DIE BIPOLARE DIFFERENZIERUNG DES PROTOPLASMAS DES TELEOSTEER-EIES

UND IHRE ENTSTEHUNG ( W e i t e r e e x p e r i m e n t e l l e Beitr~ige

z u m S t u d i u m der k a t a p h o r e s e a r t i g e n E r s c h e i n u n g e n in l ebenden Ze l l en

und der B e s t i m m u n g des pH der l ebenden Zel le)

Von JOSEF SPEK (Aus dem Zoologischen Institut der Universit~t Heidelberg)

Mit 3 Textfiguren und Tafel VIII

Eingegangen am 8. September 1932

1. P r o g r a m m und M e t h o d e n

Das eigentfimliche Verhalten des diffus gelSsten, einen empfindlichen Indikator darstellenden Pigments ir~ den Eiern yon Nereis Dumerilii hatte reich (1930) zum ersten Male zu der Erken~tnis gefiihrt, daft bei der b ipo l a r en D i f f e r e n z i e r u n g d ieser E i z e l l e n eine f o r t s c h r e i t e n d e Anre i c l l e rung yon sauer r e a g i e r e n d e n S u b s t a n z e n am einen, und eine A n r e i c b e r u n g yon a lka l i s ch r e a g i e r e n d e n S u b s t a n z e n am andern Pol der E ize l l e er folgt . Sie verl/~uft so, dab der alka- lisch reagierende und der sauer reagierende Plasmabezirk, zwischen denen eine/~quatoriale Schicht sich besonders verhaltenden ,,neutralen" Protoplasmas nachweisbar ist, zuerst in ein und derselben Zelle liegen, und dann erst beim A~ftreten der/~quatorialen Furchen eine Sonderung der differenten Plasmabezirke auf mehrere Zellen erfolgt. Das sonderbare Auseinanderwandern der sauren und alkalisehen Stoffe wird durch die RichtungskOrper- bildung, die beim Nere i se i nach der Befruehtung erfolgt, ausgelSst. Die alkalischen Substanzen wandern in der Riehtung der spi~teren Eiaehse nach dem RichtungskOrperpol, die sauren nach dem gegenfiberliegenden. Man kann beim Nere i se i leieht auf kiinst- lichem Wege (dureh Kalisalze) ohne Zusatz yon Spermatozoen eine RichtungskOrper- bildung allein herbeifiihren, auf welehe ffir gewOhnlich keine Furehung folgt. Naeh der RichtungskOrperbildung setzt abet prompt die bipolare Stoffsonderung im Ei ein und vollzieht sieh unter diesen Umst~nden bis zur hSchstmOgliehen Steigerung unkompliziert dutch Furchungsteilungen i n ei n e r ei n z i g e n Z e l le , kann also bier besonders gut studiert werden. - - Bei der normalen Entwicklung erleiden die different gewordenen Eibezirke ein ganz versehiedenes Schicksal. In der Hauptsaehe werden die alkalisehen Bezirke

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zum Ektoderm, die sauren zum Entoderm. Die vielen interessanten Einzeletappen der Differenzierung des Keimes mfissen in der Originalarbeit nachgeschlagen werden.

Wie erw~hnt, wurde die regionale J~nderung der Wasserstoffionenkonzentration zuerst am Umsch]agen des Farbtones des gelben Pigments der Eize]len in ein zartes Violett erkannt. Dieser Umschlag erfolgt in einem ganz bestimmten jungen Entwicklungs- stadium, wenn die bipolare Aussonderung der Substanzen einen gewissen Grad erreicht hat. Da bei der Stoffwandernng auch der natfirliche Indikator selbst wandert, und ganz in die vegetative Eih~lfte zu liegen kommt, gibt er uns auch nur fiber die Reaktion dieser Eih~]fte Aufschlnl3. Der Indikator schlagt hier naeh der sauren Seite urn. Der Umschlags- punkt liegt ann~hernd bei pH ~ 5,5.

Die l~eaktion der farblosen animalen Eih~lfte wurde ann~hernd durch Vitalf~r- bungen mit Neutralrot und Nilblausulfat bestimmt, die an diesem Objekt beide eine diffuse Plasmafarbung geben. Diese Vitalf~rbung ergab dann eben, daI3 sich d ie t~ e a k t i o n a m a ni m a ] e n P o ] nicht etwa auch nach der sauren Seite verschiebt, sondern im Gegenteil n a c h d e r a l k a l l s c h e n . ~eutralrot farbt das Plasma bier fahl-orange-gelb, Nilblau scheidet sich in violetten KSrnchen aus, w~hrend die vegetative Hiilfte fucbsinrot bzw. tiefblau gefal'bt wird. Die diffuse orangegelbe F~rbung mit Neutralrot ist um so fiber- raschender, als bei ~eutralrotf~rbung yon Geweben kaum jemals dieser Farbton erhalten wird. Ebenso kommt es auch nicht hi~ufig vor, daI~ sich das Protoplasma oder EinscMfisse yon Zellen mit ~ilblausulfat violett f~rben.

Da~ in ein und derselben Zelle gesetzm~tl3ig verteilte l~egionen verschiedener ~-Ionenkonzentrat ion vorkolnmen kSnnen, hatte man bis dahin weder beobachtet, noch auf irgendeinem Wege deduktiv postuliert. Der Befund war also ganz fiberraschend. Andererseits erSffnete er die interessantesten neuen Perspektiven zur weiteren Erforschung der Dynamik der lebenden Zelle, denn es war ja ganz klar, dab n n r e ine g a n z ge se t z - m~tl3ige D y n a m i k e i n e n s o l c h e n Z u s t a n d in d e r Ze l l e m i t R e g i o n e n g a n z v e r s c h i e d e n e r W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e n t r a t i o n a u f r e c h t e r h a l t e n k o n n t e , und es mul~te doch auch eine Kraf t da sein, die in dem betr. Entwicklungsstadium mit solcher Pr~zision erst einmal die Aussonderung der verschiedenen Substanzen und ihre Wan@rung nach den beiden morphologischen Polen in Gang brachte.

Die Aussonderung der verschieden reagierenden Kolloide ist in dem ~ereisei begleitet yon einer W a n d e r u n g m i k r o s k o p i s c h e r E i n s c h l f i s s e (Dotter- and Fett- tropfen) nach dem vegetativen Pol. Es wandern also in diesen Zellen erstens mikrosko- pische TrSpfchen, zweitens Kolloidteilchen. Ob das Umschlagen der Indikatoren nur darauf zuriickzuffihren war, dai3 sich am einen Pol saure, am andern alkalisch reagierende Kolloidteilchen in immer grS~erer Menge in engem Raum zusammendrSLngten, oder ob au~erdem auch noch eine gleichsinnige Wanderung yon Ionen nach den beiden Polen stattfand, so daI3 also auch mit einer direkten Zunahme ~rei beweglicher H-Ionen am einen und OH-Ionen am andern Pole zu rechnen war, konnte in der Nereis-Untersuchung nicht entschieden werden. Die beiden MSglichkeiten lieBen sich anf Grund der damaligen Befunde noch nicht klar sondern.

Die wahrscheinlichste Erklarung yon alledem war die, dai3 sich die verschiedenen dispersen Phasen in einem elektrischen Felde je nach ihrer Reaktion bzw. Ladung in der einen oder in der andern Richtung bewegten. Ich hatte daher mit allem Vorbehalt yon K a t a p h o r e s e - E r s c h e i n u n g e n in d e r l e b e n d e n Ze l l e gesproehen.

Sowohl yore entwicklungsmechanisehen als auch yore zellphysi01ogisehen Gesiehts- punkt betrachtet, forderten diese Befunde natfirlich zu einer Fortsetzung der Unter-

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suehungen auf. Ihre Bedeutung mul3te sofort viel grSl~er erseheinen, sobald es gelang, sie auch an ganz andern Objekten wiederzufinden. Aueh empfand natiirlich jedermann das Bedfirfnis, die Beweisffihrung sicherer zu gestalten und weiter auszubauen. Damit war aber eigentlich aueh schon ein vollst~ndiges Programm zu einer neuen Untersuchung gegeben. Die vorliegende Publikation ist der Bericht fiber die Resultate der fortgesetzten experimentellen Untersuchungen.

Das O b j e k t m e i n e r n e u e n U n t e r s u e h u n g e n sind die E i e r d e r K n o c h e n - f i s e h e (Te l eos t ee r ) . Und zwar fiel meine Wahl deswegen auf dieses Material, weil ja schon durch die direkten cytologischen Untersuchungen der genaueren Vorgange bei der ersten Entwieklung des T e l e o s t e e r e i e s ermittelt worden war, da~ diese mit einer ganz auffalligen, extremen polaren Aussonderung yon den Kolloiden des sog. Keim- plasmas beginnt, welche ]a bekanntlieh auch die Ursaehe des extremen sog. diskoidalen Furehungstyps der Eier ist. Schon beim Studium dieser Ph~nomene in der Literatur stieB ich auf so viele Analogien zu den Vorg~ngen im N e r e i s e i , dal3 mir eine Neuunter- suchung von meinen Gesiehtspunkten angebracht sehien. Die Notwendigkeit einer Revision der alten Darstellungen lag auch schon deswegen ganz auf der Hand, weil diese z .T . sehr weir zuriickliegen. Vielfach sind sie auch selbst dann, wenn ihnen richtige Beobachtungen zugrunde liegen, besonders in physikalischer ttinsicht so unpri~zise gehalten, dal3 das Wesentliche an den Vorgi~ngen aus ihnen schon deswegen gar nicht erkannt werden kann. Meine Untersuehungen wurden ausgeffihrt an den Eiern yon Corregonus macrophtalmus (Silberfelchen oder Gangfisch), Salmo irideus (Regenbogen- foreile), Squalius cephalus (Knilps), Leueiscus rutilus (P15tze), Barbus ]luviatilis (Barbe), Tinca fluviatilis (Schleie) und Gastrosteus aculeatus. Gelegentliche Beobaehtungen wurden aueh an Eiern yon exotisehen Aquariumfischen, M a k r o p o d e n , K a m p f f i s c h e n , Danio malabargus u .a . ausgeffihrt. Die zahlreiehen Versuehe an den Corregonus-Eiern machte ieh Ende Dezember 1931 an dem I n s t i t u t ff ir S e e n f o r s c h u n g in L a n g e n - a r g e n am B o d e n s e e , die Untersuchungen an den F o r e l l e n e i e r n in der B i o l o g i s c h e n V e r s u e h s a n s t a l t in Mf inehen . Auch bei diesen Objekten war es fiir die richtige Beurteilung der cytologischen Verhaltnisse am reifen Ei yon groBem Nutzen, auch die ganze Serie yon Ver~nderungen der Ovarialeier zu studieren. Ein Studium der Genese der Strukturen des fertigen Eies tr~gt viel zum Verst~ndnis ihres Wesens bei.

* , *

D i e T e c h n i k konnte an diesem Objekt dadurch erg~nzt werden, dab bier auch l n j e k t i o n e n m i t M i k r o p i p e t t e n ausgefiihrt werden konnten. Zu ~ast allen Vital- f~rbungen mit Indikatoren konnten daher hier auch Parallelversuehe mit Injektionen yon anderen Indikatoren gemaeht werden. Injiziert wurden zur pH-Best immung ]ndikatoren yon C l a r k und L u b s und, wenn n6tig, auch noch die Farbstoffe, mi t welchen Vitalf~rbungen ausgeffihrt wurden. An gr6~eren Eiern lassen sieh Mikro- injektionen sogar en gros auch ohne Mikromanipulator unter der Pr~tparierlupe ausffihren. Ieh bediente reich hierzu der folgenden Apparatur: Die (meistens gekniekte) Mikropipette wurde zun~ehst in ehm kurze, weitere Glaskanfile eingekittet und diese dureh einen durchbohrten Gummistopfen in ein b]eistiftdiekes, 14 cm langes

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Glasrohr eingefiigt, welches seit!ich, in handlicher I t6he eine Ausfiihrung mi t einem ein- geschliffenen, durchbot~' ten Hahn hat te . Vom hin te rn Ende des Glasrohrs fiihrte ein weicher and doeh druckfester sog. , ,Patentschlauch" zu einem Gummiballon. Der Gummi- ballon kann, wenn man die Pipet te mi t der rechten Hand in die Zelle eingeffihrt hat , mi t der l inken Hand gehandhab t werden. Der eingeschliffene Stopfen dient zum Aus- gleiehen des Druckes und kann mi t einem einzigen Finger ge6ffnet und geschlossen werden. Da die GrbBe der Eier verschiedener Fische die Konsistenz der Eimembranen und sonstige Faktoren, welehe fiir die Ansft ihrbarkeit der Injekt ionen entscheidend sind, sehr ver- schieden sind, miissen diese Dinge von Fall zu Fall besonders besprochen werden.

Aber auch noch auf anderm Wege ha t die Methodik der M i k r o o p e r a t i o n e n gerade an entscheidenden Punk ten der Untersuchung zu den besten gesu l t a t en geffihrt, so z. B. dadurch, daB mi t ihr t o k a l e E x p i p e t t i e r u n g e n y o n P l a s m a der verschiedenen Eiregionen und saubere I s o l i e r u n g y o n K e i m b e z i r k e n gelangen. Bei den kleinen Ovarialeiern wurde die Mikrotechnik wiederum nach anderer Richtung vari iert zur Sonderung yon Plasmaphasen, zum Anstechen von Zellen und dgl. mi t Erfolg angewandt.

V i t a l f / ~ r b u n g e n sind an den unreifen Ovarialeiern leicht ausffihrbar und sehr lehrreieh. Die reiferen Eier und Entwieklungsstadien dagegen sind keine idealen Objekte ffir Vitalf/~rbungen, da sie lokal oder in ihrer ganzen Masse die F/ irbbarkeit verlieren. Mit einzelnen Farben warden abet doeh aueh an ihnen gute Resultate erzielt.

Bei den Vitalf~rbungen wurden je naeh Bedarf 1--3 Tropfen einer 1/2 ~o w/~l~rigen L6sung der Farbstoffe zu 25 ecm der jeweiligen Kulturfliissigkeit zugesetzt, so dab die FarblOsung immer nur einen ganz blassen Fa rb ton hatte. Die zu f/~rbenden Kul turen wurden naeh Mbgliehkeit bei erniedrigten Temperaturen (meist 100 C) gehalten, dureh welehe auch die seh/~digende Wirkungen yon Farbstoffen betr~ehtl ich verminder t werden.

Viele Autoren stehen der Frage, ob man aus dem versehiedenen Farb ton der mi t Indikatoren vi tal gef/~rbten Zellen oder Zelleinschlfisse SchluBfolgerungen auf das pH der gef/~rbten Zellsubstanzen ziehen darf, mi t der gr6Bten Skepsis gegenfiber, da die physikMische Chemie gelehrt hat, dab manche Farbstoffe in besondern F/~llen, wie z. B. bei spezifisch gearteten Adsorptionen an Grenzfl/~ehen oder bei L6sung in andern Medien auff~llige Umsehl/~ge ihres Farbtones zeigen kbnnen, aueh wenn offensiehtliell keine Differenzen im pH vorliegen. Niemand wird sieh der Mahnung versehlieBen k6nnen, dab man sich diese Mbgliehkeiten stets vor Augen hal ten muG. Aber bei vielen Vital- f/irbungen und Indika toren liegen die Dinge so, dab man naeh vollzogener Anfi~rbung der Zellen den Fa rb ton willkiirlieh nach der alkalisehen und der sauren Seite verschieben kann, wenn man bloB Spuren einer verdi innten AmmoniaklOsung dem AuBenmedium zu- setzt oder Kohlens/ture durehleitet. Unabh/~ngig yon dem pH der Umgebung is t also der Fa rb ton dieser F~rbungen sicher nieht, und fiir das Vorliegen einer spezifisehen Adsorpt ion kann meist aueh nieht der Schat ten eines Beweises erbraeht werden. Man sollte jedenfalls n ieht allzu leiehten Herzens und otme Unterlage gleiela von spezifisctler Adsorption reden, sondern lieber die Vitalf/~rbung, zu der man noch kein reehtes Zutrauen hat , unter den verschiedensten Beeinflussungen yon augen und mit allen nur mbgliehenKontrol lversuchen so lange wiederholen, bis sieh schlieBlieh doch eine sicherere Beurteilung derselben ergibt. Nu t so kbnnen wir mit der Frage vorwi~rtskommen. Eine gute Kontrolle seheint mir z. B. darin zu bestehen, dab man ein und dasselbe Objekt, etwa Eier im gleiehen Stadium, mi t einer ganzen Reihe yon Indika toren vital f~rbt und auBerdem Indikatoren injiziert. Wenn die F/~rbungen mi t einem Dutzend Indikatoren iibereinstimmen, so scheint es mir doeh recht unwahrseheinlieh zu sein, dab an diesem Objekt und diesen Farben nennens-

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werte Komplikat ionen vorliegen k6nnen. W/~re das der Fall , so mfiBte doeh dieser oder jener Ind ika tor g/~nzlich aus der Reihe herausfallen und die Zellkolloide in einem Farb ton fgrben, der auf ein ganz anders pH sehliel3en liel3e, als man nach den F/~rbungen mit den andern Farben erwarten mfil3te. Es mfil3ten sieh kurz gesagt, irgendwo doch ganz un- gereimte Umschl/~ge ergeben.

Zu Beginn meiner Untersuchungen habe ieh Umschau gehalten naeh neuen Farb- stoffen, welehe gute Vita l farbungen und deutliehe Umschl~ge bei Reaktions~nderungen gaben. So veranlal3ten mich die pr/~ehtigen doppelfarbigen Vitalfi~rbungen, welehe ieh an Ovarialeiern mi t B r i l l a n t k r e s y l v i o l e t t und K r e s y l e c h t v i o l e t ~ (beide yon H. G r i i b l e r , Leipzig) erhielt, die Indikatoreigensehaften dieser Farbstoffe genauer zu untersuchen. Die Eignung dieser Farbstoffe zur Vitalf~rbung ist schon seit langem bekannt , ebenso ihre ,Metachromasie" , aber ihren Ursaehen ist man niemals naehge- gangen und fiber ihre Indikatoreigenschaften ist in der physikalisch-ehemischen Li tera tur wenig zu finden. In den ehemisehen Handbfiehern ist meist verzeichnet, dal3 die Farbstoffe ,,indikator/~hnliche" Eigenschaften haben. Die Vorbehalte, welche man dabei fiir die Anwendbarke i t yon B r i l l a n t k r e s y l v i o l e t t als Ind ika to r macht , beziehen sieh darauf, dab der Farbumsehlag yon Blau zu Rosa, den man bei Zusatz yon Alkalien zur neutralen w/~13rigen Farbl6sung beobachtet , nu r sehr langsam e in t r i t t und der rosa Fa rb ton bei Zusatz yon S/s n ieht wieder in Blau umsehl/~gt. Setzt man zu einer Phosphatpufferreihe yon p i t - - 6,0--8,5 je 5 Tropfen einer 1/2 ~oigen Farbl6sung in Wasser zu einem Reagenz- glas zu, so erh/~lt man eine prachtvoll abgestufte Farbenskala der Art, da{3 die sauren Puffergemisehe bis zu einem pH von 7,6--7.65 einen s tumpfen blauen ( , ,s tahlblauen") Fa rb ton zeigen, yon diesem pH aber der Fa rb ton fiber Violett---~ Rosaviolett in ein reines sattes Rosa fibergeht. Ein reines Rosa ist etwa yon einem pH yon 7,89--7,94 zu beobachten. Aber diese violet ten und rosa Farb t6ne stellen sich erst naeh Stunden oder gar Tagen ein, ja bei einer Zimmertempera~ur von ]7 ~ C verschob:n sieh die violetten Fa rb t6ne noeh naeh 14 Tagen noch welter nach Rosa. Diese Befunde ermutigten nicht gerade zu einer Verwendung des Farbstoffes als vitalfi~rbender Indikator . Zu meiner Ube r r a schung land ich dann aber, dal3 der Fa rb ton vi tal b l a u gef/~rbter Ovarialeier im Bruehtei l einer Sekunde in Rosa umschl/~gt, wenn man zur Kulturflfissigkeit (Ringer- sehe L6sung) etwas Ammoniak zusetzt, t~ei Zusatz yon etwas verd. Milchs/~ure erscheint langsam der b l a u e Fa rb ton wieder. Ieh suehte die Erkl/~rung hierffir zuerst darin, dab der Farbstoff im adsorbierten Zustand die Umsetzung in die rosa Modifikation vie] rascher erleidet, abet es wollte mir in keiner Weise gelingen, diese Vermutung in Modellversuchen, in denen der Farbstoff an Kolloiden adsorbiert wurde, zu beweisen. Erst durch einen Zufal] fund ich dann erst sp/~ter, dal3 die Umseh]~ge des Farbstoffs in m a n e h e n o r g a n i s c h e n L 6 s u n g s m i t t e l n naeh b e i d e n Seiten, von Blau naeh Rosa und wieder zurfick fast augenblicklich, oder doch in wenigen Minuten erfolgen. Der Farbstoff 16st sich z. B in ehemischreinem Chloroform mit t iefblauer Farbe, wenn man die w/~13rige Farbl6sung mit Chloroform sehfittelt. Der kleinste Zusatz yon Ammoniak 1/~13t die Farbe sofort in Rosa umschlagen, und setzt man einen Tropfen verd. Milchs~ure zu und sehfittelt, so wird das Chloroform wieder tiefblau. Besonders seh6n kann man die Umsehlage in Emulsionen yon Knoehen61 in Wasser demonstrieren. Bei Zusatz von Ammoniak wird die Emulsion sofort sattrosa, bei Zusatz yon Milehs~ure im Laufe einer Viertelstunde wieder violett und schliel31ieh blau. Die blaue Modifikation ist in Wasser offenbar viel besser 16slieh, so dab sich dieses un ten im Reagenzglase immer intensiver, und zwar eben mit rein blauer Farbe f~rbt.

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So boten die Reagenzglasversuehe nun doch mi t einem Male ein vollst/indiges Analogon zu dem Verhalten der lebenden Zellen, und gaben gleichzeitig einen Fingerzeig, daf3 der Farbstoff, wenn er in der Zelle den raschen Umschlag in Rosa zeigt, in einer besondern - - vermutl ich einer lipoiden - - Phase des Protoplasmas gel6st ist. Dies Jst auch sehon deswegen ein interessanter Ausblick, weft Bril lantkresylviolett im Gegensatz zu andern Vitalfarbstoffen Tropfen und K6rnchen yon Eiweil3k6rpern, welche in den unreifen Fischeiern in Massen ausgeschieden werden, n i c h t f~rbt, sondern immer eine zarte v611ig diffuse F~rbung des ganzen Plasmas liefert.

Offenbar ist die rosa Modifikation des Farbstoffes im 01 wesensgleieh mit der in w~tf~rigen L6sungen, da sie doeh in beiden Medien yon den gleichen Mitteln hervor- gerufen werden kann, und is~ in der Zelle ein Zelllipoid das L(isungsmittel, so handel t es sieh j~denfalls um ein sehr wasserreiches Lipoid, und in einem solehen dtirfte auch der Umschlagspunkt des Farbstoffes yon dem im Wasser n icht sehr versehieden sein.

Kenn t man die er6r ter ten besondern Eigenschaften des Farbstoffs, so wird man ruhig versuehen k6nnen, ihn auch als vi ta len Indika tor auszuprobieren, zum mindesten zum Erkennen yon relat iven pH-Untersehieden.

B r i l l a n t k r e s y l v i o l e t t hut die Zusammensetzung

C1

K r e s y l e e h t v i o l e t t sell naeh den Angaben der Hersteller bloB eine andere Modi~ f ikation des gleichen Farbstoffs sein. Beide Farbstoffe werden naeh einem etwas ver- schiedenen Verfahren aus B r i l l a n t k r e s y l b l a u hergestellt. Die Eigensehaften yon Bril lantkresylviolet t und Kresy lech tv io le t~ weisen in vielen Punk ten grebe JQlnliehkeit auf. Ganz s t immen sie aber gerade in den Dingen, die uns hier interessieren, doch n ieht iiberein.

Der Fa rb ton der waBrigen L6sungen yon K r e s y l e e h t v i o l e t t ist mehr violett . Dieser Fa rb ton setzt sieh zusammen aus einer s tahlblauen Eigenfarbe und einem roten Fluoreszenzlicht. Zusatz yon etwas 0,1-n-Ammoniak lgl3t die Farbe sofort in Rosa um- schlagen, Zusatz von Sguren (gleiehgfiltig welehen) ein tiefes Blau wiederkehren. Bei s tgrkeren Na OH-Zusgtzen n i m m t die Farbl6sung einen hellen r6tliehgelben Fa rb ton an; wahrseheinlich kommt bier irgendeine physikalische Zustandsgnderung des kolloidalen Farbstoffs zum Umschlag noeh hinzu. Aueh bier erseheint aber der blaue Fa rb ton bei Saurezusatz wieder, wenn man die S~iure gleieh naehher zusetzt. LABt man die Farbl6sung mi t einem sehwachen Alkalizusatz, welcher noch nieht diese auffallige Aufhellung und auch keine sofortige Rosafgrbung der L6sung bewirkt, lgngere Zeit stehen, dann verschiebt sich allm~hlich der Fa rb ton ~hnlich wie beim Bril lantkresylviolett , aber unauffglliger, immerhin aber noch deutl ich e rkennbar nach Rosaviolett. Die rosa Modifikation des Farbstoffs hut die Tendenz sich in Form eines iiul~erst feinen Niederschlages am Boden der GefgBe auszuscheiden. - - Die Steigerung der L6sliehkeit in orgalfisehen Medien beim ~bergang in die rosa Modifikation is t bei Kresyleehtviolet t eine ganz auffallige Ersehei- nung. W~hrend sieh z. B. die blaue Modifikation in Chloroform sehr wenig 16st, kann man die alkalische Modifikation mi~ Chloroform oder Anilin (weniger leicht auch mi~

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LeT.ithin) fast vollst~ndig ausschiitteln, so dal3 das Wasser nahezu farblos wird. Macht man den gleichen Versuch mit einer violet ten Farbl6sung, dann wird aus ihr wiederum nu r die rosa Modifikation ausgesehiittelt und das Wasser wird rein blau. - - Serienversuehe mi t Phosphat-Pufferreihon, denen gleiche Mengen des Farbstoffs zugesetzt werden, fallen mi t Kresylechtviolet t deswegen weniger hiibsch aus, weil ein grol3er Teil des Farb- stoffs durch die Phosphate ausgef~llt wird. In der restlichen klaren Farbl6sung wird die allmahliehe Verschiebung des Farbtones nach Rosa erst oberhalb pH ~ 7,5 deutlieh erkennbar .

Wie orw~hnt, erb~lt man an Ovarialeiern mi t Kresylechtviolet t praehtvolle zwei- farbige Vitalf~rbungen. Rosaviolett f~rben sich nur solcho Zellbezirke oder Zelleinlage- rungen, welehe aueh in anderen Indikatoren eine alkalische Reaktion erkennen lassen.

N e u t r a l r o t - und N i l b l a u s u l f a t f a r b u n g e n babe ich auch in dieser Unter- suchung vielfaeh angewendet. S tar t Neutra l rot habe ich aber sparer moist lieber B r i l l a n t - v i t a l r o t ( G r i i b l e r ) [idontisch mi t Vital red oder Rouge Congo bril lant] verwendet. Es gibt ganz iihnliche F~rbungen wie Neutralrot , bei denen aber der rosa Fa rb ton bei saurer Reakt ion von den scharlaehroten T0nen bei schwaeh alkaliseher Modifikation besser zu unterscheiden ist. Pufferreihen zeigen pr~ehtig abgestufte Farb t6ne von Satt- rosa bis zu einem fahlen Gelb. Rein rosa wird die Farbe erst bei einem pH yon ca. 5,6, scharlachrot ohne rosa Beiton is t sic bei 7,1--7,2 und das fame Rostgelb entsprieht einom p H yon 7,6. Durch Zusatz yon Ammoniak odor Milchsiiure zu angef~rbten Zellen kann man den Fa rb ton so oft man will im einen odor andern Sinne umsohlagen lassen.

Die Giftigkeit der angefiihrten Vitalfarbstoffe ist bei versetfiedenen Objekten sehr verschieden. Angefiihrt sollen nur solche Farbungen werden, bei denen sic sioh in ertr~glichen Grenzen halt . Ers taunl ieh gering ist die Giftigkeit bei den vorziigliehen Sulphonphtaloin-Indikatoren der yon C l a r k und L u b s (1917) zusammengestellten Reihe, aber die meisten dringen leider in die lebende Zelle fiir gew6hnlieh nioht ein. Sie wurden zu I n j e k t i o n e n vorwendet. Ihre Serie ist bekanntl ioh nach gestaffelt ansteigenden Umsehlagspunkten zusammengestellt . Die fiir uns in Frage kommende Reihe laute t : B r o m k r e s o l p u r p u r -* B r o m t h y m o l b l a u ~ P h e n o l r o ~ -~ K r e s o l r o t -* T h y m o l - b l a u . Die Indikatoren zeigen folgende Fa rben :

Bromkresolpurpur Eigelb - - * Griinlichgolb ---* Olivenbraun ---~ Tiefvioiett 5,4 yon 5,8 yon 6,8

Bromthymolb lau Zitronengelb ---* Griin - - * Bl~ulichgriin - - ~ Reines Himmelblau von 6,3 7,0 7,6

Phenolrot Orange - - * Scharlaehrot ---~ Rosa yon 7,2--7,8 yon 8,0

Kresolrot Orange ---+ Bordeauxrot von 8,0

Thymolblau Graugelb ---~ Griin ---* Blau yon 8,2 8,8

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Bei kontinuierl iehen Farbfiberg~ngen mfissen die Farben ko]orimetrisch mi t XontrollSsungen yon bekanntem pH verglichen werden. Allzuscharfe tabellarische Ab- grenzungen kann man da nieht machen. ]Die obigen pH-Werte sollen nu t eine ungef~hre Orientierung ermSglichen.

Bei der Best immung der pH-Werte dutch Vergleichung ist noch der Salz- und der Eiweil3fehler zu berficksiehtigen. Der erste diirfte - - besonders bei Zellen, die mit Flu$wasser in osmotischem Gleichgewieht stehen, sehr gering sein, der zweite mu$ offen gelassen werden, da man ja den Einflul~ der verschiedenartigen Plasmakolloide auf den Fa rb ton nicht kennt.

Was fiber die Notwendigkeit vielfgltiger Kontrol len bei der Auwendung der Vital- farben als Ind ika toren gesagt wurde, gil t in gleicher Weise fiir die Anwendung yon Indi- katoren zur pH-Best immung in der Zelle i iberhaupt, auch wenn wit das Verbal ten eines kiinstlich eingeftibrten Farbstoffes in der Zelle aueh nur einige Minuten lang verfolgen. Abet abgesehen davon miissen einmal in die ganze Diskussion fiber die pH-Best immungen in der lebenden Zelle Gesichtspunkte und Leitgedanken getragen werden. Die zahlreichen kleinen Publ ikat ionen auf diesem Gebiete maehen vielfach nur deswegen so einen ab- gerundeten, fertigen Eindruck, well sieh die Autoren bei Diskussion und Exper iment yon vornherein nur eine einzige Frage stellen. Beleuchtet man die Dinge einmal yon einer andern Seite, dann hgngt plStzlich wieder alles in der Luft, well eben die kleinen Spezialuntersuehungen, mSgen sie auch noch so exakt und vorsiehtig ausgeffihrt worden sein, doch auf einer zu schmalen Basis ausgefiihrt waren.

Ich glaube nun, dab die folgenden Ausfiihrungen an 1Jbersiehtliehkeit gewinnen und vie l le ieht auch ktirzer gefaftt werden kSnnen, wenn ieh einige der Lei tgedanken und Ausblicke, welehe sieh mir aus experimentellen Erfahrungen ergeben haben, vor- greifend sctton hier provisoriseh vorbringe.

Man ha t immer nu t kurzerhand yon , , d e m " pH des lebenden Protoplasmas ge- sprochen. Man ha t dabei entweder stillschweigend angenommen, dal3 die I-I-Ionenkon- zentrat ion in der ganzen Zelle vSllig ausgeglichen und in s~mtlichen Phasen des Proto- plasmas die gleiche ist, oder man ha t sieh vielleicht bei der Formulierung auch gar nichts gedacht. Sowie wir aueh nu t theoretiseh einmal postulieren, da$ man, ehe man wei$, ob sich die H-Ionen von den Kolloidteilehen so ohne weiteres entfernen kSnnen, zwisehen der Reaktion des Dispersionsmittels und der Reaktion der dispersen Phasen-des Proto- plasmas unterscheiden muB, wobei es dann wieder gar n icht yon vornherein ausgemacht ist, dal~ die verschiedenen dispersen Phasen der komplexen Plasmakolloide das gleiche pH haben, bekommt die ganze Frage mi t einem Male ein ganz anderes Gesieht. Und wenn wir uns einmal klar maehen, dab sieh die Farbumschl~ge, welche wit unter diesen oder jenen Bedingungen in der lebenden Zelle beobachten, zum Teil wobl an den Grenzflaehen oder im Innern yon Kolloidteilchen und dabei vielleicht nu r an best immten Phasen er- folgen, an welche die Farbstoffe herankommen kSnnen, werden damit gleieh ganz andere VorsichtsmaSregeln fiir die ganze Methodik notwendig. Ob Part ikel verschiedr Reaktion bis zu einem gewissen Grade nebeneinander bestehen kSnnen, miiSte nat i i r l ieh erst bewiesen werden. Dal3 einzelne Zelleinlagerungen eine ganz andere Reaktion und eine andere Ladung haben als das umgebende Protoplasma, ha t te man schon seit langem erkannt . Aber man ha t den Gedanken nieht zu Ende gedacht und ha t es unterlassen, die gleiehe Frage aueh fa r feinere disperse Phasen im Protoplasma zu erheben.

Um all diesen Fragen, welehe ftir die Methoden und Theorien der pH-Best immung yon prinzipieller Bedeutung sind, ngher zu kommen, wurde immer wieder versueht ,

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 505

auch die nicht vital f/~rbenden Indikatoren unter m6glichst verschiedenen Bedingungen an die Plasmakomponenten herantreten zu lassen und durch gliickliche Umst~nde ergab sich wiederholt auch die M6glichkeit, verschiedene Komponenten des Protoplasmas zu trennen und mehr oder weniger gesondert auf ihre Reaktion zu untersuchen.

2. Das Verhalten der 0oeyten im Wachstumsstadium

Bei fast allen oben angefiihrten Fischarten wurden auch die Ovarial- Bier untersucht. Da die Verhfiltnisse bei allen in den wesentliehen Punkten iibereinstimInen, ist keine gesonderte Betrachtung notwendig.

Kleine Floeken sorgf~tltig auseinandergel0ster Ovarialeier, denen keine Reste zerst6rter Eizellen anhaften, kann man in Ringerseher L0sung mit einem NaCl-Oehalt yon 0,5 % bei 10 0 C ohne weiteres eine Woche ]ang in unalteriertem Zustand erhalten. Meist wurden aber zu jedem Versneh, der aueh bei Vitalfitrbung h0chstens 2--3 Tage dauerte, Eier frisch ge- tSteter Tiere verwendet.

O o g o n i e n und ganz j u n g e O o e y t e n aller untersuchten Fische zeiehnen sich dadureh aus, dal3 sic ein v611ig klares, auch im Dunkelfeld fast vSllig optiseh leeres, stark liehtbreehendes Protoplasma besitzen, welches fast alle angewandten Vitalfarbstoffe, und zwar N e u t r a l r o t , N i l b l a u s u l f a t , B r i l l a n t v i t a l r o t und K r e s y l e e h t v i o l e t t , stark speichert. B r i l l a n t k r e s y l v i o l e t t gibt nut blasse FSrbungen, welehe iiberhaupt, wie wir noeh sehen werden, einen etwas andern Charakter tragen. Es sei noeh erwfihnt, dab T r y p a f l a v i n diffuse, zart-zitronen- gelbe Ffirbungen aller Ooeyten gibt , und dab in J a n u s g r t i n und in F l u o r e s z i n a lle Ovarialzellen ganz ungefSrbt blieben. Fiir unsere weiteren Betraehtungen sind diese drei Farbstoffe nieht yon Interesse.

Alle in den oben erw~thnten i n d i k a t o r e n v i t a l gef~t rb ten j u n g e n O o e y t e n w e i s e n e inen F a r b t o n auf , w e l e h e r e ine r s a u r e n R e a k t i o n e n t s p r i c h t , Bei den Farben, bei denen ein anderer Farbton bei Abnahme der H-Ionenkonzentration erst jenseits des Neu- tralit~itspunktes auftritt, k6nnte man allenfalls noch auf neutrale Reaktion schliegen. AuffSllig sind besonders der satte ausgesprochen rosa Farbton der jungen Ooeyten aller Fisehe in Brillantvitalrot, der einem pH yon 5,6 5,8 entsprieht, und die tiefblaue Farbe in Kresylechtviolett. Eine sieherere Absehfitzung des pH des in Frage kommenden Aziditfitsbereiehs erm6gliehten besonders Versuehe mit den Clarksehen Indikatoren B r o m k r e s o l p u r p u r und B r o m t h y m o l b l a u . Bekanntlieh dringen sie in lebende Zellen gar nicht oder nur sehr sehwaeh ein. Injektionen mit dem Mikromanipulator sind an diesen Stadien Bin undankbares Beginnen,

506 Spek

da die Zellen zu leicht ausfliegen. Aber die Injektionen sind aueh nicht nOtig. Die normale Permeabilit~tt der jungen Ooeyten scheint n~mlich gerade noch so grog zu sein, dal3 auch schon eine geringe k{instliehe 8teigerung derselben in Bromthymolblau erst bei einigen, dann bei immer mehr und schliel31ich bei allen Zellen starke Anf~rbung des ganzen Zell- innern auftreten 1/igt. Eine solehe Permeabilit~ttssteigerung ist zu er- reichen, wenn man die Kulturen statt in RingerlOsung in reiner isotonischer NaC1-LOsung ansetzt und sic einige 8tunden bei 8ommertemperatur (18--200 C) stehen lfil3t. Das Eindringen des Farbstoffs beginnt nach 1--3 Stunden. Naeh der gleiehen Methode behandelt, ffirben sieh in Bromkresolpurpur stets nut einzelne Ooeyten. Das strukturelle Bild der gef/irbten Zellen war in beiden Farben ganz unverfindert, das Plasma blieb Mar und stark lichtbrechend. Die Besehaffenheit der Kerne war normal. Der Farbton so angeffirbter kleiner Ooeyten desselben Ovars yon Leueiscus rutiIus war in Bromkresolpurpur das eharakteristische Gemisch yon Cxelblichgr{in und Violett, welches wir oben ,,olivenbraun" nannten. Es entsprieht ungef~thr einem pH yon 5,8. In Bromthymolblau war die Farbe des Oocyten ein sattes Zitronengelb mit leiehtem grtinliehem Ton, ein Parbton, weleher genau das gleiehe pi t andeutet. Mit dieser pIt-Sehatzung wtirden die o. e. Vitalf~trbungen reeht gut harmonieren. - - aunge Ooeyten eines Ovars yon Tinea vulgaris zeigten in Bromkresol- purpur einen ein klein wenig mehr naeh Gelbgrtin versehobenen Farbton.

Mit den ,,olivenbraunen" Ooeyten aus Bromkresolpurpur lassen sieh einige htibsehe Mikromanipulatorversuehe ausftihren. Die kleinste Ver- sehiebung des pII ver~tndert ngimlich, wie bekannt, diesen Farbton des Indikators vollst/indig, lfil3t ihn nach der sauren 8eite in Gelb, oder naeh der alkalischen in Violett umsehlagen. Das ,,Olivenbraun" existiert nut in einem ganz schmalen pII-Bereich. Nun sind manche Autoren auf Grund yon Anstiehversuehen zu der Vorstellung gekommen, dag dutch die meehanisehe Alteration in manehen Zellen im Augenblick eine S~turebildnng verursaeht werden kann, und fiber die tats~tchlichen Beobachtungen hinaus ist heute die Vorstellung schon sehr verbreitet, dag meehanische Alterationen im Handumdrehen eine Ans~tuerung des Protoplasmas be- wirken kOnnen. Ieh ftihrte nun an den olivenbraunen Zellen zuerst meehanische Alterationen aus, ohne sie anzusteehen. Ieh stieg mit stumpfen Nadeln yon beiden Seiten oft und oft gegen die Zelloberfl/iehe, buchtete dabei die weiehe Zellmembran oft so tief ein, dag sogar der Kern eingedellt wurde, und lieg sic wieder zurtieksehnellen; oder ieh buchtete die Zellmembran tief ein und bewegte die Nadel horizontal hin und her - -

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 507

stets, ohne die Zellen anzustechen - - , und schlieBlich legte ich eine Nadel auf die Zelloberfl~che horizontal wie einen Nudelwalker auf und walkte auf tier Zelle kr~ftig hin und her. Bei all d i e s e n M a n i p u l a t i o n e n b l i e b de r F a r b t o n des I n d i k a t o r s v611ig u n v e r ~ n d e r t !

$ticht man nun aber die hyalinen Oocyten an, so ergibt sich doch noch etwas Neues. Ich f(ihrte diese A n s t i c h v e r s u c h e mit Ooeyten von Leuciscus rutilus aus, und zwar in einer 0,5 % NaC1-L6sung, welche mit schwach saurem destilliertem Wasser angesetzt war, zum Teil auch in dem destill. Wasser selbst. Diese NaCl-LSsung hatte n~mlich mit Brom- kresolpurpur versetzt, recht genau den Farbton der mit dem Indikator vital gef~rbten Oocyten. Sticht man die mit Bromkresolpurpur vital- gef~rbten Zellen in dieser NaCl-LOsungan, ohne dem AuBenmedium neuen Farbstoff hinzuzuffigen, dann kann man meist nichts bemerkens- wertes sehen, da die FSrbung bei der Mischung des Plasmas mit dem AuBenmedium, welches sie wohl z. T. auswSscht, sehr blab wird. Versetzt man abet die Na Cl-L6sung mit dem Indikator und sticht dann ungef~rbte, einem Ovarium frisch entnommene, vorher grfindlich mit NaCloL6sung abgespfilte junge Oocyten in ihr an, dann flieBt aus der Anstichstelle ein dtinnfl~ssiges Kolloid (Kolloid?) aus, welches bald einen ziemlich grol~en Hof um dieselbe bildet. Eine zweite dickliche Plasmakomponente kommt nicht weit tiber die Anstiehstelle hinaus. Sie flieBt in hyalinen Schlieren aus und gerinnt gleich darauf k6rnig. Der groBe Hof der ersten Substanz nimmt im olivenbraunem Tropfen sogleich v i o l e t t e Farbe an, die gerinnende Plasmasubstanz f~rbt sich nach einigen Minuten ge lb l i ch - grfin. Stellt man sich vor, dab die beiden Substanzen in der intakten Zelle in feinster gleichm~Biger Verteilung vorhanden sind, dann mti~te man bei der Vitalfarbung genau die Gesamtfarbe des ganzen Plasmas erwarten, welche wit wirklich festgestellt haben, n~mlich das seltsame Gemisch yon Gelbliehgrfin und Violett.

Ganz entsprechend fielen Anstichversuehe in Bromthymolblau aus. Der mit dem Indikator versetzte Tropfen der NaCl-LOsung hatte einen gelblichgrtinen Farbton. Beim Ansteehen der Zellen konnte man ganz deutlich einen z a r t b l a u e n ttof den dieklichen Schlieren voraneilen sehen, w~hrend sich die gerinnende Substanz s a t t g e l b fSrbte. Beim Bromkresolpurpur ist die F~rbnng der d~innflfissigen alkalischen Substanz recht intensiv und die Anf~rbung der gerinnenden Plasmastoffe blab und sehr verganglieh. Inl Bromthylnolblau ist umgekehrt die gerinnbare Substanz auBerordentlich stark f~rbbar, w~hrend die hellblaue F~rbung der rasch ausstr6menden Stoffe bei der Vermischung mit dem AuBen-

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medium raseh versehwindet. Letzteres kann darauf ber•hen, da~ die A]kalinitttt des rasch diffusiblen Stoffes nach Misehung mit dem 35edium nieht hoeh genug ist, um den h6heren Umsehlagspunkt von Bromthymol- blau zu erreiehen (reinb]aue Farbt6ne treten in diesem immerhin erst bei p t t = 7,5 auf). Dazu dt~rften aber doch aueh noeh nicht unbe- tr~teht]iehe Differenzen in der Adsorbierbarkeit der Farbstoffe an den beiden Plasmakomponentœ kommen. In den angestoehenen Oocyten fttrbt sich in Bromthymolblau aueh der drinnen verbliebene Rest des gerinnbaren Protoplasmas intensiv ge]b.

Wer an der Idee festhalten mOchte, dais die auff~illige saure Reaktion der geronnenen Reste der ausgeflossenen Zellen nur von einer durch die meehanisehe Alteration verursaehten Stturebildung herrtihren dtirfte, wird ja wohl in erster Linie all diffusible S~iuren wie Milehs~iure denken mtissen. Aus den geronnenen Substanzen der zerst6rten Zellen diffundiert aber keine Substanz aus, die jene Azidittit erklttren k5nnte. Naehweisbar ist viehnehr, dais aueh noeh nach Stunden aus den Zellresten eine Sub- stanz in geringen Mengen herausdiffundiert, welche sieh mit Bromkresol- purpur tiefviolett ffirbt, also ein h 5 h e r e s pl i bat, als wir es dem Proto- plasma der intakten Zellen in summa nach dem Farbton der Vitalffirbung mit Brillantvitalrot, Bromk�9 und Bromthymolblau zusehreiben mul3ten. Beim AnstiehYersueh in Indikatoren ist die Aussonderung einer Substanz, welehe ein p l i hat, das unter dem Durehsehnittswert des Proto- plasmas liegt, nu r die e ine H~tlfte der E r s e h e i n u n g e n ; die andere leieht fibersehbare ist das Heraustreten einer sehwaeh alkalisehen zweiten Plasmakomponente. Sie ist in diesen Zellen nur in geringer Menge vorhanden. Das lJ'berwiegen der sauer reagierenden fiber sie, wtirde den auff~tlligen sauren Farbton der Vitalf5rbungen vollauf erklfiren.

Es wird uns hier zum ersten MMe die M5gliehkeit nfihergerfiekt, dal3 zwei S u b s t a n z e n , de ren R e a k t i o n we i t a u s e i n a n d e r l i e g t , u n a b h 5 n g i g n e b e n e i n a n d e r ira g l e i e h e n m i k r o s k o p i s c h u n d soga r u l t r a m i k r o s k o p i s e h v51tig h o m o g e n e n P l a s m a e x i s t i e r e n k6nnen . Ira vorliegenden Fall w~tre das um so tiberraschender, weil wir eben bei den Komponenten dieses hyalinen Protoplasmas eine sehr feine Struktur zuschreiben mfissen und die Teilehen derselben vollkommœ gleiehm~13ig verteilt sein mfissen.

Wir wollen die Diskussion naeh der Sehilderung anderer Versuehe wieder aufnehmen. Von diesen Versuehen sei nur noch erw~thnt, dal3 in Bromthymolblau in besondern Ffillen aul3e�9 der Gelbf~trbung des Zellinhaltes aueh Bine Gelbf~trbung der d(innen Zelhnembran beobaehtet

Die bipol~re Differenzierung des Protoplasmas des Teleos~er-Eies u. ihre Entstehung 509

und z. T. aueh dureh Abziehen der Membran siehergestellt wurde. Wenn ira Bromkresolpurpur eine vitale Anffirbung e'intrat, war bisweilen der Kernsaft der groBen Kernbl~sehen deutlieh v i o l e t t geffirbt. Aueh diese Zellen sahen strukturell v611ig gesund aus.

Wtthrend des Wachstums bleiben die Oocyten bekanntlich nicht hyalin. Erst treten feinste Oranulationen ira kla�9 Zellk6rp•r auf, dann gr6bere mikroskopisehe K0�9 und TrOpfehen, bis die m~ehtig an- gewachsenen Zellen dureh die vielen Einlagerungen v611ig undurehsiehtig werden, se dag oft sogar der grof3e Zellkern nur noeh ara geprel3ten Pr'~- parat siehtbar wird. Zellphysiologiseh ist zunaehst sehr interessant, dal3 die versehiedenen Einlagerungen, die ja ehemiseh ganz versehiedene Substanzen darstellen, immer in ganz gesetzmfit3iger Reihenfolge er- seheinen, und dag sie nieht regellos ira ZellkOrper einfaeh dort liegen bleiben, wo sie zut Ausseheidung kommen, sondern z. T. gesetzmfil3ige Umgruppierungen und Wanderungen durehmachen. Von den (r231 sichts- punkten dieser Arbeit ist dann weiter besonders wichtig, dag die ira Zellk6rper neuauftretenden 8toffe eine sehr versehiedene Reaktion haben, die aueh von der des hyalinen Plasmas der jungen Ooeyten betrfiehtlieh versehieden ist. Dadureh, dag sieh diese Stoffe sp5ter z. T. auch diffus ira Protoplasma aufl™ '~ndert sieh dann der Bruttowert des pl i ,,des Protoplasmas", den man z .B. bel Injektion von Indikatore~] erhfilt, ira Laufe der Weiterentwieklung der Ooeyten in gesetzm~13iger Weise. Es ergeben sich daraus aiig'emeineytoiogiseh und methodologiseh sehr interessante Konsequenzen.

Datait man aber bel den nfiehstfolgenden Betraehtungen nicht allzu leiehten Herzens alle die wahrend des Ooeytenwachstums heu auf- tretenden Stoffe als lebloses ,,Metaplasma" abtut und etwa se argumentie�9 data ja eigentlieh lediglieh die Reaktion des Grundplasmas vert Interesse ist, sel gleieh hier erw~thnt, dag gerade aueh die Reaktion des Grund- plasmas bel der komplizierten Metamorphose der waehsenden und reifenden Oocyten se versehoben wird, dag etwa Furehungszellen eine ganz andere Reaktion aufweisen als die oben besproehenen jungen Oocyten.

Aueh ira ersten Waehstuinsstadium lassen sieh die Ooeyten noeh sehr gut vital f~rben. Aus den F~trbungen ergibt sich in vOllig tiberein- stimmender Weise, dag ira Hyaloplasma zuerst eine mehr oder weniger rein dispergierte alkaliseh reagierende Substanz ausgesehieden wird. Seheidet sie sieh --- wie etwa in don Eiern des S t i c h l i n g s (Gast'rosteus

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a c u l e a t u s ) - - in Form mikroskopischer K6rnehen aus, dann kann man auch die Entstehung des definitiven Verteilungsbildes besonders gut dureh alle Etaploen verfolgen. Erst trœ232 �9 K6rnchen dicht ara Kern auf. Sie sind auch ira unge�9 Ei im Hell- und Dunkelfœ leicht zu erkennen. Besonders sch6n treten sie aber bei Vitalf~trbung mit Kresylechtviolett hervor (s. Tafel VIII, Fig. 1, kleinerœ Zellœ 8ie f~trben sich intensiv rosa- violett. In rien gr613eren Zellen ist schon ein ganzer Kranz von ihnen rings um den Kern ausgebildet. In noch gr613eren Oowten sieht man dann, dal] sie nicht in der N/the des Kernes liegen bleiben, sondern, dal3 sie sich in Bewegung setzen und immer weiter nach der Oberfl~tehe wandern. Dabei ist es nieht etwa so, dal3 sie von irgendeiner zwœ Substanz passiv vom Kern abgedr~tngt werden. Zwischen ihnen und dem Kern liegt eine Zeitlang nur ein hyaliner Zwisehenraum. In allen Etappen sind siœ oberfl~tchenwfirts ara stfirksten angereichert. IIat sich dann die sieh violett �9 Substanz bis zu einer gewissen Menge angereichert, maeht sieh eine zuerst nur teilweise Aufl6sung derselben bemerkbar, so dal3 einœ mehr diffuse lWdrbung auftritt (Taf. VIII, Fig. 1, groge Zelle). Da man dann ringsum durch eine violette Schicht sehen mug, kommt jetzt die st~rkere Anrœ der violetten Phase an der Augenseite zeitweilig nicht mehr so scharf zum Ausdruck. Der Abschlug der Ver- /tnderungen ist in allen F/~llen der, dag die heu aufgetretene Substanz �9 ganz bis an die Oberfl~tche vorrtiekt, so dag dann von der dazwischen- gelegenœ ande�9234 Grundsubstanz iibœ nichts mehr zu sehen ist. Wo sie in gr613eren Oocyten noeh irgendwo �9 liegt, ist sie wie vorher hellblau ge�9 aber meist riel sehwaeher als in den kleinsten Ooeyten.

Ganz erreieht die violette Phase die Oberfl~tehe niemals. Denn in dem Stadium, wenn sie in Oberfl~tehe�9 kommt, scheiden sieh in ihr irnmer zahh'eieher werdende, nieht f~rbbare K6rnehen und Pl~tttehen aus und o�9 sind diese noeh ober�9 und laufen den violett- gef~trbten Partikeln den Rang ab. Sie reiehern sieh direkt unter der Nembran ara st5rkstœ an, so dag es zur Entstehung einer rein radi~tr- s t r e i f i g e n , immer dieker werdenden, unge�9 R i n d e n s c h i e h t kommt, die so festgeftigt ist, dag man aus ihr, wenn man die Zelle anstieht, den Inhalt wie aus einem Beutel ausfliegœ lassen kann. - - Die in Kresy1- eehtviolett violett gefarbte Substanz trit t im ersten Wachstumsstadium der Ooeyten aller Fisehe auf, nur ihre Erseheinungsform ist inso�9 bisweilen anders, als sie von Anfang an diffus gel6st sein kann (vgl. Ta�9 VIII, Fig. 2), und sieh dann offenbar riel raseher tiber die ganze Zelle verteilt oder aber

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 511

schon gleichmt~l~ig in der ganzen Zelle zur Ausseheidung kommt. Von hier ab sind dann aber die weiteren Prozesse bei allen Typen von Fiseheiern gleieh.

Wir haben festgestellt, dal~ die rosaviolette Modifikation von Kresyl- œ bei h•herer Alkalinitt~t auftritt. Dementsprechend lttl3t sich mit allen andern Indikatoren das Auftreten von Substanzen, welche sieh ira alkalischen Farbton fttrben und datait eine auffttllige und noch l~ngere Zeit fortschreitende Versehiebung des Farbtones nach der alka- lisehen Seite feststellen. Dieser Farbumschlag erfolgt von Blau in Violett bei Kresylechtviolett (Taf. VIII, Fig. 2) von Blau in Rosa bei Brillantkresyl- violett (Fig. 3) und von Rosa in Fleisehrot bzw. Scharlaehrot bel Brillant- vitalrot (Fig. 4). Er tritt in rien genannten drei Figuren der Ta�9 VIII in augen�9 Weise hervor. Ehe wir uns auf Besprechung von Einzelheiten einlassen, sei nur noch erw~ihnt, dal~ sieh die alkalisehe Substanz nach der Ausseheidung der ztthen Kortikalschieht in zahllosen Tropfen entmischt, die mit einem noeh stttrker alkaliseh reagierenden Kolloid erftillt sind nnd stets auf eine oberflttchliche Zone direkt unter der Kortikalschieht beschr5nkt bleiben. Diese Tropfen fttrben sieh mit allen Vitalfarbstoffen aufs Intensivste ira alkalisehen Farbton. Aueh Nilblau farbt sie - - wenigstens zum grOl~ten Teil - - tiefviolett. Einige kleinere kOnnen in diesem Farbstof�9 noch blauviolett sein. Aueh die diffuse alkalische F'~r- bung, welche noeh eine Zeitlang sehr intensiv sein kann, tritt jctzt meist nur ~~oeh in der peripheren Zone auf. Die Besehr~inkung der alkalisehen Tropfen anf die Oberfl~iche trit t noeh riel seh~irfer als in den Fig. 2 und 4 auf Taf. VIII, und riel sehttrfer als bei jeder kOrperliehen Betraehtung iiberhaupt auf Schnitten hervor. Aus diesen ist dann auch ersiehtlich, dal~ der Raum innerhalb der alkalischen Tropfen bis zum Kern von einer gewissen Gr013e der Eier an er�8 wird von einer zweiten Tropfen�9 und zwar sind das die sog. Dottertropfen, die zur Zeit der Entmischung der alkalischen Tropfen zut Ausscheidung kommen. Eine sehematisehe ]�9 dieser Verh~iltnisse zeigt Textfig. 1.

Die Fttrbung der t~lteren Oocyten in B r i l l a n t k r e s y l v i o l e t t weist inso�8 einen etwas andern Charakter, als sieh die K0rnchen und die oberfl5chlichen Trop�9 der alkalischen Substanzen nur sehr blal~ oder gar nieht ftirben, und die blasse rosa F~irbung des ganzen Zellk5rpers v~llig diffus und aueh sonst nie an irgendwelehe Strukturelemente ge: bunden erseheint. Ich erkltire mir diesen Fttrbungstypus 8o, dal~ das Brillantkresylviolett in st~irkerem Mal~e von einem andern Stoff des tIyaloplasmas gespeiehert wird, der aber, wenn es zur AuflOsung der alkalisehen Kolloide kommt, von diesen auch ganz durchtr~inkt wird.

512 S p e k

Da~ se ein sch5ner Umschlag in Rosa eintritt, deutet ira Sinne des au�9 S. 502 Gesagten darauf hin, dal~ sich der Farbsto�9239 vorwiegend in den Lipoiden befinden kSnnte.

Man kann sich kaum ein komplizierteres System von Kolloiden vorstellen, als eine Eizelle, in der all die versehiedenartigen Lipoid- und Eiwei[~k5rper in der Grundmasse des Plasmas zur Ausscheidung g'elangt sind. Dal~ in solehen komplizierten Kolloidgemisehen F~rbungen mit sehr verschiedenartigen Vitalfarbstoffen nieht v511ig kongruent sind, dar~iber kann man sieh sicher nieht wundern. Erstaunlieh ist ira Gegenteil, da~ trotz dieser Kompliziertheit der Verh51tnisse gewisse Gesetzm~l~ig- keiten doch unter allen Umsttnden und bel allen Fischeiern zum Durch- bruch kommen, se die Anreieherung der alkaliseh reagierenden Substanzen in der ersten Etappe des 0oeytenwaehstums und dœ dadureh bedingtœ

Z.M ™ g~:;%:4~™ -

A.8. t ~ D.

Fig. 1. Schema von der Oberfl~chendifferenzierung des Teleosteereies kombiniert aus Sehnitten und Lebendbeobachtungen. Z.M. : Zellmembran, K . S . ~ Radi~rstreifige KortikMschicht, A .S . : viskose MkMische Sehieht mit eingelagerten kleinen Tropfen

und groBen Lipo]dkugš D : Dottermasse im Zellinnern mi~ Dottertr5pfchen.

Uinschlag aller Indikatoren des mittleren physiologischen pH-Bereichs, die Konzentrierung der alkalisehen Kolloide in der Oberfl~tchenzone und die Aussonderung d•r viskosen radi~rstrei�9 Rindenschicht.

Naeh der Ausseheidung dieser z~then t~indensehieht lassen sieh auch M i k r o i n j e k t i o n e n in die 0oeyten mit Leichtigkeit ausftihren, da sieh die Einstiehstelle sofort wieder verschliefit, und die ZelloberflSehen doch noeh se plastiseh und weieh sind, dag sie beim Auflegen der Mikropipetten nicht ausweiehen. Man braueht zu diesen 3/[ikroinjektionen nieht einmal mehr 3likroskop und Nikromanipulator. W~thrend sieh die jungen Ooeyten mit Bromkresolpurpur olivenbraun und mit Bromthymolblau zitronen- gelb f'~rbten, sehl~tgt der Farbton dieser Indikatoren, wenn man sie naeh der Ausseh•idung der Kortikalsehieht injiziert, in ein sattes Violett ira ersten und in ein tiefes Blau ira zweiten Fall um. In noeh ~tlteren grauen

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 513

Oocyten schl~gt sogar der Indikator mit dem n~chsthSheren Umschlags- punkt, n5mlich Phenolrot in ein tie�9 Rot um (beim jtingeren Stadium noch nicht). F~ihrt man geknickte Mikropipetten in die Zellen ein, kann man sie leicht so drehen, dal3 die ~tindung direkt unter die Kortikalschicht oder aber direkt an den Kern zu liegen kommt. Injiziert man auf diese Weise etwa gr(inliches Bromthymolblau gegen die Ober�9 so schl~gt es in Dunkelblau um, in der Kernn~ihe dagegen nur in ein blasses Blau. Ara sattesten ist der alkalisehe Farbton direkt nnter der Membran. Ob zwischen den alkalischen Substanzen noeh etwas von dem Kolloid vor- handen ist, welches das Bromthymolblau in den kleinen Zellen mit gelber Farbe adsorbierte, ist sehwer zu entseheiden. Gelbe FarbtSne treten jedenfalls (aueh 15ngere Zeit nach der Injektion) nieht hervor. Be- merkenswert ist aber, da~ sich bei diesen grol~en Oocyten, wenn man sie in NaCl-LSsung + einem schwachen Bromthymolblauzusatz liegen l~l~t, die Membran selbst z. T. noch so wie bei den kleinen, klaren Oocyten g elb an�9 Die grSl~eren grauen Ooeyten f~rben sich rait den Clarkschen Indikatoren ira Innern vital nieht mehr an.

In vitMgefSrbte mittelgrol3e Oocyten, etwa den grS~ten auf Fig. 2--4 auf Ta�9 VIII entsprechend, die wenigstens in ihren peripheren Zonen schon den alkalisehen Farbton zeigten, wurden Mikronadeln eingestochen. Aueh hierbei sehlie~t sich die Einstiehstelle. Man konnte nun gekniekte Nadel- enden in der Zelle hin- und herdrehen und das Protoplasma der alkalisehen Schicht durcheinanderr~hren so lange man wollte, in keinem der drei Farb- stoffe (Brillantvitalrot, Br.-Kresylviolett und Kresyleehtviolett) war auch nur die geringste Andeutung eines Umschlages des alkalischen Farbtones der alter~erten Region in den sauren zu bemerken. (Der Versueh war in NaCl-LSsung ausgef~ihrt, datait nieht etwa bei�9 Einsteehen alkalische Kulturfl(issigkeit in die Zelle eindringt.) Setzte man dem Aul~enmedium verd~innte Milchs~ure zu, sehlug der Farbton in Vitalrot sofort, in den bœ andern Farben langsamer in Rosa, bzw. ttimmelblau um.

In mittelrei�8 Fischovarien findet man �9 aussehliel~lieh Ooeyten, die in unsern Vitalfarbstoffen alkalisehen Parbton zeigen und etwa den gr613ten von Ta�9 VIII, Fig. 2--4 entspreehen. Isoliert man nun Kl~impehen von 20--25 soleher Ooeyten aus den Ovarien, ffirbt sie mit Brillantkresyl- violett rosa und 15gt sie in ph:7siologiseher NaC1- oder in t~ingerlSsung stehen, so kann man immer wieder beobachten, daB in den peripheren Zellen des ganzen Klumpens der rosa Farbton nach 1--2 Tagen verblal3t und ein blaBblauer oder doeh wenigstens violetter Farbton zum Vorsehein kommt. Fast immer weisen solehe Klumpen einen nicht auffalligen,

Protoplasma. XVIII 33

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aber immerhin deutlichen Farbunterschied auf, derart, dal3 die zentralen Zellen den Farbton behaltœ den sie bei der ersten Anf~rbung zeigten, der Farbton der peripheren Zell~n aber nach der sauren Seite verschobsn ist. Der Prozel3 kann noch weiter naeh dem Innern fortsehreiten, oder - - wenigstens fur einige Tage auf diesem Stadium stehen bleiben. Noeh se sorgf~tltig i s o l i e r t e e inze lne mi t t e lg ro l3e O o e y t e n weisen in Brillantkresylviolett mach kurzer Zeit einen blassen r e in s au r e n F a r b t o n auf und gehen a u s n a h m s l o s ein. Auchan den Kltimpchen gehen tiber- rasehenderweise die freiliegenden peripheren Zellen leichter ein. Es sei betont, da.g diese Erscheinun~en auch in der alkNisehen Ringerl6sun~ be- obachtet werden k6nnen. Ieh erklfirte sie mit anfangs se, dag in den blog- liegenden Zellen eine Silure auftritt. Jetzt neige ieh zu der Ansieht, dag die diffus gel0sten alkalischen Substanzen des Protoplasmas je mach den Bedingungen mehr oder weniger stark au eh aus der Zelle herausdiffundieren k0nnen, dag sie aus rien freiliegenden oder einzeln isolierten Zellen ara leichtesten herausdiff,ndieren und dal3, wo sie nicht mehr vorhanden sind, einfaeh die t~eaktion der auf S. 507 besproehenen sauren Kolloide des Hyaloplasmas, die nirgends ganz zu versehwinden seheinen, hervor- tritt. Dag in neutralen Koehsalzl6sungen in der Umgebung freiliegender alkaliseher Ooeyten alkalisehe Substanzen auftreten, lfil3t sieh durch Indikatoren direkt naehweisen. Mittelreife Ovarien seheinen vert diesen diffusiblen alkalisehen Substanzen f0rmlich durehtr5nkt zu sein, sodal3 dann in ihnen aueh die wenigen ganz kleinen Ooeyten, die zwisehen den grogen noeh zu finden sind, einen Mkalischeren Farbton zeigen als Zœ ihrer Gr0Be in jt~ngeren Ovarien.

Da diese Fragen ganz prinzipielle Probleme der gellphysiologie zu berfihren seheinen, sind Spezialuntersuehungen dartiber geplant. Aus diesem Grunde soll die Diskussion hier abgebroehen werden.

In der letzten Etalope des Waehstumsstadiums tritt in rien Ooeyten vider Fisehe noeh eine Emulsion vert Lipoidtropfen auf. Auch sie ent- stehen in der N~the des Kernes, haben dann aber naehher ein verschiedenes Schieksal. Es handelt sieh aueh bei verschiedenen Fiseharten offensicht- lieh nieht um Stoffe vert der gleiehen chemisch•n Natur. In der Literatur werden sie meist als ,,01"- oder ,,Pett'~ bezeiehnet. In rien Eiern maneher Fisehe, wie z. B. denen vert Squalius, fehlen sie ganz. Ira t~brigen tritt, solange die Eier trfib bleiben, keine wesentliehe Veranderung des zuletzt besehriebenen Zustandes mehr auf. Die grogen grauen Eier sind umsehlossen vert der dfinnen Zellmembran. Darunter liegt die radiarstreifige Kortikalsehiei~t. Unter dieser die ganze Masse der Mka-

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleostecr-Eies u. ihre Ents tehung 515

lisehen Trop�9 und diœ dazwischen angereicherten diffus gel5sten alkalischen Kolloide. Den ganzen Innenraum bis zum Kern nehmen von der alkalischen Tropfenzone scharf gesondert die Dottertropfen ein. Die Verteilung der Lipoidtrop%n ist nicht bei allen Fischen die gleiche. Einzelne Ffille werden wir noch beschreiben. Die radi~trstrei.fige Kortikal- schicht nimmt nach ihrem ersten Auftreten an Dickœ noch m~tchtig zu. Sp~ter scheint sie, trotzdem die Volumzunahme des ganzen Eies noch eine sehr betr~ehtliehe ist, keinen weiteren Substanzzuwachs mehr zu erfahren.

Zuerst liegt die radiitrstreifige KoItikalsehielat derZel lmembran direkt auf. Sobald sich aber ihre Teilehen zu einer gesehlossenen, resistenten , ,Sehieht" zusammengefiigt haben, kann zwisehen ihr und der Membran des weiterwaehsenden Eies vort~bergehend noeh eine weitere Sehieht auftreten, in der z. B. bei Leuciscus rutilus kSrnige Granulat ionen liegen. Aus Farbreakt ionen oder der direkt~en Beobaehtung bat sieh mi t noeh kein sicheres Kri ter ium ergeben, was ftir Stoffe sieh hier ausseheiden. Die Untersuehung ist aueh hier wiederum dadureh erschwert, dag diese Formationen nieht bei allen Fisehen gleieh sind; ja nieht einmal gleieh groge Eier desselben Ovariums eines Fisehes zeigen hierin gleiehe Bilder. Einen Fingerzeig, dal3 da doeh noeh einmal besondere (oberfli~ehenaktive ?) Stoffe unter der Membran konzœ werden, seheini die Beobieh tung zu geben, dal3 Plasma, welehes aus der Oberfl/~ehenregion gewisser Fiseheier (Perca [luriatilis) in Leitungswasser ausfliel3t, an der Oberfl~ehe zu langen Strahlen ausw/~ehst. Auf dieser Erseheinung diirfte aueh das Auftreten der sehon von den alten Autoren besehriebenen ,,Z6ttehen- s t ruk tu r " an der AuBenfl~ehe der Kort ikalsehieht unter der Zellmembran ber uhen. [Beim B a r s e h œ sind diese St rukturen besonders auff~llig. Ihre Untersuehung konnte aber in der vergangenen Saison leider n ieht beendet werden.

Reife Barseheier habe ieh leider nieht œ k5nnen. Bei allen andern unter- suehten Fiseheiern versehwindet die Zwisehensehicht naehher wieder. Man hat versueht, das Klebrigwerden der Oberfl/~ehe ~lterer Eier mit der Auspressung der Substanzen der Zwisehœ zu erkl~ren. An Leuci~cus-Eiern mit noeh vorhandener Zwisehen- sehieht habe ieh gelegentlieh stellenweise aueh a u B e r h a l b der Zellmembran einen gewellten PIasmasaum gesehen, der so aussah, wie das Plasma der Zwisehensehieht.

Durch den Innendruck des m/tchtig anschwellenden Eies wird die Kortikalsehicht im letzten Wachstumsstadium der Oocyten stark aus- gedehnt und dabei so fest an die Zellmembran geprel3t, dag eine Grenzlinie zwischen den beiden nicht mehr gesehen werden kann. Man kSnnte dann an der Doppelschichtigkeit des so entstandenen Oberfl~tchenhfiutchens zweifeln, wenn man nicht gelegentlich beim Einsetzen der Eier in hypo- tonische Medien eine lokale Abhebung und Vorbeulung der Nembran tiber der Kortikalschicht beobachten kSnnte. Da, wo aber ara Rande der Beule Nembran und Kortikalsehicht wieder zusammentreten, wird die optische Unterscheidung wieder unm0glich. Das bat frt~her zu manchen Konfusionen geffihrt. 3/[an hat diese Oberfl~chenbildung fur e in e 3/iembran gehalten und sonderbarerweise wiederholt angenommen, dag sie dem Ei

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vert aul3en aufgelagert wtirde. Se ist aueh der vOllig irreffihrende Naine Chor ion (analog dem Chorion der Insekteneier) entstanden, der aueh heure noeh immer wieder auftaueht, trotzdem sehon W. His (1873) in den wesentliehen Punkten sine Riehtigstellung gegeben bat.

Es sei in diesem Zusammenhang auf die weite Verbreitung der Erseheinung bei tierisehen Eiern hingewiesen, dal3 sieh ira vorgerfiekten Waehstumsstadium unter der Oberflfiehe spezifisehe Kolloide aussondern, dag aueh mehrere heterogene Sehiehten iibereinander zur Ausseheidung kommen kOnnen (ieh erinnere aueh an das Seeigelei), und dag sieh in den dieken viskosen Kortikalsehiehten die offenba�9 anisodiametrisehen Teilehen vielfaeh se aus�9 dag Bine RadiSrstreifigkeit entweder direkt erkennbar wird (in allen Bildungen, welehe man aueh zona radiata genannt bat, wie bei u Wirbeltiereiern und den Eiern der amerika- nisehen Nere is ) oder doeh indirekt ioostuliert werden mul3te, wie beim Seeigelei. Dahinter mtissen ~ihnliehe Gesetzmttl3igkeiten steeken. Noeh tiberrasehender aber ist, dal3, wenn man die Reaktion der Kortikalsehiehten und des Zellinnern ermitteln konnte, sieh bis jetzt jedesmal ergeben hat, dag an der Oberflttehe die alkaliseh reagierenden Kolloide zut Aussehœ kommen. Ieh erinnere an die auffttlligœ Farbreaktionen vert Kortikal- plasma und Innenplasma in den Ctenoiohoren-Eiern und an das eigen- ttimliehe Verhalten der Kortikalsubstanzen in den N er eis-Eiern. Sehade, dal3 die Substanzen der radi/trstreifigen Sehieht der Fiseheier keine zweifelsfrœ F~trbungen geben. (Blasse alkalisehe Ffirbungen, dis beob- aehtet wurden, k6nnten œ von einer DurehtrSnkung der Kortikal- sehieht mit diffusiblen alkalisehen Stoffen he�9 Wir werden sehen, dal3, wenn die Lipoidtroiofen wie ira Forellenei an die Oberflfiehe wandern, selbst sie alkalisehœ Farbrœ geben.

Es ist bekannt, dal3 die m e i s t e n a b g e l a i c h t e n F i s e h e i e r g 1 a s h e 11 s i n d. Ovarialeier des zuletzt besproehenen Waehstumsstadiums, welehe sehon dis volle Gr~)13e des ausgebfldeten Eies erreicht haben, sind zunSchst se, wie die etwas kleineren Oocyten weil31ich-trtibe, se dal3 man unter dem Mikroskop Einzelheiten an ihnen n ur, wenn man sie prel3t oder ebœ schneidet, erkennen kann. FOr das �9 Auge oder schwache Vergr613erung ist der Unterschied ira Aussehen der beiden Stadien aul3er- ordentlieh grol3.

Dieses auff';illige Klarwerden der Eier erfolgt nieht erst beim Austritt in das Wasser oder etwa bei der Befruehtung, sondern - - wenigstens in

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 517

der Hauptsaehe - - schon ira Ovar. Man kann sieh denken, wie tiefgreifende ZustandsSnderungen sieh in den Plasmakolloiden vollziehen mtissen, datait ein so augenfalliger Untersehied resultiert. Der Vorgang ist ein vollstandiges Analogon zu dem von mir (1930) genauer beschriebenen Klarwerden der Nereis-Eier . Auch die mikroskopisehen Symptome sind die gleichen. War ira letzten tr~iben Stadium nach Vitalfiirbungen noeh eine gewisse F~rbung der Tropfen und der diffus verteilten Kolloide der alkalischen Region vorhanden, so wird sie jetzt noeh blasser, die Trop�9 quellen auf, werden ganz glasig und zerflie~en z. T. aueh. Besonders gut konnte ich die Etappen dieser Ver~nderungen bei S t i eh l ing-Eie rn verfolgen. In manchen Eiern, wie denen der Forellen, 16sen sich aueh die Dotter- tropfen auf, so dal~ aus ihnen eine v611ig homogen aussehende syrup6se Masse entsteht. Die Konturen der Tropfen k6nnen al!erdings auch ver- schwinden bevor die Tropfen ganz aufgel6st sind. Wenn Von der Tropfen- masse schon riel in L6sung gegangen ist, dann liegt der Tropfenrest in einer L6sung, welehe �9 die gleiehe Liehtbreehung bat wie er selbst, und infolgedessen sehen die Tropfen aus wie Glaskugeln in Canadabalsam. Dieses PhSnomen tritt offenbar aueh bei allen anderen dispergierten TrSpfehen der Eizellen in Erseheinung, und wenn die Struktur der diffus gelSsten Kolloide dureh Verquellung aueh noeh eine gewisse Aufhellung erfShrt, dann resultiert aus alledem eben das Glashellwerden des ganzen Eies. Kolloidehemiseh kann man wohl alle die dabei erfolgenden Zustands- anderungen nicht anders als e ine s t a r k e H y d r a t a t i o n der P l a s m a - k o l l o i d e mit allen ihren Folgeerscheinungen auffassen. Genau so wie beim Nereis-Ei ist s ie aueh beim Fisehei der erste imposante Auftakt

z u den Erseheinungen der Entwicklungserregung des Eies und eine not- wendige Vorbedingung dazu.

Die Ursaehen der sprunghaft eintretenden starken Hydratation der 5ltesten Ovarialeier sind aueh bei diesem Material nicht reeht ersieht- lieh. Da in rien Eiern vieler Tiere in diesem Stadium Pigment auftritt, wird man tiefgreifenderen ehemisehen Veranderungen naehgehen m~issen.

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Wir bezeiehneten sehon in der Einleitung als Hauptziel unserer Untersuchung die Analyse der seltsamen b i p o l a r e n D i � 9 des F i s e h e i e s . Davon haben wir bisher noeh nichts zu sehen bekommen. Der gleichm~~ige konzentrisehe Aufbau ist ja gerade morphologisch und physikaliseh das Haupteharakteristikum des Ovarialeies der Knoehen-

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fische. Der komplizierte konzentrische Aufbau sehafft die Ausgangs- konstellation, aus der dann die bipolare l�9 hervorgeht. Wer diese verstehen will, muf~ erst einaml jene analysieren, das war der Zweek der bisher er6rterten Untersuchungen.

Die b i p o l a r e D i f f e r e n z i e r u n g des F i s e h e i e s besteht nieht in einer lokalisierten Neubildung von Substanzen. Sie ist l e d i g l i e h e ine U m g r u p p i e r u n g des s e h o n V o r h a n d e n e n d u r c h S t o f f w a n d e - r u n g e n , welohe spontan eintretelt und deren Hauptteil sieh in ganz kurzer Zeit, in einer Stunde oder noeh weniger vollziehen kann. Dadureh wh'd das ganze Problem sehr vereinfaeht und konzentriert sieh ganz auf die Frage, nach welehem Prinzip die Stoffe verteilt werden, und welehe Kraft ihre Wanderung herbeiftihren k/Snnte.

A u s g e l S s t w e r d e n die W a n d e r u n g e n d e r Z e l l s u b s t a n z e n d u r e h die Vorg~tnge be i der ]~ i eh t ungsk{} rpe rb i l dung . Das Aufsteigen des Kei�9 zur Oberfl~tehe ist das Zeiehen zum all- gemeinen Aufbru•h. Vielleieht ist die Wanderung des Kernes zur Ober- fl~tehe selbst niehts anders als die Wanderung der vielen andern 8ubstanzen, welehe sich nun mit der Richtung auf die gleiche Stelle der Eioberfl~tche in Bewegung setzen.

Da aie AuflSsung des Kernes und die Ausbildung der ersten Riehtungsspindel schon ira Ovarium er�9 kommen bei diesem Objekt aueh die bipolaren 8toffwanderungen sehon hier in Gang. Naeh der Ablage und Befruehtung des Eies erfahren sie aber bei allen untersu™ Eiern noch eine aul]erordentli™ Steigerung. Die Deutung liegt nahe, daB die naehtr~tgliehe 8teigerung aueh wiederum dureh die Richtungsk0rper- bildung, und zwar durch die zweite herbeigeftihrt wird. Eine siehere Antwort darauf kann ich nicht geben, da es leider eine sehr umstrittene Frage ist, wann die Richtnngsk/)rper bei den Fiseheiern ausgesehieden werden. Die Literaturdaten gehen weit auseinander. Diese Unsieherheit kommt daher, dal~ die erste Et@pe der Prozesse noch ira Muttertier abl~uft, die zweite aber, bevor die Membran ganz abgehoben ist , direkt au™ nur sehlecht beobaehtet werden kann. Bei Eiern, bel denen sich die Befruehtungsmembran ganz weit abhebt, wie beim Squalius-Ei, liegt ein l~iohtungskSrper stets dem Eik6rper an, unct zwar an der Stelle, naeh weleher gleich darauf die ungesttime Wanderung des Keimplasmas einsetzt. Dieser RiehtungskOrper - - stets nur einer! - - liegt also u n t e r

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der Befru™ Wahrseheinlieh wird der herste noeh ira Ovarium naeh auBen abgegeben. Es mtissen ~iber diesen Punkt noch Naehuntersuehungen angestellt werden.

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 519

Der unauff~llige erste, sieh sehon im Ovarium vollziehende Teil der Stoffwanderungen ira Fischei ~tugœ sieh noch ara deutliehsten bel so]ehen Eiern, welehe, wie die Sa lmon idene i e r , Lipoidtropfen bœ die an der Wanderung teilnehmœ Die stark liehtbrechenden blag-rStlichgelb gef/irbten Lipoidtropfen sind bel diesen, solange sie noeh einen intaktœ zentralgelegenen Kern besitzen, peripher in den tieferen Sehiehten des alkalischen Plasmas angeordnet und in fœ Plasma eingebett• Wenn dann die bipolarœ Stoffsondœ einsetzt, wandœ sie langsam alle nach dem l~ichtungsk6rperpol, so dag noeh im Ovarium etwa ein Drittel des Eik5rpers ara gegen~iberliegenden Pol oder mehr fast ganz trOpfehenfrei wird (s. Textfig. 2). Diese Tropfen- wanderung geht dann naeh der Be- fruchtung noeh sehr viel weiter, und die Tropfen fangen jetzt aueh an zu immer grOgeren zusammenzutreten, so dag sie zmn Sehlug alle in einer sehmalen Querzone direkt unter dem Keimplasma liegen (s. Fig. 5 auf

Taf . VIII und vergl, die GrSge der Tropfen auf Textfig. 2 mit der auf diœ Figur. BBide Figuren stellen Eier von Corregonus macrophtalmus dar).

Dag die Lipoidtropfen den Riehtungsk5rperpol nieht ganz er- reichen, kommt daher, dag das fein- k6rnigœ oberfl~tchliche Plasma und

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Fig. 2. Beginn der bipola,ren Differen- zierung am reifen Ovarialei von Cor- regonus macrophtalmus. Oben der erste

Hof von Keimplasma.

augerdem vielleieht noch andere Zellkolloide aus dem Zellinnern raseher bzw. mit grOl3erer Kraft naeh dem Riehtungsk6rperpol bewegt werden, so dag zum Sehlug sie allein das Feld um ihn einnehmen. Wenn sie sieh bis zu œ234 gewissen Grade ara RichtungskSrperpol angereiehert habœ w51bt sich diese Zone iiber diœ Oberfl~iehe des Eiœ hervor, erhebt sieh als immer h5her werdende Kuppe tiber die Umgebung, so dag Bine noeh seh~trfœ Aussonderung dieser Substanzen vom tibrigen Zellk5rper herbei- geftihrt wird (siehe Fig. 5 auf Taf. VIII). Diese Plasmakuppe liefert be- kanntlieh das sog. Keimp]asma. Sie sieht meist glasig und stark licht- breehend aus, hat aber eine feine mikroskopisehe Struktur. An der Basis der Kuppe h~tufœ sich gr6bere Granulen an und erst unter ihnen liegen bel den Salmonideneiern die grogen Lipoidtropfen. Das Zusammœ

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der Lipoidtropfen kann darauf beruhen, daB das sic zuerst umgebende feink6rnige viskose Plasma sieh von ihnen dureh Abwanderung trennt. Das Plasma, in welehes sie dann zu liegen kommen, ist aber freilieh aueh sehr viskos, so daB man jedenfalls aueh noch andere Faktoren in Erw~tgung ziehen muB, welehe die Emulsion d er Lipoidtropfen instabil maehen k6nnen (s. auch die Diskussion fiber das entspreehende Problem beim Nereisei, S p e k 1930). Als Tatsaehe wollen wir jeden�9 festhalten, daB die Stabilit'5.t der Lipoidtropfenemulsion v511ig verloren geht.

Ehe wir nun das Hauptproblem, die Wanderung der Substanzen naeh rien beiden Polen, weiterverfolgen, m~]ssen wir eine Diagnose der Vorgiinge einsehalten, welehe sieh bei der A b h e b u n g der M e m b r a n naeh vollzogener Befruehtung abspielen. Sie sind von groBem allgemein- eytologischem Interesse. Das, was sieh nfimlieh naeh der Befruehtung als mehr oder weniger dieke ,,Membran" abhebt, ist gar nicht lediglieh die primSre Ooeytenmembran, sondern diese -~ die ihr lest anliegende radifirstreifige Kortikalsehieht der Ooeyten. Der Spaltraum zwisehen ihr und dem Zellk0rper entsteht auch nieht dureh einfache meehanisehe Auseinanderl0sung, sondern dureh extreme Verquellung der 5ul3eren Partien der alkalisehen Schieht der Ooeyten, welche dazu ftihrt, dag sieh ihr Protoplasma zu Tropfen zusammenzieht, zwisehen denen wfi{3rige Lakunen entstehen. Fliel3en diese ringsum zusammen, so ist der peri- vitelline Saft�9 fertig, bloB wird er bel vielen Fisehen (wahrseheinlieh dureh starke Verquelhmg seiner Kolloide) noeh betrfiehtlich vergr6Bert. Ira perivitellinen Raum bleiben bei manehen Eiern noch lfingere Zeit lr0pfehen des peripheren Plasmas erhalten (s. Textfig. 3). Auch der Innenflfiehe der abgehobenen Membran k6nnen noeh einige Zeit solehe Plasmareste anhaften, bis sic sieh sehlieI31ieh ganz auflOsen. Ara sch6nsten konnte ich die einzelnen Etappen der Membranabhebung und Plasma- 15sung bei Squalius cephalus studieren.

Es geht aus dem Gesagten hervor, dag ira perivitellinen Sait be- trSchtliehe Mengen von Kolloiden gelOst sind, und da es sieh ja uni eine Aufl5sung von Substanzen der alkalisehen Schicht handelt, ist es kein Wund•r, daB aueh der perivitelline Saft alkalisehe Reaktion bat. Sptilt man abgelegte Fiseheier grfindlieh mit destilliertem Wasser und setzt sic dann in reinstes destilliertes Wasser + einem Indikator, so entstehen immer wieder um das Ei herum alkaliseh gefSrbte H6fe von den Substanzen, welehe - - wenigstens im destillierten Wasser dureh die Zelhnembran aus dem perivitellinen Raum herausdiffundieren.

Die bipolare Differenzierungdes Protoplasmas desTeleosteer-Eies u.ihreEntstehung 59.1

Bei den meisten Fischeiern ist die abgehobene Membran durch einen {Jberdruck von innen stark gespannt. Ganz extrem bel Corregon,ts-Eiern, bel denen beim Anstechen der Melnbran die Innenfliissigkeit f6rmlich herausspritzt. Das beweist jedenfalls, dal3 die intakte Membran v611ig geschlossen ist, und dal3 auch etwaige ,,Mikropylen" (welche ira {ibrigen nur eine Unterbrechung der Kortikalschicht darstellen d{irften, die naeh der Ausdehnung der Befruchtungsmembran nicht mehr zu finden ist), keine

Fig. 3. Die bipol~re Schichtung des befruchteten Eies von Squaliuy cephalus vor der Erhebung des Keimpl~sm~kegels. Nach dem Leben gezeichnet,.

wirklichen ,,L6ch™ in der Membran darstellen. Diœ ,,feinen Poren" der BefruchtLmgsmembran, von denen die alten Autoren immer wieder gesprochen haben, sind nichts als der optische Ausdruck der St5bchen- struktur der Kortikalschicht, welche auch nach ihrer Ausdehnung noch zu erkennen ist und in der Aufsicht als ein System feinster P(inktchen er- scheint. - - Der t5~berdruck von innen ist wohl ein Quellungsdruck der Substanzen des perivitellinen Raumes und kein osmotischer Druck, denn fiir molekulargel6ste Stoffe ist die Membran meist ziemlich durch- 1/issig.

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War es schon sehr iiberraschend, als man for viele Eizellen - - wie etwa ffir die Echinodermeneier - - nach langem Widerstreit erkannte, da[t die vorher lebende, physiologisehe Zellmembran des Eies bei der Befruehtung abgehoben wird, und darunter eine neue entsteht, so ist es noch beachtenswerter, dal3 bei unserm Objekt aueh noch die Kortikal- schicht des Plasmas mitabgehoben, eine breite periphere Plasmazone darunter ganz aufgelSst wird und die neue Zellmembran - - zuerst t~ul~erst zart und dUnn, kaum mehr als eine GrenzflSche zwisehen zwei nieht mischbaren Flfissigkeiten - - tief unter der ehemaligen Zellmembran der Ooeyten entsteht.

Ira wesentliehen hat sehon W. His (1873) diese VerhSltnisse an Fiseheiern riehtig beobachtet, aber aus seiner I)arstellung geht die Be- deutung des Gesehehenen doeh noeh nicht klar hervor, ist z. T. auch rait phantastischen Vorstellungen untermiseht, sonst h~tte man ja sieher schon frfiher bel der Diskussion dieser Frage auf diese interessanten F~lle zurUckgegriffen.

Kehren wir nun zu den S u b s t a n z w a n d e r u n g e n zurfick! Bel den Eiern mancher Fische gestattet auch schon die direkte mikroskopische Beobaehtung des Vorgangs Befunde, welche fur das Problem von gr613tem Interesse sind. Text�9 8 zeigt das eigenttimliche Aussehen des sich polar differenzierenden lebenden Squalius-Eies. Wir sehen, da~ sich das klare Keimplasma schon in erheblieher Menge ara Richtungsk6rperpol angereichert hat. Die gr™ K6rnchen und Tropfen erreichen diesen aueh hier niemals, und auch hier buehtet sieh dus Keimplasma bald darauf noch zu einer hohen Kuppe Uber die Eioberfl5che vor. An der Basis der muldenfSrmig gegen die Zellmitte vorspringenden Keimplasma- Anreicherung sehen wir ein sonderbares, ira lebenden Ei braunsehwarz aussehendes Querband, welches allem Anschein nach dadureh entsteht, dag in dieser Zone reine @ranula zwisehen den Dottertropfen in grSl~erer Mange zusammengedrfingt sind, und dag der Liehtbrechungsunterschied zwischen der Grundmasse des Protoplasmas und den darin dispergierten Einlagerungen in dieser Sehieht ein anderer, gr6gerer ist. Trotz der Auffalligkeit des Gesamtbildes lassen sich Einzelheiten sehwer ermitteln. Grolle Lipoidtropfen fehlen dem Squalius-Ei. Der ganze Raum von der untern Grenze des Keimplasmas bis zum vegetativen Pol wird von der grol3en Masse der Dottertropfen eingenommen. Danach sollte man ja glauben, dal3 dieses ganze groi3e Areal der Eizelle das gleiche Aussehen aufweisen miigte. Aber weit ge�9 ! An allen Eiern kommt in der gleichen gesetzm~tl3igen Weise eine Querbitnderung zustande, dadurch, daB sich senkrecht zut Eiaehse verlaufende, aufs sehSrfste ausgepr5gte Zonen ira

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 523

Ei ausbilden, in welchœ Plasma und Tropfen eine andere Beschaffenheit haben als in der vorhergehenden und in der n~ichstfolgenden Zone. Das Wesen dieser Differenzen liil3t sich ira einzelnen schwer er�9 Es sieht aus, als ob es sich um eine gradientœ Andernng der physikalischen Eigenschaftœ der gleichen Plasmakolloide handelt. Diese Anderung kann an sich ganz kontinuierlich sein und trotzdem bei bestimmten Werten eine sprunghafte Ver~tnderung des Gesamtbildes herbeiftihren. Ganz oben unter dem Keimplasma in der Gegend des dunklen Querbandes haben die Tropfen alle scharfe, dunkle Konturen, weiter unten verblassen diese kontinuierlich immer inehr, der Lichtbrechungsunterschied zwischen ihnen und dem Dispersionsinittel wird immer kleiner bis er plStzlich fast v611ig verschwindet. Datait erMlt die ganze Zone ~ber dem Aquator ein hell- leuchtendes Aussehen, welches in den Zeichnungen naturgemg[t nur schlecht zum Ausdruck kommt. Nach unten erscheint diese helle, gl~tnzige Zone wieder ziemlich schar�9 begrenzt, devin pl6tzlich treten weiter unten in der Dottermasse tiberall unregelm~13ige dunkle Schn0rkellinien auf, welche dadurch zustandœ kommen, dag die Tropfen z. T. miteinander verpappen und dadurch das w~tl3rige Plasma zwischen ihnen in lakunenartigen Feldern zum Vorschein kommt. Zonenweise treten auch in rien Dottertropfen w5Brige TrSpfchen auf. Dann nimlnt die Verklebung der Trop�9 wieder ab, sie nehmen wieder scharf ausgepr~gte Kugelform an und ganz unten ara vegetativen Pol sehen sie wieder mehr wie Granulen als wie Tropfen aus und zeigen dunkle, scharfe Konturen.

Es sei gleich hier erw~thnt, dal3 wenigstens in gewissem Sinne und z. T. mehr indirekt auch die Vitalf~trbungen eine zonenweise Di�9 des Eik6rpers ergeben haben.

Die auff~tlligen dunklen Streifen, welche in dœ animalen HSl�9 des Sq~alius-Eies leicht konvergierend alle nach der dunklen Querzone ziehen, sind Str0mungslinien der viskosen Eimasse, die vielleicht dadurch verst~trkt werden, dag �9 Granulationen bel ihrer Wanderung in er- h•htem MaBe ihnen folgen, w~thrend zwischen ihnen die Dottertropfen zu mehr oder weniger regelm~tgigen L5ngsreihen zusammengeschoben werden. Diese Erscheinung ist deswegen von Bedeutung, weil man aus dem Verlau�9 von Str0mungslinien auf die Ar t der b e w e g e n d e n K r a f t schliegen kann. Wir wollen jetzt in die Er6rterung dieser Frage eintreten.

Wenn wir entscheiden wollen, welche Kr~ifte nun eigentlieh die um- �9 Teilchenwanderungen ira Fischei herbei�9 mtissen wir zun~tchst drei M6glichkeiten iris Auge �8 Ober�9 diIferenzen, Schwerewirkungen und eine Bewegung durch elektrische KrMte.

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Oberfl~.chenspannuugsdifferenzen kSnnen den ganzen Inhalt eines Tropfens und de�9 aueh den einer Zelle dureheinander wirbeln. Wie eingehende Modellstudien gezeigt haben (s. bes. O. B fit s c hli, 1892 und J. Spek , 1918) ruft dabei jede Oberfl~chenspannungs/inderung, welche imstandœ ist, die Tropfen- bzw. die Zellgestalt zu ~tndern, sehr charakteristische StrSmungsbilder hervor, die bekanntlich dadureh aus- gezeichnet sind, dal3 die Fliissigkeit eine Art Wirbelbewegung ausfiihrt, bei der der Axialstrom jeweils entgegengesetzt gerichtet ist zu deln Ober- flSchenstrom. Ira Feld zwisehen Axialstrom und Oberfliichenstrom ruht die Flfissigkeit oder wird mit einer nach den Zentren abnehmenden Ge- schwindigkeit in Wirbellinien herumbewegt. Enthalten die Tropfen oder Zellen Einlagerungen, so kSnnen diese ~tuI3erst charakteristische Verla- gerungen und lokale Anh~tufungen erleiden. Trotzdem mir aber diese Bilder von meinen frtiheren Oberfl~ehenspannungsarbeiten aufs Beste bekannt waren, fand ich bei keinem der vielen untersuchten Fischeier bei der polaren Differenzierung ungef~thr bis zu dem in Textfig. 3 abge- bildeten Stadium aueh nur die leiseste Andeutung clayon vor. Es fehlt der entgegengesetzt zum Oberfl~tchenstrom verlaufende Axialstrom und es fehlt jede Spur von Wirbelfeldern dazwischen. Wiirde man z .B. annehmen, dal3 die starke Anh5ufunu des Keimplasmas, von einer Ober- fl/ichœ ara Richtungsk6rperpol ausgelSst werde, welche einen Substanzzustrom nach diesem Pol bewirkt, so kSnnte man ja allenfalls noeh sagen, dal3 der vorw~trtsgerichtete Axialstrom blo13 des- wegen nicht ein typischer ,,Axial"-strom sei, weil er sehr breit sei. An der Oberfl~tche aber mtil3ten sich die Teilehen n a e h h i n t e n bewegen und das tun sie bestimmt nieht. Feine Granulen und wo vorhanden, aueh die Lipoidtropfen der peripheren Plasmasehicht, wandern unentwegt nach dem Richtungsk6rperpol. Gehen wir umgekehrt von diese�9 ober- flSchlichen Zustrom aus und sehliel3en auf eine Oberfl~tchenspannungs- e rh ( ihung ara RiehtungskSrperpol, dann werden wir auch bei fltissigem Dotter vergeblieh nach einer axialen Riickw~rtsbewe` der ara obern Pol angeh~uften Granulen und Trop�9 suchen. Die StrSmungslinien des Squalius-Eies sind so, als ob sieh ira g a n z e n Querschnitt senkreeht zut Eiachse Teilchen mehr oder weniger geradlinig nach dem Riehtungs- kSrperpo! hin- oder umgekehrt bewegen - - und so etwas gibt es eben bei den durch Oberfl~tchenspannungs~tnderungen ausgelSsten Str6mungen tiberhaupt nicht.

Erst wenn fast die ganze Masse des Keimplasmas schon ara animalen Pol angesammelt ist, scheint sich daraus an ihrœ obersten Kuppe eine

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 525

vermindertœ Oberfl~tchenspannung zu ergeben, und sie fiihrt offenbar zur Vorw61bung des Kein~lplasmas fiber die Kuge]obœ des Eies. Denn diese Formverfinderung des Eies ist - - wie wenigstens fi~r das Corregonus-Ei naehgewiesen werden konnte - - jetzt in der Tat von Biner schwachen, au f das K e i m p l a s m a s e l b s t b e s e h r ~ t n k t e n F o n t f i n e n - s t r S m u n g begleitet, welche einige von den an der Basis des Keimplasmas angereicherten feinen Granulen gegen den Pol ffihrt und eine vorher ganz ara Pol zusammengedr/ingte feinste Granulation pinienartig aus- breitet (vgl. Fig. 5 auf Tafel VIII). Ein Pendant zu dieser Formverfinderung und Bewegung' dfirften auch die langsamen amSboiden Formverfinderungen sein, welche man bei andern Fiseheiern, z. B. S t ieh l inge ie rn in diesem Stadium beobaehten kann. Auch sic setzen erst ein, wenn die bipolare Differenzierung" des Eies schon nahezu vollendet oder doch jedenfalls sehon weit vorgeschritten ist. Sic bestehen meist in sehwachen Einsehntirungen ungef~thr in der Aquatorgeg'end, entstehen und vergehen wieder. Sic sind nicht so konstant wie die Vorw51bung der Keimplasmakuppe, aber nie ganz regellos; sic haben Bine gewisse Beziehung zu den Querzonen des Eies.

Relativ h~~ufig kommt es vor, dag die weit differenziertœ Eier Hantelform annehmen und sich vorfibergehend in der Riehtung der Eiachse in die Lange streeken.

Ail diese Bewegungen reiehen in keiner Weise zu einer ErklSrung der Entstehung der bipolaren Eidifferenzierung aus. Sic sind nicht die Ursaehen, sondern die Folgen der Differœ

E b e n s o e i n d e u t i g a b l e h n e n d m ~ s s e n wir be i g e n a u e r e r U n t e r s u e h u n g die F r a g e b e a n t w o r t e n , ob S c h w e r e w i r k u n g e n die p o l a r e D i f f e r e n z i e r u n g des E ies b e w i r k e n k5nnen . Dasich manche Eier, welehe wie die der S a l m o n i d e n , viele groge Lipoidtropfen besitzen, naeh der Befruchtung stets so drehen, dag die Keimseheibe, unter der die ,,01tropfen" liegen, nach oben gekehrt ist, ist der Gedanke a priori g'ar nieht u der Hand zu weisen, dag an diesen Pol einfach die leiehtesten Substanzen emporgestiegen sind, dag das Keimplasma am leiehtesten, der Dotter ara sehwersten ist und das spez. Gewieht der Lipoid- tropfen in der Mitte steht. Es 15[~t sich aber ara F o r e l l e n e i leieht zeigen, dag die Annahme falseh ist. Wir k5nnen namlieh an dem aus der Membran herausprfiparierten Keim (s. sp5ter S. 528) mit fœ Nadeln oder Messerehen je naeh Wunsch die Kuppe des Keimplasmas allein, oder diese + der tropfenhaltigen Plasmazone isolieren. Letzteres gelingt deswegen, weil das Protoplasma der Tropfenregion gegen Wasser seha�9 @renz-

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fl~chen ausbildet, also sich in diesem weder au�8 noch darin gerinnt. In 1 : 5 verdfinnter RingerlSsung halten sich diese Keimstficke sogar tagelang. Sowie man nun aber eine Keimscheibe + dem ganzen Tropfen- plasma abschneidet, dreht sie sich in der verdfinnten RingerlSsung sofort wie ein Stehau�9 so um, da~ das Tropfenplasma nach oben gekehrt ist. Ffihrt man noch einen zweiten Schnitt aus, der das Keim- plasma von der Trop�9 trennt, dann sinkt das erstere in der erw. RingerlSsung unter, das letztere steigt an die Oberfl~che empor. Die Tropfen sind also die leichtesten Elemente, das Keimplasma hat ein riel h6heres spezifisches Gewicht, ist vielleicht sogar schwerer als der Dotter.

Wir diirfen auch nicht vergessen, da~ die Eier im Ovarium in be- liebigen Stellungen in einer Zwangslage liegen. Trotzdem steigen die Tropfen (s. Corregonus-Befunde auf S. 519) nicht einfach an die obere Seite empor, sondern wandern unter allen Umst~nden nach dem l~ichtungs- kSrperpol.

Bei vielen Fischen, so z. B. bei Squalius cephalus, der gar keine grol3e Lipoidtropfen hat, liegen die be�9 Eier in ganz beliebigen Stellungen in der H~ille, ohne dal3 das den geringsten Einflul~ auf die bipolare Differenzierung h~ttte. Die auf S. 522 beschriebene auff~llige Differenzierung des Zellk6rpers dieser Eier ist von der Lage und Schwere- wirkung YSllig unabh~ngig. Bei anderen Eiern wiederum, wie denen des S t i c h l i n g s , sind ()ltrop�9 vorhanden, nehmen aber an der Wanderung der Stoffe nicht teil, sondern steigen an die obere Seite empor. Der Schwer- punkt des Eies liegt hier so, da~ die Tropfen eine �9 Seitenfl~che des Dotters einnehmen und die Eiachse h o r i z o n t a l liegt. Die ganze Wan- derung der Teilchen vollzieht sich also hier in der Horizontalebene.

Wenden wir uns nun der Bestimmung der l ~ e a k t i o n der wan- d e r n d e n K o l l o i d e zu.

Vitalf~rbungen ara reifen und befruchteten Ei sind leider nicht mehr so leicht ausffihrbar wie an jungen Ovarialeiern. Schon bei ~lteren Ovarial- eiern sahen wir, dal3 die F~rbbarkeit betr~tchtlich abnimmt. Nach der Befruchtung ist es vor allem das Keimplasma, welches bel u Fischen vital aul~erordentlich schwer angef~rbt werden kann. Diese Schwer- f~rbbarkeit ist an einen Vitalit~tsfaktor jener Zellen gebunden; denn wenn die Vitalit~tt derselben beeintr~chtigt erscheint, so tritt sofort eine An- f~rbung ein. Diese Beobachtung kann man machen, wenn sich bei Furchungsblastomeren das Tempo der Teilungen etwas Yerlangsamt oder wenn die Kuppe des ungeteilten Keimplasmas oder eine Keimscheibe

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vom ~ibrigen EikSrper abgetrennt wird, ohne dag dabei die Zellen - - was besonders betont sei - - absterben. Es war naheliegend an eine Beziehung zur Zellatmung zu denken, etwa so, dag beim hohen Sauerstoffverbraueh der Zelle den eindringenden Farbsto�9239 der Sauerstoff entrissen wurde, dal~ sie also hierdureh entf~trbt und erst beim Naehlassen der Atmung wieder hervortreten wfirden. Versuehe dureh Beeinflussung der Atmung die Frage zu klSren, haben bis jetzt keinen rechten Erfolg gehabt. Wir mfissen schon naeh andern physikalisehen oder chemischen Faktoren Umsehau halten, welehe die Anf~rbung des Keimplasmas verhindern. Einige Gesichtspunkte werden sich hierzu noch spater ergeben.

Die Granulen, welche zuerst an der Basis des Keimplasmas liegen, sp~ter sieh gleiehm~~iger auf die Blastomeren verteilen, nehmen die Vitalfarben wenigstens naeh einiger Zeit, ziemlieh stark an. Auch das Dotterplasma kann, aueh wenn das Hyaloplasma der Blastomeren ganz �9 bleibt, eine mehr oder weniger intensive diffuse Anf~trbung zeigen. Frit die Beurteilung der F~rbung des Hyaloplasmas der Blastomeren liegt besonders bei 5lteren Stadien der Furchung in dem Umstand eine Fehlerquelle, dal3 die stark lichtbreehenden glasigen Zellen die Farbe darunterliegender gef~rbter Granulen wie Linsen zerstreuen, so da~ besonders bel mittlerer VergrS~erung ihr Hyaloplasma in diesem Farbton blal3 gef5rbt erscheint, w~hrend das Hyaloplasma isolierter granulafreier Zellen ganz �8 aussieht. Ieh habe dies an isolierten Keimscheiben von Eiern, die vo r der Operation vital gef~rbt worden waren, bel sorg- f51tiger Untersuehung geeigneter F5lle deutlich erkennen k5nnen.

Eine zweifelsfreie, intensive vitale F~rbung des hvalinen Keim- plasmas aller befruchteten Eier einer sich gut entwiekelnden Kultur ist nur mit wenigen von unseren Farbsto�9 zu erreiehen, und zwar bel Corregonus macrophtalmus mit Kresyleehtviolett und bel Squalius cephalus mit Brillantvitalrot. Der Farbton der Kresylechtviolettf~rbung ist ein sattes R5tliehviolett (Taf. VIII, Fig. 5 n. 6), der von Brillantvitalrot ein fahles RStlichgelb. In beiden F~llen w~tre es also der Farbton, der Biner krMtig alkalischen Reaktion en tspr ich t . Bei Brillantvitalrotf~rbungen habe ieh noch nie einen ,,alkaliseheren" Farbton gesehen als den der Squalius- Keimseheiben. In Pufferl6sungen erh~lt man ihn oberhalb pl i = 7,6. Besonders schSn sind natfirlich Vitalfarbungen, bel denen eine F~rbung des ganzen Keimes erhalten werden kann. Bei der Brillantvitalrot- �9 der Squalius-Eier bleibt die Dotterh~l�8 nur sehr blal3 rosa gef~rbt. Prachtvoll ist dagegen das Gesamtbild der Kresyleehtviolett- ffirbung der Corregonus-Eier (TM. VIII, Fig. 5). Wir ersehen daraus, dal3

528 Spek

das Dotterplasma einen eklatant andern Farbton annimmt, dœ auf eine saure t~eaktion schliœ l~t[tt. Die Differenziœ des Bildes wird noeh dadureh erhOht, daf3 sieh an der obersten Kuppe des Keimplasmas eine Wolke feinster Granulen anreiehert, welehe rein karminrot gefSrbt sind. Innerhalb des Dotterplasma ist auch noehmals eine Differenz, und zwar diesmal in der Intensit~tt des Farbtons zu sehen. Es hat sieh ergeben, dafg diese blo13 daher rtihrt, dal3 sich bei jeder Lage des Eies jeweils an der untern Seitœ weniger f~trbbare, offenbar schwerere Sub- stanzen anreichern.

Die feinen Granulen an der Basis der Keimplasmakuppe f~trben sieh mit Nilblausulfat teils rein violett, teils blauviolett. Ihre geaktion scheint hart ara Umschlagspunkt des Farbstoffes zu liegen. Dieser entsprieht aueh die intensiv scharlaehrote F~trbung, welche sie in Brillantvitalrot und in Neutralrot annehmen. In Brillantkresylviolett bleiben die Granulen ungef~trbt.

Die syrupOsen Dottersubstanzen der S a l m o n i d e n - und der Dotter der M a k r o p o d e n - E i e r nehmen in s~tmtliehen Farben den Farbton an, der einer s a u r e n R e a k t i o n entsprieht. Wenn sieh bei anderen Fischen der Dotter jemals anf~irbt, se gilt fur ihn das gleiche. Diœ Diskussion tiber das in Frage kommende pl i wollen wir an sp~terer Stelle aufnehmen. Jeweils aber ist es se, dal3, wenn sowohl die Granulen bzw. die Tropfen zwisehen Keimplasma und Dotterplasma, als aueh dieses selbst einen Farb- ton annehmen, der Farbton der Granulen einem h6heren p E entsprieht als der der Dottersubstanzen. Se fiirben sich z. B. die Granulen in Brillant- vitalrot seharlaehrot, die Dottersubstanzen tiefrosa (gilt far alle Fische, bei denen sieh diese Substanzen i~berhaupt �9 oder wir erhalten in Nilblausulfat eine blauviolette bis reinviolette F/irbung der ` aber eine rein blaue der Dottermasse, die bei manchen Fisehen (Makro p o d e n , B l a u f e l c h e n ) aut3erordentlieh intensiv ist.

Ein Vergleich der FarbtOne vert Keimplasma und Dotterplasma aber l~tl3t, wo immer er ermittelt werden konnte, auf eine noeh hOhere pH-Differenz sehlieBen.

Es wurde eingangs erw~hnt, dal~ es bel Fore l l ene ie rn ge]ingt, die ganze ungeteilte Keimplasmakuppe oder aber in spSteren Stadien die ganze Masse der Furchungsblastomeren veto ~ibrigen Eik6rper zu isolieren. Man nlul~ dazu zunSchst die Eier mit einem Seherchen ira Aquator mitten- durehschneiden und dann die Eih51fte mit der Keimseheibe in einer Salz- 15sung heraussp•len, in welcher das aus�9 Dotterplasma nieht ge- rinnt. Flu~wasser wSre aise dazu vSllig ungeeignet. Aueh reine 0,5 %

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 529

NaC1 ist nicht ideM. Gut ist dagegen eine Mischung 10: 1 von 0,5 % NaC1 + isoton, oder konzentrierterer KG1-LSsung oder l:~ingersche LSsung. Durfte in meinen Versuchen keine alkalische LSsung zur Verwendung kommen, dann verwendete ich das NaC1 -4- KCl-Gemisch. ])as Dotter- plasma 15st sich darin klar auf, und das Keimplasma kann von der tropfen- haltigen Zwischenzone mit kleinen Messerchen oder Lanzettnadcln leicht abgelSst werden. Es wird dann in neuen, reinen SalzlSsungen gewaschen und in das gew~inschte Medium ~iberf~ihrt. Vor dem Zerschneiden m(issen die Membranen der Eier an einer Stelle angestochen werden, da sie sonst zu prall gespannt sind, und der Inhalt beim Anschneiden herausspritzen wtirde. Auch die viskose Plasmaschicht mit den Tropfen l~$t sich heraustrennen (s. S. 525). Die Blastomere.n sehen in verd. Ringer- oder NaCl-LSsung auch nach einigen Tagen mikroskopisch v61lig unalteriert aus, scheinen sich aber nicht weiter zu teilen. Es w/ire mOglich, daB man in andern Kulturmedien bessere l~esultate erh~lt.

Ich habe nnn auch solche isolierte Keimplasmen und Zwischen- schichten nach der Operation noch vital gef5rbt. Wie erwShnt, f5rbt sich unter diesen UmstSnden aus noch nicht gekl5rten Ursachen das Keim- plasma wenigstens etwas auch in solchen Farben an, die es ara ganzen Keim gar nicht annimmt. Dieser Befund mahnt natfirlich zu Vorsicht, aber die Resultate waren auf alle F5lle sehr lehrreich. Es f~rbte sich das K e i m p l a s m a : In Kresylechtviolett tief r o t v i o l e t t wie auf Taf. VIII, Fig. 5, nur noch satter, in Brillantvitalrot r 5 t l i e h g œ wie bei den in- takten Squalius-Eiern und in Brillantkresylviolett r e in r o s a (Dotter- plasmaf5rbung der intakten Eier himmelblau). Alle Farbt5ne entsprechen dem intensivsten alkalischen Farbton, der bei diesen Farben ~iberhaupt m~glich ist. Es sei daran erinnert, daB Brillantkresylviolett inw~Brigen L5sungen erst bel p l i = 7,8 rein rosa wird.

Besonders interessante Befunde ergab Bine Weiterverfolgung der Brillantkresylf5rbung. Zun~chst sei erw~hnt, dalB die rosa Farbung der ersten Biastomeren vOllig diffus ist, wie die der mittleren alkalischen Ovarialeier. Irgendwelche Granulen f/~rben sich nicht. Das P l a s m a de r i s o l i e r t e n Z w i s c h e n s c h i c h t f 5 r b t s i ch b l ~ t u l i c h - v i o l e t t und die D o t t e r s u b s t a n z u n t e r a l l en B e d i n g u n g e n b l a u , so dalB also dieser Farbstoff vom animalen bis zum vegetativen Pol œ kontinuier- liche Farbœ von Rein-Rosa bis Rein-Blau ergibt.

Solange die grolBen Lipoidtropfen in dem Plasma der Zwischenschicht lie ̀ nehmen sie von dem Farbstoff nichts an, trotzdem das umgebende Plasma sœ gef~rbt ist. Sobald wir aber die Tropfen mechanisch

Protoplasma. XVIII 3'~

530 Spek

aus dem Plasma befreien und sie unter dem Deekglas direkt in der gleiehen schwaehen Brillantkresyl~iolettl6sung halten, � 9 sie s ich al le t i e f k i r s e h r o t . Der Farbton des Indikators in der Lipoidsubstanz l~tgt sieh ja wohl nieht ohne weiteres Yergleiehen mit dem in w~tl3rigen •edien, aber naeh dem auf 8. 501 Oesagten liegt die Reaktion der Tropfen jeden- falls sehon auf der alkalisehen Sœ Dag sieh die Tropfen ira Plasma drinnen, trotzdem alles um sie herum gef~trbt ist, absolut nieht f~.rben, ist ein sehr lehrreiehes Beispiel daffir, dal3 die Oœ von bestimmten Kolloiden die F~trbbarkeit von Zelleinlagerungen bestimmen kann, oder dal3 allgemeiner gesagt, eine Phase starken Einflul3 auf die F~trbbarkeit der andern aus•ben kann.

LS13t man die mit Brillantkresylviolett gef~trbten isolierten Blasto- meren einige Tage ira Seh~tlehen stehen, so kann man �9 dag sieh der rosa Farbton allm/thlieh immer mehr naeh Blau versehiebt. Rein blau gewordene Blastomeren gehen raseh ein. Bei Klumioen von ~lteren Blastomeren sehl~.gt, genau so wie bei den Klumpen vital gef5rbter Ovarialeier (s. S. 514), der Farbton zuerst nur in den Zellen an der Peri- pherie um. Die Nitre des Klumpens bleibt rosa. Es s e h e i n t a u e h h i e r w i e d e r u m eine a l k a l i s e h e S u b s t a n z aus den Ze l l en he r aus - z u d i � 9 und zwar aus den peripheren ara st~rksten. Klumpen von 51t› Furehungszellen zeigen die Tendenz sieh immer %ster zu- sammenzusehliegen. Ira Innern der Nasse bleiben dann die Zellen v611ig normal, k6nnen hier sogar - - wenn sie nieht sehon vorher vital gefarbt waren - - ih re N i e h t f ~ t r b b a r k e i t in den o. e. F a r b e n wieder - e r l angen . An der Peripherie findet man immer einzelne eTtolysierte Zellen vor.

Das Auftreten des sauren Farbtones des Indikators braueht aueh in diesem u nieht auf einem Neuauftreten einer Saure zu beruhen. Aueh in diesen Zel]en sind, wie wir noeh sehen werden, noeh andere Kolloid- Phasen vorhanden, welehe von den diffusiblen alkalisehen Substanzen be�9 stets saure Reaktion zeigen.

Beim ersten Auftreten der u isolierter Keimplasmen oder Keimseheiben haben diese wahrseheinlieh sehon einen Teil ihrer alkalisehen Substanzen verloren. Die Reaktion des vSllig intakten Keim- plasma ist jedenfalls noeh etwas st~trker alkaliseh. Man roui3 die lSglieh- keit im Auge behalten, dag diese hohe alkalisehe Reaktion selbst die Ursaehe der Niehtfarbbarkeit des Keimplasmas in manehen Farbstof�8 ist.

Aueh in die rei�8 unbefruehteten und in die beIruehteten Eier wurden I n j e k t i o n e n der C l a r k s e h e n I n d i k a t o r e n gemaeht. Serien-

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weise konnten sie an Eiœ von Corregonus macrophtalmus und Sal~w irideus ausge�9 werden. Vor dem Ablaiehen hat die Eimembran aueh noeh bel den reffen Eiern die weiche Konsistenz, bel der Mikroinjektionen sehr leicht ausf0hrbar sind. Kommen die Eier ins Wasser, dann machen die Substanzen der abgœ H0llen ira Laufe einer Stunde einen eigent0mliehen Gerinnungsprozel3 dureh, dureh welchen sie auBerordent- lieh hart werden k6nnen. Nach dieser ™ kann man in die Salmonideneier nur noch mit gr5beren, 20--25 [~ weiten, schar�9 Pipetten hineingelangen. Selbst von diesen groben Pipetten breehen viele beim Durehstol3en der Memb�9 ab. Aber auch unter diesen ersch~xerten Umsthnden kann man in die Dotterh5]�9 verh~ltnismfif~ig leieht ln- jektionen ausf0h�9 Saubere, streng lokalisierte Injektionen in das Keimp]asma oder in die ]31astoineren sind dagegen ™ diesem Material, solange der Keim in rien ttt~llen bleibt, kaum durch�8 da die voll- kommene Absonderung des Keimplasmas erst naeh der Erstarrung der Nembranen erfolgt. F0hrt man gekniekte Pipetten nach vollzogener bipolarer Differenzierung von der Dotterhhlfte aus von unten in das Keim- plasma ein, bringt man mit der Pipette immer einen ganzen 3/Iantel des viskosen Dotterplasmas mit. Direkt kommt man in die kleine Keim- scheibe sehwer an der gewiinschten Stelle hinein, da sieh ja das Ei inner- halb der tt011e dreht. Ant3erdem ist bei der Oberfl~tehenbesehaffenheit des animalen Plasmas das Miteindringen von der alk™ perivitellinen F10ssigkeit eine g~:ol3e Fehlerquelle.

Ara F o r e l l e n e i kann man ja nun aber die Keimseheibe isolieren und in das isolierte Keimplasma Injektionen ausfi]hren. Aul3e�9 hat sieh for dieses P]asma noeh eine andere Nethode ergeben, es mit den nieht permeierenden Indikatoren zusammenzubringen.

Es sei hier nur noeh erwhhnt, dag bei den Injektionsversuehen am Corregonus-Ei �9 werden konnte, dag sieh die bipolare Versehieden- heit des Eik6rpers, welehe beim Corregonus-Ei sehon ira Ovarium ziemlieh weit fortsehreitet, bei Beginn der Erstarrung der Nembran eine Zeitlang sogar in K o n s i s t e n z u n t e r s e h i œ der b e i d e n M e m b r a n h ~ t l f t e n a u s w i r k t , in der Art, dag die Nembran Ober der Dotterh5lfte noch ganz weieh ist, wfihrend die Erstarrung der andern H~ilfte sehon Yollzogen ist.

In grol3er Zahl wurden Injektionen in die Dotte�9 be�9 Corregonus- und SaImo-Eier ausgef0hrt. Diese k0nnen dadureh cr- ~:ehwert werden, dag Dottersubstanzen (Globuline?) bei Beriihrung mit Wasser gerinnen und dabei grau und sehneidbar �9 werden. Wie man besonders bei einer Dunkelfelduntersuehung dieses Vorgangs an

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expipettierten Tropfœ �9 kann, besteht diœ auff~illige Zustands- ~inderung teils in Biner Dispœ teils in einem Auftreten zahlloser WassertrSpfehen in der Dottersubstanz. Gerinnt etwas Dotter- substanz in der Pipette, wird diese dadureh natttrlieh unbrauehbar. Be- merkenswert ist t~brigens, daB in die Dottersubstanz injizierte klBin• Tropfen w~igrigBr IndikatorlSsungen ira Dotter kBine Gerinnung hervor- rufen, w~hrBnd umgekBhrt in diese LSsungœ austretBnde DottertropfBn fast augBnblieklich gerinnœ In den injizierten Tropfen trBten jedBnfalls sehr raseh P]asmasubstanzBn ein, WB1BhB die GBrinnung verhindBrn; aus dem frBiliegenden DottB�9 werden siB dagegen offenbar ausgewasehen. Wir k0nnen hieraus k]ar BrsehBn, dag injiziBren Biner L6sung in diB Zelle und Ausfliel3enlassen des Plaslnas in die gleiehe L5sung keineswegs ganz kongruBntB VersuehB sind.

Das RBsultat dBr InjektionBn von Indikatoren in d as Dotterplasma kSnnen wir erst verstehen, wenn wir folgenden VersuBh kBnnBn. Wir fiillen eine sorgf5ltig erst mit dBstill. WassBr, dann mit dBr bBtr. Indikator- 16sung gewasehenB Pipette mit Biner olivenbraunen L5sung von Brom- kresolpurpur und fiihrBn sie in Bin mit FiltrierpapiBr abgBtroBknetes auf Watte gelegtes F o r e 11 e n B i unte�9 leiBhtem (~berdruek in den DottBrtBil Bin. Sowie die Pipettenmfindung ira Dotter drinnen ist, sistieren wir den PipBttBndruek und drfiBken auI3Brdem mit Biner Nadel etwas auf das Ei. Es steigt etwas Dotterplasma in die Pipette auf, und zwar erst einB sehr dtinn�8 Substanz und dann Brst diB diBkfliissigBn Kolloide. Da hierbBi eine gBwissB MisBhung der DottersubstanzBn mit der w~13rigen Indikatorl6sung eintritt, erfolgt auBh sehr bald Bine Gerinnung in der Pipette. Es gBrinnen aber nur die diekliehBn SubstanzBn ara unterBn EndB der Pipette, darttber steht dBr zuerst aus dem Ei ausgetrBtenB d~inn- flfissige Plasmainhalt und dann Brst folgt die BmporgBhobene Indikator- 16sung. DiB @erinnung der einBn Phase Brm6glieht es uns, mit Sieherheit fBstzustellen, dag da wirkliBh zwBi versehiedBne Phasen in der Kapillare aufsteigen, und da einB Spur vom Indikator in bBidB hineinkommt, be- kommBn wir aul3erdBm in bBidBn einBn Umsehlag; und zwar sehl~igt der Indikator in dBr dttnnflttssigBn obBrn Phase naeh dBr a l k a l i s e h e n Seite in Bin tiefes Vio1Btt und in der geronnBnBn DottBrmassB naBh der s a u r e n Seite in ein eharakteristisehBs Moosgr i ln um. Es stBhen also in der Kapillare unten diB geronnenB griine Masse, dann die klarB violette Flfissigkeit und darfibBr, von dBr vorigBn ziemlieh seharf gBtrennt, die olivBnbraunB IndikatorlSsung. Es wurden alle Kautelen gBtroffen, Bin Eintrœ von perivitellinem Saft in diB Pipette zu vermBidBn. Diese

Die bipolare I)iffœ des Protoplasnms des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 533

Ge�9 ist aber bei Ein�9 der Pipette in die DotterhSlfte kaum vor- handen, da man vor der Injektion mit einer PrSpariernadel die Nembran dem Ei oben in breiter Flfiehe lest aufdrticken kann. Man kann dureh weitere Pipetten und st~trkeren Druck auf das Ei mitten aus der Dotter- masse gr613ere Tropfen u Dottersubstanz aus dem Innœ der Zelle herausholen, vorsiehtig in neutralem destill. Wasser gerinnen lassen, dann noch einige Male mit destil]. Wasser abspfilen und schliš rien gœ ronnenen Tropfen in destill. Wasser § einem Zusatz von Bromkresol- purpur (olivenbraun) st› lassen. Hierbei ergibt sich, dag aus der raseh geronnenen Dottermasse noch stunden- und tagelang Spuren eines alkalischen Stoffes herausdiffundieren, welcl'~e erst einen violetten Hof um den Tropfen erzeugen und schlieBlich dœ Indikator ira ganzœ Sch~lchen umsehlagen lassen. Die geronnenen Substanzen aber f~rben sieh in ihrer ganzen Masse grtin und ihr Farbton verschiebt sich ~ ent- sprœ dem Herausdiffundieren der alka]ischen Stoffe - - noch etwas mehr nach Gelblichgrfin. Zeichen von cirier Zersetzung, einem pl,Jtz- lichen Auftreten von Sfiuren oder dergl, warœ bel den œ niederen Temperaturen innerhalb 3 Tagen nieht zu beobachten.

In analoger Weise fSrbte sieh die geronnene Phase in B r o m t h y m o l - b l a u dureh und durch satt zitronengelb mit nu�9 sehr sehwaehem Stieh iris Grfine, die unlgebende Flfissigkeit (destill. Wasser-+- Indikator) bl~tulieh grfin. In N et h y l � 9 is t die geronnene Phase orangegelb, die Fl~ssigkeit gelb. Entspreehend dem viel tieferen Umschlagspunkt des Indikators ist also hier kein aufIiilliger Farbuntersehied der Phasen mehr zu bemerken. Nethylrot wird vom Dotter auch viel weniger adsorbiert als d ie beiden andern Farbstoffe.

Die gerinnbaren sauren Kolloide sind ira Dotter in unvergleiehlieh grSl3erer l e n g e vorhanden als die leieht�9 alkalisehen.

Die Injektion kleiner Trop�9 der gleiehen Indikatoren in die Dotter- h~ifte hat ein ganz entspreehendes l~esultat. Aus der Pipettenmfindung ausfliel3ende olivenbraune Bromkresolpurpurl6sung seh]figt for einen Augenbliek in u grfine Bromthymolblaul6sung in Blau um. Aber sehon naeh cirier Sekunde oder raseher wœ die injizierten Troplen beidœ Indikatorœ g r t i n b r a u n bzw. gœ In den injizierten Tropfen des Indikators diffundiert eben zuœ diœ ]eiehtflfissige alkalisehe Phase, diœ tibœ zwisehen den Globu]inteilen vorhanden ist, ein, und erst wenn die diekliehœ Dottersubstanzen naehdringen, seh]figt der Indikator tiberall, wo er mit ihnen in Berfihrung kommt, in den sauren Farbton um; da aber die Masse der Globuline riel grSl3er ist, b]eibt dann der saure

534 Spek

Farbton bœ Die erste Farbreaktion ist leieht zu ~ibersehen. Dieser Befund wurde mit den beiden genannten Indikatoren in gleicher Weise bel Corregonus- und Forœ gemaeht. Das Dotterplasm a der Corregonus-Eier ist tin klein wenig saurer (Bromkresolpurpur grtinlichgelb).

In dem Dotter von Fo re l l ene i e rn injizierte Tropfen vert Phenol- rot, dem n~tehst h6her umschlagenden Indikator zeigten einen orange- gelben Farbton. Ob beim Injizieren eine I~~tung auftritt, blieb zweifelhaft. R6tliche Farbt5ne sind dureh die Membran sehleeht zu erkennen. Es kann aber hSehstens eine sehr zarte aufgetreten sein. - - Injiziertes M e t h y l r o t bleibt gelb.

Bel wohlgelungenen Injektionen bleiben in rien Forelleneiern die injizierten Tropfen noch lange als helle H6fœ ira Dottœ erhalten. Wenn ihre Farbe aueh blasser wird, ist der zweite (saure) Farbton doeh erkennbar. Er bleibt also erhalten. Es kann sieh demnaeh beim Ver- sehwinden des alkalisehen Farbtones nieht um eine vor~ibergehende Ans~tuerung des Plasmas dureh die ,,meehanisehe Alteration" oder dergl. handeln. Viele der sehSn injizierten Fo re l l ene i e r entwiekelten sieh flott weiter.

Injiziœ man die gleiehen Indikatoren in die vegetativen tt~ilften der reifen Ovarialeier, se ist das t~esultat nur graduel] etwas versehieden. Bei den Forelleneiern zeigt sieh der zuerst auftretende alkalisehe Farbton deutlieher und verschwindet langsamer. Au[3erdem sehl/tgt aueh noeh Phenolrot in I~ot um. Die alkalisehe Substanz seheint also hier noeh in h6herer Konzentration vorhanden zu sein. Stets œ aber sehr bald eine Versehiebung des Farbtones naeh der sauren Seite. - - Bei den Silber- fe]eheneiern, bei denen ja die bipolare Differenzierung sehon ira Ovar ziemlieh weit fortsehreitet, ist der Unterschied ira Verhalten der in die vegetativen H5lften injizierten Tropfen kaum merklieh. In die animale H5lfte in der N~the des Poles injizierte ‡ vert Bromkresolpurpttr blœ einige Minutœ lang tiefviolett. Dann verteilt sieh der Tropfen se sehr, dag man im br~tunliehen Plasma niehts Sieheres mehr aber den Farbton sagen kann. - - Andere Indikatoren kamen dureh mi[31iehe Um- starride nieht zut Untersuehung.

Zut Erg~tnzung der besproehenen Beobaehtungen maehte ieh aueh noeh folgenden Versueh: Ieh e x p i p e t t i e r t e T r o p f e n vert D o t t e r - p l a s m a aus der Mitre der Dotterh/ilfte befruehteter Forœ und pustete ihn auf einen troeknen Objekttr~ger aus. Hierauf setzte ieh vorsiehtig einen kleinen Tropfen der Indikatorl5sungen mit einem Glas- st~tbehen auf die Oberfl5ehe des Plasmatropfens auf. Der Farbstoff

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 5 3 5

dur•hdringt die TropfenInasse nur langsam. Aber o�9239 verteilt sich die leichtdiffusible Substanz des Dottertropfens sogleich auch tiber die drt~ber geschichtete Indikatorl0sung, und die Indikatoren sehlagen naeh der alkalischen Seite um. Bel Bromkresolpurpur ist der Umsehlag kr~iftig, bel Bromthymolblau ist er deutlieh, bei Phenolrot ist nur eine zarte RStung zu erkennen. Vœ man nun aber den (in diesem Fall ja nicht geronnenen) Dottertropfen mit einer para�9 Pr~ipariernadel, so dag aueh diœ untere Sehicht desselben mit der IndikatorlOsung gut ver- mischt wird, dann wird die Farbe des Bromkresolpurpurs immer aus- gesprochener grfin, in Bromthymolblau gr~inlichgelb und ira Pheno]rot versehwindet jede Spur einer RStung. Das Resultat stimmt mit den Injektionsbefunden vollkommen fiberein, dart~ber hinaus demonstriert aber der Versu.ch, dag das ,,Saurerwerden" nichts mit einer Zellt~tigkeit zu tun hat. Es ist nun schwer zu sagen, ob die Farb/inderung dadurch allein erkl~irt werden kann, dag die Teflehen, die ira alkalischen Farbton gefSrbt sind, mit immer mehr Teilehen gemischt werden, welche sich ira sauren Farbton �9 oder ob beim kr/iftigen Vermischen wenigstens teilweise auch eine Neutralisation der verschieden geladenenen Kolloidteflchen er- �9 Besonders das v611ige Verschwinden der PhenolrotrStung 1513t es mir doch wahrscheinlicher erscheinen, dag die alkalisehen Teilchen, wenn sie durch das Umrfihren mit immer neuen Teilehen der sauren Kolloide zusammengebracht werden, dann doch neutralisiert werden, dag also m. a. W. eine gewisse r~iumliche Trennung in den Mtramikroskopischen Dimensionen ira Protoplasma fiir ihr vort~bergehendes Erhaltenbleiben doch nStig ist.

Wir haben nun noeh einige zur Ermittlung des p l i des Keimplasmas angestellte Versuche zu erSrtern. Es hat sich hierzu unverhofft eine hSehst einfaehe Methode ergeben. Als ich n/imlieh rien Keimp!asmaht~gel von Forelleneiern oder die Keimscheibe ~tlterer Stadien isoliert hatte, bemerkte ich zu meiner Uberrasehung, dal3 sich in reinen 0,5 %igen Na Cl-L6sungen oder noeh besser in Na C1 § K Cl-LSsungen die Membranen bzw. Zellgrenzen der Furchungszellen teilweise auflSsten, daf~ das ganze Keimplasma allm~ihlieh in die SalzlSsung ausstrSmte und sieh darin klar 15ste. Nun brauchte man nichts anderes zu maehen, als der Salzl6sung etwas von den Indikatoren zuzusetzen, dann erhielt man auf diese Weise, sobald die Plasmasubstanzen mit der FarblOsung in Bert~hrung kamen, um die sich auflSsende Zelle herum den Umschlag in jedem beliebigen Indikator. Versuche naeh dieser Methode lassen sieh in grol3er Zahl ausfOhren. Das ist ein grol3er Vorzug. (Die entspreehenden Versuchœ mit Dotterplasma

536 Spek

lassen sieh deswegen nieht ebenso h~ibsch durehfi~hren, weil die Dotter- h~tlften dœ Eier zu grog sind und bei Bertihrung mit einer gr6Berœ Menge w~13riger L6sungen gerinnœ

Die a u s s t r 5 m e n d e n P l a s m a s u b s t a n z e n der B l a s t o m e r e n g e b œ bel B e r t t h r u n g m i t B r o m k r e s o l p u r p u � 9 B r o m t h y m o l - b l a n u n d P h e n o l r o t a u l 3 e r o r d œ s t a r k e Umsehl~tge n a e h der a l k a l i s e h e n Sei te . Es entstehen um die Zellen herum prachtvolle Farbumschl~tge, welehe sieh immer weiter ausbreiten und, wenn man den Versuch in einem Uhrseh~tlehen ansetzt, den Indikator sehliel31ieh ira ganzen Uhrsch~tlehen umsehlagen lassen. Die Farbumsehl~.ge sind so stark, dal3 man sie ira Uhrseh~tlehenversueh ohne weiteres makro- skopiseh auf weil3em Papier demonstrieren kann. Es entsteht in oliven- brauner B r o m k r e s o l p u r p u r l 6 s u n g ein s a t t v i o l e t t e r Umsehlag, in grtiner B r o m t h y m o l b l a u l 6 s u n g ein re in h i m m e l b l a u e r , der aber nieht so satt ist, weil der Farbstoff wahrseheinlieh sehw5eh• adsorbiert wird, in orangegelber P h e n o l r o t l 6 s u n g ein t i e f s e h a r l a e h r o t e r Farbton. Der Farbton von Bromthymolblau und Phenolrot l~tl3t auf ein p t t von mindestens 7,6 schliel3en. Man mul3 dabei noeh bedenken, dal~ die Plasmastoffe beim AusstrOmen stark verdtinnt werden . Die verwendete Salzl6sung hatte ein pl i von 6,8; wenn es ftir den Umsehlag der Indikatoren praktischer war, wurden die Salzl6sungen aueh mit einem destill. Wasser von p l i = 6,0 angesetzt. Aueh dann waren diœ Farbumschl~ge so stark.

Versuehe mit noeh h6her umsehlagœ Indikatoren ergaben, dal3 man in der Tat sogar mit K r e s o l r o t einen Umsehlag der orange- gelben Farbl6sung in B o r d e a u x r o t erh51t. Aber dieser Umschlag ist nur blal3. Die ausstr6mœ Plasmasehlieren zeigen ihn nur bel der œ Berfihrung mit der Farbl6sung. Bei der Verdiinnung versehwindet er wied• tIier sehl~tgt also nieht mehr der ganzœ Tropfen um. Der Farbton der rotvioletten Sehlieren wilrde einem pl i von 8,0 entspreehen, doeh ist zu bedenken, daB bei der ersten Berfihrung der Indikatorl6sung mit einem Medium von anderem pi:[ immer Sehlieren entstehen, welehe einen stSrkeren Farbumsehlag zeigen als naehher die ganze gut vermisehte L6sung. Wahr- ahrseheinlieh betr~gt das p l i der ausstrSmenden Keimplasmasubstanzen ungef~thr 7,8. Das w ~ d e auch mit dem Fa�9 der VitalfSrbungen gut iibereinstimmen. T h y m o l b l a u l 6 s u n g blieb unverandert gr~inliehgelb. Dieser Indikator sehl~tgt also nieht mehr um.

Zerzup�9 man die membranlos gewordenen Blastomeren oder auch intakte mit �8 Pr~tpariernadeln, die bis auf die Spitze paraffiniert

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmus des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 537

sind und sorgfSltig au�9 Rostfreiheit gepriift wurden, und vermischt sie griindlich mit der IndikatorlSsung, so wird der Farbton derselben i m m e r a 1 k al i s e h er. Hier ira animalen Plasma sind es die alkalisch reagierenden Kolloide, welehe an Nenge bei weitem itberwiegen; je besser man verrt~hrt, um so mehr von ihnen kommen mit der Indikatorl5sung in BerOhrung und lassen dann nat~irlieh den alkalischen Farbton entstehen. Aber es sind doeh aueh ira animalen Plasma Spuren von Kolloiden vorhanden, welche bei der AuflSsung der Blastomeren als feines Oerinnsel t~brigbleiben und von den t~brigen Zel]substanzen befreit, stets eine ihnen inh› s a u r e l%eaktion zeigen. Sie verhalten sieh ganz so, wie die gerinnbaren Substanzen des Hyaloplasmas der jiingsten Ooeyten. Aueh die spezifischœ AffinitSt zu Bromthymolblau koInmt ihnen zu, und zwar ffirben sie sieh darin auch gelb. Aber diš Farbreaktion ist hier riel weniger in die Augen fallend, weil ira animalen Plasma von dieser Phase riel weniger vorhanden ist.

LOst man junge Blastomeren in je einem Tropfen unserer Indikatoren auf und verrtihrt g�9 und verrt]hrt man andererseits je einen Trop�9 Dotterplasma der gleiehen Eier naeh dem Rezept von S. 534 mit den gleichen Indikatoren, dann ist ein direkter Vergleieh frappant. Es ffirbt sieh n a e h dem Verriihren:

t Bromkresolpurpur Brommethylblau Phenolrot

I

Keimplasm~ ] Sattviolett Itimme!blau Scharlachrot

Dottorplasma I Grtin Grtinlichgelb Orange

Aber aueh, wenn wir die Farbreaktionen des Keimplasmas mit denen der dfinnen alkalisehen Phase des Dotterplasmas allein vergleichen, ist noeh ein betr~tehtlieher quantitativœ Untersehied da. Es sind ira animalen Plasma unvergleiehlieh mehr alkaliseh reagierende Substanzen vorhandœ und wohl aueh Substanzen von h5herer Alkalinit5t. Es sind m. a. W. in d~�9 bipolar differenzierten Eizelle der Teleosteer zwei Konzentrations- gef~tl]e vorhanden derart, daB aih animalen Pole a]kalische Plasmasub- stanzen ara st~trksten angereiehert sind und von hier naeh dem andern Pole an Menge immer mehr abnehmen, wfihrend sieh ara vegetativen Pol sauer reagierende Kolloide anreichern, welehe wir ara animalen Pol nur noeh in Spuren vorfinden. Das pl i in der st/irksten Anreieherung des alkalisehen Plasmas ist ann~thernd 7,8, das der Dottersubstanzen annahernd 5,5.

538 Spek

Die oben besehriebenen Farbreaktionen des aufgelOsten Keimplasmas fallen bei allen Eiern eines Laiches gleich ans. Mit fortschreitender Ent- wieklung nimmt die In t e n s i t ~t t dieser Farbreaktionen des Plasmas der Keimscheiben bei allen Indikatoren etwas ab, ohne da~ aber das pl i nach den Farbumsehl~igen zu schliel~en herabsinkt. Es treten m.n.W, die a'leichen Farbumschl~tge auf, aber die Farben sind alle miteinander blasser. Auch wenn man die gleichen Indikatorreaktionen mit jungen Blastomeren vert Eiern verschiedener Weibehen wiederholt, kann man bel manchen in noeh h0herem Grade die gleiehe Erscheinung wiederfinden. Trotzdem das Plasma in die Farbl0sungen ausstr(imte, waren bel manehem Eirnaterial nur ganz blasse Farbreaktionen zu sehen und diœ Farbreaktionen waren bei tiefer umsehlagenden Indikatoren ebenso blalk Man konnte gerade noch erkennen, da~ alle Indikatoren bis hinauf zum Kresolrot naeh der alkalischen Seite umschlngen. Selbst in Bromkresolpurpur, welehes doch sonst se aufterordentlich intensive FSrbungen gab, war nnr ein ganz blasser violetter Farbhof zu sehen. Es war se, als ob die Farbstoffe an die basischen Plasmateilchen einfach gar nicht herankommen k6nnten. Das konnte man sieh ana ehesten se erkl~ren, daI~ die Teilchen vert andern Kolloiden um- hiillt oder doeh wenigstens mit Kolloiden stark untermischt w~ren, an welchen eine positive Adsorption der Farbst0ffe nieht erfolge. Da man solehe Eigensehaften in erster Linie bel Zellipoiden erwarten konnte, machte ich tastende Vorversuehe mit Zns~tzen vert lipoidl6senden Medien. Das Resultat war tiberraschend. Man braucht n~tmlich der Indikator- 16sung nur bis zu 30 % Alkohol zuzusetzen, dann rufen die in sie aus- str0menden Zellsubstanzen mit einem Male wieder die st~trksten Um- sehlSge hervor, und zwar erfolgen diese wieder alle nach der alkalisehen Seite. Die Umsehl5ge entsprachen ganz denen, die auf S. 536 beschrieben wurden, nur der in Kresolrot war etwas st5rker. Von einer weiteren Analyse der Befunde, von Er~rterungen tiber eine etwaige Verschiebung des Umschlagspunktes durch den Alkohol und dergl, wollen wir vorlSufig, bis mehr Versuche vorliegen, absehen. Wir kennen ja die Umschl~tge, welehe die Indikatoren bei Bertihrung mit jenen Plasmasubstanzen in rein w~tl3rigen L�99 geben.

Vert prinzipieller Bedeutung ist hier for uns zunSchst der Nachweis, dal3 manche Plasmakolloide, deren Reaktion offensiehtlich weit veto Nentralpunkt entfernt ist, trotz innigster Bert~hrung mit dem Indikator, se gnt wie gar keinen Umschlag hervorrufen, da~ sie sieh verhalten k5nnen, wie wenn sie reinstes Paraffin61 w~tren, oder aber vert derartigen Substanzen

Die bipo]are Differenzierung des Pro™ des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 539

umhtillt sind, und dag aueh in ihrer Umgebung kœ Farbumsehl~ige zu sehen sind. Diese Erkenntnis dOrfte aueh erklfiren, weshalb R. C h a m b e r s (1932) bei Mikroinjektionen von Indikatoren in das Keimplasma des Fundulus-Eies Farb]'eaktionen beobachtete, welehe blo$ ein pli von 6,8 anzeigten. Er hat wahrscheinlieh blog das p l i des Di™ de; Protoplasmas gemessen.

Es sel zum Sehlug darauf hingewiesen, dag eine genauere ehemisehe UI~tersuehung der eigenttimliehen Stoffe des Keimplasmas dringend n0tig wfire. Man kann gespannt sein, was das wohl fiir Stoffe sind. welehe ira Keimplasma in solehen Mengen konzentriert werden und dieses dann zu seinen aul3erordentliehen formativen Leistungen beftthigen.

W/tgen wir nun die Resultate aller Versuehe gegeneinander ab und versuehen, die Sehlul3reehnung zu maehen. Da kann man zunttehst einmal, so wie unsere Versuehe die Sachlage zeigen, m. A. n. der Sehhlg- folgerung nieht aus dem Wege gœ dal3 das Entseheidende bei den pi{-Bestimmungen ira lebenden Protoplasma die E�9 dœ RB- aktion der dispergierten Phasen ist, und dag diese Reaktion, selbst wenn die Teilehen sehr fein miteinander vermengt sind, bei den Teilehen versehiedener Substanzen offensichtlieh nieht die gleiehe ist, ja sogar weit auseinanderliegen kann. Die Vorstellung, dag im Zellinnern ein v611ig ausgegliehenes p l i vorhanden ist, trifft naeh meinen (zurzeit nat0r- lieh noeh provisorisehen) Erfahrungen itberhaupt nur frit tote Zellen zu. Einigermagen ausgegliehen ist nur das pl i des Dispersionsmittels und liegt jedenfalls ganz nahe beim Neutralittttspunkt. Der h/iufig wiederkehrende Befund anderer Autoren, dag das pl i der versehiedensten Zellen 6,8 sei, ist m. A. n. so zu erkl/iren, dag sie mit ihren Indikatoren und an ihrem Material an die Reaktion der Plasmateilchen ttberhaupt nieht herange- kommen sind und nur das pi{ des Dispersionslnittels gemessen haben.

Die versehiedene Eigenreaktion der Kolloidt• dtirfte aueh eine verschiedene Ladung derselben mit sieh bringen. Wie es m0glieh ist, dal3 versehieden geladene Teilehen nebeneinander existieren k0nnen, dartiber lassen sieh noeh keine bestimmteren Vorstellungen entwiekeln. Vielleieht bilden entladene oder neutrale Teilehen Barrieren zwiset~en ihnen. Man mtil3te aber aueh eine s t t tnd ige N e u b i l d u n g mehr ira Auge behalten.

540 Spek

Ein soleher Zustand des Protoplasmas er5ffnet nun fiir die Kata- phoresetheorie ganz unerwartete neue Aussiehten. Denn wenn man sieh vorstellt, dag diese Systeme versehieden geladener Teilehen in mikro- skopischen Portionen - - eben den Zellen - - in Membranen oder sonstigen Grenzfl~ehen, f~ir welehe man ausgepr~igte Grenzfl~ichenpotentiale sehon vielfaeh naehgewiesen hat, liegen, dann mul~ man ja aueh die Konsequenz ziehen, dag sich ein solehes Plasma, wenn es vorher homogen war, im ttandumdrehen ,,differenzieren" kann in dem Sinne, dal3 etwa positiv geladene Teilehen nach einer F]~ehe hinbewegt werden, andere von ihr fortwandern, dag dabei besonders leicht spezifische Oberfl~iehendifferen- zierungen, bel ungleieher Beschaffenheit der Membran aber aueh bipolare Di�9 entstehen kSnnen.

Dal~ die gesetzm~l~ige konzentrisehe Differenzierung der Fiseheier vor der Reifung auch sehon naeh dem Prinzip erfolgt, dag die alkalisehen Teilehen naeh der OberflSehe wandern, die sauren in der Nitre bleiben, seheint mit sehr wahrseheinlieh. Die Beweisfiihrung bleibt eigentlich nur insofern noch ltickenhaft, als man an die Reaktion der Kortikal- substanzen nicht herankommt. Dag aber die Sonderung von Keim- und Dotterplasma in dem Sinne erfolgt, daB die alkalisehen Plasmakolloide naeh dem RiehtungskSrperpol wandern, die sauren naeh dem andern, kann wohl kaum noeh abgelehnt werden.

Unsere Befunde ara T e l e o s t e e r e i stellen mutatis mutandis ein vSlliges Analogon zu denen ara N e r e i s e i dar, ja einige Beobachtungen ara N e r e i s e i , wie z .B. die nachtr~gliehe Differenzierung des vorher gleiehartig aussehenden Plasmas der Furehungsb]astomeren, werden jetzt riel besser verst~ind]ieh. Ob die Kolloidwanderungen von Ionen- wanderungen beg]eitet sind, bleibt aueh beim Fisehei noeh Bine offerte Frage.

Uber die Aus]5sung de�9 bipo]aren Umgruppierung hat sieh physi- kalisch noch nichts Genaueres ergeben. Das Problem fSllt zusammen mit der Frage, was wohl an der sog. Mikropyle die lokale Aufl5sung der Kortikalsehieht bewirkt. Denn sie ist ja das erste Anzeiehen daf~ir, dag hier etwas Besonderes vorgeht, und zu dieser Stelle steigt dann aueh das Keimbl~.schen empor.

FOr j e d e Methode der pH-Bestimmung ira lebenden Plasma erSffnen unsere Befunde neue Gesiehtspunkte. Sie zeigen z. B., dalt elektrometrisehe Bestimmungen des pl i expipettierter Plasmasubstanzen wahrseheinlich gerade ara Wesentlichsten, n5mlich ara versehiedenen pl i der verschiedenen

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u. ihre Entstehung 54d

Phasen vorbeiftihren, weil sie eben nur ein Bruttoergebnis liefern 1, wenn man die Protoplasmasubstanzen nieht isoliert. Jetzt erst ist es meiner Ansicht an der Zeit, aueh solehe Messungen systematiseh durehzuftihren.

Aueh die V i t a l f~ t rbung d~rfte freilieh keine ideale Methode zur Aufdeekung des Nebeneinanders versehiedene�9 Phasen sein. Alle Phasen werden sieh selten f~trben (und wenn das eintr/tte, wfirde bei �9 Ver- teilung der Stoffe ein Misehton entstehen); die F~trbbarkeit der einen Phase kann dureh die Gegenwart der andern beeinflugt oder ganz aus- gesehaltet werden, und wenn Bine Phase an Substanz stark fiberwiegt, seheint mehr oder weniger nur die F~trbung von dieser durchzudringen. Aber diese komplizierte Saehlage braueht uns nieht gleieh mutlos zu maehen, dœ gerade in diesen gegenseitigen Beeinflussungen der Plasma- substanzen kann ein Sttiek der gesš Dynalnik des Protoplasmas liegen, wir miissen nur, wie immer wieder betont wurde, alle Anfitrbungs- versuehe riel mehr, als es bisher gesehehen ist, variieren, um j eweils wenigstens ein ungeffihres Bild von der allgemeinen Konstellation zu ermitteln, unter der die betr. F~trbung erfolgt.

Aueh wenn P o t e n t i a h n e s s u n g e n ara Fisehei in Zukunft noeh zur L6sung unserer Probleme herangezogen werden, miissen sie in den Rahmen der allgemeinen eytologisehen Analyse eingefilgt werden. Es seheint mir ganz ausgesehlossen, dag man die Resultate von Messungen mit eingeffihrten Mikroelektroden aueh nur einigermal3en riehtig beurteilen kann, ehe man die komplizierte merphelogisehe und dynamisehe Kon- stellation der Eizellen erst eininal aueh nur soweit fiberbliekt, als wir sie oben kennengelernt haben. Es kommen zu solehen Versuehen m. A. n. aueh nur die wenigœ Fischeier in Fraye, welehe man tadellos ganz aus der Membran herausholen kann. Aueh zu diesen Versuehen seheint mir jetzt erst die n5tige Basis gegeben zu sein.

Bei unsern Befunden seheint aufs erste die E n t w i e k l u n g s - m œ insof› riel weniger auf ihre Kosten zu kommen als etwa beim Nereis-Ei, als ja beim Fisehei alle Organe aus dem Zellenmaterial der Keimseheibe angelegt werden. Aber wir dtirfen nieht vergessen, daB die Entstehung des Keimplasmas nur ein Teil der Dynamik der ganzen Zelle ist, und diese k6nnte beim Fisehkeim um so eher aueh neeh in sp5teren Stadien einen Einflul3 auf die Differenzierung dš Blastomerœ austiben,

1) Vgl. von diesem Gesichtspunkt die elektrometrischen pH-Messungen am Dotter- plasma des Fundulus-Eies, welche J. Bod ine (1927) ausgefiihrt hat.

542 Spek

als diese noeh lange Zeit gegen das vegetative Plasma offert sind, d. h. keinœ ~[embranen bilden. Aul3erdem sind ja sieher aueh innerhalb des animalen Bezirkes selbst noeh Diffœ in der Plasmabesehaffenheit vorhanden, bloB treten sie halt dureh unsere Methoden nieht in so auf- �9 Weise zutage wie die viel gr613eren Di�8 zwisehen animalem und vegetativem Plasma. Dag bei dem Wirbeltierkeim ~ibrigens gerade de�9 dorsale Teil des Entoderms noeh zu so aul3erordentliehen formativen Leistungen bef~thigt ist, erseheint von unsern Gesiehtspunkten besonders interessant, da diœ Plasmabeseha�9 dieser Entoderlnzellen der der Ektodermzellen physiologiseh riel n'aher stehen dtir�9

Anhangsweise seien hier zum Sehlul] noch ganz kurz einige Befunde fiber die Reaktion der Plasmakolloide des F r o s e h e i e s gemacht, welche jetzt schon zeigen, dal~ wir auch hier auf die gleichen Gesetzm5Ngkeiten sto~en, und dal3 die andersartigen VerhS]tnisse uns erlauben, die gleiche Analyse noch einen Sehritt weiterzufiihren.

Ara instruktivsten ist an diesem Naterial vielleieht ein Versuch mit expipettierten Tropfen von Plasma der versehiedenen Eiregionen. Pustet man Plasma aus der weigen tt~tlfte reifer Eier von Rarta temporaria in destill. Wasser aus, dann sondern sieh hier die verschiedenen Substanzen sehon dureh ihr versehiedenes spez. Gewieht sauberer als wir das bei den Forelleneiern durch das Gerinnungsexperiment jemals erreiehen. Der in KOrnehenform vorhandene weil3e Dotter sinkt zu Boden und tiber diesem Bodensatz steht ira Wasser Bine leiehtere trttbe Wolke. Der Bodensatz weist eine ihm inh~trente stark saure Reaktion auf, die Kolloidwolke da�9 aber ist alkaliseh. Es �9 sieh z. B. der Bodensatz in Brom- kresolpurpur satteigelb, was auf ein pII von 5,4 sehlieBen 1/il3t (!), die Wolke dartiber tiefviolett (bei stfirkerer Verteilung •ber das Seh~tlehen blaugran). In Bromthymolblau ist der Untersehied besonders seh6n, die Wolke erseheint sehmutzigblau, der Bodensatz tiefgelb, in Pheno]rot ist die Wolke rOtlieh, Bodœ nieht ge�8 Weder die saure Farb- reaktion der Dotterk0rner, noeh die alkalisehe der ,,Wolke", deren Grenzen man j a wegen ihrer optisehen Inhomogenit~tt sieht, grei�9 au�9 das umgebende Wasser fiber. Ein Ausgleieh der Farbuntersehiede Iindet bei 10 0 C aueh naeh Tagen nieht statt.

J~hnlieh wie die Lipoidtropfen der Forelleneier (s. S. 529) adsorbieren die Dotterk5rner die Farbstoffe erst wenn sie von den fibrigen Plasmastoffen

Die bipolare Differenzierung des Protoplasmas des Teleosteer-Eies u, ihre Entstehung 543

befreit sind. In der Zelle sœ nehmen sie selbst Bromkresolpurpur so gut wie gar nieht an. Bei Injektionen von Bromkresolpurpur in den weil3en Pol sieht man nur eine zarte violette F~trbung in der weil3en Masse aufsteigen.

ira anima]en Plasma sind fast nur alkaliseh reagierende Substanzen zu �9

Rurze Zusammenfassung der Hauptresultate

An s~tmtlichœ Entwieklungsstadien der Ovarialeier der unt~er- suehten Fische wurden u mit Neutralrot, Nilblausulfat, Brillantkresylviolett, Kresylœ und Brillantu ausgefiihrt. ttierzu wurdœ parallellaufend Ffirbungen bzw. Injektionen mit den Clarkschen Indikatoren Bromkresolpurpur, Bromthymolblau und Phcnol- rot gemacht und bel bœ Versuchsserien besonders die Reaktion und der Verteilungsmodus an den nacheinander auftretenden Zellein]agerungen der Eier studiert.

Schon in den klarœ kleinen Oocyten sind ira Plasma, dessen Haupt- masse zi› sauœ reagiert (pli ca. 5,8), zwei Phasen ~ersehiedener Reaktion naehweisbar. Durch F5rbungen und Indikatorinjektionen sch6n naehweisbar ist dann in diesen jungen 0oeyten besonders das massenhafte Au�9 a]kaliseher Zellkolloide. Sie entstehen in der Kernn~the und wandern dann an die 0berfl~che, wo sie eine breite periphere Sehieht einnehmen. Aus ihrer Nasse differenziert sieh noeh eine diehte Kortikal- sehicht unter der Membran aus, die dureh Ausriehtung ihrer ‡ ein radifirstreifiges Aussehen erhSlt. Zwisehen der peripheren alkalisehen Sehieht und dem grogen Zellkern haufen sieh die vielen sauer reagierenden Dotterk~irnehen an.

Das Klarwerden der a!testen 0varialeier beruht auf einer starken Yerquellung dœ meisten Zellsubstanzen.

Der konzentrisehe Aufbau des Eies wird mit dem Aufsteigen des Eikernes zur Nikropyle verlassen. Naeh diesem Vorgang setzt einœ bipolare Wanderung der Zellsubstanzen ein. Sie beginnt sehon ira 0var, erf5hrt aber stets naeh dem Austritt der Eier ins Wasser eine starke Steigerung und ltthrt zur Aussonderung des Kegels von Keimplasma ara Riehtungs- k6rperpol. Die Stof�9 erfolgt olfensiehtlieh so, dag die alkaliseh reagierenden Zellkolloide naeh dem Riehtungsk6rperpol und die sauer reagierenden naeh dem gegentiberliegenden bewegt werden. Die dabei entstehenden pH-Untersehiede werden auch dureh einige Vitalfgrbungen

544 Spek

angezeigt. Die C la rksehen Indikatoren deuten iii der Masse der Dotter- substanzen ein p l i von ca. 5,6, ira Keimplasma ein solches von fiber 7,6 an. In diesem ergibt Phenolrot einen sehr starken Umschlag nach Rot , Kresolrot noch einen blassen naeh der alkalisehen Seite, Thymolb]au sehl~tgt nieht mehr um. FOr die Best immung der Reakt ion des Keim- plasmas ergab sieh bai Forelleneiern Bine besondere Methode (Aufl6sung des Plasmas in Salzl6sungen), ara Dotterp]asma ]ieferten Studien an expipet t ier ten Tropfen wertvolle Erg~nzungen zu den andern pH-Be- st immungen. Aueh nach der stSrksten Sonderung der Substanzen sind ara vegetat iven Pol neben der Masse der sauren Kolloide geringe Mengen eines dtinnfltissigen alka]ischen Kolloides, und ara animalen Pol zwischen der Hauptmasse der a]kalisehen Kolloide Spuren Biner sauren Phase naehweisbar. Es resultiert also eus der Stoffsonderung ein nach dem animalen Pol zunehmendes Konzentrationsge�9 von alkalischen Sub- stanzen und ein nach dem vegetat iven Pol zunehmendes von sauren.

Die Stoffsonderungen sind von der Schwere unabh~ngig und kSnnen �9 .

dureh Oberfl5chenspannungsdlfferenzen nicht erkl~rt werden. Der perivitelline Saf t raum der Teleosteereier entsteht durch Ver-

quellung ™ Plasmakolloiden zwisehen der radi~rstreifigen Schieht (die mit der Membran mitabgehoben wird) und der t ieferen viskosen Zone der alkalischen Sehieht.

Den Leitern der Biologischen Versuchsanstalt in Mtinchen und des Inst i tuts far Seenforschung in Langenargen ara Bodensee spreche ieh far die mir erwiesene Gastfreundsehaft meinen besten Dank ~us.

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Diebipol~reDifferenzierungdesProtoplasmasdesTeleosteer-Eies u. ihrcEntstr 545

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E r k l ~ t r u n g d er F i g u r e n d e r T a f e l V I I I

Fig. 1. Ovarialeier von Gastros'teus aculeatus. Mit Kresylechtviolett vital gefgrbt. Fig. 2--4. Ovarialeier von Betta pugnax (Blauer Kampffisch). 2 mit Kresy]echtviolœ 3 mit Brillantkresylviolett and 4 mit Brillantvitalrot vital gefgrbt. Die Farbunter- schiede zwischen den kleinen rosa 0ocyten und den groBen ziegelroten sind in der Reproduktion leider abgeschw/icht. Von einem Neudruek wurde wegen dcr Kosten

abgesehen. Fig. 5 u. 6. Befruchtetes Ei und glteres Furehungsstadium von Corregonus macro-

phtalmus mit Kresylechtviolett vital gefgrbt.

Protoplasma. XVIII 35