Diplomarbeit Jan Schrübbers Charakterisierung des … Jan Schruebbers… · 1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome ..... 4 1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation

Charakterisierung des filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1

Diplomarbeit

vorgelegt dem

Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)

an der Universität Bremen

von

Jan Schrübbers

Oktober 2007

Betreuender Gutachter: Prof. Dr. U. Fischer

Zweiter Gutachter: Prof. Dr. K.-H. Blotevogel

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Ulrich Fischer für die

Bereitstellung meines Arbeitsplatzes sowie die Diskussions- und Hilfsbereitschaft bei

der Erstellung meiner Diplomarbeit bedanken.

Bei Herrn Prof. Dr. Karl-Heinz Blotevogel möchte ich mich für sein Interesse und für

die Begutachtung meiner Diplomarbeit bedanken.

Meinen Kollegen aus der Arbeitsgruppe danke ich für das gute Arbeitsklima, die

„leckeren Kaffeekränzchen“ und ihre Unterstützung sowie Diskussionsbereitschaft

bei Problemen.

Ein spezieller Dank gilt Dr. Birgit Heyduck-Söller, die immer ein offenes Ohr für mich

hatte und mich einfach „riesig“ betreut hat.

Bei Anke Toltz und der AG Heyser möchte ich mich für die Betreuung bei der

Erstellung der TEM-Aufnahmen bedanken.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich über mein gesamtes Studium

finanziell und moralisch unterstützt haben. Außerdem möchte ich meinen Brüdern

danken, die mir bei meinen „chemischen Problemen“ geholfen haben. Meiner

Freundin danke ich für ihr Verständnis, ihre Unterstützung und die Geduld mit mir.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis I. Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................i 1. Einleitung................................................................................................................ 1

1.1 Cyanobakterien................................................................................................. 1 1.1.1 Morphologie der Cyanobakterien................................................................ 1 1.1.2 Photosynthetisch aktive Pigmente.............................................................. 2

1.1.2.1 Struktur und Funktion der Thylakoide .................................................. 3 1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome ............................................ 4 1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation .......................................... 5

1.2 Taxonomische Einteilung von Cyanobakterien ................................................. 6 1.2.1 Historische Entwicklung der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien .......................................................................................... 6 1.2.2 Die Ordnung Oscillatoriales........................................................................ 8 1.2.3 Probleme der taxonomischen Einteilung .................................................... 9

1.3 Ziel der Arbeit.................................................................................................. 10 2. Material und Methoden......................................................................................... 11

2.1 Verwendete Cyanobakterien-Stämme und deren Herkunft............................. 11 2.2 Kulturbedingungen und verwendete Medien................................................... 11

2.2.1 Verwendete Medien.................................................................................. 11 2.2.2 Kulturbedingungen ................................................................................... 12 2.2.3 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1.................................... 13

2.2.3.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 13 2.2.3.2 Eliminierung heterotropher Bakterien durch Zugabe von Antibiotika .......................................................................................... 13

2.3 Morphologische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 ................... 14 2.3.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 14 2.3.2 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Betrachtung.................................. 14 2.3.3 Zellgrößenbestimmung............................................................................. 14 2.3.4 Scheiden-Nachweis.................................................................................. 15 2.3.5 Motilitäts-Nachweis................................................................................... 15 2.3.6 Klassifizierung von Stamm Flo1 aufgrund morphologischer Merkmale anhand von Literaturdaten........................................................................ 15

2.4 Physiologische Charakterisierung von Stamm Flo1........................................ 16 2.4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (PFDs)................................................................... 16

2.4.1.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 16 2.4.1.2 Auswertung........................................................................................ 16

2.4.1.2.1 Chlorophyll a-Bestimmung nach MACKINNEY (1941).................... 17 2.4.1.2.2 Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976) ................................ 17 2.4.1.2.3 pH-Wert-Bestimmung in den Kulturüberständen ......................... 18

2.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung einer Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht.......................................... 18 2.4.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten................................................................................................. 19


2.4.4 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH- Werten...................................................................................................... 20


Inhaltsverzeichnis

2.4.5 Untersuchungen zum Vitamin B-Bedarf ................................................... 21 2.4.5.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 21 2.4.5.2 Auswertung........................................................................................ 22

2.4.6 Untersuchungen zur Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoffverbindungen ............................................................................. 22


2.4.7 Untersuchungen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung............................... 23 2.4.7.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 23 2.4.7.2 Auswertung........................................................................................ 23

2.5 Molekularbiologische Untersuchungen an den Stämmen Flo1 und PCC 7105 ....................................................................................................... 24

2.5.1 DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996)..................... 24 2.5.2 Polymerase Chain Reaktion (PCR) .......................................................... 25

2.5.2.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 25 2.5.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gel......................... 27 2.5.2.3 Aufreinigung und Sequenzierung der PCR-Produkte......................... 28 2.5.2.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen .............................. 28

2.5.3 Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)....................................... 29 2.5.4 Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA) ......................................... 30 2.5.5 Real-Time-PCR (RT-PCR) ....................................................................... 31

2.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes (mol%) nach MARMUR (1961) .......................... 33 2.6.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 33 2.6.2 Zellaufschluss und DNA Extraktion .......................................................... 34 2.6.3 Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) und Berechnung des G+C-Gehaltes (mol%) von Stamm Flo1.......... 35

2.7 Analyse des Fettsäuremusters von Stamm Flo1............................................. 36 2.7.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 36 2.7.2 Bestimmung des Fettsäureprofils ............................................................. 36

2.8 Qualitative und quantitative Bestimmung der photosynthetisch aktiven Pigmente von Stamm Flo1 nach Wachstum der Kulturen bei unterschiedlichen Photonenflussdichten ......................................................... 37

2.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden.................... 37 2.8.1.1 Probenvorbereitung ........................................................................... 37 2.8.1.2 Auswertung........................................................................................ 37

2.8.2 Qualitative Pigment-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC .............. 38 2.8.2.1 Auftrennung der Extrakte ................................................................... 38 2.8.2.2 Detektion der Retentionszeiten und Absorptionsspektren ................. 39 2.8.2.3 Identifizierung der Pigmente und Ermittlung der relativen Anteile...... 39

2.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine ................. 39 2.8.3.1 Probenvorbereitung und Konzentrationsberechnung......................... 39

2.8.4 Versuche zur Komplementären Chromatischen Adaptation ..................... 40 2.8.4.1 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine........... 40

2.8.4.1.1 Probenvorbereitung..................................................................... 40 2.8.4.1.2 Auswertung ................................................................................. 41

2.8.4.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC .... 41 2.8.4.2.1 Probenvorbereitung..................................................................... 41 2.8.4.2.2 Auswertung ................................................................................. 41

Inhaltsverzeichnis

2.9 Transmissions-Elektronen Mikroskopie (TEM)................................................ 42 2.9.1 Probenvorbereitung .................................................................................. 42 2.9.2 Schneiden der TEM-Präparate................................................................. 43 2.9.3 TEM-Aufnahmen ...................................................................................... 44

2.10. Herkunft der verwendeten Chemikalien ....................................................... 44 3. Ergebnisse............................................................................................................ 45

3.1 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1 .......................................... 45 3.2 Morphologische Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105............. 45

3.2.1 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Beschreibung ............................... 45 3.2.2 Zellgrößenbestimmung............................................................................. 46 3.2.3 Scheidennachweis.................................................................................... 47 3.2.4 Motilitäts-Nachweis................................................................................... 47 3.2.5 Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung.......................... 48

3.3 Taxonomische Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Grundlage morphologischer Merkmale............................................................................. 49 3.4 Ergebnisse der physiologischen Charakterisierung ........................................ 50

3.4.1 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten .......... 50 3.4.1.1 pH-Wert in den Überständen ............................................................. 51 3.4.1.2 Makroskopische Beschreibung der Kulturen...................................... 53

3.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung der Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht.......................................... 54 3.4.3 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten............................ 55 3.4.4 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten ........................... 56 3.4.5 Vitamin B-Bedarf für das Wachstum......................................................... 58 3.4.6 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen............................................. 59 3.4.7 Fähigkeit zur Stickstofffixierung................................................................ 60

3.5 Auswertung der molekularbiologischen Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105......................................................................................... 60

3.5.1 DNA-Extraktion......................................................................................... 60 3.5.2 Amplifikation der 16S rDNA...................................................................... 61 3.5.3 Amplifikation des Gens gyrB .................................................................... 62 3.5.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen..................................... 63 3.5.5 Random Amplified Polymorphism DNA-Analyse (RAPD)......................... 65 3.5.6 Amplified rDNA Restriction Analysis-Analyse (ARDRA) ........................... 67 3.5.7 Real-Time-PCR-Analyse .......................................................................... 70

3.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes ......................................................................... 72 3.7 Analyse des Fettsäuremusters........................................................................ 73 3.8 Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente............................................. 75

3.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden.................... 75 3.8.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung .......................................................... 76 3.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine ................. 79 3.8.4 Ergebnisse zur Komplementären Chromatischen Adaptation .................. 80

3.8.4.1 Nachweis der Phycobiliproteine nach Inkubation in Rot- bzw. Grünlicht............................................................................................. 80 3.8.4.2 Qualitativer Nachweis der im Rot- bzw. Grünlicht synthetisierten Pigmente............................................................................................ 82

3.9 Ultrastruktur der Zelle von Stamm Flo1........................................................... 84

Inhaltsverzeichnis

4. Diskussion ............................................................................................................ 86 4.1 Hintergrund ..................................................................................................... 86 4.2 Polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1 ............................................... 87

4.2.1 Morphologie.............................................................................................. 87 4.2.2 Molekularbiologie...................................................................................... 89

4.2.2.1 Sequenzanalyse der 16S rDNA und des Gens gyrB.......................... 89 4.2.2.3 Toxin-Nachweis mittels RT-PCR........................................................ 91

4.2.3 G+C-Gehalt .............................................................................................. 92 4.2.4 Analyse des Fettsäuremusters ................................................................. 93 4.2.5 Physiologie ............................................................................................... 94

4.2.5.1 Lichtbedingungen............................................................................... 94 4.2.5.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten ..................... 96 4.2.5.3 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen ...................................... 97

4.3 Herstellung axenischer Kulturen ..................................................................... 98 5. Ausblick ...............................................................................................................100 6. Zusammenfassung ..............................................................................................102 7. Anhang ................................................................................................................105 8. Literaturverzeichnis .............................................................................................114

I. Abkürzungsverzeichnis i

I. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

AP Allophycocyanin

Aqua bidest. Zweifach destilliertes Wasser

ARDRA Amplified rDNA Restriction Analysis

ASN Artificial Seawater Nutrient

ATP Adenosintriphosphat

BBD black band disease („Korallen-Krankheit“)

BLAST basic logical aligment search tool

bp Basenpaar(e)

BSA bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

Chl a Chlorophyll a

DAD Dioden-Array-Detektor

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

EMK Erlenmeyerkolben

ERG Eppendorfreaktionsgefäß

FAME Fatty Acid Methyl Ester (Fettsäure-Standard)

G+C Guanin und Cytosin

GC Gaschromatographie

HPLC High Performance Liquid Chromatographie

ICBN International Code of Botanical Nomenclature

ICNP International Code of Nomenclature of Procaryotes

ICSP International Committee on Systematics of Procaryotes

Kap. Kapitel

kb Kilobasenpaare

NCBI National Center for Biotechnology Information

NJ Neighbour-Joining

OT Objektträger

p.a. zur Analyse

PAR Photosynthetically Active Radiation (photosynthetisch aktive

Strahlung)

PBS Phycobilisom

I. Abkürzungsverzeichnis ii

PC Phycocyanin

PCC Pasteur Culture Collection

PCR Polymerase Chain Reaction

PE Phycoerythrin

PFD Photon Flow Density (Photonenflussdichte)

PP Pasteur-Pipette

PS Photosystem

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA

rpm Rotation per minute (Rotation pro Minute)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Real-Time-PCR

RUBISCO Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase

SD „Dice similarity coefficient“ (Koeffizient zur Berechnung von

phylogenetischen Verwandtschaften anhand von Bandenmustern)

Tab. Tabelle

TEM Transmissionselektronenmikroskopie

TM Schmelztemperatur TMM Trace-Metal-Mix

U Unit (µmol/min)

UFT Umwelt Forschung Technologie Zentrum

UPGMA Unweighted Pairwise Grouping Method using Arithmetic means

(ungewichtete Methode zur Gruppierung von Organismen unter

Verwendung von Distanz-Mittelwerten)

UV/Vis Ultraviolett/visible (sichtbar)

v/v volume per volume (Volumen pro Volumen)

w/v weight per volume (Gewicht pro Volumen)

1. Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Cyanobakterien

Cyanobakterien repräsentieren die größte, formenreichste und am weitesten

verbreitete Gruppe von phototrophen Bakterien (FUCHS 2006). Sie sind in der Lage,

eine Vielzahl von Habitaten wie Böden, Seen, Gletscher, Wüsten oder heiße Quellen

zu besiedeln (SANCHEZ-BARACALDO et al. 2005).

Vom Zellwandtyp her zählen sie zu den Gram-negativen Bakterien. Dabei nehmen

die oxygen-phototrophen Cyanobakterien eine eigene phylogenetische Nische ein,

die nahe verwandt zu den Gram-positiven mit niedrigem G+C-Gehalt wie Bacillus

subtilis ist (CASTENHOLZ 2001). Wegen der Fähigkeit, Kohlendioxid über den Calvin-

Zyklus zu fixieren sind sie zu autotrophem Wachstum in der Lage und gelten somit

als wichtigste marine Primärproduzenten (WATERBURY et al. 1979).

Cyanobakterien gelten als evolutiv älteste Mikroorganismen mit über 3 Milliarden

Jahren Entwicklung (GLAZER 1977). Durch die Freisetzung von Sauerstoff in der

photosynthetischen Reaktion, analog den Pflanzen und Grünalgen, und dem

Entfernen von Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre waren diese Prokaryonten

essentiell an der Entwicklung der heutigen Biosphäre beteiligt (TANDEAU DE MARSAC

und HOUMARD 1993).

Aufgrund der großen Homologien in biochemischen Prozessen und der

Photosynthese-Reaktion wird eine Verwandtschaft zwischen den Cyanobakterien

und den Chloroplasten der Algen und Pflanzen vermutet (RAVEN und ALLEN 2003).

1.1.1 Morphologie der Cyanobakterien

Morphologisch weisen Cyanobakterien eine große Diversität auf, wobei sie

unizellulär oder in Filamenten, einzeln oder in Kolonien auftreten (WHITTON und

POTTS 2000). Außerdem können sie Mikrobenmatten und Wasserblüten bilden

(MADIGAN et al. 2001). Die Zellteilung der unizellulären Cyanobakterien kann in einer

oder mehreren Ebenen erfolgen; die Vermehrung der filamentösen Cyanobakterien

geschieht durch Filamentbrüche, so genannte Hormogonien oder durch die

Ausbildung von Akineten (WHITTON und POTTS 2000). Dabei kann es zu einer Zelllyse

einzelner Zellen im Filament kommen (necridische Zellen), wodurch die

Fragmentierung der Filamente begünstigt wird (CASTENHOLZ 2001). Als äußere,

1. Einleitung 2

protektive Abgrenzung zur Umgebung weisen zahlreiche Cyanobakterien eine Hülle

auf, die je nach Konsistenz als Glycokalix, Scheide oder Kapsel bezeichnet wird

(CASTENHOLZ 2001) und als Biopolymer in den letzten Jahren in den Fokus für eine

industrielle Nutzung gerückt ist (DE PHILIPPIS et al. 1993).

Obwohl Cyanobakterien keine Geißeln oder Flagellen besitzen (CASTENHOLZ 2001),

ist bei einigen Gattungen eine langsame, gleichmäßige, gleitende Bewegung

nachgewiesen worden. Vor allem filamentöse Cyanobakterien können auf festen

oder halbfesten Untergründen eine gleitende Motilität aufweisen (HOICZYK und

HANSEL 2000).

Cyanobakterien können eine Vielzahl verschiedener Einschlusskörper wie

Glycogengranula (Polyglukose), Cyanophycin (ein Polymer aus Arginin und

Asparagin), Carboxysomen (Speicherung kristalliner Enzyme des Calvin-Zyklus wie

RUBISCO), Polyphosphatgranula oder Gas-Vesikel aufweisen (CASTENHOLZ 2001).

Neben den vegetativen Zellen können bei Cyanobakterien differenzierte Zellen

nachgewiesen werden. Aerob stickstofffixierende Cyanobakterien können

Heterozysten zum Schutz der sauerstoffempfindlichen Nitrogenase ausbilden. Die

Synthese der Heterozysten, die durch eine dicke Zellwand und die Abwesenheit des

sauerstoffproduzierenden Photosystems II gekennzeichnet ist, wird durch

Stickstoffmangel induziert (FUCHS 2007). Unter Mangelbedingungen wie z.B. Licht

oder Nährstoffe können Akineten ausgebildet werden, die wegen ihrer dickeren

Zellwand längere Zeit tolerant gegenüber Austrocknung, Gefrieren oder hohe

Salzkonzentrationen sind (VAN DOK und HART 1997).

1.1.2 Photosynthetisch aktive Pigmente

Cyanobakterien sind in der Lage, Chlorophyll a als primäres Photopigment sowie

akzessorische Pigmente (Carotinoide und Phycobiliproteine) zu synthetisieren

(LAWLOR 1990), die zusammen in einer charakteristischen Grün-Blaufärbung der

Cyanobakterien resultieren. Dabei wird Licht mit Wellenlänge im Rot- und

Blaulichtbereich des sichtbaren Lichtes von dem Chlorophyll a absorbiert und Licht

aus dem Grün, Gelb- und Orangelichtbereich von den Phycobiliproteinen absorbiert

(SIDLER 1994).

Cyanobakterien besitzen, wie Grünpflanzen und Algen, sowohl Photosystem I (PS I)

als auch Photosystem II (PS II), wobei Wasser als Elektronendonator fungiert und

Sauerstoff entsteht (oxygene Photosynthese) (WHITTON und POTTS 2000). Der Ort

1. Einleitung 3

der Photosynthese ist die Thylakoidmembran, in der die photosynthetisch aktiven

Pigmente lokalisiert sind (BALD et al. 1996).

Anoxyphotobakterien, wie Purpur und Grüne Bakterien, fehlt das Photosystem II. Sie

sind nicht in der Lage Wasser als Elektronendonator zu verwenden und können

somit niemals Sauerstoff während der Photosynthesereaktion freisetzen (FISCHER

1987).

1.1.2.1 Struktur und Funktion der Thylakoide

Wie andere Gram-negative Prokaryonten weisen Cyanobakterien eine äußere

Begrenzung aus Cytoplasmamembran, Peptidoglykanschicht und äußerer Membran

auf (HOICZYK und HANSEL 2000). Zusätzlich weisen Cyanobakterien ein internes

System von Thylakoidmembranen auf, das häufig Großteile des Cytoplasmas

einnimmt und ein separates, membranumschlossenes Kompartiment darstellt,

welches nicht in direktem Kontakt zur Plasmamembran zu stehen scheint (LIBERTON

et al. 2006). Dabei zeigen Cyanobakterien nicht die für Grünpflanzen typische

Membran-Stapelung (ANDERSSON und ANDERSON 1980).

In die Thylakoidmembran sind die komplette photosynthetische Elektronen-

transportkette mit den Reaktionszentren PS I und PS II sowie der Cytochrom b6f-

Komplex integriert (MULLINEAUX 1999), die über Elektronen-Carrierproteine gekoppelt

sind. Außerdem sind die wichtigsten Antennensysteme, die Phycobilisome (siehe

nachfolgendes Kapitel) und Carotinoide, an die Membranoberfläche bzw. an das

Reaktionszentrum II assoziiert (BALD et al. 1996).

Carotinoide absorbieren Licht im Bereich zwischen 400 und 530 nm und leiten die

gewonnene Energie über die Phycobiliproteine zum Chlorophyll a. Außerdem wirken

sie photoprotektiv, da sie zu helles Licht absorbieren und toxische Sauerstoffderivate

detoxifizieren (NELSON und COX 2001).

Phycobiliproteine absorbieren Wellenlängen zwischen 500 und 650 nm und

transferieren die so absorbierte Energie an das Chlorophyll a (ANDERSON und TOOLE

1998). Zusätzlich zu den photosynthetisch aktiven Pigmenten enthält die

Thylakoidmembran auch die Protonen-translozierenden ATPasen sowie Enzyme der

Atmungskette (MULLINEAUX 1999).

1. Einleitung 4

1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome

Phycobilisome (PBS) sind supramolekulare Komplexe von Phycobiliproteinen, die als

bedeutendste lichtsammelnde Antennen in Cyanobakterien fungieren (BRYANT et al.

1979). Phycobiliproteine sind wasserlösliche Proteine, die kovalent verknüpfte,

offenkettige Tetrapyrrole (Phycobiline) beinhalten (SIDLER 1994).

Phycobiliproteine können, bei niedriger Belichtung und ausreichend Nährstoffen

während des Wachstums, bis zu 40% der Gesamtproteinmenge der Zelle

ausmachen (GLAZER 1994). Lokalisiert sind die Phycobilisome in Reihen auf der

Oberfläche der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran (TANDEAU DE

MARSAC 2003), wobei sie mit dem Photosystem II assoziiert sind und einen PS II-

PBS-Superkomplex bilden (BALD et al. 1996).

Phycobilisome bestehen aus 2 Strukturdomänen, dem inneren Kern bestehend aus

dem Phycobiliprotein Allophycocyanin (AP) und den peripheren zylindrisch

angeordneten Stäbchen bestehend aus den Phycobiliproteinen Phycoerythrin (PE)

und Phycocyanin (PC) (WESTERMANN und WEHRMEYER 1995), sowie die für den

strukturellen Aufbau und der funktionellen Organisation essentiellen Linkerproteine

(SIDLER 1994). Dabei sind die Allophycocyaninmoleküle mit der photosynthetischen

Membran in unmittelbarem Kontakt und von Phycoerythrin und Phycocyanin

umgeben (Abb. 1). Die außen gelegenen Pigmente absorbieren kurzwelligeres und

somit energiereicheres Licht (PE: ~550 nm; PC: ~620 nm) und leiten die gewonnene

Energie mit einer Effizienz von nahezu 100% (BRYANT et al. 1979) auf

Allophycocyanin weiter (Excitonentransfer), welches eng mit dem Reaktionszentrum

verbunden ist (MADIGAN et al. 2001).

Abb. 1: Aufbau eines Phycobilisomes aus Allophycocyanin (AP), Phycoerythrin (PE) und Phycocyanin (PC) und der Energieübertragung (Excitonentransfer) zum Chlorophyll a auf der cytoplasmatischen Seite der Thylakoidmembran. Dargestellt ist der Kern aus AP mit sechs peripheren, zylindrischen Stäbchen aus PE und PC (aus NELSON und COX 2001).

1. Einleitung 5

Phycobilisome werden auf Grund ihres Aufbaus in zwei Klassen unterteilt.

Charakteristisch für Cyanobakterien ist die hemidiscoidale Anordnung der

Phycobilisome mit sechs peripheren Zylindern (WESTERMANN und WEHRMEYER 1995),

während einige Rotalgen hemiellipsiodiale Phycobilisome aufweisen (GANTT und

CONTI 1966). Cyanobakterien können als Reaktion auf Veränderungen der

Lichtintensität und Lichtqualität die relativen Anteile an photosynthetischen

Pigmenten verändern. Die Veränderung durch Modifikation der Phycobilisome wird

als „Komplementäre Chromatische Adaptation“ bezeichnet (TANDEAU DE MARSAC und

HOUMARD 1988).

1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation

GAIDUKOV (1903) beobachtete eine Modifizierung der Pigmentzusammensetzung bei

Cyanobakterien mit wechselnder Lichtqualität, ein Phänomen, das als

„Komplementäre Chromatische Adaptation“ beschrieben wurde. Diese Pigment-

Veränderungen sind auf eine Verschiebung des Phycoerythrin/Phycocyanin-

Verhältnisses zurückzuführen (BORESCH 1922 und TANDEAU DE MARSAC 1977). Dabei

wird nur die Zusammensetzung der peripheren Phycobiliproteine verändert, nicht

aber der Kern aus Allophycocyanin (TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD 1993).

Gemäß ihren Fähigkeiten zur Komplementären Chromatischen Adaptation werden

Cyanobakterien nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) in 3 Gruppen

unterteilt. Gruppe 1 beinhaltet Stämme, die nicht zur Veränderung des

Phycoerythrin/Phycocyanin-Verhältnisses in der Lage sind und die Pigmente

mengenmäßig unabhängig von der Wellenlänge des Lichtes synthetisieren.

Organismen der Gruppe 2 betreiben eine unidirektionale Adaptation durch

Modifikation der Synthese von ausschließlich Phycoerythrin. Die Syntheserate von

Phycoerythrin ist im Grünlicht maximal, in Rotlicht hingegen minimal oder erfolgt gar

nicht. Phycocyanin wird, unabhängig von der Wellenlänge des einfallenden Lichtes,

konstant synthetisiert.

Eine bidirektionale Adaptation, eine Veränderung der Synthese von Phycoerythrin

und Phycocyanin erfolgt bei Stämmen der Gruppe 3. Bei einfallender Wellenlänge im

Grünlichtbereich ist die Synthese von Phycoerythrin maximal, von Phycocyanin

minimal, wird aber nicht total unterdrückt. Dagegen wird unter Rotlichteinfluss

Phycocyanin vermehrt synthetisiert, während die Synthese von Phycoerythrin nur

minimal ist, aber immer erfolgt.

1. Einleitung 6

1.2 Taxonomische Einteilung von Cyanobakterien

1.2.1 Historische Entwicklung der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien

Traditionell wurden die „Cyanophyta“ durch den „International Code of Botanical

Nomenclature (ICBN)“ beschrieben (COMPERE 2005). Die Einteilung und

Nomenklatur von Cyanobakterien als Prokaryonten erfolgte erst Ende der 70iger

Jahre des letzten Jahrhunderts aufgrund eines Antrages von STANIER und

Mitarbeitern (1978) durch den „International Code of Nomenclature of Procaryotes

(ICNP)“. Da bisher keine endgültige Festlegung erfolgte, ist ein duales ICBN/ICNP

Nomenklatursystem entstanden (OREN und TINDALL 2005).

Der zeitliche Abschnitt zwischen 1886-1892 leitete den Begin der Beschreibung

filamentöser Cyanobakterien ein (WHITTON und POTTS 2000). GOMONT (1892)

charakterisierte 15 Genera der Familie Oscillatoriaceae anhand ihrer Form, der

Anwesenheit einer Scheide sowie der Anordnung ihrer Trichome. GEITLER (1932)

vervollständigte diesen Bestimmungsschlüssel mit zusätzlichen Kriterien wie

Zellgröße, Zellform, Pigmentierung und Zellzahl pro Kolonie sowie dem natürlichen

Habitat (siehe ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988). Der Autor unterteilte

Cyanobakterien in kokkoide, mit den Ordnungen Chroococcales und Pleurocapsales

und filamentöse Formen mit den Ordnungen Nostocales und Stigonematales

(LITVAITIS 2002). Das Buch „Cyanophyceae“ gilt bis heute als Grundlage für alle

verwendeten Bestimmungsschlüssel (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988). Allerdings

wurden nach GEITLER (1932) Organismen anhand eines einzigen abweichenden

Kriteriums schon als neue Spezies definiert, was zu über 1500 Spezies in ungefähr

150 Genera führte (LITVAITIS 2002). Da viele dieser Charakteristika unter

wechselnden Umweltbedingungen variabel sind und phenotypische Veränderungen

beobachtet wurden (PEARSON und KINGSBURY 1966), erfolgte eine vereinfachte

Einteilung der Cyanobakterien in nur noch neun Genera durch DROUET (1981). Trotz

dieser Einfachheit fand dieses System keine Anerkennung (LITVAITIS 2002).

RIPPKA und Mitarbeiter (1979) entwickelten eine aktuell noch verwendete Einteilung

in fünf Gruppen (Sektionen I-V) basierend auf morphologischen Kriterien (Tab. 1).

Eine ausführlichere Betrachtung der Ordnung Oscillatoriales erfolgt im nächsten

Abschnitt (siehe Kap. 1.2.2).

1. Einleitung 7

Tab. 1: Einteilung von Cyanobakterien in fünf Ordnungen nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979), aufgrund morphologischer Kriterien und der Art der Zellteilung (modifiziert nach WHITTON und POTTS 2000)

Unterabteilung Ordnung Kriterien zur Klassifizierung

I ChroococcalesUnizellulär oder in Aggregaten; binäre

Teilung in einer, zwei oder drei Ebenen-symmetrisch oder

asymmetrisch

II Pleurocapsales

nicht filamentös Unizellulär oder in Aggregaten;

Reproduktion durch interne multiple Zellteilung

III OscillatorialesBinäre Teilung in einer Ebene; keine

Bildung von Heterozysten oder Akineten

IV Nostocales Binäre Teilung in einer Ebene; Bildung

von Heterozysten und teilweise Akineten

V Stigonematales

filamentös

Binäre Teilung in einer oder mehreren Ebenen; verzweigte Filamente;

Bildung von Heterozysten

Als weit verbreitetes Handbuch zur Klassifizierung von Prokaryonten dient „Bergey’s

Manuel of Systematic Bacteriology“ (1989 und 2001) mit einer Einteilung der

Cyanobakterien auf Form-Genus-Ebene. Es beinhaltet Richtlinien zur Beschreibung

anhand multidisziplinärer Charakteristika wie morphologischer, biochemischer,

physiologischer und ökologischer Kriterien (SUDA et al. 2002). Obwohl „Bergey’s

Manuel of Systematic Bacteriology“ viele operative Vorteile bietet, ist diese Form der

Klassifizierung nicht offiziell von der ICSP (International Committee on Systematics of

Procaryotes) anerkannt (OREN und TINDALL 2005).

Der neueste Bestimmungsschlüssel „Cyanoprokaryota“ für Cyanobakterien wurde

von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) verfasst und stellt eine große und

bedeutende Revision dar. Das traditionelle System wurde durch neue Kriterien wie

Zellgrößenverhältnis und Zellteilung, Vorkommen und Lokalisation von Gas-Vesikeln,

Anordnung der Thylakoide und Motilität der Zellen erweitert.

1. Einleitung 8

1.2.2 Die Ordnung Oscillatoriales

Die Ordnung Oscillatoriales unterlag, genau wie andere Cyanobakterien, vielen

taxonomischen Umstrukturierungen und Namensänderungen. In dem modernisierten

Bestimmungsschlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (1988) wurden die vier

Gattungen Phormidium, Gomontinema, Hansgirgia und Geitlerinema beschrieben. In

dem aktuellen Bestimmungsschlüssel „Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und

KOMAREK 2005) wird die Familie Pseudanabaenaceae (Ordnung Oscillatoriales) in

vier Unterfamilien mit sechs Gattungen innerhalb der Unterfamilie

Pseudanabaenoideae (Abb. 2) differenziert.

Charakteristisch für die Oscillatoriales sind Filamente ohne Heterozysten oder

Akineten. Der G+C-Gehalt der Oscillatoriales wird zwischen 40 und 67 mol%

angegeben (MADIGAN et al. 2001). Weitere Einteilungen erfolgen anhand von

Kriterien wie Anwesenheit einer Scheide sowie deren Beschaffenheit und der Farbe

der Zellen. Zur weiterführenden Einteilung auf Spezies-Ebene werden taxonomische

Kriterien wie Zellgröße, Zellform und zelluläre Einschlusskörper (Granula) sowie

deren Lokalisation innerhalb der Zelle verwendet (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005).

Abb. 2: Taxonomische Einteilung der Familie Pseudanabaenaceae (Ordnung Oscillatoriales) unter besonderer Berücksichtigung der Gattungen innerhalb der Unterfamilie Pseudanabaenoideae (nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005)

Pseudanabaenaceae

Pseudanabaenoideae Spirulinoideae Leptolyngbyoideae Heteroleibeinioideae

Romeria Arthronema Pseudanabaena Limnothrix Jaaginema Geitlerinema

Familie:

Unterfamilie:

Gattung:

Pseudanabaenaceae

Pseudanabaenoideae Spirulinoideae Leptolyngbyoideae Heteroleibeinioideae

Romeria Arthronema Pseudanabaena Limnothrix Jaaginema Geitlerinema

Familie:

Unterfamilie:

Gattung:

1. Einleitung 9

1.2.3 Probleme der taxonomischen Einteilung

Problematisch bei der taxonomischen Einteilung von Cyanobakterien ist vor allen

Dingen die morphologische Variabilität bei unterschiedlichen Wachstums-

bedingungen. Diese morphologische Vielfalt macht die Nutzung

molekularbiologischer Daten zur weiteren Klassifizierung unumgänglich. Eine

entscheidende Rolle spielt dabei die DNA-Sequenzierung, die evolutive

Verwandtschaften darstellen kann (PREMANANDH 2006). Die steigende Zahl an

Methoden, wie Elektronenmikroskopie, G+C-Gehalts-Bestimmungen, HPLC (High

Performance Liquid Chromatography), Pigmentanalyse, DNA-Fragmentierung etc.

führt zu immer mehr Klassifizierungs-Kriterien, die in der aktuellen

Bestimmungsliteratur noch nicht beschrieben wurden und daher rückwirkend

berücksichtigt werden müssten (OREN und TINDALL 2005). Eine umfangreiche

Beschreibung mit polyphasischer Betrachtung, die morphologische, physiologische

und genetische Bestandteile aufweist, ist zur möglichst vollständigen Beschreibung

eines Cyanobakteriums daher unumgänglich.

1. Einleitung 10

1.3 Ziel der Arbeit

Ziel dieser Diplomarbeit ist eine polyphasische Beschreibung des bisher noch nicht

ausführlich charakterisierten, filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1. Zusätzlich

zu einer morphologischen Beschreibung sollen physiologische Parameter wie

Lichtintensität, pH-Wert und Salzgehalt des Mediums für das Wachstum der Kulturen

optimiert werden. Außerdem sollen die Fähigkeiten zur Verwertung verschiedener

Stickstoffquellen und Stickstofffixierung untersucht werden. Molekularbiologische

Untersuchungen zur Einordnung von Stamm Flo1 in einen phylogenetischen

Stammbaum sollen mittels Amplifizierung und Sequenzierung der 16S rDNA sowie

des Gens gyrB und einer Analyse des Fettsäuremusters erfolgen. Zusätzlich soll die

Erstellung von spezifischen Fragment-Mustern durch RAPD (Random Amplified

Polymorphism DNA) und ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) sowie die

Ermittlung des G+C-Gehaltes Auskunft über Verwandtheitsbeziehungen geben.

Die unterschiedliche Pigmentierung von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen

Lichtintensitäten soll qualitativ und quantitativ mittels HPLC und photometrischer

Messungen determiniert werden. Ferner soll die Fähigkeit zur Komplementären

Chromatischen Adaptation untersucht werden.

Außerdem sollen durch elektronenmikroskopische Aufnahmen (TEM) Details zum

Aufbau der Zelle und Lokalisation von Ultrastrukturen aufgeklärt werden.

2. Material und Methoden 11

2. Material und Methoden

2.1 Verwendete Cyanobakterien-Stämme und deren Herkunft

Stamm Flo1 wurde der Stammsammlung der Abteilung Marine Mikrobiologie der

Universität Bremen entnommen. Der aus der Pasteur-Culture-Collection (PCC, Paris,

Frankreich) erworbene Stamm PCC 7105 diente als Referenzstamm und wurde

sowohl für morphologische Beschreibungen als auch für molekularbiologische

Analysen verwendet.

2.2 Kulturbedingungen und verwendete Medien

2.2.1 Verwendete Medien

Die Anzucht der Cyanobakterien erfolgte im „Artificial Seawater Nutrient“-Medium

(ASNIII/2) mit Nitrat (nach RIPPKA et al. 1979). Die Zusammensetzung des Basis-

Mediums ist in Tabelle 2, die nach dem Autoklavieren des Mediums steril

zugegebenen Zusätze (sterilfiltriert) sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tab. 2: Zusammensetzung des Basis-Mediums ASNIII/2 mit Nitrat (nach RIPPKA et al. 1979) mit Berechnung der jeweiligen Endkonzentration Komponenten g/l Konzentration [mM] NaCl 12,5 213,9 MgCl2 x 6 H2O 1,0 4,9 KCl 0,25 3,4 MgSO4 x 7 H2O 1,75 7,1 CaCl2 x 2 H2O 0,25 1,7 NaNO3 0,75 8,8 Aqua bidest. 900 ml - Separat ansetzen: Na2CO3*1 0,12 g/100 ml 11,3

*1: Natriumcarbonat (Na2CO3) wurde in Aqua bidest. gelöst und separat autoklaviert um

Ausfällungen im Medium zu vermeiden, die Zugabe erfolgte steril nach dem Autoklavieren.


Tab. 3: Zusammensetzung der dem Basis-Medium (siehe Tab. 2) zugegebenen steril-filtrierten Lösungen (nach RIPPKA et al. 1979)

Zusätze Stammlösung [g/l] Zugabe (ml/l Basis-Medium)

K2HPO4 x 3 H2O 4,0 2,5 Eisen-Ammonium-Citrat 6,0 0,25 Spurenelement-Lösung (TMM) *2 *3 0,5 Vitamin B12 0,01 0,5 *2: Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung (Trace-Metal-Mix) ist in Tabelle 4 dargestellt. *3: Angabe nicht möglich, da die TMM-Lösung unterschiedliche Mengen der einzelnen Komponenten enthält (siehe Tab. 4) Tab. 4: Zusammensetzung der Spurenelement Stammlösung (TMM) (nach RIPPKA et al. 1979)

Komponenten g/l Na3-Citrat x 2 H2O 3,0 Na2-EDTA x 2 H2O 5,0 H3BO3 2,86 MnCl2 x 4 H2O 1,81 ZnSO4 x 7 H2O 0,22 Na2MoO4 x 5 H2O 0,39 CuSO4 x 5 H2O 0,08 Co(NO3)2 x 6 H2O 0,05

Das Kulturmedium wies eine Salinität von 15-16‰ auf und wurde bei

Raumtemperatur (RT) im Dunkeln gelagert.

2.2.2 Kulturbedingungen

Die Hälterung der Kulturen während des Wachstums erfolgte im Brutraum bei einer

konstanten Temperatur von 21 °C. Im Abstand von 4 Wochen wurden Teile der

Kulturen in frisches Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) in sterile 50 ml, 100 ml oder 250 ml

Erlenmeyerkolben (EMK) mit Zellstoffstopfen inokuliert. Die Beleuchtung erfolgte

versuchsabhängig bei unterschiedlich hohen Photonenflussdichten (PFDs)

(Lichtquelle: Osram L 36W/72) von 1 bis 20 µE m-2 s-1 PAR (Photosynthetically Active

Radiation [photosynthetisch aktive Strahlung], entspricht 400 bis 700 nm) sowie nur

unter Rot- bzw. Grünlicht (Glühbirne: Osram 25W decor). Die Quantifizierung der

PFDs erfolgte mittels Lichtsensor (Quantitherm Lightmeter/Thermometer;

Hansatech).


2.2.3 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1

Zur Herstellung von axenischen Kulturen müssen die heterotrophen Bakterien aus

dem Medium entfernt werden. Heterotrophe Bakterien und Cyanobakterien leben in

enger Assoziation zu beidseitigem Nutzen. Die phototrophen Cyanobakterien geben

labile Substrate im Austausch gegen remineralisierte Nährstoffe an die heterotrophen

Bakterien (TUOMAINEN et al. 2006). Die Eliminierung der heterotrophen Bakterien aus

dem Medium erfolgte mittels Percoll-Zentrifugation (nach PALINSKA et al. 1999,

modifiziert von HUBE 2007, persönliche Mitteilung) sowie durch die Zugabe

verschiedener Antibiotika (modifiziert nach VÁZQUEZ-MARTÍNEZ et al. 2004).

2.2.3.1 Probenvorbereitung

Nach einer Behandlung im Ultraschallbad (Transsonic Digital) für 10 min bei höchster

Stufe (Stufe 9) erfolgten 4 Waschschritte zur Trennung der Filamente von

Zelltrümmern. Dabei wurde jeweils nach Zentrifugation bei 10.000 rpm für 10 min

(Heraeus Instruments; Biofuge pico) der Überstand dekantiert und das Zellpellet in

200 µl Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) resuspendiert. Zur endgültigen Trennung der

Cyanobakterien von den heterotrophen Bakterien wurde das nach dem letzten

Waschschritt resuspendierte Zellmaterial mit 1,8 ml Percollstammlösung (1 ml 10x

ASNIII/2 ohne Nitrat + 9 ml Percoll-Lösung) versetzt und bei 14.000 rpm und 20 °C

(Beschleunigung/Verlangsamung 1) über 3 h zentrifugiert. Anschließend wurde die

entstandene Cyanobakterien-Bande mittels Kanüle einer sterilen Spritze in ein

steriles 10 ml Schraubdeckelgefäß mit 5 ml sterilfiltriertem Medium (ASNIII/2 mit

Nitrat) überführt.

2.2.3.2 Eliminierung heterotropher Bakterien durch Zugabe von Antibiotika

Zur Eliminierung der heterotrophen Bakterien im Medium erfolgte die Zugabe von

50 µl Rifampicin (Endkonzentration 100 µg/ml). Nach 24 Stunden wurden die Zellen

durch 4faches Waschen (siehe Kap. 2.2.3.1) in 5 ml sterilfiltriertes Medium überführt

und über 4 Wochen bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten

PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR inkubiert. Nach 4 Wochen erfolgte eine mikroskopische

Kontrolle der Kulturen (Zeiss Axiolab) und die Zugabe von Chloramphenicol

(Endkonzentration 100 µg/ml) mit anschließenden Waschschritten und

mikroskopischer Kontrolle (s. o.). Nach einer Wachstumsphase von 5 Wochen


erfolgte die Zugabe von Kanamycin (Endkonzentration 150 µg/ml) mit

anschließenden Waschschritten und mikroskopischer Kontrolle (s. o.) sowie einer

Inkubation über 4 Wochen.

2.3 Morphologische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105

Eine morphologische Beschreibung erfolgte sowohl für den noch nicht klassifizierten

Stamm Flo1 als auch für den Referenzstamm PCC 7105. Zusätzlich sollte Stamm

Flo1 auf Basis der morphologischen Charakterisierung unter zu Hilfenahme von

Literaturbestimmungsdaten klassifiziert werden.

2.3.1 Probenvorbereitung

Die untersuchten Kulturen wurden, wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben, in ASNIII/2-

Medium mit Nitrat für 3 Wochen bei einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR

gehältert.

2.3.2 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Betrachtung

Lichtmikroskopische Untersuchungen wurden an einem Mikroskop mit

Fluoreszenzlampe (Zeiss Axiolab) bei 100facher sowie 1000facher Vergrößerung

durchgeführt. Fotographien wurden mit der integrierten Kamera (Zeiss MC 80)

gemacht. Die Bearbeitung der digitalen Bilder erfolgte mit den Programmen „Paint“

und „IrfanView“.

2.3.3 Zellgrößenbestimmung

Die Längen- und Breitenbestimmung der Zellen erfolgte mit Hilfe eines

Okularmikrometers bei 1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl. Es wurden nur

intakte Zellen ausgewertet, die sich in einem mindestens 30 Zellen umfassenden

Filament befanden. Der Bestimmungsumfang betrug 20 vegetative Zellen aus

verschiedenen Filamenten.


2.3.4 Scheiden-Nachweis

Da verschiedene Zellfärbetechniken wegen einer möglichen Polysaccharidschicht die

Zellen nicht erreichen und somit nicht als Positivnachweis dienen können, erfolgte

der Scheiden-Nachweis ausschließlich mikroskopisch bei 1000facher Vergrößerung

mit Immersionsöl. Um auch eine sehr dünne Scheide nachweisen zu können, wurde

die Kultur für 15 Tage Mangelbedingungen (Wachstum im Dunkeln) ausgesetzt, um

Filamentbrüche herbeizuführen und Reste der Scheide an den Bruchstellen sichtbar

zu machen. Fotographien wurden mit einer Digitalkamera (HP photosmart 715) durch

das Okular (mit Okularmikrometer) gemacht.

2.3.5 Motilitäts-Nachweis

Um die Motilität auf festen Oberflächen nachzuweisen, wurden Schwärm-Versuche

auf Agarplatten durchgeführt. Dazu wurden Agarplatten (ASNIII/2 mit und ohne Nitrat

mit 0,2% Glukose, 0,02% Caseinhydrolysat und 1,5% Agar) hergestellt und in der

Mitte der Platte mit 10 µl Zellkultur inokuliert. Die Inkubation erfolgte bei einer

konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR.

Zusätzlich wurden Agarplatten zur Hälfte mit Aluminiumfolie bedeckt, um

gegebenenfalls eine gerichtete Bewegung nachweisen zu können. Die Auswertung

erfolgte nach einer Inkubationszeit von 21 Tagen.

2.3.6 Klassifizierung von Stamm Flo1 aufgrund morphologischer Merkmale anhand von Literaturdaten

Auf Basis der morphologischen Charakterisierung wurde Stamm Flo1 durch diverse

Bestimmungsschlüssel klassifiziert. Dazu wurde die Literatur „Cyanophyceae“

(GEITLER 1932), „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology“ (2001) sowie

„Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005) verwendet.


2.4 Physiologische Charakterisierung von Stamm Flo1

Durch eine physiologische Charakterisierung sollten die Wachstumsbedingungen für

Stamm Flo1 optimiert werden. Zur Untersuchung des Wachstumsverhaltens von

Stamm Flo1 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wurden die

Wachstumsbedingungen variiert. Dazu wurden die Kulturen bei unterschiedlichen

Photonenflussdichten (PFDs) gehältert. Außerdem wurde die Zusammensetzung des

„Standard-Mediums“ (ASNIII/2 mit Nitrat) modifiziert, um den Einfluss von Salzgehalt,

pH-Wert, Vitamin-Bedarf und die Verwertung verschiedener Stickstoffverbindungen

zu untersuchen. Zusätzlich sollte mittels Acetylen-Reduktions-Test die Fähigkeit zur

Stickstofffixierung nachgewiesen werden.

2.4.1 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (PFDs)


Zur Ermittlung der optimalen Beleuchtungsbedingungen für das Zellwachstum

wurden die Kulturen, wie in Kapitel 2.2.2 beschrieben, inokuliert und bei

unterschiedlichen PFDs (1, 5, 10, 15 und 20 µE m-2 s-1 PAR) im Doppelansatz über

einen Zeitraum von 4 Wochen inkubiert. Es wurden Vorkulturen eingesetzt, die

ebenfalls unter den entsprechenden Lichtbedingungen für 4 Wochen an die

Lichtbedingungen adaptiert wurden. Zum Zeitpunkt der ersten Messung (t0) wurde

Biomasse aus den Vorkulturen entnommen und in sterile 50 ml Erlenmeyerkolben

(EMK) mit Zellstoffstopfen und 30 ml Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überführt. Im

Abstand von 48 Stunden wurden die Chlorophyll a- und Proteingehalte [mg/ml] im

bestimmt.

2.4.1.2 Auswertung

Die Quantifizierung des Wachstums erfolgte photometrisch durch Bestimmung des

Chlorophyll a-Gehaltes nach MACKINNEY (siehe Kap. 2.4.1.2.1) und des Protein-

gehaltes nach BRADFORD (siehe Kap. 2.4.1.2.2) im zeitlichen Abstand von 48

Stunden sowie der Bildung des Quotienten aus den Mittelwerten. Zusätzlich wurde

der pH-Wert in den Überständen (siehe Kap. 2.4.1.2.3) nach dem Wachstum

bestimmt.


2.4.1.2.1 Chlorophyll a-Bestimmung nach MACKINNEY (1941)

Die Chlorophyll a-Bestimmung erfolgte mittels Methanolextraktion nach MACKINNEY

(1941). Dazu wurde die Kultur im EMK durch mehrfaches Durchmischen mittels

Pasteur-Pipette (PP) homogenisiert. Nach Entnahme von 1 ml Kulturflüssigkeit und

Überführung in ein Eppendorfreaktionsgefäß (ERG) erfolgte eine Zentrifugation

(Heraeus Instruments; Biofuge pico) für 5 min bei 13.000 rpm. Der Überstand wurde

für eine spätere pH-Wert-Messung (siehe Kap. 2.4.1.2.3) in ein neues 2 ml ERG

überführt.

Das Pellet wurde in 1 ml Methanol für 10 sec auf einem Whirl-Mix resuspendiert und

bei 4 °C im Dunkeln für 1 h stehen gelassen. Nach erneuter Zentrifugation (s. o.)

wurde der Überstand in eine Messküvette (Plastibrand, 1,5 ml halbmicro PS)

überführt und bei 665 nm am Photometer (Biochrom Libra S12) gegen Methanol als

Blindwert gemessen. Die Chlorophyll a-Konzentration wurde mittels spezifischem

Extinktionskoeffizienten (74,5 ml mg-1 cm-1) berechnet.

Anschließend wurde das ERG unter einem Abzug 10 min offen stehen gelassen, um

restliches Methanol weitgehend zu verdampfen. Das Pellet wurde zur Bestimmung

der Proteinmenge nach BRADFORD (siehe nachfolgendes Kapitel) eingesetzt.

2.4.1.2.2 Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976)

Die Bestimmung des Protein-Gehaltes wurde modifiziert nach der Methode von

BRADFORD (1976) durchgeführt, welche als empfindlichster quantitativer Färbe-Assay

gilt (LOTTSPEICH et al. 1998).

Zur Protein-Bestimmung wurde das Pellet aus der Bestimmung des Chlorophyll a-

Gehaltes verwendet (siehe Kap. 2.4.1.2.1). Die Herstellung des BRADFORD-Reagenz

erfolgte durch Lösen von 40 mg Comassie Brilliant Blue in 50 ml Ethanol abs. und

100 ml Phosphorsäure (85%). Das Endvolumen betrug 1 l und wurde durch Zugabe

von Aqua bidest. erreicht.

Zur Denaturierung der Proteine erfolgten die Zugabe von 1 ml NaOH (1 M) und eine

Erhitzung im Wasserbad auf 90 °C für 5 min. Danach wurden die Proben sofort im

Eis für 10 min gekühlt. Aus dem Überstand wurden 100 µl entnommen, in 1 ml

BRADFORD-Reagenz überführt und sofort 10 sec lang auf einem Whirl-Mix

durchmischt. Anschließend wurden die Proben in eine Messküvette (s. o.) überführt,

und nach insgesamt 90 sec Reaktionszeit wurde die Absorption bei 595 nm


gemessen. Als Blindwert wurde 1 ml BRADFORD-Reagenz mit 100 µl NaOH (1 M)

verwendet.

Die Berechnung des Proteingehaltes erfolgte anhand von Kalibrierungskurven mit

bekannter Konzentration an Bovine Serum Albumin (BSA) von 0 bis 10 µg.

Diese waren im Bereich von 0-10 µg linear und wiesen ein Bestimmtheitsmaß ≥

99,57% auf.

2.4.1.2.3 pH-Wert-Bestimmung in den Kultur-Überständen

Der vor der Chlorophyll a-Messung entnommene Kultur-Überstand (siehe Kap.

2.4.1.2.1) wurde für die Messung des pH-Wertes verwendet. Dabei wurden die

Überstände der beiden Parallelansätze vereinigt. Die Messung erfolgte mittels pH-

Streifen (pH 6.0-10.0; Macherey-Nagel), wobei im Abstand von 4 Tagen die pH-

Werte der Überstände bestimmt wurden.

2.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung einer Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht

Zur Validierung einer Korrelation zwischen Feucht- und Trockengewicht der

cyanobakteriellen Biomasse von Stamm Flo1 wurde eine Kalibrierungskurve erstellt.

Definierte Mengen Biomasse (Feuchtgewicht) aus einer homogenen Kultur (siehe

Kap. 2.4.3.1) wurden in dekadischer Abfolge (10 mg bis 100 mg) mittels

Analysenwaage (Sartorius, MC 1 Research RC 210P) abgewogen und im

Wärmeofen bei 60 °C über Nacht getrocknet. Die Biomassetrockengewichte wurden

bestimmt und in Abhängigkeit von den Feuchtgewichten graphisch dargestellt.


2.4.3 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten

Die Ermittlung der zum Wachstum optimalen Salzkonzentration erfolgte modifiziert

nach MARGHERI und Mitarbeitern (2003).


Für die Untersuchung des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei

unterschiedlichen Salinitäten wurden Vorkulturen eingesetzt, die bei einer konstanten

Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR im ASNIII/2-

Medium mit Nitrat über 4 Wochen gehältert wurden. Die Kulturen wurden in

Zentrifugenröhrchen überführt und bei 11.000 rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman

Zentrifuge; Rotor JA-20). Anschließend wurde der Überstand verworfen, und die

Pellets wurden vereinigt und homogenisiert. Aus dem entstandenen Homogenat

wurde die Biomasse für die Inokulation entnommen. Dazu wurden 80,21 ± 0,62 mg

cyanobakterieller Biomasse mittels Analysenwaage (s. o.) in sterile ERG abgewogen.

Die abgewogene Biomasse wurde in 30 ml Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) mit

unterschiedlichen Salzkonzentrationen (0; 7; 15; 27; 38; 50 und 62‰) im

Doppelansatz überführt und dort resuspendiert.

Die Herstellung der Medien erfolgte durch variierende Zugabe von NaCl und die

Bestimmung der Salinität mittels Hand-Refractometer (Atago S/Mill-E). Als

Negativkontrolle wurde das Medium BG 110 verwendet. Die Zusammensetzung des

Mediums ist in Tabelle 5 dargestellt, die nach dem Autoklavieren steril zugegebenen

Zusätze (sterilfiltriert) sind in Tabelle 6 aufgeführt. Die Zusammensetzung der TMM-

Lösung ist in Tabelle 4 (siehe Kap. 2.2.1) dargestellt.

Tab. 5: Zusammensetzung des als Negativkontrolle (Salzgehalt: 0‰) verwendeten Mediums BG110 (nach RIPPKA et al. 1979)

Komponenten g/l Konzentration [mM]

MgSO4 x 7 H2O 0,075 0,3

CaCl2 x 2 H2O 0,036 0,2

NaNO3 0,75 8,8 Aqua bidest. 900 ml - Separat angesetzt: Na2CO3 0,04 g/100 ml 3,8


Tab. 6: Zusammensetzung der dem BG110-Medium (siehe Tab. 5) zugegebenen sterilfiltrierten Lösungen, (nach RIPPKA et al. 1979) Zusätze Stammlösung [g/l] ml/l K2HPO4 x 3 H2O 4,0 1,0 Eisen Ammonium-Citrat 6,0 1,0 Spurenelement-Lösung (TMM) *4 1,0 Zitronensäure 6,0 1,0 EDTA 1,0 1,0 *4: Angabe nicht möglich, da die TMM-Lösung unterschiedliche Mengen der einzelnen Komponenten enthält

2.4.3.2 Auswertung

Die Quantifizierung des Wachstums von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen

Salinitäten erfolgte durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte. Nach 3

Wochen Inkubation bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten

PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR wurde die gesamte Kultur in Zentrifugenröhrchen

überführt und bei 11.000 rpm über 10 min zentrifugiert (Beckman; Rotor JA-20). Der

Überstand wurde verworfen und das Pellet in gewogene ERG überführt. Nach

Trocknung der Pellets im Wärmeofen bei 60 °C über Nacht wurde das

Trockengewicht an der Analysenwaage (s. o.) ermittelt.

2.4.4 Untersuchungen zum Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten


Zur Ermittlung der zum Wachstum von Stamm Flo1 optimalen pH-Werte wurden die

pH-Werte in den Medien variiert. Die Herstellung der gepufferten Medien erfolgte

nach BOWER und BATES (1955). Durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an NaOH

(0,1 M) zu 50 ml KCl/H3BO3-Lösung (0,1 M) und anschließendem Auffüllen auf ein

Endvolumen von 100 ml mit Aqua bidest. sollten die pH-Werte auf 8,0; 8,5; 9,0; 9,5

und 10,0, wie in Tabelle 7 dargestellt, eingestellt werden. Eine pH-Wert-Messung

nach dem Autoklavieren ergab jedoch abweichende pH-Werte. Die zum Wachstum

der Kultur erforderlichen Salze des Mediums (siehe Kap. 2.2.1, Tab. 2) wurden direkt

in den Puffer eingewogen und autoklaviert.


Tab. 7: Pipettierschema zur Herstellung gepufferter Medien durch Zugabe unterschiedlicher Mengen an NaOH und Aqua bidest. zu 50 ml KCl/H3BO3-Lösung (0,1 M) (nach BOWER und BATES 1955) und ermittelte pH-Werte NaOH [ml] Aqua bidest. [ml] gemessener pH-Wert pH-Wert (Literatur)3,9 46,1 7,80 8,0 10,1 39,9 8,17 8,5 20,8 29,2 8,61 9,0 34,6 15,4 9,05 9,5 43,7 6,3 9,37 10,0

Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben

behandelt und homogenisiert wurden. Aus dem entstandenen Homogenat wurden

80,21 ± 0,44 mg cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium

inokuliert. Außerdem wurden Kontrollen mit entsprechenden pH-Werten ohne

Cyanobakterien-Kultur angesetzt.

2.4.4.2 Auswertung

Die Quantifizierung des Wachstums mit unterschiedlichen pH-Werten erfolgte wie in

Kapitel 2.4.3.2 beschrieben durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte.

2.4.5 Untersuchungen zum Vitamin B-Bedarf


Zur Ermittlung des Vitamin B-Bedarfs zum Zellwachstum wurden Medien mit zwei

unterschiedlichen Vitamin-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen angesetzt.

Außer Vitamin B12, welches im ASNIII/2- Medium nach RIPPKA und Mitarbeitern (1979)

enthalten ist, wurde eine 7-Vitamin-Lösung verwendet, deren Zusammensetzung in

Tabelle 8 dargestellt ist. Vitamin B12 wurde in den Konzentrationen 2,5 µg/l, 5 µg/l

und 10 µg/l eingesetzt. Eine Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf

Grund der unterschiedlichen Konzentrationen der einzelnen Vitamine (siehe Tab. 8)

nicht möglich. Es erfolgte die Zugabe von 0,25 ml, 0,5 ml bzw. 1 ml der 7-Vitamin-

Stammlösung pro 1 Liter Medium. Als Kontrolle wurde ASNIII/2- Medium ohne

Vitamine verwendet.


Tab. 8: Zusammensetzung der 7-Vitamin-Stammlösung. Alle Vitamine wurden in Aqua. bidest. gelöst, die Lagerung erfolgte bei 4 °C im Dunkeln Komponenten mg/l Vitamin-Klasse 4-Aminobenzoesäure 80 H D(+)-Biotin 20 B7 Nicotinsäure 200 B3 Ca-D(+)-panthoenat 100 B5 Pyridoxinhydrochlorid 300 B6 Thiamindichlorid 200 B1 Cyanocobalamin 100 B12 Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben


100 ± 0,42 mg cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium

inokuliert.

2.4.5.2 Auswertung

Die Quantifizierung des Vitamin-Bedarfs erfolgte wie in Kapitel 2.4.3.2 beschrieben

durch Bestimmung der Biomassetrockengewichte nach 3 Wochen Kultivierung.

2.4.6 Untersuchungen zur Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoffverbindungen


Um die Verwertung unterschiedlicher Stickstoffquellen durch Stamm Flo1 zu

untersuchen, wurden Medien mit verschiedenen anorganischen Stickstoff-

verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen angesetzt. Dazu wurden ASNIII/2-

Medien ohne Stickstoffquelle (Kontrolle), mit Ammoniumchlorid (NH4Cl), Natriumnitrit

(NaNO2) oder Natriumnitrat (NaNO3) in den Konzentrationen 1 mM; 2,5 mM; 5 mM

und 10 mM im Doppelansatz hergestellt.

Die Inokulation erfolgte aus Vorkulturen, die wie in Kapitel 2.4.3.1 beschrieben


100 ± 0,91 cyanobakterieller Biomasse (Feuchtgewicht) in 30 ml Medium inokuliert


2.4.6.2 Auswertung

Die Quantifizierung der Verwertung verschiedener anorganischer Stickstoff-

verbindungen erfolgte wie in Kapitel 2.4.3.2 beschrieben durch Bestimmung der

Biomassetrockengewichte.

2.4.7 Untersuchungen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung

Die Fähigkeit zur Stickstofffixierung erfolgte qualitativ mittels Acetylen-Reduktions-

Test. Dieser Test beruht auf der bakteriellen Reduktion von Acetylen (Ethin) zu Ethen

durch das Enzym Nitrogenase. Das gebildete Ethen kann daraufhin gas-

chromatographisch nachgewiesen werden (FUCHS 2007).


In den Versuchen zur Fähigkeit der Stickstofffixierung wurden Vorkulturen eingesetzt,

die bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE

m-2 s-1 PAR für 4 Wochen gehältert wurden. Als Nährmedium wurde ASNIII/2 ohne

Nitrat verwendet. Nach der Kultivierung erfolgte ein Austausch der Gasphase über

der Kultur mittels Heliumbegasung und die Zugabe von 10 ml eines Ethin-Helium

Gasgemisches (1:50). Anschließend wurden die Kulturen unter permanenter

Beleuchtung sowie im Dunkeln und mit Licht/Dunkelwechsel (jeweils 12 h) inkubiert.

Die Detektion des evtl. gebildeten Ethen erfolgte nach 1 Woche.

2.4.7.2 Auswertung

Aus dem Gasvolumen wurden 100 µl mittels gasdichter Spritze entnommen und in

den Gaschromatographen (Shimadzu GC 14B) bei 70 °C injiziert. Nach Auftrennung

der Gasproben bei 50 °C mittels Trennsäule: (Porapak N 80/100 mesh) erfolgte die

Detektion durch einen Detektor (Flammenionisationsdetektor) bei 90 °C. Als

Trägergas wurde Helium (115kPa=35 ml/min), als Brenngas Wasserstoff (H2: 40

kPa; O2: 45 kPa) verwendet.


2.5 Molekularbiologische Untersuchungen an den Stämmen Flo1 und PCC 7105

Da eine morphologische Beschreibung eines Cyanobakteriums zur vollständigen,

polyphasischen Charakterisierung nicht ausreicht, wurden auch molekularbiologische

Methoden verwendet, um den Stamm Flo1 umfassend zu beschreiben. Zusätzlich

wurde der Referenzstamm Stamm PCC 7105 molekularbiologisch untersucht. Nach

einer DNA-Extraktion wurden die 16S rDNA sowie das Gen gyrB mittels PCR

amplifiziert und anschließend sequenziert. Durch eine Real-Time-PCR (RT-PCR)

sollte ein Nachweis des Gens mcyA an Stamm Flo1 erfolgen. Außerdem wurden

mittels Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD) und Amplified rDNA

Restriction Analysis (ARDRA) spezifische Bandenmuster von den Stämmen Flo1 und

PCC 7105 erstellt.

2.5.1 DNA-Extraktion nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996)

Die DNA-Extraktion erfolgte nach NEILAN (1995) und SCHENK (1996) (modifiziert von

HEYDUCK-SÖLLER 2003). Vor der DNA-Extraktion wurden die Stämme Flo1 und PCC

7105 bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE

m-2 s-1 PAR für 8 Tage inkubiert. Nach Zentrifugation von 1 ml Cyanobakterien-Kultur

für 5 min bei 8.000 rpm (Heraeus Instruments; Biofuge pico) wurde der Überstand

dekantiert und die Kultur nach Zugabe von 1 ml STE-Puffer (100 mM NaCl; 10 mM

Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8,0) erneut zentrifugiert (s. o.). Nach Dekantierung des

Überstandes und erneuter Zugabe von 1 ml STE-Puffer wurde die Probe im

Ultraschallbad (ElmaTM; Transsonic Digital) bei maximaler Stärke (Stufe 9) für 10 min

bei 20 °C beschallt. Nach anschließender Zentrifugation (s. o.) und Dekantierung des

Überstandes erfolgte erneut die Zugabe von 1 ml STE-Puffer mit anschließender

Zentrifugation und Entfernung des Überstandes. Das entstandene Pellet wurde mit

400 µl STE-Puffer überschichtet. Im gleichen Volumenanteil wurden Glasperlen

(Durchmesser 0,1-0,2 µm; BIOmatik GmbH) und 1 ml heißes Phenol (75 °C)

zugegeben. Nach Durchmischung (Whirl-Mix) für 40-60 sec wurde die Probe direkt

im Eis gekühlt und anschließend für 20 min bei 4 °C und 12.000 rpm zur Trennung

der Phenol- und der wässrigen Phase zentrifugiert (Beckman GS-15R). Die obere

wässrige Phase wurde in ein steriles ERG überführt und das Probenvolumen

bestimmt. Nach Zugabe von 2 µl Poly A RNA (10 mg/ml; QIAGEN) wurde zur


Trennung von evtl. noch vorhandenen Proteinen aus der Interphase 1 Volumenanteil

Chloroform/Isoamylalkohol (im Verhältnis 25:1 [v/v]) hinzugefügt und nach

Durchmischung für 5 min und 4 °C bei 12.000 rpm zentrifugiert. 350 µl der oberen

wässrigen Phase wurden in ein steriles ERG überführt und 0,1 Volumenanteil

Natriumacetat (3 M; pH 5,2) zugegeben. Zur Fällung der DNA erfolgte die Zugabe

von 0,8 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol mit Lagerung für 20 min bei -80

°C und anschließender Zentrifugation für 30 min bei 12.000 rpm. Zur vollständigen

Entfernung vorhandener Salze erfolgte die Zugabe von 70%igem Ethanol (frisch

angesetzt) mit anschließender Zentrifugation für 10 min (s. o.). Nach erneuter

Dekantierung des Überstandes erfolgt die Zugabe von Ethanol abs. mit

anschließender Zentrifugation (s. o.). Das entstandene Pellet wurde bei

Raumtemperatur (RT) zum Trocknen für 45 min mit geöffnetem Deckel unter der

Sterilbank stehen gelassen. Anschließend erfolgte die Zugabe von 20 µl TE-Puffer

(10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8,0) und Lagerung über Nacht, um das Pellet

für spätere Versuche zu resuspendieren. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4 °C im

Dunkeln

2.5.2 Polymerase Chain Reaktion (PCR)

Mit Hilfe der PCR sollten die 16S rDNA sowie das Gen gyrB der Stämme Flo1 und

PCC 7105 amplifiziert und sequenziert werden. Um Aussagen über

Verwandtschaftsbeziehungen treffen zu können, sollten auf Basis der ermittelten

Sequenzen phylogenetische Stammbäume erstellt werden.


Alle verwendeten ERG und PCR-Reaktionsgefäße sowie das nukleasefreie Wasser,

die MgCl2-Lösung und der PCR-Puffer (10x PCR Rxn Puffer; Invitrogen) wurden vor

dem Ansetzten des Mastermixes zur Vermeidung von Kontaminationen mit Fremd-

DNA 10 min unter einer UV-Lampe (Benda N-4 K; 254 nm) bestrahlt. Die

Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes zur Amplifikation der 16S rDNA und des

Gens gyrB ist in Tabelle 9 dargestellt.


Tab. 9: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes zur Amplifikation der 16S rDNA und des Gens gyrB aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt. Die in der jeweiligen PCR verwendeten Primer sind in Tabelle 10

Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 28,1 Puffer 10 x 5,0 MgCl2 25 mM 4,0 dNTPs 10 mM 1,0 „forward-Primer“ 10 µM 4,0 „reverse-Primer“ 10 µM 4,0 BSA 20 mg/ml 2,5 Polymerase 5 U/µl 0,4 Summe 49

Tab. 10: Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifikation und Sequenzierung der 16S rDNA und des Gens gyrB der Stämme Flo1 und PCC 7105. Der Primer 380F wurde ausschließlich in der Sequenzierung der 16S rDNA als interner Primer eingesetzt Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle 8F AGA GTT TGA TCC TGG C 16S rDNA LANE (1991)

1494R GTA CGG CTA CCT TGT TAC GAC 16S rDNA TATON et al. (2003)

380F TTT TCC GCA ATG GGC G 16S rDNA YAN (2005)

GB/3MF AAG CGH CCN GSN ATG TAY ATH GG *5 gyrB SEO und YOKOTA (2003)

GB/CR-2 CCN GCN GAR TCN CCY TCN AC * gyrB SEO und YOKOTA (2003)

*5: H: A,C oder T; N: G,A,C oder T; S: G oder C; Y: C oder T; R: A oder G

Als Polymerasen wurden die Ampli-Taq-Gold (Roche) zur Amplifizierung der 16S

rDNA sowie die Platinum-Taq-Gold (Invitrogen) zur Amplifikation des Gens gyrB

verwendet. Vor Zugabe der Polymerase zum Mastermix wurde dieser erneut unter

der UV-Lampe für 10 min bestrahlt (s. o.). Nach Zugabe der Template-DNA (siehe

Kap. 2.5.1) erfolgte eine Überschichtung der Proben mit sterilfiltriertem Paraffinöl, um

ein Verdampfen der Proben im Cycler (Personal Cycler; biometra) zu verhindern. Die

beiden PCR-Reaktionen wurden mit unterschiedlichen Cycler-Programmen

durchgeführt, die in den Tabellen 11 und 12 dargestellt sind. Um für die spätere

Sequenzierung ausreichend Amplifikat zu erhalten, wurden jeweils sechs

Parallelansätze eingesetzt.


Tab. 11: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zu Amplifikation der 16S rDNA aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach NEILAN 1995). Als Polymerase wurde die Ampli-Taq-Gold verwendet

Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 95 900 1x 2a Denaturierung 95 30 2b Annealing 50 35 2c Polymerisation 72 120

35x

3 Endamplifikation 72 300 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x Tab. 12: : Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zu Amplifikation des Gens gyrB aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach SEO und YOKOTA 2003). Als Polymerase wurde die Platinum-Taq-Gold verwendet

Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 93 120 1x 2a Denaturierung 95 30 2b Annealing 50 35 2c Polymerisation 72 120

35x

3 Endamplifikation 72 600 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x

Die entstandenen PCR-Produkte wurden wie in den nachfolgenden Kapiteln

beschrieben aufgetrennt, aufgereinigt und sequenziert.

2.5.2.2 Auftrennung der PCR-Produkte mittels Agarose-Gel

Die entstandenen PCR-Produkte wurden auf ein 1%iges Agarose-Gel mit schmalen

Taschen aufgetragen. Dabei wurden 5 µl PCR-Produkt bzw. Marker (100 bp DNA-

Ladder-Plus) mit 1 µl 6x Loading Dye versetzt und in die Gel-Taschen pipettiert. Die

Laufzeit betrug 60 min bei einer Spannung von 70 V (Power Pac 300; BioRAD).

Anschließend erfolgte die Färbung des Gels in einer 0,1%igen Ethidiumbromid-

Lösung über einen Zeitraum von 15-20 min. Die Auswertung erfolgte am

Transilluminator (Fluco-Link; Biometra), Gel-Bilder wurden mit der integrierten

Kamera (E.A.S.Y 429K; Herolab) gemacht.


2.5.2.3 Aufreinigung und Sequenzierung der PCR-Produkte

Die Aufreinigung und Aufkonzentrierung der 16S rDNA PCR-Produkte erfolgte mittels

„DNA Clean & Concentrator TM Sample Kit“ (Zymo Reasearch) nach

Herstellerangaben. Die Eluierung der 16S rDNA erfolgte durch Zugabe von 10 µl TE-

Puffer und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min.

Die Aufreinigung und Aufkonzentrierung der gyrB PCR-Produkte erfolgte mittels

„QIAGEN-Aufreinigungskit“ nach Herstellerangaben. Die Eluierung der DNA erfolgte

durch Zugabe von 30 µl EB-Puffer und Zentrifugation bei 13.000 rpm für 1 min.

Anschließend wurden die Proben zur Sequenzierung an die Firma GATC Biotech AG

Konstanz geschickt. Die Auswertung der Sequenzen und die Erstellung von

Aligmentsequenzen erfolgte mit dem Programm „ChromasPro“.

2.5.2.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen

Die ermittelten Sequenzen wurden mit den Daten der NCBI-Datenbank

(www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand September 2007) mittels BLAST (basic logical

aligment search tool) verglichen. Außerdem wurden die Sequenzen der

Referenzstämme zur Erstellung der Stammbäume dieser Datenbank entnommen.

Zusätzlich wurden einige Sequenzen des Gens gyrB aus der ICB-Database

(http://seasquirt.mbio.co.jp/icb; Stand September 2007) entnommen.

Die Erstellung der Stammbäume erfolgte mit den Programmen „Bioedit“ (Erstellung

von Aligmentsequenzen), „GeneDoc“ (Zuschneiden der Aligmentsequenzen) und

„Mega3“ (Erstellung der phylogenetischen Stammbäume).

Es wurde das Matrix-orientierte Cluster-Verfahren UPGMA (Unweighted Pairwise

Grouping Method using Arithmetic means) verwendet, welches die einfachste

Methode zur Abschätzung von phylogenetischen Beziehungen aus genetischen

Distanzen darstellt (SOKAL und MICHENER 1958).

Zur Berechnung der evolutiven Distanzen wurden die Stammbäume nach der

Neighbour-Joining (NJ)- Methode nach JUKES und CANTOR (1969) erstellt. Statistisch

wurden die Stammbäume durch 1000fache Wiederholung der Bootstrap-Analysen

abgesichert.


2.5.3 Random Amplified Polymorphism DNA (RAPD)

Mit der Methode der RAPD können Organismen auf Sequenzähnlichkeiten

untersucht werden. Es werden kleine unspezifische Primer verwendet, die zufällig an

die Template-DNA binden. Binden gleichzeitig der „forward“ und der „reverse“ Primer

im Abstand von ca. 50 bp bis 1500 bp entsteht ein Amplifikat. Nach

gelelektrophoretischer Auftrennung entsteht ein spezifisches Bandenmuster der

Amplifikate.

Zur Erstellung des RAPD-Bandenmusters wurde eine 50 µl PCR mit 3 mM MgCl2

durchgeführt. Als Primer wurden CRA-22 und CRA-23 (universelle RAPD-Primer,

NEILAN 1995) eingesetzt. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in Tabelle 13

dargestellt.

Tab. 13: Sequenzen der zur RADP verwendeten Primer Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle CRA-22 CCG CAG CCA A RAPD NEILAN (1995) CRA-23 GCG ATC CCC A RAPD NEILAN (1995)

In Tabelle 14 ist das Pipettierschema eines Ansatzes zur RAPD angegeben. Als

Polymerase wurde die Platinum-Taq (s. o.) verwendet. Tab. 14: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes für eine RAPD mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt

Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 26,35 Puffer 10 x 5,0

MgCl2 25 mM 6,0

dNTPs 10 mM 1,0 „forward-Primer“ 10 µM 4,0 „reverse-Primer“ 10 µM 4,0 BSA 20 mg/ml 1,25 Platinum-Taq 5 U/µl 0,4 Summe 48,0

Nach Zugabe von 2 µl Template-DNA (siehe Kap. 2.5.1) erfolgte die Amplifikation im

Cycler nach dem in Tabelle 15 dargestellten Schema.


Tab. 15: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms für eine RAPD mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105 (modifiziert nach NEILAN 1995) Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. 1 Start-Denaturierung 93 120 1x 2a Denaturierung 93 30 2b Annealing 45 35 2c Polymerisation 72 120

35x

3 Endamplifikation 72 300 1x 4 Abkühlen auf Raumtemperatur 20 1 1x

Die PCR-Produkte der RAPD wurden auf ein 2%iges Agarose-Gel mit breiten

Taschen aufgetragen. Dabei wurden 20 µl PCR-Produkt bzw. Marker (100 bp DNA-

Ladder-Plus) mit 4 µl 6xLoading Dye versetzt und in die Gel-Taschen pipettiert. Die

Laufzeit betrug 100 min bei einer Spannung von 70 V. Die Auswertung erfolgte wie in

Kapitel 2.5.2.2.

2.5.4 Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)

Zur Erstellung eines spezifischen Bandenmusters analog der RAPD (siehe Kap.

2.5.3) wurde eine ARDRA mit verschiedenen Restriktionsenzymen durchgeführt.

Dazu wurde mittels PCR die 16S rDNA amplifiziert (siehe Kap. 2.5.2). Durch die

Zugabe von speziellen Restriktionsenzymen entstehen unterschiedlich lange DNA-

Fragmente, deren Größe von den Schnittstellen auf dem Amplifikat (siehe Tab. 16)

abhängig ist. Diese Fragmente können zur Erstellung eines spezifischen

Bandenmusters in einem Agarose-Gel aufgetrennt werden. Eine Kombination dieser

Restriktionsmuster ermöglicht die Erstellung eines Restriktions-Profils und erlaubt

ggf. die Identifizierung eines Organismus.

Als Restriktionsenzyme wurden die Enzyme AluI, MspI, RsaI und BsuRI (HaeIII),

sowie die „FastDigest“ Enzyme HinfI, HhaI und Sau96I (Cfr13I) (Fermentas)

verwendet. Das Pipettierschema der ARDRA sowie die Schnittstellen der

verwendeten Enzyme sind in Tabelle 16 dargestellt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C

im Wasserbad. Bei den „FastDigest“ Enzymen erfolgte die Inkubation über einen

Zeitraum von 5 min, die übrigen Enzyme wurden 4 h inkubiert.


Tab. 16: Pipettierschema der ARDRA mit der 16S rDNA aus den Stämmen Flo1 und PCC 7105 mit den Schnittstellen der verwendeten Restriktionsenzyme. Für jedes Enzym musste der entsprechende Puffer zugegeben werden. Die Pfeile symbolisieren die Schnittstellen der Enzyme Eingesetztes Enzym

Enzym [µl]

PCR-Produkt [µl]

Puffer [µl]

Wasser [µl] Schnittstellen

5’ …AG↓CT…3’ Alu I 2 10 2 (TANGO*1) 18 3’ …TC↑GA…5’ 5’ …CC↓GG…3’ Msp I 2 10 2 (TANGO) 16 3’ …GG↑CC…5’ 5’ …GT↓AC…3’ Rsa I 2 10 2 (TANGO) 16 3’ …CA↑TG…5’ 5’ …GG↓CC…3’ BsuRI 2 10 2 (R*2) 16 3’ …CC↑GG…5’ 5’ …G↓ANTC…3’HinfI 2 10 2(FastDigest*3) 17 3’ …CTNA↑G…5’5’ …GCG↓C…3’ HhaI 2 10 2(FastDigest) 17 3’ …C↑GCG…5’

5’ …G↓GNCC…3’Sau96I 2 10 2(FastDigest) 17 3’ …CCNG↑G…5’*1 : Zusammensetzung des Puffers TANGO: 33 mM Tris-Acetat (pH 7.9), 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0.1 mg/ml BSA *2 : Zusammensetzung des Puffers R: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0.1 mg/ml BSA *3 : Zusammensetzung des „FastDigest“-Puffers: keine Herstellerangaben verfügbar Die Auftrennung der entstandenen Fragmente erfolgte auf einem 2%igen Agarose-

Gel bei 80 V für 100 min. Die Auswertung erfolgte wie in Kapitel 2.5.2.2 beschrieben.

2.5.5 Real-Time-PCR (RT-PCR)

Mittels RT-PCR sollte Stamm Flo1 auf die Fähigkeit untersucht werden, ob er

Microcystine synthetisieren kann. Microcystine sind toxische zyklische Heptapeptide.

Synthetisiert werden Microcystine nicht-ribosomal durch einen Enzymkomplex, der

durch das mcy-Gen-Cluster codiert wird (TILLETT et al. 2000). Das Gen mcyA ist Teil

dieses Clusters (NISHIZAWA 2000) und sollte mittels RT-PCR nachgewiesen werden.

Es wurde eine 25 µl RT-PCR modifiziert nach FURUKAWA und Mitarbeitern (2006) im

Smart Cycler (Cepheid) mit SyberGreen durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde

DNA der Microcystis-Stämme PCC 7806 und PCC 7941 eingesetzt. Zur Amplifikation

wurden die mcyA-spezifischen Primern MSF (FURUKAWA et al. 2006) und MSR-2R

(NEILAN et al. 1997) verwendet. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in

Tabelle 17 dargestellt.


Tab. 17: Sequenzen der in der Real-Time-PCR verwendeten Primer zur Amplifikation des Gens mcyA

Primer Sequenz ( 5’ 3’) Spezifität Quelle MSF ATC CAG CAG TTG AGC AAG C mcyA FURUKAWA et al. (2006)MSR-2R GCC GAT GTT TGG CTG TAA AT mcyA NEILAN et al. (1997) In Tabelle 18 ist die Zusammensetzung eines 25 µl PCR-Reaktionsansatzes

dokumentiert. Tab. 18: Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes für eine RT-PCR zur Amplifikation und zum Nachweis des Gens mcyA aus Stamm Flo1. Als Mastermix wurde ein entsprechend Vielfaches der angegeben Mengen eingesetzt

Reagenz Konzentration Eingesetzte Menge [µl] Nukleasefreies Wasser - 15,64 Puffer 10 x 2,5 MgCl2 25 mM 3,0 dNTPs 10 mM 0,31 „forward-Primer“ 10 µM 1,25 „reverse-Primer“ 10 µM 1,25 Platinum-Taq 5 U/µl 0,05 Summe 24,0

Nach Zugabe von 1 µl Template-DNA (siehe Kap. 2.5.1) (1:100 in TE-Puffer

verdünnt) erfolgte die Amplifikation im Smart Cycler (s. o.) nach dem in Tabelle 19

dargestellten Schema.

Tab. 19: Dokumentation des angewandten Cycler-Programms zur Amplifikation des mcyA Gens aus Stamm Flo1 mittels RT-PCR. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgte nach der Polymerisation

Schritt Funktion Temperatur [°C] Dauer [sec] Anzahl Wdh. Detektion 1 Start-Denaturierung 80 600 1x AUS

2 Aktivierung der Polymerase 95 300 1x AUS

3a Denaturierung 95 5 AUS 3b Annealing 55 15 AUS 3c Polymerisation 72 20

50x EIN

Zur Differenzierung der Amplifikate wurde eine Schmelzkurve der PCR-Produkte im

Bereich von 60-90 °C im Smart Cycler (s. o.) erstellt.


2.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes (mol%) nach MARMUR (1961)

Für die Beschreibung eines Organismus muss auch der Guanin/Cytosin-Gehalt der

DNA (mol%) angegeben werden. Dies kann durch Bestimmung der

Schmelztemperatur der DNA ermittelt werden, da die Höhe der Schmelztemperatur

wesentlich von den Mengenverhältnissen zwischen Guanin/Cytosin (GC) und

Adenin/Thymin (AT) bestimmt wird (FUCHS 2007).

Die Bestimmung des G+C-Gehaltes der DNA von Stamm Flo1 wurde nach MARMUR

(1961) durchgeführt (modifiziert von SERRANO 2007, persönliche Mitteilung).


In den Versuchen zur Ermittlung des G+C-Gehaltes wurden Kulturen eingesetzt, die

bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 µE m-2

s-1 PAR gehältert wurden. Die Kulturen wurden in Zentrifugenröhrchen überführt und

bei 11.000 rpm für 10 min zentrifugiert (Beckman; Rotor JA-20). Anschließend wurde

der Überstand verworfen und in vier Parallelen jeweils 30 mg Feuchtgewicht auf der

Analysenwaage (s. o.) abgewogen. Die Zellen wurden mit 500 µl PBS (8 g NaCl; 0,2

g KCl; 1,44 g Na2HPO4; 0,24 g KH2PO4 auf 1 l; pH 7,4) gewaschen und bei 13.000

rpm für 2 min zentrifugiert (Heraeus Instruments; Biofuge pico). Der Überstand wurde

verworfen und 1 ml EDTA (2%; pH 8,0) zugegeben. Die Proben wurden bei -80 °C

für 20 min gelagert und anschließend im Wärmebad bei 80 °C für 20 min inkubiert.

Anschließend wurde der Überstand abzentrifugiert (s. o.), erneut 1 ml EDTA-Lösung

zugegeben und über Nacht bei 4 °C gelagert. Danach wurde die EDTA-Lösung

abzentrifugiert (s. o.) und die Pellets wurden, wie im folgenden Kapitel beschrieben,

aufgeschlossen.


2.6.2 Zellaufschluss und DNA Extraktion

Die Zellpellets (siehe Kap. 2.6.1) wurden mit 300 µl Suspensionspuffer

(Zusammensetzung siehe Tab. 20) homogenisiert. Es erfolgte die Zugabe von 20 µl

Lysozym (100 mg/ml) und eine Durchmischung auf einem Whirl-Mix mit

anschließender Inkubation bei 37 °C für 1 h im Wasserbad. Danach erfolgte die

Zugabe von 400 µl Lysis-Puffer (Zusammensetzung siehe Tab. 20) und 200 µl NaCl

(5 M). Die Proben wurden bei 65 °C im Wasserbad über Nacht inkubiert. Nachdem

die Lösung komplett transparent geworden war, erfolgte die Zugabe von

Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 25:1 [v/v]). Nach Zentrifugation bei 10.000 rpm

für 10 min wurde jeweils die obere Phase der vier Parallelansätze entnommen und in

einem sterilen 15 ml Greiner Röhrchen vereinigt. Anschließend erfolgte die Zugabe

von 0,6 Volumenanteilen eisgekühltem Isopropanol, so dass die DNA präzipitierte

und sichtbar wurde. Das Präzipitat wurde mittels steriler Pipettenspitze in ein ERG

überführt und durch Zugabe von 200 µl Ethanol abs. dehydriert. Nach 2 min erfolgte

der Austausch von Ethanol abs. durch 70%iges Ethanol. Anschießend wurde das

Ethanol verworfen, das Pellet an der Luft getrocknet und auf eine Dialysemembran

(Milipore) mit 0,025 µm Porengröße auf 0,1x SSC-Puffer (Zusammensetzung siehe

Tab. 20) überführt. Nach 24 h erfolgte die Zugabe von 15 µl RNase (30 µg/ml;

Molzym GmbH) mit anschließender Inkubation für 60 min bei 37 °C. Nach der

Inkubation wurde das Enzym bei 65 °C für 10 min im Wasserbad inaktiviert und die

DNA in ein steriles ERG überführt und mit 400 µl 0,1x SSC-Puffer resuspendiert.

Tab. 20: Zusammensetzung der für die G+C-Gehaltsbestimmung (mol%) verwendeten Lösungen

Suspensions-Puffer (50 ml) Lysis-Puffer 50 (ml) SSC-Puffer (1 l 20x Stammlösung pH 7)

20 mM Tris-HCl; pH 8,0 100 mM Tris-HCl; pH 8,0 175,3 g NaCl 5 mM EDTA; pH 8,0 40 mM EDTA; pH 8,0 88,2 g Natriumcitrat

6 g Saccharose 0,5 M NaCl mit Aqua bidest auf 1 l aufgefüllt

mit Aqua bidest auf 50 ml aufgefüllt 4% SDS

mit Aqua bidest auf 50 ml aufgefüllt und 1 ml ß-Mercaptoethanol

und 250 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugeführt


Zusätzlich wurde die DNA aus Escherichia coli Stamm K12 analog dem oben

beschriebenen Ablauf extrahiert, um die Schmelztemperatur als Referenz zu

ermitteln. Diese Werte werden zur Berechnung des G+C-Gehaltes von Stamm Flo1

benötigt.

2.6.3 Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) und Berechnung des G+C-Gehaltes (mol%) von Stamm Flo1

Die Spektrophotometrische Bestimmung der DNA-Schmelztemperatur (TM) wurde in

5fach Bestimmung durchgeführt. Vor der Erstellung der Schmelzkurven wurde die

Reinheit der DNA in den Proben untersucht. Dazu wurden die Absorptionen bei 234,

260 und 280 nm gemessen (Beckman Spektrophotometer DU 640) und die

Quotienten aus 234/260 nm sowie 260/280 nm errechnet.

Die Bestimmung der Schmelztemperatur (TM) der DNA erfolgte in Quarzküvetten

(UV/Visible Spektrophotometer; Beckman) im o. g. Spektrophotometer mittels

Temperaturregler (High Performance Temperature Controller; Beckman). Zur

Entfernung von Luftbläschen aus den Proben wurden die Küvetten in einem

Exsikkator (Wertheim; Pumpe: Jürgens) für 15 min unter Vakuum entgast. Die

Aufnahme der Schmelzkurve erfolgte in einem Temperaturbereich von 60-90 °C bei

einer Erhöhung der Temperatur von 1 °C/min und einer Verzögerung von 2 min. Der

Messwert wurde im Abstand von 0,5 min abgelesen und graphisch dargestellt.

Anhand der ermittelten Schmelztemperatur (TM) und der Schmelztemperatur des

verwendeten Referenzstammes E.coli konnte der G+C-Gehalt (mol%) von Stamm

Flo1 gemäß folgender Formel nach MARMUR und DOTY (1961) errechnet werden.

mol% G+C Probe = ([TM Probe + (90,5 –TM E.coli)] – 69,3)/0,41


2.7 Analyse des Fettsäuremusters von Stamm Flo1

Zusätzlich zu morphologischen, physiologischen und molekularbiologischen

Methoden sollte eine Untersuchung des Fettsäuremusters von Stamm Flo1 zur

polyphasischen Beschreibung erfolgen. Die Zusammensetzung der Fettsäuren stellt

eine wichtige chemotaxonomische Methode dar (BUSSE 1996) und wird unter

anderem zur Beschreibung auf Gattungs-Ebene und teilweise höherer Taxa

vorgeschlagen (MURRAY et al. 1990).


Die Erstellung eines Fettsäureprofils erfolgte an Kulturen, die bei einer konstanten

Temperatur von 21 °C und einer konstanten PFD von 1 bzw. 20 µE m-2 s-1 PAR

angezogen worden waren. Nach 3 Wochen Wachstum wurde der Kultur-Überstand

bei 13.000 rpm für 5 min (Heraeus Instruments; Biofuge pico) abzentrifugiert und das

Gewicht der Pellets bestimmt (sollte >50 mg betragen). Das Pellet wurde bis zur

Bestimmung des Fettsäureprofils bei -80 °C gelagert.

2.7.2 Bestimmung des Fettsäureprofils

Die Analyse des Fettsäureprofils erfolgte durch Dr. Rabenstein an der Amtlichen

Materialprüfungsanstalt Bremen. Die Proben wurden aufgeschlossen und in einem

speziellen Reaktionsgefäß verseift. Anschließend wurden die freigesetzten

Fettsäuren zu Fettsäuremethylestern verestert und nach ihrer Extraktion mit einem

Lösungsmittel gaschromatographisch analysiert. Die Zuordnung der detektierten

Fettsäuren erfolgte mit Hilfe des Fatty Acid Methyl Ester-Mix (FAME-Mix; Sigma

Aldrich).


2.8 Qualitative und quantitative Bestimmung der photosynthetisch aktiven Pigmente von Stamm Flo1 nach Wachstum der Kulturen bei unterschiedlichen Photonenflussdichten

In der Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente erfolgte ein quantitativer

Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden sowie den Phycobiliproteinen durch

photometrische Messungen. Außerdem wurde ein qualitativer Nachweis der

Carotinoide mittels Reverse Phase HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) durchgeführt. Zusätzlich wurde Stamm Flo1 auf die Fähigkeit zur

„Komplementären Chromatischen Adaptation“ untersucht.

2.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden


Es wurden Kulturen eingesetzt, die über einen Zeitraum von 3 Monaten bei

konstanten 21°C an unterschiedliche PFDs (1; 5; 10; 15; 20 µE m-2 s-1 PAR) adaptiert

worden waren. Dabei wurden die Kulturen im Abstand von 4 Wochen in frisches

Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überimpft.

Zur Freisetzung der Pigmente wurde eine Methanolextraktion analog der Chlorophyll

a-Bestimmung (siehe Kap. 2.4.1.2.1) durchgeführt. Das Feuchtgewicht der

eingesetzten Zellpellets betrug 60 ± 20 mg.

2.8.1.2 Auswertung

Die quantitative Bestimmung der Carotinoid- und Chlorophyll a-Gehalte erfolgte

photometrisch nach Methanolextraktion durch Messung der Absorption (A) bei 461

nm (Carotinoide) und 665 nm (Chlorophyll a) (Photometer Biochrom Libra S12).

Unter Verwendung der nachfolgend angegebenen Gleichung (modifiziert nach

JÖSTINGMEYER 2000) konnte der Carotinoid-Gehalt der Proben errechnet werden:

Carotinoidgehalt [µg/ml] = [A461nm – (0,046 x A665)] x 4


Die Berechnung der Chlorophyll a-Gehalte der Proben erfolgte nach MACKINNEY

(1941) (siehe Kap. 2.4.1.2.1) mittels des spezifischen Extinktionskoeffizienten (ε) von

74,5 ml mg-1 cm-1. Eine Identifizierung und quantitative Bestimmung der Carotinoide

erfolgte mittels Reverse Phase HPLC.

2.8.2 Qualitative Pigment-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC

Die Identifizierung der Carotinoide erfolgte nach Methanol-Extraktion (siehe Kap.

2.4.1.2.1) mit Hilfe eines Merck/Hitachi-HPLC-Systems (modifiziert nach RABENSTEIN

1997).

2.8.2.1 Auftrennung der Extrakte

Je 50 µl des methanolischen Extraktes wurden über ein Rheodyne-Ventil injiziert,

wobei über eine Injektionsschleife je 20 µl Extrakt auf eine Trennsäule gegeben

wurde. Die Auftrennung wurde über eine LiChrospher 100 RP 18-Säule (125-4; 5

µm) mit entsprechender Vorsäule (4-4) und einer mobilen Phase als binärem

Niederdruckgradienten (siehe Tab. 21) durchgeführt. Die mobile Phase setzte sich

aus Eluent A (75% Acetonitril, 15% Methanol, 10% Tetrahydrofuran) und Eluent B

(Aqua bidest., sterilfiltriert über Cellulose-Acetat-Filter; Porengröße 0,2 µm;

Schleicher & Schuell) zusammen. Eine konstante Säulentemperatur von 35 °C wurde

durch einen L-7350 LaChrom-Säulenofen gewährleistet.

Tab. 21: Elutionsprotokoll zur Auftrennung von Carotinoiden aus methanolischen, cyanobakteriellen Zellextrakten mittels HPLC (modifiziert nach RABENSTEIN 1997). Zusammensetzung der Eluenten siehe Text

Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%] Flussrate [ml/min]

0-1 85 15 1,5

1-15 100 0 1,5

15-25 100 0 1,5

25-27 85 15 1,5

27-28 85 15 1,5


2.8.2.2 Detektion der Retentionszeiten und Absorptionsspektren

Mit einer L-6220 Intelligent Pump wurde die mobile Phase über einen Mixer an einen

L-4250 UV/Vis-Detektor und einen L-7455 Dioden-Array-Detektor (DAD)

weitergeleitet.

In dem L-7455 DAD wurden die Absorptionsspektren der einzelnen Carotinoide jede

Sekunde im Wellenlängenbereich von 360 bis 700 nm aufgenommen. Die

Detektorsignale wurden über ein D-6000A Interface an einen D-2000 Chromato-

Integrator bzw. einen Computer mit D-7000 HPLC-Manager-Software weitergeleitet,

dort jeweils aufgezeichnet und berechnet.

2.8.2.3 Identifizierung der Pigmente und Ermittlung der relativen Anteile

Die Identifizierung der verschiedenen Pigmente anhand ihrer Absorptionsspektren

wurde sowohl aufgrund käuflich erworbener Standards als auch unter Verwendung

von Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) vorgenommen. Eine

Auswertung der relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten

Peakflächen (area counts).

2.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine

Die Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte durch photometrische Messung der

Absorption bei den Wellenlängen 565, 620 und 650 nm (modifiziert nach BENNETT

und BOGORAD 1973). Die Berechnungen der Konzentrationen wurden nach den bei

TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) angegebenen Gleichungen durchgeführt.

2.8.3.1 Probenvorbereitung und Konzentrationsberechnung

Für die photometrische Phycobiliprotein-Analyse wurden Kulturen eingesetzt, die wie

unter 2.8.1.1 beschrieben, gehältert wurden.

Nach Entnahme von 1 ml homogenisierter Kultur und anschließender Zentrifugation

bei 13.000 rpm für 5 min (Heraeus Instruments; Biofuge pico) wurde der Kultur-

Überstand dekantiert und das Pellet bei -20 °C über 1 h gelagert. Durch Zugabe von

1,25 ml Lösung I (0,01 M Na2HPO4; 0,15 M NaCl; pH 7,0; sterilfiltriert) wurde das

Pellet resuspendiert. Die Zugabe von 150 µl Lösung II (0,1% Lysozym in Lösung I

[w/v]) und anschließender Inkubation für 2 h und 120 rpm im 37 °C-Schüttelbad mit


reziprokalem Schütteln bewirkte die Zelllyse. Die Probe wurde anschließend bei 4 °C

im Dunkeln über Nacht gelagert. Nach Durchmischung auf einem Whirl-Mix erfolgte

eine Zentrifugation bei 10.000 rpm für 30 min. Durch diese Prozedur wurden die

Zelltrümmer, die das Chlorophyll a enthalten, ins Pellet zentrifugiert, so dass im

Überstand ausschließlich Phycobiliproteine (und andere lösliche Proteine) enthalten

waren (BENNETT und BOGORAD 1973). Vom Überstand wurde 1 ml in ein 2 ml ERG

überführt und mit 1 ml Lösung I versetzt. Nach Durchmischung der Probe erfolgte die

photometrische Messung (Photometer Biochrom Libra S12) der Absorption bei den

Wellenlängen 565, 620 und 650 nm. Die Konzentration der Phycobiliproteine

Phycocyanin (PC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (AP) wurde, unter

Verwendung der Gleichungen von BENNETT und BOGORAD (1973) und den

Extinktionskoeffizienten von BRYANT und Mitarbeitern (1979), nach TANDEAU DE

MARSAC und HOUMARD (1988) wie folgt berechnet:

Phycocyanin (PC) [mg/ml] = (A620 nm – 0,7 x A650 nm)/7,38

Allophycocyanin (AP) [mg/ml] = (A650 nm – 0,19 x A620 nm)/5,65

Phycoerythrin (PE) [mg/ml] = (A565 nm – 2,8 x PC) – (1,34 x AP)/12,7

2.8.4 Versuche zur Komplementären Chromatischen Adaptation

Der Nachweis der Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1

erfolgte durch Dokumentation der dynamischen Veränderungen der Pigment-

zusammensetzung nach Inkubation der Kulturen bei abwechselnd Rot- bzw.

Grünlicht. Dazu erfolgte die photometrische Bestimmung der Phycobiliproteine und

der synthetisierten Carotinoide mittels Reverse Phase HPLC.

2.8.4.1 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine

2.8.4.1.1 Probenvorbereitung

Zur Inokulation der Versuchskultur wurden 116,47 ± 1,66 mg Zellmasse einer

homogenen Vorkultur (Wachstum über 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR) in 30 ml

Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) im Doppelansatz angeimpft. Als Kontrolle (Ansatz A)

wurden die Kulturen ausschließlich in Weißlicht gehältert. Ansatz B wurde nach 3


Wochen Wachstum unter Grünlicht (t1) für 3 Wochen Rotlicht ausgesetzt (t2) und

anschließend für 3 Wochen wieder unter Grünlich inkubiert (t3).

Ansatz C wurde nach 3 Wochen Wachstum unter Rotlicht (t1) für 3 Wochen Grünlicht

ausgesetzt (t2) und anschließend für 3 Wochen wieder unter Rotlicht inkubiert (t3).

Nach der Inkubation für 3 Wochen wurden an den Messzeitpunkten t0 bis t3 jeweils 2

ml der Kultur zur Bestimmung der Phycobiliproteine entnommen und das aus der

Kultur entnommene Probenvolumen durch Zugabe von Medium wieder auf 30 ml

aufgefüllt.

2.8.4.1.2 Auswertung

Die qualitative und quantitative Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte, wie in

Kapitel 2.8.3 beschrieben, an den Messzeitpunkten t0 bis t3. Zusätzlich erfolgte die

Berechnung der Quotienten aus PC/AP und PE/AP nach TANDEAU DE MARSAC und

HOUMARD (1988).

2.8.4.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung mittels Reverse Phase HPLC

2.8.4.2.1 Probenvorbereitung

Zur Bestimmung der Carotinoide wurden Kulturen eingesetzt, die über einen

Zeitraum von 3 Monaten bei Rot- bzw. Grünlicht gehältert wurden. Dabei wurden die

Kulturen im Abstand von 4 Wochen in frisches Medium (ASNIII/2 mit Nitrat) überimpft.

Die Extraktion der Pigmente wurde analog zur Chlorophyll a-Bestimmung (siehe Kap.

2.4.1.2.1) mit Methanol durchgeführt. Das Feuchtgewicht der eingesetzten Zellpellets

betrug 60 ± 20 mg.

2.8.4.2.2 Auswertung

Die Auswertung der Carotinoid-Bestimmung erfolgte, wie in Kapitel 2.8.2

beschrieben, mittels Reverse Phase HPLC


2.9 Transmissions-Elektronen Mikroskopie (TEM)

Die Erstellung von elektronenmikroskopischen Aufnahmen sollte Aufschluss über

Zellorganisation, Zellform und morphologische Details geben. Außerdem sollte die

Anordnung der Thylakoide ermittelt und dargestellt werden.

Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden Mithilfe von Frau A. Toltz in

der Arbeitsgruppe „Angewandte Botanik“ von Prof. Heyser (UFT, Universität Bremen)

durchgeführt.


Zur Erstellung von TEM-Aufnahmen wurden 2 ml Cyanobakterien-Kultur einer

Vorkultur entnommen, die bei einer konstanten Temperatur von 21 °C und einer

konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR für 4 Wochen inkubiert wurden. Anschließend

erfolgte eine Zentrifugation (Heraeus Instruments; Biofuge pico) bei 13.000 rpm für 5

min. Die Fixierung der Zellen im Pellet erfolgte mit 2% Glutaraldehyd (in 0,05 M

Natriumcacodylat, pH 7,5) bei RT auf einem Rotator (Agar Scientific, Stufe 2-3) für 1

h. Nach der anschließenden Zentrifugation (Eppendorf Centrifuge 5415 C) für 3 min

bei 10.000 rpm wurde das Pellet mit 2 ml Aqua bidest. gewaschen und erneut

zentrifugiert. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Anschließend erfolgte zur

Nachfixierung die Zugabe von je 0,2 ml 1%igem und 2%igem Osmiumtetroxid und

einer Inkubation über 3,5 h bei RT. Nach erneutem dreimaligem Waschen mit Aqua

bidest. wurde das Pellet über Nacht im Kühlschrank gelagert.

Zur stetigen Entwässerung der Zellen wurde eine Ethanolreihe mit 15, 30, 50, 70, 80,

90, 96 und 100% Ethanol angesetzt und je Verdünnungsstufe nacheinander in

aufsteigender Konzentration zweimal je 1,5 ml auf das Pellet pipettiert. Anschließend

wurden die Zellen 10 min lang auf dem Rotator inkubiert und zentrifugiert (s. o.). Um

den Zellen vollständig das Wasser zu entziehen, wurden die Proben dreimal mit

100%igem Ethanol gewaschen.

Die Einbettung der Zellen in Kunststoff erfolgte mittels Einbettungsmedium nach

SPURR (1968) (Zusammensetzung siehe Tab. 22).


Tab. 22: Zusammensetzung des Einbettungsmedium nach SPURR (1969) und Funktion der jeweiligen Komponenten Komponenten Stoffklasse Funktion Menge [g] ERL 4206 Vinylcyclohexendioxid Epoxidmonomer 10,0 DER 736 Diglyceridether Weichmacher 6,0 NSA Nonenylbernsteinsäureanhydrid Härter 26,0 DMSAE (S1) Dimethylaminoethanol Katalysator 0,4

Die Überführung in das Einbettungsmedium erfolgte durch stetige Erhöhung der

SPURR-Konzentration, wobei gleichzeitig der Volumenanteil Ethanol gesenkt wurde

(siehe Tab. 23).

Tab. 23: Darstellung des Ablaufes zur Kunststoffinfiltration

Volumenanteil Ethanol

Volumenanteil SPURR-Einbettungsmedium Inkubationsdauer

3 1 1h 2 1 1h 1 1 über Nacht 1 2 2h 1 3 2h

Nach Zugabe des Gemisches im letzten Schritt der Kunststoffinfiltration wurden die

ERG zur Verdampfung des Ethanols offen stehen gelassen. Anschließend erfolgte

die Zugabe von 100%igem SPURR-Einbettungsmedium in die ERG. Nach 1 h wurde

zentrifugiert (s. o.), der Überstand durch frisches Einbettungsmedium (100%ig)

ersetzt, erneut für 1 h inkubiert und abzentrifugiert (s. o.). Das entstandene Pellet

wurde mittels Zahnstocher in „Förmchen“ (Beem Kapsel, Größe 00; PLANO GmbH)

überführt und mit 100%igem SPURR-Einbettungsmedium vorsichtig überschichtet.

Zum Auspolymerisieren der Epoxide wurden die Proben bei 70 °C für 11 h im Ofen

erhitzt.

2.9.2 Schneiden der TEM-Präparate

Nach Aushärtung des Kunststoffes wurden die Präparate aus den „Förmchen“

genommen und überschüssiger Kunststoff mittels Rasierklinge (GEM) entfernt. Die

Proben wurden in ein Ultramikrotom (Ultracut E; Reichert-Jung) mit Glasmesser

eingesetzt. Bei einer Schnittdicke von 1 µm wurden die Proben manuell

angeschnitten. Die entstandenen Schnitte wurden auf einen mit Gelatine

beschichteten Objektträger (OT) mit einem Tropfen Wasser überführt. Nach


Verdampfen des Wassers auf einer Heizplatte wurde das Präparat mit Richardson-

Blue-Lösung gefärbt und anschließend mit Wasser gewaschen. Der OT wurde unter

dem Mikroskop (Zeiss Axiolab) bei 400facher Vergrößerung betrachtet, um den

optimalen Schnittbereich zu finden. Zur Minimierung der Schnittfläche wurde das

Präparat mittels Rasierklinge unter einem Binokular (Stemi SV8; Zeiss) pyramidisch

angeschnitten. Nach Austausch der Glasklinge gegen eine Diamantklinge (Diatome)

wurden 50 nm dicke Schnitte durchgeführt. Die entstanden grau- und silberfarbenen

Schnitte (entspricht einer Schnittdicke von 0-60 nm) wurden mit einer Platinimpföse

(Perfekt Loop) aufgenommen und auf ein Trägermaterial (Grid) überführt.

Anschließend erfolgte eine Kontrastierung durch 2%iges Uranylacetat und 2,6%igem

Bleicitrat nach REYNOLDS (1963). Dazu wurden die Grids in eine Petrischale mit

einem Tropfen Uranyacetat überführt und nach einer Inkubation für 20 min im

Dunkeln mehrfach mit Aqua bidest. gewaschen. Anschließend wurden die Grids auf

einen Tropfen Bleicitrat in eine Petrischale mit wassergetränktem Filterpapier und

acht NaOH-Plättchen (diese binden entstehendes CO2) überführt und für 20 min

inkubiert.

2.9.3 TEM-Aufnahmen

Die elektonenmikroskopischen Aufnahmen wurden an einem Hochleistungs-

Elektronenmikroskop (Zeiss EM 10 A/B) aufgenommen, die Bilder in einer

Dunkelkammer entwickelt und eingescannt.

Eine Zuordnung und Identifizierung der Ultrastrukturen erfolgte unter zu Hilfenahme

der Literatur von HOICZYK und HANSEL (2000), ANAGNOSTIDIS (1989), FLORES und

Mitarbeitern (2007) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005).

2.10. Herkunft der verwendeten Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien wiesen HPLC oder p.a.-Grade auf und wurden von

den Firmen Merck (Darmstadt, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz), Riedel de

Haën (Seelze, Deutschland), Serva (Heidelberg, Deutschland), VWR international

(Leuven, Belgien), Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland ), Invitrogen (Karlsruhe),

MBI Fermentas (St. Leon-Rot, Deutschland), Roche (Mannheim, Deutschland),

QIAGEN (Hilden, Deutschland) und Molzym (Bremen, Deutschland) bezogen.

3. Ergebnisse 45

3. Ergebnisse

3.1 Herstellung axenischer Kulturen von Stamm Flo1

Nach Anwendung von insgesamt drei verschiedenen Antibiotika mit anschließenden

Waschschritten und Überführung der Kulturen in sterilfiltriertes Medium (ASNIII/2 mit

Nitrat) (siehe Kap. 2.2.3.2) konnten bei mikroskopischen Kontrollen bei 1000facher

Vergrößerung keine heterotrophen Bakterien nachgewiesen werden.

3.2 Morphologische Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105

In der morphologischen Beschreibung wurden Kulturen untersucht, die, wie in Kapitel

2.2.2 beschrieben, über 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR gehältert wurden.

3.2.1 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Beschreibung

Die lichtmikroskopische Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 (Abb. 3)

erfolgte bei 100facher Vergrößerung mit Hellfeld-Kontrastierung (siehe Kap. 2.3.2).

Abb. 3: Lichtmikroskopische Aufnahmen der Stämme Flo1 (3A) und PCC 7105 (3B) bei 100facher Vergrößerung mit Hellfeld-Kontrastierung. Skalierung (innerer Kasten) = 20 µm

In beiden Abbildungen sind gerade bis leicht gebogene, unverzweigte Filamente zu

erkennen, die keine differenzierten Zellen wie Heterozysten, Akineten oder

necridische Zellen aufweisen.

Eine detaillierte Darstellung der Filamente erfolgte mittels Phasenkontrast bei

1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl (Abb. 4).

3A 3B

3. Ergebnisse 46

Abb. 4: Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen der Stämme Flo1 (4A) und PCC 7105 (4B) bei 1000facher Vergrößerung mit Immersionsöl. Skalierung (1 Teilstrich = 1 µm). Abkürzungen: TZ: terminale Zelle; E: Einschnürungen zwischen den Zellen

Deutlich erkennbar sind die konisch geformten terminalen Zellen (TZ) der Filamente

sowie teilweise die Einschnürungen zwischen den Zellen zur internen Abgrenzung

(E).

3.2.2 Zellgrößenbestimmung

Die mikroskopische Zellgrößenbestimmung erfolgte bei 1000facher Vergrößerung mit

Immersionsöl (siehe Kap. 2.3.3). Der Messumfang betrug 20 vegetative Zellen. Die

Berechnung der Mittelwerte zur Längen- und Breitenbestimmung der vegetativen

Zellen der Stämme Flo1 und PCC 7105 ergab durchschnittliche Zelllängen von 4,9 ±

0,69 µm bzw. 5,0 ± 0,63 µm und durchschnittliche Zellbreiten von 2,2 ± 0,26 µm,

bzw. 2,2 ± 0,24 µm.

4A

4B

E

E

AZ

AZ

3. Ergebnisse 47

3.2.3 Scheidennachweis

Abbildung 5 zeigt lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen von Filament-Bruchstücken

der Stämme Flo1 (5A) und PCC 7105 (5B) nach Inkubation der Kulturen über eine

Dauer von 15 Tagen im Dunkeln (siehe Kap. 2.3.4).

Abb. 5: Lichtmikroskopische Detail-Aufnahmen von Filament-Bruchstücken der Stämme Flo1 (5A) und PCC 7105 (5B) bei 1000facher Vergrößerung. Dargestellt sind zylindrisch geformte Zellen mit einer dunkel erscheinenden Scheide. VZ: vegetative Zellen; SC: Scheide

An den Zellbruchstücken sind die dünnen Umrisse einer Scheide zu erkennen, die in

den Abbildungen dunkel erscheinen. Die hellleuchtende unmittelbare Umgebung der

Zellen im Filament ist ein Darstellungsartefakt, hervorgerufen durch die

Fokussierungsebene des Mikroskops.

3.2.4 Motilitäts-Nachweis

Der Motilitäts-Nachweis der Stämme Flo1 und PCC 7105 erfolgte auf ASNIII/2-

Agarplatten mit und ohne Nitrat (siehe Kap. 2.3.5). Dabei konnte Medienunabhängig

eine Fortbewegung bei beiden Stämmen nachgewiesen werden (Daten nicht

gezeigt). Die Filamente erstreckten sich nach 21 Tagen über große Flächen und bis

zum Rand der Agarplatte. Die Filamente waren je nach verwendetem Medium grün

(ASNIII/2 mit Nitrat) oder weiß gefärbt (ASNIII/2 ohne Nitrat).

Eine Verdunklung von einer Hälfte der Platte mittels Aluminiumfolie, um eine

gerichtete Bewegung nachzuweisen, hatte keinen Einfluss auf die

Fortbewegungsrichtung oder die Farbe der Filamente.

5A 5B

SC SC

VZ VZ

3. Ergebnisse 48

3.2.5 Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung

In Tabelle 24 sind die nachgewiesenen morphologischen Merkmale der Stämme Flo1

und PCC 7105 zusammengefasst dargestellt.

Tab. 24: Zusammenfassung der morphologischen Beschreibung der Stämme Flo1 und PCC 7105 nach Wachstum für 3 Wochen bei einer PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR. Nicht nachgewiesene Merkmale wurden mit (-), Positivnachweise (sofern nicht genauer beschrieben) mit (+) gekennzeichnet. Zusätzlich ist der Verweis auf das jeweilige Kapitel der expliziten Beschreibung angegeben

Merkmal Stamm Flo1 Stamm PCC 7105

Beschreibung in Kapitel

Form unverzweigtes Filament

unverzweigtes Filament 3.2.1

Einschnürungen zwischen den Zellen + (gering) + (gering) 3.2.1

(siehe auch 3.9)

Form der terminalen Zelle konisch konisch 3.2.1

Heterozysten - - 3.2.1

Akineten - - 3.2.1

necridische Zellen - - 3.2.1

Länge und Breite der vegetativen Zellen 4,9 x 2,2 µm 5,0 x 2,2 µm 3.2.2

Scheide sehr dünn sehr dünn 3.2.3

Motilität auf Agarplatten + + 3.2.4

Ein morphologischer Vergleich der Stämme (Tab. 24) zeigt identische Merkmale

zwischen beiden untersuchten Organismen. Beide Stämme weisen unverzweigte

Filamente auf, die an den Querwänden durch dünne Einschnürungen abgegrenzt

sind. Im Gegensatz zu den zylindrisch geformten, vegetativen Zellen innerhalb des

Filaments, ist die terminale Zelle konisch geformt. Bei beiden Stämmen konnten

weder Heterozysten noch Akineten oder necridische Zellen dokumentiert werden.

3. Ergebnisse 49

3.3 Taxonomische Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Grundlage morphologischer Merkmale

Anhand der dokumentierten morphologischen Merkmale (siehe Tab. 24) sollte

Stamm Flo1 mit Hilfe bekannter Daten aus der Bestimmungsliteratur wie

„Cyanophyceae“ (GEITLER 1932), „Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology“

(CASTENHOLZ et al. 2001) und „Cyanoprokaryota“ (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005)

klassifiziert werden (Tab. 25). Eine detaillierte Darstellung der Bestimmungsschlüssel

mit den relevanten Merkmalen ist im Anhang dargestellt (Tab. 37 bis 39).

Tab. 25: Klassifizierung von Stamm Flo1 anhand morphologischer Merkmale mittels Bestimmungsliteraturdaten Verwendeter Bestimmungsschlüssel und Quelle

Ermittelte Ordnung

Ermittelte Gattung Ermittelte Spezies

„Cyanophyceaea“

(GEITLER 1932) Oscillatoriales Oscillatoria

O. limnetica O. amphigranulata O. redekei

„Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology“ (CASTENHOLZ et al. 2001)

Oscillatoriales Geitlerinema -

„Cyanoprokaryota“ ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005)

Oscillatoriales Geitlerinema -

In allen verwendeten Bestimmungsschlüsseln wurde Stamm Flo1 übereinstimmend

der Ordnung Oscillatoriales zugeordnet. Auf Gattungs-Ebene wurde Stamm Flo1

nach GEITLER (1932) als Oscillatoria, mit den möglichen Spezies Oscillatoria

limnetica, O. redekei oder O. amphigranulata klassifiziert. Eine Zuordnung von

Stamm Flo1 zu einer dieser Spezies ist nicht erfolgt.

In den neueren Bestimmungsschlüsseln nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001)

sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) wurde Stamm Flo1 der Gattung

Geitlerinema zugeordnet. Eine weitergehende Einteilung war in „Bergey’s Manuel of

Systematic Bacteriology“ (CASTENHOLZ et al. 2001) wegen der Beschränkung der

Bestimmungsliteratur auf Genus-Ebene nicht möglich.

Eine Einteilung auf Spezies-Ebene nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) wurde

nicht durchgeführt.

3. Ergebnisse 50

3.4 Ergebnisse der physiologischen Charakterisierung

Zur physiologischen Beschreibung des Stammes Flo1 wurden verschiedene

Wachstumsparameter verändert. Dazu wurde das Wachstumsverhalten in

Abhängigkeit der Photonenflussdichte (PFD), unterschiedlicher Salzgehalte und pH-

Werte, des Vitamin-Bedarfs sowie der Fähigkeiten zur Verwertung verschiedener

Stickstoffquellen und zur Stickstofffixierung untersucht.

3.4.1 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Photonenflussdichten

Die Quantifizierung des Wachstums bei unterschiedlichen PFDs erfolgte durch

Bestimmung der Konzentration von Chlorophyll a nach MACKINNEY (1941) (siehe

Kap. 2.4.1.2.1) und des Proteingehaltes nach BRADFORD (1976) (siehe Kap.

2.4.1.2.2). Die graphische Darstellung erfolgte durch Berechnung des Verhältnisses

von Chlorophyll a zur Proteinkonzentration (Abb. 6).

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Zeit nach Beimpfung [Tage]

Chl

orop

hyll

a/P

rote

in-Q

uotie

nt

[µg/

ml]

1 µE PAR 5 µE PAR 10 µE PAR 15 µE PAR 20 µE PAR

Abb. 6: Graphische Darstellung des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unter-schiedlichen PFDs von 1 bis 20 µE m-2 s-1 PAR anhand der Chlorophyll a/Protein-Quotienten der Proben (Mittelwert) Wie Abbildung 6 zeigt, ist ein Zellwachstum von Stamm Flo1 bei höheren PFDs (15

und 20 µE m-2 s-1 PAR) nur bedingt möglich. Bei diesen Lichtintensitäten konnte

keine signifikante Zunahme im Chlorophyll a/Protein-Quotienten über die

Versuchsdauer von 28 Tagen beobachtet werden. Dabei wiesen beide Kurven einen

3. Ergebnisse 51

ähnlichen Verlauf auf. Einem tendenziell degressiven Verlauf bis zum 10. Messtag

folgte ein kurzer Anstieg mit anschließender Abnahme der Quotienten bis zum 24.

Messtag. Dabei stieg der Quotient bei 20 µE m-2 s-1 PAR zwischenzeitlich (18.

Messtag) noch einmal an. Am 24. Messtag erfolgte ein weiterer Anstieg in beiden

Kurvenverläufen, der bei einer PFD von 15 µE m-2 s-1 PAR kontinuierlich bis zum 28.

Messtag zunahm, im Falle von 20 µE m-2 s-1 PAR nach dem 26. Inkubationstag aber

direkt wieder abnahm. Die höchsten Messwerte wurden bei einer PFD von 20 µE m-2

s-1 PAR nach 26 Tagen (1,05) und bei 15µE m-2 s-1 PAR nach 28 Tagen (0,94)

erreicht, lagen aber deutlich unter den Messwerten der Wachstumskurven bei

niedrigeren PFDs.

Während das Wachstum bei höheren Lichtintensitäten (15 und 20 µE m-2 s-1 PAR) zu

Begin der Messung degressiv verlief, konnte bei PFDs von 1 bis 10 µE m-2 s-1 PAR

tendenziell eine Zunahme des Chlorophyll a/Protein-Quotienten bis zum 20. Messtag

beobachtet werden. Innerhalb der letzten Versuchstage (22. bis 28. Messtag) zeigten

die Kurvenverläufe starke Schwankungen.

Der insgesamt höchste Quotient (1,59) wurde nach 26 Tagen bei einer Beleuchtung

von 1 µE m-2 s-1 PAR dokumentiert. Bei einer PFD von 5 µE m-2 s-1 PAR wurde das

Maximum (1,42) nach 20 Tagen und bei einer PFD von 10 µE m-2 s-1 PAR nach 26

Tagen (1,36) erreicht.

3.4.1.1 pH-Wert in den Überständen

Parallel zu den Messungen zum Wachstumsverhalten in Abhängigkeit der PFD

wurde in den Kultur-Überständen im Abstand von 4 Tagen auch der pH-Wert mittels

pH-Streifen (pH 6.0-10.0; Macherey-Nagel) gemessen (siehe Kap. 2.4.1.2.3). Die

Darstellung der pH-Wert-Endwicklung erfolgte aus Übersichtsgründen für jede PFD

in getrennten Graphiken (Abb. 7A-E).

3. Ergebnisse 52

8,5

8,8

9,1

9,4

9,7

10,0

0 4 8 12 16 20 24 28Zeit nach Beimpfung [Tage]

pH- W

ert

1 µE PAR

8,5

8,8

9,1

9,4

9,7

10,0


pH- W

ert

5 µE PAR

8,5

8,8

9,1

9,4

9,7

10,0


pH- W

ert

10 µE PAR

8,5

8,8

9,1

9,4

9,7

10,0


pH- W

ert

15 µE PAR

8,5

8,8

9,1

9,4

9,7

10,0


pH- W

ert

20 µE PAR

Wie aus den Abbildungen 7A bis 7E ersichtlich, kommt es tendenziell zu einem pH-

Wert-Anstieg in den Kultur-Überständen während der Versuchsdauer. Dabei stieg

der pH-Wert bei einer PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR auf 9,1 und bei einer PFD von 5 µE

m-2 s-1 PAR auf 9,4 an. Bei den höheren PFDs von 10, 15 und 20 µE m-2 s-1 PAR

stieg der pH-Wert auf 10,0.

Abb. 7: Entwicklung des pH-Wertes in den Kultur-Überständen während des 28 tägigen Wachstums von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs. Die Messungen erfolgten im zeitlichen Abstand von 4 Tagen

7A 7B

7C 7D

7E

3. Ergebnisse 53

3.4.1.2 Makroskopische Beschreibung der Kulturen

Nach Wachstum über eine Dauer von 4 Wochen bei unterschiedlichen PFDs wurden

die Kulturen von Stamm Flo1 makroskopisch, unter Berücksichtigung der Farbe und

der Ausbildung von exopolymeren Substanzen (ES), beschrieben. Abbildung 8 zeigt

Aufnahmen der Kulturen, die Auswertung ist in Tabelle 26 dargestellt.

Abb. 8: Photographische Dokumentation der Kulturen von Stamm Flo1 nach Wachstum bei unterschiedlichen PFDs über einen Zeitraum von 4 Wochen Tab. 26: Farbe der Kulturen von Stamm Flo1 und Ausbildung von exopolymeren Substanzen (ES) nach Wachstum bei unterschiedlich hohen PFDs (+): ES vorhanden, aber deutlich weniger als Kultur (dunkler gefärbt) (++): ES ± so viel wie Kultur, starke Aggregatbildung (+++): mehr ES als Kultur, Einschluss von Gas- Bläschen

20

Gelbgrün

+++Dunkelgelb

15 ++

10 Meeresgrün ++

5 Grün +

1 Dunkelgrün +

PFD während das Wachstums [µE m-2 s-1 PAR]

Farbe der KulturAusbildung von exopolymeren

Substanzen

Abbildung 8 und Tabelle 26 zeigen die farblichen Veränderungen und die Ausbildung

von exopolymeren Substanzen bei Stamm Flo1 nach Wachstum bei

unterschiedlichen PFDs. Dabei konnte mit steigender PFD eine stetige Entfärbung

3. Ergebnisse 54

der Kulturen beobachtet werden. Gleichzeitig nahm die Menge an gebildeten ES mit

steigender Lichtintensität zu und war nach der Inkubation bei einer Lichtintensität von

20 µE m-2 s-1 PAR maximal.

3.4.2 Erstellung einer Kalibrierungskurve zur Darstellung der Korrelation zwischen Feuchtgewicht und Trockengewicht

Zum Nachweis einer Korrelation zwischen Feucht- und Trockengewicht der

Biomasse der Zellen von Stamm Flo1 wurde eine Kalibrierungskurve erstellt (siehe

Kap. 2.4.2). Die ermittelten Biomassetrockengewichte wurden in Abhängigkeit von

den Feuchtgewichten graphisch dargestellt und das Bestimmtheitsmaß berechnet.

R2 = 0,9855

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Biomassefeuchtgewicht [mg]

Bio

mas

setr

ocke

ngew

icht

[mg]

Abb. 9: Darstellung der Korrelation zwischen den Feuchtgewichten einer homogenen Kultur von Stamm Flo1 und den Biomassetrockengewichten der Zellen nach Verdampfen des Wassers im Wärmeofen Wie in Abbildung 9 ersichtlich, besteht eine Korrelation (Bestimmtheitsmaß von

98,55%) zwischen Feucht- und Trockengewicht der cyanobakteriellen Biomasse von

Stamm Flo1. Diese Feststellung ist Grundlage für die Auswertung der in den Kapiteln

3.4.3 bis 3.4.6 durchgeführten physiologischen Versuche zur Bestimmung der

Biomassetrockengewichte.

3. Ergebnisse 55

3.4.3 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten

In Abbildung 10 ist das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen

Salinitäten (0 bis 62‰) nach einer 3 Wochen langen Kultivierung anhand der

Biomassetrockengewichte (siehe auch Kap. 3.4.2) der Zellpellets dokumentiert (siehe

Kap. 2.4.3). Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse der Doppel-

bestimmungen und die daraus errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt

(Tab. 40).

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

Bio

mas

setr

ocke

ngew

icht

[mg]

0 7 15 27 38 50 62

Salinität des Mediums [‰]

Abb. 10: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Salzgehalten nach 3 Wochen Wachstum

Die geringste Menge an Biomassetrockengewicht (2,09 mg) wurde im Kontroll-

medium ohne Salz (0‰ = BG110) festgestellt. Bei einem Salzgehalt von 7 ‰ wurde

eine größere Produktion an Biomasse gemessen als bei den höheren Salzgehalten

von 27‰ bis 62‰. Die Biomassetrockengewichte bei höheren Salzgehalten

differierten nur gering zwischen 7,08 mg bei 27‰ und 8,13 mg bei 62‰. Die größte

Zunahme an Trockengewicht (14,08 mg) konnte bei einem Salzgehalt von 15 ‰

ermittelt werden, was dem Salzgehalt des Basis-Mediums ASNIII2 entspricht.

3. Ergebnisse 56

3.4.4 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen pH-Werten

Das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen pH-Werten in

gepufferten Medium wurde nach 3 Wochen Kultivierung durch Bestimmung der

Trockengewichte (siehe auch Kap. 3.4.2) der Zellpellets ermittelt (siehe Kap. 2.4.4).

Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse der Doppelbestimmung und der

daraus errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt (Tab. 41).

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Bio

mas

setr

ocke

ngew

icht

[mg]

7,80 8,17 8,61 9,05 9,37pH- Wert des Mediums

Abb. 11: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Start-pH-Werten im Medium nach für 3 Wochen Wachstum

Abbildung 11 zeigt das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen

Start-pH-Werten in gepufferten Medien. Bei Start-pH-Werten von 9,05 und 9,37

konnte eine höhere Produktion an Biomasse erzielt werden als bei pH-Werten von

7,80 bis 8,61.

Die höchste Produktion an Biomasse (12,85 mg Trockengewicht) wurde bei einem

pH-Wert im Medium von 9,05 erreicht, geringfügig weniger Biomasse (11,76 mg)

wurde bei einem Start-pH-Wert von 9,37 erreicht. Die Trockengewichte nach

Wachstum bei pH-Werten von 7,80 bis 8,61 differierten nur gering zwischen 7,68 und

8,12 mg.

Nach Auswertung der Biomassetrockengewichte der Kulturen wurden zusätzlich die

End-pH-Werte in den Medien und in den Kontrollen bestimmt und in Tabelle 27

dargestellt.

3. Ergebnisse 57

Tab. 27: Vergleich der pH-Wert-Änderungen in den Kulturmedien und Kontrollen (ohne Cyanobakterien) nach 3wöchiger Inkubation

8,72

8,86

pH-Wert in den Kontrollen nach 3 Wochen

7,73

8,06

8,43

9,05 8,76

9,37 8,92

8,17 8,13

8,61 8,49

Start-pH-Wert des Mediums

pH-Wert des Mediums nach 3 Wochen Inkubation

7,80 7,88

In Tabelle 27 sind die Pufferkapazität der Medien und die Entwicklung der pH-Werte

in den Kontrollansätzen dargestellt. Während die niedrigeren pH-Werte von 7,80 bis

8,61 sowohl in den Versuchsansätzen als auch den Kontrollen stabil blieben,

konnten pH-Wert-Schwankungen in den Ansätzen mit höheren Start-pH-Werten

nachgewiesen werden. In beiden Fällen konnten keine signifikanten Unterschiede

zwischen den pH-Werten der Kontrollen und der gepufferten Medien nach 3 Wochen

Inkubationsdauer dokumentiert werden.

3. Ergebnisse 58

3.4.5 Vitamin B-Bedarf für das Wachstum

In diesem Versuch sollte geprüft werden, ob das Wachstum von Stamm Flo1 durch

die Zugabe von Vitamin B12 bzw. einer aus 7 Vitaminen bestehenden Lösung

gefördert wird. Das Wachstum wurde, wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben,

durch die Zunahme an Biomassetrockengewicht bestimmt. Eine detaillierte

Darstellung der Messergebnisse und die daraus errechneten Mittelwerte ist im

Anhang dargestellt (Tab. 42).

16,0

16,2

16,4

16,6

16,8

17,0

17,2

17,4

17,6

Bio

mas

setr

ocke

ngew

icht

[mg]

ASNIII/2 ohne Vitamine

Vit B12 2,5 µg/l

Vit B12 5 µg/l

Vit B12 10 µg/l

7-Vitamin-Lsg. 0,25 ml/l



AbbTab. 12: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen verschiedener Vitamin-Lösungen nach 3 Wochen Wachstum. Die Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf Grund der unterschiedlichen Mengen der einzelnen Vitamine in der Lösung nicht möglich (siehe Tab. 8)

Das Wachstum von Stamm Flo1 konnte durch die geringe Zugabe von Vitaminen, im

Vergleich zum Medium ohne Vitamine (grau), gesteigert werden. Das größte

Wachstum von Stamm Flo1 mit Vitamin B12 (grün) konnte bei einer Konzentration

von 2,5 µg/l dokumentiert werden. Die Zugabe von 5 µg/l hatte nur eine geringe

Steigerung des Biomassetrockengewichts zur Folge. Eine zu hohe Konzentration von

Vitamin B12 (10 µg/l) führte zu vermindertem Wachstum.

Die Zugabe von 0,5 ml/l der 7-Vitamin-Lösung (orange) bewirkte die größte Zunahme

an Biomassetrockengewicht. Die Zugabe von 0,25 und 1,0 ml/l der 7-Vitamin-Lösung

hatte keinen positiven Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Stamm Flo1.

3. Ergebnisse 59

3.4.6 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen

In diesem Versuch sollte untersucht werden, mit welchen anorganischen

Verbindungen Stamm Flo1 in der Lage ist zu wachsen. Dabei wurden die

Stickstoffverbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und das

Biomassetrockengewicht nach einer Inkubation über einen Zeitraum von 3 Wochen

bestimmt (Abb. 13). Eine detaillierte Darstellung der Messergebnisse und die daraus

errechneten Mittelwerte ist im Anhang dargestellt (Tab. 43).

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Bio

mas

setr

ocke

ngew

icht

[m

g]

ASN III/2

-

1 mM N

itrat

2,5 m

M Nitra

t

5 mM N

itrat

10 m

M Nitra

t

1 mM A

mmonium

2,5 m

M Ammon

ium

5 mM A

mmonium

10 m

M Ammonium

1 mM N

itrit

2,5 m

M Nitri

t

5 mM N

itrit

10 m

M Nitri

t

Abb. 13: Zunahme des Biomassetrockengewichts von Stamm Flo1 in Abhängigkeit unterschiedlicher Konzentrationen anorganischer Stickstoffverbindungen nach 3 Wochen Wachstum Abbildung 13 zeigt die Verwertung der in unterschiedlichen Konzentrationen

eingesetzten Stickstoffverbindungen Natriumnitrat (NaNO3, blau), Ammoniumchlorid

(NH4Cl, grün) und Natriumnitrit (NaNO2, orange) im Vergleich zur Kontrolle ohne

Stickstoffquelle (ASNIII/2, grau).

In den Ansätzen mit Natriumnitrat als einziger Stickstoffquelle war im Vergleich zum

Kontrollansatz keine signifikant höhere Produktion an Biomasse zu beobachten. Die

höchste Produktion an Biomasse bzw. Trockengewicht (10,01 mg) wurde bei einer

Konzentration mit 1 mM Nitrat erzielt und lag im Vergleich mit der Kontrolle (9,16 mg)

nur unwesentlich höher. Bei Konzentrationen von 2,5 mM (9,36 mg Trockengewicht)

und 5 mM (9,57 mg Trockengewicht) konnte keine gesteigerte Produktion an

Biomasse dokumentiert werden. Bei einer Konzentration von 10 mM war sogar eine

Abnahme in der Biomasse (8,86 mg) im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten.

Mit Ammoniumchlorid als einziger Stickstoffquelle war im Vergleich zur Kontrolle nur

bei einer Konzentration von 2,5 mM die Ausbeute an Biomasse signifikant höher

3. Ergebnisse 60

(10,76 mg Trockengewicht). Mit Konzentrationen von 1 und 5 mM Ammonium lag die

Menge an produzierter Biomasse (9,43 bzw. 9,27 mg) nur unwesentlich höher als in

der Kontrolle. Bei einer Konzentration von 10 mM war dagegen eine Abnahme der

Biomasse (8,58 mg) im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten.

Die insgesamt größte Produktion an Biomasse konnte mit Natriumnitrit als einziger

Stickstoffquelle nachgewiesen werden. Bei einer Konzentration von 1 mM Nitrit

wurde die meiste Biomasse (11,89 mg Trockengewicht) gebildet. Eine gesteigerte

Biomasseproduktion (10,71 mg) konnte bei einer Konzentration von 2,5 mM Nitrit

dokumentiert werden. Mit Konzentrationen von 5 und 10 mM Nitrit war eine

signifikante Abnahme an Biomasse (7,65 bzw. 6,74 mg) zu beobachten.

3.4.7 Fähigkeit zur Stickstofffixierung

Die Auswertung des Acetylen-Reduktions-Tests erfolgte durch die Detektion des

gebildetem Ethen mittels Gaschromatograph (siehe Kapitel 2.4.7). Dabei konnte in

keiner Probe die Reduktion von Acetylen zu Ethen dokumentiert werden. Folglich hat

bei Stamm Flo1keine Stickstofffixierung stattgefunden.

3.5 Auswertung der molekularbiologischen Charakterisierung der Stämme Flo1 und PCC 7105

3.5.1 DNA-Extraktion

Die extrahierten und in TE-Puffer resuspendierte DNAs (siehe Kap. 2.5.1) der

Stämme Flo1 und PCC 7105 wurden bei 4 °C im Dunkeln gelagert und für die PCR-

Reaktionen eingesetzt. Als Positivkontrolle der DNA-Extraktion erfolgte eine

Auftrennung im Agarose-Gel (siehe Kap. 2.5.2.2) (Gel-Bild nicht gezeigt).

3. Ergebnisse 61

3.5.2 Amplifikation der 16S rDNA

Die ermittelten 16S rDNA Sequenzen der Stämme Flo1 (1372 bp) und PCC 7105

(1378 bp) sind im Anhang dargestellt (Tab. 44 und 45). Ein Vergleich der ermittelten

Sequenz von Stamm Flo1 mit Sequenzen einer öffentlichen Datenbank (NCBI)

mittels BLAST ergab die in Tabelle 28 dargestellten Übereinstimmungen.

Tab. 28: Vergleich der 16S rDNA Sequenz verschiedener Geitlerinema Stämme aus der NCBI-Datenbank mit der von Stamm Flo1. Angegeben sind die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare (bp) mit Stamm Flo1 sowie die Accession-Nummern der Stämme n.d: nicht durchgeführt

AF132791.1

1461 1332/1372

Geitlerinema sp. PCC 7105 Geitlerinema sp. BBD P2b-1Geitlerinema sp. BBD HS217Geitlerinema sp. BBD HS223

EF372580.1

EF110974.1

DQ680351.1

EF154084.1

Stamm Länge der Sequenz [bp] Identität [bp] Identität [%] Accession-Nr.

1409 1363/1369 99,56% AF132780.1

97,08%

1419 1330/1372 96,94%

1439 1330/1372 96,94%

Geitlerinema sp. W-1

Gloeobacter violaceus PCC 8105

1396 1322/1362 97,06%

1407 n.d n.d

Stamm Flo1 zeigt eine Übereinstimmung in der 16S rDNA Sequenz von 99,56% mit

Geitlerinema sp. Stamm PCC 7105, welcher in der vorliegenden Arbeit als

Referenzstamm eingesetzt wurde (siehe Kap. 2.1). Bei dem als „Outgroup“

verwendeten Stamm Gloeobacter violaceus konnte in der NCBI-Datenbank kein

Vergleich durchgeführt werden, so dass die Übereinstimmungen der Basenpaare

nicht angegeben werden konnte.

Ein Vergleich der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Sequenz von Stamm PCC

7105 mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Sequenz von Geitlerinema sp. PCC

7105 zeigte eine Übereinstimung von 99,93% (Daten nicht gezeigt).

3. Ergebnisse 62

3.5.3 Amplifikation des Gens gyrB

Die ermittelten Sequenzen des Gens gyrB der Stämme Flo1 (1150 bp) und PCC

7105 (1181 bp) sind im Anhang (Tab. 46 und 47) dargestellt. Ein Vergleich der

ermittelten Sequenzen der Stämme Flo1 und PCC 7105 mit Sequenzen in den

öffentlichen Datenbanken NCBI und ICB ergab die in Tabelle 29 dargestellten

Übereinstimmungen.

Tab. 29: Vergleich der gyrB Sequenz von Stamm Flo1 mit Sequenzen der NCBI- und ICB-Datenbank. Angegeben sind die Länge der hinterlegten Sequenzen, die Übereinstimmungen der Basenpaare (bp) mit Stamm Flo1 sowie die Accession-Nummern der Stämme n.d: nicht durchgeführt

AB014989.1 *2

Pleurocapsa sp. PCC 7327 1173 795/1111 71,56% AB074784.1 *2

Microcystis wesenbergii 1144 813/1137 71,50%

n.d. gy00448 *1

AB074779.1 *2

Chroococcidiopsis sp. PCC 7431 1188 829/1144 72,47% AB074786.1 *2

73,11%Oscillatoria sp. PCC 7112

Anabaena variabilis 1439 n.d.

AB096723.1 *2 Nostoc entophytum 1188 810/1137 71,24%

1188 813/1112

Gloeobacter violaceus n.d. gy00454 *1

Nostoc punctiforme 1419 n.d. n.d.

1461 n.d.

gy00447 *1

Accession-Nr./ ICB-Nr.

Synechococcus elongatus

Stamm Länge der Sequenz [bp] Identität [bp] Identität [%]

n.d. gy00453 *11409 n.d.

*1: Accession-Nr. aus der ICB-Datenbank *2: Accession-Nr. aus der NCBI-Datenbank

Die größte Übereinstimmung der Sequenz von Stamm Flo1 mit den Sequenzen der

NCBI-Datenbank lag bei 73,11%.

Ein Vergleich zwischen den Sequenzen der Stämme Flo1 und PCC 7105 und den in

der ICB-Datenbank hinterlegten Sequenzen des Gens gyrB ist in der ICB-Datenbank

nicht möglich. Daher sind keine detaillierten Aussagen über die Identität der Basen

möglich. Die längeren Sequenzen (ca. 1400 bp) der Stämme aus der ICB-Datenbank

sind auf einen (klonierten) Zusammenschluss der Sequenzen der Gene gyrB (~1,23

kb) und rpoC1 (~230 bp) zurückzuführen.

3. Ergebnisse 63

3.5.4 Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen

Die Darstellung der phylogenetischen Stammbäume auf Basis der Sequenz der 16S

rDNA (Abb. 14) und des Gens gyrB (Abb. 15) erfolgte nach der UPGMA-Distanz-

Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) (siehe Kap. 2.5.2.4). Die als

Vergleich durchgeführten Methoden „Neighbor-Joining“, „Minimum Evolution“ und

„Maximum Parsimony“ ergaben ähnliche phylogenetische Verwandtschaften (Daten

nicht gezeigt).

Geitlerinema sp. BBD P2b-1

Geitlerinema sp. W-1

Geitlerinema sp. BBD HS217

Geitlerinema sp. BBD HS223

Stamm PCC 7105

Stamm Flo1


8249

100

100

0.000.010.020.030.040.050.06 Abb. 14: Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der 16S rDNA-Sequenz nach der UPGMA-Distanz-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) zur Berechnung der evolutiven Distanzen. An den Knotenpunkten sind die Bootstrap-Werte (in Prozent) dargestellt. Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid

Abbildung 14 zeigt die Verwandtschaftsbeziehungen der Stämme Flo1 und PCC

7105 auf Basis der 16S rDNA-Sequenz. Der Referenzstamm PCC 7105 zeigt eine

enge Verwandtschaft zu Stamm Flo1, beide Stämme sind als Cluster deutlich von

den anderen Stämmen der Gattung Geitlerinema abgegrenzt.

Der als „Outgroup“ verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105 ist deutlich

von den anderen Clustern abgegrenzt.

3. Ergebnisse 64

Nostoc punctiforme PCC 73102

Nostoc entophytum

Anabaena variabilis ATCC 29413

Chroococcidiopsis sp. PCC 7431

Oscillatoria sp. PCC 7112

Microcystis wesenbergii

Pleurocapsa sp. PCC 7327

Stamm Flo1

Stamm PCC 7105

Synechococcus elongatus PCC 7942


100

8997

53

87

94

100100

0.000.050.100.150.200.25 Abb. 15: Phylogenetischer Stammbaum auf Basis der Sequenz des Gens gyrB nach der UPGMA-Distanz-Methode und dem Model von JUKES und CANTOR (1969) zur Berechnung der evolutiven Distanzen. An den Knotenpunkten sind die Bootstrap-Werte (in Prozent) dargestellt. Skalierung: Anzahl an Substitutionen pro Nukleotid

Abbildung 15 zeigt die Verwandtschaftsbeziehungen der Stämme Flo1 und PCC

7105 auf Basis der Sequenz des Gens gyrB. Beide Versuchsorganismen bilden ein

deutlich zu den Referenzstämmen abgegrenztes Cluster. Der als „Outgroup“

verwendete Stamm Gloeobacter violaceus PCC 8105 ist deutlich von den anderen

Clustern abgegrenzt.

Hohe Bootstrap-Werte in beiden Stammbäumen zeigen eine hohe statistische

Absicherung der Ergebnisse.

3. Ergebnisse 65

3.5.5 Random Amplified Polymorphism DNA-Analyse (RAPD)

Eine RAPD wurde mit den Stämmen Flo1 und PCC 7105 im Doppelansatz mit

unverdünnter und 1:10 in TE-Puffer verdünnter DNA durchgeführt (siehe Kap. 2.5.3).

Das Gel-Bild ist in Abbildung 16A dargestellt. Zusätzlich wurde das spezifische

Bandenmuster in Abbildung 16B digitalisiert dargestellt.

Abb. 16: Gelbild (16A) und digitalisiertes Bandenmuster (16B) der RAPD mit den Stämmen Flo1 (Proben 2 und 4) und PCC 7105 (Proben 3 und 5). Eingesetzt wurden der Marker (DNA-Ladder-Mix; Gene-Ruler: Probe 1) sowie unverdünnte DNA (Proben 2 und 3) und 1:10 verdünnte DNA (Proben 4 und 5).

Abbildung 16A zeigt das Gel-Bild der RAPD. Sowohl in den Proben mit unverdünnter

als auch verdünnter DNA entstanden fast identische Bandenmuster. Die

Bandenmuster der Stämme Flo1 und PCC 7105 wiesen dabei hohe Ähnlichkeiten

auf und zeigten nur im höhermolekularen Bereich von 4000 bis 10000 bp signifikante

Unterschiede. Anhand des Gel-Bildes wurden die Banden und ihre relative Lage

zueinander in digitalisierter Form dargestellt (Abb. 16B). Mit Hilfe der digitalisierten

Bandenmuster wurde ein Consensusbandenmuster erstellt, d.h. es wurden nur

Banden berücksichtigt, die bei beiden Stämmen nachgewiesen werden konnten.

Diese wurden als spezifische Bandenmuster der RAPD Zusammenfassend in

16A 16B 1 2 3 4 5

1500 bp

800 bp

500 bp

300 bp

4000 bp

10000 bp

Probe: Probe: 1 2 3 4 5

3. Ergebnisse 66

Tabelle 30 in Relation zum Marker dargestellt. Zusätzlich wurden die Unterschiede

im Bandenmuster zwischen den Stämmen Flo1 und PCC 7105 aufgezeigt.

Tab. 30: Dokumentation der RAPD-Consensusbanden und von Einzelbanden der Stämme Flo1 und PCC 7105 in relativer Lage zum Marker (DNA-Ladder-Mix)

nur Flo1 nur PCC 7105

Marker mit bp-Angaben Consensusbanden Einzelbanden

In Tabelle 30 ist eine große Homologie zwischen den Bandenmustern der Stämme

Flo1 und PCC 7105 zu erkennen. 16 Banden im Bereich von ~200 bis 3000 bp

konnten in beiden Stämmen dokumentiert werden. Zusätzlich zeigte das Gel-Bild von

Stamm Flo1 fünf Banden, die im „Fingerprint“ von Stamm PCC 7105 nicht

nachgewiesen werden konnten. Drei dieser Banden lagen im höhermolekularen

Bereich von <5000 bp, außerdem je eine Bande bei ~1500 bzw. bei ~750 bp. Bei

Stamm PCC 7105 konnte dagegen nur eine zusätzliche Bande (~1500 bp)

dokumentiert werden.

2000

2500

4000 6000

10000

1031 1500

900 800 700

600

500

300

400

3. Ergebnisse 67

3.5.6 Amplified rDNA Restriction Analysis-Analyse (ARDRA)

Die Auswertung der ARDRA erfolgte auf zwei separaten Agarose-Gelen durch

Auftrennung der Fragmente nach sequenzspezifischem Restriktionsverdau mit

sieben unterschiedlichen Enzymen (siehe Kap. 2.5.4). Anhand der entstandenen

Banden (Abb. 17A und 18A) sollte ein digitalisiertes, spezifisches Bandenmuster

(Abb. 17B und 18B) für einen Vergleich der Stämme Flo1 und PCC 7105 erstellt

werden (Tab. 31).

Abb. 17: Gel-Bild (17A) und digitalisiertes Bandenmuster (17B) der ARDRA von Stamm Flo1 nach Restriktionsverdau und Auftrennung der Fragmente im Agarose-Gel Probe 1: Marker (100bp DNA- Marker) Probe 2: Alu I Probe 3: Msp I Probe 4: Rsa I

Probe 5: BsuR I (Hae III) Probe 6: Hinf I Probe 7: Hha I Probe 8: Sau96 I

17A 17B 3000 bp

1000 bp

500 bp

200 bp

Probe: 1 2 3 4 5 6 7 8

Probe: 1 2 3 4 5 6 7 8

3. Ergebnisse 68

Abb. 18: Gel-Bild (18A) und digitalisiertes Bandenmuster (18B) der ARDRA von Stamm Flo1 nach Restriktionsverdau und Auftrennung der Fragmente im Agarose-Gel Probe 1: Marker (100bp DNA- Marker), Probe 2: Alu I Probe 3: Msp I Probe 4: Rsa I

Probe 5: BsuR I (Hae III) Probe 6: Hinf I Probe 7: Hha I Probe 8: Sau96 I

Die Abbildungen 17 und 18 zeigen die entstandenen Bandenmuster der Stämme

Flo1 und PCC 7105 nach Restriktionsverdau durch sieben verschiedene

Restriktionsenzyme. Für Stamm Flo1 konnten im Bereich von ~200 bp bis ~700 bp

drei bis sechs Banden dokumentiert werden. Für Stamm PCC 7105 konnten nur drei

bzw. vier Banden dokumentiert werden, Banden unter 200 bp konnten nicht

detektiert werden. Ein Vergleich der digitalisierten Bandenmuster der Stämme Flo1

und PCC 7105 erfolgt in Tabelle 33.

18B 18A

Probe: Probe:

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 3000 bp

1000 bp

500 bp

200 bp

3. Ergebnisse 69

Tab. 31: Vergleich der digitalisierten Bandenmuster der ARDRA der Stämme Flo1 und PCC 7105. Zur Größenbestimmung der Fragmente wurde auch das entstandene Bandenmuster des Markers digitalisiert. Gestrichelte Banden konnten nicht auf dem Gel detektiert werden (siehe Text)

Alu I Msp I Rsa I Sau96 I

PCC 7105 Flo1 PCC

7105 Flo1

BsuR I (Hea III) Hinf I Hha I

Flo1

Restriktions-enzym

Flo1 PCC 7105

PCC 7105

PCC 7105 Flo1 PCC

7105 Flo1Flo1 PCC 7105

StammMarker

700 600 500

400

300

200

3. Ergebnisse 70

Ein Vergleich der digitalisierten Bandenmuster zeigt große Ähnlichkeiten zwischen

den Stämmen Flo1 und PCC 7105. In beiden Ansätzen konnten keine Fragmente im

Bereich von ~3000 bis ~700 bp nachgewiesen werden (siehe Abb. 17A und 18A). Im

niedermolekularen Bereich konnten, abhängig von den verwendeten Enzymen drei

bis sechs Fragmente nachgewiesen werden. Auf dem Gel-Bild für Stamm PCC 7105

konnten keine Fragmente kleiner als 300 bp nachgewiesen werden. Diese kleineren

Fragmente wurden möglicherweise aufgrund einer zu langen Laufzeit aus dem Gel

gezogen und wurden deshalb in der vergleichenden Digitalisierung gestrichelt

dargestellt.

3.5.7 Real-Time-PCR-Analyse

Die Auswertung der RT-PCR zum spezifischen Nachweis des Gens mcyA von

Stamm Flo1 (siehe Kap. 2.5.5) umfasste die Darstellung der Fluoreszenz-Emission

nach jedem Zyklus (Abb. 19) sowie eine Schmelzkurve der entstandenen Amplifikate

zur Differenzierung der Produkte (Abb. 20). Als Positivkontrolle wurde DNA der

Microcystis Stämme PCC 7806 und PCC 7941 eingesetzt. Die Detektion der

Fluoreszenz erfolgte jeweils nach der Polymerisation.

Abb. 19: Dokumentation der Fluoreszenz-Emission während der RT-PCR über 50 Zyklen. Eingesetzt wurden die Stämme PCC 7806 (orange) und PCC 7941 (grün) als Positivkontrollen sowie die DNA von Stamm Flo1 (gelb) und eine Negativkontrolle ohne DNA (braun)

3. Ergebnisse 71

Abbildung 19 zeigt die jeweilige Fluoreszenz-Emission bei den Cyanobakterien-

Stämme PCC 7806, PCC 7941 und Flo1 sowie der Negativkontrolle. Der Begin der

Amplifikation erfolgte nach unterschiedlicher Zyklenzahl zwischen Zyklus 15 und 35.

Bei allen Proben, einschließlich der Negativkontrolle, konnte eine Fluoreszenz-

Emission mit sigmoidem Kurvenverlauf dokumentiert werden. Eine Analyse der

Produkte durch Erstellung einer Schmelzkurve sollte Aufschluss über die

amplifizierten Produkte geben (Abb. 20).

Abb. 20: Dokumentation der Schmelzkurven und Schmelzpunkte (rote Linien) der PCR-Produkte (siehe Kap. 3.5.7) im Bereich von 60 bis 90 °C. Eingesetzt wurden die PCR-Produkte der Stämme PCC 7806 (orange), PCC 7941 (grün) und von Stamm Flo1 (gelb) sowie der Negativkontrolle (braun) Abbildung 20 zeigt die Schmelzkurven der mittels RT-PCR amplifizierten PCR-

Produkte. Deutlich zu erkennen sind die unterschiedlichen Schmelzpunkte der

Positivkontrollen (orange und grün) im Gegensatz zu den Amplifikaten von Stamm

Flo1 (gelb) und der Negativkontrolle (braun). Dabei lagen die Schmelzpunkte von

Stamm Flo1 und der Negativkontrolle mit 82,70 ± 0,11 °C (A) signifikant niedriger als

Schmelzpunkte der Stämme PCC 7806 und 7941, die Werte von 85,93 ± 0,09 °C (B)

aufwiesen.

A B

3. Ergebnisse 72

3.6 Ermittlung des G+C-Gehaltes

Die Ermittlung des G+C-Gehaltes (siehe Kap. 2.6) erfolgte mittels 5fach-Bestimmung

(Tab. 32) durch Erstellung von Schmelzkurven im Bereich von 60-90°C (Daten nicht

gezeigt). Die Berechnung des G+C-Gehaltes der DNA von Stamm Flo1 wurde auf

Basis der ermittelten Schmelztemperatur des Referenzstammes E.coli nach MARMUR

und DOTY (1961) wie folgt berechnet :

mol% G+C Probe = ([TM Probe + (90,5 –TM E.coli)] –69,3)/0,41

Zusätzlich wurden zur Darstellung der Reinheit der eingesetzten DNA die Absorption

(A) bei den Wellenlängen 234, 260 und 280 nm gemessen und die Quotienten

234/260 nm und 260/280 nm gebildet.

Tab. 32: Schmelztemperaturen (TM) der DNA der Stämme Flo1 und E.coli und berechneter G+C-Gehalt von Stamm Flo1 sowie Absorptions-Quotienten zur Reinheitsbestimmung der DNA

1 76,9 0,35 3,29 77,5 0,53 1,87 50,22 76,9 0,74 1,78 77,9 0,48 1,89 49,33 77,9 2,02 1,33 77,4 0,63 1,82 52,94 76,5 0,81 1,73 78,3 0,71 1,88 47,35 75,8 0,96 1,91 77,8 0,54 2,05 46,8

Messung Ratio 260/280 nm

TM E.coli [°C]

Flo1 G+C- Gehalt [mol%]

TM Flo1 [°C]

Ratio 234/260 nm

Ratio 260/280 nm

Ratio 234/260 nm

Die Bestimmung der Schmelztemperatur ergab im arithmetischen Mittel einen

Schmelzpunkt der DNA von 76,8 ± 0,7 °C (Stamm Flo1) bzw. 77,8 ± 0,3 °C (E.coli).

Die Berechnung des Mittelwertes der ermittelten G+C-Gehalte ergab einen G+C-

Gehalt der DNA für Stamm Flo1 von 49,2 ± 2,2 mol%.

Die Berechnung der Quotienten wies für Stamm Flo1 große Schwankungen

zwischen 0,35 bis 2,02 (234/260 nm) und 1,33 bis 3,29 (260/280 nm) auf. Beim

Referenzstamm E.coli waren nur sehr geringe Schwankungen von 0,53 bis 0,71 für

A234/260 nm bzw. 1,82 bis 2,05 für A260/280 nm zu beobachten.

3. Ergebnisse 73

3.7 Analyse des Fettsäuremusters

Zur Analyse des Fettsäureprofils von Stamm Flo1 wurden Kulturen untersucht, die

bei unterschiedlichen Photonenflussdichten (1 und 20 µE m-2 s-1 PAR) gehältert

wurden (siehe Kap. 2.7). Zusätzlich zur Bestimmung der qualitativen

Zusammensetzung (Abb. 21) wurde auch der prozentuale Anteil an gesättigten und

ungesättigten Fettsäuren dokumentiert (Abb. 22). Eine detaillierte Darstellung der

ermittelten Retentionszeiten der Fettsäuren, deren relative Verteilung (area counts)

sowie die Summenformeln der identifizierten Fettsäuren ist im Anhang dargestellt

(Tab. 48 und 49).

39%

1%

28%

7%4%

21%

n.i14-Methylpentadecanoat-Methylestercis-9-Hexadecenoat-MethylesterHexadecanoat-Methylestercis-9-Octadecenoat-Methylestertrans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester

47%

25%

5%

13%

10%

n.i.cis-9-Hexadecenoat-MethylesterHexadecanoat-Methylestercis-9-Octadecenoat-Methylestertrans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester

Abb. 21: Qualitative Bestimmung des Fettsäuren von Stamm Flo1 nach Wachstum für 3 Wochen bei 1 µE m-2 s-1 PAR (21A) und 20 µE m-2 s-1 PAR (21B) und deren prozentualer Verteilung n.i.: nicht identifizierte Fettsäuren Wie in Abbildung 21A ersichtlich, konnten bei Stamm Flo1 nach Wachstum mit einer

PFD von 1 µ E m-2 s-1 PAR fünf unterschiedliche Fettsäuren genau detektiert werden.

Den größten Anteil hatten dabei die C16-Fettsäuren Hexadecanoat-Methylester

(28%) und cis-9-Hexadecenoat-Methylester (21%). Außerdem konnten die C18-

Fettsäuren cis-9-Octadecenoat-Methylester (7%) und trans-9- + cis-11-

Octadecenoat-Methylester (4%) sowie die C15-Fettsäure 14-Methylpentadecanoat-

Methylester (1%) nachgewiesen werden. 39% der detektierten Fettsäuren konnten

mittels Standard-Gemisch (FAME-Mix) nicht identifiziert werden.

Nach Wachstum mit einer PFD von 20 µ E m-2 s-1 PAR konnten 4 unterschiedliche

Fettsäuren detektiert werden. Den größten Anteil an Fettsäuren hatte dabei

Hexadecanoat-Methylester (25%). Außerdem konnten die Fettsäuren cis-9-

21A 21B

3. Ergebnisse 74

Hexadecenoat-Methylester (13%), cis-9-Octadecenoat-Methylester (5%) und trans-9-

+ cis-11-Octadecenoat-Methylester (10%) nachgewiesen werden. 47% der

Fettsäuren konnten mittels Standard-Gemisch nicht identifiziert werden.

Ein Vergleich der Verteilung von gesättigten Fettsäuren (14-Methylpentadecanoat-

Methylester und Hexadecanoat-Methylester) und ungesättigten Fettsäuren (cis-9-

Hexadecenoat-Methylester, cis-9-Octadecenoat-Methylester und trans-9- + cis-11-

Octadecenoat-Methylester) ist in Abbildung 22 dargestellt.

48,2%51,8%

Anteil gesättigter FettsäurenAnteil ungesättigter Fettsäuren

47,2%52,8%

Anteil gesättigter FettsäurenAnteil ungesättigter Fettsäuren

Abb. 22: Darstellung der Anteile an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren von Stamm Flo1 nach Wachstum bei unterschiedlichen PFDs von 1 µE m-2 s-1 PAR (22A) bzw. 20 µE m-2 s-1 PAR (22B). Abbildung 22A zeigt den Anteil an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren bei

Stamm Flo1 nach Wachstum bei 1 µE m-2 s-1 PAR. Der Anteil an ungesättigten

Fettsäuren lag mit 51,8% nur minimal über dem Anteil an gesättigten Fettsäuren

(48,2%). Auch nach Wachstum bei einer PFD von 20 µE m-2 s-1 PAR (Abb. 22B) lag

der Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit 52,8% nur minimal über dem Anteil an

gesättigten Fettsäuren (47,2%). Ein Vergleich der prozentualen Verteilung der

Fettsäuren nach Wachstum bei PFDs von 1 bzw. 20 µE m-2 s-1 zeigte keine

signifikanten Unterscheide.

22A 22B

3. Ergebnisse 75

3.8 Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente

Die Analyse der photosynthetisch aktiven Pigmente umfasste sowohl den qualitativen

als auch den quantitativen Nachweis der Carotinoide, des Chlorophylls a sowie der

Phycobiliproteine. Dabei wurden Kulturen verwendet, die über einen Zeitraum von 3

Monaten an die jeweiligen PFDs adaptiert worden waren (siehe Kap. 2.8.1.1).

3.8.1 Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a und Carotinoiden

Nach photometrischer Bestimmung der Absorptionen bei 461 nm und 665 nm

erfolgte die Berechnung der Chlorophyll a- und Carotinoid-Gehalte (siehe Kap.

2.8.1.2). Eine detaillierte Darstellung der ermittelten Messergebnisse ist im Anhang

dargestellt (Tab. 50). Als Bezugsgröße wurde die ermittelte Carotinoid-Konzentration

auf die Menge an Chlorophyll a bezogen und durch Berechnung als

Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten dargestellt.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

Car

otin

oid/

Chl

orop

hyll

a-Q

uotie

nt

1 5 10 15 20

Photonenflussdichte [µE m-2 s-1 PAR]

Abb. 23: Quotienten aus Carotinoid- und Chlorophyll a-Gehalten der Proben (Mittelwerte der Doppelbestimmung) nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlich hohen PFDs

Der Carotinoid/Chlorophyll a-Quotient zeigte eine Korrelation zwischen Photonen-

flussdichte und Menge an synthetisierten Pigmenten (Abb. 23). Mit steigender

Photonenflussdichte war eine stetige Zunahme des Quotienten zu beobachten. Eine

verstärkte Zunahme des Quotienten fand nach Wachstum bei PFDs von 15 und 20

µE m-2 s-1 PAR statt. Während die Quotienten nach Wachstum bei Lichtintensitäten

3. Ergebnisse 76

von 1 bis 10 µE m-2 s-1 PAR zwischen 0,32 und 0,44 lagen, war der Quotient nach

Wachstum bei einer Lichtintensität von 15 µE m-2 s-1 PAR im Vergleich zum Wert bei

1 µE m-2 s-1 PAR etwa doppelt so hoch.

Die qualitative Zusammensetzung an Carotinoiden wurde mittels Reverse Phase

HPLC ermittelt (siehe nachfolgendes Kapitel).

3.8.2 Qualitative Carotinoid-Bestimmung

Nach Injektion der Extrakte und Separation der Pigmente mittels HPLC wurden die

Retentionszeiten mittels DAD und UV/Vis detektiert (siehe Kap. 2.8.2). In allen

Extrakten konnten vier unterschiedliche Pigmente mit verschiedenen

Retentionszeiten von durchschnittlich 3,2; 6,9; 16,8 und 20,0 min detektiert und

deren Absorptionsspektren (Abb. 24) ermittelt werden, anhand derer die

Absorptionsmaxima und Schultern der Peaks zur Identifikation der Pigmente ermittelt

wurden.

Abb. 24: Absorptionsspektren der Pigmente von Stamm Flo1. Die Detektion erfolgte mittels DAD

24A 24B

24C 24D

3. Ergebnisse 77

Die Auswertung der Absorptionsmaxima ergab bei den unterschiedlichen Pigmenten

die in Tabelle 33 dargestellten Peaks bzw. Schultern.

Tab. 33: Zusammenfassung der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der detektierten Pigmente in den Extrakten nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs über einen Zeitraum von insgesamt 3 Monaten mit korrespondierenden Literaturdaten bzw. käuflich erworbener Standards. In Klammern sind Schultern der Peaks dargestellt

3,38 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,07 (446), 458, 487 Zeaxanthin Roche16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,10 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche2,94 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel6,50 (446), 458, 479 Zeaxanthin Roche16,37 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,62 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche3,29 (452), 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,07 (446), 465, 487 Zeaxanthin Roche16,81 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,97 (446), 458, 487 ß-Carotin Roche3,38 (452), 487, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,20 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche17,03 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,19 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche3,25 (452), 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel6,89 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche16,72 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich19,93 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche

10

15

20

PFD [µE m-2 s-1 PAR]

1

zugeordnetes Pigment Quelle

5

Retentionszeit DAD [min]

detektierte Absorptionsmax. [nm]

Durch einen Vergleich der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der

detektierten Pigmente mit Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) und

käuflich erworbener Standards (Roche; Sigma-Aldrich) konnten die Carotinoide

identifiziert werden. In allen Extrakten konnten die Pigmente Myxoxanthophyll,

Zeaxanthin, ß-Carotin und Chlorophyll a identifiziert werden. Eine Auswertung der

relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten Peakflächen (area

counts, Daten nicht gezeigt).

Zur graphischen Darstellung wurde der Quotient aus dem jeweiligem Carotinoid und

Chlorophyll a gebildet (Abb. 25).

3. Ergebnisse 78

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

Car

otin

oid/

Chl

orop

hyll

a-Q

uotie

nt

1 5 10 15 20


Myxoxanthophyll Zeaxanthin ß-Carotin

Abb. 25: Darstellung der Quotienten aus den relativen Anteilen der Carotinoide Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin zu Chlorophyll a auf Basis der mittels HPLC ermittelten integrierten Peakflächen. Untersucht wurden Extrakte aus Kulturen von Stamm Flo1, die bei unterschiedlichen PFDs für insgesamt 3 Monate gehältert wurden Der Myxoxanthophyll- bzw. Zeaxanthin/Chlorophyll a-Quotient zeigte eine Korrelation

zwischen Photonenflussdichte und Menge an synthetisiertem Carotinoid (Abb. 25).

Mit steigender Photonenflussdichte war auch eine stetige Zunahme im Carotinoid-

Gehalte im Verhältnis zum Chlorophyll a-Gehalt zu beobachten.

Der ß-Carotin/Chlorophyll a-Quotient zeigte tendenziell ebenfalls eine Korrelation

zwischen Photonenflussdichte und Menge an synthetisiertem Carotinoid. Dabei

wurde der höchste Wert jedoch bei einer PFD von 15 µE m-2 s-1 PAR nachgewiesen.

Wie die Verteilung der Carotinoide zeigt, bildet ß-Carotin den Hauptbestanteil an der

Gesamtmenge der Carotinoide. Außerdem lag der Anteil an Zeaxanthin höher als der

von Myxoxanthophyll.

3. Ergebnisse 79

3.8.3 Qualitativer und quantitativer Nachweis der Phycobiliproteine

Die Bestimmung der Phycobiliproteine (siehe Kap. 2.8.3) erfolgte durch

photometrische Messung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen und

Berechnung der Konzentrationen (Abb. 26). Eine detaillierte Darstellung der

Messergebnisse und Berechnung der Mittelwerte ist im Anhang (Tab. 51) dargestellt.

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

Phyc

obili

prot

ein-

Geh

alt

[µg/

ml]

1 5 10 15 20


PE PC AP Gesamt Phycobiliproteine

Abb. 26: Darstellung der Konzentrationen an Phycoerythrin (PE), Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (AP) der Proben nach Inkubation der Kulturen von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs für insgesamt 3 Monate sowie Gesamt-Menge an Phycobili-proteinen Abbildung 26 zeigt den Phycobiliprotein-Gehalt der Proben nach Inkubation der

Kulturen von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs. Dabei nahmen die Gesamt-

Menge an Phycobiliproteinen und die Konzentration des Phycocyanins (PC) mit

steigender PFD konstant ab. Die Konzentration der Phycobiliproteine Phycoerythrin

(PE) und Allophycocyanin (AP) nahmen sowohl zu als auch ab.

3. Ergebnisse 80

3.8.4 Ergebnisse zur Komplementären Chromatischen Adaptation

Der Nachweis zur Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1

erfolgte durch Bestimmung der Konzentrationen an Phycobiliproteinen nach

Inkubation bei wechselnden Lichtbedingungen (siehe Kap. 2.8.4). Zusätzlich erfolgte

ein qualitativer Nachweis der synthetisierten Carotinoide (siehe Kap. 2.8.2).

3.8.4.1 Nachweis der Phycobiliproteine nach Inkubation in Rot- bzw. Grünlicht

Die photometrische Bestimmung der Phycobiliproteine erfolgte an 3 Kulturen von

Stamm Flo1 (im Doppelansatz) zu Begin (t0) und im Abstand von 3 Wochen (t1 bis t3)

über eine Versuchsdauer von insgesamt 9 Wochen (Tab. 34). Eine detaillierte

Darstellung der Messergebnisse ist im Anhang (Tab. 52 bis 54) dargestellt.

Zur Darstellung bezüglich der Fähigkeit zur „Komplementären Chromatischen

Adaptation“ wurden aus den errechneten Mittelwerten die Quotienten PC/AP und

PE/AP nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechnet und dargestellt

(Abb. 27).

Tab. 34: Zusammenfassung der ermittelten Phycoerythrin- (PE), Phycocyanin- (PC) und Allophycocyanin-Konzentrationen (AP) sowie der Quotienten von PC/AP und PE/AP während des Versuchsablaufs zur Komplementären Chromatischen Adaptation von Stamm Flo1. Als Kontrolle diente Probe A

t0 Weißlicht 1,88 8,39 1,98 4,23 0,95t1 Weißlicht 4,67 27,22 4,45 6,12 1,05t2 Weißlicht 6,69 40,09 11,46 3,50 0,58t3 Weißlicht 6,04 38,47 10,09 3,81 0,60t0 Weißlicht 1,80 9,47 1,95 4,86 0,92t1 Rotlicht 4,38 26,90 5,60 4,80 0,78t2 Grünlicht 5,13 28,88 7,49 3,86 0,68t3 Rotlicht 8,18 50,35 13,13 3,83 0,62t0 Weißlicht 2,07 9,00 2,60 3,46 0,80t1 Grünlicht 3,16 14,73 3,86 3,82 0,82t2 Rotlicht 4,99 34,45 7,18 4,80 0,70t3 Grünlicht 5,35 34,92 7,29 4,79 0,73

PC [µg/ml]

AP [µg/ml] PC/AP PE/APProbe Messzeit-

punktexponiertes

LichtPE

[µg/ml]

A

B

C

3. Ergebnisse 81

Tabelle 34 zeigt die Konzentrationen an Phycobiliproteinen nach wechselnden

Lichtbedingungen (Proben B und C) zu verschiedenen Messzeitpunkten im Vergleich

zur Kontrolle (Probe A), die mittels Weißlicht inkubiert worden war. Die graphische

Darstellung der „Komplementären Chromatischen Adaptation“ erfolgte basierend auf

den ermittelten Quotienten aus PC/AP und PE/AP.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

PC/A

P- u

nd P

E/A

P-Q

uotie

nten

t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3 t0 t1 t2 t3Messzeitpunkt

PC/AP PC/APPE/AP PE/AP

Abb. 27: Entwicklung der PC/AP- und PE/AP-Quotienten bei wechselnden Lichtbedingungen in den der Proben (B und C) und der Kontrolle (A) in Kulturansätzen von Stamm Flo1. Gesamtversuchsdauer: 9 Wochen: t0= Begin; t1= nach 3 Wochen; t2= nach 6 Wochen; t3= nach 9 Wochen. Weitere Einzelheiten siehe Tabelle 34 Sowohl in den Ansätzen mit wechselnden Lichtbedingungen (B und C, siehe auch

Tab. 34) als auch im Kontrollansatz (A) konnten nur geringe, ungerichtete

Schwankungen der PC/AP- und PE/AP-Quotienten über die gesamte Messdauer

beobachten werden. In der Kontrolle (A) erfolgte nach einem Anstieg der Quotienten

(PC/AP und PE/AP) nach 3 Wochen (t1) ein direkter Rückgang (t2). Danach (t3) war

nur beim PC/AP-Quotienten ein erneuter Anstieg zu beobachten. Der PE/AP-

Quotient blieb dagegen konstant. Der Quotient aus PC/AP in Probe B zeigte nach

Inkubation sowohl unter Rotlicht (t1) als auch unter Grünlicht (t2) einen geringen

Rückgang beider Quotienten. Nach anschließender Inkubation unter erneuten

Rotlichtbedingungen (t3) blieben beide Quotienten konstant. In Probe C war nach

Inkubation mittels Grünlicht (t1) und Rotlicht (t2) jeweils ein geringer Anstieg des

PC/AP-Quotienten zu beobachten. Der Quotient aus PE/AP blieb über die gesamte

Probe A Probe B Probe C

3. Ergebnisse 82

Messdauer konstant. Eine weitere Inkubation unter Grünlichtbedingungen (t3) hatte

keinen Einfluss auf eine Verschiebung der Quotienten.

3.8.4.2 Qualitativer Nachweis der im Rot- bzw. Grünlicht synthetisierten Pigmente

Die Identifizierung der Carotinoide mittels HPLC erfolgte durch Ermittlung der

Retentionszeiten und Absorptionsmaxima bzw. Schultern der Peaks in den

Absorptionsspektren (siehe Kap. 2.8.2).

Tab. 36: Zusammenfassung der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der detektierten Pigmente in den Extrakten von Stamm Flo1 nach Wachstum über einen Zeitraum von insgesamt 3 Monaten bei Rot- bzw. Grünlicht mit korrespondierenden Literaturdaten bzw. käuflich erworbener Standards. In Klammern sind Schultern der Peaks

Rotlicht 3,38 (452), 479, 512 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,11 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche 16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,06 (424), 458, 487 ß-Carotin Roche

Grünlicht 3,38 446, 479, 503 Myxoxanthophyll Karsten u. Garcia-Pichel7,11 (424), 458, 487 Zeaxanthin Roche 16,90 429, 668 Chlorophyll a Sigma-Aldrich20,06 (424), 458, 480 ß-Carotin Roche

QuelleLichtbedingungen Retentionszeit DAD [min]

detektierte Absorptionsmax. [nm]

zugeordnetes Pigment

Durch einen Vergleich der ermittelten Retentionszeiten und Absorptionsmaxima der

detektierten Pigmente mit Literaturdaten (KARSTEN und GARCIA-PICHEL 1996) bzw.

käuflich erworbener Standards (Roche; Sigma-Aldrich) konnten die Carotinoide

Myxoxanthophyll, Zeaxanthin, ß-Carotin und Chlorophyll a identifiziert werden. Die

Auswertung der relativen Anteile der Carotinoide erfolgte anhand der integrierten

Peakflächen (area counts, Daten nicht gezeigt).

Zur graphischen Darstellung wurde jeweils der Quotient aus dem jeweiligem

Carotinoid und dem Chlorophyll a gebildet (Abb. 28).

3. Ergebnisse 83

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

Car

otin

oid/

Chl

orop

hyll

a-

Quo

tient

Myxoxanthophyll Zeaxanthin ß-Carotin

Carotinoid

Rotlicht Grünlicht

Abb. 28: Quotient aus relativem Anteil der Carotinoide Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin zum Chlorophyll a auf Basis der mittels HPLC ermittelten integrierten Peakflächen. Untersucht wurden Extrakte aus Kulturen von Stamm Flo1, die bei Rot- bzw. Grünlicht über eine Dauer von insgesamt 3 Monaten gehältert wurden

Wie aus Abbildung 28 ersichtlich, war der Gehalt der drei Carotinoide bei Inkubation

unter Grünlichtbedingungen zweifach höher als unter Rotlichtbedingungen. In beiden

Ansätzen wurde Myxoxanthophyll in den geringsten Mengen nachgewiesen. Der

Anteil von Zeaxanthin lag etwa doppelt so hoch wie der Anteil von Myxoxanthophyll.

Der größte Quotient wurde in beiden Proben für ß-Carotin nachgewiesen, welches

etwa ⅔ der Menge an Carotinoiden ausmachte.

3. Ergebnisse 84

3.9 Ultrastruktur der Zelle von Stamm Flo1

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden bei 12.500 (Abb. 29) und

25.000facher (Abb. 30) Vergrößerung erstellt und ohne Nachbearbeitung

eingescannt (siehe Kap. 2.9). Eine Zuordnung und Identifizierung der

Zellbestandteile erfolgte mittels Literaturdaten (siehe Kap. 2.9.3).

Abb. 29: Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Zelle im Filament von Stamm Flo1 bei 12.500facher Vergrößerung. Mit Pfeilen markiert sind, die „Äußere Membran“ (AM), die Peptidoglykanschicht (PG) und die Cytoplasmamembran (CM), Einschnürungen zwischen den Zellen (E), Granula (GR), Thylakoid-Stapel (TS) mit Querverbindungen (QV) und ein Präparationsartefakt (PA) Abbildung 29 zeigt einen Querschnitt einer vegetativen Zelle von Stamm Flo1 bei

12.500facher Vergrößerung. Die „äußere Begrenzung“ der Zelle kann in Äußere

Membran (AM), Peptidoglykanschicht (PG) und Cytoplasmamembran (CM)

differenziert werden. Dunkel gefärbt sind die größtenteils randständigen Granula

(GR) zu erkennen. In regelmäßigen Abständen sind die Thylakoid-Stapel (TS) in

paralleler Anordnung zu erkennen. Zusätzlich sind die Quervernetzungen (QV) der

Thylakoide erkennbar.

Eine detaillierte Darstellung der „äußeren Begrenzung“ der Zelle und der Thylakoide

bei 25.000facher Vergrößerung ist in Abbildung 30 dokumentiert.

GR

AM

E

PG

PA

TS CM QV

3. Ergebnisse 85

Abb. 30: Elektronenmikroskopische Detail-Aufnahme der Zellwand und Thylakoide von Stamm Flo1 bei 25.000facher Vergrößerung. Mit Pfeilen markiert sind die Äußere Membran (AM), Peptidoglykanschicht (PG),Cytoplasmamembran (CM), Granula (GR) und Thylakoide (TS) mit Querverbindungen(QV)

Abbildung 30 zeigt einen Detail-Ausschnitt (siehe auch Abb. 29) einer vegetativen

Zelle von Stamm Flo1 im Querschnitt bei 25.000facher Vergrößerung. Mit Pfeilen

markiert ist die „äußere Begrenzung“ der Zelle bestehend aus Cytoplasmamembran

(CP), Peptidoglykanschicht (PG) und Äußerer Membran (AM) sowie unterschiedlich

große, dunkelschwarz gefärbte, vorwiegend randständige Granula (GR). In paralleler

Anordnung sind die Thylakoide (TS) mit ihren Querverbindungen (QV) dargestellt.

GR

CM PG AM

TS

QV

4. Diskussion 86

4. Diskussion

4.1 Hintergrund

Der in dieser Diplomarbeit charakterisierte Stamm Flo1 wurde bereits 1995 aus

einem Mangrovenwäldchen in Key Biscayne (Florida, USA) isoliert und in die

Cyanobakterien-Stammsammlung der Abt. Marine Mikrobiologie an der Universität

Bremen aufgenommen. In Untersuchungen zum Einfluss von Sulfid auf die

Photosyntheseleistung konnte gezeigt werden, dass Stamm Flo1 eine hohe Toleranz

gegenüber Sulfid aufweist und unter anaeroben Bedingungen in der Lage ist, dieses

zu oxidieren (RABENSTEIN 1997). Außerdem konnte bei Stamm Flo1 die Produktion

von extrazellulären Substanzen dokumentiert werden, die eine antimikrobielle

Wirkung gegen heterotrophe Bakterien und Cyanobakterien hatte und dabei u. a.

eine Zelllyse sowie teilweise eine Reduktion der Chlorophyll a- und Proteingehalte

bewirkte (HEYDUCK-SÖLLER und FISCHER 2000). In aktuellen Untersuchungen werden

diese extrazellulären Substanzen näher identifiziert und klassifiziert (CAICEDO et al.

2007).

Eine Klassifizierung von Stamm Flo1 erfolgte bisher ausschließlich auf Grundlage

morphologischer Merkmale nach GEITLER (1932). Dabei wurde Stamm Flo1 als

Oscillatoria limnetica klassifiziert (RABENSTEIN 1997). Die Klassifizierung nach

GEITLER (1932) erfolgte jedoch noch mit Hilfe des „Botanischen Codes“ (ICBN), da

eine Nomenklatur mittels „Bakteriellen Codes“ (ICNP) erst Ende der 70iger Jahre des

letzten Jahrhunderts eingeführt wurde (siehe auch Kap. 1.2.1).

Die große Problematik einer Klassifizierung ausschließlich auf Basis morphologischer

Merkmale ist, dass die morphologische Erscheinung eines Cyanobakteriums von den

Kultur- bzw. Umweltbedingungen beeinflusst wird (PREMANANDH 2006) und nur wenig

über die möglichen morphologischen Veränderungen der Zellen bekannt ist

(ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005). Auch ein Vergleich zwischen Cyanobakterien-

Isolaten kann zu fehlerhaften Einteilungen führen, da geschätzte 50% der

Cyanobakterien bisher falsch klassifiziert wurden (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 1988).

In dem neuesten Bestimmungsschlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005)

erfolgte zudem eine Überarbeitung der Klassifizierung unter Berücksichtigung neuer

Kriterien wie Zellgrößenverhältnis oder Anordnung der Thylakoide. So kam es z.B. zu

der Umordnung einiger Spezies (siehe auch Kap. 1.2.2) aus der Gattung Oscillatoria,

4. Diskussion 87

wie Oscillatoria limnetica, zur Gattung Geitlerinema (ANAGNOSTIDIS 1989). Generell

hat die Anzahl an Methoden zugenommen, die für eine Beschreibung eines

Cyanobakteriums berücksichtigt werden müssen (OREN und TINDALL 2005).

Stamm Flo1, der bisher auf rein morphologischer Basis als Oscillatoria limnetica

klassifiziert wurde (RABENSTEIN 1997), sollte nach dem neusten Bestimmungs-

schlüssel von ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) klassifiziert werden.

Für die polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1 wurden morphologische,

physiologische und molekularbiologische Untersuchungen berücksichtigt.

4.2 Polyphasische Beschreibung von Stamm Flo1

4.2.1 Morphologie

Die Ordnung Oscillatoriales (Sektion III, siehe auch Kap. 1.2.2) besteht

übereinstimmend nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) sowie CASTENHOLZ und

Mitarbeitern (2001) aus filamentösen Cyanobakterien, die ausschließlich durch

vegetative Zellen ohne Heterozysten oder Akineten charakterisiert sind. Auf

Gattungs-Ebene wird auf Grund der An- bzw. Abwesenheit einer Scheide sowie der

farblichen Erscheinung und der Größe der Zellen differenziert. Dabei wird je nach

Bestimmungsschlüssel zwischen sechs (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005) bzw. 17

Gattungen (CASTENHOLZ et al. 2001) unterschieden.

Die Gattung Geitlerinema ist nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001) sowie

ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) übereinstimmend durch gerade bis leicht

gebogene Filamente mit zylindrischen Zellen charakterisiert, die länger als breit sind.

Die Abgrenzung der Zellen im Filament erfolgt durch wenig ausgeprägte

Einschnürungen. Große Cyanophycin-Granula können an den Querwänden in

einigen Spezies nachgewiesen werden. Gas-Vesikel können nur selten dokumentiert

werden. Die Trichome weisen eine Motilität auf.

Zusätzlich weisen nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) die Filamente, die als

Matte oder in Büscheln auftreten, eine blaugrüne Färbung auf. Die Thylakoide sind

peripher und parallel zu den longitudinalen Zellwänden konzentrisch angeordnet.

Nach CASTENHOLZ und Mitarbeitern (2001) wird für Vertreter der Gattung

Geitlerinema ein G+C-Gehalt zwischen 53 und 67 mol% angegeben.

4. Diskussion 88

Die ermittelten morphologischen Merkmale von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.2.5)

stimmen mit den Kriterien der Gattung Geitlerinema nach CASTENHOLZ und

Mitarbeitern (2001) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) überein. Ein Vergleich

der morphologischen Merkmale von Stamm Flo1 mit dem Referenzstamm

Geitlerinema sp. PCC 7105 zeigte ein identisches morphologisches

Erscheinungsbild.

Anhand der erstellten TEM-Aufnahmen von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.9) konnten

zum einen konzentrische Thylakoide in peripherer und paralleler Anordnung zu den

longitudinalen Zellwänden nachgewiesen werden, zum anderen Granula, die in

Zellwandnähe ohne festgelegte Organisation angeordnet waren.

Zur Identifizierung der Granula von Stamm Flo1 wurde ein

elektronenmikroskopischer Vergleich mit TEM-Aufnahmen anderer Arbeiten

gemacht. Bei einem Vergleich der Granula-Struktur von Stamm Flo1 mit denen von

LIBERTON und Mitarbeitern (2006) beobachteten Strukturen könnte es sich um

Cyanophycin handeln. Die ebenfalls von den Autoren dargestellten Carboxysomen

weisen signifikant größere Ausmaße und eine wesentlich unregelmäßigere Form auf,

als die in der vorliegenden Arbeit dokumentierten Granula.

Aerotope oder Gas-Vesikel konnten nicht nachgewiesen werden (Details siehe

VENTER et al. 2003).

Auf Grund der Übereinstimmung in der Morphologie zwischen Stamm Flo1 und dem

Referenzstamm Geitlerinema sp. PCC 7105 sowie der Klassifizierung mittels

aktueller Bestimmungsliteratur kann Stamm Flo1 der Ordnung Oscillatoriales und der

Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Eine Zuordnung auf Spezies-Ebene wurde

in der vorliegenden Arbeit nicht durchgeführt.

Eine genauere Validierung dieser Klassifizierung sollte durch die Erstellung von

phylogenetischen Stammbäumen auf Basis der Sequenzen der 16S rDNA und des

Gens gyrB erfolgen (siehe nachfolgende Kapitel).

4. Diskussion 89

4.2.2 Molekularbiologie

4.2.2.1 Sequenzanalyse der 16S rDNA und des Gens gyrB

Obwohl eine Klassifizierung auf Grundlage morphologischer Merkmale weitgehend

möglich ist, sind molekularbiologische Methoden ausschlaggebend für eine

taxonomische Klassifizierung. Als wichtigstes „Werkzeug“ dient die routinemäßig

verwendete Sequenzierung der 16S rDNA zur Erstellung von phylogenetischen

Stammbäumen. Diese genotypische Charakterisierung wird verwendet, um

Organismen auf Gattungs-Ebene zu unterscheiden (ANAGNOSTIDIS und KOMAREK

2005). Die Artgrenze liegt bei Übereinstimmungen der Sequenzen bei ≥ 97% (WAYNE

et al. 1987). Eine Unterscheidung zweier nah verwandter Spezies auf Grund dieser

Sequenzierung ist jedoch noch nicht möglich (FOX et al. 1992). Um Aussagen über

Verwandtschaften auf Spezies-Ebene treffen zu können, muss zusätzlich zur 16S

rDNA Analyse eine DNA-DNA-Hybridisierung erfolgen (FOX et al. 1992). Dabei

werden Organismen mit einer DNA-Übereinstimmung von 70% oder mehr und einer

maximalen Abweichung der DNA-Schmelztemperatur von 5 °C als eine Art

bezeichnet (WAYNE et al. 1987).

Die Darstellung evolutiver Veränderungen ganzer Genome sollte nicht anhand eines

einzelnen Genes wie der 16S rDNA erfolgen. Taxonomische Marker wie protein-

codierende Gene können zusätzliche Informationen zur Erstellung von

phylogenetischen Stammbäumen liefern. Speziell Gene, die an Prozessen wie

Replikation, Transkription oder Translation beteiligt sind, können für diese Zwecke

verwendet werden (SEO und YOKOTA 2003). Dabei liegen die großen Vorteile

gegenüber der 16S rDNA-basierten Taxonomie in einem geringeren horizontalen

Gentransfer und der höheren molekularen Evolutionsrate. Die durchschnittliche Rate

für Basen-Substitutionen liegt bei Genen der 16S rDNA bei 1% pro 50 Millionen

Jahre, wobei Substitutionen im Gen gyrB mit 0,7-0,8% pro 1 Millionen Jahre

stattfinden (KASAI et al. 1998). Außerdem sind die Voraussetzungen, Konstanz unter

variierenden physiologischen Bedingungen und ubiquitäre Verbreitung unter

Bakterien, gegeben (SEO und YOKOTA 2003).

Die Sequenzen der Gene gyrB, rpoC1 und rpoD1 können daher als molekulare

Marker zur Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen von Mikroorganismen

genutzt werden (KASAI et al. 1998).

4. Diskussion 90

Das 1,23 kb lange Gen-Segment gyrB codiert die kleine Untereinheit der DNA-

Gyrase. Dieses Enzym ist allgemein zur Kontrolle der Superspiralisierung an

Prozessen der DNA-Replikation und der Translokation während der Transkription

beteiligt (DRLICA und ZHAO 1997). Die Gene rpoC1 (0,96 kb) und rpoD1 (0,63 kb)

codieren Untereinheiten der DNA-abhängigen RNA-Polymerase (SEO und YOKOTA

2003).

Ein Vergleich der Sequenzen dieser Gene innerhalb von Gattungen der

Cyanobakterien bzw. die Erstellung phylogenetischer Stammbäume ausschließlich

auf Basis der Gen-Sequenzen von gyrB, rpoC1 und rpoD1 ist allerdings aktuell

wegen der geringen Anzahl an in Datenbanken hinterlegten Sequenzen noch nicht

möglich.

In den auf 16S rDNA und gyrB basierenden phylogenetischen Stammbäumen bilden

die Stämme Flo1 und PCC 7105 ein von den anderen Organismen abgegrenztes

Cluster (siehe Kap. 3.5.4). Hohe Bootstrap-Werte zeigen die hohe statistische

Absicherung der UPGMA-Berechnungen. Zur weiteren Absicherung der erstellten

Verwandtschaftsbeziehungen wurden phylogenetische Stammbäume mit den

Methoden „Neighbor-Joining“, „Minimum Evolution“ und „Maximum Parsimony“

erstellt (Daten nicht angegeben), welche fast identische evolutive Verwandtschaften

zeigten.

Da die Übereinstimmung der 16S rDNA Sequenz von Stamm Flo1 von 99,56% mit

Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 über der Artgrenze von ≥ 97% liegt und eine

enge Verwandtschaft auf Grundlage der gyrB Sequenzen nachgewiesen werden

konnte, kann Stamm Flo1 definitiv der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Ob

es sich bei den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105 um identische Arten

handelt, kann nur durch eine DNA-DNA-Hybridisierung sichergestellt werden, die

noch durchgeführt werden sollte, was im Zeitrahmen der vorliegenden Diplomarbeit

nicht mehr möglich war.

4. Diskussion 91

4.2.2.3 Toxin-Nachweis mittels RT-PCR

RICHARDSON und Mitarbeiter (2007) sowie MYERS und Mitarbeiter (2007) konnten das

Cyanotoxin Microcystin in Mikrobenmatten nachweisen, die für das so genannte

„black band disease“ (BBD) verantwortlich gemacht werden. Diese charakteristisch

schwarz gefärbten, sulfidreichen Bänder „wandern“ durch Korallen-Kolonien und

führen zu deren Absterben. Als Hauptbestandteil dieser Mikrobenmatten konnten

filamentöse Cyanobakterien nachgewiesen werden. Speziell bei zwei isolierten

Kulturen, Geitlerinema sp. BBD und Leptolyngbya sp., konnte das Toxin

nachgewiesen werden. Da in der vorliegenden Arbeit bereits eine enge

Verwandtschaft zwischen Stamm Flo1 und verschiedenen Stämmen von

Geitlerinema sp. BBD dokumentiert werden konnte (siehe Kap. 3.5.3), wurde Stamm

Flo1 mittels RT-PCR auf genetischer Ebene auf das Toxin hin getestet. Dabei sollte

das Gen mcyA mittels RT-PCR amplifiziert und detektiert werden.

Zur Sicherstellung der Funktionalität der RT-PCR wurden als Positivkontrollen die

DNA der Microcystis Stämme PCC 7806 und PCC 7941 verwendet. Bei diesen

Stämmen konnte das Gen mcyA bereits nachgewiesen werden (NEILAN et al. 1999

und VAITOMAA et al. 2003). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte mittels „Standard-

PCR“ und den spezifischen Primern MSF und MSR-2R das Gen mcyA bei den

Microcystis Stämmen detektiert werden (Daten nicht gezeigt).

Sowohl bei den beiden zuvor genannten Microcystis Stämmen als auch in der

Negativkontrolle ohne DNA und bei Stamm Flo1 konnte in der RT-PCR eine

Fluoreszenz mit sigmoidem Kurvenverlauf detektiert werden (siehe Kap. 3.5.7).

Da zumindest in der Negativkontrolle kein mcyA-Amplifikat gebildet werden sollte,

wurde eine Schmelzkurve zum Vergleich der Schmelzpunkte der amplifizierten PCR-

Produkte erstellt. Dabei konnten jeweils für die Positivkontrollen als auch für die

Probe von Stamm Flo1 und der Negativkontrolle zwei unterschiedliche

Schmelzpunkte detektiert werden.

Obwohl ein sigmoider Kurvenverlauf während der RT-PCR bei Stamm Flo1

dokumentiert wurde, ist das Gen mcyA nicht amplifiziert worden. Die detektierte

Fluoreszenz bei Stamm Flo1 und der Negativkontrolle ist wahrscheinlich auf Primer-

Dimere zurückzuführen.

Im Gegensatz zu den nahverwandten Stämmen Geitlerinema sp. BBD ist Stamm

Flo1 auf Grund fehlender Gene nicht in der Lage, Microcystine zu synthetisieren.

4. Diskussion 92

4.2.3 G+C-Gehalt

Eine polyphasiche Beschreibung eines Cyanobakteriums umfasst auch die

konventionelle Bestimmung des G+C-Gehaltes. Der G+C-Gehalt der Ordnung

Oscillatoriales wird mit 40 bis 67mol% angegeben (MADIGAN et al. 2001). Innerhalb

der Gattung Geitlerinema liegt der G+C-Gehalt zwischen 53 und 67 mol%

(CASTENHOLZ et al. 2001). Auf Spezies-Ebene können die G+C-Gehalte bis maximal

5% variieren, auf Gattungs-Ebene sind Abweichungen bis zu 10% möglich

(SCHLEIFER UND STACKEBRANDT 1983). Der G+C-Gehalt von Stamm Geitlerinema sp.

PCC 7105, welcher in dieser Arbeit als Referenzstamm verwendet wurde, ist mit 53

mol% angegeben (RIPPKA und HERDMAN 1992).

Voraussetzung für die korrekte Ermittlung der Schmelztemperatur der DNA ist eine

von Proteinen aufgereinigte Nukleinsäure, was durch die Ermittlung des Quotienten

aus den Absorptionen 260/280 nm dargestellt wird. Dabei sind bei einem Quotienten

von 1,81 lediglich 40% der Probe auf Nukleinsäuren zurückzuführen, 60% entfallen

auf den Proteinanteil. Ein Anteil von 100% DNA wird durch einen Quotienten von

2,00 angezeigt (GLASEL 1995).

Die Ermittlung des G+C-Gehaltes für Stamm Flo1 ergab im arithmetischen Mittel

49,2 ± 2,2 mol% (siehe Kap. 3.6). Da die Differenz der G+C-Gehalte der Stämme

Flo1 und Geitlerinema sp. maximal in 6 mol% differiert, kann Stamm Flo1 auf Basis

der G+C-Gehalte der Gattung Geitlerinema zugeordnet werden. Eine

Übereinstimmung auf Spezies-Ebene mit Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 ist

somit weder nachgewiesen noch ausgeschlossen.

Die vor der Erstellung einer Schmelzkurve erstellten Quotienten (260/280 nm) deuten

bei Stamm Flo1 auf Protein-Verunreinigungen der DNA hin. Die erstellten

Schmelzkurven der DNA von Stamm Flo1 zeigten nicht den typischen sigmoiden,

sondern tendenziell einen linearen Kurvenverlauf (Daten nicht gezeigt). Trotz linearer

Schmelzkurven konnten die Schmelzpunkte bestimmt und ausgewertet werden.

Die Verunreinigungen der DNA sind wahrscheinlich auf Rückstände von

exopolymeren Substanzen zurückzuführen, die während der Zelllyse an die DNA

gebunden haben. Zur Entfernung dieser Substanzen ist eine Modifikation des

Versuchsprotokolls erforderlich, was in dem zur Erstellung der vorliegenden

Diplomarbeit vorgegebenen Zeitrahmen nicht mehr möglich war. Deshalb wurden die

Schmelzpunkte in 5fach Bestimmung ermittelt und das arithmetische Mittel

4. Diskussion 93

berechnet. Die nur geringen Abweichungen in den Messwerten und die geringe

Standardabweichung zeigen die Korrektheit der ermittelten Werte.

4.2.4 Analyse des Fettsäuremusters

Eine Analyse des Fettsäureprofils kann als taxonomischer Marker bei der

Klassifizierung von Mikroorganismen dienen. HOLTEN und Mitarbeiter (1968) zeigten,

dass eine Korrelation zwischen morphologischer Komplexität und Grad an

ungesättigten Fettsäuren besteht. KENYON und STANIER (1970) beobachteten, dass

der Anteil an ungesättigten Fettsäuren mit der klassischen morphologisch-

physiologischen Charakterisierung korreliert. Außerdem ergaben Vergleiche

zwischen 16S rDNA- und Fettsäureanalyse übereinstimmende Klassifizierungen

(WILMOTTE und HERDMAN 2001). Dabei kann ein Vergleich zwischen Organismen

bzw. eine Identifizierung oder Klassifizierung anhand von Fettsäureprofilen mit zehn

oder mehr identifizierten Fettsäuren durchgeführt werden (BUSSE et al. 1996).

Die Untersuchungen von HOLTON und Mitarbeitern (1968) zeigten bei verschiedenen

Oscillatoria Spezies Fettsäureprofile mit einem großen Anteil an gesättigten und

ungesättigten C16 und C18 Fettsäuren. Außerdem konnten in Organismen der

Ordnung Oscillatoriales hohe Konzentrationen von mehrfach ungesättigten

Fettsäuren (z.B. C18:2 und C18:3) nachgewiesen werden (CAUDALES 2000).

Entscheidenden Einfluss auf die Synthese der Fettsäuren hat dabei die Temperatur.

Bei niedrigeren Temperaturen werden vermehrt kürzere und ungesättigte Fettsäuren

synthetisiert, um die Fluidität der Membran aufrecht zu erhalten (WADA und MURATA

1990), was zu einem geringeren Anteil an längerkettigen Fettsäuren führt.

Den größten Anteil an identifizierten Fettsäuren von Stamm Flo1 hatten in beiden

Ansätzen die C16 und C18 Fettsäuren (siehe Kap. 3.7). Ein Vergleich des

Fettsäureprofils von Stamm Flo1 (nach Wachstum bei 1 µE m-2 s-1 PAR) mit dem

Fettsäureprofil von Oscillatoria sp. (HOLTON et al. 1968) zeigt große

Überseinstimmungen in der Menge an nachgewiesenen C16 Fettsäuren. Dabei

konnte ein Anteil von 49% (Stamm Flo1) bzw. 53% (Oscillatoria sp.) dokumentiert

werden. Der prozentuale Anteil der C18 Fettsäuren zeigt hingegen signifikante

Unterschiede von 11% für Stamm Flo1 gegenüber 25,6% bei Oscillatoria sp.

Die prozentuale Verteilung der gesättigten und ungesättigten Fettsäuren bei Stamm

Flo1 zeigte in den Ansätzen mit unterschiedlichen PFDs keine signifikanten

4. Diskussion 94

Unterschiede und ergab einen Anteil an ungesättigten Fettsäuren von 51,8% (1 µE

m-2 s-1 PAR) bzw. 52,8% (20 µE m-2 s-1 PAR). Die von CAUDALES und Mitarbeitern

(2000) bei Organismen der Ordnung Oscillatoriales in großem Anteil

nachgewiesenen mehrfach ungesättigten Fettsäuren konnten bei Stamm Flo1 nicht

identifiziert werden. Dieses Nichtauffinden könnte möglicherweise auf den

verwendeten Standard zurückzuführen sein.

4.2.5 Physiologie

Zur polyphasischen Beschreibung eines Cyanobakteriums müssen zusätzlich zu

morphologischen und molekularbiologischen Methoden auch physiologische

Untersuchungen zum Wachstumsverhalten durchgeführt werden.

4.2.5.1 Lichtbedingungen

Die phototrophen Cyanobakterien sind auf Licht als primäre Energiequelle

angewiesen. Dabei muss zwischen zwei Parametern unterschieden werden: 1.) der

Photonenflussdichte und 2.) der Wellenlänge des Lichts (TANDEAU DE MARSAC und

HOUMARD 1993). Die zum Wachstum optimalen PFDs liegen bei den meisten

Frischwasser-Organismen zwischen 50 und 60 µE m-2 s-1 PAR (WYMAN und FAY

1987), die geringsten PFDs, bei denen Wachstum nachgewiesen werden konnte,

liegen bei 1-2 µE m-2 s-1 PAR (FOY et al. 1983). Dabei besteht bei allen

photosynthetischen Organismen eine inverse Korrelation zwischen der Menge an

lichtsammelnden Pigmenten und der Photonenflussdichte (ALLEN 1968). Die

Konzentration der Pigmente Chlorophyll a und den Phycobiliproteinen in der Zelle

kann dabei um das 4-5fache zwischen Stark- und Schwachlicht variieren (WYMAN

und FAY 1987). Die Anpassung an hohe Lichtintensitäten hat zusätzlich zur

Reduktion von Chlorophyll a und den Phycobiliproteinen auch eine Abnahme des

Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten zur Folge (RAPS et al. 1983). Dabei haben die

synthetisierten Carotinoide zusätzlich zur Funktion als lichtsammelndes Pigment

noch photoprotektive Eigenschaften. Die Synthese und Akkumulation der Carotinoide

wird von den Umweltbedingungen beeinflusst, deren molekularen Mechanismen

bisher jedoch noch nicht geklärt sind. Die am weitesten unter Cyanobakterien

verbreiteten Carotinoide sind ß-Carotin, Zeaxanthin, Echinenon und Myxoxanthophyll

(HIRSCHBERG und CHAMOVITZ 1994). Myxoxanthophyll ist in der „Äußeren Membran“

4. Diskussion 95

lokalisiert (EHLING-SCHULZ et al. 1997), während ß-Carotin in der Thylakoidmembran

und Zeaxanthin in der Cytoplasmamembran lokalisiert ist (MASAMOTO und FURUKAWA

1997). Dabei sind zwei ß-Carotin Moleküle direkt mit dem Photosystem II assoziiert

(FRESE et al. 2003).

Zusätzlich zu den photoprotektiven und lichtsammelnden Funktionen haben

Carotinoide auch einen Einfluss auf die Fluidität der Membranen. Die Carotinoide

Myxoxanthophyll und Zeaxanthin bewirken eine Verringerung, ß-Carotin eine

Steigerung der Membran-Fluidität (LAGARDE et al. 2000).

Die Konzentrationsverschiebungen der photosynthetisch aktiven Pigmente kann

auch makroskopisch beobachtet werden. Dabei erfolgt eine farbliche Veränderung

von blaugrün bei geringen PFDs zu gelbgrün bei hohen PFDs (KELLAR und PAERL

1980). Zusätzlich zu Veränderungen in der Pigmentzusammensetzung konnte bei

Cyanobakterien der Ordnung Chroococcales bei steigenden Lichtintensitäten auch

eine vermehrte Produktion von sekretierten Polysacchariden nachgewiesen werden

(KONOPKA und SCHNUR 1980).

Die Untersuchungen zum Wachstumsverhalten von Stamm Flo1 zeigten tendenziell

ein besseres Wachstum bei niedrigeren Lichtintensitäten (siehe Kap. 3.4.1). Eine

Aussage über die optimale Beleuchtungsintensität kann anhand der ermittelten

Daten jedoch nicht getroffen werden.

Mit steigenden PFDs konnte eine Zunahme des Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten

beobachtet werden. Auch die Synthese der Phycobiliproteine korrelierte mit der

Lichtintensität. Mit zunehmender PFD war eine Reduktion der Gesamtmenge an

Phycobiliproteinen zu beobachten (siehe Kap. 3.8.3), bei gleichzeitiger Zunahme

bzw. konstanter Menge an Carotinoiden.

Die erhöhte Synthese der Carotinoide bei Stamm Flo1 mit steigenden PFDs kann auf

eine Lichtschutzreaktion zurückgeführt werden. Eine gerichtete Veränderung der

Membran-Fluidität kann wegen der vorherrschenden konstanten Versuchstemperatur

ausgeschlossen werden. Dabei wurden alle nachgewiesenen Carotinoide mit

steigender PFD vermehrt nachgewiesen. Den größten Anteil an Carotinoiden hatte ß-

Carotin, das teilweise mit dem PS II assoziiert ist und dort photoprotektiv wirken

kann.

Die makroskopische Beschreibung (siehe Kap. 3.4.1.2) zeigte eine farbliche

Veränderung der Kulturen sowie eine erhöhte Menge an exopolymeren Substanzen

mit steigender PFD. Die vermehrte Produktion der extrazellulären Substanzen ist

4. Diskussion 96

möglicherweise, wie die gesteigerte Produktion an Carotinoiden, auf eine Licht-

schutzreaktion zurückzuführen.

Zusätzlich zum Einfluss der Lichtquantität auf die Pigmentzusammensetzung

beeinflusst die Lichtqualität, also die Wellenlänge des einfallenden Lichtes, ebenfalls

die Synthese der Pigmente. Verschiebungen des Lichtspektrums führen zu

Veränderungen der Pigmentsynthese (WYMAN und FAY 1987). Die Chromatische

Adaptation resultiert in der präferierten Synthese des Phycobiliproteins, das

komplementär zur Wellenlänge des Lichtes ist, also Phycocyanin (PC) in Rotlicht und

Phycoerythrin (PE) in Grünlicht. Dabei werden die Cyanobakterien anhand ihrer

Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation nach TANDEAU DE MARSAC

und HOUMARD (1988), wie in Kapitel 1.1.2.3 beschrieben, in drei Gruppen unterteilt.

Die Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation konnte bisher nicht bei

Stämmen der Gattung Geitlerinema nachgewiesen werden (RIPPKA und HERDMAN

1992).

Bei Stamm Flo1 wurde keine gerichtete Anpassung der Konzentration an

Phycobiliproteinen bei wechselnder Lichtqualität beobachtet. Weder eine vermehrte

Synthese des Phycobiliproteins PE bei Inkubation unter Grünlicht noch eine

vermehrte Synthese von PC unter Rotlicht konnte dokumentiert werden.

Lediglich ungerichtete Schwankungen der Konzentration an Phycobiliproteinen

konnten über die gesamte Versuchsdauer beobachtet werden, welche durch einen

Mangel an Nährstoffen entstanden sein könnten. Bei Nährstoffmangel können

Phycobilisome zur Gewinnung von Aminosäuren und Kohlenstoffverbindungen zur

Bewahrung des Erhaltungsstoffwechsels abgebaut werden (GROSSMAN et al. 2001).

4.2.5.2 Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Salinitäten

Cyanobakterien werden nach REED und Mitarbeitern (1986) auf Grundlage ihrer

Salztoleranz in drei Gruppen unterteilt. Leicht halophile Cyanobakterien tolerieren

Salinitäten bis ca. 40‰ (entspricht 0,7 M NaCl), moderat halophile können bei

Salzgehalten bis 110‰ (1,8 M) wachsen und extrem halophile Cyanobakterien

tolerieren Salzgehalte von 160 ‰ (2,7 M NaCl).

Für einige Organismen der Gattung Geitlerinema konnte optimales Wachstum bei

Salinitäten von 0,2 bzw. 18‰ nachgewiesen werden. Insgesamt wurde ein

4. Diskussion 97

Wachstum bei Stämmen der Gattung Geitlerinema von 0,2 bis 92‰ dokumentiert

(MARGHERI et al. 2003). Der Stamm PCC 7105 zeigte dabei ein optimales Wachstum

bei einem Salzgehalt von 18‰.

Das beste Wachstum von Stamm Flo1 konnte bei einer Salinität von 15‰

nachgewiesen werden (siehe Kap. 3.4.3), was dem Salzgehalt des standardmäßig

verwendeten ASNIII/2 entspricht. Bei niedrigeren Salzgehalten (7‰) fiel die Zunahme

an Biomasse am geringsten aus. Auch höhere Salzgehalte (27-62‰) konnten das

Wachstum der Zellen nicht positiv beeinflussen.

Stamm Flo1 weist eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Salinitäten auf:

Ein Zellwachstum konnte bei Salzgehalten zwischen 0,2‰ und 64‰ beobachtet

werden. Folglich kann Stamm Flo1 als leicht bis moderat halophil bezeichnet werden.

Ein Wachstum der Kulturen ohne Salz im Medium konnte nicht dokumentiert werden.

4.2.5.3 Verwertung verschiedener Stickstoffquellen

Cyanobakterien können ein breites Spektrum an Stickstoffquellen zum Wachstum

nutzen. Viele Cyanobakterien, in erster Linie heterozystenbildende Organismen,

besitzen die Fähigkeit zur Stickstofffixierung. Außerdem können sowohl organische

N-Verbindungen wie Harnstoff oder Aminosäuren als auch anorganische

Stickstoffverbindungen wie Nitrat, Nitrit oder Ammonium genutzt werden. Nitrat wird

dabei im Allgemeinen als Stickstoffquelle präferiert (GUERRERO et al. 1987).

Die Stickstofffixierung in nicht heterozystenbildenden Cyanobakterien erfolgt, wie

auch bei Heterozystenbildnern, mittels Nitrogenase-Komplex (FAY 1992), welcher

durch die Gene nifD, nifK und nifH codiert wird (VAN BAALEN 1987). Lokalisiert ist der

Nitrogenase-Komplex im Cytoplasma und ist in nichtheterozystenbildenden

Cyanobakterien somit nicht von dem photosynthetischen Apparat separiert (STAL und

BERGMANN 1990). Zur Vermeidung einer Inaktivierung der Nitrogenase durch

Sauerstoff erfolgt eine zeitliche Trennung der Photosynthese (im Licht) und der

Stickstofffixierung (im Dunkeln) (FAY 1992).

Eine besondere Art der Stickstofffixierung bei nichtheterozystenbildenden,

filamentösen Cyanobakterien konnte bei Organismen der Gattung Trichodesmium

nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass sowohl eine zeitliche als auch eine

räumliche Trennung von Photosynthese und Stickstofffixierung zur Vermeidung der

Inaktivierung der Nitrogenase durch Sauerstoff stattfindet. Dabei erfolgt während der

4. Diskussion 98

Photosynthesereaktion ausschließlich ein linearer Elektronentransport, so dass kein

Sauerstoff an Photosystem II gebildet wird (BERMAN-FRANK et al. 2001).

Für Organismen der Gattung Geitlerinema konnte bisher keine Stickstofffixierung

nachgewiesen werden (RIPPKA und HERDMAN 1992).

Eine temporäre Unabhängigkeit von externen Stickstoffquellen kann außerdem durch

Speicherstoffe wie Cyanophycin erreicht werden. Cyanophycin-Granula bestehen

aus L-Aspartat- und L-Arginin-Polypeptiden (im Verhältnis 1:1), die bei fast allen

Cyanobakterien nachgewiesen wurden (SIMON 1987).

Es konnte gezeigt werden, dass Stamm Flo1 in der Lage ist, mit verschiedenen

Stickstoffquellen zu wachsen (siehe Kap. 3.4.6). Dabei wurden keine signifikanten

Unterschiede im Wachstumsverhalten der Kulturen bei unterschiedlich angebotenen

Stickstoffquellen nachgewiesen. Eine toxische Wirkung auf die Zellen konnte für

NaNO2 in den Konzentrationen 5 und 10 mM beobachtet werden.

Obwohl bei Stamm Flo1 keine Stickstofffixierung erfolgt (siehe Kap. 3.4.7), war das

Wachstum im Ansatz ohne Stickstoffquelle nicht signifikant geringer als in den

Ansätzen mit zugegebener Stickstoffquelle, was auf interne Stickstoffreserven

hindeutet (siehe auch Kap. 3.9). Um Letzteres zu beweisen, müssten

Versuchsansätze mit Vorkulturen durchgeführt werden, die unter Stickstoffmangel

inkubiert wurden.

4.3 Herstellung axenischer Kulturen

Für die Durchführung von physiologischen und molekularbiologischen Methoden ist

es sinnvoll, mit axenischen Kulturen zu arbeiten. Die Herstellung axenischer Kulturen

bei Cyanobakterien ist oftmals schwierig, da viele Cyanobakterien eine Scheide oder

extrazelluläre Substanzen ausbilden, in denen eine Vielzahl von heterotrophen

Bakterien gebunden sein kann. Außerdem kommt es im Verlauf der Herstellung

axenischer Kulturen oftmals zum Absterben der Kultur (PALINSKA et al. 1999).

Die zur Herstellung axenischer Cyanobakterien-Kulturen verwendeten Antibiotika

haben verschiedene Wirkungsmechanismen auf die Zellen. Chloramphenicol

unterdrückt bakterielles Wachstum durch hemmende Bindung der 50S-Untereinheit

der Ribosomen, Kanamycin beeinflusst die Proteinsynthese durch Bindung der 30S-

Untereinheit. Rifampicin beeinträchtigt die Transkription durch Hemmung der RNA-

Polymerase. Alle verwendeten Antibiotika wirken auf Gram-negative Bakterien und

4. Diskussion 99

mit Abstrichen (Chloramphenicol) auch auf Gram-positive Bakterien (MADIGAN et al.

2001, „DrugBank-Homepage“: http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank; Stand

September 2007).

Durch eine Separation von Cyanobakterien und ihrer heterotrophen Begleitflora

mittels Percoll-Zentrifugation und Zugabe der unterschiedlichen Antibiotika konnten

axenische Kulturen hergestellt werden (siehe Kap. 3.1). In einigen Ansätzen wurden

auch die Zellen von Stamm Flo1 nachhaltig in ihrem Wachstum beeinträchtigt, was in

einer Entfärbung und dem Absterben der Filamente resultierte. Durch die

anschließend durchgeführten Waschschritte und Wachstumsphasen von jeweils 3

Wochen in sterilfiltriertem Medium konnte die Lebensfähigkeit der Kulturen von

Stamm Flo1 jedoch erhalten werden.

5. Ausblick 100

5. Ausblick

Die in dieser Diplomarbeit ermittelten Ergebnisse lassen eine Vielzahl neuer

Fragestellungen aufkommen.

Eine Klassifizierung von Stamm Flo1 auf Spezies-Ebene durch die 16S rDNA-

Sequenzierung war nicht möglich. Ob Stamm Flo1 und Stamm Geitlerinema sp. PCC

7105 identische Arten sind, kann auf Grund der 16S rDNA Sequenzübereinstimmung

von 99,56% nicht endgültig geklärt werden. Für den Vergleich von zwei Spezies

muss daher eine DNA-DNA-Hybridisierung durchgeführt werden. Eine

Übereinstimmung von mindestens 70% würde die beiden Stämme als identische

Spezies kennzeichnen.

Die aktuell noch geringe Anzahl an publizierten gyrB-Sequenzen lässt eine

Klassifizierung anhand dieses taxonomischen Markers noch nicht zu. Für die

Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen sind weitere Sequenzen

nahverwandter Cyanobakterien nötig. Die Gene rpoC1 und rpoD1 könnten als

zusätzliche taxonomische Marker sequenziert werden (s. o.).

Bei Stamm Flo1 konnte eine Produktion von exopolymeren Substanzen (ES)

beobachtet werden, die unter dem Einfluss höherer PFDs gesteigert wurde (siehe

Kap. 3.4.1.2). Eine antimikrobielle Wirkung dieser EPS konnte bereits nachgewiesen

werden (HEYDUCK-SÖLLER und FISCHER 2000). Die Zusammensetzung dieser

Substanz ist bisher noch nicht untersucht worden. Es stellt sich daher die Frage, ob

die Produktion der exopolymeren Substanzen ausschließlich durch Stamm Flo1, nur

in Assoziation mit heterotrophen Bakterien oder ausschließlich durch die

heterotrophen Bakterien erfolgt. Voraussetzung für Versuche dieser Art ist die

Herstellung axenischer Cyanobakterien-Kulturen. Die heterotrophen Begleitbakterien

von Stamm Flo1 müssen isoliert, eingehend identifiziert und stoffwechsel-

physiologisch charakterisiert werden.

Da auf molekularer Ebene die Fähigkeit zur Biosynthese von Microcystin

ausgeschlossen werden konnte (siehe Kap. 3.5.8), ist noch nicht geklärt, worauf die

antimikrobielle Wirkung der ES von Stamm Flo1 basiert. Bisher konnten viele

toxische Sekundär-Metabolite identifiziert werden, die von Cyanobakterien

synthetisiert werden. Die Synthese erfolgt dabei nicht-ribosomal, sondern durch

Polypeptid-Synthetasen (NEILAN et al. 1999) wie die Polyketid-Synthase und Peptid-

5. Ausblick 101

Synthetase (SCHEMBRI et al. 2001). Diese Enzyme werden als nicht-ribosomale

Peptid-Synthetasen (NRPS) zusammengefasst (CHRISTIANSEN et al. 2001).

Zur Determinierung der antimikrobiellen Wirkung der exopolymeren Substanz von

Stamm Flo1 könnte ein genetischer Nachweis dieser Enzyme mittels PCR oder RT-

PCR erfolgen.

In Zukunft sind weitere Umstrukturierungen und Namensänderungen bei der

Klassifizierung von Cyanobakterien unumgänglich, so dass eine stetige Kontrolle der

aktuellen Bestimmungsliteratur nötig ist: Einerseits ist das Konzept zur Einteilung auf

Spezies-Ebene und die Regeln zur Namensgebung noch nicht zufrieden stellend

gelöst worden, andererseits steigt die Anzahl an Methoden, die zur polyphasischen

Beschreibung berücksichtigt werden müssen.

6. Zusammenfassung 102

6. Zusammenfassung

1) Die Zellen von Stamm Flo1 sind als gerades bis leicht gebogenes Filament, ohne

signifikante Einschnürungen zwischen den Zellen organisiert. Die Größe der Zellen

beträgt 4,9 x 2,2 µm, die terminalen Zellen sind abgerundet. Heterozysten, Akineten

oder necridische Zellen werden nicht ausgebildet. Eine sehr dünne Scheide konnte

nur an Bruchstücken nachgewiesen werden. Die Filamente zeigten auf Agarplatten

eine Motilität. Der Referenzstamm Geitlerinema sp. PCC 7105 zeigte ein identisches

morphologisches Erscheinungsbild.

2) Auf Grundlage der morphologischen Charakterisierung von Stamm Flo1 konnte

dieser anhand der Bestimmungsliteratur von GEITLER (1932), CASTENHOLZ und

Mitarbeitern (2001) sowie ANAGNOSTIDIS und KOMAREK (2005) der Ordnung

Oscillatoriales zugeordnet werden. Nach den neueren Bestimmungsschlüsseln

wurde Stamm Flo1 der Gattung Geitlerinema zugeordnet. Eine Klassifizierung auf

Spezies-Ebene wurde nicht durchgeführt.

3) Die zum Wachstum optimale Photonenflussdichte liegt zwischen 1 und 10 µE m-2

s-1 PAR. Bei höheren Lichtintensitäten konnte kein Zellwachstum dokumentiert

werden. In den Kultur-Überständen erfolgte über eine Versuchsdauer von 28 Tagen

eine Alkalisierung des Mediums. Bei höheren PFDs erfolgte eine vermehrte

Produktion von Exopolysacchariden.

4) Für Stamm Flo1 zeigte eine hohe Toleranz gegenüber wechselnden Salinitäten.

Dabei konnte bei Salzgehalten von 7‰ bis 62‰ eine Zunahme der Biomasse

dokumentiert werden. Der für das Wachstum optimale Salzgehalt des Mediums lag

bei 15‰, ein Zellwachstum ohne Salz im Medium erfolgte nicht.

5) Das Wachstum von Stamm Flo1 konnte durch einen höheren Start-pH-Wert (9,05-

9,37) im Medium und durch die Zugabe von Vitaminlösungen (B12 und 7-

Vitaminlösung) gesteigert werden.


6) Stamm Flo1 zeigte ein breites Spektrum in der Verwertung verschiedener

anorganischer Stickstoffverbindungen. Zellwachstum konnte mit Nitrit, Nitrat und

Ammonium als einziger Stickstoffquelle nachgewiesen werden. Auch im Ansatz ohne

Stickstoffquelle konnte eine Zunahme an Biomasse dokumentiert werden, was auf

die Verwertung von Reservestoffen wie Cyanophycin schließen lässt.

7) Die Sequenzierung der 16S rDNA von Stamm Flo1 ergab nach einem Vergleich

mit Daten aus der NCBI-Datenbank eine Übereinstimmung von 99,56% mit Stamm

Geitlerinema sp. PCC 7105. Demzufolge kann Stamm Flo1 der Gattung Geitlerinema

zugeordnet werden. Ob es sich bei Stamm Flo1 und Stamm Geitlerinema sp. PCC

7105 um identische Spezies handelt, konnte anhand dieser Daten nicht endgültig

geklärt werden. Auch die Sequenzierung des Gens gyrB ergab eine enge

Verwandtschaft zwischen den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105.

8) Ein Vergleich der Ergebnisse der RADP und der ARDRA ergab ähnliche

Bandenmuster bei den Stämmen Flo1 und Geitlerinema sp. PCC 7105. Die

Erstellung eines gattungsspezifischen Bandenmusters erfordert jedoch einen

größeren Versuchsumfang und die Verwendung mehrerer Stämme der Gattung

Geitlerinema.

9) Bei Stamm Flo1 konnte mittels Real-Time PCR kein mcyA Gen nachgewiesen

werden. Folglich ist Stamm Flo1 nicht in der Lage, Microcystine zu synthetisieren.

10) Bei Stamm Flo1 konnte ein G+C-Gehalt von 49,2 ± 2,2 mol% ermittelt werden.

Da die verwendete DNA jedoch noch Proteinkontaminationen enthielt und bei der

Erstellung der Schmelzkurven keine sigmoiden Kurvenverläufe vorlagen, muss

dieses Ergebnis nach Modifikation des Protokolls zur DNA-Isolierung und

Aufreinigung noch einmal validiert werden.


11) Den größten Anteil am Fettsäureprofil von Stamm Flo1 hatten die C16 und C18

Fettsäuren Hexadecanoat-Methylester, cis-9-Hexadecenoat-Methylester, cis-9-

Octadecenoat-Methylester und trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester.

Außerdem konnte nach Wachstum bei einer Lichtintensität von 1 µE m-2 s-1 PAR im

Vergleich zum Wachstum bei der von 20 µE m-2 s-1 PAR noch eine zusätzliche

Fettsäure (14-Methylpentadecanoat-Methylester) dokumentiert werden.

12) Bei Stamm Flo1 konnte mit steigender Photonenflussdichte eine Zunahme des

Carotinoid/Chlorophyll a-Quotienten sowie eine Reduktion in der Menge an

Phycobiliproteinen nachgewiesen werden. Dabei konnten die Carotinoide

Myxoxanthophyll, Zeaxanthin und ß-Carotin detektiert werden.

13) Bei Stamm Flo1 erfolgte nach wechselnder Qualität des Lichtes (Rot↔Grün)

keine gerichtete Anpassung der Konzentration der Phycobiliproteine. Es konnte

keine Fähigkeit zur Komplementären Chromatischen Adaptation nachgewiesen

werden. Folglich wird Stamm Flo1 nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988)

der Gruppe 1 zugeordnet.

14) Anhand von TEM-Aufnahmen konnten konzentrische Thylakoide in peripherer

und paralleler Anordnung zu den longitudinalen Zellwänden nachgewiesen werden.

Außerdem konnten Granula, wahrscheinlich Cyanophycin, dokumentiert werden, die

in Zellwandnähe ohne festgelegte Organisation angeordnet waren.

7. Anhang 105

7. Anhang

Tab. 37: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach GEITLER 1932). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels sowie die ermittelten möglichen Spezies (siehe Kap. 3.3) Trichome ohne oder mit gänzlich zerfließenden, nicht sichtbaren Scheiden → Trichome lang, vielzellig, ± gerade oder unregelmäßig gebogen → Trichome mit normalem Bau, Zellen zusammenschließend ⇒ Gattung: Oscillatoria → Zellen ⅓ mal so lang wie breit, oder länger → Trichome nicht gelbgrün gefärbt → Trichome an den Enden nicht schraubig gewunden oder nur am äußersten Ende kurz gebogen oder hakig → Trichome an den Enden nicht deutlich verjüngt → Zellen länger als breit, an den Querwänden eingeschnürt → Trichome bis 2 µm (maximal 2 ¼ µm) breit ⇒ Oscillatoria limnetica; O. amphigranulata; O. redekei Tab. 38: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach CASTENHOLZ et al. 2001). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels sowie die ermittelte Gattung (siehe Kap. 3.3) → Filamentös, Trichome verzweigt oder unverzweigt → binäre Teilung in einer Ebene führt zu unverzweigten Trichomen → keine Differenzierung von Heterozysten oder Akineten aus vegetativen Zellen ⇒ Sektion III : Oscillatoriales → Trichome aus zylindrisch geformten Zellen → Trichome gerade oder der Länge nach leicht gewunden → Trichome meist frei beweglich ohne Scheide (gleitende Zellen können sehr dünnen, meist transparenten “Schweif” ausbilden) → Zellen länger als breit ⇒ Gattung: Geitlerinema

7. Anhang 106

Tab. 39: Klassifizierung des Stammes Flo1 (modifiziert nach ANAGNOSTIDIS und KOMAREK 2005). Angegeben sind die relevanten morphologischen Merkmale und Kriterien des Bestimmungsschlüssels und die ermittelte Gattung (siehe Kap. 3.3)

→ Trichome ohne Scheide oder umgeben von einem sehr dünnen, farblosen, homogenen Schleim → Trichome gerade oder gekrümmt ⇒ Unterfamilie: Pseudanabaenoideae → Trichome bestehen nur aus zylindrischen Zellen → nicht verengt an den Zell-Wänden; immer ohne Gas-Vesikel, manchmal Granula in der Zelle → Trichome freibeweglich, gerade oder leicht wellig, hauptsächlich in Matten, selten in Büscheln ⇒ Gattung: Geitlerinema Tab. 40: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen Salinitäten (siehe Kap. 3.4.3). Trockengewichte der Zellpellets nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C

1,862,339,719,99

14,0514,116,907,267,678,077,877,927,498,77

Salinität des Mediums [‰]

Trockengewicht der Zellpellets [mg]

Mittelwert der Trockengewichte [mg]

2,090

7,89

8,13

9,85

14,08

7,08

7,87

49

62

7

15

27

38

7. Anhang 107

Tab. 41: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen pH-Werten (siehe Kap. 3.4.4). Trockengewichte der Zellpellets wurden nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt. Zur Darstellung der Pufferkapazität wurden die pH-Werte zum Zeitpunkt der Inokulation und nach 3 Wochen bestimmt. Als Kontrolle (Einzelbestimmung) wurde ASNIII/2-Medium mit Nitrat ohne Kultur eingesetzt

7,148,227,868,949,616,6212,7412,9513,1410,389,37

7,88

8,13

8,49

8,76

8,92

7,80

8,17

8,61

9,05

8,43

Start-pH-Wert des Mediums

Trockengewicht der Zellpellets

[mg]

Mittelwert der Trockengewichte

[mg]

pH- Wert des Mediums nach 3

Wochen

8,72

pH- Wert der Kontrollen nach

3 Wochen

8,86

7,68

8,40

8,12

12,85

11,76

7,73

8,06

Tab. 42: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Vitamin B-Bedarfs von Stamm Flo1 (siehe Kap. 3.4.5). Trockengewichte der Zellpellets wurden nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt. Die Angabe der Konzentration der 7-Vitamin-Lösung ist auf Grund der unterschiedlichen Mengen der einzelnen Vitamine in der Lösung nicht möglich (siehe Tab. 8)

ASNIII/2 ohne Vitamine 17,01ASNIII/2 ohne Vitamine 16,49 16,75VitB12 2,5 µg/l 17,52VitB12 2,5 µg/l 17,44 17,48VitB12 5 µg/l 16,44VitB12 5 µg/l 17,79 17,12VitB12 10 µg/l 17,29VitB12 10 µg/l 15,77 16,53

7-Vitamin-Lösung 0,25 ml/l 17,297-Vitamin-Lösung 0,25 ml/l 16,35 16,827-Vitamin-Lösung 0,5 ml/l 18,117-Vitamin-Lösung 0,5 ml/l 17,04 17,577-Vitamin-Lösung 1,0 ml/l 18,247-Vitamin-Lösung 1,0 ml/l 15,15 16,70

Zugegebene Vitamine Trockengewicht der Zellpellets [mg]


7. Anhang 108

Tab. 43: Detaillierte Darstellung der Messergebnisse des Wachstumsverhaltens von Stamm Flo1 mit verschiedenen Stickstoffquellen und Konzentrationen (siehe Kap. 3.4.6). Trockengewichte der Zellpellets nach 3 Wochen Wachstum bei einer konstanter PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C bestimmt

10,128,2110,549,498,839,899,679,478,668,708,889,9810,0111,509,359,208,408,7611,6412,1410,5810,837,607,707,216,27

Keine (ASN III/2-)

NaNO3

NaNO3

NaNO3

NaNO3

NH4Cl

NH4Cl

NH4Cl

NH4Cl

NaNO2

NaNO2

NaNO2

NaNO2

Stickstoffquelle im Medium

Konzentration [mM]

-

1

2,5

5

10

1

2,5

5

10

1

2,5

5

10

Trockengewicht der Zellpellets [mg]


9,16

10,01

9,36

9,57

8,68

9,43

10,71

7,65

6,74

10,76

9,27

8,58

11,89

7. Anhang 109

Tab. 44: 16S rDNA Sequenz (siehe Kap. 3.5.2) von Stamm Flo1 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) AGTCGAACGAAGTCTTCGGGACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAACCTGCCTCGAGGAGGGGGATCACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCGGCGTTTCAAGTCTGCTGTCAAAGGCCGAGGCTCAACTTCGGAAAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGAGACTAGGTGTTGCCTGTATCGACCCGGGCCGCGAATCTCGGCGAAAGTTGAGAGTGCCTACGGGAACGCGGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTCGACACACGTACTACAATGGTCGGGAACAGCGAGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGCTAATCTCTCAAACCCGGCCCTCTAAACCGTTCGCGGAGGAAGGGTGCCAAGGCAGTC Tab. 45: 16S rDNA Sequenz (siehe Kap. 3.5.2) von Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) GCAGTCGAACGAAGTCTTCGGACTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACCGCGTGAGAACCTGCCTCGAGGAGGGGGCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTTCGTAGGCGGCGTTTCAAGTCTGCTGTCAAAGGCCGAGGCTCAACTTCGGAAACGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGAGACTAGGTGTTGCCTGTATCGACCCGGGCAGCGAATCTCGGCGAAAGTTGAGAGTGCCTACGGGAACGCGGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGGACACACGTACTACAATGGTCGGGACAGCGAGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGCTAATCTCTCAAACCCGGCCTCCCGTTCGCGGAGGAGGGTGCCGAAGGCA

Tab. 46: Sequenz des Gens gyrB (siehe Kap. 3.5.4) von Stamm Flo1 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) GAAGTGGTGGACAACTCCATCGACGAGGCACTAGCTGGTTACTGCACCCACATCGAAATCGACATCAACGCCGACCACGGGGTTGGCGTCTCTGTCGTCAACGCCCTATCCGAATGGGTAGAAGTCACCGTTTGGCGGGAGAAAAAGGTTGGACGGATTCGCGAACTGGCCTATCTCAACGCAGGCGTTCGCATCACCTTTACCGATAACCGCCTCGAATTTCTCGAGTGGTCGATCGACGCCTACAGCGACAACCTCCTCGGCTTCGCCAACAACATTCGTACCGTAGACGGCGGAACGCGGAATTCGAGGGTCAGACGAAGACGAAACTGGGAAATACGGAAGTTCGCGGAATCGTCGATTCGTTGGTGGGGGAGGGAAACTGGCTGATGCAGTACGAAGTCCTCG Tab. 47: Sequenz des Gens gyrB (siehe Kap. 3.5.4) von Stamm Geitlerinema sp. PCC 7105 (die Sequenzierung wurde von der Firma GATC, Konstanz durchgeführt) TGGTTTACGAAGTGGTGGACAACTCCGTCGACGAGGCACTAGCTGGTTACTGCACCCACATCGAAATCGACATCAAGGGGATTGCACGGGGTTGGCGTCTCTGTCGTCAACGCCCTATCCGAATGGGTAGAAGTCACCGTTTGGCGGGAGACCATCGCCGGACGGATTCGCGAACTGGCCTATCTCAACGCAGGCGTTCGCATCACCTTTACCGATAACCGCCTCGTCGCCTTACAGTGGTCGATCGACGCCTACAGCGACAACCTCCTCGGCTTCGCCAACAACATTCGTACCGTAGACTCCCCGATCCGGAATTCGAGGGTCAGACGAAGACGAAACTGGGAAATACGGAAGTTCGCGGAATCGTCGATTCGTCACGCTACCGGGAATCTGGCTGATGCAGTACGAAGATCCCATCGCATCCCCATTCCT

7. Anhang 110

Tab. 48: Detaillierte Darstellung der detektierten Fettsäuren (siehe Kap. 3.7) von Stamm Flo1 nach Wachstum bei einer konstanten PFD von 1 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C

14,40 25364 7,62 n.i.19,80 6306 1,89 n.i.23,65 3667 1,10 n.i.24,81 4784 1,44 14-Methylpentadecanoat-Methylester CH3- C15:025,16 61035 18,33 n.i.25,28 25315 7,60 n.i.25,40 70392 21,14 cis-9-Hexadecenoat-Methylester C16:125,83 93421 28,06 Hexadecanoat-Methylester C16:030,05 4322 1,30 n.i.31,13 3192 0,96 n.i.31,26 23223 6,97 cis-9-Octadecenoat-Methylester C18:131,43 11964 3,59 trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester C18:1Summe 332985 100

Summen-Formel

Retentionszeit [min] Area counts Anteil an Gesamt-

Area counts [%] detektierte Fettsäure- Methylester

Tab. 49: Detaillierte Darstellung der detektierten Fettsäuren (siehe Kap. 3.7) von Stamm Flo1 nach Wachstum bei einer konstanten PFD von 20 µE m-2 s-1 PAR und einer konstanten Temperatur von 21 °C

14,41 11269 13,39 n.i.19,35 2256 2,68 n.i.19,80 4312 5,12 n.i.21,45 749 0,89 n.i.23,65 761 0,90 n.i.25,16 12552 14,92 n.i.25,29 6185 7,35 n.i.25,40 10794 12,83 cis-9-Hexadecenoat-Methylester C16:125,83 20960 24,91 Hexadecanoat-Methylester C16:031,26 4461 5,30 cis-9-Octadecenoat-Methylester C18:131,42 8206 9,75 trans-9- + cis-11-Octadecenoat-Methylester C18:132,16 1640 1,95 n.i.Summe 84145 100

Summen-Formel

Retentionszeit [min] Area counts Anteil an Gesamt-

Area counts [%] detektierte Fettsäure- Methylester

7. Anhang 111

Tab. 50: Quantitativer Nachweis von Chlorophyll a (Chl a) und den Carotinoiden nach Wachstum von Stamm Flo1 bei unterschiedlichen PFDs (siehe Kap. 3.8.1). Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte nach JÖSTINGMEYER (2000) bzw. MACKINNEY (1941) (siehe Kap. 2.8.1)

0,311 0,31 0,292 3,920,270 0,27 0,227 3,050,448 0,45 0,307 4,120,257 0,26 0,196 2,630,328 0,33 0,207 2,780,200 0,20 0,137 1,840,462 0,46 0,209 2,810,359 0,36 0,144 1,930,339 0,34 0,136 1,830,331 0,33 0,119 1,60

0,44

0,68

0,77

Quotient Carotinoid/

Chlorophyll a

0,32

0,40

2,37

1,71

Chl a -Gehalt [µg/ml]

20

1

5

10

15

Mittelwert Chl a - Gehalt

3,48

3,38

2,31

A 665nm

(Chlorophyll a )

PFD [µE m-2 s-1 PAR]

A 461nm

(Carotinoide)

Carotinoid- Gehalt [µg/ml]

Mittelwert Carotinoid-

Gehalt

1,11

1,36

1,02

1,61

1,32

Tab. 51: Photometrische Messung der Absorption bei den spezifischen Wellenlängen 565, 620 und 650 nm zur Berechnung der Konzentrationen der Phycobiliproteine Phycocyanin (PC), Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (AP) nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) (siehe Kap. 3.8.3)

1 0,087 0,145 0,055 14,43 4,86 3,161 0,030 0,067 0,017 7,47 0,76 0,645 0,064 0,104 0,044 9,92 4,29 2,405 0,054 0,097 0,035 9,82 2,93 1,7810 0,034 0,060 0,023 5,95 2,05 1,1510 0,019 0,032 0,013 3,10 1,22 0,6815 0,035 0,055 0,024 5,18 2,40 1,3615 0,033 0,058 0,023 5,68 2,12 1,1220 0,020 0,036 0,014 3,55 1,27 0,6620 0,012 0,036 0,006 4,31 0,00 0,01

PC [µg/ml] AP [µg/ml] PE [µg/ml]PFD [µE m-2 s-1 PAR]

A 565nm A 620nm A 650nm

7. Anhang 112

Tab. 52: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4) der Kontrolle (A), die ausschließlich unter Weißlicht inkubiert wurde

Messzeitpunkt PE [µg/ml] PC [µg/ml] AP [µg/ml] Gesamt [µg/ml]t0 1,917 9,363 1,819 13,100t0 1,837 7,425 2,147 11,410t1 4,684 30,298 1,995 36,977t1 4,657 24,146 6,897 35,701t2 7,373 43,970 12,873 64,216t2 5,997 36,206 10,042 52,246t3 8,662 57,019 15,926 81,607t3 3,426 19,919 4,264 27,609

A

Tab. 53: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4). Die Probe (B) wurde wie in Tabelle 34 beschrieben inkubiert


B

Tab. 54: Detaillierte Darstellung der nach TANDEAU DE MARSAC und HOUMARD (1988) berechneten Konzentrationen der Phycobiliproteine zur Komplementären Chromatischen Adaptation (siehe Kap. 3.8.4). Die Probe (C) wurde wie in Tabelle 34 beschrieben inkubiert


C

7. Anhang 113

8. Literaturverzeichnis 114

8. Literaturverzeichnis

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Erklärung gemäß § 21 Abs. 6 DPO-Biologie

Hiermit versichere ich, dass ich die Diplomarbeit mit dem Titel: „Charakterisierung

des filamentösen Cyanobakteriums Stamm Flo1“ selbstständig verfasst und keine

anderen als die angegeben Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Bremen, den 30.10.2007

(Jan Schrübbers)

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Diplomarbeit Jan Schrübbers Charakterisierung des … Jan Schruebbers… · 1.1.2.2 Struktur und Funktion der Phycobilisome ..... 4 1.1.2.3 Komplementäre Chromatische Adaptation