Die biologische Signifikanz des Tumorsuppressors p16INK4a ... · Die biologische Signifikanz des Tumorsuppressors p16INK4a und des proangiogenen Faktors Angiopoietin 2 im orthotopen

Die biologische Signifikanz des Tumorsuppressors p16INK4a

und des proangiogenen Faktors Angiopoietin 2 im

orthotopen humanen Pankreaskarzinommodell

vorgelegt von

Diplom Ingenieurin

Petra Schulz

von der Fakultät III Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

-Dr.rer.nat.-

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. U. Stahl

Berichter: Prof. Dr. R. Lauster

Berichter: Dr. med A. Scholz

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30.10.2007

Berlin 2007

D 83

Inhaltsverzeichnis i

Inhaltsverzeichnis Abkürzungen ......................................................................................................................................... 1 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis ................................................................................................. 3 Zusammenfassung................................................................................................................................. 5 Abstract .................................................................................................................................................. 6 1. Einleitung ...................................................................................................................................... 7

1.1. Allgemeines zur Tumorbiologie ................................................................................................ 7 1.2. Tumorbiologische Bedeutung der Angiogenese ........................................................................ 8 1.3. Tumorbiologische Bedeutung der Lymphangiogenese............................................................ 11 1.4. Das Pankreaskarzinom............................................................................................................. 12 1.5. Der Tumorsuppressor p16INK4a................................................................................................. 13 1.6. Das Angiopoietin Tie-2 System............................................................................................... 16

1.6.1. Der Einfluss von Ang-2 im Rahmen der tumorassoziierten Angiogenese ......................... 19 1.7. Zielsetzung............................................................................................................................... 20

2. Material und Methoden ............................................................................................................. 21

2.1. Material.................................................................................................................................... 21 2.1.1. Biologisches Material ......................................................................................................... 21

2.1.1.1. Eukaryotische Zellen................................................................................................... 21 2.1.1.2. Prokaryotische Zellen.................................................................................................. 21

2.1.2. Medien und Zusätze............................................................................................................ 21 2.1.2.1. Zellkulturmedien und deren Zusätze ........................................................................... 21 2.1.2.2. Nährmedium für Bakterien.......................................................................................... 21

2.1.3. Antibiotika .......................................................................................................................... 22 2.1.4. Enzyme und Enzympuffer .................................................................................................. 22 2.1.5. Antikörper........................................................................................................................... 22 2.1.6. Größenstandards ................................................................................................................. 23 2.1.7. Kits...................................................................................................................................... 23 2.1.8. Puffer und Lösungen........................................................................................................... 23 2.1.9. Software.............................................................................................................................. 24 2.1.10. Chemikalien/Reagenzien .................................................................................................. 24 2.1.11. Sonstige Materialien ......................................................................................................... 25 2.1.12. Geräte................................................................................................................................ 26

2.2. Methoden ................................................................................................................................. 27 2.2.1. Molekularbiologische Methoden ........................................................................................ 27

2.2.1.1. Agarosegelelektrophorese (Elektrophoretische Auftrennung von DNA).................... 27 2.2.1.2. Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA........................................................ 27 2.2.1.3. Klonierung................................................................................................................... 27 2.2.1.4. RNA Isolierung aus Zellen.......................................................................................... 29 2.2.1.5. RT-PCR....................................................................................................................... 29 2.2.1.6. PCR ............................................................................................................................. 30 2.2.1.7. cDNA – Array ............................................................................................................. 30

2.2.2. Proteinbiochemische Methoden.......................................................................................... 31 2.2.2.1. Herstellung von Proteinlysaten ................................................................................... 31 2.2.2.2. Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA Fällung) ................................................ 32 2.2.2.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...................................................................... 32 2.2.2.4. Western Blot................................................................................................................ 33 2.2.2.5. Strippen der Membran................................................................................................. 34 2.2.2.6. FACS Analyse............................................................................................................. 34 2.2.2.7. Koloniebildungsassay (HTCA) ................................................................................... 35

Inhaltsverzeichnis ii

2.2.2.8. ELISA.......................................................................................................................... 36 2.2.3. Zellbiologische Methoden .................................................................................................. 37

2.2.3.1. Allgemeine Methoden der Zellkultur .......................................................................... 37 2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter Klone – Transfektion mit Effectene.......................... 37 2.2.3.3. Transiente Transfektion – Calcium Phosphat Transfektion zur Bestimmung der Induktionsstärke ....................................................................................................................... 38 2.2.3.4. Dual-Luciferase Reporter Assay zur Überprüfung der Induzierbarkeit ...................... 38 2.2.3.5. Proliferationsassay mittels Alamar Blue ..................................................................... 39

2.2.4. Tierexperimentelle Methoden............................................................................................. 39 2.2.4.1. Versuchstiere und Haltung .......................................................................................... 39 2.2.4.2. Orthotope Implantation ............................................................................................... 40 2.2.4.3. Retrobulbäre Blutentnahme......................................................................................... 40

2.2.5. Immunhistochemische Methoden....................................................................................... 41 2.2.5.1. Herstellung von Gefrierschnitten ................................................................................ 41 2.2.5.2. HE-Färbung................................................................................................................. 41 2.2.5.3. Immunhistochemische Färbungen an Gefrierschnitten ............................................... 41

3. Ergebnisse.................................................................................................................................... 43

3.1. Generierung des TREx Systems zur induzierbaren Expression von p16 in MiaPaCa-2 Zellen ................................................................................................................. 43

3.2. Stabile Expression des Tet-Repressors in MiaPaCa-2 Zellen.................................................. 44 3.3. Stabile induzierbare Expression von p16 in MiaPaCa-2- TREx Zellen .................................. 46

3.3.1. Klonierung der p16 cDNA in den induzierbaren Vektor pcDNA4/TO.............................. 46 3.3.2. Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie.............................. 47

3.4. Funktionelle Analysen der induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie ...................... 48 3.4.1. Die Induktion von p16 in MiaPaCa-2 Zellen führt zu einer Abnahme von Rb .................. 48 3.4.2. Der Einfluss von p16 auf das Wachstum der MiaPaCa-2 Zellen ....................................... 49 3.4.3 Der Einfluss von p16 auf das verankerungsunabhängige Wachstum.................................. 50

3.5. Charakterisierung der in vivo Effekte von induzierter p16 Expression nach orthotoper Xenotransplantation ........................................................................................................... 50

3.5.1. Das orthotope Modell ......................................................................................................... 50 3.5.2. Orthotope Implantation der MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen ................................................ 51 3.5.4. Immunhistochemischer Nachweis der p16 Induktion ........................................................ 53 3.5.5. Der Einfluss von p16 auf das Tumorwachstum.................................................................. 56 3.5.6. Der Einfluss der p16-Überexpression auf die Tumorangiogenese ..................................... 57 3.5.7. Der Einfluss von p16 auf die Lymphangiogenese .............................................................. 59 3.5.8. Der Einfluss von p16 auf die Metastasierung..................................................................... 61 3.5.9. Der Einfluss von p16 auf die Expression proangiogener Faktoren im MiaPaCa-2 System 63

3.6. Untersuchungen zur Überexpression von Angiopoietin-2 im humanen Pankreaskarzinom.... 64 3.6.1. Das Tet-On System zur induzierbaren Expression von Ang-2 in MiaPaCa-2-Zellen ....... 64

3.7. Stabile Expression des reversen Transaktivators (rtTA) in MiaPaCa-2 Zellen ....................... 65 3.8. Stabil induzierbare Ang-2 Expression in MiaPaCa-2-Tet-On Zellen ...................................... 67

3.8.1. Klonierung der Ang-2 cDNA in den induzierbaren Vektor pTRE2hyg ............................. 67 3.8.2. Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zelllinie........................ 68

3.9. Tumorbiologische Charakterisierung der Effekte von induzierter Ang-2 Expression nach orthotoper Xenotransplantation............................................................................................. 69

3.9.1. Orthotope Implantation der MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zellen.......................................... 69 3.9.2. Induktion der Ang-2 Expression nach orthotoper Implantation mit Doxyzyklin ............... 69

3.10. Effekte der induzierten Ang-2 Expression auf die Serum-konzentration von humanem Ang-2 im orthotopen MiaPaCa-2 Modell ............................................................................. 70

3.11. Einfluss der induzierten Überexpression von Ang-2 auf das Tumorwachstum im orthotopen MiaPaCa-2 Modell.............................................................................................. 71

3.12. Ausbildung einer Pankreaskarzinom-typischen Komplikation während des Tumorwachstums .................................................................................................................. 73

3.13. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Tumor-assoziierte Angiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell.............................................................................................. 74

Inhaltsverzeichnis iii

3.14. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Lymphangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell................................................................................................................ 75

3.15. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2 Modell................................................................................................................ 76

3.16. Identifizierung direkter Tie-2 unabhängiger Ang-2 Effekte .................................................. 79 3.16.1. Auswahl von herunterregulierten Kandidatengenen......................................................... 82 3.16.2. Auswahl von hochregulierten Kandidatengenen .............................................................. 83

4. Diskussion.................................................................................................................................... 84

4.1. Beurteilung des orthotopen Modells........................................................................................ 84 4.2. Beurteilung der induzierbaren Systeme - Vergleich der Systeme TREx und Tet-On ............. 86 4.3. Die Kombination des Tetrazyklin-induzierbaren Systems mit dem orthotopen

Pankreasmodell ........................................................................................................................ 87 4.4. Biologische Effekte der induzierbaren Expression von p16................................................... 88

4.4.1. Die Restitution von p16 reduziert das Tumorwachstum im orthotopen MiaPaCa-2 Modell................................................................................................................................ 89 4.4.2. Die induzierte p16-Expression reduziert die Hämangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2

Modell................................................................................................................................ 89 4.4.3. Die induzierte p16 Expression vermindert die Lymphangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell............................................................................................................. 90 4.4.4. Die induzierte p16 Expression reduziert die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2

Modell................................................................................................................................ 91 4.5. Biologische Effekte der induzierbaren Expression von Ang-2................................................ 91

4.5.1. Effekt der induzierten Ang-2 Expression auf das Tumorwachstum, die Angiogenese und die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2 Modell ...................................................... 92

4.6. Identifizierung neuartiger Endothelzell-unabhängiger Ang-2 Effekte .................................... 93 5. Literatur ...................................................................................................................................... 98 6. Danksagung............................................................................................................................... 110 7. Anhang....................................................................................................................................... 111

Lebenslauf..................................................................................................................................... 111 Veröffentlichungen ....................................................................................................................... 112

Abkürzungen 1

Abkürzungen

Abb. Abbildung Akt Proteinkinase Ang Angiopoietin AP Alkalische Phosphatase Bp Basenpaar BrMS1 Breast metastasis suppressor 1 BSA Bovine serum albumin Cav Caveolin CDK Cyclin dependent kinase cDNA Komplementäre DNA CMV Cytomegalievirus Crk SH2/SH3-adaptor protein DANN Desoxribonukleinsäure DCC Deleted in colorectal cancer ddH2O Doppelt destilliertes Wasser DEPC Diethyl pyrocarbonate DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Desoxyribonukleotide DPC4 Deleted in pancreatic cancer, locus 4 DTT Dithiothreitol E.coli Escherichia coli E2F Transkriptionsfaktor ECL enhanced chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat EGF Epidermal growth factor FACS Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer FAK Focal adhesion kinase FBS Fötales bovines Serum Flt-1 Fms-like tyrosine kinase G-418 Geneticinsulfat-418 GAM-POD Goat-anti-mouse peroxidase-conjugated antibody Grb Growth factor receptor-bound protein H Stunde Hepes 4-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-1-Ethansulfonsäure HTCA Human tumor colony assay ICH Immunhistochemie Ig Immunglobulin Kb Kilo Basen kDa Kilo Dalton KDR Kinase insert domain receptor K-ras Kirsten-Ras (Rattensarkom) LB Luria Bertrani LVD Lymphatic vessel density MVD Microvessel density Nck Non catalytic region of tyrosine kinase NP-40 NonidetP-40, Nonylphenoxyployethoxyethanol Nu/nu Nacktmäuse homozygot P13K Phosphatidylinositol-3-phosphat Kinase PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphate buffered saline

Abkürzungen 2

PCR Polymerase-Kettenreaktion PDGF Plantelet derived growth factor PFA Paraformaldehyd PMSF Phenylmethylsulfonfluorid pRB Retinoblastomprotein PVDF Polyvenylidenifluorid RasGAP Ras GTPase aktivierendes Protein RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur RT Reverse Transkriptase SCID Severe combined immunodefiency SDS Sodium dodecyl sulfate SHp2 SH2-containing phosphatase 2 SSC Natriumchlorid-Natriumcitrat SSRT II Super Script Reverse Transkriptase II Tab. Tabelle TAE Tris Acetat EDTA TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Tris Trishydroxymethylaminomethan uPAR Urokinase Plasminogenaktivator Rezeptor UV Ultra Violett V Volt VEGF (R) Vascular Endothelial Growth Factor (Receptor) wt Wildtyp

Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 3

Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

Tab. 1: Pro- und Antiangiogene Faktoren ............................................................................................... 9 Tab. 2: Primäre Antikörper für Western Blot (WB) und Immunhistochemie (IHC) ............................ 22 Tab. 3: Primärantikörper und deren Einsetzungen ................................................................................ 42 Tab. 4: Abdominelle Sektion der Mäuse............................................................................................... 53 Tab. 5: Beurteilung der Lymphknotenmetastasierung. ......................................................................... 62 Tab. 6: Untersuchung der Primärtumore (PT) nach abdominaler Sektion der Mäuse. ......................... 72 Tab. 7: Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen. ..................................................................... 81 Abb. 1: Vaskulogenese und Angiogenese. .............................................................................................. 8 Abb. 2: Aufbau endothelialer Rezeptor-Tyrosin-Kinasen..................................................................... 10 Abb. 3: Tumor assoziierte Angiogenese. .............................................................................................. 11 Abb. 4: INK4a/ARF Locus. .................................................................................................................. 13 Abb. 5: Die Regulation der G1/S Progression durch den CDK4/6-Cyclin D/INK4/Rb Signalweg...... 14 Abb. 6: Schematischer Aufbau der Angiopoietine................................................................................ 17 Abb. 7: Tie-2 Signaltransduktion. ......................................................................................................... 18 Abb. 8: Fließschema der cDNA Array Methode (SuperArray)............................................................. 30 Abb. 9: Funktionsschema des induzierbaren TREx-Systems................................................................ 44 Abb. 10: Aufbau der Plasmide pcDNA6/TR und pcDNA4/TO-Luc. ................................................... 45 Abb. 11: Luciferase Assay zur Überprüfung der Induktion der TetR-Expression in

MiaPaCa-2-TREx Zellklonen.................................................................................................. 46 Abb. 12: Klonierung des induzierbaren pcDNA4/TO-p16 Konstrukts. ................................................ 47 Abb. 13: Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie.................................. 48 Abb. 14: Induzierte p16 Expression führt zum Verlust von pRb. ......................................................... 49 Abb. 15: Einfluss von p16 auf die Proliferation von MiaPaCa-2 Zellen. ............................................. 49 Abb. 16: Die induzierte p16 Expression reduziert die Koloniebildung von MiaPaCa-2 Zellen. .......... 50 Abb. 17: Orthotope Implantation der Zellen in die Nacktmaus. ........................................................... 51 Abb. 18: Reduktion des Tumorvolumens durch p16 Restitution. ......................................................... 52 Abb. 19: Immunhistochemische Analyse der p16-Expression an Primärtumorgewebe der nicht

induzierten Gruppe (-Dox).................................................................................................... 54 Abb. 20: Immunhistochemische Analyse der p16 Expression in Tumoren der induzierten Gruppe

(+Dox)................................................................................................................................... 55 Abb. 21: Die induzierte p16 Expression vermindert das Tumorwachstum........................................... 56 Abb. 22: Der Einfluss von p16 auf die Tumorangiogenese. ................................................................. 58 Abb. 23: Immunhistochemischer Nachweis der Lymphendothelien mittels Lyve-1 Färbung. ............. 60 Abb. 24: Panzytokeratinfärbung der Lymphknotenmetastase einer (-Dox) Maus. ............................... 61 Abb. 25: Metastasierung in Leberhilus-Lymphknoten.......................................................................... 62 Abb. 26: Induzierte p16 Expression hat keinen Einfluss auf die Expression von VEGF-C und –D..... 63 Abb. 27: Funktionsschema des Tet-On Systems. .................................................................................. 65 Abb. 28: Aufbau der Plasmide pTet-On und pTRE2hyg-Luc.............................................................. 66 Abb. 29: Expressionsstärke des MiaPaCa-2-Tet-On Klons. ................................................................. 66 Abb. 30: Klonierung des induzierbaren pTRE2hyg-Ang-2 Konstrukts. ............................................... 67 Abb. 31: Nachweis der Ang-2 Induktion in Überständen der MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zellen

nach Doxyzyklin-Zugabe. ..................................................................................................... 68 Abb. 32: Quantifizierung des Ang-2 Spiegels in Blutseren der Mäuse nach 4 und 8 Wochen............. 71 Abb. 33: Der Einfluss von Ang-2 auf das Tumorwachstum. ................................................................ 73 Abb. 34: Ikterus, eine typsiche Komplikation....................................................................................... 74 Abb. 35: Der Einfluss von Ang-2 auf die Tumorangiogenese. ............................................................. 75 Abb. 36: Der Einfluss von Ang-2 auf die Lymphangiogenese.............................................................. 76 Abb. 37: Untersuchung der Metastasierung am Beispiel einer (+Dox) Maus....................................... 77 Abb. 38: Hämatogene Metastasierung in der Leber. ............................................................................. 78 Abb. 39: Lymphogene Metastasierung.................................................................................................. 79 Abb. 40: Herunterregulierte Kandidatengene........................................................................................ 82

Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 4

Abb. 41: Hochregulierte Kandidatengene. ............................................................................................ 83 Abb. 42: Hypothese der direkten Ang-2 Wirkung in MiaPaCa-2 Zellen. ............................................. 97

Zusammenfassung 5

Zusammenfassung

Die Entwicklung von neuen innovativen Therapieansätzen zur Behandlung des humanen

Pankreaskarzinoms ist von essentieller Bedeutung. Dazu ist es notwendig anhand klinisch relevanter

Modelle die biologische Relevanz von typischen molekularen Alterationen des Pankreaskarzinoms für

das Tumorwachstum und -progression aufzuklären.

Eine der häufigsten genetischen Alterationen des humanen Pankreaskarzinoms stellt die funktionelle

Inaktivierung des Tumorsuppressors p16 dar. Obwohl die biologische Funktion von p16 auf zellulärer

Ebene gut charakterisiert ist, gibt es bisher wenige Informationen über die spezifischen Effekte auf das

Tumorwachstum bzw. Tumorformation sowie auf Angiogenese und Metastasierung. Daher haben wir

in Pankreaskarzinomzellen p16 in einem orthotopen Mausmodell induzierbar rekonstituiert und die

tumorbiologischen Effekte untersucht. Dazu wurde eine Tetrazyklin-induzierbare MiaPaCa-2-p16

Zelllinie etabliert, in der durch Zugabe von Doxyzyklin die p16 Expression angeschaltet wurde.

Dieses induzierbare System wurde erfolgreich mit dem orthotopen Mausmodell (Xenograft Modell)

kombiniert. Nach Anschalten der p16 Expression in vivo kam es zu einem reduzierten

Tumorwachstum und zu einer reduzierten Hämangiogenese. Erstmals konnte mit dieser Arbeit für p16

auch eine reduzierte Lymphangiogenese gezeigt werden.

Angiopoietin-2 (Ang-2) ist über den endothelial lokalisierten Rezeptor Tie-2 an der Regulation

Tumor-assoziierter Angiogenese beteiligt. Erst kürzlich wurde die Überexpression des proangiogenen

Faktors Ang-2 im humanen Pankreaskarzinom entdeckt. Zur Aufklärung der biologischen Rolle für

die Progression des Pankreaskarzinoms wurden ebenfalls das Tetrazylin-induzierbare System und das

orthotope Xenograft Mausmodell ausgenutzt und kombiniert. Nach erfolgreicher Implantation der

induzierbaren MiaPaCa-2-Ang-2 Zellen in das Pankreas von SCID-Mäusen wurde die Ang-2

Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten mittels Doxyzyklin an- und abgeschaltet. Die induzierte

Ang-2 Expression in vivo führte zu einem gesteigerten Tumorwachstum, die Häm- und

Lymphangiogenese war verstärkt und es konnten mehr Metastasen in Ang-2 exprimierenden Zellen

detektiert werden als in Tieren ohne Ang-2. Die gezeigten Wirkungen des Ang-2 waren vom

Zeitpunkt der Induktion unabhängig, was einen alleinigen proangiogenen Tie-2 vermittelten

Wirkmechanismus von Ang-2 unwahrscheinlich machte. Eventuelle Endothelzell- bzw. Tie-2

unabhängige Ang-2 Mediatoren bzw. downstream targets wurden mit Hilfe der Chip Technologie

identifiziert und diskutiert. Zu den herunterregulierten Genen gehörten das BrMS1, das Caveolin und

das DCC. Zu den hochregulierten Kandidatengenen zählte das Integrin b1, der uPAR und das

Vitronektin. Die vorliegende Arbeit konnte zwei wesentliche Beiträge zur Aufklärung der

biologischen Relevanz zweier typischer molekularer Alterationen leisten, die zu einem malignen

Phänotyp des Pankreaskarzinoms führen. Besonders die Durchführung des orthotopen Modells konnte

ein kliniknahes Bild abgeben. Somit konnte vor allem mit dem Ang-2/Tie-2 System ein viel

versprechendes therapeutisches Target für neue Therapieansätze identifiziert werden.

Abstract 6

Abstract

The development of new and innovative strategies for the therapy of human pancreatic carcinoma is of

essential importance. Based on clinically relevant models the biological molecular relevance of the

typical alterations of pancreatic carcinoma for tumor growth and –progression has to be cleared up

necessarily.

The functional inactivation of the tumor suppressor gene p16 represents one of the most frequent

genetic alterations in pancreatic carcinoma. Although the biological effects of p16 are well

characterized on cellular level, there is so far only little information about the specific effects on tumor

growth and formation, as well as on metastasis and angiogenesis. Therefore we established a

tetracycline inducible cell system to express p16 by adding doxycycline to the media of the cells. The

inducible system was successfully combined with the orthotopic mouse model (xenograft model). The

inducible p16 expression in nude mice led to a reduction of tumor growth and hemangiogenesis.

Moreover for the first time we could show a reducing effect on lymphangiogenesis for p16.

Angiopoietin-2 (Ang-2) is involved in the regulation of tumor angiogenesis by its receptor Tie-2

which is located on endothelial cells. Recently, an overexpression of the proangiogenic factor Ang-2

in human pancreatic carcinoma was discovered. To clarify the biological relevance of Ang-2 in the

progress of pancreatic carcinoma the inducible system and the orthotopic model have been used and

combined likewise. After successful implantation of the inducible MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 cells into

the pancreas of SCID mice the Ang-2 expression was switched on by doxycycline at different time

points. The induced Ang-2 expression in vivo caused an increased tumor growth. Furthermore the

hem- and lymphangiogenesis were strengthened and an increased number of metastases were found in

Ang-2 expressing animals. This pro-angiogenic effect of Ang-2 was independent from the time of

induction, which made an exclusive pro-angiogenic effect of Ang-2 improbable. Potential Ang-2

mediators and/or downstream targets were identified by means of the chip technology and discussed.

BrMS1, Caveolin and DCC belong to the group of down-regulated genes. Among the up-regulated

candidate genes Integrin ß1, uPAR and vitronectin were found.

This available work could make two substantial contributions for the clarification of the biological

relevance of two typical molecular alterations, which lead to malignant phenotype of pancreatic

cancer. Especially the orthotopic model depicted a clinically relevant situation and thus particularly by

means of this model we could identify the Tie-2/Tek system as a promising therapeutically target

system.

Einleitung 7

1. Einleitung

1.1. Allgemeines zur Tumorbiologie

Unter dem Begriff Tumor im engeren Sinn versteht man die Neubildung (Neoplasie) von

Körpergewebe, die gutartig (benigne) oder bösartig (maligne) sein kann. Der Begriff Krebs ist die

Bezeichnung für maligne Tumore (Pschyrembel, 1990) und ist nach den Herz-Kreislauf-

Erkrankungen, die zweithäufigste Todesursache in Deutschland (Statistisches Bundesamt, 2004). Die

Differenzierung des Tumors richtet sich nach dem ursprünglichen Zelltyp. Karzinome z.B. leiten sich

aus dem Epithel ab, wohingegen Sarkome sich vom Binde- und Stützgewebe ableiten.

Als wesentlicher Faktor in der Entstehung von malignen Tumoren aus nicht transformiertem

Ursprungsgewebe gilt die Akkumulation von genetischen Mutationen (Lengauer and Issa, 1998).

Dieser mehrschrittige Prozess konnte zum Beispiel für kolorektale Karzinome eindrucksvoll belegt

werden (Kinzler and Vogelstein, 1996). Es wird beschrieben, dass ein Tumor während seiner

Entwicklung verschiedene Stadien bis zur malignen Manifestation durchlebt. Die Zielgene solcher

transformierender Mutationen werden als Onkogene und Tumorsuppressorgene bezeichnet

(Weinberg, 1994). Onkogene sind zelluläre Gene, deren Genprodukte an der Regulation von

Zellwachstum und –teilung beteiligt sind. Diese Gene können durch funktionssteigernde Alterationen

(Punktmutation, Amplifikation, Translokation) konstitutiv aktiviert werden. Es kommt als Folge zu

unkontrolliertem Zellwachstum und Proliferation der Zellen. Die Tumorsuppressorgene dagegen sind

Gene, deren Inaktivierung aufgrund von Mutationen oder Deletionen die Tumorbildung fördert. Der

Funktionsverlust bei Tumorsuppressorgenen bedarf einer Inaktivierung beider Allele. Diese

Inaktivierung geschieht in der Regel durch eine Mutation in einem Allel, gefolgt von einem Verlust

des zweiten Allels durch eine Deletion. Im Pankreaskarzinom erfolgt die Inaktivierung des p16-Gens

z.B. in 43 % der Fälle über eine homozygote Deletion. In über 40 % der Fälle geschieht die

Inaktivierung durch Deletion in einem und Punktmutation im anderen Allel (Schutte et al., 1997). Ein

weiterer Mechanismus der Inaktivierung ist die Hypermethylierung der Promotorregion (Merlo et al.,

1995). Viele der bekannten Tumorsuppressoren zeigen eine negativ regulierende Wirkung auf

Prozesse, die entweder direkt mit der Regulation der Zellteilung in Zusammenhang stehen oder diese

auf indirektem Wege beeinflussen. Weitere Funktionen von Tumorsuppressorgenen liegen im Bereich

der DNA-Reperatur und der Zelladhäsion (Lewin, 1998).

Neben den Mechanismen, die primär zur malignen Transformation von Zellen führen, sind in den

letzten Jahren zunehmend Mechanismen ins Zentrum des Interesses gerückt, die Tumorwachstum und

Metastasierung regulieren. Dazu gehören u.a. die tumorassoziierte Angiogenese und

Lymphangiogenese, die im Folgenden näher beschrieben werden.

Einleitung 8

1.2. Tumorbiologische Bedeutung der Angiogenese

Die Blutgefäßbildung wird durch zwei Prozesse beschrieben: die Vaskulogenese und die Angiogenese

(Abb. 1). Die Vaskulogenese umfasst die Ausbildung eines primitiven Gefäßnetzwerkes in der

Embryonalentwicklung, wobei sich undifferenzierte Angioblasten aus dem Mesoderm zu einem

primären Gefäßnetz entwickeln (Risau and Flamme, 1995). Die noch unreifen Gefäße entwickeln sich

unter Einwirkung von endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF, Ang-1, EphrinB2) zu stabilen

Gefäßen. Unter Angiogenese dagegen versteht man die Gefäßneubildung aus bereits bestehenden

Gefäßen. Das kann durch Aussprossung bzw. Teilung der Gefäße und durch die Intussuszeption

erfolgen. Bei der Intussuszeption wachsen Pfeiler aus Endothelzellen in ein bestehendes Lumen ein

und bilden so genannte Kollateralen. Im Gegensatz zur Vaskulogenese findet die Angiogenese auch

im adulten Organismus statt, so bei der Wundheilung, der Folikelreifung und dem Tumorwachstum

(Yancopoulos et al., 2000).

Abb. 1: Vaskulogenese und Angiogenese. Die Gefäßbildung kann über verschiedene Wege erfolgen. In der Embryonalentwicklung erfolgt die Bildung der Gefäße durch die Vaskulogenese, bei der unreife Angioblasten zu Vorläuferendothelien reifen und ein Gefäßnetz bilden (A). Angiogenese bedeutet die Neubildung von Gefäßen aus bereits bestehenden (B). VEGF ist der bedeutendste Faktor in diesem System. Er führt zur Auslösung von Vaskulogenese (A). Außerdem induziert VEGF die Angiogenese sowie die Reifung von Gefäßen (B, F) im adulten Organismus. Ang-1 und EphrinB2 sind anschließend für Stabilisierung und Reifung der Gefäße zuständig (B, C). Zerstörung des Stabilisierungssignals führt entweder zur Rückbildung der Gefäße (E) oder in Anwesenheit von VEGF zu einem weiteren vaskulärem Remodeling (F) (Yancopoulos et al., 2000).

Einleitung 9

Die Regulation der Angiogenese ist abhängig von pro- und antiangiogenen Faktoren (Tab.1). Unter

physiologischen Bedingungen wird die Balance zwischen pro- und antiangiogenen Substanzen

aufrechterhalten („angiogene Balance“). Die Ausschüttung der genannten Faktoren erfolgt durch

endotheliale Zellen und Stromazellen, aber auch durch Tumorzellen oder tumorassoziierte

Makrophagen (Folkman, 1995). Die Überexpression von angiogenen Wachstumsfaktoren im Tumor

kann unterschiedliche Ursachen haben: metabolischer Stress (Hypoxie, geringer pH-Wert),

mechanischer Druck durch proliferierende Zellen, Immun-/Entzündungsreaktionen oder genetische

Alterationen (Bergers and Benjamin, 2003; Carmeliet and Jain, 2000).

Tab. 1: Pro- und Antiangiogene Faktoren Proangiogene Faktoren Anti-angiogene Faktoren,

VEGF-A

FGF (fibroblast growth factor)

Angiogenin

TGF-α (transforming growth factor α)

HGF (hepatocyte growth factor)

IGF-1 (insulin-like growth factor1)

TNF-α (tumor necrosis factor α)

MCP-1 (monocyte chemoattractant protein 1)

Angiopoietine

Angiostatin

Endostatin

Thrombospondin

Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor, auch als VEGF-A bezeichnet, repräsentiert den am

besten charakterisierten Vertreter der proangiogenen Wachstumsfaktoren. VEGF wird von

Endothelzellen wie auch von Tumorzellen exprimiert und bindet an die entsprechenden, physiologisch

nur endothelial lokalisierten, Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK). Die fünf bis heute bekannten

überwiegend endothelzellspezifischen Rezeptor-Tyrosin-Kinasen werden in zwei Familien unterteilt

(Witzenbichler et al., 1998) (Abb. 2). Die VEGFRs 1-3 weisen Homologiedomänen mit den

Rezeptoren von PDGF auf (Plate et al., 1994). Die zweite Familie der RTKs umfasst Tie-1 und Tie-2.

Beide besitzen Homologiedomänen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (Witzenbichler et al.,

1998). VEGF-A bindet und aktiviert die endothelialen Rezeptoren VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2

(KDR) (Griffioen and Molema, 2000) . Die Liganden VEGF-C und D binden an VEGFR-3, der

vorwiegend auf Lymphendothelien lokalisiert ist (Griffioen and Molema, 2000).

Einleitung 10

Abb. 2: Aufbau endothelialer Rezeptor-Tyrosin-Kinasen. Die dargestellten Rezeptoren können unterteilt werden in die VEGF-Rezeptoren und die Tie-Rezeptoren. Extrazellulär findet man die Ig-ähnlichen Domänen. Die Tie-Rezeptoren weisen zusätzlich EGF-ähnliche und Fibronektin-ähnliche Motive auf. Intrazellulär befindet sich die Tyrosinkinase. Die Aktivierung von Tie-1/-2 hat vor allem einen antiapoptotischen Einfluss. Zusätzlich werden Zellausbreitung sowie die Stabilisierung und Permeabilität der Gefäße beeinflusst. (Abbildung nach Jones et al., 2001)

Bindung der Liganden an den/die Rezeptoren kann Gefäßneubildung initiieren und induziert

Signaltransduktionswege, die mitogen, anti-apoptotisch und migrationsfördernd auf Endothelzellen

wirken (Yancopoulos et al., 2000). Die Aktivierung der Endothelzelle leitet die „angiogene Kaskade“

ein und bewirkt einen Abbau der extrazellulären Matrix sowie der vaskulären Basalmembran durch

Proteasen wie z.B. Metalloproteinasen. Ist die Basalmembran degradiert, wandern die Endothelzellen

aus ihrem Verbund in Richtung des angiogenen Stimulus (Egeblad and Werb, 2002; Kalluri, 2003).

Gleichzeitig proliferieren Endothelzellen und bilden gefäßähnliche Strukturen (Klagsbrun and Moses,

1999). Endothelzellen migrieren in die Peripherie und formen zunächst solide Stränge, die sich weiter

in die Peripherie bewegen und unter Einfluss angiogener Faktoren Lumina ausbilden (Conway et al.,

2001). Es entstehen Blutgefäße, die in den Tumor eindringen (Abb. 3). Das neu gebildete Gefäßsystem

sichert dem Tumor die nötige Blut- und Nährstoffversorgung, bietet Tumorzellen aber zusätzlich auch

die Möglichkeit über diese Gefäße mit dem Blutstrom andere Regionen zu erreichen und Metastasen

zu bilden.

Die Rolle der Tumorangiogenese ist für die unterschiedlichsten Neoplasien klar belegt worden. Es

besteht eine inverse Korrelation zwischen dem Grad der Vaskularisierung und der Prognose (Borre et

al., 1998; Pruneri et al., 2002). Dies ist auch für das humane Pankreaskarzinom gezeigt worden

Einleitung 11

(Niedergethmann et al., 2002). Entsprechend lassen sich durch antiangiogene Therapie in

Tiermodellen Metastasierung und Tumorwachstum inhibieren (Feldman and Libutti, 2000).

Neben den Blutgefäßen ist aber auch das Lymphsystem wesentlich an der Ausbreitung von

Metastasen beteiligt, was im folgenden Abschnitt näher beschrieben wird.

Abb. 3: Tumor assoziierte Angiogenese. Die meisten Tumore wachsen avaskulär (A) bis sie eine Größe erreichen, in der sie nicht mehr ausreichend mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden (B). Durch Expression von angiogenen Faktoren, wie dem Ang-2, dass sowohl von Endothelzellen als auch von Tumorzellen exprimiert wird, kommt es zur Destabilisierung und Regression von Blutgefäßen; die VEGF Konzentration steigt daraufhin an, wodurch die Gefäßsprossung initiiert wird (C). Durch andauernde Sprossung und Reifung der neu gebildeten Gefäße (D) kommt es zur Ausbildung eines dichten Gefäßnetzes innerhalb des Tumors (Bergers and Benjamin, 2003).

1.3. Tumorbiologische Bedeutung der Lymphangiogenese

Viele maligne Tumore streuen über das Lymphsystem in regionale Lymphknoten (Saharinen et al.,

2004). Im Gegensatz zur Hämangiogenese ist die funktionelle Bedeutung der Lymphangiogenese

bisher noch unzureichend geklärt. Durch die Entdeckung von LYVE-1, Prox und Podoplanin, wurde

kürzlich erstmals eine Möglichkeit eröffnet zwischen Lymph- und Blutendothelien zu unterscheiden

(Al Rawi et al., 2005). Lymphendothelzellen unterscheiden sich von Hämendothelien im

Expressionsmuster proangiogener Rezeptoren. So zeigt VEGFR-3 vorwiegend lymphendotheliale

Lokalisation und konnte eingesetzt werden, um Lymphendothelzellen zu isolieren. An den VEGFR-3

binden VEGF C+D, die interessanterweise in Tumoren mit ausgeprägter lymphogener Metastasierung

Einleitung 12

besonders stark überexprimiert werden (Stacker et al., 2002). Durch Tiermodelle konnte die

prolymphangiogene Wirkung von VEGF-C und VEGF-D sowie ihre Rolle in der Vermittlung von

lymphogener Metastasierung belegt werden (Mattila et al., 2002; Skobe et al., 2001; Stacker et al.,

2001). In dem Modell nach Stacker wurde ebenfalls durch VEGF-D/VEGF-C neutralisierende

Antikörper eine lymphogene Metastasierung unterdrückt. Für eine weitere Validierung

antilymphangiogener Therapien sprechen die klinischen Daten anderer Tumorentitäten. Die Daten

belegen deutlich, dass ein Lymphknotenbefall invers mit der Prognose der Tumorerkrankung

assoziiert ist (Cassella and Skobe, 2002).

1.4. Das Pankreaskarzinom

Das Pankreaskarzinom ist ein maligner Tumor epithelialen Ursprungs aus der Bauchspeicheldrüse und

ist in den USA bei Männern die viert- und bei Frauen die fünfhäufigste tumorbedingte Todesursache

(Jemal et al., 2005). Mit einer 5-Jahres Überlebensrate von ca. 2 % gehört das Pankreaskarzinom zu

den aggressivsten Tumorerkrankungen. Diese schlechte Prognose beruht unter anderem auf einem

lokal invasiven Wachstum in das peripankreatische Fettgewebe sowie einer früh einsetzenden

lymphogenen und hämatogenen Metastasierung (Rothenberg et al., 1996; Warshaw and

Fernandezdelcastillo, 1992). Die therapeutischen Möglichkeiten für die Behandlung des

Pankreaskarzinoms sind limitiert. Die chirurgische Tumorentfernung ist die einzige Möglichkeit zur

kurativen Behandlung. Trotz einer R0-Resektion (vollständige Tumorentfernung inklusive

tumorzellfreier Schnittränder) kommt es bei einem hohen Anteil von Patienten zum Wiederauftreten

der Tumorerkrankung. Diese kann sich entweder lokal oder in Form von Fernmetastasen manifestieren

(Bohmig and Rosewicz, 2004). Die weit überwiegende Mehrzahl der Patienten weist bereits bei

Diagnosestellung ein fortgeschrittenes, nicht-resektables Tumorstadium auf. In diesem Fall sinkt die

durchschnittliche Lebenserwartung auf 4-6 Monate (Rosewicz and Wiedenmann, 1997). Für diese

Patienten verbleibt in der Regel nur noch ein palliativer chemotherapeutischer Ansatz (Bohmig et al.,

1999).

Molekulargenetisch ist der Prozess der malignen Transformation des exokrinen Pankreas

vergleichsweise gut charakterisiert (Bardeesy et al., 2002b). Die häufigsten genetischen Defekte im

humanen Pankreaskarzinom umfassen die Aktivierung des Onkogen K-ras (90 % der Fälle)

(überwiegend durch Punktmutation im Codon 12) (Bos, 1989) ebenso wie die funktionelle

Inaktivierung der Tumorsuppressorgene p16 (90 % der Fälle) (Schutte et al., 1997), p53 (40-70 % der

Fälle) (Rozenblum et al., 1997) und DPC4 (50 % der Fälle) (Schutte, 1999). Über 75 % aller

Pankreaskarzinome weisen gleichzeitig drei oder vier dieser Gendefekte auf, die zu einer Störung der

Zellzyklusprogression und zu einem Verlust der Apoptosesensitivität führen (Bardeesy et al., 2002a;

Schneider et al., 2003). Nach erfolgter maligner Transformation und klonaler Expansion sind

Einleitung 13

zusätzliche Mechanismen erforderlich, um eine weitere Tumorprogression und -metastasierung zu

ermöglichen (Hanahan and Weinberg, 2000).

1.5. Der Tumorsuppressor p16INK4a

Eine der häufigsten genetischen Alterationen des humanen Pankreaskarzinoms stellt die funktionelle

Inaktivierung des Tumorsuppressorgens p16 dar. In mehr als 90 % aller humanen Pankreaskarzinome

und Tumorzelllinien ist p16 funktionell inaktiv (Serrano et al., 1997). Die genetischen Veränderungen

werden durch homozygote Deletion, Mutation und/oder durch Promotor-Hypermethylierung

verursacht (Caldas et al., 1994; Liggett and Sidransky, 1998; Yang et al., 1995).

Der Genlocus INK4a/ARF (alternative reading frame) befindet sich auf dem menschlichen

Chromosomabschnitt 9p21 und kodiert für zwei unterschiedliche Proteine (Abb.4): p14ARF und

p16INK4a, die von zwei alternativen Leserastern transkribiert werden (Rocco and Sidransky, 2001).

Das p14ARF ist auf die drei Exone 1ß-2-3 verteilt und stabilisiert den Tumorsuppressor p53, der

Zellzyklusarrest und Apoptose auslösen kann (Michael and Oren, 2002). P16 dagegen besteht aus den

drei Exonen 1α- 2-3 und kodiert für das Tumorsuppressorgen p16 (Serrano et al., 1993).

Abb. 4: INK4a/ARF Locus. Dargestellt sind die offenen Leserahmen der Gene p14ARF und p16INK4a. Beide Gene haben die Exone 2 und 3 gemeinsam. P16INK4a setzt sich aus den Exonen 1α, 2 und 3 zusammen. Das Gen für p14ARF ist aus den Exonen 1ß-2-3 zusammengesetzt. Durch zwei unterschiedliche Leseraster werden zwei unterschiedliche Gene transkribiert. Beide gehören zu den Tumorsuppressoren, wobei p14ARF Einfluss auf die Stabilität des p53 ausübt und p16INKa über eine Bindung an CDK4/6 inhibierend auf den Rb Signalweg wirkt (Sharpless, 2005).

P16 gehört zur Familie der INK4 Proteine (inhibitors of CDK4), die sich aus 4 Mitgliedern

zusammensetzt: p15 INK4b, p16 INK4a, p18INK4c und p19 INK4d (Serrano, 1997). Die INK4 Proteine

gehören mit der CIP/Kip-Familie (CDK inhibitory polypeptides / Kinase inhibitory proteins) zu den

CDK Inhibitoren. Cyclin abhängige Kinasen (CDK) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des

Zellzyklus. Diese Serin- bzw. Threoninkinasen werden zu bestimmten Zeitpunkten im Zellzyklus

aktiviert oder inhibiert. Die CIP/Kip Proteine (p21, p27, p57) sind universelle CDK Inhibitoren,

während die INK4 Proteine spezifisch CDK 4 und CDK6 inhibieren und die Progression aus der G1-

Phase in die S-Phase verhindern, indem sie die Phosphorylierung des Retinoblastomproteins (Rb)

verhindern (Abb. 5) (Ortega et al., 2002). Die Progression aus der G1 Phase in die

Einleitung 14

Replikationsphase S wird durch Cyclin D/CDK4/6 Komplexe initiiert, deren Assoziation durch

geringe p21 Mengen gefördert wird. Diese Komplexe phosphorylieren Rb und führen damit die

funktionelle Inaktivierung von pRb herbei, so dass die Passage durch den Rb abhängigen G1

Kontrollpunkt möglich wird. Die Bindung von p16 an den CDK4/6 Cyclin D Komplex inhibiert

dessen Aktivität. Dies verhindert somit die Phosphorylierung des Rb bzw. der Taschenproteine p107

und p130 und damit auch die Freisetzung der an sie gebundenen E2F-Transkriptionsfaktoren. Die

Freisetzung und damit Aktivierung des Transkriptionsfakors E2F ist für die Fortsetzung des

Zellzyklus erforderlich. Die Zellen verharren somit im G1 Arrest (Dyson, 1998; Sherr, 1996; Sherr

and Roberts, 1995).

Abb. 5: Die Regulation der G1/S Progression durch den CDK4/6-Cyclin D/INK4/Rb Signalweg. Die Progression durch die G1-Phase wird von den Rb-Proteinen pRb, p107, p130 reguliert. In der G0-Phase sind die Rb-Proteine unphosphoryliert. In diesem Stadium können die Proteine an den E2F-Transkriptionsfaktor binden und verhindern somit die E2F-abhängige Transkription. In der G1-Phase werden die CDK 4/6 durch die mitogenabhängigen Cycline D1, 2 und 3 aktiviert. Die entstehenden CDK4/6 Cyclin D Komplexe phosphorylieren und inaktivieren die Rb-Proteine, so dass die Zellzyklus relevanten Gene CDK2 und Cyclin E, mit Hilfe von E2F transkribiert werden können und somit für den Übergang in die S-Phase sorgen. Die Aktivität der CDK4/6 wird von den INK4 Proteine (p15 INK4b, p16 INK4a, p18 INK4c und p19 INK4d) negativ reguliert. Die CDK2-Aktivität wird durch die CIP/KIP Proteinen inhibiert. Für den Übergang von der G1 in die S-Phase ist die Hyperphosphorylierung der Rb-Proteine durch die CDK2-Cyclin E Komplexe notwendig (Ortega et al., 2002).

In diesem Zusammenhang wurde auch erstmals das Protein p16INK4a entdeckt (Serrano et al., 1993).

Das humane p16 Protein besteht aus 156 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 16 kDa

(Quelle et al., 1995; Serrano et al., 1993). P16 weist wie alle anderen INK4 Proteine mehrere

Ankyrinmotive auf, die in Protein-Protein Interaktionen involviert sind (Ruas and Peters, 1998).

Somit hat p16 neben den anderen Zellzyklusinhibitoren eine wichtige Kontrollfunktion vor dem

Eintritt in die DNA-Synthesephase, um seneszente Zellen aus dem Proliferationszyklus zu entfernen

(Sherr, 2001b). Ist p16 in den Zellen durch Mutationen oder Deletionen inaktiv, was in vielen

Tumorzellen der Fall ist, kann es zu einer Proliferation aberranter/veränderter Zellen kommen. 1994

Einleitung 15

wurde p16 durch Untersuchung von Chromosomen-Abberrationen erstmals als Tumorsuppressor in

Melanomen identifiziert (Kamb et al., 1994). Im weiteren wurde auch in diversen Tumoren und

Zelllinien eine Inaktivierung von p16 beschrieben (Hatta et al., 1995; Serrano, 1997). Eine hohe

Anzahl von homozygoten Deletionen und Mutationen wurde in Zelllinien der verschiedensten

Tumoren identifiziert (Gliome, Brust, Lunge, Blase und Melanom) (Devos et al., 1995; Nobori et al.,

1994).

„Knock-Out” Mäuse mit funktionsfähigem ARF und inaktivem p16 bestätigen diese Daten. P16 -/-

Mäuse entwickeln innerhalb eines Jahres spontan mehr B-Zelllymphome und Melanome als Tiere mit

intaktem p16. Behandlung der p16 negativen Mäuse mit Karzinogenen führte zu einem noch breiteren

Spektrum an Tumoren (Krimpenfort et al., 2001; Sharpless et al., 2001; Sherr, 2001a).

Mehrere Studien belegen, dass p16 neben der CDK-Inhibition weitere Interaktionspartner und

Funktionen zu haben scheint. P16 wird z.B. als Induktor der zellulären Seneszenz beschrieben. In

seneszenten Zellen wurde eine erhöhte Expression von p16 festgestellt (Bringold and Serrano, 2000;

Rocco and Sidransky, 2001). P16 scheint auch eine Rolle in der Angiogenese zu spielen. In humanen

Gliomen wurde z.B. nach Restitution von p16 die Expression des VEGF verringert und die

Angiogenese somit inhibiert (Harada et al., 1999). In „Knock-Out“ Mäusen, die weder intaktes

p14ARF noch p16INK4a exprimierten (INK4a/ARF -/-), konnte in einem Kolonkarzinommodell

neben einem erhöhtem Tumorwachstum auch eine erhöhte Vaskularisierung der Tumore festgestellt

werden (Gibson et al., 2003). P16 ist ebenfalls an der Zelladhäsion beteiligt. Auch eine Rolle in der

Zelladhäsion wurde für p16 beschrieben. In verschiedenen Zelllinien konnte das Zellspreiten auf

Vitronektin, vermittelt durch das Integrin αV ß1, durch eine Überexpression von p16 verhindert

werden (Adachi et al., 2001; Fahraeus and Lane, 1999).

Es konnte außerdem gezeigt werden, das eine p16 Restitution in humanen Karzinomzellen zu einer

Induktion von Anoikis über eine Regulation des α5 Integrins führte (Plath et al., 2000).

Weiterhin wurde eine direkte physikalische Interaktion mit NF-κB dokumentiert (Wolff and

Naumann, 1999). Eine funktionelle Bedeutung von p16 auf die Chemotherapieempfindlichkeit konnte

eindrucksvoll illustriert werden. Durch die Rekonstitution von p16 in humanen

Pankreaskarzinomzellen konnte eine Inhibition der pRB Expression erreicht werden, was zu einer

Induktion der chemotherapie-induzierten Apoptose führte (Plath et al., 2002). Hinsichtlich der

Bedeutung für Metastasierung und Angiogenese ist der Tumorsuppressor p16 bisher noch nicht

untersucht worden.

Einleitung 16

1.6. Das Angiopoietin Tie-2 System

Im Folgenden soll mit dem Angiopoietin System eine Ligand/Rezeptor Familie beschrieben werden,

die neben den schon erwähnten VEGF Proteinen an der Regulation der Angiogenese beteiligt ist.

1996 wurde mit der Klonierung von Angiopoietin 1 (Ang-1) der erste Ligand der endothelial

lokalisierten transmembranären Tyrosinkinase Tie-2 entdeckt (Davis et al., 1996). Ein Jahr später

wurde aufgrund von Homologiestudien das Angiopoietin 2 (Ang-2) identifiziert (Maisonpierre et al.,

1997). Der Genlocus von Ang-1 befindet sich auf Chromosom 8q22; Ang-2 ist auf Chromosom 8q23

lokalisiert. Darüber hinaus existieren noch weitere Mitglieder der Angiopoietine. Das Angiopoietin 4,

dessen Genort sich auf Chromosom 20p13 befindet und sein homologes murines Gegenstück, das

Ang-3, auf Chromosom 2 (Valenzuela et al., 1999).

Biochemisch handelt es sich bei den Angiopoietinen um sezernierte Glykoproteine mit einem

Molekulargewicht von ca. 75 kDa. Ang-1 hat eine Länge von 498 Aminosäuren, während Ang-2 eine

Länge von 496 Aminosäuren aufweist. Zwischen beiden besteht eine Sequenzhomologie von 60 %

(Davis et al., 1996; Maisonpierre et al., 1997). Angiopoietin 1 und 2 weisen einen charakteristischen

Molekülaufbau auf, den man in drei Domänen einteilen kann (Abb. 6): Der N-terminale Anteil des

Proteins, eine „coiled coil“ Domäne und eine carboxyterminale „Fibrinogen-like“ Domäne. Die

„coiled coil“ Domäne ist für eine Homodimerisierung und die Ausbildung höhergradiger Homomere

verantwortlich, wobei Ang-1 Homooligomere höherer Ordnung ausbildet als Ang-2. Die

Oligomerisierung ist Voraussetzung für die Aktivierung von Tie-2, nicht jedoch für die

Rezeptorbindung der Angiopoietine, die über die „Fibrinogen-like“ Domäne vermittelt wird (Davis et

al., 1996; Procopio et al., 1999). Die Tie-Rezeptor Familie besteht aus zwei Mitgliedern, Tie-1 und

Tie-2 (auch TEK genannt), wobei die Funktion und der Ligand des Tie-1 noch nicht bekannt sind. Die

extrazelluläre Domäne der Tie-Rezeptoren besteht aus zwei Immunglobulin (Ig)-ähnlichen Bereichen,

die durch die EGF (epidermal growth factor) ähnlichen Domänen voneinander getrennt sind, gefolgt

von drei Fibronektin III ähnlichen Domänen. Die intrazelluläre Region enthält

Tyrosinkinase-Domänen, die mehrere Phosphorylierungs- und Protein-Protein-Interaktionsstellen

enthalten (Abb.2) (Dumont et al., 1993; Sato et al., 1993).

Einleitung 17

Abb. 6: Schematischer Aufbau der Angiopoietine. Alle vier Angiopoietine sind sehr ähnlich aufgebaut. Sie bestehen alle aus einer N-terminalen „coiled-coil“ Domäne und einer C-terminalen fibrinogenähnlichen Domäne (Koh et al., 2002).

Ang-1 und Ang-2 können beide an den Tie-2 Rezeptor binden, aber nur durch die Bindung von Ang-1

kommt es zu einer Autophosphorylierung und somit zur Aktivierung des Rezeptors (Davis et al.,

1996). Ang-2 führt nach Rezeptorbindung zu keiner Autophosphorylierung und wirkt daher als

Antagonist (Maisonpierre et al., 1997). Jedoch wurde in einigen Experimenten gezeigt, dass Ang-2

abhängig von Dosis und Einwirkzeit ebenfalls als Agonist wirken kann (Kim et al., 2000b). Durch die

Interaktion mit Tie-2 binden verschiedene Adaptoren an den Rezeptor und aktivieren andere

Signalwege (Abb. 7).

Die Aktivierung des Tie-2-Rezeptors führt durch Phosphorylierung der p85 Untereinheit zu einer

Stimulation der Phosphatidylinositol-3-OH Kinase (PI(3)K). Die resultierende Aktivierung des

Downstream-Effektors Akt hemmt proapoptotische Effektorproteine (Dumont et al., 1993; Jones et al.,

2001; Kim et al., 2000a). Zudem konnte gezeigt werden, dass durch die antiapoptotische Wirkung

von Ang-1 eine Inaktivierung des Akt Signalwegs aufgehoben wird (Papapetropoulos et al., 2000).

Über diese Ang-1 vermittelte Akt-Aktivierung wird der Apoptose Inhibitor „Survivin“ hochreguliert.

Die Tie-2 Aktivierung löst außerdem eine Aktivierung von DokR (docking protein) aus.

Phosphoryliertes DokR interagiert mit rasGAP, Nck und Crk. Diese Signaltransduktionsmoleküle

spielen eine Rolle in der Zellmigration und Proliferation, der Reorganisation des Zytoskeletts und der

Regulierung des Ras Signalwegs (Jones and Dumont, 1998).

Moleküle, die mit Tie-2 über die SH2 Domäne interagieren sind Adapter Proteine wie das Grb2, Grb7,

Grb14, die Protein Tyrosinkinase SHP2 und die schon erwähnte p85 Untereinheit. Einige dieser

Moleküle scheinen für Zellmigration und Proliferation, Differenzierungs- und Apoptosevorgänge

wichtig zu sein (Huang et al., 1995; Kontos et al., 1998).

Einleitung 18

bb. 7: Tie-2 Signaltransduktion. n erwiesenen Signalwege, während die gestrichelten potentielle Signalwege

Übereinstimmung mit in vitro Daten, die Ang-1 als Agonisten und Ang-2 als Antagonisten

en Situationen, in denen es zur

ADurchgehende Pfeile zeigen die schodarstellen. Die regulatorische p85 Untereinheit der PI(3)-Kinase interagiert mit dem phosphorylierten Tie-2 Rezeptor. Daraus resultiert eine Aktivierung der Serin/Threonin Kinase Akt, welche sich verstärkend auf das Überleben der Zellen, also antiapoptotisch, auswirkt. Neben der Hochregulation des Proteins „Survivin“ sind noch keine weiteren Mechanismen beschrieben. Alternativ, fällt die Stimulation der PI(3)-Kinase mit einer Aktivierung der FAK (focal adhesion kinase) zusammen, was die Zellmigration verstärkt. Grb7 und Shp2 scheinen den gleichen Weg zu gehen. Durch Tie-2 aktiviertes bzw. phosphoryliertes DokR (Docking protein) interagiert mit rasGAP, Nck und Crk und wirkt somit auf die Zellproliferation sowie eventuell auf die Zellmigration (Jones et al., 2001).

In

beschreiben, stehen die in vivo Daten über die biologische Bedeutung des Angiopoietin/Tie-2 Systems

in der Embryonalentwicklung. Tie-2 knock-out Mäuse, Tie-2 (-/-), sterben in der

Embryonalentwicklung zwischen Tag 9,5 und 12,5 (E 9,5 und E 12,5) als Folge einer unzureichenden

Erweiterung und Erhaltung des primären kapillaren Plexus. Zusätzlich treten Störungen im vaskulären

„Remodeling“ auf, sowie Defekte während des angiogenen Umstrukturierens in verschiedenen

Geweben (Dumont et al., 1995; Sato et al., 1995). In Ang-1 knock-out Mäusen (Ang-1 -/-) dagegen

traten weniger gravierende aber trotzdem letale Störungen der Gefäßstruktur auf (E12,5) (Suri et al.,

1996). Weiterhin wurde durch die Überexpression von Ang-2 in Endothelzellen transgener Mäuse die

embryonale Gefäßentwicklung inhibiert (Maisonpierre et al., 1997). Diese Untersuchungen bestätigen

das Konzept der proangiogenen und gefäßstabilisierenden Wirkung von Ang-1, vermittelt durch die

Aktivierung von Tie-2 und einer antiangiogenen Wirkung von Ang-2.

Im Gegensatz zur Embryonalentwicklung, scheint Ang-2 in bestimmt

Gefäßneubildung (Wundheilung, weiblicher Reproduktionzyklus, Tumorangiogenese) im adulten

Organismus kommt, eher proangiogen und Ang-1 eher antiangiogen zu wirken.

Einleitung 19

1.6.1. Der Einfluss von Ang-2 im Rahmen der tumorassoziierten Angiogenese

Unter physiologischen Bedingungen wird Ang-2 nur von endothelialen Zellen exprimiert. Das

Expressionsniveau ist dabei sehr niedrig. Kommt es z.B. durch Verletzungen oder Tumorwachstum zu

einem vaskulären Remodeling, steigt die Ang-2 Expression deutlich an und neue Gefäße werden

gebildet (Vajkoczy et al., 2002). Im Glioblastom konnte unter anderem eine erhöhte Ang-2 Expression

im Tumorendothelium nachgewiesen werden (Stratmann et al., 1998). Mittlerweile gibt es eine

Vielzahl an Arbeiten, die eine Überexpression von Ang-2 in den verschiedensten Tumorenentitäten

zeigen. Dazu gehören das hepatozelluläre Karzinom (Tanaka et al., 1998), das Magenkarzinom (Etoh

et al., 2001), das Kolonkarzinom (Ahmad et al., 2001), das Blasenkarzinom (Oka et al., 2005) sowie

die NSCLC (non small cell lung cancer) (Takanami, 2004).

Obwohl die Rolle von Ang-1 im Fall der tumorassoziierten Angiogenese immer noch umstritten ist,

zeigen die meisten Studien, dass eine Überexpression von Ang-1 keinen oder sogar einen

reduzierenden Einfluss auf das Tumorwachstum und die Angiogenese ausübt. Im Kolonkarzinom

wurden nur geringe Mengen an Ang-1 im Tumorendothelium detektiert (Ahmad et al., 2001). Auch im

hepatozellulären Karzinom (Tanaka et al., 1998) und im Mammakarzinom (Hayes et al., 2000) konnte

keine Überexpression von Ang-1 im Tumorgewebe gefunden werden.

Der Widerspruch zwischen proangiogener Wirkung von Ang-2 im Rahmen der malignen

Transformation und der antiangiogenen Wirkung von Ang-2 in der Embryonalsituation ist

wahrscheinlich durch eine funktionelle Kooperation von Ang-2 mit dem VEGF System zu erklären.

Schon 1997 beschrieb Maissonpierre, dass Ang-2 nur dann im adulten Organismus exprimiert wird,

wenn VEGF zugegen war (Maisonpierre et al., 1997). Als Modell zusammengefasst postulierte Holash

folgendes: In der Embryonalentwicklung fördert VEGF die Endothelzelldifferenzierung und

Proliferation und unterstützt somit die Gefäßausbildung. Die anschließende Ang-1 Expression führt

zur Stabilisierung der noch unreifen Gefäße durch die Interaktion mit umliegender periendothelialer

Matrix. Im adulten Organismus ist die Ang-2 Expression an vaskularisierenden Orten (Ovarien,

Tumor) verstärkt. Es kommt zur Störung der Assoziation von Endothelzellen und periendothelialer

Matrix durch Ang-2 und führt zu einer Loslösung von Endothelzellen aus dem Endothelverband. In

dieser Situation sind die „gelockerten“ Endothelzellen verstärkt sensibel für mitogene Stimuli wie

erhöhte VEGF Konzentrationen. Durch die Endothelzellproliferation werden Gefäßsprossung oder

Gefäßverzweigung eingeleitet und führt damit zu Tumor-assoziierter Angiogenese. Falls wenig oder

kein VEGF vorhanden ist (Embryonalsituation), geht die Endothelzelle bei fehlenden mitogenen and

antiapoptotischen Signalen in die Apoptose über und das Gefäß wird zurückgebildet (Holash et al.,

1999).

Einleitung 20

1.7. Zielsetzung

Angesichts der hohen medizinischen Bedeutung des Pankreaskarzinoms sowie der nahezu unverändert

infausten Prognose sind umfassende Untersuchungen insbesondere zu den Mechanismen von

Tumorwachstum und Metastasierung notwendig, um so die Grundlage neuer und innovativer

Therapiestrategien zu legen. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit 2 potentiellen Targetmolekülen

des Pankreaskazinoms. Im Verlauf der letzten 30 Jahre haben Therapieansätze mit systemischer

Chemotherapie bei der fortgeschrittenen Tumorerkrankung keine klinisch relevante Verlängerung der

Überlebenszeit erbringen können. Vor diesem Hintergrund wird deutlich, dass die Entwicklung

innovativer experimenteller Therapiestrategien für die Behandlung des humanen Pankreaskarzinoms

von essentieller Bedeutung ist. Neue Therapien sind aber nur dann möglich, wenn Wachstums- und

Überlebensstrategien des Tumors aufgeklärt werden. Anhand eines klinisch relevanten Modells sollte diese Arbeit in zwei zentralen Bereichen Beiträge zu

einem verbesserten Verständnis liefern:

1.) Funktion des Tumorsuppressors p16INK4a auf Tumorwachstum, Metastasierung und

Angiogenese

2.) Funktion des angiogenen Faktors Angiopoietin-2 auf Tumorwachstum, Metastasierung und

Angiogenese

Die biologische Bedeutung des Tumorsuppressors p16 ist auf zellulärer und molekularer Ebene gut

charakterisiert, aber es gibt bisher noch wenige Informationen über die spezifischen Effekte auf das

Tumorwachstum bzw. Tumorformation sowie auf die Angiogenese und Metastasierung. Zur

Aufklärung dieser Fragestellung sollte mit dieser Arbeit die Restitution des Tumorsuppressors p16 in

vivo untersucht werden. Dazu sollte eine Tetrazyklin-induzierbare p16 Zelllinie etabliert werden, in

der durch Zugabe von Doxyzyklin, die p16 Expression zu definierten Zeitpunkten angeschaltet werden

kann. Dieses induzierbare Zellsystem sollte zusätzlich mit einem orthotopen Mausmodell (Xenograft

Modell) kombiniert werden. Nach Anschalten der p16 Expression in vivo sollte folgend die

Tumoretablierung, das Tumorwachstum und die Angiogenese sowie die Metastasierung unter p16

Einfluss analysiert werden.

Angesichts der Bedeutung von hämatogener Angiogenese, Lymphangiogenese und Metastasierung im

humanen Pankreaskarzinom und der erst kürzlich entdeckten Überexpression des proangiogenen

Faktors Angiopoietin-2 im Pankreaskarzinom sollte in der vorliegenden Arbeit zusätzlich das

Angiopoietin-2 und dessen biologische Rolle für die Progression des Pankreaskarzinoms untersucht

werden. Dazu wurden ebenfalls das Tetrazyklin-induzierbare System und das orthotope Mausmodell

genutzt und miteinander kombiniert. Effekte auf Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung

nach Ang-2 Überexpression sollten an Hand dieses Modells evaluiert werden.

Material und Methoden 21

2. Material und Methoden

2.1. Material

2.1.1. Biologisches Material

2.1.1.1. Eukaryotische Zellen

MiaPaCa-2 Zellen wurden für beide Teile der Arbeit verwendet. MiaPaCa-2 ist eine humane adhärent

wachsende Pankreaskarzinomzelllinie, die aus dem Pankreas von einem 65 Jahre alten Kaukasier

stammt. Sie zeigt epitheliale Morphologie und wirkt tumorigen im Tiermodell.

2.1.1.2. Prokaryotische Zellen

Für die Klonierungen wurden chemisch kompetente E.coli TOP10 One Shot Zellen von Invitrogen

verwendet. Genotyp: Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZ M15

lacX74 recA1 ara 139 (ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

2.1.2. Medien und Zusätze

2.1.2.1. Zellkulturmedien und deren Zusätze

DMEM (Dulbeccco/Vogt modiefied Eagle`s Medium) von Gibco: Zellkulturmedium für

MiaPaCa-2 Zellen. Bei Vollmedium Hinzugabe von 10 % FBS (Biochrom), 2 mM

Glutamine (Gibco/Invitrogen) und 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (Biochrom)

PBS ohne Ca2+, Mg2+ 1x (Gibco BRL, PAA Laboratories)

Trypsin/EDTA in PBS ohne Ca2+, Mg2+ 0,05 % / 0,02 % w/v (Biochrom KG)

FBS (Biochrom KG)

L-Glutamin 200 mM (Gibco/Invitrogen)

Penicillin/Streptomycin 10000U bzw. 10 mg/ml (Biochrom KG)

2.1.2.2. Nährmedium für Bakterien

LB-Medium SOC- Medium

Bacto-Trypton 1 % Bacto-Trypton 2 % Hefeextrakt 0,5 % Hefeextrakt 0,5 % NaCl 0,5 % Na Cl 10 mM KCl 2,5 mM MgCl2 10 mM Für Agarplatten Zugabe von 1,5 % Agar Glucose 20 mM


2.1.3. Antibiotika

Ampicillin zur Selektion der Bakterien (100 µg/ml) Sigma

Geneticin G-418-Sulfat zur Selektion der Zellen (2 mg/ml) GibcoBRL

Hygromycin B zur Selektion der Zellen (0,4 mg/ml) Invitrogen

Blasticidin zur Selektion der Zellen (5 µg/ml) Invitrogen

Zeozin zur Selektion der Zellen (0,5 mg/ml) Invitrogen

Doxyzyklin (1 mg/ml) Sigma

2.1.4. Enzyme und Enzympuffer

Restriktionsenzyme: BamHI, Sal I, Hind III, Kpn I Invitrogen

React 2, 4, 3, Puffer (10x) Invitrogen

T4 DNA Ligase (1U/µl) GibcoBRL

T4 DNA-Ligase Puffer (10x) GibcoBRL

SuperScript II RNase H-Reverse Transkriptase (200 U/µl) Invitrogen

RNase H (2 U/µl) Invitrogen

RNase Inhibitor (40 U/µl) Roche

RNase Out (40 U/µl) Invitrogen

CIP alkaline Phosphatase shrimp (1U/µl) Roche

2.1.5. Antikörper

Alle Antikörper wurden entsprechend den Angaben des Herstellers aufbewahrt.

Primäre Antikörper: Tab. 2: Primäre Antikörper für Western Blot (WB) und Immunhistochemie (IHC) Antikörper Spezies Firma WB IHC

P16INK4a (554070) Maus monoklonal BD Pharmingen 1 mg/ml -

P16INK4a (RB-025-P1) Kaninchen polyklonal NeoMarkers - 1µg/ml

Rb G3-245 Maus monoklonal BD Pharmingen 500 µg/ml -

Ang-2 SC-7015 Ziege polyklonal Santa Cruz 1:200 -

Pan-Zytokeratin 8018 Maus monoklonal Santa Cruz - 1:50

CD31 (550274) Ratte monoklonal BD Pharmingen - 1:50

Lyve-1 (0406R06) Kaninchen polyklonal Relia Tech - 1:200

VEGF-C 18-2255 Kaninchen polyklonal Zytomed 2 µg/ml -

VEGF-D Maus monoklonal (Stacker et al.,

2002)

2 mg/ml -


Sekundäre Antikörper:

GAM-POD: Ziege Anti-Maus IgG, Peroxidase-konjugiert (800 µg/ml) Dianova

GAR-POD: Ziege Anti-Kaninchen IgG, Peroxidase-konjugiert (800 µg/ml) Dianova

RAG-POD: Kaninchen-anti-Ziege IgG, Peroxidase-konjugiert (800 µg/ml) Dianova

SAR: Polyklonaler Schwein Anti-Rabbit igG, biotinilyiert (1,5 µg/ml) Dako Cytomation

RAS: Kaninchen Anti-Schwein, biotinilyiert (1: 200) Dako Cytomation

RAR: Ratte anti-Kaninchen, biotinilyiert (1: 200) Dako Cytomation

2.1.6. Größenstandards

DNA-Marker

Ready-Load 1 Kb DNA Ladder (0,1 µg/µl) Invitrogen

Ready-Load 100 bp DNA Ladder (0,1 µg/µl) Invitrogen

Protein-Marker

See Blue Plus2 Pre-Stained Invitrogen

Molekulargewichtsgrößen in kDa: 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16

2.1.7. Kits

ABC-Kit Vectastin PR-6100 Vector Laboratories BEArray Q series HumanTumor Metastasis Gene Array SuperArray Chemiluminescent Detection Kit SuperArray Effectene Transfection Kit Quiagen LPR ampolabeling Kit SuperArray Plasmid Maxi Kit für Plasmidextraktion Quiagen QIA Prep Spin Mini Kit für Plasmidextraktion Quiagen QIAquick Gel Extraction Kit Quiagen Quantikine, Human VEGF ELISA R&D Systems Quantikine, Human Angiopoietin-2 ELISA R&D Systems SuperScript Double Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen

2.1.8. Puffer und Lösungen

PBS (pH 7,2) 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4 TAE-Puffer (50x) 2 M Tris-Base, 50 mM EDTA-Lösung, 20 mM Eisesssig pH

8,0


2x DNA Präzipitationspuffer 0,5 M Hepes, 150 mM Na2HPO4, 1 M KCl, 1 M NaCl, 0,2 M Glucose, (pH 7,05), steril filtrieren, 4 °C Lagerung

BSA-Lösung 2 % Bovines Serum Albumin in PBS, Lagerung -20 °C PFA-Lösung 4 % PFA in 1x PBS DNA-Ladepuffer 50 % Glycerin , 10 mM Tris, 10 mg/ml Orange G, pH 7,5 20 x SSC 175,5 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat auf 1 l mit Aqua dest.

Auffüllen, pH mit HCL auf 7,0 einstellen, autoklavieren 20 x SDS 200 g SDS in 1 l Aqua dest. lösen Puffer die nicht aufgeführt sind, wurden nach Standardrezeptur angesetzt.

2.1.9. Software

Zur statistischen Auswertung der Daten wurden Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen

Experimenten, die zugehörigen Standardabweichungen und die Signifikanz angegeben. Deren

Berechnung erfolgte mit den Programmen Microsoft Excel bzw. Graph Pad Prism.

2.1.10. Chemikalien/Reagenzien

Acryl-/Bisacrylamid 30 % / 0,8 % (37,5:1) Roth AEC Chromogen Substrat GibcoBRL Alamar Blue Reagenz BioSource Ammoniumpersulfat Merck Bacto-Agar Difco Bacto-Hefeextrakt Difco Biotin-16-dUTP Roche Chloroform Merck Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma dNTPs (10mM) Invitrogen Doxyzyklin Sigma ECL-Reagenzien für Western Blot Renaissance NEN EDTA Merck Essigsäure 100 % Merck Ethanol absolut Merck Ethidiumbromidstammlösung (10 mg/ml) Roth FBS-HyClone Hyclone Glycerin 87 % Merck Glycin Serva Hematoxylin Vector Laboratories Isopropanol Merck Kaisers Microscopy Glyceringelatine Merck Ketamin 10 % WDT Luciferase Assay Substrate Promega Magermilchpulver Bio-Rad MgCl2 Invitrogen


Natriumchlorid Merck, Sigma Natriumdodecylsulfat (SDS) Fluka Natriumhydorxid 5 M Merck PBS w/o Ca²+, Mg 2+ GibcoBRL Paraformaldehyd Merck RNA-Bee RNA Isolation Solvent Tel-Test, Inc. Rompun 2 % Bayer Salzsäure 2 M Merck Stop and Glo Buffer Promega Sucrose Merck TEMED Sigma Tris(hydroxymethyl-)aminomethan Merck Tween 20 Merck Wasser steril, doppelt destilliert Braun Wasserstoffperoxid, H2O2, 30 % Merck Alle Chemikalien, die nicht aufgelistet sind, wurden im Allgemeinen von Sigma-Aldrich bezogen.

2.1.11. Sonstige Materialien

DAKO Cytometion Pen Dako Cytomotion Deckgläser 20 x 26 mm² Superior Deckgläser 22 x 22 mm² Menzel-Glaser Digitalkamera Nikon Coolpix 4500 Nikon Combitips plus 5 ml Eppendorf Einmalküvetten Sarstedt Einmalskalpelle Feather Einmalspritze 20 ml Braun Eppendorf Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml, Safe Lock) Eppendorf Farbnegativfilm Optima II Prestige, 100 ASA, 36 Exp. AGFA Filmkasette Kodak Filter 0,22 µm Millipore Filtertips 10, 100 und 1000 µl Greiner Gel-Blotting-Papier Schleicher & Schuell Gewebekulturflaschen 50, 250, 750 ml Falcon Gewebekulturplatten 6 wells, 24 wells Falcon Gewebekulturschalen (10 cm Durchmesser) Falcon Gewebekulturschalen mit Raster (3,5 cm) Nunc Gewebekulturschalen mit Raster (13,5 cm) Falcon Hämacytometer Neubauer Insulinspritze mit 0,45 x 12 mm Kanüle Terumo Insulinspritze Micro-Fine 0,3 ml BD Kryoröhrchen (2 ml) Nalgene Micocons YM-10 Millipore Mikroliter Spritze (50 µl) Hamilton Nahtmaterial 5-0 (70 cm) ethicon Nitrocellulosemembran Hybond ECL Amersham Pharmacia

biotech Nylonmembran (PVDF) Schleicher & Schuell OP-Abdecktuch, 2-lagig (75 x 90 cm) Lohmann & Reuscher OP-Besteck VWR Parafilm Menasha Pasteurpipetten Brand PCR-Softtubes (0,2 µl) Biozym


Petrischalen (10 cm Durchmesser) Greiner Pipettenspitzen 10 µl, 100 µl, 1000 µl, steril Greiner Polystyrol-Röhrchen für FACS Falcon Reaktionsgefäße 1,5 ml und 2 ml Eppendorf Röhrchen 12 ml Greiner Röhrchen 15 ml Falcon Röhrchen 50 ml Falcon Röntgenfilme Biomax ML und MR Kodak Transparentfolie Saran, Tartan Zahnstocher Fackelmann Zellschaber Costar

2.1.12. Geräte

Autoklav Jumo Comp LS Webeco Brutschrank für Bakterienplatten Heraeus Brutschrank für Gewebezellkultur Labotect Brutschrank mit Schüttler SM-30 Edmund Bühler Elektophorese-und Blotapparaturen für Minigele Bio-Rad Elektrophoresekammern für Agarosegele Bio-Rad FACS Calibur + Computer mit Cell Quest Software Becton Dickinson +

Macintosh Feinwaage max. 150 g Sartorius Filmentwicklungsgerät 45compact Protec Grobwaage max. 1200 g Kern Heizblock Eppendorf Heizofen Heraeus Hybridisierungsofen Biometra Kamerasystem und UV-/Weißlichtkasten Biometra Lichtkasten mit UV (312 nm) Bachofer Magnetrührer Variomag Mikroskop Carl Zeiss Mikrowelle Siemens Multipette Eppendorf Photometer DU 640 Beckmann Pipettierhilfen Heidolph, Junke &

Kunkel Spannunggeräte Bio-Rad, Consort Sterile Werkbank Heraeus Thermocycler RoboCycler Gradient 96 Stratagene Thermomixer compact Eppendorf Thermostat Dri-Block Techne Tischzentrifugen Beckmann, Eppendorf Trockenschrank Memmert Vortex Reax Control Heidolph Wasserbäder Julabo Zentrifuge Allegra 64R Beckmann


2.2. Methoden

2.2.1. Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1. Agarosegelelektrophorese (Elektrophoretische Auftrennung von DNA)

Die Agarosegelelektrophorese ermöglicht die Auftrennung von DNA-Molekülen gemäß ihrer

Molekülgröße. Je nach Größe des aufzutrennenden DNA-Fragments wurden 1,0 % ige - 2,5 % ige

Agarosegele verwendet. Die entsprechende Menge an Agarose wurde in 1 x TAE Puffer aufgekocht,

mit Ethidiumbromidstammlösung (4 µl/100 ml) versetzt und in die Gelkammer gegossen. Nach

Erstarren des Gels wurden die Proben (mit 1/6 Volumen DNA-Ladepuffer gemischt) auf das Gel

aufgetragen und in 1x TAE-Puffer bei einer Spannung von maximal 100 Volt aufgetrennt. Zur

Dokumentation wurden die Gele unter UV-Licht fotografiert.

2.2.1.2. Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA

Die Konzentration einer Nukleinsäure kann über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer

Wellenlänge von 260 nm an einem Spektrophotometer bestimmt werden. Per Definition entspricht

eine optische Dichte von 1, gemessen bei einer Wellenlänge von 260 nm in einer 1 cm dicken

Quarzküvette folgenden Nukleinsäurenkonzentrationen (Sambrock et al. 1989):

1 OD260 nm entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA

1 OD260 nm entspricht 40 µg/ml RNA

Die Reinheit von Nukleinsäuren wird über den Quotienten aus den optischen Dichten bei 260 nm und

280 nm bestimmt. Für DNA sollte eine Reinheit zwischen 1,6 und 1,8 liegen, für RNA zwischen 1,8

und 2,0.

2.2.1.3. Klonierung

Restriktionsverdau von DNA

Für die Klonierung müssen Vektor und Insert mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen

verdaut werden. Der Restriktionsverdau wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 µl angesetzt. Die

Wahl des Reaktionspuffers erfolgte entsprechend den Herstellerangaben. Für einen sequentiellen

Restriktionsverdau wurde die DNA nach dem ersten Verdau gefällt, im Reaktionspuffer für das zweite

Enzym aufgenommen und erneut geschnitten.

Dephosphorylierung von Plasmid DNA

Bei dem Restriktionsverdau von zirkulärer Plasmid-DNA mit nur einem Restriktionsenzym ist die

Wahrscheinlichkeit einer Religation der beiden Vektorenden erhöht. Aus diesem Grund erfolgte die

Dephosphorylierung der linerarisierten Plasmid DNA mit dem Enzym Alkalische Phosphatase. Nach

der gewünschten Inkubationsdauer des Restriktionsansatzes, wurde 1 Einheit CIP Alkaline


Phosphatase zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch

Hitzeinaktivierung abgestoppt.

Präparative Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen

Für die Aufreinigung von DNA-Fragmenten und linearisierten Vektoren aus einem Agarosegel,

wurden diese unter UV-Licht aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des QIAquick Gel

Extraction Kits gemäß den Herstellerangaben extrahiert.

Ligation

DNA-Ligasen katalysieren die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen einer freien 5´-

Phosphatgruppe und einer 3´-Hydroxylgruppe von zwei miteinander kompatiblen DNA-Enden. In

dieser Arbeit wurde die T4-DNA Ligase verwendet, um DNA-Fragmente in entsprechend linearisierte

Plasmid-DNA zu integrieren. Hierzu wurden die zu legierenden DNA-Fragemente in einem

Gesamtvolumen von 10 µl unter Verwendung des 10x T4-DNA-Ligase Puffers und 1 µl T4-DNA-

Ligase inkubiert. Dazu wurde Insert- und Vektor-DNA im Verhältnis von 3:1 verwendet, wobei

insgesamt 10-100 ng DNA eingesetzt wurden. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht bei 4 °C

inkubiert.

Transformation

Bei einer Transformation wird Plasmid DNA in Bakterienzellen eingebracht, deren Membran dafür

durchlässig gemacht wurde. Die bei -80 °C gelagerten chemisch kompetenten Zellen TOP 10

(Invitrogen) wurden langsam auf Eis aufgetaut. Pro Transformationsansatz wurden 50 µl kompetente

Zellen mit 2 µl Ligationansatz vermengt und 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde für 30 s

einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt und sofort wieder auf Eis heruntergekühlt (~3 min).

Anschließend wurde der Ansatz mit 250 µl SOC Medium versetzt und 1 h bei 300 rpm bei 37 °C

geschüttelt. Verschiedene Volumina (50 µl – 150 µl) wurden auf LB-Agarplatten mit entsprechenden

Antibiotika ausgestrichen und über Nacht im Brutschrank bei 37 °C kultiviert. Die Platten konnten mit

Parafilm verschlossen einige Wochen bei 4 °C gelagert werden

Mini Plasmid DNA Präparation

Zur Analyse rekombinanter DNA wurden die Plasmide mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma

Qiagen aus E.coli Zellen isoliert. Nach der Transformation wurden die Klone von den Agarplatten mit

autoklavierten Zahnstochern gepickt, auf einer „Masterplate“ abgestrichen und in Röhrchen mit je

3 ml LB-Medium überführt. Die Röhrchen wurden bei 37 °C über Nacht geschüttelt, wohingegen die

„Masterplate“ bei 4 °C gelagert wurde. Es wurden je 2 ml der über Nacht gewachsenen

Bakterienkultur für die Plasmidisolierung nach Herstellerangaben eingesetzt. Die DNA wurde in 50 µl

ddH2O eluiert.


Maxi Plasmid DNA Präparation

Zur Gewinnung ausreichender Mengen an Plasmid DNA aus Bakterien, z.B. für die Transfektion

wurde das Plasmid MAXI Kit der Firma Qiagen verwendet. Als Ausgang für die Plasmidisolierung

wurden 100 – 200 ml einer Übernachtkultur, die aus einem Glycerinstock angeimpft wurde,

eingesetzt. Die Bakteriensuspension wurde in Zentrifugenbehältern 15 min bei 4 °C und 6000 g

zentrifugiert und die Bakterienpellets gemäß Protokoll der Firma Qiagen weiterverarbeitet. Die

isolierte Plasmid-DNA wurde in 200 µl ddH2O gelöst.

2.2.1.4. RNA Isolierung aus Zellen

Für die Isolierung von Gesamt-RNA wurde mit „RNase-freien“ Plastikmaterialien und DEPC-

behandeltem Wasser gearbeitet. Alle Arbeiten erfolgten auf Eis. Das Medium wurde aus der

Gewebekulturschale abgesaugt und die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 800 µl

RNA-Bee Isolations Solvent pro 10 cm Schale lysiert und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die Zellen

wurden durch eine Insulinspritze 3x auf- und abgezogen, um die Zellen aufzuschließen. Danach

wurden 200 µl Chloroform zugegeben, etwa 15 sec gevortext und 5 min auf Eis inkubiert. Eine

anschließende Zentrifugation für 15 min bei 12000 g führte zur Trennung der Probe in zwei Phasen,

wobei sich die RNA in der oberen wässrigen Phase anreicherte. Diese Phase wurde in ein neues

Eppendorfgefäß überführt und die RNA durch Zugabe von gleichem Volumen Isopropanol präzipitiert

(15 min, auf Eis). Die gefällte RNA wurde abzentrifugiert (12000 g, 15 min, 4 °C) und das RNA Pellet

mit 1 ml 75 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde kurz an der Luft getrocknet und in 50 µl DPEC-

Wasser gelöst. Die Lagerung der RNA Proben erfolgte bei – 80 °C.

2.2.1.5. RT-PCR

Bei der RT-PCR (Reverse Transkription) wurde die Gesamt-RNA aus Zellen durch das Enzym der

Reversen Transkriptase in die komplementäre cDNA umgeschrieben. In der vorliegenden Arbeit

wurde die SuperScript II (SSRT II) der Firma Invitrogen eingesetzt.

Es wurden 1 µg Gesamt-RNA je Ansatz in einem Gesamtvolumen von 8 µl mit DEPC-H2O eingesetzt.

Nach Zugabe von je 1 µl dNTPs (10 mM) und je 1 µl OligodT Primern wurde das Gemisch 5 min bei

65 °C inkubiert und danach auf Eis abgekühlt. Folgend wurde ein Mix aus 2 µl RT-Puffer 2 µl MgCl2

(50 mM), 2 µl DTT (0,1 M) und 1 µl RNaseOut zugegeben und 2 min bei 42 °C inkubiert. Nach

Zugabe von 1 µl SSRT II wurde der Ansatz weitere 50 min bei 42 °C inkubiert mit anschließender

Inkubation von 15 min bei 72 °C. Danach wurde 1 µl RNaseH zugegeben und der Ansatz 20 min bei

37 °C inkubiert. Die Proben wurden auf Eis gekühlt und bei -20 °C gelagert.


2.2.1.6. PCR

Bei der Polymerase Kettenreaktion (PCR) werden ausgewählte DNA-Abschnitte mit Hilfe von

Primern (Oligonukleotiden) und einer Polymerase stark vervielfältigt. Die PCR wurde in einem

Volumen von 50 µl durchgeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich aus 1/10 Volumen 10x PCR-Puffer

mit MgCl2 (Roche), je 10 µM der jeweiligen Primer, 10 mM der dNTPs, sowie 0,6 µl der Taq-

Polymerase (1U/µl, Roche) zusammen. Als Template wurde entweder gereinigte Plasmid-DNA oder

cDNA (50-100 ng) eingesetzt. Folgendes Standardprogramm wurde verwendet: Einer initialen

Denaturierung bei 94 °C für 5 min folgten 30-40 Zyklen mit je 1 min Denaturierung bei 94 °C, 1 min

Primerannealing bei 55-60 °C (je nach Primer) und 1 min Elongation bei 72 °C. Die finale Elongation

bei 72 °C dauerte 10 min. Zur Überprüfung der PCR-Reaktion wurden 10 µl der Reaktion auf einem

1 -2 % iges Agarosegel mittels Gelelektrophorese analysiert.

2.2.1.7. cDNA – Array

Um die Signaltransdutkion der Ang-2 exprimierenden MiaPaCa Zellen zu untersuchen wurde RNA

aus den Zellen wie bereits beschrieben isoliert und mit Hilfe eines cDNA Arrays der Firma Superarray

und photochemischer Detektion untersucht. Der in dieser Arbeit benutzte cDNA-Array (GEArray Q

Series Human Tumor Metastasis Gene Array) enthielt 96 cDNA Fragmente von

Metastasierungsgenen. Abbildung 8 zeigt schematisch den Ablauf der Methode, die im Folgenden

näher beschrieben wird.

Abb. 8: Fließschema der cDNA Array Methode (SuperArray)


In-vitro Transkription

Der Umbau der RNA mit gleichzeitiger Biotin-Markierung erfolgte mit dem

Labeling-Kit der Firma Superarray. Bei dieser Methode wurde mit Hilfe von Random Primern und

Reverser Transkriptase RNA in cDNA umgeschrieben. Mit Gen-spezifischen Primern erfolgte dann

die Amplifizierung der Transkripte mit gleichzeitigem Biotin-Einbau. Zur Herstellung der cDNA

Sonden wurden jeweils 3 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Die Qualität der Sonden wurde mittels Dot-Blot

überprüft. Hierzu wurden die Sonden in 1:20 Schritte mit H2O verdünnt und auf positiv geladene

Nylonmembran gespottet. Die Detektion des Biotins erfolgte nach der Anleitung des Herstellers und

wird in den folgenden Abschnitten beschrieben.

Hybridisierung und Detektion

Nach der Vorhybridisierung mit „GeAPreHyb-Solution“ erfolgte die Hybridisierung der Membranen

mit der Sonde in „GeAHyb-Solution“ bei 60 °C über Nacht. Die Sonden wurden zuvor 5 min bei

95 °C denaturiert. Am nächsten Tag wurden die Membranen mit Waschpuffer 1 (2x SSC, 1 % SDS)

und anschließend mit Waschpuffer 2 (0,1x SSC, 0,5 % SDS) behandelt, bevor eine 60-minütige

Blockierung (mit GEAblocking Solution, der Lachsspermien-DNA zugesetzt wurde) erfolgte. Zum

Nachweis von Biotin wurde das Chemiluminescent Detection Kit verwendet. Der Anti-Biotin-AP-

Antikörper wurde in der Verdünnung 1: 8000 eingesetzt und für 10 min inkubiert. Nach weiteren

Waschschritten erfolgte die Detektion der AP (Chemilumineszenz) mit CDP-Star. Die Lumineszenz

wurde über einen Röntgenfilm detektiert und 1-5 min exponiert.

cDNA-Array Auswertung

Mit Hilfe der Software war es möglich, ein Raster über die fotografierte Membran (Röntgenfilm) zu

legen, das sowohl die einzelnen „spots“ erkannte als auch in der Lage war, den Hintergrund mit

einzubeziehen bzw. heraus zu rechnen. Die Rohdaten wurden durch die Differenz aus „Integral-

Background“, die für jeden Spot erhalten wurde, charakterisiert. Die weitere Auswertung erfolgte über

die Software ScanAlyze und GEArray Analzyer.

2.2.2. Proteinbiochemische Methoden

2.2.2.1. Herstellung von Proteinlysaten

Alle Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt. Für die Präparation von Zelllysaten wurden zu 70-80 %

konfluente Zellen mit eiskaltem PBS gewaschen und nach Zugabe von 100-500 µl Lysepuffer vom

Kulturgefäßboden abgekratzt. Die Zellen wurden mit Hilfe von Ultraschall (Bandelin Sonifier, 10 sec,

80 % output) aufgeschlossen und anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Nach 10 minütiger

Zentrifugation (13000 g, 4 °C), die zur Abtrennung der Zelltrümmer diente, wurde der Überstand

abgenommen und in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Der Proteingehalt wurde mittels

Proteinbestimmung nach Lowry gemäß Herstellerangaben (BioRad) gemessen. Die Zelllysate wurden


in Flüssigstickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Je nach Versuchkonzeption wurden die

Zellen vor der Lyse für verschiedene Zeitpunkte mit Doxyzyklin induziert.

Lysepuffer: frisch zugegeben:

Tris (pH 7,8) 20 mM Na3VO4 1 mM Na Cl 150 mM DTT 1 mM EDTA 2 mM Aprotinin 10 KIU/ml ß-Glyerolphosphat 50 mM NaF 10 mM NP-40 0,5 % Leupeptin 2 µM Glycerin 1 % PMSF 2 mM

2.2.2.2. Proteinfällung mit Trichloressigsäure (TCA Fällung)

Zur Konzentrierung von Proteinen aus serum-freien Mediumüberständen, wurde die TCA-

Fällung durchgeführt. Dazu wurden 2 Mio. Zellen auf eine 10 cm Zellkulturschale ausgesät

und über Nacht kultiviert. Die Zellen wurden vorsichtig mit PBS gewaschen und 10 ml FBS-

freies Medium wurde zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 48 h inkubiert und das

Medium danach abgenommen und bei 1500 rpm bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand kann

bei -20 °C gelagert werden oder wie folgt für die Fällung weiter verarbeitet werden. Dazu

wurde der Überstand 5 ml einer 21 % TCA-Lösung vermischt und 4 h bei 4 °C gefällt.

Anschließend folgte eine Zentrifugation (45 min, 5000 rpm, 4 °C). Der Überstand wurde gut

abgesaugt und das Pellet mit Aceton gewaschen und anschließend nochmals zentrifugiert

(5 min, 5000 rpm, 4 °C). Das Pellet wurde anschließend getrocknet und in Laemmli Proben-

Puffer (80-100 µl) gelöst.

2.2.2.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Durch die diskontinuierliche SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel elektrophoresis)

können denaturierende Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Die SDS-Gele

wurden mit dem Elektrophorese System für Minigele der Firma BioRad hergestellt. Es wurden Gele

mit Trenn- und Sammelgel verwendet. TEMED als Polymerisationsinitiator und APS

(Ammoinumpersulfat) als Polymerisationskatalysator wurden erst kurz vorm Gießen der Gele

zugegeben. Zuerst wurde das Trenngel mit einem (Acrylamidgehalt von 7,5 – 13,5 %) bis ca. 1 cm

unterhalb des später eingesetzten Kammes gegossen. Nach dem Auspolymerisieren wurde dann das

Sammelgel darüber gegossen und ein 10-Taschen Kamm zur Aussparung von Taschen eingesetzt. Die

Proteinlysate wurden vor dem Probenauftrag mit 1/5 Volumen Laemmli-Probenpuffer versetzt und

5 min bei 95 °C aufgekocht. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V (Sammelgel) und 200 V

(Trenngel) in 1x-Laufpuffer. Als Größenstandard wurden 7 µl des Molekulargewichtsstandards See

Blue Plus2 Pre-Stained aufgetragen.


10x Laufpuffer nach Laemmli: 5x Probenpuffer:

Tris 25 mM SDS 10 % Glycin 192 mM DTT 500 mM SDS 0,1 % Tris (pH 6,8) 250 mM Glycerin 50 % Bromphenolblau 0,5 %

Sammelgel (5,6 %) Trenngel (Bsp. 10 %)

Acryamid/Bisacrylamid (30 %) 937 µl 4,5 ml 2 M Tris-Base (pH 8,8) - 1,875 ml 2 M Tris Base (pH 6,8) 315 µl - 10 % SDS 50 µl 100 µl Millipore-Wasser 3,75 ml 3,42 ml 10 % Ammoniumpersulfat (APS) 50 µl 100 µl TEMED 5 µl 5 µl

2.2.2.4. Western Blot

Nach der Elektrophorese können die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine Membran

transferiert und einzelne Proteine mit Hilfe von Antikörpern selektiv nachgewiesen werden. Hierbei

wird über die Bindung spezifischer primärer Antikörper an Meerrettich-Peroxidase-konjugierte

sekundäre Antikörper ein zu detektierendes Signal erzeugt. Kommt es zur Bindung beider Antikörper

kann durch die Meerettich-Peroxidase ein Chemilumineszenz-Reagenz umgesetzt werden, so dass

schwarze Proteinbanden auf einem Röntgenfilm sichtbar werden.

Es kamen je nach Primärantikörper unterschiedliche Membranarten zum Einsatz. Für die Ang-2

Detektion wurde eine Nitrocellulose (NC) Membran, für alle anderen verwendeten Antikörper wurde

eine PVDF Membran verwendet. Die PVDF Membran wurde vor dem Blot in 96 % Alkohol kurz

inkubiert, wohingegen die NC-Membranen nur in Blotpuffer äquilibriert wurden. Für den Transfer der

Proteine auf die Membran wurde eine Nass-Blot-Kammer für Minigele der Firma BioRad eingesetzt.

Der Blot wurde luftblasenfrei wie folgt aufgebaut:

Minuspol (schwarz) 1 x Schwamm

1 x Gel-Blotting-Papier Gel

Membran 1 x Gel-Blotting-Papier

2 x Schwamm Pluspol (rot)

Geblottet wurde unter Eiskühlung bei 100 V für 60 min. 10x Blotpuffer: Transferpuffer:

Tris-Base 250 mM 1x Blotpuffer Glycin 1,92 M Ethanol 10 %


Nach dem Blotten wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer, freier Proteinbindestellen 1 h

in 5 % Milch/PBS/Tween 0,1 % bei RT geschwenkt. Für die Immunreaktion wurde die Membran über

Nacht mit dem entsprechenden primären Antikörper (verdünnt in 5 % Milch/PBS/Tw) bei 4 °C

inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran 3x 10 min in PBS/Tween Waschpuffer gewaschen,

und mit dem sekundären Antiköper (1:10000 verdünnt in 5 % Milch/PBS/Tween) 1 h bei RT

inkubiert. Anschließend wurde die Membran 3 x 10 min in PBS/Tw Puffer gewaschen. Die ECL-

Reagenzien Oxidizing und Enhanced Luminol Reagent der Firma NEN wurden zu gleichen Teilen

gemischt und die Membran in dieser Lösung 1 min inkubiert. Nach dem Abtropfen der Membran

wurde diese zwischen zwei saubere Folien luftblasenfrei in eine Filmkassette gelegt. Die

anschließende Exposition der Röntgenfilme mit der Membran erfolgte für wenige Sekunden bis zu

2 h.

PBS/Tween Waschpuffer: Blocking-Lösung:

PBS 1 x Magermilchpulver 5 g Tween 20 0,1 % PBS/Tween 20 0,1 % 100 ml 2.2.2.5. Strippen der Membran

Um auf derselben Membran weitere Proteine nachzuweisen, mussten die Antikörper mittels

hochreduzierenden Strip-Puffers von der Membran entfernt werden. Dazu wurden die Membranen in

einer mit Parafilm verschlossenen Küvette für 30 min bei 57 °C im Wasserbad geschüttelt.

Anschließend wurde die Membran mehrmals mit PBS/Tween gewaschen und konnte dann für eine

weitere Antikörper Detektion eingesetzt werden.

Strip-Puffer (Stammlösung): Frisch angesetzt:

SDS 2 % Strip-Puffer (Stammlsg.) 20 ml Tris-Base pH 8,8 62 mM ß-Mercaptoethanol 174,5 µl

2.2.2.6. FACS Analyse

Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) erlaubt die Analyse verschiedener Eigenschaften von

Zellen. So können Größe und Granularität der Zelle dargestellt und Oberflächenproteine sowie

zytoplasmatisch auftretende Proteine nachgewiesen werden. Zudem kann der DNA-Gehalt und somit

die Zellzyklus-Phase gezeigt werden. Die Zellen werden mit fluoreszenzmarkierten Molekülen als

feine Tröpfchen in einer Fließkammer an einem Laserstrahl vorbeigeleitet, durch den die Größe,

Granularität und Fluoreszenzart jeder einzelnen Zelle registriert werden kann. Durch Aufladung der

Tröpfchen werden die Zellen nach ihren Parametern sortiert. Die Messung wird in Zytogrammen, z.B.

als Dot Plot mit den Parametern der Zellgröße und –granularität oder als Histogramm mit der Zellzahl,

bezogen auf die Fluoreszenzdichte angegeben.


In dieser Arbeit wurde die DNA der Zellen durch Einlagerung von Propidiumiodid markiert, um

Zellzyklusanalysen zu erstellen.

Dazu wurden ca. 2 x 105 Zellen trypsiniert und in ein 15 ml Röhrchen überführt und 5 min bei

1100 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, das Pellet in 900 µl PBS resuspendiert und

zur Vereinzelung der Zellen wurde tropfenweise dreimal 700 µl eiskaltes Ethanol (96 %)

dazugegeben, bevor die Proben mindest für 20 min bei -20 °C gelagert wurden. Die Zellen wurden

anschließend zentrifugiert (1100 rpm), mit 1 ml PBS gewaschen und in 500 µl Färbelösung

resuspendiert. Nach 30 min Inkubation im Dunkeln bei 37 °C wurden je 10000 Zellen mit Hilfe der

CellQuest Software im FACS Calibur-Gerät (Becton Dickinson) analysiert. Zur Auswertung wurden

Histogramme und ihre statistischen Daten verwendet.

FACS Färbelösung: 50 µl Propidiumiodidlösung (1 mg/ml) 3 µl RNase A (100 mg/ml) pro 1 ml PBS

2.2.2.7. Koloniebildungsassay (HTCA)

Beim Koloniebildungsassay (human tumor colony assay, HTCA) wird die Fähigkeit von Zellen

untersucht Kolonien in Agar zu bilden. Die Fähigkeit in der Agar-Matrix Kolonien zu bilden, ist ein

Zeichen der Tumorigenität der Zellen. Zudem kann so die in vivo Situation gut nachgeahmt werden.

Methylcellulose-Mix

In 500 ml kochendes, steriles destilliertes Wasser wurden langsam 21 g Methylcellulose eingerührt.

Nach dem Abkühlen auf 37 °C wurden 500 ml eiskaltes Iscove´s Medium (2x) hinzugegeben. Die

fertige Lösung wurde in 100 ml portioniert und bei -20 °C über Nacht eingefroren. Ein Aliquot wurde

bei 37 °C aufgetaut und in 12 ml Röhrchen zu je 3,6 ml portioniert, die bei -20 °C gelagert wurden.

3 % iger Agar

3 g Agar wurden in 100 ml sterilem destilliertem Wasser aufgekocht, in 12 ml Röhrchen zu je 3 ml

portioniert und bei 4 °C aufbewahrt.

0,06 % ige ß-Mercaptoethanol-Lösung

8,45 ml PBS wurden mit 5 µl ß-Mercapthoethanol versetzt und sterilfiltriert. Die Lösung wurde frisch

angesetzt.

Für den HTCA Assay wurden Methylcellulose-Aliquots und FBS (Hyclone) bei 37 °C warm gestellt.

Die Zellzahl wurde auf 3 x 104/ml in DMEM (ohne Zusätze) eingestellt. Folgender Ansatz

wurde steril angesetzt:


Methylcellulose 3,6 ml FBS (HyClone) 2,7 ml ß-Mercaptoethanol-Lösung 60 µl Iscove´s Medium (1x) 770 µl Zellsuspension 300 µl Die Röhrchen wurden kräftig geschüttelt und umgeschwenkt. Die Agar-Aliquots wurden in

der Mikrowelle kurz aufgekocht und mit je 6 ml DMEM (ohne FBS) vermischt. Es wurden

1,63 ml der Agarlösung pro Ansatz zugegeben und wieder kräftig geschüttelt. Die Röhrchen

wurden 20 min bei 37 °C inkubiert. Währenddessen wurden große Gewebekulturschalen mit

je 7 kleinen Kulturschalen mit Raster (3,5 cm) bestückt. Je 1 ml der Zellsuspension wird mit

einer Insulinspritze in die kleinen Schalen gefüllt; in die große Schale wurde etwa 2 ml PBS

gegeben, um Austrocknung zu vermeiden. Die Schalen wurden 10-13 Tage bei 37 °C im

Brutschrank inkubiert. Bei ausreichender Größe wurden die Kolonien in den Schalen bei

40-facher Vergrößerung mikroskopiert und gezählt.

2.2.2.8. ELISA

Für den Proteinnachweis mittels ELISA (Enzym-linked immunosorbent Assay) wurden MiaPaCa-2

Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro 24-Well ausgesät und in serumhaltigem DMEM-

Medium angezüchtet. Nach 4 h erfolgte ein Wechsel auf serumfreies Medium für weitere 48 h mit und

ohne Dox Zugabe zur Induktion der Ang-2 Expression. Die Überstände wurden abgenommen und bei

-20 °C gelagert.

Zum Nachweis von Ang-2 im Medium und im Mäuse-Serum wurde ein spezifischer ELISA Kit für

humanes Ang-2 (QuantikineTM, R&D Systems) nach Angaben des Herstellers verwendet. Dieser

eignete sich aufgrund seiner hohen Sensitivität um extrem geringe Konzentrationen von Ang-2 im

Pikogramm-Bereich quantitativ nachweisen zu können. Dabei reagiert das zu messende Ang-2 in einer

Antigen-Antikörper Reaktion als Antigen mit einem monoklonalen Primärantikörper, der an der

Mikrotiterplatte anhaftet. Ein hinzugegebener, enzymgekoppelter Sekundärantikörper bindet ebenfalls

an das Ang-2 und katalysierte gleichzeitig eine Farbreaktion. Die Intensität der Farbreaktion ist

proportional zur Ang-2-Konzentration und kann photometrisch bestimmt werden. Anhand einer

Standardkurve mit einem Ang-2 Standard (R&D Systems) wurde die absolute Konzentration ermittelt.

Für die Bestimmung der Ang-2 Expression im Zellkulturüberstand wurde eine Verdünnung von 1:50

im ELISA eingesetzt, während die Seren unverdünnt eingesetzt wurden.

Entsprechend wurde in den Überständen die Konzentration an humanem VEGF mittels eines VEGF

ELISAs (R&D Systems) bestimmt, der nach Vorschrift durchgeführt wurde.


2.2.3. Zellbiologische Methoden

2.2.3.1. Allgemeine Methoden der Zellkultur

Alle Zelllinien wurden bei 37 °C in einer CO2-Konzentration von 5 % kultiviert. Die Medien wurden

alle 2-3 Tage gewechselt. Zur Sub-Kultivierung wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von

70-80 % angezogen und dann durch Zugabe von Trypsin vom Gefäßboden gelöst (Waschen der Zellen

mit PBS (ohne Ca2+/Mg2+) und Inkubation mit Trypsin (1 ml/25 cm²) bei 37 °C bis die Zellen sich

ablösen, abstoppen der Reaktion mit Medium +10 % FBS). 1/5 bis 1/10 der Zellsuspension wurde in

einer neuen Zellkulturflasche ausgesät.

Zur Aufbewahrung wurden die Zellen in 10 % DMSO/FBS eingefroren und in flüssigen Stickstoff

gelagert. Das Auftauen der Zellen erfolgt so schnell wie möglich (Wasserbad 37 °C). Die Zellen

wurden in Medium aufgenommen, in ein 15 ml Falcon überführt und bei 1000 rpm 5 min bei RT

zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml 10 % FBS-Medium resuspendiert, in eine

Zellkulturflasche überführt und bei 37 °C, 5 % CO2 kultiviert. Nach 24 h wurde ein Mediumwechsel

durchgeführt.

Zellzahlbestimmungen von 2D Kulturen wurden mittels der Neubauer Zählkammer und Trypanblau-

Färbung durchgeführt (Zellzahl x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml Medium).

2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter Klone – Transfektion mit Effectene

Bei der stabilen Transfektion werden die Zellen mit einem Antibiotikum unter Selektionsdruck

gesetzt, so dass nur Zellen, die die transfizierte Plasmid DNA mit dem Resistenzgen ins Genom

integriert haben, überleben können. Diese werden vereinzelt, um Klone mit nur einer Population

heranzuzüchten.

Für die stabile Transfektion der Zellen wurde das „Effectene Transfection Reagent“ (Qiagen, Hilden),

nach Herstellerangaben eingesetzt. Dabei wird die DNA mittels eines Enhancers kondensiert und in

Form von Micellen eines nicht-liposomalen Lipids in die Zellen transferiert.

Einen Tag vor der Transfektion wurden 1x 105 Zellen (MiaPaCa-2) in eine 10 cm Schale ausgesät, so

dass die Zellen am nächsten Tag eine Konfluenz von 40-70 % erreicht hatten. 5 µg der zu

transfizierenden Plasmid-DNA wurden mit EC-Puffer auf ein Volumen von 300 µl aufgefüllt und

anschließend nach Zugabe von 40 µl Enhancer Lösung kurz gevortext. Nach 2-5 min Inkubation bei

RT wurden 50 µl Effectene Lösung zugegeben, kurz gevortext und für 10 min bei RT inkubiert.

Inzwischen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 7 ml frisches Medium dazugegeben. Der

Transfektionsansatz wurde mit 3 ml Medium vermischt und tropfenweise zu den Zellen pipettiert.

Nach 6-stündiger Inkubation der Zellen mit dem Transfektionsansatz bei 37 °C und 5 % CO2 wurde

das Medium durch frisches Medium ersetzt. Nach 24 h wurden die transfizierten Zellen mit Medium +

Selektionsantibiotikum in einer Verdünnung von 1:5 bis 1:10 auf mehrere große Zellkulturschalen


(13,5 cm) passagiert. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Nach 3-4 Wochen waren einzelne

Zellklone sichtbar. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, die Zellklone mit einer Pipettenspitze

durch Abschaben „gepickt“ und in je ein 24 Well einer 24-Wellplatte zur Weiterkultivierung

überführt.

2.2.3.3. Transiente Transfektion – Calcium Phosphat Transfektion zur Bestimmung der

Induktionsstärke

Zur Überprüfung der Induktionsstärke der Erst-Vektor Transfektion (Produktion des TetR) wurden

transiente Transfektionen mittels Calcium Phosphat durchgeführt. Das Prinzip der Calcium Phosphat

Präzipitation liegt in einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat. Die zu übertragende

DNA bindet sich an das ausfallende Calciumphosphat. Die ausgefallenen Kristalle werden der

Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Zellen mit dem Reportergenkonstrukt (pTRE2hyg-Luc,

pcDNA4/TO-Luc), das das Luziferasegen (Firfly) kodiert, transfiziert. Als Kontrolle der

Transfektionseffizienz wurde das Plasmid pRL-TK zur Expression des Luziferasegens aus dem

Leuchtkäfer Renilla reniformis cotransfiziert. Anschließend wurden die transfizierten Zellen mit und

ohne Dox für 48 h inkubiert. Die folgende Messung der Luziferase Aktivität stellt ein direktes Maß für

die Menge an transkribierten Luziferasegens dar und vermittelt einen Eindruck über die Aktivität bzw.

die Induktionsstärke des induzierbaren Systems.

Für die transienten Transfektionen wurden 1,5 x 105 Zellen pro 6-Well einer 6-Wellplatte in

serumhaltigen Medium ausgesät und über Nacht kultiviert. Zur Transfektion wurden 500 ng

Reportergenkonstrukt (pTRE2hyg-Luc oder pcDNA4-Luc) und 50 ng pRL-TK in einem

Gesamtvolumen von 109,5 µl in H2O aufgenommen und mit 15,5 µl CaCl (2 M) und 125 µl des DNA-

Präzipitationspuffers versetzt. Der Transfektionsansatz wurde für 30 min bei RT inkubiert, um die

notwendige Komplexbildung zu erzielen. Die Zellen wurden anschließend mit 250 µl des

Transfektionsansatzes versetzt und 4-6 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

DNA Präzipitationspuffer:

Hepes 50 mM Na2HPO4 1,5 mM KCl 10 mM NaCl 280 mM Glucose 12 mM pH 7,5, steril filtrieren, Lagerung bei 4 °C

2.2.3.4. Dual-Luciferase Reporter Assay zur Überprüfung der Induzierbarkeit

48 h nach Transfektion wurden die Zellen einem Dual-Luciferase Assay der Firma Promega

unterzogen, der nach Angaben des Herstellers durchgeführt wurde. Diese Methode erlaubt die nahezu


gleichzeitige Quantifizierung der in den transfizierten Zellen exprimierten Firefly Luciferase und der

Renilla Luciferase.

Zur Gewinnung von Zelllysaten wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit 250 µl

PLB (passive lysis buffer) überschichtet. Nach einer 10 minütigen Inkubation bei RT auf einem

Laborschüttler wurden die Platten zunächst bei -80 °C eingefroren, aufgetaut und 20 µl jedes

Zelllysats in eine 96-Well Platte überführt.

Die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte an einem Plattenreader-Luminometer. Je 100 µl einer

Luciferin-Substratlösung (LARII-Puffer, Promega) wurden innerhalb des Gerätes in jedes Well

pipettiert und die Messung sofort gestartet. Die dadurch aktivierte Lumineszenz der Firefly Luciferase

wurde unmittelbar im Luminometer in einem Messintervall von 10 s in Form von Relative Light Units

(RLU) quantifiziert. Derselben Probe wurden anschließend 100 µl Stop and Glo Puffer (Promega)

zugefügt, wodurch die Lumineszenz der Firefly Luciferase gehemmt und gleichzeitig die der Renilla

Luciferase aktiviert wurde. Es erfolgte ebenfalls unmittelbar die Quantifizierung der Renilla

Luciferase im Luminometer in einem Messintervall von 10 s in Form von RLU.

2.2.3.5. Proliferationsassay mittels Alamar Blue

Mittels des Alamar Blue Assays der Firma Biosource wird die Zahl der lebenden Zellen indirekt durch

Bestimmung der mitochondrialen metabolischen Aktivität der Zellen gemessen. Hierbei wird ein

wasserlöslicher blauer Farbstoff zu einem roten Endprodukt reduziert. Der Alamar Blue Assay ist sehr

schnell durchführbar und der Farbstoff ist ungiftig. Nach Ablauf der Inkubationszeit der Zellen (z.B.

+/- Dox, 48 h) wurde dem Zellkulturmedium 50 µl (pro 24-Well) Alamar Blue zugegeben und der

Farbumschlag nach 3 h Inkubation bei 37 °C mit dualer Wellenlänge 535 / 590 nm an einem

Plattenfluoreszenzreader gemessen.

2.2.4. Tierexperimentelle Methoden

Die Haltung der Tiere und alle tierexperimentellen Versuche wurden bei der Firma Schering AG

(Abteilung: Optical Imaging & New Modalities Research) durchgeführt.

2.2.4.1. Versuchstiere und Haltung

Als Modell für das Studium von Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung von humanen

Pankreaskarzinomzellen nach Rekonstitution von p16 und Ang-2 wurden entweder weibliche

Nacktmäuse (NMRI nu/nu Mäuse von Taconic M&B) oder SCID (severe combined immunodefiency)

(VFox Chase SCID NOD von Bomholdgard/Möllegard Dänemark) im Alter von 3-6 Wochen

verwendet. Die Haltung der Tiere erfolgte in Käfigen mit Gruppen von 6-8 Tieren. Die Nahrung der

Mäuse war ausschließlich Wasser und übliches Trockenfutter. Das Wasser wurde je nach Gruppe mit

Succrose (5 %) versetzt oder mit Sucrose und zusätzlich Doxyzyklin (2 mg/ml).


2.2.4.2. Orthotope Implantation

Durch die Verwendung eines orthotopen Modells ist im Vergleich zum subkutanen Modell mit einem

wesentlich höheren Erkenntnisgewinn zu rechnen. Die charakteristischen Wachstumsstadien,

bestehend aus lokalem Tumorwachstum, der lymphogenen Metastasierung in benachbarte

Lymphknoten, der hämatogenen Metastasierung sowie der peritonealen Aussaat mit Entwicklung

einer Bauchwassersucht (maligne Ascites) und Ausbildung einer diffusen peritonealen Metastasierung

(Peritonealkarzinose) lassen sich nur im orthotopen Tiermodell nachbilden.

MiaPaCa-2 Zellen wurden bis zur einer Konfluenz von 70-80 % in 175 cm² Zellkulturflaschen

kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, gezählt und mit PBS auf 1 x 106

Zellen/ml eingestellt und in 1 ml Eppendorfgefäße aliquotiert. Die Zellen wurden bei 1100 rpm für

5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in 10 µl PBS resuspendiert und auf Eis

gelagert.

Die Tiere wurden durch intraperitoneale Injektion eines Gemisches aus Ketamin (100 mg/kg) und

Rompun (20 mg/kg) narkotisiert. Unter der sterilen Bank wurde die Maus auf dem Rücken fixiert, der

Bauch mit dem Desinfektionsmittel (Softasept-Spray) desinfiziert und das Abdomen mit sterilen

Instrumenten schichtweise median über eine Länge von ca. 1,5 cm laparotomiert. Der Magen wurde

durch Zug nach extraperitoneal verlagert und so eingestellt, dass der Pankreas zur Darstellung kam.

Eine zweite Person injizierte dann 10 µl, d.h. 1 Millionen Zellen in den Pankreas. Erfolgreiche

Injektionen sind durch Bildung einer blasenartigen Aufweitung des Pankreas gekennzeichnet. Tiere

bei denen keine „Blasenbildung“ oder der Austritt von Tumorzellsuspension in die Bauchhöhle zu

beobachten war, wurden sofort durch zervikale Dislokation getötet. Nach erfolgreicher Injektion

wurde der Magen reponiert und das Perituneum fortlaufend mit einem resorbierenden Faden genäht.

Die Haut wurde durch Einzelklammern verschlossen. Die postoperative Lagerung der Tiere erfolgte

auf der Wärmeplatte.

Am letzten Versuchstag wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet und seziert. Alle

Beobachtungen wurden in einem Sektionsprotokoll festgehalten. Primärtumore, Lymphknoten,

eventuelle Metastasen wurden entnommen und auf Trockeneis bis zur Lagerung bei -80 °C

transportiert. Zur Dokumentation wurden die Tiere und alle Auffälligkeiten mit einer Digitalkamera

fotografiert.

2.2.4.3. Retrobulbäre Blutentnahme

Für die Blutentnahme wurden die Tiere mit einem Gemisch aus Rompun/Ketamin (s.o.) narkotisiert.

Anschließend wurde ein Einmal-Mikrohämatokritröhrchen über den medialen Augenwinkel am

Augapfel entlang zum Augenhintergrund eingeführt. Mit einer drehenden Bewegung wurde der

retrobulbäre Venenplexus eröffnet, das Blut über die Kapillare entnommen und in einem

Eppendorfgefäß aufgefangen. Anschließend wurde das Blut bei 3000 rpm für 10 min zentrifugiert, das

Serum abgenommen und in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und bei -20 °C gelagert.


2.2.5. Immunhistochemische Methoden

2.2.5.1. Herstellung von Gefrierschnitten

Zur Anfertigung von Gefrierschnitten wurden die Proben mit Tissue-Tec auf Aluminiumzylinder

aufgeblockt. Tissue-Tec besitzt Elastizität, die ähnlich dem Gewebe ist, und dient sowohl zur

Fixierung als auch zum Schutz vor Erwärmung. Die Gefrierschnitte wurden in einer Dicke von 5 -

7 µm mit einem Kryostat hergestellt. Die Schneidetemperatur betrug –30 °C. Die Schnitte wurden mit

warmen (RT) Glasobjektträgern (Super Frost/Plus) aufgenommen und über Nacht bei RT getrocknet.

Gelagert wurden die Schnitte bei -80 °C.

2.2.5.2. HE-Färbung

Bei der HE-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) handelt es sich um eine Kern-Plasma-Färbung für

die Routineuntersuchung von histologischen Schnitten. Die Kerne färben sich blauschwarz bis violett,

zytoplasmatische Bestandteile rosa bis rot. Die Schnitte wurden 10 min in die Hämalaunlösung

eingetaucht und dann unter fließendem Wasser gebläut. Anschließend wurden die Schnitte kurz (1-

2 min) in Eosinlösung (1 % in Aqua dest.) gefärbt. Danach wurden die Schnitte unter fließendem

Wasser gewaschen und mit Gyceringelatine eingedeckt.

2.2.5.3. Immunhistochemische Färbungen an Gefrierschnitten

Der immunhistochemische Nachweis der Proteine (p16, Zytokeratin, CD31 und Lyve-1) an

Gefrierschnitten erfolgte mittels der Immunperoxidase Technik der ABC Methode (Avidin-Biotin-

Methode). Dazu wurden die Schnitte in 4 % PFA für 20 min bei RT fixiert. Danach erfolgte ein

einmaliges Waschen für 5 min in 1x PBS. Das Gewebe auf dem Objekträger wurde mit einem Dako-

Pen Stift umrandet. Zur Blockierung der endogenen Peroxidasen wurden die Schnitte für 15 min in

0,6 % H2O2 /PBS inkubiert und anschließend 2x 5 min in PBS gespült. Als nächstes erfolgte zur

Blockierung unspezifischer Bindungen eine Inkubation für 15 min mit 10 % Schweineserum bei RT.

Dieser Schritt entfiel bei der Färbung mit CD31, Lyve-1 und Zytokeratin. Die Schnitte wurden erneut

2x in PBS gewaschen bevor der primäre Antikörper in der entsprechenden Verdünnung (Tab.3) auf

die Schnitte gegeben wurde (100 µl/ Schnitt). Die Inkubation mit dem primären Antikörper erfolgte in

einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C oder für 1 h bei RT (je nach Antikörper). Danach wurden

die Schnitte nach 3x Waschen in PBS mit dem biotinyliertem sekundären Antikörper für 30 min bei

RT inkubiert. Während der Inkubation mit dem sekundären Antikörper wurde die ABC Lösung

angesetzt. Die Objektträger wurden 3x in PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit

dem Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Kit) für 30 min bei RT. Nach dem Waschen (2x

PBS) erfolgte die Substratumsetzung eines Substrat/Chromogengemisches (AEC Substrat, DAKO)

durch die Peroxidase. Die Entwicklung wurde unter dem Mikroskop beobachtet und nach

ausreichender Rotfärbung wurde die Reaktion durch Aqua dest. gestoppt. Die Schnitte wurden mit


Haematoxylin für 2 min gegengefärbt und anschließend mit Wasser gebläut. Schließlich wurden die

Schnitte getrocknet und mit Glyceringelatine eingedeckt.

Tab. 3: Primärantikörper und deren Einsetzungen 1.AK Inkubation 2.AK Inkubation Entwicklung

p16 1 µg/ml, ü.N. bei 4 °C Biot. Schwein anti

rabbit, 1:200, 1 h RT

ABC + AEC

CD31 (Pecam1)

Anti-mouse

1:50

1 h bei RT

Biot. Anti-rat v rabbit

1:200 , 30 min bei RT

ABC + AEC

Lyve-1

Anti mouse

1:200

1 h bei RT

Biot. Anti-rat v rabbit

1:200, 30 min bei RT

ABC + AEC

Pan Zytokeratin

Anti-human

1:50

1 h bei RT

entfällt AEC

Ergebnisse 43

3. Ergebnisse

3.1. Generierung des TREx Systems zur induzierbaren Expression von p16 in MiaPaCa-2 Zellen

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von p16 auf die Tumorbiologie im Pankreaskarzinom

untersucht. Trotz vieler Studien, die p16 als Tumorsuppressor beschreiben, ist die vollständige

Bedeutung von p16 für die Tumorbiologie im Pankreaskarzinom noch unklar.

Als Modell zur Untersuchung der p16 Restitution im humanen Pankreas diente in der vorliegenden

Arbeit die Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2. Diese Zelllinie steht bezüglich ihres genetischen

Hintergrundes mit den genetischen Alterationen von p16, p53 und k-ras repräsentativ für die typische

humane in vivo Situation. Zudem sind MiaPaCa-2 Zellen in der Lage, nach orthotoper Implantation

anzuwachsen und Tumore auszubilden.

Eine Restitution von p16 über einen längeren Zeitraum führt in vielen Zellen zu einem G1 Arrest

(Lukas et al., 1995; Medema et al., 1995). Dadurch werden Untersuchungen über längere Zeiträume

erschwert. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit die Vorteile eines Tetrazyklin-induzierbaren

Systems ausgenutzt. Um p16 induzierbar zu exprimieren, wurde das TRExTM System von Invitrogen

gewählt. Das TREx System basiert im Gegensatz zu dem ursprünglich von Manfred Gossen und

Hermann Bujard 1992 (Gossen and Bujard, 1992) publizierten System, welches später im zweiten Teil

der Arbeit näher erläutert wird, auf einem Regulatorprotein ohne VP-16-Transaktivierungsdomäne aus

dem Herpes Simplex Virus. Damit entfällt die Möglichkeit pleiotroper Induktionseffekte (Gallia and

Khalili, 1998). Bei längerfristiger Expression des Regulatorproteins (Tetrazyklin-Repressor) in den

Zellen treten somit keine unspezifischen Nebeneffekte auf. In anderen Systemen könnten solche

Nebeneffekte aufgrund einer unspezifischen Aktivierung von zellulären Genen durch virale

Transaktivatoren ausgelöst werden. Eine schematische Darstellung zur Beschreibung der

Funktionsweise des Systems ist in Abbildung 9 dargestellt.

Das TREx System besteht aus einem Tetrazyklin-Repressorprotein (TetR), welches von dem

Regulatorplasmid pcDNA6/TR exprimiert wird. Als Homodimer bindet das TetR Protein fest an eine

spezifische DNA-Sequenz im Promotor, den Tetrazyklin-Operator (Hillen et al., 1983), der sich in

diesem System auf dem induzierbaren Expressionsplasmid (pcDNA4/TO) befindet. Die Expression

des Zielgens, z.B. p16, steht unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors (CMV), in den

zwei Kopien der Tet-Operator (TetO2) Sequenz inseriert wurden. Der Induktor Tetrazyklin oder wie

hier verwendet das Tetrazyklinderivat Doxyzyklin, bindet an dieses Regulatorprotein (TetR), welches

daraufhin seine Konformation ändert und von der DNA abdiffundiert. Damit wird die DNA für die

RNA-Polymerase II freigegeben und die Transkription kann starten.

Ergebnisse 44

Abb. 9: Funktionsschema des induzierbaren TREx-Systems. Unter der Kontrolle des CMV-Promotors wird der Tet Repressor (TetR) vom Regulatorplasmid pcDNA6/TR in hohen Dosen exprimiert. Als Homodimere binden sie im Vektor pcDNA4/TO an die spezifische DNA-Sequenz des Promotors, die TetO2 Sequenz, und blockieren somit die Transkription von p16. Durch Zugabe von Tetrazyklin (tet) oder Doxyzyklin (dox), einem Tetrazyklinderivat, kommt es zu einer Konformationsänderung des Tet Repressors. Als Folge diffundieren die Homodimere von der DNA ab und die Transkription von p16 ist aktiviert.

3.2. Stabile Expression des Tet-Repressors in MiaPaCa-2 Zellen

Das Regulatorplasmid pcDNA6/TR ist eine wichtige Komponente des TREx-Systems (Postle et al.,

1984). Es kodiert den Tetrazyklin-Repressor (TetR) (Abb. 10A). Dieses Plasmid wurde als erstes in

die Pankreaskarzinom-Zelllinie mit Hilfe von nicht-liposomalen kationischen Lipiden (Effectene,

Quiagen) stabil transfiziert.

Zur Isolation stabil transfizierter Zellklone wurden zwei Tage nach der Transfektion die Zellen

passagiert und mit Blasticidin (5 µg/ml) unter Selektionsdruck gesetzt. Drei bis vier Wochen nach

Selektionsbeginn wurden Zellklone gepickt, expandiert und anschließend die Induktion des TetR-Gens

mittels Luciferase Assay überprüft.

Ergebnisse 45

Dazu wurde das Plasmid pcDNA4/TO-Luc (Abb. 10B) mittels Calcium Phosphat Präzipitation

transient in die Zellen transfiziert und die Expression von Luciferase durch Zugabe von Doxyzyklin

induziert. 48 h nach Induktion wurden die Zellen aufgearbeitet und die Luciferase-Aktivität am

Luminometer gemessen. Abbildung 11A zeigt exemplarisch die erhaltenen Ergebnisse. Insgesamt

konnten in 74 % (14/19) der mit Doxyzyklin behandelten Zellklone eine erhöhte Luciferase-Aktivität

gemessen werden. Ziel war es, einen Klon mit möglichst hoher Induktion und gleichzeitig niedriger

Basalexpression zu isolieren. Der Zellklon Nummer 10 (Abb. 11B) zeigt im Vergleich die höchste

Induktion (10-fach) mit gleichzeitig geringster Basalexpression. Aus diesem Grunde wurde er als

Zelllinie unter dem Namen MiaPaCa-2-TREx für die weitere Transfektion verwendet.

Wir konnten somit die erste Zelllinie zur stabilen Expression des Tet-Repressors in MiaPaCa-2 Zellen

bereitstellen.

A B Luciferase-Gen

Luc

Abb. 10: Aufbau der Plasmide pcDNA6/TR und pcDNA4/TO-Luc. (A) Aufbau des Regulatorplasmids pcDNA6/TR. Der Vektor pcDNA6/TR exprimiert unter Kontrolle des CMV Promotors (PCMV) hohe Dosen des Tet-Repressors (TetR). Zusätzliche wichtige Elemente sind die Resistenzgene für Ampicillin und Blasticidin, die Startstelle für die Replikation (origin) und das SV-40 Poly-A-Signal. (B) Aufbau des Kontrollvektors pcDNA4/TO-Luc. Der Vektor enthält alle Elemente des pcDNA4/TO Vektors. Zusätzlich weist dieser Vektor das Gen für die Luciferase auf. Der Vektor dient als Reporter Kontrollplasmid zur Überprüfung der TetR-Expressionsstärke.

Ergebnisse 46

- Dox

+ Dox

0

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500**

Luci

fera

se A

ktiv

ität

[RLU

]

MiaPaC

a-2-TREx-3

MiaPaC

a-2-TREx-7

MiaPaC

a-2-TREx-1

0

MiaPaC

a-2-TREx-1

20

25000

50000

75000- Dox+ Dox

Luci

fera

se A

ktiv

ität

[RLU

]

A B Abb. 11: Luciferase Assay zur Überprüfung der Induktion der TetR-Expression in MiaPaCa-2-TREx Zellklonen. Zellen wurden transient mit dem Plasmid pcDNA4/TO-Luc transfiziert und 48h +/- Dox (1µg/ml) kultiviert. Nach Inkubation wurden die Zellen in Passive Lysis Buffer (PLB) der Firma Promega lysiert und die Luciferase-Aktivität am Luminometer gemessen. (A) Die Zugabe von Dox zeigt eine erhöhte Luciferase-Aktivität in allen hier dargestellten Zellklonen. (B) Für die Generierung der induzierbaren p16-Zelllinie wurde MiaPaCa-2-TREx-10 ausgewählt, da dieser die höchste Induktion mit einem Signifikanzniveau von p=0,0012 zeigte. Die Darstellung resultiert aus drei unabhängigen Experimenten. Dargestellt sind MW der gemessenen Luciferase-Aktivitäten + SEM.

3.3. Stabile induzierbare Expression von p16 in MiaPaCa-2- TREx Zellen

Zur regulierten induzierbaren Expression von p16 in den zuvor generierten Zellen (MiaPaCa-2-

TREx-10) wurde die cDNA von p16 in den induzierbaren Vektor (pcDNA4/TO) kloniert und mittels

einer zweiten stabilen Transfektion in diese Zellen transfiziert.

3.3.1. Klonierung der p16 cDNA in den induzierbaren Vektor pcDNA4/TO

Aus Vorarbeiten in der Arbeitsgruppe stand die cDNA von p16, kloniert in das Plasmid pRC-CMV,

bereits zur Verfügung (Plath et al., 2000). Die cDNA von p16INK4a wurde mit den

Restriktionsenzymen Hind III und Kpn I aus dem Vektor pRC-CMV ausgeschnitten und isoliert. Der

Vektor pcDNA4/TO wurde ebenfalls mit diesen beiden Enzymen verdaut und mit dem geschnittenen

p16 Insert ligiert und in E.coli (Top 10 Zellen, Invitrogen) transformiert. Die schematische Darstellung

der Klonierung ist in Abbildung 12 abgebildet. Nach Vermehrung in E.coli Zellen und der

Plasmidisolierung wurden die Konstrukte in Restriktionsansätzen auf den korrekten Einbau der p16

cDNA kontrolliert. Anschließend wurde die DNA mittels Sequenzierung überprüft.

Ergebnisse 47

p16INK4aHind III Kpn I Abb. 12: Klonierung des induzierbaren pcDNA4/TO-p16 Konstrukts. Die cDNA von p16INK4a und der Vektor pcDNA4/TO wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen Hind III und Kpn I geschnitten und anschließend ligiert. Der Vektor enthält eine Ampicillin und eine Zeozin Resistenz. Der CMV Promotor (PCMV) stellt eine hohe Expression des eingebauten p16 Gens sicher. Direkt hinter dem Promotor liegt die Bindungsstelle für den Tet Repressor, die Tetrazyklin Operator-O2-Sequenz (2xTetO2).

3.3.2. Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie

Die stabile MiaPaCa-2-TREx Zelllinie aus Punkt 3.2., die das TetR Gen exprimiert, wurde mit dem

induzierbaren Vektor, pcDNA4/TO-p16 mittels Effectene (Quiagen) stabil transfiziert. Nach 48 h

wurden die Zellen passagiert und unter Selektionsdruck mit Zeozin (0,5 mg/ml) gesetzt. Nach drei bis

vier Wochen wurden Zellklone isoliert und expandiert. Diese Klone wurden anschließend mit

Doxyzyklin induziert und 48 h kultiviert. Die Analyse der p16 Expression erfolgte daraufhin auf

Proteinebene (Abb. 13). Die Zellklone zeigten unterschiedlich induzierbare p16 Expressionen.

Zusätzlich exprimierten die Klone unter nicht induktiven Bedingungen eine geringe Menge an p16.

Diese Basalexpression war in einigen Klonen höher als in anderen. Dieses Phänomen wurde auf die

unterschiedliche Durchlässigkeit des Promotors zurückgeführt und spielte eine wesentliche Rolle in

der Auswahl des geeigneten Zellklons. Der Zellklon 13 entsprach den Auswahlkriterien am besten,

d.h. er zeigt die höchste induzierbare p16 Expression mit der geringsten Basalexpression. Dieser

wurde für weitere Experimente ausgewählt.

Ergebnisse 48

Abb. 13: Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie. Die Zellklone wurden 48 h lang mit und ohne Dox kultiviert und anschließend auf Proteinebene analysiert. Dazu wurden 20 µg Ripa-Lysat in einem 12 % SDS-PolyAcrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer auf PVDF-Membran konnte p16 mit einem humanen Antikörper gegen p16 bei 16 kDa detektiert werden. In den meisten Zellklonen konnte eine starke p16-Expression induziert werden (Nr.10, 12, 13, 14). Dagegen zeigte Klon Nr. 11 keine p16 Expression bzw. Induktion. Der Zellklon mit der Nummer 13 wies die höchste p16 Expression mit geringster Basalexpression auf und wurde für weitere Experimente ausgewählt.

3.4. Funktionelle Analysen der induzierbaren MiaPaCa-2-TREx-p16 Zelllinie

Zur Charakterisierung der Effekte von p16 in vitro, wurden funktionelle Analysen betreffend des

Einflusses von p16 auf die Expression von pRb, auf die Zellproliferation und auf das

verankerungsunabhängige Zellwachstum durchgeführt.

3.4.1. Die Induktion von p16 in MiaPaCa-2 Zellen führt zu einer Abnahme von Rb

Wie schon in der Einleitung beschrieben, spielt p16 eine wesentliche Rolle im Zellzyklus,

insbesondere in der Vorbereitungsphase der DNA-Synthese, der G1-Phase. Zu der Wirkung von p16

gehört, dass die Phosphorylierung des Rb Proteins verhindert wird und es somit zu einem

Zellzyklusarrest in der G1-Phase kommt. Im Folgenden wurden die Auswirkungen der Restitution

von p16 auf den Zellzyklus in diesen Zellen untersucht. Um den Rb Status nach erfolgter p16

Induktion zu untersuchen, wurden die Zellen über 0 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h mit Doxyzyklin

induziert. Für jeden Zeitwert wurden Proteinlysate angefertigt und diese mittels Western Blot auf die

spezifische Expression von p16 und pRb analysiert (Abb. 14). Im Western Blot wurde eine deutliche

Induktion der Expression von p16 nach Doxyzyklinbehandlung im Vergleich zur Kontrolle (nicht

induzierten Bedingungen - Dox) nachgewiesen. Ab 24 h nach Induktion mit Doxyzyklin ist p16

Expression in den Zellen nachweisbar. Gleichzeitig führte die Induktion von p16 in den Zellen zu

einer Abnahme von pRb. Nach 96 h war pRb nicht mehr detektierbar.

Ergebnisse 49

Abb. 14: Induzierte p16 Expression führt zum Verlust von pRb. Zelllysate von induzierte MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern gegen p16 und pRb im Western Blot analysiert. 20 µg Zelllysat wurden in einem 12 % SDS-PAGE Gel aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte mit einem polyklonalen Antikörper gegen das humane p16 und mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes pRb. Die Induktion von p16 in den Zellen führt zu einer Abnahme von pRb bis zum vollständigen Verlust von pRb nach 96 h.

3.4.2. Der Einfluss von p16 auf das Wachstum der MiaPaCa-2 Zellen

Um den Einfluss von p16 auf das Wachstum der Zellen zu erfassen, wurde die Proliferation in den

Tumorzellen mit und ohne Behandlung von Doxyzyklin gemessen. Dazu wurden 2x 104 Zellen als

Triplikate in eine 24 Well-Platte ausgesät und mit und ohne Doxyzyklin (1 µg/ml) kultiviert. Alle 24 h

wurde die Zellzahl mittels Alamar blue Messung bestimmt. Abbildung 15 zeigt das Ergebnis von drei

unabhängigen Messungen. Durch die Induktion der p16 Expression durch Dox kam es zu einem leicht

verzögertem Wachstum im Vergleich zu den unbehandelten Zellen (- Dox). Im Durchschnitt wurde

das Wachstum unter p16 Induktion um 13 % gehemmt.

Abb. 15: Einfluss von p16 auf die Proliferation von MiaPaCa-2 Zellen. Induzierte man die Expression von p16 in MiaPaCa-2 Zellen, kam es zu einem um 13 % verzögertem Wachstum im Vergleich zur Kontrolle ohne Dox. Je 2x 104 Zellen wurden in 24 Well Platten als Triplikate ausgesät und mit und ohne Doxyzyklin kultiviert. Alle 48 h wurde das Medium gewechselt und frisches Dox zugegeben. Täglich wurde die Anzahl an vitalen Zellen mittels Alamar blue Messung bestimmt. Dargestellt ist die Auswertung dreier unabhängiger Experimente (p= 0,0132 im gepaarten t-test).

Ergebnisse 50

3.4.3 Der Einfluss von p16 auf das verankerungsunabhängige Wachstum

Weiterhin sollte getestet werden, ob eine p16 Restitution zu einer reduzierten Tumorigenität der

entsprechenden Zellen führt. Dazu wurde ein Softagartest durchgeführt, in dem Zellen ohne Zell-

Zellkontakt und ohne Zell-Matrixkontakt in einer inerten Matrix (Agar-Agar) immobilisiert werden.

Die Fähigkeit in dieser Matrix Kolonien zu bilden, ist ein Zeichen der Tumorigenität der Zellen.

Zudem kann so die in vivo Situation gut nachgeahmt werden. Zusätzlich ist es möglich, die

Auswirkungen der p16 Expression auf das Wachstum bzw. die Tumorigenitäten zu untersuchen. Der

HTCA (Koloniebildungsassay) zeigt, dass in p16 exprimierenden Zellen 30 % weniger Kolonien

wachsen. Jedoch erreichen diese Beobachtungen nicht das Signifikanzniveau (p<0,05).

- Dox + Dox0

100

200

300

400

Anz

ahl d

er K

olon

ien

Abb. 16: Die induzierte p16 Expression reduziert die Koloniebildung von MiaPaCa-2 Zellen. MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen wurden +/- Dox in Agar inkubiert. Nach 10 Tagen wurden die Kolonien ausgezählt. P16 exprimierende Zellen (+ Dox) bildeten 30 % weniger Kolonien als Zellen ohne p16 (- Dox). Dargestellt ist die Auswertung dreier unabhängiger Experimente.

3.5. Charakterisierung der in vivo Effekte von induzierter p16 Expression nach orthotoper Xenotransplantation

Zur Charakterisierung der Effekte von p16 auf Tumorwachstum, Invasivität, hämatogene und

lymphogene Metastasierung von humanen Pankreaskarzinomzellen wurden das

Tetrazyklin-induzierbare System und das orthotope Xenotransplantationsmodell in der Maus

miteinander kombiniert.

3.5.1. Das orthotope Modell

Im Rahmen von anderen Arbeiten konnte in unserer Gruppe ein orthotopes Pankreaskarzinommodell

nach der Methode nach Alves et al. etabliert werden (Alves et al., 2001). Im Vergleich zum

subkutanen Modell simuliert es nicht nur die reale Situation im Pankreaskarzinom besser, es lassen

Ergebnisse 51

sich neben Tumorwachstum, Angiogenese und Lymphangiogenese auch zusätzliche Parameter

bestimmen wie das invasive Wachstum in Nachbarorgane sowie lymphogene und hämatogene

Metastasierung. Entscheidend für den Verlauf und die Prognose der humanen Erkrankung sind neben

der hämatogenen und lymphogenen Metastasierung die Ausbildung typischer Komplikationen

(Ikterus, Aszites, Magenausgangstenose), die durch die anatomische Lage des Pankreas bedingt sind.

Diese potentiellen Komplikationen können sich nur im orthotopen Modell ausbilden.

Diesen Vorteilen gegenüber steht ein hoher technischer Aufwand der orthotopen Implantation und der

längeren Anwachsrate der Tumore. Außerdem besteht keine Möglichkeit, das Tumorwachstum

kontinuierlich zu bestimmen. Dies ist mit dem vorliegenden System nur im Rahmen einer Sektion

möglich.

3.5.2. Orthotope Implantation der MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen

Die neu etablierte Zelllinie MiaPaCa-2-TREx-p16 wurde orthotop in immundefiziente Nacktmäuse

xenotransplantiert. Hierfür wurden 2 Gruppen à 12 Tiere verwendet, da durch die komplizierte

Operationstechnik Komplikationen wahrscheinlich waren. Aus jeder Gruppe musste eine Maus

aufgrund fehlerhafter Implantation getötet werden. Somit verblieben je Gruppe 11 Tiere. Die erste

Gruppe diente als Kontrollgruppe (-Dox), die zweite als p16 exprimierende Gruppe (+Dox). Der

narkotisierten Maus wurde zur Implantation der Bauchraum geöffnet. Durch extraperitoneale

Verlagerung des Magens konnte der Pankreaskopf freigelegt und in diesen 1x 106 Zellen injiziert

werden (Abb. 17). Nach Rückverlagerung der Organe in die Bauchhöhle und schichtweisem

Bauchdeckenverschluss wurden die Tiere 2-mal wöchentlich gewogen und hinsichtlich des

Allgemeinzustandes beurteilt. Die Doxyzyklingabe erfolgte über das Trinkwasser, das alle drei Tage

gewechselt wurde. Zusätzlich wurde dem Trinkwasser in beiden Tiergruppen (+ und – Dox) Sucrose

zugesetzt, um den bitteren Geschmack des Doxyzyklins zu mindern. Nach acht Wochen wurde der

Versuch beendet und die Tiere durch zervikale Dislokation getötet.

Abb. 17: Orthotope Implantation der Zellen in die Nacktmaus. (A) Dargestellt ist der geöffnete Bauchraum einer Maus mit freigelegten Magen und Pankreas. 1x 106 Zellen, resuspendiert in PBS, wurden direkt in den Kopf des Pankreas injiziert. Nach erfolgreicher Implantation entsteht eine typische Blase (B).

Ergebnisse 52

Acht Wochen nach orthotoper Implantation mit und ohne Behandlung mit Doxyzyklin wurde der

Versuch beendet und die Mäuse aufgearbeitet. Eine beispielhafte Sektion ist in Abbildung 18

dargestellt. Für jede Gruppe (- / + Dox) ist ein Tier dargestellt. Der Situs wurde geöffnet und die

Organe freigelegt. Um den Grad der Tumorinvasion zu bestimmen, wurde während der Sektion

beurteilt mit welchen Organen der Primärtumor verwachsen ist. Es waren keine signifikanten

Veränderungen in der Häufigkeit von invasivem Wachstum in Nachbarorgane zu beobachten. Wie aus

Tabelle 4 ersichtlich, waren nur vereinzelt Tumore aus der nicht-induzierten Gruppe mit dem

Duodenum oder dem Magen verwachsen. Dagegen wurden in der p16 induzierten Gruppe (+ Dox)

keinerlei Tumorinvasionen in andere Gewebe festgestellt.

Anschließend wurde der Primärtumor entnommen, dreidimensional vermessen und gewogen. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Nach der Tumorentnahme wurden weitere Organe auf

Metastasen untersucht. Mesenteriale Lymphknoten und Lymphknoten aus dem Leberhilus wurden

zusätzlich entnommen.

Abb. 18: RBeispielhaft für jede Gruppe (-/+ Dox) ist eine abdomine

eduktion des Tumorvolumens durch p16 Restitution. lle Sektion einer Maus dargestellt. Der Primärtumor

(PT) ist schwarz umrandet. Weitere Organe wie Magen, Duodenum, Milz, Leber und Darm wurden auf Invasion des Tumors in diese Gewebe und auf Metastasen untersucht.

Ergebnisse 53

Tab. 4: Abdominelle Sektion der Mäuse. t und die Tiere hinsichtlich der Größe der Primärtumore und deren

Der Versuch wurde nach 8 Wochen beendeInvasion in benachbarte Gewebe untersucht. 0 bedeutet keine Invasion vorhanden; 1 bedeutet Invasion war positiv für das entsprechende Gewebe. Danach wurden die PT entnommen, gewogen und vermessen.

Invasion pisch (makrosko

sichtbar) Tiernummer Dox -Gewicht [g] -Volumen [mm3] agen eber ilz PT PT Duodenum M L M1 - 1,070 871 0 0 0 0 2 - 0,370 326 0 0 0 0 3 - 0,380 312 0 0 0 0 4 - 0,372 532 0 0 0 0 5 - 0,384 404 0 0 0 0 6 - 0,858 1032 1 0 0 0 7 - 0,650 826 1 0 0 0 8 - 0,465 523 0 0 0 0 9 - 0,615 1259 0 0 0 0 10 - 0,460 652 1 1 0 0 11 - 0,507 479 1 1 0 0 Mittelwert

- 0,557 +/- 0,06853 656 +/- 92,21 4/11 2/11 0/11 0/11 +/- SEM 12 + 0,522 340 0 0 0 0 13 + 0,300 221 0 0 0 0 14 + 0,551 1157 0 0 0 0 15 + 0,270 163 0 0 0 0 16 + 0,730 946 0 0 0 0 17 + 0,180 154 0 0 0 0 18 + 0,068 27 0 0 0 0 19 + 0,630 703 0 0 0 0 20 + 0,577 437 0 0 0 0 21 + 0,754 1367 0 0 0 0 22 + 0,016 21 0 0 0 0 Mittelwert

0,07894 142 +/- SEM + 0,418 +/- 503 +/- 0/11 0/11 0/11 0/11

Zur Überprüfung der p16 Expression wurden 7 µm dicke Gefrierschnitte des Primärtumors angefertigt

ierten Gruppe wurde keine signifikante p16 Expression detektiert.

Analysen nicht berücksichtigt.

3.5.4. Immunhistochemischer Nachweis der p16 Induktion

und mit einem polyklonalen Antikörper gegen das humane p16 gefärbt. Die Ergebnisse sind in

Abbildung 19 und 20 dargestellt.

In den Tumoren der nicht induz

Lediglich in den Tumoren 2, 4 und 9 konnte eine geringe Basalexpression des p16-Proteins beobachtet

werden, die wahrscheinlich auf die Durchlässigkeit des Promotors zurückzuführen ist. Im Vergleich

dazu ist die p16 Expression in der mit Dox behandelten Gruppe (+ Dox) in einigen Tumoren deutlich

induziert. In den Tumoren 12, 15, 16, 21 ist p16 dagegen nur gering induziert worden. Vergleicht man

die Tumorgrößen aus Tabelle 4 mit der p16 Expressionsstärke fällt auf, dass die p16 Expression mit

der Tumorgröße korreliert. Je höher die p16 Expression war, desto kleiner war der Tumor. Es konnte

also nicht in allen Tieren von einer erfolgreichen Induktion ausgegangen werden. Ein Grund für die

unzureichende Induktion könnte der hohe Selektionsdruck gegen p16 sein, was aber später noch

diskutiert wird. Die Tumore mit sehr geringer Induktion (12, 15, 16 und 21) wurden für die weiteren

Ergebnisse 54

Abb. 19: Immunhistochemische Analyse der p16-Expression an Primärtumorgewebe der nicht induzierten Gruppe (-Dox). Gefrierschnitte der Primärtumore wurden angefertigt und mit einem polyklonalen Antikörper gegen p16 gefärbt. Gezeigt sind Aufnahmen einer 20-fachen Vergrößerung. Es konnte in den Tumoren der nicht induzierten Gruppe keine signifikante p16 Expression detektiert werden. Als Vergleich wurde eine Negativkontrolle (neg) mitgeführt. Lediglich in den Tumoren 2, 4 und 9 konnte eine leichte p16 Expression im Cytoplasma detektiert werden, was wahrscheinlich auf die Durchlässigkeit des Promotors im nicht-induktiven Zustand zurückzuführen ist.

Ergebnisse 55

Abb. 20: Immunhistochemische Analyse der p16 Expression in Tumoren der induzierten Gruppe (+Dox). Gefrierschnitte der Primärtumore wurden angefertigt und mit einem polyklonalen Antikörper gegen p16 gefärbt. Gezeigt sind Aufnahmen einer 20-fachen Vergrößerung. Nicht alle Tumore zeigten eine p16 Expression. Tumore mit den Nummern 12, 15, 16 und 21 schienen kein oder nur sehr wenig p16 zu exprimieren. In den restlichen Tumoren konnte p16 mit jeweils unterschiedlich starker Expression detektiert werden. Als Vergleich dient eine positive Kontrolle (Pos.), ein Pankreas Normalgewebe mit deutlicher Expression von p16.

Ergebnisse 56

3.5.5. Der Einfluss von p16 auf das Tumorwachstum

Zur Beurteilung von Tumorgröße und –gewicht erfolgte wie schon erwähnt eine abdominale Sektion.

Der Primärtumor wurde entnommen, dreidimensional vermessen und gewogen. Die Mittelwerte der

Tumordaten aus Tabelle 4 sind in Abbildung 21 graphisch dargestellt. Anhand der Abbildung erkennt

man eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens und des Gewichts in der p16 induzierten Gruppe

(+ Dox) im Gegensatz zur Kontrollgruppe (- Dox). Für jede Gruppe sind beispielhaft die

entsprechenden p16 immunhistochemischen Färbungen gezeigt (Abb. 21A). Das durchschnittliche

Tumorgewicht in der p16 induzierten Gruppe (298 mg) ist um 46 % geringer als in der Kontrollgruppe

(557 mg) während das durchschnittliche Tumorvolumen mit 267 mm³ um 60 % gegenüber der

Kontrollgruppe (656 mm³) reduziert ist. Der Vergleich der Einzelwerte ergab bei der Analyse des

Tumorgewichts ein Signifikanz von p=0,038 und bei der des Tumorvolumens eine Signifikanz von p=

0,019. Diese Daten zeigen, dass eine Restitution von p16 in vivo zu einem reduzierten

Tumorwachstum führt.

Abb. 21: Die induzierte p16 Expression vermindert das Tumorwachstum. (A) p16 Immunhistochemie für je einen PT aus jeder Gruppe (+/- Dox) (B). Die Daten der Tumorgewichte und -volumina sind Mittelwerte (+SEM aus n=11 Tieren in der (–Dox)-Gruppe und n=7 Tiere in der (+Dox)-Gruppe. Signifikanzniveau p<0,05 (unverbundener t-Test) erreicht im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (-Dox). Der Vergleich der Einzelwerte ergibt bei der Analyse des Tumorgewichts eine Signifikanz von p= 0,038 und bei der des Tumorvolumens eine Signifikanz von p= 0,019.

Ergebnisse 57

3.5.6. Der Einfluss der p16-Überexpression auf die Tumorangiogenese

Da Angiogenese eine wesentliche Voraussetzung für das Tumorwachstum ist, sollte im Folgenden die

Tumorangiogenese untersucht werden. Ausgangspunkt der histologischen Untersuchungen war die

HE-Färbung der Primärtumore zur Darstellung der Morphologie.

Die tumorassoziierte Angiogenese wurde über die Bestimmung der Blutgefäßdichte (MVD) erfasst.

Hierzu erfolgte eine immunhistochemische Färbung mit dem monospezifischen Antikörper gegen das

endothelspezifische CD31. CD31 ist ein 140 kDa schweres Glykoprotein, das wichtig ist für die

Interaktion zwischen benachbarten Endothelzellen wie auch zwischen Endothelzellen und Leukozyten.

Das Anfärben von Gefäßen mit CD31 zeigte, dass dieser zur Beurteilung von Neoangiogenese in

verschiedenen Tumorentitäten genutzt werden kann. Die Quantifizierung der Angiogenese erfolgte

nach dem Protokoll von Weidner (Weidner et al., 1991; Weidner et al., 1993). Beispielhafte CD31

immunhistochemische Färbungen und die Auswertung der Zählungen sind in Abbildung 22

dargestellt. Daraus ist ersichtlich, dass die Mittelwerte der Gefäßanzahl in der induzierten p16 Gruppe

signifikant um 34 % reduziert sind (p= 0,0210). Der Mittelwert der Blutgefäßdichte (MVD) liegt in

der p16-induzierten Gruppe (+ Dox) bei 35 und in der uninduzierten Gruppe (- Dox) bei 53 Gefäßen.

Um auszuschließen, dass generell kleine Tumoren eine geringe MVD haben und damit der

beobachtete Effekt nur eine Folge der p16 induzierten Größenabnahme ist, wurden alle Mittelwerte

der MVD gegen die Tumorgröße bzw. das Tumorgewicht aufgetragen. Die Verteilung zeigte, dass die

Anzahl der Gefäße nicht vom Tumorgewicht abhängt. Somit korreliert die Gefäßdichte nicht mit der

Tumorgröße (Abb. 22C).

Für das Wachstum des Tumors müssen Blutgefäße in den Tumor eindringen, um die Nähr- und

Sauerstoffversorgung der Tumorzellen zu gewährleisten. Durch die Induktion von p16 in den Tieren,

wurde scheinbar die Blutgefäßbildung als auch das Eindringen von Blutgefäßen in das Tumorgewebe

reduziert. Damit erscheint die verringerte MVD ursächlich an der Inhibition des Tumorwachstums

beteiligt zu sein.

Ergebnisse 58

Abb. 22: Der Einfluss von p16 auf die Tumorangiogenese. (A) Immunhistochemische Färbungen der Primärtumore mit monospezifischen Antikörper gegen CD 31. Beispielhaft ist eine Färbung aus jeder Gruppe (-/+ Dox) gezeigt. Im Gegensatz zur (+ Dox) Gruppe beobachtet man in Primärtumoren der (– Dox) Gruppe typischerweise ein dichtes kapillares Gefäßnetz, welches den ganzen Tumor durchzieht. (B) Dargestellt sind die Mittelwerte der Blutgefäßdichte (MVD) + SEM aus n=11 Tiere (- Dox) und n=7 Tiere (+ Dox). Der MVD-MW für die (+ Dox) Gruppe liegt bei 35 und in der (- Dox) Gruppe bei 53 Gefäßen. Die MVD ist in der (+ Dox) Gruppe um 34 % reduziert. Signifikanzniveau p< 0,05 versus unbehandelter Gruppe (- Dox) im unverbundenen t-Test. Der Vergleich der Einzelwerte ergibt bei der Analyse der MVD eine Signifikanz von p= 0,0210. (C) Alle gemittelten Werte der MVD aus beiden Gruppen (+/- Dox) wurden gegen das Gewicht aufgetragen. Die Verteilung zeigt, dass die Anzahl der Gefäße nicht vom Tumorgewicht abhängt und somit nicht mit der Tumorgröße korreliert.

Ergebnisse 59

3.5.7. Der Einfluss von p16 auf die Lymphangiogenese

Neben den Blutgefäßen ist auch das Lymphgefäßsystem an der Verbreitung von Metastasen beteiligt.

Eine Eigenschaft vieler maligner Tumore ist die Absiedelung von Tumorzellen über das Lymphsystem

in regionale Lymphknoten. Deswegen sollte das Ausmaß der Lymphangiogenese unter induzierter p16

Restitution untersucht werden. Der Einfluss von p16 auf die Lymphangiogenese wurde über die

Anzahl der Lymphgefäße im Tumor untersucht. Hierzu wurden 7 µm Gefrierschnitte des Tumors

angefertigt und mit einem Antikörper gegen den Lymphendothelmarker LYVE-1, der

Lymphendothelien aber nicht Gefäßendothelien detektiert, gefärbt. LYVE-1 ist ein wichtiger Rezeptor

auf Lymphgefäßwänden, der das in der extrazellulären Matrix vorkommende Glycosaminoglycan

Hyaloronan (HA) bindet. Durch Auszählen vier großer Tumorareale sollten Lymphendothelien nach

Lyve-1 Färbung quantifiziert und somit das Maß der Lymphangiogenese als Lymphgefäßdichte

(LVD) bestimmt werden. Die Mittelwerte dieser Auszählungen sind in Abbildung 23B dargestellt. Die

Daten zeigen, dass die Anzahl der Lymphgefäße bei Induktion von p16 signifikant reduziert waren (p=

0,009). Die Mittelwerte der LVD in der induzierten p16 Gruppe (+ Dox) ist mit durchschnittlich 13,8

Gefäßen um 36 % geringer im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (- Dox) mit 21,5 Gefäßen. Dieser

Effekt ist ebenfalls nicht primär abhängig von der Tumorgröße, da die Gefäßdichte auch hier nicht mit

der Tumorgröße korreliert (Abb. 23C). In vielen Tumoren konnte man Lymphgefäße beobachten, die

mit Tumorzellen ausgefüllt waren (Abb. 23A). Dieser Vorgang der Lymphangiosis carcinomatosa

wird als Vorstufe der Metastasierung in Lymphknoten angesehen.

Ergebnisse 60

Abb. 23: Immunhistochemischer Nachweis der Lymphendothelien mittels Lyve-1 Färbung. (A) Immunhistochemische Färbung mit einem monospezifischen Antikörper gegen LYVE-1. Es ist aus jeder Gruppe (-/+ Dox) eine Färbung eines Primärtumors beispielhaft gezeigt. Angefärbte Lymphgefäße in der – Dox Gruppe (20-fache Vergrößerung) zeigt das Umschließen von Tumorzellen. Aufnahme der Färbung aus der (+ Dox) Gruppe ist 10-fach vergrößert aufgenommen. (B) Dargestellt sind die MW + SEM aus n=11 Tieren (- Dox) und n=7 Tiere aus (+ Dox) Gruppe. Die MW der Lymphgefäßdichte (LVD) in der induzierten p16 Gruppe war mit 13,8 Gefäßen signifikant um 36 % reduziert im Vergleich zu 21,5 Gefäßen der nicht induzierten Gruppe. Der Vergleich der Einzelwerte ergab bei der Analyse der LVD eine Signifikanz von p=0,009. (C) Alle MW der LVD aus (+/- Dox) wurden gegen das Gewicht aufgetragen. Die Verteilung zeigt, dass die LVD nicht vom Tumorgewicht abhängt und somit nicht mit der Tumorgröße korreliert.

Ergebnisse 61

3.5.8. Der Einfluss von p16 auf die Metastasierung

Angiogenese ist wesentlich am Vorgang der Metastasierung beteiligt. In den vorherigen Abschnitten

konnte bereits gezeigt werden, dass p16 einen reduzierenden Einfluss sowohl auf die hämatogene als

auch auf die lymphogene Angiogenese hat. In diesem Abschnitt soll ein möglicher Zusammenhang

zwischen der Reduktion der Gefäßanzahl durch p16 und der Metastasierung untersucht werden.

Makroskopisch konnten während der Sektion keine Metastasen gefunden werden. Zur Beurteilung der

Metastasierung in relevante abdominelle Lymphknoten wurden jeder Maus der im Leberhilus

gelegene Lymphknoten und der mesenteriale Lymphknoten entnommen, in Flüsssigstickstoff

schockgefroren und histologisch untersucht.

Zur Identifizierung der Lymphknotenstruktur wurde zunächst eine HE-Färbung an 7 µm dicken

Gefrierschnitten der entnommenen Lymphknoten angefertigt. Um Metastasen befallene Lymphknoten

letztendlich zu verifizieren, wurden humane epitheliale Tumorzellen immunhistochemisch mittels

einer human spezifisch Panzytokeratinfärbung nachgewiesen (Turner et al., 2001). Pan-Zytokeratin

gehört zur Familie der Zytokeratine, die als Tumormarker u. a. für disseminierte Karzinomzellen im

Blut und in den Lymphknoten eingesetzt werden. Zytokeratine sind Proteine, die in den Zellen ein

Stützgerüst bilden und sie so stabilisieren. In Abbildung 24 ist eine typische Panzytokeratinfärbung

gezeigt.

Abb. 24: Panzytokeratinfärbung der Lymphknotenmetastase einer (-Dox) Maus. 7 µm Gefrierschnitte eines Lymphknotens wurden angefertigt und mit dem human spezifischen Antikörper gegen Pan-Zytokeratin gefärbt. (A) 10fache Vergrößerung. (B) 20fach vergrößerter Ausschnitt von (A) Lymphozyten sind blau gefärbt, postitiv angefärbte Tumorzellen erscheinen rot.

Die Auswertung der Färbungen ist in Tabelle 5 und zusammenfassend in Abb. 25 dargestellt. In 10

von 11 untersuchten Leberhilus-Lymphknoten aus der nicht induzierten (-Dox) Gruppe wurden

positive Lymphknotenmetastasierungen festgestellt. Dagegen konnten in der p16 induzierten Gruppe

in 6 von 9 Lymphknoten Metastasen nachgewiesen werden. Das heißt, dass in der nicht-induzierten

Gruppe 90 % der Lymphknoten und in der p16 induzierten Gruppe nur 27 % der Lymphknoten mit

Tumorzellen befallen waren (Abb. 25). Das Signifikanzniveau lag im Fisher´s exact Test bei p=

0,0166. Die mesenterialen Lymphknoten waren dagegen alle unauffällig.

Ergebnisse 62

Tab. 5: Beurteilung der Lymphknotenmetastasierung. Die Lymphknoten wurden mit HE und Panzytokeratin immunhistochemisch angefärbt. Die Auswertung im Hinblick auf Metastasierung ist in der Tabelle dargestellt. In der uninduzierten (-Dox) Gruppe waren 10 von 11 LK im Leberhilus positiv (+) nach Panzytokeratin-Färbung. In der (+Dox) Gruppe waren dagegen nur 6 positiv und 3 negativ (-). Die mesenterialen LK waren alle unauffällig. Abk.: (LK) Lymphknoten, (LH) Leberhilus, (LK mes) mesenterialer Lymphknoten

Tiernummer Dox Zytokeratin LK LH

Zytokeratin LK mes

HE LH

HE LK mes

1 - + - + - 2 - - - - - 3 - + - - - 4 - + - + - 5 - + - + - 6 - + - + - 7 - + - + - 8 - + - + - 9 - + - + -

10 - + - + - 11 - + - + -

Summe - 10/11 pos 0/11 pos. 9/11 pos 0/11 pos 12 + + - + - 13 + - - - - 14 + + - + - 15 + - - - - 16 + + - + - 17 + Kein LK - Kein LK - 18 + + - - - 19 + Kein LK - - - 20 + + - + - 21 + + - + - 22 + - - - -

Summe - 6/9 pos 0/11 pos. 5/9 pos. 0/11 pos

- Dox + Dox0

2

4

6

8

10

12 Leberhilus positiv negativ

*

Anz

ahl d

er T

iere

Abb. 25: Metastasierung in Leberhilus-Lymphknoten. Gefrierschnitte der Leberhilus Lymphknoten wurden angefertigt und mit Panzytokeratin immunhistochemisch gefärbt. In der nicht induzierten Gruppe waren 90 % (10/11) der Leberhili mit Tumorzellen befallen, während in der p16-induztierten Gruppe nur 27 % (3/9) der Leberhili positiv befallen waren. Das Signifikanzniveau lag bei p= 0,0166 im Fisher´s exact test.

Ergebnisse 63

Bei Gegenüberstellung der Ergebnisse der Metastasierung und der endothelialen sowie

lymphendothelialen Vaskularisierung stellt man einen Zusammenhang bzw. eine Abhängigkeit fest.

Eine erhöhte Vaskularisierung (-Dox) geht mit einer verstärkten Metastasierung einher.

3.5.9. Der Einfluss von p16 auf die Expression proangiogener Faktoren im MiaPaCa-2 System

Anhand der letzten Abschnitte wurde gezeigt, dass die Induktion der p16 Expression zu einer

reduzierten Angiogenese und Lymphangiogenese führte. Die anti-angiogene Wirkung von p16 ist

bisher ungeklärt. Nahe liegend ist eine durch p16 veränderte Expression angiogener Faktoren wie

VEGF-A, VEGF-C und –D. Zur Untersuchung dieser Hypothese stand uns im Fall von VEGF-A ein

ELISA der Firma R&D zur Verfügung. Die Expression von VEGF-C und –D wurde anhand der

Western Blot Analyse überprüft. Dazu wurden die MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen synchronisiert und

mit und ohne Doxyzyklin für 48 h ohne FBS inkubiert. Die Zellkulturüberstände wurden im ELISA

und im Western Blot eingesetzt. Zusätzlich wurden Ripa-Lysate der entsprechenden Zellen hergestellt

und mittels Western Blot untersucht (Abb. 26). Im Fall der VEGF-A Expression zeigen die Daten

(nicht gezeigt) keine veränderte Expression nach Induktion der p16 Expression. Western Blot

Analysen mit Antikörpern gegen VEGF-C und –D zeigen ebenfalls keine Regulation dieser beiden

lymphogen wirkenden Faktoren. Angiopoietin-2 ist bereits im Wildtyp mittels ELISA nicht

nachweisbar, daher wurde hier wie erwartet keine Veränderung nach p16 Induktion gesehen.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass eine über p16 verminderte Angiogenese nicht über eine

Regulation der proangiogenen Faktoren VEGF-A, -C, -D und Ang-2 funktioniert.

VEGF-D

- + - + Dox

Lysate TCA

VEGF-C 31 kD

21kDa

Abb. 26: Induzierte p16 Expression hat keinen Einfluss auf die Expression von VEGF-C und –D. Zelllysate und TCA-Fällungen aus konditionierten Zellüberständen von induzierten und nicht induzierten MiaPaCa-2-TREx-p16 Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern gegen VEGF-C und –D im Western Blot analysiert. 50 mg Zelllysat und 100 µl TCA-Fällung wurden auf einem 15 % SDS-PAGE Gel aufgetragen. Der Nachweis erfolgte mit humanen monoklonalen Antikörper gegen VEGF-C und VEGF-D. Die Induktion der p16 Expression in den Zellen hat keinen Einfluss auf die Expression bzw. Sekretierung von VEGF-C und –D.

Ergebnisse 64

3.6. Untersuchungen zur Überexpression von Angiopoietin-2 im humanen Pankreaskarzinom

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die biologischen Effekte der Überexpression von Ang-2 im

Pankreaskarzinom durch die Kombination des Tetrazyklin-induzierbaren Systems mit der orthotopen

Xenotransplantation untersucht.

3.6.1. Das Tet-On System zur induzierbaren Expression von Ang-2 in MiaPaCa-2-Zellen

Um die biologischen Effekte einer Überexpression von Ang-2 zu analysieren, wurde auch hier die

Pankreaskarzinom Zelllinie MiaPaCa-2 gewählt. Neben den bereits erwähnten Vorteilen der

Tumorigenität in Mäusen zählt auch, dass die Zellen kein messbares Ang-2 endogen sezernieren. Um

die Vorteile der individuellen Induktion eines Gens zu jedem Zeitpunkt auszunutzen, wurde für dieses

Projekt das Tetrazyklin-induzierbare Tet-On System von Clontech gewählt. Das System unterscheidet

sich in seiner Wirkungsweise vom TREx System und wird aus diesem Grund separat erläutert (Abb.

27). Das Tet-Off /On System wurde erstmals 1992 von Gossen & Bujard beschrieben und wird bis

heute ständig weiterentwickelt. Grundlage für das System ist ein bakterielles Regulationssystem. In

E. coli wird das Gen für das Tetrazyclin-Resistenz-Operon vom Tn10 Transposon durch den Tet-

Repressor (TetR) negativ reguliert. In Anwesenheit von Tetrazyklin wird die Transkription durch

Bindung des Tet-Repressors an die tet-Operator Sequenz (tetO) blockiert (Hillen und Berens, 1994).

Die zwei Elemente, das Tet-R Protein und die TetO-Regulationssequenz liefern die Grundlage für

Tet-Off und Tet-On-Systeme. In dieser Arbeit wurde das Tet-On System verwendet. Das Tet-On

System ist dem Tet-Off sehr ähnlich, hat jedoch einen „reversen tet-Repressor“ (rTetR), der sich in

vier Aminosäuren vom Tet-R des Tet-Off Systems unterscheidet (Hillen und Berens, 1994; Gossen

und Bujard, 1995).

Durch die Fusion des reversen Tet-Repressors mit der VP 16 Aktivierungsdomäne des Herpes

simplex-Virus entstand der reverse Transaktivator (rtTA), der über Zugabe von Tetrazyklin in der

Zellkultur direkt reguliert werden kann. Aufgrund der durch Doxyzyklin, ein Tetrazyklinanalog,

bewirkten Konformationsänderung kann der rtTA an seine Tetrazyklinoperon Konsensusequenz

(Tetracyclin Responsives Element, TRE) binden und so die Transkription eines gewählten Gens, z.B.

Ang-2, aktivieren. In Abwesenheit von Dox findet keine Transkription statt.

Ergebnisse 65

Abb. 27: Funktionsschema des Tet-On Systems. Der reverse tet-Repressor (rTetR) wird von dem Plasmid pTet-On konstitutiv in hohen Dosen exprimiert. Erst durch Zugabe von Doxyzyklin, ändert sich seine Konformation und bindet an TRE (Tetrazyklin Responsive Element) und aktiviert die Transkription von Ang-2. Ohne Dox kann keine Bindung und somit keine Transkription stattfinden.

3.7. Stabile Expression des reversen Transaktivators (rtTA) in MiaPaCa-2 Zellen

In diesem System wird das Plasmid pTet-On als Regulatorplasmid zur konstitutiven Expression des

tet-Repressors verwendet (Abb. 28A). MiaPaCa-2 Zellen wurden stabil mit dem Plasmid pTet-On

transfiziert und mit Geneticin (G-418) unter Selektionsdruck gesetzt.

Nach 3-4 Wochen konnten Zellklone isoliert und expandiert werden. Der Nachweis der rtTA

Expressionsstärke kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. In der vorliegenden Arbeit wurde hierzu

das Luciferasegen als Reportergen eingesetzt. Dazu wurden die Zellen transient mit dem Plasmid

pTRE2hyg-Luc transfiziert und 48 h lang in An- und Abwesenheit von Dox inkubiert. Anschließend

wurde die induzierte Expression des Luciferasegens am Luminometer gemessen. In 19 % (5/26) der

getesteten Zellklone konnte eine Induktion festgestellt werden. Abbildung 29 zeigt die

Expressionsstärke des ausgewählten Klons. Die Expression konnte durch die Zugabe von Dox im

Vergleich zur nicht induzierten Kontrolle um das vierfache signifikant (p= 0,040) gesteigert werden.

Jedoch weist dieser Klon auch im abgeschalteten Zustand eine Luciferase Expression auf, die auf die

Durchlässigkeit des Promotors zurückzuführen ist. Der Zellklon MiaPaCa-2-Tet-On wurde für weitere

Experimente verwendet, da er im Vergleich zu den anderen getesteten Klonen die höchste Induktion

mit der gleichzeitig geringsten Basalexpression aufwies.

Ergebnisse 66

Wir konnten somit die erste Zelllinie zur stabilen Expression des tet-Repressors in MiaPaCa-2 Zellen

bereitstellen.

Abb. 28: Aufbau der Plasmide pTet-On und pTRE2hyg-Luc. (A) Das Plamid pTet-On (7,4 kb) enthält folgende Elemente: Einen konstitutiv aktiven Promotor des Cytomegalovirus, den „reverse tetracyclin-responsive transcriptional activator“ (rtTA), eine pUC Startstelle für die Replikation, das Resistenzmarkergen Ampicillin, die PolyA-Signalstelle von SV 40 und das Neomycin/Kanamycin Resistenzgen. (B) Der Vektor pTRE2hyg-Luc dient als Reporter Kontrollplasmid zur Überprüfung der rtTA-Expressionstärke des pTet-On-Plasmids, in transfizierten MiaPaCa-2 Zellen. Der Vektor enthält neben den Elementen des pTRE2hyg Plasmids, zusätzlich das Luciferasegen in der „multiple cloning site“ (MCS).

- Dox + Dox0

1000

2000

3000

MiaPaCa-2-Tet-On

*

Luci

fera

seak

tivitä

t[R

LU]

Abb. 29: Expressionsstärke des MiaPaCa-2-Tet-On Klons. Zellen wurden transient mit dem Plasmid pTRE2hyg-Luc transfiziert und 48 h +/- Dox kultiviert. Die Zellen wurden lysiert und die Luciferase Aktivität am Luminometer gemessen. Durch Zugabe von Dox kam es zu einer 4-fach induzierten Luciferase-Aktivität im Vergleich zur Kontrolle ohne Dox. Die Mittelwerte entstanden aus drei unabhängigen Experimenten, das Signifikanzniveau lag bei p=0,040 im uverbundenen t-test.

Ergebnisse 67

3.8. Stabil induzierbare Ang-2 Expression in MiaPaCa-2-Tet-On Zellen

Zur regulierten induzierbaren Expression von Ang-2 in den zuvor generierten Zellen (MiaPaCa-2-Tet-

On) wurde die cDNA von Ang-2 in den induzierbaren Vektor (pTRE2hyg) kloniert und mittels einer

zweiten stabilen Transfektion in diese Zellen transfiziert.

3.8.1. Klonierung der Ang-2 cDNA in den induzierbaren Vektor pTRE2hyg

Die cDNA von Ang-2, aus Vorarbeiten der Arbeitsgruppe in pSecTAg2/HygroA kloniert, und der

Vektor pTRE2hyg wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI geschnitten (Abb. 30). Nach

der Aufreinigung der Fragmente über ein 1 %iges Agarose Gel und Gelextraktionsisolation wurde das

aufgereinigte Fragment Ang-2 mit dem geschnittenem Plasmid ligiert und anschließend transformiert.

Nach Vermehrung in E.coli Zellen und der Plasmidisolierung wurden die Konstrukte in

Restriktionsansätzen auf den korrekten Einbau der Ang-2-cDNA kontrolliert. Zur Überprüfung wurde

die cDNA-Sequenz mittels Sequenzierung überprüft.

Abb. 30: Klonierung des induzierbaren pTRE2hyg-Ang-2 Konstrukts. pTRE2hyg enthält folgende wichtige Elemente: PCMV-1, den induzierbaren Promotor des Cytomegalovirus, das TRE Element, die Startstelle für die Replikation (origin), die Resistenzmarker Ampicillin und Hygromycin, das SV-40 Poly-A-Signal und die MCS (Multiple Cloning Site), in die die Ang-2 cDNA inseriert wurde. Die Klonierung erfolgte über die Schnittstellen BamHI und SalI.

Ergebnisse 68

3.8.2. Generierung der stabil induzierbaren MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zelllinie

Die Ang-2 Expression kann durch die Zugabe von Doxyzyklin induziert werden. Der Nachweis

erfolgte 48 h nach der Induktion mittels Western Blot Analyse. Außerdem wurden die Ang-2

Konzentrationen im konditionierten Medium mittels ELISA quantitativ bestimmt. Die Zellen wurden

hierfür ausgesät und in Medium mit und ohne Dox 48 Stunden kultiviert. Anschließend wurden im

konditionierten Medium die Ang-2 Sekretion der Zellen bestimmt. In Abbildung 31 ist die Ang-2

Induktion von zwei Zellklonen exemplarisch gezeigt. Die absoluten Ang-2 Konzentrationen des Klons

28 waren höher als die des Klons 58. Jedoch war die Expression im Vergleich zum nicht induzierten

Zustand in Klon 58 (10x) höher als im Klon 28 (9x). Aus diesem Grund wurde der Klon 58 für weitere

Experimente ausgewählt.

0

100000

200000

300000

9x 10x

Ang

-2 K

onze

ntra

tion

[pg/

ml]

Ang-2

- + - + Dox

28 58 MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2

68 kD

Klon

Abb. 31: Nachweis der Ang-2 Induktion in Überständen der MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zellen nach Doxyzyklin-Zugabe. 50.000 Zellen/24-well wurden ausgesät und 48 h in FBS-freien DMEM Medium +/- Dox inkubiert. Das Medium wurde abgenommen und die Ang-2 Sezernierung bzw. deren Induktion wurde mittels ELISA gemessen und im Western Blot analysiert. Für den ELISA wurden je 100 µl konditioniertes Medium eingesetzt und nach Protokoll verfahren. Die Ang-2 Konzentrationen wurden am Fluoreszenzreader bei 450 nm gemessen. Für den Western Blot wurden 50 µl des Überstandes auf ein 10 % SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf Nitrozellulose-Membran transferiert und anschließend mit dem Antikörper gegen Ang-2 bei 68 kDa detektiert. Durch Zugabe von Dox konnte in den Zellklonen 28/58 die Ang-2 Expression um das 9- bzw. 10-Fache induziert werden.

Ergebnisse 69

3.9. Tumorbiologische Charakterisierung der Effekte von induzierter Ang-2 Expression nach orthotoper Xenotransplantation

Zur Charakterisierung der tumorbiologischen Effekte von Ang-2 in humanen Pankreaskarzinomzellen

wurden auch in diesem Teil der Arbeit das Tetrazyklin-induzierbare System und das orthotope

Xenotransplantationsmodell in der Maus miteinander kombiniert.

3.9.1. Orthotope Implantation der MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 Zellen

Der unter 3.8. generierte Zellklon MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 wurde hinsichtlich der biologischen

Auswirkungen in vivo analysiert. Zur Charakterisierung der Effekte von Ang-2 auf Tumorwachstum,

Invasivität, hämatogene und lymphogene Metastasierung von humanen Pankreaskarzinomzellen sollte

der generierte Zellklon MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2 orthotop in SCID („severe combined

immunodeficiency“) Mäuse xenotransplantiert werden. Hierfür wurden pro Gruppe 10 Tiere

verwendet. Die orthotope Implantation erfolgte wie schon unter Punkt 3.5.2. beschrieben. Nach acht

Wochen wurde der Versuch beendet und die Tiere durch zervikale Dislokation getötet.

3.9.2. Induktion der Ang-2 Expression nach orthotoper Implantation mit Doxyzyklin

Insgesamt wurden die Tiere in 4 Gruppen á 10 Tiere unterteilt. Dieses experimentelle Design wurde

gewählt, um differenzierte Aussagen zur Ang-2 Wirkung in unterschiedlichen zeitlichen Phasen der

Tumorerkrankung treffen zu können.

1. Gruppe 1 ist die unbehandelte Kontrollgruppe. Die Tiere erhielten kein Doxyzyklin.

2. Gruppe 2 untersucht die Ang-2 Effekte in der Phase der Tumoretablierung, also in den ersten

4 Wochen nach Implantation. Diese Tiere erhielten in den ersten 4 Wochen Doxyzyklin über

das Trinkwasser.

3. Die Tiere in Gruppe 3 erhielten erst ab Woche 5 und bis zur 8. Woche Doxyzyklin. In dieser

Zeit kommt es, wie aus Vorexperimenten bekannt ist, zu invasivem Wachstum und

Metastasierung. Um die Auswirkung von Ang-2 auf diese Vorgänge zu untersuchen, wurde in

diesem Zeitraum Ang-2 induziert.

4. Tiere der Gruppe 4 erhielten über den gesamten Zeitraum (8 Wochen) Doxyzyklin.

Die Doxyzyklinzugabe (2 mg/ml) erfolgte über das Trinkwasser, das alle drei Tage gewechselt wurde.

Zusätzlich wurde dem Trinkwasser Succrose (5 %) zugesetzt, um den bitteren Geschmack des

Doxyzyklins zu mindern.

Ergebnisse 70

3.10. Effekte der induzierten Ang-2 Expression auf die Serum-konzentration von humanem Ang-2 im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Ang-2 wird ins Blut sezerniert und ist damit leicht nachweisbar. Nach vier Wochen wurde den Mäusen

unter Narkose retrobulbär Blut entnommen und spezifisch der humane Ang-2 Spiegel im Serum

mittels ELISA quantitativ überprüft. Die Mittelwerte der Konzentrationen in den einzelnen Gruppen

sind in Abbildung 32 graphisch dargestellt. Sowohl in der Kontrollgruppe ohne Dox-Zugabe als auch

bei den Tieren der Gruppe drei (Dox 5-8), die bis zu diesem Zeitpunkt noch kein Dox erhalten hatten,

konnte ein geringe Ang-2 Konzentration (13 und 27 pg/ml) nachgewiesen werden. Dies wurde auf die

Durchlässigkeit des Promotors zurückgeführt. Dagegen wiesen die Tiere der Gruppen zwei und vier,

in denen vier Wochen lang die Ang-2 Expression mit Dox induziert wurde, signifikant höhere

Konzentrationen an sezerniertem Ang-2 auf. Für Gruppe zwei (Dox 0-4) wurden durchschnittlich

52 pg/ml (p= 0,0124) und für Gruppe vier 38 pg/ml (p= 0,0388) quantifiziert.

Die Induktion der Ang-2 Expression wurde nach vier Wochen in Gruppe zwei gestoppt und in Gruppe

drei angeschaltet.

Nach acht Wochen Gesamtversuchszeit wurde der Versuch beendet und die Ang-2 Konzentration im

Serum der Mäuse mittels Ang-2 ELISA quantifiziert (Abb. 32B). Wie erwartet stiegen die Ang-2

Konzentrationen am Ende des Versuchs im Vergleich zur ersten Messung (nach vier Wochen) an. Die

Ang-2 Konzentrationen lagen nach acht Wochen im Bereich von 350-1178 pg/ml. In den Tieren der

Kontrollgruppe lag die durchschnittliche Ang-2 Konzentration ohne Induktionen aufgrund der

Durchlässigkeit des Promotors bei 250 pg/ml. Die Tiere aus Gruppe zwei (Dox 0-4) exprimierten im

Durchschnitt 737 pg /ml. Deutlich signifikant höhere Konzentrationen konnten in Gruppe drei und vier

gemessen werden. Auffallend war das die Tiere der Gruppe drei, die die letzten vier Wochen des

Versuchs Dox aufnahmen, die Ang-2 Sekretion mit 1143 pg/ml fast genauso hoch war wie in Tieren

der Gruppe vier (1178 pg/ml), in der Ang-2 über den gesamten Versuchszeitraum induziert wurde. Es

scheint, dass die Initiale Induktion der Ang-2 Expression nicht entscheidend für den Gesamtverlauf ist.

Ob diese Ang-2 Produktionen auch Einfluss auf das Tumorwachstum bzw. auf die Tumorgröße hatten,

wird im nächsten Abschnitt geklärt.

Ergebnisse 71

Gr.1 -D

ox

Gr. 2 +

Dox 0-

4

Gr. 3 +

Dox 5-

8

Gr. 4 +

Dox 0-

80

10

20

30

40

50

60

70

4 WochenA

ng-2

[pg/

ml]

**

Gr.1 - D

ox

Gr. 2 +

Dox 0-4

Gr. 3 +

Dox 5-8

Gr. 4 +

Dox 0-8

0

250

500

750

1000

1250

1500

8 Wochen

*****

Ang

-2 [p

g/m

l]

A B

Abb. 32: Quantifizierung des Ang-2 Spiegels in Blutseren der Mäuse nach 4 und 8 Wochen. (A) Vier Wochen nach Implantation wurde die Induktion von Ang-2 überprüft. Dazu wurde den Mäusen retrobulbär Blut entnommen und die Ang-2 Konzentration mittels Ang-2 ELISA bestimmt. Gruppe 1 und 3 zeigten die niedrigsten Konzentrationen mit 13 und 27 pg/ml, während die anderen zwei Gruppen höhere Konzentrationen aufwiesen. In Gruppe 2 war die Ang-2 Konzentration mit durchschnittlich 52 pg/ml signifikant erhöht (p= 0,0124). Die durchschnittliche Konzentration in Gruppe 4 war mit 39 pg/ml auch signifikant erhöht (p= 0,0388). (B) Nach acht Wochen wurde der Versuch beendet und die Ang-2 Konzentration im Blut nochmals mittels ELISA bestimmt. Die Tiere der Kontrollgruppe (Gr.1) wiesen die geringsten Ang-2 Konzentration (350 pg/ml) auf. Gruppe 2 (Dox 0-4) wies mit 737 pg/ml eine etwas höhere Konzentration auf. Signifikant höhere Konzentrationen wurden in Gruppe 3 (p= 0,0001) und 4 (p= 0,0028) gemessen (1143 und 1178 pg/ml). Dargestellt sind MW + SEM der gemessenen Ang-2 Konzentrationen bei n=7 Tiere für Gr. 1, n=9 für Gr. 2, n=9 für Gr.3 und n=9 Tiere für Gr. 4.

3.11. Einfluss der induzierten Überexpression von Ang-2 auf das Tumorwachstum im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Zur Beurteilung von Tumorgröße und –gewicht erfolgte eine abdominale Sektion der Tiere. Der

Primärtumor wurde entnommen, in drei Dimensionen vermessen und gewogen. Die ermittelten Daten

sind in Tabelle 6 aufgelistet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abbildung 33 dargestellt.

Zusätzlich geben die Daten Aufschluss über das Maß einer eventuellen makroskopisch erkennbaren

Invasion in andere Gewebe. Vor allem die Tumorinvasion in Duodenum und Magen war in (+Dox)

Mäusen häufiger zu finden als in Tieren der Kontrollgruppe (- Dox).

Ergebnisse 72

Tab. 6: Untersuchung der Primärtumore (PT) nach abdominaler Sektion der Mäuse. Der Versuch wurde nach acht Wochen beendet und die Tiere hinsichtlich der Größe der PT und deren Invasion in benachbarte Gewebe untersucht. Dazu wurden die PT auf Invasivität untersucht. Danach wurden die PT entnommen, gewogen und vermessen. 0: keine Invasion, 1: positive Invasion

Invasion (makroskopisch sichtbar)Gruppe Tiernummer Dox PT-Gewicht [mg] PT-Volumen [mm3] Duodenum Magen Leber Milz

1 - 436 407 0 1 0 01 2 - 213 492 1 1 0 0

- Dox 3 - 362 516 1 1 0 04 - 104 100 0 0 0 05 - 307 318 0 1 0 06 - 287 436 1 1 0 07 - 185 175 0 0 0 08 - 96 96 0 0 0 0

MW +/- SEM - 249+/- 120 318+/- 172 Summe 3/8 5/8 0 01 + 192 200 0 1 0 0

2 2 + 539 944 1 1 0 0Dox 0-4 3 + 387 576 1 1 0 0

4 + 316 361 0 1 0 05 + 437 896 1 1 0 06 + 276 288 0 1 0 07 + 641 504 1 1 1 18 + 368 400 0 0 0 0

MW +/- SEM + 395 +/- 144 521 +/- 272 Summe 4/8 7/8 1/8 1/81 + 488 710 1 1 0 0

Dox 5-8 3 + 420 686 1 1 1 04 + 350 284 0 1 0 05 + 320 426 0 1 0 06 + 360 686 1 1 0 07 + 281 255 0 1 0 08 + 233 498 1 1 0 09 + 113 130 1 0 0 0

MW +/- SEM + 321 +/- 115 459 +/- 223 Summe 5/8 7/8 1/8 01 + 450 174 1 1 0 0

4 2 + 347 391 1 0 0 0Dox 0-8 3 + 193 333 0 1 0 0

4 + 485 840 1 1 0 05 + 328 288 1 1 0 06 + 343 520 0 1 0 07 + 377 704 0 1 0 08 + 211 260 1 1 0 09 + 320 462 1 1 0 0

MW +/- SEM + 339 +/- 95 441 +/- 216 Summe 6/9 8/9 0 0

Im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (- Dox) war in allen anderen Gruppen sowohl das Volumen

als auch das Gewicht des Primärtumors erhöht (Abb. 33). Die Primärtumore aus Gruppe 1 (- Dox)

waren im Durchschnitt 318 mm3 groß und 249 mg schwer. Durch Induktion von Ang-2 in den Tieren

nahm sowohl das Tumorvolumen als auch das Tumorgewicht zu. Die Tumorgewichte waren in allen

drei Ang-2 exprimierenden Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht, wobei die PT-Gewichte

der Gruppe zwei und vier signifikant erhöht waren.

Eine Überexpression von Ang-2 führte also zu einem erhöhten Tumorwachstum. Das Tumorwachstum

wurde unabhängig vom Zeitpunkt der Ang-2 Induktionen durch Doxyzyklin gesteigert. Ob das Tumorwachstum zu krankheitsbedingten Komplikationen führte oder einen Einfluss auf die

Tumorangiogenese und Metastasierung hatte wird in den nächsten Abschnitten untersucht.

Ergebnisse 73

PT-Volumen

- Dox

Dox 0-4

Dox 4-8

Dox 0-8

0

150

300

450

600

750

Voum

en (m

m³)

A BPT-Gewicht

- Dox

Dox 0-4

Dox 4-8

Dox 0-8

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

**

Gew

icht

(g)

Abb. 33: Der Einfluss von Ang-2 auf das Tumorwachstum. Die Primärtumore wurden entnommen, vermessen und gewogen. Die Daten der Tumorvolumina (A) und –gewichte (B) sind MW + SEM. In Tieren, der Kontrollgruppe wurden im Durchschnitt kleinere Tumore beobachtet. Eine Überexpression von Ang-2 führte in den Tieren der anderen drei Versuchsgruppen zu einem erhöhten Tumorwachstum. Im Vergleich zur Kontrolle (- Dox) waren die MW+ SEM der Tumorgewichte der Gruppe 2 (Dox 0-4) signifikant erhöht (p=0,0205), wie auch in Gruppe 4 (Dox 0-8) zu beobachten war (p=0,033).

3.12. Ausbildung einer Pankreaskarzinom-typischen Komplikation während des Tumorwachstums

Ein Vorteil des orthotopen Modells ist die Nachahmung des klinischen Bildes der menschlichen

Erkrankung im Tierversuch. Entscheidend für den Verlauf und die Prognose der humanen Erkrankung

ist neben der Metastasierung die Ausbildung krankheitsbedingter Komplikationen, zu denen auch die

Ausbildung eines Ikterus gehört. Diese Komplikation trat in einem Fall der induzierten Gruppe (+Dox)

auf. Es kam bei der Maus zu einer typischen gelblichen Verfärbung der Haut, der Schleimhäute und

der Organe (Abb. 34). Diese Komplikation tritt häufig bei Tumoren der Leber und des Pankreas auf.

Durch eine Tumor-bedingte Verengung oder Verstopfung der Gallengänge innerhalb oder außerhalb

der Leber oder des Gallenganges staut sich der Gallenfarbstoff Bilirubin im Blut zurück und es kommt

zur so genannten „Gelbsucht“.

Ergebnisse 74

Abb. 34: Ikterus, eine typsiche Komplikation. (A) Gezeigt ist der geöffnete Situs der an Ikterus erkrankten Maus. Man erkennt deutlich die typische gelbe Verfärbung von Haut, Schleimhäuten und Organen. Leber und Lebermetastase (B) und Mesenterium (C) sind ebenfalls gelb verfärbt.

3.13. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Tumor-assoziierte Angiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Mit zunehmender Vergrößerung beginnt der Tumor durch gebildete Angiogenesefaktoren nahe

gelegene Blutgefäße zur Ausspriessung feiner Kapillaren anzuregen. Die quantitative histologische

Auswertung der Tumor-assoziierten Angiogenese erfolgte über die Bestimmung der Gefäßdichte

(MVD, microvessel density) (Weidner et al., 1991; Weidner et al., 1993). Dazu wurden von den

Primärtumoren 7 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt und diese mit einem monoklonalen Antikörper

gegen den Endothelzellmarker CD31 angefärbt. Die MW + SEM der Anzahl der Gefäße bzw. die

Gefäßdichte (MVD) sind in Abbildung 35 dargestellt. In Primärtumoren der Kontrolltiere (- Dox) war

die MVD mit 35 am niedrigsten. Im Gegensatz dazu war die MVD in den mit Doxyzyklin behandelten

Mäusen höher. Die Dauer der Ang-2 Expression hatte dabei keinen Einfluss auf die Gefäßdichte, die

in den drei Gruppen im Durchschnitt bei 52,5 Gefäßen lag. Die Gefäßdichte nahm im Tumor durch

Ang-2 Expression signifikant um 34 % zu. Das heißt die Hämangiogenese wurde durch Ang-2

gesteigert. Eine proangiogene Wirkung von Ang-2 konnte damit in diesem Modell nachgewiesen

werden. Im Weiteren soll der Einfluss von Ang-2 auf die Lymphangiogenese und Metastasierung

untersucht werden.

Ergebnisse 75

- Dox

Dox 0-4

Dox 5-8

Dox 0-8

0

10

20

30

40

50

60

CD 31

** ** *

Gef

äßdi

chte

[MVD

]

Abb. 35: Der Einfluss vDargestellt sind die M

on Ang-2 auf die Tumorangiogenese. W der ausgezählten Gefäße (MVD) + SEM. Primärtumore aus Gruppe 1 (- Dox) wiesen

In der Behandlung des humanen Pankreaskarzinoms ist die früh einsetzende lymphogene

r gegen

durchschnittlich 35 Gefäße auf. In den drei mit Dox behandelten Gruppen wurden im Mittel 53 Gefäße ausgezählt. Die Zunahme der MVD ist im Vergleich zur Kontrollgruppe (kein Dox) in allen drei Ang-2 exprimierenden Gruppen signifikant im unverbundenen t-Test (Dox 0-4, p= 0,0018; Dox 5-8, p=0,0089; Dox 0-8, p=0,0282).

3.14. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Lymphangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Metastasierung problematisch. Deswegen war der Einfluss von Ang-2 auf die Lymphangiogenese im

Pankreaskarzinom von besonderem Interesse. Seit einiger Zeit ist es möglich, mit Hilfe histologischer

Färbungen den Grad der Lymphangiogenese über die LVD (lymphatic vessel density) zu bestimmen.

In dieser Arbeit wurde die Lymphangiogenese nach induzierter Ang-2 Expression untersucht.

Dazu wurden 7 µm Gefrierschnitte der Primärtumore angefertigt und mit dem Antikörpe

Lyve-1, der nur Lymphendothelien detektiert, gefärbt. Durch Auszählen 4 großer Tumorareale wurde

das Maß der Lymphangiogenese bestimmt. Die Mittelwerte dieser Auswertung sind in Abbildung 36

dargestellt. Die Anzahl der Lymphgefäße war im Fall der Ang-2 Überexpression gering erhöht. In

Tieren der Kontrollgruppe ohne Ang-2 (- Dox) wurden im Mittel 15 Lymphgefäße gezählt. In den

Primärtumoren der anderen drei Gruppen wurden durchschnittlich 17 Lymphgefäßen gezählt.

Festzustellen ist, dass es bei Ang-2 Expression zu einer um 14 % gesteigerten Lymphgefäßbildung

kam. Jedoch erreichte diese Beobachtung nicht das Signifikanzniveau (p<0,05).

Ergebnisse 76

- Dox

Dox 0-4

Dox 5-8

Dox 0-8

0

5

10

15

20

25

Lyve-1

Anz

ahl d

erLy

mph

gefä

ße

Abb. 36: Der Einfluss von Ang-2 auf die Lymphangiogenese. Dargestellt sind MW der ausgezählten Lymphgefäße (LVD) + SEM. Der MW der Kontrollgruppe (kein Dox) liegt bei 15 Gefäßen. Für Gruppe 2, 3 und 4 wurden im Durchschnitt ein LVD von 17,4 ermittelt. Nach der Ang-2 Expression kam es zu einer 14,5 % verstärkten Lymphangiogenese.

3.15. Einfluss der induzierten Ang-2 Expression auf die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Die lymphatische Metastasierung betrifft beim Pankreaskarzinom häufig parapankreatische, im

Leberhilus gelegene Lymphknoten, paraaortale und mesenteriale Lymphknoten. Dagegen führt die

hämatogene Metastasierung am häufigsten zu Lebermetastasen. Im vorangegangenen Abschnitt wurde

eine erhöhte Vaskularisierung von Tumoren bei Ang-2 Expression gezeigt. Eine solche fördert eine

verstärkte Metastasierung, welche im Folgenden untersucht werden soll.

Zur Beurteilung der hämatogenen Metastasierung wurde zunächst makroskopisch die Leber beurteilt

und gegebenenfalls histologisch analysiert. Abbildung 37 zeigt beispielhaft die Sektion einer (+Dox)

Maus, bei der neben einem Tumor zusätzlich Lebermetastasen diagnostiziert wurden. Dieser Befund

konnte histologisch mittels HE-Färbung bestätigt werden. Zusätzlich wurde der Befall der Leber mit

Tumorzellen in Schnitten des Leberlappens durch HE-Färbung nachgewiesen. In dieser Maus wurden

außerdem Metastasen im Mesenterium beobachtet.

Ergebnisse 77

Abb. 37: Untersuchung der Metastasierung am Beispiel einer (+Dox) Maus. (A) Dargstellt ist der geöffnete Situs einer Ang-2-exprimierenden Maus mit großem Primärtumor (PT) und Lebermetastasen. (B) Bei Untersuchung des Mesenteriums konnten zusätzlich kleine Metastasen entdeckt werden. (C) Lebermetastasen wurden histologisch mittels einer HE Färbung bestätigt (10 fache Vergrößerung). (D) Auch in der Leber, makroskopisch nicht sichtbar, konnten Tumorzellen beobachtet werden, die mittels HE Färbung histologisch nachgewiesen wurden (20 fache Vergrößerung).

Die Ergebnisse aller untersuchten Tiere ist in Abbildung 38 graphisch dargestellt. Diese zeigt, dass

sich in der Kontrollgruppe (- Dox) keine Lebermetastasen entwickelten. Demgegenüber wurde bei

allen Ang-2 exprimierenden Tieren (Gruppe zwei bis vier) Lebermetastasen beobachtet: 50 % der

Lebern (4/8) waren in der Gruppe zwei (Dox 0-4) mit Metastasen infiltriert. Die Inzidenz von

Lebermetastasen in der Gruppe vier (Dox 0-8) betrug im Vergleich nur 22 % während sie für Gruppe

drei (Dox 5-8) bei 44 % (4 von 9) lag. Durch die Induktion der Ang-2 Expression kam es im

Gegensatz zur Kontrollgruppe zu einer Infiltration der Leber und der Ausbildung von Lebermetastasen

in 38 % der Tiere (Gruppe zwei bis vier). Jedoch erreichte diese Beobachtung, wahrscheinlich

aufgrund der geringen Fallzahlen, nicht das Signifikanzniveau (P<0,05).

Makroskopisch konnten wir somit nach Induktion der Ang-2 Expression durch Doxyzyklin eine

erhöhte Lebermetastasierung feststellen.

Ergebnisse 78

- Dox

Dox 0-4

Dox 4-8

Dox 0-8

0123456789

1011

positiv

negativ

n (T

iere

)

- Dox

+ Dox

0

10

20

30positiv

negativ

n (T

iere

)

A B

Abb. 38: Hämatogene Metastasierung in der Leber. Die Leber der Tiere wurde während der Sektion makroskopisch auf Metastasen hin untersucht. (A) Alle Tiere der Kontrollgruppe (- Dox) waren frei von Lebermetastasen. Dagegen wurden in der Gruppe zwei (Dox 0-4) in der Hälfte der Lebern Metastasen gefunden. Bei induzierter Ang-2 Expression während des gesamten Versuchszeitraums (Dox 0-8) waren 2 von 9 Lebern infiltriert. In der Gruppe, in der über die letzten vier Versuchswochen die Ang-2 Expression induziert wurde (Dox 5-8), kam es in 4 von 9 Fällen zu einer Lebermetastasierung. In Abbildung B sind die Ergebnisse aus A zusammenfassend dargestellt. Durch die Ang-2 Expression kam es in 38 % zu einer Lebermetastasierung.

Eine Eigenschaft vieler maligner Tumore ist die Absiedlung von Tumorzellen über das Lymphsystem

in regionale Lymphknoten. Speziell im Pankreaskarzinom sind lokale Lymphknoten frühzeitig von

Metastasen befallen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit einer der lokoregionären

Lymphknoten im Gebiet des Leberhilus während der Sektion der Versuchstiere entnommen und zur

Untersuchung histologisch aufgearbeitet. Zur Identifizierung der Lymphknotenstruktur wurde

zunächst eine HE-Färbung an 7 µm dicken Gefrierschnitten der entnommenen Lymphknoten

angefertigt. Um von Metastasen befallene Lymphknoten letztendlich zu verifizieren, wurden humane

epitheliale Tumorzellen immunhistochemisch mittels einer human spezifischen Panzytokeratinfärbung

nachgewiesen, wie bereits unter Punkt 3.5.8 beschrieben (Abb. 39). Alle Tiere der unbehandelten

Gruppe (- Dox) waren frei von Metastasen; es konnten in diesen Lymphknoten keine Tumorzellen

nachgewiesen werden. Demgegenüber waren in vielen der Ang-2 exprimierenden Tieren die

Lymphknoten von Tumorzellen befallen. In Gruppe 2 (Dox 0-4) waren 75 % (6 von 8) der

Lymphknoten positiv (p=0,007). In Gruppe 3 (Dox 5-8) waren 56 % (5 von 9) der Lymphknoten

positiv (p=0,033), während in Gruppe 4 (Dox 0-8) 67 % (6 von 9) positiv waren und das

Signifikanzniveau bei p= 0,011 lag. Insgesamt wurden in mehr als der Hälfte der untersuchten

Lymphknoten Tumorzellen nachgewiesen (39B). Wurde die Ang-2 Expression in den Tieren

angeschaltet kam es in allen behandelten Gruppen zu einer signifikant verstärkt auftretenden

Metastasierung. Dabei war es unerheblich zu welchem Zeitpunkt die Ang-2 Expression initiiert bzw.

gestoppt wurde. Zwischen den einzelnen mit Dox behandelten Gruppen gab es kaum Unterschiede

hinsichtlich der Metastasierung in Lymphknoten.

Ergebnisse 79

- Dox

Dox 0-4

Dox 5-8

Dox 0-8

0123456789

10111213

Leberhiluspositiv

negativ** * **

n (T

iere

)

- Dox

+ Dox0

10

20

30Leberhiluspositiv

negativ

**

n (T

iere

)

A B

Abb. 39: Lymphogene Metastasierung. Die Lymphknoten im Leberhilus wurden entfernt und immunhistochemisch mittels Zytokeratinfärbung ausgewertet. (A) Nach Expression in den ersten vier Wochen (Dox 0-4) waren bei 6 von 9 Tieren die Lymphknoten mit Tumorzellen befallen (p=0,007). Bei der Induktion in den letzten 4 Wochen des Experiments (Dox 5-8) kam es in 5 von 9 Fällen zu einem Lymphknotenbefall (p=0,0337). Ang-2 Expression in den Tieren für acht Wochen führte in 6 von 9 Fällen zu einem positiven Befall von Tumorzellen in den Lymphknoten (p=0,0027). (B) Zusammengefasst kam es bei Ang-2 Expression in 65 % der Tiere zu einer Metastasierung des Leberhilus. Die Metastasierung war in allen drei Gruppen im Fisher´s exact Test signifikant erhöht gegenüber der Kontrollgruppe (p=0,0027).

3.16. Identifizierung direkter Tie-2 unabhängiger Ang-2 Effekte

Die aktuelle Hypothese zur proangiogenen Wirkung von Ang-2 geht von einer Destabilisierung des

Endotehlzellverbandes nach Bindung an den Rezeptor Tie-2 aus. Die aus ihrer Zell-Zell und Zell-

Matrix Adhäsion z.T. gelöste Endothelzelle kann dann verstärkt auf mitogene Reize von VEGF-A

reagieren, im Ergebnis kommt es bei Anwesenheit von VEGF-A zu einer erhöhten Gefäßdichte

(Holash et al., 1999a). Direkte proliferative Effekte von Ang-2 auf Endothelzellen konnten nicht

dokumentiert werden. Unabhängig von diesem Mechanismus stellte sich die Frage, ob auch direkte

Effekte von Ang-2 auf MiaPaCa-2 Zellen an dem wachstumsfördernden, proangiogenen und

prometastatischen in vivo Effekt beteiligt sein könnten. Da die Expression des Ang-2 Rezeptors Tie-2

selektiv nur in Endothelzellen stattfindet und in Übereinstimmung damit MiaPaCa-2 Zellen kein Tie-2

exprimieren, sollte also nach direkten Tie-2- und Endothel- unabhängigen Effekten von Ang-2 auf

MiaPaCa-2 gesucht werden. Aus Vorexperimenten war bekannt, dass Ang-2 keinen Einfluss auf die

Proliferation von MiaPaCa-2 Zellen hat. Um eventuelle proangiogene oder prometastatische

Mediatoren, die durch Ang-2 in MiaPaCa-2 Zellen reguliert sind, zu identifizieren, wurde der Ansatz

der Chip Technologie gewählt. Die in dieser Arbeit hergestellten induzierbaren Zellen können für

solche Studien optimal genutzt werden, da die entsprechenden differentiell regulierten Gene in ein und

derselben Zelllinie (MiaPaCa-2-Tet-On-Ang2) in An- und Abwesenheit von Doxyzyklin untersucht

werden können. Damit werden eventuelle Effekte aufgrund der Heterogenität einzelner Zellklone

ausgeschlossen. Das gezielte An- und Abschalten der Genexpression ermöglicht eine zeitlich

definierte Aktivierung des Angiopoietins-2. Zur Analyse potentieller Ang-2 Mediatoren wurde ein

Ergebnisse 80

Chip der Firma Super Array der Serie Q ausgewählt auf dem sich 96 Gene befinden, die im Rahmen

der Metastasierung und Angiogenese wirken.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Induktionswert von 48 h gewählt, um die differentielle

Genexpression nach Ang-2 Induktion zu untersuchen. Es wurden mehrere Ansätze gewählt: Als erstes

wurde eine Genexpressionsanalyse mittels Induktion von Ang-2 in den schon beschriebenen

induzierbaren Ang-2 Klon durchgeführt. Parallel wurde die Genexpression von MiaPaCa-2

Wildtypzellen mit und ohne Zugabe von exogenem Ang-2 analysiert. Um einen Doxyzyklin Effekt

auszuschließen, wurde der gleiche Ansatz mit den induzierbaren Ausgangszellen (MiaPaCa-2-Tet-On)

durchgeführt. Dox-spezifische Effekte wurden so identifiziert und im MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2-58

Ansatz normalisiert. Es wurden jeweils zwei Proben (-/+ Dox oder -/+ Ang-2) miteinander verglichen.

Die Zellen wurden 48 h mit und ohne Dox bzw. mit und ohne rekombinanten Ang-2 inkubiert und im

Anschluss wurde Gesamt-RNA aus den Zellen isoliert. 3 µg der RNA wurden für die Umschreibung

in cDNA bei gleichzeitiger Markierung mit Biotin eingesetzt. Die Hybridisierung und Detektion

erfolgte nach Herstellerangaben (SuperArray). Die Signale wurden mittels spezieller Software

(GEArray Analyzer von SuperArray) ausgewertet. Anschließend wurden die ermittelten Daten auf das

Haushaltsgen ß-Actin normiert. Zum Vergleich der beiden Proben wurde der Quotient der normierten

Expressionswerte aus – und + Dox bzw. -/+ Ang-2 gebildet. Dieser Faktor, auch „fold-induction“ (F)

genannt, ist ein Maß für die Expressionsstärke in den beiden unterschiedlich behandelten Zellen. Um

eventuelle Kandidatengene zu identifizieren wurden die Daten wie folgt interpretiert.

F< 0,5 Herunterregulation der Gens

0,5<F<2 keine relevanten Unterschiede in der Genexpression in den

Zellen

F > 2 Überexpression des Gens

Insgesamt waren nach Induktion von Ang-2 28 Gene hochreguliert und 25 Gene herunterreguliert. Im

Gegensatz dazu waren nach exogener Zugabe von rekombinantem Ang-2 24 Gene hoch- und 37 Gene

herunterreguliert. Im Folgenden soll nur auf einige der differenziell exprimierten Gene näher

eingegangen werden. Es wurden nur Gene betrachtet, die in beiden Versuchsansätzen hoch oder

herunterreguliert waren.

Ergebnisse 81

Tab. 7: Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen. RNA Extrakte von induzierbaren MiaPaCa-2-Tet-On-Ang-2-58 Zellen mit und ohne Dox, von MiaPaCa-2 wt Zellen +/- Ang-2 und von Kontrollzellen (MiaPaCa-2-Tet-On) +/- Dox wurden für die Chip Analyse verwendet. Die Auswertung der Signale erfolgte mittels spezieller Software (GEArry Analyzer). Die Signale wurden auf das Haushaltsgen ß-Actin normalisiert. Die ermittelte fold-induction ergibt sich aus der Verhältnis zwischen +/- Ang-2 Zugabe bzw. zwischen induziertem zu nicht-induziertem Zustand, wobei auf die Ergebnisse der Dox Kontrolle normalisiert wurde. Herunterregulierte Gene (F<0,5) sind hellgrau markiert, hochregulierte dunkelgrau (F>2).

fold induction foldinductionGen #58 /Dox Kontrolle wt +/- Ang2 Gen #58 /Dox Kontrolle wt +/- Ang2 Apoptosis inhibitor 5 0,950529809 1,013711756 Hyaluronidases 3,293889641 1,312339025RhoC 0,374628561 1,512122627 MUC-18 0,705022239 9,876031287BrMS1 0,094663041 0,205428154 collagenase-1 4,422807236 0,163110773caspase 8, FLICE 0,163416712 4,214541345 stromelysin 2 1,655862249 0,922585845caspase 9, Mch6 0,129794273 0,696485394 stromelysin-3 0,665582374 1,194418775caveolin-1 0,394611712 0,229647626 collagenase-3 0,981034061 2,59707681CD44 3,220783112 1,187832179 MT1-MMP 1,589516365 0,125970186E-cadherin 0,48163268 1,797264816 MMP15 0,853016324 6,403011219collagen 4 A2 0,805592074 0,72947556 MMP16 1,756934176 0,721319376csf-1 0,152935705 2,304655263 gelatinase A 36,65421101 0,59247614c-fms (MC-SF-R) 0,128976288 0,490890471 stromelysin-1 1,333037962 5,018715642cystatin C 0,195467609 1,467393622 MMP-7 2,255789759 0,192062275Cathepsin B 0,292381922 0,555002364 MMP8 1,308998605 0,0810226cathepsin D 0,402997675 1,123304994 gelatinase B 1,234852371 0,452293958cathepsin L 0,490575038 4,464085733 Mta-1 1,371362475 0,173423018DCC 0,484580727 0,435883389 MUCI, episialin 0 0,705567102Ehm2 1,193409432 1,020472634 c-myc 0,12379829 9,02036283Elastase 0,712486762 0,243465033 NCAM 28,42260267 0,378961504autotaxin 0,128897467 0,052634861 NGF b 2,625843078 0,101186074erb-2 0,197029607 1,201749107 NM23A 1,554328927 1,534460063c-ets1 0,229234525 1,307596649 Nm23-E4 1,200092107 2,657733306c-ets2 0,272767081 1,767777964 ornithine decarboxylase 2,561798159 0,092394923PEA3 0,291968054 1,596147147 PDGF a 0,787333949 1,540322098c-fes 0,774562928 0,324750301 CD31 0,207151829 4,448177638a-FGF 1,341125409 0,126216725 PI3K 3,177522984 0,320304582b-FGF 1,105417262 0,262853337 uPA 1,905835906 0,206748645c-fos 0,477230585 0,034632981 uPAR 7,984991635 2,649538239scatter factor 0,239374078 2,1597411 PTEN 1,741744913 3,540414737Heparanases 0,866536616 0,206515032 Cox-2 2,339922509 0,111681801H-ras 0,441954929 3,840145349 Rac1 1,043438687 2,900961527ICAM-5 0,81646084 0,13534528 c-raf-1 2,137076677 0,783961205IGF-II 0,516976351 4,918905506 Mts1 4,091491698 0,359924845Integrin a2 2,351572754 0,050728415 PAI-2 0,649917538 9,388397269Integrin a3 2,491630946 1,252627669 maspin 0 0,097862163Integrin a5 0,486027847 3,158484844 PAI-1 19,92212534 0,635110476Integrin a6 0,390563323 0,173492189 BCSG1 11,85690332 0,638022558Integrin b1 2,069456579 1,907730657 osteopontin 6,077413288 0,598943628CD61 1,416202081 1,49505823 c-src 3,09004732 0,514211044KAI1 1,973000659 0,848007383 TGF-a 11,83809757 0,011319538KISS1 1,84645879 0,039043223 TGFb1 1,181526289 2,314846811laminin B1 0,923584672 0,408530208 thrombospondin-1 0 0,254260217laminin B2 2,019765945 0,487826584 thrombospondin-2 4,994289001 0,098402017LIM Kinase 0,939385078 5,306020712 TIMP-1 0,923601283 1,827193798mkk4, JNKK1 0,653405936 0,284928515 TIMP-2 8,996628961 3,3853526mdm2 0,984890099 1,605347613 TIMP-3 0 0,252798413GnT-III 0,733687495 2,202137313 TMPRSS-4 1,140362456 0,152646454GnT-V 1,672126294 0,225263038 VEGF 2,54047841 1,351057477Hyaluronidases 3,293889641 1,312339025 VEGF-C 3,478500807 0,812368128MUC-18 0,705022239 9,876031287 vitronectin 9,172532279 9,923548854

Ergebnisse 82

3.16.1. Auswahl von herunterregulierten Kandidatengenen

Da Ang-2 als proangiogener Faktor beschrieben ist, erwartet man durch Ang-2 eine

Herunterregulation von Genen, die eine Angiogenese oder Metastasierung inhibieren könnten. Drei

der am interessantesten herunterregulierten Gene werden im Folgenden betrachtet: DCC, BrMS1,

Caveolin 1 (Abb. 40).

Aus der Gruppe der Metastasierungssuppressoren sind das DCC Gen (deleted in colorectal cancer)

und das Gen für BrMS1 (Breast metastasis suppressor 1) vermindert transkribiert. Die mRNA von

DCC ist um den Faktor 0,43 und 0,48 herunterreguliert. DCC codiert für ein transmembranäres

Glykoprotein (Reale et al., 1994), das im Kolonkarzinom häufig deletiert ist (Fearon et al., 1990).

Auch im Pankreaskarzinom ist der Verlust des DCC Gens und seine pathogenetische Rolle

beschrieben worden (Simon et al., 1994).

Das Gen BrMS1 war nach Zugabe von exogenem Ang-2 um den Faktor 0,25 herunterreguliert,

während die Transkription im induzierten Fall sogar um 0,09 reduziert war. BrMS1 ist als

Metastasierungs-Suppressor im Mammakarzinom beschrieben worden (Seraj et al., 2000).

Das Gen für Caveolin-1 wurde nach Induktion von Ang-2 um den Faktor 0,4 und nach exogener

Zugabe von Ang-2 um den Faktor 0,23 herunterreguliert. Caveolin-1 gehört zur Familie der

Caveoline, d.h. Membranproteine, welche Einstülpungen der Zytoplasmamembran, sog. Caveolae

bilden (Anderson, 1998). Caveolin-1 ist als Tumorsuppressor beschrieben (Engelman et al., 1998) und

ist auch in vielen Tumorentitäten herunterreguliert beobachtet worden (Bender et al., 2000; Lee et al.,

1998; Racine et al., 1999).

BrMS1

cave

olin-1

DCC0.0625

0.125

0.25

0.5 #58 +/- Doxwt +/- Ang-2

fold

indu

ctio

n

Abb. 40: Herunterregulierte Kandidatengene. Graphisch dargestellt sind drei der ausgewählten herunterregulierten Gene. Herunterreguliert war die mRNA von DCC (deleted in colorectal cancer) um den Faktor 0,48 bzw. 0,43. Die mRNA für Caveolin war um das 0,4 fache bzw. um das 0,2 fache reduziert. Die mRNA von BrMS1 war um den Faktor 0,2 bzw. 0,09 reduziert.

Ergebnisse 83

3.16.2. Auswahl von hochregulierten Kandidatengenen

Ein besonderes Augenmerk der Untersuchung richtete sich auf Gene, die durch die Induktion der

Ang-2 Expression oder durch die exogene Zugabe von Ang-2 hochreguliert werden und dadurch

proangiogen wirken, weil sie meistens therapeutisch relevanter sind. Die „fold Induction“ sollte also

einen Wert > 2 haben. In Abbildung 41 sind drei der hochregulierten Gene dargestellt, deren mRNA in

beiden Versuchsansätzen hochreguliert ist.

Das Integrin ß1 gehört zu den Membranrezeptoren, die die Zell-Matrixadhäsion vermitteln, und war in

beiden Ansätzen um das 2-Fache induziert.

Die mRNA des Urokinase Plasminogen Aktivator Rezeptors (uPAR) war nach endogener Ang-2

Induktion um das 8-Fache induziert und nach exogener Zugabe von Ang-2 um das 2,7-Fache. Das

uPA-System ist ein extrazelluläres Protease System, welches in aggressiven metastasierenden soliden

Tumoren überexprimiert wird (Andreasen et al., 1997; Duffy, 2004). Zudem fand sich eine Erhöhung

der Expression von uPA- und uPAR mRNA im humanen Pankreaskarzinomgewebe (Cantero et al.,

1997). Die mRNA von Vitronektin war in beiden Ansätzen um das 9-Fache hochreguliert. Vitronektin

ist ein extrazelluläres Matrixmolekül, das die Zelladhäsion und Zellmotilität fördert (Suzuki et al.,

1984).

Integrin

b1uPAR

vitro

nectin

1

2

4

8

16 #58 +/- Doxwt +/- Ang-2

fold

indu

ctio

n

Abb. 41: Hochregulierte Kandidatengene. Graphisch dargestellt sind drei der am stärksten hochregulierten Gene nach Induktion der Ang-2 Expression bzw. nach exogener Zugabe von rekombinanten Ang-2. Um den Faktor 2 war die mRNA von Integrin ß1 hochreguliert. uPAR war im induzierten Fall um das 8-Fache induziert, während es nach exogener Zugabe von Ang-2 3-fach induziert wurde. Die mRNA von Vitronektin war in beiden Fällen um das 9-Fache hochreguliert.

Diskussion 84

4. Diskussion

Das Pankreaskarzinom stellt eine der größten Herausforderungen in der modernen Onkologie dar, da

es im Hinblick auf die verfügbaren Chemo- und/oder Biotherapien als nahezu resistent einzustufen ist.

Um aussichtsreiche Ansatzpunkte zu identifizieren, ist ein vertieftes Verständnis der speziellen

Tumorbiologie dieser Erkrankung eine wesentliche Voraussetzung. Mit der vorliegenden Arbeit

konnten hierzu zwei Beiträge geleistet werden, indem die biologische Bedeutung von zwei typischen

molekularen Alterationen für den komplexen malignen Phänotyp des Pankreaskarzinoms

charakterisiert wurde. Um diese Aufgabenstellung erfolgreich bearbeiten zu können, wurde der

aufwändige methodische Ansatz der induzierbaren Expression in Kombination mit einem orthotopen

Tiermodell des Pankreaskarzinoms gebracht. Im Ergebnis konnte erstmalig die Bedeutung des

Tumorsuppressors p16 und des Angiogenesefaktors Ang-2 für Tumorwachstum und Vaskularisierung

sowie für lokalinvasives Wachstum und Metastasierung an einem kliniknahen und somit onkologisch

relevanten Tiermodell des Pankreaskarzinoms evaluiert werden. Besondere Bedeutung verdient

hierbei die Beobachtung, dass sowohl der Verlust von p16 als auch die vermehrte Expression von

Ang-2 zu einer gesteigerten Lymphangiogenese führen. Besonders ausgeprägt ist dies im Fall des p16

Verlustes. Diese Befunde legen eine wesentliche funktionelle Beteiligung beider Alterationen an der

früh einsetzenden lymphatischen Metastasierung nahe, die somit eine bedeutende Rolle für diesen

klinisch überaus wichtigen tumorbiologischen Aspekt des Pankreaskarzinoms spielen dürften.

Besonders mit dem Ang-2/Tie 2 Rezeptor-Ligandensystem konnte so ein viel versprechendes und

therapeutisch gut zugängliches Target für neue Therapiemodalitäten identifiziert werden.

Die Relevanz der hier erhobenen Befunde hängt in besonderem Maß von der Möglichkeit ab, mit dem

orthotopen Modell einen kliniknahen Erkrankungsverlauf abzubilden.

4.1. Beurteilung des orthotopen Modells

Für beide Projekte in der vorliegenden Arbeit war die erfolgreiche Durchführung der orthotopen

Implantation Vorraussetzung für eine Aussage über die biologische Relevanz der zu untersuchenden

Gene. Deshalb soll an dieser Stelle eine Bewertung des orthotopen Xenotransplantationsmodells

vorgenommen werden. Die Mehrzahl der bisher verwendeten in vivo Untersuchungen zum

Pankreaskarzinom erfolgten an chemisch induzierten Nagermodellen, welche sich als nicht

repräsentativ für das humane Pankreas erwiesen (Standop et al., 2001) und an subkutanen

Nacktmausmodellen (Fogh et al., 1980). Zu den Nachteilen der subkutanen Implantationstechnik von

Pankreaskarzinomzellen gehört unter anderem das Fehlen des invasiven und metastasierenden

Verhaltens. Die Metastasierung ist stark abhängig von der umgebenden Organmatrix und bestimmt

unter anderem die Subpopulation der Tumorzellen aus dem Primärtumor in die umliegenden Organe

Diskussion 85

und in weiter entfernte Gewebe (Killion et al., 1998). Orthotope Modelle in der Nacktmaus dagegen

zeigen eine höhere Anwachsrate und ein höheres Potential zur Metastasierung (Marincola et al., 1989;

Tan and Chu, 1985). Durch die Verwendung des orthotopen Modells ist insgesamt im Vergleich zu

einem subkutanen Modell auch mit einem wesentlich höheren Erkenntnisgewinn zu rechnen.

Ein Nachteil des orthotopen Modells ist die komplizierte Implantationstechnik. Aber in der

vorliegenden Arbeit mussten im Fall von p16 nur 2 von 24 Tieren (8,3 %) wegen nicht erfolgreicher

Implantation getötet werden und bezüglich der Ang-2 Untersuchungen mussten 15% (6/40) der Tiere

getötet werden. Bei den restlichen Tieren konnten die Zellen erfolgreich mit einer 100 %

Angehensrate implantiert werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde invasives Wachstum vor allem in das Duodenum, aber vereinzelt

auch in Magen und Leber festgestellt, was die Aggressivität des Tumors verdeutlicht. In subkutanen

Modellen lassen sich Parameter wie Tumorwachstum, Angiogenese und Lymphangiogenese zwar gut

untersuchen, sind aber nicht unbedingt relevant. Untersuchungen zu HIF-1α zeigten beispielsweise,

das Tumorverhalten abhängig von der Umgebung sprich kontextabhängig ist (Blouw et al., 2003).

Tumorzellen subkutan und intracranial implantiert, zeigten völlig verschiedene Verhaltensweisen auf.

In orthotopen Modellen dagegen werden die Zellen in das Ursprungsorgan mit seiner organtypischen

Gefäß-, Lymphgefäß- und Nervenversorgung implantiert. Da die Metastasierung klinisch oft schwerer

zu beherrschen ist als das Wachstum des Primärtumors und vielfach die Prognose der Patienten

limitiert, ist dieser Prozess in den letzten Jahren vermehrt in den Mittelpunkt der Forschung gerückt.

Die meisten Publikationen kommen zu dem Schluss, dass sich nach subkutaner Injektion nur äußerst

wenige oder gar keine Metastasen bilden, da die Tumoren abgegrenzt und wenig invasiv wachsen

(Fidler, 1991). Nur durch die Verwendung des orthotopen Modells war es uns möglich, Aussagen über

die biologische Relevanz von p16 und von Ang-2 im Hinblick auf deren Einfluss auf Metastasierung

im Pankreaskarzinom zu machen. Durch das gewählte orthotope Modell ließen sich die humanen

anatomischen Gegebenheiten, die Lymphabflusswege in primäre und sekundäre

Lymphknotenstationen und die venöse Drainage des Pfortadersystems, sehr gut nachbilden. Ein

wesentlicher Erkenntnisgewinn des verwendeten orthotopen Modells war somit die Beurteilung der

hämatogenen und lymphogenen Metastasierung nach Expression der Zielgene (p16, Ang-2).

Ein weiterer großer Vorteil orthotoper gegenüber subkutanen Modellen ist, dass man durch die

Implantation der Zellen in das Ursprungsgewebe (hier Pankreas), das klinische Bild der menschlichen

Erkrankung im Tierversuch besser abbilden kann. Entscheidend für den Verlauf und Prognose der

humanen Erkrankung ist nicht nur die Metastasierung, sondern auch die Ausbildung typischer

Komplikationen, die durch die anatomische Lage des Pankreas bedingt sind. So führt das lokale

Tumorwachstum häufig zu einer Obstruktion (Blockierung) des Gallenausganges mit Ausbildung

eines Ikterus (Gelbsucht). Zusätzlich kann es durch den Tumor zu einer Magenausgangsstenose

(Magenverengung) kommen. Diese Komplikationen können nur im orthotopen Modell ausgebildet

Diskussion 86

werden. Im Rahmen der hier durchgeführten Experimente kam es in einem Fall zu einem Ikterus,

weitere Komplikationen blieben aus.

Ein methodischer Nachteil des orthotopen Modells besteht darin, dass dieses Modell kein

kontinuierliches Monitoring des Tumorwachstums erlaubt. Der Krankheitsverlauf der Tiere wurde nur

anhand ihres Gewichtes und der allgemeinen Verfassung beurteilt. Zusätzlich wurde das Anwachsen

des Tumors und das weitere Tumorwachstum durch Abtasten der Tiere untersucht. Diese Tatsachen

wurden aber alle als nicht limitierend für das System beurteilt.

4.2. Beurteilung der induzierbaren Systeme - Vergleich der Systeme TREx und Tet-On

Die Arretierung der Zellen in der G1 Phase nach erfolgter p16 Expression und die gezielte

zeitabhängige Untersuchung der Metastasierung nach Ang-2 Expression verlangte nach einem

geeigneten regulierbaren Genexpressionssystem, das auch in vivo anwendbar ist. Eine regulierbare

Genexpression ist von Vorteil:

- für die Analyse der Funktion spezifischer Gene, die toxisch oder wachstumshemmend wirken

- für die Expression von Genprodukten, die nur für einen begrenzten Zeitraum benötigt werden

- für die reversible Abschaltung der Genexpression nach erfolgter Induktion

- für die Analyse der Funktion spezifischer Gene an verschiedenen biologischen Prozessen.

Vor allem der erste Punkt war entscheidend für die Untersuchung von p16. Ohne ein induzierbares

System ist es nicht möglich gewesen, stabile p16 exprimierende Zelllinien (MiaPaCa-2) zu generieren.

Für die Untersuchung von Ang-2 war es vor allem von Vorteil, das die Genexpression zu

verschiedenen Zeitpunkten an- und abgeschaltet werden konnte.

Zusätzlich sollte das regulierbare System für den Einsatz in unserem Vorhaben folgende

Eigenschaften aufweisen:

- eine geringe Basalexpression im repremierten Zustand

- eine hohe Expression im induzierten Zustand

- keine Auslösung pleiotroper Effekte

- in vivo einsetzbar

Neben den von uns verwendeten Systemen Tet-On oder TREx nach Bujard et al. standen noch andere

Systeme zur Verfügung wie das EcdysoneTM-System. (No et al., 1996) oder das GeneSwitschTM-

System (Wang et al., 1994), um nur zwei zu nennen. Die vielen beschriebenen Vorteile des

Tet-Systems (Yamamoto et al., 2001) und die leichte Verabreichung des Inducers (Dox) in vivo (über

das Trinkwasser), führten zur Auswahl des Tetrazyklin-induzierbaren Systems.

Diskussion 87

Entscheidend für beide Systeme ist die Herstellung der Ausgangszelllinie, die den Tet-Repressor

codiert und exprimiert. Diese Ausgangszelllinie entscheidet über die Basalexpression im uninduzierten

Zustand (-Dox) und über die Expressionsstärke des Zielgens. Wie schon oben festgelegt, sollte die

Zelllinie eine niedrige Basalexpression im uninduzierten Zustand und eine hohe induzierte Expression

bei Anwesenheit des Inducers (Dox) haben, eine hohe Ratio von induzierter- zu basaler Expression,

und der Inducer (Dox) sollte nur geringe Nebeneffekte aufweisen. Für die induzierbare Expression von

p16 wurde das TREx-System von der Firma Invitrogen und für die induzierbare Expression von Ang-2

das Tet-On System von Chlontech verwendet. Obschon die beiden kommerziell verfügbaren

Tetrazyklin-induzierbaren Expressionssysteme außerordentlich ähnlich sind, ließ sich in den hier

verwendeten MiaPaCa-2 Zellen mit dem TREx System wesentlich leichter und schneller eine

induzierbare Zelllinie etablieren als mit der Tet-On Variante. Es gab (i) wesentlich mehr positive

Zellklone (ii) die gemessene Luciferaseaktivität lag deutlich höher (iii) der Induktionsquotient war

mehr als doppelt so hoch (iv) die Basalexpression (Leakiness) war niedriger bzw. vergleichbar.

Toxische Effekte waren in keinem der beiden Systeme zu erkennen, so dass man zusammenfassend

sagen kann, dass die Bereitstellung eines induzierbaren TREx Systems aufgrund der höheren

Induktion und der einfacheren bzw. schnelleren Bereitstellung der ersten Zelllinie vorteilhafter war

und -zumindest für MiaPaCa-2 Zellen- auch eher empfehlenswert ist. Dies bestätigen ebenso andere

Studien, in denen verschiedene induzierbare Systeme verglichen wurden, die ebenfalls das TREx

System dem Tet-On System vorziehen würden (Xu et al., 2003). Trotz dieser Unterschiede führten

aber beide Systeme letztendlich sowohl in vitro als auch im Tiermodell zu einer erfolgreichen

induzierbaren Expression der Zielgene p16 und Ang-2.

4.3. Die Kombination des Tetrazyklin-induzierbaren Systems mit dem orthotopen Pankreasmodell

In Kombination mit dem Tetrazyklin-abhängigen Expressionsmodell ermöglicht das orthotope Modell

den Einfluss der Zielgene auf Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung gezielt, für

unterschiedliche Stadien der Tumorentwicklung, zu untersuchen. Voraussetzung ist die erfolgreiche

und dauerhafte Induktion der Zielgene in vivo.

Da Ang-2 ins Blut sezerniert und somit im Blut nachgewiesen werden konnte, war es möglich, schon

während des Versuchs (nach 4 Wochen) die Induzierbarkeit des Systems in vivo zu überprüfen. Dabei

wurde festgestellt, dass das induzierbare System in den Tieren funktioniert und die Nachweisgrenze

für Ang-2 bei 20-40 pg/ml liegt. Nach acht Wochen sind die Ang-2 Konzentrationen im Serum

deutlich angestiegen. Aufgrund der Durchlässigkeit des Promotors des Systems („Leakyness“) weist

Gruppe 1 (-Dox) leider auch einen erhöhten Ang-2 Spiegel auf, der aber noch deutlich unter den

Werten der induzierten Gruppen liegt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Kombination aus

Diskussion 88

dem induzierbaren Tet-On System mit dem orthotopen MiaPaCa-2 Modell möglich, jedoch kritisch in

Bezug auf die Basalexpression („leaky system“) zu betrachten ist.

Im Fall der p16 Untersuchung wurde die Induktion der p16-Expression direkt nach Implantation der

Zellen in das Pankreas gestartet, da die Inaktivierung von p16INK4a ein relativ frühes Ereignis in der

Karzinogenese des Pankreaskarzinoms ist (Hruban et al., 2004). Kritisch für die Beantwortung unserer

Fragestellung war die Frage, ob das induzierbare System eine dauerhafte Überexpression in vivo

gewährleisten kann. Es herrschte eine komplexere Situation bei der Untersuchung von p16 als bei der

Ang-2 Untersuchung, da ein Selektionsdruck gegen die Induktion bestehen könnte. Tatsächlich

zeigten immunhistochemische Färbungen mit p16 deutlich unterschiedliche Expressionsstärken von

p16 in den Primärtumoren der induzierten Gruppe. In kleineren Tumoren war eine wesentlich stärkere

p16 Expression zu beobachten. Es scheint zu unterschiedlichen Induktionsstärken aufgrund der

Selektion zu kommen, was zu unterschiedlichen Expressionen in den Tieren führt. Ist die Induktion

ausreichend stark, wird der Tumor in seinem Wachstum gehemmt. Die Tiere wurden mit einer

ausreichenden Menge an Dox (2mg/ml) über das Trinkwasser versorgt, so dass von dieser Seite keine

Probleme auftreten sollten.

Der zweite problematische Aspekt war die Durchlässigkeit dieses Systems („leaky system“). In den

Tumoren der Kontrollgruppe (-Dox) konnte immunhistochemisch sehr schwache p16 Expression

detektiert werden.

Wir nehmen an, dass es bei niedriger Induktion und dem Auftreten von „Leakyness“ zu einem

überlappenden Expressionsniveau kommt. Dies führte insgesamt zu einer Einschränkung der Tiere für

die Auswertung.

4.4. Biologische Effekte der induzierbaren Expression von p16

Der Focus dieser Arbeit lag auf der Herstellung eines induzierbaren p16 Tumormodells. Aus

vorherigen Arbeiten war bekannt, dass eine Restitution von p16 in den Pankreaskarzinomzellen

äußerst schwierig ist. Die Re-Expression von p16 führte in den Zellen zu einem G1-Arrest und erlaubt

keine Kultivierung der Zellen über einen längeren Zeitraum. Der Einsatz des Tetrazyklin-

induzierbaren Systems stellte daher ein optimales Konzept zur Expression von p16 dar.

Durch Restitution von p16 wird meist eine Inhibition der pRb Expression beobachtet, wobei diese

transkriptionelle Inhibition abhängig von Zell- und Gewebetyp ist (Fang et al., 1998; Frizelle et al.,

1998; Plath et al., 2002). Tatsächlich lässt sich mit unserem System infolge der p16 Induktion nach 96

Stunden eine Herunterregulation von pRb erkennen, die jedoch weniger stark ausgeprägt war als z.B.

in Capan-1 Zellen (Pankreaskarzinomzellen) (Plath et al., 2002). Dies zeigt, dass wir durch die

induzierbare Reexpression von p16 physiologische Regulationsprozesse rekapitulieren können. Genau

wie in nicht transformierten Zellen anzunehmen, finden wir hier ein balanciertes System zwischen p16

Diskussion 89

und pRb vor. Zusätzlich können wir die Wirkung von p16 in vitro durch verminderte Proliferation und

Koloniebildung absichern.

4.4.1. Die Restitution von p16 reduziert das Tumorwachstum im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Trotz vieler Studien die p16 als Tumorsuppressor beschreiben ist bislang unklar, ob p16 neben der

Beteiligung an der initialen Transformation auch weitere, spätere biologische Prozesse der

Tumorformation und Tumorausbreitung reguliert. Für einige Tumorentitäten konnte gezeigt werden,

das eine p16 Expression das Tumorwachstum reduzierte oder zumindest stabilisierte (Rocco et al.,

1998; Spillare et al., 1996). In unserer eigenen Gruppe wurde im subkutanem Mausmodell mit

Capan-1 Zellen durch Restitution von p16 ein Verlust der Tumorigenität der Zellen gezeigt (Plath et

al., 2000).

In unserem orthotopen Modell führte die Induktion von p16 zu einem signifikant reduzierten

Tumorwachstum, die Tumorentstehung war jedoch nicht vollständig unterbunden. Die Inaktivierung

von p16 gehört zwar zu den frühen Ereignissen in der Karzinogenese des Pankreaskarzinoms, aber

noch früher in der Karzinogenese findet unter anderem die onkogene Aktivierung des k-ras Gens statt.

Zusätzlich ist für das Pankreaskarzinom bekannt, das mindestens drei der vier häufigsten genetischen

Alterationen (Kras, P16INK4a, P53 und DPC4) gleichzeitig auftreten (Bardeesy et al., 2002b; Schneider

et al., 2003). Die alleinige Restitution von p16INK4a würde nach unseren Ergebnissen nicht zu einem

vollständigen Tumorverlust führen, sondern zu einer signifikanten Verlangsamung des

Tumorwachstums. Es ist vorstellbar, dass analog zur double hit Hypothese der Transformation auch

für die Reversion des malignen Phänotyps mehr als eine Alteration korrigiert werden muss. So könnte

eine Restitution von p16 kombiniert mit einer gleichzeitigen Inhibierung von onkogenem Kras in

diesem System möglicherweise zu einer vollständigen Inhibierung des Tumorwachstums führen.

4.4.2. Die induzierte p16-Expression reduziert die Hämangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Die Angiogenese wird durch die Balance aus pro- und antiangiogenen Faktoren reguliert. Erst durch

die Verschiebung des angiogenen Gleichgewichts (angiogenic switch) beispielsweise im Tumor

kommt es zur Stimulation der Angiogenese (Hanahan and Folkman, 1996). Eine Verbindung zwischen

Tumorsuppressorgenen (z.B. Rb, p16) und Angiogenese ist immer noch unklar, aber nicht

unbedeutend. Genetische Alterationen einiger Tumorsuppressorgene sind an der Transformation zum

angiogenen Phänotyp eines Tumors beteiligt. Nach erfolgter Transformation kommt es zu einer

Veränderung der Expression von Zytokinen, die pro- oder antiangiogen wirken können (Vanmeir et

al., 1994). In zahlreichen Fällen scheint eine Inhibition der VEGF-Expression dabei von zentraler

Bedeutung. Für den Tumorsuppressor p53 ist beispielsweise gezeigt worden, dass dieser nach

Restitution zu einer verminderten VEGF Expression führte begleitet von einer reduzierten

Diskussion 90

Tumorvaskularität in den verschiedensten Tumorentitäten (Bouvet et al., 1998; Fontanini et al., 1998).

In mehreren Zusammenhängen wurde auch der Tumorsuppressor p16INK4a und dessen „downstream“

Targets mit einer antiangiogenen Wirkung in Verbindung gebracht. Die Überexpression von Rb

Proteinen RB2/p130 z.B. führte zu einer Inhibierung der Angiogenese durch Herunterregulation des

VEGF Faktors (Claudio et al., 2001). Die Transduktion von p16INK4a in humanen Lungenkarzinom

Zelllinien resultierte in einer Herunterregulation der VEGF Expression (Miki K et al., 2005). Auch die

Restitution von p16INK4a in humane Gliomen führte zu einer Herunterregulation von VEGF und einer

Inhibierung der Angiogenese (Harada et al., 1999). Interessanterweise wurde die VEGF Expression in

unserem MiaPaca-2 Modell zumindest in vitro durch p16 Reexpression nicht vermindert.

Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Restitution von p16INK4a in der

Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2 nach orthotoper Xenotransplantation ebenfalls eine verminderte

Hämangiogenese, gemessen als verminderte Vaskularisierung, zeigt. Diese Beobachtungen legen

nahe, dass die funktionelle Inaktivierung von p16 im Pankreaskarzinom zu einem angiogenen

Phänotyp führt und somit zu einer Progression des Tumors beiträgt.

In verschiedenen Tiermodellen diverser Tumorentitäten konnte bereits überzeugend gezeigt werden,

dass antiangiogene Therapien Tumorwachstum, Metastasierung und Überleben günstig beeinflussen

(Morin, 2000). Eine Inhibition der Angiogenese im Pankreaskarzinom erscheint daher als ein viel

versprechender und nebenwirkungsarmer experimenteller Therapieansatz.

4.4.3. Die induzierte p16 Expression vermindert die Lymphangiogenese im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Zusätzlich zum vaskulären System kommt dem lymphogenen System eine entscheidende Bedeutung

im Verständnis von Tumorwachstum und lymphogener Metastasierung zu (Stacker et al., 2002). Zur

Zeit der Anfertigung dieser Arbeit waren ein Zusammenhang zwischen p16 und Lymphangiogenese

noch nicht berichtet worden. Erstmals konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine

Rekonstitution von p16 in Pankreaskarzinomzellen auch zu einer reduzierten Lymphangiogenese in

vivo führt.

Der molekulare Mechanismus dieser Erstbeobachtung ist dabei zur Zeit völlig unklar. Die aktuell am

besten charakterisierten proangiogenen Mediatoren VEGF-C und VEGF-D sowie untergeordnet auch

VEGF-A waren in ihrer Expression nach p16 Rekonstitution nicht verändert. Weitere Untersuchungen

zu diesem Thema erscheinen daher außerordentlich lohneswert.

Diskussion 91

4.4.4. Die induzierte p16 Expression reduziert die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Oft wird die Vaskularisierung des Tumors mit einer erhöhten Metastasierung korreliert (Araya et al.,

1997; Craft and Harris, 1994). In dieser Arbeit kann entsprechend festgestellt werden, dass mit der p16

Expression eine reduzierte Vaskularisierung sowie eine verminderte Anzahl an tumorbefallenen

Lymphknoten beobachtet werden konnte. Schon nach acht Wochen waren in den Mäusen der

Kontrollgruppe (-Dox) Metastasen in regionalen Lymphknoten zu beobachten (90 %). Zusätzlich

konnte eine stark einsetzende Infiltration in anliegendes Nachbargewebe festgestellt werden. In p16

exprimierenden Tieren dagegen war die Metastasierung und Invasivität in Nachbarorgane deutlich

herabgesetzt. Nur 27 % der analysierten Lymphknoten waren positiv. Zusammenfassend wurde die

Metastasierung in regionale Lymphknoten nach p16 Expression signifikant herabgesetzt (p=0,0166).

Das Lymphsystem dient auch als primärer Metastasierungsweg vieler Arten von Karzinomen. Dabei

ist das Ausmaß der Streuung durch die Lymphgefäße zu regionalen Lymphknoten ein wesentliches

prognostisches Kriterium für zahlreiche maligne Tumore (Swartz and Skobe, 2001). Bevor ein Tumor

über das Lymphgefäßsystem metastasieren kann, müssen sich einzelne maligne Zellen aus dem

Zellverband lösen und in die Lymphbahn eindringen. Es erscheint daher plausibel, dass die Reduktion

der Lymphvaskularisierung durch p16 in unserem Modell ursächlich für die verminderte Ausbreitung

der MiaPaCa-2 Zellen in regionale Lymphknoten war. Zur Zeit der Anfertigung waren keine Daten

zur Wirkung von p16 auf die Lymphangiogenese bekannt und können als neue Beobachtung

festgehalten werden.

Damit war klar belegt, dass durch die früh in der Karzinogenese auftretende genetische Alteration von

p16 nicht nur die Kontrolle der Zellzyklusprogression beschädigt wird. Eine Restitution von p16

reduziert nicht nur das Tumorwachstum und die Hämangiogenese, sondern vermindert auch die

Lymphangiogenese.

Da Lymphknoten beim Pankreaskarzinom wie auch bei vielen anderen Tumorentitäten die frühesten

Metastasierungslokalisationen repräsentieren, besteht in Analogie zu einer antiangiogenen Therapie

auch für eine antilymphangiogene Therapie ein hohes therapeutisches Potential.

4.5. Biologische Effekte der induzierbaren Expression von Ang-2

Auch in diesem Teil der Arbeit lag der Focus auf der Herstellung eines in vivo induzierbaren

Tumormodells. Hierbei wurde in diesem Teil der Arbeit zur Untersuchung der Ang-2 Effekte die

Möglichkeit der zeitgesteuerten Induktion ausgenutzt. Durch die einzelnen Gruppen sollte der Einfluss

der Ang-2 Expression erstens auf die Tumoretablierung und zweitens die Wirkung auf die

Metastasierung und Angiogenese untersucht werden.

Diskussion 92

4.5.1. Effekt der induzierten Ang-2 Expression auf das Tumorwachstum, die Angiogenese und die Metastasierung im orthotopen MiaPaCa-2 Modell

Ang-2 wird unter physiologischen Bedingungen nur endothelial exprimiert (Vajkoczy et al., 2002).

Neben der endothelialen Expression ist aber auch die Expression über Tumorzellen bekannt, die schon

für die verschiedensten Tumorentitäten gezeigt worden ist (Etoh et al., 2001; Tanaka et al., 2002;

Tanaka et al., 1998). Für alle konnte eine proangiogene Wirkung des Ang-2 gezeigt werden. Mit der

vorliegenden Arbeit kann die proangiogene Wirkung von Ang-2 auch für das Pankreaskarzinom

bestätigt werden.

Wir können mit dieser Arbeit zeigen, dass die induzierte Ang-2 Expression einen fördernden Einfluss

auf das Tumorwachstum hat. Die induzierte Ang-2 Expression führte zu einem signifikanten Anstieg

des Tumorgewichts. Denkbar ist, dass durch eine erhöhte Ang-2 Expression die Tumorangiogenese

verstärkt wurde und somit die Voraussetzung für das Weiterwachsen des Tumors gegeben war.

Wie erwartet kam es in den Ang-2 exprimierenden Tieren auch zu einer signifikanten 34 % igen

Steigerung der hämatogenen Angiogenese. Damit können wir die Annahme das Ang-2 proangiogen

wirkt bestätigen. Angesichts der von uns bereits zuvor gezeigten Überexpression von Ang-2 im

humanen Pankreaskarzinom erhalten die Ergebnisse eine besondere Relevanz. Die Daten zeigen auch,

dass es zu einer moderat gesteigerten Lymphangiogenese nach Induktion der Ang-2 Expression

kommt. Dieses ist bisher für keine andere Tumorentität vorbeschrieben und damit von besonderer

Bedeutung.

Anders als erwartet wurde beobachtet, dass die verschiedenen Zeitpunkte der Ang-2 Induktionen

keinen Unterschied im Einfluss auf Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung ergaben.

Damit scheint Ang-2 sowohl in der Phase der Tumoretablierung als auch in der Metastasierungsphase

von Bedeutung zu sein, wobei keine additive Wirkung zu dokumentieren war. Diese Beobachtung legt

nahe, dass Ang-2 über unterschiedliche molekulare Effekte wirkt, die nicht allein über die Induktion

der Angiogenese abgebildet werden.

Bei der Interpretation der Daten muss immer die Basalexpression von Ang-2 im uninduzierten

Zustand (350 ng/ml) mit betrachtet werden. Wir können leider nicht einschätzen, was für

Auswirkungen diese Konzentrationen haben, und ob die Ang-2 Wirkung konzentrationsabhängig ist.

Für Ang-2 ist bekannt, dass es nur in bestimmten Konzentrationen antagonistisch zu Ang-1 wirkt,

demnach könnte eine Basalexpression von 350 ng/ml schon einen Einfluss auf die Angiogenese haben

und die eigentliche Steigerung der Angiogenese könnte dann nicht quantifiziert werden.

Neben dem Wachstum und der Vaskularisierung des Primärtumors war vor allem die Beurteilung der

Metastasierung entscheidend für die Untersuchung der biologischen Relevanz von Ang-2 im humanen

Pankreaskarzinom. Grund dafür ist die Tatsache, dass immer weniger Patienten an den Folgen des

Primärtumors sterben, da dieser chirurgisch entfernt werden kann, sondern an dessen Metastasen. Zum

Diskussion 93

Zeitpunkt der Diagnosestellung weisen die meisten Patienten ein fortgeschrittenes, nicht resektables

Tumorstadium mit einer durchschnittlichen Lebenserwartung von 4-6 Monaten auf (Bohmig and

Rosewicz, 2004). Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass die Induktion der Ang-2 Expression

in den Tumorzellen auch zu einer gesteigerten Metastasierung in vivo führt. Es wurden mehr

Lebermetastasen in Ang-2 exprimierenden Tieren gefunden. Zusätzlich wurde auch eine vermehrte

Lymphknotenmetastasierung in Ang-2 exprimierenden Tieren nachgewiesen. Ursache hierfür könnte

neben dem proangiogen Effekt vor allem die neu entdeckte pro-lymphangiogene Wirkung sein.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die selektive und induzierbare Überexpression von Ang-2 im

orthotopen MiaPaCa-2 Modell zu einem Anstieg des Tumorwachstums und zu einer Induktion der

Angiogenese und Metastasierung führte, so dass Ang-2 als prognostischer Faktor und therapeutisches

Target des Pankreaskarzinoms lohnenswert erscheint.

Bereits vor langer Zeit kam der Gedanke auf, dass neben den Tumorzellen selbst die den Tumor

versorgenden Gefäße geeignete therapeutische Angriffsziele darstellen könnten (Burrows and Thorpe,

1994; Folkman et al., 1971). Das Ziel besteht darin, den Tumor von der Blutzufuhr und somit von

Nähr- und Sauerstoffbedarf abzuschneiden. Der Vorteil einer anti-angiogenen Therapie ist vor allem,

dass die Endothelzellen, die Ziele einer anti-angiogenen Therapie, selbst nicht transformiert sind.

Daher sind klassische Mechanismen der Resistenzentwicklung, die oft bei Chemotherapeutika

auftreten, nicht zu erwarten (Marme, 2003). Als Beispiel einer anti-angiogenen Therapie wird hier als

Schlüsselmolekül der Angiogenese die Inhibition des VEGF/R Systems genannt. Den gegenwärtig

wichtigsten Ansatz hierbei stellt die Entwicklung eines rekombinanten, humanisierten Antikörpers

gegen humanes VEGF dar (Bevacizumab, AvastinTM, Genentech/Roche) (Presta et al., 1997).

Klinischen Studien zeigten, dass in Kombination mit einer Chemotherapie das mediane Überleben von

Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom von 15,6 auf 20,3 Monate verbessert werden

konnte (Hurwitz et al., 2004). Auch für das Pankreaskarzinom wird Bevacizumab in klinischen

Studien Phase II getestet (http://www.clinicaltrials.goc/ct/show/NCT00066677 oder NCT00047710).

Nachdem die proangiogene Wirkung für Ang-2 im Pankreaskarzinom mit dieser Arbeit bestätigt

werden konnte, ist auch vorstellbar, dass in einigen Jahren das Ang-2/Tie-2 System Angriffspunkt

neuer Therapien ist.

4.6. Identifizierung neuartiger Endothelzell-unabhängiger Ang-2 Effekte

Neben den bekannten Tie-2 vermittelten Wirkungen von Ang-2 auf Endothelzellen wurde auch

untersucht, ob direkte proliferationsunabhängige Ang-2 Effekte auf die Expression wichtiger

proangiogener und prometastasischer Gene in MiaPaca-2 Zellen vorhanden sind. Hierfür wurde ein

entsprechender Chip der Firma SuperArray ausgewählt.

Die in der vorliegenden Arbeit generierten induzierbaren Ang-2 Zellklone bieten aufgrund ihrer

Regulierbarkeit Vorteile für das Hybridsierungsexperiment. Das gezielte An- und Ausschalten der

http://www.clinicaltrials.goc/ct/show/NCT00066677%20oder%20NCT00047710

Diskussion 94

Genexpression in den Zellen ermöglicht eine zeitlich definierte Expression. Außerdem besitzen die

Zellen den gleichen genetischen Hintergrund, so dass eine Verfälschung der Ergebnisse durch klonale

Variationen ausgeschlossen wird. Der Möglichkeit einer Genexpressionsveränderung durch Dox selbst

wurde durch Normalisierung der Ergebnisse auf die Chipanalyse des MiaPaCa-2 Ausgangsklons ohne

induzierbare Ang-2 Expression -/+ Dox Inkubation begegnet. Eine weitere Kontrolle zum Ausschluss

biologisch nicht bedeutsamer Epiphänomene war die Inkubation von MiaPaCa-2 wt Zellen mit

rekombinantem Ang-2. Nur Effekte, die sowohl Dox-induzierbar (nicht aber Dox-induzierbar in

Kontrollzellen) als auch durch exogene Zugabe von Ang-2 zu beobachten waren, sollten als potentiell

biologisch relevant analysiert werden.

Weiterhin wurde gefordert, dass die Veränderungen mindestens den Faktor 2 bzw. 0.5 betrugen. Im

Ereignis konnte tatsächlich erstmals eine veränderte Expression von Schlüsselgenen der

Metastasierung und Angiogenese durch Ang-2 in Tumorzellen gezeigt werden. Damit einher geht der

erstmalige Beweis, dass Ang-2 unabhängig von seinem Rezeptor Tie-2 Signaltransduktionskaskaden

aktivieren kann. Im Folgenden sollen je drei der tumorbiologisch interessantesten durch Ang-2 hoch-

und herunterregulierten Gene, die bei Metastasierung eine Rolle spielen könnten, im Detail diskutiert

werden.

Zu den herunterregulierten Genen gehört das DCC („deleted in colorectal cancer“), das BrMS1

(„breast metastasis suppressor-1“) und das Caveolin-1. Die mRNAs dieser drei Gene waren nach

endogener Ang-2 Expression und nach exogener Zugabe von rekombinantem Ang-2 vermindert

exprimiert und scheinen zu einer erhöhten Metastasierungsrate zu führen.

Das DCC Gen ist auf dem langen Arm von Chromosom 18 lokalisiert und kodiert für ein

transmembranäres Zelloberflächenmolekül, das Homologien zu Adhesionsmolekülen aufweist (Fearon

et al., 1990). Berichte über eine quantitativ verminderte DCC-Expression in Karzinomen (Itoh et al.,

1993b) und der häufige chromosomale Verlust des DCC-Genlocus 18q21 in vielen soliden Tumoren

sprechen für eine tumorsuppressive Funktion des DCC-Gens. Zudem konnte gezeigt werden, dass in

kolorektalen Karzinomen mit Lebermetastasen die mRNA für DCC herunterreguliert war (Itoh et al.,

1993a). Die Verminderung des DCC Gens könnte wie schon in anderen Tumorentitäten gezeigt zu

einer Reduktion der Tumorwachstums und der Metastasierung führen. Allerdings bleibt die Rolle des

DCC als Tumorsuppressor sehr umstritten. Denn es existieren auch Studien, die über fehlende

Unterschiede in der DCC Expression zwischen Normal- und Tumorgewebe berichten (Gotley et al.,

1996).

Das Caveolin-1 Gen ist auf Chromosom 7q31.1 lokalisiert, einer Region, die in verschiedenen

humanen Tumoren Deletionen aufweißt (Koike et al., 1999; Zenklusen et al., 1994). Diese Daten

lassen gleichzeitig darauf schließen, dass Caveolin-1 als Tumorsuppressor fungiert. Das Protein

Caveolin-1 ist Bestandteil der Membran und ist vielfältig im Organismus involviert. Caveolin-1 ist in

der Lage , Cholesterol zu binden und assoziiert mit einer Reihe von Signalmolekülen, wie Kinasen der

Diskussion 95

Src-Familie, heterotrimeren G-Proteinen und H-Ras (Razani et al., 2002). Im Hinblick auf die

Metastasierung sind widersprüchliche Daten bekannt. Zum einen ist die Caveolin-1 Expression in

Brust- und Lungenkrebs herunterreguliert. Dagegen ist die Expression in Blasen- und

Prostatakarzinom hochreguliert (Williams and Lisanti, 2005). Für die Expression im duktalen

Pankreaskarzinom ist eine erhöhte Caveolin-1 Expression einhergehend mit einer schlechteren

Prognose beschrieben worden (Suzuoki et al., 2002). Unsere Daten zeigen aber, dass durch die

induzierte Ang-2 Expression die Caveolin-1 mRNA vermindert exprimiert wird, was Caveolin-1 eher

als Tumorsuppressorgen beschreiben würde. Die Rolle des Caveolin-1 bleibt weiterhin ungeklärt;

weitere Daten sind erforderlich, um die Rolle des Caveolin-1 Gens im Pankreaskarzinom zu deuten

und eventuelle Verbindungen zu Ang-2 zu evaluieren.

BrMS1 ist ein bekanntes Metastasierungssuppressorgen, mit erhöhtem Expressionslevel in

Mammakarzinom- und Melanomzelllinien mit der Funktion der Reduzierung des

Metastasierungspotentials, ohne das Primärtumorwachstum zu beeinflussen (Seraj et al., 2000). Der

eigentliche Mechanismus bleibt aber unklar. Auch ist zur Zeit nichts über die Expression von BrMS1

im humanen Pankreaskarzinom bekannt. Gemäß der Annahme einer metastasierungshemmenden

Wirkung von BrMS1 im Pankreaskarzinom, würde eine Herunterregulation des Gens durch Ang-2 zu

einer metastasierungsfördernden Wirkung führen. Erst kürzlich wurde auch eine inverse Korrelation

zwischen der BrMS1 und der uPA-Genexpression beschrieben (Cicek et al., 2005), die wir nach

Ang-2 Expression/Zugabe in MiaPaCa-2 Zellen auch beobachten können.

Da therapeutisch häufig relevanter, lag unser Interesse besonders auf Kandidatengenen, die durch

Ang-2 hochreguliert werden und somit verstärkend auf Metastasierung wirken.

Die Metastasierung beginnt immer mit einer Veränderung der Zell-Zell-Adhäsion, welche die

Voraussetzung für eine Dissoziation der Tumorzellen aus dem Primärtumor ist. Es folgt eine lokale

Invasion und Migration unter proteolytischer Degradation der extrazellulären Matrix des umgebenden

Gewebes. Nach Intravasation in die periphere Blutzirkulation müssen die Zellen zunächst der

Immunabwehr entkommen, um schließlich an anderer Stelle wieder zu invadieren, um eine Metastase

zu bilden. Invasion und Metastasierung sind also abhängig von dem Zusammenspiel von

verschiedenen Zelladhäsionsmolekülen und der Aktivität verschiedener Proteasesysteme (Guo and

Giancotti, 2004).

In dem Zusammenhang fiel in dieser Arbeit die Detektion der Ang-2 induzierten Genexpression des

Integrin ß1 auf, welches eine Untereinheit der Integrine bildet. Integrine sind transmembrane α/β-

Heterodimere, deren Untereinheiten nichtkovalent miteinander verknüpft sind. Bisher sind 18 α- und 8

β-Ketten bekannt, die in 24 verschiedenen Paarungen auftreten können (Arnaout et al., 2005; Hynes,

2002). Sie spielen in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, wie Zellmotilität, Inflammation,

Geweberemodulierung und Tumorgenese eine wesentliche Rolle. Integrine binden gemäß ihrer breit

gefächerten Funktionen an ein breites Spektrum von Liganden, wie z.B. Fibronektin, Laminin,

Diskussion 96

Vitronektin und Kollagen (Hynes, 2002). Die Ang-2 induzierte Hochregulation der Integrin ß1 mRNA

führt höchst wahrscheinlich zu einer erhöhten Adhäsionsfähigkeit der Tumorzellen an ß1 Integrine

(z.B. Fibronektin, Kollagen, Laminin). Eine erhöhte ß1 Integrin Expression wurde schon früher mit

einer erhöhten Metastasierung in einigen anderen Karzinomen beobachtet (Arboleda et al., 2003;

Fujita et al., 1995; Morini et al., 2000).

Viel interessanter war die Tatsache, dass sich unter den hochregulierten Genen auch der Urokinase-

Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (uPAR), der zum Urokinase-Plasminogen-Aktivator-(uPA)-System

gehört, befand. uPA spielt eine zentrale Rolle in der Plasminogenaktivierung. uPA wird in seiner

inaktiven Vorform (pro-uPA) von verschiedenen Zellen sezerniert und anschließend von

Gewebeproteasen in seine aktive Form gespalten. Pro-uPA und uPA können an den

zellmembranständigen Rezeptor (uPAR) binden. Der uPAR stellt eine wichtige Verbindung zwischen

Adhäsion und Migration von Zellen dar. Durch die Bindung von uPA an uPAR wird Plasminogen zu

Plasmin umgewandelt, welches seinerseits den Abbau der EZM fördert. Der Abbau der EZM

ermöglicht es den Tumorzellen, in angrenzendes Gewebe und schließlich ins Blut einzudringen (Blasi

and Carmeliet, 2002).

Neben den typischen Liganden (uPA und pro-uPA) wurden weitere uPAR-assoziierte Proteine

beschrieben. Es wurde ein Zusammenhang von uPAR mit den verschiedensten Adhäsionsmolekülen

beschrieben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass uPAR direkt mit Integrinen der ß1-Subfamilie

interagiert und speziell die Bindung α5ß1 (Fibronektin) Integrin und dessen Funktion reguliert (Wei

et al., 2005). Daneben bindet uPAR aber auch Vitronektin, eine Komponente der extrazellulären

Matrix. Durch die Überexpression von uPAR wird die Zelladhäsion an Fibronektin unterdrückt,

während gleichzeitig eine verstärkte Affinität für Vitronektin auftritt (Waltz and Chapman, 1994).

Diese Beobachtung ist für die vorliegende Arbeit besonders von Bedeutung, da durch die Expression

bzw. Zugabe von Ang-2 in den Zellen nicht nur uPAR, sondern auch die mRNA des Liganden

Vitronektin erhöht gefunden wurde. Vitronektin ist ein multifunktionelles Glykoprotein, das im

Blutplasma des Menschen (Preissner et al., 1985), aber auch in der extrazellulären Matrix

verschiedener Gewebe (Hayman et al., 1983) nachweisbar ist. Durch die Gliederung in räumlich und

funktionell voneinander getrennte Domänen ist das Vitronektin-Molekül zur Interaktion und

Komplexbildung mit einer Vielzahl von Membranrezeptoren und Proteinen befähigt, was seinen

multifunktionellen Charakter bedingt. Vitronektin fördert unter anderem die Anheftung und

Ausbreitung der Zellen (Suzuki et al., 1984). Eine durch Ang-2 induzierte Überexpression von

Vitronektin könnte in dem Zusammenhang das Ausbreiten und Anheften der Tumorzellen erleichtern.

Vitronektin besitzt zudem die Fähigkeit an uPAR zu binden, dadurch zelluläre Kontakte und

Kooperationen mit Integrinen oder anderen Bestandteilen auf der Zelloberflächezu vermitteln, und auf

diese Weise in die Signaltransduktion einzugreifen. Vorstellbar wäre das Vitronektin an Zellen bindet,

Diskussion 97

die kein uPAR exprimieren, um uPA/uPAR zu binden und damit die Proteolyse auszulösen. Dieser

ternäre Komplex wurde z.B. u.a. auch bei Brustkrebs im Gewebe nachgewiesen (Carriero et al., 1997).

Folgende Hypothese wird anhand der vorliegenden Daten erstellt. Ang-2 exprimierende MiaPaCa-2

Zellen erwerben, durch die veränderte Expression von Adhäsions- und Proteasemolekülen, einen

Wachstums- und Überlebensvorteil, wodurch es zu einer verstärkten Metastasierung kommt. Anhand

der Abbildung 42 soll folgendes postuliert werden: Wenn die erhöhte Ang-2 Expression zu einer

verstärkten Expression von Vitronektin, ß1 Integrinen und uPAR führt, könnte es (i) zu einer

veränderten Adhäsion der Tumorzellen aufgrund der veränderten Integrinverteilung an der

Tumorzelloberfläche kommen; (ii) zu einem verstärkten Abbau der extrazellulären Matrix über uPAR

und (iii) zu einer veränderten Proliferation und Migration der Tumorzellen über Vitronektin kommen.

Um diese Hypothesen zu untersuchen, müssen als erstes die Chip Daten auf mRNA und Proteinebene

bestätigt werden. Erst nach Bestätigung der veränderten Expression dieser Gene, sollte die

Beschaffenheit der Tumorzelloberfläche im Hinblick auf Integrine untersucht werden. Gleichzeitig

sollte die Adhäsion der Zellen bei Ang-2 Überexpression und nach exogener Zugabe von

rekombinantem Ang-2 beobachtet werden. Zusätzliche Untersuchungen könnten Migrations- und

Invasionsassays sein.

bb. 42: Hypothese der direkten Ang-2 Wirkung in MiaPaCa-2 Zellen. ei Überexpression von Ang-2 kommt es zu einer erhöhten Expression von Vitronektin, ß1 Integrinen und AR auf der Tumorzelloberfläche. ß1 Integrine vermitteln die Adhäsion der Zellen an Fibronektine, Lamine

nd Kollagene. Vitronektin erhöht die Fähigkeit der Zellen sich auszubreiten bzw. sich anzuheften. Zudem kann itronektin ebenfalls an PAR binden und über die Aktivierung des Fibronektin Rezeptors (α5ß3) den MAPK-ignalweg aktivieren. Dies führt zur Proliferation der Zellen. Eine erhöhte Expression von uPAR führt zu einem erstärkten Abbau der EZM.

ABuPuVSv

Literatur 98

5. Literatur

dachi,Y., Lakka,S.S., Chandrasekar,N., Yanamandra,N., Gondi,C.S., Mohanam,S., Dinh,D.H., livero,W.C., Gujrati,M., Tamiya,T., Ohmoto,T., Kouraklis,G., Aggarwal,B., and Rao,J.S. (2001). own-regulation of integrin alpha(v)beta(3) expression and integrin-mediated signaling in glioma

ells by adenovirus-mediated transfer of antisense urokinase-type plasminogen activator receptor PAR) and sense p16 genes. J. Biol. Chem. 276, 47171-47177.

haheen,R.M., Bucana,C.D., and

Alves,F., Contag,S., Missbach,M., Kaspareit,J., Nebendahl,K., Borchers,U., Heidrich,B., Streich,R., and Hiddemann,W. (2001). An orthotopic model of ductal adenocarcinoma of the pancreas in severe combined immunodeficient mice representing all steps of the metastatic cascade. Pancreas 23, 227-235.

Anderson,R.G.W. (1998). The caveolae membrane system. Annual Review of Biochemistry 67, 199-225.

Andreasen,P.A., Kjoller,L., Christensen,L., and Duffy,M.J. (1997). The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: A review. International Journal of Cancer 72, 1-22.

Araya,M., Terashima,M., Takagane,A., Abe,K., Nishizuka,S., Yonezawa,H., Irinoda,T., Nakaya,T., and Saito,K. (1997). Microvessel count predicts metastasis and prognosis in patients with gastric cancer. Journal of Surgical Oncology 65, 232-236.

Arboleda,M.J., Lyons,J.F., Kabbinavar,F.F., Bray,M.R., Snow,B.E., Ayala,R., Danino,M., Karlan,B.Y., and Slamon,D.J. (2003). Overexpression of AKT2/protein kinase B beta leads to up-regulation of beta 1 integrins, increased invasion, and metastasis of human breast and ovarian cancer cells. Cancer Research 63, 196-206.

Arnaout,M.A., Mahalingam,B., and Xiong,J.P. (2005). INTEGRIN STRUCTURE, ALLOSTERY, AND BIDIRECTIONAL SIGNALING. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 381-410.

Bardeesy,N., Morgan,J., Sinha,M., Signoretti,S., Srivastava,S., Loda,M., Merlino,G., and DePinho,R.A. (2002a). Obligate roles for p16(Ink4a) and p19(Arf)-p53 in the suppression of murine pancreatic neoplasia. Molecular and Cellular Biology 22, 635-643.

Bardeesy,N., Morgan,J., Sinha,M., Signoretti,S., Srivastava,S., Loda,M., Merlino,G., and DePinho,R.A. (2002b). Obligate roles for p16(Ink4a) and p19(Arf)-p53 in the suppression of murine pancreatic neoplasia. Molecular and Cellular Biology 22, 635-643.

Bender,F.C., Reymond,M.A., Bron,C., and Quest,A.F.G. (2000). Caveolin-1 levels are down-regulated in human colon tumors, and ectopic expression of caveolin-1 in colon carcinoma cell lines reduces cell tumorigenicity. Cancer Research 60, 5870-5878.

AODc(u

Ahmad,S.A., Liu,W.B., Jung,Y.D., Fan,F., Wilson,M., Reinmuth,N., SEllis,L.M. (2001). The effects of angiopoietin-1 and-2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer. Cancer Research 61, 1255-1259.

Al Rawi,M.A., Mansel,R.E., and Jiang,W.G. (2005). Lymphangiogenesis and its role in cancer. Histol. Histopathol. 20, 283-298.

Literatur 99

Bergers,G. and Benjamin,L.E. (2003). Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nature Reviews Can

Blasi,F. and AR: A versatile signalling orchestrator. Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 932-943.

,H.Q., Tihan,T., Bosze,J., Ferrara,N., Gerber,H.P., Johnson,R.S., and Bergers,G. 003). The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell 4, 133-

f pancreatic adenocarcinoma]. Med.

waiting. British Journal of Cancer 78, 940-944.

Bringold,F. and Serrano,M. (2000). Tumor suppressors and oncogenes in cellular senescence.

Carmeliet,P. and Jain,R.K. (2000). Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407, 249-257.

Stoppelli,M.P., and

n cancer. Lymphatic Continuum:

appa B activity. Cancer Research

ordano,G.G., and Giordano,A. (2001).

cer 3, 401-410.

Carmeliet,P. (2002). uP

Blouw,B., Song(2146.

Bohmig,M. and Rosewicz,S. (2004). Pancreatic carcinoma. Zeitschrift fur Gastroenterologie 42, 261-268.

Bohmig,M., Wiedenmann,B., and Rosewicz,S. (1999). [Therapy oKlin. (Munich) 94, 614-625.

Borre,M., Offersen,B.V., Nerstrom,B., and Overgaard,J. (1998). Microvessel density predicts survival in prostate cancer patients subjected to watchful

Bos,J.L. (1989). ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res. 49, 4682-4689.

Bouvet,M., Ellis,L.M., Nishizaki,M., Fujiwara,T., Liu,W.B., Bucana,C.D., Fang,B.L., Lee,J.J., and Roth,J.A. (1998). Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer down-regulates vascular endothelial growth factor expression and inhibits angiogenesis in human colon cancer. Cancer Research 58, 2288-2292.

Experimental Gerontology 35, 317-329.

Burrows,F.J. and Thorpe,P.E. (1994). Vascular Targeting - A New Approach to the Therapy of Solid Tumors. Pharmacology & Therapeutics 64, 155-174.

Caldas,C., Hahn,S.A., Dacosta,L.T., Redston,M.S., Schutte,M., Seymour,A.B., Weinstein,C.L., Hruban,R.H., Yeo,C.J., and Kern,S.E. (1994). Frequent Somatic Mutations and Homozygous Deletions of the P16 (Mts1) Gene in Pancreatic Adenocarcinoma (Vol 8, Pg 27, 1994). Nature Genetics 8, 410.

Cantero,D., Friess,H., Deflorin,J., Zimmermann,A., Brundler,M.A., Riesle,E., Korc,M., and Buchler,M.W. (1997). Enhanced expression of urokinase plasminogen activator and its receptor in pancreatic carcinoma. British Journal of Cancer 75, 388-395.

Carriero,M.V., DelVecchio,S., Franco,P., Potena,M.I., Chiaradonna,F., Botti,G.,Salvatore,M. (1997). Vitronectin binding to urokinase receptor in human breast cancer. Clinical Cancer Research 3, 1299-1308.

Cassella,M. and Skobe,M. (2002). Lymphatic vessel activation iLymphatic Biology and Disease 979, 120-130.

Cicek,M., Fukuyama,R., Welch,D.R., Sizemore,N., and Casey,G. (2005). Breast cancer metastasis suppressor 1 inhibits gene expression by targeting nuclear factor-k65, 3586-3595.

Claudio,P.P., Stiegler,P., Howard,C.M., Bellan,C., Minimo,C., Tosi,G.M., Rak,J., Kovatich,A., De Fazio,P., Micheli,P., Caputi,M., Leoncini,L., Kerbel,R., Gi

Literatur 100

RB2/p130 gene-enhanced expression down-regulates vascular endothelial growth factor expression and inhibits angiogenesis in vivo. Cancer Research 61, 462-468.

Davis,S., Aldrich,T.H., Jones,P.F., Acheson,A., Compton,D.L., Jain,V., Ryan,T.E., Bruno,J.,

for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression cloning. Cell 87, 1161-1169.

ell Lung-Cancer. Genes Chromosomes & Cancer 14, 164-170.

M.L. (1995). Vascularization of the Mouse Embryo - A Study of Flk-1, Tek, Tie, and Vascular Endothelial Growth-

e Kinase, Tek, Is A Member of A New Subfamily of Receptors. Oncogene 8, 1293-1301.

by pRB-family proteins. Genes & Development 12, 2245-2262.

for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev. Cancer 2, 161-174.

olding domain. Febs Letters 428, 205-211.

ts alpha(v)beta(3) integrin-mediated cell spreading on vitronectin by blocking PKC-dependent

,L., Peng,H.Q., Hogg,D., Roth,J.A., Yu,Y.H., Xu,F.J., Bast,R.C., and Mills,G.B. (1998). Expression of p16 induces transcriptional downregulation of the RB gene.

Fearon,E.R., Cho,K.R., Nigro,J.M., Kern,S.E., Simons,J.W., Ruppert,J.M., Hamilton,S.R.,

Feldman,A.L. and Libutti,S.K. (2000). Progress in antiangiogenic gene therapy of cancer. Cancer 89,

Fidler,I.J. (1991). The Biology of Human Cancer Metastasis. Acta Oncologica 30, 669-675.

Conway,E.M., Collen,D., and Carmeliet,P. (2001). Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc. Res. 49, 507-521.

Craft,P.S. and Harris,A.L. (1994). Clinical Prognostic-Significance of Tumor Angiogenesis. Annals of Oncology 5, 305-311.

Radziejewski,C., Maisonpierre,P.C., and Yancopoulos,G.D. (1996). Isolation of angiopoietin-1, a ligand

Devos,S., Miller,C.W., Takeuchi,S., Gombart,A.F., Cho,S.K., and Koeffler,H.P. (1995). Alterations of Cdkn2 (P16) in Non-Small-C

Duffy,M.J. (2004). The urokinase plasminogen activator system: Role in malignancy. Current Pharmaceutical Design 10, 39-49.

Dumont,D.J., Fong,G.H., Puri,M.C., Gradwohl,G., Alitalo,K., and Breitman,

Factor Expression During Development. Developmental Dynamics 203, 80-92.

Dumont,D.J., Gradwohl,G.J., Fong,G.H., Auerbach,R., and Breitman,M.L. (1993). The Endothelial-Specific Receptor Tyrosin

Dyson,N. (1998). The regulation of E2F

Egeblad,M. and Werb,Z. (2002). New functions

Engelman,J.A., Chu,C., Lin,A., Jo,H., Ikezu,T., Okamoto,T., Kohtz,D.S., and Lisanti,M.P. (1998). Caveolin-mediated regulation of signaling along the p42/44 MAP kinase cascade in vivo - A role for the caveolin-scaff

Etoh,T., Inoue,H., Tanaka,S., Barnard,G.F., Kitano,S., and Mori,M. (2001). Angiopoietin-2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma: Possible in vivo regulation via induction of proteases. Cancer Research 61, 2145-2153.

Fahraeus,R. and Lane,D.P. (1999). The p16(INK4a) tumour suppressor protein inhibi

localization of alpha(v)beta(3) to focal contacts. Embo Journal 18, 2106-2118.

Fang,X.J., Jin,X.M., Xu,H.J., Liu

Oncogene 16, 1-8.

Preisinger,A.C., Thomas,G., Kinzler,K.W., and Vogelstein,B. (1990). Identification of A Chromosome-18Q Gene That Is Altered in Colorectal Cancers. Science 247, 49-56.

1181-1194.

Literatur 101

Fogh,J., Orfeo,T., Tiso,J., Sharkey,F.E., Fogh,J.M., and Daniels,W.P. (1980). 23 New Human-Tumor Lines Established in Nude-Mice. Experimental Cell Biology 48, 229-239.

,E. (1971). Tumor Angiogenesis - Therapeutic Implications. New England Journal of Medicine 285, 1182-&.

growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis in non-small cell lung carcinoma. European Journal of Cancer 34,

Frizelle,S.P., Grim,J., Zhou,J., Gupta,P., Curiel,D.T., Geradts,J., and Kratzke,R.A. (1998). Re-

ncogene 16, 3087-3095.

Gibson,S.L., Dai,C.Y., Lee,H.W., DePinho,R.A., Gee,M.S., Lee,W.M.F., Furth,E.E., Brensinger,C.,

ancer Research 63, 742-746.

dings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551.

expressed in colorectal cancers and metastases. Oncogene 13, 787-795.

r diseases, and chronic inflammation. Pharmacological Reviews 52, 237-268.

Hanahan,D. and Weinberg,R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70.

r expression and inhibits angiogenesis in human gliomas. Cancer Research 59, 3783-3789.

rama,T., Takeuchi,S., Lee,E., Pham,E., Miller,C.W., Strohmeyer,T., Wilczynski,S.P., Melmed,S., and Koeffler,H.P. (1995). Alterations of the P16 (Mts1) Gene in Testicular, Ovarian, and

Folkman,J. (1995). Angiogenesis in Cancer, Vascular, Rheumatoid and Other Disease. Nature Medicine 1, 27-31.

Folkman,J., Bach,M., Rowe,J.W., Davidoff,F., Lambert,P., Hirsch,C., Goldberg,A., Hiatt,H.H., Glass,J., and Henshaw

Fontanini,G., Boldrini,L., Vignati,S., Chine,S., Basolo,F., Silvestri,V., Lucchi,M., Mussi,A., Angeletti,C.A., and Bevilacqua,G. (1998). Bcl2 and p53 regulate vascular endothelial

718-723.

expression of p16(INK4a) in mesothelioma cells results in cell cycle arrest, cell death, tumor suppression and tumor regression. O

Fujita,S., Watanabe,M., Kubota,T., Teramoto,T., and Kitajima,M. (1995). Alteration of Expression in Integrin Beta(1)-Subunit Correlates with Invasion and Metastasis in Colorectal-Cancer. Cancer Letters 91, 145-149.

Gallia,G.L. and Khalili,K. (1998). Evaluation of an autoregulatory tetracycline regulated system. Oncogene 16, 1879-1884.

and Enders,G.H. (2003). Inhibition of colon tumor progression and angiogenesis by the Ink4a/Arf locus. C

Gossen,M. and Bujard,H. (1992). Tight Control of Gene-Expression in Mammalian-Cells by Tetracycline-Responsive Promoters. Procee

Gotley,D.C., Reeder,J.A., Fawcett,J., Walsh,M.D., Bates,P., Simmons,D.L., and Antalis,T.M. (1996). The deleted in colon cancer (DCC) gene is consistently

Griffioen,A.W. and Molema,G. (2000). Angiogenesis: Potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascula

Guo,W.J. and Giancotti,F.G. (2004). Integrin signalling during tumour progression. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 816-826.

Hanahan,D. and Folkman,J. (1996). Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 86, 353-364.

Harada,H., Nakagawa,K., Iwata,S., Saito,M., Kumon,Y., Sakaki,S., Sato,K., and Hamada,K. (1999). Restoration of wild-type p16 down-regulates vascular endothelial growth facto

Hatta,Y., Hi

Endometrial Malignancies. Journal of Urology 154, 1954-1957.

Literatur 102

Hayes,A.J., Huang,W.Q., Yu,J., Maisonpierre,P.C., Liu,A., Kern,F.G., Lippman,M.E., McLeskey,S.W., and Li,L.Y. (2000). Expression and function of angiopoietin-1 in breast cancer. British Journal of Cancer 83, 1154-1160.

chbacher,M.D., Ohgren,Y., and Ruoslahti,E. (1983). Serum Spreading Factor (Vitronectin) Is Present at the Cell-Surface and in Tissues. Proceedings of the National Academy of

Schollmeier,K., and Meier,I. (1983). Control of Expression of the Tn10-Encoded Tetracycline Resistance Genes - Equilibrium and Kinetic Investigation of the

and,S.J. (1999a). Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science 284, 1994-1998.

angiopoietins and VEGF. Oncogene 18, 5356-5362.

mpton,C., Fukushima,N., Furukawa,T., Goggins,M., Kato,Y., Kloppel,G., Longnecker,D.S., Luttges,J., Maitra,A., Offerhaus,G.J.A., Shimizu,M., and Yonezawa,S. (2004). An

ms. American Journal of Surgical Pathology 28, 977-987.

an, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. New England Journal of Medicine 350, 2335-2342.

Itoh,F., Hinoda,Y., Ohe,M., Ohe,Y., Ban,T., Endo,T., Imai,K., and Yachi,A. (1993a). Decreased

Itoh,F., Hinoda,Y., Ohe,M., Ohe,Y., Ban,T., Endo,T., Imai,K., and Yachi,A. (1993b). Decreased

cer Journal for Clinicians 55, 10-30.

ok-related docking protein, Dok-R. Oncogene 17, 1097-1108.

, 257-267.

Hayman,E.G., Piers

Sciences of the United States of America-Biological Sciences 80, 4003-4007.

Hillen,W., Gatz,C., Altschmied,L.,

Regulatory Reactions. Journal of Molecular Biology 169, 707-721.

Holash,J., Maisonpierre,P.C., Compton,D., Boland,P., Alexander,C.R., Zagzag,D., Yancopoulos,G.D., and Wieg

Holash,J., Wiegand,S.J., and Yancopoulos,G.D. (1999b). New model of tumor angiogenesis: dynamic balance between vessel regression and growth mediated by

Hruban,R.H., Takaori,K., Klimstra,D.S., Adsay,N.V., Albores-Saavedra,J., Biankin,A.V., Biankin,S.A., Co

illustrated consensus on the classification of pancreatic Intraepithelial neoplasia and intraductal papillary mucinous neoplas

Huang,L., Turck,C.W., Rao,P., and Peters,K.G. (1995). GRB2 and SH-PTP2: potentially important endothelial signaling molecules downstream of the TEK/TIE2 receptor tyrosine kinase. Oncogene 11, 2097-2103.

Hurwitz,H., Fehrenbacher,L., Novotny,W., Cartwright,T., Hainsworth,J., Heim,W., Berlin,J., Baron,A., Griffing,S., Holmgren,E., Ferrara,N., Fyfe,G., Rogers,B., Ross,R., and Kabbinavar,F. (2004). Bevacizumab plus irinotec

Hynes,R.O. (2002). Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110, 673-687.

Expression of Dcc Messenger-Rna in Human Colorectal Cancers. International Journal of Cancer 53, 260-263.

Expression of Dcc Messenger-Rna in Human Colorectal Cancers. International Journal of Cancer 53, 260-263.

Jemal,A., Murray,T., Ward,E., Samuels,A., Tiwari,R.C., Ghafoor,A., Feuer,E.J., and Thun,M.J. (2005). Cancer statistics, 2005. Ca-A Can

Jones,N. and Dumont,D.J. (1998). The Tek/Tie2 receptor signals through a novel D

Jones,N., Iljin,K., Dumont,D.J., and Alitalo,K. (2001). Tie receptors: New modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2

Kalluri,R. (2003). Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat. Rev. Cancer 3, 422-433.

Literatur 103

Kamb,A., Shattuckeidens,D., Eeles,R., Liu,Q., Gruis,N.A., Ding,W., Hussey,C., Tran,T., Miki,Y., Weaverfeldhaus,J., Mcclure,M., Aitken,J.F., Anderson,D.E., Bergman,W., Frants,R., Goldgar,D.E., Green,A., Maclennan,R., Martin,N.G., Meyer,L.J., Youl,P., Zone,J.J., Skolnick,M.H., and Cannonalbright,L.A. (1994). Analysis of the P16 Gene (Cdkn2) As A Candidate for the Chromosome

ary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer and Metastasis Reviews 17, 279-284.

/Akt signal transduction pathway. Circ. Res. 86, 24-29.

phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Oncogene 19, 4549-4552.

Klagsbrun,M. and Moses,M.A. (1999). Molecular angiogenesis. Chemistry & Biology 6, R217-R224.

(1999). Ovarian cancer: Loss of heterozygosity frequently occurs in the ATM gene, but structural alterations do not

, Stauffer,T.P., Yang,W.P., York,J.D., Huang,L.W., Blanar,M.A., Meyer,T., and Peters,K.G. (1998). Tyrosine 1101 of Tie2 is the major site of association of p85 and is required for

e 413, 83-86.

growth inhibition by caveolin re-expression in human breast cancer cells. Oncogene 16, 1391-1397.

etics of Cancer - An American Association for Cancer Research Special Conference - Las Croabas, Puerto Rico, 12-16 1997 December. Molecular Medicine Today 4, 102-103.

Liggett,W.H. and Sidransky,D. (1998). Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer. Journal of

Lukas,J., Parry,D., Aagaard,L., Mann,D.J., Bartkova,J., Strauss,M., Peters,G., and Bartek,J. (1995).

ncopoulos,G.D. (1997). Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 277,

9P Melanoma Susceptibility Locus. Nature Genetics 8, 22-26.

Killion,J.J., Radinsky,R., and Fidler,I.J. (1998). Orthotopic models are necess

Kim,I., Kim,H.G., So,J.N., Kim,J.H., Kwak,H.J., and Koh,G.Y. (2000a). Angiopoietin-1 regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-Kinase

Kim,I., Kim,J.H., Moon,S.O., Kwak,H.J., Kim,N.G., and Koh,G.Y. (2000b). Angiopoietin-2 at high concentration can enhance endothelial cell survival through the

Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. (1996). Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 87, 159-170.

Koh,G.Y., Kim,I., Kwak,H.J., Yun,M.J., and Leem,J.C. (2002). Biomedical significance of endothelial cell specific growth factor, angiopoietin. Experimental and Molecular Medicine 34, 1-11.

Koike,M., Takeuchi,S., Park,S., Hatta,Y., Yokota,J., Tsuruoka,N., and Koeffler,H.P.

occur in this gene. Oncology 56, 160-163.

Kontos,C.D.

activation of phosphatidylinositol 3-kinase and Akt. Molecular and Cellular Biology 18, 4131-4140.

Krimpenfort,P., Quon,K.C., Mooi,W.J., Loonstra,A., and Berns,A. (2001). Loss of p16(Ink4a) confers susceptibility to metastatic melanoma in mice. Natur

Lee,S.W., Reimer,C.L., Oh,P., Campbell,D.B., and Schnitzer,J.E. (1998). Tumor cell

Lengauer,C. and Issa,J.P. (1998). The role of epigenetics in cancer - DNA methylation, Imprinting and the Epigen

Lewin,B. (1998). Molekularbiologie der Gene. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin.

Clinical Oncology 16, 1197-1206.

Retinoblastoma-Protein-Dependent Cell-Cycle Inhibition by the Tumor-Suppressor P16. Nature 375, 503-506.

Maisonpierre,P.C., Suri,C., Jones,P.F., Bartunkova,S., Wiegand,S.J., Radziejewski,C., Compton,D., McClain,J., Aldrich,T.H., Papadopoulos,N., Daly,T.J., Davis,S., Sato,T.N., and Ya

55-60.

Literatur 104

Marincola,F.M., Drucker,B.J., Siao,D.Y., Hough,K.L., and Holder,W.D., Jr. (1989). The nude mouse as a model for the study of human pancreatic cancer. J. Surg. Res. 47, 520-529.

Marme,D. (2003). The impact of anti-angiogenic agents on cancer therapy. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 129, 607-620.

Mattila,M.M.T., Ruohola,J.K., Karpanen,T., Jackson,D.G., Alitalo,K., and Harkonen,P.L. (2002). VEGF-C induced lymphangiogenesis is associated with lymph node metastasis in orthotopic MCF-7 tumors. International Journal of Cancer 98, 946-951.

etinoblastoma Protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 6289-6293.

th Transcriptional Silencing of the Tumor-Suppressor P16/Cdkn2/Mts1 in Human Cancers. Nature Medicine 1, 686-692.

Michael,D. and Oren,M. (2002). The p53 and Mdm2 families in cancer. Current Opinion in Genetics

pression in human lung cancer cell lines. 12[8], 335-342. 2005.

: development of small molecule tyrosine kinase inhibitors as anti-tumor and anti-angiogenic agents. Oncogene 19, 6574-6583.

ll metastasis, invasion, and gelatinase B (MMP-9) activity. International Journal of Cancer 87, 336-342.

turm,J.W., Richter,A., and Post,S. (2002). High expression of vascular endothelial growth factor predicts early recurrence and poor

No,D., Yao,T.P., and Evans,R.M. (1996). Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells

Nobori,T., Miura,K., Wu,D.J., Lois,A., Takabayashi,K., and Carson,D.A. (1994). Deletions of the

-2, and its clinical significance in human bladder cancer. Bju International 95, 660-663.

ochimica et Biophysica Acta-Reviews on Cancer 1602, 73-87.

Plate,K.H., Breier,G., and Risau,W. (1994). Molecular Mechanisms of Developmental and Tumor Angiogenesis. Brain Pathology 4, 207-218.

Medema,R.H., Herrera,R.E., Lam,F., and Weinberg,R.A. (1995). Growth Suppression by P16(Ink4) Requires Functional R

Merlo,A., Herman,J.G., Mao,L., Lee,D.J., Gabrielson,E., Burger,P.C., Baylin,S.B., and Sidransky,D. (1995). 5' Cpg Island Methylation Is Associated wi

& Development 12, 53-59.

Miki K, Shimizu E, Yano S, Tani K, and Sone S. Demethylation by 5-aza-2´-deoxycytidine (5-azadC) of p16INK4A gene results in downregulation of vascular endothelial growth factor ex

Ref Type: Generic

Morin,M.J. (2000). From oncogene to drug

Morini,M., Mottolese,M., Ferrari,N., Ghiorzo,F., Buglioni,S., Mortarini,R., Noonan,D.M., Natali,P.G., and Albini,A. (2000). The alpha 3 beta 1 integrin is associated with mammary carcinoma ce

Niedergethmann,M., Hildenbrand,R., Wostbrock,B., Hartel,M., S

prognosis after curative resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas. Pancreas 25, 122-129.

and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93, 3346-3351.

Cyclin-Dependent Kinase-4 Inhibitor Gene in Multiple Human Cancers. Nature 368, 753-756.

Oka,N., Yamamoto,Y., Takahashi,M., Nishitani,M., Kanayama,H.O., and Kagawa,S. (2005). Expression of angiopoietin-1 and

Ortega,S., Malumbres,M., and Barbacid,M. (2002). Cyclin D-dependent kinases, INK4 inhibitors and cancer. Bi

Papapetropoulos,A., Fulton,D., Mahboubi,K., Kalb,R.G., O'Connor,D.S., Li,F.Z., Altieri,D.C., and Sessa,W.C. (2000). Angiopoietin-1 inhibits endothelial cell apoptosis via the Akt/survivin pathway. Journal of Biological Chemistry 275, 9102-9105.

Literatur 105

Plath,T., Detjen,K., Welzel,M., Von Marschall,Z., Murphy,D., Schirner,M., Wiedenmann,B., and Rosewicz,S. (2000). A novel function for the tumor suppressor p16(INK4a): Induction of anoikis via upregulation of the alpha(5)beta(1) fibronectin receptor. Journal of Cell Biology 150, 1467-1477.

on Marschall,Z., Radke,C., Wiedenmann,B., and Rosewicz,T. (2002). Overexpression of pRB in human pancreatic carcinoma cells: Function in

cleotide-Sequence of the Repressor Gene of the Tn10 Tetracycline Resistance Determinant. Nucleic Acids Research 12, 4849-4863.

Blood-Coagulation System. Biochemical Journal 231, 349-355.

r monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Research 57, 4593-4599.

, Lee,W.M.F., and Yeilding,N.M. (1999). Angiopoietin-1 and-2 coiled coil domains mediate distinct homo-oligomerization patterns, but fibrinogen-like domains mediate ligand

resoldi,M., Raggi,F., Baldessari,C., Freschi,M., a,M., Neri,A., Carboni,N., Bertolini,F., and Viale,G. (2002). Microvessel density,

a surrogate marker of angiogenesis, is significantly related to survival in multiple myeloma patients.

Pschyrembel. Medizinisches Wörterbuch , Verlag: Walter de Gryter, 257. Auflage. 1990.

P15(Ink4B) Genes. Oncogene 11, 635-645.

ch Communications 255, 580-586.

ical Reviews 54, 431-467.

lignant-Tissues. Cancer Research 54, 4493-4501.

Rocco,J.W., Li,D.Q., Liggett,W.H., Duan,L., Saunders,J.K., Sidransky,D., and O'Malley,B.W. (1998).

Rosewicz,S. and Wiedenmann,B. (1997). Pancreatic carcinoma. Lancet 349, 485-489.

Plath,T., Peters,M., Detjen,K., Welzel,M., V

chemotherapy-induced apoptosis. Journal of the National Cancer Institute 94, 129-142.

Postle,K., Nguyen,T.T., and Bertrand,K.P. (1984). Nu

Preissner,K.T., Wassmuth,R., and Mullerberghaus,G. (1985). Physicochemical Characterization of Human S-Protein and Its Function in the

Presta,L.G., Chen,H., OConnor,S.J., Chisholm,V., Meng,Y.G., Krummen,L., Winkler,M., and Ferrara,N. (1997). Humanization of an anti-vascular endothelial growth facto

Procopio,W.N., Pelavin,P.I.

activity. Journal of Biological Chemistry 274, 30196-30201.

Pruneri,G., Ponzoni,M., Ferreri,A.J.M., Decarli,N., TBaldini,L., Goldanig

British Journal of Haematology 118, 817-820.

Quelle,D.E., Ashmun,R.A., Hannon,G.J., Rehberger,P.A., Trono,D., Richter,K.H., Walker,C., Beach,D., Sherr,C.J., and Serrano,M. (1995). Cloning and Characterization of Murine P16(Ink4A) and

Racine,C., Belanger,M., Hirabayashi,H., Boucher,M., Chakir,J., and Couet,J. (1999). Reduction of caveolin 1 gene expression in lung carcinoma cell lines. Biochemical and Biophysical Resear

Razani,B., Woodman,S.E., and Lisanti,M.P. (2002). Caveolae: From cell biology to animal physiology. Pharmacolog

Reale,M.A., Hu,G., Zafar,A.I., Getzenberg,R.H., Levine,S.M., and Fearon,E.R. (1994). Expression and Alternative Splicing of the Deleted in Colorectal-Cancer (Dcc) Gene in Normal and Ma

Risau,W. and Flamme,I. (1995). Vasculogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91.

P16(INK4A) adenovirus-mediated gene therapy for human head and neck squamous cell cancer. Clinical Cancer Research 4, 1697-1704.

Rocco,J.W. and Sidransky,D. (2001). p16(MTS-1/CDKN2/INK4a) in cancer progression. Experimental Cell Research 264, 42-55.

Literatur 106

Rothenberg,M.L., Abbruzzese,J.L., Moore,M., Portenoy,R.K., Robertson,J.M., and Wanebo,H.J. (1996). A rationale for expanding the endpoints for clinical trials in advanced pancreatic carcinoma. Cancer 78, 627-632.

Rozenblum,E., Schutte,M., Goggins,M., Hahn,S.A., Panzer,S., Zahurak,M., Goodman,S.N., Sohn,T.A., Hruban,R.H., Yeo,C.J., and Kern,S.E. (1997). Tumor-suppressive pathways in pancreatic carcinoma. Cancer Research 57, 1731-1734.

Ruas,M. and Peters,G. (1998). The p16(INK4a)/CDKN2A tumor suppressor and its relatives. Biochimica et Biophysica Acta-Reviews on Cancer 1378, F115-F177.

Saharinen,P., Tammela,T., Karkkainen,M.J., and Alitalo,K. (2004). Lymphatic vasculature: development, molecular regulation and role in tumor metastasis and inflammation. Trends in Immunology 25, 387-395.

s of America 90, 12056.

stinct Roles of the Receptor Tyrosine Kinases Tie-1 and Tie-2 in Blood-Vessel Formation. Nature 376, 70-74.

Schutte,M. (1999). DPC4/SMAD4 gene alterations in human cancer, and their functional implications.

e pathway in virtually all pancreatic carcinomas. Cancer Research 57, 3126-3130.

tasis suppressor, BRMS1, encoded at chromosome 11q13. Cancer Research 60, 2764-2769.

ental Cell Research 237, 7-13.

Serrano,M., Lin,A.W., McCurrach,M.E., Beach,D., and Lowe,S.W. (1997). Oncogenic ras provokes , 593-602.

Sharpless,N.E., Bardeesy,N., Lee,K.H., Carrasco,D., Castrillon,D.H., Aguirre,A.J., Wu,E.A.,

.

Sherr,C.J. (2001a). Parsing Ink4a/Arf: "Pure" p16-null mice. Cell 106, 531-534.

Sato,T.N., Qin,Y., Kozak,C.A., and Audus,K.L. (1993). Tie-1 and Tie-2 Define Another Class of Putative Receptor Tyrosine Kinase Genes Expressed in Early Embryonic Vascular System (Vol 90, Pg 9355, 1993). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State

Sato,T.N., Tozawa,Y., Deutsch,U., Wolburgbuchholz,K., Fujiwara,Y., Gendronmaguire,M., Gridley,T., Wolburg,H., Risau,W., and Qin,Y. (1995). Di

Schneider,G., Lersch,C., and Schmid,R.M. (2003). Pancreatic carcinogenesis. Clinical implications. Chirurg 74, 165-170.

Annals of Oncology 10, 56-59.

Schutte,M., Hruban,R.H., Geradts,J., Maynard,R., Hilgers,W., Rabindran,S.K., Moskaluk,C.A., Hahn,S.A., SchwarteWaldhoff,I., Schmiegel,W., Baylin,S.B., Kern,S.E., and Herman,J.G. (1997). Abrogation of the Rb/p16 tumor-suppressiv

Seraj,M.J., Samant,R.S., Verderame,M.F., and Welch,D.R. (2000). Functional evidence for a novel human breast carcinoma metas

Serrano,M. (1997). The tumor suppressor protein p16(INK4a). Experim

Serrano,M., Hannon,G.J., and Beach,D. (1993). A New Regulatory Motif in Cell-Cycle Control Causing Specific-Inhibition of Cyclin-D/Cdk4. Nature 366, 704-707.

premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16(INK4a). Cell 88

Sharpless,N.E. (2005). INK4a/ARF: A multifunctional tumor suppressor locus. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 576, 22-38.

Horner,J.W., and DePinho,R.A. (2001). Loss of p16(Ink4a) with retention of p19(Arf) predisposes mice to tumorigenesis. Nature 413, 86-91

Sherr,C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science 274, 1672-1677.

Literatur 107

Sherr,C.J. (2001b). The INK4a/ARF network in tumour suppression. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 731-737.

Sherr,C.J. and Roberts,J.M. (1995). Inhibitors of Mammalian G(1) Cyclin-Dependent Kinases. Genes

chmidt,J., Kortner,G., and Arnold,R. (1994). Frequent Alterations of the Tumor-Suppressor Genes P53 and Dcc in Human Pancreatic-Carcinoma.

Skobe,M., Hawighorst,T., Jackson,D.G., Prevo,R., Janes,L., Velasco,P., Riccardi,L., Alitalo,K.,

Spillare,E.A., Okamoto,A., Hagiwara,K., Demetrick,D.J., Serrano,M., Beach,D., and Harris,C.C.

S.A., Baldwin,M.E., and Achen,M.G. (2002). The role of tumor lymphangiogenesis in metastatic spread. Faseb Journal 16, 922-934.

e metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nature Medicine 7, 186-191.

,M.B., Ulrich,A., and Pour,P.M. (2001). Experimental animal models in pancreatic carcinogenesis: Lessons for humane pancreatic cancer. Digestive Diseases 19, 24-31.

ww.gbe-bund.de

& Development 9, 1149-1163.

Simon,B., Weinel,R., Hohne,M., Watz,J., S

Gastroenterology 106, 1645-1651.

Claffey,K., and Detmar,M. (2001). Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nature Medicine 7, 192-198.

(1996). Suppression of growth in vitro and tumorigenicity in vivo of human carcinoma cell lines by transfected p16(INK4). Molecular Carcinogenesis 16, 53-60.

Stacker,

Stacker,S.A., Caesar,C., Baldwin,M.E., Thornton,G.E., Williams,R.A., Prevo,R., Jackson,D.G., Nishikawa,S., Kubo,H., and Achen,M.G. (2001). VEGF-D promotes th

Standop,J., Schneider

Statistisches Bundesamt. http://w . 2004.

ell 87, 1171-1180.

Active-Sites. Journal of Cell Biology 99, A164.

Nakakubo,Y., Fukunaga,A., Shichinohe,T., Shinohara,T., Itoh,T., Kondo,S., and Katoh,H. (2002). Impact of caveolin-1 expression

Swartz,M.A. and Skobe,M. (2001). Lymphatic function, lymphangiogenesis, and cancer metastasis.

Takanami,I. (2004). Overexpression of Ang-2 mRNA in non-small cell lung cancer: Association with

ization of the Tumorigenic and Metastatic Properties of A Human Pancreatic Tumor-Cell Line (Aspc-1) Implanted Orthotopically Into Nude-Mice. Tumour

Stratmann,A., Risau,W., and Plate,K.H. (1998). Cell type-specific expression of angiopoietin-1 and angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis. American Journal of Pathology 153, 1459-1466.

Suri,C., Jones,P.F., Patan,S., Bartunkova,S., Maisonpierre,P.C., Davis,S., Sato,T.N., and Yancopoulos,G.D. (1996). Requisite role of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. C

Suzuki,S., Pierschbacher,M., and Ruoslahti,E. (1984). Domain-Structure of Vitronectin - Alignment of

Suzuoki,M., Miyamoto,M., Kato,K., Hiraoka,K., Oshikiri,T.,

on prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. British Journal of Cancer 87, 1140-1144.

Microscopy Research and Technique 55, 92-99.

angiogenesis and poor prognosis. Oncology Reports 12, 849-853.

Tan,M.H. and Chu,T.M. (1985). Character

Biology 6, 89-98.

Literatur 108

Tanaka,F., Ishikawa,S., Yanagihara,K., Miyahara,R., Kawano,Y., Li,M., Otake,Y., and Wada,H. (2002). Expression of angiopoietins and its clinical significance in non-small cell lung cancer. Cancer Research 62, 7124-7129.

,Y., Makuuchi,M., Sugimachi,K., and Wands,J.R. (1998). Biologic significance of angiopoietin-2 expression in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 28, 602A.

for breast carcinoma. World Journal of Surgery 25, 798-805.

Investigation 109, 777-785.

poulos,N., Maisonpierre,P.C., Davis,S., and Yancopoulos,G.D. (1999). Angiopoietins 3 and 4: Diverging gene counterparts in mice and

(1994). A Regulatory System for Use in ene-Transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91,

8180-8184.

6, 455-465.

logy 168, 501-511.

arcinoma. American Journal of Pathology 143, 401-409.

Williams,T.M. and Lisanti,M.P. (2005). Caveolin-1 in oncogenic transformation, cancer, and

Witzenbichler,B., Asahara,T., Murohara,T., Silver,M., Spyridopoulos,I., Magner,M., Principe,N.,

Wolff,B. and Naumann,M. (1999). INK4 cell cycle inhibitors direct transcriptional inactivation of NF-kappa B. Oncogene 18, 2663-2666.

Tanaka,S., Mori,M., Sakamoto

Turner,R.R., Giuliano,A.E., Hoon,D.S.B., Glass,E.C., and Krasne,D.L. (2001). Pathologic examination of sentinel lymph node

Vajkoczy,P., Farhadi,M., Gaumann,A., Heidenreich,R., Erber,R., Wunder,A., Tonn,J.C., Menger,M.D., and Breier,G. (2002). Microtumor growth initiates angiogenic sprouting with simultaneous expression of VEGF, VEGF receptor-2, and angiopoietin-2. Journal of Clinical

Valenzuela,D.M., Griffiths,J.A., Rojas,J., Aldrich,T.H., Jones,P.F., Zhou,H., McClain,J., Copeland,N.G., Gilbert,D.J., Jenkins,N.A., Huang,T., Papado

humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 1904-1909.

Vanmeir,E.G., Polverini,P.J., Chazin,V.R., Huang,H.J.S., Detribolet,N., and Cavenee,W.K. (1994). Release of An Inhibitor of Angiogenesis Upon Induction of Wild-Type P53 Expression in Glioblastoma Cells. Nature Genetics 8, 171-176.

Waltz,D.A. and Chapman,H.A. (1994). Reversible Cellular Adhesion to Vitronectin Linked to Urokinase Receptor Occupancy. Journal of Biological Chemistry 269, 14746-14750.

Wang,Y.L., Omalley,B.W., Tsai,S.Y., and Omalley,B.W.G

Warshaw,A.L. and Fernandezdelcastillo,C. (1992). Pancreatic-Carcinoma. New England Journal of Medicine 32

Wei,Y., Czekay,R.P., Robillard,L., Kugler,M.C., Zhang,F., Kim,K.K., Xiong,J.P., Humphries,M.J., and Chapman,H.A. (2005). Regulation of alpha 5 beta 1 integrin conformation and function by urokinase receptor binding. Journal of Cell Bio

Weidner,N., Carroll,P.R., Flax,J., Blumenfeld,W., and Folkman,J. (1993). Tumor Angiogenesis Correlates with Metastasis in Invasive Prostate C

Weidner,N., Semple,J.P., Welch,W.R., and Folkman,J. (1991). Tumor Angiogenesis and Metastasis - Correlation in Invasive Breast-Carcinoma. New England Journal of Medicine 324, 1-8.

Weinberg,R.A. (1994). Oncogenes and tumor suppressor genes. CA Cancer J. Clin. 44, 160-170.

metastasis. American Journal of Physiology-Cell Physiology 288, C494-C506.

Kearney,M., Hu,J.S., and Isner,J.M. (1998). Vascular endothelial growth factor-c (VEGF-C/VEGF-2) promotes angiogenesis in the setting of tissue ischemia. American Journal of Pathology 153, 381-394.

Literatur 109

Xu,Z.L., Mizuguchi,H., Mayumi,T., and Hayakawa,T. (2003). Regulated gene expression from adenovirus vectors: a systematic comparison of various inducible systems. Gene 309, 145-151.

Yamamoto,A., Hen,R., and Dauer,W.T. (2001). The ons and offs of inducible transgenic technology: a

Yancopoulos,G.D., Davis,S., Gale,N.W., Rudge,J.S., Wiegand,S.J., and Holash,J. (2000). Vascular-

Yang,R., Gombart,A.F., Serrano,M., and Koeffler,H.P. (1995). Mutational Effects on the P16(Ink4A)

arcinomas: a possible tumor suppressor gene at 7q31.1. Cancer Res. 54, 6370-6373.

review. Neurobiol. Dis. 8, 923-932.

specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407, 242-248.

Tumor-Suppressor Protein. Cancer Research 55, 2503-2506.

Zenklusen,J.C., Thompson,J.C., Troncoso,P., Kagan,J., and Conti,C.J. (1994). Loss of heterozygosity in human primary prostate c

Danksagung 110

6. Danksagung

erte Unterstützung meiner

n Themas und der Betreuung dieser Arbeit, die ohne Ihn nie Zustande gekommen

Weiterhin danke ich Herrn Dr. med. Arne Scholz für die engagierte Betreuung und

Motivation in den letzten 2 Jahren bei der Fortführung und Vollendung dieser Arbeit.

Ich danke auch Herrn Prof. Wiedenmann für die Unterstützung im Rahmen des

Graduiertenkollegs 276/3 „Signalerkennung und –umsetzung“, durch die mein Stipendium

der DFG gefördert wurde.

Weiterhin bedanke ich mich bei Frau Katharina Detjen für ihre Unterstützung und die stete

Diskussionsbereitschaft, die wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.

Dank auch an die Arbeitsgruppe „Optical Imaging & New Modalities Research“ bei der

Schering AG, bei denen ich die Tierexperimente durchführen konnte.

Außerdem möchte ich mich bei der ganzen Arbeitsgruppe AG Rosewicz für die freundliche

Zusammenarbeit und Unterstützung im Labor bedanken.

Grit Kasper, Nadine Rohwer und Wenke Jonas danke ich für das geduldige Korrekturlesen

dieser Arbeit. Grit Kasper danke ich zusätzlich für die Unterstützung auf dem Weg dahin.

Hartmut Sager danke ich besonders für seine Geduld und sein Verständnis. Er hat wie sonst

niemand die Höhen und Tiefen dieser Arbeit mit gemacht und mir stets Mut gemacht.

Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Mutter, die mich immer in jeglicher Hinsicht

unterstützt hat.

An dieser Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei meinem Betreuer von Seiten der TU-

Berlin, Prof. Dr. Roland Lauster für die freundliche und unkomplizi

Doktorarbeit bedanken.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Stefan. Rosewicz † für die Überlassung des

interessante

wäre.

7. Anhang

Lebenslauf

3353 Berlin

ERUFPRAXIS / AUSBILDUNG:

uster, (TU-Berlin) etreuer: Dr. med. ArneScholz

Berlin, Deutschland

etaGen PharmaceuticalsGmbH iplomarbeit bei (TU-Berlin)

Jan. 2002-Juli 2002Berlin, Deutschland

Petra Schulz Torfstr. 16 1 PERSÖNLICHE DATEN geboren am 11.08.1973 in Leverkusen ledig STIPENDIUM: 2002-2005 Promotionsstipendium des Graduiertenkollegs 276/3 „Signalerkennung und –Umsetzung“ BCharité, Abteilung Gastroenterologie Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Seit Nov. 2005Berlin, Deutschland

Charité, Abteilung Gastroenterologie Promotion bei Prof. Roland La

Nov. 2002- Okt.2005

B Technische Universität Berlin Studium in der Fachrichtung medizinische Biotechnologie

Okt. 1995-2002Berlin, Deutschland

MDBetreuer: Dr. Andreas Rump (metaGen Pharmaceuticals GmbH) MetaGen Pharmaceuticals GmbH OB

nkologie, Genomic Technologie iologisch Technische Assistentin

Okt. 2001-Dez. 2001 Berlin, Deutschland

tudentische Hilfskraft

Juni 1999 -Sep. 2001Berlin, Deutschland

y of California, Berkeley Aug. 2000-Nov. 2000

raktikum in der Abteilung Scientific Director Berlin, Deutschland

tschland

Schering AG, Berlin High Throughput Screening SUniversitDepartment of Molecular and Cell Biology

Berkeley, USA

Schering AG, Berlin Feb. 1999-Mai1999P Rheinische Akademie, e.V., Köln, Höhere Berufsfachschule für Technik Berufsausbildung zur „Staatlich geprüften Biologisch-technischen Assistentin“

Sep. 1993-Juli 1995Köln, Deu

Gymnasium “Lise-Meitner” in Leverkusen Hochschulreife (Note: 2.6)

Sep. 1984-Juli 1993 Leverkusen, Deutschland

Veröffentlichungen

Publikationen Sch Rexin A, Hauff P, Schirner M, Wiedenmann B, Detjen K, Rosewicz S. † Reconstitution of p16INK4a in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer inhibits tumor growth nd angiogenesis.[Manuskript in Vorbereitung]

z, Petra Schulz, Zofia von Marschall, Annett Rexin, Frauke Alves, Peter Hauff, Martin d G. Jackson, Helmut Friess, Michael Schirner, Karl Heinz Thierauch, Bertram

iedenmann1 & Stefan Rosewicz. Tumor derived overexpression of Angiopoietin-2 promotes mphatic spread in pancreatic cancer. [Manuskript in Vorbereitung]

n

odell. DGVS 2005, Köln

off S., Vollmer S., Hauff P., Schirner M., Wiedenmann B.,expression von Angiopoietin-2 in human

T) induziert Angiogenese und lymphogene Met

ner Mexpression of Angiopoietin-2 enhances angiogenesis and lymphatic

nmann B., Detjen K., Rosewicz .†. Reconstitution of p16INK4a in an orthotopic pancreatic mouse model inhibits tumor

ulz P, Scholz A,

a Arne ScholHaberey, DaviWly

Poster Schulz P., Scholz A., Rexin A., Hauff P., Schirner M., Wiedenmann B., Detjen K., Rosewicz S.†. DieRekonstitution von p16INK4A inhibiert Tumorwachstum und Angiogenese im orthotopen murinePankreaskarzinomm Rieke S., Rexin A., Schulz P., RudlRosewicz S.†, Scholz A. Die Über

pankreatischen en

astasierung. DGVS Neuroendokrinen Tumoren (NE2005, Köln Rieke S., Rexin A., Schulz P., Rudloff S., Vollmer S., Hauff P., Schir ., Wiedenmann B., Rosewicz S. †, 1Scholz A. Overspread in pancreatic neuroendocrine tumors. DDW 2006, Los Angeles, USA

Vortrag

Schulz P., Scholz A., Rexin A., Hauff P., Schirner M., WiedeSgrowth and angiogenesis. DDW 2006, Los Angeles, USA

Documents

Die biologische Signifikanz des Tumorsuppressors p16INK4a ... · Die biologische Signifikanz des Tumorsuppressors p16INK4a und des proangiogenen Faktors Angiopoietin 2 im orthotopen