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Charakterisierung des filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1
Diplomarbeit
vorgelegt dem
Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)
an der Universität Bremen
von
Jan Schrübbers
Oktober 2007
Betreuender Gutachter: Prof. Dr. U. Fischer
Zweiter Gutachter: Prof. Dr. K.-H. Blotevogel
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die
Bereitstellung meines Arbeitsplatzes sowie die Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei
der Erstellung meiner Diplomarbeit bedanken.
Bei Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz Blotevogel möchte ich mich für sein Interesse und für
die Begutachtung meiner Diplomarbeit bedanken.
Meinen Kollegen aus der Arbeitsgruppe danke ich für das gute Arbeitsklima, die
„leckeren Kaffeekränzchen“ und ihre Unterstützung sowie Diskussionsbereitschaft
bei Problemen.
Ein spezieller Dank gilt Dr. Birgit Heyduck-Söller, die immer ein offenes Ohr für mich
hatte und mich einfach „riesig“ betreut hat.
Bei Anke Toltz und der AG Heyser möchte ich mich für die Betreuung bei der
Erstellung der TEM-Aufnahmen bedanken.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich über mein gesamtes Studium
finanziell und moralisch unterstützt haben. Außerdem möchte ich meinen Brüdern
danken, die mir bei meinen „chemischen Problemen“ geholfen haben. Meiner
Freundin danke ich für ihr Verständnis, ihre Unterstützung und die Geduld mit mir.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I. Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................i 1. Einleitung................................................................................................................ 1
1.1 Cyanobakterien................................................................................................. 1 1.1.1 Morphologie der Cyanobakterien................................................................ 1 1.1.2 Photosynthetisch aktive Pigmente.............................................................. 2
1.1.2.1 Struktur und Funktion der Thylakoide .................................................. 3 1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome ............................................ 4 1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation .......................................... 5
1.2 Taxonomische Einteilung von Cyanobakterien ................................................. 6 1.2.1 Historische Entwicklung der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien .......................................................................................... 6 1.2.2 Die Ordnung Oscillatoriales........................................................................ 8 1.2.3 Probleme der taxonomischen Einteilung .................................................... 9
1.3 Ziel der Arbeit.................................................................................................. 10 2. Material und Methoden......................................................................................... 11
2.1 Verwendete Cyanobakterien-Stämme und deren Herkunft............................. 11 2.2 Kulturbedingungen und verwendete Medien................................................... 11
2.2.1 Verwendete Medien.................................................................................. 11 2.2.2 Kulturbedingungen ................................................................................... 12 2.2.3 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1.................................... 13
2.2.3.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 13 2.2.3.2 Eliminierung heterotropher Bakterien durch Zugabe von Antibiotika .......................................................................................... 13
2.3 Morphologische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 ................... 14 2.3.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 14 2.3.2 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Betrachtung.................................. 14 2.3.3 Zellgrößenbestimmung............................................................................. 14 2.3.4 Scheiden-Nachweis.................................................................................. 15 2.3.5 Motilitäts-Nachweis................................................................................... 15 2.3.6 Klassifizierung von Stamm Flo1 aufgrund morphologischer Merkmale anhand von Literaturdaten........................................................................ 15
2.4 Physiologische Charakterisierung von Stamm Flo1........................................ 16 2.4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (PFDs)................................................................... 16
2.4.1.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 16 2.4.1.2 Auswertung........................................................................................ 16
2.4.1.2.1 Chlorophyll a-Bestimmung nach MACKINNEY (1941).................... 17 2.4.1.2.2 Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976) ................................ 17 2.4.1.2.3 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen ......................... 18
2.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung einer Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht.......................................... 18 2.4.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten................................................................................................. 19
2.4.3.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 19 2.4.3.2 Auswertung........................................................................................ 20
2.4.4 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH- Werten...................................................................................................... 20
2.4.4.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 20 2.4.4.2 Auswertung........................................................................................ 21
Inhaltsverzeichnis
2.4.5 Untersuchungen zum Vitamin B-Bedarf ................................................... 21 2.4.5.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 21 2.4.5.2 Auswertung........................................................................................ 22
2.4.6 Untersuchungen zur Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoffverbindungen ............................................................................. 22
2.4.6.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 22 2.4.6.2 Auswertung........................................................................................ 23
2.4.7 Untersuchungen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung............................... 23 2.4.7.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 23 2.4.7.2 Auswertung........................................................................................ 23
2.5 Molekularbiologische Untersuchungen an den Stämmen Flo1 und PCC 7105 ....................................................................................................... 24
2.5.1 DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996)..................... 24 2.5.2 Polymerase Chain Reaktion (PCR) .......................................................... 25
2.5.2.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 25 2.5.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gel......................... 27 2.5.2.3 Aufreinigung und Sequenzierung der PCR-Produkte......................... 28 2.5.2.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen .............................. 28
2.5.3 Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)....................................... 29 2.5.4 Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA) ......................................... 30 2.5.5 Real-Time-PCR (RT-PCR) ....................................................................... 31
2.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes (mol%) nach MARMUR (1961) .......................... 33 2.6.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 33 2.6.2 Zellaufschluss und DNA Extraktion .......................................................... 34 2.6.3 Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) und Berechnung des G+C-Gehaltes (mol%) von Stamm Flo1.......... 35
2.7 Analyse des Fettsäuremusters von Stamm Flo1............................................. 36 2.7.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 36 2.7.2 Bestimmung des Fettsäureprofils ............................................................. 36
2.8 Qualitative und quantitative Bestimmung der photosynthetisch aktiven Pigmente von Stamm Flo1 nach Wachstum der Kulturen bei unterschiedlichen Photonenflussdichten ......................................................... 37
2.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden.................... 37 2.8.1.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 37 2.8.1.2 Auswertung........................................................................................ 37
2.8.2 Qualitative Pigment-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC .............. 38 2.8.2.1 Auftrennung der Extrakte ................................................................... 38 2.8.2.2 Detektion der Retentionszeiten und Absorptionsspektren ................. 39 2.8.2.3 Identifizierung der Pigmente und Ermittlung der relativen Anteile...... 39
2.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine ................. 39 2.8.3.1 Probenvorbereitung und Konzentrationsberechnung......................... 39
2.8.4 Versuche zur Komplementären Chromatischen Adaptation ..................... 40 2.8.4.1 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine........... 40
2.8.4.1.1 Probenvorbereitung..................................................................... 40 2.8.4.1.2 Auswertung ................................................................................. 41
2.8.4.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC .... 41 2.8.4.2.1 Probenvorbereitung..................................................................... 41 2.8.4.2.2 Auswertung ................................................................................. 41
Inhaltsverzeichnis
2.9 Transmissions-Elektronen Mikroskopie (TEM)................................................ 42 2.9.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 42 2.9.2 Schneiden der TEM-Präparate................................................................. 43 2.9.3 TEM-Aufnahmen ...................................................................................... 44
2.10. Herkunft der verwendeten Chemikalien ....................................................... 44 3. Ergebnisse............................................................................................................ 45
3.1 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1 .......................................... 45 3.2 Morphologische Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105............. 45
3.2.1 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Beschreibung ............................... 45 3.2.2 Zellgrößenbestimmung............................................................................. 46 3.2.3 Scheidennachweis.................................................................................... 47 3.2.4 Motilitäts-Nachweis................................................................................... 47 3.2.5 Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung.......................... 48
3.3 Taxonomische Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Grundlage morphologischer Merkmale............................................................................. 49 3.4 Ergebnisse der physiologischen Charakterisierung ........................................ 50
3.4.1 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten .......... 50 3.4.1.1 pH-Wert in den Überständen ............................................................. 51 3.4.1.2 Makroskopische Beschreibung der Kulturen...................................... 53
3.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung der Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht.......................................... 54 3.4.3 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten............................ 55 3.4.4 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten ........................... 56 3.4.5 Vitamin B-Bedarf für das Wachstum......................................................... 58 3.4.6 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen............................................. 59 3.4.7 Fähigkeit zur Stickstofffixierung................................................................ 60
3.5 Auswertung der molekularbiologischen Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105......................................................................................... 60
3.5.1 DNA-Extraktion......................................................................................... 60 3.5.2 Amplifikation der 16S rDNA...................................................................... 61 3.5.3 Amplifikation des Gens gyrB .................................................................... 62 3.5.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen..................................... 63 3.5.5 Random Amplified Polymorphism DNA-Analyse (RAPD)......................... 65 3.5.6 Amplified rDNA Restriction Analysis-Analyse (ARDRA) ........................... 67 3.5.7 Real-Time-PCR-Analyse .......................................................................... 70
3.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes ......................................................................... 72 3.7 Analyse des Fettsäuremusters........................................................................ 73 3.8 Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente............................................. 75
3.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden.................... 75 3.8.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung .......................................................... 76 3.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine ................. 79 3.8.4 Ergebnisse zur Komplementären Chromatischen Adaptation .................. 80
3.8.4.1 Nachweis der Phycobiliproteine nach Inkubation in Rot- bzw. Grünlicht............................................................................................. 80 3.8.4.2 Qualitativer Nachweis der im Rot- bzw. Grünlicht synthetisierten Pigmente............................................................................................ 82
3.9 Ultrastruktur der Zelle von Stamm Flo1........................................................... 84
Inhaltsverzeichnis
4. Diskussion ............................................................................................................ 86 4.1 Hintergrund ..................................................................................................... 86 4.2 Polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1 ............................................... 87
4.2.1 Morphologie.............................................................................................. 87 4.2.2 Molekularbiologie...................................................................................... 89
4.2.2.1 Sequenzanalyse der 16S rDNA und des Gens gyrB.......................... 89 4.2.2.3 Toxin-Nachweis mittels RT-PCR........................................................ 91
4.2.3 G+C-Gehalt .............................................................................................. 92 4.2.4 Analyse des Fettsäuremusters ................................................................. 93 4.2.5 Physiologie ............................................................................................... 94
4.2.5.1 Lichtbedingungen............................................................................... 94 4.2.5.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten ..................... 96 4.2.5.3 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen ...................................... 97
4.3 Herstellung axenischer Kulturen ..................................................................... 98 5. Ausblick ...............................................................................................................100 6. Zusammenfassung ..............................................................................................102 7. Anhang ................................................................................................................105 8. Literaturverzeichnis .............................................................................................114
I. Abkürzungsverzeichnis i
I. Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AP Allophycocyanin
Aqua bidest. Zweifach destilliertes Wasser
ARDRA Amplified rDNA Restriction Analysis
ASN Artificial Seawater Nutrient
ATP Adenosintriphosphat
BBD black band disease („Korallen-Krankheit“)
BLAST basic logical aligment search tool
bp Basenpaar(e)
BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)
Chl a Chlorophyll a
DAD Dioden-Array-Detektor
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynucleotidtriphosphat
EMK Erlenmeyerkolben
ERG Eppendorfreaktionsgefäß
FAME Fatty Acid Methyl Ester (Fettsäure-Standard)
G+C Guanin und Cytosin
GC Gaschromatographie
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
ICBN International Code of Botanical Nomenclature
ICNP International Code of Nomenclature of Procaryotes
ICSP International Committee on Systematics of Procaryotes
Kap. Kapitel
kb Kilobasenpaare
NCBI National Center for Biotechnology Information
NJ Neighbour-Joining
OT Objektträger
p.a. zur Analyse
PAR Photosynthetically Active Radiation (photosynthetisch aktive
Strahlung)
PBS Phycobilisom
I. Abkürzungsverzeichnis ii
PC Phycocyanin
PCC Pasteur Culture Collection
PCR Polymerase Chain Reaction
PE Phycoerythrin
PFD Photon Flow Density (Photonenflussdichte)
PP Pasteur-Pipette
PS Photosystem
RAPD Random Amplified Polymorphism DNA
rpm Rotation per minute (Rotation pro Minute)
RT Raumtemperatur
RT-PCR Real-Time-PCR
RUBISCO Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase
SD „Dice similarity coefficient“ (Koeffizient zur Berechnung von
phylogenetischen Verwandtschaften anhand von Bandenmustern)
Tab. Tabelle
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TM Schmelztemperatur TMM Trace-Metal-Mix
U Unit (µmol/min)
UFT Umwelt Forschung Technologie Zentrum
UPGMA Unweighted Pairwise Grouping Method using Arithmetic means
(ungewichtete Methode zur Gruppierung von Organismen unter
Verwendung von Distanz-Mittelwerten)
UV/Vis Ultraviolett/visible (sichtbar)
v/v volume per volume (Volumen pro Volumen)
w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen)
1. Einleitung 1
1. Einleitung
1.1 Cyanobakterien
Cyanobakterien repräsentieren die größte, formenreichste und am weitesten
verbreitete Gruppe von phototrophen Bakterien (FUCHS 2006). Sie sind in der Lage,
eine Vielzahl von Habitaten wie Böden, Seen, Gletscher, Wüsten oder heiße Quellen
zu besiedeln (SANCHEZ-BARACALDO et al. 2005).
Vom Zellwandtyp her zählen sie zu den Gram-negativen Bakterien. Dabei nehmen
die oxygen-phototrophen Cyanobakterien eine eigene phylogenetische Nische ein,
die nahe verwandt zu den Gram-positiven mit niedrigem G+C-Gehalt wie Bacillus
subtilis ist (CASTENHOLZ 2001). Wegen der Fähigkeit, Kohlendioxid über den Calvin-
Zyklus zu fixieren sind sie zu autotrophem Wachstum in der Lage und gelten somit
als wichtigste marine Primärproduzenten (WATERBURY et al. 1979).
Cyanobakterien gelten als evolutiv älteste Mikroorganismen mit über 3 Milliarden
Jahren Entwicklung (GLAZER 1977). Durch die Freisetzung von Sauerstoff in der
photosynthetischen Reaktion, analog den Pflanzen und Grünalgen, und dem
Entfernen von Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre waren diese Prokaryonten
essentiell an der Entwicklung der heutigen Biosphäre beteiligt (TANDEAU DE MARSAC
und HOUMARD 1993).
Aufgrund der großen Homologien in biochemischen Prozessen und der
Photosynthese-Reaktion wird eine Verwandtschaft zwischen den Cyanobakterien
und den Chloroplasten der Algen und Pflanzen vermutet (RAVEN und ALLEN 2003).
1.1.1 Morphologie der Cyanobakterien
Morphologisch weisen Cyanobakterien eine große Diversität auf, wobei sie
unizellulär oder in Filamenten, einzeln oder in Kolonien auftreten (WHITTON und
POTTS 2000). Außerdem können sie Mikrobenmatten und Wasserblüten bilden
(MADIGAN et al. 2001). Die Zellteilung der unizellulären Cyanobakterien kann in einer
oder mehreren Ebenen erfolgen; die Vermehrung der filamentösen Cyanobakterien
geschieht durch Filamentbrüche, so genannte Hormogonien oder durch die
Ausbildung von Akineten (WHITTON und POTTS 2000). Dabei kann es zu einer Zelllyse
einzelner Zellen im Filament kommen (necridische Zellen), wodurch die
Fragmentierung der Filamente begünstigt wird (CASTENHOLZ 2001). Als äußere,
1. Einleitung 2
protektive Abgrenzung zur Umgebung weisen zahlreiche Cyanobakterien eine Hülle
auf, die je nach Konsistenz als Glycokalix, Scheide oder Kapsel bezeichnet wird
(CASTENHOLZ 2001) und als Biopolymer in den letzten Jahren in den Fokus für eine
industrielle Nutzung gerückt ist (DE PHILIPPIS et al. 1993).
Obwohl Cyanobakterien keine Geißeln oder Flagellen besitzen (CASTENHOLZ 2001),
ist bei einigen Gattungen eine langsame, gleichmäßige, gleitende Bewegung
nachgewiesen worden. Vor allem filamentöse Cyanobakterien können auf festen
oder halbfesten Untergründen eine gleitende Motilität aufweisen (HOICZYK und
HANSEL 2000).
Cyanobakterien können eine Vielzahl verschiedener Einschlusskörper wie
Glycogengranula (Polyglukose), Cyanophycin (ein Polymer aus Arginin und
Asparagin), Carboxysomen (Speicherung kristalliner Enzyme des Calvin-Zyklus wie
RUBISCO), Polyphosphatgranula oder Gas-Vesikel aufweisen (CASTENHOLZ 2001).
Neben den vegetativen Zellen können bei Cyanobakterien differenzierte Zellen
nachgewiesen werden. Aerob stickstofffixierende Cyanobakterien können
Heterozysten zum Schutz der sauerstoffempfindlichen Nitrogenase ausbilden. Die
Synthese der Heterozysten, die durch eine dicke Zellwand und die Abwesenheit des
sauerstoffproduzierenden Photosystems II gekennzeichnet ist, wird durch
Stickstoffmangel induziert (FUCHS 2007). Unter Mangelbedingungen wie z.B. Licht
oder Nährstoffe können Akineten ausgebildet werden, die wegen ihrer dickeren
Zellwand längere Zeit tolerant gegenüber Austrocknung, Gefrieren oder hohe
Salzkonzentrationen sind (VAN DOK und HART 1997).
1.1.2 Photosynthetisch aktive Pigmente
Cyanobakterien sind in der Lage, Chlorophyll a als primäres Photopigment sowie
akzessorische Pigmente (Carotinoide und Phycobiliproteine) zu synthetisieren
(LAWLOR 1990), die zusammen in einer charakteristischen Grün-Blaufärbung der
Cyanobakterien resultieren. Dabei wird Licht mit Wellenlänge im Rot- und
Blaulichtbereich des sichtbaren Lichtes von dem Chlorophyll a absorbiert und Licht
aus dem Grün, Gelb- und Orangelichtbereich von den Phycobiliproteinen absorbiert
(SIDLER 1994).
Cyanobakterien besitzen, wie Grünpflanzen und Algen, sowohl Photosystem I (PS I)
als auch Photosystem II (PS II), wobei Wasser als Elektronendonator fungiert und
Sauerstoff entsteht (oxygene Photosynthese) (WHITTON und POTTS 2000). Der Ort
1. Einleitung 3
der Photosynthese ist die Thylakoidmembran, in der die photosynthetisch aktiven
Pigmente lokalisiert sind (BALD et al. 1996).
Anoxyphotobakterien, wie Purpur und Grüne Bakterien, fehlt das Photosystem II. Sie
sind nicht in der Lage Wasser als Elektronendonator zu verwenden und können
somit niemals Sauerstoff während der Photosynthesereaktion freisetzen (FISCHER
1987).
1.1.2.1 Struktur und Funktion der Thylakoide
Wie andere Gram-negative Prokaryonten weisen Cyanobakterien eine äußere
Begrenzung aus Cytoplasmamembran, Peptidoglykanschicht und äußerer Membran
auf (HOICZYK und HANSEL 2000). Zusätzlich weisen Cyanobakterien ein internes
System von Thylakoidmembranen auf, das häufig Großteile des Cytoplasmas
einnimmt und ein separates, membranumschlossenes Kompartiment darstellt,
welches nicht in direktem Kontakt zur Plasmamembran zu stehen scheint (LIBERTON
et al. 2006). Dabei zeigen Cyanobakterien nicht die für Grünpflanzen typische
Membran-Stapelung (ANDERSSON und ANDERSON 1980).
In die Thylakoidmembran sind die komplette photosynthetische Elektronen-
transportkette mit den Reaktionszentren PS I und PS II sowie der Cytochrom b6f-
Komplex integriert (MULLINEAUX 1999), die über Elektronen-Carrierproteine gekoppelt
sind. Außerdem sind die wichtigsten Antennensysteme, die Phycobilisome (siehe
nachfolgendes Kapitel) und Carotinoide, an die Membranoberfläche bzw. an das
Reaktionszentrum II assoziiert (BALD et al. 1996).
Carotinoide absorbieren Licht im Bereich zwischen 400 und 530 nm und leiten die
gewonnene Energie über die Phycobiliproteine zum Chlorophyll a. Außerdem wirken
sie photoprotektiv, da sie zu helles Licht absorbieren und toxische Sauerstoffderivate
detoxifizieren (NELSON und COX 2001).
Phycobiliproteine absorbieren Wellenlängen zwischen 500 und 650 nm und
transferieren die so absorbierte Energie an das Chlorophyll a (ANDERSON und TOOLE
1998). Zusätzlich zu den photosynthetisch aktiven Pigmenten enthält die
Thylakoidmembran auch die Protonen-translozierenden ATPasen sowie Enzyme der
Atmungskette (MULLINEAUX 1999).
1. Einleitung 4
1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome
Phycobilisome (PBS) sind supramolekulare Komplexe von Phycobiliproteinen, die als
bedeutendste lichtsammelnde Antennen in Cyanobakterien fungieren (BRYANT et al.
1979). Phycobiliproteine sind wasserlösliche Proteine, die kovalent verknüpfte,
offenkettige Tetrapyrrole (Phycobiline) beinhalten (SIDLER 1994).
Phycobiliproteine können, bei niedriger Belichtung und ausreichend Nährstoffen
während des Wachstums, bis zu 40% der Gesamtproteinmenge der Zelle
ausmachen (GLAZER 1994). Lokalisiert sind die Phycobilisome in Reihen auf der
Oberfläche der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran (TANDEAU DE
MARSAC 2003), wobei sie mit dem Photosystem II assoziiert sind und einen PS II-
PBS-Superkomplex bilden (BALD et al. 1996).
Phycobilisome bestehen aus 2 Strukturdomänen, dem inneren Kern bestehend aus
dem Phycobiliprotein Allophycocyanin (AP) und den peripheren zylindrisch
angeordneten Stäbchen bestehend aus den Phycobiliproteinen Phycoerythrin (PE)
und Phycocyanin (PC) (WESTERMANN und WEHRMEYER 1995), sowie die für den
strukturellen Aufbau und der funktionellen Organisation essentiellen Linkerproteine
(SIDLER 1994). Dabei sind die Allophycocyaninmoleküle mit der photosynthetischen
Membran in unmittelbarem Kontakt und von Phycoerythrin und Phycocyanin
umgeben (Abb. 1). Die außen gelegenen Pigmente absorbieren kurzwelligeres und
somit energiereicheres Licht (PE: ~550 nm; PC: ~620 nm) und leiten die gewonnene
Energie mit einer Effizienz von nahezu 100% (BRYANT et al. 1979) auf
Allophycocyanin weiter (Excitonentransfer), welches eng mit dem Reaktionszentrum
verbunden ist (MADIGAN et al. 2001).
Abb. 1: Aufbau eines Phycobilisomes aus Allophycocyanin (AP), Phycoerythrin (PE) und Phycocyanin (PC) und der Energieübertragung (Excitonentransfer) zum Chlorophyll a auf der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran. Dargestellt ist der Kern aus AP mit sechs peripheren, zylindrischen Stäbchen aus PE und PC (aus NELSON und COX 2001).
1. Einleitung 5
Phycobilisome werden auf Grund ihres Aufbaus in zwei Klassen unterteilt.
Charakteristisch für Cyanobakterien ist die hemidiscoidale Anordnung der
Phycobilisome mit sechs peripheren Zylindern (WESTERMANN und WEHRMEYER 1995),
während einige Rotalgen hemiellipsiodiale Phycobilisome aufweisen (GANTT und
CONTI 1966). Cyanobakterien können als Reaktion auf Veränderungen der
Lichtintensität und Lichtqualität die relativen Anteile an photosynthetischen
Pigmenten verändern. Die Veränderung durch Modifikation der Phycobilisome wird
als „Komplementäre Chromatische Adaptation“ bezeichnet (TANDEAU DE MARSAC und
HOUMARD 1988).
1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation
GAIDUKOV (1903) beobachtete eine Modifizierung der Pigmentzusammensetzung bei
Cyanobakterien mit wechselnder Lichtqualität, ein Phänomen, das als
„Komplementäre Chromatische Adaptation“ beschrieben wurde. Diese Pigment-
Veränderungen sind auf eine Verschiebung des Phycoerythrin/Phycocyanin-
Verhältnisses zurückzuführen (BORESCH 1922 und TANDEAU DE MARSAC 1977). Dabei
wird nur die Zusammensetzung der peripheren Phycobiliproteine verändert, nicht
aber der Kern aus Allophycocyanin (TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD 1993).
Gemäß ihren Fähigkeiten zur Komplementären Chromatischen Adaptation werden
Cyanobakterien nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) in 3 Gruppen
unterteilt. Gruppe 1 beinhaltet Stämme, die nicht zur Veränderung des
Phycoerythrin/Phycocyanin-Verhältnisses in der Lage sind und die Pigmente
mengenmäßig unabhängig von der Wellenlänge des Lichtes synthetisieren.
Organismen der Gruppe 2 betreiben eine unidirektionale Adaptation durch
Modifikation der Synthese von ausschließlich Phycoerythrin. Die Syntheserate von
Phycoerythrin ist im Grünlicht maximal, in Rotlicht hingegen minimal oder erfolgt gar
nicht. Phycocyanin wird, unabhängig von der Wellenlänge des einfallenden Lichtes,
konstant synthetisiert.
Eine bidirektionale Adaptation, eine Veränderung der Synthese von Phycoerythrin
und Phycocyanin erfolgt bei Stämmen der Gruppe 3. Bei einfallender Wellenlänge im
Grünlichtbereich ist die Synthese von Phycoerythrin maximal, von Phycocyanin
minimal, wird aber nicht total unterdrückt. Dagegen wird unter Rotlichteinfluss
Phycocyanin vermehrt synthetisiert, während die Synthese von Phycoerythrin nur
minimal ist, aber immer erfolgt.
1. Einleitung 6
1.2 Taxonomische Einteilung von Cyanobakterien
1.2.1 Historische Entwicklung der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien
Traditionell wurden die „Cyanophyta“ durch den „International Code of Botanical
Nomenclature (ICBN)“ beschrieben (COMPERE 2005). Die Einteilung und
Nomenklatur von Cyanobakterien als Prokaryonten erfolgte erst Ende der 70iger
Jahre des letzten Jahrhunderts aufgrund eines Antrages von STANIER und
Mitarbeitern (1978) durch den „International Code of Nomenclature of Procaryotes
(ICNP)“. Da bisher keine endgültige Festlegung erfolgte, ist ein duales ICBN/ICNP
Nomenklatursystem entstanden (OREN und TINDALL 2005).
Der zeitliche Abschnitt zwischen 1886-1892 leitete den Begin der Beschreibung
filamentöser Cyanobakterien ein (WHITTON und POTTS 2000). GOMONT (1892)
charakterisierte 15 Genera der Familie Oscillatoriaceae anhand ihrer Form, der
Anwesenheit einer Scheide sowie der Anordnung ihrer Trichome. GEITLER (1932)
vervollständigte diesen Bestimmungsschlüssel mit zusätzlichen Kriterien wie
Zellgröße, Zellform, Pigmentierung und Zellzahl pro Kolonie sowie dem natürlichen
Habitat (siehe ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988). Der Autor unterteilte
Cyanobakterien in kokkoide, mit den Ordnungen Chroococcales und Pleurocapsales
und filamentöse Formen mit den Ordnungen Nostocales und Stigonematales
(LITVAITIS 2002). Das Buch „Cyanophyceae“ gilt bis heute als Grundlage für alle
verwendeten Bestimmungsschlüssel (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988). Allerdings
wurden nach GEITLER (1932) Organismen anhand eines einzigen abweichenden
Kriteriums schon als neue Spezies definiert, was zu über 1500 Spezies in ungefähr
150 Genera führte (LITVAITIS 2002). Da viele dieser Charakteristika unter
wechselnden Umweltbedingungen variabel sind und phenotypische Veränderungen
beobachtet wurden (PEARSON und KINGSBURY 1966), erfolgte eine vereinfachte
Einteilung der Cyanobakterien in nur noch neun Genera durch DROUET (1981). Trotz
dieser Einfachheit fand dieses System keine Anerkennung (LITVAITIS 2002).
RIPPKA und Mitarbeiter (1979) entwickelten eine aktuell noch verwendete Einteilung
in fünf Gruppen (Sektionen I-V) basierend auf morphologischen Kriterien (Tab. 1).
Eine ausführlichere Betrachtung der Ordnung Oscillatoriales erfolgt im nächsten
Abschnitt (siehe Kap. 1.2.2).
1. Einleitung 7
Tab. 1: Einteilung von Cyanobakterien in fünf Ordnungen nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979), aufgrund morphologischer Kriterien und der Art der Zellteilung (modifiziert nach WHITTON und POTTS 2000)
Unterabteilung Ordnung Kriterien zur Klassifizierung
I ChroococcalesUnizellulär oder in Aggregaten; binäre
Teilung in einer, zwei oder drei Ebenen-symmetrisch oder
asymmetrisch
II Pleurocapsales
nicht filamentös Unizellulär oder in Aggregaten;
Reproduktion durch interne multiple Zellteilung
III OscillatorialesBinäre Teilung in einer Ebene; keine
Bildung von Heterozysten oder Akineten
IV Nostocales Binäre Teilung in einer Ebene; Bildung
von Heterozysten und teilweise Akineten
V Stigonematales
filamentös
Binäre Teilung in einer oder mehreren Ebenen; verzweigte Filamente;
Bildung von Heterozysten
Als weit verbreitetes Handbuch zur Klassifizierung von Prokaryonten dient „Bergey’s
Manuel of Systematic Bacteriology“ (1989 und 2001) mit einer Einteilung der
Cyanobakterien auf Form-Genus-Ebene. Es beinhaltet Richtlinien zur Beschreibung
anhand multidisziplinärer Charakteristika wie morphologischer, biochemischer,
physiologischer und ökologischer Kriterien (SUDA et al. 2002). Obwohl „Bergey’s
Manuel of Systematic Bacteriology“ viele operative Vorteile bietet, ist diese Form der
Klassifizierung nicht offiziell von der ICSP (International Committee on Systematics of
Procaryotes) anerkannt (OREN und TINDALL 2005).
Der neueste Bestimmungsschlüssel „Cyanoprokaryota“ für Cyanobakterien wurde
von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) verfasst und stellt eine große und
bedeutende Revision dar. Das traditionelle System wurde durch neue Kriterien wie
Zellgrößenverhältnis und Zellteilung, Vorkommen und Lokalisation von Gas-Vesikeln,
Anordnung der Thylakoide und Motilität der Zellen erweitert.
1. Einleitung 8
1.2.2 Die Ordnung Oscillatoriales
Die Ordnung Oscillatoriales unterlag, genau wie andere Cyanobakterien, vielen
taxonomischen Umstrukturierungen und Namensänderungen. In dem modernisierten
Bestimmungsschlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (1988) wurden die vier
Gattungen Phormidium, Gomontinema, Hansgirgia und Geitlerinema beschrieben. In
dem aktuellen Bestimmungsschlüssel „Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und
KOMAREK 2005) wird die Familie Pseudanabaenaceae (Ordnung Oscillatoriales) in
vier Unterfamilien mit sechs Gattungen innerhalb der Unterfamilie
Pseudanabaenoideae (Abb. 2) differenziert.
Charakteristisch für die Oscillatoriales sind Filamente ohne Heterozysten oder
Akineten. Der G+C-Gehalt der Oscillatoriales wird zwischen 40 und 67 mol%
angegeben (MADIGAN et al. 2001). Weitere Einteilungen erfolgen anhand von
Kriterien wie Anwesenheit einer Scheide sowie deren Beschaffenheit und der Farbe
der Zellen. Zur weiterführenden Einteilung auf Spezies-Ebene werden taxonomische
Kriterien wie Zellgröße, Zellform und zelluläre Einschlusskörper (Granula) sowie
deren Lokalisation innerhalb der Zelle verwendet (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005).
Abb. 2: Taxonomische Einteilung der Familie Pseudanabaenaceae (Ordnung Oscillatoriales) unter besonderer Berücksichtigung der Gattungen innerhalb der Unterfamilie Pseudanabaenoideae (nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005)
Pseudanabaenaceae
Pseudanabaenoideae Spirulinoideae Leptolyngbyoideae Heteroleibeinioideae
Romeria Arthronema Pseudanabaena Limnothrix Jaaginema Geitlerinema
Familie:
Unterfamilie:
Gattung:
Pseudanabaenaceae
Pseudanabaenoideae Spirulinoideae Leptolyngbyoideae Heteroleibeinioideae
Romeria Arthronema Pseudanabaena Limnothrix Jaaginema Geitlerinema
Familie:
Unterfamilie:
Gattung:
1. Einleitung 9
1.2.3 Probleme der taxonomischen Einteilung
Problematisch bei der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien ist vor allen
Dingen die morphologische Variabilität bei unterschiedlichen Wachstums-
bedingungen. Diese morphologische Vielfalt macht die Nutzung
molekularbiologischer Daten zur weiteren Klassifizierung unumgänglich. Eine
entscheidende Rolle spielt dabei die DNA-Sequenzierung, die evolutive
Verwandtschaften darstellen kann (PREMANANDH 2006). Die steigende Zahl an
Methoden, wie Elektronenmikroskopie, G+C-Gehalts-Bestimmungen, HPLC (High
Performance Liquid Chromatography), Pigmentanalyse, DNA-Fragmentierung etc.
führt zu immer mehr Klassifizierungs-Kriterien, die in der aktuellen
Bestimmungsliteratur noch nicht beschrieben wurden und daher rückwirkend
berücksichtigt werden müssten (OREN und TINDALL 2005). Eine umfangreiche
Beschreibung mit polyphasischer Betrachtung, die morphologische, physiologische
und genetische Bestandteile aufweist, ist zur möglichst vollständigen Beschreibung
eines Cyanobakteriums daher unumgänglich.
1. Einleitung 10
1.3 Ziel der Arbeit
Ziel dieser Diplomarbeit ist eine polyphasische Beschreibung des bisher noch nicht
ausführlich charakterisierten, filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1. Zusätzlich
zu einer morphologischen Beschreibung sollen physiologische Parameter wie
Lichtintensität, pH-Wert und Salzgehalt des Mediums für das Wachstum der Kulturen
optimiert werden. Außerdem sollen die Fähigkeiten zur Verwertung verschiedener
Stickstoffquellen und Stickstofffixierung untersucht werden. Molekularbiologische
Untersuchungen zur Einordnung von Stamm Flo1 in einen phylogenetischen
Stammbaum sollen mittels Amplifizierung und Sequenzierung der 16S rDNA sowie
des Gens gyrB und einer Analyse des Fettsäuremusters erfolgen. Zusätzlich soll die
Erstellung von spezifischen Fragment-Mustern durch RAPD (Random Amplified
Polymorphism DNA) und ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) sowie die
Ermittlung des G+C-Gehaltes Auskunft über Verwandtheitsbeziehungen geben.
Die unterschiedliche Pigmentierung von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen
Lichtintensitäten soll qualitativ und quantitativ mittels HPLC und photometrischer
Messungen determiniert werden. Ferner soll die Fähigkeit zur Komplementären
Chromatischen Adaptation untersucht werden.
Außerdem sollen durch elektronenmikroskopische Aufnahmen (TEM) Details zum
Aufbau der Zelle und Lokalisation von Ultrastrukturen aufgeklärt werden.
2. Material und Methoden 11
2. Material und Methoden
2.1 Verwendete Cyanobakterien-Stämme und deren Herkunft
Stamm Flo1 wurde der Stammsammlung der Abteilung Marine Mikrobiologie der
Universität Bremen entnommen. Der aus der Pasteur-Culture-Collection (PCC, Paris,
Frankreich) erworbene Stamm PCC 7105 diente als Referenzstamm und wurde
sowohl für morphologische Beschreibungen als auch für molekularbiologische
Analysen verwendet.
2.2 Kulturbedingungen und verwendete Medien
2.2.1 Verwendete Medien
Die Anzucht der Cyanobakterien erfolgte im „Artificial Seawater Nutrient“-Medium
(ASNIII/2) mit Nitrat (nach RIPPKA et al. 1979). Die Zusammensetzung des Basis-
Mediums ist in Tabelle 2, die nach dem Autoklavieren des Mediums steril
zugegebenen Zusätze (sterilfiltriert) sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tab. 2: Zusammensetzung des Basis-Mediums ASNIII/2 mit Nitrat (nach RIPPKA et al. 1979) mit Berechnung der jeweiligen Endkonzentration Komponenten g/l Konzentration [mM] NaCl 12,5 213,9 MgCl2 x 6 H2O 1,0 4,9 KCl 0,25 3,4 MgSO4 x 7 H2O 1,75 7,1 CaCl2 x 2 H2O 0,25 1,7 NaNO3 0,75 8,8 Aqua bidest. 900 ml - Separat ansetzen: Na2CO3*1 0,12 g/100 ml 11,3
*1: Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde in Aqua bidest. gelöst und separat autoklaviert um
Ausfällungen im Medium zu vermeiden, die Zugabe erfolgte steril nach dem Autoklavieren.
2. Material und Methoden 12
Tab. 3: Zusammensetzung der dem Basis-Medium (siehe Tab. 2) zugegebenen steril-filtrierten Lösungen (nach RIPPKA et al. 1979)
Zusätze Stammlösung [g/l] Zugabe (ml/l Basis-Medium)
K2HPO4 x 3 H2O 4,0 2,5 Eisen-Ammonium-Citrat 6,0 0,25 Spurenelement-Lösung (TMM) *2 *3 0,5 Vitamin B12 0,01 0,5 *2: Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung (Trace-Metal-Mix) ist in Tabelle 4 dargestellt. *3: Angabe nicht möglich, da die TMM-Lösung unterschiedliche Mengen der einzelnen Komponenten enthält (siehe Tab. 4) Tab. 4: Zusammensetzung der Spurenelement Stammlösung (TMM) (nach RIPPKA et al. 1979)
Komponenten g/l Na3-Citrat x 2 H2O 3,0 Na2-EDTA x 2 H2O 5,0 H3BO3 2,86 MnCl2 x 4 H2O 1,81 ZnSO4 x 7 H2O 0,22 Na2MoO4 x 5 H2O 0,39 CuSO4 x 5 H2O 0,08 Co(NO3)2 x 6 H2O 0,05
Das Kulturmedium wies eine Salinität von 15-16‰ auf und wurde bei
Raumtemperatur (RT) im Dunkeln gelagert.
2.2.2 Kulturbedingungen
Die Hälterung der Kulturen während des Wachstums erfolgte im Brutraum bei einer
konstanten Temperatur von 21 °C. Im Abstand von 4 Wochen wurden Teile der
Kulturen in frisches Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) in sterile 50 ml, 100 ml oder 250 ml
Erlenmeyerkolben (EMK) mit Zellstoffstopfen inokuliert. Die Beleuchtung erfolgte
versuchsabhängig bei unterschiedlich hohen Photonenflussdichten (PFDs)
(Lichtquelle: Osram L 36W/72) von 1 bis 20 µE m-2 s-1 PAR (Photosynthetically Active
Radiation [photosynthetisch aktive Strahlung], entspricht 400 bis 700 nm) sowie nur
unter Rot- bzw. Grünlicht (Glühbirne: Osram 25W decor). Die Quantifizierung der
PFDs erfolgte mittels Lichtsensor (Quantitherm Lightmeter/Thermometer;
Hansatech).
2. Material und Methoden 13
2.2.3 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1
Zur Herstellung von axenischen Kulturen müssen die heterotrophen Bakterien aus
dem Medium entfernt werden. Heterotrophe Bakterien und Cyanobakterien leben in
enger Assoziation zu beidseitigem Nutzen. Die phototrophen Cyanobakterien geben
labile Substrate im Austausch gegen remineralisierte Nährstoffe an die heterotrophen
Bakterien (TUOMAINEN et al. 2006). Die Eliminierung der heterotrophen Bakterien aus
dem Medium erfolgte mittels Percoll-Zentrifugation (nach PALINSKA et al. 1999,
modifiziert von HUBE 2007, persönliche Mitteilung) sowie durch die Zugabe
verschiedener Antibiotika (modifiziert nach VÁZQUEZ-MARTÍNEZ et al. 2004).
2.2.3.1 Probenvorbereitung
Nach einer Behandlung im Ultraschallbad (Transsonic Digital) für 10 min bei höchster
Stufe (Stufe 9) erfolgten 4 Waschschritte zur Trennung der Filamente von
Zelltrümmern. Dabei wurde jeweils nach Zentrifugation bei 10.000 rpm für 10 min
(Heraeus Instruments; Biofuge pico) der Überstand dekantiert und das Zellpellet in
200 µl Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) resuspendiert. Zur endgültigen Trennung der
Cyanobakterien von den heterotrophen Bakterien wurde das nach dem letzten
Waschschritt resuspendierte Zellmaterial mit 1,8 ml Percollstammlösung (1 ml 10x
ASNIII/2 ohne Nitrat + 9 ml Percoll-Lösung) versetzt und bei 14.000 rpm und 20 °C
(Beschleunigung/Verlangsamung 1) über 3 h zentrifugiert. Anschließend wurde die
entstandene Cyanobakterien-Bande mittels Kanüle einer sterilen Spritze in ein
steriles 10 ml Schraubdeckelgefäß mit 5 ml sterilfiltriertem Medium (ASNIII/2 mit
Nitrat) überführt.
2.2.3.2 Eliminierung heterotropher Bakterien durch Zugabe von Antibiotika
Zur Eliminierung der heterotrophen Bakterien im Medium erfolgte die Zugabe von
50 µl Rifampicin (Endkonzentration 100 µg/ml). Nach 24 Stunden wurden die Zellen
durch 4faches Waschen (siehe Kap. 2.2.3.1) in 5 ml sterilfiltriertes Medium überführt
und über 4 Wochen bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten
PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR inkubiert. Nach 4 Wochen erfolgte eine mikroskopische
Kontrolle der Kulturen (Zeiss Axiolab) und die Zugabe von Chloramphenicol
(Endkonzentration 100 µg/ml) mit anschließenden Waschschritten und
mikroskopischer Kontrolle (s. o.). Nach einer Wachstumsphase von 5 Wochen
2. Material und Methoden 14
erfolgte die Zugabe von Kanamycin (Endkonzentration 150 µg/ml) mit
anschließenden Waschschritten und mikroskopischer Kontrolle (s. o.) sowie einer
Inkubation über 4 Wochen.
2.3 Morphologische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105
Eine morphologische Beschreibung erfolgte sowohl für den noch nicht klassifizierten
Stamm Flo1 als auch für den Referenzstamm PCC 7105. Zusätzlich sollte Stamm
Flo1 auf Basis der morphologischen Charakterisierung unter zu Hilfenahme von
Literaturbestimmungsdaten klassifiziert werden.
2.3.1 Probenvorbereitung
Die untersuchten Kulturen wurden, wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben, in ASNIII/2-
Medium mit Nitrat für 3 Wochen bei einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR
gehältert.
2.3.2 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Betrachtung
Lichtmikroskopische Untersuchungen wurden an einem Mikroskop mit
Fluoreszenzlampe (Zeiss Axiolab) bei 100facher sowie 1000facher Vergrößerung
durchgeführt. Fotographien wurden mit der integrierten Kamera (Zeiss MC 80)
gemacht. Die Bearbeitung der digitalen Bilder erfolgte mit den Programmen „Paint“
und „IrfanView“.
2.3.3 Zellgrößenbestimmung
Die Längen- und Breitenbestimmung der Zellen erfolgte mit Hilfe eines
Okularmikrometers bei 1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl. Es wurden nur
intakte Zellen ausgewertet, die sich in einem mindestens 30 Zellen umfassenden
Filament befanden. Der Bestimmungsumfang betrug 20 vegetative Zellen aus
verschiedenen Filamenten.
2. Material und Methoden 15
2.3.4 Scheiden-Nachweis
Da verschiedene Zellfärbetechniken wegen einer möglichen Polysaccharidschicht die
Zellen nicht erreichen und somit nicht als Positivnachweis dienen können, erfolgte
der Scheiden-Nachweis ausschließlich mikroskopisch bei 1000facher Vergrößerung
mit Immersionsöl. Um auch eine sehr dünne Scheide nachweisen zu können, wurde
die Kultur für 15 Tage Mangelbedingungen (Wachstum im Dunkeln) ausgesetzt, um
Filamentbrüche herbeizuführen und Reste der Scheide an den Bruchstellen sichtbar
zu machen. Fotographien wurden mit einer Digitalkamera (HP photosmart 715) durch
das Okular (mit Okularmikrometer) gemacht.
2.3.5 Motilitäts-Nachweis
Um die Motilität auf festen Oberflächen nachzuweisen, wurden Schwärm-Versuche
auf Agarplatten durchgeführt. Dazu wurden Agarplatten (ASNIII/2 mit und ohne Nitrat
mit 0,2% Glukose, 0,02% Caseinhydrolysat und 1,5% Agar) hergestellt und in der
Mitte der Platte mit 10 µl Zellkultur inokuliert. Die Inkubation erfolgte bei einer
konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR.
Zusätzlich wurden Agarplatten zur Hälfte mit Aluminiumfolie bedeckt, um
gegebenenfalls eine gerichtete Bewegung nachweisen zu können. Die Auswertung
erfolgte nach einer Inkubationszeit von 21 Tagen.
2.3.6 Klassifizierung von Stamm Flo1 aufgrund morphologischer Merkmale anhand von Literaturdaten
Auf Basis der morphologischen Charakterisierung wurde Stamm Flo1 durch diverse
Bestimmungsschlüssel klassifiziert. Dazu wurde die Literatur „Cyanophyceae“
(GEITLER 1932), „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology“ (2001) sowie
„Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005) verwendet.
2. Material und Methoden 16
2.4 Physiologische Charakterisierung von Stamm Flo1
Durch eine physiologische Charakterisierung sollten die Wachstumsbedingungen für
Stamm Flo1 optimiert werden. Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens von
Stamm Flo1 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wurden die
Wachstumsbedingungen variiert. Dazu wurden die Kulturen bei unterschiedlichen
Photonenflussdichten (PFDs) gehältert. Außerdem wurde die Zusammensetzung des
„Standard-Mediums“ (ASNIII/2 mit Nitrat) modifiziert, um den Einfluss von Salzgehalt,
pH-Wert, Vitamin-Bedarf und die Verwertung verschiedener Stickstoffverbindungen
zu untersuchen. Zusätzlich sollte mittels Acetylen-Reduktions-Test die Fähigkeit zur
Stickstofffixierung nachgewiesen werden.
2.4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (PFDs)
2.4.1.1 Probenvorbereitung
Zur Ermittlung der optimalen Beleuchtungsbedingungen für das Zellwachstum
wurden die Kulturen, wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben, inokuliert und bei
unterschiedlichen PFDs (1, 5, 10, 15 und 20 µE m-2 s-1 PAR) im Doppelansatz über
einen Zeitraum von 4 Wochen inkubiert. Es wurden Vorkulturen eingesetzt, die
ebenfalls unter den entsprechenden Lichtbedingungen für 4 Wochen an die
Lichtbedingungen adaptiert wurden. Zum Zeitpunkt der ersten Messung (t0) wurde
Biomasse aus den Vorkulturen entnommen und in sterile 50 ml Erlenmeyerkolben
(EMK) mit Zellstoffstopfen und 30 ml Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überführt. Im
Abstand von 48 Stunden wurden die Chlorophyll a- und Proteingehalte [mg/ml] im
bestimmt.
2.4.1.2 Auswertung
Die Quantifizierung des Wachstums erfolgte photometrisch durch Bestimmung des
Chlorophyll a-Gehaltes nach MACKINNEY (siehe Kap. 2.4.1.2.1) und des Protein-
gehaltes nach BRADFORD (siehe Kap. 2.4.1.2.2) im zeitlichen Abstand von 48
Stunden sowie der Bildung des Quotienten aus den Mittelwerten. Zusätzlich wurde
der pH-Wert in den Überständen (siehe Kap. 2.4.1.2.3) nach dem Wachstum
bestimmt.
2. Material und Methoden 17
2.4.1.2.1 Chlorophyll a-Bestimmung nach MACKINNEY (1941)
Die Chlorophyll a-Bestimmung erfolgte mittels Methanolextraktion nach MACKINNEY
(1941). Dazu wurde die Kultur im EMK durch mehrfaches Durchmischen mittels
Pasteur-Pipette (PP) homogenisiert. Nach Entnahme von 1 ml Kulturflüssigkeit und
Überführung in ein Eppendorfreaktionsgefäß (ERG) erfolgte eine Zentrifugation
(Heraeus Instruments; Biofuge pico) für 5 min bei 13.000 rpm. Der Überstand wurde
für eine spätere pH-Wert-Messung (siehe Kap. 2.4.1.2.3) in ein neues 2 ml ERG
überführt.
Das Pellet wurde in 1 ml Methanol für 10 sec auf einem Whirl-Mix resuspendiert und
bei 4 °C im Dunkeln für 1 h stehen gelassen. Nach erneuter Zentrifugation (s. o.)
wurde der Überstand in eine Messküvette (Plastibrand, 1,5 ml halbmicro PS)
überführt und bei 665 nm am Photometer (Biochrom Libra S12) gegen Methanol als
Blindwert gemessen. Die Chlorophyll a-Konzentration wurde mittels spezifischem
Extinktionskoeffizienten (74,5 ml mg-1 cm-1) berechnet.
Anschließend wurde das ERG unter einem Abzug 10 min offen stehen gelassen, um
restliches Methanol weitgehend zu verdampfen. Das Pellet wurde zur Bestimmung
der Proteinmenge nach BRADFORD (siehe nachfolgendes Kapitel) eingesetzt.
2.4.1.2.2 Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976)
Die Bestimmung des Protein-Gehaltes wurde modifiziert nach der Methode von
BRADFORD (1976) durchgeführt, welche als empfindlichster quantitativer Färbe-Assay
gilt (LOTTSPEICH et al. 1998).
Zur Protein-Bestimmung wurde das Pellet aus der Bestimmung des Chlorophyll a-
Gehaltes verwendet (siehe Kap. 2.4.1.2.1). Die Herstellung des BRADFORD-Reagenz
erfolgte durch Lösen von 40 mg Comassie Brilliant Blue in 50 ml Ethanol abs. und
100 ml Phosphorsäure (85%). Das Endvolumen betrug 1 l und wurde durch Zugabe
von Aqua bidest. erreicht.
Zur Denaturierung der Proteine erfolgten die Zugabe von 1 ml NaOH (1 M) und eine
Erhitzung im Wasserbad auf 90 °C für 5 min. Danach wurden die Proben sofort im
Eis für 10 min gekühlt. Aus dem Überstand wurden 100 µl entnommen, in 1 ml
BRADFORD-Reagenz überführt und sofort 10 sec lang auf einem Whirl-Mix
durchmischt. Anschließend wurden die Proben in eine Messküvette (s. o.) überführt,
und nach insgesamt 90 sec Reaktionszeit wurde die Absorption bei 595 nm
2. Material und Methoden 18
gemessen. Als Blindwert wurde 1 ml BRADFORD-Reagenz mit 100 µl NaOH (1 M)
verwendet.
Die Berechnung des Proteingehaltes erfolgte anhand von Kalibrierungskurven mit
bekannter Konzentration an Bovine Serum Albumin (BSA) von 0 bis 10 µg.
Diese waren im Bereich von 0-10 µg linear und wiesen ein Bestimmtheitsmaß ≥
99,57% auf.
2.4.1.2.3 pH-Wert-Bestimmung in den Kultur-Überständen
Der vor der Chlorophyll a-Messung entnommene Kultur-Überstand (siehe Kap.
2.4.1.2.1) wurde für die Messung des pH-Wertes verwendet. Dabei wurden die
Überstände der beiden Parallelansätze vereinigt. Die Messung erfolgte mittels pH-
Streifen (pH 6.0-10.0; Macherey-Nagel), wobei im Abstand von 4 Tagen die pH-
Werte der Überstände bestimmt wurden.
2.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung einer Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht
Zur Validierung einer Korrelation zwischen Feucht- und Trockengewicht der
cyanobakteriellen Biomasse von Stamm Flo1 wurde eine Kalibrierungskurve erstellt.
Definierte Mengen Biomasse (Feuchtgewicht) aus einer homogenen Kultur (siehe
Kap. 2.4.3.1) wurden in dekadischer Abfolge (10 mg bis 100 mg) mittels
Analysenwaage (Sartorius, MC 1 Research RC 210P) abgewogen und im
Wärmeofen bei 60 °C über Nacht getrocknet. Die Biomassetrockengewichte wurden
bestimmt und in Abhängigkeit von den Feuchtgewichten graphisch dargestellt.
2. Material und Methoden 19
2.4.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten
Die Ermittlung der zum Wachstum optimalen Salzkonzentration erfolgte modifiziert
nach MARGHERI und Mitarbeitern (2003).
2.4.3.1 Probenvorbereitung
Für die Untersuchung des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei
unterschiedlichen Salinitäten wurden Vorkulturen eingesetzt, die bei einer konstanten
Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR im ASNIII/2-
Medium mit Nitrat über 4 Wochen gehältert wurden. Die Kulturen wurden in
Zentrifugenröhrchen überführt und bei 11.000 rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman
Zentrifuge; Rotor JA-20). Anschließend wurde der Überstand verworfen, und die
Pellets wurden vereinigt und homogenisiert. Aus dem entstandenen Homogenat
wurde die Biomasse für die Inokulation entnommen. Dazu wurden 80,21 ± 0,62 mg
cyanobakterieller Biomasse mittels Analysenwaage (s. o.) in sterile ERG abgewogen.
Die abgewogene Biomasse wurde in 30 ml Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) mit
unterschiedlichen Salzkonzentrationen (0; 7; 15; 27; 38; 50 und 62‰) im
Doppelansatz überführt und dort resuspendiert.
Die Herstellung der Medien erfolgte durch variierende Zugabe von NaCl und die
Bestimmung der Salinität mittels Hand-Refractometer (Atago S/Mill-E). Als
Negativkontrolle wurde das Medium BG 110 verwendet. Die Zusammensetzung des
Mediums ist in Tabelle 5 dargestellt, die nach dem Autoklavieren steril zugegebenen
Zusätze (sterilfiltriert) sind in Tabelle 6 aufgeführt. Die Zusammensetzung der TMM-
Lösung ist in Tabelle 4 (siehe Kap. 2.2.1) dargestellt.
Tab. 5: Zusammensetzung des als Negativkontrolle (Salzgehalt: 0‰) verwendeten Mediums BG110 (nach RIPPKA et al. 1979)
Komponenten g/l Konzentration [mM]
MgSO4 x 7 H2O 0,075 0,3
CaCl2 x 2 H2O 0,036 0,2
NaNO3 0,75 8,8 Aqua bidest. 900 ml - Separat angesetzt: Na2CO3 0,04 g/100 ml 3,8
2. Material und Methoden 20
Tab. 6: Zusammensetzung der dem BG110-Medium (siehe Tab. 5) zugegebenen sterilfiltrierten Lösungen, (nach RIPPKA et al. 1979) Zusätze Stammlösung [g/l] ml/l K2HPO4 x 3 H2O 4,0 1,0 Eisen Ammonium-Citrat 6,0 1,0 Spurenelement-Lösung (TMM) *4 1,0 Zitronensäure 6,0 1,0 EDTA 1,0 1,0 *4: Angabe nicht möglich, da die TMM-Lösung unterschiedliche Mengen der einzelnen Komponenten enthält
2.4.3.2 Auswertung
Die Quantifizierung des Wachstums von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen
Salinitäten erfolgte durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte. Nach 3
Wochen Inkubation bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten
PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR wurde die gesamte Kultur in Zentrifugenröhrchen
überführt und bei 11.000 rpm über 10 min zentrifugiert (Beckman; Rotor JA-20). Der
Überstand wurde verworfen und das Pellet in gewogene ERG überführt. Nach
Trocknung der Pellets im Wärmeofen bei 60 °C über Nacht wurde das
Trockengewicht an der Analysenwaage (s. o.) ermittelt.
2.4.4 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten
2.4.4.1 Probenvorbereitung
Zur Ermittlung der zum Wachstum von Stamm Flo1 optimalen pH-Werte wurden die
pH-Werte in den Medien variiert. Die Herstellung der gepufferten Medien erfolgte
nach BOWER und BATES (1955). Durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an NaOH
(0,1 M) zu 50 ml KCl/H3BO3-Lösung (0,1 M) und anschließendem Auffüllen auf ein
Endvolumen von 100 ml mit Aqua bidest. sollten die pH-Werte auf 8,0; 8,5; 9,0; 9,5
und 10,0, wie in Tabelle 7 dargestellt, eingestellt werden. Eine pH-Wert-Messung
nach dem Autoklavieren ergab jedoch abweichende pH-Werte. Die zum Wachstum
der Kultur erforderlichen Salze des Mediums (siehe Kap. 2.2.1, Tab. 2) wurden direkt
in den Puffer eingewogen und autoklaviert.
2. Material und Methoden 21
Tab. 7: Pipettierschema zur Herstellung gepufferter Medien durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an NaOH und Aqua bidest. zu 50 ml KCl/H3BO3-Lösung (0,1 M) (nach BOWER und BATES 1955) und ermittelte pH-Werte NaOH [ml] Aqua bidest. [ml] gemessener pH-Wert pH-Wert (Literatur)3,9 46,1 7,80 8,0 10,1 39,9 8,17 8,5 20,8 29,2 8,61 9,0 34,6 15,4 9,05 9,5 43,7 6,3 9,37 10,0
Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben
behandelt und homogenisiert wurden. Aus dem entstandenen Homogenat wurden
80,21 ± 0,44 mg cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium
inokuliert. Außerdem wurden Kontrollen mit entsprechenden pH-Werten ohne
Cyanobakterien-Kultur angesetzt.
2.4.4.2 Auswertung
Die Quantifizierung des Wachstums mit unterschiedlichen pH-Werten erfolgte wie in
Kapitel 2.4.3.2 beschrieben durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte.
2.4.5 Untersuchungen zum Vitamin B-Bedarf
2.4.5.1 Probenvorbereitung
Zur Ermittlung des Vitamin B-Bedarfs zum Zellwachstum wurden Medien mit zwei
unterschiedlichen Vitamin-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen angesetzt.
Außer Vitamin B12, welches im ASNIII/2- Medium nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979)
enthalten ist, wurde eine 7-Vitamin-Lösung verwendet, deren Zusammensetzung in
Tabelle 8 dargestellt ist. Vitamin B12 wurde in den Konzentrationen 2,5 µg/l, 5 µg/l
und 10 µg/l eingesetzt. Eine Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf
Grund der unterschiedlichen Konzentrationen der einzelnen Vitamine (siehe Tab. 8)
nicht möglich. Es erfolgte die Zugabe von 0,25 ml, 0,5 ml bzw. 1 ml der 7-Vitamin-
Stammlösung pro 1 Liter Medium. Als Kontrolle wurde ASNIII/2- Medium ohne
Vitamine verwendet.
2. Material und Methoden 22
Tab. 8: Zusammensetzung der 7-Vitamin-Stammlösung. Alle Vitamine wurden in Aqua. bidest. gelöst, die Lagerung erfolgte bei 4 °C im Dunkeln Komponenten mg/l Vitamin-Klasse 4-Aminobenzoesäure 80 H D(+)-Biotin 20 B7 Nicotinsäure 200 B3 Ca-D(+)-panthoenat 100 B5 Pyridoxinhydrochlorid 300 B6 Thiamindichlorid 200 B1 Cyanocobalamin 100 B12 Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben
behandelt und homogenisiert wurden. Aus dem entstandenen Homogenat wurden
100 ± 0,42 mg cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium
inokuliert.
2.4.5.2 Auswertung
Die Quantifizierung des Vitamin-Bedarfs erfolgte wie in Kapitel 2.4.3.2 beschrieben
durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte nach 3 Wochen Kultivierung.
2.4.6 Untersuchungen zur Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoffverbindungen
2.4.6.1 Probenvorbereitung
Um die Verwertung unterschiedlicher Stickstoffquellen durch Stamm Flo1 zu
untersuchen, wurden Medien mit verschiedenen anorganischen Stickstoff-
verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen angesetzt. Dazu wurden ASNIII/2-
Medien ohne Stickstoffquelle (Kontrolle), mit Ammoniumchlorid (NH4Cl), Natriumnitrit
(NaNO2) oder Natriumnitrat (NaNO3) in den Konzentrationen 1 mM; 2,5 mM; 5 mM
und 10 mM im Doppelansatz hergestellt.
Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben
behandelt und homogenisiert wurden. Aus dem entstandenen Homogenat wurden
100 ± 0,91 cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium inokuliert
2. Material und Methoden 23
2.4.6.2 Auswertung
Die Quantifizierung der Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoff-
verbindungen erfolgte wie in Kapitel 2.4.3.2 beschrieben durch Bestimmung der
Biomassetrockengewichte.
2.4.7 Untersuchungen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung
Die Fähigkeit zur Stickstofffixierung erfolgte qualitativ mittels Acetylen-Reduktions-
Test. Dieser Test beruht auf der bakteriellen Reduktion von Acetylen (Ethin) zu Ethen
durch das Enzym Nitrogenase. Das gebildete Ethen kann daraufhin gas-
chromatographisch nachgewiesen werden (FUCHS 2007).
2.4.7.1 Probenvorbereitung
In den Versuchen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung wurden Vorkulturen eingesetzt,
die bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE
m-2 s-1 PAR für 4 Wochen gehältert wurden. Als Nährmedium wurde ASNIII/2 ohne
Nitrat verwendet. Nach der Kultivierung erfolgte ein Austausch der Gasphase über
der Kultur mittels Heliumbegasung und die Zugabe von 10 ml eines Ethin-Helium
Gasgemisches (1:50). Anschließend wurden die Kulturen unter permanenter
Beleuchtung sowie im Dunkeln und mit Licht/Dunkelwechsel (jeweils 12 h) inkubiert.
Die Detektion des evtl. gebildeten Ethen erfolgte nach 1 Woche.
2.4.7.2 Auswertung
Aus dem Gasvolumen wurden 100 µl mittels gasdichter Spritze entnommen und in
den Gaschromatographen (Shimadzu GC 14B) bei 70 °C injiziert. Nach Auftrennung
der Gasproben bei 50 °C mittels Trennsäule: (Porapak N 80/100 mesh) erfolgte die
Detektion durch einen Detektor (Flammenionisationsdetektor) bei 90 °C. Als
Trägergas wurde Helium (115kPa=35 ml/min), als Brenngas Wasserstoff (H2: 40
kPa; O2: 45 kPa) verwendet.
2. Material und Methoden 24
2.5 Molekularbiologische Untersuchungen an den Stämmen Flo1 und PCC 7105
Da eine morphologische Beschreibung eines Cyanobakteriums zur vollständigen,
polyphasischen Charakterisierung nicht ausreicht, wurden auch molekularbiologische
Methoden verwendet, um den Stamm Flo1 umfassend zu beschreiben. Zusätzlich
wurde der Referenzstamm Stamm PCC 7105 molekularbiologisch untersucht. Nach
einer DNA-Extraktion wurden die 16S rDNA sowie das Gen gyrB mittels PCR
amplifiziert und anschließend sequenziert. Durch eine Real-Time-PCR (RT-PCR)
sollte ein Nachweis des Gens mcyA an Stamm Flo1 erfolgen. Außerdem wurden
mittels Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) und Amplified rDNA
Restriction Analysis (ARDRA) spezifische Bandenmuster von den Stämmen Flo1 und
PCC 7105 erstellt.
2.5.1 DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996)
Die DNA-Extraktion erfolgte nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) (modifiziert von
HEYDUCK-SÖLLER 2003). Vor der DNA-Extraktion wurden die Stämme Flo1 und PCC
7105 bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE
m-2 s-1 PAR für 8 Tage inkubiert. Nach Zentrifugation von 1 ml Cyanobakterien-Kultur
für 5 min bei 8.000 rpm (Heraeus Instruments; Biofuge pico) wurde der Überstand
dekantiert und die Kultur nach Zugabe von 1 ml STE-Puffer (100 mM NaCl; 10 mM
Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8,0) erneut zentrifugiert (s. o.). Nach Dekantierung des
Überstandes und erneuter Zugabe von 1 ml STE-Puffer wurde die Probe im
Ultraschallbad (ElmaTM; Transsonic Digital) bei maximaler Stärke (Stufe 9) für 10 min
bei 20 °C beschallt. Nach anschließender Zentrifugation (s. o.) und Dekantierung des
Überstandes erfolgte erneut die Zugabe von 1 ml STE-Puffer mit anschließender
Zentrifugation und Entfernung des Überstandes. Das entstandene Pellet wurde mit
400 µl STE-Puffer überschichtet. Im gleichen Volumenanteil wurden Glasperlen
(Durchmesser 0,1-0,2 µm; BIOmatik GmbH) und 1 ml heißes Phenol (75 °C)
zugegeben. Nach Durchmischung (Whirl-Mix) für 40-60 sec wurde die Probe direkt
im Eis gekühlt und anschließend für 20 min bei 4 °C und 12.000 rpm zur Trennung
der Phenol- und der wässrigen Phase zentrifugiert (Beckman GS-15R). Die obere
wässrige Phase wurde in ein steriles ERG überführt und das Probenvolumen
bestimmt. Nach Zugabe von 2 µl Poly A RNA (10 mg/ml; QIAGEN) wurde zur
2. Material und Methoden 25
Trennung von evtl. noch vorhandenen Proteinen aus der Interphase 1 Volumenanteil
Chloroform/Isoamylalkohol (im Verhältnis 25:1 [v/v]) hinzugefügt und nach
Durchmischung für 5 min und 4 °C bei 12.000 rpm zentrifugiert. 350 µl der oberen
wässrigen Phase wurden in ein steriles ERG überführt und 0,1 Volumenanteil
Natriumacetat (3 M; pH 5,2) zugegeben. Zur Fällung der DNA erfolgte die Zugabe
von 0,8 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol mit Lagerung für 20 min bei -80
°C und anschließender Zentrifugation für 30 min bei 12.000 rpm. Zur vollständigen
Entfernung vorhandener Salze erfolgte die Zugabe von 70%igem Ethanol (frisch
angesetzt) mit anschließender Zentrifugation für 10 min (s. o.). Nach erneuter
Dekantierung des Überstandes erfolgt die Zugabe von Ethanol abs. mit
anschließender Zentrifugation (s. o.). Das entstandene Pellet wurde bei
Raumtemperatur (RT) zum Trocknen für 45 min mit geöffnetem Deckel unter der
Sterilbank stehen gelassen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 20 µl TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8,0) und Lagerung über Nacht, um das Pellet
für spätere Versuche zu resuspendieren. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4 °C im
Dunkeln
2.5.2 Polymerase Chain Reaktion (PCR)
Mit Hilfe der PCR sollten die 16S rDNA sowie das Gen gyrB der Stämme Flo1 und
PCC 7105 amplifiziert und sequenziert werden. Um Aussagen über
Verwandtschaftsbeziehungen treffen zu können, sollten auf Basis der ermittelten
Sequenzen phylogenetische Stammbäume erstellt werden.
2.5.2.1 Probenvorbereitung
Alle verwendeten ERG und PCR-Reaktionsgefäße sowie das nukleasefreie Wasser,
die MgCl2-Lösung und der PCR-Puffer (10x PCR Rxn Puffer; Invitrogen) wurden vor
dem Ansetzten des Mastermixes zur Vermeidung von Kontaminationen mit Fremd-
DNA 10 min unter einer UV-Lampe (Benda N-4 K; 254 nm) bestrahlt. Die
Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes zur Amplifikation der 16S rDNA und des
Gens gyrB ist in Tabelle 9 dargestellt.
2. Material und Methoden 26
Tab. 9: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes zur Amplifikation der 16S rDNA und des Gens gyrB aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt. Die in der jeweiligen PCR verwendeten Primer sind in Tabelle 10
Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 28,1 Puffer 10 x 5,0 MgCl2 25 mM 4,0 dNTPs 10 mM 1,0 „forward-Primer“ 10 µM 4,0 „reverse-Primer“ 10 µM 4,0 BSA 20 mg/ml 2,5 Polymerase 5 U/µl 0,4 Summe 49
Tab. 10: Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifikation und Sequenzierung der 16S rDNA und des Gens gyrB der Stämme Flo1 und PCC 7105. Der Primer 380F wurde ausschließlich in der Sequenzierung der 16S rDNA als interner Primer eingesetzt Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle 8F AGA GTT TGA TCC TGG C 16S rDNA LANE (1991)
1494R GTA CGG CTA CCT TGT TAC GAC 16S rDNA TATON et al. (2003)
380F TTT TCC GCA ATG GGC G 16S rDNA YAN (2005)
GB/3MF AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG *5 gyrB SEO und YOKOTA (2003)
GB/CR-2 CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC * gyrB SEO und YOKOTA (2003)
*5: H: A,C oder T; N: G,A,C oder T; S: G oder C; Y: C oder T; R: A oder G
Als Polymerasen wurden die Ampli-Taq-Gold (Roche) zur Amplifizierung der 16S
rDNA sowie die Platinum-Taq-Gold (Invitrogen) zur Amplifikation des Gens gyrB
verwendet. Vor Zugabe der Polymerase zum Mastermix wurde dieser erneut unter
der UV-Lampe für 10 min bestrahlt (s. o.). Nach Zugabe der Template-DNA (siehe
Kap. 2.5.1) erfolgte eine Überschichtung der Proben mit sterilfiltriertem Paraffinöl, um
ein Verdampfen der Proben im Cycler (Personal Cycler; biometra) zu verhindern. Die
beiden PCR-Reaktionen wurden mit unterschiedlichen Cycler-Programmen
durchgeführt, die in den Tabellen 11 und 12 dargestellt sind. Um für die spätere
Sequenzierung ausreichend Amplifikat zu erhalten, wurden jeweils sechs
Parallelansätze eingesetzt.
2. Material und Methoden 27
Tab. 11: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zu Amplifikation der 16S rDNA aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach NEILAN 1995). Als Polymerase wurde die Ampli-Taq-Gold verwendet
Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 95 900 1x 2a Denaturierung 95 30 2b Annealing 50 35 2c Polymerisation 72 120
35x
3 Endamplifikation 72 300 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x Tab. 12: : Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zu Amplifikation des Gens gyrB aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach SEO und YOKOTA 2003). Als Polymerase wurde die Platinum-Taq-Gold verwendet
Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 93 120 1x 2a Denaturierung 95 30 2b Annealing 50 35 2c Polymerisation 72 120
35x
3 Endamplifikation 72 600 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x
Die entstandenen PCR-Produkte wurden wie in den nachfolgenden Kapiteln
beschrieben aufgetrennt, aufgereinigt und sequenziert.
2.5.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gel
Die entstandenen PCR-Produkte wurden auf ein 1%iges Agarose-Gel mit schmalen
Taschen aufgetragen. Dabei wurden 5 µl PCR-Produkt bzw. Marker (100 bp DNA-
Ladder-Plus) mit 1 µl 6x Loading Dye versetzt und in die Gel-Taschen pipettiert. Die
Laufzeit betrug 60 min bei einer Spannung von 70 V (Power Pac 300; BioRAD).
Anschließend erfolgte die Färbung des Gels in einer 0,1%igen Ethidiumbromid-
Lösung über einen Zeitraum von 15-20 min. Die Auswertung erfolgte am
Transilluminator (Fluco-Link; Biometra), Gel-Bilder wurden mit der integrierten
Kamera (E.A.S.Y 429K; Herolab) gemacht.
2. Material und Methoden 28
2.5.2.3 Aufreinigung und Sequenzierung der PCR-Produkte
Die Aufreinigung und Aufkonzentrierung der 16S rDNA PCR-Produkte erfolgte mittels
„DNA Clean & Concentrator TM Sample Kit“ (Zymo Reasearch) nach
Herstellerangaben. Die Eluierung der 16S rDNA erfolgte durch Zugabe von 10 µl TE-
Puffer und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min.
Die Aufreinigung und Aufkonzentrierung der gyrB PCR-Produkte erfolgte mittels
„QIAGEN-Aufreinigungskit“ nach Herstellerangaben. Die Eluierung der DNA erfolgte
durch Zugabe von 30 µl EB-Puffer und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min.
Anschließend wurden die Proben zur Sequenzierung an die Firma GATC Biotech AG
Konstanz geschickt. Die Auswertung der Sequenzen und die Erstellung von
Aligmentsequenzen erfolgte mit dem Programm „ChromasPro“.
2.5.2.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen
Die ermittelten Sequenzen wurden mit den Daten der NCBI-Datenbank
(www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand September 2007) mittels BLAST (basic logical
aligment search tool) verglichen. Außerdem wurden die Sequenzen der
Referenzstämme zur Erstellung der Stammbäume dieser Datenbank entnommen.
Zusätzlich wurden einige Sequenzen des Gens gyrB aus der ICB-Database
(http://seasquirt.mbio.co.jp/icb; Stand September 2007) entnommen.
Die Erstellung der Stammbäume erfolgte mit den Programmen „Bioedit“ (Erstellung
von Aligmentsequenzen), „GeneDoc“ (Zuschneiden der Aligmentsequenzen) und
„Mega3“ (Erstellung der phylogenetischen Stammbäume).
Es wurde das Matrix-orientierte Cluster-Verfahren UPGMA (Unweighted Pairwise
Grouping Method using Arithmetic means) verwendet, welches die einfachste
Methode zur Abschätzung von phylogenetischen Beziehungen aus genetischen
Distanzen darstellt (SOKAL und MICHENER 1958).
Zur Berechnung der evolutiven Distanzen wurden die Stammbäume nach der
Neighbour-Joining (NJ)- Methode nach JUKES und CANTOR (1969) erstellt. Statistisch
wurden die Stammbäume durch 1000fache Wiederholung der Bootstrap-Analysen
abgesichert.
2. Material und Methoden 29
2.5.3 Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)
Mit der Methode der RAPD können Organismen auf Sequenzähnlichkeiten
untersucht werden. Es werden kleine unspezifische Primer verwendet, die zufällig an
die Template-DNA binden. Binden gleichzeitig der „forward“ und der „reverse“ Primer
im Abstand von ca. 50 bp bis 1500 bp entsteht ein Amplifikat. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung entsteht ein spezifisches Bandenmuster der
Amplifikate.
Zur Erstellung des RAPD-Bandenmusters wurde eine 50 µl PCR mit 3 mM MgCl2
durchgeführt. Als Primer wurden CRA-22 und CRA-23 (universelle RAPD-Primer,
NEILAN 1995) eingesetzt. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle 13
dargestellt.
Tab. 13: Sequenzen der zur RADP verwendeten Primer Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle CRA-22 CCG CAG CCA A RAPD NEILAN (1995) CRA-23 GCG ATC CCC A RAPD NEILAN (1995)
In Tabelle 14 ist das Pipettierschema eines Ansatzes zur RAPD angegeben. Als
Polymerase wurde die Platinum-Taq (s. o.) verwendet. Tab. 14: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes für eine RAPD mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt
Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 26,35 Puffer 10 x 5,0
MgCl2 25 mM 6,0
dNTPs 10 mM 1,0 „forward-Primer“ 10 µM 4,0 „reverse-Primer“ 10 µM 4,0 BSA 20 mg/ml 1,25 Platinum-Taq 5 U/µl 0,4 Summe 48,0
Nach Zugabe von 2 µl Template-DNA (siehe Kap. 2.5.1) erfolgte die Amplifikation im
Cycler nach dem in Tabelle 15 dargestellten Schema.
2. Material und Methoden 30
Tab. 15: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms für eine RAPD mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach NEILAN 1995) Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 93 120 1x 2a Denaturierung 93 30 2b Annealing 45 35 2c Polymerisation 72 120
35x
3 Endamplifikation 72 300 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x
Die PCR-Produkte der RAPD wurden auf ein 2%iges Agarose-Gel mit breiten
Taschen aufgetragen. Dabei wurden 20 µl PCR-Produkt bzw. Marker (100 bp DNA-
Ladder-Plus) mit 4 µl 6xLoading Dye versetzt und in die Gel-Taschen pipettiert. Die
Laufzeit betrug 100 min bei einer Spannung von 70 V. Die Auswertung erfolgte wie in
Kapitel 2.5.2.2.
2.5.4 Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Zur Erstellung eines spezifischen Bandenmusters analog der RAPD (siehe Kap.
2.5.3) wurde eine ARDRA mit verschiedenen Restriktionsenzymen durchgeführt.
Dazu wurde mittels PCR die 16S rDNA amplifiziert (siehe Kap. 2.5.2). Durch die
Zugabe von speziellen Restriktionsenzymen entstehen unterschiedlich lange DNA-
Fragmente, deren Größe von den Schnittstellen auf dem Amplifikat (siehe Tab. 16)
abhängig ist. Diese Fragmente können zur Erstellung eines spezifischen
Bandenmusters in einem Agarose-Gel aufgetrennt werden. Eine Kombination dieser
Restriktionsmuster ermöglicht die Erstellung eines Restriktions-Profils und erlaubt
ggf. die Identifizierung eines Organismus.
Als Restriktionsenzyme wurden die Enzyme AluI, MspI, RsaI und BsuRI (HaeIII),
sowie die „FastDigest“ Enzyme HinfI, HhaI und Sau96I (Cfr13I) (Fermentas)
verwendet. Das Pipettierschema der ARDRA sowie die Schnittstellen der
verwendeten Enzyme sind in Tabelle 16 dargestellt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C
im Wasserbad. Bei den „FastDigest“ Enzymen erfolgte die Inkubation über einen
Zeitraum von 5 min, die übrigen Enzyme wurden 4 h inkubiert.
2. Material und Methoden 31
Tab. 16: Pipettierschema der ARDRA mit der 16S rDNA aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 mit den Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme. Für jedes Enzym musste der entsprechende Puffer zugegeben werden. Die Pfeile symbolisieren die Schnittstellen der Enzyme Eingesetztes Enzym
Enzym [µl]
PCR-Produkt [µl]
Puffer [µl]
Wasser [µl] Schnittstellen
5’ …AG↓CT…3’ Alu I 2 10 2 (TANGO*1) 18 3’ …TC↑GA…5’ 5’ …CC↓GG…3’ Msp I 2 10 2 (TANGO) 16 3’ …GG↑CC…5’ 5’ …GT↓AC…3’ Rsa I 2 10 2 (TANGO) 16 3’ …CA↑TG…5’ 5’ …GG↓CC…3’ BsuRI 2 10 2 (R*2) 16 3’ …CC↑GG…5’ 5’ …G↓ANTC…3’HinfI 2 10 2(FastDigest*3) 17 3’ …CTNA↑G…5’5’ …GCG↓C…3’ HhaI 2 10 2(FastDigest) 17 3’ …C↑GCG…5’
5’ …G↓GNCC…3’Sau96I 2 10 2(FastDigest) 17 3’ …CCNG↑G…5’*1 : Zusammensetzung des Puffers TANGO: 33 mM Tris-Acetat (pH 7.9), 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0.1 mg/ml BSA *2 : Zusammensetzung des Puffers R: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0.1 mg/ml BSA *3 : Zusammensetzung des „FastDigest“-Puffers: keine Herstellerangaben verfügbar Die Auftrennung der entstandenen Fragmente erfolgte auf einem 2%igen Agarose-
Gel bei 80 V für 100 min. Die Auswertung erfolgte wie in Kapitel 2.5.2.2 beschrieben.
2.5.5 Real-Time-PCR (RT-PCR)
Mittels RT-PCR sollte Stamm Flo1 auf die Fähigkeit untersucht werden, ob er
Microcystine synthetisieren kann. Microcystine sind toxische zyklische Heptapeptide.
Synthetisiert werden Microcystine nicht-ribosomal durch einen Enzymkomplex, der
durch das mcy-Gen-Cluster codiert wird (TILLETT et al. 2000). Das Gen mcyA ist Teil
dieses Clusters (NISHIZAWA 2000) und sollte mittels RT-PCR nachgewiesen werden.
Es wurde eine 25 µl RT-PCR modifiziert nach FURUKAWA und Mitarbeitern (2006) im
Smart Cycler (Cepheid) mit SyberGreen durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde
DNA der Microcystis-Stämme PCC 7806 und PCC 7941 eingesetzt. Zur Amplifikation
wurden die mcyA-spezifischen Primern MSF (FURUKAWA et al. 2006) und MSR-2R
(NEILAN et al. 1997) verwendet. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in
Tabelle 17 dargestellt.
2. Material und Methoden 32
Tab. 17: Sequenzen der in der Real-Time-PCR verwendeten Primer zur Amplifikation des Gens mcyA
Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle MSF ATC CAG CAG TTG AGC AAG C mcyA FURUKAWA et al. (2006)MSR-2R GCC GAT GTT TGG CTG TAA AT mcyA NEILAN et al. (1997) In Tabelle 18 ist die Zusammensetzung eines 25 µl PCR-Reaktionsansatzes
dokumentiert. Tab. 18: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes für eine RT-PCR zur Amplifikation und zum Nachweis des Gens mcyA aus Stamm Flo1. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt
Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 15,64 Puffer 10 x 2,5 MgCl2 25 mM 3,0 dNTPs 10 mM 0,31 „forward-Primer“ 10 µM 1,25 „reverse-Primer“ 10 µM 1,25 Platinum-Taq 5 U/µl 0,05 Summe 24,0
Nach Zugabe von 1 µl Template-DNA (siehe Kap. 2.5.1) (1:100 in TE-Puffer
verdünnt) erfolgte die Amplifikation im Smart Cycler (s. o.) nach dem in Tabelle 19
dargestellten Schema.
Tab. 19: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zur Amplifikation des mcyA Gens aus Stamm Flo1 mittels RT-PCR. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgte nach der Polymerisation
Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. Detektion 1 Start-Denaturierung 80 600 1x AUS
2 Aktivierung der Polymerase 95 300 1x AUS
3a Denaturierung 95 5 AUS 3b Annealing 55 15 AUS 3c Polymerisation 72 20
50x EIN
Zur Differenzierung der Amplifikate wurde eine Schmelzkurve der PCR-Produkte im
Bereich von 60-90 °C im Smart Cycler (s. o.) erstellt.
2. Material und Methoden 33
2.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes (mol%) nach MARMUR (1961)
Für die Beschreibung eines Organismus muss auch der Guanin/Cytosin-Gehalt der
DNA (mol%) angegeben werden. Dies kann durch Bestimmung der
Schmelztemperatur der DNA ermittelt werden, da die Höhe der Schmelztemperatur
wesentlich von den Mengenverhältnissen zwischen Guanin/Cytosin (GC) und
Adenin/Thymin (AT) bestimmt wird (FUCHS 2007).
Die Bestimmung des G+C-Gehaltes der DNA von Stamm Flo1 wurde nach MARMUR
(1961) durchgeführt (modifiziert von SERRANO 2007, persönliche Mitteilung).
2.6.1 Probenvorbereitung
In den Versuchen zur Ermittlung des G+C-Gehaltes wurden Kulturen eingesetzt, die
bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2
s-1 PAR gehältert wurden. Die Kulturen wurden in Zentrifugenröhrchen überführt und
bei 11.000 rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman; Rotor JA-20). Anschließend wurde
der Überstand verworfen und in vier Parallelen jeweils 30 mg Feuchtgewicht auf der
Analysenwaage (s. o.) abgewogen. Die Zellen wurden mit 500 µl PBS (8 g NaCl; 0,2
g KCl; 1,44 g Na2HPO4; 0,24 g KH2PO4 auf 1 l; pH 7,4) gewaschen und bei 13.000
rpm für 2 min zentrifugiert (Heraeus Instruments; Biofuge pico). Der Überstand wurde
verworfen und 1 ml EDTA (2%; pH 8,0) zugegeben. Die Proben wurden bei -80 °C
für 20 min gelagert und anschließend im Wärmebad bei 80 °C für 20 min inkubiert.
Anschließend wurde der Überstand abzentrifugiert (s. o.), erneut 1 ml EDTA-Lösung
zugegeben und über Nacht bei 4 °C gelagert. Danach wurde die EDTA-Lösung
abzentrifugiert (s. o.) und die Pellets wurden, wie im folgenden Kapitel beschrieben,
aufgeschlossen.
2. Material und Methoden 34
2.6.2 Zellaufschluss und DNA Extraktion
Die Zellpellets (siehe Kap. 2.6.1) wurden mit 300 µl Suspensionspuffer
(Zusammensetzung siehe Tab. 20) homogenisiert. Es erfolgte die Zugabe von 20 µl
Lysozym (100 mg/ml) und eine Durchmischung auf einem Whirl-Mix mit
anschließender Inkubation bei 37 °C für 1 h im Wasserbad. Danach erfolgte die
Zugabe von 400 µl Lysis-Puffer (Zusammensetzung siehe Tab. 20) und 200 µl NaCl
(5 M). Die Proben wurden bei 65 °C im Wasserbad über Nacht inkubiert. Nachdem
die Lösung komplett transparent geworden war, erfolgte die Zugabe von
Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 25:1 [v/v]). Nach Zentrifugation bei 10.000 rpm
für 10 min wurde jeweils die obere Phase der vier Parallelansätze entnommen und in
einem sterilen 15 ml Greiner Röhrchen vereinigt. Anschließend erfolgte die Zugabe
von 0,6 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol, so dass die DNA präzipitierte
und sichtbar wurde. Das Präzipitat wurde mittels steriler Pipettenspitze in ein ERG
überführt und durch Zugabe von 200 µl Ethanol abs. dehydriert. Nach 2 min erfolgte
der Austausch von Ethanol abs. durch 70%iges Ethanol. Anschießend wurde das
Ethanol verworfen, das Pellet an der Luft getrocknet und auf eine Dialysemembran
(Milipore) mit 0,025 µm Porengröße auf 0,1x SSC-Puffer (Zusammensetzung siehe
Tab. 20) überführt. Nach 24 h erfolgte die Zugabe von 15 µl RNase (30 µg/ml;
Molzym GmbH) mit anschließender Inkubation für 60 min bei 37 °C. Nach der
Inkubation wurde das Enzym bei 65 °C für 10 min im Wasserbad inaktiviert und die
DNA in ein steriles ERG überführt und mit 400 µl 0,1x SSC-Puffer resuspendiert.
Tab. 20: Zusammensetzung der für die G+C-Gehaltsbestimmung (mol%) verwendeten Lösungen
Suspensions-Puffer (50 ml) Lysis-Puffer 50 (ml) SSC-Puffer (1 l 20x Stammlösung pH 7)
20 mM Tris-HCl; pH 8,0 100 mM Tris-HCl; pH 8,0 175,3 g NaCl 5 mM EDTA; pH 8,0 40 mM EDTA; pH 8,0 88,2 g Natriumcitrat
6 g Saccharose 0,5 M NaCl mit Aqua bidest auf 1 l aufgefüllt
mit Aqua bidest auf 50 ml aufgefüllt 4% SDS
mit Aqua bidest auf 50 ml aufgefüllt und 1 ml ß-Mercaptoethanol
und 250 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugeführt
2. Material und Methoden 35
Zusätzlich wurde die DNA aus Escherichia coli Stamm K12 analog dem oben
beschriebenen Ablauf extrahiert, um die Schmelztemperatur als Referenz zu
ermitteln. Diese Werte werden zur Berechnung des G+C-Gehaltes von Stamm Flo1
benötigt.
2.6.3 Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) und Berechnung des G+C-Gehaltes (mol%) von Stamm Flo1
Die Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) wurde in
5fach Bestimmung durchgeführt. Vor der Erstellung der Schmelzkurven wurde die
Reinheit der DNA in den Proben untersucht. Dazu wurden die Absorptionen bei 234,
260 und 280 nm gemessen (Beckman Spektrophotometer DU 640) und die
Quotienten aus 234/260 nm sowie 260/280 nm errechnet.
Die Bestimmung der Schmelztemperatur (TM) der DNA erfolgte in Quarzküvetten
(UV/Visible Spektrophotometer; Beckman) im o. g. Spektrophotometer mittels
Temperaturregler (High Performance Temperature Controller; Beckman). Zur
Entfernung von Luftbläschen aus den Proben wurden die Küvetten in einem
Exsikkator (Wertheim; Pumpe: Jürgens) für 15 min unter Vakuum entgast. Die
Aufnahme der Schmelzkurve erfolgte in einem Temperaturbereich von 60-90 °C bei
einer Erhöhung der Temperatur von 1 °C/min und einer Verzögerung von 2 min. Der
Messwert wurde im Abstand von 0,5 min abgelesen und graphisch dargestellt.
Anhand der ermittelten Schmelztemperatur (TM) und der Schmelztemperatur des
verwendeten Referenzstammes E.coli konnte der G+C-Gehalt (mol%) von Stamm
Flo1 gemäß folgender Formel nach MARMUR und DOTY (1961) errechnet werden.
mol% G+C Probe = ([TM Probe + (90,5 –TM E.coli)] – 69,3)/0,41
2. Material und Methoden 36
2.7 Analyse des Fettsäuremusters von Stamm Flo1
Zusätzlich zu morphologischen, physiologischen und molekularbiologischen
Methoden sollte eine Untersuchung des Fettsäuremusters von Stamm Flo1 zur
polyphasischen Beschreibung erfolgen. Die Zusammensetzung der Fettsäuren stellt
eine wichtige chemotaxonomische Methode dar (BUSSE 1996) und wird unter
anderem zur Beschreibung auf Gattungs-Ebene und teilweise höherer Taxa
vorgeschlagen (MURRAY et al. 1990).
2.7.1 Probenvorbereitung
Die Erstellung eines Fettsäureprofils erfolgte an Kulturen, die bei einer konstanten
Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 bzw. 20 µE m-2 s-1 PAR
angezogen worden waren. Nach 3 Wochen Wachstum wurde der Kultur-Überstand
bei 13.000 rpm für 5 min (Heraeus Instruments; Biofuge pico) abzentrifugiert und das
Gewicht der Pellets bestimmt (sollte >50 mg betragen). Das Pellet wurde bis zur
Bestimmung des Fettsäureprofils bei -80 °C gelagert.
2.7.2 Bestimmung des Fettsäureprofils
Die Analyse des Fettsäureprofils erfolgte durch Dr. Rabenstein an der Amtlichen
Materialprüfungsanstalt Bremen. Die Proben wurden aufgeschlossen und in einem
speziellen Reaktionsgefäß verseift. Anschließend wurden die freigesetzten
Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern verestert und nach ihrer Extraktion mit einem
Lösungsmittel gaschromatographisch analysiert. Die Zuordnung der detektierten
Fettsäuren erfolgte mit Hilfe des Fatty Acid Methyl Ester-Mix (FAME-Mix; Sigma
Aldrich).
2. Material und Methoden 37
2.8 Qualitative und quantitative Bestimmung der photosynthetisch aktiven Pigmente von Stamm Flo1 nach Wachstum der Kulturen bei unterschiedlichen Photonenflussdichten
In der Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente erfolgte ein quantitativer
Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden sowie den Phycobiliproteinen durch
photometrische Messungen. Außerdem wurde ein qualitativer Nachweis der
Carotinoide mittels Reverse Phase HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) durchgeführt. Zusätzlich wurde Stamm Flo1 auf die Fähigkeit zur
„Komplementären Chromatischen Adaptation“ untersucht.
2.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden
2.8.1.1 Probenvorbereitung
Es wurden Kulturen eingesetzt, die über einen Zeitraum von 3 Monaten bei
konstanten 21°C an unterschiedliche PFDs (1; 5; 10; 15; 20 µE m-2 s-1 PAR) adaptiert
worden waren. Dabei wurden die Kulturen im Abstand von 4 Wochen in frisches
Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überimpft.
Zur Freisetzung der Pigmente wurde eine Methanolextraktion analog der Chlorophyll
a-Bestimmung (siehe Kap. 2.4.1.2.1) durchgeführt. Das Feuchtgewicht der
eingesetzten Zellpellets betrug 60 ± 20 mg.
2.8.1.2 Auswertung
Die quantitative Bestimmung der Carotinoid- und Chlorophyll a-Gehalte erfolgte
photometrisch nach Methanolextraktion durch Messung der Absorption (A) bei 461
nm (Carotinoide) und 665 nm (Chlorophyll a) (Photometer Biochrom Libra S12).
Unter Verwendung der nachfolgend angegebenen Gleichung (modifiziert nach
JÖSTINGMEYER 2000) konnte der Carotinoid-Gehalt der Proben errechnet werden:
Carotinoidgehalt [µg/ml] = [A461nm – (0,046 x A665)] x 4
2. Material und Methoden 38
Die Berechnung der Chlorophyll a-Gehalte der Proben erfolgte nach MACKINNEY
(1941) (siehe Kap. 2.4.1.2.1) mittels des spezifischen Extinktionskoeffizienten (ε) von
74,5 ml mg-1 cm-1. Eine Identifizierung und quantitative Bestimmung der Carotinoide
erfolgte mittels Reverse Phase HPLC.
2.8.2 Qualitative Pigment-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC
Die Identifizierung der Carotinoide erfolgte nach Methanol-Extraktion (siehe Kap.
2.4.1.2.1) mit Hilfe eines Merck/Hitachi-HPLC-Systems (modifiziert nach RABENSTEIN
1997).
2.8.2.1 Auftrennung der Extrakte
Je 50 µl des methanolischen Extraktes wurden über ein Rheodyne-Ventil injiziert,
wobei über eine Injektionsschleife je 20 µl Extrakt auf eine Trennsäule gegeben
wurde. Die Auftrennung wurde über eine LiChrospher 100 RP 18-Säule (125-4; 5
µm) mit entsprechender Vorsäule (4-4) und einer mobilen Phase als binärem
Niederdruckgradienten (siehe Tab. 21) durchgeführt. Die mobile Phase setzte sich
aus Eluent A (75% Acetonitril, 15% Methanol, 10% Tetrahydrofuran) und Eluent B
(Aqua bidest., sterilfiltriert über Cellulose-Acetat-Filter; Porengröße 0,2 µm;
Schleicher & Schuell) zusammen. Eine konstante Säulentemperatur von 35 °C wurde
durch einen L-7350 LaChrom-Säulenofen gewährleistet.
Tab. 21: Elutionsprotokoll zur Auftrennung von Carotinoiden aus methanolischen, cyanobakteriellen Zellextrakten mittels HPLC (modifiziert nach RABENSTEIN 1997). Zusammensetzung der Eluenten siehe Text
Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flussrate [ml/min]
0-1 85 15 1,5
1-15 100 0 1,5
15-25 100 0 1,5
25-27 85 15 1,5
27-28 85 15 1,5
2. Material und Methoden 39
2.8.2.2 Detektion der Retentionszeiten und Absorptionsspektren
Mit einer L-6220 Intelligent Pump wurde die mobile Phase über einen Mixer an einen
L-4250 UV/Vis-Detektor und einen L-7455 Dioden-Array-Detektor (DAD)
weitergeleitet.
In dem L-7455 DAD wurden die Absorptionsspektren der einzelnen Carotinoide jede
Sekunde im Wellenlängenbereich von 360 bis 700 nm aufgenommen. Die
Detektorsignale wurden über ein D-6000A Interface an einen D-2000 Chromato-
Integrator bzw. einen Computer mit D-7000 HPLC-Manager-Software weitergeleitet,
dort jeweils aufgezeichnet und berechnet.
2.8.2.3 Identifizierung der Pigmente und Ermittlung der relativen Anteile
Die Identifizierung der verschiedenen Pigmente anhand ihrer Absorptionsspektren
wurde sowohl aufgrund käuflich erworbener Standards als auch unter Verwendung
von Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) vorgenommen. Eine
Auswertung der relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten
Peakflächen (area counts).
2.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine
Die Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte durch photometrische Messung der
Absorption bei den Wellenlängen 565, 620 und 650 nm (modifiziert nach BENNETT
und BOGORAD 1973). Die Berechnungen der Konzentrationen wurden nach den bei
TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) angegebenen Gleichungen durchgeführt.
2.8.3.1 Probenvorbereitung und Konzentrationsberechnung
Für die photometrische Phycobiliprotein-Analyse wurden Kulturen eingesetzt, die wie
unter 2.8.1.1 beschrieben, gehältert wurden.
Nach Entnahme von 1 ml homogenisierter Kultur und anschließender Zentrifugation
bei 13.000 rpm für 5 min (Heraeus Instruments; Biofuge pico) wurde der Kultur-
Überstand dekantiert und das Pellet bei -20 °C über 1 h gelagert. Durch Zugabe von
1,25 ml Lösung I (0,01 M Na2HPO4; 0,15 M NaCl; pH 7,0; sterilfiltriert) wurde das
Pellet resuspendiert. Die Zugabe von 150 µl Lösung II (0,1% Lysozym in Lösung I
[w/v]) und anschließender Inkubation für 2 h und 120 rpm im 37 °C-Schüttelbad mit
2. Material und Methoden 40
reziprokalem Schütteln bewirkte die Zelllyse. Die Probe wurde anschließend bei 4 °C
im Dunkeln über Nacht gelagert. Nach Durchmischung auf einem Whirl-Mix erfolgte
eine Zentrifugation bei 10.000 rpm für 30 min. Durch diese Prozedur wurden die
Zelltrümmer, die das Chlorophyll a enthalten, ins Pellet zentrifugiert, so dass im
Überstand ausschließlich Phycobiliproteine (und andere lösliche Proteine) enthalten
waren (BENNETT und BOGORAD 1973). Vom Überstand wurde 1 ml in ein 2 ml ERG
überführt und mit 1 ml Lösung I versetzt. Nach Durchmischung der Probe erfolgte die
photometrische Messung (Photometer Biochrom Libra S12) der Absorption bei den
Wellenlängen 565, 620 und 650 nm. Die Konzentration der Phycobiliproteine
Phycocyanin (PC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (AP) wurde, unter
Verwendung der Gleichungen von BENNETT und BOGORAD (1973) und den
Extinktionskoeffizienten von BRYANT und Mitarbeitern (1979), nach TANDEAU DE
MARSAC und HOUMARD (1988) wie folgt berechnet:
Phycocyanin (PC) [mg/ml] = (A620 nm – 0,7 x A650 nm)/7,38
Allophycocyanin (AP) [mg/ml] = (A650 nm – 0,19 x A620 nm)/5,65
Phycoerythrin (PE) [mg/ml] = (A565 nm – 2,8 x PC) – (1,34 x AP)/12,7
2.8.4 Versuche zur Komplementären Chromatischen Adaptation
Der Nachweis der Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1
erfolgte durch Dokumentation der dynamischen Veränderungen der Pigment-
zusammensetzung nach Inkubation der Kulturen bei abwechselnd Rot- bzw.
Grünlicht. Dazu erfolgte die photometrische Bestimmung der Phycobiliproteine und
der synthetisierten Carotinoide mittels Reverse Phase HPLC.
2.8.4.1 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine
2.8.4.1.1 Probenvorbereitung
Zur Inokulation der Versuchskultur wurden 116,47 ± 1,66 mg Zellmasse einer
homogenen Vorkultur (Wachstum über 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR) in 30 ml
Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) im Doppelansatz angeimpft. Als Kontrolle (Ansatz A)
wurden die Kulturen ausschließlich in Weißlicht gehältert. Ansatz B wurde nach 3
2. Material und Methoden 41
Wochen Wachstum unter Grünlicht (t1) für 3 Wochen Rotlicht ausgesetzt (t2) und
anschließend für 3 Wochen wieder unter Grünlich inkubiert (t3).
Ansatz C wurde nach 3 Wochen Wachstum unter Rotlicht (t1) für 3 Wochen Grünlicht
ausgesetzt (t2) und anschließend für 3 Wochen wieder unter Rotlicht inkubiert (t3).
Nach der Inkubation für 3 Wochen wurden an den Messzeitpunkten t0 bis t3 jeweils 2
ml der Kultur zur Bestimmung der Phycobiliproteine entnommen und das aus der
Kultur entnommene Probenvolumen durch Zugabe von Medium wieder auf 30 ml
aufgefüllt.
2.8.4.1.2 Auswertung
Die qualitative und quantitative Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte, wie in
Kapitel 2.8.3 beschrieben, an den Messzeitpunkten t0 bis t3. Zusätzlich erfolgte die
Berechnung der Quotienten aus PC/AP und PE/AP nach TANDEAU DE MARSAC und
HOUMARD (1988).
2.8.4.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC
2.8.4.2.1 Probenvorbereitung
Zur Bestimmung der Carotinoide wurden Kulturen eingesetzt, die über einen
Zeitraum von 3 Monaten bei Rot- bzw. Grünlicht gehältert wurden. Dabei wurden die
Kulturen im Abstand von 4 Wochen in frisches Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überimpft.
Die Extraktion der Pigmente wurde analog zur Chlorophyll a-Bestimmung (siehe Kap.
2.4.1.2.1) mit Methanol durchgeführt. Das Feuchtgewicht der eingesetzten Zellpellets
betrug 60 ± 20 mg.
2.8.4.2.2 Auswertung
Die Auswertung der Carotinoid-Bestimmung erfolgte, wie in Kapitel 2.8.2
beschrieben, mittels Reverse Phase HPLC
2. Material und Methoden 42
2.9 Transmissions-Elektronen Mikroskopie (TEM)
Die Erstellung von elektronenmikroskopischen Aufnahmen sollte Aufschluss über
Zellorganisation, Zellform und morphologische Details geben. Außerdem sollte die
Anordnung der Thylakoide ermittelt und dargestellt werden.
Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden Mithilfe von Frau A. Toltz in
der Arbeitsgruppe „Angewandte Botanik“ von Prof. Heyser (UFT, Universität Bremen)
durchgeführt.
2.9.1 Probenvorbereitung
Zur Erstellung von TEM-Aufnahmen wurden 2 ml Cyanobakterien-Kultur einer
Vorkultur entnommen, die bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer
konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR für 4 Wochen inkubiert wurden. Anschließend
erfolgte eine Zentrifugation (Heraeus Instruments; Biofuge pico) bei 13.000 rpm für 5
min. Die Fixierung der Zellen im Pellet erfolgte mit 2% Glutaraldehyd (in 0,05 M
Natriumcacodylat, pH 7,5) bei RT auf einem Rotator (Agar Scientific, Stufe 2-3) für 1
h. Nach der anschließenden Zentrifugation (Eppendorf Centrifuge 5415 C) für 3 min
bei 10.000 rpm wurde das Pellet mit 2 ml Aqua bidest. gewaschen und erneut
zentrifugiert. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte zur
Nachfixierung die Zugabe von je 0,2 ml 1%igem und 2%igem Osmiumtetroxid und
einer Inkubation über 3,5 h bei RT. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit Aqua
bidest. wurde das Pellet über Nacht im Kühlschrank gelagert.
Zur stetigen Entwässerung der Zellen wurde eine Ethanolreihe mit 15, 30, 50, 70, 80,
90, 96 und 100% Ethanol angesetzt und je Verdünnungsstufe nacheinander in
aufsteigender Konzentration zweimal je 1,5 ml auf das Pellet pipettiert. Anschließend
wurden die Zellen 10 min lang auf dem Rotator inkubiert und zentrifugiert (s. o.). Um
den Zellen vollständig das Wasser zu entziehen, wurden die Proben dreimal mit
100%igem Ethanol gewaschen.
Die Einbettung der Zellen in Kunststoff erfolgte mittels Einbettungsmedium nach
SPURR (1968) (Zusammensetzung siehe Tab. 22).
2. Material und Methoden 43
Tab. 22: Zusammensetzung des Einbettungsmedium nach SPURR (1969) und Funktion der jeweiligen Komponenten Komponenten Stoffklasse Funktion Menge [g] ERL 4206 Vinylcyclohexendioxid Epoxidmonomer 10,0 DER 736 Diglyceridether Weichmacher 6,0 NSA Nonenylbernsteinsäureanhydrid Härter 26,0 DMSAE (S1) Dimethylaminoethanol Katalysator 0,4
Die Überführung in das Einbettungsmedium erfolgte durch stetige Erhöhung der
SPURR-Konzentration, wobei gleichzeitig der Volumenanteil Ethanol gesenkt wurde
(siehe Tab. 23).
Tab. 23: Darstellung des Ablaufes zur Kunststoffinfiltration
Volumenanteil Ethanol
Volumenanteil SPURR-Einbettungsmedium Inkubationsdauer
3 1 1h 2 1 1h 1 1 über Nacht 1 2 2h 1 3 2h
Nach Zugabe des Gemisches im letzten Schritt der Kunststoffinfiltration wurden die
ERG zur Verdampfung des Ethanols offen stehen gelassen. Anschließend erfolgte
die Zugabe von 100%igem SPURR-Einbettungsmedium in die ERG. Nach 1 h wurde
zentrifugiert (s. o.), der Überstand durch frisches Einbettungsmedium (100%ig)
ersetzt, erneut für 1 h inkubiert und abzentrifugiert (s. o.). Das entstandene Pellet
wurde mittels Zahnstocher in „Förmchen“ (Beem Kapsel, Größe 00; PLANO GmbH)
überführt und mit 100%igem SPURR-Einbettungsmedium vorsichtig überschichtet.
Zum Auspolymerisieren der Epoxide wurden die Proben bei 70 °C für 11 h im Ofen
erhitzt.
2.9.2 Schneiden der TEM-Präparate
Nach Aushärtung des Kunststoffes wurden die Präparate aus den „Förmchen“
genommen und überschüssiger Kunststoff mittels Rasierklinge (GEM) entfernt. Die
Proben wurden in ein Ultramikrotom (Ultracut E; Reichert-Jung) mit Glasmesser
eingesetzt. Bei einer Schnittdicke von 1 µm wurden die Proben manuell
angeschnitten. Die entstandenen Schnitte wurden auf einen mit Gelatine
beschichteten Objektträger (OT) mit einem Tropfen Wasser überführt. Nach
2. Material und Methoden 44
Verdampfen des Wassers auf einer Heizplatte wurde das Präparat mit Richardson-
Blue-Lösung gefärbt und anschließend mit Wasser gewaschen. Der OT wurde unter
dem Mikroskop (Zeiss Axiolab) bei 400facher Vergrößerung betrachtet, um den
optimalen Schnittbereich zu finden. Zur Minimierung der Schnittfläche wurde das
Präparat mittels Rasierklinge unter einem Binokular (Stemi SV8; Zeiss) pyramidisch
angeschnitten. Nach Austausch der Glasklinge gegen eine Diamantklinge (Diatome)
wurden 50 nm dicke Schnitte durchgeführt. Die entstanden grau- und silberfarbenen
Schnitte (entspricht einer Schnittdicke von 0-60 nm) wurden mit einer Platinimpföse
(Perfekt Loop) aufgenommen und auf ein Trägermaterial (Grid) überführt.
Anschließend erfolgte eine Kontrastierung durch 2%iges Uranylacetat und 2,6%igem
Bleicitrat nach REYNOLDS (1963). Dazu wurden die Grids in eine Petrischale mit
einem Tropfen Uranyacetat überführt und nach einer Inkubation für 20 min im
Dunkeln mehrfach mit Aqua bidest. gewaschen. Anschließend wurden die Grids auf
einen Tropfen Bleicitrat in eine Petrischale mit wassergetränktem Filterpapier und
acht NaOH-Plättchen (diese binden entstehendes CO2) überführt und für 20 min
inkubiert.
2.9.3 TEM-Aufnahmen
Die elektonenmikroskopischen Aufnahmen wurden an einem Hochleistungs-
Elektronenmikroskop (Zeiss EM 10 A/B) aufgenommen, die Bilder in einer
Dunkelkammer entwickelt und eingescannt.
Eine Zuordnung und Identifizierung der Ultrastrukturen erfolgte unter zu Hilfenahme
der Literatur von HOICZYK und HANSEL (2000), ANAGNOSTIDIS (1989), FLORES und
Mitarbeitern (2007) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005).
2.10. Herkunft der verwendeten Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien wiesen HPLC oder p.a.-Grade auf und wurden von
den Firmen Merck (Darmstadt, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz), Riedel de
Haën (Seelze, Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland), VWR international
(Leuven, Belgien), Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland ), Invitrogen (Karlsruhe),
MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Roche (Mannheim, Deutschland),
QIAGEN (Hilden, Deutschland) und Molzym (Bremen, Deutschland) bezogen.
3. Ergebnisse 45
3. Ergebnisse
3.1 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1
Nach Anwendung von insgesamt drei verschiedenen Antibiotika mit anschließenden
Waschschritten und Überführung der Kulturen in sterilfiltriertes Medium (ASNIII/2 mit
Nitrat) (siehe Kap. 2.2.3.2) konnten bei mikroskopischen Kontrollen bei 1000facher
Vergrößerung keine heterotrophen Bakterien nachgewiesen werden.
3.2 Morphologische Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105
In der morphologischen Beschreibung wurden Kulturen untersucht, die, wie in Kapitel
2.2.2 beschrieben, über 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR gehältert wurden.
3.2.1 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Beschreibung
Die lichtmikroskopische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 (Abb. 3)
erfolgte bei 100facher Vergrößerung mit Hellfeld-Kontrastierung (siehe Kap. 2.3.2).
Abb. 3: Lichtmikroskopische Aufnahmen der Stämme Flo1 (3A) und PCC 7105 (3B) bei 100facher Vergrößerung mit Hellfeld-Kontrastierung. Skalierung (innerer Kasten) = 20 µm
In beiden Abbildungen sind gerade bis leicht gebogene, unverzweigte Filamente zu
erkennen, die keine differenzierten Zellen wie Heterozysten, Akineten oder
necridische Zellen aufweisen.
Eine detaillierte Darstellung der Filamente erfolgte mittels Phasenkontrast bei
1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl (Abb. 4).
3A 3B
3. Ergebnisse 46
Abb. 4: Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen der Stämme Flo1 (4A) und PCC 7105 (4B) bei 1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl. Skalierung (1 Teilstrich = 1 µm). Abkürzungen: TZ: terminale Zelle; E: Einschnürungen zwischen den Zellen
Deutlich erkennbar sind die konisch geformten terminalen Zellen (TZ) der Filamente
sowie teilweise die Einschnürungen zwischen den Zellen zur internen Abgrenzung
(E).
3.2.2 Zellgrößenbestimmung
Die mikroskopische Zellgrößenbestimmung erfolgte bei 1000facher Vergrößerung mit
Immersionsöl (siehe Kap. 2.3.3). Der Messumfang betrug 20 vegetative Zellen. Die
Berechnung der Mittelwerte zur Längen- und Breitenbestimmung der vegetativen
Zellen der Stämme Flo1 und PCC 7105 ergab durchschnittliche Zelllängen von 4,9 ±
0,69 µm bzw. 5,0 ± 0,63 µm und durchschnittliche Zellbreiten von 2,2 ± 0,26 µm,
bzw. 2,2 ± 0,24 µm.
4A
4B
E
E
AZ
AZ
3. Ergebnisse 47
3.2.3 Scheidennachweis
Abbildung 5 zeigt lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen von Filament-Bruchstücken
der Stämme Flo1 (5A) und PCC 7105 (5B) nach Inkubation der Kulturen über eine
Dauer von 15 Tagen im Dunkeln (siehe Kap. 2.3.4).
Abb. 5: Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen von Filament-Bruchstücken der Stämme Flo1 (5A) und PCC 7105 (5B) bei 1000facher Vergrößerung. Dargestellt sind zylindrisch geformte Zellen mit einer dunkel erscheinenden Scheide. VZ: vegetative Zellen; SC: Scheide
An den Zellbruchstücken sind die dünnen Umrisse einer Scheide zu erkennen, die in
den Abbildungen dunkel erscheinen. Die hellleuchtende unmittelbare Umgebung der
Zellen im Filament ist ein Darstellungsartefakt, hervorgerufen durch die
Fokussierungsebene des Mikroskops.
3.2.4 Motilitäts-Nachweis
Der Motilitäts-Nachweis der Stämme Flo1 und PCC 7105 erfolgte auf ASNIII/2-
Agarplatten mit und ohne Nitrat (siehe Kap. 2.3.5). Dabei konnte Medienunabhängig
eine Fortbewegung bei beiden Stämmen nachgewiesen werden (Daten nicht
gezeigt). Die Filamente erstreckten sich nach 21 Tagen über große Flächen und bis
zum Rand der Agarplatte. Die Filamente waren je nach verwendetem Medium grün
(ASNIII/2 mit Nitrat) oder weiß gefärbt (ASNIII/2 ohne Nitrat).
Eine Verdunklung von einer Hälfte der Platte mittels Aluminiumfolie, um eine
gerichtete Bewegung nachzuweisen, hatte keinen Einfluss auf die
Fortbewegungsrichtung oder die Farbe der Filamente.
5A 5B
SC SC
VZ VZ
3. Ergebnisse 48
3.2.5 Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung
In Tabelle 24 sind die nachgewiesenen morphologischen Merkmale der Stämme Flo1
und PCC 7105 zusammengefasst dargestellt.
Tab. 24: Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 nach Wachstum für 3 Wochen bei einer PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR. Nicht nachgewiesene Merkmale wurden mit (-), Positivnachweise (sofern nicht genauer beschrieben) mit (+) gekennzeichnet. Zusätzlich ist der Verweis auf das jeweilige Kapitel der expliziten Beschreibung angegeben
Merkmal Stamm Flo1 Stamm PCC 7105
Beschreibung in Kapitel
Form unverzweigtes Filament
unverzweigtes Filament 3.2.1
Einschnürungen zwischen den Zellen + (gering) + (gering) 3.2.1
(siehe auch 3.9)
Form der terminalen Zelle konisch konisch 3.2.1
Heterozysten - - 3.2.1
Akineten - - 3.2.1
necridische Zellen - - 3.2.1
Länge und Breite der vegetativen Zellen 4,9 x 2,2 µm 5,0 x 2,2 µm 3.2.2
Scheide sehr dünn sehr dünn 3.2.3
Motilität auf Agarplatten + + 3.2.4
Ein morphologischer Vergleich der Stämme (Tab. 24) zeigt identische Merkmale
zwischen beiden untersuchten Organismen. Beide Stämme weisen unverzweigte
Filamente auf, die an den Querwänden durch dünne Einschnürungen abgegrenzt
sind. Im Gegensatz zu den zylindrisch geformten, vegetativen Zellen innerhalb des
Filaments, ist die terminale Zelle konisch geformt. Bei beiden Stämmen konnten
weder Heterozysten noch Akineten oder necridische Zellen dokumentiert werden.
3. Ergebnisse 49
3.3 Taxonomische Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Grundlage morphologischer Merkmale
Anhand der dokumentierten morphologischen Merkmale (siehe Tab. 24) sollte
Stamm Flo1 mit Hilfe bekannter Daten aus der Bestimmungsliteratur wie
„Cyanophyceae“ (GEITLER 1932), „Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology“
(CASTENHOLZ et al. 2001) und „Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005)
klassifiziert werden (Tab. 25). Eine detaillierte Darstellung der Bestimmungsschlüssel
mit den relevanten Merkmalen ist im Anhang dargestellt (Tab. 37 bis 39).
Tab. 25: Klassifizierung von Stamm Flo1 anhand morphologischer Merkmale mittels Bestimmungsliteraturdaten Verwendeter Bestimmungsschlüssel und Quelle
Ermittelte Ordnung
Ermittelte Gattung Ermittelte Spezies
„Cyanophyceaea“
(GEITLER 1932) Oscillatoriales Oscillatoria
O. limnetica O. amphigranulata O. redekei
„Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology“ (CASTENHOLZ et al. 2001)
Oscillatoriales Geitlerinema -
„Cyanoprokaryota“ ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005)
Oscillatoriales Geitlerinema -
In allen verwendeten Bestimmungsschlüsseln wurde Stamm Flo1 übereinstimmend
der Ordnung Oscillatoriales zugeordnet. Auf Gattungs-Ebene wurde Stamm Flo1
nach GEITLER (1932) als Oscillatoria, mit den möglichen Spezies Oscillatoria
limnetica, O. redekei oder O. amphigranulata klassifiziert. Eine Zuordnung von
Stamm Flo1 zu einer dieser Spezies ist nicht erfolgt.
In den neueren Bestimmungsschlüsseln nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001)
sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) wurde Stamm Flo1 der Gattung
Geitlerinema zugeordnet. Eine weitergehende Einteilung war in „Bergey’s Manuel of
Systematic Bacteriology“ (CASTENHOLZ et al. 2001) wegen der Beschränkung der
Bestimmungsliteratur auf Genus-Ebene nicht möglich.
Eine Einteilung auf Spezies-Ebene nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) wurde
nicht durchgeführt.
3. Ergebnisse 50
3.4 Ergebnisse der physiologischen Charakterisierung
Zur physiologischen Beschreibung des Stammes Flo1 wurden verschiedene
Wachstumsparameter verändert. Dazu wurde das Wachstumsverhalten in
Abhängigkeit der Photonenflussdichte (PFD), unterschiedlicher Salzgehalte und pH-
Werte, des Vitamin-Bedarfs sowie der Fähigkeiten zur Verwertung verschiedener
Stickstoffquellen und zur Stickstofffixierung untersucht.
3.4.1 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten
Die Quantifizierung des Wachstums bei unterschiedlichen PFDs erfolgte durch
Bestimmung der Konzentration von Chlorophyll a nach MACKINNEY (1941) (siehe
Kap. 2.4.1.2.1) und des Proteingehaltes nach BRADFORD (1976) (siehe Kap.
2.4.1.2.2). Die graphische Darstellung erfolgte durch Berechnung des Verhältnisses
von Chlorophyll a zur Proteinkonzentration (Abb. 6).
0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Zeit nach Beimpfung [Tage]
Chl
orop
hyll
a/P
rote
in-Q
uotie
nt
[µg/
ml]
1 µE PAR 5 µE PAR 10 µE PAR 15 µE PAR 20 µE PAR
Abb. 6: Graphische Darstellung des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unter-schiedlichen PFDs von 1 bis 20 µE m-2 s-1 PAR anhand der Chlorophyll a/Protein-Quotienten der Proben (Mittelwert) Wie Abbildung 6 zeigt, ist ein Zellwachstum von Stamm Flo1 bei höheren PFDs (15
und 20 µE m-2 s-1 PAR) nur bedingt möglich. Bei diesen Lichtintensitäten konnte
keine signifikante Zunahme im Chlorophyll a/Protein-Quotienten über die
Versuchsdauer von 28 Tagen beobachtet werden. Dabei wiesen beide Kurven einen
3. Ergebnisse 51
ähnlichen Verlauf auf. Einem tendenziell degressiven Verlauf bis zum 10. Messtag
folgte ein kurzer Anstieg mit anschließender Abnahme der Quotienten bis zum 24.
Messtag. Dabei stieg der Quotient bei 20 µE m-2 s-1 PAR zwischenzeitlich (18.
Messtag) noch einmal an. Am 24. Messtag erfolgte ein weiterer Anstieg in beiden
Kurvenverläufen, der bei einer PFD von 15 µE m-2 s-1 PAR kontinuierlich bis zum 28.
Messtag zunahm, im Falle von 20 µE m-2 s-1 PAR nach dem 26. Inkubationstag aber
direkt wieder abnahm. Die höchsten Messwerte wurden bei einer PFD von 20 µE m-2
s-1 PAR nach 26 Tagen (1,05) und bei 15µE m-2 s-1 PAR nach 28 Tagen (0,94)
erreicht, lagen aber deutlich unter den Messwerten der Wachstumskurven bei
niedrigeren PFDs.
Während das Wachstum bei höheren Lichtintensitäten (15 und 20 µE m-2 s-1 PAR) zu
Begin der Messung degressiv verlief, konnte bei PFDs von 1 bis 10 µE m-2 s-1 PAR
tendenziell eine Zunahme des Chlorophyll a/Protein-Quotienten bis zum 20. Messtag
beobachtet werden. Innerhalb der letzten Versuchstage (22. bis 28. Messtag) zeigten
die Kurvenverläufe starke Schwankungen.
Der insgesamt höchste Quotient (1,59) wurde nach 26 Tagen bei einer Beleuchtung
von 1 µE m-2 s-1 PAR dokumentiert. Bei einer PFD von 5 µE m-2 s-1 PAR wurde das
Maximum (1,42) nach 20 Tagen und bei einer PFD von 10 µE m-2 s-1 PAR nach 26
Tagen (1,36) erreicht.
3.4.1.1 pH-Wert in den Überständen
Parallel zu den Messungen zum Wachstumsverhalten in Abhängigkeit der PFD
wurde in den Kultur-Überständen im Abstand von 4 Tagen auch der pH-Wert mittels
pH-Streifen (pH 6.0-10.0; Macherey-Nagel) gemessen (siehe Kap. 2.4.1.2.3). Die
Darstellung der pH-Wert-Endwicklung erfolgte aus Übersichtsgründen für jede PFD
in getrennten Graphiken (Abb. 7A-E).
3. Ergebnisse 52
8,5
8,8
9,1
9,4
9,7
10,0
0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]
pH- W
ert
1 µE PAR
8,5
8,8
9,1
9,4
9,7
10,0
0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]
pH- W
ert
5 µE PAR
8,5
8,8
9,1
9,4
9,7
10,0
0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]
pH- W
ert
10 µE PAR
8,5
8,8
9,1
9,4
9,7
10,0
0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]
pH- W
ert
15 µE PAR
8,5
8,8
9,1
9,4
9,7
10,0
0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]
pH- W
ert
20 µE PAR
Wie aus den Abbildungen 7A bis 7E ersichtlich, kommt es tendenziell zu einem pH-
Wert-Anstieg in den Kultur-Überständen während der Versuchsdauer. Dabei stieg
der pH-Wert bei einer PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR auf 9,1 und bei einer PFD von 5 µE
m-2 s-1 PAR auf 9,4 an. Bei den höheren PFDs von 10, 15 und 20 µE m-2 s-1 PAR
stieg der pH-Wert auf 10,0.
Abb. 7: Entwicklung des pH-Wertes in den Kultur-Überständen während des 28 tägigen Wachstums von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs. Die Messungen erfolgten im zeitlichen Abstand von 4 Tagen
7A 7B
7C 7D
7E
3. Ergebnisse 53
3.4.1.2 Makroskopische Beschreibung der Kulturen
Nach Wachstum über eine Dauer von 4 Wochen bei unterschiedlichen PFDs wurden
die Kulturen von Stamm Flo1 makroskopisch, unter Berücksichtigung der Farbe und
der Ausbildung von exopolymeren Substanzen (ES), beschrieben. Abbildung 8 zeigt
Aufnahmen der Kulturen, die Auswertung ist in Tabelle 26 dargestellt.
Abb. 8: Photographische Dokumentation der Kulturen von Stamm Flo1 nach Wachstum bei unterschiedlichen PFDs über einen Zeitraum von 4 Wochen Tab. 26: Farbe der Kulturen von Stamm Flo1 und Ausbildung von exopolymeren Substanzen (ES) nach Wachstum bei unterschiedlich hohen PFDs (+): ES vorhanden, aber deutlich weniger als Kultur (dunkler gefärbt) (++): ES ± so viel wie Kultur, starke Aggregatbildung (+++): mehr ES als Kultur, Einschluss von Gas- Bläschen
20
Gelbgrün
+++Dunkelgelb
15 ++
10 Meeresgrün ++
5 Grün +
1 Dunkelgrün +
PFD während das Wachstums [µE m-2 s-1 PAR]
Farbe der KulturAusbildung von exopolymeren
Substanzen
Abbildung 8 und Tabelle 26 zeigen die farblichen Veränderungen und die Ausbildung
von exopolymeren Substanzen bei Stamm Flo1 nach Wachstum bei
unterschiedlichen PFDs. Dabei konnte mit steigender PFD eine stetige Entfärbung
3. Ergebnisse 54
der Kulturen beobachtet werden. Gleichzeitig nahm die Menge an gebildeten ES mit
steigender Lichtintensität zu und war nach der Inkubation bei einer Lichtintensität von
20 µE m-2 s-1 PAR maximal.
3.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung der Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht
Zum Nachweis einer Korrelation zwischen Feucht- und Trockengewicht der
Biomasse der Zellen von Stamm Flo1 wurde eine Kalibrierungskurve erstellt (siehe
Kap. 2.4.2). Die ermittelten Biomassetrockengewichte wurden in Abhängigkeit von
den Feuchtgewichten graphisch dargestellt und das Bestimmtheitsmaß berechnet.
R2 = 0,9855
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Biomassefeuchtgewicht [mg]
Bio
mas
setr
ocke
ngew
icht
[mg]
Abb. 9: Darstellung der Korrelation zwischen den Feuchtgewichten einer homogenen Kultur von Stamm Flo1 und den Biomassetrockengewichten der Zellen nach Verdampfen des Wassers im Wärmeofen Wie in Abbildung 9 ersichtlich, besteht eine Korrelation (Bestimmtheitsmaß von
98,55%) zwischen Feucht- und Trockengewicht der cyanobakteriellen Biomasse von
Stamm Flo1. Diese Feststellung ist Grundlage für die Auswertung der in den Kapiteln
3.4.3 bis 3.4.6 durchgeführten physiologischen Versuche zur Bestimmung der
Biomassetrockengewichte.
3. Ergebnisse 55
3.4.3 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten
In Abbildung 10 ist das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen
Salinitäten (0 bis 62‰) nach einer 3 Wochen langen Kultivierung anhand der
Biomassetrockengewichte (siehe auch Kap. 3.4.2) der Zellpellets dokumentiert (siehe
Kap. 2.4.3). Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse der Doppel-
bestimmungen und die daraus errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt
(Tab. 40).
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
Bio
mas
setr
ocke
ngew
icht
[mg]
0 7 15 27 38 50 62
Salinität des Mediums [‰]
Abb. 10: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Salzgehalten nach 3 Wochen Wachstum
Die geringste Menge an Biomassetrockengewicht (2,09 mg) wurde im Kontroll-
medium ohne Salz (0‰ = BG110) festgestellt. Bei einem Salzgehalt von 7 ‰ wurde
eine größere Produktion an Biomasse gemessen als bei den höheren Salzgehalten
von 27‰ bis 62‰. Die Biomassetrockengewichte bei höheren Salzgehalten
differierten nur gering zwischen 7,08 mg bei 27‰ und 8,13 mg bei 62‰. Die größte
Zunahme an Trockengewicht (14,08 mg) konnte bei einem Salzgehalt von 15 ‰
ermittelt werden, was dem Salzgehalt des Basis-Mediums ASNIII2 entspricht.
3. Ergebnisse 56
3.4.4 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten
Das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen pH-Werten in
gepufferten Medium wurde nach 3 Wochen Kultivierung durch Bestimmung der
Trockengewichte (siehe auch Kap. 3.4.2) der Zellpellets ermittelt (siehe Kap. 2.4.4).
Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse der Doppelbestimmung und der
daraus errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt (Tab. 41).
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Bio
mas
setr
ocke
ngew
icht
[mg]
7,80 8,17 8,61 9,05 9,37pH- Wert des Mediums
Abb. 11: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Start-pH-Werten im Medium nach für 3 Wochen Wachstum
Abbildung 11 zeigt das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen
Start-pH-Werten in gepufferten Medien. Bei Start-pH-Werten von 9,05 und 9,37
konnte eine höhere Produktion an Biomasse erzielt werden als bei pH-Werten von
7,80 bis 8,61.
Die höchste Produktion an Biomasse (12,85 mg Trockengewicht) wurde bei einem
pH-Wert im Medium von 9,05 erreicht, geringfügig weniger Biomasse (11,76 mg)
wurde bei einem Start-pH-Wert von 9,37 erreicht. Die Trockengewichte nach
Wachstum bei pH-Werten von 7,80 bis 8,61 differierten nur gering zwischen 7,68 und
8,12 mg.
Nach Auswertung der Biomassetrockengewichte der Kulturen wurden zusätzlich die
End-pH-Werte in den Medien und in den Kontrollen bestimmt und in Tabelle 27
dargestellt.
3. Ergebnisse 57
Tab. 27: Vergleich der pH-Wert-Änderungen in den Kulturmedien und Kontrollen (ohne Cyanobakterien) nach 3wöchiger Inkubation
8,72
8,86
pH-Wert in den Kontrollen nach 3 Wochen
7,73
8,06
8,43
9,05 8,76
9,37 8,92
8,17 8,13
8,61 8,49
Start-pH-Wert des Mediums
pH-Wert des Mediums nach 3 Wochen Inkubation
7,80 7,88
In Tabelle 27 sind die Pufferkapazität der Medien und die Entwicklung der pH-Werte
in den Kontrollansätzen dargestellt. Während die niedrigeren pH-Werte von 7,80 bis
8,61 sowohl in den Versuchsansätzen als auch den Kontrollen stabil blieben,
konnten pH-Wert-Schwankungen in den Ansätzen mit höheren Start-pH-Werten
nachgewiesen werden. In beiden Fällen konnten keine signifikanten Unterschiede
zwischen den pH-Werten der Kontrollen und der gepufferten Medien nach 3 Wochen
Inkubationsdauer dokumentiert werden.
3. Ergebnisse 58
3.4.5 Vitamin B-Bedarf für das Wachstum
In diesem Versuch sollte geprüft werden, ob das Wachstum von Stamm Flo1 durch
die Zugabe von Vitamin B12 bzw. einer aus 7 Vitaminen bestehenden Lösung
gefördert wird. Das Wachstum wurde, wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben,
durch die Zunahme an Biomassetrockengewicht bestimmt. Eine detaillierte
Darstellung der Messergebnisse und die daraus errechneten Mittelwerte ist im
Anhang dargestellt (Tab. 42).
16,0
16,2
16,4
16,6
16,8
17,0
17,2
17,4
17,6
Bio
mas
setr
ocke
ngew
icht
[mg]
ASNIII/2 ohne Vitamine
Vit B12 2,5 µg/l
Vit B12 5 µg/l
Vit B12 10 µg/l
7-Vitamin-Lsg. 0,25 ml/l
7-Vitamin-Lsg. 0,5 ml/l
7-Vitamin-Lsg. 1,0 ml/l
AbbTab. 12: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Vitamin-Lösungen nach 3 Wochen Wachstum. Die Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf Grund der unterschiedlichen Mengen der einzelnen Vitamine in der Lösung nicht möglich (siehe Tab. 8)
Das Wachstum von Stamm Flo1 konnte durch die geringe Zugabe von Vitaminen, im
Vergleich zum Medium ohne Vitamine (grau), gesteigert werden. Das größte
Wachstum von Stamm Flo1 mit Vitamin B12 (grün) konnte bei einer Konzentration
von 2,5 µg/l dokumentiert werden. Die Zugabe von 5 µg/l hatte nur eine geringe
Steigerung des Biomassetrockengewichts zur Folge. Eine zu hohe Konzentration von
Vitamin B12 (10 µg/l) führte zu vermindertem Wachstum.
Die Zugabe von 0,5 ml/l der 7-Vitamin-Lösung (orange) bewirkte die größte Zunahme
an Biomassetrockengewicht. Die Zugabe von 0,25 und 1,0 ml/l der 7-Vitamin-Lösung
hatte keinen positiven Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1.
3. Ergebnisse 59
3.4.6 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen
In diesem Versuch sollte untersucht werden, mit welchen anorganischen
Verbindungen Stamm Flo1 in der Lage ist zu wachsen. Dabei wurden die
Stickstoffverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und das
Biomassetrockengewicht nach einer Inkubation über einen Zeitraum von 3 Wochen
bestimmt (Abb. 13). Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse und die daraus
errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt (Tab. 43).
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Bio
mas
setr
ocke
ngew
icht
[m
g]
ASN III/2
-
1 mM N
itrat
2,5 m
M Nitra
t
5 mM N
itrat
10 m
M Nitra
t
1 mM A
mmonium
2,5 m
M Ammon
ium
5 mM A
mmonium
10 m
M Ammonium
1 mM N
itrit
2,5 m
M Nitri
t
5 mM N
itrit
10 m
M Nitri
t
Abb. 13: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen anorganischer Stickstoffverbindungen nach 3 Wochen Wachstum Abbildung 13 zeigt die Verwertung der in unterschiedlichen Konzentrationen
eingesetzten Stickstoffverbindungen Natriumnitrat (NaNO3, blau), Ammoniumchlorid
(NH4Cl, grün) und Natriumnitrit (NaNO2, orange) im Vergleich zur Kontrolle ohne
Stickstoffquelle (ASNIII/2, grau).
In den Ansätzen mit Natriumnitrat als einziger Stickstoffquelle war im Vergleich zum
Kontrollansatz keine signifikant höhere Produktion an Biomasse zu beobachten. Die
höchste Produktion an Biomasse bzw. Trockengewicht (10,01 mg) wurde bei einer
Konzentration mit 1 mM Nitrat erzielt und lag im Vergleich mit der Kontrolle (9,16 mg)
nur unwesentlich höher. Bei Konzentrationen von 2,5 mM (9,36 mg Trockengewicht)
und 5 mM (9,57 mg Trockengewicht) konnte keine gesteigerte Produktion an
Biomasse dokumentiert werden. Bei einer Konzentration von 10 mM war sogar eine
Abnahme in der Biomasse (8,86 mg) im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten.
Mit Ammoniumchlorid als einziger Stickstoffquelle war im Vergleich zur Kontrolle nur
bei einer Konzentration von 2,5 mM die Ausbeute an Biomasse signifikant höher
3. Ergebnisse 60
(10,76 mg Trockengewicht). Mit Konzentrationen von 1 und 5 mM Ammonium lag die
Menge an produzierter Biomasse (9,43 bzw. 9,27 mg) nur unwesentlich höher als in
der Kontrolle. Bei einer Konzentration von 10 mM war dagegen eine Abnahme der
Biomasse (8,58 mg) im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten.
Die insgesamt größte Produktion an Biomasse konnte mit Natriumnitrit als einziger
Stickstoffquelle nachgewiesen werden. Bei einer Konzentration von 1 mM Nitrit
wurde die meiste Biomasse (11,89 mg Trockengewicht) gebildet. Eine gesteigerte
Biomasseproduktion (10,71 mg) konnte bei einer Konzentration von 2,5 mM Nitrit
dokumentiert werden. Mit Konzentrationen von 5 und 10 mM Nitrit war eine
signifikante Abnahme an Biomasse (7,65 bzw. 6,74 mg) zu beobachten.
3.4.7 Fähigkeit zur Stickstofffixierung
Die Auswertung des Acetylen-Reduktions-Tests erfolgte durch die Detektion des
gebildetem Ethen mittels Gaschromatograph (siehe Kapitel 2.4.7). Dabei konnte in
keiner Probe die Reduktion von Acetylen zu Ethen dokumentiert werden. Folglich hat
bei Stamm Flo1keine Stickstofffixierung stattgefunden.
3.5 Auswertung der molekularbiologischen Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105
3.5.1 DNA-Extraktion
Die extrahierten und in TE-Puffer resuspendierte DNAs (siehe Kap. 2.5.1) der
Stämme Flo1 und PCC 7105 wurden bei 4 °C im Dunkeln gelagert und für die PCR-
Reaktionen eingesetzt. Als Positivkontrolle der DNA-Extraktion erfolgte eine
Auftrennung im Agarose-Gel (siehe Kap. 2.5.2.2) (Gel-Bild nicht gezeigt).
3. Ergebnisse 61
3.5.2 Amplifikation der 16S rDNA
Die ermittelten 16S rDNA Sequenzen der Stämme Flo1 (1372 bp) und PCC 7105
(1378 bp) sind im Anhang dargestellt (Tab. 44 und 45). Ein Vergleich der ermittelten
Sequenz von Stamm Flo1 mit Sequenzen einer öffentlichen Datenbank (NCBI)
mittels BLAST ergab die in Tabelle 28 dargestellten Übereinstimmungen.
Tab. 28: Vergleich der 16S rDNA Sequenz verschiedener Geitlerinema Stämme aus der NCBI-Datenbank mit der von Stamm Flo1. Angegeben sind die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare (bp) mit Stamm Flo1 sowie die Accession-Nummern der Stämme n.d: nicht durchgeführt
AF132791.1
1461 1332/1372
Geitlerinema sp. PCC 7105 Geitlerinema sp. BBD P2b-1Geitlerinema sp. BBD HS217Geitlerinema sp. BBD HS223
EF372580.1
EF110974.1
DQ680351.1
EF154084.1
Stamm Länge der Sequenz [bp] Identität [bp] Identität [%] Accession-Nr.
1409 1363/1369 99,56% AF132780.1
97,08%
1419 1330/1372 96,94%
1439 1330/1372 96,94%
Geitlerinema sp. W-1
Gloeobacter violaceus PCC 8105
1396 1322/1362 97,06%
1407 n.d n.d
Stamm Flo1 zeigt eine Übereinstimmung in der 16S rDNA Sequenz von 99,56% mit
Geitlerinema sp. Stamm PCC 7105, welcher in der vorliegenden Arbeit als
Referenzstamm eingesetzt wurde (siehe Kap. 2.1). Bei dem als „Outgroup“
verwendeten Stamm Gloeobacter violaceus konnte in der NCBI-Datenbank kein
Vergleich durchgeführt werden, so dass die Übereinstimmungen der Basenpaare
nicht angegeben werden konnte.
Ein Vergleich der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Sequenz von Stamm PCC
7105 mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz von Geitlerinema sp. PCC
7105 zeigte eine Übereinstimung von 99,93% (Daten nicht gezeigt).
3. Ergebnisse 62
3.5.3 Amplifikation des Gens gyrB
Die ermittelten Sequenzen des Gens gyrB der Stämme Flo1 (1150 bp) und PCC
7105 (1181 bp) sind im Anhang (Tab. 46 und 47) dargestellt. Ein Vergleich der
ermittelten Sequenzen der Stämme Flo1 und PCC 7105 mit Sequenzen in den
öffentlichen Datenbanken NCBI und ICB ergab die in Tabelle 29 dargestellten
Übereinstimmungen.
Tab. 29: Vergleich der gyrB Sequenz von Stamm Flo1 mit Sequenzen der NCBI- und ICB-Datenbank. Angegeben sind die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare (bp) mit Stamm Flo1 sowie die Accession-Nummern der Stämme n.d: nicht durchgeführt
AB014989.1 *2
Pleurocapsa sp. PCC 7327 1173 795/1111 71,56% AB074784.1 *2
Microcystis wesenbergii 1144 813/1137 71,50%
n.d. gy00448 *1
AB074779.1 *2
Chroococcidiopsis sp. PCC 7431 1188 829/1144 72,47% AB074786.1 *2
73,11%Oscillatoria sp. PCC 7112
Anabaena variabilis 1439 n.d.
AB096723.1 *2 Nostoc entophytum 1188 810/1137 71,24%
1188 813/1112
Gloeobacter violaceus n.d. gy00454 *1
Nostoc punctiforme 1419 n.d. n.d.
1461 n.d.
gy00447 *1
Accession-Nr./ ICB-Nr.
Synechococcus elongatus
Stamm Länge der Sequenz [bp] Identität [bp] Identität [%]
n.d. gy00453 *11409 n.d.
*1: Accession-Nr. aus der ICB-Datenbank *2: Accession-Nr. aus der NCBI-Datenbank
Die größte Übereinstimmung der Sequenz von Stamm Flo1 mit den Sequenzen der
NCBI-Datenbank lag bei 73,11%.
Ein Vergleich zwischen den Sequenzen der Stämme Flo1 und PCC 7105 und den in
der ICB-Datenbank hinterlegten Sequenzen des Gens gyrB ist in der ICB-Datenbank
nicht möglich. Daher sind keine detaillierten Aussagen über die Identität der Basen
möglich. Die längeren Sequenzen (ca. 1400 bp) der Stämme aus der ICB-Datenbank
sind auf einen (klonierten) Zusammenschluss der Sequenzen der Gene gyrB (~1,23
kb) und rpoC1 (~230 bp) zurückzuführen.
3. Ergebnisse 63
3.5.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen
Die Darstellung der phylogenetischen Stammbäume auf Basis der Sequenz der 16S
rDNA (Abb. 14) und des Gens gyrB (Abb. 15) erfolgte nach der UPGMA-Distanz-
Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) (siehe Kap. 2.5.2.4). Die als
Vergleich durchgeführten Methoden „Neighbor-Joining“, „Minimum Evolution“ und
„Maximum Parsimony“ ergaben ähnliche phylogenetische Verwandtschaften (Daten
nicht gezeigt).
Geitlerinema sp. BBD P2b-1
Geitlerinema sp. W-1
Geitlerinema sp. BBD HS217
Geitlerinema sp. BBD HS223
Stamm PCC 7105
Stamm Flo1
Gloeobacter violaceus PCC 8105
8249
100
100
0.000.010.020.030.040.050.06 Abb. 14: Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der 16S rDNA-Sequenz nach der UPGMA-Distanz-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) zur Berechnung der evolutiven Distanzen. An den Knotenpunkten sind die Bootstrap-Werte (in Prozent) dargestellt. Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid
Abbildung 14 zeigt die Verwandtschaftsbeziehungen der Stämme Flo1 und PCC
7105 auf Basis der 16S rDNA-Sequenz. Der Referenzstamm PCC 7105 zeigt eine
enge Verwandtschaft zu Stamm Flo1, beide Stämme sind als Cluster deutlich von
den anderen Stämmen der Gattung Geitlerinema abgegrenzt.
Der als „Outgroup“ verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105 ist deutlich
von den anderen Clustern abgegrenzt.
3. Ergebnisse 64
Nostoc punctiforme PCC 73102
Nostoc entophytum
Anabaena variabilis ATCC 29413
Chroococcidiopsis sp. PCC 7431
Oscillatoria sp. PCC 7112
Microcystis wesenbergii
Pleurocapsa sp. PCC 7327
Stamm Flo1
Stamm PCC 7105
Synechococcus elongatus PCC 7942
Gloeobacter violaceus PCC 7421
100
8997
53
87
94
100100
0.000.050.100.150.200.25 Abb. 15: Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der Sequenz des Gens gyrB nach der UPGMA-Distanz-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) zur Berechnung der evolutiven Distanzen. An den Knotenpunkten sind die Bootstrap-Werte (in Prozent) dargestellt. Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid
Abbildung 15 zeigt die Verwandtschaftsbeziehungen der Stämme Flo1 und PCC
7105 auf Basis der Sequenz des Gens gyrB. Beide Versuchsorganismen bilden ein
deutlich zu den Referenzstämmen abgegrenztes Cluster. Der als „Outgroup“
verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105 ist deutlich von den anderen
Clustern abgegrenzt.
Hohe Bootstrap-Werte in beiden Stammbäumen zeigen eine hohe statistische
Absicherung der Ergebnisse.
3. Ergebnisse 65
3.5.5 Random Amplified Polymorphism DNA-Analyse (RAPD)
Eine RAPD wurde mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105 im Doppelansatz mit
unverdünnter und 1:10 in TE-Puffer verdünnter DNA durchgeführt (siehe Kap. 2.5.3).
Das Gel-Bild ist in Abbildung 16A dargestellt. Zusätzlich wurde das spezifische
Bandenmuster in Abbildung 16B digitalisiert dargestellt.
Abb. 16: Gelbild (16A) und digitalisiertes Bandenmuster (16B) der RAPD mit den Stämmen Flo1 (Proben 2 und 4) und PCC 7105 (Proben 3 und 5). Eingesetzt wurden der Marker (DNA-Ladder-Mix; Gene-Ruler: Probe 1) sowie unverdünnte DNA (Proben 2 und 3) und 1:10 verdünnte DNA (Proben 4 und 5).
Abbildung 16A zeigt das Gel-Bild der RAPD. Sowohl in den Proben mit unverdünnter
als auch verdünnter DNA entstanden fast identische Bandenmuster. Die
Bandenmuster der Stämme Flo1 und PCC 7105 wiesen dabei hohe Ähnlichkeiten
auf und zeigten nur im höhermolekularen Bereich von 4000 bis 10000 bp signifikante
Unterschiede. Anhand des Gel-Bildes wurden die Banden und ihre relative Lage
zueinander in digitalisierter Form dargestellt (Abb. 16B). Mit Hilfe der digitalisierten
Bandenmuster wurde ein Consensusbandenmuster erstellt, d.h. es wurden nur
Banden berücksichtigt, die bei beiden Stämmen nachgewiesen werden konnten.
Diese wurden als spezifische Bandenmuster der RAPD Zusammenfassend in
16A 16B 1 2 3 4 5
1500 bp
800 bp
500 bp
300 bp
4000 bp
10000 bp
Probe: Probe: 1 2 3 4 5
3. Ergebnisse 66
Tabelle 30 in Relation zum Marker dargestellt. Zusätzlich wurden die Unterschiede
im Bandenmuster zwischen den Stämmen Flo1 und PCC 7105 aufgezeigt.
Tab. 30: Dokumentation der RAPD-Consensusbanden und von Einzelbanden der Stämme Flo1 und PCC 7105 in relativer Lage zum Marker (DNA-Ladder-Mix)
nur Flo1 nur PCC 7105
Marker mit bp-Angaben Consensusbanden Einzelbanden
In Tabelle 30 ist eine große Homologie zwischen den Bandenmustern der Stämme
Flo1 und PCC 7105 zu erkennen. 16 Banden im Bereich von ~200 bis 3000 bp
konnten in beiden Stämmen dokumentiert werden. Zusätzlich zeigte das Gel-Bild von
Stamm Flo1 fünf Banden, die im „Fingerprint“ von Stamm PCC 7105 nicht
nachgewiesen werden konnten. Drei dieser Banden lagen im höhermolekularen
Bereich von <5000 bp, außerdem je eine Bande bei ~1500 bzw. bei ~750 bp. Bei
Stamm PCC 7105 konnte dagegen nur eine zusätzliche Bande (~1500 bp)
dokumentiert werden.
2000
2500
4000 6000
10000
1031 1500
900 800 700
600
500
300
400
3. Ergebnisse 67
3.5.6 Amplified rDNA Restriction Analysis-Analyse (ARDRA)
Die Auswertung der ARDRA erfolgte auf zwei separaten Agarose-Gelen durch
Auftrennung der Fragmente nach sequenzspezifischem Restriktionsverdau mit
sieben unterschiedlichen Enzymen (siehe Kap. 2.5.4). Anhand der entstandenen
Banden (Abb. 17A und 18A) sollte ein digitalisiertes, spezifisches Bandenmuster
(Abb. 17B und 18B) für einen Vergleich der Stämme Flo1 und PCC 7105 erstellt
werden (Tab. 31).
Abb. 17: Gel-Bild (17A) und digitalisiertes Bandenmuster (17B) der ARDRA von Stamm Flo1 nach Restriktionsverdau und Auftrennung der Fragmente im Agarose-Gel Probe 1: Marker (100bp DNA- Marker) Probe 2: Alu I Probe 3: Msp I Probe 4: Rsa I
Probe 5: BsuR I (Hae III) Probe 6: Hinf I Probe 7: Hha I Probe 8: Sau96 I
17A 17B 3000 bp
1000 bp
500 bp
200 bp
Probe: 1 2 3 4 5 6 7 8
Probe: 1 2 3 4 5 6 7 8
3. Ergebnisse 68
Abb. 18: Gel-Bild (18A) und digitalisiertes Bandenmuster (18B) der ARDRA von Stamm Flo1 nach Restriktionsverdau und Auftrennung der Fragmente im Agarose-Gel Probe 1: Marker (100bp DNA- Marker), Probe 2: Alu I Probe 3: Msp I Probe 4: Rsa I
Probe 5: BsuR I (Hae III) Probe 6: Hinf I Probe 7: Hha I Probe 8: Sau96 I
Die Abbildungen 17 und 18 zeigen die entstandenen Bandenmuster der Stämme
Flo1 und PCC 7105 nach Restriktionsverdau durch sieben verschiedene
Restriktionsenzyme. Für Stamm Flo1 konnten im Bereich von ~200 bp bis ~700 bp
drei bis sechs Banden dokumentiert werden. Für Stamm PCC 7105 konnten nur drei
bzw. vier Banden dokumentiert werden, Banden unter 200 bp konnten nicht
detektiert werden. Ein Vergleich der digitalisierten Bandenmuster der Stämme Flo1
und PCC 7105 erfolgt in Tabelle 33.
18B 18A
Probe: Probe:
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 3000 bp
1000 bp
500 bp
200 bp
3. Ergebnisse 69
Tab. 31: Vergleich der digitalisierten Bandenmuster der ARDRA der Stämme Flo1 und PCC 7105. Zur Größenbestimmung der Fragmente wurde auch das entstandene Bandenmuster des Markers digitalisiert. Gestrichelte Banden konnten nicht auf dem Gel detektiert werden (siehe Text)
Alu I Msp I Rsa I Sau96 I
PCC 7105 Flo1 PCC
7105 Flo1
BsuR I (Hea III) Hinf I Hha I
Flo1
Restriktions-enzym
Flo1 PCC 7105
PCC 7105
PCC 7105 Flo1 PCC
7105 Flo1Flo1 PCC 7105
StammMarker
700 600 500
400
300
200
3. Ergebnisse 70
Ein Vergleich der digitalisierten Bandenmuster zeigt große Ähnlichkeiten zwischen
den Stämmen Flo1 und PCC 7105. In beiden Ansätzen konnten keine Fragmente im
Bereich von ~3000 bis ~700 bp nachgewiesen werden (siehe Abb. 17A und 18A). Im
niedermolekularen Bereich konnten, abhängig von den verwendeten Enzymen drei
bis sechs Fragmente nachgewiesen werden. Auf dem Gel-Bild für Stamm PCC 7105
konnten keine Fragmente kleiner als 300 bp nachgewiesen werden. Diese kleineren
Fragmente wurden möglicherweise aufgrund einer zu langen Laufzeit aus dem Gel
gezogen und wurden deshalb in der vergleichenden Digitalisierung gestrichelt
dargestellt.
3.5.7 Real-Time-PCR-Analyse
Die Auswertung der RT-PCR zum spezifischen Nachweis des Gens mcyA von
Stamm Flo1 (siehe Kap. 2.5.5) umfasste die Darstellung der Fluoreszenz-Emission
nach jedem Zyklus (Abb. 19) sowie eine Schmelzkurve der entstandenen Amplifikate
zur Differenzierung der Produkte (Abb. 20). Als Positivkontrolle wurde DNA der
Microcystis Stämme PCC 7806 und PCC 7941 eingesetzt. Die Detektion der
Fluoreszenz erfolgte jeweils nach der Polymerisation.
Abb. 19: Dokumentation der Fluoreszenz-Emission während der RT-PCR über 50 Zyklen. Eingesetzt wurden die Stämme PCC 7806 (orange) und PCC 7941 (grün) als Positivkontrollen sowie die DNA von Stamm Flo1 (gelb) und eine Negativkontrolle ohne DNA (braun)
3. Ergebnisse 71
Abbildung 19 zeigt die jeweilige Fluoreszenz-Emission bei den Cyanobakterien-
Stämme PCC 7806, PCC 7941 und Flo1 sowie der Negativkontrolle. Der Begin der
Amplifikation erfolgte nach unterschiedlicher Zyklenzahl zwischen Zyklus 15 und 35.
Bei allen Proben, einschließlich der Negativkontrolle, konnte eine Fluoreszenz-
Emission mit sigmoidem Kurvenverlauf dokumentiert werden. Eine Analyse der
Produkte durch Erstellung einer Schmelzkurve sollte Aufschluss über die
amplifizierten Produkte geben (Abb. 20).
Abb. 20: Dokumentation der Schmelzkurven und Schmelzpunkte (rote Linien) der PCR-Produkte (siehe Kap. 3.5.7) im Bereich von 60 bis 90 °C. Eingesetzt wurden die PCR-Produkte der Stämme PCC 7806 (orange), PCC 7941 (grün) und von Stamm Flo1 (gelb) sowie der Negativkontrolle (braun) Abbildung 20 zeigt die Schmelzkurven der mittels RT-PCR amplifizierten PCR-
Produkte. Deutlich zu erkennen sind die unterschiedlichen Schmelzpunkte der
Positivkontrollen (orange und grün) im Gegensatz zu den Amplifikaten von Stamm
Flo1 (gelb) und der Negativkontrolle (braun). Dabei lagen die Schmelzpunkte von
Stamm Flo1 und der Negativkontrolle mit 82,70 ± 0,11 °C (A) signifikant niedriger als
Schmelzpunkte der Stämme PCC 7806 und 7941, die Werte von 85,93 ± 0,09 °C (B)
aufwiesen.
A B
3. Ergebnisse 72
3.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes
Die Ermittlung des G+C-Gehaltes (siehe Kap. 2.6) erfolgte mittels 5fach-Bestimmung
(Tab. 32) durch Erstellung von Schmelzkurven im Bereich von 60-90°C (Daten nicht
gezeigt). Die Berechnung des G+C-Gehaltes der DNA von Stamm Flo1 wurde auf
Basis der ermittelten Schmelztemperatur des Referenzstammes E.coli nach MARMUR
und DOTY (1961) wie folgt berechnet :
mol% G+C Probe = ([TM Probe + (90,5 –TM E.coli)] –69,3)/0,41
Zusätzlich wurden zur Darstellung der Reinheit der eingesetzten DNA die Absorption
(A) bei den Wellenlängen 234, 260 und 280 nm gemessen und die Quotienten
234/260 nm und 260/280 nm gebildet.
Tab. 32: Schmelztemperaturen (TM) der DNA der Stämme Flo1 und E.coli und berechneter G+C-Gehalt von Stamm Flo1 sowie Absorptions-Quotienten zur Reinheitsbestimmung der DNA
1 76,9 0,35 3,29 77,5 0,53 1,87 50,22 76,9 0,74 1,78 77,9 0,48 1,89 49,33 77,9 2,02 1,33 77,4 0,63 1,82 52,94 76,5 0,81 1,73 78,3 0,71 1,88 47,35 75,8 0,96 1,91 77,8 0,54 2,05 46,8
Messung Ratio 260/280 nm
TM E.coli [°C]
Flo1 G+C- Gehalt [mol%]
TM Flo1 [°C]
Ratio 234/260 nm
Ratio 260/280 nm
Ratio 234/260 nm
Die Bestimmung der Schmelztemperatur ergab im arithmetischen Mittel einen
Schmelzpunkt der DNA von 76,8 ± 0,7 °C (Stamm Flo1) bzw. 77,8 ± 0,3 °C (E.coli).
Die Berechnung des Mittelwertes der ermittelten G+C-Gehalte ergab einen G+C-
Gehalt der DNA für Stamm Flo1 von 49,2 ± 2,2 mol%.
Die Berechnung der Quotienten wies für Stamm Flo1 große Schwankungen
zwischen 0,35 bis 2,02 (234/260 nm) und 1,33 bis 3,29 (260/280 nm) auf. Beim
Referenzstamm E.coli waren nur sehr geringe Schwankungen von 0,53 bis 0,71 für
A234/260 nm bzw. 1,82 bis 2,05 für A260/280 nm zu beobachten.
3. Ergebnisse 73
3.7 Analyse des Fettsäuremusters
Zur Analyse des Fettsäureprofils von Stamm Flo1 wurden Kulturen untersucht, die
bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (1 und 20 µE m-2 s-1 PAR) gehältert
wurden (siehe Kap. 2.7). Zusätzlich zur Bestimmung der qualitativen
Zusammensetzung (Abb. 21) wurde auch der prozentuale Anteil an gesättigten und
ungesättigten Fettsäuren dokumentiert (Abb. 22). Eine detaillierte Darstellung der
ermittelten Retentionszeiten der Fettsäuren, deren relative Verteilung (area counts)
sowie die Summenformeln der identifizierten Fettsäuren ist im Anhang dargestellt
(Tab. 48 und 49).
39%
1%
28%
7%4%
21%
n.i14-Methylpentadecanoat-Methylestercis-9-Hexadecenoat-MethylesterHexadecanoat-Methylestercis-9-Octadecenoat-Methylestertrans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester
47%
25%
5%
13%
10%
n.i.cis-9-Hexadecenoat-MethylesterHexadecanoat-Methylestercis-9-Octadecenoat-Methylestertrans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester
Abb. 21: Qualitative Bestimmung des Fettsäuren von Stamm Flo1 nach Wachstum für 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR (21A) und 20 µE m-2 s-1 PAR (21B) und deren prozentualer Verteilung n.i.: nicht identifizierte Fettsäuren Wie in Abbildung 21A ersichtlich, konnten bei Stamm Flo1 nach Wachstum mit einer
PFD von 1 µ E m-2 s-1 PAR fünf unterschiedliche Fettsäuren genau detektiert werden.
Den größten Anteil hatten dabei die C16-Fettsäuren Hexadecanoat-Methylester
(28%) und cis-9-Hexadecenoat-Methylester (21%). Außerdem konnten die C18-
Fettsäuren cis-9-Octadecenoat-Methylester (7%) und trans-9- + cis-11-
Octadecenoat-Methylester (4%) sowie die C15-Fettsäure 14-Methylpentadecanoat-
Methylester (1%) nachgewiesen werden. 39% der detektierten Fettsäuren konnten
mittels Standard-Gemisch (FAME-Mix) nicht identifiziert werden.
Nach Wachstum mit einer PFD von 20 µ E m-2 s-1 PAR konnten 4 unterschiedliche
Fettsäuren detektiert werden. Den größten Anteil an Fettsäuren hatte dabei
Hexadecanoat-Methylester (25%). Außerdem konnten die Fettsäuren cis-9-
21A 21B
3. Ergebnisse 74
Hexadecenoat-Methylester (13%), cis-9-Octadecenoat-Methylester (5%) und trans-9-
+ cis-11-Octadecenoat-Methylester (10%) nachgewiesen werden. 47% der
Fettsäuren konnten mittels Standard-Gemisch nicht identifiziert werden.
Ein Vergleich der Verteilung von gesättigten Fettsäuren (14-Methylpentadecanoat-
Methylester und Hexadecanoat-Methylester) und ungesättigten Fettsäuren (cis-9-
Hexadecenoat-Methylester, cis-9-Octadecenoat-Methylester und trans-9- + cis-11-
Octadecenoat-Methylester) ist in Abbildung 22 dargestellt.
48,2%51,8%
Anteil gesättigter FettsäurenAnteil ungesättigter Fettsäuren
47,2%52,8%
Anteil gesättigter FettsäurenAnteil ungesättigter Fettsäuren
Abb. 22: Darstellung der Anteile an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren von Stamm Flo1 nach Wachstum bei unterschiedlichen PFDs von 1 µE m-2 s-1 PAR (22A) bzw. 20 µE m-2 s-1 PAR (22B). Abbildung 22A zeigt den Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren bei
Stamm Flo1 nach Wachstum bei 1 µE m-2 s-1 PAR. Der Anteil an ungesättigten
Fettsäuren lag mit 51,8% nur minimal über dem Anteil an gesättigten Fettsäuren
(48,2%). Auch nach Wachstum bei einer PFD von 20 µE m-2 s-1 PAR (Abb. 22B) lag
der Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit 52,8% nur minimal über dem Anteil an
gesättigten Fettsäuren (47,2%). Ein Vergleich der prozentualen Verteilung der
Fettsäuren nach Wachstum bei PFDs von 1 bzw. 20 µE m-2 s-1 zeigte keine
signifikanten Unterscheide.
22A 22B
3. Ergebnisse 75
3.8 Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente
Die Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente umfasste sowohl den qualitativen
als auch den quantitativen Nachweis der Carotinoide, des Chlorophylls a sowie der
Phycobiliproteine. Dabei wurden Kulturen verwendet, die über einen Zeitraum von 3
Monaten an die jeweiligen PFDs adaptiert worden waren (siehe Kap. 2.8.1.1).
3.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden
Nach photometrischer Bestimmung der Absorptionen bei 461 nm und 665 nm
erfolgte die Berechnung der Chlorophyll a- und Carotinoid-Gehalte (siehe Kap.
2.8.1.2). Eine detaillierte Darstellung der ermittelten Messergebnisse ist im Anhang
dargestellt (Tab. 50). Als Bezugsgröße wurde die ermittelte Carotinoid-Konzentration
auf die Menge an Chlorophyll a bezogen und durch Berechnung als
Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten dargestellt.
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
Car
otin
oid/
Chl
orop
hyll
a-Q
uotie
nt
1 5 10 15 20
Photonenflussdichte [µE m-2 s-1 PAR]
Abb. 23: Quotienten aus Carotinoid- und Chlorophyll a-Gehalten der Proben (Mittelwerte der Doppelbestimmung) nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlich hohen PFDs
Der Carotinoid/Chlorophyll a-Quotient zeigte eine Korrelation zwischen Photonen-
flussdichte und Menge an synthetisierten Pigmenten (Abb. 23). Mit steigender
Photonenflussdichte war eine stetige Zunahme des Quotienten zu beobachten. Eine
verstärkte Zunahme des Quotienten fand nach Wachstum bei PFDs von 15 und 20
µE m-2 s-1 PAR statt. Während die Quotienten nach Wachstum bei Lichtintensitäten
3. Ergebnisse 76
von 1 bis 10 µE m-2 s-1 PAR zwischen 0,32 und 0,44 lagen, war der Quotient nach
Wachstum bei einer Lichtintensität von 15 µE m-2 s-1 PAR im Vergleich zum Wert bei
1 µE m-2 s-1 PAR etwa doppelt so hoch.
Die qualitative Zusammensetzung an Carotinoiden wurde mittels Reverse Phase
HPLC ermittelt (siehe nachfolgendes Kapitel).
3.8.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung
Nach Injektion der Extrakte und Separation der Pigmente mittels HPLC wurden die
Retentionszeiten mittels DAD und UV/Vis detektiert (siehe Kap. 2.8.2). In allen
Extrakten konnten vier unterschiedliche Pigmente mit verschiedenen
Retentionszeiten von durchschnittlich 3,2; 6,9; 16,8 und 20,0 min detektiert und
deren Absorptionsspektren (Abb. 24) ermittelt werden, anhand derer die
Absorptionsmaxima und Schultern der Peaks zur Identifikation der Pigmente ermittelt
wurden.
Abb. 24: Absorptionsspektren der Pigmente von Stamm Flo1. Die Detektion erfolgte mittels DAD
24A 24B
24C 24D
3. Ergebnisse 77
Die Auswertung der Absorptionsmaxima ergab bei den unterschiedlichen Pigmenten
die in Tabelle 33 dargestellten Peaks bzw. Schultern.
Tab. 33: Zusammenfassung der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der detektierten Pigmente in den Extrakten nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs über einen Zeitraum von insgesamt 3 Monaten mit korrespondierenden Literaturdaten bzw. käuflich erworbener Standards. In Klammern sind Schultern der Peaks dargestellt
3,38 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,07 (446), 458, 487 Zeaxanthin Roche16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,10 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche2,94 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel6,50 (446), 458, 479 Zeaxanthin Roche16,37 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,62 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche3,29 (452), 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,07 (446), 465, 487 Zeaxanthin Roche16,81 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,97 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche3,38 (452), 487, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,20 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche17,03 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,19 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche3,25 (452), 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel6,89 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche16,72 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,93 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche
10
15
20
PFD [µE m-2 s-1 PAR]
1
zugeordnetes Pigment Quelle
5
Retentionszeit DAD [min]
detektierte Absorptionsmax. [nm]
Durch einen Vergleich der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der
detektierten Pigmente mit Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) und
käuflich erworbener Standards (Roche; Sigma-Aldrich) konnten die Carotinoide
identifiziert werden. In allen Extrakten konnten die Pigmente Myxoxanthophyll,
Zeaxanthin, ß-Carotin und Chlorophyll a identifiziert werden. Eine Auswertung der
relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten Peakflächen (area
counts, Daten nicht gezeigt).
Zur graphischen Darstellung wurde der Quotient aus dem jeweiligem Carotinoid und
Chlorophyll a gebildet (Abb. 25).
3. Ergebnisse 78
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
Car
otin
oid/
Chl
orop
hyll
a-Q
uotie
nt
1 5 10 15 20
Photonenflussdichte [µE m-2 s-1 PAR]
Myxoxanthophyll Zeaxanthin ß-Carotin
Abb. 25: Darstellung der Quotienten aus den relativen Anteilen der Carotinoide Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin zu Chlorophyll a auf Basis der mittels HPLC ermittelten integrierten Peakflächen. Untersucht wurden Extrakte aus Kulturen von Stamm Flo1, die bei unterschiedlichen PFDs für insgesamt 3 Monate gehältert wurden Der Myxoxanthophyll- bzw. Zeaxanthin/Chlorophyll a-Quotient zeigte eine Korrelation
zwischen Photonenflussdichte und Menge an synthetisiertem Carotinoid (Abb. 25).
Mit steigender Photonenflussdichte war auch eine stetige Zunahme im Carotinoid-
Gehalte im Verhältnis zum Chlorophyll a-Gehalt zu beobachten.
Der ß-Carotin/Chlorophyll a-Quotient zeigte tendenziell ebenfalls eine Korrelation
zwischen Photonenflussdichte und Menge an synthetisiertem Carotinoid. Dabei
wurde der höchste Wert jedoch bei einer PFD von 15 µE m-2 s-1 PAR nachgewiesen.
Wie die Verteilung der Carotinoide zeigt, bildet ß-Carotin den Hauptbestanteil an der
Gesamtmenge der Carotinoide. Außerdem lag der Anteil an Zeaxanthin höher als der
von Myxoxanthophyll.
3. Ergebnisse 79
3.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine
Die Bestimmung der Phycobiliproteine (siehe Kap. 2.8.3) erfolgte durch
photometrische Messung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen und
Berechnung der Konzentrationen (Abb. 26). Eine detaillierte Darstellung der
Messergebnisse und Berechnung der Mittelwerte ist im Anhang (Tab. 51) dargestellt.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
Phyc
obili
prot
ein-
Geh
alt
[µg/
ml]
1 5 10 15 20
Photonenflussdichte [µE m-2 s-1 PAR]
PE PC AP Gesamt Phycobiliproteine
Abb. 26: Darstellung der Konzentrationen an Phycoerythrin (PE), Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (AP) der Proben nach Inkubation der Kulturen von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs für insgesamt 3 Monate sowie Gesamt-Menge an Phycobili-proteinen Abbildung 26 zeigt den Phycobiliprotein-Gehalt der Proben nach Inkubation der
Kulturen von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs. Dabei nahmen die Gesamt-
Menge an Phycobiliproteinen und die Konzentration des Phycocyanins (PC) mit
steigender PFD konstant ab. Die Konzentration der Phycobiliproteine Phycoerythrin
(PE) und Allophycocyanin (AP) nahmen sowohl zu als auch ab.
3. Ergebnisse 80
3.8.4 Ergebnisse zur Komplementären Chromatischen Adaptation
Der Nachweis zur Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1
erfolgte durch Bestimmung der Konzentrationen an Phycobiliproteinen nach
Inkubation bei wechselnden Lichtbedingungen (siehe Kap. 2.8.4). Zusätzlich erfolgte
ein qualitativer Nachweis der synthetisierten Carotinoide (siehe Kap. 2.8.2).
3.8.4.1 Nachweis der Phycobiliproteine nach Inkubation in Rot- bzw. Grünlicht
Die photometrische Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte an 3 Kulturen von
Stamm Flo1 (im Doppelansatz) zu Begin (t0) und im Abstand von 3 Wochen (t1 bis t3)
über eine Versuchsdauer von insgesamt 9 Wochen (Tab. 34). Eine detaillierte
Darstellung der Messergebnisse ist im Anhang (Tab. 52 bis 54) dargestellt.
Zur Darstellung bezüglich der Fähigkeit zur „Komplementären Chromatischen
Adaptation“ wurden aus den errechneten Mittelwerten die Quotienten PC/AP und
PE/AP nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechnet und dargestellt
(Abb. 27).
Tab. 34: Zusammenfassung der ermittelten Phycoerythrin- (PE), Phycocyanin- (PC) und Allophycocyanin-Konzentrationen (AP) sowie der Quotienten von PC/AP und PE/AP während des Versuchsablaufs zur Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1. Als Kontrolle diente Probe A
t0 Weißlicht 1,88 8,39 1,98 4,23 0,95t1 Weißlicht 4,67 27,22 4,45 6,12 1,05t2 Weißlicht 6,69 40,09 11,46 3,50 0,58t3 Weißlicht 6,04 38,47 10,09 3,81 0,60t0 Weißlicht 1,80 9,47 1,95 4,86 0,92t1 Rotlicht 4,38 26,90 5,60 4,80 0,78t2 Grünlicht 5,13 28,88 7,49 3,86 0,68t3 Rotlicht 8,18 50,35 13,13 3,83 0,62t0 Weißlicht 2,07 9,00 2,60 3,46 0,80t1 Grünlicht 3,16 14,73 3,86 3,82 0,82t2 Rotlicht 4,99 34,45 7,18 4,80 0,70t3 Grünlicht 5,35 34,92 7,29 4,79 0,73
PC [µg/ml]
AP [µg/ml] PC/AP PE/APProbe Messzeit-
punktexponiertes
LichtPE
[µg/ml]
A
B
C
3. Ergebnisse 81
Tabelle 34 zeigt die Konzentrationen an Phycobiliproteinen nach wechselnden
Lichtbedingungen (Proben B und C) zu verschiedenen Messzeitpunkten im Vergleich
zur Kontrolle (Probe A), die mittels Weißlicht inkubiert worden war. Die graphische
Darstellung der „Komplementären Chromatischen Adaptation“ erfolgte basierend auf
den ermittelten Quotienten aus PC/AP und PE/AP.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
PC/A
P- u
nd P
E/A
P-Q
uotie
nten
t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3Messzeitpunkt
PC/AP PC/APPE/AP PE/AP
Abb. 27: Entwicklung der PC/AP- und PE/AP-Quotienten bei wechselnden Lichtbedingungen in den der Proben (B und C) und der Kontrolle (A) in Kulturansätzen von Stamm Flo1. Gesamtversuchsdauer: 9 Wochen: t0= Begin; t1= nach 3 Wochen; t2= nach 6 Wochen; t3= nach 9 Wochen. Weitere Einzelheiten siehe Tabelle 34 Sowohl in den Ansätzen mit wechselnden Lichtbedingungen (B und C, siehe auch
Tab. 34) als auch im Kontrollansatz (A) konnten nur geringe, ungerichtete
Schwankungen der PC/AP- und PE/AP-Quotienten über die gesamte Messdauer
beobachten werden. In der Kontrolle (A) erfolgte nach einem Anstieg der Quotienten
(PC/AP und PE/AP) nach 3 Wochen (t1) ein direkter Rückgang (t2). Danach (t3) war
nur beim PC/AP-Quotienten ein erneuter Anstieg zu beobachten. Der PE/AP-
Quotient blieb dagegen konstant. Der Quotient aus PC/AP in Probe B zeigte nach
Inkubation sowohl unter Rotlicht (t1) als auch unter Grünlicht (t2) einen geringen
Rückgang beider Quotienten. Nach anschließender Inkubation unter erneuten
Rotlichtbedingungen (t3) blieben beide Quotienten konstant. In Probe C war nach
Inkubation mittels Grünlicht (t1) und Rotlicht (t2) jeweils ein geringer Anstieg des
PC/AP-Quotienten zu beobachten. Der Quotient aus PE/AP blieb über die gesamte
Probe A Probe B Probe C
3. Ergebnisse 82
Messdauer konstant. Eine weitere Inkubation unter Grünlichtbedingungen (t3) hatte
keinen Einfluss auf eine Verschiebung der Quotienten.
3.8.4.2 Qualitativer Nachweis der im Rot- bzw. Grünlicht synthetisierten Pigmente
Die Identifizierung der Carotinoide mittels HPLC erfolgte durch Ermittlung der
Retentionszeiten und Absorptionsmaxima bzw. Schultern der Peaks in den
Absorptionsspektren (siehe Kap. 2.8.2).
Tab. 36: Zusammenfassung der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der detektierten Pigmente in den Extrakten von Stamm Flo1 nach Wachstum über einen Zeitraum von insgesamt 3 Monaten bei Rot- bzw. Grünlicht mit korrespondierenden Literaturdaten bzw. käuflich erworbener Standards. In Klammern sind Schultern der Peaks
Rotlicht 3,38 (452), 479, 512 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,11 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche 16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,06 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche
Grünlicht 3,38 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,11 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche 16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,06 (424), 458, 480 ß-Carotin Roche
QuelleLichtbedingungen Retentionszeit DAD [min]
detektierte Absorptionsmax. [nm]
zugeordnetes Pigment
Durch einen Vergleich der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der
detektierten Pigmente mit Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) bzw.
käuflich erworbener Standards (Roche; Sigma-Aldrich) konnten die Carotinoide
Myxoxanthophyll, Zeaxanthin, ß-Carotin und Chlorophyll a identifiziert werden. Die
Auswertung der relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten
Peakflächen (area counts, Daten nicht gezeigt).
Zur graphischen Darstellung wurde jeweils der Quotient aus dem jeweiligem
Carotinoid und dem Chlorophyll a gebildet (Abb. 28).
3. Ergebnisse 83
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Car
otin
oid/
Chl
orop
hyll
a-
Quo
tient
Myxoxanthophyll Zeaxanthin ß-Carotin
Carotinoid
Rotlicht Grünlicht
Abb. 28: Quotient aus relativem Anteil der Carotinoide Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin zum Chlorophyll a auf Basis der mittels HPLC ermittelten integrierten Peakflächen. Untersucht wurden Extrakte aus Kulturen von Stamm Flo1, die bei Rot- bzw. Grünlicht über eine Dauer von insgesamt 3 Monaten gehältert wurden
Wie aus Abbildung 28 ersichtlich, war der Gehalt der drei Carotinoide bei Inkubation
unter Grünlichtbedingungen zweifach höher als unter Rotlichtbedingungen. In beiden
Ansätzen wurde Myxoxanthophyll in den geringsten Mengen nachgewiesen. Der
Anteil von Zeaxanthin lag etwa doppelt so hoch wie der Anteil von Myxoxanthophyll.
Der größte Quotient wurde in beiden Proben für ß-Carotin nachgewiesen, welches
etwa ⅔ der Menge an Carotinoiden ausmachte.
3. Ergebnisse 84
3.9 Ultrastruktur der Zelle von Stamm Flo1
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden bei 12.500 (Abb. 29) und
25.000facher (Abb. 30) Vergrößerung erstellt und ohne Nachbearbeitung
eingescannt (siehe Kap. 2.9). Eine Zuordnung und Identifizierung der
Zellbestandteile erfolgte mittels Literaturdaten (siehe Kap. 2.9.3).
Abb. 29: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle im Filament von Stamm Flo1 bei 12.500facher Vergrößerung. Mit Pfeilen markiert sind, die „Äußere Membran“ (AM), die Peptidoglykanschicht (PG) und die Cytoplasmamembran (CM), Einschnürungen zwischen den Zellen (E), Granula (GR), Thylakoid-Stapel (TS) mit Querverbindungen (QV) und ein Präparationsartefakt (PA) Abbildung 29 zeigt einen Querschnitt einer vegetativen Zelle von Stamm Flo1 bei
12.500facher Vergrößerung. Die „äußere Begrenzung“ der Zelle kann in Äußere
Membran (AM), Peptidoglykanschicht (PG) und Cytoplasmamembran (CM)
differenziert werden. Dunkel gefärbt sind die größtenteils randständigen Granula
(GR) zu erkennen. In regelmäßigen Abständen sind die Thylakoid-Stapel (TS) in
paralleler Anordnung zu erkennen. Zusätzlich sind die Quervernetzungen (QV) der
Thylakoide erkennbar.
Eine detaillierte Darstellung der „äußeren Begrenzung“ der Zelle und der Thylakoide
bei 25.000facher Vergrößerung ist in Abbildung 30 dokumentiert.
GR
AM
E
PG
PA
TS CM QV
3. Ergebnisse 85
Abb. 30: Elektronenmikroskopische Detail-Aufnahme der Zellwand und Thylakoide von Stamm Flo1 bei 25.000facher Vergrößerung. Mit Pfeilen markiert sind die Äußere Membran (AM), Peptidoglykanschicht (PG),Cytoplasmamembran (CM), Granula (GR) und Thylakoide (TS) mit Querverbindungen(QV)
Abbildung 30 zeigt einen Detail-Ausschnitt (siehe auch Abb. 29) einer vegetativen
Zelle von Stamm Flo1 im Querschnitt bei 25.000facher Vergrößerung. Mit Pfeilen
markiert ist die „äußere Begrenzung“ der Zelle bestehend aus Cytoplasmamembran
(CP), Peptidoglykanschicht (PG) und Äußerer Membran (AM) sowie unterschiedlich
große, dunkelschwarz gefärbte, vorwiegend randständige Granula (GR). In paralleler
Anordnung sind die Thylakoide (TS) mit ihren Querverbindungen (QV) dargestellt.
GR
CM PG AM
TS
QV
4. Diskussion 86
4. Diskussion
4.1 Hintergrund
Der in dieser Diplomarbeit charakterisierte Stamm Flo1 wurde bereits 1995 aus
einem Mangrovenwäldchen in Key Biscayne (Florida, USA) isoliert und in die
Cyanobakterien-Stammsammlung der Abt. Marine Mikrobiologie an der Universität
Bremen aufgenommen. In Untersuchungen zum Einfluss von Sulfid auf die
Photosyntheseleistung konnte gezeigt werden, dass Stamm Flo1 eine hohe Toleranz
gegenüber Sulfid aufweist und unter anaeroben Bedingungen in der Lage ist, dieses
zu oxidieren (RABENSTEIN 1997). Außerdem konnte bei Stamm Flo1 die Produktion
von extrazellulären Substanzen dokumentiert werden, die eine antimikrobielle
Wirkung gegen heterotrophe Bakterien und Cyanobakterien hatte und dabei u. a.
eine Zelllyse sowie teilweise eine Reduktion der Chlorophyll a- und Proteingehalte
bewirkte (HEYDUCK-SÖLLER und FISCHER 2000). In aktuellen Untersuchungen werden
diese extrazellulären Substanzen näher identifiziert und klassifiziert (CAICEDO et al.
2007).
Eine Klassifizierung von Stamm Flo1 erfolgte bisher ausschließlich auf Grundlage
morphologischer Merkmale nach GEITLER (1932). Dabei wurde Stamm Flo1 als
Oscillatoria limnetica klassifiziert (RABENSTEIN 1997). Die Klassifizierung nach
GEITLER (1932) erfolgte jedoch noch mit Hilfe des „Botanischen Codes“ (ICBN), da
eine Nomenklatur mittels „Bakteriellen Codes“ (ICNP) erst Ende der 70iger Jahre des
letzten Jahrhunderts eingeführt wurde (siehe auch Kap. 1.2.1).
Die große Problematik einer Klassifizierung ausschließlich auf Basis morphologischer
Merkmale ist, dass die morphologische Erscheinung eines Cyanobakteriums von den
Kultur- bzw. Umweltbedingungen beeinflusst wird (PREMANANDH 2006) und nur wenig
über die möglichen morphologischen Veränderungen der Zellen bekannt ist
(ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005). Auch ein Vergleich zwischen Cyanobakterien-
Isolaten kann zu fehlerhaften Einteilungen führen, da geschätzte 50% der
Cyanobakterien bisher falsch klassifiziert wurden (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988).
In dem neuesten Bestimmungsschlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005)
erfolgte zudem eine Überarbeitung der Klassifizierung unter Berücksichtigung neuer
Kriterien wie Zellgrößenverhältnis oder Anordnung der Thylakoide. So kam es z.B. zu
der Umordnung einiger Spezies (siehe auch Kap. 1.2.2) aus der Gattung Oscillatoria,
4. Diskussion 87
wie Oscillatoria limnetica, zur Gattung Geitlerinema (ANAGNOSTIDIS 1989). Generell
hat die Anzahl an Methoden zugenommen, die für eine Beschreibung eines
Cyanobakteriums berücksichtigt werden müssen (OREN und TINDALL 2005).
Stamm Flo1, der bisher auf rein morphologischer Basis als Oscillatoria limnetica
klassifiziert wurde (RABENSTEIN 1997), sollte nach dem neusten Bestimmungs-
schlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) klassifiziert werden.
Für die polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1 wurden morphologische,
physiologische und molekularbiologische Untersuchungen berücksichtigt.
4.2 Polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1
4.2.1 Morphologie
Die Ordnung Oscillatoriales (Sektion III, siehe auch Kap. 1.2.2) besteht
übereinstimmend nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) sowie CASTENHOLZ und
Mitarbeitern (2001) aus filamentösen Cyanobakterien, die ausschließlich durch
vegetative Zellen ohne Heterozysten oder Akineten charakterisiert sind. Auf
Gattungs-Ebene wird auf Grund der An- bzw. Abwesenheit einer Scheide sowie der
farblichen Erscheinung und der Größe der Zellen differenziert. Dabei wird je nach
Bestimmungsschlüssel zwischen sechs (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005) bzw. 17
Gattungen (CASTENHOLZ et al. 2001) unterschieden.
Die Gattung Geitlerinema ist nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001) sowie
ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) übereinstimmend durch gerade bis leicht
gebogene Filamente mit zylindrischen Zellen charakterisiert, die länger als breit sind.
Die Abgrenzung der Zellen im Filament erfolgt durch wenig ausgeprägte
Einschnürungen. Große Cyanophycin-Granula können an den Querwänden in
einigen Spezies nachgewiesen werden. Gas-Vesikel können nur selten dokumentiert
werden. Die Trichome weisen eine Motilität auf.
Zusätzlich weisen nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) die Filamente, die als
Matte oder in Büscheln auftreten, eine blaugrüne Färbung auf. Die Thylakoide sind
peripher und parallel zu den longitudinalen Zellwänden konzentrisch angeordnet.
Nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001) wird für Vertreter der Gattung
Geitlerinema ein G+C-Gehalt zwischen 53 und 67 mol% angegeben.
4. Diskussion 88
Die ermittelten morphologischen Merkmale von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.2.5)
stimmen mit den Kriterien der Gattung Geitlerinema nach CASTENHOLZ und
Mitarbeitern (2001) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) überein. Ein Vergleich
der morphologischen Merkmale von Stamm Flo1 mit dem Referenzstamm
Geitlerinema sp. PCC 7105 zeigte ein identisches morphologisches
Erscheinungsbild.
Anhand der erstellten TEM-Aufnahmen von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.9) konnten
zum einen konzentrische Thylakoide in peripherer und paralleler Anordnung zu den
longitudinalen Zellwänden nachgewiesen werden, zum anderen Granula, die in
Zellwandnähe ohne festgelegte Organisation angeordnet waren.
Zur Identifizierung der Granula von Stamm Flo1 wurde ein
elektronenmikroskopischer Vergleich mit TEM-Aufnahmen anderer Arbeiten
gemacht. Bei einem Vergleich der Granula-Struktur von Stamm Flo1 mit denen von
LIBERTON und Mitarbeitern (2006) beobachteten Strukturen könnte es sich um
Cyanophycin handeln. Die ebenfalls von den Autoren dargestellten Carboxysomen
weisen signifikant größere Ausmaße und eine wesentlich unregelmäßigere Form auf,
als die in der vorliegenden Arbeit dokumentierten Granula.
Aerotope oder Gas-Vesikel konnten nicht nachgewiesen werden (Details siehe
VENTER et al. 2003).
Auf Grund der Übereinstimmung in der Morphologie zwischen Stamm Flo1 und dem
Referenzstamm Geitlerinema sp. PCC 7105 sowie der Klassifizierung mittels
aktueller Bestimmungsliteratur kann Stamm Flo1 der Ordnung Oscillatoriales und der
Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Eine Zuordnung auf Spezies-Ebene wurde
in der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt.
Eine genauere Validierung dieser Klassifizierung sollte durch die Erstellung von
phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der Sequenzen der 16S rDNA und des
Gens gyrB erfolgen (siehe nachfolgende Kapitel).
4. Diskussion 89
4.2.2 Molekularbiologie
4.2.2.1 Sequenzanalyse der 16S rDNA und des Gens gyrB
Obwohl eine Klassifizierung auf Grundlage morphologischer Merkmale weitgehend
möglich ist, sind molekularbiologische Methoden ausschlaggebend für eine
taxonomische Klassifizierung. Als wichtigstes „Werkzeug“ dient die routinemäßig
verwendete Sequenzierung der 16S rDNA zur Erstellung von phylogenetischen
Stammbäumen. Diese genotypische Charakterisierung wird verwendet, um
Organismen auf Gattungs-Ebene zu unterscheiden (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK
2005). Die Artgrenze liegt bei Übereinstimmungen der Sequenzen bei ≥ 97% (WAYNE
et al. 1987). Eine Unterscheidung zweier nah verwandter Spezies auf Grund dieser
Sequenzierung ist jedoch noch nicht möglich (FOX et al. 1992). Um Aussagen über
Verwandtschaften auf Spezies-Ebene treffen zu können, muss zusätzlich zur 16S
rDNA Analyse eine DNA-DNA-Hybridisierung erfolgen (FOX et al. 1992). Dabei
werden Organismen mit einer DNA-Übereinstimmung von 70% oder mehr und einer
maximalen Abweichung der DNA-Schmelztemperatur von 5 °C als eine Art
bezeichnet (WAYNE et al. 1987).
Die Darstellung evolutiver Veränderungen ganzer Genome sollte nicht anhand eines
einzelnen Genes wie der 16S rDNA erfolgen. Taxonomische Marker wie protein-
codierende Gene können zusätzliche Informationen zur Erstellung von
phylogenetischen Stammbäumen liefern. Speziell Gene, die an Prozessen wie
Replikation, Transkription oder Translation beteiligt sind, können für diese Zwecke
verwendet werden (SEO und YOKOTA 2003). Dabei liegen die großen Vorteile
gegenüber der 16S rDNA-basierten Taxonomie in einem geringeren horizontalen
Gentransfer und der höheren molekularen Evolutionsrate. Die durchschnittliche Rate
für Basen-Substitutionen liegt bei Genen der 16S rDNA bei 1% pro 50 Millionen
Jahre, wobei Substitutionen im Gen gyrB mit 0,7-0,8% pro 1 Millionen Jahre
stattfinden (KASAI et al. 1998). Außerdem sind die Voraussetzungen, Konstanz unter
variierenden physiologischen Bedingungen und ubiquitäre Verbreitung unter
Bakterien, gegeben (SEO und YOKOTA 2003).
Die Sequenzen der Gene gyrB, rpoC1 und rpoD1 können daher als molekulare
Marker zur Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen von Mikroorganismen
genutzt werden (KASAI et al. 1998).
4. Diskussion 90
Das 1,23 kb lange Gen-Segment gyrB codiert die kleine Untereinheit der DNA-
Gyrase. Dieses Enzym ist allgemein zur Kontrolle der Superspiralisierung an
Prozessen der DNA-Replikation und der Translokation während der Transkription
beteiligt (DRLICA und ZHAO 1997). Die Gene rpoC1 (0,96 kb) und rpoD1 (0,63 kb)
codieren Untereinheiten der DNA-abhängigen RNA-Polymerase (SEO und YOKOTA
2003).
Ein Vergleich der Sequenzen dieser Gene innerhalb von Gattungen der
Cyanobakterien bzw. die Erstellung phylogenetischer Stammbäume ausschließlich
auf Basis der Gen-Sequenzen von gyrB, rpoC1 und rpoD1 ist allerdings aktuell
wegen der geringen Anzahl an in Datenbanken hinterlegten Sequenzen noch nicht
möglich.
In den auf 16S rDNA und gyrB basierenden phylogenetischen Stammbäumen bilden
die Stämme Flo1 und PCC 7105 ein von den anderen Organismen abgegrenztes
Cluster (siehe Kap. 3.5.4). Hohe Bootstrap-Werte zeigen die hohe statistische
Absicherung der UPGMA-Berechnungen. Zur weiteren Absicherung der erstellten
Verwandtschaftsbeziehungen wurden phylogenetische Stammbäume mit den
Methoden „Neighbor-Joining“, „Minimum Evolution“ und „Maximum Parsimony“
erstellt (Daten nicht angegeben), welche fast identische evolutive Verwandtschaften
zeigten.
Da die Übereinstimmung der 16S rDNA Sequenz von Stamm Flo1 von 99,56% mit
Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 über der Artgrenze von ≥ 97% liegt und eine
enge Verwandtschaft auf Grundlage der gyrB Sequenzen nachgewiesen werden
konnte, kann Stamm Flo1 definitiv der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Ob
es sich bei den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105 um identische Arten
handelt, kann nur durch eine DNA-DNA-Hybridisierung sichergestellt werden, die
noch durchgeführt werden sollte, was im Zeitrahmen der vorliegenden Diplomarbeit
nicht mehr möglich war.
4. Diskussion 91
4.2.2.3 Toxin-Nachweis mittels RT-PCR
RICHARDSON und Mitarbeiter (2007) sowie MYERS und Mitarbeiter (2007) konnten das
Cyanotoxin Microcystin in Mikrobenmatten nachweisen, die für das so genannte
„black band disease“ (BBD) verantwortlich gemacht werden. Diese charakteristisch
schwarz gefärbten, sulfidreichen Bänder „wandern“ durch Korallen-Kolonien und
führen zu deren Absterben. Als Hauptbestandteil dieser Mikrobenmatten konnten
filamentöse Cyanobakterien nachgewiesen werden. Speziell bei zwei isolierten
Kulturen, Geitlerinema sp. BBD und Leptolyngbya sp., konnte das Toxin
nachgewiesen werden. Da in der vorliegenden Arbeit bereits eine enge
Verwandtschaft zwischen Stamm Flo1 und verschiedenen Stämmen von
Geitlerinema sp. BBD dokumentiert werden konnte (siehe Kap. 3.5.3), wurde Stamm
Flo1 mittels RT-PCR auf genetischer Ebene auf das Toxin hin getestet. Dabei sollte
das Gen mcyA mittels RT-PCR amplifiziert und detektiert werden.
Zur Sicherstellung der Funktionalität der RT-PCR wurden als Positivkontrollen die
DNA der Microcystis Stämme PCC 7806 und PCC 7941 verwendet. Bei diesen
Stämmen konnte das Gen mcyA bereits nachgewiesen werden (NEILAN et al. 1999
und VAITOMAA et al. 2003). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte mittels „Standard-
PCR“ und den spezifischen Primern MSF und MSR-2R das Gen mcyA bei den
Microcystis Stämmen detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Sowohl bei den beiden zuvor genannten Microcystis Stämmen als auch in der
Negativkontrolle ohne DNA und bei Stamm Flo1 konnte in der RT-PCR eine
Fluoreszenz mit sigmoidem Kurvenverlauf detektiert werden (siehe Kap. 3.5.7).
Da zumindest in der Negativkontrolle kein mcyA-Amplifikat gebildet werden sollte,
wurde eine Schmelzkurve zum Vergleich der Schmelzpunkte der amplifizierten PCR-
Produkte erstellt. Dabei konnten jeweils für die Positivkontrollen als auch für die
Probe von Stamm Flo1 und der Negativkontrolle zwei unterschiedliche
Schmelzpunkte detektiert werden.
Obwohl ein sigmoider Kurvenverlauf während der RT-PCR bei Stamm Flo1
dokumentiert wurde, ist das Gen mcyA nicht amplifiziert worden. Die detektierte
Fluoreszenz bei Stamm Flo1 und der Negativkontrolle ist wahrscheinlich auf Primer-
Dimere zurückzuführen.
Im Gegensatz zu den nahverwandten Stämmen Geitlerinema sp. BBD ist Stamm
Flo1 auf Grund fehlender Gene nicht in der Lage, Microcystine zu synthetisieren.
4. Diskussion 92
4.2.3 G+C-Gehalt
Eine polyphasiche Beschreibung eines Cyanobakteriums umfasst auch die
konventionelle Bestimmung des G+C-Gehaltes. Der G+C-Gehalt der Ordnung
Oscillatoriales wird mit 40 bis 67mol% angegeben (MADIGAN et al. 2001). Innerhalb
der Gattung Geitlerinema liegt der G+C-Gehalt zwischen 53 und 67 mol%
(CASTENHOLZ et al. 2001). Auf Spezies-Ebene können die G+C-Gehalte bis maximal
5% variieren, auf Gattungs-Ebene sind Abweichungen bis zu 10% möglich
(SCHLEIFER UND STACKEBRANDT 1983). Der G+C-Gehalt von Stamm Geitlerinema sp.
PCC 7105, welcher in dieser Arbeit als Referenzstamm verwendet wurde, ist mit 53
mol% angegeben (RIPPKA und HERDMAN 1992).
Voraussetzung für die korrekte Ermittlung der Schmelztemperatur der DNA ist eine
von Proteinen aufgereinigte Nukleinsäure, was durch die Ermittlung des Quotienten
aus den Absorptionen 260/280 nm dargestellt wird. Dabei sind bei einem Quotienten
von 1,81 lediglich 40% der Probe auf Nukleinsäuren zurückzuführen, 60% entfallen
auf den Proteinanteil. Ein Anteil von 100% DNA wird durch einen Quotienten von
2,00 angezeigt (GLASEL 1995).
Die Ermittlung des G+C-Gehaltes für Stamm Flo1 ergab im arithmetischen Mittel
49,2 ± 2,2 mol% (siehe Kap. 3.6). Da die Differenz der G+C-Gehalte der Stämme
Flo1 und Geitlerinema sp. maximal in 6 mol% differiert, kann Stamm Flo1 auf Basis
der G+C-Gehalte der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Eine
Übereinstimmung auf Spezies-Ebene mit Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 ist
somit weder nachgewiesen noch ausgeschlossen.
Die vor der Erstellung einer Schmelzkurve erstellten Quotienten (260/280 nm) deuten
bei Stamm Flo1 auf Protein-Verunreinigungen der DNA hin. Die erstellten
Schmelzkurven der DNA von Stamm Flo1 zeigten nicht den typischen sigmoiden,
sondern tendenziell einen linearen Kurvenverlauf (Daten nicht gezeigt). Trotz linearer
Schmelzkurven konnten die Schmelzpunkte bestimmt und ausgewertet werden.
Die Verunreinigungen der DNA sind wahrscheinlich auf Rückstände von
exopolymeren Substanzen zurückzuführen, die während der Zelllyse an die DNA
gebunden haben. Zur Entfernung dieser Substanzen ist eine Modifikation des
Versuchsprotokolls erforderlich, was in dem zur Erstellung der vorliegenden
Diplomarbeit vorgegebenen Zeitrahmen nicht mehr möglich war. Deshalb wurden die
Schmelzpunkte in 5fach Bestimmung ermittelt und das arithmetische Mittel
4. Diskussion 93
berechnet. Die nur geringen Abweichungen in den Messwerten und die geringe
Standardabweichung zeigen die Korrektheit der ermittelten Werte.
4.2.4 Analyse des Fettsäuremusters
Eine Analyse des Fettsäureprofils kann als taxonomischer Marker bei der
Klassifizierung von Mikroorganismen dienen. HOLTEN und Mitarbeiter (1968) zeigten,
dass eine Korrelation zwischen morphologischer Komplexität und Grad an
ungesättigten Fettsäuren besteht. KENYON und STANIER (1970) beobachteten, dass
der Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit der klassischen morphologisch-
physiologischen Charakterisierung korreliert. Außerdem ergaben Vergleiche
zwischen 16S rDNA- und Fettsäureanalyse übereinstimmende Klassifizierungen
(WILMOTTE und HERDMAN 2001). Dabei kann ein Vergleich zwischen Organismen
bzw. eine Identifizierung oder Klassifizierung anhand von Fettsäureprofilen mit zehn
oder mehr identifizierten Fettsäuren durchgeführt werden (BUSSE et al. 1996).
Die Untersuchungen von HOLTON und Mitarbeitern (1968) zeigten bei verschiedenen
Oscillatoria Spezies Fettsäureprofile mit einem großen Anteil an gesättigten und
ungesättigten C16 und C18 Fettsäuren. Außerdem konnten in Organismen der
Ordnung Oscillatoriales hohe Konzentrationen von mehrfach ungesättigten
Fettsäuren (z.B. C18:2 und C18:3) nachgewiesen werden (CAUDALES 2000).
Entscheidenden Einfluss auf die Synthese der Fettsäuren hat dabei die Temperatur.
Bei niedrigeren Temperaturen werden vermehrt kürzere und ungesättigte Fettsäuren
synthetisiert, um die Fluidität der Membran aufrecht zu erhalten (WADA und MURATA
1990), was zu einem geringeren Anteil an längerkettigen Fettsäuren führt.
Den größten Anteil an identifizierten Fettsäuren von Stamm Flo1 hatten in beiden
Ansätzen die C16 und C18 Fettsäuren (siehe Kap. 3.7). Ein Vergleich des
Fettsäureprofils von Stamm Flo1 (nach Wachstum bei 1 µE m-2 s-1 PAR) mit dem
Fettsäureprofil von Oscillatoria sp. (HOLTON et al. 1968) zeigt große
Überseinstimmungen in der Menge an nachgewiesenen C16 Fettsäuren. Dabei
konnte ein Anteil von 49% (Stamm Flo1) bzw. 53% (Oscillatoria sp.) dokumentiert
werden. Der prozentuale Anteil der C18 Fettsäuren zeigt hingegen signifikante
Unterschiede von 11% für Stamm Flo1 gegenüber 25,6% bei Oscillatoria sp.
Die prozentuale Verteilung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren bei Stamm
Flo1 zeigte in den Ansätzen mit unterschiedlichen PFDs keine signifikanten
4. Diskussion 94
Unterschiede und ergab einen Anteil an ungesättigten Fettsäuren von 51,8% (1 µE
m-2 s-1 PAR) bzw. 52,8% (20 µE m-2 s-1 PAR). Die von CAUDALES und Mitarbeitern
(2000) bei Organismen der Ordnung Oscillatoriales in großem Anteil
nachgewiesenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren konnten bei Stamm Flo1 nicht
identifiziert werden. Dieses Nichtauffinden könnte möglicherweise auf den
verwendeten Standard zurückzuführen sein.
4.2.5 Physiologie
Zur polyphasischen Beschreibung eines Cyanobakteriums müssen zusätzlich zu
morphologischen und molekularbiologischen Methoden auch physiologische
Untersuchungen zum Wachstumsverhalten durchgeführt werden.
4.2.5.1 Lichtbedingungen
Die phototrophen Cyanobakterien sind auf Licht als primäre Energiequelle
angewiesen. Dabei muss zwischen zwei Parametern unterschieden werden: 1.) der
Photonenflussdichte und 2.) der Wellenlänge des Lichts (TANDEAU DE MARSAC und
HOUMARD 1993). Die zum Wachstum optimalen PFDs liegen bei den meisten
Frischwasser-Organismen zwischen 50 und 60 µE m-2 s-1 PAR (WYMAN und FAY
1987), die geringsten PFDs, bei denen Wachstum nachgewiesen werden konnte,
liegen bei 1-2 µE m-2 s-1 PAR (FOY et al. 1983). Dabei besteht bei allen
photosynthetischen Organismen eine inverse Korrelation zwischen der Menge an
lichtsammelnden Pigmenten und der Photonenflussdichte (ALLEN 1968). Die
Konzentration der Pigmente Chlorophyll a und den Phycobiliproteinen in der Zelle
kann dabei um das 4-5fache zwischen Stark- und Schwachlicht variieren (WYMAN
und FAY 1987). Die Anpassung an hohe Lichtintensitäten hat zusätzlich zur
Reduktion von Chlorophyll a und den Phycobiliproteinen auch eine Abnahme des
Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten zur Folge (RAPS et al. 1983). Dabei haben die
synthetisierten Carotinoide zusätzlich zur Funktion als lichtsammelndes Pigment
noch photoprotektive Eigenschaften. Die Synthese und Akkumulation der Carotinoide
wird von den Umweltbedingungen beeinflusst, deren molekularen Mechanismen
bisher jedoch noch nicht geklärt sind. Die am weitesten unter Cyanobakterien
verbreiteten Carotinoide sind ß-Carotin, Zeaxanthin, Echinenon und Myxoxanthophyll
(HIRSCHBERG und CHAMOVITZ 1994). Myxoxanthophyll ist in der „Äußeren Membran“
4. Diskussion 95
lokalisiert (EHLING-SCHULZ et al. 1997), während ß-Carotin in der Thylakoidmembran
und Zeaxanthin in der Cytoplasmamembran lokalisiert ist (MASAMOTO und FURUKAWA
1997). Dabei sind zwei ß-Carotin Moleküle direkt mit dem Photosystem II assoziiert
(FRESE et al. 2003).
Zusätzlich zu den photoprotektiven und lichtsammelnden Funktionen haben
Carotinoide auch einen Einfluss auf die Fluidität der Membranen. Die Carotinoide
Myxoxanthophyll und Zeaxanthin bewirken eine Verringerung, ß-Carotin eine
Steigerung der Membran-Fluidität (LAGARDE et al. 2000).
Die Konzentrationsverschiebungen der photosynthetisch aktiven Pigmente kann
auch makroskopisch beobachtet werden. Dabei erfolgt eine farbliche Veränderung
von blaugrün bei geringen PFDs zu gelbgrün bei hohen PFDs (KELLAR und PAERL
1980). Zusätzlich zu Veränderungen in der Pigmentzusammensetzung konnte bei
Cyanobakterien der Ordnung Chroococcales bei steigenden Lichtintensitäten auch
eine vermehrte Produktion von sekretierten Polysacchariden nachgewiesen werden
(KONOPKA und SCHNUR 1980).
Die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 zeigten tendenziell
ein besseres Wachstum bei niedrigeren Lichtintensitäten (siehe Kap. 3.4.1). Eine
Aussage über die optimale Beleuchtungsintensität kann anhand der ermittelten
Daten jedoch nicht getroffen werden.
Mit steigenden PFDs konnte eine Zunahme des Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten
beobachtet werden. Auch die Synthese der Phycobiliproteine korrelierte mit der
Lichtintensität. Mit zunehmender PFD war eine Reduktion der Gesamtmenge an
Phycobiliproteinen zu beobachten (siehe Kap. 3.8.3), bei gleichzeitiger Zunahme
bzw. konstanter Menge an Carotinoiden.
Die erhöhte Synthese der Carotinoide bei Stamm Flo1 mit steigenden PFDs kann auf
eine Lichtschutzreaktion zurückgeführt werden. Eine gerichtete Veränderung der
Membran-Fluidität kann wegen der vorherrschenden konstanten Versuchstemperatur
ausgeschlossen werden. Dabei wurden alle nachgewiesenen Carotinoide mit
steigender PFD vermehrt nachgewiesen. Den größten Anteil an Carotinoiden hatte ß-
Carotin, das teilweise mit dem PS II assoziiert ist und dort photoprotektiv wirken
kann.
Die makroskopische Beschreibung (siehe Kap. 3.4.1.2) zeigte eine farbliche
Veränderung der Kulturen sowie eine erhöhte Menge an exopolymeren Substanzen
mit steigender PFD. Die vermehrte Produktion der extrazellulären Substanzen ist
4. Diskussion 96
möglicherweise, wie die gesteigerte Produktion an Carotinoiden, auf eine Licht-
schutzreaktion zurückzuführen.
Zusätzlich zum Einfluss der Lichtquantität auf die Pigmentzusammensetzung
beeinflusst die Lichtqualität, also die Wellenlänge des einfallenden Lichtes, ebenfalls
die Synthese der Pigmente. Verschiebungen des Lichtspektrums führen zu
Veränderungen der Pigmentsynthese (WYMAN und FAY 1987). Die Chromatische
Adaptation resultiert in der präferierten Synthese des Phycobiliproteins, das
komplementär zur Wellenlänge des Lichtes ist, also Phycocyanin (PC) in Rotlicht und
Phycoerythrin (PE) in Grünlicht. Dabei werden die Cyanobakterien anhand ihrer
Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation nach TANDEAU DE MARSAC
und HOUMARD (1988), wie in Kapitel 1.1.2.3 beschrieben, in drei Gruppen unterteilt.
Die Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation konnte bisher nicht bei
Stämmen der Gattung Geitlerinema nachgewiesen werden (RIPPKA und HERDMAN
1992).
Bei Stamm Flo1 wurde keine gerichtete Anpassung der Konzentration an
Phycobiliproteinen bei wechselnder Lichtqualität beobachtet. Weder eine vermehrte
Synthese des Phycobiliproteins PE bei Inkubation unter Grünlicht noch eine
vermehrte Synthese von PC unter Rotlicht konnte dokumentiert werden.
Lediglich ungerichtete Schwankungen der Konzentration an Phycobiliproteinen
konnten über die gesamte Versuchsdauer beobachtet werden, welche durch einen
Mangel an Nährstoffen entstanden sein könnten. Bei Nährstoffmangel können
Phycobilisome zur Gewinnung von Aminosäuren und Kohlenstoffverbindungen zur
Bewahrung des Erhaltungsstoffwechsels abgebaut werden (GROSSMAN et al. 2001).
4.2.5.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten
Cyanobakterien werden nach REED und Mitarbeitern (1986) auf Grundlage ihrer
Salztoleranz in drei Gruppen unterteilt. Leicht halophile Cyanobakterien tolerieren
Salinitäten bis ca. 40‰ (entspricht 0,7 M NaCl), moderat halophile können bei
Salzgehalten bis 110‰ (1,8 M) wachsen und extrem halophile Cyanobakterien
tolerieren Salzgehalte von 160 ‰ (2,7 M NaCl).
Für einige Organismen der Gattung Geitlerinema konnte optimales Wachstum bei
Salinitäten von 0,2 bzw. 18‰ nachgewiesen werden. Insgesamt wurde ein
4. Diskussion 97
Wachstum bei Stämmen der Gattung Geitlerinema von 0,2 bis 92‰ dokumentiert
(MARGHERI et al. 2003). Der Stamm PCC 7105 zeigte dabei ein optimales Wachstum
bei einem Salzgehalt von 18‰.
Das beste Wachstum von Stamm Flo1 konnte bei einer Salinität von 15‰
nachgewiesen werden (siehe Kap. 3.4.3), was dem Salzgehalt des standardmäßig
verwendeten ASNIII/2 entspricht. Bei niedrigeren Salzgehalten (7‰) fiel die Zunahme
an Biomasse am geringsten aus. Auch höhere Salzgehalte (27-62‰) konnten das
Wachstum der Zellen nicht positiv beeinflussen.
Stamm Flo1 weist eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Salinitäten auf:
Ein Zellwachstum konnte bei Salzgehalten zwischen 0,2‰ und 64‰ beobachtet
werden. Folglich kann Stamm Flo1 als leicht bis moderat halophil bezeichnet werden.
Ein Wachstum der Kulturen ohne Salz im Medium konnte nicht dokumentiert werden.
4.2.5.3 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen
Cyanobakterien können ein breites Spektrum an Stickstoffquellen zum Wachstum
nutzen. Viele Cyanobakterien, in erster Linie heterozystenbildende Organismen,
besitzen die Fähigkeit zur Stickstofffixierung. Außerdem können sowohl organische
N-Verbindungen wie Harnstoff oder Aminosäuren als auch anorganische
Stickstoffverbindungen wie Nitrat, Nitrit oder Ammonium genutzt werden. Nitrat wird
dabei im Allgemeinen als Stickstoffquelle präferiert (GUERRERO et al. 1987).
Die Stickstofffixierung in nicht heterozystenbildenden Cyanobakterien erfolgt, wie
auch bei Heterozystenbildnern, mittels Nitrogenase-Komplex (FAY 1992), welcher
durch die Gene nifD, nifK und nifH codiert wird (VAN BAALEN 1987). Lokalisiert ist der
Nitrogenase-Komplex im Cytoplasma und ist in nichtheterozystenbildenden
Cyanobakterien somit nicht von dem photosynthetischen Apparat separiert (STAL und
BERGMANN 1990). Zur Vermeidung einer Inaktivierung der Nitrogenase durch
Sauerstoff erfolgt eine zeitliche Trennung der Photosynthese (im Licht) und der
Stickstofffixierung (im Dunkeln) (FAY 1992).
Eine besondere Art der Stickstofffixierung bei nichtheterozystenbildenden,
filamentösen Cyanobakterien konnte bei Organismen der Gattung Trichodesmium
nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass sowohl eine zeitliche als auch eine
räumliche Trennung von Photosynthese und Stickstofffixierung zur Vermeidung der
Inaktivierung der Nitrogenase durch Sauerstoff stattfindet. Dabei erfolgt während der
4. Diskussion 98
Photosynthesereaktion ausschließlich ein linearer Elektronentransport, so dass kein
Sauerstoff an Photosystem II gebildet wird (BERMAN-FRANK et al. 2001).
Für Organismen der Gattung Geitlerinema konnte bisher keine Stickstofffixierung
nachgewiesen werden (RIPPKA und HERDMAN 1992).
Eine temporäre Unabhängigkeit von externen Stickstoffquellen kann außerdem durch
Speicherstoffe wie Cyanophycin erreicht werden. Cyanophycin-Granula bestehen
aus L-Aspartat- und L-Arginin-Polypeptiden (im Verhältnis 1:1), die bei fast allen
Cyanobakterien nachgewiesen wurden (SIMON 1987).
Es konnte gezeigt werden, dass Stamm Flo1 in der Lage ist, mit verschiedenen
Stickstoffquellen zu wachsen (siehe Kap. 3.4.6). Dabei wurden keine signifikanten
Unterschiede im Wachstumsverhalten der Kulturen bei unterschiedlich angebotenen
Stickstoffquellen nachgewiesen. Eine toxische Wirkung auf die Zellen konnte für
NaNO2 in den Konzentrationen 5 und 10 mM beobachtet werden.
Obwohl bei Stamm Flo1 keine Stickstofffixierung erfolgt (siehe Kap. 3.4.7), war das
Wachstum im Ansatz ohne Stickstoffquelle nicht signifikant geringer als in den
Ansätzen mit zugegebener Stickstoffquelle, was auf interne Stickstoffreserven
hindeutet (siehe auch Kap. 3.9). Um Letzteres zu beweisen, müssten
Versuchsansätze mit Vorkulturen durchgeführt werden, die unter Stickstoffmangel
inkubiert wurden.
4.3 Herstellung axenischer Kulturen
Für die Durchführung von physiologischen und molekularbiologischen Methoden ist
es sinnvoll, mit axenischen Kulturen zu arbeiten. Die Herstellung axenischer Kulturen
bei Cyanobakterien ist oftmals schwierig, da viele Cyanobakterien eine Scheide oder
extrazelluläre Substanzen ausbilden, in denen eine Vielzahl von heterotrophen
Bakterien gebunden sein kann. Außerdem kommt es im Verlauf der Herstellung
axenischer Kulturen oftmals zum Absterben der Kultur (PALINSKA et al. 1999).
Die zur Herstellung axenischer Cyanobakterien-Kulturen verwendeten Antibiotika
haben verschiedene Wirkungsmechanismen auf die Zellen. Chloramphenicol
unterdrückt bakterielles Wachstum durch hemmende Bindung der 50S-Untereinheit
der Ribosomen, Kanamycin beeinflusst die Proteinsynthese durch Bindung der 30S-
Untereinheit. Rifampicin beeinträchtigt die Transkription durch Hemmung der RNA-
Polymerase. Alle verwendeten Antibiotika wirken auf Gram-negative Bakterien und
4. Diskussion 99
mit Abstrichen (Chloramphenicol) auch auf Gram-positive Bakterien (MADIGAN et al.
2001, „DrugBank-Homepage“: http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank; Stand
September 2007).
Durch eine Separation von Cyanobakterien und ihrer heterotrophen Begleitflora
mittels Percoll-Zentrifugation und Zugabe der unterschiedlichen Antibiotika konnten
axenische Kulturen hergestellt werden (siehe Kap. 3.1). In einigen Ansätzen wurden
auch die Zellen von Stamm Flo1 nachhaltig in ihrem Wachstum beeinträchtigt, was in
einer Entfärbung und dem Absterben der Filamente resultierte. Durch die
anschließend durchgeführten Waschschritte und Wachstumsphasen von jeweils 3
Wochen in sterilfiltriertem Medium konnte die Lebensfähigkeit der Kulturen von
Stamm Flo1 jedoch erhalten werden.
5. Ausblick 100
5. Ausblick
Die in dieser Diplomarbeit ermittelten Ergebnisse lassen eine Vielzahl neuer
Fragestellungen aufkommen.
Eine Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Spezies-Ebene durch die 16S rDNA-
Sequenzierung war nicht möglich. Ob Stamm Flo1 und Stamm Geitlerinema sp. PCC
7105 identische Arten sind, kann auf Grund der 16S rDNA Sequenzübereinstimmung
von 99,56% nicht endgültig geklärt werden. Für den Vergleich von zwei Spezies
muss daher eine DNA-DNA-Hybridisierung durchgeführt werden. Eine
Übereinstimmung von mindestens 70% würde die beiden Stämme als identische
Spezies kennzeichnen.
Die aktuell noch geringe Anzahl an publizierten gyrB-Sequenzen lässt eine
Klassifizierung anhand dieses taxonomischen Markers noch nicht zu. Für die
Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen sind weitere Sequenzen
nahverwandter Cyanobakterien nötig. Die Gene rpoC1 und rpoD1 könnten als
zusätzliche taxonomische Marker sequenziert werden (s. o.).
Bei Stamm Flo1 konnte eine Produktion von exopolymeren Substanzen (ES)
beobachtet werden, die unter dem Einfluss höherer PFDs gesteigert wurde (siehe
Kap. 3.4.1.2). Eine antimikrobielle Wirkung dieser EPS konnte bereits nachgewiesen
werden (HEYDUCK-SÖLLER und FISCHER 2000). Die Zusammensetzung dieser
Substanz ist bisher noch nicht untersucht worden. Es stellt sich daher die Frage, ob
die Produktion der exopolymeren Substanzen ausschließlich durch Stamm Flo1, nur
in Assoziation mit heterotrophen Bakterien oder ausschließlich durch die
heterotrophen Bakterien erfolgt. Voraussetzung für Versuche dieser Art ist die
Herstellung axenischer Cyanobakterien-Kulturen. Die heterotrophen Begleitbakterien
von Stamm Flo1 müssen isoliert, eingehend identifiziert und stoffwechsel-
physiologisch charakterisiert werden.
Da auf molekularer Ebene die Fähigkeit zur Biosynthese von Microcystin
ausgeschlossen werden konnte (siehe Kap. 3.5.8), ist noch nicht geklärt, worauf die
antimikrobielle Wirkung der ES von Stamm Flo1 basiert. Bisher konnten viele
toxische Sekundär-Metabolite identifiziert werden, die von Cyanobakterien
synthetisiert werden. Die Synthese erfolgt dabei nicht-ribosomal, sondern durch
Polypeptid-Synthetasen (NEILAN et al. 1999) wie die Polyketid-Synthase und Peptid-
5. Ausblick 101
Synthetase (SCHEMBRI et al. 2001). Diese Enzyme werden als nicht-ribosomale
Peptid-Synthetasen (NRPS) zusammengefasst (CHRISTIANSEN et al. 2001).
Zur Determinierung der antimikrobiellen Wirkung der exopolymeren Substanz von
Stamm Flo1 könnte ein genetischer Nachweis dieser Enzyme mittels PCR oder RT-
PCR erfolgen.
In Zukunft sind weitere Umstrukturierungen und Namensänderungen bei der
Klassifizierung von Cyanobakterien unumgänglich, so dass eine stetige Kontrolle der
aktuellen Bestimmungsliteratur nötig ist: Einerseits ist das Konzept zur Einteilung auf
Spezies-Ebene und die Regeln zur Namensgebung noch nicht zufrieden stellend
gelöst worden, andererseits steigt die Anzahl an Methoden, die zur polyphasischen
Beschreibung berücksichtigt werden müssen.
6. Zusammenfassung 102
6. Zusammenfassung
1) Die Zellen von Stamm Flo1 sind als gerades bis leicht gebogenes Filament, ohne
signifikante Einschnürungen zwischen den Zellen organisiert. Die Größe der Zellen
beträgt 4,9 x 2,2 µm, die terminalen Zellen sind abgerundet. Heterozysten, Akineten
oder necridische Zellen werden nicht ausgebildet. Eine sehr dünne Scheide konnte
nur an Bruchstücken nachgewiesen werden. Die Filamente zeigten auf Agarplatten
eine Motilität. Der Referenzstamm Geitlerinema sp. PCC 7105 zeigte ein identisches
morphologisches Erscheinungsbild.
2) Auf Grundlage der morphologischen Charakterisierung von Stamm Flo1 konnte
dieser anhand der Bestimmungsliteratur von GEITLER (1932), CASTENHOLZ und
Mitarbeitern (2001) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) der Ordnung
Oscillatoriales zugeordnet werden. Nach den neueren Bestimmungsschlüsseln
wurde Stamm Flo1 der Gattung Geitlerinema zugeordnet. Eine Klassifizierung auf
Spezies-Ebene wurde nicht durchgeführt.
3) Die zum Wachstum optimale Photonenflussdichte liegt zwischen 1 und 10 µE m-2
s-1 PAR. Bei höheren Lichtintensitäten konnte kein Zellwachstum dokumentiert
werden. In den Kultur-Überständen erfolgte über eine Versuchsdauer von 28 Tagen
eine Alkalisierung des Mediums. Bei höheren PFDs erfolgte eine vermehrte
Produktion von Exopolysacchariden.
4) Für Stamm Flo1 zeigte eine hohe Toleranz gegenüber wechselnden Salinitäten.
Dabei konnte bei Salzgehalten von 7‰ bis 62‰ eine Zunahme der Biomasse
dokumentiert werden. Der für das Wachstum optimale Salzgehalt des Mediums lag
bei 15‰, ein Zellwachstum ohne Salz im Medium erfolgte nicht.
5) Das Wachstum von Stamm Flo1 konnte durch einen höheren Start-pH-Wert (9,05-
9,37) im Medium und durch die Zugabe von Vitaminlösungen (B12 und 7-
Vitaminlösung) gesteigert werden.
6. Zusammenfassung 103
6) Stamm Flo1 zeigte ein breites Spektrum in der Verwertung verschiedener
anorganischer Stickstoffverbindungen. Zellwachstum konnte mit Nitrit, Nitrat und
Ammonium als einziger Stickstoffquelle nachgewiesen werden. Auch im Ansatz ohne
Stickstoffquelle konnte eine Zunahme an Biomasse dokumentiert werden, was auf
die Verwertung von Reservestoffen wie Cyanophycin schließen lässt.
7) Die Sequenzierung der 16S rDNA von Stamm Flo1 ergab nach einem Vergleich
mit Daten aus der NCBI-Datenbank eine Übereinstimmung von 99,56% mit Stamm
Geitlerinema sp. PCC 7105. Demzufolge kann Stamm Flo1 der Gattung Geitlerinema
zugeordnet werden. Ob es sich bei Stamm Flo1 und Stamm Geitlerinema sp. PCC
7105 um identische Spezies handelt, konnte anhand dieser Daten nicht endgültig
geklärt werden. Auch die Sequenzierung des Gens gyrB ergab eine enge
Verwandtschaft zwischen den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105.
8) Ein Vergleich der Ergebnisse der RADP und der ARDRA ergab ähnliche
Bandenmuster bei den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105. Die
Erstellung eines gattungsspezifischen Bandenmusters erfordert jedoch einen
größeren Versuchsumfang und die Verwendung mehrerer Stämme der Gattung
Geitlerinema.
9) Bei Stamm Flo1 konnte mittels Real-Time PCR kein mcyA Gen nachgewiesen
werden. Folglich ist Stamm Flo1 nicht in der Lage, Microcystine zu synthetisieren.
10) Bei Stamm Flo1 konnte ein G+C-Gehalt von 49,2 ± 2,2 mol% ermittelt werden.
Da die verwendete DNA jedoch noch Proteinkontaminationen enthielt und bei der
Erstellung der Schmelzkurven keine sigmoiden Kurvenverläufe vorlagen, muss
dieses Ergebnis nach Modifikation des Protokolls zur DNA-Isolierung und
Aufreinigung noch einmal validiert werden.
6. Zusammenfassung 104
11) Den größten Anteil am Fettsäureprofil von Stamm Flo1 hatten die C16 und C18
Fettsäuren Hexadecanoat-Methylester, cis-9-Hexadecenoat-Methylester, cis-9-
Octadecenoat-Methylester und trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester.
Außerdem konnte nach Wachstum bei einer Lichtintensität von 1 µE m-2 s-1 PAR im
Vergleich zum Wachstum bei der von 20 µE m-2 s-1 PAR noch eine zusätzliche
Fettsäure (14-Methylpentadecanoat-Methylester) dokumentiert werden.
12) Bei Stamm Flo1 konnte mit steigender Photonenflussdichte eine Zunahme des
Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten sowie eine Reduktion in der Menge an
Phycobiliproteinen nachgewiesen werden. Dabei konnten die Carotinoide
Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin detektiert werden.
13) Bei Stamm Flo1 erfolgte nach wechselnder Qualität des Lichtes (Rot↔Grün)
keine gerichtete Anpassung der Konzentration der Phycobiliproteine. Es konnte
keine Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation nachgewiesen
werden. Folglich wird Stamm Flo1 nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988)
der Gruppe 1 zugeordnet.
14) Anhand von TEM-Aufnahmen konnten konzentrische Thylakoide in peripherer
und paralleler Anordnung zu den longitudinalen Zellwänden nachgewiesen werden.
Außerdem konnten Granula, wahrscheinlich Cyanophycin, dokumentiert werden, die
in Zellwandnähe ohne festgelegte Organisation angeordnet waren.
7. Anhang 105
7. Anhang
Tab. 37: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach GEITLER 1932). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels sowie die ermittelten möglichen Spezies (siehe Kap. 3.3) Trichome ohne oder mit gänzlich zerfließenden, nicht sichtbaren Scheiden → Trichome lang, vielzellig, ± gerade oder unregelmäßig gebogen → Trichome mit normalem Bau, Zellen zusammenschließend ⇒ Gattung: Oscillatoria → Zellen ⅓ mal so lang wie breit, oder länger → Trichome nicht gelbgrün gefärbt → Trichome an den Enden nicht schraubig gewunden oder nur am äußersten Ende kurz gebogen oder hakig → Trichome an den Enden nicht deutlich verjüngt → Zellen länger als breit, an den Querwänden eingeschnürt → Trichome bis 2 µm (maximal 2 ¼ µm) breit ⇒ Oscillatoria limnetica; O. amphigranulata; O. redekei Tab. 38: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach CASTENHOLZ et al. 2001). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels sowie die ermittelte Gattung (siehe Kap. 3.3) → Filamentös, Trichome verzweigt oder unverzweigt → binäre Teilung in einer Ebene führt zu unverzweigten Trichomen → keine Differenzierung von Heterozysten oder Akineten aus vegetativen Zellen ⇒ Sektion III : Oscillatoriales → Trichome aus zylindrisch geformten Zellen → Trichome gerade oder der Länge nach leicht gewunden → Trichome meist frei beweglich ohne Scheide (gleitende Zellen können sehr dünnen, meist transparenten “Schweif” ausbilden) → Zellen länger als breit ⇒ Gattung: Geitlerinema
7. Anhang 106
Tab. 39: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels und die ermittelte Gattung (siehe Kap. 3.3)
→ Trichome ohne Scheide oder umgeben von einem sehr dünnen, farblosen, homogenen Schleim → Trichome gerade oder gekrümmt ⇒ Unterfamilie: Pseudanabaenoideae → Trichome bestehen nur aus zylindrischen Zellen → nicht verengt an den Zell-Wänden; immer ohne Gas-Vesikel, manchmal Granula in der Zelle → Trichome freibeweglich, gerade oder leicht wellig, hauptsächlich in Matten, selten in Büscheln ⇒ Gattung: Geitlerinema Tab. 40: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Salinitäten (siehe Kap. 3.4.3). Trockengewichte der Zellpellets nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C
1,862,339,719,99
14,0514,116,907,267,678,077,877,927,498,77
Salinität des Mediums [‰]
Trockengewicht der Zellpellets [mg]
Mittelwert der Trockengewichte [mg]
2,090
7,89
8,13
9,85
14,08
7,08
7,87
49
62
7
15
27
38
7. Anhang 107
Tab. 41: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen pH-Werten (siehe Kap. 3.4.4). Trockengewichte der Zellpellets wurden nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt. Zur Darstellung der Pufferkapazität wurden die pH-Werte zum Zeitpunkt der Inokulation und nach 3 Wochen bestimmt. Als Kontrolle (Einzelbestimmung) wurde ASNIII/2-Medium mit Nitrat ohne Kultur eingesetzt
7,148,227,868,949,616,6212,7412,9513,1410,389,37
7,88
8,13
8,49
8,76
8,92
7,80
8,17
8,61
9,05
8,43
Start-pH-Wert des Mediums
Trockengewicht der Zellpellets
[mg]
Mittelwert der Trockengewichte
[mg]
pH- Wert des Mediums nach 3
Wochen
8,72
pH- Wert der Kontrollen nach
3 Wochen
8,86
7,68
8,40
8,12
12,85
11,76
7,73
8,06
Tab. 42: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Vitamin B-Bedarfs von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.4.5). Trockengewichte der Zellpellets wurden nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt. Die Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf Grund der unterschiedlichen Mengen der einzelnen Vitamine in der Lösung nicht möglich (siehe Tab. 8)
ASNIII/2 ohne Vitamine 17,01ASNIII/2 ohne Vitamine 16,49 16,75VitB12 2,5 µg/l 17,52VitB12 2,5 µg/l 17,44 17,48VitB12 5 µg/l 16,44VitB12 5 µg/l 17,79 17,12VitB12 10 µg/l 17,29VitB12 10 µg/l 15,77 16,53
7-Vitamin-Lösung 0,25 ml/l 17,297-Vitamin-Lösung 0,25 ml/l 16,35 16,827-Vitamin-Lösung 0,5 ml/l 18,117-Vitamin-Lösung 0,5 ml/l 17,04 17,577-Vitamin-Lösung 1,0 ml/l 18,247-Vitamin-Lösung 1,0 ml/l 15,15 16,70
Zugegebene Vitamine Trockengewicht der Zellpellets [mg]
Mittelwert der Trockengewichte [mg]
7. Anhang 108
Tab. 43: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 mit verschiedenen Stickstoffquellen und Konzentrationen (siehe Kap. 3.4.6). Trockengewichte der Zellpellets nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt
10,128,2110,549,498,839,899,679,478,668,708,889,9810,0111,509,359,208,408,7611,6412,1410,5810,837,607,707,216,27
Keine (ASN III/2-)
NaNO3
NaNO3
NaNO3
NaNO3
NH4Cl
NH4Cl
NH4Cl
NH4Cl
NaNO2
NaNO2
NaNO2
NaNO2
Stickstoffquelle im Medium
Konzentration [mM]
-
1
2,5
5
10
1
2,5
5
10
1
2,5
5
10
Trockengewicht der Zellpellets [mg]
Mittelwert der Trockengewichte [mg]
9,16
10,01
9,36
9,57
8,68
9,43
10,71
7,65
6,74
10,76
9,27
8,58
11,89
7. Anhang 109
Tab. 44: 16S rDNA Sequenz (siehe Kap. 3.5.2) von Stamm Flo1 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) AGTCGAACGAAGTCTTCGGGACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAACCTGCCTCGAGGAGGGGGATCACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCGGCGTTTCAAGTCTGCTGTCAAAGGCCGAGGCTCAACTTCGGAAAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGAGACTAGGTGTTGCCTGTATCGACCCGGGCCGCGAATCTCGGCGAAAGTTGAGAGTGCCTACGGGAACGCGGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTCGACACACGTACTACAATGGTCGGGAACAGCGAGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGCTAATCTCTCAAACCCGGCCCTCTAAACCGTTCGCGGAGGAAGGGTGCCAAGGCAGTC Tab. 45: 16S rDNA Sequenz (siehe Kap. 3.5.2) von Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) GCAGTCGAACGAAGTCTTCGGACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACCGCGTGAGAACCTGCCTCGAGGAGGGGGCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCGGCGTTTCAAGTCTGCTGTCAAAGGCCGAGGCTCAACTTCGGAAACGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGAGACTAGGTGTTGCCTGTATCGACCCGGGCAGCGAATCTCGGCGAAAGTTGAGAGTGCCTACGGGAACGCGGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAGCGAGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGCTAATCTCTCAAACCCGGCCTCCCGTTCGCGGAGGAGGGTGCCGAAGGCA
Tab. 46: Sequenz des Gens gyrB (siehe Kap. 3.5.4) von Stamm Flo1 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) GAAGTGGTGGACAACTCCATCGACGAGGCACTAGCTGGTTACTGCACCCACATCGAAATCGACATCAACGCCGACCACGGGGTTGGCGTCTCTGTCGTCAACGCCCTATCCGAATGGGTAGAAGTCACCGTTTGGCGGGAGAAAAAGGTTGGACGGATTCGCGAACTGGCCTATCTCAACGCAGGCGTTCGCATCACCTTTACCGATAACCGCCTCGAATTTCTCGAGTGGTCGATCGACGCCTACAGCGACAACCTCCTCGGCTTCGCCAACAACATTCGTACCGTAGACGGCGGAACGCGGAATTCGAGGGTCAGACGAAGACGAAACTGGGAAATACGGAAGTTCGCGGAATCGTCGATTCGTTGGTGGGGGAGGGAAACTGGCTGATGCAGTACGAAGTCCTCG Tab. 47: Sequenz des Gens gyrB (siehe Kap. 3.5.4) von Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) TGGTTTACGAAGTGGTGGACAACTCCGTCGACGAGGCACTAGCTGGTTACTGCACCCACATCGAAATCGACATCAAGGGGATTGCACGGGGTTGGCGTCTCTGTCGTCAACGCCCTATCCGAATGGGTAGAAGTCACCGTTTGGCGGGAGACCATCGCCGGACGGATTCGCGAACTGGCCTATCTCAACGCAGGCGTTCGCATCACCTTTACCGATAACCGCCTCGTCGCCTTACAGTGGTCGATCGACGCCTACAGCGACAACCTCCTCGGCTTCGCCAACAACATTCGTACCGTAGACTCCCCGATCCGGAATTCGAGGGTCAGACGAAGACGAAACTGGGAAATACGGAAGTTCGCGGAATCGTCGATTCGTCACGCTACCGGGAATCTGGCTGATGCAGTACGAAGATCCCATCGCATCCCCATTCCT
7. Anhang 110
Tab. 48: Detaillierte Darstellung der detektierten Fettsäuren (siehe Kap. 3.7) von Stamm Flo1 nach Wachstum bei einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C
14,40 25364 7,62 n.i.19,80 6306 1,89 n.i.23,65 3667 1,10 n.i.24,81 4784 1,44 14-Methylpentadecanoat-Methylester CH3- C15:025,16 61035 18,33 n.i.25,28 25315 7,60 n.i.25,40 70392 21,14 cis-9-Hexadecenoat-Methylester C16:125,83 93421 28,06 Hexadecanoat-Methylester C16:030,05 4322 1,30 n.i.31,13 3192 0,96 n.i.31,26 23223 6,97 cis-9-Octadecenoat-Methylester C18:131,43 11964 3,59 trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester C18:1Summe 332985 100
Summen-Formel
Retentionszeit [min] Area counts Anteil an Gesamt-
Area counts [%] detektierte Fettsäure- Methylester
Tab. 49: Detaillierte Darstellung der detektierten Fettsäuren (siehe Kap. 3.7) von Stamm Flo1 nach Wachstum bei einer konstanten PFD von 20 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C
14,41 11269 13,39 n.i.19,35 2256 2,68 n.i.19,80 4312 5,12 n.i.21,45 749 0,89 n.i.23,65 761 0,90 n.i.25,16 12552 14,92 n.i.25,29 6185 7,35 n.i.25,40 10794 12,83 cis-9-Hexadecenoat-Methylester C16:125,83 20960 24,91 Hexadecanoat-Methylester C16:031,26 4461 5,30 cis-9-Octadecenoat-Methylester C18:131,42 8206 9,75 trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester C18:132,16 1640 1,95 n.i.Summe 84145 100
Summen-Formel
Retentionszeit [min] Area counts Anteil an Gesamt-
Area counts [%] detektierte Fettsäure- Methylester
7. Anhang 111
Tab. 50: Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a (Chl a) und den Carotinoiden nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs (siehe Kap. 3.8.1). Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte nach JÖSTINGMEYER (2000) bzw. MACKINNEY (1941) (siehe Kap. 2.8.1)
0,311 0,31 0,292 3,920,270 0,27 0,227 3,050,448 0,45 0,307 4,120,257 0,26 0,196 2,630,328 0,33 0,207 2,780,200 0,20 0,137 1,840,462 0,46 0,209 2,810,359 0,36 0,144 1,930,339 0,34 0,136 1,830,331 0,33 0,119 1,60
0,44
0,68
0,77
Quotient Carotinoid/
Chlorophyll a
0,32
0,40
2,37
1,71
Chl a -Gehalt [µg/ml]
20
1
5
10
15
Mittelwert Chl a - Gehalt
3,48
3,38
2,31
A 665nm
(Chlorophyll a )
PFD [µE m-2 s-1 PAR]
A 461nm
(Carotinoide)
Carotinoid- Gehalt [µg/ml]
Mittelwert Carotinoid-
Gehalt
1,11
1,36
1,02
1,61
1,32
Tab. 51: Photometrische Messung der Absorption bei den spezifischen Wellenlängen 565, 620 und 650 nm zur Berechnung der Konzentrationen der Phycobiliproteine Phycocyanin (PC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (AP) nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) (siehe Kap. 3.8.3)
1 0,087 0,145 0,055 14,43 4,86 3,161 0,030 0,067 0,017 7,47 0,76 0,645 0,064 0,104 0,044 9,92 4,29 2,405 0,054 0,097 0,035 9,82 2,93 1,7810 0,034 0,060 0,023 5,95 2,05 1,1510 0,019 0,032 0,013 3,10 1,22 0,6815 0,035 0,055 0,024 5,18 2,40 1,3615 0,033 0,058 0,023 5,68 2,12 1,1220 0,020 0,036 0,014 3,55 1,27 0,6620 0,012 0,036 0,006 4,31 0,00 0,01
PC [µg/ml] AP [µg/ml] PE [µg/ml]PFD [µE m-2 s-1 PAR]
A 565nm A 620nm A 650nm
7. Anhang 112
Tab. 52: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4) der Kontrolle (A), die ausschließlich unter Weißlicht inkubiert wurde
Messzeitpunkt PE [µg/ml] PC [µg/ml] AP [µg/ml] Gesamt [µg/ml]t0 1,917 9,363 1,819 13,100t0 1,837 7,425 2,147 11,410t1 4,684 30,298 1,995 36,977t1 4,657 24,146 6,897 35,701t2 7,373 43,970 12,873 64,216t2 5,997 36,206 10,042 52,246t3 8,662 57,019 15,926 81,607t3 3,426 19,919 4,264 27,609
A
Tab. 53: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4). Die Probe (B) wurde wie in Tabelle 34 beschrieben inkubiert
Messzeitpunkt PE [µg/ml] PC [µg/ml] AP [µg/ml] Gesamt [µg/ml]t0 1,650 9,282 1,533 12,465t0 1,952 9,661 2,359 13,972t1 4,518 25,921 5,996 36,436t1 4,251 27,873 5,205 37,328t2 5,014 27,724 7,237 39,975t2 5,238 30,041 7,736 43,015t3 8,238 49,783 13,425 71,446t3 8,128 50,921 12,835 71,884
B
Tab. 54: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4). Die Probe (C) wurde wie in Tabelle 34 beschrieben inkubiert
Messzeitpunkt PE [µg/ml] PC [µg/ml] AP [µg/ml] Gesamt [µg/ml]t0 2,168 9,919 2,756 14,843t0 1,975 8,089 2,442 12,506t1 3,228 14,715 4,327 22,271t1 3,084 14,743 3,400 21,226t2 4,970 31,992 6,945 43,907t2 5,017 36,911 7,412 49,340t3 4,854 32,195 6,127 43,176t3 5,848 37,642 8,458 51,949
C
7. Anhang 113
8. Literaturverzeichnis 114
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Erklärung gemäß § 21 Abs. 6 DPO-Biologie
Hiermit versichere ich, dass ich die Diplomarbeit mit dem Titel: „Charakterisierung
des filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1“ selbstständig verfasst und keine
anderen als die angegeben Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Bremen, den 30.10.2007
(Jan Schrübbers)