das ganze
Reaktorvolumen
mM
S3int Intrazellulare Pantothenatkonzentration bezogen auf das ganze
Reaktorvolumen
µM
P Valinkonzentration mM
µmaxS1 0,40 Biomasse-spezifische maximale Wachstumsrate auf S1 OD.L/g.h
KmS1 0,0001 Michaelis-Menten Konstante für Wachstum auf S1 g/L
µmaxS2 0,10 Biomasse-spezifische maximale Wachstumsrate auf S2 OD/mM.h
KmS2 1,7 Michaelis-Menten Konstante für Wachstum auf S2 mM
Ki rxS2,P 67 Inhibierungskonstante für Inhibierung von Wachstum auf S2 durch
P
mM
krxs2int 76 Wachstumskonstante für Wachstum auf S2int OD/mM.h
µmaxS3 2,8 Biomasse-spezifische maximale Wachstumsrate auf S3 OD/µM.h
KmS3 12 Michaelis-Menten Konstante für Wachstum auf S3 µM
µmaxS3int 6,0 Biomasse-spezifische maximale Wachstumsrate auf S3int OD/µM.h
S3intmin 0,010 minimale intrazellulare S3 Konzentration für Wachstum µM/OD
KmS3int 0,50 Michaelis-Menten Konstante für Wachstum auf intrazellulares S3 µM
YXS1 2,4 Ausbeute von X aus S1 OD.L/g
mS1 0,016 Konstante für den S1 Verbrauch für den Erhaltungsstoffwechsel g/L.h.OD
YPS1 3,8 Ausbeute von P aus S1 mmol/g
YXS2 5,0 Ausbeute von X aus extrazellulares S2 OD/mmol
mS2int 2,9 Konstante für den S2int Verbrauch L/µmol.h
frS3 0,057 Fraktion der nicht direkt für Wachstum benötigten S3 Aufnahme -
die trotzdem aufgenommen wird
YXS3 6,7 Ausbeute von X aus extrazellulares S3 OD/µM
mS3int 0,003 Konstante für den S3int Verbrauch 1/h �
maxS1 0,41 Biomasse spezifische maximale P Produktionsrate auf S1 mM/h
KrPS1 14 S1 Bindungskonstante für P Produktion g/l
Ki rPS2int 0,0011 Inhibierungskonstante für Inhibierung von P Produktion auf S1
durch S2int
mM
frPS1 0,086 Fraktion der nicht direkt für Wachstum benötigte S1 Aufnahme die
statt dessen für P Produktion verwendet wird
-
�
maxS3int 0,13 Biomasse spezifische maximale P Produktionsrate auf S3int mM/h
KrPS3int 0,050 S3int Bindungskonstante für P Produktion µM
Mit Hilfe dieses Modells gelang die sehr genaue Anpassung an verschiedene batch- bzw. fed-
batch Experimente wie in der nachfolgenden Abbildung 3.4 dargestellt. Damit konnte
erfolgreich die Technik der modelldiskriminierenden Versuchsplanung nicht nur theoretisch
erarbeitet, sondern auch software-technisch umgesetzt und experimentell getestet werden.
TP 4: Verfahrenstechnik
Zielsetzung war die Entwicklung einer allgemein nutzbaren Verfahrenstechnik zur
Biohydrierung mit ganzen Zellen. Dabei wurde eine mikrodisperse Bereitstellung der schlecht
wasserlöslichen Edukte im Biotransformationsreaktor angestrebt, um die Verwendung einer
0 10 200
20
40
60
80
0 20 40 600
50
100
150
200
250
300
time [h]
X [
OD
], G
lc[g
/l],
Val [
mM
]
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Abbildung3.4: Modellaussagen des oben skizzierten kinetischen Modells zur L-Valin Produktion mir C.
glutamicum. x (blau): Biomassekonzentration (OD600); * (grün): Glucose-Konzentrationen; + (rot): L-Valin-
Konzentration.
zweiten organischen Lösungsmittelphase zu vermeiden. Zur Erzeugung einer hohen
Stoffaustauschfläche zwischen Eduktphase und wässrigem Reaktionsmedium wurde das in
einem gut wasserlöslichem Cosolvenz gelöste Edukt in den Bioreaktor injiziert. Aufgrund der
sofortigen Vermischung des Cosolvenz (Isopropanol) in der wässrigen Phase können dadurch
sehr feine Edukt-Tropfen in-situ erzeugt werden.
Zur Analyse von Edukten und chiralen Produkten wurde eine geeignete GC-Methode
etabliert. Zur Erfassung der Aktivität der Bioakatalysatoren wurden die Enzymaktivitäten der
Alkoholdehydrogenase und der Cofaktor-Regenerierungsenzyme gemessen. Weitere
Informationen über den Prozess konnten über die Bestimmung von Metabolit-
Konzentrationen (Cosubstrat und Nebenprodukte) gewonnen werden. Für die
verfahrenstechnische Untersuchungen zur mikrodispersiven Eduktbereitstellung wurde zur in-
line Bestimmung der Edukt-Tropfendurchmesser im Bioreaktor (KLF2000, Bioengineering,
Schweiz) erstmals die 3 dimensionale optische Laser-Rückreflexionsmessung (3-D-ORM)
etabliert. Damit stehen die aktuelle Tropfengröße der dispersen Phase und
Tropfengößenverteilung on-line zur Verfügung (siehe Abb. 4.1).
Cosubstrat
N2
Abluft
Mikrodispersive Eduktzugabe (Edukt in Cosolvenz)
3-D-ORM
Zellen und mikrodisperses
Edukt
Abbildung 4.1: Prinzipskizze der mikrodispersiven Biohydrierung (Cosubstrat: Glucose; Cosolvenz:
Isopropanol; 3-D-ORM: 3-dimensionale optische Laser-Reflexionsmessung).
Mit Hilfe reaktionstechnischer Untersuchungen im Parallelansatz konnten geeignete
Reaktionsbedingungen zur asymmetrischen Reduktion von 6-Cl-3,5-Dioxo-Hexansäure-tert-
Butylester zum 6-Cl-(3R,5S)-3,5-dihydroxyhexanoate und des Referenzedukts 4-Cl-
Acetophenon zu (R)-1-(4-Chlorophenyl)-Ethanol mit ruhenden Lactobacillus kefir-Zellen
ermittelt werden. Als erster Schritt zur Maßstabsvergrößerung in einen 2 L-Rührkesselreaktor
wurden die Biotransformationen in gerührten Systemen mit definiertem Leistungseintrag
durchgeführt.
In gerührten Systemen (20–200 mL Reaktionsvolumen) wurden für 6-Cl-3,5-Dioxo-
Hexansäure-tert-Butylester folgende optimale Umsetzungsbedingungen ermittelt: Temperatur
22°C, Kalium-Phosphat-Puffer pH 6.5 (0.2 M), 0.2 g L-1 MgCl2, Ausschluss von Sauerstoff,
Glukose als Cosubstrat. Durch Einhalten der oben genannten Reaktionsbedingungen und
einer geeigneten Edukt-Zudosierungsstrategie kann die Nebenproduktbildung durch Zerfall
des Edukts minimiert werden. Mit 50 g L-1 L. kefir konnte somit die Raum-Zeit-Ausbeute um
den Faktor 10 auf bis zu 7.5 mmol L-1 h-1 (3R,5S)-Dihydroxyhexanoat gesteigert werden,
dieses bei einer Ausbeute von 55% und einem de> 99%. Zur Zeit erfolgt die weitere
Optimierung der Edukt-Zudosierung, um noch höhere Ausbeuten bei gleichbleibend hohem
Enantiomerenüberschuss und möglichst vollständigem Umsatz zum gewünschten (3R,5S)-
Dihydroxyhexanoat zu erreichen.
Bei der Reduktion von 4-Cl-Acetophenon mit L. kefir konnte eine irreversible Inhibierung bei
hohen (R)-1-(4-Chlorophenyl)-Ethanol-Konzentrationen festgestellt werden, wenn Glukose
als alleiniges Cosubstrat eingesetzt wird. So konnte beispielsweise bei der Umsetzung von
125 mM 4-Cl-Acetophenon mit 50 g L-1 L. kefir zwar eine Raum-Zeit-Ausbeute von 62.5
mmol L-1 h-1, jedoch nur ein Umsatz von 50 % nach 1 h erreicht werden (Temperatur 30°C,
Kalium-Phosphat-Puffer pH 6.5 (0.2 M), 0.2 g L-1 MgCl2, Ausschluss von Sauerstoff). Durch
den Einsatz von 30% v/v Isopropanol als zweites Cosubstrat in Kombination mit Glukose
konnte der Umsatz für die gleiche Zellkonzentration und 150 mM 4-Cl-Acetophenon auf 88
% (nach 4 h) gesteigert werden (spezifische Produktbildung 3 mmol g-1, ee 96.6%). Durch
eine intermittierende Zugabe von 4-Cl-Acetophenon und Isopropanol kann die zellspezifische
Produktbildung nochmals auf 6.3 mmol g-1 gesteigert werden, jedoch bei Verringerung der
Ausbeute auf 70% und des Enantiomerenüberschusses auf 94.5% (Abb. 4.2) [17].
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Abbildung 4.2: Reaktionstechnische Untersuchungen zur Biohydrierung von 4-Cl-Acetophenon mit
Lactobacillus kefir
Mit Hilfe der 3 dimensionalen optischen Laser-Rückreflexionsmessung (3-D-ORM) in
Kombination mit einer off-line Bildanalyse der Proben konnte bei 5 g L-1 L. kefir
Biotrockenmasse ein mittlerer Tropfendurchmesser d32=11 µm für 6-Cl-3,5-Dioxo-
Hexansäure-tert-Butylester und d32=14 µm für 4-Cl-Acetophenon bestimmt werden
(Leistungseintrag von 4 kW m-3). Damit ist eine ausreichende Stoffaustauschfläche bei den
untersuchten Biotransformationen mit L. kefir gewährleistet. In 2-Phasen-Systemen
Edukt/Puffer ohne Zellen sind die Tropfen dagegen bei gleichem Leistungseintrag um den
Faktor 3.5 größer (d32 4-Cl-Acetophenon = 49 µm). Dieser Wert entspricht in etwa den mit
bekannten Korrelationsbeziehungen der Gleichgewichtstropfendurchmesser beim
Dispergieren im Rührkesselreaktor kalkulierten Durchmessern von d32 ~ 39 µm (4-Cl-
Acetophenon) und d32 ~ 36 µm (6-Cl-3,5-Dioxo-Hexansäure-tert-Butylester).
Einen Prozessverlauf für einen Ansatz mit intermittierender 6-Cl-3,5-Dioxo-Hexansäure-tert-
Butylester-Zudosierung im Rührkesselreaktor ist in Abb. 4.3 gezeigt; man erreicht unter
diesen Bedingungen ca. 60% Dihydroxy-Produkt bei Bildung von ca. 40% Nebenprodukt
(Abb. 43).
0
20
40
60
80
100
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 20,0
Zeit [h]
Kon
zen
trat
ion
[mM
]
Substrat Furanon Monohydroxy.Dihydroxy. Nebenprodukte
Abbildung 4.3: Prozessverlauf eines Ansatzes mit intermittierender 6-Cl-3,5-Dioxo-Hexansäure-tert-
Butylester-Zudosierung im Rührkesselreaktor (50 g L-1 L. kefir, 0.2 M KPi-Puffer, pH 6.5, 22°C)
TP 5: Jülich Fine Chemicals
Mit Wirkung zum 01.07.2002 hat die Firma JFC – Jülich Fine Chemicals GmbH die Rechte
und Pflichten der Fa. Rhein Biotech GmbH in dem oben genannten Projekt übernommen.
Zunächst stand zur Einarbeitung in die Themenstellung die Sichtung der Antragsunterlagen,
der Aufgabenverteilung zwischen den Partnern und der bisherigen Ergebnisse im
Vordergrund. Darüber hinaus wurde die Realisierbarkeit der im Projekt erarbeiteten
Techniken mit den technischen Möglichkeiten der Firma gegenübergestellt. Prinzipiell ist JFC
in der Lage, Biomasse zur Ganzzellbiotransformation im größeren Maßstab (Kg-Mengen)
bereit zu stellen. Speziell beim Down Stream Processing der hergestellten 5-Hydroxy-3-oxo-
hexansäurederivate kann JFC aufgrund des vorhandenen Know-hows und entsprechender
Gerätetechnologie einen Beitrag leisten. In den Labors der Firma werden derzeit eine Reihe
von chiralen Alkoholen aus Biokatalyse-Verfahren extraktiv und destillativ im kg-Maßstab
aufgearbeitet. Dabei kommt ein kontinuierlich betriebener Mischabsetzer mit hoher
Extraktionseffizienz zum Einsatz.
Die Firma konnte in erster Linie dem Projektpartner an der TU München bei den Arbeiten zu
TP 4 beratend zur Seite stehen. Es wurden hier speziell Erfahrungen bei den isolierten
Dehydrogenase-Systemen mit den L. kefir-Ansätzen verglichen, sowie die bestehenden
Techniken zur Ganzzellbiotransformation mit L. kefir für die Herstellung chiraler (R,R)-Diole
eingebracht und diskuiert.
SOLL-/ISTVERGLEICH
Soll Ist
TP 1 - Entwicklung eines Ganzzell-Systems mit künstlicher NADPH-Regenerierung durch z.B. Glucose Dehydrogenase (GDH) und anderen Dehydrogenasen; - Coexpression von ADH und einem Regenerierungs-Enzym; - Bewertung neuer Ganzzell-System
-GDH Gen aus B.subtilis isoliert und kloniert - ADH Gen aus L. kefir isoliert und kloniert - Rekombinantes Ganzzell-System (E. coli) mit exprimierbaren ADH- und GDH-Genen konstruiert - 2 verschiedene Coexpressions-Systeme entwickelt und in Ganzzellbiotransformationen getestet - Ganzzell-Biotransformation in wässrig-organischen Zweiphasen-Systemen durchgeführt und vergleichend quantitativ bewertet - Weitere Gene für die Regenerierung von NADPH isoliert und kloniert
TP 2 - Substratsynthese
- Produktcharakterisierung
- > 75 g Substrat hergestellt
- Syntheserouten zu allen vier diastereomeren Diolen mit entsprechender Analytik entwickelt
- Übertragung der Ansätze der regio- und enantioselektiven Reduktion auf andere Arbeitskreise der Chemokatalyse erfolgt
TP 3 - Versuchsplanungstechnik für fed-batch
- Versuchsplanungstechnik in MATLAB/SIMULINK realisiert
- Modellidentifizierung und –diskriminierung anhand von Fermentationsdaten mit C. glutamicum erfolgt (da E. coli System noch nicht einsetzbar)
- experimentelle Überprüfung der Versuchplanung wird aktuell durchgeführt
TP 4 - Verfahrenstechnische Untersuchungen zur Biohydrierung mit intermittierender Eduktzugabe (6-Cl-3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester und 4-Cl- Acetophenon)
- Maßstabsvergrößerung
- Biohydrierung von 6-Cl-3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester: Raum-Zeit-Ausbeute im Rührkessel-Reaktor um Faktor 10 gesteigert auf 7.5 mmol L-1 h-1 für (3R, 5S)-Dihydroxyhexanoat (50 g L-1 L. kefir, Ausbeute 55%, de > 99%).
- Biohydrierung von 4-Cl-Acetophenon: spezifische Produktbildung um Faktor 2.5 auf 6.3 mmol g-1 für (R)-1-(4-Chlorphenyl)-Ethanol gesteigert (Ausbeute 70%, ee 94.5%), mit Glukose und Isopropanol als Cosubstrat
- Vollständige verfahrenstechnische Charakterisierung im 2 L Rührkesselreaktor unter Zuhilfenahme einer in-situ Stoffaustauschflächenbestimmung (3 dimensionale optische Laser-Rückreflexionsmessung 3-D-ORM zur Messung der Tropfengrößen (-verteilung) in Kombination mit einer Bildanalyse).
TP 5 - halbtechnische Realisierung - Fa. JFC ist kurzfristig nach Ausscheiden von Rhein Biotech GmbH in das Projekt aufgenommen worden
- technische Möglichkeiten bei JFC werden zur Zeit evaluiert und diskutiert
- Produktherstellung durch Ganzzellbiotransformation und Isolierung im kg-Maßstab ist bereits mit alternativen Produkten erfolgreich durchgeführt worden (siehe z.B. (2R,5R)-2,5-Hexandiol)
Die Ergebnisse dieses Projekts sind in mehreren aktuellen Präsentationen (Posterpräsentation
BIOCAT 2002 [18], Vortrag [17] und Poster auf der Dechema Jahrestagung 2003 [19],
Vortrag „Int. Symp. Math. Modelling“ [20] und TRANSKRIPT-Beitrag [21])
zusammenfassend dargestellt.
References
1. Weckbecker, A., Hummel, W., Enzyme Microb. Technol. (submitted), 2004.
2. Weckbecker, A., Hummel, W., Meth. Biotechnol., Humana Press (in press). 2004.
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4. Wolberg, M., Hummel, W. Wandrey, C. Müller, M., Angew. Chem., 2000. 39 (23): p.
4306.
5. Wolberg, M., Bode, S., Feldmann, R., Müller, M., Advan. Syn. Catal. (in Vorber.).
6. Stewart, J., Wolberg, M., Müller, M., unveröffentlicht.
7. Wolberg, M., Ji, A.G., Hummel, W., Müller, M., Synthesis, 2001(6): p. 937-942.
8. Ji, A.G., Wolberg, M., Hummel, W., Wandrey, C., Müller, M., Chem. Comm.,
2001(01): p. 57-58.
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4272-4284.
11. Job, A., Wolberg, M., Müller, M., Enders, D., Synlett 11, 2001: p. 1796-1798.
12. Vicario, J.L., Job, A., Wolberg, M., Müller, M., Enders, D., Org. Lett., 2002. 4: p.
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16. Chen, B.H., Asprey, R., Ind. & Eng. Chem. Res., 2003. 41: p. 1379-1390.
17. Amidjojo, M., Lindberg, P., Jones, R., Link, H., Weuster-Botz, D., Poster Dechema
Jahrestagung der Biotechnologen 2003, 2.4.2003-4.4.2003, Garching, 2003.
18. Müller, M., Takors, R., Hummel, W., Amidjojo, M., Weuster-Botz, D., Wandrey, C.,
Poster biocat 2002; 28.7.2002-31.7.2002, Hamburg, 2002.
19. Brik Ternbach, M.A., Wandrey, C., Takors, R., DECHEMA-Jahrestagung der
Biotechnologen, Garching, (2.-4.4.2003), 2003.
20. Brik Ternbach, M.A., Wandrey, C., Takors, R., 4th International Symposium on
Mathematical Modelling (MATHMOD 4), Wien, (5.-7.2.2003), 2003.
21. Weckbecker, A., Hummel, W., Amidjojo, M., Weuster-Botz, D., Brik Ternbach, M.,
Takors, R., Müller, M., Wandrey, C., Transkript; Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse,
2003, S. 100-104, 2003.
ZUSÄTZLICHE ANGABEN ZUM PROJEKTVERLAUF
(Abgeschlossene) Dissertationen
1) M. Amidjojo, ;Verfahrenstechnik der mikrobiellen Biohydrierung’ (Arbeitstitel,
laufende Dissertation)
2) M.A. Brik Ternbach ‚Development and Application of a Model-Discriminating
Experimental Design Strategy for Microbial Fed-batch Processes’ (Arbeitstitel,
laufende Dissertation)
3) A. Weckbecker “Entwicklung von Ganzzell-Biokatalysatoren zur Reduktion von
Ketoverbindungen” (Arbeitstitel, laufende Dissertation )
Angemeldete/Erteilte Patente
-
Begutachtete/eingereichte/geplante Publikationen
M.A. Brik Ternbach, Wandrey, C., Takors, R., 4th International Symposium on Mathematical
Modelling (MATHMOD 4), Wien, (5.-7.2.2003), 2003 (Proceedings)
M.A. Brik Ternbach, C. Bollman, C. Wandrey, R. Takors (2004) Application of Model
Discriminating Experimental designs for Modeling and Process Development of a
Fermentative fed-batch L-Valine Production Process (submitted)
A. Weckbecker, Hummel, W., Enzyme Microb. Technol. (submitted), 2004.
A. Weckbecker, Hummel, W., Meth. Biotechnol., Humana Press (in press). 2004.
A. Weckbecker, Schneider, F. Hummel, W., Appl. Microbiol. Biotechnol. (submitted), 2004
M. Wolberg, Ji, A.G., Hummel, W., Müller, M., Synthesis, 2001(6): p. 937-942.
M. Wolberg, S. Bode, R. Feldmann, M. Müller, M. Villela, Large scale synthesis of (3R,5S)-
tert-butyl 6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate and it’s application in the synthesis of a building
block of atorvastatin,Adv. Synth. Catal. (in Vorbereitung).
M. Wolberg, I. A. Kaluzna, M. Müller, J. Stewart, Bakers yeast reduction of tert-butyl 6-
chloro-3,5-dihydroxyhexanoate, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, (submitted).
M. Wolberg, Hummel, W., Müller, M., Chem. Eur. J., 2001. 7(21): p. 4562-4571.
M. Wolberg, Hummel, W. Wandrey, C. Müller, M., Angew. Chem., 2000. 39 (23): p. 4306.
Sonstige Publikationen
M. Amidjojo, Lindberg, P., Jones, R., Link, H., Weuster-Botz, D., Poster - Dechema
Jahrestagung der Biotechnologen 2003, 2.4.2003-4.4.2003, Garching, 2003.
M. Amidjojo; Lindberg, P.; Nowak, A.; Mehler, S.;Hummel, W.; Müller, M.; Weuster-Botz,
D.; Vortrag - Bioperspectives 2004: Process design for the microbial reduction of
hydrophobic keto compounds, 4.-6.5.2004, Wiesbaden 2004.
M. Amidjojo, Nowak, A.; Franco-Lara, E.; Link, H.; Weuster-Botz, D.; Poster – GVC
Jahrestagung 2004 (submitted): Process design for the asymmetric synthesis of tert-butyl-6-
chloro-(3R,5S)-dihydroxyhexanoate, 12.-14.10.2004, Karlsruhe 2004.
M.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Application of Experimental Designs for
Modelling of a Fermentative L-Valine Production Process by Corynebacterium glutamicum,
4th International Symposium on Mathematical Modelling (MATHMOD 4), Wien, 05.-07.02.
M.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Model Based Process Development of a
Fermentative L-Valine Production Process Using Corynebacterium glutamicum, 21
DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Garching, 02.-04.04.
M.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2004) Modelldiskriminierende
Versuchsplanung in fed-btach Prozessen – Beispiel: L-Valinproduktion mit Corynebacterium
glutamicum, DECHEMA/GVC Vortrags- und Diskussionstagung „Simultane und integrierte
Bioprozessentwicklung“, Eisenach 17.-19.05.
M. Müller, Highly Regioselective and Enantioselective Reduction of 3,5-Dioxocarboxylates,
CHIRAL Europe 2001, London, 11.-12.10.2001 (Vortrag).
M. Müller, Neuere Aspekte biokatalytischer Ketonreduktion, Universität Dortmund,
29.10.2002 (Vortrag).
M. Müller, Takors, R., Hummel, W., Amidjojo, M., Weuster-Botz, D., Wandrey, C., Poster
biocat 2002; 28.7.2002-31.7.2002, Hamburg, 2002.
M. Müller, M. Wolberg, T. Schubert, W. Hummel, Enzyme-catalyzed regio- and
enantioselective ketone reductions, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,
Volume Title: Technology Transfer in Biotechnology: From Lab to Industry to Production,
Springer Verlag, Heidelberg (in press)
A. Weckbecker, Müller., Hummel, W., Poster biocat 2002; 28. - 31.7.2002; Hamburg, 2002
A. Weckbecker, Hummel, W., Amidjojo, M., Weuster-Botz, D., Brik Ternbach, M., Takors,
R., Müller, M., Wandrey, C., Transkript; Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse, 2003, S. 100-
104, 2003
Wirtschaftliche Verwertung der Projektergebnisse
Die Firma JFC – Jülich Fine Chemicals GmbH hat in der Zwischenzeit die im Institut für
Biotechnologie bei Herrn Dr. M. Müller entwickelte Substratsynthese in den >100 g-Maßstab
übertragen und insgesamt zweimal erfolgreich durchgeführt, um einen ersten Auftrag über 25
g des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu erfüllen. Weitere Produktaufträge in
diesem Umfeld werden erwartet.
Weitere potenzielle Nutzer oder Kapitalgeber
Zur Indikation möglicher Produkt-Nutzer ist die nachfolgende Publikationsliste zum Thema
„Verwendung des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat (und des entsprechenden
(R)-Enantiomers) in der Wirkstoff- und Naturstoffsynthese“ angegeben:
A. Job, M. Wolberg, M. Müller, D. Enders, Asymmetric Synthesis of S-(+)-Argentilactone
and S-(-)-Goniothalamin, Synlett 2001, 1796-1798.
J. L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. Müller, D. Enders, Asymmetric Total Synthesis of (-)-
Callystatin A Employing the SAMP/RAMP Hydrazone Alkylation Methodology, Org. Lett.
2002, 4, 1023-1026.
D. Enders, J.L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. Müller, Asymmetric Total Synthesis of (-)-
Callystatin A and (-)-20-epi-Callystatin A Employing the SAMP/RAMP Hydrazone
Alkylation Methodology, Chem. Eur. J. 2002, 8, 4272-4284.
D. Enders, A. Lenzen, M. Müller, Efficient Asymmetric Syntheses of (+)-Strictifolione,
Synthesis 2004, 1486-1488
Weiterführende Entwicklungsmöglichkeiten
Neben den im obigen Abschlussbericht bereits genannten Themen sind folgende
Entwicklungsmöglichkeiten zu nennen:
• Die Übertragung der Optimierung der LBADH-katalysierten Reduktion des tert-Butyl
6-chlor-3,5-dioxohexanoats kann auch zur des tert-Butyl (R)-6-chlor-5-hydroxy-3-
oxohexanoat mit isolierter ADH aus Bäckehefe (siehe Publikation mit Jon Stewart)
genutzt werden und erlaubt den Zugang zu den vier möglichen stereoisomeren 3,5-
dihydroxyestern in enantiomerenreiner Form und in präparativen Mengen. Diese
können wiederum in vielfältiger Form in der Synthese von Polyketid-abgeleiteten
Natur- und Wirkstoffen genutzt werden.
• Die modelldiskriminierende Versuchsplanungstechnik ist in einer Software
Matlab/Simulink verfügbar und steht für entsprechende Anwendungen bereit.
Zusätzliche Projektanträge bei der DBU
Von den einzelnen Projektpartnern wurden innerhalb der ICBio Ausschreibung neue
Projektanträge gestellt bzw. sind bereits in Bearbeitung.
