Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in ... · Tierärztliche Hochschule Hannover Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in dendritischen Zellen für die Pathophysiologie

Tierärztliche Hochschule Hannover

Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in dendritischen Zellen für die Pathophysiologie einer Dextrannatriumsulfat induzierten Colitis

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Katharina Flück

Borken

Hannover 2014

Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Joachim Fandrey Institut für Physiologie Universität Duisburg-Essen Universitätsklinikum Essen 2. Prof. Dr. Gerhard Breves Physiologisches Institut Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. Joachim Fandrey

Prof. Dr. Gerhard Breves

2. Gutachter: PD Dr. Maren von Köckritz-Blickwede

Tag der mündlichen Prüfung: 26.09.2014

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert.

Meiner Familie

Ein Teil dieser Dissertation wurde zur Veröffentlichung vorbereitet.

Hypoxia-inducible factor 1 in dendritic cells is crucial for the activation of

regulatory T cells in murine colitis

Katharina Flück1,2, Gerhard Breves2, Joachim Fandrey1, Sandra Winning1

1 Institut für Physiologie, Universität Duisburg-Essen, Essen, Germany;

2 Physiologisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Germany

Inhaltsverzeichnis --____________________________________________________________________

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung................................................................................................................ 7

1.1 Immunsystem des Darms .................................................................................7

1.2 Rolle von dendritischen Zellen (DCs) im Immunsystem des Darms .................9

1.2.1 Aktivierung der adaptiven Immunantwort im Darm durch DCs ................ 10

1.2.2 Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase ...................................... 13

1.3 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen ................................................... 17

1.4 Murine Modelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen ..................... 20

1.5 Beteiligung von DCs an der Entstehung von chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen ........................................................................................ 22

1.6 Der Hypoxie induzierbare Faktor (HIF) ........................................................... 23

1.6.1 Aufbau und Funktion von HIF .................................................................. 23

1.6.2 Sauerstoffabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1 ................... 25

1.6.3 Sauerstoffunabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1 ............... 26

1.6.4 Bedeutung von HIF-1 im Rahmen von Infektionen und Entzündungen ... 28

1.7 Ziel der Dissertation ........................................................................................ 30

2 Material und Methoden ......................................................................................... 31

2.1 Materialien ...................................................................................................... 31

2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien .......................................................... 31

2.1.2 Chemikalien ............................................................................................. 33

2.1.3 Puffer und Lösungen ............................................................................... 35

2.1.4 Antikörper ................................................................................................ 37

2.1.5 Zytokine ................................................................................................... 38

2.1.6 Oligonukleotide ........................................................................................ 39

2.1.7 cDNA-Synthese, PCR und Real Time PCR ............................................. 41

2.2 Methoden ........................................................................................................ 42

2.2.1 Tierexperimentelle Methoden .................................................................. 42

2.2.2 Zellkultur .................................................................................................. 47

2.2.3 Molekularbiologische Methoden .............................................................. 48

2.2.4 Histologische Methoden .......................................................................... 60

3 Ergebnisse ........................................................................................................... 64

Inhaltsverzeichnis --____________________________________________________________________

3.1 Zur Publikation vorbereitetes Manuskript ........................................................ 64

3.1.1 Abstract ................................................................................................... 66

3.1.2 Introduction .............................................................................................. 66

3.1.3 Materials and Methods ............................................................................ 68

3.1.4 Results ..................................................................................................... 70

3.1.5 Discussion ............................................................................................... 75

3.1.6 References .............................................................................................. 78

3.1.7 Figures ..................................................................................................... 84

3.1.8 Supplementary Material ........................................................................... 95

3.2 Weitere Präsentationen ................................................................................ 101

3.3 Weitere Ergebnisse ....................................................................................... 102

3.3.1 Anstieg des Disease Activity Index durch DSS induzierte Colitis........... 102

3.3.2 Veränderungen des Colons durch DSS induzierte Colitis ...................... 103

3.3.3 Hochgradige Entzündung des Colons durch DSS Behandlung ............. 104

3.3.4 Verstärkte Alcianblau Färbung in DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tieren .................................................................................................... 108

4 Diskussion .......................................................................................................... 110

4.1 Auswirkungen einer Colitis auf intestinale DCs ............................................. 110

4.2 Entzündungsparameter HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f DSS behandelter

Tiere .............................................................................................................. 110

4.3 Typ I Interferon Produktion............................................................................ 115

4.4 Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch DCs ............................................ 117

4.5 Wechselwirkungen zwischen IECs und DCs................................................. 123

5 Zusammenfassung ............................................................................................. 128

6 Summary ............................................................................................................ 132

7 Literaturverzeichnis ............................................................................................ 135

8 Anhang ............................................................................................................... 162

8.1 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................. 162

8.2 Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 168

8.3 Tabellenverzeichnis ...................................................................................... 170

Einleitung 7

1 Einleitung

1.1 Immunsystem des Darms

Das Immunsystem ist ein komplexes Netzwerk des Körpers, um Pathogene und

entartete körpereigene Zellen zu erkennen und unschädlich zu machen. Das

Abwehrsystem des Körpers wird dabei in die angeborene und in die adaptive

Immunantwort unterteilt.

Zu den wichtigsten Effektorzellen des angeborenen Immunsystems gehören die

phagozytierenden Zellen, wie Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen

(DC, engl. dendritic cell). Sie können eingedrungene Erreger anhand ihrer

Oberflächenproteine erkennen und vernichten. Diese Zellen stellen zudem ein

Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunantwort dar, da sie

aufgenommene Zellen und Partikel in Peptidfragmente zerlegen und durch den

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) den Zellen der adaptiven Immunantwort

präsentieren können. Diese Zellen werden demnach auch antigenpräsentierende

Zellen (APC, engl. antigen presenting cell) genannt (Medzhitov 2007; Steinman &

Hemmi 2006).

Zu den Zellen der adaptiven Immunantwort gehören unter anderem die B-Zellen,

welche Antikörper oder Immunglobuline (Ig) sezernieren können. Diese können

Antigen-spezifische Epitope erkennen und so gegen extrazelluläre Pathogene und

lösliche Proteine, wie Toxine, schützen (LeBien & Tedder 2008). Eine weitere

Zellpopulation der adaptiven Immunantwort sind die T-Zellen. Diese lassen sich in

mehrere Subgruppen unterteilen und lösen nach Stimulation durch APCs

unterschiedliche Immunantworten aus.

Das mukosale Immunsystem stellt eine große Besonderheit dar, da es mit einer

Oberfläche von ca. 400 m2 wie keine andere Körperoberfläche einer Vielzahl von

Antigenen ausgesetzt ist. Dabei müssen pathogene Faktoren erkannt und eliminiert,

apathogene Substanzen und körpereigene Antigene hingegen toleriert werden. Im

Darm haben sich dafür unterschiedlichste Mechanismen entwickelt. Zum einen bildet

die intestinale Epithelschicht den ersten Schutz gegen eingedrungene Pathogene,

die sogenannte first line of defense. Intestinale Epithelzellen (IEC, engl. intestinal

Einleitung 8

epithelial cell) stehen durch Zell-Zellkontakte, tight junctions, in Verbindung und

verhindern so auch sehr kleinen Molekülen den Durchtritt durch die Darmwand (Shen

& Turner 2006; Madara 1998). Die Becherzellen des Darmepithels produzieren

Mucine und Kleeblatt-Faktoren (TFF, engl. trefoil factor), welche sich als schützende

Schicht auf die IECs legen und so die Anheftung und das Eindringen von

Pathogenen vermindern (Taupin & Podolsky 2003; Shirazi et al. 2000; Ohning 2013).

Außerdem produzieren IECs und Paneth-Zellen antimikrobielle Peptide, wie

Defensine und bakteriolytische Enzyme, welche gegen invasive Erreger schützen

(Müller et al. 2005). Auch die natürliche Darmflora trägt zum Schutz des Darms bei,

da die kommensalen Mikroorganismen die Bindungsstellen für Pathogene besetzen

und so ein Eindringen in den Darm erschweren (Duerkop et al. 2009).

Immunzellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems befinden sich verteilt

über den gesamten Darmtrakt in der Lamina propria mucosae oder in organisierten

Strukturen, dem darmassoziierten lymphatischen Gewebe (GALT, engl. gut

associated lymphoid tissue). Dies muss eine Immunreaktion gegen die Darmflora

und Nahrungsbestandteile verhindern, zugleich aber gegen pathogene

Mikroorganismen schützen. Zum GALT gehören die Peyer-Plaques, isolierte

Lymphfollikel, Kryptopatches und die mesenterialen Lymphknoten (Newberry &

Lorenz 2005). Peyer-Plaques befinden sich im gesamten Dünndarm und bestehen

aus mehreren B-Zell-Follikeln mit Keimzentren sowie aus kleineren T-Zell-Regionen.

Sie werden von einen follikelassoziiertem Epithel bedeckt, welches spezialisierte

Epithelzellen, die sogenannten M-Zellen (Mikrofaltenzellen), enthält. Diese besitzen

eine gefaltete Oberfläche und ermöglichen den Eintritt von Antigenen aus dem

Lumen in die Peyer-Plaques. Dort werden die Antigene von APCs aufgenommen,

welche in die T-Zell-Regionen der Peyer-Plaques oder in die mesenterialen

Lymphknoten einwandern, um entsprechende Immunreaktionen auszulösen (Murphy

et al. 2009). In den B-Zell-Follikeln findet zudem ein Klassenwechsel zu IgA statt,

welches in das Darmlumen sekretiert wird und gegen luminale Antigene wirken kann

(Brandtzaeg 2009). Isolierte Lymphfollikel sind kleine Zellaggregate, welche im

gesamten Darmtrakt zu finden sind. Sie bestehen zu einem großen Teil aus B-Zellen,

welche wiederum IgA produzieren können. Wie die Peyer-Plaques sind auch die

Einleitung 9

isolierten Lymphfollikel von M-Zellen bedeckt, welche den Durchtritt von Antigenen

gewähren. Kryptopatches sind im Dünndarm und im Colon an der Basis der

epithelialen Krypten lokalisiert. Sie bestehen unter anderem aus lineage-marker

negativen (lin-)c-kit+ Zellen und DCs. Ihre Aufgabe ist noch nicht vollständig geklärt,

aber es wird vermutet, dass sie an der extrathymischen Differenzierung von T-Zellen

beteiligt sind (Oida et al. 2000). Die mesenterialen Lymphknoten stellen die größten

Lymphknoten des Körpers dar. Sie bestehen aus einem äußerem Cortex (Rinde),

welcher B-Zellen enthält, und einer inneren Medulla (Mark), welche vor allem aus

T-Zellen und DCs besteht. Antigenbeladene APCs aus dem umliegenden intestinalen

Gewebe strömen über afferente Lymphgefäße zu den mesenterialen Lymphknoten,

um dort spezifische Immunreaktionen auszulösen. Naive Lymphozyten treten aus

dem Blut über spezielle postkapilläre Venolen in die Lymphknoten ein.

1.2 Rolle von dendritischen Zellen (DCs) im Immunsystem des Darms

DCs wurden erstmals im Jahre 1973 von Steinman beschrieben (Steinman & Cohn

1973). Sie stellen das Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität

dar. Unreife DCs wandern durch die Peripherie und nehmen kontinuierlich

Fremdmaterial auf. Dies geschieht zum einen durch Eintritt von Antigenen durch die

oben beschriebenen M-Zellen, zum anderen sind intestinale DCs in der Lage

Antigene direkt aus dem Darmlumen aufzunehmen. Dafür strecken sie ihre langen

zytoplasmatischen Fortsätze, die Dendriten, durch die Epithelzellen des Darms.

Durch eigene Produktion von tight junction Proteinen können DCs die tight junctions

des Epithels penetrieren ohne die Barriere zu schädigen (Rescigno et al. 2001). DCs

identifizieren sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP, engl.

pathogen-associated molecular pattern) auf Antigenen durch Mustererkennungs-

Rezeptoren (PRR, engl. pattern-recognition receptor), wie Toll-like Rezeptoren

(TLRs) (Medzhitov & Janeway 2000). Bestandteile von Bakterien, wie z. B.

Lipopolysaccharid (LPS), ein Zellwandmolekül gramnegativer Bakterien, oder auch

virale Bestandteile, wie doppelsträngige DNA, binden an die transmembranären

TLRs und lösen eine Signalkaskade aus, die zu einer spezifischen Immunantwort

führt. DCs können PAMPs nicht nur über TLRs, sondern auch über intrazelluläre

Einleitung 10

Proteine erkennen. Diese Proteine bezeichnet man als NOD1 und NOD2

(Nukleotidbindungs-Oligomerisierungsdomäne). NOD1 bindet γ-Glutamyl-

Diaminopimelinsäure, ein Abbauprodukt von Proteoglykanen gramnegativer

Bakterien. NOD2 bindet Muramyldipeptid, das in den Proteoglykanen aller

Bakterienarten vorkommt (Strober et al. 2006). Durch die Antigenaufnahme wird ein

Reifungsprozess in den DCs ausgelöst. Es kommt zu einer gesteigerten Sekretion

von Zytokinen und Chemokinen. Des Weiteren erhöht sich die Expression der

MHC-Proteine und der kostimulatorischen Moleküle (Banchereau & Steinman 1998).

1.2.1 Aktivierung der adaptiven Immunantwort im Darm durch DCs

Die gereiften DCs wandern nun über die Lymphgefäße in die T-Zellregionen der

mesenterialen Lymphknoten. Dort induzieren sie die Differenzierung und Proliferation

von spezifischen T-Zellen (Banchereau & Steinman 1998). Aufgenommene Antigene

werden im Zytoplasma der DCs in kleine Peptidfragmente gespalten. Diese

Peptidfragmente werden über MHC-Moleküle präsentiert, welche von dem

T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) erkannt werden. Für die Zellaktivierung

müssen außerdem die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 mit dem CD28

Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen interagieren. Durch MHC-I-Moleküle

werden CD8+ T-Zellen aktiviert, welche sich überwiegend zu zytotoxischen T-Zellen

ausdifferenzieren (CTL, engl. cytotoxic T-lymphocyte) und z. B. virusbefallene Zellen

direkt abtöten. MHC-II-Moleküle aktivieren CD4+ positive T-Zellen, welche sich in

verschiedene Subgruppen aufteilen lassen (König et al. 1992; Murphy et al. 2009).

Einleitung 11

Abb. 1.1: Aktivierung der adaptiven Immunantwort durch DCs.

Intestinale DCs nehmen Antigene auf, migrieren in die mesenterialen Lymphknoten und aktivieren dort

CD4+ und CD8

+ T-Zellen. CD4

+ T-Zellen differenzieren zu Effektor T-Helfer-Zellen (Th1, Th2 und

Th17-Zellen) oder zu regulatorischen T-Zellen (Tregs). CD8+ T-Zellen differenzieren zu zytotoxischen

T-Zellen (CTL) (modifiziert nach Westendorf et al. 2010).

Die Anwesenheit von entzündlichen Mediatoren wie LPS oder Interferon (IFN)-γ

bewirkt die Ausdifferenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen, welche eine

proinflammatorische Immunreaktion mit hoher Produktion von IFN-γ,

Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 und IL-12 auslösen. Dies wiederum

führt zu einer Aktivierung von Makrophagen und weiterer DCs, wohingegen die

Differenzierung von CD4+ T-Zellen zu Th2, Th17 und Tregs gehemmt wird.

Th2-Zellen werden vornehmlich bei einer parasitären Infektion mit Helminthen und

Ausschüttung von IL-4 gebildet. Sie stimulieren die Antikörperproduktion der B-Zellen

und aktivieren zudem Mastzellen, eosinophile und basophile Granulozyten (Murphy

et al. 2009; Bluestone et al. 2009; Coffman 2006). In Anwesenheit von

inflammatorischen Zytokinen, wie IL-6 und TGF-β (engl. transforming growth factor),

Einleitung 12

erfolgt die Differenzierung zu Th17-Zellen (Ivanov et al. 2006). Th17-Zellen weisen

eine proinflammatorische Funktion auf und schützen vor mikrobiellen Infektionen und

verstärken die Reaktion neutrophiler Zellen (Murphy et al. 2009). Sie sezernieren

unter anderem IL-6, IL-17, IL-22 und TNF-α.

DCs können Antigene auch B-Zellen präsentieren, welche verschiedene

Immunglobuline sezernieren. Aktivierte B-Zellen stimulieren zudem Th2-Zellen und

regen diese zur Zytokinproduktion an. Dies führt zur weiteren Aktivierung

nahegelegener B-Zellen und somit vermehrter Antikörperproduktion (Murphy et al.

2009).

Die so aktivierten Effektorzellen verlassen die organisierten Strukturen des GALT

oder die mesenterialen Lymphknoten schließlich über die efferenten Lymphgefäße

und gelangen über den Ductus thoracicus und den Blutkreislauf wieder in mukosales

Gewebe (Murphy et al. 2009). Die DCs der Peyer-Plaques und der mesenterialen

Lymphknoten übernehmen hierbei eine entscheidende Aufgabe. Sie vermitteln die

Expression der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9

(CC Chemokin Rezeptor 9) auf Lymphozyten (Johansson-Lindbom et al. 2003). Das

α4β7-Integrin bindet an das mukosale gefäßspezifische Adressin MAdCAM-1 (engl.

mucosal vascular addressin cell-adhesion molecule 1), welches vor allem auf

intestinalen Endothelzellen vorkommt. CCR9 bindet den Liganden CCL25, welcher

von Epithelzellen des Dünndarms exprimiert wird. Die aktivierten Lymphozyten

gelangen somit direkt zurück in die Lamina propria und das Epithel des Darms, wo

sie gemeinsam mit den Zellen des angeborenen Immunsystems ihre Effektorfunktion

ausüben.

Einleitung 13

Abb. 1.2: Zusammenspiel der Immunzellen.

Durch Bindung von Pathogenen an Mustererkennungs-Rezeptoren (PRR, engl. pattern-recognition

receptor) wie Toll-like Rezeptoren (TLR) werden DCs aktiviert. Diese vermitteln die Differenzierung

von naiven T-Zellen in verschiedene Subtypen. Th1-Zellen produzieren unter anderem IFN-γ, welches

Makrophagen aktivieren kann. Th2-Zellen unterstützen die Antikörperproduktion von B-Zellen und

rekrutieren eosinophile Granulozyten. CD8+ T-Zellen wirken zytotoxisch und lösen Zelllyse aus.

Aktivierte Makrophagen sezernieren proinflammatorische Zytokine und Chemokine und rekrutieren

neutrophile Granulozyten. Regulatorische T-Zellen kontrollieren die Funktion der Effektorzellen und

dämmen die Reaktion ein (aus Mills 2004).

1.2.2 Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase

Die besondere Aufgabe im Gastrointestinaltrakt stellt die Unterscheidung zwischen

körpereigenen und körperfremden Stoffen dar. Autoreaktive Lymphozyten, welche

auf körpereigene Produkte reagieren, werden daher schon im Thymus bzw. im

Knochenmark eliminiert. Diesen Vorgang bezeichnet man als zentrale Toleranz oder

Einleitung 14

negative Selektion. Da viele körpereigene Antigene sich aber der Präsentation im

Thymus oder Knochenmark entziehen können, haben sich verschiedene

Mechanismen der peripheren Toleranz entwickelt. Dabei werden Lymphozyten in

einen anergen Zustand versetzt wodurch eine Immunreaktion ausbleibt. Dies

geschieht z. B. durch das Fehlen entzündungsspezifischer Zytokine oder

kostimulatorischer Moleküle bei der Antigenpräsentation (Murphy et al. 2009; Palmer

2003; Ohashi & DeFranco 2002). Im Darm muss zudem zwischen apathogenen

Nahrungsbestandteilen, der kommensalen Mikroflora und pathogenen Erregern

unterschieden werden. Es werden kontinuierlich Immunantworten ausgelöst, welche

streng kontrolliert werden müssen. Diese Aufgabe übernehmen die regulatorischen

T-Zellen (Tregs). Kennzeichnend für die Identifizierung als Treg ist die Expression

des Transkriptionsfaktors Foxp3 (engl. forkhead box P3) (Hori et al. 2003). Tregs

entwickeln sich zum einen im Thymus und werden daraufhin als natürliche Tregs

(nTregs) bezeichnet. Im Darm kann zum anderen die Bildung von Tregs induziert

werden (iTregs). Diese besondere Aufgabe übernehmen tolerogene DCs.

Tolerogene DCs werden durch IECs induziert. IECs produzieren unter anderem das

Zytokin TSLP (engl. thymic stromal lymphopoietin), welches die Differenzierung von

mukosalen DCs zu tolerogenen DCs fördert. Diese haben die Fähigkeit naive

CD4+ T-Zellen zu Foxp3+ Tregs zu konvertieren (Sun et al. 2007; Annacker et al.

2005). Die Produktion von TGF-ß und IL-10 durch DCs spielt hierbei eine große

Rolle (Coombes et al. 2007; Groux et al. 1999). Des Weiteren ist die Bildung von

Retinsäure (RA, engl. retinoic acid) durch DCs erforderlich (Coombes et al. 2007;

Benson et al. 2007). Retinsäure ist ein Vitamin A Metabolit. Es entsteht durch den

Abbau von Retinol (Vitamin A) durch Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) zu Retinal,

welches durch Aldehyd-Dehydrogenasen (Aldh) weiter zu Retinsäure oxidiert wird

(Duester 2000). Es sind mehrere Isoformen der Aldhs beschrieben. Für die DCs in

mesenterialen Lymphknoten spielt Aldh1a2 dabei die größte Rolle (Iwata et al. 2004).

Die durch DCs induzierten Tregs haben große Bedeutung in der Aufrechterhaltung

der intestinalen Homöostase. Es sind verschiedene Suppressionsmechanismen der

Tregs beschrieben. Zum einen inhibieren sie die Proliferation der Effektorzellen

durch Produktion von antiinflammatorischen Zytokinen, wie TGF-β, IL-10 und IL-35.

Einleitung 15

Zum anderen können sie die direkte Zytolyse der Zielzelle, ähnlich wie CTLs, durch

Produktion von Granzymen einleiten. Zielzellen der Tregs sind hierbei vor allem

aktivierte, proinflammatorische T-Zellen. Des Weiteren können sie durch

verschiedene Mechanismen den Metabolismus der Zielzellen stören oder die

Fähigkeit von DCs, naive T-Zellen zu aktivieren, hemmen (Workman et al. 2009).

Abb. 1.3: Suppressionsmechanismen von Tregs.

Durch Sekretion von inhibitorischen Zytokinen, wie TGF-β, IL-10 und IL-35, können Tregs

Effektorzellen hemmen. Die Produktion von Granzymen führt zur Lyse der Zielzelle. Durch Bindung

von IL-2 an den Rezeptor CD25 wird den Effektorzellen IL-2 entzogen, welches sie zur Proliferation

benötigten. Anti-proliferativ wirkendes zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) kann in Zielzellen

eingeschleust werden oder von Tregs produziertes Adenosin an den Adenosin-Rezeptor 2A auf

Zielzellen binden, so dass die Bildung des proinflammatorischen Zytokins IL-6 unterbleibt. Die

Fähigkeit von DCs T-Zellen zu aktivieren, kann durch Interaktion von LAG-3 mit MHC-II oder von

CTLA-4 mit CD80/CD86 inhibiert werden (aus Workman et al. 2009).

Tregs wirken zudem protektiv im Rahmen einer Colitis. Sie können die Ausprägung

einer Colitis verhindern oder eine bestehende Colitis lindern (Mottet et al. 2003;

Uhlig, Coombes, et al. 2006; Izcue et al. 2006). Es ist außerdem ein positiver

Rückkopplungsmechanismus zwischen Tregs und tolerogenen DCs beschrieben

(Min et al. 2003). Tregs können die Bildung von tolerogenen DCs stimulieren, welche

wiederum weitere Tregs aktivieren.

Einleitung 16

Die durch DCs produzierte Retinsäure fördert nicht nur die Induktion von Tregs,

sondern weist zudem noch weitere wichtige Effekte für die intestinale Immunität auf.

Zum einen wird die Expression der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle

α4β7-Integrin und CCR9 durch die Anwesenheit von Retinsäure erhöht (Iwata et al.

2004; Benson et al. 2007). Dies ermöglicht vor allem induzierten Tregs effizienter in

den Darm zu gelangen. Des Weiteren hemmt Retinsäure die Differenzierung von

naiven T-Zellen zu Th17-Zellen wodurch einer proinflammatorischen Antwort

entgegen gewirkt wird (Mucida et al. 2007).

Abb. 1.4: Rolle der Retinsäure in der intestinalen Immunität.

Die Produktion von TSLP durch intestinale Epithelzellen erzeugt tolerogene DCs. Diese generieren

mit Hilfe der Aldehyd Dehydrogenase Aldh1a2 Retinsäure (RA) aus Vitamin A. Retinsäure induziert

die Expression der darmassoziierten Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 auf Lymphozyten.

Zusammen mit IL-5 und IL-6 unterstützt Retinsäure den Klassenwechsel zu IgA produzierenden

B-Zellen im mesenterialen Lymphknoten. Die Differenzierung naiver T-Zellen zu Tregs wird durch

Retinsäure gefördert, wohingegen die Aktivierung von Th17- und Th1-Zellen gehemmt wird

(modifiziert nach Coombes & Powrie 2008).

Einleitung 17

1.3 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) handelt es sich um

rezidivierende oder kontinuierlich auftretende inflammatorische Erkrankungen des

Gastrointestinaltrakts. CED treten weltweit mit einer erhöhten Häufigkeit in

Nordamerika, Großbritannien und Skandinavien auf. Die Anzahl der Neuerkrankten

(Inzidenz) liegt bei 4-10/100.000 Einwohnern pro Jahr. Die Anzahl der Erkrankten

(Prävalenz) liegt bei 40-100/100.000 Einwohnern (Hendrickson et al. 2002). Meist

manifestiert sich die Krankheit zwischen dem 15. und 30. Lebensjahr (Xavier &

Podolsky 2007). Die Hauptformen sind hierbei der Morbus Crohn (MC) und die

Colitis ulcerosa (CU). MC stellt eine Entzündung dar, welche jeden Abschnitt des

Gastrointestinaltrakts befallen kann. Am häufigsten sind die Ileocaecal-Region und

das terminale Ileum allein betroffen. Histologisch sind granulomatöse Läsionen und

transmurale leukozytäre Infiltrationen zu erkennen. Bei der CU beschränkt sich die

Entzündung auf das Colon, wobei lediglich die Tunica mucosa betroffen ist. Es sind

oberflächliche Ulzerationen und Kryptenabszesse auffindbar. Zudem kann es zu

einem Verlust der Becherzellen kommen (Xavier & Podolsky 2007). Beides sind

multifaktoriell bedingte Erkrankungen mit noch nicht vollständig geklärter Ätiologie.

Es wird davon ausgegangen, dass die Entstehung einer CED durch genetische

Prädisposition begünstigt wird. Die am häufigsten beschriebene genetische Ursache

für MC ist eine Mutation im NOD2/CARD15 Gen (engl. caspase recruitment domain

family member 15) (Strober et al. 2007). Wie bereits oben erwähnt, erkennt NOD2

bakterielle Zellwandpolymere und aktiviert über NF-κB (engl. nuclear factor ‚kappa-

light-chain-enhancer‘ of activated B-cells) weitere zahlreiche proinflammatorische

Gene. Des Weiteren ist NOD2/CARD15 für die Sekretion antimikrobiell wirksamer

α-Defensine verantwortlich (Kucharzik et al. 2006). Mutationen könnten somit zu

einer gestörten Immunreaktion und einer verminderten Fähigkeit des Darmepithels,

Bakterien zu eliminieren, führen (Strober et al. 2007). Für CU sind Mutationen sowohl

im Gen für IFN-γ als auch im MDR1 Gen (engl. multidrug resistance gene)

beschrieben (Abraham & Cho 2009; Annese et al. 2006). Des Weiteren wurden auch

genetische Veränderungen von IL-12 und des IL-23 Rezeptors in Zusammenhang

mit der Entstehung von CED gebracht (Duerr et al. 2006).

Einleitung 18

Einen weiteren Einfluss auf die Entstehung von CED nehmen Umweltfaktoren.

Stress, die Einnahme nichtsteroidaler Antiphlogistika, welche die Epithelbarriere

schädigen, und Rauchen werden als Auslöser für CED diskutiert (Mawdsley &

Rampton 2005; Podolsky 2002). Rauchen wirkt sich dabei positiv auf CU aus, wobei

es MC eher verschlimmert.

Auch die kommensale Mikroflora kann einen Einfluss auf die Entwicklung von

Darmerkrankungen nehmen. Eine Dysregulation zwischen Mikroflora und der

epithelialen Barriere kann zu einer intestinalen Entzündung führen. Es wurde gezeigt,

dass Patienten mit MC und CU zum einen eine erhöhte Permeabilität des

Darmepithels und zum anderen eine veränderte Zusammensetzung der intestinalen

Mikroflora aufweisen (Welcker et al. 2004; Sartor 2008). Des Weiteren hat eine

Therapie mit Antibiotika, wie Metronidazol, bei CED Patienten einen positiven Effekt,

was für eine Beteiligung der Darmflora spricht. Einzelne Erreger, welche die

Erkrankung auslösen, konnten bislang nicht identifiziert werden. Viele Studien

beschäftigen sich mit dem Zusammenhang zwischen MC und dem Erreger

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP). MAP löst die

Paratuberkulose, eine chronische Enteritis, in Wiederkäuern aus, welche auch

Johne´sche Krankheit genannt wird. Die Paratuberkulose ist eine in Deutschland

meldepflichtige Tierseuche, welche sich in unstillbaren, wässrigen Durchfällen und

starker Abmagerung äußert und zum Tod führen kann (Baumgärtner 2012).

Histologisch ähnelt das Erscheinungsbild dem MC des Menschen. Es ist

gekennzeichnet durch eine granulomatöse Enteritis, die vor allem im Ileum und

Caecum auftritt. Auf Grund dessen wurde eine Beteiligung MAPs an MC diskutiert

(Chiodini et al. 1984). MAP wird über kontaminierte Milch- und Fleischprodukte

übertragen, da es als intrazellulärer Erreger auch starke Erhitzung übersteht (Lund et

al. 2002). Tatsächlich wurde MAP in Patienten mit MC identifiziert (Olsen et al. 2009;

Naser et al. 2004). Allerdings wurde MAP auch zu einem geringeren Anteil in

Patienten mit CU und in gesunden Patienten gefunden (Autschbach et al. 2005;

Davis & Madsen-Bouterse 2012). Es wird somit vermutet, dass MAP nicht als

Auslöser des MC gilt, sondern dass eine persistierende MAP Infektion den Ausbruch

der Krankheit in genetisch prädisponierten Menschen fördert (Sartor 2006).

Einleitung 19

Des Weiteren kann die Entstehung einer CED durch Defekte in der Immunfunktion

begünstigt werden. Patienten mit MC weisen eine überschießende

Th1-Immunreaktion mit erhöhter IFN-γ und IL-12 Produktion auf (Strober et al. 2002;

Sartor 2006). Zusätzlich wurde gezeigt, dass auch Th17-Zellen einen großen

Einfluss auf das Fortschreiten der Erkrankung haben (Elson et al. 2007). Das von

APCs produzierte Zytokin IL-23 stimuliert die Differenzierung von naiven T-Zellen zu

Th17-Zellen. Es beinhaltet die gleiche Untereinheit p40 wie das von Th1-Zellen

sezernierte IL-12. Die Behandlung mit einem IFN-γ Antikörper in Studien zeigte nur

geringen Effekt, wohingegen ein p40 Antikörper, welcher sowohl IL-12 als auch IL-23

blockiert, einen deutlich positiven Effekt bei Patienten mit MC aufwies, was für eine

Beteiligung der Th17-Zellen spricht (Mannon et al. 2004). Bei der CU hingegen wird

davon ausgegangen, dass es sich um eine atypische, Th2 vermittelte Entzündung

handelt. CU Patienten weisen eine erhöhte Produktion von IL-5 und IL-13 auf, nicht

jedoch von IL-4. Es wird davon ausgegangen, dass natürliche Killer T-Zellen durch

APCs, welche einen atypischen MHC-Rezeptor tragen, aktiviert werden. Dadurch

kommt es zu einer gesteigerten Produktion von IL-13, welches das Epithel schädigt

und die Entstehung von Ulzerationen fördert (Fuss et al. 2004). Insgesamt kann

allerdings kein Faktor isoliert betrachtet werden. Meist handelt es sich um ein

Zusammenspiel der Faktoren, welche in Kombination zu schwerwiegenden

entzündlichen Veränderungen im Darm führen können.

Einleitung 20

Abb. 1.5: Auslösende Faktoren einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung.

Genetische Prädispositionen und fehlgeleitete Immunreaktionen sind an der Entstehung chronisch

entzündlicher Darmerkrankungen (CED) beteiligt, ebenso wie die kommensale Darmflora und

begünstigende Umweltfaktoren. Meist wirken alle Faktoren synergistisch (modifiziert nach Sartor

2006).

1.4 Murine Modelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Zur Untersuchung von CED werden viele verschiedene Tiermodelle heran gezogen

(Hoffmann et al. 2002). Zum einen bildet sich in bestimmten Mausstämmen eine

Spontancolitis. Dabei handelt es sich unter anderem um SAMP1/Yit Mäuse, welche

sich ursprünglich von Seneszenz-Mäusen ableiten (Matsumoto et al. 1998). Des

Weiteren entwickeln C3H/HeJBir Mäusen, welchen der TLR4 fehlt, eine spontane

Colitis (Cong et al. 1998). Außerdem kann eine Colitis in verschiedenen transgenen

Tieren induziert werden. So entwickeln z. B. IL-2 Knock-out oder IL-10 Knock-out

Tiere unter speziellen Bedingungen eine entzündliche Darmerkrankung (Contractor

et al. 1998; Kühn et al. 1993). Unter keimfreien Haltungsbedingungen bleibt eine

Erkrankung aus, wohingegen sich unter SPF-Bedingungen (engl. special pathogen

free) in IL-10 Knock-out Tieren eine milde Entzündung des proximalen Colons und in

IL-2 Tieren eine komplette Colitis entwickelt. Unter konventionellen

Haltungsbedingungen entwickeln IL-10 Knock-out Mäuse eine hochgradige

chronische Enterocolitis (Kühn et al. 1993). Dies spiegelt zudem eine Bedeutung der

mukosalen Mikroflora für die Entwicklung einer Darmerkrankung wider. In

Einleitung 21

immunsupprimierten SCID (engl. severe combined immunodeficiency) oder RAG-

defizienten (engl. recombination activation gene) Mäusen kann durch Transfer von

bestimmten T-Zellpopulationen eine Entzündung ausgelöst werden und die Funktion

der T-Zellen untersucht werden. Der Transfer von CD45RBhigh-T-Lymphozyten

(undifferenzierte T-Lymphozyten) führt hierbei zu einer schweren Colitis, wohingegen

der Transfer von CD45RBlow-T-Lymphozyten (reife T-Lymphozyten) einen protektiven

Effekt aufweist (Hoffmann et al. 2002). Durch diese Modelle erfolgte der Nachweis,

dass sich regulatorische T-Zellen positiv auf eine Colitis auswirken (Izcue et al.

2006). Ein weiteres Colitismodell ist das der chemisch induzierbaren

Darmerkrankungen. Durch rektale Verabreichung von Oxazolon oder TNBS (engl.

trinitrobenzene sulfonic acid) kann eine Colitis ausgelöst werden (Morris et al. 1989;

Boirivant et al. 1998). Des Weiteren entsteht durch die orale Gabe von

Dextrannatriumsulfat (DSS, engl. dextran sodium sulfate) eine schwere Colitis,

welche durch starke leukozytäre Infiltrationen, fokale Kryptenzerstörung, lymphoide

Hyperplasie und epitheliale Ulzeration gekennzeichnet ist (Okayasu et al. 1990;

Cooper et al. 1993). Die Wirkungsweise dieses Modells ist bislang noch nicht

vollständig geklärt. Es wird allerdings meist davon ausgegangen, dass DSS direkt

zytotoxisch auf die Epithelzellen der Colonschleimhaut wirkt und diese somit zerstört.

Daraufhin werden Phagozyten aktiviert, welche eine Immunreaktion mit erhöhter

proinflammatorischer Zytokinproduktion auslösen (Okayasu et al. 1990). Weitere

Studien zeigen jedoch, dass es sich bei der Immunantwort im DSS Modell um eine

Mischform aus einer Th1- und Th2-Antwort handelt (Dieleman et al. 1998). Des

Weiteren konnte zudem gezeigt werden, dass auch in SCID-Mäusen, welche keine

funktionalen T- und B-Lymphozyten besitzen, eine DSS Colitis ausgelöst werden

kann (Dieleman et al. 1994; Axelsson et al. 1996).

Einleitung 22

1.5 Beteiligung von DCs an der Entstehung von chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen

Wie bereits erwähnt, haben DCs großen Einfluss auf die Regulation der

Immunantwort. Verschiedene Studien befassen sich mit ihrer Bedeutung bei CED.

Abe et al. zeigten, dass die Ablation von DCs in einem Colitismodell während der

Erkrankung zu einer Verbesserung der Symptome führte. Wurden die DCs jedoch

schon vor Ausbruch der Colitis entfernt, führte dies zu einer Verschlechterung. Die

Behandlung der Mäuse mit einem TLR9-Liganden vor Induktion der Colitis, zeigte

wiederum protektive Wirkung (Abe et al. 2007). DCs spielen hiernach eine zeitlich

abhängige Rolle bei der Entstehung von entzündlichen Darmerkrankungen. Uhlig et

al. beschrieben zudem eine T-Zell unabhängige Entwicklung einer Colitis durch

direkte Aktivierung von DCs durch CD40 Stimulation (Uhlig, McKenzie, et al. 2006).

Des Weiteren besteht ein Zusammenhang zwischen den prädisponierenden Genen

für CED und DCs. Das oben beschriebene NOD2 wird auch auf DCs exprimiert.

Mutationen können zu Dysfunktionen dieser Zellen und somit zu fehlgeleiteten

Immunreaktionen oder schließlich auch zum Ausbruch von CED beitragen (Strober

et al. 2007). In Patienten mit CED konnte eine erhöhte Expression von TLR2 und

TLR4 auf intestinalen DCs festgestellt werden. Patienten mit MC zeigten zudem eine

gesteigerte Expression des Aktivierungsmarkers CD40 auf DCs sowie eine

vermehrte Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-12 und IL-6 durch DCs

(Hart et al. 2005). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass DCs im

terminalen Ileum in der Lage sind die Untereinheit p40 der Zytokine IL-12 und IL-23

zu produzieren (Becker et al. 2003). IL-23, welches Th17-Zellen aktivieren kann,

spielt eine bedeutende Rolle in der Pathogenese von CED (Yen et al. 2006; Hue et

al. 2006a; Izcue et al. 2008). Bei Patienten mit MC konnte eine erhöhte Menge an

durch DCs produziertem IL-23 sowie eine verringerte Produktion von IL-10

festgestellt werden (Sakuraba et al. 2009). Des Weiteren sind DCs auch als Quelle

des proinflammatorischen Zytokins TNF-α beschrieben (de Baey et al. 2003).

Baumgart et al. hingegen beschrieben einen Mangel an unreifen DCs bei CED

Patienten (Baumgart et al. 2005). Die Bedeutung von DCs im Rahmen von

Darmentzündungen kann somit als sehr entscheidend angesehen werden.

Einleitung 23

1.6 Der Hypoxie induzierbare Faktor (HIF)

Überschreitet der Bedarf an Sauerstoff das Angebot, so entsteht ein

Sauerstoffmangel, die sogenannte Hypoxie (Fandrey 2007). Geringe

Sauerstoffkonzentrationen sind kennzeichnend für entzündetes Gewebe. Dies wird

zum einen durch mangelhafte Durchblutung bei gleichzeitig erhöhtem

Sauerstoffverbrauch durch rekrutierte Immunzellen bedingt (Karhausen et al. 2005;

Eltzschig & Carmeliet 2011). Im Falle des Darmes liegen noch weitere Ursachen vor.

Die Epithelzellen des Darms nehmen eine besondere Stellung ein. Sie trennen das

fast anoxische Darmlumen von den reich durchbluteten Zellen der Lamina propria

mucosae und sind somit großen Sauerstoffschwankungen ausgesetzt. Im gesunden

Darm weisen die Epithelzellen daher schon eine „physiologische Hypoxie“ auf. Wird

das Epithel nun durch eine Darmentzündung geschädigt, so tritt die Anoxie des

Darmlumens tiefer in das Gewebe ein (Karhausen et al. 2004). Auch die Zellen der

Lamina propria mucosae und der Tela submucosa sind nun hypoxischen

Bedingungen ausgesetzt. Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor

(HIF) nimmt für die Anpassung des Zellstoffwechsels an hypoxische Bedingungen

eine zentrale Rolle ein (Semenza et al. 1997). HIF reguliert die

Sauerstoffhomöostase und induziert die transkriptionelle Genexpression, welche

unter anderem für die Angiogenese, Erythropoiese und anaerobe Glykolyse benötigt

wird.

1.6.1 Aufbau und Funktion von HIF

HIF ist ein heterodimerer Proteinkomplex aus einer sauerstoffabhängig regulierten α-

und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit, welche auch als ARNT (engl. aryl

hydrocarbon receptor nuclear translocator) bezeichnet wird (Wang et al. 1995). Bei

Mensch und Maus sind bislang drei Isoformen der α-Untereinheit (HIF-1α, -2α, -3α)

sowie drei Isoformen des HIF-β Proteins identifiziert. Die HIF-1α Untereinheit weist

eine extrem kurze Halbwertszeit auf und wird unter normoxischen Bedingungen

kontinuierlich abgebaut und neugebildet. Unter Hypoxie erfolgen die Stabilisierung

des Proteins und die Translokation in den Nukleus. Dort folgt die Dimerisierung mit

der β-Untereinheit. Beide Untereinheiten gehören zur Familie der basischen-Helix-

Einleitung 24

Loop-Helix (bHLH) und PER-ARNT-Sim (PAS) Transkriptionsfaktoren. Die bHLH

Domänen am N-terminalen Ende ermöglichen die Bindung der Untereinheiten an die

Hypoxie-responsiven Elemente (HRE) des jeweiligen Zielgens. Die nachfolgenden

PAS Domänen vermitteln die Dimerisierung zwischen der α- und β-Untereinheit des

HIF-Komplexes. Die Transaktivierungsdomäne (TAD), welche sich im Falle der

HIF-1α Untereinheit in eine N-terminale (NAD) und C-terminale (CAD)

Aktivierungsdomäne aufgliedert, dient der Aktivierung von Zielgenen. Die

sauerstoffabhängigen Abbaudomänen (ODDD, engl. oxygen-dependent degradation

domain) der α-Untereinheit bedingen die posttranslationale, sauerstoffabhängige

Regulation der Aktivität des Transkriptionsfaktors (Wenger et al. 2005; Fandrey et al.

2006).

Abb. 1.6: Struktur des Hypoxie-induzierbaren Faktors HIF-1.

Die basischen Helix-Loop-Helix (bHLH) Domänen dienen der Bindung der Untereinheiten an DNA. Die

PAS Domänen ermöglichen die Dimerisierung der Untereinheiten. Die N- und C-terminalen

sauerstoffabhängigen Abbaudomänen (engl. oxygen-depending degradation domain, NODDD bzw.

CODDD) sowie die transaktivierenden Domänen (NAD bzw. CAD) der α-Untereinheit dienen der

sauerstoffabhängigen Regulation und der Aktivierung von Zielgenen (modifiziert nach Schofield &

Ratcliffe 2004).

Hydroxylierung

Einleitung 25

1.6.2 Sauerstoffabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1

Unter normoxischen Bedingungen vermitteln spezielle Prolylhydroxylasen (PHDs) die

Hydroxylierung von spezifischen Prolinresten innerhalb der ODDDs der

α-Untereinheit. Diese werden von dem von Hippel-Lindau (VHL)

Tumorsuppressorproteinkomplex, welcher zur Familie der E3-Ubiquitin-Ligase

Komplexe gehört, erkannt. Nach vermittelter Ubiquitinierung wird das HIF-1α Protein

daraufhin dem proteasomalen Abbau zugeführt (Ivan et al. 2001). Des Weiteren

hydroxyliert die Asparaginhydroxylase HIF-1-inhibierender Faktor (FIH-1, engl. factor

inhibiting HIF-1) sauerstoffabhängig den Asparaginrest in der C-terminalen

Transaktivierungsdomäne (CAD) der α-Untereinheit. Dies verhindert die Interaktion

der CAD mit dem Koaktivator p300/Creb-bindenden Protein (CPB), wodurch die

transkriptionelle Steuerung von Genen durch den HIF-Komplex inhibiert wird (Mahon

et al. 2001).

Unter hypoxischen Bedingungen kommt es zu einer Hemmung der PHD und der

FIH-1 Aktivität. Eine Veränderung des Eisenhaushaltes der Zelle sowie eine

Inhibition mit NO kann zudem eine Hemmung der PHDs unter Normoxie induzieren

(Zhou et al. 2003; Metzen et al. 2003). Die Hydroxylierung der HIF-1α Untereinheit

unterbleibt, wodurch diese in den Kern translozieren und Koaktivatoren rekrutieren

kann. Die Dimerisierung mit der β-Untereinheit führt schließlich zur transkriptionellen

Aktivität.

Einleitung 26

Abb. 1.7: Sauerstoffabhängige Regulation der HIF-α Aktivität.

Unter normoxischen Bedingungen hydroxylieren die sauerstoffabhängigen Prolylhydroxylasen (PHDs)

und der HIF-1-inhibierende Faktor (engl. factor inhibiting HIF, FIH-1) die Prolin- und Asparaginreste

des HIF-α. Dadurch erfolgen die durch das von Hippel-Lindau Tummorsuppressorprotein vermittelte

Ubiquitinierung und der proteasomale Abbau von HIF-α. Zudem wird die Interaktion der C-terminalen

Transaktivierungsdomäne mit dem Koaktivator p300/CPB verhindert. Unter hypoxischen Bedingungen

werden PHDs und FIH-1 gehemmt. HIF-α wird stabilisiert und transloziert in den Nukleus. Dort

dimerisiert es mit der β-Untereinheit, rekrutiert Koaktivatoren, und bildet somit das transkriptionell

aktive HIF Heterodimer (modifiziert nach Schofield & Ratcliffe 2004).

1.6.3 Sauerstoffunabhängige Regulation und Aktivierung von HIF-1

In verschiedenen Forschungen konnte gezeigt werden, dass eine HIF Aktivierung

nicht nur durch Hypoxie ausgelöst werden kann, sondern auch durch

inflammatorische Stimuli. So induziert LPS durch Aktivierung des

Transkriptionsfaktors NF-κB die HIF-1α mRNA Expression (Frede et al. 2006).

Jantsch et al. konnten zeigen, dass dieser Effekt außerdem von TLR4 und dem

Adaptorprotein MyD88 (engl. myeloid differentiation primary resonse gene 88)

abhängig ist. DCs von MyD88 Knock-out Mäusen zeigten nach LPS Stimulation

keine Induktion von HIF-1α (Jantsch et al. 2011). Weitere Studien beschrieben eine

Einleitung 27

HIF-1α mRNA Induktion durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und

inflammatorische Zytokine, wie IL-1β und TNF-α (Acker et al. 2006; Westra et al.

2007). In humanen Hepatomzellen konnte ebenfalls eine HIF-1 Aktivierung durch

entzündliche Prozesse gezeigt werden (Hellwig-Bürgel et al. 1999). Des Weiteren

kann die HIF-1α Transkription auch durch IFN-α über den JAK-ISGF3 (Janus

Kinase – IFN-γ-stimulierter Genfaktor-3) Signalweg in humanen Endothelzellen

induziert werden (Gerber & Pober 2008).

Abb. 1.8: Sauerstoffunabhängige Regulation der HIF-1α Aktivität.

Unter normoxischen Bedingungen wird HIF-1α sauerstoffabhängig von den PHDs hydroxyliert,

ubiquitiniert und proteasomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen oder durch NO Einwirkung

wird die Aktivität der PHDs gehemmt, was zu einer HIF-1α Proteinstabilisierung führt.

Inflammatorische Zytokine und Lipopolysaccharide (LPS) führen über die Aktivierung von

Signalkaskaden zu einer vermehrter Expression und Translation von HIF-1α mRNA und durch die

zusätzliche Rekrutierung von Koaktivatoren zu einer gesteigerten Transkription von HIF-1 Zielgenen

(modifiziert nach Frede et al. 2007).

Einleitung 28

1.6.4 Bedeutung von HIF-1 im Rahmen von Infektionen und Entzündungen

Verschiedene Studien konnten verdeutlichen, dass der Transkriptionsfaktor HIF-1

eine wichtige Rolle im Entzündungsgeschehen spielt. So konnte gezeigt werden,

dass Mäuse mit einem HIF-1α Knock-out in myeloischen Zellen eine deutliche

Beeinträchtigung in ihrer Immunfunktion aufweisen. HIF-1α defiziente Makrophagen

besitzen eine verminderte Fähigkeit zur Phagozytose und sind in ihrer Motilität und

Zellaggregation beeinträchtigt (Cramer et al. 2003). Zudem induziert HIF-1α die

Expression des β2-Integrins, ein Rezeptor, welcher für die Rekrutierung von

Leukozyten eine wichtige Rolle spielt (Kong et al. 2004). Auch Peyssonnaux et al.

konnten zeigen, dass die bakterizide Aktivität und die Produktion von TNF-α in

Makrophagen nach Infektion mit Streptokokken HIF-1α abhängig ist (Peyssonnaux et

al. 2005). Des Weiteren besteht ein Zusammenhang zwischen HIF-1 und der

Induktion von bestimmten TLRs. Kuhlicke et al. konnten eine hypoxische, HIF-1α

abhängige Induktion von TLR2 und TLR9 in verschiedenen Zellen nachweisen

(Kuhlicke et al. 2007).

Weitere Studien beschäftigten sich intensiv mit der Bedeutung von HIF-1 in

intestinalen Epithelzellen im Rahmen entzündlicher Darmveränderungen. Ein Verlust

von HIF-1α in Epithelzellen führte dabei zu einer deutlichen Verschlechterung der

Symptome, wohingegen die Stabilisierung von epithelialem HIF-1 einen protektiven

Effekt aufweist (Karhausen et al. 2004). Die Behandlung mit dem Hydroxylase

Inhibitor Dimethyloxalylglycin (DMOG), welcher den Abbau von HIF-1α verhindert,

führte zudem zu einer reduzierten Apoptoserate der Epithelzellen im DSS

Colitismodell (Cummins et al. 2008). Des Weiteren resultierte eine gesteigerte HIF

Expression durch die genetische Deletion der Prolylhydroxylase 1 (PHD1) in einer

gemilderten Ausprägungsform der Colitis mit reduzierter epithelialer Apoptose und

somit gesteigerter Barrierefunktion (Tambuwala et al. 2010).

Der Einfluss von HIF-1 auf die Funktion von DCs wurde in einigen Studien

beschrieben. Jantsch et al. zeigten, dass Hypoxie die LPS vermittelte Aktivierung von

DCs erhöht. Die Stimulation von murinen DCs mit LPS unter hypoxischen

Bedingungen führte zu einer erhöhten Expression der Aktivierungsmarker CD80 und

CD86, sowie des MHC-II-Oberflächenmoleküls. Ein Knock-down von HIF-1α

Einleitung 29

resultierte hingegen in einer verminderten Expression der Aktivierungsmarker und

einer eingeschränkten Fähigkeit der DCs allogene T-Zellen zu stimulieren (Jantsch et

al. 2008). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Befunden von Mancino et al.,

welche besagen, dass LPS stimulierte DCs unter Hypoxie eine geringere Expression

der Aktivierungsmarker CD40, CD80, CD83 und CD86 aufweisen, wohingegen die

Produktion von TNF-α und IL-1β erhöht ist (Mancino et al. 2008). Auch Bosseto et al.

stellten eine reduzierte Expression von CD80 und CD86 in DCs unter Hypoxie fest.

Die Produktion des proinflammatorischen Zytokins IL-12p70 durch DCs hingegen

war unter Hypoxie erhöht. Eine zusätzliche Infektion der Zellen mit Leishmania führte

wiederum zu einer erhöhten IL-12p70 Produktion unter Normoxie (Bosseto et al.

2010). Des Weiteren konnte ein direkter Zusammenhang zwischen HIF-1α in DCs

und der Produktion von Typ I Interferonen nachgewiesen werden. Ein Knock-out von

HIF-1α in DCs führte zu einer verringerten Produktion von Typ I Interferonen nach

LPS Stimulus, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen beeinträchtigt

wurde (Wobben et al. 2013).

Einleitung 30

1.7 Ziel der Dissertation

Dendritische Zellen sind wie alle Immunzellen im entzündeten Gewebe hypoxischen

Bedingungen ausgesetzt und müssen sich diesen anpassen (Eltzschig & Carmeliet

2011). Hierfür wird der Transkriptionsfaktor HIF-1 benötigt, welcher die zelluläre

Adaptation an Hypoxie reguliert. Verschiedene Studien haben die

unterschiedlichsten Effekte von HIF-1 für die Funktion von Immunzellen und speziell

von DCs beschrieben. Im Rahmen einer experimentellen Colitis wurde bislang

allerdings nur die Bedeutung von HIF-1 in intestinalen Epithelzellen untersucht

(Karhausen et al. 2004; Cummins et al. 2008). Hierbei wird HIF-1 eine protektive

Rolle zugeschrieben.

Da DCs von zentraler Bedeutung im Immungeschehen des Darmes sind, sollte in

dieser Arbeit nun der Effekt von dendritischem HIF-1 auf die Ausprägung einer

experimentellen Colitis untersucht werden. Dazu wurde durch orale Gabe von DSS

eine experimentelle Colitis in Kontrollmäusen (HIF-1α+f/+f) und in Mäusen mit einem

Knock-out von HIF-1α in DCs (CD11cCre/HIF-1α+f/+f) induziert. Der Schweregrad der

Entzündung, die Expression von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen sowie der

Einfluss von DCs auf weitere Immunzellen wurde untersucht. Da die Antigen-

präsentation von intestinalen DCs vornehmlich in mesenterialen Lymphknoten

stattfindet, wurden diese zusätzlich zum Colon untersucht. Zur Unterstützung dieser

in vivo Untersuchungen wurden zudem DCs aus dem Knochenmark der

beschriebenen Tiere generiert, unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und in

ihrer Aktivierbarkeit verglichen.

Material und Methodik

31

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Tabelle 2.1: Geräte

Gerät Hersteller

Absaugpumpe Biotec

Auflichtmikroskop CK 40 Olympus

Brutschrank Hera cell Heraeus Instruments

CO2 Brutschrank Thermo

ELISA-Reader Spectra Count Packard

Spektrophotometer-System Epoch/Take 3 Biotec

Fluoreszenz- und Chemilumineszenzsystem Fusion-FX 7 Peqlab

Fluoreszenzmikroskop Eclipse E1000 Nikon

Gas Mixer Q Ruskinn

Gefrierschrank Liebherr

Heizblock HTM 130 / HTM 130-6 HLC

Hypoxie-Brutschrank BB6620 CUO2 Heraeus Instruments

iCycler iQ5, Multicolor Real-Time PCR Detection System Bio-Rad

Invivo2 400 Hypoxia Workstation Ruskinn

Kamerasystem DS Ri1 Nikon

Kühlschrank Liebherr

Mastercycler Eppendorf

Microm HM 340E Thermo Scientific

Mini Protean 3 Bio-Rad

Mini-Protean® Tetra Cell Bio-Rad

pH-Meter Eutech Instruments

Photometer SmartSpec 3000 Bio-Rad

ScanScope CS2 Aperio


32

Schüttler Titramax 101 Heidolph

Sterilbank HERA Safe Heraeus Instruments

Thermocycler Tpersonal / Tprofessional Biometra

UV-Geldokumentationsanlage BioDoc-It UVP

Vortexer Bioproducts

Western Blot-Kammer Mini Trans-Blot© Bio-Rad

Zählkammer nach Neubauer BD

Zentrifugen Eppendorf und Heraeus

Tabelle 2.2: Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Hersteller

8er Kette optisch klar flacher Deckel Sarstedt

Bechergläser Schott

Deckgläser Engelbrecht

Einmalspritzen (2 ml, 5 ml, 10 ml) B. Braun

Erlenmeyerkolben Schott

Gel-blotting-Papiere, GB003 Schleicher & Schuell

hema-screenTM

Immunostics.inc.

Kanülen (G27 ¾") BD

Microtome Blade S35 Feather

96 Multiply® PCR Platte natur Sarstedt

Nitrocellulose-Transfermembran, 0,2 µm Porengröße Schleicher & Schuell

Pinzetten Oehmen

Plastikpipetten (steril, 1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Greiner bio-one

PP-Schraubverschluss Röhrchen (15 ml, 50 ml) Greiner bio-one

Reaktionsgefäß (1,5 ml, 2 ml) Eppendorf

Rotilabo®-Einbettkassetten Roth

Safe-Lock Tubes 0,5 ml Eppendorf


33

Scheren Oehmen

SuperFrost® Plus Objektträger R. Langenbrinck

Zellkulturflaschen (T25, T75, T175) Greiner bio-one

Zellkulturplatte steril (6 Vertiefungen) Greiner bio-one

2.1.2 Chemikalien

Tabelle 2.3: Chemikalien


4,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma

Aceton Sigma

Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) Bio-Rad

Agarose Invitrogen

Alcian Blue Solution Sigma

Ammoniumchlorid Sigma

Ammoniumpersulfat (APS) Bio-Rad

Bromphenolblau Sigma

Bovines Serum Albumin (BSA) SERVA

Cytoseal XYL Thermo Scientific

Fluorescence Mounting Medium Dako

Dextrannatriumsulfat MP Biomedicals

Diethylpyrocarbonat (DEPC) Sigma

ECL Advance™ Western Blotting Detection Kit GE Healthcare

Eosin Y Lösung Sigma

Essigsäure Fluka

Ethanol Roth

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck

Ethidiumbromid Sigma

Fetal calf serum (FCS) Biochrom AG


34

Glutamin Invitrogen

Glycerin Merck

Glycin Fluka

Guanidinthiocyanat (GTC) Roth

Isopropanol Sigma

Kaliumchlorid AppliChem

Kaliumdihydrogenphosphat Merck

Lipopolysaccharid (LPS) Sigma

Mayers Hämalaunlösung Merck

Mouse IL-6 ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

Mouse IL-10 ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

Mouse TSLP ELISA MAX™ Deluxe BioLegend

β-Mercaptoethanol Merck

Methanol Sigma

Natriumacetat Sigma

Natriumazid AppliChem

Natriumchlorid Fluka

Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth

Natriumhydrogencarbonat Fluka

Natriumdihydrogenphosphat Fluka

Natriumpyruvat Gibco

Normal goat serum (NGS) Sigma

Normal rabbit serum (NRS) Invitrogen

Nukleosidtriphosphate Invitrogen

Paraffin McCormick

Paraformaldehyd (PFA) Sigma

Penicillin Gibco

Phenol AppliChem

Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol AppliChem


35

Pimonidazole HPI

Ponceau S Sigma

Protease-Inhibitor Roche Diagnostics

RPMI-Medium 1640 Gibco

Salzsäure Fluka

Streptomycin Gibco

Target Retrieval Solution Dako

Tris-aminomethan (Tris-Base) Fluka

Tris-HCl Roth

Trypanblau Merck

Trypsin-EDTA Gibco

Tween 20 Roth

Vector Mouse on Mouse (M.O.M.TM

) Kit Vector Labs

Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck

Xylol Roth

2.1.3 Puffer und Lösungen

BmDC-Medium: RPMI 1640

10 % FCS

4 mM Glutamin

1mM Natriumpyruvat

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

0,06 mM β-Mercaptoethanol

Blotpuffer (Western Blot): 25 mM Tris-Base

96 mM Glycin

20 % Methanol


36

DEPC-H2O: 500 ml H2O

0,5 ml DEPC

1 h bei RT rühren, autoklavieren

Laufpuffer (Western Blot): 25 mM Tris-Base

192 mM Glycin

3,5 mM SDS

Lower Buffer 1,5 M Tris-Base

(Western Blot): 13,9 mM SDS

pH 8,8

Lysepuffer (Gesamtlysat): 150 mM NaCl

10 mM Tris-Base

1 mM EDTA

0,5 % NP 40

1 % Protease-Inhibitor

PBS: 137 mM NaCl

2,7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

2 mM KH2PO4

pH 7,2

PBS-T: 1 x PBS

0,05 % Tween 20


37

4 x SDS (Western Blot): 0,4 ml Aqua dest.

1,6 ml 0,5 M Tris pH 6,8

3,2 ml 10 % SDS

0,8 ml β-Mercaptoethanol

0,4 ml 0,5 % Bromphenolblau

10 % Glycerin

TAE (PCR): 40 mM Tris-Base

0,11 % Essigsäure

1 mM EDTA pH 8,0

TBS: 137 mM NaCl

20 mM Tris-HCl

pH 7,6

TBS-T: 1 x TBS

0,1 % Tween 20

Upper Buffer 252 mM Tris-Base

(Western Blot): 6,9 mM SDS

pH 6,8

2.1.4 Antikörper

Tabelle 2.4: Antikörper für Western Blot

Antikörper Typisierung Hersteller

β-Aktin Kaninchen Abcam

HIF-1α Kaninchen Cayman chemical

HRP-konjugiert anti-Kaninchen Ziege Sigma


38

Tabelle 2.5: Antikörper für die Immunfluoreszenz

Primärantikörper Typisierung Hersteller

Foxp3 Ratte eBioscience

Muc-2 Kaninchen Santa Cruz

Pimonidazole (HP-1) Maus HPI

Sekundärantikörper Antigen Hersteller

anti-Kaninchen Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

anti-Maus Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

anti-Ratte Alexa 568 Ziege IgG Invitrogen

2.1.5 Zytokine

muGM-CSF

Das murine GM-CSF wurde aus dem Überstand der Zelllinie NIH 3T3-GM-CSF

gewonnen. Die Zellen wurden unserem Institut von Herrn Prof. Dr. Dittmer

(Universität Duisburg-Essen, Essen) zur Verfügung gestellt.

muIL-4

Das murine Interleukin-4 wurde aus dem Überstand der Zelllinie NIH 3T3-IL-4

gewonnen. Die Zellen wurden unserem Institut von Herrn Prof. Dr. Dittmer

(Universität Duisburg-Essen, Essen) zur Verfügung gestellt.


39

2.1.6 Oligonukleotide

Tabelle 2.6: Murine Primer

Zielgen Sequenz Produktlänge

(bp)

qPCR

Bedingungen

5’ α4-Integrin

3’ α4-Integrin

TAC AAT GGC CGA GTC GAT GG

ATG CAC CAA CGG CTA CAT CA

151 60°C, 40 Zyk.

5‘ Aldh1a2

3‘ Aldh1a2

ATC GCT TCT CAC ATC GGC AT

CAG CGT AGT CCA AGT CAG CA

166 60°C, 40 Zyk.

5’ β7-Integrin

3’ β7-Integrin

TGA GAC CCC AAG AGA AGG GAG

GAT TTC CAC AGA GAG CCG GT

116 60°C, 40 Zyk.

5’ CCR 9

3’ CCR 9

ACT CAC AAG CCT TAT TCC TGG C

CCA AGG TGC CCA CAA TGA AC

179 60°C, 40 Zyk.

5’ CD 4

3’ CD 4

TGA AGG AAA CGC TCC CAC TC

AGC AGT GCT GAT GTC TTG CT

136 60°C, 40 Zyk.

5’ CD 8a

3’ CD 8a

ACC CTT GGC CGG AAT CTG CG

CTG TCT GAC TAG CGG CCT GGG A

112

60°C, 40 Zyk.

5‘ F4/80

3‘ F4/80

TCT GGG GAG CTT ACG ATG GA

GAA TCC CGC AAT GAT GGC AC

237 60°C, 40 Zyk.

5‘ Foxp 3

3‘ Foxp 3

CTG GCG AAG GGC TCG GTA GTC CT

CTC CCA GAG CCC ATG GCA GAA GT

250 60°C, 40 Zyk.

5’ HIF-1α

3’ HIF-1α

GAA ATG GCC CAG TGA GAA AA

CTT CCA CGT TGC TGA CTT GA

119 60°C, 40 Zyk.

5’ HIF-1α Exon 2

3’ HIF-1α Exon 2

CAT CCA GAA GTT TTC TCA CAC G

GGC GAA GCA AAG AGT CTG AA

138 60°C, 40 Zyk.

IFN-α 4 QuantiTect Primer Assay, Qiagen 53°C, 42 Zyk.

IFN-α 12 QuantiTect Primer Assay, Qiagen 53°C, 42 Zyk.

5’ IL-1β

3’ IL-1β

CCT CTC CAG CCA AGC TTC CT

TTT GGA AGC AGC CCT TCA TC

151 60°C, 40 Zyk.

5’ IL-6

3’ IL-6

TCC TAC CCC AAT TTC CAA TGC

CAT AAC GCA CTA GGT TTG CCG

151 60°C, 40 Zyk.


40

5’ IL-10

3’ IL-10

TGC CCC AGG CAG AGA AGC AT

GGG AGA AAT CGA TGA CAG CGC C

109 60°C, 40 Zyk.

5’ IL-23 p19

3’ IL-23 p19

ACC AGC GGG ACA TAT GAA TCT

AGA CCT TGG CGG ATC CTT TG

147 65°C, 45 Zyk.

5’ Lipocalin 2

3’ Lipocalin 2

ACG GAC TAC AAC CAG TTC GC

CAT TGG TCG GTG GGG ACA GA

188 60°C, 40 Zyk.

5’ MUC 1

3’ MUC 1

TCA CCC CAG TTG TCT GTT GG

GCC TGA CCT GAA CTT GAT GC

192 57°C, 40 Zyk.

5’ MUC 2

3’ MUC 2

GCT GAC GAG TGG TTG GTG AAT G

GAT GAG GTG GCA GAC AGG AGA C

135 63°C, 40 Zyk.

5’ MUC 3

3’ MUC 3

AGT GCT GTT GGT GAT CCT CG

AGA GTC CAG GGG CAT GTA GT

193

57°C, 40 Zyk.

5’ OX 40

3’ OX 40

GCC CTG CAT TTG CTG TTC TC

AGC TGT TTC CCC AAC AAG GT

132 60°C, 40 Zyk.

5’ RARα

3’ RARα

CAG AGC AGC AGT TCC GAA GA

CCG GGT CAC CTT GTT GAT GA

222 60°C, 40 Zyk.

5’ rib. Protein

3’ rib. Protein

AGA TGA TCG AGC CGC GC

GCT ACC AGG GCC TTT GAG ATG GA

163 60°C, 40 Zyk.

5’ SAA

3’ SAA

GAA AGA AGC TGG TCA AGG GTC

TCC GGG CAG CAT CAT AGT TC

119 60°C, 40 Zyk.

5’ TFF 3

3’ TFF 3

CCT GGT TGC TGG GTC CTC TG

GCC ACG GTT GTT ACA CTG CTC

133 60°C, 40 Zyk.

5’ TGF-β

3’ TGF-β

AAC CCC AAA GCC AGA GTG G

CGT CTG TCA CGT CGA AGG AG

151 62°C, 40 Zyk.

5’ TSLPR

3’ TSLPR

TTT CCG GGG CAG CAT CC

CGC ATC TTT CAC CCT GCG AA

188 62°C, 40 Zyk.


41

Tabelle 2.7: Murine Genotypisierungsprimer

Zielgen Sequenz Produktlänge

(bp)

PCR

Bedingungen

5‘ HIF-1 α DF

3‘ HIF-1 α DF

GGA GCT ATC TCT CTA GAC C

GCA GTT AAG AGC ACT AGT TG

WT ~ 200

DF ~ 250

57°C, 34 Zyk.

5’ CD 11c Cre

3’ CD 11c Cre

ACT TGG CAG CTG TCT CCA AG

GCG AAC ATC TTC AGG TTC TG

313 63°C, 35 Zyk.

5’ CD 11c Cre

pos. Kontrolle

3’ CD 11c Cre

pos. Kontrolle

CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG

GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT

206 63°C, 35 Zyk.

2.1.7 cDNA-Synthese, PCR und Real Time PCR

Tabelle 2.8: Reagenzien für cDNA-Synthese, PCR, Real Time PCR, PCR Array


5x GoTaq® Buffer Invitrogen

100 bp DNA Ladder Invitrogen

GoTaq© DNA Polymerase Promega

M-MLV Reverse Transcriptase Promega

M-MLV RT 5x Reaction Buffer Promega

MESA Green qPCR MastermixPlus for SYBR® ASSAY Eurogentec

NTPs Qiagen

Oligo dT Invitrogen

Primer Invitrogen

RNeasy Mini Kit Qiagen

RT2 First Stand Kit (12) Qiagen

RT2 Profiler PCR Array

Mouse Crohn´s Disease

Qiagen

RT2 SYBR® Green Fluor qPCR Mastermix Qiagen


42

2.2 Methoden

2.2.1 Tierexperimentelle Methoden

2.2.1.1 Tierhaltung und –zucht

Alle Mäuse wurden im Zentralen Tierlaboratorium des Universitätsklinikums Essen

unter speziell pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten. Bis zu fünf Tiere lebten

zusammen in Makrolon©-Filterkäfigen Typ III bei einer Umgebungstemperatur von

20 °C und einem konstanten 12 h-Tag-Nacht-Rhythmus. Die Tiere erhielten

pelletiertes Alleinfuttermittel und Trinkwasser ad libitum.

Die Genehmigung des Tierversuchs wurde vom Landesamt für Natur, Umwelt und

Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen unter dem Aktenzeichen

84-02.04.2011.A098 erteilt.

2.2.1.2 Transgene Mausstämme

Für die vorliegenden Studien wurden transgene Mausstämme mit einem C57BL/6J

Hintergrund verwendet. Es handelte sich bei den verwendeten Tieren um Mäuse mit

einem konditionellen Knock-out von HIF-1α in CD11c+ dendritischen Zellen. Die

genetische Inaktivierung erfolgte mithilfe des Cre/loxP-Systems. In Zielmäusen ist

hierbei das Exon 2 des HIF-1α Gens auf beiden Allelen von loxP-sites flankiert

(HIF-1αf+/f+). Um einen konditionellen Knock-out von HIF-1α zu generieren, wurden

diese homozygot-gefloxten Mäuse mit Mäusen gepaart, bei denen die Sequenz für

die Cre-Rekombinase der Kontrolle des murinen Integrin α X (CD11c) Promoters

unterliegt. Die Expression der Cre-Rekombinase führt zu einem Verlust des Exons 2

des HIF-1α Gens. Die daraus resultierende mRNA führt zur Bildung eines verkürzten,

nicht funktionellen HIF-1α Proteins. Die so generierten Knock-out Mäuse

(CD11cCre/HIF-1αf+/f+) exprimierten das Cre heterozygot in den CD11c+, also

vornehmlich dendritischen Zellen. Geschwistertiere ohne Cre-Rekombinase Aktivität

(HIF-1αf+/f+) dienten als sogenannte Wild-typ Kontrollen.


43

Die HIF-1αf+/f+ Mäuse wurden ursprünglich von Prof. Dr. Randall Johnson (University

of California, San Diego) und die CD11cCre Mäuse von Prof. Dr. Boris Reizis

(Columbia University Medical Centre, New York) generiert.

Alle verwendeten Mäuse zeigten unter physiologischen Umständen einen

ungestörten Habitus und züchten normal.

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Cre/loxP-Knockout-Systems.

Durch die Kreuzung von Mäusen mit einem doppelt gefloxten Exon 2 auf dem HIF-1α Gen mit

Mäusen, die eine Expression von Cre unter der Kontrolle des Integrin α X Promoters aufweisen,

entstehen Mäuse mit einem um das Exon 2 verkürzten HIF-1α Gen und funktionslosem Protein in

CD11c+ Zellen.

2.2.1.3 Genotypisierung

Die Mäuse wurden im Alter von etwa vier Wochen abgesetzt und durch das

Ausstanzen eines oder mehrerer Ohrlöcher markiert. Das Ohrgewebe wurde mit

300 µl 50 mM NaOH versetzt und mindestens für eine Stunde bei 100 °C unter

leichten Schüttelbewegungen erhitzt. Anschließend wurden 30 µl 1 M Tris-HCl zu

den Proben gegeben, gevortext und die Gewebereste abzentrifugiert. Es wurden

2,5 µl freigesetzte genomische DNA und 22,5 µl des Mastermixes für die

Genotypisierungs-PCR eingesetzt.

loxP – Maus (HIF-1α+f/+f

)

HIF-1α Gen

Ex.1 Ex.2 Ex.3 Ex.4

Cre-loxP – Maus (CD11cCre/HIF-1α+f/+f

)

Ex.1 Ex.3 Ex.4

CD11cCre - Maus

Integrin α X Gen

Promoter x


44

Tabelle 2.9: Mastermix für die Genotypisierung

Volumen (µl)

PCR-Puffer (5x) 5

dNTP 2

je Primer (20 pmol/µl) 0,5

H2O 14,5

Taq-Polymerase 0,05

Tabelle 2.10: Exemplarisches PCR-Programm für die Genotypisierung

Die Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl wurden der zu amplifizierenden DNA entsprechend

angepasst.

Temperatur (°C) Dauer (min) Zyklen

Initiale Denaturierung 96 3 1

Denaturierung 96 1

Annealing 60 1 x 30

Elongation 72 3

Finale Elongation 72 10 1

2.2.1.4 DSS Modell

Zur Induktion einer Colitis wurde Dextrannatriumsulfat (DSS, engl. dextran sodium

sulfate) in einer 3%igen Konzentration verwendet (Okayasu et al. 1990; Vowinkel et

al. 2004). Es handelt sich bei DSS um ein sulfatiertes Polysaccharid, welches die

Tiere peroral für 7 Tage via Trinkwasser ad libitum erhielten und aufgrund dessen an

einer Colitis erkrankten. Durch die Gabe von 3 % DSS über 7 Tage wird laut

Vowinkel et al. bei Mäusen des C57BL/6J Stammes die erforderliche Schwellendosis

von 30 mg DSS pro Gramm Körpergewicht vollständig erreicht, um zuverlässig eine

Colitis zu induzieren (Vowinkel et al. 2004). Geringe Trinkmengenunterschiede im

Verlauf des Versuches sind somit vernachlässigbar. Die Tiere waren zu Beginn des


45

Versuches mindestens zehn Wochen alt. Wild-typ Tiere (HIF-1αf+/f+) und Knock-out

Tiere (CD11cCre/HIF-1αf+/f+) wurden getrennt voneinander jeweils zu zweit zwei

Tage vor Gabe des DSS in einem Käfig zusammengesetzt. Es wurde ausschließlich

DSS der Firma MP Biomedicals aus ein und derselben Charge verwendet, damit

Schwankungen des Schwefelgehaltes ausgeschlossen werden konnten. Des

Weiteren betrug das Molekulargewicht des DSS hierdurch konstant 36000 – 50000

Dalton, was sehr entscheidend ist, da dieses großen Einfluss auf die Ausprägung der

Colitis hat (Kitajima et al. 2000). Das DSS wurde in unbehandeltem Leitungswasser

gelöst und an Tag 3 des Versuches erneuert. Das Körpergewicht der Tiere wurde

täglich kontrolliert und die prozentuale Veränderung des Gewichtes errechnet. Die

klinische Einstufung der Erkrankung erfolgte mithilfe eines Disease Activity Index

(DAI) (Cooper et al. 1993; Williams et al. 2001; Cummins et al. 2008). Der DAI setzt

sich aus den jeweiligen Punktzahlen für den prozentualen Verlust an Körpergewicht,

die Beschaffenheit des Stuhles und das Ergebnis eines Tests auf okkultes Blut im

Stuhl zusammen. Es handelt sich hierbei um einen Haemoccult-Test, bei welchem

durch Kontakt des Stuhles mit einer Indikatorlösung okkultes Blut durch einen

Farbumschlag detektiert werden kann. Die Einzelpunktzahlen wurden addiert,

woraus ein maximaler Score von 12 resultierte. Die genaue Zusammensetzung des

DAI ist in Tabelle 2.11 dargestellt. Der DAI wurde täglich für jedes einzelne Tier

bestimmt.


46

Tabelle 2.11: Disease Activity Index

Score Beschreibung

Gewichtsverlust 0 0 %

1 1-5 %

2 6-10 %

3 11-20 %

4 > 20 %

Stuhlbeschaffenheit 0 geformt

2 breiig

4 flüssig

Blut im Stuhl 0 Hema-Screen negativ

2 Hema-Screen positiv

4 sichtbare Blutung

2.2.1.5 Pimonidazol-Injektion

Zur immunhistochemischen Darstellung von hypoxischem Gewebe wurde den

Mäusen eine Stunde vor Versuchsende 60 mg Pimonidazol pro kg, gelöst in 100 µl

0,9 % NaCl, intraperitoneal injiziert. Pimonidazol (Hydroxyprobe™-1) stellt ein

substituiertes 2-Nitroimidazol dar, welches unter normoxischen Bedingungen leicht

oxidativ metabolisiert und als N-Oxid, Sulfat und Gluconat eliminiert wird. Unter

hypoxischen Bedingungen (pO2 < 10 mm Hg) wird es reduktiv aktiviert und bildet

kovalente Bindungen mit Sulfhydrylgruppen umgebender Protein, Peptide und

Aminosäuren (Arteel et al. 1998; Gross et al. 1995). Die entstanden Produkte können

in Gewebeschnitten anschließend durch spezifische Antikörper detektiert werden, so

dass das hypoxische Gewebe sichtbar gemacht wird (Samoszuk et al. 2004).


47

2.2.1.6 Organentnahme

Zur Organentnahme wurden die Tiere an Tag 7 des DSS Versuches durch

Genickbruch getötet und in Rückenlage fixiert. Sowohl die Haut als auch das

Peritoneum wurde durch Längsschnitt durchtrennt. Als erstes wurden die

mesenterialen Lymphknoten entfernt und für die RNA-Isolation bis zur weiteren

Verwendung erst in flüssigem Stickstoff und dann in einem -80 °C Gefrierschrank

gelagert. Das Colon wurde in seiner gesamten Länge freipräpariert, am Übergang

zum Caecum und Rektum durchtrennt und entnommen. Anschließend wurde es

vorsichtig mit PBS gespült, gewogen und die Länge gemessen. 0,5 cm des distalen

Colonendes wurden für die RNA-Isolation verwendet und bis zur Homogenisierung

des Gewebes zunächst in flüssigem Stickstoff und dann in einem -80 °C

Gefrierschrank gelagert. Die nächsten 1 cm des distalen Colons wurden für

histologische Arbeiten in 4 % PFA fixiert. Von einigen Tieren wurde auch das

restliche Colon für die Erstellung sogenannter Swiss Rolls in 4 % PFA fixiert (s.

Abschnitt 2.2.4.1). Für die Durchführung des ELISA wurde von den dafür

verwendeten Tieren die komplette distale Hälfte des Colons zunächst in flüssigem

Stickstoff und anschließend bis zur weiteren Verarbeitung in einem -80 °C

Gefrierschrank gelagert. Für die Gewinnung des Knochenmarks wurden die

Hinterbeine der Tiere präpariert. Dazu wurde die Haut entlang des Hinterbeins

eröffnet und von der darunter liegenden Muskulatur abgelöst. Die Knochen wurden

vollständig von Muskeln und Sehnen befreit und nach dem Durchtrennen des

Fußgelenkes und des Beckens entnommen. Ober- und Unterschenkelknochen

wurden daraufhin in einer 6-Well-Zellkulturplatte mit PBS auf Eis gelegt.

2.2.2 Zellkultur

2.2.2.1 Dendritische Zellen aus dem Knochenmark

Das Knochenmark aus Femur und Tibia von Wild-typ und Knock-out Tieren wurde

mit ca. 5 ml PBS durch die Epiphysenöffnung ausgespült. Das so gewonnene

Knochenmark wurde gesammelt und resuspendiert, um eine Einzelzellsuspension zu

erhalten. Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 90 µl der Suspension mit 0,4 %


48

Trypanblau 1:10 verdünnt und in einer Neubauerkammer gezählt. Trypanblau färbt

tote Zellen an. Für die Zellzahlbestimmung wurden nur lebende Zellen gezählt. Der

Rest der Zellsuspension wurde für 5 min bei 4 °C und 1500 rpm zentrifugiert und das

Zellpellet danach mit Medium auf 1x107 Zellen pro ml eingestellt. Zur Generierung

von aus dem Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen (engl. bone marrow-

derived dendritic cells, BmDC) wurde von dieser Zellsuspension 100 µl pro

Vertiefung in eine 6-Well-Zellkulturplatte gegeben. Dazu wurde je 1 ml

BmDC-Medium mit 5 ng/ml GM-CSF und 1 ng/ml IL-4 gegeben, so dass eine

Konzentration von 1x106 Zellen pro ml vorlag. Die Zellen wurden in einem

Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 in wasserdampfgesättigter Umgebung kultiviert.

Bei einem Teil der Zellen erfolgte die Kultivierung in einer Hypoxiekammer mit

3 % O2. Alle zwei Tage wurde 1 ml Medium durch frisches Medium mit Zytokinen

ersetzt. Für die RNA- und Proteinisolierung wurden die BmDCs nach acht Tagen in

den Versuch genommen (Sallusto & Lanzavecchia 1994). Hierbei wurde ein Teil der

Zellen unstimuliert belassen. Ein weiterer Teil wurde mit dem TLR4-Agonisten

Lipopolysaccharid (LPS) in einer Konzentration von 1 µg/ml stimuliert. Beide Ansätze

wurden für den Proteinnachweis vier Stunden und für die RNA-Isolation sechs

Stunden jeweils unter Normoxie und Hypoxie (3 % O2) inkubiert.

2.2.3 Molekularbiologische Methoden

2.2.3.1 RNA Isolierung

Die Isolation der RNA aus den BmDCs erfolgte mithilfe der Phenol-Chloroform-

Extraktionsmethode nach Chomczynski & Sacchi (1987). Dazu wurde das Medium

der BmDCs zu Versuchsende komplett aus den 6-Well-Zellkulturplatten entfernt,

700 µl 4 M GTC in jede Vertiefung gegeben und die Platten über Nacht bei -20 °C

eingefroren. Nach dem Auftauen wurde der Inhalt in ein 2 ml

Eppendorfreaktionsgefäß überführt und 70 µl 2 M Natriumacetat hinzugegeben.

Anschließend wurden die Proben mit 500 µl Phenol und 350 µl

Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol versetzt. Die Proben wurden geschüttelt,

gevortext, 60 min auf Eis inkubiert und daraufhin für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm

zentrifugiert. Durch dieses Vorgehen erhält man eine Trennung der Probe in drei


49

Phasen: die oberste, wässrige Phase enthält die RNA, die Interphase die DNA und

die untere, organische Phase die Proteine. Die obere Phase wurde in ein neues

1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt, 600 µl Isopropanol zugegeben und die

Probe über Nacht bei -20 °C eingefroren. Am nächsten Tag wurden die Proben direkt

für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die

RNA-Pellets bei Raumtemperatur 30 – 60 min getrocknet und 300 µl GTC und 500 µl

Isopropanol zugegeben. Nach erneuter Inkubation bei -20 °C über Nacht wurden die

Proben wieder für 30 min bei 4 °C und 13200 rpm zentrifugiert und das Pellet nach

Verwerfen des Überstandes mit 500 µl 75%igem Ethanol gewaschen. Daraufhin

wurden die Proben ein letztes Mal bei 4 °C und 13200 rpm für 30 min zentrifugiert,

der Überstand abgegossen, die Pellets getrocknet und anschließend je nach Größe

in 10 – 20 µl DEPC-H2O gelöst und für 10 min bei 60 °C erhitzt. Der RNA Gehalt

wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die Reinheit der

Proben wurde über das Verhältnis der gemessenen Absorption bei 260 und 280 nm

bestimmt. Es wurden nur Proben verwendet bei denen ein Quotient zwischen 1,7

und 2,0 vorlag. Die RNA wurde anschließend bei -20 °C eingefroren.

Die Isolation der RNA aus Gewebeproben erfolgte mithilfe des Qiagen RNeasy Mini

Kits. Die RNA wird hierbei an eine Silicagel-Membran gebunden, Kontaminationen

entfernt und nachfolgend die gewaschene RNA von der Membran eluiert. Dazu

wurden die Proben mit je 600 µl RLT-Puffer, zu welchem 1 % frisches

β-Mercaptoethanol gegeben wurde, homogenisiert und über Nacht bei -20 °C

eingefroren. Am nächsten Tag wurden 600 µl 70%iges Ethanol zu den Proben

gegeben und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. 700 µl je Probe wurden auf ein

RNeasy-Röhrchen gegeben und für 15 s bei 12000 rpm und Raumtemperatur

zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Nun wurde der Rest der Proben auf

die Röhrchen gegeben und ebenso zentrifugiert. Der Durchfluss wurde wieder

verworfen. Anschließend wurden je 700 µl RW1 Puffer aus dem RNeasy Mini Kit auf

die Röhrchen pipettiert und für 15 s bei 12000 rpm und Raumtemperatur

zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Als nächstes wurden 500 µl RPE

Puffer auf die Röhrchen gegeben und unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert.


50

Der Durchfluss wurde wieder verworfen. Weitere 500 µl RPE Puffer wurden auf je ein

Röhrchen gegeben. Die Proben wurden nun für 2 min bei 12000 rpm und

Raumtemperatur zentrifugiert. Abschließend wurden je 30 µl RNase freies Wasser

zum Eluieren der Membran auf die Röhrchen gegeben und für 1 min bei 13200 rpm

und Raumtemperatur zentrifugiert. Der Durchfluss wurde noch einmal auf die

Membran pipettiert und unter gleichen Umständen zentrifugiert. Der Gehalt der

isolierten RNA wurde wie oben beschrieben photometrisch bestimmt und die RNA

anschließend bei -20 °C gelagert.

2.2.3.2 Reverse Transkription

Für die cDNA-Synthese der BmDCs wurde 1 µg RNA mit 2,5 µl Oligo-dT Primern und

DEPC-H2O auf insgesamt 12 µl gebracht. Für die Gewebeproben wurden 3 µg RNA

eingesetzt und diese mit 5 µl Oligo-dT Primern und DEPC-H2O auf 24 µl aufgefüllt.

Die Proben wurden 10 min bei 68 °C erhitzt und anschließend 5 min auf Eis gekühlt.

Zu den Proben der BmDCs wurde daraufhin 13 µl Mastermix, zu den Gewebeproben

26 µl Mastermix gegeben. Die Umschreibung der RNA erfolgte im Thermocycler bei

45 °C für 90 min und 52 °C für 30 min. Die Denaturierung erfolgte bei 95 °C für

15 min. Die cDNA wurde anschließend bei 4 °C gelagert.

Tabelle 2.12: Mastermix für die cDNA Synthese

Volumen (µl)

M-MLV Buffer (5x) 5

dNTP 5

DEPC-H2O 2,5

M-MLV Reverse Transkriptase 0,5


51

2.2.3.3 PCR und quantitative Real Time PCR

cDNA kann mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, engl. polymerase chain

reaction) amplifiziert werden. Der Mastermix für die PCR wird wie in Tabelle 2.13

hergestellt, in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und 0,5 µl cDNA hinzugegeben.

Tabelle 2.14 zeigt ein exemplarisches PCR-Programm, bei welchem die

Annealing-Temperatur und die Zyklenzahl abhängig von den verwendeten Primern

angepasst wurden. Die amplifizierte Menge cDNA wurde nun zusammen mit einem

Größenstandard auf ein 2%iges Agarosegel mit 0,07 % Ethidiumbromid aufgetragen,

mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und durch UV-Licht in einer

Geldokumentationskammer dargestellt.

Tabelle 2.13: Mastermix für PCR

Volumen (µl)

PCR-Puffer (5x) 5

dNTP 2

je Primer (20 pmol/µl) 0,5

H2O 17

Taq-Polymerase 0,05

Tabelle 2.14: Exemplarisches PCR-Programm


angepasst.



Denaturierung 96 1

Annealing 60 1,5 x 30

Elongation 72 1

Finale Elongation 72 10 1


52

Die Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels Echtzeit-PCR (Real Time PCR). Hierzu

wurden Reaktionsansätze von 50 µl je Probe erstellt und diese, sowie ein Leerwert,

als Doppelbestimmung (2 x 20 µl) in 96-Well-Platten pipettiert. Die PCR-Reaktion mit

gleichzeitiger Fluoreszenz-Messung wurde als Zweistufen-PCR mithilfe des iCycler

Detektionssystems von Bio-Rad durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels der

ΔΔCT Methode (engl. Cycle Threshold). Dabei werden die ermittelten CT-Werte der

einzelnen Proben auf die CT-Werte des homogen exprimierten Gens ribosomales

Protein normalisiert und die Unterschiede der Genexpression der zu vergleichenden

Proben als n-fache Änderung berechnet (Winer et al. 1999).

Tabelle 2.15: Mastermix für Real Time PCR

Volumen (µl)

MESA Green qPCR MastermixPlus 25

H2O 22

je Primer (20 pmol/µl) 1

cDNA 1

Tabelle 2.16: Exemplarisches Real Time PCR-Programm


angepasst.



Denaturierung 95 0,25

Annealing/

Elongation

60 1,5 x 40


53

2.2.3.4 PCR Array

Mit Hilfe eines PCR Arrays ist die Quantifizierung sehr vieler mRNAs in einer Probe

gleichzeitig möglich. Im verwendeten Array wurde die Expression von mRNAs

untersucht, welche im Zusammenhang mit Morbus Crohn stehen (RT2 Profiler PCR

Array Mouse Crohn´s Disease, PAMM-169ZA, Qiagen). Es handelte sich um eine

96-Well-Platte auf welcher insgesamt 84 mRNAs untersucht werden konnten.

Zusätzlich waren fünf Referenzgene, eine Kontrolle auf genomische DNA, drei

reverse Transkriptase Kontrollen und drei positive PCR Kontrollen auf der Platte

vorhanden.

Tabelle 2.17: Zusammenstellung der im Array untersuchten Gene

Abkürzung Beschreibung des Genes

Abcb1a ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1A

Adh1 Alcohol dehydrogenase 1 (class I)

Aldob Aldolase B, fructose-bisphosphate

Atg16l1 Autophagy-related 16-like 1 (yeast)

C3 Complement component 3

Casp1 Caspase 1

Ccl11 Chemokine (C-C motif) ligand 11





Ccr1 Chemokine (C-C motif) receptor 1




Cd55 CD55 antigen

Chi3l1 Chitinase 3-like 1


54

Cldn8 Claudin 8

Col1a2 Collagen, type I, alpha 2

Cr2 Complement receptor 2

Csta Cystatin A

Cx3cl1 Chemokine (C-X3-C motif) ligand 1

Cx3cr1 Chemokine (C-X3-C) receptor 1

Cxcl1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 1







Cxcr1 Chemokine (C-X-C motif) receptor 1

Cxcr3 Chemokine (C-X-C motif) receptor 3

Edn3 Endothelin 3

Egr3 Early growth response 3

Fpr1 Formyl peptide receptor 1

Gcg Glucagon

H2-Aa Histocompatibility 2, class II antigen A, alpha

H2-Eb1 Histocompatibility 2, class II antigen E beta

Hsp90b1 Heat shock protein 90, beta (Grp94), member 1

Hspa5 Heat shock protein 5

Ifng Interferon gamma

Il13 Interleukin 13

Il17a Interleukin 17A

Il1b Interleukin 1 beta

Il1rn Interleukin 1 receptor antagonist

Il23a Interleukin 23, alpha subunit p19


55

Il2ra Interleukin 2 receptor, alpha chain

Il5 Interleukin 5

Il6 Interleukin 6

Irf5 Interferon regulatory factor 5

Isg15 ISG15 ubiquitin-like modifier

Itgb2 Integrin beta 2

Lcn2 Lipocalin 2

Ltb Lymphotoxin B

Lyz1 Lysozyme 1

Mmp10 Matrix metallopeptidase 10


Mmp1a Matrix metallopeptidase 1a (interstitial collagenase)



Muc1 Mucin 1, transmembrane

Nod2 Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2

Nos2 Nitric oxide synthase 2, inducible

Nr3c2 Nuclear receptor subfamily 3, group C, member 2

Pck1 Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic

Pecam1 Platelet/endothelial cell adhesion molecule 1

Reg1 Regenerating islet-derived 1

Reg2 Regenerating islet-derived 2

S100a8 S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A)

S100a9 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B)

Saa3 Serum amyloid A 3

Sele Selectin, endothelial cell

Selenbp1 Selenium binding protein 1

Sell Selectin, lymphocyte

Sod2 Superoxide dismutase 2, mitochondrial


56

Stat1 Signal transducer and activator of transcription 1

Stat3 Signal transducer and activator of transcription 3

Tdo2 Tryptophan 2,3-dioxygenase

Tff1 Trefoil factor 1

Timp1 Tissue inhibitor of metalloproteinase 1

Tnf Tumor necrosis factor

Tyk2 Tyrosine kinase 2

Ubd Ubiquitin D

Vwf Von Willebrand factor homolog

Actb Actin, beta

B2m Beta-2 microglobulin

Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Gusb Glucuronidase, beta

Hsp90ab1 Heat shock protein 90 alpha (cytosolic), class B member 1

MGDC Mouse Genomic DNA Contamination

RTC Reverse Transcription Control



PPC Positive PCR Control



Für den PCR-Array wurden Colonproben von DSS behandelten Wild-typ und

Knock-out Tieren benutzt. Dazu wurde die RNA aus Colongewebe mit Hilfe des

Qiagen RNeasy Mini Kits, wie in Abschnitt 2.2.3.1 beschrieben, isoliert. Nach

photometrischer Bestimmung des RNA Gehaltes wurden 500 ng RNA für die

Umschreibung in cDNA mittels des RT2 First Strand Kits eingesetzt. Dazu wurde

zunächst ein Mix aus RNA, RNase freiem Wasser und dem Puffer GE des Kits

erstellt. Dieser Puffer sollte genomische DNA eliminieren. Dieser Mix wurde 5 min bei


57

42 °C inkubiert und direkt danach für 1 min auf Eis gelagert. Als nächstes wurde der

in Tabelle 2.18 beschriebene Reverse Transkriptase Mix erstellt. 10 µl des ersten Mix

wurden nun zu 10 µl des Reverse Transkriptase Mix gegeben und vermischt. Dieser

Ansatz wurde 15 min bei 42 °C und danach 5 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend

wurden 91 µl RNase freies Wasser dazu gegeben.

Tabelle 2.18: Reverse Transkriptase Mix für PCR Array

Volumen (µl)

5x Puffer BC3 4

Kontrolle P2 1

RE3 Reverse Transkriptase Mix 2

RNase freies Wasser 3

Von der erstellten cDNA wurden nun 102 µl für den PCR Ansatz genutzt. Es wurden

1350 µl 2x RT2 SYBR Green Mastermix und 1248 µl RNase freies Wasser

hinzugeben. 25 µl dieses Ansatzes wurden jeweils in eine Vertiefung der

96-Well-Platte des PCR Arrays gegeben. Das PCR Programm wurde im iCycler von

BioRad durchgeführt.

Tabelle 2.19: Real Time PCR Programm für PCR Array



Denaturierung 95 0,25

Annealing/

Elongation

60 1 x 40


58

Die Auswertung erfolgte nach der ΔΔCT Methode mittels einer kostenfrei zur

Verfügung gestellten auf Excel basierenden Analyse Software von SABiociences™.

Gene mit einem CT-Wert von ≥ 35 für die Expression der Amplifikate wurden in der

Analyse ausgeschlossen. Für die Auswertung wurden Gene ausgewählt, die einen

deutlichen Unterschied in der Expression zwischen Wild-typ und Knock-out Tieren

zeigten.

2.2.3.5 Proteinisolierung

Zu Versuchsende wurden die ausdifferenzierten BmDCs in 6-Well-Zellkulturplatten

auf Eis gestellt und das Medium abgesaugt. In jede Vertiefung wurden 65 µl

Lysepuffer pipettiert und die Zellen mit Zellschabern vom Boden der Platten

abgeschabt. Die Zellsuspension wurde in Eppendorfreaktionsgefäße überführt und

20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Suspension für 5 min und 10000

rpm bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Reaktionsgefäße gegeben.

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurden 5 µl des Proteinlysates

verwendet.

2.2.3.6 Proteinbestimmung nach Lowry

Der Proteingehalt der Proben wurde nach der Methode von Lowry bestimmt (Lowry

et al. 1951). Dafür wurden je 5 µl eines BSA-Standards (25-0,1 mg/ml BSA) und 5 µl

der Proben in eine 96-Well-Zellkulturplatte pipettiert, mit 10 µl Reagenz A und 80 µl

Reagenz B versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wurde die Extinktion bei 700 nm im ELISA-Reader gemessen und die

Proteinkonzentration anhand der Standardreihe berechnet. Alle Messungen wurden

als Doppelbestimmungen durchgeführt.

2.2.3.7 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)

Durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach der Methode von Laemmli

(1970) erfolgte die Auftrennung der Proteine unter denaturierenden Bedingungen. Es

wurden dabei 5%ige Sammelgele und 7,5%ige Trenngele verwendet. Von den


59

Lysaten wurden 40 – 60 µg Probe im Verhältnis 1:4 mit 4xSDS-Probenpuffer versetzt

und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Anschließend wurden sie auf das Gel

aufgetragen und bei 120 V für 90 min aufgetrennt.

Tabelle 2.20: Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele

Sammelgel (5 %) Trenngel (7,5 %)

A. dest. 2,92 ml 5 ml

Bisacrylamid 30 % 0,83 ml 2,5 ml

4x upper buffer pH 6,8 1,25 ml -

4x lower buffer pH 8,8 - 2,5 ml

2.2.3.8 Western Blot

Der Proteintransfer aus Polyacrylmaid-Gelen auf Nitrocellulosemembranen erfolgte

elektrophoretisch nach der Methode von Towbin (Towbin et al. 1979) bei 110 V für

90 min. Anschließend wurden die Membranen kurz in Ponceau S Lösung getaucht,

um die Effizienz des Transfers zu überprüfen und danach mit TBS-T gewaschen. Die

Blockierung der unspezifischen Bindungen erfolgte mit 5 % Magermilch in TBS-T für

eine Stunde. Die Membranen wurden nun über Nacht mit den primären Antikörpern

bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Membranen dreimal für 5 min mit

TBS-T gewaschen und danach für mindestens eine Stunde mit dem sekundären

Antikörper inkubiert. Die Detektion von Antigenen erfolgte indirekt über die Reaktion

der an den Zweitantikörper gekoppelten Meerrettichperoxidase durch das

ECL-Detektionssystem. Dafür wurden die Membranen dreimal für 5 min mit TBS-T

gewaschen und danach für 5 min mit 600 µl des ECL-Reagenzes inkubiert. Das

Chemilumineszenz-Signal wurde im Fusion FX7-Detektionssystem aufgenommen.

2.2.3.9 Kompetitiver Enzymgekoppelter Immunabsorptionsassay (ELISA)

Der ELISA wurde mit dem jeweiligen Mouse ELISA MAX™ Deluxe Kit von

BioLegend und Proben von Gesamtcolon durchgeführt. Dazu wurde das Colon in


60

400 µl PBS homogenisiert, 1 min bei 13200 rpm zentrifugiert und der Überstand in

ein neues Eppendorfreaktionsgefäß gegeben. Davon wurden 5 µl für die

Proteinbestimmung verwendet (s. Abschnitt 2.2.3.6). Es wurden jeweils 200 µg der

Proben eingesetzt und mit Assay Diluent A auf 100 µl aufgefüllt. Zur Durchführung

des ELISA wurde die beigefügte 96-Well-Platte zunächst mit 100 µl Capture Antibody

Lösung über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde viermal mit 300 µl

PBS-T gewaschen. Anschließend wurde die Platte mit 200 µl Assay Diluent A für

1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 4 Waschschritten mit 300 µl PBS-T

wurden je 100 µl der Standardreihe (500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8 pg/ml), ein

Leerwert und die Proben als Doppelbestimmung aufgetragen. Die Inkubation erfolgte

für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wurde viermal mit 300 µl PBS-T

gewaschen und die Platte mit 100 µl Detection Antibody für 1 Stunde bei

Raumtemperatur inkubiert. Nach 4 weiteren Waschschritten erfolgte die Inkubation

mit 100 µl Avidin-HRP für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde fünfmal für je

1 min gewaschen und die Platte daraufhin mit 100 µl TMB Lösung im Dunklen

inkubiert. Nach 20 min wurden 100 µl Stopp Lösung hinzugegeben und die

Absorption photometrisch bei einer Wellenlänge von 450 nm und 570 nm gemessen.

Der Leerwert und die Werte der Messung bei 570 nm wurden von den Werten der

Messung bei 450 nm abgezogen und die Konzentration der Proben anhand der

Standardreihe berechnet.

2.2.4 Histologische Methoden

2.2.4.1 Fixierung und Paraffineinbettung von Organen

Die Fixierung der Gewebeproben erfolgte in 4 % Paraformaldehyd für 24 Stunden.

Danach wurden die Proben mit PBS gewaschen und in 70%igem Ethanol gelagert.

Im Institut für Anatomie des Universitätsklinikums Essen erfolgte das Entwässern der

Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe, das Ersetzen des Alkohols durch ein

Intermedium und das Paraffinieren. Gewebeproben des distalen Colons wurden

anschließend im Querschnitt in Paraffin eingebettet. Das restliche Colon wurde als

so genannte Swiss Roll eingerollt, wobei das distale Ende nach innen gelegt wurde


61

und in Paraffin eingebettet. Die Blöcke wurden mit dem Rotationsmikroskop in 4 µm

dicke Schnitte geschnitten und auf einen SuperFrost® Plus Objektträger aufgezogen.

2.2.4.2 Hämatoxylin/Eosin-Färbung

Vor der eigentlichen Färbung mussten die Schnitte zunächst deparaffiniert und

rehydriert werden. Für die Deparaffinierung wurden die Schnitte zweimal für 10 min

in Xylol inkubiert. Für die Rehydrierung wurden die Schnitte weiterhin in einer

absteigenden Alkoholreihe beginnend mit Isopropanol, über 90 % Ethanol und 70 %

Ethanol, bis hin zu 50 % Ethanol für jeweils 5 min inkubiert. Anschließend wurden die

Schnitte kurz in vollentsalztes (VE) Wasser getaucht und dann für 1 min in

Hämatoxylin gefärbt. Hämatoxylin färbt alle basophilen Strukturen, wie Zellkerne,

blau an. Die Schnitte wurden nun unter fließendem Leitungswasser gewaschen bis

sich das Wasser entfärbte und ein pH-Wechsel eintrat. Daraufhin wurden die

Schnitte kurz in VE Wasser getaucht, um dann für 40 s in Eosin gefärbt zu werden.

Eosin färbt azidophile Strukturen, wie Zytoplasmaproteine, Mitochondrien oder das

glatte endoplasmatische Retikulum, rot an. Anschließend wurden die Schnitte kurz in

VE Wasser getaucht und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe, beginnend mit

50 % Ethanol, über 70 % Ethanol und 90 % Ethanol, gefolgt von Isopropanol und

zweimal Xylol für jeweils 5 min inkubiert. Abschließend wurden die Schnitte mit dem

Eindeckmedium Cytoseal eingedeckelt und getrocknet. Zur Darstellung von

großflächigen Übersichtsaufnahmen wurde der ScanScope CS2 von Aperio in der

Pathologie des Universitätsklinikums Essen verwendet und diese Bilder mit der

Aperio ImageScope Software betrachtet.

2.2.4.3 Auswertung der HE-Färbung

Die Querschnitte des distalen Colons wurden von zwei verblindeten Untersuchern

betrachtet und die entzündlichen Darmveränderungen anhand dem in Tabelle 2.21

beschriebenen histologischen Score (Cooper et al. 1993; Williams et al. 2001;

Tambuwala et al. 2010) beurteilt.


62

Tabelle 2.21: Histologischer Score

Score Beschreibung

Infiltration von 0 nicht vorhanden

Entzündungszellen 1 gering

2 mittel

3 schwer

Ausmaß 0 nicht vorhanden

1 mukosal

2 mukosal und submukosal

3 transmural

Kryptenschaden 0 nicht vorhanden

1 basal ein Drittel betroffen

2 basal zwei Drittel betroffen

3 nur noch oberflächliches Epithel intakt

4 Krypten und Epithel komplett betroffen

betroffene Fläche 0 0 %

1 1-25 %

2 26-50 %

3 51-75 %

4 76-100 %

Die jeweiligen Punkte für die Infiltration der Entzündungszellen, das Ausmaß der

Entzündung und den Kryptenschaden wurden addiert, so dass hierdurch ein

maximaler Score von 10 entstand. Dieser wurde mit der Punktzahl für die betroffene

Fläche multipliziert. Somit ergab sich insgesamt ein maximaler Score von 40.

2.2.4.4 Alcianblau Färbung

Die Alcianblau Färbung wurde nach dem Prinzip der Hämatoxylin/Eosin Färbung

(s. Abschnitt 2.2.4.2) durchgeführt. Das Hämatoxylin wurde hierbei jedoch durch die


63

Alcianblau Lösung ersetzt. Diese färbt saure Mucopolysaccharide blau an. Die

Schnitte wurden 10 min in der Lösung gefärbt. Anschließend erfolgte die gleiche

Behandlung der Schnitte wie in der HE-Färbung.

2.2.4.5 Immunfluoreszenz

Vor der eigentlichen Färbung mussten die Schnitte auch hierfür zunächst

deparaffiniert und rehydriert werden. Zum Deparaffinieren wurden die Schnitte

dreimal für je 5 min in Xylol inkubiert. Daraufhin wurden die Schnitte in einer

absteigenden Alkoholreihe, beginnend mit zweimal 100 % Ethanol, über 96 %

Ethanol, 90 % Ethanol und 80 % Ethanol, bis zu 70 % Ethanol für jeweils 3 min

inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte in VE Wasser gegeben, in welchem eine

Lagerung bei 4 °C bis zu einer Woche möglich war. Für die Antigendemaskierung

wurden die Schnitte 15 min lang in einer 10%igen Demaskierungslösung von Dako in

einer Plastikküvette in einem Schnellkochtopf erhitzt. Danach kühlten sie mindestens

20 min ab. Als nächstes wurden die Schnitte zweimal für 2 min in PBS gewaschen.

Der darauf folgende Proteinblock erfolgt je nach Antikörper in 5 % NGS oder in 5 %

NRS für 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Schnitte für mindestens

1 h oder über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antikörper inkubiert. Die Detektion

des gebundenen Primärantikörpers erfolgte nach zweimaligem Waschen in PBS für

jeweils 2 min mithilfe eines Fluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpers. Nach

dreimaligem Waschen in PBS für jeweils 2 min erfolgte hiernach die Färbung der

Zellkerne mittels 4,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) für 1 min bei Raumtemperatur.

Die Schnitte wurden anschließend noch zweimal für je 5 min in PBS und einmal für

3 min in VE Wasser gewaschen. Für den Nachweis von monoklonalen

Maus-Antikörpern in Mausgewebe wurde das Mouse on Mouse (M.O.M.)-Kit

(Vector Labs) nach Herstellerangaben verwendet. Die Schnitte wurden anschließend

mit dem Dako-Fluorescent Mounting Medium eingedeckelt und bei 4 °C gelagert. Zur

Darstellung der Schnitte wurde ein Nikon Eclipse E1000 Mikroskop mit

entsprechendem Kamerasystem (Nikon DS-Ri1) und eine NIS-Elements F.3.0

Imaging Software benutzt.

Ergebnisse

64

3 Ergebnisse

3.1 Zur Publikation vorbereitetes Manuskript

Das folgende Manuskript wurde zur Veröffentlichung vorbereitet.

Hypoxia-inducible factor 1 in dendritic cells is crucial for the activation of

regulatory T cells in murine colitis

Short Title: Dendritic HIF-1α in colitis

Authors:

Katharina Flück1,2, Gerhard Breves2, Joachim Fandrey1, Sandra Winning1

1 Institut für Physiologie, Universität Duisburg-Essen, Essen, Germany;

2 Physiologisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Germany

Ergebnisse

65

Abbreviations: Aldh, aldehyde dehydrogenase; BmDC, bone marrow–derived

dendritic cell; DC, dendritic cell; DSS, dextran sodium sulfate; Foxp3, forkhead box

P3; HIF, hypoxia inducible factor; IEC, intestinal epithelial cell; IFN, interferon; IL,

interleukin; MUC, Mucin; RAR, retinoic acid receptor; TFF, trefoil factor; Treg,

regulatory T cell; TGF-β, transforming growth factor β; TSLPR, thymic stromal

lymphopoietin receptor

Correspondence: Joachim Fandrey, Institut für Physiologie, Universität Duisburg-

Essen, Hufelandstr. 55, 45122 Essen, Germany

E-mail: [email protected]

Disclosures: The authors have no conflicts to disclose.

Author Contributions:

Katharina Flück: acquisition of data, analysis and interpretation of data, drafting of

the manuscript

Gerhard Breves: critical revision of the manuscript, study supervision

Joachim Fandrey: critical revision of the manuscript, study supervision

Sandra Winning: critical revision of the manuscript, study supervision

Acknowledgment: We would like to thank Dr. Flo Witte for critical reading of the

manuscript and Agnes Neugebauer for technical support.

HIF-1α+f/+f mice were purchased from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine,

USA). CD11cCre mice were originally obtained from Boris Reizis (Columbia

University Medical Center, New York, New York, USA).

Ergebnisse

66

3.1.1 Abstract

Background & Aims: Dendritic cells (DCs) are believed to serve as a bridge between

innate and adaptive immunity; they help to maintain intestinal homeostasis.

Inflammatory bowel disease (IBD) is associated with dysregulation of the mucosal

immune response and hypoxic inflammation; in IBD gene expression by DCs is

regulated by the transcription factor hypoxia inducible factor (HIF)-1. Recent studies

have described only a protective role for epithelial HIF-1 in mouse models of IBD.

Methods: We investigated the role of HIF-1 in DC function in a dextran sodium

sulfate (DSS)-induced model of murine colitis. Wild-type and dendritic cell–specific

HIF-1α knock-out mice were treated with 3% DSS for 7 days.

Results: Knock-out of HIF-1α in DCs led to a significantly larger loss of body weight

in mice with DSS-induced colitis than in control mice. Knock-out mice exhibited

severer intestinal inflammation with increased levels of proinflammatory cytokines

and enhanced production of mucin. Induction of regulatory T cells (Tregs) was

impaired, and the number of forkhead box P3 (Foxp3) Tregs was diminished by

dendritic HIF-1α knock-out.

Conclusion: Our findings demonstrate that in DCs HIF-1α is necessary for the

induction of sufficient numbers of Tregs to control intestinal inflammation.

Keywords: HIF-1α; dendritic cells; DSS; regulatory T cells

3.1.2 Introduction

The intestinal immune system must protect against infection by initiating

defensive responses to pathogens while also maintaining tolerance to self-antigens,

food, and commensal microflora.1 Mucosal dendritic cells (DCs) are fundamental in

balancing this process. Immature DCs are present in peripheral tissues and are

activated by taking up antigens in the intestine, after which they mature and migrate

to the draining lymph nodes.2 Several subsets of DCs are found in the intestine.3

Depending on their cell-surface receptor expression and their cytokine profile, DCs

can induce a proinflammatory Th1 or Th17 immune response or a humoral Th2

Ergebnisse

67

immune response. A specialized function of intestinal DCs is the induction of

regulatory T cells (Tregs).4

Nearly every inflamed tissue is characterized by low oxygen availability

(hypoxia).5 With respect to inflammatory bowel disease (IBD), this feature is likely to

be of special importance because the lumen of the gut is almost anoxic. Inflammatory

breakdown of the intestinal barrier allows anoxia to spread to formerly normoxic

tissue, which must adapt to this condition. The hypoxia inducible factor (HIF)-1

complex is a key transcription factor for cellular adaption to low oxygen tension.6

HIF-1 is a heterodimer formed by two subunits: HIF-1α and HIF-1β. Under normoxic

conditions, hydroxylation of the HIF-1α subunit by specific prolyl hydroxylases

(PHDs) leads to ubiquitin-proteasome–dependent degradation. Under hypoxic

conditions, however, PHD activity is inhibited; thus, HIF-1α can translocate into the

nucleus, dimerize with HIF-1β, and bind to hypoxia-responsive elements of HIF-1

target genes.

Several studies have investigated the function of HIF-1α in intestinal epithelial

cells. Karhausen et al.7 showed that loss of epithelial HIF-1α led to severer intestinal

inflammation, whereas an increase in epithelial HIF protein was protective. Reduction

of epithelial cell apoptosis in murine colitis by inhibition of HIF-1 degradation by the

hydroxylase inhibitor dimethyloxalylglycine supports the importance of HIF-1 in the

intestinal epithelium.8 Frede et al. found that HIF-1 regulates inflammation and

showed that lipopolysaccharide (LPS) and inflammatory cytokines lead to HIF-1α

accumulation.9 Very recent studies also demonstrated that HIF-1α plays a crucial role

in regulatory T cells and DCs. Clambey et al. reported a connection between HIF-1α

levels and the number of Tregs, as well as the expression of Foxp3.10 In vitro studies

by Wobben et al. showed that HIF-1α protein in DCs is needed for adequate

production of interferon type I and for activation of cytotoxic T cells.11

Our study was designed to elucidate the effect of transcription factor HIF-1 on

DCs in an experimental model of colitis by using mice with inactive HIF-1α protein in

CD11c-expressing cells. We treated HIF-1α+f/+f (wild-type) mice and

CD11cCre/HIF-1α+f/+f (knock-out) mice with dextran sodium sulfate (DSS) to induce

colitis and then examined the severity of inflammation.

Ergebnisse

68

3.1.3 Materials and Methods

Mice

C57Bl/6J mice with two loxP sites flanking exon 2 of the hif-1α gene

(HIF-1α+f/+f) were crossed with mice in which the integrin α X (CD11c) promoter

drives Cre recombinase expression (CD11cCre/HIF-1α+f/+f) to achieve a CD11c

cell-specific knock-out of HIF-1α. In these mice, exon 2 encodes for the DNA binding

site of translated HIF-1α protein. Knock-out mice exhibit dramatically reduced

expression of functionally active HIF-1α protein in CD11c-expressing cells and also

exhibit a loss of function of the HIF-1 complex. Sibling mice negative for Cre

recombinase (HIF-1α+f/+f) served as controls. All animals demonstrated physiological

habitus and bred regularly. They were kept and treated in accordance with the

German law for animal welfare and with institutional regulations for animal handling.

Experimental procedures were approved by the Landesamt für Umwelt-, Natur- und

Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (LANUV NRW; file reference

84-02.04.2011.A098).

DSS colitis model

Colitis was induced by treatment with DSS (MP Biomedicals, Santa Ana,

USA).12 Female mice 10 to 12 weeks old were given 3% DSS dissolved in drinking

water for 7 days. The body weight of each mouse was recorded daily. On day 7, mice

were killed by cervical dislocation, and mesenteric lymph nodes and colonic tissues

were dissected.

Primary murine bone marrow–derived dendritic cells (BmDC)

Dendritic cells were isolated from HIF-1α+f/+f and CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice as

previously described.11 Cells were cultivated under normoxic (O2/CO2/N2, 21:5:74

vol%) and hypoxic (O2/CO2/N2, 3:5;92 vol%) conditions. On culture day 8, DCs were

incubated for 6 h with 1 µg/ml LPS (serotype 0111:B4, Sigma, Deisenhofen,

Germany); total RNA was then extracted.

Ergebnisse

69

Western blot analysis

Cells were lysed, and Western blot analysis was performed as previously

described.11 HIF-1α was detected with a rabbit polyclonal anti–HIF-1α antibody

(Cayman Chemical, Michigan, USA), and β-actin was used as a loading control

(Abcam, Cambridge, UK).

RNA preparation and RT-PCR

RNA was isolated from BmDCs by the guanidinium thiocyanate-phenol-

chloroform extraction method.13 Total RNA was isolated from lymph nodes and colon

with the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Primer sequences used for

quantitative PCR are listed in supplemental Table S1 (Invitrogen, Darmstadt,

Germany). Quantitative detection of IFN-α subtypes was performed with the

QuantiTect Primer Assay (Qiagen, Hilden, Germany). Real-time PCR was performed

with SYBR green fluorescent dye (Eurogentec, Verviers, Belgium) on the iQ5

Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, München, Germany). Amounts of cDNA

were normalized to ribosomal protein, and expression was calculated as induction

relative to respective controls with the Δct method.14

Colon cytokine analysis

Levels of IL-6, IL-10, and thymic stromal lymphopoietin were detected in colon

homogenates according to the manufacturer’s instructions (ELISA MAX Deluxe,

BioLegend, San Diego, USA).

Immunostaining

Tissue hypoxia was detected with the Vector M.O.M. Immunodetection Kit

(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, USA) and the Hypoxyprobe-1 Kit

(Hypoxyprobe, Inc., Burlington, USA), according to the manufacturer’s instructions.

Foxp3 was detected with a rat anti-mouse Foxp3 antibody (eBioscience, Inc., San

Diego, USA). MUC2 was detected with a rabbit anti-mouse MUC2 antibody (Santa

Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA). Alexa Flour 568 second antibodies were

used (Invitrogen, Darmstadt, Germany).

Ergebnisse

70

Statistical analysis

Data were compared by one-way analysis of variance with GraphPad Prism

6 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA); the Tukey-Kramer post hoc test

was used to determine the statistical significance of the differences between the

groups. Values are expressed as means ± SEM for n individual experiments.

P values less than 0.05 were considered significant.

3.1.4 Results

DSS-induced colitis leads to profound extension of hypoxia

Colitis was induced by treating HIF-1α+f/+f and CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice with

3% DSS in the drinking water for 7 days. Control mice were given drinking water with

3% PBS. Initially, we investigated the extent of hypoxia in the damaged colon by

using 2-nitroimidazole dye. As found in previous studies,5,7 DSS-treated mice

exhibited profound extension of hypoxia into the submucosa (Figure 1); this finding

supports the notion that activation of HIF-1 is likely to occur and to influence gene

expression of mucosal and submucosal cells. To control knock-out efficiency, we

used hypoxia and LPS stimulation to induce HIF-1α protein in bone marrow–derived

dendritic cells (BmDCs) from HIF-1α+f/+f and CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice. Immunoblot

assays showed that the HIF-1α protein in DCs from CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice is

smaller than that in HIF-1α+f/+f mice because exon 2 is deleted (Figure S1A). The

absence of the DNA binding domain of the transcription factor causes the protein to

be inactive. To quantify knock-out efficiency, we performed mRNA analysis with

specific HIF-1α oligonucleotides binding to HIF-1α cDNA in exon 2. DCs from

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice showed a 90% loss of wild-type HIF-1α (Figure S1B).

Knock-out of HIF-1α in DCs leads to severer inflammation in DSS-induced

colitis

We next studied the phenotype of CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice in a DSS colitis

model. Control mice maintained their weight. Both DSS-treated groups experienced

progressive weight loss within 3 days. However, CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice lost more

weight than did HIF-1α+f/+f mice; the difference in weight loss was statistically

Ergebnisse

71

significant at days 6 and 7 (P<.01-.001; Figure 2A). Characteristically, colon weight

increased and colon length decreased because of DSS-induced inflammation;

however, the differences between the two groups were not statistically significant

(data not shown).

To investigate the impact of the dendritic HIF-1α knock-out on mucosal

inflammation, we looked for changes in mRNA expression by the colon after DSS

exposure. Levels of IL-6 and IL-23 were significantly higher in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice than in HIF-1α+f/+f mice (P<.05) (Figure 2B-C).

Furthermore, DSS-treated knock-out mice exhibited significantly higher levels of

lipocalin2, a small secreted protein crucial for regulating the immune response15

(P<.01) (Figure 2D). The number of macrophages was also higher in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice than in HIF-1α+f/+f mice, as shown by significantly higher

expression of F4/80, a transmembrane protein on the cell surface of macrophages

(P<.01) (Figure 2E). The DSS-induced increase in IL-6 expression in dendritic HIF-1α

knock-out mice was confirmed at the protein level (Figure 2F). In DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice we also detected significantly higher levels of mRNA

expression of the inflammatory cytokine IL-1β and serum amyloid A as an acute

phase protein; the levels of this protein correlate with the degree of intestinal

inflammation.16 In these mice we also found higher levels of HIF-1α, which is known

to accumulate during inflammation9 (Figure S2A-C). Taken together, these findings

demonstrate that DSS-induced inflammation is severer in dendritic HIF-1α knock-out

mice.

In vivo induction of type I interferons is HIF-1α dependent

Previous studies have demonstrated that the secretion of type I interferons by

DCs is HIF-1 dependent in vitro.11 To investigate this finding in vivo, we analyzed

mesenteric lymph nodes from HIF-1α+f/+f and CD11cCre/HIF-1α+f/+f control and

DSS-treated mice for mRNA expression of interferon (IFN)-α4 and IFN-α12. The

induction of IFN-α4 (Figure 3A) and IFN-α12 (Figure 3B) by DSS was significantly

higher in HIF-1α+f/+f mice; this finding confirms the HIF-1α dependency of dendritic

type I interferon production in vivo.

Ergebnisse

72

Induction of IL-10 and TSLPR by LPS in BmDCs and induction of TSLPR in

DSS-induced colitis are HIF-1α dependent

IL-10 is an antiinflammatory cytokine secreted by DCs; it influences the

phenotypes of DCs and T cells.17 To determine whether this antiinflammatory

response is affected by HIF-1α knock-out, we isolated BmDCs from HIF-1α+f/+f and

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice, cultivated them for 8 days under normoxic conditions,

and then stimulated them with 1 µg LPS for 6 h. The induction of IL-10 by LPS was

significantly higher in HIF-1α+f/+f mice than in CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.0001)

(Figure 4A). To better imitate the in vivo situation of mucosal DCs, we cultivated

BmDCs under hypoxic conditions (3% O2) for 8 days. Again, IL-10 induction by LPS

was HIF-1α dependent (Figure 4B). In vivo, mRNA expression of IL-10 in colon tissue

showed a slight but not statistically significant increase in DSS-treated HIF-1α+f/+f and

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice. However, there was no difference between the wild-type

group and the knock-out group (Figure 4D). DSS colitis had no effect on the levels of

IL-10 protein in colon tissues (Figure S3).

Because mucosal DCs are always influenced by intestinal epithelial cells

(IECs), we looked for expression of thymic stromal lymphopoietin receptor (TSLPR)

by DCs. The ligand TSLP is released by IECs and induces the production of

noninflammatory DCs.18 BmDCs exhibited expression of TSLPR in vitro.

Hypoxia-cultivated BmDCs from HIF-1α+f/+f mice exhibited a significantly larger

increase of TSLPR production by LPS stimulation than did BmDCs from

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.01) (Figure 4C). In vivo, we also found that the

induction of TSLPR in colon tissue from DSS-treated HIF-1α+f/+f mice was

significantly higher than that in colon tissue from DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice (P<.01) (Figure 4E). In DSS colitis, protein levels of TSLP showed a slight but

not statistically significant decrease, probably because of the destruction of a large

number of IECs (Figure 4F). However, there were no significant differences in the

production of TSLP by IECs in the wild-type group and the knock-out group. Taken

together, these findings indicate that HIF-1α significantly influences IL-10 production

and TSLPR expression by DCs.

Ergebnisse

73

Induction of Treg-activating and gut-homing molecules in mesenteric lymph

nodes depends on HIF-1α expression in DCs in DSS-induced colitis

Mucosal DCs migrate into the mesenteric lymph nodes, where they present

antigens to T cells. DCs can induce a proinflammatory Th1 and Th17 response, but

certain mucosal DCs can also promote the differentiation of Tregs to limit

inflammation.19 To determine whether the dendritic HIF-1α knock-out affects the

induction of Tregs, we isolated mesenteric lymph nodes and measured mRNA

expression of Treg-activating molecules. The levels of IL-10 and transforming growth

factor (TGF)-β were significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f mice than in

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.05) (Figure 5A-B).

The induction of Tregs is also dependent on retinoic acid (RA).20 The activity

of aldehyde dehydrogenase (Aldh)1a2, which is necessary for catalyzing retinal to

RA, was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f mice than in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.05) (Figure 5C). Furthermore, the levels of RA

receptor α (RARα), a ligand-inducible transcription factor21 expressed by Tregs, were

significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f mice than in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.0001) (Figure 5D).

The gut-homing T-cell markers CC chemokine receptor (CCR)9 and

α4β7-integrin are dependent on activation by DCs and RA.22 Therefore, we

investigated the effect of dendritic HIF-1α knock-out on these markers in our DSS

colitis model. DSS treatment significantly increased the induction of α4 integrin in

lymph nodes from wild-type and knock-out mice (P<.01) (Figure S4). In contrast, the

expression of CCR9 and β7 integrin was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.001-.0001) (Figure 5E-F). Taken

together, these findings indicate that the loss of dendritic HIF-1α leads to impaired

induction of Tregs in mesenteric lymph nodes and to diminished expression of T-cell

gut-homing markers.

Ergebnisse

74

Increased numbers of T cells and Tregs in mesenteric lymph nodes are

dependent on HIF-1α expression in DCs in DSS-induced colitis

To determine whether the dendritic HIF-1α knock-out influences the number of

T cells and in particular of Tregs, we measured mRNA expression of CD4 and CD8a

by mesenteric lymph nodes. We found a significant increase in DSS-mediated

inflammation only in HIF-1α+f/+f mice, whereas the mRNA expression of CD4 and

CD8a did not change in CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.01-.001) (Figure 6A-B).

We next examined the expression of Foxp3, a key transcriptional regulator of

Tregs.23 DSS-treated HIF-1α+f/+f mice exhibited a significantly larger induction of

Foxp3 mRNA than did CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.05) (Figure 6C). Levels of

OX40, reported to be a surface molecule of Tregs,24 were also higher in DSS-treated

HIF-1α+f/+f mice than in CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice (P<.05) (Figure 6D). Enhanced

numbers of Foxp3-positive Tregs were confirmed by immunofluorescence.

DSS-treated HIF-1α+f/+f mice exhibited more Foxp3-positive cells (red) in mesenteric

lymph nodes than did knock-out mice (Figure 6E). These findings indicate that

knock-out of dendritic HIF-1α in DSS colitis leads to lower numbers of T cells and

Tregs in mesenteric lymph nodes.

DC-specific knock-out of HIF-1α stimulates mucosal epithelium to increase the

production of mucins in DSS-induced colitis

Because DCs are in close contact with epithelial cells,25 we examined the

influence of the DC-specific HIF-1α knock-out on IECs in a model of DSS colitis.

Goblet cells produce mucins and trefoil factors (TFF), thus forming a protective

mucus layer that coats the gastrointestinal tract.26 We found that the expression of

MUC1, MUC2, and MUC3 by colon mRNA is significantly higher in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice than in DSS-treated HIF-1α+f/+f mice (P<.05-.01)

(Figure 7A-C). Immunofluorescence studies of MUC2 confirmed these results

(Figure 7D). CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice exhibited a more intense production of MUC2

in DSS colitis than did HIF-1α+f/+f mice. Levels of TFF3 mRNA were significantly

higher than control levels only in DSS-treated knock-out mice; there were no

significant differences between DSS-treated wild-type and knock-out mice

Ergebnisse

75

(Figure S5B). In total, these findings show that the loss of HIF-1α by DCs affects the

crosstalk between DCs and IECs in a way that stimulates IECs to produce more

mucins.

3.1.5 Discussion

Dendritic cells play a crucial role in regulating the immune response and are

involved in the pathogenesis of IBD.27 We and others5,7 have reported that mucosal

DCs in inflamed tissue are exposed to hypoxia, and this finding caused us to focus

on the role of dendritic HIF-1 in a murine model of colitis. Recent studies have

demonstrated that epithelial HIF-1 exerts a protective effect in intestinal

inflammation.7,8 In the current report we show for the first time that dendritic HIF-1α

also exerts a pivotal influence on the control of colitis. The absence of dendritic

HIF-1α leads to severe intestinal inflammation with increased levels of inflammatory

cytokines and impaired induction of regulatory T cells.

Inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-23 are strongly involved in the

pathogenesis of IBD.28,29 IL-6 can inhibit Treg-mediated suppression in a murine

model of colitis.30 It has been shown that IL-23 promotes inflammation by IL-6 and

IL-17 and drives a Th17 immune response.29 A recent study demonstrated that

lamina propria DCs constitutively express IL-2331; this finding reveals an additional

influence of DCs on IBD. In the present study we found higher levels of IL-6 and

IL-23 in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice than in HIF-1α+f/+f mice. In addition,

we looked for lipocalin2, a known regulator of the gut´s immune response.15

Lipocalin2 is a member of the lipocalin protein family and is apically secreted by

epithelial cells. Chassaing et al. measured fecal lipocalin2 levels with ELISA and

reported that these levels are up-regulated in murine models of colitis.32 After DSS

treatment, our knock-out mice exhibited elevated levels of lipocalin2, a finding

indicating severer inflammation (Figure 2D). Therefore, in future experiments fecal

measurements of lipocalin2 may prove useful in monitoring the progression of

intestinal inflammation.

We further aimed to analyze the influence of dendritic HIF-1α on the

production of type I IFN in a murine colitis model. Wobben et al. found that dendritic

Ergebnisse

76

IFN-α production is HIF-1α dependent.11 We confirmed these findings in vivo,

because our knock-out mice exhibited less expression of IFN-α4 and IFN-α12 mRNA

after DSS treatment. Type I IFNs are known to exert protective effects in intestinal

inflammation by preventing epithelial barrier dysfunction and inhibiting the

inflammatory response of activated macrophages.33,34 This finding is in line with our

finding that HIF-1α+f/+f mice exhibit fewer infiltrated macrophages than do

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice in DSS colitis (Figure 2E).

Tregs can limit inappropriate inflammatory responses and are protective in

intestinal inflammation.35 A subset of intestinal DCs can induce Tregs to control

inflammation. This is why we looked for the impact of dendritic HIF-1α on Treg

induction. Tregs are defined by the expression of Foxp3.23 We found fewer

Foxp3-positive cells in our knock-out mice, and this reduced number of cells may

lead to severer inflammation. The induction of Tregs is further dependent on the

release of retinoic acid (RA) and TGF-β by DCs.22 RA is converted from retinal by

aldehyde dehydrogenases (Aldhs). Aldh1a2 is found primarily in DCs in the

mesenteric lymph nodes.20 Moreover, RA can inhibit the IL-6–mediated induction of

proinflammatory Th17 cells.36 DSS treatment did not induce higher levels of TGF-β,

Aldh1a2, and retinoic acid receptor α (RARα) in our DSS-treated knock-out mice

(Figure 5B-D). Consistent with the findings of Fernández-Martínez et al., who

reported crosstalk between HIF-1α and RARβ,37 we have now shown a connection

between dendritic HIF-1α and RARα expression. Transcription of RARα is directly

induced by RA.21 Together with the decrease in Aldh1a2 expression, this finding

leads to the conclusion that HIF-1α–deficient dendritic cells secrete less RA and

consequently induce fewer Tregs.

Treg induction also relies on DC-secreted IL-10.38 Spontaneous colitis

develops in IL-10 knock-out mice after a few weeks.39 Several studies have

demonstrated that HIF-1α influences IL-10 production. Cai et al. showed that HIF-1α

activates IL-10 production in myocytes and is required for remote preconditioning of

the heart.40 HIF-1α–dependent IL-10 secretion is also required for lung interstitial

macrophages to prevent airway allergy.41 In the current study we found for the first

time that dendritic loss of HIF-1α directly leads to diminished levels of IL-10 in vitro

Ergebnisse

77

(Figure 4A-B) and in the lymph nodes in vivo (Figure 5A), with a severe impact on

intestinal inflammation. The fact that we could not detect significant changes in IL-10

mRNA expression in the colon (Figure 4D) may be due to the small numbers of DCs

in colon tissue.

Intestinal DCs can induce the specific gut-homing markers α4β7 integrin and

CCR9 on Tregs.42 RA enhances the expression of α4β7 integrin and CCR9.20 We

found that the expression of β7 integrin and CCR9 was significantly higher in

DSS-treated HIF-1α+f/+f mice than in knock-out mice (Figure 4E-F), a finding

indicating that dendritic HIF-1α is needed for adequate Treg homing.

Rimoldi et al recently reported that intestinal epithelial cells (IECs) and DCs

interact.18 IECs release TSLP, which conditions mucosal DCs to noninflammatory

tolerogenic DCs. Jang et al. demonstrated that the expression of TSLP in

keratinocytes is HIF-1α dependent.43 We were unable to detect differences in the

expression of TSLP in the colon because the IECs in our model express active

HIF-1α. However, expression of the TSLP receptor (TSLPR) was induced by LPS

only in BmDCs from HIF-1α+f/+f mice (Figure 4C). Correspondingly, in vivo only

HIF-1α+f/+f mice exhibited increased levels of TSLPR in DSS colitis (Figure 4E).

Furthermore, we detected an additional interaction between IECs and DCs.

We found that knock-out of dendritic HIF-1α leads to increased production of

MUC1 - 3. Mucins are produced primarily by goblet cells and play a crucial role in

mucosal protection and repair.26 The expression of mucins in intestinal inflammation

depends on the severity and degree of colitis. Hoebler et al. found that the

expression of MUC1 and MUC3 was higher in DSS-induced colitis, whereas the

expression of MUC2 did not change.44 In contrast, Dharmani et al. found that the

expression of MUC2 and MUC3 did not decrease in a DSS model.45 Clinical studies

also found diverging findings in patients with IBD.26,46,47 Van der Sluis et al. reported

that MUC2 knock-out mice develop spontaneous colitis and are more prone to DSS

colitis.47 Furthermore, recent studies demonstrated an interaction between IL-6 and

the production of mucin. Yokoigawa et al. found that mucins secreted from colon

cancer cells induce the production of IL-6.48 In contrast, Li et al. showed that IL-6

modulates mucin expression of colorectal cancer cells by up-regulating MUC1 and

Ergebnisse

78

down-regulating MUC2.49 Other studies have demonstrated IL-6–mediated induction

of MUC2 and MUC3 in colon carcinoma cells.50,51 In our DSS-treated knock-out mice,

higher levels of IL-6 were associated with higher levels of mucins. This association

may result from a compensatory protective mechanism in the intestinal epithelium,

because mucins are also involved in mucosal repair.52,53

Although new therapeutic strategies for IBD focus primarily on T cells, it is

noteworthy that the phenotype of DCs can also affect intestinal inflammation. In the

present study we demonstrated that loss of dendritic HIF-1α leads to severer

intestinal inflammation with impaired induction of Tregs and enhanced production of

mucins. Targeting intestinal dendritic cells may therefore be an additional therapeutic

option in the treatment of IBD.

3.1.6 References

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3.1.7 Figures

Fig. 3.1: DSS colitis leads to profound extension of hypoxia.

Sections (4 µm) of colon tissue from HIF-1α+f/+f

mice were stained with hydroxyprobe (red) and DAPI

(blue). Stained tissue from control mice showed hypoxic epithelium. DSS treatment led to profound

extension of hypoxia into the submucosal regions. Magnification, 200 x; scale bar, 100 µm.

C DSS

HIF-1α+f/+f

Ergebnisse

85

A

M o u s e w e ig h t

0 1 2 3 4 5 6 7

7 5

8 0

8 5

9 0

9 5

1 0 0

1 0 5

d a y

rel.

Mo

us

e w

eig

ht

(% o

f d

ay

0)

H IF -1+ f/+ f

D S S

C D 1 1 c C re /H IF -1+ f/+ f

C

H IF -1+ f/+ f

C

C D 1 1 c C re /H IF -1+ f/+ f

D S S

**

***

IL -6

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

3 0

6 0

9 0

1 2 0

1 5 0

1 8 0

IL-6

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

***

ns

*

IL -2 3

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

5

IL-2

3/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

*

*

B C

Ergebnisse

86

Fig. 3.2: Dendritic cell specific knock-out of HIF-1α led to more severe inflammation in

DSS colitis.

Colitis was induced in mice by 3% DSS in the drinking water for 7 days. (A) DSS-induced weight loss

was higher in CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice than in HIF-1α+f/+f

mice, with significant differences at days 6

and 7. Control mice receiving drinking water without DSS maintained weight. n=9-14 per control

group; n=15-17 per DSS group. Colonic mRNA expression of (B) IL-6, (C) IL-23, (D) lipocalin2, and

(E) F4/80 expression after DSS treatment was significantly higher in CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice than in

all other types of mice studied. (F) ELISA showed significantly higher concentrations of IL-6 in colon

homogenates from DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice than in all other groups of mice studied

(n.d.=non detectable). n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01; ***P<.001; ****P<.0001.

E F 4 /8 0

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

F4

/80

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

***

ns

**

L ip o c a lin 2

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2 0

4 0

6 0

Lc

n2

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

****

ns

**

D

IL -6

Co

nc

en

tra

tio

n o

f

IL-6

(p

g/m

l)

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

5

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

**

****

****

n .d .

F

Ergebnisse

87

Fig. 3.3: HIF-1α dependent induction of type I interferons in DSS colitis.

Expression of mRNA was measured in mesenteric lymph nodes. Induction of (A) IFN-α4 and (B)

IFN-α12 was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice.

n=5-7 per group. *P<.05.

IF N - 4

IFN

- 4

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

5ns

*

IF N - 1 2

IFN

- 1

2/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

5

*

*

B A

IL -1 0

IL-1

0/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f L

PS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f L

PS

0

2

4

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

****

*

****

IL -1 0

IL-1

0/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f L

PS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f L

PS

0

2

4

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

***

ns

*

A B

Ergebnisse

88

Fig. 3.4: Inflammatory induction of IL-10 and TSLPR is HIF-1α dependent.

(A) Bone marrow–derived dendritic cells (BmDCs) were cultivated under normoxic conditions and

stimulated with LPS. LPS-mediated IL-10 induction was significantly higher in HIF-1α+f/+f

mice than in

CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice or in mice not stimulated with LPS. BmDCs were also cultivated under

hypoxic conditions and stimulated with LPS. Induction of (B) IL-10 and (C) TSLPR by LPS was

significantly higher in HIF-1α+f/+f


mice or in mice not stimulated with

LPS. n=3; triplicates per group. (D) Expression of IL-10 by colonic mRNA was slightly higher in DSS

treated mice than in control mice, but the difference was not statistically significant; IL-10 expression

was not significantly different between HIF-1α+f/+f

and CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice. (E) Colonic mRNA

expression of TSLPR was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in all other types of

mice studied. (F) ELISA for TSLP expression in colon homogenates showed a slight but not

statistically significant decrease in DSS-treated groups and no significant differences between

HIF-1α+f/+f


mice. n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01; ***P<.001; ****P<.0001.

IL -1 0

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

IL-1

0/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

ns

ns

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TS

LP

R/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f L

PS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f L

PS

0

2

4

6**

**

C

T S LP

Co

nc

en

tra

tio

n o

f

TS

LP

(p

g/m

l)

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2 0

4 0

6 0 ns

ns

T S LP R

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

5

1 0

1 5

TS

LP

R/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

ns

***

**

F E

Ergebnisse

89

IL -1 0

IL-1

0/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

**

*

A T G F -

TG

F-

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

**

*

ns

B

A ld h 1 a 2

Ald

h1

a2

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

*

*

R AR

RA

R

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

5 ***

****

C D

Ergebnisse

90

Fig. 3.5: Activation and gut-homing of Tregs in DSS colitis require HIF-1α expression

in dendritic cells.

Expression of mRNA was measured in mesenteric lymph nodes. Levels of (A) IL-10 and (B) TGF-β

were significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice or in mice not treated with DSS. Expression of (C) Aldh1a2 and (D) retinoic acid receptor α

(RARα) mRNA was higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in other types of mice tested. Induction

of gut-homing molecules (E) CCR9 and (F) β7 integrin was higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than

in other types of mice. n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01; ***P<.001; ****P<.0001.

7 In te g r in

7

In

teg

rin

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3****

****

C C R 9

CC

R9

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

5

1 0

1 5 **

***F E

Ergebnisse

91

C D 4

CD

4/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

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3

4

5 **

**

C D 8 a

CD

8a

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4 ***

***

A B

F o xp3

Fo

xp

3/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

5

**

*

O X 4 0

OX

40

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

*

*

C D

Ergebnisse

92

Fig. 3.6: Increases in numbers of T cells and Tregs in mesenteric lymph nodes depend

on dendritic HIF-1α expression in DSS colitis.

Expression of mRNA was measured in mesenteric lymph nodes. (A) CD4 and (B) CD8a mRNA

expression was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f


treated mice or in either type of mouse not treated with DSS. The expression of Treg markers

(C) Foxp3 and (D) OX40 mRNA was significantly higher in DSS-treated HIF-1α+f/+f

mice than in

DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice or in mice not treated with DSS. (E) Sections (4 µm) of

mesenteric lymph nodes were stained with Foxp3 (red) and DAPI (blue). The number of

Foxp3-positive cells (red) after DSS colitis was enhanced only in HIF-1α+f/+f

mice (magnification, 200 x;

scale bar, 50 µm). n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01; ***P<.001.

Ergebnisse

93

M U C 1

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

5

1 0

1 5

MU

C1

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

****

**

*

M U C 2

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

1 0

MU

C2

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

****

ns

**

B A

M U C 3

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

MU

C3

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

**

ns

*

C

Ergebnisse

94

Fig. 3.7: Dendritic cell–specific knock-out of HIF-1α stimulates mucosal epithelium to

increased production of mucins in DSS colitis.

Colonic mRNA expression of (A) MUC1, (B) MUC2, and (C) MUC3 was significantly higher in



DSS-treated mice or in mice not treated with

DSS. (D) Sections (4 µm) of colon tissue were stained with MUC2 (red) and DAPI (blue). After

treatment with DSS, the amount of colonic MUC2 protein was higher in CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice

than in HIF-1α+f/+f

mice (magnification, 200 x; scale bar, 50 µm). n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01;

****P<.0001.

Ergebnisse

95

3.1.8 Supplementary Material

Fig. 3.8: Knock-out efficiency of CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice is approximately 90%.

(A) Immunoblot shows induction of HIF-1α protein by lipopolysaccharide (LPS) stimulation

(1 µg/ml, 4 h) under hypoxic conditions. HIF-1α proteins in DCs from CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice are

smaller than HIF-1α proteins from HIF-1α+f/+f

mice because of the deletion of exon 2. In this

experiment, β-actin was used as a loading control. (B) HIF-1α exon 2 mRNA expression was

significantly lower in CD11cCre/HIF-1α+f/+f


mice, a finding demonstrating a

knock-out efficiency of 90%. n=3, triplicates per group. ****P<.0001.

H IF -1 e x o n 2

HIF

-1

ex

on

2/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

HIF

-1+

f/+

f C

CD

11cC

re/H

IF-1

+

f/+

f C

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5 ****

B

Ergebnisse

96

Fig. 3.9: Dendritic cell–specific knock-out leads to severer inflammation in DSS colitis.

We measured mRNA expression in colon homogenates. Levels of (A) IL-1β, (B) serum amyloid A, and

(C) HIF-1α were significantly higher in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice than in all other types

of mice studied. n=5-7 per group. *P<.05; **P<.01; ***P<.001; ****P<.0001.

IL -1

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

1 0

2 0

3 0

4 0

IL-1

/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

***

ns

*

A S e ru m a m y lo id A

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

3

3 0 0

6 0 0

9 0 0

1 2 0 0

SA

A/r

ibP

mR

NA

ex

pre

ss

ion

(2-

c

t )

***

ns

**

B

H IF -1

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

1 0

HIF

-1

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

****

ns

*

C

Ergebnisse

97

Fig. 3.10: IL-10 ELISA of colon tissue shows no differences between groups.

Colon homogenates were subjected to enzyme-linked immunosorbent assay analysis of IL-10. Very

low levels of IL-10 were found, with no statistically significant differences between the groups of mice.

n=5-7 per group.

Fig. 3.11: mRNA expression of α4 integrin increases in DSS colitis.

Expression of mRNA was measured in mesenteric lymph nodes showing significant increase in α4

integrin levels in DSS-treated mice, with no statistically significant difference between HIF-1α+f/+f

mice


mice. n=5-7 per group. **P<.01.

IL -1 0

Ex

tin

cti

on

at

45

0 n

m

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

4 In te g r in

4

In

teg

rin

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

2

4

6

8

**

**

Ergebnisse

98

Fig. 3.12: mRNA expression of trefoil factor (TFF)3 increases in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice.

We measured mRNA expression in colon homogenates and found significant induction of TFF3 in


mice. n=5-7 per group. **P<.01.

T F F 3

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1

2

3

4

TF

F3

/rib

P m

RN

A e

xp

res

sio

n

(2-

c

t )

**

ns

Ergebnisse

99

Table 3.1: Primer sequences

Gene Primer sequence Gene accession number

α4 Integrin 5´-TAC AAT GGC CGA GTC GAT GG-3´

5´-ATG CAC CAA CGG CTA CAT CA-3´

NM_010576.3

Aldh1a2 5´-ATC GCT TCT CAC ATC GGC AT-3´

5´-CAG CGT AGT CCA AGT CAG CA-3´

NM_009022.4

CCR9 5´-ACT CAC AAG CCT TAT TCC TGG C-3´

5´-CCA AGG TGC CCA CAA TGA AC-3´

NM_001166625.1

β7 Integrin 5´-TGA GAC CCC AAG AGA AGG GAG-3´

5´-GAT TTC CAC AGA GAG CCG GT-3´

NM_013566.2

CD4 5´-TGA AGG AAA CGC TCC CAC TC-3´

5´-AGC AGT GCT GAT GTC TTG CT-3´

NM_013488.2

CD8a 5´-ACC CTT GGC CGG AAT CTG CG-3´

5´-CTG TCT GAC TAG CGG CCT GGG A-3´

NM_001081110.2

HIF-1α 5´-GAA ATG GCC CAG TGA GAA AA-3´

5´-CTT CCA CGT TGC TGA CTT GA-3´

NM_010431.2

HIF-1α exon 2 5´-CAT CCA GAA GTT TTC TCA CAC G-3´

5´-GGC GAA GCA AAG AGT CTG AA-3´

NM_010431.2

F4/80 5´-TCT GGG GAG CTT ACG ATG GA-3´

5´-GAA TCC CGC AAT GAT GGC AC-3´

NM_010130.4

Foxp3 5´-CTG GCG AAG GGC TCG GTA GTC CT-3´

5´-CTC CCA GAG CCC ATG GCA GAA GT-3´

NM_001199347.1

IL-1β 5´-CCT CTC CAG CCA AGC TTC CT-3´

5´-TTT GGA AGC AGC CCT TCA TC-3´

NM_08361.3

IL-6 5´-TCC TAC CCC AAT TTC CAA TGC-3´

5´-CAT AAC GCA CTA GGT TTG CCG-3´

NM_031168.1

IL-10 5´-TGC CCC AGG CAG AGA AGC AT-3´

5´-GGG AGA AAT CGA TGA CAG CGC C-3´

NM_010548.2

IL-23p19 5´-ACC AGC GGG ACA TAT GAA TCT-3´

5´-AGA CCT TGG CGG ATC CTT TG-3´

NM_031252.2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&id=114326553





Ergebnisse

100

Lipocalin2 5´-ACG GAC TAC AAC CAG TTC GC-3´

5´-CAT TGG TCG GTG GGG ACA GA-3´

NM_008491.1

MUC1 5´-TCA CCC CAG TTG TCT GTT GG-3´

5´-GCC TGA CCT GAA CTT GAT GC-3´

NM_013605.1

MUC2 5´-GCT GAC GAG TGG TTG GTG AAT G-3´

5´-GAT GAG GTG GCA GAC AGG AGA C-3´

NM_023566.3

MUC3 5´-AGT GCT GTT GGT GAT CCT CG-3´

5´-AGA GTC CAG GGG CAT GTA GT-3´

XM_355711.9

OX40 5´-GCC CTG CAT TTG CTG TTC TC-3´

5´-AGC TGT TTC CCC AAC AAG GT-3´

NM_011659.2

RARα 5´-CAG AGC AGC AGT TCC GAA GA-3´

5´-CCG GGT CAC CTT GTT GAT GA-3´

NM_009024.2

Ribosomal protein 5´-AGA TGA TCG AGC CGC GC-3´

5´-GCT ACC AGG GCC TTT GAG ATG GA-3´

NM_013647.2

Serum amyloid A 5´-GAA AGA AGC TGG TCA AGG GTC-3´

5´-TCC GGG CAG CAT CAT AGT TC-3´

NM_011315.3

TFF3 5´-CCT GGT TGC TGG GTC CTC TG-3´

5´-GCC ACG GTT GTT ACA CTG CTC-3´

NM_011575.2

TGF-β 5´-AAC CCC AAA GCC AGA GTG G-3´

5´-CGT CTG TCA CGT CGA AGG AG-3´

NM_009367.3

TSLPR 5´-TTT CCG GGG CAG CAT CC-3´

5´-CGC ATC TTT CAC CCT GCG AA-3´

NM_001164735.1





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/257900527?report=gbwithparts

Ergebnisse

101

3.2 Weitere Präsentationen

Vortrag

Flück K., (2012). Die Bedeutung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren bei chronisch

entzündlichen Darmerkrankungen. 18. Workshop Zell- und Gewebeschädigung:

Mechanismen, Protektion und Therapie, Xanten.

Poster

1. Flück K., Winning S. (2011). Die Bedeutung der Hypoxie-induzierbaren

Faktoren bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. 10. Forschungstag

der Medizinischen Fakultät, Essen, Abstractband S. 27.

2. Flück K., Fandrey J., Winning S. (2012). The role of hypoxia-inducible factors

in inflammatory bowel disease. 91st Annual Meeting, Deutsche Physiologische

Gesellschaft, Dresden, Abstractband S. 197.

3. Flück K., Breves G., Fandrey J., Winning S. (2012). The role of hypoxia-

inducible factors in inflammatory bowel disease. EPO Meeting Luebeck,

Abstractband S. 29.


in inflammatory bowel disease. 11. Forschungstag der Medizinischen Fakultät,

Essen, Abstractband S. 42.


in inflammatory bowel disease. 92st Annual Meeting, Deutsche Physiologische

Gesellschaft, Heidelberg, Abstractband S.167.

6. Flück K., Fandrey J., Breves G., Winning S. (2013). Bedeutung des

Hypoxie-induzierbaren Faktors in dendritischen Zellen im Rahmen einer DSS

induzierten akuten Colitis in vivo. 12. Forschungstag der Medizinischen

Fakultät, Essen, Abstractband S. 30.

Ergebnisse

102

3.3 Weitere Ergebnisse

3.3.1 Anstieg des Disease Activity Index durch DSS induzierte Colitis

Das Trinkwasser von HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren wurde mit 3 %

Dextrannatriumsulfat (DSS) versetzt, um eine Colitis zu induzieren. Kontrolltiere

erhielten mit 3 % PBS versetztes Trinkwasser. Der Disease Activity Index (DAI),

welcher sich aus prozentualem Gewichtsverlust, Stuhlbeschaffenheit und Blutgehalt

im Stuhl zusammensetzt (s. Tabelle 2.11), wurde täglich ermittelt. Bei den

Kontrolltieren lag der DAI während des gesamten Experimentes etwa bei 0 Punkten.

Leichte Abweichungen ergaben sich aus physiologischen Gewichtsschwankungen.

Bei den mit DSS behandelten Tieren stieg der DAI ab Tag 3 kontinuierlich an. An

Tag 7 waren Maximalwerte von 12 Punkten vorhanden. HIF-1α+f/+f und

CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tiere zeigten jedoch keine Unterschiede im DAI. Bei beiden

Gruppen stieg der DAI gleichmäßig an (s.

Abb. 3.13).

Abb. 3.13: Anstieg des Disease Activity Index (DAI) durch DSS Colitis.

HIF-1α+f/+f

und CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tiere zeigten einen simultanen Anstieg des DAI ab Tag 3 durch

die DSS induzierte Colitis. n = 9 pro Kontrollgruppe (C); n = 14 pro DSS Gruppe.

Ergebnisse

103

3.3.2 Veränderungen des Colons durch DSS induzierte Colitis

An Tag 7 des Experimentes wurden die Tiere durch Genickbruch getötet und das

Colon herausgenommen. Die Colonlänge wurde bestimmt, das Colongewicht wurde

gemessen und auf die Länge bezogen. Bei den DSS behandelten Tieren verkürzte

sich das Colon signifikant durch die Entzündung. Es waren jedoch keine

Unterschiede zwischen HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren feststellbar.

Zudem stieg das Colongewicht durch die Colitis signifikant an. Es waren jedoch auch

hier keine Unterschiede zwischen HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren

feststellbar (s. Abb. 3.14).

Abb. 3.14: Verkürzung des Colons und Anstieg des Colongewichtes durch DSS

Colitis.

(A) Durch die DSS induzierte Colitis verkürzte sich das Colon in HIF-1α+f/+f


Tieren signifikant. (B) Das Colongewicht stieg signifikant in beiden Gruppen durch die Entzündung an.

n = 14 pro Kontrollgruppe (C); n = 17 pro DSS Gruppe. ****P<0.0001.

C o lo n g e w ic h t

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

(mg

/cm

)

****

****

C o lo n lä n g e

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

3

6

9

1 2

(cm

)

****

****

A B

Ergebnisse

104

3.3.3 Hochgradige Entzündung des Colons durch DSS Behandlung

Das distale Colon wurde im Querschnitt in Paraffin eingebettet und in 4 µm dicke

Schnitte geschnitten, welche zur Beurteilung der Entzündung mit H&E gefärbt

wurden. Die Kontrolltiere wiesen einen physiologischen Aufbau des Colons auf. Das

Epithel der Tunica mucosa war intakt und die Darmkrypten waren zu erkennen. In

der Lamina propria mucosae waren nur vereinzelte Leukozyten zu finden. HIF-1α+f/+f

und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Kontrolltiere zeigten keine Unterschiede im Aufbau des

Colons. Durch die Gabe von 3 % DSS für 7 Tage entwickelte sich eine hochgradige

Entzündung im Colon (s. Abb. 3.15). Es kam zu einer massiven Infiltration von

Leukozyten in die Lamina propria mucosae mit Zerstörung des Epithels und der

Krypten. Die Tela submucosa wies eine Ödematisierung mit deutlicher

Leukozyteninfiltration auf. Auch die Tunica muscularis war verdickt und mit einzelnen

Leukozyten durchsetzt. Bei der Betrachtung der Schnitte war kein Unterschied in

dem Ausmaß der Entzündung zwischen HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f

DSS behandelten Tieren feststellbar. Die Colonquerschnitte wurden daraufhin von

zwei verblindeten Untersuchern nach einem vorgegebenen Score (s. Tabelle 2.21)

ausgewertet und die Ergebnisse in Abb. 3.16 dargestellt. Die Kontrolltiere erhielten

für die jeweiligen Parameter jeweils 0 Punkte, da keinerlei Entzündungszeichen

vorhanden waren. Bei den DSS behandelten Tieren lag ein durchschnittlicher Score

von ca. 14 Punkten vor, was eine deutliche Entzündung beschreibt. Zwischen

HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f DSS behandelten Tieren war jedoch auch

mithilfe der Auswertung des histologischen Score kein Unterschied im

Entzündungsgrad erkennbar.

Ergebnisse

105

Abb. 3.15: Hochgradige Entzündung des Colons durch DSS Behandlung.

4-µm Schnitte von distalen Colonquerschnitten wurden H&E gefärbt. HIF-1α+f/+f

und


Kontrolltiere (C) zeigten einen physiologischen Aufbau des Colons. Durch die

DSS Behandlung wurde eine hochgradige Entzündung im Colon induziert. Es kam zu einer deutlichen

Infiltration von Leukozyten mit Zerstörung des Epithels und Verlust der Kryptenstrukturen. Die Tela

submucosa zeigte eine Ödematisierung. Zwischen HIF-1α+f/+f


DSS

behandelten Tieren war kein Unterschied im Entzündungsausmaß feststellbar. Die gezeigten Bilder

sind repräsentativ für 5-7 analysierte Tiere pro Gruppe (40-fache Vergrößerung).

Ergebnisse

106

Abb. 3.16: Anstieg des histologischen Scores durch DSS Behandlung.

Der histologische Score der Kontrolltiere (C) lag bei 0. DSS behandelte Tiere zeigten einen deutlichen

Anstieg des Score, wobei kein Unterschied zwischen HIF-1α+f/+f


Tieren

ermittelt wurde. n = 3 pro Kontrollgruppe (C); n = 8 pro DSS Gruppe.

Von einigen Tieren wurden zudem sogenannte Swiss Rolls angefertigt (s. Abb. 3.17).

Dabei wurde das gesamte Colon als Rolle eingedreht, wobei das distale Ende des

Colons einheitlich nach innen gelegt wurde. Bei den Kontrolltieren war ein

physiologischer Colonaufbau zu erkennen. Es bestand kein Unterschied zwischen

HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren. Durch die DSS Behandlung ließ sich

auch in der Swiss Roll eine hochgradige Entzündung feststellen. Durch diese

Darstellung wurde deutlich, dass die Entzündung vor allem im distalen Bereich des

Colons vorlag. In diesem Bereich waren massive Leukozyteninfiltrate auffindbar.

Epithelzellen wurden zerstört und das Colon war insgesamt stark ödematös.

Allerdings konnte auch bei dieser Darstellungsweise kein Unterschied in

Entzündungsstärke und –ausbreitung zwischen DSS behandelten HIF-1α+f/+f und

CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren festgestellt werden.

H is to S c o re

HIF

-1+f/+f C

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f C

HIF

-1+f/+f D

SS

CD

11cC

re/H

IF-1+f/+f D

SS

0

5

1 0

1 5

2 0

Sc

ore

Ergebnisse

107

Abb. 3.17: Hochgradige Entzündung des Colons vor allem im distalen Bereich.

Das Colon wurde als sogenannte Swiss Roll eingerollt, wobei das distale Ende innen lag. 4-µm

Schnitte wurden H&E gefärbt. Kontrolltiere (C) zeigten einen physiologischen Aufbau des Colons.

Durch die DSS Behandlung konnte vor allem in der distalen Hälfte des Colons eine deutliche

Infiltration mit Leukozyten festgestellt werden. Epithelzellen wurden zerstört und das Colon zeigte eine

Ödematisierung. Zwischen HIF-1α+f/+f


behandelten Tieren wurde kein

Unterschied im Entzündungsausmaß festgestellt. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für 5-7

analysierte Tiere pro Gruppe (10-fache Vergrößerung).

Ergebnisse

108

3.3.4 Verstärkte Alcianblau Färbung in DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tieren

4-µm dicke Schnitte von distalen Colonquerschnitten wurden mit Alcianblau gefärbt

(s. Abb. 3.18). Becherzellen im Colon produzieren Mucine, welche aus sauren

Mucopolysacchariden bestehen und durch Alcianblau dunkelblau angefärbt werden.

In den Kontrolltieren wurde ein physiologischer Aufbau des Colons festgestellt.

Alcianblau färbte hierbei vor allem Strukturen in tiefer gelegenen Krypten an. Die

Färbung war sehr regelmäßig. Zwischen HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Kontrolltieren war kein Unterschied erkennbar. In den DSS behandelten Tieren

konnte man eine deutliche Änderung des Colonaufbaus erkennen. Die Alcianblau

Färbung war zudem eher vesikulär und zum Lumen orientiert. In den Knock-out

Tieren zeigten sich vermehrt positive Strukturen und die Färbung war deutlich

stärker.

Ergebnisse

109

Abb. 3.18: Verstärkte Alcianblau Färbung in DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tieren.

4-µm Schnitte von distalen Colonquerschnitten wurden mit Alcianblau gefärbt. Mucopolysaccharide

färbten sich dunkelblau an. Kontrolltiere (C) wiesen eine gleichmäßige Färbung vor allem in tiefer

gelegenen Krypten auf. Die DSS Behandlung führte zu einer verstärkt vesikulären, zum Lumen

orientierten Färbung. Die DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f

zeigten eine vermehrte und

intensivere Färbung. Die gezeigten Bilder sind repräsentativ für 5-7 analysierte Tiere pro Gruppe

(40-fache Vergrößerung).

Diskussion

110

4 Diskussion

4.1 Auswirkungen einer Colitis auf intestinale DCs

Als Bindeglied zwischen erworbener und angeborener Immunität übernehmen DCs

eine entscheidende Rolle in der intestinalen Immunantwort. Zudem haben sie die

wichtige Aufgabe, die Homöostase des Darms zu regulieren. Mehrere Studien

zeigten, dass entzündliche Prozesse im Darm Veränderungen im Sauerstoffhaushalt

bedingen, welche zu einer sich in das umliegende Gewebe ausbreitenden Hypoxie

führen (Taylor & Colgan 2007; Eltzschig & Carmeliet 2011). Der Transkriptionsfaktor

Hypoxie induzierbarer Faktor (HIF)-1 reguliert die zelluläre Adaptation an diese

sauerstoffarmen Bedingungen (Semenza et al. 1997). In intestinalen Epithelzellen

konnte bislang ein protektiver Effekt von HIF-1 dargestellt werden (Karhausen et al.

2004; Cummins et al. 2008; Tambuwala et al. 2010). Durch die intraperitoneale

Injektion von Pimonidazol, welches in hypoxischer Umgebung aktiviert wird, konnte

in der Immunfluoreszenz gezeigt werden, dass eine Colitis zu einer Ausbreitung der

Hypoxie führt (s. Fig. 3.1 B). Die Immunzellen innerhalb der Tunica mucosa und

Tela submucosa waren deutlich positiv in der Hypoxie Färbung, was auf eine

Aktivierung von HIF-1 schließen lässt. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden

Arbeit die Bedeutung von HIF-1α in DCs im Rahmen einer experimentellen Colitis

untersucht.

4.2 Entzündungsparameter HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f DSS

behandelter Tiere

In Kontrollmäusen (HIF-1α+f/+f) und Knock-out Mäusen ohne funktionelles HIF-1α in

DCs (CD11cCre/ HIF-1α+f/+f) wurde durch siebentägige Gabe von 3 % DSS eine

Colitis induziert. Die Knock-out Mäuse zeigten im Vergleich zu den Kontrollmäusen

einen signifikant größeren Gewichtsverlust an Tag 6 und 7 des Experiments (s. Fig.

3.2 A), wohingegen sich im Disease Activity Index (DAI) (s. Abb. 3.13), in der

Colonlänge und –gewicht (s. Abb. 3.14), sowie in der Histologie (s. Abb. 3.16) keine

Unterschiede zwischen den Gruppen feststellen ließen. Karhausen et al., welche

Diskussion

111

einen protektiven Effekt von epithelialem HIF-1α darstellten, konnten in ihren

Untersuchungen einen Unterschied in der Colonlänge zwischen den untersuchten

Gruppen feststellen. Hierbei handelte es sich jedoch um ein TNBS Colitismodell, bei

welchem TNBS rektal appliziert wurde (Karhausen et al. 2004). Dies könnte eventuell

zu deutlicheren Auswirkungen auf die Colonlänge geführt haben. Auch in weiteren

Studien, die sich mit der Rolle von epithelialem HIF während einer Colitis

beschäftigten, konnten Unterschiede zwischen den betreffenden Gruppen sowohl im

DAI, in der Colonlänge und –gewicht als auch in der Histologie festgestellt werden.

Allerdings wurden in diesen Studien sowohl andere DSS Konzentrationen für

geringere Zeiträume als auch Mäuse mit einem unterschiedlichen genetischen

Hintergrund benutzt (Cummins et al. 2008; Tambuwala et al. 2010). Die Gabe von

3 % DSS über 7 Tage ist für Mäuse mit C57BL/6J Hintergrund ein zuverlässiges

Modell der Colitis Induktion (Vowinkel et al. 2004). Wie man in der Histologie

erkennen kann, lag in den DSS behandelten Tieren eine äußerst hochgradige

Entzündung vor. Dies könnte dazu geführt haben, dass mögliche Unterschiede von

dem Schweregrad der Colitis überdeckt worden sind.

Auf mRNA Ebene ließ sich jedoch ein deutlicher Unterschied zwischen DSS

behandelten HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren feststellen. Die Expression

der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-23 zeigte eine deutliche Erhöhung in

den Knock-out Tieren (s. Fig. 3.2 B-C). Diese Zytokine haben dabei eine große

Bedeutung in murinen Colitismodellen und in der Pathogenese von CED. IL-6 wird

durch viele verschiedene Immunzellen produziert, unter anderem durch DCs,

Makrophagen und Th17-Zellen. In CED Patienten konnten erhöhte Werte von IL-6 in

der intestinalen Mukosa und im Serum sowie eine erhöhte dendritische IL-6

Produktion festgestellt werden (Gross et al. 1992; Hart et al. 2005; Eastaff-Leung et

al. 2010). Des Weiteren konnte durch Gabe eines anti-IL-6-Antikörpers die

Ausprägung einer Colitis in SCID Mäusen unterdrückt werden. Die Behandlung

führte zudem zu verringerten Expressionen von IFN-γ, TNF-α und IL-1β. Dies lässt

darauf schließen, dass auch für die Entwicklung einer proinflammatorischen

Th1-Immunantwort die Wirkung von IL-6 benötigt wird (Yamamoto et al. 2000). Es

konnte außerdem gezeigt werden, dass die Neutralisation des membrangebundenen

Diskussion

112

IL-6 Rezeptors (IL-6R) den Ausbruch einer Colitis in verschiedenen Modellen

verhinderte (Atreya et al. 2000). IL-6 kann zudem an den löslichen IL-6 Rezeptor

binden (sIL-6R, engl. soluble IL-6R), was zur Entstehung des IL-6/sIL-6R-Komplex

führt. Dieser kann über Bindung an das ubiquitär vorkommende Glykoprotein gp130

proinflammatorische Immunantworten auslösen. Dieser Vorgang wird als

IL-6-trans-signaling bezeichnet. Unter anderem wird dadurch die Apoptose

mukosaler T-Zellen inhibiert und die Aufrechterhaltung einer chronischen

Darmerkrankung ermöglicht. Die Neutralisation des sIL-6R in Patienten mit MC führte

zu einer deutlichen Unterdrückung der Aktivität im Rahmen einer Colitis und zu einer

gesteigerten Apoptose von T-Zellen (Atreya et al. 2000). IL-6-trans-signaling führte

außerdem zu einer erhöhten Expression des TGF-β Inhibitors SMAD7. Durch

Überexpression von SMAD7 in transgenen Mäusen waren diese nicht mehr in der

Lage Foxp3+ Tregs zu induzieren und eine Colitis durch die Aktivierung von Tregs zu

unterdrücken (Dominitzki et al. 2007). Fujimoto et al. bewiesen, dass die

Überproduktion von IL-6 die Induktion von Tregs hemmte (Fujimoto et al. 2011). Die

deutlich erhöhte IL-6 Produktion in den DSS behandelten Knock-out Tieren (s. Fig.

3.2 B) lässt somit auf eine verstärkt proinflammatorische Immunantwort schließen,

welche zudem direkt in der Lage sein könnte, regulatorische Antworten zu

unterdrücken.

Viele Studien beschäftigten sich des Weiteren mit der Bedeutung des

proinflammatorischen Zytokins IL-23 in entzündlichen Darmerkrankungen. IL-23

besteht aus den Untereinheiten IL-23p19 und IL-12p40, welches die gemeinsame

Untereinheit mit IL-12 darstellt (Oppmann et al. 2000). IL-23 sowie IL-12 werden von

APCs, vornehmlich DCs, gebildet. IL-12 fördert dabei in Anwesenheit von IFN-γ die

Differenzierung naiver T-Zellen zu Th1-Zellen, wohingegen IL-23 in Verbindung mit

TGF-β und IL-6 die Differenzierung zu Th17-Zellen einleitet (Kikly et al. 2006). Es

konnte gezeigt werden, dass IL-23 in die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen,

wie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und der

Kollagen-induzierten Arthritis (CIA, engl. collagen-induced arthritis), involviert ist. Die

Produktion von IL-23 steht zudem in engem Zusammenhang mit der Entwicklung

entzündlicher Darmerkrankungen. In CED Patienten konnten sowohl erhöhte IL-23

Diskussion

113

Konzentrationen in intestinalen Geweben als auch eine erhöhte IL-23 Produktion

durch mukosale DCs festgestellt werden (Stallmach et al. 2004; Schmidt et al. 2005;

Sakuraba et al. 2009). In RAG-/- Mäusen, welche auf Grund einer Defizienz reifer

B- und T-Lymphozyten nach T-Zell Transfer eine Colitis entwickeln, führte die

Deletion von IL-23p19 oder IL-12p40 zur Unterdrückung der Colitis. Mäuse mit einer

zusätzlichen Deletion von IL-12p35 hingegen entwickelten eine deutliche Colitis (Hue

et al. 2006b). Die Deletionen von IL-23p19 und IL-12p40 führten zu einer Inhibierung

der IL-23 Produktion, wohingegen durch die Deletion von IL-12p35 die

IL-12 Produktion gehemmt wurde. Es wird daher vermutet, dass IL-23 als

entscheidendes Zytokin für eine intestinale Erkrankung gilt. Studien von Elson et al.

bestätigten diese Vermutung, indem sie zeigten, dass die Neutralisation von

IL-23p19 durch einen monoklonalen Antikörper den Ausbruch einer Colitis verhindern

sowie eine bestehende Colitis abschwächen konnte (Elson et al. 2007). Yen et al.

zeigten des Weiteren, dass die Gabe von IL-23 Protein zu einem deutlich früheren

Ausbruch der Colitis in RAG-/- Mäusen sowie zu einer erhöhten Produktion von IL-6

und IL-17 führte. Zudem konnte eine erhöhte Rekrutierung von Makrophagen und

Granulozyten festgestellt werden (Yen et al. 2006). Izcue et al. konnten eine weitere

Wirkung von IL-23 darstellen. Sie zeigten, dass IL-23 die Funktion regulatorischer

T-Zellen im Darm behindern und dass die Aufhebung immunsupprimierender und

regulatorischer Antworten die Entstehung intestinaler Entzündungen begünstigen

kann (Izcue et al. 2008). Diese Daten stehen im Einklang mit den erhobenen

Ergebnissen dieser Arbeit. Die DSS behandelten Knock-out Tiere zeigten eine

stärkere Entzündung mit einer erhöhten IL-23 Produktion (s. Fig. 3.2 C), einer

erhöhten Anzahl an Makrophagen (s. Fig. 3.2 E) und einer eingeschränkten

regulatorischen T-Zellantwort (s. Fig. 3.6 C-E). Es kann vermutet werden, dass die

HIF-1α Defizienz in DCs vornehmlich zu einer eingeschränkten Induktion

regulatorischer T-Zellen führte. Dies resultierte in einer verstärkten Entzündung mit

erhöhter Produktion proinflammatorischer Zytokine, welche wiederum die Funktion

der Tregs unterdrücken konnten.

Auf der anderen Seite muss jedoch erwähnt werden, dass die durch IL-23 ausgelöste

Th17-Antwort auch positiven Einfluss auf eine Darmentzündung nehmen kann.

Diskussion

114

Sugimoto et al. zeigten, dass das von Th17-Zellen produzierte Zytokin IL-22 zur

Verbesserung einer intestinalen Entzündung führte (Sugimoto et al. 2008). IL-22

aktiviert die Mucinproduktion der IECs und fördert die Restitution geschädigter Mucin

produzierender Becherzellen. Durch Gabe eines IL-22 bindenden Antikörpers wurde

die Wiederherstellung der Becherzellen in der Erholungsphase eines DSS

Colitismodells gehemmt. In den behandelten Knock-out Mäusen dieser Arbeit konnte

eine deutlich erhöhte Mucinproduktion festgestellt werden (s. Fig. 3.7 A-D). Es ist

also möglich, dass der Knock-out von HIF-1α in DCs über ausgelöste

proinflammatorische Th17-Antworten Effekte auf das intestinale Epithel aufwies,

welche kompensatorische Schutzmechanismen und die Restitution des geschädigten

Epithels einleiteten.

Ein weiterer Parameter für die verstärkte Erkrankung der Knock-out Tiere war die

erhöhte Expression von Lipocalin 2 (Lcn2) (s. Fig. 3.2 D). Lcn2 ist ein Mitglied der

Lipocalin Protein Familie und wird unter anderem von neutrophilen Granulozyten und

IECs exprimiert (Cowland & Borregaard 1997; Raffatellu et al. 2009). Es stellt einen

wichtigen Regulator der Immunantwort dar (Berger et al. 2006). Chassing et al.

maßen den fäkalen Lcn2 Gehalt in einem DSS Colitismodell mittels ELISA und

konnten einen kontinuierlichen Anstieg während der Entwicklung der Erkrankung

nachweisen (Chassaing et al. 2012). Dies stellt eine relativ kostengünstige und vor

allem nicht-invasive Methode dar, um den Verlauf der Colitis zu dokumentieren und

könnte in nächsten Versuchen verwendet werden.

Es zeigte sich des Weiteren eine signifikant erhöhte IL-1β Expression in den DSS

behandelten Knock-out Tieren (s. Fig. 3.9 A). Makrophagen stellen die

Hauptproduzenten von IL-1β dar, welches unter anderem Lymphozyten aktiviert und

die Freisetzung von Akute-Phase-Proteinen (APPs) induziert (Murphy et al. 2009).

Serum Amyloid A (SAA) stellt ein wichtiges APP dar, welches zudem mit dem

Schweregrad einer Colitis in Mensch und Maus korreliert (Chambers et al. 1987; de

Villiers et al. 2000). Auch für SAA wiesen die Knock-out Mäuse höhere Werte durch

die DSS Colitis auf (s. Fig. 3.9 B). Verschiedene Studien zeigten zudem, dass CED

Patienten deutlich erhöhte IL-1β Werte aufwiesen (Stallmach et al. 2004; Eastaff-

Leung et al. 2010). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass IL-1β Einfluss auf das

Diskussion

115

intestinale Epithel hat. Zum einen kann es bei einer Shigellen Infektion die tight

junctions der Epithelzellen so stark lockern, dass weitere Mikroorganismen aus dem

Darmlumen in das Gewebe eindringen können und die Infektion sich ausbreitet

(Sansonetti 2004). Zum anderen kann es IECs zur vermehrten Produktion von IL-6

anregen (McGee et al. 1993). Eine erhöhte IL-6 Expression konnte auch in den DSS

behandelten Knock-out Mäusen festgestellt werden (s. Fig. 3.2 B). Es erscheint also

möglich, dass die einzelnen Zytokine sich untereinander beeinflussen und zur

vermehrten Produktion anregen. Da DCs eine entscheidende Bedeutung im

Zusammenspiel der intestinalen Immunität aufweisen, führte der Verlust von

dendritischem HIF-1α somit zu weitgreifenden Veränderungen im

Zytokinexpressionsmuster der lokalen Immunzellen. Dies wiederum könnte das

Ausbilden immunregulatorischer Tregs unterdrückt haben, was sich in einer

verschlechterten Kontrolle der Darminfektion äußerte.

4.3 Typ I Interferon Produktion

DCs stellen die Hauptproduzenten der Typ I Interferone dar (Abe et al. 2007). In vitro

Studien von Wobben et al. zeigten eine HIF-1α abhängige dendritische Produktion

von Typ I Interferonen (Wobben et al. 2013). Die Synthese von IFN-α4, IFN-α12 und

IFN-β durch LPS Stimulation war in isolierten BmDCs von LysMcre/HIF-1α+f/+f

Mäusen, welche einen Verlust von HIF-1α in myeloischen Zellen aufwiesen,

signifikant geringer im Vergleich zu Kontrollmäusen. Dies hatte entscheidende

Auswirkungen auf die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen. Durch Kokulturversuche

konnte gezeigt werden, dass DCs mit einem Mangel an HIF-1α Protein deutlich

weniger CD278 mRNA in T-Zellen induzierten, wodurch ein Hinweis auf eine

reduzierte T-Zellaktivierung bestand. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden

Arbeit die Typ I Interferon Produktion untersucht. Ergebnisse von Wobben et al.

konnten dabei zum Teil mit in vivo Daten bestätigt werden, da die Kontrolltiere in den

mesenterialen Lymphknoten nach DSS Behandlung eine signifikant höhere

Expression von IFN-α4 und IFN-α12 aufwiesen als die DSS behandelten Knock-out

Tiere. Typ I Interferone, wozu IFN-α und IFN-β zählen, unterscheiden sich stark von

IFN-γ, welches vornehmlich von Makrophagen, Th1-Zellen, CTLs und NK-Zellen

Diskussion

116

sezerniert wird und gegen intrazelluläre Pathogene wirkt (Murphy et al. 2009). Die

ursprünglich beschriebene Aufgabe der Typ I Interferone war die Abwehr von

Virusinfektionen. Neuere Studien beschrieben jedoch auch weitreichendere

Funktionen und zeigten zudem einen Zusammenhang zwischen Typ I Interferonen

und der Kontrolle einer intestinalen Entzündung. Sainathan et al. untersuchten die

Effekte von Imiquimod auf die Auswirkungen einer DSS Colitis. Imiquimod ist ein

Virostatikum, welches über TLR7 Bindung die Produktion von IFN-α, TNF-α, IL-6 und

IL-12 steigert. Es wird unter anderem gegen Genitalwarzen, aktinische Keratose und

oberflächliche Basalzell-Karzinome eingesetzt (Gupta et al. 2004). Sainathan et al.

zeigten nun, dass sowohl die orale als auch die topische Behandlung mit Imiquimod

zu einer erhöhten Typ I Interferon Produktion im Colon und dadurch zu einer

deutlichen Verbesserung der Symptome der DSS Colitis führte (Sainathan et al.

2012). Katakura et al. konnten des Weiteren nachweisen, dass die Induktion der

Typ I Interferone über TLR9 eine protektive Wirkung in einer experimentellen Colitis

aufwies (Katakura et al. 2005). TLR9 Agonisten, wie nicht-methylierte

Cytosin-Phosphatidyl-Guanin Inseln bakterieller DNA (CpGs), verbesserten eine

DSS induzierte Colitis in RAG defizienten Mäusen, jedoch nicht in SCID Mäusen. Die

Ursache hierfür lag in einer reduzierten IFN-α/β Produktion auf Grund einer

verringerten Anzahl an DCs in den SCID Mäusen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass

die positiven Effekte durch die Neutralisation von IFN-α/β mit speziellen Antikörpern

aufgehoben werden konnten. Weitere Untersuchungen konnten nachweisen, dass

die protektive Wirkung von IFN-α/β in einer DSS Colitis zum Teil durch die

Unterdrückung der proinflammatorischen Aktivität der Makrophagen bedingt war.

Zudem wurde vermutet, dass Typ I Interferone Einfluss auf das intestinale Epithel

haben, indem sie die Apoptose der IECs verhindern und somit die epitheliale

Barrierefunktion aufrecht erhalten (Katakura et al. 2005). Auch Abe et al. bewiesen

einen protektiven Einfluss von Typ I Interferonen mit direktem Bezug auf DCs (Abe et

al. 2007). Eine Deletion von DCs während einer DSS induzierten Colitis führte zu

einer Abmilderung der Symptome, wohingegen die Abwesenheit von DCs vor

Induktion der Colitis zu einer deutlichen Verschlechterung führte. Wurden die Mäuse

jedoch vor der Induktion einer DSS Colitis mit TLR9 Agonisten, wie CpGs, behandelt,

Diskussion

117

zeigte dies eine protektive Wirkung. Die Autoren führten diesen positiven Effekt auf

den Einfluss von Typ I Interferonen zurück, welche die Aktivierung

proinflammatorischer Makrophagen unterdrücken konnten. Diese Befunde stehen im

Einklang mit den Ergebnissen dieser Arbeit. Der Verlust von dendritischem HIF-1α

resultierte in einer verringerten Produktion an Typ I Interferonen (s. Fig. 3.3 A-B).

Dies wiederum beeinträchtigte die Unterdrückung der proinflammatorischen

Makrophagenantwort, was sich in der erhöhten Anzahl an F4/80 positiven Zellen

(s. Fig. 3.2 E) und der gesteigerten Produktion proinflammatorischer Zytokine in den

Knock-out Tieren wiederspiegelte (s. Fig. 3.2 B-D).

4.4 Aktivierung regulatorischer T-Zellen durch DCs

Bestimmte intestinale DCs besitzen die Fähigkeit, die Differenzierung CD4+ T-Zellen

zu Foxp3+ regulatorischen T-Zellen zu induzieren (Annacker et al. 2005; Coombes et

al. 2007). Tregs übernehmen eine entscheidende Rolle in der intestinalen Immunität.

Sie können die Symptome einer bestehenden Colitis abmildern oder sogar den

Ausbruch einer Colitis verhindern (Mottet et al. 2003; Uhlig, Coombes, et al. 2006;

Izcue et al. 2006). In CED Patienten konnte zudem eine reduzierte Treg-Anzahl und

eine Zunahme der Th17-Zellen nachgewiesen werden (Eastaff-Leung et al. 2010).

Aus diesem Grund wurden die Auswirkungen des HIF-1α Verlustes in DCs auf die

Fähigkeit der Treg Induktion untersucht.

Die Treg Induktion durch DCs wird von verschiedenen Mediatoren beeinflusst. Dazu

gehören TGF-β, Retinsäure und IL-10. TGF-β wird von äußerst vielen Zellen in einer

inaktiven Vorläuferform sezerniert und liegt in großen Mengen in der intestinalen

Mukosa vor. Für die Ausübung der biologischen Effekte muss TGF-β allerdings noch

aktiviert werden. Es konnte gezeigt werden, dass dies durch die Expression von

ανβ8-Integrinen auf DCs erfolgt (Travis et al. 2007). Der Verlust von ανβ8-Integrinen

auf DCs führte zu einer eingeschränkten Fähigkeit, Foxp3+ Tregs zu induzieren und

zur Entwicklung von Autoimmunerkrankungen und entzündlichen

Darmveränderungen (Travis et al. 2007; Lacy-Hulbert et al. 2007). Coombes et al.

konnten des Weiteren nachweisen, dass CD103+ intestinale DCs sowohl große

Mengen an LTBP3 (engl. latent TGF-β binding protein 3), welches für die Sekretion

Diskussion

118

und Erkennung von inaktivem / latentem TGF-β entscheidend ist, als auch an PLAT

(engl. tissue plasminogen activator) aufweisen, was für die Aktivierung von latentem

TGF-β benötigt wird (Coombes et al. 2007). Sie konnten zudem zeigen, dass die

Differenzierung von CD4+ T-Zellen zu Foxp3+ Tregs durch das von CD103+ DCs

produzierte TGF-β gesteuert wird. Die Inhibierung von TGF-β durch einen

blockierenden Antikörper führte zu einer vollständigen Hemmung der Foxp3

Induktion, wohingegen die Zugabe von exogenem TGF-β zu einer enormen

Steigerung der Foxp3 Induktion führte. Shull et al. zeigten schon vor einigen Jahren,

dass ein vollständiger Verlust von TGF-β1 zur Entwicklung einer Spontancolitis und

im weiteren Verlauf zu Multiorganversagen führte (Shull et al. 1992).

Verschiedene Studien untersuchten den Zusammenhang zwischen HIF-1 und

TGF-β. Bereits 1991 konnten Falanga et al. nachweisen, dass die Synthese von

TGF-β1 in humanen dermalen Fibroblasten durch Hypoxie gesteigert wird (Falanga

et al. 1991). HIF-1α vermittelte zudem in colorektalen Karzinomzellen die durch

TGF-β induzierte Glutathionperoxidase 1 Expression, welche den H2O2 vermittelten

Zelltod hemmt (Huang et al. 2012). In renalen Epithelzellen wird die TGF-β induzierte

Kollagenexpression von HIF-1 gesteuert (Basu et al. 2011). Clambey et al.

untersuchten die Verbindung zwischen Hypoxie und Tregs und konnten auch hierbei

feststellen, dass Hypoxie die relative Menge an Foxp3+ Tregs durch einen TGF-β

abhängigen Mechanismus erhöht (Clambey et al. 2012). Hung et al. konnten

schließlich in neuesten Studien mithilfe eines ChIP Assay den Nachweis erbringen,

dass TGF-β1 ein direktes Zielgen von HIF-1 darstellt (Hung et al. 2013). Intestinale

Makrophagen waren zudem unter dem Einfluss von TGF-β nicht mehr in der Lage,

proinflammatorische Zytokine zu sezernieren (Smythies et al. 2005). Diese

Ergebnisse untermauern insgesamt die Befunde der vorliegenden Arbeit, welche

zeigen, dass der Verlust von HIF-1α in DCs große Auswirkungen auf die TGF-β

Produktion, die Treg Differenzierung und letztendlich auch auf den Schweregrad

einer intestinalen Entzündung hatte.

TGF-β kann allerdings zusammen mit IL-6 auch die Differenzierung von naiven

T-Zellen zu proinflammatorischen Th17-Zellen steuern (Mangan et al. 2006;

Veldhoen et al. 2006; Bettelli et al. 2006). Dies wird jedoch durch die Anwesenheit

Diskussion

119

von Retinsäure inhibiert (Mucida et al. 2007). Viele Studien bewiesen zudem, dass

Retinsäure die Differenzierung naiver T-Zellen zu Foxp3+ Tregs fördert (Sun et al.

2007; Mucida et al. 2007; Coombes et al. 2007; Kang et al. 2007). Retinsäure

entsteht durch den Abbau von Vitamin A (Retinol) zu Retinal, welches durch Aldehyd

Dehydrogenasen weiter zu Retinsäure oxidiert wird (Duester 2000). Es wurde

gezeigt, dass DCs aus mesenterialen Lymphknoten bzw. CD103+ DCs diesen

Prozess durch die Aldehyd Dehydrogenase Aldh1a2 steuern (Iwata et al. 2004;

Coombes et al. 2007). Coombes et al. zeigten, dass die Zufuhr von exogener

Retinsäure in Zusammenhang mit TGF-β zu einer deutlichen Steigerung der

Foxp3+ Treg Induktion führte. Die Inhibierung der Retinsäurerezeptoren (RARs, engl.

retinoic acid receptors) unterdrückte diese Induktion komplett (Coombes et al. 2007).

Balmer et al. beschrieben eine weitere Verbindung zwischen TGF-β und Retinsäure.

Sie zeigten, dass Retinsäure direkt die Expression der Isoformen 1 und 2 des TGF-β

Rezeptors induziert (Balmer 2002). Die Zugabe von Retinsäure führt zudem zu einer

Reduktion der IFN-γ produzierenden T-Zellen (Cantorna et al. 1994). Annacker et al.

belegten diese Befunde, indem sie zeigten, dass mit CD103+ DCs kultivierte T-Zellen

weniger IFN-γ produzierten (Annacker et al. 2005). IFN-γ induziert die Expression

von SMAD7, welches wiederum die Funktion von TGF-β inhibiert. Es besteht also

auch hier ein Zusammenspiel der einzelnen Faktoren, da die durch Retinsäure

reduzierte IFN-γ Produktion in einem Anstieg von TGF-β und folglich in einer

erhöhten Foxp3 Expression resultieren könnte (Coombes & Powrie 2008).

Retinsäure induziert des Weiteren direkt die Transkription der RARs (Blomhoff &

Blomhoff 2006). Fernández-Martínez und Mitarbeiter bewiesen, dass die Regulation

des RARβ von HIF-1α abhängig ist (Fernández-Martínez et al. 2011). In dieser Arbeit

zeigten die HIF-1α+f/+f Kontrolltiere durch die DSS Behandlung einen deutlichen

Anstieg in der Aldh1a2 und RARα Expression, wohingegen der Anstieg in den

CD11cCre/HIF-1α+f/+f Knock-out Tieren unterblieb (s. Fig. 3.5 C-D). Es kann also

vermutet werden, dass der Verlust von dendritischen HIF-1α zu einer

Beeinträchtigung der Retinsäureproduktion und damit eingeschränkter Regulation

durch Tregs im Rahmen einer experimentellen Colitis führte. In weiterführenden

Diskussion

120

Versuchen könnte dies durch die direkte Bestimmung des Retinsäuregehalts z. B.

durch HPLC Verfahren untersucht und gegebenenfalls bestätigt werden.

Intestinale DCs besitzen des Weiteren die Fähigkeit, die darmspezifischen

Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 auf Lymphozyten zu induzieren

(Johansson-Lindbom et al. 2005). Iwata et al. konnten darstellen, dass Retinsäure

die Expression dieser Moleküle deutlich steigert (Iwata et al. 2004). Die Kontrolltiere

wiesen im Vergleich zu den Knock-out Tieren eine signifikant erhöhte Expression des

β7-Integrins und CCR9 durch die DSS Behandlung auf (s. Fig. 3.5 E-F). Es kann

daher angenommen werden, dass dendritisches HIF-1α für die Expression dieser

Moleküle von entscheidender Bedeutung ist und zu einer verbesserten Rekrutierung

der Lymphozyten führt. Zwar werden auch andere Effektorzellen als Tregs rekrutiert,

wie z. B. Th1-Zellen oder CTLs, aber da in den Kontrolltieren eine sehr große Menge

an Foxp3+ Tregs festgestellt werden konnte, ist davon auszugehen, dass diese

Zellen äußerst stark beeinflusst werden und so die Fähigkeit besitzen, die

Entzündung einzudämmen.

Ein weiteres wichtiges Zytokin für die intestinale Immunität stellt IL-10 dar. IL-10

Knock-out Mäuse entwickeln unter SPF Haltungsbedingungen eine milde

Entzündung des proximalen Colons, wohingegen sie unter konventionellen

Bedingungen eine schwere Enterocolitis mit Gewichtsreduktion und Anämie

entwickeln (Kühn et al. 1993). Dies spricht für eine Beteiligung der intestinalen

Mikroflora am Krankheitsgeschehen. In den erkrankten Tieren wurden von Berg et al.

erhöhte Werte von IFN-γ, IL-1α, TNF-α, IL-6 und Stickstoffmonoxid detektiert. Zudem

waren äußerst viele Zellen positiv in der F4/80 Färbung (Berg et al. 1996). Sie

vermuteten daher, dass der Verlust von IL-10 zu einer unkontrollierten Th1-Antwort

mit überschießender Zytokinproduktion durch Makrophagen führte. Die Gabe eines

Antikörpers gegen IFN-γ führte zu einer deutlichen Verbesserung der Symptome in

jungen Tieren. Durch Behandlung von frisch abgesetzten Mäusen mit IL-10 konnte

der Ausbruch der Colitis komplett gehemmt werden (Berg et al. 1996). Weitere

Studien zeigten, dass die Deletion von STAT3, dem Transkriptionsfaktor an welchen

IL-10 bindet, in myeloischen Zellen zu einer erhöhten Produktion von IL-12p40 und

IL-23p40 und dadurch zu einer chronischen Enterocolitis führte (Takeda et al. 1999;

Diskussion

121

Kobayashi et al. 2003). IL-10 wird von verschiedenen Zellen produziert. Das von

Tregs sezernierte IL-10 hat entscheidende Bedeutung für die Regulation und

Suppression von proinflammatorischen Antworten (Mittrücker & Kaufmann 2004;

Workman et al. 2009). Für die Induktion der Tregs ist die IL-10 Produktion durch

tolerogene DCs neben der schon beschriebenen TGF-β und RA Produktion

ausschlaggebend (Groux et al. 1999; Levings et al. 2005; Roncarolo et al. 2006).

Mäuse mit einer Deletion des IL-10 Rezeptors in Foxp3+ Tregs entwickelten im Alter

von 18-20 Wochen eine hochgradige Colitis. Weitere Untersuchungen zeigten, dass

IL-10 Rezeptor defiziente Tregs nicht in der Lage waren, proinflammatorische

Th17-Antworten zu unterdrücken. (Chaudhry et al. 2011). Auch im Rahmen von CED

spielt IL-10 eine Rolle. Isolierte DCs von MC Patienten wiesen eine reduzierte

Produktion von IL-10 auf (Sakuraba et al. 2009). De Baey et al. beschrieben eine

neue Vorläuferform von humanen DCs, genannt M-DC8, welche auf einen LPS

Stimulus 10-mal mehr TNF-α produzierten als normale DCs und im Gegensatz dazu

eine signifikant reduzierte IL-10 Produktion aufwiesen (de Baey et al. 2003). In MC

Patienten fanden sie eine sehr große Anzahl an M-DC8+ Zellen in der entzündeten

Tunica mucosa des Ileums. In der vorliegenden Arbeit wurden zum einen BmDCs

von HIF-1α+f/+f und CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren isoliert, unter normoxischen

Bedingungen kultiviert und mit LPS stimuliert. Die Kontrolltiere zeigten hierbei im

Vergleich zu den Knock-out Tieren einen signifikanten Anstieg von IL-10 durch LPS

Stimulation (s. Fig. 3.4 A). Zur besseren Imitation einer in vivo Situation wurde der

Versuch mit BmDCs, welche unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden,

wiederholt. Auch hier zeigten die Kontrolltiere einen signifikanten Anstieg von IL-10

durch LPS Stimulation (s. Fig. 3.4 B). In den DSS behandelten Tieren konnten diese

Befunde in mesenterialen Lymphknoten bestätigt werden. Hier wiesen ebenfalls die

HIF-1α+f/+f Tiere eine höhere Produktion von IL-10 auf (s. Fig. 3.5 A). Es kann somit

angenommen werden, dass HIF-1α für die IL-10 Produktion in DCs von

entscheidender Bedeutung ist und dass ein Verlust von dendritischem HIF-1α auch

durch diesen Mechanismus zu einer Beeinträchtigung der Induktion regulatorischer

T-Zellen führte.

Diskussion

122

Bereits mehrere Studien untersuchten den Zusammenhang zwischen HIF-1 und

IL-10. Rama et al. berichteten, dass durch Hypoxie stimulierte DCs eine erhöhte

Proteinproduktion von IL-10 aufweisen (Rama et al. 2008). Cai et al. bewiesen

zudem, dass HIF-1 die IL-10 Produktion in Myozyten aktiviert und unerlässlich für die

ischämische Präkonditionierung des Herzens ist (Cai et al. 2013). Des Weiteren

konnte gezeigt werden, dass die HIF-1 abhängige IL-10 Produktion in interstitiellen

Makrophagen der Lunge eine Überempfindlichkeitsreaktion in den Atemwegen

unterdrückt (Toussaint et al. 2013). Diese Ergebnisse verdeutlichen insgesamt die

HIF-1 Abhängigkeit der IL-10 Produktion.

Verschiedene Studien untersuchten außerdem den Effekt von HIF-1 in T-Zellen.

Ben-Shoshan et al. zeigten im Jahr 2008, dass hypoxisch stimulierte Jurkat T-Zellen,

humane mononukleäre Zellen sowie murine Milzzellen eine erhöhte Foxp3

Expression aufwiesen. Es konnte bewiesen werden, dass dieser Effekt direkt HIF-1α

abhängig war, da die Expression durch HIF-1α Gen-Silencing mittels siRNA

(engl. short interfering RNA) gehemmt werden konnte. Die hypoxisch stimulierten

Foxp3+ Zellen konnten zudem die Proliferation von T-Effektorzellen effektiver

unterdrücken als normoxische Tregs. Des Weiteren konnte auch in vivo durch eine

Überexpression von HIF-1α in murinen Milzzellen eine erhöhte Menge an Foxp3+

Tregs festgestellt werden (Ben-Shoshan et al. 2008). Higashiyama et al. konnten

zum einen nachweisen, dass infiltrierte T-Zellen in der Tunica mucosa von CED

Patienten eine deutliche HIF-1 Aktivierung aufwiesen (Higashiyama et al. 2012). Zum

anderen untersuchten sie den Knock-out von HIF-1α in T-Zellen im Rahmen einer

DSS Colitis. Hierbei konnten sie feststellen, dass die Knock-out Tiere eine im

Vergleich zu den Kontrolltieren schwerere Entzündung mit erhöhter Th1- und

Th17-Antwort entwickelten. Isolierte Milzzellen der Kontrolltiere zeigten zudem

in vitro eine deutliche Induktion der Foxp3 Expression durch hypoxische Stimulation.

In Knock-out Tieren blieb die Foxp3 Induktion aus, stattdessen konnte sowohl eine

erhöhte Menge an Th17-Zellen als auch eine gesteigerte IL-17 Expression

nachgewiesen werden (Higashiyama et al. 2012). Clambey et al. bestätigten diese

Befunde in eigenen Untersuchungen (Clambey et al. 2012). Sie konnten beweisen,

dass Foxp3 ein direktes HIF-1 Zielgen darstellt und HIF-1 die Quantität und Funktion

Diskussion

123

der Foxp3+ Tregs beeinflusst. Zudem konnten sie in einem T-Zell Transfer

Colitismodell zeigen, dass der Verlust von HIF-1α in Tregs zu einer Beeinträchtigung

der inhibitorischen Fähigkeiten der Tregs und zu einer schwereren Entzündung führt

(Clambey et al. 2012). Diese Studien beschreiben allesamt einen protektiven Effekt

von HIF-1α in T-Zellen im Rahmen einer Colitis. In der vorliegenden Arbeit wurde

nun zum ersten Mal der Einfluss von dendritischem HIF-1α auf eine Colitis

untersucht, wobei auch hier ein bedeutender Effekt dargestellt werden konnte. Die

insgesamt größte Auswirkung des Verlustes von HIF-1α in DCs bestand in der

eingeschränkten Fähigkeit, regulatorische T-Zellen zu induzieren, welche eine

Entzündung eindämmen können. Es konnte somit gezeigt werden, dass auch

dendritisches HIF-1α einen protektiven Einfluss auf eine experimentelle Colitis

ausübt.

4.5 Wechselwirkungen zwischen IECs und DCs

Mehrere Studien haben Interaktionen zwischen IECs und DCs nachgewiesen. Butler

et al. konnten zeigen, dass die Kokultur von DCs mit Caco-2 IECs zu einer

reduzierten Expression von MHC-II, CD80 und CD86 in DCs sowie zu einer

eingeschränkten T-Zellstimulation durch DCs führte (Butler et al. 2006). Des

Weiteren zeigten die kokultivierten DCs eine geringere Aktivierbarkeit durch TLRs

und eine erhöhte TGF-β Produktion. Insgesamt vermuteten die Autoren, dass die

Anwesenheit von IECs zur Ausbildung von tolerogenen DCs führte. Rimoldi et al.

zeigten, dass es die Produktion von TSLP durch IECs war, welche die Entwicklung

tolerogener DCs förderte (Rimoldi et al. 2005). Tolerogene DCs sind für die

intestinale Homöostase von großer Bedeutung. Sie unterdrücken unter anderem

proinflammatorische Th1-Antworten (Rimoldi et al. 2005). Es konnte zudem gezeigt

werden, dass die TSLP Produktion durch Hassall-Körperchen im Thymus DCs dazu

befähigt, CD4+CD25- Thymozyten in Foxp3+CD4+CD25+ Tregs zu differenzieren

(Watanabe et al. 2005). Es könnte daher möglich sein, dass intestinale DCs unter

anderem auch durch den Einfluss von TSLP die Fähigkeit erlangen, Foxp3+ Tregs zu

induzieren (Coombes & Powrie 2008). Studien von Zaph et al. zeigten, dass der

Knock-out von IKKβ in IECs zu einer eingeschränkten TSLP Produktion führte. Dies

Diskussion

124

resultierte in einer verminderten Expression des TSLP Rezeptors (TSLPR) auf DCs.

Diese DCs produzierten erhöhte Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12

und IL-23 und waren unfähig, eine Trichuris muris Infektion zu unterdrücken (Zaph et

al. 2007). Ein Zusammenhang zwischen TSLP und HIF konnte kürzlich von Jang et

al. nachgewiesen werden (Jang et al. 2013). Sie wiesen eine HIF-1α abhängige

TSLP Expression in Keratinozyten auf. In der vorliegenden Arbeit konnte im Colon

mittels ELISA kein Unterschied zwischen den beiden Mausgruppen in der TSLP

Produktion festgestellt werden, da die IECs der verwendeten Mausstämme

funktionell aktives HIF-1α aufwiesen. Allerdings konnte in isolierten, hypoxisch

kultivierten BmDCs von HIF-1α+f/+f Mäusen eine im Vergleich zu den Knock-out

Tieren signifikant höhere Induktion des TSLPR durch LPS Stimulation nachgewiesen

werden (s. Fig. 3.4 C). Auch in den DSS behandelten Kontrolltieren waren im Colon

höhere Expressionen des TSLPR als in den Knock-out Tieren zu finden

(s. Fig. 3.4 E). Es kann daher angenommen werden, dass der Knock-out von HIF-1α

in DCs die Fähigkeit der TSLPR Expression nachteilig beeinflusst und somit auch die

Ausprägung eines tolerogenen DC-Phänotyps.

Ein weiteres Zusammenspiel der IECs und DCs konnte in dieser Arbeit

nachgewiesen werden, da der Knock-out von dendritischem HIF-1α Auswirkungen

auf die Mucinproduktion des Epithels zeigte. In den CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren

führte die DSS Colitis zu einer signifikant erhöhten Expression von MUC1, MUC2

und MUC3 im Vergleich zu den Kontrolltieren. Becherzellen produzieren Mucine,

welche sich als schützende Schleimschicht über die Epithelzellen legen. MUC1 bis 4

sind dabei die wichtigsten Mucine im Colon (Corfield et al. 2000). MUC1, MUC3 und

MUC4 stellen membrangebundene Mucine dar, wohingegen MUC2 von den IECs in

das Darmlumen sezerniert wird (Shirazi et al. 2000). Die Mucinexpression während

einer gastrointestinalen Erkrankung wird sehr unterschiedlich beschrieben und ist

meist abhängig von der Schwere und dem Ausmaß der Entzündung. Hoebler et al.

untersuchten die Mucinproduktion von Balb/c Mäusen, in welchen durch die orale

Gabe von 1 % DSS für 5 Tage eine akute Colitis induziert wurde (Hoebler et al.

2006). Die Expression von MUC2 zeigte hierbei keinerlei Veränderungen,

wohingegen die MUC1 und MUC3 Expressionen im Caecum und Colon durch die

Diskussion

125

Colitis deutlich anstiegen. Im Gegensatz dazu, zeigten Dharmani et al. in einem DSS

Modell bei Ratten, dass die MUC2 und MUC3 mRNA Expressionen durch die Colitis

abnahmen. Die Behandlung mit einem anti-TNF-α-Antikörper führte dabei wiederum

zu einem Anstieg der Mucinproduktion (Dharmani et al. 2011). Verschiedene

Untersuchungen mit MUC2 Knock-out Mäusen verdeutlichen eine protektive

Funktion von MUC2. Die Infektion mit Citrobacter rodentium in MUC2 Knock-out

Mäusen führte zu einer hochgradigen Erkrankung mit einer Mortalität von bis zu

90 % (Bergstrom et al. 2010). Van der Sluis et al. zeigten zudem, dass der Verlust

von MUC2 zur Entwicklung einer spontanen Colitis im Alter von fünf Wochen führte

(Van der Sluis et al. 2006). Mit zunehmendem Alter verschlimmerte sich die

Entzündung, bis schließlich ab einem Alter von sechs Monaten Adenokarzinome im

Dünndarm und Rektum auftraten. Dadurch wurde vermutet, dass MUC2 auch eine

suppressive Rolle bei intestinalen Krebserkrankungen aufweist (Van der Sluis et al.

2006). Im DSS Colitismodell zeigten die homozygoten MUC2 Knock-out Tiere eine

deutlich höhere Krankheitsanfälligkeit als die heterozygoten Knock-out Tiere und die

Kontrolltiere, wodurch die protektive Wirkung von MUC2 dargelegt wurde (Van der

Sluis et al. 2006). Klinische Studien, welche die Mucinexpression in Patienten mit MC

und CU untersuchten, beschrieben sehr unterschiedliche Ergebnisse. Sowohl in MC

als auch in CU Patienten wurden gleichbleibende, gesteigerte oder auch reduzierte

Expressionen von MUC1 bis 3 nachgewiesen (Shirazi et al. 2000; Hoebler et al.

2006; Louis et al. 2006; Van der Sluis et al. 2006; Dorofeyev et al. 2013). Es besteht

zudem ein Zusammenhang zwischen einzelnen Mucinen und HIF. In renalen

Karzinomzellen konnte eine HIF-1 abhängige MUC1 Induktion nachgewiesen werden

(Aubert et al. 2009). Louis et al. beschrieben eine HIF-1 abhängige Induktion von

MUC3 in T84 Darmepithelzellen (Louis et al. 2006). In Bronchialepithelzellen konnte

zudem eine HIF-1 Abhängigkeit von MUC5AC festgestellt werden (Polosukhin et al.

2011; Zhou et al. 2012). Ein weiteres interessantes Zusammenspiel findet sich

zwischen Mucinen und dem proinflammatorischen Zytokin IL-6. Yokoigawa et al.

zeigten, dass Mucine von Colonkarzinomzellen der Linie LS180 die Produktion von

IL-6 in Monozyten induzierten, was eine mögliche Ursache für die erhöhten IL-6

Serumspiegel von Patienten mit Krebserkrankungen des Colons darstellen könnte

Diskussion

126

(Yokoigawa et al. 2005). Li et al. beschrieben hingegen, dass von Makrophagen

produziertes IL-6 die Produktion der Mucine beeinflusste (Li et al. 2009). In

Colonkarzinomzellen der Linie HAT-29 erhöhte sich durch Zugabe von IL-6 die

MUC1 Expression, wohingegen sich die MUC2 Expression reduzierte. Andere

Studien wiederum zeigten einen Anstieg von MUC2 und MUC3 durch IL-6 (Enss et

al. 2000; Shekels & Ho 2003). In den DSS behandelten HIF-1α Knock-out Tieren

dieser Arbeit konnte eine signifikant erhöhte Expression der Mucine 1 bis 3 entdeckt

werden (s. Fig. 3.7 A-D). Die IL-6 Expression in diesen Tieren zeigte ebenfalls eine

signifikante Erhöhung (s. Fig. 3.2 B). Ob nun die IL-6 Produktion die Mucinproduktion

beeinflusste oder umgekehrt, konnte nicht geklärt werden. Es wird jedoch vermutet,

dass alle Befunde in einem übergeordneten Zusammenhang stehen. Der Verlust von

dendritischen HIF-1α führte in den Knock-out Tieren zu einer schwereren

Entzündung im DSS Colitismodell als in den Kontrolltieren. Die Hauptursache hierfür

lag vermutlich in der eingeschränkten Fähigkeit der Knock-out DCs regulatorische

T-Zellen zu induzieren, welche die Colitis kontrollieren und einschränken könnten.

Dies resultierte in einer insgesamt gesteigerten proinflammatorischen

Zytokinproduktion. Es könnte möglich sein, dass die epitheliale Mucinproduktion in

den Knock-out Tieren als kompensatorischer Schutzmechanismus auf die verstärkte

Entzündung gesteigert wurde, da Mucine, wie oben erwähnt, eine protektive Funktion

aufweisen. Des Weiteren sind sie aber auch in Reparaturvorgänge involviert.

Wallace et al. zeigten, dass MUC2 defiziente Mäuse eine schwere Beeinträchtigung

in der Restitution der gastrischen Mukosa aufwiesen (Wallace et al. 2011).

Untersuchungen von Ho et al. bewiesen ebenfalls eine Beteiligung von intestinalem

MUC3 an der Wundheilung (Ho et al. 2006). Dies könnte eine weitere Erklärung für

die verstärkte Mucinexpression der Knock-out Tiere darstellen, indem diese

versuchten durch die erhöhte Mucinproduktion dem intestinalen Schaden entgegen

zu wirken.

Zwar entwickelten auch die Kontrolltiere durch die DSS Gabe eine Colitis, jedoch in

einer milderen Ausprägung. Sie zeigten einen signifikant niedrigeren

Gewichtsverlust, eine reduzierte proinflammatorische Immunantwort sowie eine

deutlich effektivere Induktion regulatorischer T-Zellen. Dies lässt darauf schließen,

Diskussion

127

dass HIF-1α in DCs einen positiven Effekt im Rahmen einer DSS induzierten Colitis

aufweist. Wenngleich die Therapiestrategien bei chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen überwiegend T-Zellen fokussieren, konnte durch diese Arbeit

gezeigt werden, dass auch der Phänotyp von dendritischen Zellen Auswirkungen auf

eine intestinale Entzündung zeigt. Dies könnte eine neue Therapiemöglichkeit für

chronisch entzündliche Darmerkrankungen darstellen.

Zusammenfassung

128

5 Zusammenfassung

Katharina Flück

Die Bedeutung des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 in dendritischen Zellen für

die Pathophysiologie einer Dextrannatriumsulfat induzierten Colitis

Dendritische Zellen (DCs) vermitteln zwischen angeborener und erworbener

Immunität und sind von entscheidender Bedeutung für die intestinale Homöostase.

Für die Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) spielen sie

eine große Rolle. In solch entzündeten Geweben sind DCs niedrigen

Sauerstoffpartialdrücken ausgesetzt. Der Transkriptionsfaktor Hypoxie induzierbarer

Faktor (HIF)-1 reguliert die zelluläre Adaptation an eine sauerstoffarme Umgebung.

Um den Einfluss der regulierenden Untereinheit HIF-1α in DCs auf die Ausprägung

einer experimentellen Colitis zu untersuchen, wurde in Kontroll- (HIF-1α+f/+f) und

Knock-out Mäusen, welche einen Verlust von HIF-1α in DCs aufwiesen

(CD11cCre/HIF-1α+f/+f), durch siebentägige Gabe von 3 % Dextrannatriumsulfat

(DSS, engl. dextran sodium sulfate) eine Colitis induziert. Die Knock-out Tiere

zeigten einen signifikant größeren Gewichtsverlust an Tag 6 und 7 des

Experimentes. Zudem war die mRNA Expression proinflammatorischer Zytokine, wie

Interleukin (IL)-6 und IL-23, in den Knock-out Tieren signifikant erhöht. Kontrolltiere

mit funktionellem dendritischen HIF-1α wiesen hingegen eine deutlich erhöhte

Interferon (IFN)-α Produktion sowie einen tolerogenen DC-Phänotyp (Expression von

TSLP Rezeptor) durch die DSS induzierte Colitis auf. Des Weiteren konnte eine

signifikant erhöhte Anzahl an Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) in den

erkrankten Kontrolltieren festgestellt werden. Tregs können von bestimmten

intestinalen DCs durch Produktion von IL-10, TGF-β (engl. transforming growth

factor-β) und Retinsäure induziert werden. Expressionen von IL-10 und TGF-β waren

in DSS behandelten HIF-1α+f/+f Tieren signifikant erhöht im Vergleich zu DSS

behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren. Retinsäure entsteht in DCs durch den

Abbau von Vitamin A, wozu unter anderem die Aldehyd Dehydrogenase Aldh1a2

Zusammenfassung

129

benötigt wird. Die Expression von Aldh1a2 in Kontrolltieren war im Vergleich zu den

Knock-out Tieren durch die Colitis signifikant erhöht. Zudem konnte in den

Kontrolltieren ein deutlicher Anstieg des Retinsäurerezeptors α (RARα) festgestellt

werden. Retinsäure beeinflusst die Expression der darmspezifischen

Adhäsionsmoleküle α4β7-Integrin und CCR9 (CC Chemokin Rezeptor 9). In den DSS

behandelten Kontrolltieren konnte ein signifikanter Anstieg für das β7-Integrin und

CCR9 nachgewiesen werden. In den Knock-out Tieren zeigte der Verlust von HIF-1α

in DCs Auswirkungen auf das Epithel. Durch die DSS induzierte Colitis konnte in

diesen Tieren eine deutlich gesteigerte Mucinproduktion festgestellt werden. Diese

lässt sich am wahrscheinlichsten als kompensatorischer Schutzversuch durch

geschädigte intestinale Epithelzellen interpretieren.

Insgesamt konnte durch diese Arbeit verdeutlicht werden, dass dendritisches HIF-1α

einen positiven Einfluss auf eine experimentelle Colitis hat, da die Aktivierung

regulatorischer T-Zellen und die Eindämmung der Colitis von funktionellem HIF-1α in

DCs abhängig war.

Zusammenfassung

130

Abb. 5.1: Regulation der Colitis durch Aktivierung von Tregs durch HIF-1α+f/+f DCs.

In HIF-1α+f/+f

Tieren wurde durch eine experimentelle Colitis die Expression des TSLP-Rezeptors

(TSLP-R) auf DCs gesteigert, so dass diese in einen tolerogenen Zustand versetzt wurden. Dies

führte zu einer erhöhten Produktion von IL-10 und TGF-β durch DCs. Durch die erhöhte Expression

von Aldh1a2 in HIF-1α+f/+f

DCs wurde vermehrt Retinsäure (RA) gebildet. Dies führte insgesamt zu

einer gesteigerten Aktivierung von Tregs, welche eine erhöhte Expression des Retinsäurerezeptors α

(RARα) und der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle CCR9 und β7-Integrin aufwiesen.

Proinflammatorische Th1- und Th17-Reaktionen wurden durch Tregs reguliert und eingedämmt. Die

gesteigerte IFN-α Produktion durch HIF-1α+f/+f

DCs hatte einen positiven Einfluss auf die Entzündung.

Zusammenfassung

131

Abb. 5.2: Verstärkte Entzündung in CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren.

DCs von CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tieren zeigten in einer experimentellen Colitis eine eingeschränkte

Fähigkeit Tregs zu aktivieren. Die Expression des TSLP-Rezeptors (TSLP-R) und Aldh1a2 war

vermindert. Die Produktion von IL-6 und IL-23 wurde gesteigert, was zu proinflammatorischen

Th1- und Th17-Antworten führte. Effektorlymphozyten wiesen im Vergleich zu HIF-1α+f/+f

Tieren eine

geringere Expression des Retinsäurerezeptors RARα und der darmspezifischen Adhäsionsmoleküle

CCR9 und β7-Integrin auf. Durch die hochgradige Entzündung produzierte das intestinale Epithel der


Tiere kompensatorisch verstärkt Mucine.

Summary

132

6 Summary

Katharina Flück

The role of hypoxia-inducible factor 1 in dendritic cells in dextran sodium

sulfate-induced colitis

Dendritic cells (DCs) play a crucial role in connecting innate and adaptive immunity

and in maintaining intestinal homeostasis. They are highly involved in the

pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). IBD is associated with hypoxic

inflammation where gene expression in DCs is regulated by the transcriptions factor

hypoxia inducible factor (HIF)-1. To investigate how dendritic HIF-1α in DCs

influences the development of an experimental colitis, control mice (HIF-1α+f/+f) and

knock-out mice, which had a deficiency of dendritic HIF-1α (CD11cCre/HIF-1α+f/+f),

were treated with 3 % dextran sodium sulfate (DSS) for 7 days to induce colitis.

Knock-out mice showed significantly higher weight loss at day 6 and 7 of the

experiment. mRNA expression of proinflammatory cytokines as interleukin (IL)-6 and

IL-23 was significantly increased in knock-out mice. Control mice with functional

dendritic HIF-1α showed significantly enhanced interferon (IFN)-α production and a

tolerogenic phenotype of DCs (expression of TSLP receptor) due to DSS-induced

colitis as well as increased amounts of Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). Tregs are

induced through production of IL-10, TGF-β (transforming growth factor) and retinoic

acid (RA) by DCs. Expressions of IL-10 and TGF-β were significantly enhanced in

DSS-treated HIF-1α+f/+f mice compared to DSS treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice.

RA is generated through degradation of vitamin A catalyzed by the aldehyde

dehydrogenase Aldh1a2. Expression of Aldh1a2 in control mice was significantly

increased through colitis compared to knock-out mice as well as expression of the

retinoic acid receptor α (RARα). RA also has influence on expression of the

gut-homing molecules α4β7-integrin and CCR9 (CC chemokine receptor 9).

DSS-treated control mice showed significantly increased levels of β7-integrin and

CCR9 compared to DSS-treated knock-out mice. In addition, the loss of dendritic

Summary

133

HIF-1α influenced intestinal epithelial cells (IECs). Mucin production by IECs was

significantly enhanced in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice which might

represent a compensatory effect mediated by extensively damaged intestinal

epithelial cells.

Collectively, these data demonstrated a positive effect of dendritic HIF-1α in an

experimental model of colitis since activation of regulatory T cells and control of

colitis were dependent on functional HIF-1α in DCs.

Fig. 6.1: Colitis regulation through activation of Tregs by HIF-1α+f/+f DCs.

HIF-1α+f/+f

DCs showed increased expression of TSLP-receptor (TSLP-R) in DSS-induced colitis. They

showed a tolerogenic phenotype with high production of IL-10 and TGF-β. Increased levels of Aldh1a2

led to great amount of retinoic acid (RA). Together this led to intense activation of Tregs which showed

high expression of the retinoic acid receptor α (RARα) and the gut-homing markers CCR9 and

β7-integrin. Proinflammatory Th1 and Th17 immune responses got inhibited through activated Tregs.

Enhanced production of IFN-α by HIF-1α+f/+f

DCs had protective effects on colitis.

Summary

134

Fig. 6.2: Augmented inflammation in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice.


DCs lost their ability to induce Tregs in DSS-induced colitis. Expression of the

TSLP-receptor (TSLP-R) and Aldh1a2 was diminished. Production of IL-6 and IL-23 was enhanced

which led to proinflammatory Th1 and Th17 immune responses. Effector lymphocytes showed less

expression of the retinoic acid receptor α (RARα) and the gut-homing markers CCR9 and β7-integrin.

Production of mucins by the intestinal epithelium was enhanced in CD11cCre/HIF-1α+f/+f

mice through

experimental colitis.

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Anhang

162

8 Anhang

8.1 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung

µ Mikro

A. dest. destilliertes Wasser (aqua destillata)

Abb. Abbildung

ADH Alkohol Dehydrogenase

ALDH Aldehyd Dehydrogenase

APC Antigen präsentierende Zelle (antigen presenting cell)

APP Akute-Phase-Protein

APS Ammoniumpersulfat

ARNT Arylhydrocarbon Rezeptor Nuklear Translokator

bHLH Basisches Helix-Loop-Helix

BmDC aus dem Knochenmark generierte Dendritische Zellen

(bone marrow-derived dendritic cells)

bp base pair

BSA bovines Serumalbumin

bzw. beziehungsweise

C Celsius

ca. circa

CAD C-terminale Transaktivierungsdomäne

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

CBP CREB-bindendes Protein

CCR CC Chemokin Rezeptor

CD Nomenklatur für Zelloberflächenmoleküle (cluster of differentiation)

cDC klassische dendritische Zellen

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CED Chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Anhang

163

ChIP Chromatin-Immunpräzipitation

CO2 Kohlendioxid

Ct cycle threshold

CTL zytotoxische T-Zelle (cytotoxic T-lymphocyte)

CU Colitis ulcerosa

C57BL/6 C57/Black 6

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

DC Dendritische Zelle (dendritic cell)

DEPC Diethylpyrocarbonat

DF doppelt gefloxt (double-floxed)

DMOG Dimethyloxallylglycin

DNA Desoxyribonucleinsäure

dsDNA doppelsträngige DNA

DSS Dextrannatriumsulfat (dextran sodium sulfate)

ECL Enhanced chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

engl. englisch

FCS Fötales Kälberserum

Fig. Figure

FIH-1 HIF-inhibierender Faktor-1 (factor inhibiting HIF 1)

Foxp3 Forkhead-Box-Protein P3

g Gramm

GALT Darmassoziierte lymphatische Gewebe (gut associated lymphoid tissue)

GM-CSF Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor

(granulocyte macrophage colony-stimulating factor)

GTC Guanidinthiocyanat

h Stunde(n)

H&E Hämatoxylin und Eosin

Anhang

164

HIF Hypoxie induzierbarer Faktor

HIF-1αf+/f+

homozygote Mäuse mit einem beidseitig von loxP-sites flankiertem

Exon 2 des HIF-1α Gens

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

HOX Hypoxie

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(high performance liquid chromatography)

HRE Hypoxie-responsives Element

IBD inflammatory bowel disease

IEC Intestinale Epithelzelle (intestinal epithelial cell)

i.p. intraperitoneal

IFN Interferon

IL Interleukin

KCL Kaliumchlorid

KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat

KO Knock-out

l Liter

LPS Lipopolysaccharid

LysM Lysozym M

M Molar

m milli

MAdCAM-1 mukosales gefäßspezifisches Adressin 1

(mucosal vascular addressin cell-adhesion molecule 1)

MAP Mycobacterium avium subspezies paratuberculosis

MC Morbus Crohn

MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)

min Minute(n)

mRNA messenger RNA

Anhang

165

MUC Mucin

n nano

n Anzahl

NaCL Natriumchlorid

NAD N-terminale Transaktivierungsdomäne

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

NaOAc Natriumacetat

NaOH Natriumhydroxid

NF-B nuclear factor ‚kappa-light-chain-enhancer‘ of activated B-cells

NGS normal goat serum

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

NOX Normoxie

NRS normal rabbit serum

NTP Nukleosidtriphosphat

O2 Sauerstoff

ODDD Sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (oxygen-dependent degradation

domain)

Oligo-dT Oligomer aus Desoxynukleosidtriphosphaten

PAMP Pathogen-assoziierte molekulare Muster

(pathogen-associated molecular patterns)

PAS Per-ARNT-Sim

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline)

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PFA Paraformaldehyd

pH -log [H+]

PHD Prolylhydroxylase

PRR Mustererkennungs-Rezeptor (pattern-recognition receptor)

pVHL von Hippel-Lindau Tumorsuppressorprotein

qPCR quantitative Echtzeit-PCR

Anhang

166

RA Retinsäure (retinoic acid)

RAG recombination activation gene

RARα Retinsäure Rezeptor α (retinoic acid receptor α)

rib.Protein ribosomales Protein

RNA Ribonukleinsäure

rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur

RT(-PCR) Reverse Transkriptase (-PCR)

s Sekunde(n)

s. siehe

S. Seite

SAA Serum Amyloid A

SCID severe combined immunodeficiency

SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)

SEM Standardfehler (standard error of mean)

SPF speziell pathogenfrei (special pathogen free)

TAD Transaktivierungsdomäne

TAE Tris-acetate-EDTA

TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung

TCR T-Zellrezeptor (T-cell receptor)

TFF Kleeblatt-Faktor (trefoil factor)

TGF Transformierender Wachstumsfaktor (transforming growth factor)

TLR Toll-like Rezeptor

TNBS trinitrobenzene sulfonic acid

TNF Tumornekrosefaktor

Treg Regulatorische T-Zelle

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

TSLP Thymisches stromales Lymphopoietin

Anhang

167

TSLPR TSLP-Rezeptor

TWEEN Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat

U Units

VE vollentsalzt

vHL von Hippel-Lindau Protein

Vol. Volumen

WT Wild-typ

z. B. zum Beispiel

Zyk. Zyklen

Anhang

168

8.2 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Aktivierung der adaptiven Immunantwort durch DCs. ............................... 11

Abb. 1.2: Zusammenspiel der Immunzellen.............................................................. 13

Abb. 1.3: Suppressionsmechanismen von Tregs. .................................................... 15

Abb. 1.4: Rolle der Retinsäure in der intestinalen Immunität. ................................... 16

Abb. 1.5: Auslösende Faktoren einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung..... 20

Abb. 1.6: Struktur des Hypoxie-induzierbaren Faktors HIF-1. .................................. 24

Abb. 1.7: Sauerstoffabhängige Regulation der HIF-α Aktivität. ................................ 26

Abb. 1.8: Sauerstoffunabhängige Regulation der HIF-1α Aktivität. .......................... 27

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des Cre/loxP-Knockout-Systems. ................... 43

Fig. 3.1: DSS colitis leads to profound extension of hypoxia. ................................... 84

Fig. 3.2: Dendritic cell specific knock-out of HIF-1α led to more severe inflammation

in DSS colitis. .................................................................................................... 86

Fig. 3.3: HIF-1α dependent induction of type I interferons in DSS colitis. ................. 87

Fig. 3.4: Inflammatory induction of IL-10 and TSLPR is HIF-1α dependent. ............. 88

Fig. 3.5: Activation and gut-homing of Tregs in DSS colitis require HIF-1α expression

in dendritic cells. ................................................................................................ 90

Fig. 3.6: Increases in numbers of T cells and Tregs in mesenteric lymph nodes

depend on dendritic HIF-1α expression in DSS colitis. ...................................... 92

Fig. 3.7: Dendritic cell–specific knock-out of HIF-1α stimulates mucosal epithelium to

increased production of mucins in DSS colitis. .................................................. 94

Fig. 3.8: Knock-out efficiency of CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice is approximately 90%. . 95

Fig. 3.9: Dendritic cell–specific knock-out leads to severer inflammation in DSS

colitis. ................................................................................................................ 96

Fig. 3.10: IL-10 ELISA of colon tissue shows no differences between groups.......... 97

Fig. 3.11: mRNA expression of α4 integrin increases in DSS colitis. ........................ 97

Fig. 3.12: mRNA expression of trefoil factor (TFF)3 increases in DSS-treated

CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice. ............................................................................... 98

Abb. 3.13: Anstieg des Disease Activity Index (DAI) durch DSS Colitis. ................ 102

Abb. 3.14: Verkürzung des Colons und Anstieg des Colongewichtes durch DSS

Colitis. .............................................................................................................. 103

Anhang

169

Abb. 3.15: Hochgradige Entzündung des Colons durch DSS Behandlung. ............ 105

Abb. 3.16: Anstieg des histologischen Scores durch DSS Behandlung. ................ 106

Abb. 3.17: Hochgradige Entzündung des Colons vor allem im distalen Bereich. ... 107

Abb. 3.18: Verstärkte Alcianblau Färbung in DSS behandelten CD11cCre/HIF-1α+f/+f

Tieren. ............................................................................................................. 109

Abb. 5.1: Regulation der Colitis durch Aktivierung von Tregs durch HIF-1α+f/+f DCs.

........................................................................................................................ 130

Abb. 5.2: Verstärkte Entzündung in CD11cCre/HIF-1α+f/+f Tieren. ......................... 131

Fig. 6.1: Colitis regulation through activation of Tregs by HIF-1α+f/+f DCs. ............. 133

Fig. 6.2: Augmented inflammation in DSS-treated CD11cCre/HIF-1α+f/+f mice. ...... 134

Anhang

170

8.3 Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Geräte ................................................................................................... 31

Tabelle 2.2: Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 32

Tabelle 2.3: Chemikalien .......................................................................................... 33

Tabelle 2.4: Antikörper für Western Blot ................................................................... 37

Tabelle 2.5: Antikörper für die Immunfluoreszenz .................................................... 38

Tabelle 2.6: Murine Primer ....................................................................................... 39

Tabelle 2.7: Murine Genotypisierungsprimer ............................................................ 41

Tabelle 2.8: Reagenzien für cDNA-Synthese, PCR, Real Time PCR, PCR Array und

Sequenzierung .................................................................................................. 41

Tabelle 2.9: Mastermix für die Genotypisierung ....................................................... 44

Tabelle 2.10: Exemplarisches PCR-Programm für die Genotypisierung .................. 44

Tabelle 2.11: Disease Activity Index ......................................................................... 46

Tabelle 2.12: Mastermix für die cDNA Synthese ...................................................... 50

Tabelle 2.13: Mastermix für PCR .............................................................................. 51

Tabelle 2.14: Exemplarisches PCR-Programm ........................................................ 51

Tabelle 2.15: Mastermix für Real Time PCR ............................................................ 52

Tabelle 2.16: Exemplarisches Real Time PCR-Programm ....................................... 52

Tabelle 2.17: Zusammenstellung der im Array untersuchten Gene .......................... 53

Tabelle 2.18: Reverse Transkriptase Mix für PCR Array .......................................... 57

Tabelle 2.19: Real Time PCR Programm für PCR Array .......................................... 57

Tabelle 2.20: Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgele ................................ 59

Tabelle 2.21: Histologischer Score ........................................................................... 62

Table 3.1: Primer sequences .................................................................................... 99

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