Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Naturwissenschaftlichen-Mathematischen Gesamtfakultät

der Ruprecht-Karls-Universität

Heidelberg

vorgelegt von

Diplom Chemiker

Frieder Helm

aus Freiburg i. Br.

Tag der mündlichen Prüfung:

Untersuchungen zur Hirngängigkeit

von liposomalen Konjugaten

Gutachter: Prof. Dr. Gert Fricker

Prof. Dr. Jürgen Reichling

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie der Rup-

recht-Karls-Universität Heidelberg, Abteilung Pharmazeutische Technologie und Pharmakologie, in

der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Gert Fricker, angefertigt.

Ich versichere hiermit an Eides statt, dass die vorliegende Arbeit eigenständig und ohne Verwen-

dung anderer als der ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen angefertigt wurde und die Ar-

beit in dieser oder anderer Form an keiner anderen Fakultät als Dissertation eingereicht wurde. Es

wurde ferner an keiner anderen Stelle ein Prüfungsverfahren beantragt.

Heidelberg, den

Vorstellungskraft ist wichtiger als Wissen

Albert Einstein (1879 – 1955)

Teile dieser Arbeit wurden vorgetragen oder veröffentlicht:

Helm F., Fricker G.

Drug delivery across the blood-brain barrier utilizing liposomes conjugated with cationized

albumin

20th Mountain/Sea Liposome Workshop, Ameland (2009), Vortrag

Helm F., Guderjan D., Stremmel W., Fricker G.

Encapsulation of triethylenetetramine into liposomes for drug targeting

AAPS annual meeting, Los Angeles (2009), Posterpräsentation

Helm F., Reichel V., Fricker G.

A lipid based drug delivery system for C!S application

1st Meeting of the Phospholipid Research Center researcher community, Heidelberg (2010), Vortrag

Helm F., Reichel V., Fricker G.

Aufnahme von konjugierten Liposomen in Hirnkapillar-Endothelzellen

13. Herrenalber Transporter-Tage, Bad Herrenalb (2011), Vortrag & Posterpräsentation

Helm F., Reichel V., Fricker G.

Uptake of cBSA-liposomes into brain capillary endothelial cells

2nd Symposium on Phospholipids in Pharmaceutical Research, Heidelberg (2011), Posterpräsentation

Helm F., Reichel V., Fricker G.

Uptake of cBSA-liposomes into brain capillary endothelial cells

AAPS annual meeting, Washington DC (2011), Posterpräsentation

Helm F., Reichel V., Fricker G.

Oberflächenmodifizierte Liposomen zum Targeting der Blut-Hirn Schranke

14. Herrenalber Transporter- und Barriere-Tage, Bad Herrenalb (2012), Vortrag

Inhaltsverzeichnis xvii

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................xvii Abkürzungen ..................................................................................................................................xxiii Abstract...........................................................................................................................................xxix Zusammenfassung ..........................................................................................................................xxxi 1. Einleitung....................................................................................................................................... 35

1.1 Die Blut-Hirn Schranke ........................................................................................................... 35 1.1.1 Aufbau und Funktion........................................................................................................ 35 1.1.2 Transportprozesse an der Blut-Hirn Schranke.................................................................. 37 1.1.3 Erkrankungen des Zentralnervensystems ......................................................................... 43 1.1.4 Strategien zu Überwindung der Blut-Hirn Schranke........................................................ 44 1.1.5 Modellsysteme zur Untersuchung der Blut-Hirn Schranke.............................................. 48

1.2 Liposomen ............................................................................................................................... 51 1.2.1 Liposomen als Arzneimittelformulierung ........................................................................ 51 1.2.2 Liposomen als Transportsysteme an der Blut-Hirn Schranke .......................................... 51 1.2.3 Aufbau von Liposomen .................................................................................................... 52 1.2.4 Herstellungsmethoden ...................................................................................................... 58 1.2.5 Charakterisierungsmethoden ............................................................................................ 62

1.3 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................................. 65 2. Material und Methoden ................................................................................................................. 69

2.1 Chemikalien und Lösungen ..................................................................................................... 69 2.2 Herstellung von kationisiertem Albumin ................................................................................ 77

2.2.1 Kationisierung von Rinder-Serumalbumin....................................................................... 77 2.2.2 Sulfhydrierung von kationisiertem Albumin.................................................................... 77 2.2.3 Fluoreszenzmarkierung von kationisiertem Albumin ...................................................... 78 2.2.4 Gefriertrocknung .............................................................................................................. 78

2.3 Charakterisierung von kationisiertem Albumin ...................................................................... 79 2.3.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese .................................................. 79 2.3.2 Isoelektrische Fokussierung ............................................................................................. 80 2.3.3 Konzentrationsbestimmung.............................................................................................. 82 2.3.4 Bestimmung der freien Thiolgruppen............................................................................... 82

2.4 Herstellung von cBSA-Liposomen-Konjugaten...................................................................... 83 2.4.1 Herstellung der Liposomen .............................................................................................. 83 2.4.2 Kopplung von cBSA und Liposomen............................................................................... 84 2.4.3 Aufreinigung liposomaler Dispersionen........................................................................... 85 2.4.4 Liposomale Konjugate mit weiteren Proteinen ................................................................ 86

2.5 Charakterisierung liposomaler Dispersionen........................................................................... 87 2.5.1 Bestimmung des hydrodynamischen Radius.................................................................... 87 2.5.2 Bestimmung des Zetapotentials........................................................................................ 87 2.5.3 Bestimmung der Lipidkonzentration ................................................................................ 87

2.6 Kapillarendothelzellen aus dem Schweinehirn........................................................................ 88 2.6.1 Zellkulturbedingungen...................................................................................................... 88 2.6.2 Zellisolation ...................................................................................................................... 88 2.6.3 Aufnahme von liposomalen Konjugaten .......................................................................... 93 2.6.4 Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes ........................................ 95 2.6.5 Zytotoxizitätstest .............................................................................................................. 95

2.7 In vivo Experimente ................................................................................................................ 96 2.7.1 Applikation und Probenentnahme .................................................................................... 96 2.7.2 Anfertigung der Gefrierschnitte........................................................................................ 96 2.7.3 Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie ............................................................................... 97

Inhaltsverzeichnis xix

3. Liposomale Konjugate................................................................................................................. 101 3.1 Proteinmodifikationen ........................................................................................................... 101

3.1.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese .................................................................................. 101 3.1.2 Isoelektrische Fokussierung ........................................................................................... 102 3.1.3 Bestimmung der freien Thiolgruppen............................................................................. 103

3.2 Proteinkopplung an Liposomen............................................................................................. 105 3.2.1 Veränderungen von Größe und Zetapotential ................................................................ 105 3.2.2 Kopplungseffizienz für kationisiertes Albumin ............................................................. 108

3.3 Freisetzung aus Liposomen ................................................................................................... 109 3.4 Stabilität von cBSA-Liposomen............................................................................................ 112 3.5 Zusammenfassung ................................................................................................................. 118

4. In vitro Experimente.................................................................................................................... 123 4.1 Aufnahme von cBSA-Liposomen ......................................................................................... 123

4.1.1 Konzentrationsabhängige Aufnahme ............................................................................. 123 4.1.2 Zeitabhängige Aufnahme ............................................................................................... 126 4.1.3 Inhibitorische Effekte ..................................................................................................... 129

4.2 Aufnahme von ApoE-Liposomen.......................................................................................... 132 4.2.1 Konzentrationsabhängige Aufnahme ............................................................................. 132 4.2.2 Zeitabhängige Aufnahme ............................................................................................... 134

4.3 Aufnahme von Transferrin-Liposomen ................................................................................. 135 4.4 Aufnahme von Liposomen ohne Vektor ............................................................................... 137

4.4.1 Aufnahme von Liposomen mit PEG-Hülle .................................................................... 137 4.4.2 Aufnahme von Liposomen ohne PEG-Hülle.................................................................. 139

4.5 Zytotoxizität........................................................................................................................... 141 4.5.1 Toxizität von Liposomen................................................................................................ 141 4.5.2 Toxizität von cBSA ........................................................................................................ 143 4.5.2 Toxizität von cBSA-Liposomen..................................................................................... 145

4.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ...................................................................................... 148 4.6.1 Einfache Fluoreszenzaufnahmen.................................................................................... 148 4.6.2 In z-Richtung gestapelte Fluoreszenzaufnahmen ........................................................... 150

4.7 Zusammenfassung ................................................................................................................. 153 5. In vivo Experimente .................................................................................................................... 157

5.1 Gewebeschnitte zur Verteilung von cBSA-Liposomen......................................................... 157 5.1.1 Drei Stunden nach Applikation ...................................................................................... 157 5.1.2 Sechs Stunden nach Applikation .................................................................................... 164 5.1.3 Eine Stunde nach Applikation ........................................................................................ 166 5.1.4 24 Stunden nach Applikation ......................................................................................... 169 5.1.5 Verwendung von ungereinigten cBSA-Liposomen........................................................ 170

5.2 Gewebeschnitte zur Verteilung von BSA-Liposomen .......................................................... 175 5.3 Gewebeschnitte zur Verteilung von Liposomen ohne Vektor............................................... 179 5.4 Verweildauer von cBSA-Liposomen im Kreislauf ............................................................... 183 5.5 Zusammenfassung ................................................................................................................. 186

6. Ausblick....................................................................................................................................... 191 7. Literaturverzeichnis ....................................................................................................................cxcv 8. Anhang........................................................................................................................................ ccix

Anhang A.................................................................................................................................... ccix Anhang B................................................................................................................................... ccxii Anhang C.................................................................................................................................. ccxiii

Danksagung .................................................................................................................................. ccxvi

Abkürzungen xxiii

Abkürzungen

ABC ATP-Bindungstasche

AP Aufnahmepuffer

ApoE Peptidfragment von Apolipoprotein E4

APS Ammoniumperoxodisulfat

ATP Adenosintriphosphat

BCA Bichinonsäure

BCEC Hirnkapillar-Endothelzellen

BHS Blut-Hirn Schranke

BPB Bromphenolblau

BSA Rinder-Serumalbumin

cBSA kationisiertes Rinder-Serumalbumin

CF Carboxyfluorescein

DMSO Dimethylsulfoxid

DPPE-RH Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-lissamin-

rhodamin B

DPSS Diodengepumpter Festkörper(-Laser)

DSPE-MPEG Distearylphosphatidylethanolamin-methoxy-

polyethylenglykol-2000

DSPE-PEG-MI Distearylphosphatidylethanolamin-polyethylen-glykol-

2000-maleimid

DTNB Dithiobisnitrobenzoesäure

DTT Dithiothreitol

EDAC Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid

EP Endosomenpuffer

EPC Phosphatidylcholin aus dem Eidotter

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FP FITC-Puffer

HEPES Hydroxyethylpiperazinylethansulfonsäure

HPLC Hochdruck-Flüssigchromatographie

IEF Isoelektrische Fokussierung

LP Lysosomenpuffer

MWCO Molekulargewichtsgrenze

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

Abkürzungen xxv

PBCEC Schweinehirn-Kapillarendothelzellen

PBS Phosphat gepufferte Salzlösung

PEG Polyethylenglykol

PPZ Phosphatpuffer für Zetapotential-Messungen

PVK Protein-Vektor Kopplung

SATA N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat

SDS Natriumdodecylsulfat

SEC Größenausschlusschromatographie

SP Sulfhydrierungspuffer

SWP saurer Waschpuffer

TER transendothelialer elektrischer Widerstand

TEMED Tetramethylethylendiamin

TETA Triethylentetramin

Tf Transferrin

TNP Thiolgruppennachweis-Puffer

TRIS Trishydroxymethylaminomethan

ZNS Zentralnervensystem

Abstract xxix

Abstract

Many treatments of diseases of the central nervous system fail due to the blood-brain barrier. This

thesis was supposed to elaborate on the possible use of liposomal conjugates for the transport of

drugs into the brain.

As possible transport vectors for liposomes cationized albumin (cBSA), transferrin and a peptide

fragment of apolipoprotein E, which contains the receptor binding domain for the LDL-receptor,

were chosen. Coupling of those proteins was performed covalently with a special linker-lipid that

was incorporated into the liposomes. The liposomal conjugates were characterised through

measurement of diameter and zeta potential. All liposomes were in between 120 and 220 nm in

size. cBSA-liposomes had a positive, transferrin- and apoE-liposomes a negative zeta potential.

Efficiency of the coupling reaction was determined via fluorescent labelled cBSA and yielded up to

60 % depending on the used protein-linker ratio. In order to evaluate the release from liposomes the

retention of carboxyfluorescein was measured and its half-life was calculated. In PBS the half-life

was approximately two days, at pH 4.5 it was about three and a half hours and seven for rat plasma.

Experiments investigating uptake of liposomes into brain capillary endothelial cells isolated from

pig brains (PBCEC) showed a maximum efficiency for cBSA-liposomes of approximately 15 % of

uptake in regard to the used amount. Transferrin- and apoE-liposomes achieved only 6.6 and 1.5 %,

respectively, which was worse than for liposomes without vector. With confocal fluorescence

microscopy it was possible to show an actual localisation of liposomes in the cytoplasm of PBCEC.

Toxicity studies on PBCEC resulted in toxic effect for cBSA in concentrations as low as 1 nM.

Coupling to liposomes, however, allowed for a reduction in toxicity of two orders of magnitude.

Confocal fluorescence microscopy of cryosections from male Wistar rats after intravenous

application of cBSA-liposomes showed uptake into the brain. Fluorescence associated with

liposomes could be detected in brain tissue after three, six and 24 hours, for liposomes with a

diameter between 120 and 150 nm. For a size above 180 nm no uptake could be seen. Half-life of

the liposomes in the circulation could be determined to about seven and a half hours. Investigation

on cryosections of liver and spleen resulted only in uptake of cBSA-liposomes into the latter.

Liposomes with native BSA and without protein vector were also tested, but showed only little to

no uptake into the brain.

Zusammenfassung xxxi

Zusammenfassung

Viele Behandlungen von Erkrankungen des Zentralnervensystems scheitern an der Blut-Hirn

Schranke. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Nutzung von liposomalen Konjugaten als Träger für

Arzneistoffe ins Gehirn untersucht werden.

Als in Frage kommende Vektoren für die Anbindung an Liposomen wurden kationisiertes Albumin

(cBSA), Transferrin und ein Peptidfragment von Apolipoprotein E4, welches die Rezeptor bindende

Domäne für den LDL-Rezeptor enthält, ausgewählt. Die Kopplung der Proteine erfolgte über eine

kovalente Anbindung an ein spezielles Linker-Lipid, welches in die Liposomen inkorporiert wurde.

Hergestellte liposomale Konjugate wurden durch Bestimmung von Durchmesser und Zetapotential

charakterisiert. Der Durchmesser aller Liposomen bewegte sich zwischen 120 und 220 nm nach

Proteinbindung. cBSA-Liposomen hatten ein positives, Transferrin- und ApoE-Liposomen ein ne-

gatives Zetapotential. Die Effizienz der Kopplungsreaktion wurde durch Fluorescein markiertes

cBSA bestimmt und ergab abhängig vom eingesetzten Protein-Linker Verhältnis bis zu ca. 60 %.

Zur Evaluation der Freisetzung aus Liposomen wurde der Austritt von Carboxyfluorescein unter-

sucht und die Halbwertszeit bestimmt. In PBS betrug sie ca. zwei Tage, bei pH 4,5 etwa dreieinhalb

Stunden und im Plasma von Ratten etwa sieben.

Experimente zur Aufnahme der Liposomen in Hirnkapillar-Endothelzellen isoliert aus dem

Schweinehirn (PBCEC) zeigte für cBSA-Liposomen eine maximale Effizienz von etwa 15 % an

aufgenommenen Liposomen bezogen auf die eingesetzte Menge. Transferrin- und ApoE-

Liposomen erreichten lediglich ca. 6,6 bzw. 1,5 %, was sich als schlechter erwies als Liposomen

die keinen Vektor trugen. Durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie konnte eine tatsächliche Loka-

lisation der Liposomen im Zytoplasma der PBCEC festgestellt werden. Untersuchungen zur mögli-

chen Zytotoxizität ergaben für cBSA bereits in Konzentrationen von 1 nM toxische Effekte, die

allerdings durch die Anbindung an Liposomen um zwei Größenordnungen reduziert wurden.

Durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie von Gefrierschnitten männlicher Wistar-Ratten nach in-

travenöser Applikation von cBSA-Liposomen konnte eine Aufnahme ins Gehirn nachgewiesen

werden. Mit Liposomen assoziierte Fluoreszenz konnte nach drei, sechs und 24 Stunden, für Lipo-

somen zwischen 120 und 150 nm, im Hirngewebe ausgemacht werden. Oberhalb von 180 nm er-

folgte keine Aufnahme. Die Halbwertszeit der Liposomen im Blutkreislauf konnte auf ca. sieben-

einhalb Stunden bestimmt werden. Untersuchungen von Leber und Milz ergaben lediglich eine

Aufnahme von cBSA-Liposomen durch letztere. Liposomen mit nativem BSA und ohne Protein-

vektor wurden ebenfalls getestet, ergaben aber nur sehr geringe bis keine Aufnahme ins Gehirn.

1. Einleitung 35

1. Einleitung

1.1 Die Blut-Hirn Schranke

Viele der im Zentralnervensystem (ZNS) ablaufenden Prozesse sind auf ein exakt gleich bleibendes

Milieu angewiesen. Veränderungen des Salzspiegels können die Nervenleitung der Neuronen beein-

flussen. Im Körper kursierende Hormone, die außerdem als Neurotransmitter fungieren, können die

Funktion der Synapsen beeinflussen. Darüber hinaus sind Neuronen kaum regenerationsfähig, was

für das Gehirn, bei Schaden durch Xenobiotika oder Pathogene, fatale Folgen haben kann. Ein

Schutz des Hirngewebes vor den sich mitunter rapide verändernden Verhältnissen im Blut ist daher

unabdingbar. Diese Funktion übernimmt die so genannte Blut-Hirn Schranke (BHS).

Bereits 1885 fanden sich erste Hinweise auf die Existenz der BHS, als Paul Ehrlich beim Injizieren

saurer Farbstoffe in Ratten feststellte, dass das Gehirn als einziges von allen Organen ungefärbt

blieb.[1] Ehrlich selbst zog daraus noch nicht den richtigen Schluss. Weitere Experimente von einer

Reihe verschiedenster Wissenschaftler, darunter Max Lewandowsky, der erstmals den Begriff

„Blut-Hirn Schranke“ prägte, sowie Friedrich Karl Walter und Hugo Spatz, die die Unterscheidung

in Blut-Hirn- und Blut-Liquor-Schranke einführten,[2, 3] führten schließlich zur Postulation einer

Barriere zwischen Blut und ZNS. Erst 1967 konnte die tatsächliche Existenz der BHS von Thomas

S. Reese und Morris J. Karnovsky durch elektronenmikroskopische Aufnahmen bewiesen wer-

den.[4]

1.1.1 Aufbau und Funktion

Das Kapillarnetzwerk aus dem die BHS besteht erstreckt sich über eine Gesamtlänge von

600 km[5] und besitzt eine Oberfläche von etwa 20 m².[6] Dabei beträgt der durchschnittliche Ab-

stand der Kapillaren 40 µm[5] (s. Abb. 1.1). Zusammen mit der Blut-Liquor-Schranke deckt sie den

enormen Nährstoffbedarf des ZNS und sorgt gleichzeitig für die Homeostase der Cerebrospinalflüs-

sigkeit.[7] Die selektive Aufnahme von Nährstoffen und das Aussortieren von Fremd- und Schad-

stoffen bewerkstelligt die BHS durch ein komplexes System an Rezeptoren, Ionenkanälen und

Transportern (s. Abschnitt 1.1.3).

36 1. Einleitung

Abbildung 1.1: Plastinat des Kapillarnetzwerks im ZNS.[8]

Den größten und wichtigsten Teil der BHS machen die Hirnkapillar-Endothelzellen (BCEC) aus.

Sie sind untereinander durch tight junctions verknüpft, die den parazellulären Austausch von Stof-

fen zwischen Blut und ZNS unterbinden.[9] Sie werden aufgebaut durch die tight junction Proteine

Occludin und einige Claudine (1, 2, 3, 5, 11 and 12), sowie Junctional adhesion molecules (JAMs).

Extrazellulär formen diese Proteine Homodimere, während sie intrazellulär entweder direkt oder

über die Zonula occludens Proteine (ZOs) mit dem Aktinskelett der Zelle wechselwirken (s. Abb.

1.2).[10]

Abbildung 1.2: Schematische Darstellung einer tight junction.[10]

1. Einleitung 37

Auf diese Weise werden die Lücken, die normalerweise zwischen Zellen bestehen geschlossen. Da

die Endothelzellen außerdem auf ihrer luminalen Seite nur wenige Mikrovilli ausbilden, kommt es

kaum zu Pinozytose.[11]

Auf ihrer abluminalen Seite umgibt die Endothelzellen eine Basalmembran, bestehend aus Kollagen

und Fibronektin, die sowohl als zusätzliche Barriere als auch als physikalische Stütze wirkt.[12] In

der Basalmembran eingebettet befinden sich die Perizyten.[13] Sie stabilisieren die Kapillaren und

regulieren den Blutdruck (s. Abb. 1.3). Etwa 80 % der interstitiellen Seite der Basalmembran sind

außerdem durch Fortsätze von Astrozyten bedeckt.[14] Die Astrozyten stehen in Kontakt mit Neuro-

nen und versorgen diese mit Nährstoffen.[15, 16] Perizyten und Astrozyten stellen mit ihren Membra-

nen eine weitere Hürde für polare Verbindungen auf ihrem Weg ins Hirngewebe dar.[6]

Abbildung 1.3: Schematische Darstellung einer Gehirnkapillare.[17]

1.1.2 Transportprozesse an der Blut-Hirn Schranke

Neben dem Barrierecharakter ist das Vorhandensein von Transportwegen für alle wichtigen Nähr-

stoffe, die im ZNS benötigt werden, zentral für die Funktion der BHS. Als mögliche Routen kom-

men transzelluläre Diffusion, aktiver und passiver Transport durch Proteine, sowie Rezeptor vermit-

telte und adsorptive Transzytose in Frage (s. Abb. 1.4).

38 1. Einleitung

Passive Diffusion

Entlang eines entsprechenden Konzentrationsgradienten kann passive oder freie Diffusion sowohl

para- als auch transzellulär stattfinden. Die parazelluläre Route ist durch die tight junctions weitest-

gehend blockiert. Transzelluläre Diffusion beinhaltet das durchqueren zweier Lipid-

Doppelschichten. Die Geschwindigkeit mit der ein Stoff diese Barriere durchqueren kann hängt von

seiner Lipophilie, Form, Ladung und Molekulargewicht ab. Oktanol-Wasser Verteilungskoeffizien-

ten[18] und Wasserstoff-Bindungszahl[19] können darüber Aufschluss geben. Die meisten heutzutage

kommerziell erhältlichen ZNS-Therapeutika nutzen diese Route.[20]

Abbildung 1.4: Schematische Darstellung der BHS. Transportwege über die BHS sind wie folgt dargestellt: 1 = parazelluläre Diffusion, 2 = transzelluläre Diffusion, 3 = Transportprote-ine, 4 = Rezeptor vermittelte Transzytose, 5 = adsorptive Transzytose.[20]

Protein vermittelter Transport

Transport von Substanzen durch Proteine kann auf vielfache Weise erfolgen. Kanalproteine können

die passive Diffusion über die Zellmembran eines Moleküls, das den Kanal passieren kann, erleich-

tern. Passive Transporter verlagern Moleküle entlang eines Konzentrationsgradienten über die

Zellmembran. Die Anbindung des Substrats löst dabei an dem Transporter eine Konformationsän-

derung aus, die ersteres auf die andere Seite der Membran befördert. Manche passiven Transporter

können auch zwei verschiedene Moleküle gleichzeitig in die gleiche (Symport) oder entgegenge-

setzte Richtung (Antiport) transportieren. Der Glucose-Transporter an der BHS ist ein Beispiel für

1. Einleitung 39

einen passiven Transporter.[21] Transport entgegen einem Konzentrationsgradienten erfordert Ener-

gie und wird daher als aktiver Transport bezeichnet. Die benötigte Energie kann dabei aus chemi-

scher Bindungsenergie, z. B. der Hydrolyse von ATP, oder durch Abbau eines bestehenden Kon-

zentrationsgradienten als Sym- oder Antiport bezogen werden. Die für den Transport nötige Ände-

rung der Konformation des Transporters wird dabei vom Energie liefernden Prozess induziert. Die

aktiven Efflux-Transporter der ABC-Familie, zu denen unter anderem das permeability glycopro-

tein (p-Gp), die multi drug resistance-associated Proteine (MRP’s), das breast cancer resistance

Protein (BCRP) und viele weitere gehören (s. Abb. 1.5), sind an der BHS von fundamentaler Be-

deutung für den Abtransport unerwünschter Fremd- und Schadstoffe, die das Hirnkapillar-Endothel

ansonsten überwinden würden.[6] Dies hat zur Folge, dass viele Therapeutika nicht an Wirkorte im

ZNS gelangen können, was die nicht invasive Behandlung von ZNS-Erkrankungen schwierig bis

unmöglich macht.[22, 23, 24, 25] Neben dem Glucosetransporter existieren an der BHS Transportprotei-

ne für neutrale und basische Aminosäuren,[26] Monocarbonsäuren,[27] Cholin,[28] Glutamat,[29] Purin-

basen und Purinnukleoside.[30]

Abbildung 1.5: Lokalisation ausgewählter Transporter, sowie mehrerer Makromolekül-Rezeptoren in BCEC. Pfeile zeigen die Richtung des Transports. (Ins-R = Insulin-Rezeptor, Alb-R = Albumin-Rezeptor; Cp-R = Ceruloplasmin-Rezeptor; Tf-R = Transferrin-Rezeptor).[6]

Zytotische Prozesse

Die Absorption von Substanzen durch Einstülpung der Membran und anschließende Internalisie-

rung in die Zelle als Vesikel, nennt man Endozytose. Phagozytose beschreibt die Aufnahme von

größeren Partikeln, wie Bakterien und Viren. Die wenigsten Zelltypen sind zur Phagozytose in der

Lage, z.B. Makrophagen, Granulozyten oder Perizyten. In der Immunabwehr spielt sie aber eine

tragende Rolle. Unspezifische Aufnahme von extrazellulärer Flüssigkeit und darin enthaltenen Stof-

fen wird auch als Pinozytose bezeichnet. Wie bereits erwähnt spielt diese Form der Endozytose in

40 1. Einleitung

BCEC keine tragende Rolle. Die gebildeten Vesikel nennt man Endosomen (s. Abb. 1.6). Abhängig

von ihrem Inhalt können sie entweder mit Lysosomen, die hydrolytische Enzyme und niedrigen pH

besitzen und den Inhalt des Endosoms abbauen, fusionieren oder sie durchwandern die Zelle und

geben als sekretorisches Vesikel ihren Inhalt durch Exozytose wieder an das extrazelluläre Medium

ab. Der gesamte Prozess von Endo- und Exozytose wird als Transzytose bezeichnet.[31] An der BHS

wurde die Transzytose für Insulin,[32] LDL[33], Transferrin[34, 35] und kationisiertes Albumin[36, 37]

gezeigt.

Abbildung 1.6: Schematische Darstellung zytotischer Prozesse.[38]

Grundsätzlich lässt sich die Endozytose in zwei Kategorien unterscheiden. Adsorptive und Rezeptor

vermittelte Endozytose. Adsorptive oder nicht Rezeptor vermittelte Endozytose tritt dann ein wenn

Makromoleküle über elektrostatische Wechselwirkungen in Kontakt mit der Zellmembran treten.

Dazu muss das Makromolekül unter physiologischen Bedingungen eine ausreichend hohe Ladung

tragen. Da die Oberflächenladung der Zellmembran nicht gleichmäßig ist[39] können sowohl negati-

ve geladene (pI < 4,5) als auch positive Stoffe (pI > 7) aufgenommen werden.[40] Generell funktio-

niert die Endozytose kationischer Substanzen besser, da die Zellmembran insgesamt negativ gela-

den ist. Adsorptive Endozytose hat eine geringere Affinität aber höhere Kapazität als die Rezeptor

vermittelte Endozytose.[41, 42, 43] Kationisiertes Albumin[37, 43] und Histon[44] werden durch adsorpti-

ve Endozytose aufgenommen.

1. Einleitung 41

Bei Rezeptor vermittelter Endozytose verursacht das Anbinden des Substrates an den Rezeptor eine

Konformationsänderung desselben, was wiederum die Endozytose induziert. Da der Rezeptor mit

internalisiert und gegebenenfalls sogar abgebaut wird und damit nicht mehr zur Verfügung steht, ist

die Kapazität Rezeptor vermittelter Endozytose geringer. Hohe spezifische Affinitäten zwischen

Substrat und Rezeptor sorgen jedoch für eine Selektivität der Internalisierung und Prozessierung

des Endosoms. Beispiele für diesen Aufnahmemechanismus sind Insulin,[16], [32] Transferrin[34, 35]

und low-density lipoprotein (LDL).[33]

Endozytotische Prozesse lassen sich, außer in adsorptiv und Rezeptor vermittelt, noch über die Art

und Weise klassifizieren, wie die Membraneinstülpungen zusammengesetzt sind. Clathrin-coated

pits sind auf zytosolischer Seite der Membran mit Clathrin bekleidet und bilden Hohlräume von

etwa 150 nm Durchmesser.[45] Transferrin- und LDL-Aufnahme verläuft über diesen Mechanismus.

Aus Bereichen mit hohen Anteilen an Cholesterol, Glykosphingolipiden und intrazellulären Memb-

ranproteinen, z. B. Caveolin,[46] bilden sich so genannte caveolae, Ω-förmige Membraneinstülpun-

gen.[47] Diese Form der Endozytose wurde z. B. für Folsäure beschrieben.[48]

Inhibition der Endozytose

Um Erkenntnisse über die Endozytose-Mechanismen verschiedener Substanzen zu erlangen, ist es

hilfreich selektive Inhibitoren einzusetzen, die diese Wege blockieren können. Veränderungen des

Aufnahmeverhaltens einer Substanz in Kombination mit Inhibitoren können dann Aufschluss dar-

über geben ob diese Form von Endozytose von Bedeutung für die Aufnahme dieser Substanz ist

oder nicht.

Dansylcadaverin (s. Abb. 1.7) ist ein Fluoreszenzfarbstoff und wird verbreitet eingesetzt um Au-

tophagozytose zu beobachten, da es sich, auf Grund einer Kombination von Ioneneinschluss und

spezifischen Interaktionen mit Membranlipiden, bevorzugt in autophagozytotischen Vakuolen an-

sammelt.[49] Die Endozytose über clathrin-coated pits wird von Dansylcadaverin inhibiert. [50, 51, 52]

SO

O

NH

N

NH2

Abbildung 1.7: Dansylcadaverin; C17H25N3O2S; 335,46 g/mol.

42 1. Einleitung

Der aus Streptomyces filipinensis isolierbare Filipin-Komplex, bestehend aus acht isomeren Kom-

ponenten, von denen Filipin III den Hauptteil ausmacht (s. Abb. 1.8), besitzt neben seinen antibioti-

schen und antimykotischen Eigenschaften auch die Fähigkeit Endozytose über caveolae zu inhibie-

ren.[33, 53] Filipin ist in der Lage Cholesterol enthaltende Membranbereiche in einer Poren formen-

den Orientierung zu infiltrieren.[54] Es konnte außerdem gezeigt werden, dass es die Endozytose von

Prionen verhindert und deren Freisetzung aus der Zelle verursacht.[55] Die Affinität zu Cholesterol

und die damit einhergehenden Veränderungen der Zellmembran ist vermutlich sowohl der Grund

für die antimykotischen Eigenschaften[56] als auch für die Fähigkeit die Bildung von caveolae zu

verhindern.[57]

OH OH OH OH OH OH

O O

OH

OH

OH Abbildung 1.8: Filipin; C35H58O11; 654,83 g/mol.

Als eine antineoplastische Substanz behindert Nocodazol (s. Abb. 1.9) die Polymerisation der

Mikrotubuli. Das dynamische Mikrotubuli Netzwerk ist unter anderem für den vesikulären Trans-

port zuständig. Nocodazol kann damit alle zytotischen Prozesse beeinflussen.[58]

N

NH

S

ONH

O

O

Abbildung 1.9: Nocodazol; C14H11N3O3S; 301,32 g/mol.

Chlorpromazin (s. Abb. 1.10), ein niederpotentes Neuroleptikum, verringert und lindert psychomo-

torische Erregungszustände, Spannungen und Ängste. Zahlreiche Rezeptoren für Neurotransmitter,

darunter Dopamin- und Serotonin-Rezeptoren werden von Chlorpromazin blockiert.[59] Die Unter-

bindung des Auf- und Abbaus von Clathrin führt außerdem zu einer Hemmung der Endozytose über

clathrin-coated pits.[60]

1. Einleitung 43

N

S Cl

N

Abbildung 1.10: Chlorpromazin; C17H19ClN2S, 318,86 g/mol.

Das metabolische Gift Phenylarsinoxid hemmt die Internalisierung von Rezeptoren an der Zellober-

fläche, durch die Beeinflussung von Tyrosin-Phosphatasen (s. Abb. 1.11). Tyrosin-Kinasen werden

nicht beeinflusst.[61] Phenylarsinoxid ist kein selektiver Endozytose-Inhibitor.[62, 63] Clathrin abhän-

gige Endozytose, sowie Pinozytose in Adipozyten und Phagozytose in Mastzellen werden ge-

hemmt.[57]

As

O

Abbildung 1.11: Phenylarsinoxid, C6H5AsO, 168,02 g/mol.

1.1.3 Erkrankungen des Zentralnervensystems

Durch den stark regulierten Stofftransport über die BHS ist die Therapie der meisten ZNS-

Erkrankungen äußerst schwierig. Viele Wirkstoffe werden von p-Gp als Substrate erkannt und an

einem Eintritt ins Hirngewebe gehindert. Dazu gehören unter anderem Morphin,[64] Phenytoin,[65]

das bei Epilepsie eingesetzt wird, und Azidothymidin, ein AIDS-Medikament.[20, 22, 66] Die starke

Expression von p-Gp an der BHS stellt daher für die Behandlung vieler Krankheiten ein Problem

dar.[15, 16]

Der menschliche Körper kann an einer Reihe von Krankheiten leiden, die das ZNS in Mitleiden-

schaft ziehen. Epilepsie, Migräne, Chorea Huntington, HIV Enzephalopathie und psychologische

Erkrankungen sind nur einige Beispiele für die ein Arzneistoff-Transport ins ZNS von Nöten ist.

Auch wenn die Behandlung von Krebs in den letzten Jahren Fortschritte gemacht hat, so entziehen

sich Hirntumore weiterhin einer effektiven Behandlungsmöglichkeit. Nicht zuletzt sind die Alzhei-

mer- und Parkinson-Krankheiten, die besonders im hohen Alter zu Tage treten und damit durch den

demographischen Wandel an Bedeutung zunehmen werden, zu nennen. Die überwiegende Mehr-

zahl an Arzneistoffen und hochmolekularen partikulären Wirksystemen, wie rekombinante Protei-

44 1. Einleitung

ne, Peptide, monoklonale Antikörper, small interfering RNA (siRNA) und Gen-Therapeutika sind

nicht in der Lage die BHS zu überwinden. Im ZNS wirksame Substanzen zeichnen sich alle durch

eine spezielle Eigenschaft aus, die ihnen eine Passage der BHS ermöglichen. Wie diese Substanzen

das bewerkstelligen ist der Schlüssel zur erfolgreichen Modifikation von anderen Wirkstoffen, um

die Bioverfügbarkeit im ZNS zu erhöhen und eine Behandlung dortiger Erkrankungen zu verbes-

sern.

1.1.4 Strategien zu Überwindung der Blut-Hirn Schranke

Transkraniale Applikation

Die direkte Injektion in den Liquor (intrathekal) oder die Hirnventrikel (intraventrikular) ist eine

technisch und unter aseptischen Gesichtspunkten aufwendige Möglichkeit Wirkstoffe unter Umge-

hung der BHS ins ZNS zu bringen. Depotdarreichungsformen oder Medikamentenpumpen sind hier

besonders von Vorteil, da sie eine längere Versorgung gewährleisten können. Diese Methoden ha-

ben aber auf Grund von begrenzter Diffusion,[67] der Erneuerungsrate der Cerebrospinalflüssigkeit

(4 bis 5 mal pro Tag)[19] und der Abwesenheit eines lymphatischen Systems ihre Grenzen.[68] Die

Behandlung mit Morphin bei schweren Schmerzzuständen[69] oder von multipler Sklerose mit Bac-

lofen sind Beispiele für die Anwendung dieser Verfahren.[70]

Transnasale Applikation

Eine Verabreichung über die Nase und anschließender Transport der Substanzen über den Riech-

nerv ins ZNS konnte für Neurotrophine, Neuropeptide, Insulin, Zytokine und DNA gezeigt wer-

den.[71] Sogar Stammzellen können auf diesem Wege die BHS umgehen.[72] Generell ist eine ausrei-

chende Lipophilie der Substanz vorauszusetzen, damit die Nasenschleimhaut überwunden werden

kann.

Öffnung der Blut-Hirn Schranke

Ein möglichst reversibles Öffnen der BHS durch Störung der tight junctions ist unter anderem

durch die Gabe von so genannten tight junction Modulatoren, der intraarteriellen Infusion hyperos-

motischer Lösungen in die Karotisarterie oder durch Ultraschall möglich.

Als tight junction Modulatoren werden Substanzen bezeichnet, die eine gezielte Interaktion mit

tight junction Proteinen eingehen und dadurch eine Öffnung der BHS erzeugen.[73, 74] Ein von

Vibrio cholerae, eines Cholera-Erregers, gebildete Zonula occludens Toxin (ZOT), ein

1. Einleitung 45

45 kDA schweres Protein, beispielsweise interagiert mit dem ZOT-Rezeptor und löst dadurch eine

Signalkaskade aus, deren genaue Folge noch nicht bekannt ist. Unter anderem wird aber die Prote-

inkinase A aktiviert, welche den Abbau der tight junctions katalysiert.[75, 76] Auch die Interaktion

von Bradykinin, einem Oligopeptid bestehend aus neun Aminosäuren, mit dem luminalen B2-

Rezeptor an Endothelien führt zu einer Öffnung von tight junctions. Der Anstieg an freiem intrazel-

lulären Ca2+ aktiviert den Aktin-Myosin-Komplexes, der mit Occludin und Claudinen verbunden

ist.[77]

Direkte Infusion hyperosmolarer Lösungen, z.B. Mannitol, in die Arteria carotis interna sorgen bei

Kontakt mit Endothelzellen für einen Efflux an Wasser. Dies führt zu einem Schrumpfen der Zellen

und damit zu Spannungen, die die tight junctions öffnen.[78, 79] Die Größe der Öffnung beträgt etwa

20 nm, so dass nur Moleküle und Partikel deren hydrodynamischer Durchmesser 20 nm oder klei-

ner ist die BHS passieren können.[80, 81] In der Regel ist nach zehn Minuten bis zwei Stunden die

Funktion der BHS wieder hergestellt.[82] Für eine Vielzahl von wasserlöslichen Wirkstoffen, Pepti-

den, Antikörpern, Enzymen, viralen Vektoren für die Gentherapie und Chemotherapeutika findet

diese Methode vielversprechende Anwendung.[83]

Behandlung mit fokussiertem Ultraschall führen zu Schädigungen des Gehirngewebes. In Kombina-

tion mit der Applikation so genannter Microbubbles lässt sich dies jedoch verhindern.[84] Die Art

und Weise wie die BHS geöffnet wird ist nicht vollständig verstanden. Entscheidend scheinen die

vom Ultraschall erzeugten Schwingungen der Microbubbles zu sein, die ihrerseits Mikroströmun-

gen und damit Scherkräfte verursachen[85] auf die die Endothelzellen reagieren.[86] Ein Vorteil die-

ser Methode ist das bestimmte Hirnareale gezielt geöffnet werden können, ein Nachteil wiederum,

dass die Fokussierung des Ultraschalls in tieferen Hirnregionen schwierig ist. Für Doxorubicin[87]

und Trastuzumab[88] wurde eine Passage der BHS auf diese Weise bereits beschrieben.

Allen diesen Verfahren ist gemein, dass jegliche im Blut befindliche Substanzen parazellulär ins

ZNS diffundieren können. Dies kann zu Problemen führen, da z.B. Albumin für Astrozyten toxisch

ist.[89] Darüber hinaus kann es zu vaskulären Schäden, zu Ödemen[90] und neuropathologischen Ver-

änderungen kommen.[91, 92]

Wirkstoffmodifikation

Modifikationen des Wirkstoffs selbst, wie z.B. Lipophilisierung oder Kationisierung, können die

Bioverfügbarkeit im ZNS erhöhen. Auch das gezielte Ausnutzen von, an der BHS existierenden,

Transportern durch Veränderungen am Wirkstoff können einen Transport in ZNS ermöglichen.

Das Einführen von polaren Gruppen ist eine beliebte Strategie um kleine lipophile Moleküle daran

zu hindern die BHS zu durchqueren. Im Umkehrschluss bedeutet eine Maskierung polarer Gruppen

46 1. Einleitung

eine Verbesserung der Hirngängigkeit der Substanz, da die Zellmembranen schneller überquert

werden können. Eindrucksvoll erläutern lässt sich dieses Prinzip am Beispiel von Morphin und He-

roin (s. Abb. 1.12). Das wesentlich lipophilere Heroin (logP = 1,12) wird etwa 25 mal besser in

ZNS aufgenommen als Morphin (logP = 0,2).[93] Grund für die höhere Lipophilie sind zwei Ace-

tylgruppen. Eine verstärkte Aufnahme kann jedoch abgesehen vom ZNS auch andernorts im Körper

erfolgen. Ab einer bestimmten Größe sind selbst lipophile Moleküle nicht mehr in der Lage die

Zellmembranen zu passieren. Außerdem verschlechtert zunehmende Lipophilie die Wasserlöslich-

keit. Handelt es sich bei dem Wirkstoff um ein Substrat der Efflux-Transporter der BHS kann auch

eine hinreichend hohe Lipophilie nicht ausreichend für eine gute Bioverfügbarkeit sein.

OHOHO

H

N

H

OOO

H

N

H

O O

Diacetylierung

Abbildung 1.12: Morphin (links) und Heroin (rechts).

Die Kationisierung von Substanzen kann, wenn sie zu einer positiven Ladung unter physiologischen

Bedingungen führt, die Aufnahme ins ZNS verbessern. Durch die negative Gesamtladung der Zell-

membranen kommt es zu elektrostatischen Wechselwirkungen und in deren Folge zu adsorptiver

Endozytose bzw. Transzytose (s. Abschnitt 1.1.2).[94, 95] Ein Beispiel ist das bereits erwähnte katio-

nisierte Albumin.[43]

Das Netzwerk an Transportern an der BHS, das der Nährstoffversorgung des ZNS dient, kann in

bestimmten Fällen für die Aufnahme von Wirkstoffen zweckentfremdet werden. Das wohl bekann-

teste Beispiel dafür ist das Prodrug L-DOPA (s. Abb. 1.13), das für die Behandlung von der Parkin-

son-Krankheit eingesetzt wird. Dopamin selbst ist nicht in der Lage die BHS zu passieren.

L-DOPA allerdings wird vom LAT1-Transporter, der zur LNAA-Familie (large neutral amino

acid) gehört, ins ZNS transportiert, wo es dann zu Dopamin umgewandelt wird.[59] Die Möglichkei-

ten dieses Ansatzes sind gegebenermaßen begrenzt.

1. Einleitung 47

OHO

NH2

OH

OH

NH2

OH

OH Abbildung 1.13: L-DOPA (links) und Dopamin (rechts).

Eine weitere Möglichkeit das bestehende Transportnetzwerk der BHS auszunutzen besteht in der

Vektorisierung. Einige körpereigene Substanzen wie Insulin, Transferrin und low-density lipopro-

tein werden über Rezeptor vermittelte Endozytose bzw. Transzytose aufgenommen (s. Abschnitt

1.1.2). Das Anbinden von Wirkstoffen an diese Substanzen, Vektoren genannt, erlaubt eine Auf-

nahme sozusagen „huckepack“.[96] Kleinere wie größere Peptide lassen sich beispielsweise über

diese Methode transportieren.[97] Auch Antikörper gegen Tranzytose vermittelnde Rezeptoren las-

sen sich auf diese Weise nutzen.[32, 98, 99] Ein zu berücksichtigender Aspekt dieser Methode ist, dass

sich nach einem erfolgreichen Passieren der BHS Vektor und Wirkstoff unter Umständen vonein-

ander trennen müssen, damit letzterer seine Wirkung entfalten kann. Da das Verhältnis zwischen

Wirkstoff zu Vektor für die direkte Vektorisierung maximal bei 10:1 liegt,[100] ist die Anbindung

von Vektoren an vesikuläre Trägersysteme, die eine viel höhere Wirkstofflast in ihrem Inneren tra-

gen können ein vielversprechender Ansatz.

Vesikuläre Trägersysteme

Nanoskalige vesikuläre Trägersysteme, die klein genug sind um durch Endozytose aufgenommen

zu werden und in ihrem Inneren eine Wirkstoffladung transportieren können, können ebenfalls vek-

torisiert werden. Auf diese Weise kann der Wirkstoff unverändert ins ZNS gelangen und wird im

Vesikel vor Abbau geschützt.[101] Zusätzlich können durch möglichst gezielte Vektoren Nebenwir-

kungen verringert werden. Diese Vesikel können Durchmesser im Bereich weniger nm bis hin zu 1

µm haben und aus vielerlei Materialien bestehen. Zu ihnen zählen Polymer-Nanopartikel, feste Li-

pid-Nanopartikel, Lipid-Nanokapseln, Albumin-Nanopartikel, Liposomen, Mizellen, Dendrimere,

Nanogele, Nano-Emulsionen und Nano-Suspensionen.[6] So können beispielsweise Nanopartikel

aus Polylactiden oder Polycyanoacrylaten die BHS passieren.[102] Entscheidend ist hierbei eine Be-

schichtung der Partikel mit Polysorbat 80 oder Poloxameren.[103] Diese Beschichtung sorgt ihrer-

seits vermutlich für eine Interaktion mit Apolipoprotein E[104] und vermittelt dadurch eine Aufnah-

me über den LDL-Rezeptor.[105] Einmal endozytiert wird der Wirkstoff entweder aus dem Partikel

48 1. Einleitung

freigesetzt und kann auf sich allein gestellt das Hirngewebe erreichen oder das Partikel wird als

Ganzes transzytiert.[106] Eine Problematik von vesikulären Systemen stellt die Absorption durch das

mononukleäre Phagozytensystem dar. Neben Polysorbat 80[107] kann eine Beschichtung mit Poly-

ethylenglykolen (PEG) dies verringern und die Plasmahalbwertszeit signifikant erhöhen.[108] Der

Großteil der Nanopartikel wird dennoch von anderen Organen aufgenommen.[109] Ein weiteres

Problem stellt die Freisetzung des Wirkstoffes dar, da nicht alle nanopartikulären Formulierungen

biologisch abbaubar sind. Dennoch können diese Systeme bedeutende Verbesserungen erzielen. Mit

in Nanopartikeln verpacktem Doxorubicin konnte die Bioverfügbarkeit im ZNS um das 60fache

erhöht werden.[110, 111] Auch das normalerweise nicht zentral wirksame Analgetikum Loperamid

konnte auf diese Weise in ZNS transportiert werden.[112] Auf Grund ihrer Vielseitigkeit, generellen

Bioverträglichkeit und Bioabbaubarkeit sind unter den Nanopartikeln Liposomen von besonderem

Interesse (s. Abschnitt 1.2).

1.1.5 Modellsysteme zur Untersuchung der Blut-Hirn Schranke

Um Transportprozesse und Wirkstoff-Verhalten an der BHS zu untersuchen und besser zu verste-

hen, existiert eine Reihe von Modellsystemen.

In vivo Modelle

Injektion radioaktiver Test- zusammen mit Referenzsubstanzen in die innere Karotisarterie erlaubt

die Bestimmung des brain uptake index (BUI).[113] Er setzt sich zusammen aus dem Verhältnis der

Radioaktivitäten von Test- zu Referenzsubstanz im extrahierten Gehirn in Bezug zur Injektion.[19]

Diese Methode eignet im Prinzip nur für Substanzen die schnell ins ZNS gelangen können, da die

Versuchszeit nur weinige Sekunden beträgt. Für nur sehr langsam ins ZNS gelangende Substanzen,

z.B. Peptide oder Proteine, ist diese Methode unzureichend.[114] Untersuchungen von Injektionsvo-

lumen und Zirkulationszeit haben außerdem gezeigt, dass sich große Schwankungen im BUI erge-

ben können.[115] Nach einem ähnlichen Prinzip funktioniert die Hirn-Perfusion, nur das anstelle ei-

ner Injektion in die Karotisarterie selbige perfundiert wird und die Testsubstanz mit dem Perfusat

verabreicht wird. Die Abwesenheit von Blutfluss verringert hierbei den metabolischen Abbau des

Wirkstoffes.[116] Eine Anwendung dieser Methode findet hauptsächlich bei Ratten und Meer-

schweinchen statt.[117, 118]

Bei Gabe eines Wirkstoffs kann die ins ZNS vorgedrungene Menge auch über die so genannte ca-

pillary depletion Methode gemessen werden.[37] Nach Ablauf des Experimentes und Entnahme des

Gehirns wird dieses homogenisiert und die Kapillaren werden durch eine Dichtegradienten-

1. Einleitung 49

Zentrifugation abgetrennt. Im verbleibenden Homogenat befindet sich nur noch die tatsächlich auf-

genommene Wirkstoffmenge. Auf diese Weise wurde z.B. der Transport von Liposomen, die einen

Antikörper gegen den Transferrin-Rezeptor tragen, ins ZNS nachgewiesen.[119]

Mikrodialyse ist eine weitere Methode mit der der Wirkstoffgehalt der Cerebrospinal-flüssigkeit

gemessen werden kann.[120] Die Implantation einer Mikrokanüle mit semipermeabler Membran ins

Gehirn und ihre Perfusion lassen nach Injektion einer zu testenden Substanz in die Blutbahn eine

Analyse durch Bestimmung der Konzentration im Perfusat zu. Hiermit sind vor allem Substanzen

die längere Zeit brauchen um die BHS zu überwinden zu erfassen.[121, 122] Ein Vorteil der Methode

liegt darin, dass die Versuchstiere nicht dauerhaft in Narkose bleiben müssen und dadurch sogar

Beobachtungen des Verhaltens möglich werden.[123] Untersuchungen während der Öffnung der

BHS durch hyperosmolare Lösungen wurden mit diesem Verfahren durchgeführt.[124]

In vitro Modelle

Aus dem Gehirn isolierte Kapillaren wurden schon für zahlreiche Studien der Physiologie, Bioche-

mie und Entwicklungsbiologie der BHS verwendet.[125] Ihre Gewinnung aus Hirnhomogenat ist auf

vielerlei Art und Weise möglich.[126, 127, 128] Einmal gewonnen können mit den Kapillaren in Sus-

pension Aufnahme-Experimente durchgeführt werden. Der Vorteil der Methode liegt darin, dass sie

ex vivo die natürliche Anordnung aller Komponenten der BHS enthält. Nachteilig wirkt sich die

Tatsache aus, dass nicht klar bestimmt werden kann ob eine Substanz apikal oder basolateral aufge-

nommen wird.[116, 129] Außerdem verlieren die Zellen nach einigen Stunden ihre metabolische Akti-

vität.[130]

Aus Hirnkapillaren lassen sich die Hirnkapillar-Endothelzellen (BCEC) isolieren und für einige Zeit

kultivierten. Da sie der Hauptbestandteil der BHS sind, können sie als Modellsystem für Aufnahme

und Transportprozesse dienen. Ihre Isolation wurde bereits für Maus,[131] Ratte,[132] Rind,[133]

Schwein[131] und Mensch[134] beschrieben und erfolgt durch mechanische und enzymatische Homo-

genisierung und anschließende Trennungsschritte durch Filtration und Dichtegradienten-

Zentrifugation. In entsprechend behandelten Kulturgefäßen wachsen sie zu dichten Zellschichten

zusammen, die viele Charakteristika der BHS ausbilden. Die Bildung von tight junctions, eine ge-

ringe pinozytotische Aktivität und polarisiertes Wachstum,[135] sowie die Expression charakteristi-

scher Enzyme, z.B. alkalische Phosphatase oder von-Willebrand-Faktor, wurden nachgewiesen.[136,

137] Auch die Ausbildung von transendothelialen elektrischen Widerständen (TER) bis zu 1000

Ω·cm2 (in vivo bis zu 2000 Ω·cm2)[138] konnte gemessen werden.[139] Durch Kultivierung in Kultur-

gefäßen mit zwei durch Filter getrennte Kompartimente lassen sich Experimente durchführen, die

über die bloße Aufnahme hinausgehen (s. Abb. 1.14). Eine Beschichtung des Filters sorgt für ein

50 1. Einleitung

polarisiertes Anwachsen der BCEC. Durch Messungen des TER können Aussagen über die Dich-

tigkeit der Zellschicht gemacht werden. Zu untersuchende Substanzen können apikal oder basolate-

ral in das System eingebracht und ihr Transportverhalten unter gut kontrollierbaren Bedingungen

gemessen werden.

Abbildung 1.14: Schematische Darstellung eines zwei-Kompartiment-Kulturgefäßes für Transportstudien.

Abgesehen von primären Zellen existieren auch mehrere Zelllinien als Modellsysteme für die BHS.

Die Immortalisierung von Zellen sorgt normalerweise für weitgreifende Veränderungen des zellulä-

ren Metabolismus, so dass ursprüngliche Eigenschaften verloren gehen. Ein BHS-Modell lässt sich

dann meist nur in aufwändigeren Cokulturen mit Astrozyten, Perizyten oder Neuronen erhalten.[133,

140, 141, 142] Die RBE4-Zellinie, ein Klon aus Hirnkapillar-Endothelzellen der Ratte, stellt eine Aus-

nahme dar. In ihr sind die Expression spezifischer Marker und die Empfindlichkeit gegenüber An-

giogenese- und astrogliären Faktoren erhalten.[143] Aus Maus oder Rind erzeugte Systeme zeigten,

dass auch weitere morphologische Marker erhalten bleiben können.[144] Auch eine Zelllinie aus im-

mortalisierten humanen Hirn-kapillar-Endothelzellen (HCMEC/D3) wurde bereits beschrieben.[145,

146] Einfachere Handhabung und der Verzicht auf langwierige und komplexe Isolationsverfahren

sind Vorteile der Verwendung von Zelllinien. Da in vielen Zelllinien die Proteinexpression verän-

dert ist und sich im Laufe der Passagen weiter verändern kann, geben Primärzellen nach wie vor ein

besseres Bild der Gesamtfunktion der BHS. Genau charakterisierte Zelllinien können aber für ge-

zielte Fragestellungen wertvoll sein.[147, 148, 149]

1. Einleitung 51

1.2 Liposomen

1.2.1 Liposomen als Arzneimittelformulierung

Liposomen gehören zu den nanoskaligen vesikulären Trägersystemen (s. Abschnitt 1.1.4) und sind

hauptsächlich aus bioverträglichen Phospholipiden und Cholesterol aufgebaut (s. Abschnitt 1.2.3).

Als Formulierung für Arzneimittel sind sie vor allem deshalb interessant, da Zielgewebe gerichtet

angesteuert werden können, indem die Liposomen durch Kopplung von Proteinen an ihrer Oberflä-

che modifiziert werden, und gleichzeitig eine hohe Transportkapazität aufweisen.[150] Dies bewirkt

höhere Wirkstoffkonzentrationen am Wirkort und die Verringerung von Nebenwirkungen.[151] Auch

die Halbwertszeit von Wirkstoffen kann dadurch erhöht werden.[152] Sowohl die topische Anwen-

dung auf der Haut[153] als auch eine transdermale Aufnahme[154, 155] kann durch Liposomen verbes-

sert werden. Liposomale Arzneiformen auf dem Markt sind unter anderem AmBisome® (Amphote-

ricin B) zur Behandlung invasiver Pilzinfektionen, DaunoXome® (Daunorubicin) und Doxil

® (Do-

xorubicin) gegen Tumorerkrankungen als parenterale Darreichungsform. Für topische Anwendung

existieren z.B. Pevaryl®

-Lipogel (Econazol) gegen Pilzbefall, Heparin PUR/-forte (Heparin) gegen

Schwellungen und Epaxal-Berna (inaktivierte Hepatitis A Virionen und Hämaglutinin aus Influen-

za-Viren) zur Impfung.[156] Während hydrophile Wirkstoffe, wie Doxorubicin oder Heparin, im In-

neren der Liposomen eingeschlossen sind, lagern sich lipophile, wie Amphotericin B und Econazol,

in die Doppellipidschicht der Liposomen ein. Verlängerte Plasmahalbwertszeit, erhöhte Konzentra-

tion im Zielorgan und verringerte Toxizität konnte für einige der genannten parenteralen Formulie-

rungen gezeigt werden.[157, 158, 159] Für die topische Arzneiformen gehören höhere Wirkstoffkonzent-

ration und kürzere Behandlungsdauer zu den Vorteilen der liposomalen Formulierung.[160] Ob der

vorteilhafte Charakter von den Liposomen selbst oder nur dem in ihnen enthaltenen Phosphatidyl-

cholin stammt ist teilweise jedoch umstritten.[161] Auch in Kosmetika, zum Transport von Vitaminen

oder von DNA in der Gentherapie finden Liposomen Anwendung.[162, 163]

1.2.2 Liposomen als Transportsysteme an der Blut-Hirn Schranke

Da konventionelle Liposomen das ZNS nicht erreichen können ist eine Vektorisierung

(s. Abschnitt 1.1.4) und zusätzlich ist eine sterische Stabilisierung notwendig, um die Anbindung

von Opsoninen und die damit verbundene Aufnahme der Liposomen ins mononukleäre Phagozy-

tensystem zu verhindern. Am häufigsten werden hierfür Polyethylenglykole eingesetzt, die kovalent

an die Kopfgruppen von Phospholipiden gebunden sind.[164, 165, 166, 167] Dies verlängert die Plasma-

halbwertszeit um ein Vielfaches. Verschiedene Endozytose vermittelnde Vektoren sind für aufs

ZNS zielgerichtete Liposomen möglich. Sowohl der LDL-[168] als auch der Transferrin-Rezeptor[169,

52 1. Einleitung

170] werden an der BHS stark exprimiert und führen bei Substratbindung zur Endo- bzw. Transzyto-

se des Substrat-Rezeptor-Komplexes. Neben Rezeptor vermittelter Transzytose wurde für kationi-

siertes Albumin ex vivo und in vivo adsorptive Transzytose beschrieben.[42, 43] Darüber hinaus wäre

ein Ansteuern des Insulin-Rezeptors[171] oder die Verwendung von Histonen[44] denkbar. Tatsächlich

konnte bereits die Aufnahme von Liposomen mit kationisiertem Albumin[172] bzw. dem Rezeptor

bindenden Peptidfragment von Apolipoprotein E[173], welches an den LDL-Rezeptor bindet, in

Hirnkapillar-Endothelzellen aus dem Schweinehirn nachgewiesen werden. Für Nanopartikel die

Transferrin bzw. einen gegen den Transferrin-Rezeptor gerichteten Antikörper tragen,[170] sowie für

Apolipoprotein E[168] konnte eine Aufnahme ins ZNS gezeigt werden. Mit Transferrin[174] bzw. dem

Transferrin-Rezeptor-Antikörper OX26[150] konnten außerdem Liposomen über die BHS geschleust

werden. Für einige Wirkstoffe ist eine durch Liposomen vermittelte verstärkte Wirkung im ZNS

nachweisbar, darunter: Phenytoin[175] und Cisplatin.[176]

1.2.3 Aufbau von Liposomen

Als Liposomen bezeichnet man aus einer oder mehreren Phospholipid-Doppelschichten aufgebaute

kugelförmige Vesikel, die einen wässrigen Innenraum umschließen. Sie werden generell nach Grö-

ße und Anzahl an Doppelschichten unterschieden in small unilamellar vesicles (SUV, < 100 nm),

large unilamellar vesicles (LUV > 100 nm), sowie mulitlamellar und multivesicular vesicles (MLV

bzw. MVV; s. Abb. 1.15). Hauptbestandteile von Liposomen sind einfache Phospholipide, wie sie

auch in biologischen Membranen vorkommen, z.B. Phosphatidylcholin aus dem Eidotter (EPC, s.

Abb. 1.16), und oft auch Cholesterol (s. Abb. 1.17). Letzteres ist für die Fluidität der Membran über

die Breite physiologischer Temperaturen hinweg verantwortlich und für die Membranintegrität von

Liposomen bei der Lagerung bei niedrigen Temperaturen wichtig.

1. Einleitung 53

Abbildung 1.15: Schematische Darstellung von unilamellaren (links) und multilamellaren Liposomen (rechts).[177]

Beim Einbringen von Lipiden in eine wässrige Phase oberhalb der kritischen Mizellbildungskon-

zentration orientieren sich die amphiphilen Moleküle so, dass ihre hydrophilen Kopfgruppen die

hydrophoben Ketten vor der wässrigen Phase abschirmen. Der hydrophobe Effekt ist hierbei Trieb-

kraft für die Verringerung der Entropie.[11, 96] Dies führt zur spontanen Bildung von Mizellen, Dop-

pelschichten und Liposomen.[162, 163] Dieses sehr heterogene Gemisch an Lipidkörpern kann dann

durch geeignete Verfahren zu diskreteren Liposomenpopulationen geformt werden (s. Abschnitt

1.2.4).

O

O

O

OO P O

N+

O-

O

Abbildung 1.16: Distearylphosphatidylcholin (DSPC); C44H88NO8P; 790,15 g/mol.

OH

H

H H

Abbildung 1.17: Cholesterol; C27H46O; 386,65 g/mol.

54 1. Einleitung

Erstmals 1911 wurde die Bildung von Vesikeln aus Phospholipiden und Wasser beobachtet,[178]

aber erst 1961 kam es zur Aufklärung ihrer Struktur durch Alec Bangham, der seither als Entdecker

der Liposomen gilt, mittels Elektronenmikroskopie.[179, 180] Zunächst fanden Liposomen hauptsäch-

lich Anwendung zur Erforschung von Eigenschaften biologischer Membranen.[181] Nach und nach

wurde erkannt, dass viele Eigenschaften von Liposomen, wie die Aufnahme lipophiler Stoffe oder

der Schutz vor metabolischem Abbau, für Arzneistoffformulierungen interessant sein könnten. Zu-

dem waren Phosphatidylcholine bereits als Hilfsstoffe anerkannt.

Liposomen für parenterale Applikation

Ein großer Vorteil von Liposomen liegt in der flexiblen Zusammensetzung ihrer Membran, die

durch Verwendung verschiedenster Lipid auf viele denkbare Funktionen hin angepasst werden

kann. Für parenterale Applikation, die nicht direkt auf Leber oder Milz abzielt, bietet es sich an mit

Polyethylenglykol (PEG) an ihrer Kopfgruppe modifizierte Lipide zu verwenden (s. Abb. 1.18), um

die Plasmahalbwertszeit der Liposomen zu erhöhen (vgl. Abschnitt 1.2.2).[162, 182]

n

O

O

O

OO P O

NHO

-

O

O

O

O

Abbildung 1.18: Distearylphosphatidylethanolamin-methoxy(polyethylenglykol); C43H83NO10P·[C2H4O]n; 805,10+[44,05]n g/mol.[183]

PEGylierte Phospholipide sind für PEG-Massen von 350 (n = 7) bis 5000 (n = 113) erhältlich. Häu-

fig verwendete Lipide sind mit PEG2000 (n = 45) modifiziert und werden im einstelligen Prozent-

anteil bezogen auf die Gesamtlipidmenge eingesetzt.[150, 164]

Liposomen für orale Applikation

Höhere Stabilitäten gegenüber den Bedingungen im Gastrointestinaltrakt für eine orale Verabrei-

chung können z.B. mit so genannten Tetraetherlipiden, die die gesamte Membran durchspannen und

Liposomen somit gegenüber Gallensalzen und den sauren Bedingungen im Magen stabilisieren,

erreicht werden (s. Abb. 1.19).[184] Zur verbesserten Aufnahme im Darm ist außerdem eine Einbin-

dung von Permeationsverstärkern möglich (s. Abb. 1.20). Diese häufig toxischen Substanzen kön-

nen eine Penetration der Darmschleimhaut erleichtert. Die, durch den Einbau in Liposomen, er-

reichte Colokalisation von Verstärker und Wirkstoff kann die Toxizität auf ein Minimum reduzie-

ren.[185]

1. Einleitung 55

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OOH

Abbildung 1.19: Glycerylcaldityltetraether (GCTE), ein Tetraetherlipid aus Sulfolobus aci-

docaldarius; C92H174O11; 1456,36 g/mol.[186]

N+

Cl-

Abbildung 1.20: Cetylpyridiniumchlorid, ein Aufnahmeverstärker; C21H38ClN; 339,99 g/mol.

Vektorisierte Liposomen

Zur gezielten Ansteuerung eines Organs kann die Anbindung eines für dieses Gewebe spezifischen

Vektors von Vorteil sein (vgl. Abschnitte 1.1.4 & 1.2.2). Für kovalente Verknüpfungen zwischen

Lipiden und Proteinen existiert eine Reihe von funktionalisierten Lipiden. Zu den erhältlichen funk-

tionellen Gruppen, die auch durch PEG-Ketten von der Kopfgruppe getrennt sein können, zählen

Carbonsäuren, Amine und Maleimide. Besonders Maleimide (s. Abb. 1.21) bieten über die Anbin-

dung von Thiolgruppen am Protein eine selektive und stabile Möglichkeit der Kopplung (s. Ab-

schnitt 1.2.4).

n

O

O

O

OO P O

NHO

-

O

ONH

O

O

N

O

O

Abbildung 1.21: Distearylphosphatidylethanolamin-polyethylenglykol-maleimid, ein Linker-Lipid; C49H87N3O12P·[C2H4O]n; 941,20+[44,05]n g/mol.[183]

56 1. Einleitung

Liposomen mit erleichterter Freisetzung

Haben Liposomen ihren Wirkort erreicht stellt sich immer noch die Frage der Freisetzung des

Wirkstoffs. Enden Liposomen in Lysosomen werden Formulierungen aus Phosphatidylcholinen und

Cholesterol für kleine hydrophile Substanzen löchrig (vgl. Abschnitt 3.3). Für größere Moleküle

oder einer schnellen Freisetzung bereits im Endosom können Liposomen pH-sensitiv gemacht wer-

den.[187, 188] Auch viele pathologische Gewebe, wie Entzündungen, Infektionen oder Tumore, kön-

nen ein saures Milieu erzeugen.[189] Bei pH-Sensitivität spielen Phosphatidylethanolamine (s. Abb.

1.22) eine zentrale Rolle.[190, 191] Ihre Kopfgruppe ist kaum hydratisiert und nimmt daher ein gerin-

geres Volumen als die unpolaren Ketten ein. Dieser Umstand würde die Bildung von Liposomen

eigentlich verhindern. Durch die Beimischung von Lipiden mit aziden Kopfgruppen, die unter phy-

siologischen Bedingungen negativ geladen sind, können durch elektrostatische Abstoßung jedoch

liposomale Strukturen stabilisiert werden.[192, 193] Gelangen diese Liposomen in ein saures Milieu, in

dem die aziden Gruppen protoniert werden, bricht die elektrostatische Abstoßung zusammen und

die Liposomen destabilisieren sich, wobei sie ihren Inhalt freigeben, oder fusionieren mit Endoso-

men- oder Zellmembranen und entlassen in ihnen enthaltene direkt ins Zytosol.[189, 194, 195]

O

O

O P

O

O-

ONH3

+

O

O Abbildung 1.22: Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE); C41H78NO8P; 744,03 g/mol.

Wenn der Wirkort der Liposomen genau bekannt ist, bietet sich eine weitere Möglichkeit der er-

leichterten Freisetzung an. Lipidmembranen können in zwei verschiedenen Phasen vorliegen: dem

Gel- und dem flüssigkristallinen Zustand (s. Abb. 1.23). Die Temperatur bei der die beiden Zustän-

de in einander übergehen, nennt man Phasenübergangstemperatur (Tc). Sie hängt von der Ketten-

länge und den Anteilen an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren in der Membran ab. Während

des Phasenübergangs kommt es zu einer Reduktion der Dicke der Membran um etwa 20%[196] und

damit zu Lücken durch falsche Paarungen, besonders zwischen Bereichen unterschiedlicher Pha-

sen.[197] Für beispielsweise gesättigte Fettsäuren der Kettenlänge C16 liegt Tc im Bereich von 40 bis

65 °C, abhängig von der Kopfgruppe.[198] Einfach ungesättigte z.B. C18 Phospholipide besitzen Tc

von −20 bis 40°, wobei cis- und trans-Stellung der C-Doppelbindung entscheidende Auswirkung

hat.[198] Durch Mischen von Phospholipiden kann beinahe jede gewünschte Tc erreicht werden.

Wählt man Tc leicht oberhalb der Körpertemperatur sorgt eine Applikation von Wärme im Zielge-

1. Einleitung 57

webe, dass Liposomen dieser Zusammensetzung bei ihren Inhalt schlagartig freigeben.[176, 199, 200,

201]

Abbildung 1.23: Phasenübergang einer Phospholipid-Doppelschicht.[17]

Fluoreszierende Liposomen

Da Liposomen in der Regel aus Materialen aufgebaut sind, die so auch in biologischen Systemen

vorkommen, kann eine Verfolgung schwierig sein. Eine einfache Methode den Nachweis von Lipo-

somen in Zellen und Gewebe zu erleichtern ist die Inkorporation fluoreszierender Lipide. Eine Rei-

he von Lipiden mit Fluoreszenzfarbstoffen, gebunden sowohl an die Kopfgruppe (s. Abb. 1.24) als

auch an Fettsäuren (s. Abb. 1.25), ist kommerziell erhältlich.

O

O

O

OO P O NH

O-

O S OO

O N+

N

SO3-

Abbildung 1.24: Mit Rhodamin B markiertes Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE); Anregung: 560 nm, Emission: 583 nm; C64H105N4O14PS2; 1249,64 g/mol.[183]

O

O

O P

O

O

O-

ON

+

O

NH

NO

N

N+O

-

O

Abbildung 1.25: Mit Nitrobenzoxadiazol markiertes Monooleylphosphatidylcholin; Anre-gung: 464 nm, Emission: 531 nm; C38H64N5O11P; 797,92 g/mol.[183]

58 1. Einleitung

1.2.4 Herstellungsmethoden

Für die Herstellung von Liposomen existiert eine Vielzahl von Methoden, die ihre Vor- und

Nachteile mit sich bringen. Kontrollierbarkeit der Größenverteilung und Einschlusseffizienz sind

wichtige Kriterien, die zu beachten sind.[196, 202]

Extrusion

Die eigentliche Herstellung der Liposomen erfolgt nach der Filmmethode, bei der die in organi-

schen Lösungsmittel gelösten Lipid unter Verdampfen der Flüssigkeit in einem Film an der Gefäß-

wand abgeschieden werden.[180] Die Hydratation des Films führt dann zur spontanen Bildung von

Liposomen (MLV’s). Die Extrusion durch Membranen mit definierter Porengröße verursacht

Scherkräfte, die die Liposomen zu SUV’s formen. Vorteil dieser Methode ist die gute Kontrollier-

barkeit des Liposomendurchmessers im Bereich der erhältlichen Extrusionsmembranen (50 – 400

nm). Nachteilig ist vor allen Dingen die relativ geringe Einschlusseffizienz für hydrophile Stoffe.

Diese müssen im hydratisierenden Medium enthalten sein und werden in der Regel nur zu wenigen

Prozent eingeschlossen.[203] Lipophile Stoffe können bereits bei der Filmbildung zugegeben werden

und Einschlusseffizienzen von bis zu 50% erreichen. Im Labormaßstab lässt sich diese Methode

schnell und leicht anwenden.

Ultraschall

Durch Filmbildung hergestellte MLV’s können auch durch Ultraschall geformt werden.[204] Die

Beschallung verursacht im Medium kleine Kavitäten, die Scherkräfte aufbauen und dadurch die

Liposomen formen. Abhängig von Dauer und Intensität der Beschallung können SUV’s im Bereich

um 100 nm erreicht werden. Die Einschlusseffizienzen dieser Methode decken sich mit der Extrusi-

on. Die Kontrolle der Größe ist jedoch nicht so gut zu steuern. Vorteilhaft ist ein geringerer Auf-

wand. Da aber für eine adäquate Beschallung eine Ultraschallnadel verwendet werden muss, wird

die Probe mit Abrieb derselben verunreinigt, der sich allerdings durch Zentrifugation von den Lipo-

somen trennen lässt.

Duale asymmetrische Zentrifugation

Ein relativ neues Verfahren stellt die duale asymmetrische Zentrifugation (DAC) dar.[152] Mit ihr

kann die gewünschte Lipidkomposition direkt eingewogen und mit einer geringen Menge an Medi-

um durch DAC zu einem so genannten vesicular phospholipid gel (VPG) verarbeitet werden. Hohe

Scherkräfte während der Zentrifugation sorgen auch hier für die Bildung der Vesikel. Die eigentli-

che Formung der Liposomen erfolgt durch Verdünnung des VPG. Vorteile dieser Methode sind

1. Einleitung 59

geringer Aufwand und hohe Einschlusseffizienzen (um 50% für hydrophile Stoffe), da das Verhält-

nis zwischen Medium und Lipidmenge bei der Formung der Vesikel wesentlich geringer ist als bei

der Filmmethode, sowie eine Vergrößerungsmöglichkeiten der Ansätze. Ein Nachteil ist eine nur

schlechte Kontrolle der Größe und damit einhergehende breitere Verteilung der Liposomenpopula-

tion.[205]

Weitere Methoden

Weitere Methoden zur Herstellung von SUV’s sind Ethanol-Injektion,[206] Hochdruckhomogenisati-

on,[207] Detergenz-Verdünnung durch Dialyse[208] und reverse phase evaporation.[209]

Bei ersterer Methode wird eine Lipid-Lösung in Ethanol schnell in eine wässrige Phase injiziert.

Die gebildeten Vesikel befinden sich im Bereich von 30 bis 110 nm und können Einschlusseffizien-

zen um 40% erreichen.[210] Allerdings müssen große Mengen an Ethanol aus der Präparation ent-

fernt werden.

Hochdruckhomogenisation von MLV’s liefert SUV’s zwischen 30 und 50 nm. Die gebildeten Lipo-

somen zeigen jedoch für gewöhnlich eine hohe Polydispersität. Dafür lässt das Verfahren große

Ansätze in kurzer Zeit zu.

Bei der Detergenz-Verdünnung durch Dialyse werden zunächst Lipide und Detergenz miteinander

gemischt und durch Beschallung Mischmizellen gebildet. Durch das Entfernen des Detergenz durch

Dialyse bilden sich Liposomen um 200 nm. Einschlusseffizienzen können kleine zweistellige Pro-

zente erreichen.[208, 211] Ein Nachteil der Methode ist, dass das Detergenz durch Dialyse nicht voll-

ständig entfernt werden kann.

Die reverse phase evaporation bildet aus einer Mischung von wässrigem und organischem Medi-

um, in der inverse Mizellen aus Lipiden enthalten sind, durch Verdampfen des organischen Lö-

sungsmittels Liposomen. Mit abnehmender organischer Phase invertieren die inversen Mizellen um

die wässrige Phase herum und schließen diese ein. Bis zu 65% Einschlusseffizienz kann dadurch

erreicht werden.[209] Eine hohe Dispersität der Liposomenpopulation und Kontakt der einzuschlie-

ßenden Substanzen mit organischen Lösungsmitteln sind Nachteile dieser Methode.

Aktives Beladen

Für einige in Liposomen einzuschließende Substanzen bietet gegenüber dem passiven Einschluss

während der Herstellung ein so genanntes aktives Beladen nach Fertigstellung der Liposomen an.

Werden die Liposomen nach der Herstellung durch Pufferaustausch in ein anderes Medium ge-

bracht, so dass über ihre Membran ein Ionen-[212] oder pH-Gradient[213] entsteht, so können Mole-

küle von geeigneter Ladung oder Säure-Basenverhalten die Membran auf Kosten dieses Gradienten

60 1. Einleitung

überqueren, sofern sie lipophil genug sind, und werden im Liposomeninneren eingefangen (s. Abb.

1.26).[214] Mit dieser Methode lassen sich Einschlusseffizienzen von über 90 % für hydrophile Stof-

fe erreichen. Allerdings ist steht sie nicht jeder Substanz offen.[215]

O O

O

OH OH

OH

O OH

O

O

OH

NH2

O O

O

OH OH

OH

O OH

O

O

OH

NH3+

Liposomenmembranbasicher pH neutraler pH

Abbildung 1.26: Aktive Beladung von Doxorubicin (pKS-Amin = 8,6). Außerhalb des Lipo-soms ist Doxorubicin im Basischen deprotoniert und kann die Membran passieren. Durch Protonierung im Inneren wird Doxorubicin im Liposom gefangen.

Vektorisierung

Für einen zielgerichteten Liposomen-Transport in ZNS ist ein Vektor nötig. Wie Bereits erwähnt (s.

Abschnitt 1.2.2) bieten sich für einen solchen Zweck mehrere Vektoren an. Der Prozess der Vekto-

risierung sei an dieser Stelle für kationisiertes Rinderserum-Albumin (cBSA) als ein Beispiel für

einen ZNS-Vektor dargestellt.

Von Seiten des Liposoms erfolgt die Vektorisierung über funktionalisierte Lipide die mit ihrem

Partner an dem Vektormolekül eine kovalente Bindung eingehen. Als einfach zu handhaben und in

guter Ausbeute und Selektivität reagierend hat sich ein mit einem Maleimid funktionalisiertes Lipid

erwiesen (vgl. Abb. 1.21). Durch Reaktion mit einer freien Thiolgruppe an cBSA entsteht eine sta-

bile Thioether-Bindung zwischen Liposom und Vektor (s. Abb. 1.27).

NDSPE-PEG(2000)

O

O

+ SH cBSAN

DSPE-PEG(2000)O

OH

ScBSA

Abbildung 1.27: Kopplungsreaktion zwischen cBSA und DSPE-PEG(2000)-MI am Lipo-som.

In nativer Form enthält Rinderserum-Albumin 35 Cysteine, von denen 17 in Disulfidbrücken ge-

bunden sind (s. Anhang B). Um sicherzustellen, dass genügend freie Thiolgruppen zur Kopplung

1. Einleitung 61

zur Verfügung stehen, können durch verschieden Reagenzien weitere Thiolgruppen eingeführt wer-

den. Ein bewährtes Reagenz, das eine Acetat geschützte Thiolgruppe einführt, die sich bei Bedarf

mit Hydroxylamin entschützen lässt, ist N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetat (SATA).[216] Es reagiert

mit einer Aminogruppe des cBSA unter Bildung einer Amidbindung (s. Abb. 1.28).

NH2cBSA +O

N

O

O

O

S

O

SATA

N

O-

OO+NHcBSA

O

S

O

Abbildung 1.28: Reaktion von SATA mit einer Aminogruppe von Albumin.

Bevor cBSA thioliert werden kann, muss es aus nativem Rinderserum-Albumin (BSA) hergestellt

werden. Durch Aktivierung von Carbonsäuren in BSA durch ein wasserlösliches Carbodiimid, wie

1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), und anschließende Reaktion mit Ethylendi-

amin, lässt sich aus einer bei physiologischem pH negative funktionellen Gruppe eine positive ma-

chen (s. Abb. 1.29).[217]

BSA OH

O

NH2

NH2+BSA NH

O

NH2

EDAC

Abbildung 1.29: Kationisierung von Albumin.

Thiolierung und Kopplung von anderen Proteinen zum ZNS-Transport, wie Transferrin oder Apoli-

poprotein E, oder gänzlich anderen Vektoren für andere Zielgewebe können nach analogem Schema

durchgeführt werden.

62 1. Einleitung

1.2.5 Charakterisierungsmethoden

Durchmesser und Zetapotential von Liposomen sind für die Verweildauer im Blutkreislauf und die

Aufnahme durch adsorptive Endozytose von essentieller Bedeutung.[40] Hohe Zetapotentiale können

eine liposomale Dispersion außerdem auf Grund der elektrostatischen Abstoßung stabilisieren.[218]

Bestimmung des hydrodynamischen Radius

Eine mögliche Methode der Größenbestimmung von Liposomen stellt die dynamische Lichtstreu-

ung (DLS) oder Photonen Korrelationsspektroskopie (PCS) dar. Dabei wird die von den Liposomen

verursachte Lichtstreuung gemessen und über die Zeit korreliert. Dadurch lässt sich der Diffusi-

onskoeffzient berechnet und nach Gleichung 1.1 der hydrodynamische Radius. Je kleiner die Lipo-

somen sind desto schneller diffundieren sie und desto schneller verändert sich die Lichtstreuung (s.

Abb. 1.30).

B

0

k TD

6πηR=

Gleichung 1.1: Stokes-Einstein-Gleichung

D = Diffusionskoeffizient [m²/s]

kB = Boltzmann-Konstante [J/K]

T = Temperatur [K]

η = Viskosität des Mediums [Ns/m²]

R0 = hydrodynamische Radius

Abbildung 1.30: Veränderungen der Lichtstreuung für große und kleine Partikel.

1. Einleitung 63

Bestimmung des Zetapotentials

In einem wässrigen System orientieren sich Wasser und gelöste Teilchen an der Liposomenoberflä-

che an dessen Ladungsträgern. Dadurch tragen sie zur Gesamtladung des Liposoms bei. Je näher

sich ein Teilchen an der Oberfläche des Liposoms befindet umso stärker ist es an dieses gebunden

und folgt den Bewegungen des Liposoms durch das Medium. Die Schicht an der die Teilchen dem

Liposom gerade nicht mehr folgen nennt man Scherebene. Das elektrische Potential an dieser

Schicht ist das Zetapotential (s. Abb. 1.31). Es ist abhängig von pH und Ionenstärke des Mediums.

Abbildung 1.31: Schematische Darstellung des Zetapotentials.

Gemessen werden kann das Zetapotential durch die Frequenzverschiebung von Laserlicht an Parti-

keln, die sich in einem angelegten elektrischen Feld bewegen (s. Abb. 1.32). Dabei bewegen sich

die Liposomen in einer Geschwindigkeit in Richtung der entgegen zu ihrem Zetapotential gelade-

nen Elektrode, die proportional vom Betrag des Zetapotentials abhängt. Die von den Liposomen

verursachte Verschiebung der Frequenz des Laserlichts kann in ihre Mobilität umgerechnet werden.

Diese wiederum erlaubt, bei Kenntnis über die Viskosität des Medium, durch die Smoluchowski-

oder Hückel-Theorie eine Bestimmung des Zetapotentials.[218]

64 1. Einleitung

Abbildung 1.32: Schematische Darstellung des Messprinzips zur Bestimmung des Zetapo-tentials.

1. Einleitung 65

1.3 Zielsetzung der Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Hirngängigkeit von liposomalen Konjugaten mit kationisiertem

Rinderserum-Albumin (cBSA) in vivo an Ratten getestet werden. Dazu sollte zunächst die Aufnah-

me der Liposomen in Hirnkapillar-Endothelzellen aus dem Schweinehirn (PBCEC) aus vorherigen

Arbeiten reproduziert und mit der für Liposomen, die mit Transferrin bzw. dem Rezeptor bindenden

Peptidfragment von Apolipoprotein E verknüpft sind, verglichen werden. Mit Augenmerk auf ge-

eignete Herstellungsmethoden sollte eine reproduzierbare liposomale Formulierung im Labormaß-

stab zur Experimentation etabliert und charakterisiert werden. Dabei sollten Größe, Zetapotential,

Freisetzungseigenschaften und Stabilität betrachtet werden. Die Herstellung von cBSA sollte aus

vorherigen Arbeiten übernommen und in Hinblick auf Arbeitsaufwand, Ertrag und Lagerungsstabi-

lität erweitert werden.

Die Untersuchungen an PBCEC sollten sowohl Konzentrations- als auch Zeitabhängigkeiten der

verschiedenen liposomalen Konjugate darstellen. Durch Experimente mit Endozytose-Inhibitoren

sollte Aufschluss über den Mechanismus der Aufnahme erlangt werden. Ferner war eine Einschät-

zung der Zytotoxizität gefordert.

Für die Analyse der liposomalen Verteilung in vivo wurde die Anfertigung von Gefrierschnitten und

deren fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung gewählt. Neben dem Gehirn sollten auch Leber

und Milz untersucht werden, um Aufschluss über den Verbleib der Liposomen zu geben. Um einen

Eindruck über die Verweildauer der Liposomen im Blut und im Gewebe zu bekommen wurden Ex-

perimente über verschiedene Zeiträume geplant.

2. Material und Methoden 69

2. Material und Methoden

2.1 Chemikalien und Lösungen

Das für diese Arbeit verwendete Wasser wurde durch zweifache Destillation in der abteilungseige-

nen Destille hergestellt und wird im Folgenden als ddH2O bezeichnet.

Chemikalien

Bezeichnung Hersteller Reinheitsgrad

1,2-Dipalmityl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin-N-(lissamin-rhodamin-B-sulfonyl) Ammoniumsalz (DPPE-RH)

Avanti Polar Lipids, Inc. > 99%

1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-N-[maleimid(polyethylen-glykol)-2000] Ammoniumsalz (DSPE-PEG-MI)

Avanti Polar Lipids, Inc. n.a.

1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin-N-[methoxy(polyethylen-glykol)-2000] Natriumsalz (DSPE-MPEG)

Lipoid GmbH n.a.

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES)

AppliChem GmbH ≥ 99,5%

2-Methylbutan AppliChem GmbH ≥ 99%

5(6)-Carboxyfluorescein (CF) Serva Electrophoresis GmbH rein

5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 98%

Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung Roth GmbH & Co KG 30 % (w/v)

alamarBlue® Life Technologies GmbH n.a.

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Grüssing GmbH 99%

Bio-Lyte® Ampholytlösung pH 3/10 BioRad Laboratories GmbH 40 % (w/v)

Bromphenolblau (BPB) Natriumsalz Roth GmbH & Co KG n.a.

Calcliumdichlorid Dihydrat AppliChem GmbH 99,5%

Chloroform zentrale Versorgung der Univerisät ≥ 99%

Cholesterol Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 99%

Collagen G Biochrom AG 4 mg/mL

Collagenase/Dispase® aus Vibrio

alginolyticus/Bacillus polymyxa Roche Diagnostics GmbH n.a.

Coomassie® Brillant Blue R250 Sigma-Aldrich Chemie GmbH ~ 50%

Crocein Scarlet 7B Sigma-Aldrich Chemie GmbH ~ 70%

70 2. Material und Methoden

D(+)-Glucose Merck KGaA f. biochem.

Zwecke

Dansylcadaverin Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 97%

Dextran from Leuconostoc mesenteroides Sigma-Aldrich Chemie GmbH n.a.

Dimethylsulfoxid (DMSO) J.T. Baker ≥ 99%

Dinatriumethylendiamintetraacetat Di-hydrat

Roth GmbH & Co KG ≥ 99%

Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat AppliChem GmbH ≥ 99,5%

Dispase® from Bacillus polymyxa Becton Dickinson GmbH n.a.

Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 99%

DMEM/Ham's F12 Biochrom AG n.a.

Earle's Medium 199 Biochrom AG n.a.

Earle's Medium 199 10fach Sigma-Aldrich Chemie GmbH n.a.

Earle's Salzlösung Biochrom AG n.a.

Essigsäure J.T. Baker 99-100%

Ethanol zentrale Versorgung der Univerisät 99%

Ethylendiamin Dihydrochlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH 98%

Filipin complex aus Streptomyces

Filipinensis Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 70%

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Isomer I Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 90%

Glycerol J.T. Baker ≥ 99,5%

Glycin AppliChem GmbH ≥ 99,5%

Hydroxylamin Hydrochlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 99%

IEF Mix 3,6 - 9,3 Sigma-Aldrich Chemie GmbH n.a.

Isopropanol zentrale Versorgung der Univerisät 99,9%

Kaliumchlorid AppliChem GmbH ≥ 99,5%

Kaliumdihydrogenphosphat Grüssing GmbH 99,5%

Kanamycin Biochrom AG 5 mg/mL

Kupfersulfat Pentahydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH 99,5%

L-Cystein Hydrochlorid Monohydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 99%

L-Glutamin Biochrom AG 200 mM

Magnesiumdichlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 98%

Magnesiumsulfat Heptahydrat Grüssing GmbH 99%

Methanol VWR International GmbH 99,8%

Mikro-BCA™-Reagenz A Thermo Fisher Scientific n.a.

Mikro-BCA™-Reagenz B Thermo Fisher Scientific n.a.

Mikro-BCA™-Reagenz C Thermo Fisher Scientific n.a.

Mowiol 4-88 Roth GmbH & Co KG n.a.

2. Material und Methoden 71

N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH 99%

NaCl-Lösung Braun AG 0,9%

Natriumacetat Merck KGaA ≥ 99,5%

Natriumchlorid AppliChem GmbH ≥ 99,5%

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva Electrophoresis GmbH ≥ 99%

N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydro-chlorid (EDAC)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH n.a.

Neugeborenen Kälberserum Biochrom AG n.a.

N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SA-TA)

AppliChem GmbH ≥ 99%

Penicillin/Streptomycin Biochrom AG 10 mg/mL

Percoll™-Lösung, ρ 1,130 g/mL GE Healthcare GmbH n.a.

Phenylarsinoxid Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 97%

Phosphatidylcholin aus dem Eidotter (EPC)

Lipoid GmbH ~ 80%

Puromycin from Streptomyces alboniger Sigma-Aldrich Chemie GmbH > 98%

Rattenschwanz-Collagen Roche Diagnostics GmbH n.a.

Rinder-Serumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH ≥ 96%

Rinder-Serumalbumin Fluoresceinisothio-cyanat Konjugat (FITC-BSA)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH n.a.

Transferrin, humanes Holoenzym, Fe-gesättigt

ICN Biomedicals, Inc. n.a.

Triethylentetramin Monohydrat (TETA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH 98%

Trifluoressigsäure (TFA) Merck KGaA ≥ 98%

Trinatriumcitrat Dihydrat Sigma-Aldrich Chemie GmbH 99,5%

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)

Roth GmbH & Co KG ≥ 99%

Triton X-100 Roth GmbH & Co KG reinst

Trypanblau Life Technologies GmbH 0,4 %

Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich Chemie GmbH 0,25%

Wasser für HPLC VWR International GmbH n.a.

Zitronensäure Monohydrat J.T. Baker 99%

72 2. Material und Methoden

Puffer und Lösungen

Bezeichnung Bestandteile Konzentration

Acetat-Quench-Puffer pH 4,75 NaCH3COO 4 M

Aufnahmepuffer (AP) pH 7,4 HEPES 15 mM

NaCl 103 mM

KCl 4,7 mM

CaCl2·2H2O 2,5 mM

KH2PO4 1,2 mM

MgSO4·2H2O 1,2 mM

Glucose 10 mM

Dextran-Lösung Earle's Salzlösung

NaHCO3 26,2 mM

Dextran 18 % (w/v)

Endosomenpuffer (EP) pH 6 NaCl 133,5 mM

KH2PO4 5,9 mM

Na2HPO4·2H2O 8,1 mM

FITC-Puffer (FP) pH 9 Na2HPO4·2H2O 150 mM

IEF-Färbelösung Isopropanol 25 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

Coomassie Blue 0,04 % (w/v)

Crocein Scarlet 0,05 % (w/v)

CuSO4·5H2O 0,5 % (w/v)

IEF- Entfärbelösung I Isopropanol 12,5 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

CuSO4·5H2O 0,5 % (w/v)

IEF- Entfärbelösung II Isopropanol 25 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

serumfreies Medium DMEM/Ham's F12

L-Glutamin 4,1 mM

Penicillin/Streptomycin (10mg/mL)

1 % (v/v)

Kanamycin (5mg/mL) 1 % (v/v)

Kulturmedium Präparationsmedium

Neugeborenen Kälberserum 10 % (v/v)

2. Material und Methoden 73

Lysosomenpuffer (LP) pH 4,5 NaCH3COO 1 mM

CH3COOH 1,8 mM

KCl 30 mM

NaCl 120 mM

Mowiol-Einbettmedium TRIS 150 mM

Glycerin 22,5 % (w/v)

Mowiol 4-88 9 % (w/v)

Posphat-gepufferte Salzlösung (PBS) NaCl 135 mM

pH 7,4 KCl 3 mM

Na2HPO4·2H2O 8 mM

KH2PO4 1,5 mM

PBS++ pH 7,4 PBS

MgCl2 0,5 mM

CaCl2·2H2O 0,9 mM

PAGE-Elektrophoresepuffer TRIS 25 mM

Glycin 190 mM

SDS 1% (w/v)

PAGE-Entfärbelösung Methanol 40 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

PAGE-Färbelösung Methanol 40 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v)

Coomassie Blue 0,1 % (w/v)

PAGE-Probenpuffer pH 8 TRIS 100 mM

DTT 5 mM

SDS 10 % (w/v)

BPB 0,2 % (w/v)

Glycerin 50 % (v/v)

PAGE-Sammelgelpuffer pH 6,8 TRIS 0,5 M

PAGE-Trenngelpuffer pH 8,8 TRIS 1,5 M

Percoll-Lösung ρ 1,03 g/mL PBS

Percoll™-Lösung 18 % (v/v)

Earle's Medium 199 10fach 2 % (v/v)

Percoll-Lösung ρ 1,07 g/mL PBS

Percoll™-Lösung 54 % (v/v)

Earle's Medium 199 10fach 6 % (v/v)

Phosphatpuffer für Zetapotential- KH2PO4 50 mM

Messungen (PPZ) pH 7,4

74 2. Material und Methoden

Präparationsmedium Earle's Medium 199

NaHCO3 26,2 mM

L-Glutamin 0,7 mM

Penicillin/Streptomycin (10mg/mL) 1 % (v/v)

Kanamycin (5mg/mL) 1 % (v/v)

saurer Waschpuffer (SWP) pH 3 Zitronensäure·H2O 26 mM

Na3Citrat·2H2O 9,2 mM

NaCl 90,1 mM

KCl 30 mM

Sulfhydrierungspuffer (SP) pH 7,4 HEPES 10 mM

Na2EDTA·2H2O 2 mM

NaCl 150 mM

Thiolgruppennachweis-Puffer (TNP) pH 8 Na2HPO4·2H2O 100 mM

Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Details Hersteller

Adhesionsobjektträger Superfrost® Plus Thermo Fisher Scientific

Deckgläser 24 x 24 mm Roth GmbH & Co. KG

Deckgläser 25 x 50 mm Roth GmbH & Co. KG

Einbettmedium Jung, für Gefrierschnitte Leica Microsystems GmbH

Einfrierröhrchen Cryo.S™, PP Greiner Bio-One GmbH

GelBond PAG Gel-Support-Film BioRad Laboratories GmbH

Glaskugeln ø 0,75-1 mm Roth GmbH & Co. KG

Glaskugeln ø 1,25-1,55 mm Roth GmbH & Co. KG

Glaskugeln ø 3 mm Sigma-Aldrich Chemie GmbH

HPLC-Säule Acclaim® 120, c18 5µm, 120 Å, 4,6 x 250 mm

Dionex Corporation

Kanülen 20G, 22G & 25G Becton Dickinson GmbH

Klingenroller Edelstahl WMF AG

Kulturflaschen 175 cm² & 75 cm² Corning Costar

Kulturplatte 96 Vertiefungen Corning Costar

Microvetten® 100 LH, Li-Heparin Sarstedt AG & Co.

Mikroskopie-Schale 35,0/10 mm Glasboden Greiner Bio-One GmbH

Nylongaze Siebgewebe 180 µm Heidland

Objektträger 76 x 26 mm Roth GmbH & Co. KG

2. Material und Methoden 75

Plastikküvetten Rotilabo® , PS Roth GmbH & Co. KG

Polycarbonatmembranen Porengröße 50/100/200/400 nm Avestin Europe GmbH

Polyethylenfritten ø 0,5 & 2 cm Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Quarzglasküvette Suprasil® Hellma GmbH & Co. KG

Sephadex™ G50 Fine GE Healthcare GmbH

Sepharose® CL-4B Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Spritzen 1 mL Becton Dickinson GmbH

Sterilfilter 0,22 µm, PS Corning Costar

Transwell-Platte 12 Vertiefungen, Polycarbonat Corning Costar

Zählkammer Neubauer improved bright line Paul Marienfeld GmbH & Co. KG

Zentrifugalfilter Amicon® Ultra 15, 30 kDa Merck Millipore

Zetapotential-Küvette gefaltete Kapillare mit Cu-Elektroden Malvern Instruments Ltd.

Zwangröhre Kunststoff-Maßanfertigung Feinmechanik, Universität

Heidelberg

Geräte

Bezeichnung Gerät Hersteller

111 Mini IEF Cell Elektrophoreseapparatur BioRad Laboratories GmbH

150 FVZ Duale asymmetrische Zentrifuge Hauschild GmbH & Co. KG

(DAC)

5415D Tischzentrifuge Eppendorf

ALC 4237R Zentrifuge Apparecchi per Laboratori

Chimici

AQUAline AL25 Wasserbad Lauda Dr. R Wobser GmbH &

Co. KG

CellZscope TEER-Messgerät nanoAnalytics GmbH

CM3050 S Kryostat Leica Microsystems CMS

GmbH

Cytoperm 2 Brutschrank Heraeus Holding GmbH

Delta 1-20 KD Gefriertrockner Christ

Fluoroscan Ascent Fluoreszenz-Plattenleser Thermo Fisher Scientific

Fluotest Universal UV-Lampe Original Hanau

HeraSafe HS 15 Sterilwerkbank Heraeus Holding GmbH

76 2. Material und Methoden

HTU Soni 130 Ultraschallgenerator Heinemann Labortechnik

LiposoFast-Basic Extruder Avestin Europe GmbH

Mini Protean 3 Cell Elektrophoreseapparatur BioRad Laboratories GmbH

Power Pac 1000 Spannungsquelle BioRad Laboratories GmbH

Sorvall® Superspeed RC2-B Kühlzentrifuge Sorvall, Inc.

Sunrise Vis-Photometrie-Plattenleser Tecan

Systec VX-95 Autoklave Systec GmbH

TCS SP5 X konfokales Fluoreszenz- Leica Microsystems CMS

mikroskop GmbH

UltiMate 3000 HPLC-Anlage Dionex Corporation

Universal 16-R Tischzentrifuge Hettich Zentrifugen

UV-mini 1240 UV-Vis-Spektralphotometer Shimadzu Deutschland GmbH

Zetasizer Nano ZS Partikelanalysator Malvern Instruments Ltd.

2. Material und Methoden 77

2.2 Herstellung von kationisiertem Albumin

2.2.1 Kationisierung von Rinder-Serumalbumin

Rinder-Serumalbumin (BSA) wurde in abgewandelter Form nach der von Hoare[217] beschriebenen

Methode hergestellt. Dazu wurden zu 40 mL Ethylendiamin-Lösung

(3 M, pH 4,75) 8 mL BSA-Lösung (PBS, 5 mM) und 0,18 g N-Ethyl-N′-(3-

dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochloride (EDAC) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde

für 2 h gerührt und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 650 µL Acetat-Quench-Puffer

gestoppt. Während der Reaktion wurde alle 30 min der pH-Wert überprüft und gegebenenfalls auf

4,75 eingestellt.

Zur Abtrennung nicht reagierten Ethylendiamins und zur Aufkonzentrierung des kationisierten Al-

bumins (cBSA) wurde die gequenchte Reaktionsmischung durch Größenausschlussfilter (Amicon®

Ultra 15, 30 kDa MWCO, Merck Millipore) bis zur Volumenkonstanz zentrifugiert (2000 g, RT,

ALC 4237R). Da Ethylendiamin bei der Sulfhydrierung mit cBSA konkurriert wurde die konzent-

rierte cBSA-Lösung zweimal mit je 50 mL PBS gewaschen und erneut aufkonzentriert. Die Kon-

zentration der erhaltenen cBSA-Lösung wurde durch UV-Vis-Messung (s. Abschnitt 2.3.3) be-

stimmt. Die Unversehrtheit des Proteins und das Ausmaß der Kationisierung wurden durch SDS-

PAGE (s. Abschnitt 2.3.1) bzw. isoelektrische Fokussierung überprüft (s. Abschnitt 2.3.2).

2.2.2 Sulfhydrierung von kationisiertem Albumin

Zur Einführung von Acetat geschützten Thiolgruppen wurde eine Lösung von cBSA (SP, 0,5 mM)

mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA)[216] (Endkonzentration 2,5 bis 5 mM, DMSO) ver-

setzt und über Nacht (min. 16 h) gerührt. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurde die Reakti-

onsmischung durch Größenausschlussfilter (Amicon Ultra 15, 30 kDa MWCO, Merck Millipore)

bis zur Volumenkonstanz zentrifugiert (2000 g, RT, ALC 4237R) und mit 50 mL PBS gewaschen.

Die Proteinkonzentration wurde durch BCA-Test (s. Abschnitt 2.3.3) und die Anzahl der Thi-

olgruppen pro Protein durch Ellman-Test[219] (s. Abschnitt 2.3.4) bestimmt. Zur späteren Verwen-

dung wurde die Proteinlösung mit ddH2O auf eine Konzentration von 0,5 mM verdünnt und ge-

friergetrocknet (s. Abschnitt 2.2.4).

78 2. Material und Methoden

2.2.3 Fluoreszenzmarkierung von kationisiertem Albumin

Zur Bestimmung der Kopplungseffizienz von cBSA mit Liposomen wurde mit Fluoresceinisothio-

cyanat (FITC) markiertes cBSA (FITC-cBSA) verwendet. Für die Markierung wurde einer cBSA-

Lösung (FP, 50 µM) eine FITC-Lösung (FP, 250 µM) über einen Zeitraum von 30 min zugetropft.

Im Anschluss wurde das Gemisch für 1 h gerührt und dann durch Größenausschlussfilter (Amicon

Ultra 15, 30 kDA MWCO, Merck Millipore) bis zur Volumenkonstanz zentrifugiert (2000 g, RT,

ALC 4237R). Um nicht reagiertes FITC zu entfernen, wurde die Lösung zweimal mit jeweils 50

mL PBS gewaschen und erneut aufkonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde durch BCA-Test

(s. Abschnitt 2.3.3) bestimmt und die Lösung zur späteren Verwendung mit ddH2O auf eine Kon-

zentration von 0,5 mM verdünnt und gefriergetrocknet (s. Abschnitt 2.2.4).

2.2.4 Gefriertrocknung

Zur Langzeitlagerung wurde cBSA auf eine Konzentration von 0,5 mM mit ddH2O verdünnt und

gefriergetrocknet (Delta 1-20 KD, Christ). Die bei −20°C eingefrorene Proteinlösung wurde bei

−20°C und 0,1 mbar über mindestens 24 h getrocknet. Die Nachtrocknung wurde bei 10°C und ei-

nem Sicherheitsdruck von 0,63 mbar über mindestens 16 h durchgeführt. Nach Abschluss der

Trocknung wurden die Lyophilisate unter Argon-Schutzatmosphäre verschlossen und bis zur weite-

ren Verwendung bei −20°C gelagert. Vor Gebrauch wurde das Lyophilisat in einem Zehntel des

ursprünglichen Volumens an PBS rekonstituiert um eine

5 mM Proteinlösung zu erhalten.

2. Material und Methoden 79

2.3 Charakterisierung von kationisiertem Albumin

2.3.1 Batriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

Mithilfe der SDS-PAGE wurde nach der Kationisierung bzw. der Sulfhydrierung von BSA über-

prüft ob am Protein signifikante Größenänderungen stattgefunden haben. Es wurden Gele mit 13%

Polyacrylamid verwendet.

Gelherstellung

Die Glasplatten mit Abstandhalter wurden in der Gießkammer Mini Protean 3 Cell (BioRad) einge-

spannt, das Trenngel eingegossen und mit Isopropanol überschichtet. Das Trenngel wurde, wie in

Tabelle 2.1 angegeben, gemischt.

Tabelle 2.1: Zusammensetzung des Trenngels.

Trenngel 13,0% T, 1,1% C

Acrylamid-Lösung 4800 µL

PAGE-Trenngelpuffer 3720 µL

ddH2O 2460 µL

SDS-Lösung 10 % (w/v) 110 µL

TEMED 16 µL

APS-Lösung 10 % (w/v) 56 µL

Nach der vollständigen Polymerisation (ca. 30 min) des Trenngels wurde das Isopropanol entfernt,

das Sammelgel eingegossen und der Probenkamm eingeführt. Das Sammelgel wurde, wie in Tabel-

le 2.2 angegeben, gemischt.

Tabelle 2.2: Zusammensetzung des Sammelgels.

Sammelgel 4,0% T, 0,4% C

Acrylamid-Lösung 500 µL

PAGE-Sammelgelpuffer 930 µL

ddH2O 2260 µL

SDS-Lösung 10 % (w/v) 36 µL

TEMED 8 µL

APS-Lösung 10 % (w/v) 36 µL

80 2. Material und Methoden

Die APS-Lösung wurde immer zuletzt zugeben, um eine Polymerisation vor dem Einfüllen der Ge-

le zu vermeiden. Bis zur Verwendung wurden die fertigen Gele, ohne sie aus der Klammer oder den

Kamm zu entfernen, feucht bei 4°C gelagert.

Vorbereitung der Proben

5 – 15 µL der Proteinlösungen (20 µg Protein) wurden mit 5 µL PAGE-Probenpuffer vermischt, für

20 – 30 min bei 90°C im Heizblock inkubiert und mit einer Hamiltonspritze in die Probentaschen

gefüllt.

Elektrophorese

Die Elektrophorese wurde in der Apparatur Mini Protean 3 Cell (BioRad) mit PAGE-

Elektrophoresepuffer durchgeführt. Für den Sammelgelbereich wurde eine konstante Stromstärke

(Power Pac 1000, BioRad) von 20 – 25 mA eingestellt und sobald die Banden den Trenngelbereich

erreicht hatten auf 40 – 50 mA erhöht. Bei der gleichzeitigen Elektrophorese zweier Gele wurde die

Stromstärke verdoppelt. Die Elektrophorese wurde gestoppt, sobald die BPB-Front das Gelende

erreicht hatte. Um eine Diffusion der Protein-Banden aus dem Gel zu vermeiden wurden die Gele

direkt im Anschluss an die Elektrophorese fixiert und gefärbt.

Färbung und Fixierung

Für die Gelfärbung und -fixierung mit Coomassie Brillant Blau wurde das Gel in PAGE-

Färbelösung gelegt, kurz in der Mikrowelle zum Sieden erhitzt und für 10 – 20 min inkubiert. An-

schließend wurde das Gel aus der Färbelösung genommen und mit PAGE-Entfärbelösung so lange

entfärbt bis der gewünschte Kontrast zwischen Proteinbanden und Hintergrund erreicht war. Gege-

benfalls wurde die Entfärbelösung gewechselt.

2.3.2 Isoelektrische Fokussierung

Mit Hilfe der isoelektrischen Fokussierung wurde das Ausmaß der Kationisierung von BSA über-

prüft. Die Fokussierung wurde mit der 111 Mini IEF Cell (BioRad) durchgeführt.

Gelherstellung

Ein Gel-Support-Film für Polyacrylamidgele (GelBond PAG film, BioRad) wurde durch einige

Tropfen Wasser mit der hydrophoben Seite auf eine Glasplatte aufgebracht, das Schutzpapier ent-

fernt und die Glasplatte mit dem Film nach unten auf den Gießstand gelegt. Die Gellösung wurde

2. Material und Methoden 81

vorsichtig von einer Seite aus unter den Film pipettiert, wobei zu beachten war, dass keine Luftbla-

sen eingeschlossen wurden. Das Gel wurde für 1 h unter einer UV-Lampe (Fluotest Universal, Ori-

ginal Hanau) polymerisiert. Die Gellösung wurde, wie in Tabelle 2.3 angegeben, gemischt.

Tabelle 2.3: Zusammensetzung des IEF-Gels.

IEF-Gel 6,0% T, 0,5% C

Acrylamid-Lösung 1000 µL

Ampholyt-Lösung 250 µL

dd-H2O 3250 µL

GGlycerol 50% 500 µL

TEMED 3 µL

APS 10% 35 µL

Probenauftragung

2 µL der Proteinlösungen (20-40 µM ≡ 1-3 µg Protein) wurden vorsichtig auf das Gel pipettiert.

Vor dem Start der Fokussierung wurde 30 min gewartet, um das Diffundieren der Proteine in das

Gel zu garantieren.

Fokussierung

Das Gel wurde direkt auf den Graphitelektroden platziert, ohne die Glasplatte zu entfernen. Die

Fokussierung wurde bei konstanter Spannung (Power Pac 1000, BioRad) nach folgendem Schema

durchgeführt: 100 V (15 min), 200 V (15 min) und 500 V (1 h). Nach Ablauf des Programms wurde

der Film mitsamt Gel von der Glasplatte genommen, fixiert und gefärbt.

Fixierung und Färbung

Zur Fixierung und Färbung wurde das Gel für je 1 h in IEF-Färbelösung und IEF-Entfärbelösung I

inkubiert. Anschließend wurde das Gel solange in IEF-Entfärbelösung II eingelegt bis der ge-

wünschte Kontrast erreicht war. Gegebenenfalls wurde dazu die Entfärbelösung gewechselt.

82 2. Material und Methoden

2.3.3 Konzentrationsbestimmung

UV-Vis-Photometrie

Unter der Annahme, dass sich bei der Kationisierung und Thiolierung von BSA die Zusammenset-

zung der Aminosäuren nicht verändert, wurde die Konzentration von cBSA über eine Kalibiergera-

de von BSA bestimmt. Für die Kalibriergerade wurde ein Konzentrationsbereich von 0,75 bis 15

µM gewählt. Die Messung wurde bei 278 nm in einer Quarzglasküvette (Suprasil®, Hellma) durch-

geführt (UV-mini 1240, Shimadzu).

Bichinonsäure-Test

Für genauere Bestimmungen der Proteinkonzentration wurde der BCA™-Test gegenüber einer

BSA-Kalibriergerade durchgeführt. Für die Kalibriergerade wurde ein Konzentrationsbereich von

0,15 bis 3 µM gewählt. Je 100 µL der Proteinlösung wurden mit 900 µL BCA-Reagenz direkt in

Plastikküvetten (Rotilabo®, Roth) verdünnt und für etwa 30 min bei 60°C inkubiert. Das BCA-

Reagenz wurde, wie in Tabelle 2.4 angeben, gemischt.

Tabelle 2.4: Zusammensetzung des BCA-Reagenzes.

Mikro-BCA™-Reagenz A 25 Teile

Mikro-BCA™-Reagenz B 24 Teile

Mikro-BCA™-Reagenz C 1 Teil

Die spektralphotometrische Messung wurde bei 562 nm durchgeführt (UV-mini 1240, Shimadzu).

2.3.4 Bestimmung der freien Thiolgruppen

Die für die Kopplung von cBSA an Liposomen notwendigen Thiolgruppen wurden mittels Ellman-

Test[219] gegenüber einer Cystein-Kalibriergerade bestimmt. Für die Kalibriergerade wurde ein

Konzentrationsbereich von 0,1 mM bis 0,6 mM gewählt. Je 100 µL der Cystein- bzw. Proteinlösung

wurden direkt in Plastikküvetten mit 300 µL Dithiobisnitrobenzoesäure (DTNB) (TNP, 0,7 mM)

und 600 µL TNP verdünnt und für etwa 20 min inkubiert. Die Acetatschutzgruppe von cBSA wurde

zuvor durch Inkubation mit Hydroxylamin (Endkonzentration 90 mM) über etwa 20 min entfernt.

Die spektralphotometrische Messung wurde bei 412 nm durchgeführt (UV-mini 1240, Shimadzu).

2. Material und Methoden 83

2.4 Herstellung von cBSA-Liposomen-Konjugaten

2.4.1 Herstellung der Liposomen

Filmbildung

Für die Herstellung der Liposomendispersionen wurde zunächst ein Phospholipidfilm[180] erzeugt.

Dazu wurden die Lipide in Lösung (Chloroform/Methanol 9:1) gemischt und das Lösungsmittel

unter Stickstoffstrom bei 50°C verdunstet. Tabelle 2.5 gibt die Mischung der Lipide an. Bei An-

satzgrößen über 1 mL wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck bei 50°C abgedampft. Im

Anschluss wurden Lösungsmittelreste im Hochvakuum über 1 h entfernt. Die gebildeten Lipidfilme

wurden bei 4°C unter Stickstoffschutzatmosphäre bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

Tabelle 2.5: Zusammensetzung der Lipidmischung.

Lipid Anteil (mol-%) Anteil (w-%)

EPC 54 bis 55 -

Cholesterol 40 -

DSPE-MPEG 5 -

DSPE-PEG-MI 0 bis 1 -

DPPE-RH - 0 bis 1

Extrusion

Zu den Lipidfilmen wurde die Menge an Puffer zugegeben, um eine definierte Endkonzentration an

Lipiden zu erreichen. Substanzen, die in die Liposomen eingeschlossen werden sollten, wurden

zuvor in dem Puffer gelöst. Unter Zusatz einiger Glaskugeln (ø 3 mm) wurde die Mischung so lan-

ge gerührt bis sich der Lipidfilm komplett von der Wand des Reaktionsgefäßes gelöst hatte. Nach

einer Ruhephase von etwa 30 min wurde die Dispersion mittels eines Extruders (LiposoFast-Basic,

Avestin)[220] durch eine Polycarbonatmembran (Avestin) definierter Porengröße gepresst. Nach ei-

ner bestimmten Anzahl an Durchgängen wurde die Größe der Vesikel bestimmt (s. Abschnitt 2.5.1)

und gegebenenfalls die Extrusion fortgesetzt bis die gewünschte Vesikelgröße erreicht war. Gege-

benenfalls wurden nicht eingeschlossene Substanzen, wie unter Abschnitt 2.4.3 beschrieben, abge-

trennt. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Liposomendispersion bei 4°C aufbewahrt.

84 2. Material und Methoden

Ultraschall

Bis zum Erhalt der Liposomendispersion wurde wie bei der Extrusion verfahren. In einem Eisbad

wurde die Dispersion über 1 h in Intervallen von 30 s mit 130 Watt und 20 kHz mit anschließend 30

s Pause über eine Ultraschallnadel beschallt (HTU Soni 130, Heinemann Labortechnik). Die Nadel

wurde hierbei so platziert, dass sie gerade die Oberfläche der Dispersion berührte. Nach Abschluss

der Beschallung wurden gegebenenfalls nicht eingeschlossene Substanzen, wie unter Abschnitt

2.4.3 beschrieben, abgetrennt. Die Liposomendispersion wurde bis zur weiteren Verwendung bei

4°C gelagert.

Duale asymmetrische Zentrifugation

Die Lipidfilme wurden mit 100% ihrer Masse an Glaskugeln (ø 0,75-1,0 oder 1,25-1,55 mm) und

150% an Puffer versetzt. Substanzen, die in die Liposomen eingeschlossen werden sollten, wurden

zuvor in dem Puffer gelöst. Mit Hilfe der dualen asymmetrischen Zentrifuge[152] (DAC) (150 FVZ,

Hausschild) wurde die Mischung zentrifugiert (3540 rpm, 30 min, RT). Im Anschluss wurde das

entstandene vesikulare Phospholipidgel[205] mit 250% der ursprünglichen Masse an Puffer versetzt

und erneut zentrifugiert (3540 rpm, 30 s, RT). Der letzte Schritt wurde einmal wiederholt und die

dadurch entstandene Dispersion auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Bei Populationen über

200 nm wurden die Vesikel durch Behandlung mit Ultraschall, wie oben beschrieben, verkleinert.

Gegebenenfalls wurden nicht eingeschlossene Substanzen, wie unter Abschnitt 2.4.3 beschrieben,

abgetrennt. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Liposomendispersion bei 4°C aufbewahrt.

Charakterisierung der Liposomen

Größe und Zetapotential der Liposomen wurde im Partikelanalysator (Zetasizer Nano ZS, Malvern),

wie unter Abschnitt 2.5.1 und 2.5.2 beschrieben, bestimmt. Die Messung der Lipidkonzentrationen

erfolgte durch Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) (UltiMate 3000, Dionex), wie in Ab-

schnitt 2.5.3 angegeben.

2.4.2 Kopplung von cBSA und Liposomen

Gefriergetrocknetes cBSA wurde zu einer Konzentration von 5 mM in PBS rekonstituiert und die

Acetatschutzgruppe der eingeführten Thiolgruppen durch Zugabe von Hydroxylamin (Endkonzent-

ration 90 mM) und Inkubation für etwa 20 min entfernt. Frisch hergestellte oder maximal eine

Nacht bei 4°C unter Stickstoffschutzatmosphäre aufbewahrte Liposomen, die das Linkerlipid

Distearylphosphatidylethanolamin-polyethylenglykol-2000-maleimid (DSPE-PEG-MI) enthielten

2. Material und Methoden 85

wurden mit dem entschützten cBSA gemischt, so dass festgelegte Verhältnisse von cBSA zu DSPE-

PEG-MI erreicht wurden. Die Mischung wurde über Nacht (min. 16 h) inkubiert und im Anschluss

durch Größenausschlusschromatographie (SEC) von nicht angebundenem cBSA befreit (s. Ab-

schnitt 2.4.3). Größe und Zetapotential der Vesikel wurden vor und nach der Kopplung mit cBSA

bestimmt (s. Abschnitt 2.5.1 bzw. 2.5.2). Für die Bestimmung des Kopplungsgrades wurde mit

FITC markiertes cBSA verwendet.

Bestimmung des Kopplungsgrades

FITC-cBSA wurde wie oben beschrieben an Liposomen gekoppelt und anschließend nicht ange-

bundenes Protein durch SEC abgetrennt (s. Abschnitt 2.4.3). Die Fluoreszenz der liposomalen Dis-

persion wurde bei einer Anregungs- und einer Emissionswellenlänge von 485 bzw. 520 nm gemes-

sen (Fluoroscan Ascent, Thermo Fisher). Die cBSA-Konzentration wurde über eine Kalibrierung

mit FITC-cBSA bekannter Konzentration ermittelt. Die Lipidkonzentration wurde über HPLC er-

mittelt (s. Abschnitt 2.5.3) und mit der cBSA-Konzentration in Bezug gesetzt um den Kopplungs-

grad zu erhalten.

2.4.3 Aufreinigung liposomaler Dispersionen

Die Abtrennung von nicht in die Liposomen eingeschlossenen Substanzen oder zur Kopplung ein-

gesetztem Protein, das nicht kovalent gebunden hatte, wurde durch Größenausschlusschroma-

tographie (SEC) erreicht. Für kleinere Moleküle (z.B. Carboxyfluorescein, Triethylentetramin)

wurde Sephadex™ G50 Fine (GE Healthcare), für größere (z.B. cBSA, FITC-Dextran) Sepharose®

CL-4B (Sigma-Aldrich) verwendet. Das Säulenmaterial wurde vor der Verwendung etwa 20 min im

gewünschten Puffer quellen gelassen und anschließend bis zum gewünschten Volumen in die Säule

gefüllt. Am unteren und oberen Ende des Gelbettes wurden Polyethylenfritten (Sigma-Aldrich) ein-

gesetzt. Vor Beginn der Chromatographie wurde mit min. zehn Säulenvolumina (CV) an Puffer

äquilibriert. Die liposomale Dispersion wurde nach Elution in einer möglichst konzentrierten Frak-

tion gesammelt. Die Kontrolle erfolgte optisch durch die Trübung des Eluats durch die Liposomen.

Im Anschluss wurde die Säule mit zehn CV an Puffer gespült. Für längere Lagerzeiten wurde der

Puffer durch 20%iges Ethanol ersetzt.

86 2. Material und Methoden

2.4.4 Liposomale Konjugate mit weiteren Proteinen

Zu Vergleichszwecken wurden neben cBSA-Liposomen auch Liposomen mit BSA, Transferrin[170]

und einem Peptidfragment von Apolipoprotein E4[221] (ApoE), welches den Rezeptor bindenden

Teil enthält, hergestellt.

BSA-Liposomen

Für die Herstellung von BSA-Liposomen wurde BSA verwendet, welches wie unter Abschnitt 2.2.2

thioliert, aber zuvor nicht kationisiert, wurde. Alle weiteren Schritte erfolgten analog zur Herstel-

lung von cBSA-Liposomen.

Transferrin-Liposomen

Zur Anbindung an Liposomen wurden analog zu cBSA Thiolgruppen in humanes Holo-Transferrin

eingeführt (s. Abschnitt 2.2.2). Die Herstellung der Konjugate erfolgte ebenfalls analog zu cBSA.

Die Aufreinigung erfolgte über Sepharose®.

ApoE-Liposomen

Da das Peptidfragment von ApoE bereits eine freie Thiolgruppe enthielt, war eine Einführung der-

selben nicht notwendig. ApoE wurde analog zu cBSA an Liposomen gekoppelt, wobei der Aktivie-

rungsschritt mit Hydroxylamin entfiel, und über Sephadex aufgereinigt.

2. Material und Methoden 87

2.5 Charakterisierung liposomaler Dispersionen

2.5.1 Bestimmung des hydrodynamischen Radius

Für die Messung des hydrodynamischen Radius der Liposomen wurde der Zetasizer Nano ZS

(Malvern) verwendet. Die liposomale Dispersion wurde in Puffer auf eine Lipidkonzentration von

etwa 0,1 mM verdünnt und in Plastikküvetten vermessen. Die Messung wurde nach einer Inkubati-

onszeit von 2 min bei 25°C durchgeführt. Es wurden mindestens drei Messungen durchgeführt. Da-

bei wurde darauf geachtet, dass der Attenuator keinen größeren Wert als neun annahm. Gegebenen-

falls wurde die Lipidkonzentration erhöht und die Messung wiederholt.

2.5.2 Bestimmung des Zetapotentials

Das Zetapotential der Liposomen wurde mit Zetapotential-Küvetten im Zetasizer Nano ZS (Mal-

vern) bestimmt. Die liposomale Dispersion wurde in PPZ auf eine Lipidkonzentration von etwa 0,1

mM verdünnt, da Puffer mit zu hoher Salzkonzentration die Messelektroden zerstören. Die Mes-

sung wurde nach einer Inkubationszeit von 2 min bei 25°C durchgeführt. Es wurden mindestens

drei Messungen durchgeführt. Zwischen den Messungen wurde kontrolliert, ob sich Luftblasen ge-

bildet hatten und diese gegebenenfalls durch Klopfen entfernt. Bei Werten für den Attenuator grö-

ßer als neun wurde die Lipidkonzentration erhöht und die Messung wiederholt.

2.5.3 Bestimmung der Lipidkonzentration

Liposomale Dispersionen wurden zur Analyse 1:10 mit Methanol verdünnt, um die Liposomen zu

zerstören. Die Chromatographie wurde an der UltiMate 3000 (Dionex) mit dem Programm Chrome-

leon Client Version 6.80 durchgeführt. Vor Beginn der Chromatographie wurden die Proben auf

35°C erwärmt und jeweils 50 µL injiziert. Als Säule wurde eine Reversed-Phase-18 (Acclaim® 120,

c18, 5µm, 120 Å, 4,6 x 250 mm, Dionex) bei 45°C verwendet. Fließmittel waren bidestilliertes

Wasser, Methanol und Acetonitril, jeweils mit 0,05% Trifluoressigsäure versetzt, die in einem

mehrstufigen Gradienten (s. Abb. 1) gemischt wurden. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,2

mL/min, was einem Druck von etwa 90 bar entspricht. Das genaue Programm der Chromatographie

ist Anhang A zu entnehmen.

88 2. Material und Methoden

2.6 Kapillarendothelzellen aus dem Schweinehirn

2.6.1 Zellkulturbedingungen

Verbrauchsmaterialen wurden entweder einzelverpackt und steril vom Hersteller bezogen oder so-

fern möglich autoklaviert (30 min, 121°C, 2 bar, Systec VX-95). Sämtliche Glasgebinde und andere

Gebrauchsmaterialen wurden ebenfalls vor Verwendung autoklaviert. Puffer wurden mit ddH2O

hergestellt und durch Filtration (0,22 µm, Corning Costar) oder Autoklavieren sterilisiert. Für die

Herstellung von Lösungen wurde autoklaviertes ddH2O verwendet. Grundsätzlich wurden alle Ar-

beiten unter aseptischen Bedingungen an der Sterilwerkbank (HeraSafe HS15, Heraeus) nach direk-

ter Desinfektion mit 70%igem Ethanol durchgeführt. Für Inkubationszwecke wurde ein Brutschrank

(Cytoperm 2, Heraeus) verwendet, der alle sechs Monate einem Desinfektionsprogramm unterzogen

wurde. Das Anwärmen von Puffern und Medien erfolgte in einem Wasserbad (AQUAline AL25,

Lauda). Alle betreffenden Geräte und Räumlichkeiten wurden einmal im Monat gründlich gereinigt

und desinfiziert.

2.6.2 Zellisolation

Als in vitro Modell für die Blut-Hirn Schranke (BHS) wurden aus dem Schweinehirn isolierte Ka-

pillarendothelzellen (PBCEC) (s. Abschnitt 1.1.5) verwendet. Abbildung 2.1 gibt einen Überblick

über die Arbeitschritte der Isolation.

Vorbereitung

Am Vortag der Zellisolation wurden Präparations- und Kulturmedium sowie die Per-

coll™Lösungen unter der Sterilwerkbank (HeraSafe HS15, Heraeus) hergestellt. PBS und Dextran-

Lösung wurden nach der Herstellung autoklaviert (30 min, 121°C, 2 bar, Systec VX-95). Die Puffer

und Medien wurden bis zur Verwendung bei 4°C gelagert. 20 Kulturflaschen (175 cm², Corning

Costar) wurden mit je 2,5 mL Collagen G-Lösung (133 µg/mL, ddH2O) beschickt und über Nacht

bei 37°C im Brutschrank (Cytoperm 2, Heraeus) inkubiert.

Beschaffung und Transport

Schweinehirnhälften wurden vom Schlachthof (Fleischverarbeitungszentrum, Mannheim) direkt aus

dem Tier in 70%iges Ethanol eingelegt. Um Sterilität zu gewährleisten wurde darauf geachtet, dass

die Hirnhaut der entnommenen Hirnhälften noch intakt war und dass Reste der zweiten Hemisphäre

noch vorhanden waren. Nachdem 20 Hirnhälften gesammelt worden waren, wurden sie einmal mit

2. Material und Methoden 89

eiskaltem PBS + 2% Penicillin/Streptomycin gewaschen und auf Eis in selbigem transportiert. Vor

Ort wurden alle weiteren Arbeitsschritte unter der Sterilwerkbank (HeraSafe HS15, Heraeus)

durchgeführt.

Cortexpräparation

Die Hirnhälften wurden in frischen 4°C kalten PBS + 2% Penicillin/Streptomycin gegeben. Vor

dem weiteren Vorgehen wurden erneut die Unversehrtheit der Hirnhaut und das Vorhandensein der

zweiten Hemisphäre jeder einzelnen Hirnhälfte überprüft. Beschädigte Hirnhälften wurden entsorgt.

Daraufhin wurden die Reste der zweiten Hemisphäre und die gesamte Hirnhaut entfernt. Nach ei-

nem Waschschritt in PBS + 2% Penicillin/Streptomycin wurden nochmals alle Falten auf verblie-

bene Kapillaren der Hirnhaut untersucht und diese gegebenenfalls entfernt. Anschließend wurden

Stammhirn und limbisches System grob herausgeschnitten und der verbliebene Cortex mit einem

Klingenroller homogenisiert. Das Homogenat von 16 Hirnhälften wurde vereinigt und mit 37°C

warmem Präparationsmedium auf 750 mL aufgefüllt. Durch die Zugabe von 50 mL Dispase® wurde

der erste Verdau gestartet. Die Mischung wurde 2 h bei 37°C unter moderatem Rühren inkubiert.

Kapillarisolation

Nach Abschluss der Inkubationszeit wurden jeweils 100 mL des verdauten Hirnhomogenats mit

150 mL Dextran-Lösung gemischt und in Zentrifugenbecher überführt. Nach kräftigem Schütteln

erfolgte die Zentrifugation (6800 g, 10 min, 4°C, Sorvall® Superspeed RC2-B). Der sich ausbilden-

de, kontinuierliche Dichtegradient trennt die im Homogenat enthaltenen Kapillaren vom verdauten

Hirngewebe. Die Kapillaren befinden sich im tiefroten Niederschlag. Der Überstand wurde verwor-

fen und Reste des Hirngewebes sorgfältig aus dem Zentrifugenbecher entfernt, um Verunreinigun-

gen des Niederschlages zu vermeiden. Die Niederschläge wurden direkt in je 7 mL Präparationsme-

dium resuspendiert und mit je 1 mL nachgespült. Die Suspension wurde über Nylongaze (Poren-

größe 180 µm) filtriert und die Gaze mit max. 8 mL Präparationsmedium gewaschen. Das Filtrat

wurde in einem Becherglas min. fünfmal mit einer Pipette trituriert, um die Kapillarverbände zu

vereinzeln. Im Anschluss wurde mit Präparationsmedium auf 72 mL aufgefüllt und 8 mL Collage-

nase/Dispase®-Lösung (Präparationsmedium, 10 mg/mL) zugegeben.

90 2. Material und Methoden

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der PBCEC-Isolation.

2. Material und Methoden 91

Die Mischung wurde für 30 min bei 37°C unter sanftem Rühren inkubiert. Nach Ablauf der Inkuba-

tionszeit wurde das Stadium des Verdaus mikroskopisch kontrolliert. Dabei wurde darauf geachtet,

dass die Endothelzellen nicht komplett vereinzelt wurden, sondern sich noch in Verbänden an den

Kapillarresten befanden (s. Abb. 2.2). Gegebenenfalls wurde der Verdau verlängert bis das ge-

wünschte Stadium erreicht war.

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des gewünschten Verdaustadiums.

Dargestellt sind Verbände von PBCEC an einer Kapillare.

Endothelzellgewinnung

Nach Abschluss des Verdaus wurde die Zellsuspension zentrifugiert (140 g, 10 min, RT, Universal

16-R) und der Niederschlag wurde in 50 mL 37°C warmem Präparationsmedium resuspendiert. Je

10 mL der Suspension wurden auf einen Percoll™-Dichtegradienten gegeben. Für die Dichtegra-

dienten wurden 20 mL Percoll™-Lösung der Dichte 1,03 g/mL in einem Reaktionsgefäß vorgelegt

und mit 15 mL Percoll™-Lösung der Dichte 1,07 g/mL unterschichtet. Die diskontinuierlichen

Dichtegradienten wurden ohne Bremse zentrifugiert (1300 g, 10 min, RT, ALC 4237R). Die Endo-

thelzellen setzten sich in der Interphase zwischen den Percoll™-Lösungen ab. Im Niederschlag be-

finden sich Erythrozyten und im Überstand verbliebene Gewebereste. Nach dem vorsichtigen Ab-

nehmen der Interphase wurde die Endothelzellsuspension erneut zentrifugiert (140 g, 10 min, RT,

Universal 16-R) und der Niederschlag in 50 mL 37°C warmem Kulturmedium resuspendiert. Je 2,5

mL dieser Suspension wurden in die bereits mit 22 mL Kulturmedium und 12 µL Puromycin be-

schickten, sowie bei 37°C vorinkubierten Kulturflaschen (175 cm², Corning Costar) gegeben. Die

befüllten Kulturflaschen wurden über Nacht im Brutschrank (Cytoperm 2, Heraeus) bei gesättigter

Luftfeuchte und 5 % CO2 inkubiert.

Waschen

Am Tag nach der Zellisolation wurde das Kulturmedium aus den Kulturflaschen entfernt und jede

Flasche zweimal mit je 25 mL 37°C warmem PBS++ gewaschen, um die durch das Puromycin abge-

töteten Perizyten auszuspülen. Dabei wurde darauf geachtet, dass der Puffer nicht direkt auf die

92 2. Material und Methoden

Zellen gegeben wurde. Anschließend wurden erneut 25 mL 37°C warmes Kulturmedium eingefüllt

und die Flaschen über Nacht bei gesättigter Luftfeuchte und 5% CO2 inkubiert.

Einfrieren

Am zweiten Tag nach der Isolation wurden die Kulturflaschen erneut zweimal mit je 10 mL 37°C

warmem PBS gewaschen. Zur Ablösung wurden dann in jede Flasche 7 mL PBS und 3 mL

Trypsin/EDTA-Lösung gegeben. Durch Klopfen wurden die Zellverbände vom Boden der Kultur-

flaschen gelöst. Das Stadium der Ablösung wurde mikroskopisch kontrolliert und sobald sich etwa

90 % der Zellen abgelöst hatten, wurde die Zellsuspension abgezogen. Der Inhalt von jeweils zwei

Flaschen wurde vereinigt und das Trypsin durch Zugabe von Kulturmedium gestoppt. Nach der

Zentrifugation (140 g, 10 min, RT, Universal 16-R) wurden die Zellniederschläge in Neugeborenem

Kälberserum (NCS) + 10% DMSO resuspendiert und zu je 1,8 mL auf Einfrierröhrchen (Cryo.S™,

Greiner) verteilt. Das Einfrieren erfolgte direkt nach dem Einfüllen in einem Kältebad aus Isopro-

panol und Trockeneis. Bis zur Verwendung wurden die Zellen bei −80°C gelagert.

Auftauen und Aussäen

Die gewünschte Anzahl an Einfrierröhrchen wurde für 1-2 min im Wasserbad bei 37°C angetaut

und noch weitestgehend gefroren in 37°C warmem Kulturmedium vereinigt. Nachdem die Zellen

komplett aufgetaut waren, wurde die Suspension zentrifugiert (140 g, 10 min, RT, Universal 16-R)

und der Niederschlag in zunächst 5 mL 37°C warmem Kulturmedium resuspendiert. Der Zellsus-

pension wurde eine Probe entnommen und 1:2 mit Trypanblau-Lösung verdünnt. Mit einer Zähl-

kammer (Neubauer improved, Marienfeld) wurde die Zellkonzentration bestimmt. Es wurden zehn

große Quadrate mit je 16 kleinen Quadraten gezählt und die Zellzahl nach Gleichung 2.1 und 2.2

berechnet.

( )( )i

i

N gr

N kl16 i

=⋅

∑

Gleichung 2.1: N(kl) = mittlere Zellzahl pro kleinem Quadrat

Ni(gr) = gezählte Zellen aller großen Quadrate

i = Anzahl gezählter großer Quadrate

2. Material und Methoden 93

( )( )

VN N kl VF

V kl= ⋅

Gleichung 2.2: N = Gesamtzahl Zellen in Suspension

V = Gesamtvolumen der Suspension (5 mL)

V(kl) = Volumen pro kleinem Quadrat (2,5 · 10−7 mL)

VF = Verdünnungsfaktor (3)

Es wurde min. dreimal gezählt und der Mittelwert bestimmt. Die Zellsuspension wurde mit 37°C

warmem Kulturmedium auf eine Konzentration verdünnt, die eine Aussaat mit einer Dichte von

200.000 bis 250.000 pro cm² erlaubte. Tabelle 2.6 gibt die Volumina an, die zur Aussaat in den ge-

brauchten Kulturgefäßen verwendet wurden.

Tabelle 2.6: Verwendete Volumina für Kulturgefäße.

Kulturgefäß Flasche 175 cm² Transwell Platte 96er Platte Mikroskopier-Schale

Volumen 10 mL 500 µL 100 µL 300 µL

Alle verwendeten Kulturgefäße wurden am Vortag mit Collagen G beschichtet (s. Abschnitt 2.6.2).

Die ausgesäten Zellen wurden im Brutschrank (Cytoperm 2, Heraeus) bei gesättigter Luftfeuchte

und 5 % CO2 inkubiert. Am zweiten Tag nach der Aussaat wurden die Zellen von Kulturmedium

auf serumfreies Medium umgestellt. Vier Tage nach Aussaat waren die Zellen konfluent und konn-

ten für Experimente verwendet werden.

2.6.3 Aufnahme von liposomalen Konjugaten

Um die Interaktion und etwaige Aufnahme von mit Proteinen konjugierten Liposomen zu überprü-

fen wurden sie mit kultivierten PBCEC inkubiert. Untersucht wurden mit Transferrin, dem Signal-

fragment von Apolipoprotein E4, BSA und cBSA konjugierte Liposomen. Zur Kontrolle wurden

außerdem Liposomen ohne Oberflächenmodifikationen und solche nur mit PEG-Hülle verwendet.

Es wurden unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeiten untersucht. Um den Aufnah-

memechanismus näher zu betrachten wurden bei cBSA-Liposomen außerdem verschiedene Endo-

zytose-Inhibitoren verwendet.

Für die Aufnahmeexperimente wurden die PBCEC in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Corning

Costar), wie unter Abschnitt 2.6.2 beschrieben, kultiviert. Am vierten Tag nach der Aussaat waren

die Zellen konfluent und konnten für die Experimente verwendet werden. Um die spätere Detektion

94 2. Material und Methoden

der fluoreszierenden Liposomen nicht zu behindern, wurde zunächst das phenolrothaltige Medium

entfernt und die Zellen zweimal mit 200 µL PBS pro Vertiefung gewaschen. Anschließend wurden

100 µL 37°C warmer AP pro Vertiefung auf die Zellen gegeben und diese für 15 min bei 37°C vo-

rinkubiert. Nach Ablauf der Vorinkubationszeit wurde AP durch AP mit Liposomen ausgetauscht

und die Zellen für weitere 30 min bis 3 h bei 37°C inkubiert. Um alle endozytotischen Prozesse zu

stoppen wurde der Liposomen enthaltende AP entfernt und die Zellen mit je 100 µL 4°C kaltem AP

gewaschen. Danach wurden je 100 µL 4°C kalter SWP auf die Zellen gegeben und für 5 min inku-

biert. Der niedrige pH maskiert die negativen Ladungen an der Zelloberfläche und verhindert so

elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Liposomen und Zellen, wodurch sich adsorbierte Li-

posomen lösen sollen. Um restliche Liposomen auszuspülen wurden die Zellen im Anschluss mit

200 µL PBS pro Vertiefung gewaschen. Zuletzt wurden 100 µL AP + 1 % Triton X-100 auf die

Zellen gegeben und für 30 min bei 60°C inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Um die Konzentration

an Liposomen im Zelllysat zu bestimmen wurde die Fluoreszenz von DPPE-RH, welches in die

Liposomen inkorporiert worden war, bei einer Anregungswellenlänge von 530 nm und einer Emis-

sionswellenlänge von 590 nm im Fluoreszenzplattenleser (Fluoroscan Ascent, Thermo Fisher) ge-

genüber Liposomen bekannter Konzentration gemessen. Abbildung 2.2 gibt einen Überblick über

die Arbeitsschritte.

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Aufnahmeexperimente.

2. Material und Methoden 95

2.6.4 Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes

Für die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstandes (TEER) über eine Zellschicht

von PBCEC wurde das CellZscope (nanoAnalytics) verwendet. Dazu wurden die Filter einer

Transwell-Platte mit 12 Vertiefungen (Corning Costar) mit jeweils 100 µL Rattenschwanz-

Collagen-Lösung (Endkonzentration 3 µg/cm², 0,1 % Essigsäure) benetzt und über Nacht bei 37°C

und gesättigter Luftfeuchte inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Filtereinsätze im Luftzug der

Sterilwerkbank getrocknet und die PBCEC, wie unter Abschnitt 2.6.2 beschrieben, ausgesät und

kultiviert. Die basolateralen Kompartimente wurden hierbei mit 1,5 mL Medium befüllt. Beim Aus-

tausch des Mediums am zweiten Tag nach der Aussaat wurde besonders darauf geachtet sowohl im

apikalen als auch im basolateralen Kompartiment das Medium nicht komplett abzunehmen. Neben

normalem serumfreien Medium kam, um die Barrierefunktion zu stärken, selbiges mit Zusätzen von

HEPES (15 mM), Hydrocortison (550 nM) und beiden zusammen zum Einsatz. Am vierten Tag

nach der Aussaat wurden in den Vertiefungen des TEER-Messgeräts Medium vorgelegt und auf

37°C vorgewärmt. Die Filtereinsätze der Transwellplatte wurden ohne das Medium zu entfernen in

das TEER-Messgerät umgesetzt und die Messung nach etwa 30 min unter normalen Kulturbedin-

gungen durchgeführt.

2.6.5 Zytotoxizitätstest

Um toxische Eigenschaften der verwendeten Liposomen zu untersuchen wurde mit PBCEC ein

Alamar Blue®-Test durchgeführt. PBCEC wurden in einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen kulti-

viert (s. Abschnitt 2.6.2). Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen zweimal mit je 200 µL

37°C warmem PBS gewaschen und mit je 100 µL AP mit der zu testenden Substanz für 2 h bei

37°C und gesättigter Luftfeuchte inkubiert. Im Anschluss wurden die Zellen erneut zweimal mit je

200 µL 37°C warmem PBS gewaschen und mit 100 µL einer 1:40 Verdünnung von Alamar Blue in

AP versetzt. Nach 1, 2, 3 und 4 und über 20 h Inkubation bei 37°C und gesättigter Luftfeuchte wur-

de die Fluoreszenz bei einer Anregungs- und Emissionswellenlänge von 530 bzw. 590 nm gemes-

sen (Fluoroscan Ascent, Thermo Fisher). Über die Parallelbestimmung von unbehandelten und ab-

getöteten Zellen wurde die Beeinflussung des Zellmetabolismus der eingesetzten Substanzen be-

stimmt.

96 2. Material und Methoden

2.7 In vivo Experimente

Für alle in vivo Experimente wurden männliche Wistar Ratten zwischen 210 und 260 g über die

Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung der Universität Heidelberg von Charles Ri-

ver bezogen. Die Tiere wurden nach Erhalt max. einen Tag mit freiem Zugang zu Wasser und Fut-

ter (Ssniff, Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) gehalten. Alle Versuche wurden nach gelten-

den Tierschutzrichtlinien durchgeführt.

2.7.1 Applikation und Probenentnahme

Für die intravenöse Applikation wurden die Tiere in einer Zwangröhre fixiert und ihr Schwanz für

etwa 5 min in 40°C warmem Wasser gebadet, um die Durchblutung zu fördern und die Gefäße bes-

ser sichtbar zu machen. Die liposomale Dispersion wurde auf Körpertemperatur vorgewärmt und

über eine der Schwanzvenen appliziert (Spritze 1 mL, Kanüle 25G). Die Dosis betrug zwischen 3

und 26 mg Lipid pro kg Körpergewicht. Es wurden nicht mehr als 750 µL injiziert. Pro Experiment

wurden jeweils drei Tiere verwendet. Zusätzlich wurde als Kontrolle immer einem Tier das gleiche

Volumen an Kochsalzlösung (0,9 % w/v) verabreicht. Nach Applikation wurden die Tiere zwischen

1 und 24 h beobachtet und im Anschluss mit CO2 betäubt und durch zervikale Dislokation getötet.

15 min vor Tötung wurde jedem Tier zur Anfärbung der Kapillaren 500 µL FITC-BSA-Lösung (4

% w/v) analog zur liposomalen Dispersion intravenös appliziert. Bei Beobachtungszeiten von mehr

als 6 h wurde den Tieren jede Stunde etwa 200 µL Blut über eine der Schwanzvenen abgenommen

(Kanüle 22G, Microvette®) und zentrifugiert (6500g, 3 min, RT, 5415D). Die liposomale Konzent-

ration wurde über die Messung der Fluoreszenz von DPPE-RH bei einer Anregungs- und einer

Emissionswellenlänge von 530 bzw. 590 nm bestimmt (Fluoroscan Ascent, Thermo Fisher). Zur

späteren Untersuchung wurde den Tieren Hirn, Milz und ein Stück der Leber entnommen, in eiskal-

ter Kochsalzlösung (0,9 % w/v) gewaschen und in einem Kältebad aus Isopentan und Trockeneis

schockgefroren. Bis zur Anfertigung der Gefrierschnitte wurden die Organe bei −80°C aufbewahrt.

2.7.2 Anfertigung der Gefrierschnitte

Die Gefrierschnitte wurden bei −20°C durchgeführt (CM3050 S, Leica). Dazu wurden die Organe

mit Einbettmedium (Jung, Leica) auf einem Metallstempel fixiert und so in der Halterung befestigt,

dass sich eine gute Schnittfläche bot. Die abdeckende Schicht des Einbettmediums wurde entfernt

und die ersten paar Gewebeschnitte verworfen. Von jedem Organ wurden sechs bis acht 35 µm

dünne Schnitte angefertigt und auf spezielle Adhesiönsobjektträger (Superfrost® Plus, Thermo Fi-

2. Material und Methoden 97

sher) aufgebracht. Die Objektträger wurden für 15 min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss

an Luft getrocknet und anschließend mit Mowiol-Einbettmedium und einem Deckglas (25 x 50

mm, Roth) über Nacht fixiert. Für längere Lagerzeiten wurden die Präparate bei −20°C gelagert.

2.7.3 Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie

Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Gewebepräparate erfolgte an einem konfokalen

Fluoreszenz-Mikroskop (TCS SP5 X, Leica). Für die Anregung von Fluorescein wurde ein Argon-

Laser bei 496 nm und eine Detektionsspanne von 500 bis 520 nm verwendet. Für Rhodamin erfolg-

te die Anregung mit einem DPSS-Laser bei 561 nm und die Detektion im Bereich von 570 bis 610

nm. Die beiden Fluorophore wurden in Sequenz detektiert um ein gegenseitiges Stören auszuschlie-

ßen. Als Objektiv wurde ein 63faches Ölimmersionsobjektiv (HCX PL APO) verwendet. Bei jeder

Aufnahme wurden das fünffache Mittel jeder Linie und das vierfache Mittel des Ausschnitts über-

einandergelegt, um die Auflösung zu verbessern. Von jedem Präparat wurden vier bis sechs reprä-

sentative Ausschnitte aufgenommen.

3. Liposomale Konjugate 101

3. Liposomale Konjugate

3.1 Proteinmodifikationen

3.1.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Um eine etwaige Degradation des Proteins während der Modifikation auszuschließen, wurde cBSA

nach der Kationisierung und nach der Thiolierung einer SDS-PAGE unterzogen (s. Abb. 3.1).

Abbildung 3.1: Fotografie eines Gels einer SDS-PAGE. Die Banden wurden wie folgt befüllt 1: Größenstandard, 2: BSA, 3: cBSA und 4: thioliertes cBSA.

Von Bande 2 bis 4 ist eine leichte Zunahme der Größe zu sehen, die von der Einführung des Ethy-

lendiamin bei der Kationisierung bzw. des SATA bei der Thiolierung (s. Abschnitt 1.2.4) herrührt.

Davon abgesehen sind durch die Modifikationen am Protein keine Veränderungen zu beobachten.

102 3. Liposomale Konjugate

3.1.2 Isoelektrische Fokussierung

Um das Ausmaß der Kationisierung von BSA festzustellen wurde eine Isoelektrische Fokussierung

(IEF) mit Proben von BSA, cBSA und thioliertem cBSA durchgeführt (s. Abb. 3.2).

Abbildung 3.2: Fotografie eines Gels einer IEF. Die Banden wurden wie folgt befüllt 1: IEF-Standard, 2: BSA, 3: cBSA und 4: thioliertes cBSA.

Für die Proben des cBSA und des thiolierten cBSA sind deutlich basische pI’s zwischen 8,6 und 9,3

bzw. um 8,6 ersichtlich. Natives BSA besitzt einen pI von 4,7 bis 4,9[222] und befindet sich auf die-

sem Gel zwischen 4,6 und 5,1. Durch die Reaktion mit Ethylendiamin ist es somit gelungen den pI

von BSA um etwa 4 pH-Einheiten ins Basische zu verschieben. Ferner lässt sich beobachten, dass

sich durch die Thiolierung der pI von cBSA wieder etwas in Richtung neutral verschiebt, da das

Thiolierungsreagenz SATA mit basischen Aminogruppen im Protein reagiert und diese neutralisiert

(s. Abschnitt 1.2.4). Die sehr langgezogenen Banden für cBSA und thioliertes cBSA können durch

eine nicht vollständige Fokussierung erklärt werden oder aber nicht alle Proteine wurden im glei-

chen Ausmaß kationisiert und thioliert.

3. Liposomale Konjugate 103

3.1.3 Bestimmung der freien Thiolgruppen

Für die Bestimmung freier Thiolgruppen nach Ellman wurde zunächst eine Kalibriergerade mit

Cystein-Lösungen bekannter Konzentration erstellt (s. Abb. 3.3).

Abbildung 3.3: Kalibriergerade für die Bestimmung freier Thiolgruppen. Kalibrierbereich entspricht einer Cystein-Konzentration von 0,01 bis 0,06 mM.

Mit Hilfe der resultierenden Geradengleichung (s. Gl. 3.1) wurde die Cystein äquivalente Konzent-

ration an freien Thiolgruppen der Protein-Lösungen berechnet.

3Lmmoly 10,326 x 3, 27 10−= ⋅ + ⋅

Gleichung 3.1: s(m) = 0,024 L/mmol

s(c) = 0,94 · 10−3

R² = 0,99921

Über die spektralphotometrische Bestimmung der Protein-Konzentration bei 278 nm (s. Abschnitt

2.3.3) wurde daraus die Anzahl der freien Thiolgruppen pro Protein berechnet. Tabelle 3.1 zeigt die

Ergebnisse der Thiolgruppen-Bestimmung für drei unterschiedliche Ansätze von cBSA.

104 3. Liposomale Konjugate

Tabelle 3.1: Anzahl der eingeführten Thiolgruppen für drei Ansätze von cBSA.

Ansatz Cystein äquivalente Konzentration (µM)

Protein-Konzentration (µM)

Thiolgruppen/Protein eingeführte

Thiolgruppen

thioliertes cBSA 47,52 ± 0,30 16,00 ± 0,53 2,97 ± 0,12 1

cBSA 0,17 ± 0,20 38,0 ± 1,1 0,0045 ± 0,0054 2,97 ± 0,13

thioliertes cBSA 85,29 ± 0,52 28,00 ± 0,81 3,05 ± 0,11 2

cBSA 2,49 ± 0,11 25,00 ± 0,74 0,0996 ± 0,0074 2,95 ± 0,12

thioliertes cBSA 51,69 ± 0,31 19,00 ± 0,60 2,72 ± 0,11 3

cBSA 3,07 ± 0,20 22,00 ± 0,67 0,140 ± 0,014 2,58 ± 0,13

In mehreren unterschiedlichen Ansätzen gelang es 2,5 bis 3 freie Thiolgruppen in cBSA einzufüh-

ren. Eine ungerade Anzahl an Thiolgruppen kann dadurch entstehen, dass nicht alle Proteine gleich

stark thioliert werden. Die Bestimmung der Thiolgruppen für Transferrin erfolgte analog zu cBSA

und ist in Tabelle 3.2 angegeben.

Tabelle 3.2: Anzahl der eingeführten Thiolgruppen für Transferrin.

Protein Cystein äquivalente Konzentration (µM)

Protein-Konzentration (µM)

Thiolgruppen/Protein eingeführte

Thiolgruppen

thioliertes Transferrin

267 ± 16 250 ± 33 1,07 ± 0,21

Transferrin 11 ± 13 250 ± 33 0,044 ± 0,058

1,02 ± 0,27

Für Transferrin konnte nach der Thiolierung eine freie Thiolgruppe mehr als zuvor nachgewiesen

werden. Das Ausmaß der Thiolierung war damit nicht so erfolgreich wie bei cBSA. Dies liegt ver-

mutlich daran, dass cBSA durch die vorhergehende Kationisierung mehr Aminogruppen enthält an

denen das Thiolierungsreagenz SATA angreifen kann.

3. Liposomale Konjugate 105

3.2 Proteinkopplung an Liposomen

3.2.1 Veränderungen von Größe und Zetapotential

Vor und nach der Anbindung von Proteinen an Liposomen wurden der hydrodynamische Radius

und das Zetapotential der Vesikel bestimmt (s. Abschnitte 2.5.1 & 2.5.2). In Tabelle 3.3 sind die

Durchmesser und PDI’s liposomaler Formulierungen vor und nach der Kopplung mit cBSA, Trans-

ferrin und dem Peptidfragment von ApoE, sowie die Differenzen angegeben.

Tabelle 3.3: Durchmesser und PDI’s verschiedener liposomaler Formulierungen vor und nach Kopplung mit cBSA, Transferrin und ApoE. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Ansatz Durchmesser

(nm) Differenz

(nm) PDI Differenz

vor PVK 130,93 ± 0,64 0,1533 ± 0,0075 1

nach PVK 181,77 ± 0,41 50,9 ± 1,1

0,2500 ± 0,0017 0,0967 ± 0,0092

vor PVK 118,17 ± 0,33 0,2040 ± 0,0081 2

nach PVK 121,8 ± 1,1 3,7 ± 1,5

0,2060 ± 0,0065 0,002 ± 0,015

vor PVK 129,33 ± 0,74 0,1853 ± 0,0041 3

nach PVK 140,7 ± 1,5 11,4 ± 2,3

0,1807 ± 0,0083 -0,005 ± 0,013

vor PVK 132,5 ± 1,1 0,175 ± 0,019 4

nach PVK 132,8 ± 1,3 0,3 ± 2,4

0,186 ± 0,017 0,011 ± 0,036

vor PVK 139,0 ± 1,4 0,1657 ± 0,0076

cBSA

5 nach PVK 144,4 ± 1,1

5,4 ± 2,5 0,230 ± 0,011

0,064 ± 0,019

vor PVK 153,9 ± 1,6 0,1760 ± 0,0070 1

nach PVK 267,6 ± 1,7 113,7 ± 3,3

0,231 ± 0,023 0,055 ± 0,030

vor PVK 172,7 ± 2,1 0,223 ± 0,018 Transferrin

2 nach PVK 287,7 ± 2,8

115,0 ± 4,9 0,282 ± 0,010

0,059 ± 0,028

vor PVK 185,8 ± 1,7 0,189 ± 0,022 1

nach PVK 189,7 ± 1,5 3,9 ± 3,2

0,220 ± 0,011 0,031 ± 0,033

vor PVK 169,10 ± 0,54 0,186 ± 0,012 2

nach PVK 171,9 ± 1,2 2,8 ± 1,8

0,174 ± 0,016 -0,012 ± 0,028

vor PVK 181,30 ± 0,97 0,098 ± 0,019

ApoE

3 nach PVK 195,7 ± 1,9

14,4 ± 2,9 0,102 ± 0,032

0,004 ± 0,051

106 3. Liposomale Konjugate

Die Kopplung von Transferrin vergrößerte den Liposomen-Durchmesser im Mittel um 114,4 ± 4,1

nm. Für ApoE und cBSA betrug die Zunahme der Größe zwischen 2,8 ± 1,8 und 14,4 ± 2,9 nm

bzw. 0,3 ± 2,4 und 50,9 ± 1,1 nm. Da Transferrin einen hydrodynamischen Radius von 3,58 nm[223]

und cBSA von 3,48 nm[222] hat und ApoE ein nur 26 Aminosäuren langes Peptid[173] ist, können

diese Größenzunahmen nicht allein durch die Anbindung der Proteine erklärt werden. Aggregation

der Liposomen durch Proteine, die mehrere Thiolgruppen enthalten ist möglich. Elektronenmikro-

skopische Aufnahmen zeigen lediglich multivesikulare Vesikel (s. Abb. 3.4). Eine Zunahme der

Größe durch Aufnahme von Puffer während der Kopplung und den folgenden Reinigungsprozessen

könnte jedoch stattfinden.

Abbildung 3.4: Elektronenmikroskopische Aufnahme von cBSA-Liposomen (Durchmesser ~180 nm).

Die Veränderungen des Zetapotentials durch die Kopplung von Proteinen sind in Tabelle 3.4 wie-

dergegeben.

3. Liposomale Konjugate 107

Tabelle 3.4: Zetapotentiale verschiedener liposomaler Formulierungen vor und nach Kopp-lung mit cBSA, Transferrin und ApoE. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Ansatz Zetapotential

(mV) Differenz

(mV)

vor PVK −3,42 ± 0,24 1

nach PVK 6,330 ± 0,070 9,75 ± 0,31

vor PVK −2,97 ± 0,46 2

nach PVK 0,95 ± 0,58 3,9 ± 1,1

vor PVK −2,73 ± 0,57 3

nach PVK 2,6 5,33 ± 0,57

vor PVK −4,3 ± 1,3 4

nach PVK 5,8 ± 1,8 10,1 ± 3,1

vor PVK −3,80 ± 0,18

cBSA

5 nach PVK −1,35 ± 0,34

2,45 ± 0,52

vor PVK −0,14 ± 0,22 1

nach PVK −1,747 ± 0,090 −1,61 ± 0,31

vor PVK −0,19 ± 0,26 Transferrin

2 nach PVK −2,713 ± 0,055

−2,52 ± 0,32

vor PVK 3,27 ± 0,38 1

nach PVK −2,43 ± 0,27 −5,70 ± 0,65

vor PVK 0,43 ± 0,11 2

nach PVK −0,40 ± 0,14 −0,83 ± 0,25

vor PVK −2,10 ± 0,34

ApoE

3 nach PVK −5,937 ± 0,029

−3,84 ± 0,37

Die Anbindung von cBSA an Liposomen sorgte für eine Erhöhung des Zetapotentials um 2,45 ±

0,52 bis 10,1 ± 3,1 mV, was in der Regel zu einem insgesamt positiven Potential der Liposomen

führte. Für das unter physiologischen Bedingungen kationische Protein (s. Abschnitt 3.1.2) war dies

zu erwarten. Die Kopplung von Transferrin und ApoE führte zu einer Erniedrigung des Zetapotenti-

al von im Mittel −2,07 ± 0,32 mV bzw. −0,83 ± 0,25 bis −5,70 ± 0,65 mV. Die negative Ladung

von Transferrin[224] kann die Verringerung des Zetapotential erklären. Das ApoE-Peptid enthält al-

lerdings mehr kationische als anionische Aminosäuren[173] und sollte daher für eine Erhöhung des

Potentials sorgen. Möglicherweise schirmt die Faltung des Peptids die positive Ladung ab oder aber

die Ladung des Peptids ist zu gering um einen Ausschlag zu geben und die Veränderungen des Po-

tentials sind auf andere Effekte zurückzuführen.

108 3. Liposomale Konjugate

3.2.2 Kopplungseffizienz für kationisiertes Albumin

Zur Bestimmung der Kopplungseffizienz wurde mit Fluorescein markiertes cBSA (FITC-cBSA)

verwendet. Das Linker-Lipid DSPE-PEG-MI wurde zu Anteilen von 0,25, 0,5 und 1 %, bezogen

auf die gesamte Lipidmenge, in Liposomen eingebaut. FITC-cBSA wurde im Verhältnis von 1:1,

2,5:1 und 5:1 zum Linker zugegeben. Da der Einbau von DSPE-PEG-MI während der Formung der

Liposomen zufällig stattfindet und statistisch die Hälfte der Linker-Lipide ins Liposomeninnere

zeigen, sollten maximal Kopplungseffizienzen um 50% möglich sein. Protein-Linker Verhältnisse

von 1:1 und 2,5:1 lieferten Kopplungseffizienzen um 10% bzw. 30%. Ein Verhältnis von 5:1 führte

zu Effizienzen um 50% und höher, was einer maximalen Ausbeute der Kopplungsreaktion ent-

spricht (s. Tab. 3.5). Kopplungseffizienzen für Transferrin und ApoE wurden nicht getestet und

können von den Ergebnissen für cBSA abweichen, da die Anzahl der freien Thiolgruppen pro Pro-

tein unterschiedlich ist.

Tabelle 3.5: Kopplungseffizienz bezogen auf das Protein-Linker Verhältnis und die Linker-Konzentration. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Protein-Linker Verhältnis

DSPE-PEG-MI Konzentration

FITC-cBSA Konzent-ration (mM)

Kopplungseffizienz (%)

0,25 mM (0,25%) 0,25 10,6 ± 1,5

0,50 mM (0,5%) 0,50 26,5 ± 9,1 1 : 1

1,0 mM (1%) 1,0 72 ± 13

0,25 mM (0,25%) 0,625 10,7 ± 3,8

0,50 mM (0,5%) 1,25 30,3 ± 2,9 2.5 : 1

1,0 mM (1%) 2,5 42 ± 9,9

0,25 mM (0,25%) 1,25 10,81 ± 0,72

0,50 mM (0,5%) 2,5 36,1± 0,9 5 : 1

1,0 mM (1%) 5,0 63,5 ± 0,5

3. Liposomale Konjugate 109

3.3 Freisetzung aus Liposomen

Um die Freisetzung von Stoffen aus dem Inneren der Liposomen zu testen, wurde der Fluoreszenz-

farbstoff Carboxyfluorescein (CF) in Liposomen eingeschlossen. Dabei wurde die Konzentration an

CF so hoch gewählt (50 mM), dass ein selbst quenchender Effekt auftrat, so dass bei Austritt aus

den Liposomen, durch die damit einhergehende Verdünnung, eine Zunahme der Fluoreszenz er-

folgt. Die Freisetzung von CF wurde in PBS (s. Abb. 3.5 & 3.6), Lysosomenpuffer bei pH 4,5 (LP,

s. Abb. 3.7) und aus Rattenblut gewonnenem Plasma (s. Abb. 3.8) jeweils bei 37°C über einen Zeit-

raum von 24 h beobachtet. Die Ergebnisse wurden zu einer Kontrolle in Bezug gesetzt, bei der Li-

posomen mit Triton X-100 zerstört wurden und somit eine vollständige Freisetzung stattfand.

Abbildung 3.5: Freisetzung von CF aus Liposomen in PBS bei 37°C über 24 h in drei An-sätzen. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Die Freisetzung von CF aus Liposomen in PBS zeigt einen exponentiellen Verlauf und erreicht

nach 24 h Werte zwischen 11,04 ± 0,49 und 13,4 ± 2,7 %. Da die Freisetzung in einem geschlosse-

nen Kompartiment erfolgte, steht die Einstellung eines Diffusionsgleichgewichts zwischen Liposo-

meninnerem und der Umgebung der Freisetzungskinetik in einem offenen System, wie dem Blut-

kreislauf, entgegen. Eine Regressiongerade durch den linearen Bereich zwischen 0,5 und 4 h (s.

Abb. 3.6) liefert eine mittlere Freisetzungsrate von 1,068 ± 0,082 %/h. Dies entspricht einer Halb-

wertszeit von CF in Liposomen in PBS von 46,8 ± 3,6 h.

110 3. Liposomale Konjugate

Abbildung 3.6: Freisetzung von CF aus Liposomen in PBS bei 37°C über 24 h in drei An-sätzen mit Regressiongeraden für den Bereich zwischen 0,5 und 4 h.

Für die Freisetzung bei pH 4,5 in LP ergaben sich 36,4 ± 2,8 bis 47,8 ± 3,8 % Freisetzung nach 24

h. Lineare Regression im Bereich 0,5 bis 2 h ergab eine mittlere Freisetzungsrate von 13,4 ± 1,5

%/h und eine Halbwertszeit von 3,73 ± 0,42 h (s. Abb. 3.7).

Abbildung 3.7: Freisetzung von CF aus Liposomen in LP (pH 4,5) bei 37°C über 24 h in drei Ansätzen mit Regressiongeraden für den Bereich zwischen 0,5 und 2 h. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

3. Liposomale Konjugate 111

Nach 24 h in Rattenplasma wurde eine Freisetzung von 40,0 ± 6,3 % erreicht. Die mittlere Freiset-

zungsrate und die Halbwertszeit für einen Regressionsbereich von 0,5 bis 3 h betrugen 7,02 ± 0,17

%/h bzw. 7,12 ± 0,18 h (s. Abb. 3.8).

Abbildung 3.7: Freisetzung von CF aus Liposomen in Rattenplasma bei 37°C über 24 h in zwei Ansätzen mit Regressiongeraden für den Bereich zwischen 0,5 und 3 h. Die Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Tabelle 3.5 gibt eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die Freisetzung von Carboxyfluorescein

aus Liposomen in allen untersuchten Medien.

Tabelle 3.5: Freisetzungsraten, Halbwertszeiten, maximale Freisetzung nach 24 h und Liposomendurchmesser für PBS, LP und Rattenplasma.

Medium Freisetzungsrate

(%/h) Halbwertszeit

(h) maximale Freisetzung

nach 24 h (%) Liposomendurchmesser

(nm)

PBS 1,068 ± 0,082 46,8 ± 3,6 13,4 ± 2,7 165,6 ± 3,5

LP 13,4 ± 1,5 3,73 ± 0,42 47,8 ± 3,8 165,6 ± 3,5

Plasma 7,02 ± 0,17 7,12 ± 0,18 40,0 ± 6,3 160,7 ± 7,4

Die Halbwertszeit des 376 g/mol schweren, hydrophilen Fluoreszenzfarbstoffes Carboxyfluorescein

in PBS liegt im Bereich von zwei Tagen. Unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen bei pH

4,5 (LP) ist die Halbwertszeit bereits um eine Größenordnung reduziert. In Rattenplasma liegt die

Rate der Freisetzung in etwa bei der Hälfte von pH 4,5.

112 3. Liposomale Konjugate

3.4 Stabilität von cBSA-Liposomen

Um die Stabilität von liposomalen Konjugaten mit cBSA zu testen, wurden mit Carboxyfluorescein

(CF), in selbst quenchender Konzentration, beladene Liposomen bei 4°C, −20°C und gefrierge-

trocknet bei −20°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurden über acht Wochen Durchmesser,

PDI, Zetapotential und die Freisetzung von CF überprüft.

Der Durchmesser von cBSA-Liposomen bei 4°C veränderte sich über acht Wochen lediglich um

4,9 ± 7,0 bis 25 ± 8,9 nm. Der PDI veränderte sich zum Ausgangspunkt nach der Proteinkopplung

nur marginal und stieg nicht über 0,201 ± 0,029 (s. Abb. 3.8). Liposomen die bei −20°C gelagert

wurden zeigten nach sechs Wochen deutliche Zunahmen im Durchmesser von bis zu 1220 ± 210

nm und PDI’s von 1, wobei bereits nach vier Wochen Veränderungen zu sehen waren (s. Abb. 3.9).

Gefriertrocknung und anschließende Lagerung der Liposomen bei −20°C führte bereits nach einer

Woche zu Vergrößerungen der Vesikel um bis zu

301 ± 47 nm, die im Verlauf der acht Wochen auf bis zu 315 ± 34 nm stiegen. Die PDI’s schwank-

ten stark und bewegten sich zwischen 0,117 ± 0,066 und 0,555 ± 0,051.

Abbildung 3.8: Durchmesser (geschlossene Symbole) und PDI (offene Symbole) dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gelagert bei 4°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

3. Liposomale Konjugate 113

Abbildung 3.9: Durchmesser (geschlossene Symbole) und PDI (offene Symbole) dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gelagert bei −20°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Abbildung 3.10: Durchmesser (geschlossene Symbole) und PDI (offene Symbole) dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gefriergetrocknet und gelagert bei −20°C. Werte sind ange-geben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Bei der Lagerung bei 4°C fand über den Zeitraum von acht Wochen ein deutlicher Abfall des Zeta-

potential statt (s. Abb. 3.11). Veränderungen waren bereits nach einer Woche festzustellen und be-

liefen sich nach acht Wochen auf bis zu 7,0 ± 1,1 mV. Die Potentiale blieben aber positiv. Die La-

gerung bei −20°C mit und ohne vorhergehende Gefriertrocknung zeigt geringere Veränderungen (s.

Abb. 3.12 & 3.13). Beide Betrachtungen zeigen mitunter schwankende Werte und sogar Zunahmen

des Zetapotentials. Ein Trend wie bei der Lagerung bei 4°C ist jedoch nicht zu erkennen, auffällig

sind jedoch teilweise große Standardabweichungen. Messungen liposomaler Konjugate mit cBSA

114 3. Liposomale Konjugate

gestalteten sich im Allgemeinen schwierig und lieferten häufig stark schwankende Werte. Vermut-

lich liefen in den Proben während der Messung irreversible RedOx-Prozesse ab, die eine Degradati-

on der Proteine zur Folge hatte. Dieser Umstand erschwert eine klare Aussage über etwaige Verän-

derungen während der Lagerungszeit. Es lässt sich aber sagen, dass die positive Ladung des cBSA

besser erhalten bleibt.

Abbildung 3.11: Zetapotentiale dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gelagert bei 4°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

3. Liposomale Konjugate 115

Abbildung 3.12: Zetapotentiale dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gelagert bei −20°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Abbildung 3.13: Zetapotentiale dreier Ansätze von cBSA-Liposomen gefriergetrocknet und gelagert bei −20°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Messung der Fluoreszenz von Carboxyfluorescein (CF) eingeschlossen in cBSA-Liposomen zeigen

für 4°C einen kontinuierlichen Anstieg über acht Wochen (s. Abb. 3.14). Die Zunahme an Fluores-

zenz ist gleichzusetzen mit einem Austritt von CF, das in den Liposomen einem selbst quenchenden

Effekt unterliegt. Die Lagerung bei −20°C zeigt nach einer Woche in zwei von drei Fällen das Er-

reichen eines relativ konstanten Wertes (s. Abb. 3.15). Im dritten Fall liegen schwankende Werte

vor, die keine Aussage über den Austritt von CF zulassen. Die Messung der gefriergetrockneten

Proben zeigt ebenfalls in zwei von drei Proben nach zwei Wochen einen konstanten Wert (s. Abb.

3.16). Die dritte Messreihe lässt wiederum keine klare Aussage zu, da sie nach vier Wochen ein

Maximum zeigt und die Fluoreszenz danach wieder abfällt.

116 3. Liposomale Konjugate

Abbildung 3.14: Fluoreszenz dreier Ansätze von cBSA-Liposomen mit eingeschlossenem CF gelagert bei 4°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Abbildung 3.15: Fluoreszenz dreier Ansätze von cBSA-Liposomen mit eingeschlossenem CF gelagert bei −20°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

3. Liposomale Konjugate 117

Abbildung 3.16: Fluoreszenz dreier Ansätze von cBSA-Liposomen mit eingeschlossenem CF gefriergetrocknet und gelagert bei −20°C. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Stan-dardabweichung (n = 3). (PVK = Protein-Vektor Kopplung)

Bei der Betrachtung der Ergebnisse bleibt anzumerken, dass sich der Effekt des Einfrier- und

Gefriertrocknungsprozesses auf die Größenveränderung nicht bestimmen lässt, da keine Mes-

sungen direkt nach dem Einfrieren sondern erst nach einer Woche Lagerung durchgeführt wur-

den. Es ist möglich, dass Veränderungen während der ersten Woche auf das Einfrieren bzw.

Gefriertrocknen zurückzuführen sind. Generell ist eine Lagerung bei 4°C besser für den Erhalt

des Durchmessers der Liposomen. Veränderungen des Zetapotentials, vermutlich hervorgeru-

fen durch Reaktionen der, bei der Kopplung an die Liposomen nicht besetzten, Thiolgruppen

am cBSA, und der Austritt von CF machen diese Lagerungsmethode aber langfristig ungeeig-

net. Je nach eingeschlossener Substanz kann sich die Freisetzungskinetik allerdings anders ver-

halten. Bei −20°C waren Veränderungen des Zetapotentials und auch der Austritt von CF ge-

ringer. Der enorme Größenzuwachs der Vesikel zwischen zwei und vier Wochen schließt aber

auch diese Methode aus. Aus Sicht des Zetapotentials und des CF-Austritts zeigt die Gefrier-

trocknung gegenüber −20°C keine Vorteile. Die Zunahme des Durchmessers fällt jedoch we-

sentlich geringer aus und findet während der ersten Woche und somit wahrscheinlich während

des Gefriertrocknens selbst statt. Ließe sich diese Zunahme durch Zusatz von Lyo- und/oder

Kryoprotektoren verringern oder verhindern, wäre diese Methode für die Langzeitlagerung von

cBSA-Liposomen am besten geeignet.

118 3. Liposomale Konjugate

3.5 Zusammenfassung

Durch Reaktion mit Ethylendiamin konnte eine deutliche Kationisierung von nativem Rinderserum-

Albumin ohne Degradation des Proteins erreicht werden (s. Abschnitt 3.1.1). Die Verschiebung des

pI bewegte sich im Bereich von 4 pH-Einheiten bis in den Bereich von 8 bis 9, so dass kationisier-

tes Albumin unter physiologischen Bedingungen positiv geladen ist (s. Abschnitt 3.1.2). Die Reak-

tion mit SATA ergab 2,5 bis 3 bzw. 1 eingeführte Thiolgruppen zur Kopplung von Proteinen an

Liposomen für cBSA und Transferrin. Da über Bildung von Disulfidbrücken Oligomere der Protei-

ne oder über Reaktion mit mehreren Liposomen Vesikel-Aggregate entstehen können, ist eine

übermäßige Thiolierung der Proteine nicht erwünscht. Eine übermäßige Thiolierung von cBSA

würde darüber hinaus den Effekt der Kationisierung einschränken (s. Abschnitt 3.1.3).

Die Anbindung der Proteine an Liposomen führte zu Vergrößerungen des liposomalen Durchmes-

sers, die sich nicht allein durch die Größe der Proteine[222, 223] erklären lassen. Da die Veränderun-

gen unterschiedlich stark ausfielen, sind wahrscheinlich Vorgänge bei der Kopplung und der Reini-

gung, wie z.B. Pufferaustausch, dafür verantwortlich (s. Abschnitt 3.2.1). Die negative bzw. positi-

ve Ladung von Transferrin[224] und cBSA führte erwartungsgemäß zu einer Verringerung bzw. Er-

höhung des Zetapotentials der Liposomen. Das Peptidfragment von ApoE verringert das Zetapoten-

tial ebenfalls, obwohl es deutlich mehr kationische als anionische Aminosäuren enthält.[173] Da die

Oberflächenladung des Peptids nicht bekannt ist, lässt sich hierfür keine klare Erklärung geben (s.

Abschnitt 3.2.1). Bestimmungen der Kopplungseffizienz mit Fluorescein markiertem cBSA liefer-

ten für äquimolare Verhältnisse von Protein zu Linker eine Ausbeute der Kopplungsreaktion von

etwa 10%. Überschüsse an Protein von 2,5- und 5fach lieferten Ausbeuten von etwa 30% und um

50% und höher. Letzteres entspricht auf Grund der statistischen Verteilung der Linker-Lipide, die

auch nach innen zeigen können, grob der maximal erreichbaren Kopplungseffizienz (s. Abschnitt

3.2.2).

Untersuchungen zur Freisetzung von Carboxyfluorescein (CF), als Modellsubstanz für kleine

hydrophile Moleküle, aus Liposomen ergab eine Halbwertszeit von etwa zwei Tagen in PBS. In

sauerem Milieu (pH 4,5) erfolgte die Freisetzung um eine Größenordnung schneller. Die Halbwert-

zeit betrug ca. 3,5 Stunden. Etwa die doppelte Halbwertszeit von 7 Stunden wurde in Rattenplasma

erreicht (s. Abschnitt 3.3).

Die Lagerung von CF enthaltenden cBSA-Liposomen über acht Wochen bei 4 und −20°C, letzteres

mit und ohne vorherige Gefriertrocknung, zeigte für 4°C stabile Verhältnisse bei Durchmesser und

PDI, aber Degradation des positiven Zetapotentials und zunehmende Freisetzung von CF. Die

−20°C Ansätze wiederum zeigten nur kleine anfängliche Veränderungen an Zetapotential und CF-

Freisetzung, aber größere Veränderungen des Durchmessers. Da sowohl kleine Durchmesser als

3. Liposomale Konjugate 119

auch ein hinreichend positives Zetapotential für ein Passieren der BHS notwendig sind, eignet sich

keines der hier verwendeten Verfahren für eine Lagerung von cBSA-Liposomen für mehr als zwei

Wochen. Auch die Freisetzung des Inhalts sollte möglichst begrenzt ausfallen. Da die Größenzu-

nahme der gefriergetrockneten Proben während der ersten Woche und somit vermutlich durch den

Gefriertrocknungsprozess selbst erfolgte, wäre eine Verbesserung der Gefriertrocknung, die zu ge-

ringeren oder keinen Vergrößerungen der Liposomen führt, denkbar (s. Abschnitt 3.4).

4. In vitro Experimente 123

4. In vitro Experimente Alle für in vitro Experimente verwendeten Liposomen enthielten, wenn nicht anders angegeben, 1

mol-% DSPE-PEG-MI. Zur Bestimmung der Menge aufgenommener Liposomen wurde 0,2 w-%

DPPE-RH verwendet, für konfokale Fluoreszenzmikroskopie 0,1 w-%. Liposomen für Toxizitäts-

studien enthielten kein DPPE-RH. Proteine zur Kopplung wurden im 5fachen Überschuss zum Lin-

ker-Lipid zugegeben.

4.1 Aufnahme von cBSA-Liposomen

4.1.1 Konzentrationsabhängige Aufnahme

Von Hirnkapillar-Endothelzellen aus dem Schweinehirn (PBCEC), die nach dem Erreichen der

Konfluenz in Kultur (s. Abschnitt 2.6.2) mit cBSA-Liposomen, die das fluoreszierende Lipid

DPPE-RH enthielten, inkubiert worden waren, wurde die Fluoreszenz des Zelllysat gemessen. Zu-

nehmende Ausgangskonzentrationen an cBSA-Liposomen führten hierbei zu verstärkter Fluores-

zenz im Zelllysat (s. Abb. 4.1). Unterhalb von 10 µM konnten keine verlässlichen Ergebnisse pro-

duziert werden. Die maximal eingesetzte Konzentration von

1 mM lieferte eine über die Fluoreszenz berechnete liposomale Konzentration im Zelllysat von 39,4

± 1,9 bis 48,9 ± 2,3 µM.

Abbildung 4.1: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von cBSA-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

124 4. In vitro Experimente

Die, aus der eingesetzten und nach der Aufnahme bestimmten Konzentration, berechnete prozentua-

le Aufnahme an cBSA-Liposomen zeigt im Bereich von 75 bis 175 µM die maximale Effizienz

(s. Abb. 4.2). Bei 100 µM ergaben sich Aufnahmen zwischen 9,77 ± 0,87 und 13,59 ± 0,77 %, was

einer Konzentration im Zelllysat von 9,77 ± 0,87 bzw. 13,59 ± 0,77 µM entspricht. Bei einer Aus-

gangskonzentration von 1 mM, mit der die maximale Konzentration im Zelllysat erreicht wurde,

ergaben sich lediglich Aufnahmen von 3,94 ± 0,19 bis 4,89 ± 0,23 %.

Abbildung 4.2: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von cBSA-Liposomen bei unter-schiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Um den vorteilhaften Effekt der Kationisierung von cBSA beurteilen zu können, wurden ebenfalls

Aufnahme-Versuche mit Liposomen, die mit nativem BSA konjugiert worden waren, durchgeführt.

Für mit cBSA-Liposomen vergleichbare Konzentrationen ließ sich lediglich für 250 µM Fluores-

zenz im Zelllysat nachweisen (s. Abb. 4.3). Höhere Konzentrationen wurden nicht getestet. Die

erreichte Konzentration im Zelllysat belief sich auf 0,063 ± 0,078 bis 0,095 ± 0,083 µM.

4. In vitro Experimente 125

Abbildung 4.3: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von BSA-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Für die prozentuale Aufnahme ergeben sich daraus Werte von 0,025 ± 0,031 bis 0,038 ± 0,033 %

(s. Abb. 4.4). Damit ist die Aufnahme von cBSA-Liposomen gegenüber BSA-Liposomen, bei 250

µM Ausgangskonzentration, mit Werten von 6,7 ± 1,3 bis 11,6 ± 1,1 % um etwa das 300fache ef-

fektiver. Eine höhere Ausgangskonzentration an cBSA-Liposomen führte wie zu erwarten zu einer

größeren Endkonzentration im Zelllysat der PBCEC. Die maximale Effizienz lag mit ca. 10 bis

15% um 100 µM an eingesetzten Liposomen. Vermutlich führt bei höheren Konzentrationen eine

Sättigung der Zellmembran zu einer verminderten anteiligen Aufnahme oder die Endozytose-

Kapazitäten der Zellen arbeiten an ihrer Grenze. Bei geringeren Konzentrationen könnte die Auslas-

tung der Zellen nicht voll ausgeschöpft werden, was zu geringerer Effizienz führt. BSA-Liposomen

werden nur äußerst schlecht von PBCEC aufgenommen. Eine 300fache Steigerung der Aufnahme

von BSA- zu cBSA-Liposomen verdeutlicht den Gewinn bringenden Effekt der Kationisierung.

126 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.4: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von BSA-Liposomen bei unterschied-lichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind an-gegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

4.1.2 Zeitabhängige Aufnahme

Zur Betrachtung der zeitlichen Auflösung der Aufnahme von cBSA-Liposomen in PBCEC wurde

die Fluoreszenz im Zelllysat nach bestimmten Zeitpunkten bis zu maximal 3 h für Ausgangskon-

zentrationen von 100 und 250 µM bestimmt und die prozentuale Aufnahme berechnet (s. Abb. 4.5

& 4.6). Für beide Konzentrationen zeigt sich eine kontinuierliche Zunahme der Fluoreszenz über 3

h. Für 100 µM werden Aufnahmen zwischen 9,4 ± 1,5 und 15,15 ± 0,91 % erreicht, bei 250 µM

zwischen 2,48 ± 0,30 und 7,52 ± 0,49. Betrachtet man beide Konzentrationen im direkten Vergleich

neben einander mit korrekter zeitlicher Skalierung ist ein flacherer Verlauf der Werte für 250 ge-

genüber 100 µM zu sehen (s. Abb. 4.7). In Tabelle 4.1 sind die durch lineare Regression ermittelten

Aufnahmeraten, wobei nur die Werte für 0,25 bis 2 h berücksichtigt wurden, zu sehen. Da zur

Durchführung der Fluoreszenzmessungen die Zellen lysiert werden mussten, handelt es sich bei den

einzelnen Zeitpunkten um unterschiedliche Zell-Kompartimente. Aus diesem Grund sind die Er-

gebnisse mit Vorsicht zu betrachten.

4. In vitro Experimente 127

Abbildung 4.5: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von 100 µM cBSA-Liposomen zu un-terschiedlichen Zeitpunkten bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angege-ben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Abbildung 4.6: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von 250 µM cBSA-Liposomen zu un-terschiedlichen Zeitpunkten bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angege-ben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

128 4. In vitro Experimente

Tabelle 4.1: Prozentuale und molare Aufnahmeraten für 100 und 250 µM cBSA-Liposomen. Werte und Fehler ergeben sich aus linearer Regression der Messreihen.

Ansatz prozentuale Rate

(%/h) molare Rate

(µM/h)

1 2,46 ± 0,56 2,46 ± 0,56

2 2,76 ± 0,31 2,76 ± 0,31 100 µM

3 2,92 ± 0,22 2,92 ± 0,22

1 1,47 ± 0,16 3,70 ± 0,40

2 0,55 ± 0,14 1,37 ± 0,34 250 µM

3 1,47 ± 0,18 3,66 ± 0,44

Betrachtet man die Aufnahmerate in Bezug auf die im Zelllysat nachgewiesene Konzentration sind

die Werte für 250 µM, der Ausgangskonzentration entsprechend, um das 2,5fache größer und über-

steigen damit die Rate von 100 µM. Prozentual gesehen ist die Aufnahme bei

250 µM etwa halb so schnell wie bei 100 µM.

Abbildung 4.7: Prozentuale Aufnahme der Ansätze für 100 (geschlossene Symbole) und 250 µM (offene Symbole) cBSA-Liposomen im direkten Vergleich bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Bei der Kurvenbetrachtung für 250 µM deutet sich ein Abflachen der Kurven an, was einen Sätti-

gungseffekt vermuten lässt. Zwischen zwei und drei Stunden bei 250 µM scheint die Aufnahme-

Kapazität der PBCEC erreicht. Höhere Ausgangskonzentrationen könnten diesen Bereich schon

früher erreichen, wurden aber nicht getestet. Bei 100 µM könnte folglich die Sättigung später, wie

4. In vitro Experimente 129

sich in einem der drei Ansätze abzeichnet, oder gar nicht eintreten. Längere Aufnahmeexperimente

ließen sich auf Grund der Empfindlichkeit der Zellen nicht durchführen.

4.1.3 Inhibitorische Effekte

Um den Einfluss von freiem, nicht liposomal konjugierten cBSA auf die Aufnahme von cBSA-

Liposomen zu untersuchen, wurden nach der Protein-Kopplung nicht aufgereinigte Liposomen

verwendet. Zu sehen sind gegenüber aufgereinigten cBSA-Liposomen stark verringerte Aufnahmen

(s. Abb. 4.8). Tabelle 4.2 zeigt die prozentualen Aufnahmen im direkten Vergleich.

Tabelle 4.2: Prozentuale Aufnahmen für aufgereinigte und ungereinigte cBSA-Liposomen. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Ansatz Aufnahme gereinigt

(%) Aufnahme ungereinigt

(%)

1 11,6 ± 1,1 4,69 ± 0,27

2 10,76 ± 0,58 4,11 ± 0,35 250 µM

3 6,7 ± 1,3 5,23 ± 0,55

1 8,29 ± 0,74 3,20 ± 0,17

2 6,5 ± 0,13 3,77 ± 0,25 500 µM

3 6,09 ± 0,66 3,63 ± 0,27

1 4,89 ± 0,23 1,615 ± 0,087

2 3,94 ± 0,19 1,81 ± 0,17 1 mM

3 4,02 ± 0,15 1,44 ± 0,11

Der Verringerung der Aufnahme beläuft sich in allen bis auf einen Ansatz von 250 µM auf über die

Hälfte. cBSA kann in freiem Zustand mit seiner positiven Ladung die negative Ladung der Zell-

membran abschirmen und somit eine Interaktion derselben mit cBSA-Liposomen und folglich die

Aufnahme erschweren (s. Abschnitt 1.1.2).

130 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.8: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von ungereinigten cBSA-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Zur Untersuchung des Endozytose-Mechanismus, durch den cBSA-Liposomen aufgenommen wer-

den, wurde die Aufnahme bei einer Ausgangskonzentration von 100 µM mit verschiedenen Inhibi-

toren untersucht (s. Abb. 4.9). Als Inhibitoren wurden BSA und cBSA, jeweils 10 und 100 µM, was

dem 10 bzw. 100fachen Überschuss zu liposomalen cBSA entspricht, sowie Dansylcadaverin 100

µM, Filipin 3 µg/mL, Nocodazol 4 µM, Phenylarsinoxid 20 µM und Chlorpromazin 14 µM (s. Ab-

schnitt 1.1.2) eingesetzt. Als Kontrolle für vollständige Inhibition wurde Triton X-100 verwendet.

BSA und cBSA zeigten beide im 100fachen Überschuss einen inhibitorischen Effekt, wobei dieser

bei cBSA stärker ausgeprägt ist. Nicht nur cBSA scheint daher in der Lage die Aufnahme von

cBSA-Liposomen zu erschweren. BSA könnt durch Adsorption an die Membranen der PBCEC eine

Interaktion mit cBSA-Liposomen verhindern. Von den anderen eingesetzten Inhibitoren konnte

lediglich bei Chlorpromazin und hier auch nur in einem Fall ein Effekt gezeigt werden. Dies lässt

daher keine Schlüsse über den Endozytose-Mechanismus zu. Frühere Experimente deuten jedoch

auf einen über caveolae vermittelten Mechanismus hin.[172]

4. In vitro Experimente 131

Abbildung 4.9: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von 100 µM cBSA-Liposomen unter Einfluss verschiedener Inhibitoren bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8). (DC = Dansylcadaverin, ND = No-codazol, PhAsO = Phenylarsinoxid, CP = Chlorpromazin)

132 4. In vitro Experimente

4.2 Aufnahme von ApoE-Liposomen

4.2.1 Konzentrationsabhängige Aufnahme

Als Alternative zu cBSA wurden mit einem Peptidfragment von ApoE, das die an den LDL-

Rezeptor bindende Domäne enthält, konjugierte Liposomen auf ihre Aufnahme in PBCEC unter-

sucht. Zunehmende Ausgangskonzentrationen von ApoE-Liposomen führten zu höheren liposoma-

len Konzentrationen im Zelllysat (s. Abb. 4.10). Unterhalb von 100 µM eingesetzten Liposomen

ließen sich keine verlässlichen Werte bestimmen. Die maximale Konzentration im Zelllysat wurde

bei einer Ausgangskonzentration von 5 mM erreicht und betrug zwischen 16,89 ± 0,78 und 23,2 ±

1,1 µM. cBSA-Liposomen erreichten bereits mit 1 mM etwa das Doppelte (s. Abschnitt 4.1.1).

Abbildung 4.10: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von ApoE-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Bezogen auf die eingesetzten Liposomenmengen ergaben sich für ApoE-Liposomen Effizienzen

von 0,338 ± 0,019 bis 1,50 ± 0,17 % (s. Abb. 4.11), was im besten Fall gegenüber cBSA-

Liposomen etwa ein Zehntel beträgt (s. Abschnitt 4.1.1).

4. In vitro Experimente 133

Abbildung 4.11: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von ApoE-Liposomen bei unter-schiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Ferner lässt sich für ApoE-Liposomen kein Maximum der Effizienz wie bei cBSA-Liposomen beo-

bachten. Mit Ausnahme einiger abweichender Werte befindet sich die Effizienz durchgängig auf

einem ähnlichen Niveau. Einzig bei 5 mM lässt sich eine leichte Verringerung beobachten. Da

ApoE-Liposomen über den LDL-Rezeptor in PBCEC aufgenommen werden und somit Membran-

Sättigungseffekte keinen Einfluss haben, erklärt sich dieser Effekt. Die Aufnahme wird durch die

Anzahl freier Rezeptoren nicht der Oberfläche freier Membran bestimmt. Eine Absättigung aller

Rezeptoren ist denkbar, scheint aber bei den getesteten Konzentrationen nicht aufzutreten.

134 4. In vitro Experimente

4.2.2 Zeitabhängige Aufnahme

Bei der Beobachtung der Aufnahme von ApoE-Liposomen zu verschiedenen Zeitpunkten bei einer

Ausgangskonzentration von 500 µM zeigt sich zwischen 0,5 und 3 h keine Veränderung an der

Menge aufgenommener Liposomen (s. Abb. 4.12). Bereits nach einer halben Stunde ist ein Wert

von im Mittel 1,07 ± 0,18 % erreicht, der sich im Verlauf der restlichen zweieinhalb Stunden nur

bis auf 1,36 ± 0,18 % erhöht.

Abbildung 4.12: Prozentuale Aufnahme zweier Ansätze von 500 µM ApoE-Liposomen zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind ange-geben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Die Aufnahme von ApoE-Liposomen erscheint so schnell zu erfolgen, dass die von PBCEC auf-

nehmbare Menge bereits nach einer halben Stunde endozytiert wurde. Weitere Liposomen werden

in Folge von den Zellen nur sehr langsam bis gar nicht mehr aufgenommen. Da es sich um eine

Rezeptor vermittelte Endozytose handelt, ist es denkbar, dass alle Rezeptoren mit Liposomen inter-

nalisiert wurden und für weitere Endozytose nicht mehr zur Verfügung stehen bis sie recycelt wer-

den. Das nicht Auftreten einer maximalen Effizienz bei der Untersuchung zur konzentrationsabhän-

gigen Aufnahme spricht jedoch dagegen, da bei einer zehnfach höheren als hier getesteten Konzent-

ration die Effizienz gleich hoch ausfiel. Andere zellinterne Sättigungseffekte müssen ebenfalls eine

Rolle spielen.

4. In vitro Experimente 135

4.3 Aufnahme von Transferrin-Liposomen

Neben cBSA und ApoE wurden Aufnahmeexperimente an PBCEC mit Transferrin (Tf) konjugier-

ten Liposomen als einer weiteren Alternative durchgeführt. Der Aufnahme von Tf-Liposomen lässt

sich zu steigenden Ausgangskonzentrationen kein klarer Trend zuweisen (s. Abb. 4.13). Die höchs-

te Konzentration an Liposomen im Zelllysat wurde in einem von drei Ansätzen für 250 µM erreicht

und betrug 9,11 ± 0,97 µM. Dies entspricht etwa einem Drittel der von cBSA-Liposomen erreichten

Konzentration bei 250 µM. Sowohl bei 500 µM als auch bei 1 mM wurden geringere Konzentratio-

nen erreicht. Weitere Ansätze bei 250 µM zeigten lediglich Konzentrationen um 1 µM.

Abbildung 4.13: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von Tf-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Die Berechnung der prozentualen Aufnahme ergab für 100 µM ein Maximum von

6,59 ± 0,40 %, was in etwa der Hälfte von cBSA-Liposomen entspricht. Bei höheren Konzentratio-

nen nahm die Effizienz ab (s. Abb. 4.14). Dies lässt auf einen Sättigungseffekt schließen, wie er für

eine Rezeptor vermittelte Endozytose über den Transferrin-Rezeptor zu erwarten wäre.

136 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.14: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von Tf-Liposomen bei unterschiedli-chen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind an-gegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Auf Grund der von Ansatz zu Ansatz stark abweichenden Werte und der damit einhergehenden

schlechten Reproduzierbarkeit wurde auf eine zeitabhängige Betrachtung der Aufnahme von Tf-

Liposomen verzichtet.

4. In vitro Experimente 137

4.4 Aufnahme von Liposomen ohne Vektor

Um den Effekt der einzelnen Protein-Vektoren besser einschätzen zu können wurden Liposomen

ohne Vektor, sowohl mit PEG-Hülle als auch ohne, auf ihre Aufnahme in PBCEC untersucht.

4.4.1 Aufnahme von Liposomen mit PEG-Hülle

Liposomen mit PEG-Hülle ohne Vektor (PEG-Liposomen) zeigten erst ab 1 mM Ausgangskonzent-

ration eine detektierbare Fluoreszenz im Zelllysat (s. Abb. 4.15). Die maximale Konzentration von

26,0 ± 2,9 µM wurde für 2,5 mM erreicht.

Abbildung 4.15: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von PEG-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Prozentual betrachtet erreicht die Aufnahme bei 1 mM ihre maximale Effizienz von 0,546 ±

0,060 bis 1,34 ± 0,17 % (s. Abb. 4.16). Für höhere Konzentrationen fällt sie geringer aus, was

auch hier auf eine Sättigung der Membran oder der Endozytose-Kapazitäten schließen lässt. In

Tabelle 4.3 sind die jeweils maximalen prozentualen Aufnahmen für cBSA-, ApoE- und Tf-

Liposomen im direkten Vergleich zu PEG-Liposomen für drei Konzentrationen angegeben.

138 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.16: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze von PEG-Liposomen bei unter-schiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Tabelle 4.3: Maximale, prozentuale Aufnahme für cBSA-, ApoE- und Tf-Liposomen im Vergleich zu PEG-Liposomen. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Ausgangskonzentration PEG (%) cBSA (%) ApoE (%) Tf (%)

250 µM 0 11,6 ± 1,1 0,755 ± 0,065 3,64 ± 0,43

1 mM 1,34 ± 0,17 4,89 ± 0,23 1,05 ± 0,13 0,547 ± 0,074

2,5 mM 1,04 ± 0,13 - 0,86 ± 0,19 -

cBSA-Liposomen liegen im direkten Vergleich bei 1 mM etwa beim 3,5fachen von PEG-

Liposomen. ApoE- und Tf-Liposomen liegen bei etwa drei Viertel bzw. der Hälfte. Lediglich bei

einer Konzentration von 250 µM können ApoE- und Tf-Liposomen gegenüber PEG-Liposomen

einen Vorteil geltend machen, bleiben aber weit hinter cBSA-Liposomen zurück. Die Anbindung

von ApoE und Tf behindert anscheinend die Aufnahme von Liposomen bei höheren Konzentratio-

nen. Arbeiten die Rezeptoren an ihrer Kapazitätsgrenze kann der Rezeptor vermittelte Mechanismus

gegenüber der unspezifischen adsorptiven Aufnahme von PEG-Liposomen benachteiligt sein. Bei

geringeren Konzentrationen jedoch scheint sich die Affinität von Substrat und Rezeptor vorteilhaft

auszuwirken und führt zur Aufnahme, wo PEG-Liposomen keine zeigen. In vivo könnte dieser Ef-

fekt ausschlaggebend für eine erfolgreiche Passage der BHS sein, die anderweitig nicht erfolgen

würde.

4. In vitro Experimente 139

4.4.2 Aufnahme von Liposomen ohne PEG-Hülle

Für Liposomen ohne Vektor und ohne PEG-Hülle (O-Liposomen) sind ebenfalls für Ausgangskon-

zentrationen unter 1 mM keine Liposomen im Zelllysat nachweisbar (s. Abb. 4,17). Die maximale

Konzentration wird wie bei PEG-Liposomen für 2,5 mM erreicht und beläuft sich auf 51,9 ± 7,2

µM, womit PEG-Liposomen etwa um das Doppelte übertroffen werden, was sich durch die schüt-

zende PEG-Hülle erklären lässt.

Abbildung 4.17: Liposomale Konzentration im Zelllysat dreier Ansätze von O-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Die Umrechung auf prozentuale Aufnahme ergibt ein Maximum bei 2,5 mM. Erreicht werden zwi-

schen 1,36 ± 0,21 und 2,08 ± 0,32 %. Über 2,5 mM fällt die Effizienz wieder ab. Das spätere Errei-

chen des Maximums gegenüber PEG-Liposomen lässt eine höhere Kapazität der Membran bzw.

Endozytose für O-Liposomen vermuten. Tabelle 4.4 stellt die maximale prozentuale Aufnahme von

O-Liposomen cBSA-, ApoE- und Tf-Liposomen gegenüber.

140 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.18: Prozentuale Aufnahme dreier Ansätze O-Liposomen bei unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen bestimmt durch Fluoreszenz von DPPE-RH. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Tabelle 4.4: Maximale, prozentuale Aufnahme für cBSA-, ApoE- und Tf-Liposomen im Vergleich zu O-Liposomen. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Ausgangskonzentration O (%) cBSA (%) ApoE (%) Tf (%)

250 µM 0 11,6 ± 1,1 0,755 ± 0,065 3,64 ± 0,43

1 mM 1,67 ± 0,19 4,89 ± 0,23 1,05 ± 0,13 0,547 ± 0,074

2,5 mM 2,08 ± 0,32 - 0,86 ± 0,19 -

Im Prinzip zeigt sich für O-Liposomen das gleiche Bild wie für PEG-Liposomen. Auf Grund der

besseren Aufnahme von O-Liposomen erreichen cBSA-Liposomen nur etwa das Dreifache. ApoE-

Liposomen kommen auf zwei Drittel und Tf-Liposomen auf ein Drittel. Wie auch bei PEG-

Liposomen können ApoE- und Tf-Liposomen bei geringeren Konzentrationen eine Aufnahme vor-

weisen, wo O-Liposomen keine zeigen. Gründe und Folgerungen aus diesen Effekten sind diesel-

ben wie bereits oben erläutert (s. Abschnitt 4.4.1).

4. In vitro Experimente 141

4.5 Zytotoxizität

4.5.1 Toxizität von Liposomen

Um die Zytotoxizität der verwendeten liposomalen Formulierung zu untersuchen wurden Liposo-

men ohne Protein-Vektor (PEG-Liposomen) mit PBCEC inkubiert und ein Alamar Blue®-Test

durchgeführt (s. Abschnitt 2.6.5). Getestet wurden Konzentrationen an Liposomen von 250 µM,

500 µM und 1 mM. Die gemessene Fluoreszenz der Positivkontrolle (unbehandelte Zellen) wurde

zu 100 % gesetzt. Als Negativkontrolle wurden PBCEC mit 1% Triton X-100 lysiert. Alle betrach-

teten Konzentrationen zeigen zwischen 1 und 3 h nach der Inkubationsphase eine Reduktion der

Zellviabilität auf etwa 25 % (s. Abb. 4.19 – 4.21). Nach 20 h hatten sich alle Zellen jedoch wieder

weitestgehend erholt und lieferten Viabilitäten um 90 %. Die Negativkontrollen ergaben 5 % und

darunter. Eine Erholung der Zellen nach 20 h war hier nicht zu erkennen.

Abbildung 4.19: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 250 µM PEG-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, PEG-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

142 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.20: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 500 µM PEG-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, PEG-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Abbildung 4.21: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 1 mM PEG-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, PEG-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Der Alamar Blue®-Test beruht auf der Reduktion von Resazurin (blau) zu Resorufin (pink, fluores-

zierend)[225] durch NADH (s. Abb. 4.22). Verringerte Viabilitäten müssen nicht zwangsläufig auf

tote Zellen zurückzuführen sein. Wird die Reduktionsfähigkeit der Zellen, z. B. durch anderweiti-

gen Verbrauch von NADH, beeinflusst oder es findet eine Reoxidation von Resorufin statt, so kann

dies im Alamar-Blue®-Test zu falschen Ergebnissen führen. Weitere Viabilitätstests, die auf ande-

4. In vitro Experimente 143

ren Prinzipien beruhen, z. B. der LDH-Assay[226], wären von Nöten um eine klare Aussage zu tref-

fen. Da jedoch nach 20 h die Viabilität der PBCEC wieder fast 100 % erreicht hatte, scheint der

Effekt reversibel zu sein.

N+

OOH O

O-

N

OOH O

NADH/H+

NAD+/H2O

Resazurin Resorufin

Abbildung 4.22: Alamar Blue® Reaktion.

4.5.2 Toxizität von cBSA

Bei der Bestimmung der Toxizität der Protein-Vektoren wurde auf ApoE und Transferrin verzich-

tet, da es sich bei diesen ohnehin um Proteine handelt die im Organismus vorhanden sind. Die To-

xizität von cBSA für PBCEC wurde in Konzentration von 1, 10 und 25 nM ermittelt. Eine Konzent-

ration von 1 nM zeigte eine reduzierte Viabilität über 25 h von etwa 30 % gegenüber einer Negativ-

kontrolle von etwa 5 % (s. Abb. 4.23). Die höheren Konzentrationen ergaben Viabilitäten von 5 bis

10% über 22 h bei Negativkontrollen von ebenfalls 5 bis 10 % (s. Abb. 4.24 & 4.25). Nach 22 h

übersteigt die Negativkontrolle cBSA sogar deutlich.

144 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.23: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 1 nM cBSA. Positivkon-trolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Abbildung 4.24: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 10 nM cBSA. Positivkon-trolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

4. In vitro Experimente 145

Abbildung 4.25: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 25 nM cBSA. Positivkon-trolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

cBSA zeigt in sehr geringen Konzentrationen eine ausgeprägte Zytotoxizität. Zwar behalten die

zuvor erwähnten Einschränkungen des Alamar Blue®-Test auch hier ihre Gültigkeit (s. Abschnitt

4.5.1), aber eine Reversibilität konnte nicht beobachtet werden. Eine Konzentration von 10 nM

cBSA entspräche, bei einer Kopplungseffizient von 50 % und einem Anteil von 1 mol-% an Linker-

Lipid, lediglich 2 µM cBSA-Liposomen. Diese Menge liegt um zwei bis drei Größenordnungen

unter den Konzentrationen, mit denen eine erfolgreiche Aufnahme in PBCEC erfolgte (s. Abschnitt

4.1.1). Entweder wird die apparente Zytotoxizität von cBSA durch direkte Reaktion mit Resazurin

bzw. Resorufin hervorgerufen oder liposomal gebundenes cBSA besitzt eine geringere Toxizität.

4.5.2 Toxizität von cBSA-Liposomen

Die Zytotoxizität von cBSA-Liposomen wurde bei Konzentrationen von 250 µM, 500 µM und 1

mM getestet. Für 250 und 500 µM ergaben sich über den Verlauf von 25 h konstante Viabilitäten

von etwa 50 % bei Negativkontrollen von 5 % und weniger (s. Abb. 4.25 & 4.26). 1 mM zeigte eine

leicht geringere Viabilität von etwa 40 % gegenüber Negativkontrollen von ebenfalls 5 % und dar-

unter (s. Abb. 4.27).

146 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.25: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 250 µM cBSA-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Abbildung 4.26: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 500 µM cBSA-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

4. In vitro Experimente 147

Abbildung 4.27: Zellviabilität nach zweistündiger Inkubation mit 1 mM cBSA-Liposomen. Positivkontrolle = hellgrau, Negativkontrolle = dunkelgrau, cBSA-Liposomen = schwarz. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 8).

Eine Reversibilität der Viabilitätsreduktion wie bei PEG-Liposomen ist nicht zu beobachten. PEG-

Liposomen hatten dafür einen doppelt so schweren Effekt unter 20 h (s. Abschnitt 4.5.1). Die einge-

setzten Konzentrationen von 250 µM, 500 µm und 1 mM entsprechen, bei

50 % Kopplungseffizienz, cBSA-Konzentrationen von 1,25, 2,5 bzw. 5 µM und sind damit um zwei

Größenordnungen höher als diejenigen, für die cBSA alleine schon vollständige Zytotoxizität zeigte

(s. Abschnitt 4.5.2). Die Anbindung von cBSA an Liposomen reduziert die Zytotoxizität von erste-

rem drastisch. Die verringerte Mobilität könnte der dafür Ausschlag gebende Faktor sein.

148 4. In vitro Experimente

4.6 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

4.6.1 Einfache Fluoreszenzaufnahmen

Zur Untersuchung der Lokalisation der aufgenommenen Liposomen in PBCEC wurden konfokale

Fluoreszenzaufnahmen angefertigt (s. Abschnitt 2.7.3). Die detektierte Fluoreszenz von DPPE-RH

zeigt deutliche zelluläre Strukturen und die Umrisse von Zellkernen (s. Abb. 4.28 & 4.30). Inner-

halb der Zellen sind kreisförmige Gebilde von stärkerer Fluoreszenz zu erkennen. Die Überlagerung

der Fluoreszenz- mit Durchlichtaufnahmen verdeutlicht die zelluläre Lokalisation der Fluoreszenz

(s. Abb. 4.29 & 4.31).

Abbildung 4.28: Konfokale Aufnahme von PBCEC nach zweistündiger Inkubation mit 175 µM cBSA-Liposomen in 63facher optischer Vergrößerung. Links: Fluoreszenz von DPPE-RH, rechts: Durchlicht. Zellkerne sind durch weiße Pfeile markiert.

4. In vitro Experimente 149

Abbildung 4.29: Überlagerung der Aufnahmen aus Abbildung 4.28. Zellkerne sind durch weiße Pfeile markiert.

Abbildung 4.30: Konfokale Aufnahme von PBCEC nach zweistündiger Inkubation mit 175 µM cBSA-Liposomen in 63facher optischer Vergrößerung. Links: Fluoreszenz von DPPE-RH, rechts: Durchlicht. Zellkerne sind durch weiße Pfeile markiert.

150 4. In vitro Experimente

Abbildung 4.31: Überlagerung der Aufnahmen aus Abbildung 4.30. Zellkerne sind durch weiße Pfeile markiert.

Die sich abzeichnenden Umrisse von Zellkernen lässt die Vermutung zu, dass die Liposomen in die

Zellen aufgenommen wurden und nicht nur an ihrer Oberfläche adsorbiert sind. Bei den kreisförmi-

gen Konzentrationen handelt es sich vermutlich um endozytierte Liposomen in Endo- oder Lyso-

somen. In Betracht zu ziehen ist, dass das fluoreszierende Lipid DPPE-RH über Membranfusion

oder Lipidaustausch auch in die Zellmembran gelangen kann. Dies könnte zum einen die diffuse

Fluoreszenz außerhalb der kreisförmigen Konzentrationen erklären. Zum anderen lässt sich dadurch

nicht garantieren, dass die gezeigte Fluoreszenz noch in den Liposomen lokalisiert ist. Da die Lipo-

somen allerdings durch PEG sterisch stabilisiert sind sollten diese Prozesse nicht allzu schnell ab-

laufen.

4.6.2 In z-Richtung gestapelte Fluoreszenzaufnahmen

Durch auf einander folgende Aufnahmen in Abständen von 0,2 µm in z-Richtung konnte die Ab-

zeichnung der Zellkerne in den Fluoreszenzaufnahmen von mit cBSA-Liposomen inkubierten

PBCEC genauer betrachtet werden. Deutlich zu erkennen ist Auftauchen und Verschwinden der

Zellkerne in Folge des Fortschritt in der z-Ebene (s. Abb. 4.32 & 4.33).

4. In vitro Experimente 151

Abbildung 4.32: Konfokale Fluoreszenzaufnahme von PBCEC nach zweistündiger Inkuba-tion mit 175 µM cBSA-Liposomen in 63facher optischer und 1,5facher digitaler Vergröße-rung. Fortschritt in z-Richtung von links nach rechts und von oben nach unten je 0,2 µm.

Abbildung 4.33: Konfokale Fluoreszenzaufnahme von PBCEC nach zweistündiger Inkuba-tion mit 175 µM cBSA-Liposomen in 63facher optischer und 1,5facher digitaler Vergröße-rung. Fortschritt in z-Richtung von links nach rechts und von oben nach unten je 0,2 µm.

152 4. In vitro Experimente

Beim Durchschreiten der z-Ebene werden die Zellen von oben nach unten Schritt für Schritt aufge-

nommen. Das Auftauchen der Zellkerne ist dabei ein Indiz für die erfolgte Aufnahme der Liposo-

men in die PBCEC. Ob die für die Passage der BHS nötige Transzytose erfolgt, ließ sich mit dieser

Methode allerdings nicht nachweisen.

4. In vitro Experimente 153

4.7 Zusammenfassung

Die Experimente zur Aufnahme von liposomalen Konjugaten von kationisiertem Albumin, dem

Rezeptor bindenden Peptidfragment von ApoE und Transferrin in Hirnkapillar-Endothelzellen aus

Schweinehirnen zeigten eine deutliche Überlegenheit von cBSA-Liposomen. Tabelle 4.5 zeigt eine

vergleichende Aufstellung der maximalen Aufnahmen der drei liposomalen Konjugate für drei ver-

schiedene Konzentrationen. Bei allen führten zunehmende eingesetzte Konzentrationen zu höheren

Aufnahmen. Die maximale Effizienz lag für cBSA und Transferrin bei 100 µM, für ApoE bei

500 µM (s. Abschnitte 4.1 – 4.3).

Tabelle 4.5: Maximale Aufnahmen für cBSA-, ApoE- und Tf-Liposomen bei drei verschie-denen Konzentrationen. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standard-abweichung (n =8).

100 µM 250 µM 500 µM Vektor

µM % µM % µM %

cBSA 15,0 ± 1,1 15,0 ± 1,1 29,0 ± 2,8 11,6 ± 1,1 41,5 ± 3,7 8,29 ± 0,74

ApoE 1,20 ± 0,33 1,20 ± 0,33 1,89 ± 0,14 0,755 ± 0,065 7,48 ± 0,77 1,50 ± 0,17

Tf 6,59 ± 0,40 6,59 ± 0,40 9,11 ± 0,97 3,64 ± 0,43 6,79 ± 0,93 1,36 ± 0,18

Zu den Konzentrationen ihrer maximalen Effizienz wurden ApoE- und Tf- von cBSA-Liposomen

um das 5,5 bzw. 2,3fache übertroffen. Bei anderen Konzentrationen konnte der Vorteil von cBSA

gegenüber ApoE und Tf bis zum 12,5 bzw. 6,1fachen reichen. Unter

100 µM Ausgangskonzentration konnten ApoE und Tf-Liposomen nicht in PBCEC nachgewiesen

werden. cBSA-Liposomen erreichten diese Schwelle erst bei 10 µM. Beim Vergleich gegenüber

Liposomen ohne Vektor mit und ohne PEG-Hülle zeigte sich darüber hinaus, dass ApoE- und Tf-

Liposomen auch diesen an Effizienz nachstehen. Lediglich bei geringen Konzentrationen konnte

eine Aufnahme erreicht werden, wo Liposomen ohne Vektor keine zeigten (s. Abschnitt 4.4). Bei

einer in vivo Applikation dürfte die Lage allerdings gänzlich anders aussehen, da Liposomen ohne

PEG-Hülle vom mononukleären Phagozytensystem aufgenommen werden und Liposomen mit

PEG-Hülle ohne Vektor kaum in ausreichenden Konzentrationen die Hirnkapillar-Endothelzellen

erreichen dürften. Die hohe Affinität von Substrat zu Rezeptor dürfte hier entscheidend sein.

Liposomen ohne Vektor zeigten eine moderate Zytotoxizität gegenüber PBCEC, die sich nach über

20 h wieder erholten. Für cBSA wurde eine bereits in Konzentrationen im zweistelligen nanomola-

ren Bereich starke Toxizität gefunden. Gebunden an Liposomen verringerte sich dieser Effekt aller-

dings drastisch, so dass selbst cBSA-Liposomen entsprechend einer 100fach stärkeren Konzentrati-

on, welche für cBSA alleine zu 100% toxisch war, nur eine verringerte Viabilität von 50 % ergab

154 4. In vitro Experimente

(s. Abschnitt 4.5). Somit wurde die Toxizität von cBSA an Liposomen gegenüber der freien Form

um das 200fache verringert. Zu beachten bleibt, dass der verwendete Toxizitätstest auf einer Re-

dOx-Reaktion beruht, die auch durch andere Faktoren beeinflussbar ist.

Konfokale Fluoreszenzaufnahmen von mit cBSA-Liposomen inkubierten PBCEC zeigten kreisför-

mige Konzentrierungen von Fluoreszenz von DPPE-RH, was den Schluss einer vesikulären An-

sammlung von Liposomen Endosomen oder Lysosomen zulässt (s. Abschnitt 4.6.1). Gestapelte

Aufnahmen durch die z-Ebene zeigten darüber hinaus das Auftauchen bzw. Verschwinden der Um-

risse von Zellkernen, was wiederum eine Aufnahme der Liposomen ins Zellinnere vermuten lässt

(s. Abschnitt 4.6.2). Da Membranfusion sowie Lipidaustausch zwischen Liposom und Zellmembran

nicht auszuschließen sind, lässt sich die Lokalisation von DPPE-RH nicht hundertprozentig mit der

von Liposomen gleichsetzen.

5. In vivo Experimente 157

5. In vivo Experimente Alle für in vivo Applikation verwendeten Liposomen enthielten 1 mol-% DSPE-PEG-MI und 1 w-

% DPPE-RH. Proteine zur Kopplung wurden im 5fachen Überschuss zum Linker-Lipid zugegeben.

5.1 Gewebeschnitte zur Verteilung von cBSA-Liposomen

5.1.1 Drei Stunden nach Applikation

Von Gehirn, Leber und Milz angefertigte Gefrierschnitte männlicher Wistar-Ratten wurden mittels

konfokaler Mikroskopie auf Fluoreszenz von in Liposomen enthaltenem DPPE-RH untersucht. Zur

Orientierung wurden die Kapillaren durch FITC-BSA grün angefärbt. Die Gewebeschnitte für das

Gehirn 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen zeigen in zwei von drei Tieren

gegenüber der Kontrolle eine deutliche rote Fluoreszenz (s. Abb. 5.1, C & D). Die von FITC-BSA

gefärbten Hirnkapillaren sind in grün zu sehen. Tabelle 5.1 gibt die Eigenschaften der verwendeten

Liposomen sowie die applizierte Dosis an.

Tabelle 5.1: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.1 – 5.4. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Durchmesser (nm) 132,8 ± 1,3

PDI 0,186 ± 0,017

Zetapotential (mV) 3,65 ± 3,3

Dosis (mg/kg KG) ~ 15

158 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.1: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 130 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Die Punkförmigkeit der roten Fluoreszenz lässt auf intakte Liposomen schließen (vgl. Abb. 5.2).

Rote, punktförmige Fluoreszenz außerhalb der grünen Kapillaren würde demnach bedeuten, dass

Liposomen die Blut-Hirn Schranke überwinden konnten. In einigen Fällen sind rote Punkte in den

schwarzen Gewebebereichen oder unmittelbar in Kapillarennähe zu erkennen.

Aufnahmen von Leber- und Milzschnitten lassen in der Leber keine rote Fluoreszenz erkennen (s.

Abb. 5.3). Für zwei von drei Tieren ist in der Milz jedoch sowohl punktförmige als auch diffuse

Fluoreszenz zu sehen (s. Abb. 5.4, B & C). Ob die Liposomen sich in Gefäßen oder interstitieller

Flüssigkeit befinden, lässt sich nicht sagen, da die sich die Färbung mit FITC-BSA nicht nur auf die

Gefäßwände beschränkt, da die Endothelielen in Leber und Milz keine Barriere für das Protein dar-

stellen.

5. In vivo Experimente 159

Abbildung 5.2: Mikroskopaufnahme einer liposomalen Dispersion in PBS. Fluoreszenz von DPPE-RH (links) und Durchlicht (rechts).

Abbildung 5.3: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 130 nm). A: Kontrolle, B-C: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

160 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.4: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 130 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Die Inkorporation von DSPE-MPEG soll die Liposomen zwar vor Aufnahme von Makrophagen in

Leber und Milz schützen, jedoch ist bislang unbekannt welche Wirkung die Addition von cBSA

hat. In jedem Fall kann vermutet werden, dass cBSA-Liposomen von der Milz, nicht aber von der

Leber aufgenommen werden.

5. In vivo Experimente 161

Abbildung 5.5: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 180 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Experimente mit Liposomen größeren Durchmessers zeigten ein etwas anderes Bild. In den Gefrier-

schnitten der Gehirne sind nur vereinzelt Liposomen zu erkennen (s. Abb. 5.5). Aufnahmen der

Leber zeigen wie zuvor keine Fluoreszenz (s. Abb. 5.6). In der Milz wiederum sind eine Vielzahl

von Liposomen zu sehen (s. Abb. 5.7).

Ob eine verstärkte Aufnahme der größeren Liposomen in die Milz erfolgte, lässt sich auf Grund der

Intensität der roten Fluoreszenz in den Gewebeschnitten schwer sagen, da es sich nur um repräsen-

tative Ausschnitte handelt. Für die Aufnahme ins Gehirn allerdings scheint der größere Durchmes-

ser unvorteilhaft. In Tabelle 5.2 sind die Eigenschaften und die applizierte Dosis der größeren Lipo-

somen angegeben.

162 5. In vivo Experimente

Tabelle 5.2: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.5 – 5.7. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Durchmesser (nm) 182,4 ± 4,5

PDI 0,1560 ± 0,0083

Zetapotential (mV) 7,74 ± 0,44

Dosis (mg/kg KG) 9 - 14

Abbildung 5.6: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 180 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 163

Abbildung 5.7: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~ 180 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

164 5. In vivo Experimente

5.1.2 Sechs Stunden nach Applikation

Um einen längeren Zeitraum nach der Applikation zu untersuchen, wurden Gefrierschnitte 6 h nach

intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen angefertigt. Es wurden Liposomen zweier unter-

schiedlicher Größen verwendet. Tabelle 5.3 führt die Eigenschaften und die Dosis der applizierten

Liposomen auf.

In den Gewebeschnitten der Tiere, die kleinere Liposomen erhielten, sind erneut in zwei von drei

Schnitten mehrere bis viele Liposomen zu erkennen (s. Abb. 5.8, B & D). Für die größeren Lipo-

somen konnten nur vereinzelte gefunden werden (s. Abb. 5.9, C & D).

Abbildung 5.8: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 6 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~120 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 165

Tabelle 5.3: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.8 & 5.9. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Abb. 5.8 Abb. 5.9

Durchmesser (nm) 122,0 ± 0,72 182,4 ± 4,5

PDI 0,308 ± 0,034 0,1560 ± 0,0083

Zetapotential (mV) 6,57 ± 0,32 7,74 ± 0,44

Dosis (mg/kg KG) ~ 22 9 - 14

Diese Ergebnisse decken sich mit dem Bild nach 3 h. Ein bemerkbarer Unterschied zwischen den

Liposomenmengen bei 3 und 6 h ist nicht zu erkennen. In beiden Fällen wurden die größeren Lipo-

somen kaum ins Gehirn aufgenommen oder in den Kapillaren zurückgehalten. Auf eine Betrach-

tung von Leber und Milz wurde bei 6 h verzichtet.

Abbildung 5.9: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 6 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~180 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

166 5. In vivo Experimente

5.1.3 Eine Stunde nach Applikation

Um auch kürzere Zeiträume zu betrachten, wurden wurden Gefrierschnitte 1 h nach intravenöser

Applikation untersucht. Tabelle 5.4 fasst die Daten zu den Liposomen zusammen.

Tabelle 5.4: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.10 – 5.12. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Durchmesser (nm) 122,0 ± 0,72

PDI 0,308 ± 0,034

Zetapotential (mV) 6,57 ± 0,32

Dosis (mg/kg KG) ~ 22

Abbildung 5.10: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 1 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~120 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 167

Im Gewebe außerhalb der Kapillaren ist keine rote Fluoreszenz zu erkennen. Bei zwei Aufnahmen

können im Lumen größerer Blutgefäße Liposomen detektiert werden (s. Abb. 5.10, B & C). Es hat

den Anschein als ob cBSA-Liposomen nach 1 h noch nicht bis ins Gehirn vordringen konnten.

Gefrierschnitte der Leber zeigen zum Teil eine starke, rote Fluoreszenz (s. Abb. 5.11, B). Da durch

FITC-BSA hier aber keine Kapillaren oder Gefäße erkennbar sind, ist eine Zuordnung schwierig.

Möglicherweise handelt es sich auch um beschädigtes Gewebe. Die Tatsache, dass nach 3 h keine

Liposomen in der Leber nachgewiesen wurden, legt den Schluss nahe, dass hier ein Abbau oder

Abtransport innerhalb der ersten drei Stunden nach Applikation erfolgt.

Abbildung 5.11: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 1 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~120 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

168 5. In vivo Experimente

Die rote Fluoreszenz in der Milz ist wesentlich stärker ausgeprägt als nach 3 oder 6 h (s. Abb. 5.12).

Einzelne Liposomen sind nur wenige zu erkennen. Um die Abnahme der Fluoreszenzintensität in

der Milz, wie in der Leber, erklären zu können, muss bereits früh ein Abbau der cBSA-Liposomen

erfolgen, um von der gezeigten hohe Konzentration nach 1 h das Niveau nach 3 h zu erreichen.

Abbildung 5.12: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 1 h nach intravenöser Applikation von cBSA-Liposomen (~120 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 169

5.1.4 24 Stunden nach Applikation

Um über die Dauer des Verbleibs von cBSA-Liposomen im Gehirn der Versuchtiere Aufschluss zu

erhalten, wurden Gefrierschnitte des Gehirns 24 h nach Applikation betrachtet. In den Aufnahmen

aller drei Tiere sind mehrere, mitunter schwache, rote Fluoreszenzpunkte jenseits der grün gefärbten

Kapillaren zu sehen (s. Abb. 5.13). In Tabelle 5.5 sind die Daten zu den verwendeten Liposomen

angegeben.

Tabelle 5.5: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.13. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Durchmesser (nm) 140,3 ± 1,1

PDI 0,283 ± 0,019

Zetapotential (mV) 8,39 ± 0,67

Dosis (mg/kg KG) ~ 24

Abbildung 5.13: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 24 h nach intravenö-ser Applikation von cBSA-Liposomen (~140 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

170 5. In vivo Experimente

Dies würde bedeuten, dass auch nach 24 h noch Liposomen im Gehirn verbleiben. Über die Integri-

tät derselben lässt sich allerdings keine Aussage treffen. Auch Membranfusion oder der Austausch

von DPPE-RH mit anderen Membranen ist nicht auszuschließen. Die Punktförmigkeit der Fluores-

zenz spricht jedoch dagegen (vgl. Abb. 5.2). In den Liposomen eingeschlossene Substanzen hätten

damit bis zu 24 h Zeit um ins Hirngewebe freigesetzt zu werden. Auf Gefrierschnitten von Leber

und Milz wurde verzichtet, da diese bereits bei kürzeren Zeiträumen hinreichend untersucht wur-

den.

5.1.5 Verwendung von ungereinigten cBSA-Liposomen

Der Aufreinigungsschritt von cBSA-Liposomen nach der Kopplung zur Abtrennung von freiem

cBSA resultiert in ungewünschten Verdünnungseffekten, die die Applikation von größeren Dosen

erschwert. Deshalb wurde getestet, ob die Anwesenheit von freiem cBSA, die für die Aufnahme in

Hirnkapillar-Endothelzellen hinderlich war, sich in vivo ebenfalls negativ auswirkt. Verwendet

wurden cBSA-Liposomen in zwei unterschiedlichen Größen. Tabelle 5.6 gibt deren Eigenschaften

und die applizierte Dosis an. Die Gefrierschnitte wurden 3 h nach Applikation angefertigt.

Tabelle 5.6: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.13. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Abb. 5.14 Abb. 5.15 - 5.17

Durchmesser (nm) 148,2 ± 6,5 192,1 ± 3,4

PDI 0,346 ± 0,034 0,170 ± 0,013

Zetapotential (mV) 0,3 ± 1,4 −2,04 ± 0,35

Dosis (mg/kg KG) ~ 20 12 - 26

In allen drei Hirngewebeschnitten der Versuchstiere nach Applikation der kleineren Liposomen

sind gegenüber der Kontrolle mehrere bis viele Liposomen zu erkennen (s. Abb. 5.14). In einer

Aufnahme sind keine Kapillaren auszumachen, aber die anderen beiden lassen vermuten, dass die

Verteilung ähnlich ist (s. Abb. 5.14, C).

5. In vivo Experimente 171

Abbildung 5.14: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von ungereinigten cBSA-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

In den Gewebeschnitten der Tiere, die größere Liposomen erhielten, ist deutlich weniger rote Fluo-

reszenz zu sehen (s. Abb. 5.15). Darüber hinaus war die Anfärbung der Kapillaren mit FITC-BSA

sehr schwach und daher nur bedingt brauchbar. Dennoch lässt sich sagen, dass die größeren Lipo-

somen erneut kaum aufgenommen wurden.

172 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.15: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von ungereinigten cBSA-Liposomen (~190 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Beide Betrachtungen decken sich mit den Ergebnissen von aufgereinigten cBSA-Liposomen. Ein

Verzicht auf die Aufreinigung hat demnach in vivo keine Auswirkung auf die Aufnahme in Hirnka-

pillar-Endothelzellen zur Folge. Vermutlich sorgt die Verdünnung der liposomalen Dispersion bei

Eintritt in die Blutbahn für eine ausreichende Trennung von freiem und liposomal gebundenem

cBSA, so dass letzteres von ersterem bei der Aufnahme nicht blockiert werden kann.

Gefrierschnitte von Leber und Milz wurden nur für größere Liposomen angefertigt. In der Leber

sind einige Liposomen zu entdecken (s. Abb. 5.16). Bei bisherigen Versuchen konnten nach 3 h

keine Liposomen mehr in der Leber nachgewiesen werden, lediglich nach 1 h. Möglicherweise

spielt hier der größere Durchmesser im Vergleich zu den vorherigen Liposomen eine Rolle. Da frei-

es cBSA die Aufnahme ins Gehirn nicht zu behindern schien, erscheint es unplausibel, dass es für

eine verstärkte Aufnahme in der Leber verantwortlich ist.

5. In vivo Experimente 173

Abbildung 5.16: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von ungereinigten cBSA-Liposomen (~190 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Zwei der drei Gewebeschnitte aus der Milz zeigen starke rote Fluoreszenz, ähnlich in Intensität den

Aufnahmen nach 1 h von gereinigten cBSA-Liposomen (s. Abb. 5.17, B & D). Der Dritte ist ver-

gleichbar mit den Schnitten nach 3 und 6 h (s. Abb. 5.17, C). Auch in der Milz, wie in der Leber

scheint eine verstärkte Aufnahme, gegenüber gereinigten cBSA-Liposomen, erfolgt zu sein. Die

Umstände, die dazu führen, dürften vermutlich ebenfalls an der Größe liegen.

174 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.17: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von ungereinigten cBSA-Liposomen (~190 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 175

5.2 Gewebeschnitte zur Verteilung von BSA-Liposomen

Um in vivo den Vorteil der Kationisierung von BSA für die Aufnahme in Hirnkapillar-

Endothelzellen zu untersuchen, wurden BSA-Liposomen intravenös verabreicht und 3 h nach Ap-

plikation Gefrierschnitte angefertigt. Tabelle 5.7 gibt die Eigenschaften und die applizierte Dosis

der verwendeten Liposomen an.

Tabelle 5.7: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.18 – 5.20. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Durchmesser (nm) 151,9 ± 3,1

PDI 0,327 ± 0,012

Zetapotential (mV) 1,073 ± 0,083

Dosis (mg/kg KG) ~ 13

Im Gehirn sind bei einem von drei Gewebeschnitten gegenüber der Kontrolle mehrere Liposomen

zu sehen (s. Abb. 5.18, D). Bei genauerer Betrachtung ist zu erkennen, dass sich die meisten davon

in Kapillaren befinden. Zumindest einige scheinen jedoch aufgenommen worden zu sein. Da eine

genaue Quantifizierung nicht möglich ist, lässt sich nur qualitativ sagen, dass cBSA-Liposomen wie

erwartet besser ins Gehirn aufgenommen werden. Betrachtungen zur Aufnahme in Leber und Milz

decken sich mit den bisherigen Ergebnissen. In der Leber sind keine Liposomen zu finden, mit

Ausnahme eines Bereichs der einen Gewebeschaden zu zeigen scheint (s. Abb. 5.19, C), was auch

bei cBSA-Liposomen der Fall war. Die Milz zeigt ein ebenfalls zu cBSA-Liposomen vergleichbares

Bild. Bei allen drei Versuchstieren ist diffuse rote Fluoreszenz, jedoch keine punktförmige, die auf

Liposomen schließen ließe, zu sehen (s. Abb. 5.20, B-D). Gegenüber der Kontrolle, die hier selbst

rote Fluoreszenz zeigt (s. Abb. 5.20, A), ist diese stark erhöht, was auf abgebaute Liposomen hin-

weisen könnte.

176 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.18: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von BSA-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 177

Abbildung 5.19: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von BSA-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

178 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.20: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von BSA-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Eine Aufnahme von BSA-Liposomen ins Gehirn erscheint möglich, wenn auch wesentlich geringer

als für cBSA-Liposomen, was auf Grund der Kationisierung auch zu erwarten war. Die Aufnahme

in Leber und Milz ist für beide Liposomenarten ähnlich. Ein Versuch mit größeren BSA-Liposomen

wurde nicht durchgeführt.

5. In vivo Experimente 179

5.3 Gewebeschnitte zur Verteilung von Liposomen ohne Vektor

Das Verhalten von Liposomen mit lediglich einer PEG-Hülle ohne Proteinvektor 3 h nach Applika-

tion wurde ebenfalls betrachtet. Es wurden zwei verschiedene Größen von PEG-Liposomen ver-

wendet. In Tabelle 5.8 sind die Daten der verwendeten Liposomen angegeben.

Tabelle 5.8: Eigenschaften und Dosis der applizierten Liposomen für Abb. 5.21 – 5.24. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Abb. 5.21 & 5.23 - 5.24 Abb. 5.22

Durchmesser (nm) 147,1 ± 1,5 191,8 ± 3,8

PDI 0,167 ± 0,013 0,188 ± 0,021

Zetapotential (mV) -3,57 ± 0,58 -2,74 ± 0,82

Dosis (mg/kg KG) ~ 20 12 - 26

Abbildung 5.21: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von PEG-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

180 5. In vivo Experimente

In einer der drei Gewebeproben sind deutlich eine Vielzahl an Liposomen zu sehen, von denen sich

allerdings alle in Kapillaren befinden (s. Abb. 5.21, D). In den Kapillarzwischenräumen sind bes-

tenfalls vereinzelte Liposomen auszumachen. Für die Gewebeschnitte der größeren Liposomen ließ

sich überhaupt keine rote Fluoreszenz finden (s. Abb. 5.22). Dies bestätigt die Vermutung, dass

Liposomen ab einer bestimmten Größe erst gar nicht in die Hirnkapillaren geschweige in das um-

gebende Parenchym vordringen können.

Abbildung 5.22: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von PEG-Liposomen (~190 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Die Betrachtungen zur Aufnahme von PEG-Liposomen deuten an, dass Liposomen ohne Protein-

vektor nicht in Hirnkapillar-Endothelzellen aufgenommen werden. Ab einer bestimmten Größe sind

sie, wie auch cBSA-Liposomen, nicht in der Lage die Hirnkapillaren zu erreichen. Sind sie klein

5. In vivo Experimente 181

genug scheinen, sie die Kapillaren jedoch nicht verlassen zu können. Eine nicht Vektor vermittelte

Aufnahme von Liposomen war nicht zu erwarten.

Für kleinere Liposomen wurde außerdem die Verteilung in Leber und Milz untersucht. In der Leber

sind vereinzelt und in einem Bereich verstärkt Liposomen zu sehen (s. Abb. 5.23, B). Für cBSA-

und BSA-Liposomen wurde nach 3 h in der Regel keine Liposomen in der Leber gefunden. Der

Bereich verstärkten Auftretens könnte auf einen Gewebeschaden zurückzuführen sein. Vereinzelte

Liposomen könnten trotz PEG-Hülle von der Leber aufgenommen worden sein.

Abbildung 5.23: Gefrierschnitte der Leber männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von PEG-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

Die Gewebeschnitte der Milz zeigen äußerst starke rote Fluoreszenz (s. Abb. 5.24). In den übrigen

Versuchen konnte stets Fluoreszenz in der Milz gesehen werden, aber nicht in diesem Ausmaß.

Dies würde bedeuten, dass PEG-Liposomen innerhalb von 3 h massiv in die Milz aufgenommen

182 5. In vivo Experimente

und vermutlich abgebaut werden. Der „Stealth“-Effekt, den PEG-Liposomen eigentlich besitzen

sollten (s. Abschnitt 1.2.2), wäre demnach relativ begrenzt.

Abbildung 5.24: Gefrierschnitte der Milz männlicher Wistar-Ratten 3 h nach intravenöser Applikation von PEG-Liposomen (~150 nm). A: Kontrolle, B-D: Versuchstiere. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 183

5.4 Verweildauer von cBSA-Liposomen im Kreislauf

Um die Verweildauer von cBSA-Liposomen in der Blutbahn männlicher Wistar-Ratten zu untersu-

chen, wurde den Tieren nach intravenöser Applikation über 24 h mehrfach Blut abgenommen und

das Plasma gewonnen. Fluoreszenzmessungen von DPPE-RH wurden zur applizierten Dosis in

Bezug gesetzt und, unter der Voraussetzung, dass die Tiere 6 % ihres Körpergewichts an Blut besa-

ßen[227], der anteilige Verbleib an Liposomen im Blut berechnet. Der Verlauf der Liposomen-

Konzentration im Blut zeigte einen grob exponentiellen Abbau (s. Abb. 5.25). Nach 24 h waren im

Mittel noch 19,24 ± 0,23 % im Kreislauf vorhanden.

Abbildung 5.25: Blutspiegelkurve von cBSA-Liposomen in männlichen Wistar-Ratten über 24 h nach Applikation. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Raute = Kontrolle (PBS ohne Liposomen); Quadrat, Dreieck, Kreis = Versuchstiere.

Das Anlegen einer Ausgleichsfunktion für exponentielle Zerfälle erlaubte die Bestimmung der

Halbwertszeit von cBSA-Liposomen im Blut der Tiere (s. Abb. 5.26).

184 5. In vivo Experimente

Abbildung 5.26: Blutspiegelkurve von cBSA-Liposomen aus Abb. 5.25 mit exponentiellem Fit. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Raute = Kontrolle; Quadrat, Dreieck, Kreis = Versuchstiere.

Die Form der Funktion und ihre Werte für die drei Kurven sind in Gleichung 5.1 und Tabelle 5.9

angegeben.

xy a b c= − ⋅

Gleichung 5.1: exponentielle Ausgleichsfunktion für Abb. 5.26.

Tabelle 5.9: Werte der Ausgleichsfunktion für Gleichung 5.1.

#1 #2 #3

a 1,6 ± 8,9 5,6 ± 7,0 3,5 ± 9,1

b −77,6 ± 6,9 −77,3 ± 5,3 −77,6 ± 6,9

c 0,939 ± 0,016 0,932 ± 0,015 0,934 ± 0,019

Einsetzen für y von 50 % lieferte die Halbwertszeit. Sie betrug im Mittel für die drei Kurven 7,62 ±

0,15 h. Die Größe der Liposomen, die in diesem Experiment verwendet wurden, betrug 140,3 ± 1,1

nm. Eine Zirkulation der cBSA-Liposomen scheint für die hier untersuchte Formulierung über ei-

nen Zeitraum von 24 h gut gewährleistet zu sein. Zumindest für Liposomen eines Durchmesser von

etwa 140 nm und vermutlich auch darunter. Da nach 24 h noch etwa 20% der ursprünglichen Dosis

im Kreislauf vorhanden sind, muss sich die Aufnahme in andere Gewebe, vor allem Leber und Milz

in Grenzen halten, was sich gut mit den Fluoreszenzaufnahmen der Gefrierschnitte deckt.

5. In vivo Experimente 185

Um sicher zu gehen, dass die bestimmte Fluoreszenz von intakten Liposomen stammte, wurde eine

Plasmaprobe nach 24 h im konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet (s. Abb. 5.27). Die punkt-

förmige rote Fluoreszenz charakteristisch für Liposomen ist gut zu erkennen (vgl. Abb. 5.2). Damit

lässt sich mit relativer Sicherheit sagen, dass es sich um Liposomen handelt und, dass diese auch

nach 24 h noch im Blutkreislauf zirkulieren.

Abbildung 5.27: Mikroskopaufnahme von Rattenplasma 24 h nach Applikation. Fluores-zenz von DPPE-RH (links) und Durchlicht (rechts).

186 5. In vivo Experimente

5.5 Zusammenfassung

Die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Hirnschnitte von männlichen Wistar-Ratten zeigte eine

starke Assoziation von cBSA-Liposomen bestimmter Größen mit Hirnkapillaren. In verschiedens-

ten Schnitten nach konnten darüber hinaus Liposomen im Gewebe zwischen den Kapillaren ausge-

macht werden (s. Abschnitte 5.1.1 − 5.1.4). Nach 3, 6 und 24 h konnte eine Aufnahme nachgewie-

sen werden. Nach 1 h hingegen scheint diese noch nicht erfolgt zu sein (s. Abschnitt 5.1.3). Freies

cBSA hat entgegen den Ergebnissen der in vitro Experimente keine negativen Auswirkungen auf

die Aufnahme von cBSA-Liposomen (s. Abschnitt 5.1.5), was vermutlich mit der starken Verdün-

nung durch den Eintritt in die Blutbahn zusammenhängt. BSA-Liposomen zeigten ebenfalls eine,

wenn auch geringe, Fähigkeit zur Kapillarassoziation und Endothelpenetration (s. Abschnitt. 5.2).

Liposomen ohne Proteinvektor konnten zwar in die Kapillaren nicht aber ins Hirngewebe selbst

vordringen (s. Abschnitt 5.3). Abbildung 5.28 zeigt Ausschnitte aus Gebeschnitten der drei Lipo-

somensorten im direkten Vergleich.

Abbildung 5.28: Gefrierschnitte des Gehirns männlicher Wistar-Ratten 3 h nach Applikation von verschiedenen Liposomen. Grün = FITC-BSA, rot = DPPE-RH.

5. In vivo Experimente 187

Aufnahme in die Leber scheint für alle Liposomen kaum zu erfolgen. In der Milz jedoch konnte zu

allen Zeitpunkten und für alle Formen von Liposomen Fluoreszenz gesehen werden (s. Abschnitte

5.1 – 5.3). Diese war nicht immer, für Liposomen indikativ, punktförmig, sondern häufig diffus,

was auf einen bereits erfolgten Abbau der Liposomen zurückzuführen sein könnte. Besonders Lipo-

somen ohne Proteinvektor wurden verstärkt von der Milz aufgenommen, obwohl ihre PEG-Hülle

dies behindern sollte. Ein weiterer, interessanter Aspekt zeigte sich bei allen Beobachtungen: Lipo-

somen ab einem bestimmten Durchmesser scheinen nicht in die Hirnkapillaren oder das Hirngewe-

be vordringen zu können. Tabelle 5.10 gibt eine Aufstellung aller Liposomen und ob sie in Hirn-

schnitten detektiert wurden oder nicht.

Tabelle 5.10: Vergleich der liposomalen Eigenschaften mit der Detektion in Hirngewebe-schnitten. Werte sind angegeben als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3).

Art Größe (nm) PDI Zetapotential (mV) Detektion

cBSA 132,8 ± 1,3 0,186 ± 0,017 3,65 ± 3,3 ja

cBSA 182,4 ± 4,5 0,1560 ± 0,0083 7,74 ± 0,44 nein

cBSA 122,00 ± 0,72 0,308 ± 0,034 6,57 ± 0,32 ja

cBSA 140,3 ± 1,1 0,283 ± 0,019 8,39 ± 0,67 ja

cBSA 148,2 ± 6,5 0,346 ± 0,034 0,3 ± 1,4 ja

cBSA 192,1 ± 3,4 0,170 ± 0,013 −2,04 ± 0,35 nein

BSA 151,9 ± 3,1 0,327 ± 0,012 1,073 ± 0,083 ja

PEG 147,1 ± 1,5 0,167 ± 0,013 −3,57 ± 0,58 ja

PEG 191,8 ± 3,8 0,188 ± 0,021 −2,74 ± 0,82 nein

Die Grenze des Durchmessers zur erfolgreichen Aufnahme scheint zwischen 150 und 180 nm zu

liegen. Weitere in dieser Arbeit nicht gezeigte Versuche deuteten an, dass cBSA-Liposomen bis zu

einem Durchmesser von 160 nm noch aufgenommen werden können und solche ab 170 nm nicht

mehr, was den Grenzbereich weiter eingeschränkt. Wovon dieser Effekt hervorgerufen wird, lässt

sich nur spekulieren. Eine Möglichkeit wäre das verstärkte Abfangen der Liposomen durch Leber

oder Milz. Das Zetapotential scheint für das Erreichen der Hirnkapillaren keinen Einfluss zu haben.

Sowohl negative als auch positive Liposomen konnten in ihnen nachgewiesen werden. Allerdings

erreichten nur Liposomen mit einem positiven Zetapotential das Hirngewebe selbst. Dabei scheint

der tatsächliche Betrag der positiven Ladung keine signifikante Rolle zu spielen. Ein Zusammen-

hang zwischen applizierter Dosis und Liposomen-Menge im Gehirn konnte nicht hergestellt wer-

den, da eine Quantifizierung nicht möglich war. Applizierte Dosen bewegten sich zwischen 9 und

24 mg/kg Körpergewicht.

188 5. In vivo Experimente

Untersuchungen von Blutproben über 24 h von Tieren, die cBSA-Liposomen erhalten hatten, erga-

ben eine exponentielle Klärung der Liposomen aus dem Blutkreislauf (s. Abschnitt 5.4). Durch

Ausgleichsfunktionen bestimmte Halbwertszeiten ergaben etwa 7,5 h. Nach 24 h befanden sich

noch ca. 20 % der ursprünglichen Dosis in der Blutbahn. Die Zirkulation der Liposomen ist damit

über mehrere Stunden gewährleistet, was ausreichend Möglichkeit zur Aufnahme ins Hirnendothel

bietet.

6. Ausblick 191

6. Ausblick cBSA-Liposomen stellen einen vielversprechenden Ansatz für die Penetration der Blut-Hirn

Schranke dar. Damit eröffnen sich Perspektiven für neue Transfersysteme sowie Optimierung bei

der Liposomenherstellung.

• Neben cBSA könnten sich andere Proteine in vivo als geeignete Vektoren erweisen. Die in

vitro getesteten, Transferrin und Apolipoprotein E, sind nur zwei Beispiele. Hierbei ist auch

der Weg über Rezeptor vermittelte gegenüber der adsorptiven Endozytose von cBSA

interessant.

Der Einfluss dieser Proteine auf den Durchmesser, das Zetapotential und die Stabilität der

Liposomen dürfte dabei ebenfalls wichtig sein.

• Die Anwendung von Ultrazentrifugation statt Größenausschlusschromatographie zur Ab-

trennung nicht gebundener Vektoren bietet Vorteile in Hinblick auf Verdünnungseffekte

und Größenveränderung.

• Zur Langzeitstabilität könnte die Gefriertrocknung dienen, sofern das Problem der Vergrö-

ßerung der Liposomen während des Verfahrens gelöst werden kann.

• Um die Freisetzung von Wirkstoffen aus Liposomen zu verändern, zu verbessern oder leich-

ter beeinflussbar zu machen dürfte die Verwendung von thermolabilen oder pH-sensitiven

Lipid-Zusammensetzungen interessant sein.

• Nähere Untersuchungen zum Einfluss des Liposomendurchmessers auf die Aufnahmefähig-

keit der Liposomen ins Gehirn, der sich in den gezeigten in vivo Experimenten andeutete,

dürften sich als vorteilhaft herausstellen. Die genaue Grenze der Größe zu kennen, ab der

Vesikel noch ins Gehirn aufgenommen werden können, ist fundamental. Auch die Untersu-

chung von kleineren als den hier verwendeten Liposomen ist von Interesse in Hinsicht auf

Verweildauer im Blut und Penetration des Hirnkapillarendothels.

• Um zum einen First-Pass-Effekte zu vermeiden oder zu untersuchen und zum anderen höhe-

re Liposomen-Dosen zum Gehirn zu bringen, ist eine direkte Injektion in die Karotis-Arterie

ein vielversprechender alternativer Applikationsweg. Interessant zu beobachten wäre hierbei

nicht nur eine eventuell veränderte Aufnahme des Gehirns, sondern auch der Leber und der

Milz. Untersuchungen durch die capillary depletion Methode können außerdem einen weite-

ren Beweis für die Passage der Liposomen durch die Blut-Hirn Schranke und eine Möglich-

keit zur Quantifizierung liefern.

192 6. Ausblick

• Letztlich bleibt jede mikroskopische Betrachtung von Gefrierschnitten den Beweis auf einen

tatsächlichen therapeutischen Effekt schuldig. Der Einschluss von nicht hirngängigen Anal-

getika, z.B. Loperamid, in Liposomen und deren nachfolgende Applikation in vivo gemein-

sam mit der Beobachtung der Schmerzwahrnehmung stellen eine Möglichkeit dar Erkennt-

nisse darüber zu erhalten. Schließlich würde die Verwendung von Therapeutika für Erkran-

kungen des Zentralnervensystems, die selbiges normalerweise nicht erreichen, in Liposomen

verpackt und erprobt an einem entsprechenden Tiermodell, die wohl aussagekräftigsten

möglichen Ergebnisse liefern.

7. Literaturverzeichnis cxcv

7. Literaturverzeichnis 1. Ehrlich, P., Das Sauerstoff-Bedürfniss des Organismus: Eine farbenanalytische Studie. Au-

gust Hirschwald, Berlin, 1885: p. 167. 2. Walter, F.K., Die allgemeinen Grundlagen des Stoffaustausches zwischen dem Zentralner-

vensystem und dem übrigen Körper. Arch Psychiatr Nervenkr, 1930. 101: p. 195-230. 3. Spatz, H., Die Bedeutung der vitalen Färbung für die Lehre vom Stoffaustausch zwischen

dem Zentralnervensystem und dem übrigen Körper. Arch Psychiatr Nervenkr, 1933. 101: p. 267-358.

4. Reese, T.S. and M.J. Karnovsky, Fine structural localization of a blood-brain barrier to

exogenous peroxidase. J Cell Biol, 1967. 34(1): p. 207-17. 5. Pardridge, W.M., Peptide drug delivery to the brain. New York: Raven Press, 1991: p. 239-

279. 6. Wong, H.L., X.Y. Wu, and R. Bendayan, !anotechnological advances for the delivery of

C!S therapeutics. Adv Drug Deliv Rev, 2012. 64(7): p. 686-700. 7. Boron, W.F. and E.L. Boulpaep, Medical physiology : a cellular and molecular approach.

Philadelphia, Pa.: Elsevier Saunders, 2005: p. 1319. 8. Zlokovic, B.V. and M.L. Apuzzo, Strategies to circumvent vascular barriers of the central

nervous system. Neurosurgery, 1998. 43(4): p. 877-8. 9. Rubin, L.L., Endothelial cells: adhesion and tight junctions. Curr Opin Cell Biol, 1992.

4(5): p. 830-3. 10. Liu, W.Y., et al., Tight junction in blood-brain barrier: an overview of structure, regulation,

and regulator substances. CNS Neurosci Ther, 2012. 18(8): p. 609-15. 11. Hillery, A.M., A.W. Lloyd, and J. Swarbick, Drug delivery and targeting for pharmacists

and pharmaceutical scientists. Taylor & Francis, London, 2001. 12. Dermietzel, R. and D. Krause, Molecular anatomy of the blood-brain barrier as defined by

immunocytochemistry. Int Rev Cytol, 1991. 127: p. 57-109. 13. Frey, A., et al., Pericytes of the brain microvasculature express gamma-glutamyl

transpeptidase. Eur J Biochem, 1991. 202(2): p. 421-9. 14. Thews, G., G. Mutschler, and P. Vaupel, Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie des Men-

schen 4. Aufl. Stuttgart, WVG, 1991. 15. Klinke, R., R. Baumann, and R. Gay, Physiologie. Georg Thieme Verlag KG, Stuttgart,

2010. 16. Langguth, P., G. Fricker, and H. Wunderli-Allenspach, Biopharmazie. Wiley-VCH, Wein-

heim, 2004. 17. Thöle, M., Arzneistofftransport an der Blut-Hirn Schranke: Drug targeting mit liposomalen

Konjugaten, in Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie. 2000, Rup-recht-Karls-Universität: Heidelberg. p. 124.

18. Oldendorf, W.H., Blood brain barrier permeability to drugs. Annual Reviews Pharmacology 1974. 14: p. 239-348.

19. Pardridge, W.M., Transport of small molecules through the blood-brain barrier: biology

and methodology. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995. 15: p. 5-36. 20. Alam, M.I., et al., Strategy for effective brain drug delivery. Eur J Pharm Sci, 2010. 40(5):

p. 385-403. 21. Pardridge, W.M., R.J. Boado, and C.R. Farrell, Brain-type glucose transporter (GLUT-1) is

selectively localized to the blood-brain barrier. The Journal of Biological Chemistry, 1990(265): p. 18035-18040.

22. Egleton, R.D. and T.P. Davis, Development of neuropeptide drugs that cross the blood-

brain barrier. NeuroRx, 2005. 2(1): p. 44-53. 23. Huwyler, J., et al., Modulation of morphine-6-glucuronide penetration into the brain by P-

glycoprotein. Int J Clin Pharmacol Ther, 1998. 36(2): p. 69-70.

cxcvi 7. Literaturverzeichnis

24. Huwyler, J., et al., Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-

glucuronide into brain capillary endothelium. Br J Pharmacol, 1996. 118(8): p. 1879-85. 25. Drion, N., et al., Role of p-glycoprotein in the blood-brain barrier transport of colchicine

and vinblastine. Journal of Neurochemistry, 1996. 4(67): p. 1688-1693. 26. Pardridge, W.M. and W.H. Oldendorf, Kinetic analysis of blood-brain barrier transport of

amino acids. Biochim Biophys Acta, 1975. 401(1): p. 128-36. 27. Oldendorf, W.H., Carrier-mediated blood-brain barrier transport of short-chain

monocarboxylic organic acids. Am J Physiol, 1973. 224(6): p. 1450-3. 28. Cornford, E.M., L.D. Braun, and W.H. Oldendorf, Carrier mediated blood-brain barrier

transport of choline and certain choline analogs. J Neurochem, 1978. 30(2): p. 299-308. 29. Pardridge, W.M., Regulation of amino acid availability to brain: selective control

mechanisms for glutamate. New York: Raven Press, 1979: p. 125-137. 30. Cornford, E.M. and W.H. Oldendorf, Independent blood-brain barrier transport systems for

nucleic acid precursors. Biochim Biophys Acta, 1975. 394(2): p. 211-9. 31. Mostov, K.E. and N.E. Simister, Transcytosis. Cell, 1985. 43(2 Pt 1): p. 389-90. 32. Pardridge, W.M., et al., Human insulin receptor monoclonal antibody undergoes high

affinity binding to human brain capillaries in vitro and rapid transcytosis through the

blood-brain barrier in vivo in the primate. Pharm Res, 1995. 12(6): p. 807-16. 33. Dehouck, B., et al., A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the

blood-brain barrier. J Cell Biol, 1997. 138(4): p. 877-89. 34. Broadwell, R.D., et al., Transcytosis of protein through the mammalian cerebral epithelium

and endothelium. III. Receptor-mediated transcytosis through the blood-brain barrier of

blood-borne transferrin and antibody against the transferrin receptor. Exp Neurol, 1996. 142(1): p. 47-65.

35. van Gelder, W., et al., Transcytosis of 6.6-nm gold-labeled transferrin: an ultrastructural

study in cultured porcine blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res, 1997. 746(1-2): p. 105-16.

36. Smith, K.R. and R.T. Borchardt, Permeability and mechanism of albumin, cationized

albumin, and glycosylated albumin transcellular transport across monolayers of cultured

bovine brain capillary endothelial cells. Pharmaceutical Research, 1989. 6(6): p. 466-473. 37. Triguero, D., J. Buciak, and W.M. Pardridge, Capillary depletion method for quantification

of blood-brain barrier transport of circulating peptides and plasma proteins. Journal of Neurochemistry, 1990. 54(6): p. 1882-1888.

38. Alberts, B., et al., Molekularbiologie der Zelle, 3. Aufl. . Weinheim: VCH, 1995. 39. Ghinea, N. and N. Simionescu, Anionized and cationized hemeundecapeptides as probes for

cell surface charge and permeability studies: differentiated labeling of endothelial

plasmalemmal vesicles. J Cell Biol, 1985. 100(2): p. 606-12. 40. Baldwin, A.L. and S. Chien, Endothelial transport of anionized and cationized ferritin in the

rabbit thoracic aorta and vasa vasorum. Arteriosclerosis, 1984. 4(4): p. 372-82. 41. Bickel, U., T. Yoshikawa, and W.M. Pardridge, Delivery of peptides and proteins through

the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev, 2001. 46(1-3): p. 247-79. 42. Kumagai, A.K., J.B. Eisenberg, and W.M. Pardridge, Absorptive-mediated endocytosis of

cationized albumin and a β-endorphin-cationized albumin chimeric peptide by isolated

brain capillaries. Journal of Biological Chemistry, 1987. 262(31): p. 15214-15219. 43. Pardridge, W.M., et al., Evaluation of cationized rat albumin as a potential blood-brain

barrier drug transport vector. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1990. 255(2): p. 893-899.

44. Pardridge, W.M., D. Triguero, and J. Buciak, Transport of histone through the blood-brain

barrier. J Pharmacol Exp Ther, 1989. 251(3): p. 821-6. 45. Morris, S.A., S. Ahle, and E. Ungewickell, Clathrin-coated vesicles. Curr Opin Cell Biol,

1989. 1(4): p. 684-90.

7. Literaturverzeichnis cxcvii

46. Anderson, R.G., The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 199-225. 47. van Deurs, B., et al., Are caveolae involved in clathrinindependend endocytosis? Trends in

Cell Biology, 1993(3): p. 249-251. 48. Anderson, R.G., et al., Potocytosis: sequestration and transport of small molecules by

caveolae. Science, 1992. 255(5043): p. 410-1. 49. Biederbick, A., H.F. Kern, and H.P. Elsasser, Monodansylcadaverine (MDC) is a specific in

vivo marker for autophagic vacuoles. Eur J Cell Biol, 1995. 66(1): p. 3-14. 50. Haigler, H.T., et al., Dansylcadaverine inhibits internalization of 125I-epidermal growth

factor in BALB 3T3 cells. J Biol Chem, 1980. 255(4): p. 1239-41. 51. Minagawa, T., et al., Blood-brain-barrier transport of lipid microspheres containing

clinprost, a prostaglandin I2 analogue. J Pharm Pharmacol, 1996. 48(10): p. 1016-22. 52. Tokuda, H., et al., Specific uptake of succinylated proteins via a scavenger receptor-

mediated mechanism in cultured brain microvessel endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 1993. 196(1): p. 18-24.

53. Schnitzer, J.E., et al., Filipin-sensitive caveolae-mediated transport in endothelium: reduced

transcytosis, scavenger endocytosis, and capillary permeability of select macromolecules. J Cell Biol, 1994. 127(5): p. 1217-32.

54. Lopes, S.C., et al., Filipin orientation revealed by linear dichroism. Implication for a model

of action. J Am Chem Soc, 2004. 126(17): p. 5396-402. 55. Marella, M., et al., Filipin prevents pathological prion protein accumulation by reducing

endocytosis and inducing cellular PrP release. J Biol Chem, 2002. 277(28): p. 25457-64. 56. Kawasaki, S., et al., Sterol control of the phosphatidylethanolamine-phosphatidylcholine

conversion in the yeast mutant GL7. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(17): p. 5715-9. 57. Ivanov, A.I., Exocytosis and endocytosis. Humana Press, Totowa, N.J, 2008. 58. Karp, G., Molekulare Zellbiologie. Springer Verlag, Berlin, 2005. 59. Mutschler, E., et al., Mutschler Arzneimittelwirkungen: Lehrbuch der Pharmakologie und

Toxikologie, 9. Aufl. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 2008. 60. Stuart, A.D. and T.D. Brown, Entry of feline calicivirus is dependent on clathrin-mediated

endocytosis and acidification in endosomes. J Virol, 2006. 80(15): p. 7500-9. 61. Wachtel, M., et al., Occludin proteolysis and increased permeability in endothelial cells

through tyrosine phosphatase inhibition. J Cell Sci, 1999. 112 ( Pt 23): p. 4347-56. 62. Terasaki, T., et al., Absorptive-mediated endocytosis of a dynorphin-like analgesic peptide,

E-2078 into the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther, 1989. 251(1): p. 351-7. 63. Knutson, V.P., G.V. Ronnett, and M.D. Lane, Rapid, reversible internalization of cell

surface insulin receptors. Correlation with insulin-induced down-regulation. J Biol Chem, 1983. 258(20): p. 12139-42.

64. Zong, J. and G.M. Pollack, Morphine antinociception is enhanced in mdr1a gene-deficient

mice. Pharm Res, 2000. 17(6): p. 749-53. 65. Potschka, H. and W. Loscher, In vivo evidence for P-glycoprotein-mediated transport of

phenytoin at the blood-brain barrier of rats. Epilepsia, 2001. 42(10): p. 1231-40. 66. Zlokovic, B.V., et al., Differential expression of !a,K-ATPase alpha and beta subunit

isoforms at the blood-brain barrier and the choroid plexus. J Biol Chem, 1993. 268(11): p. 8019-25.

67. Yan, Q., et al., Distribution of intracerebral ventricularly administered neurotrophins in rat

brain and its correlation with trk receptor expression. Exp Neurol, 1994. 127(1): p. 23-36. 68. Pardridge, W.M., Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today, 2007. 12(1-2): p. 54-

61. 69. Krames, E.S., Intrathecal infusional therapies for intractable pain: patient management

guidelines. J Pain Symptom Manage, 1993. 8(1): p. 36-46. 70. Ochs, G., et al., Intrathecal baclofen for long-term treatment of spasticity: a multi-centre

study. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1989. 52(8): p. 933-9.

cxcviii 7. Literaturverzeichnis

71. Hanson, L.R. and W.H. Frey, 2nd, Intranasal delivery bypasses the blood-brain barrier to

target therapeutic agents to the central nervous system and treat neurodegenerative disease. BMC Neurosci, 2008. 9 Suppl 3: p. S5.

72. Danielyan, L., et al., Intranasal delivery of cells to the brain. Eur J Cell Biol, 2009. 88(6): p. 315-24.

73. Kondoh, M. and K. Yagi, Progress in absorption enhancers based on tight junction. Expert Opin Drug Deliv, 2007. 4(3): p. 275-86.

74. Johnson, P.H., D. Frank, and H.R. Costantino, Discovery of tight junction modulators:

significance for drug development and delivery. Drug Discov Today, 2008. 13(5-6): p. 261-7.

75. Fasano, A., et al., Zonula occludens toxin modulates tight junctions through protein kinase

C-dependent actin reorganization, in vitro. J Clin Invest, 1995. 96(2): p. 710-20. 76. Deli, M.A., Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous

barriers and improve drug delivery. Biochim Biophys Acta, 2009. 1788(4): p. 892-910. 77. Zausinger, S., Bradykinin receptor antagonists in cerebral ischemia and trauma. IDrugs,

2003. 6(10): p. 970-5. 78. Rapoport, S.I., Effect of concentrated solutions on blood-brain barrier. Am J Physiol, 1970.

219(1): p. 270-4. 79. Rapoport, S.I., M. Hori, and I. Klatzo, Reversible osmotic opening of the blood-brain

barrier. Science, 1971. 173(4001): p. 1026-8. 80. Robinson, P.J. and S.I. Rapoport, Size selectivity of blood-brain barrier permeability at

various times after osmotic opening. Am J Physiol, 1987. 253(3 Pt 2): p. R459-66. 81. Rapoport, S.I., Osmotic opening of the blood-brain barrier: principles, mechanism, and

therapeutic applications. Cell Mol Neurobiol, 2000. 20(2): p. 217-30. 82. Rapoport, S.I., Modulation of blood-brain barrier permeability. J Drug Target, 1996. 3(6):

p. 417-25. 83. Jahnke, K., et al., Intraarterial chemotherapy and osmotic blood-brain barrier disruption

for patients with embryonal and germ cell tumors of the central nervous system. Cancer, 2008. 112(3): p. 581-8.

84. Vykhodtseva, N., N. McDannold, and K. Hynynen, Progress and problems in the

application of focused ultrasound for blood-brain barrier disruption. Ultrasonics, 2008. 48(4): p. 279-96.

85. Nyborg, W.L., Biological effects of ultrasound: development of safety guidelines. Part II:

general review. Ultrasound Med Biol, 2001. 27(3): p. 301-33. 86. Krizanac-Bengez, L., M.R. Mayberg, and D. Janigro, The cerebral vasculature as a

therapeutic target for neurological disorders and the role of shear stress in vascular

homeostatis and pathophysiology. Neurol Res, 2004. 26(8): p. 846-53. 87. Treat, L.H., et al., Targeted delivery of doxorubicin to the rat brain at therapeutic levels

using MRI-guided focused ultrasound. Int J Cancer, 2007. 121(4): p. 901-7. 88. Kinoshita, M., Targeted drug delivery to the brain using focused ultrasound. Top Magn

Reson Imaging, 2006. 17(3): p. 209-15. 89. Nadal, A., et al., Plasma albumin is a potent trigger of calcium signals and D!A synthesis

in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(5): p. 1426-30. 90. Rapoport, S.I., et al., Quantitative aspects of reversible osmotic opening of the blood-brain

barrier. Am J Physiol, 1980. 238(5): p. R421-31. 91. Salahuddin, T.S., et al., Structural changes in the rat brain after carotid infusions of

hyperosmolar solutions. An electron microscopic study. Acta Neuropathol, 1988. 77(1): p. 5-13.

92. Lossinsky, A.S., A.W. Vorbrodt, and H.M. Wisniewski, Scanning and transmission electron

microscopic studies of microvascular pathology in the osmotically impaired blood-brain

barrier. J Neurocytol, 1995. 24(10): p. 795-806.

7. Literaturverzeichnis cxcix

93. Oldendorf, W.H., Lipid solubility and drug penetration of the blood brain barrier. Proc Soc Exp Biol Med, 1974. 147(3): p. 813-5.

94. Herve, F., N. Ghinea, and J.M. Scherrmann, C!S delivery via adsorptive transcytosis. AAPS J, 2008. 10(3): p. 455-72.

95. Smith, M.W. and M. Gumbleton, Endocytosis at the blood-brain barrier: from basic

understanding to drug delivery strategies. J Drug Target, 2006. 14(4): p. 191-214. 96. Patrick, G.L., An introduction to medicinal chemistry. Oxford University Press, Oxford,

2005. 97. Pardridge, W.M., !on-invasive drug delivery to the human brain using endogenous blood-

brain barrier transport systems. Pharm Sci Technolo Today, 1999. 2(2): p. 49-59. 98. Friden, P.M., Receptor-mediated transport of therapeutics across the blood-brain barrier.

Neurosurgery, 1994. 35(2): p. 294-8; discussion 298. 99. Friden, P.M., et al., Anti-transferrin receptor antibody and antibody-drug conjugates cross

the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(11): p. 4771-5. 100. Bickel, U., et al., Pharmacologic effects in vivo in brain by vector-mediated peptide drug

delivery. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(7): p. 2618-22. 101. Oliver, J.C., Drug transport to brain with targeted nanoparticles. NeuroRx, 2005(2): p. 108-

119. 102. Blasi, P., et al., Solid lipid nanoparticles for targeted brain drug delivery. Adv Drug Deliv

Rev, 2007. 59(6): p. 454-77. 103. Kreuter, J., Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs

to the brain. J Nanosci Nanotechnol, 2004. 4(5): p. 484-8. 104. Lück, M., Plasmaproteinadsorption als möglicher Schlüsselfaktor für eine kontrollierte

Arzneistoffapplikation mit partikulären Trägern. Dissertation, Freie Universität Berlin, 1997.

105. Reimold, I., et al., Delivery of nanoparticles to the brain detected by fluorescence

microscopy. Eur J Pharm Biopharm, 2008. 70(2): p. 627-32. 106. Kreuter, J., !anoparticulate systems for brain delivery of drugs. Adv Drug Deliv Rev, 2001.

47(1): p. 65-81. 107. Kreuter, J., !anoparticles and microparticles for drug and vaccine delivery. J Anat, 1996.

189 ( Pt 3): p. 503-5. 108. Calvo, P., et al., Long-circulating PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as new drug

carrier for brain delivery. Pharm Res, 2001. 18(8): p. 1157-66. 109. Lobenberg, R., et al., Body distribution of azidothymidine bound to hexyl-cyanoacrylate

nanoparticles after i.v. injection to rats. J Control Release, 1998. 50(1-3): p. 21-30. 110. Kreuter, J. and S. Gelperina, Use of nanoparticles for cerebral cancer. Tumori, 2008. 94(2):

p. 271-7. 111. Gulyaev, A.E., et al., Significant transport of doxorubicin into the brain with polysorbate

80-coated nanoparticles. Pharm Res, 1999. 16(10): p. 1564-9. 112. Alyautdin, R.N., et al., Delivery of loperamide across the blood-brain barrier with

polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles. Pharm Res, 1997. 14(3): p. 325-8.

113. Oldendorf, W.H., Measurement of brain uptake of radiolabeled substances using a tritiated

water internal standard. Brain Res, 1970. 24(2): p. 372-6. 114. Fenstermacher, J.D., R.G. Blasberg, and C.S. Patlak, Methods for Quantifying the transport

of drugs across brain barrier systems. Pharmacol Ther, 1981. 14(2): p. 217-48. 115. Hardebo, J.E. and B. Nilsson, Estimation of cerebral extraction of circulating compounds by

the brain uptake index method: influence of circulation time, volume injection, and cerebral

blood flow. Acta Physiol Scand, 1979. 107(2): p. 153-9. 116. Tamai, I. and A. Tsuji, Drug delivery through the blood-brain barrier. Advanced Drug

Delivery Reviews, 1996(19): p. 401-424.

cc 7. Literaturverzeichnis

117. Takasato, Y., S.I. Rapoport, and Q.R. Smith, An in situ brain perfusion technique to study

cerebrovascular transport in the rat. Am J Physiol, 1984. 247(3 Pt 2): p. H484-93. 118. Zlokovic, B.V., et al., Measurement of solute transport across the blood-brain barrier in the

perfused guinea pig brain: method and application to !-methyl-alpha-aminoisobutyric acid. J Neurochem, 1986. 46(5): p. 1444-51.

119. Cerletti, A., et al., Endocytosis and transcytosis of an immunoliposome-based brain drug

delivery system. J Drug Target, 2000. 8(6): p. 435-46. 120. Terasaki, T., et al., In vivo transport of a dynorphin-like analgesic peptide, E-2078, through

the blood-brain barrier: an application of brain microdialysis. Pharm Res, 1991. 8(7): p. 815-20.

121. de Lange, E.C., et al., Critical factors of intracerebral microdialysis as a technique to

determine the pharmacokinetics of drugs in rat brain. Brain Res, 1994. 666(1): p. 1-8. 122. de Lange, E.C., et al., Methodological considerations of intracerebral microdialysis in

pharmacokinetic studies on drug transport across the blood-brain barrier. Brain Res Brain Res Rev, 1997. 25(1): p. 27-49.

123. Alvarez, F.D., et al., Sensitization to the behavioural effects of cocaine: alterations in

tyrosine hydroxylase or endogenous opioid mR!As are not necessarily involved. !aunyn

Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 2001(363): p. 288-294. 124. de Lange, E.C., et al., The use of intracerebral microdialysis for the determination of

pharmacokinetic profiles of anticancer drugs in tumor-bearing rat brain. Pharm Res, 1995. 12(12): p. 1924-31.

125. Joo, F., The cerebral microvessels in culture, an update. J Neurochem, 1992. 58(1): p. 1-17. 126. Brendel, K., E. Meezan, and E.C. Carlson, Isolated brain microvessels: a purified,

metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science, 1974. 185(4155): p. 953-5.

127. Goldstein, G.W., et al., Isolation of metabolically active capillaries from rat brain. J Neurochem, 1975. 25(5): p. 715-7.

128. Mrsulja, B.B., et al., Isolation of brain capillaries: a simplified technique. Brain Res, 1976. 110(2): p. 361-5.

129. Takakura, Y., K.L. Audus, and R.T. Borchardt, Blood-brain barrier: transport studies in

isolated brain capillaries and in cultured brain endothelial cells. Adv Pharmacol, 1991. 22: p. 137-65.

130. Lasbennes, F. and J. Gayet, Capacity for energy metabolism in microvessels isolated from

rat brain. Neurochem Res, 1984. 9(1): p. 1-10. 131. Tontsch, U. and H.C. Bauer, Isolation, characterization, and long-term cultivation of

porcine and murine cerebral capillary endothelial cells. Microvasc Res, 1989. 37(2): p. 148-61.

132. Bowman, P.D., et al., Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro, 1981. 17(4): p. 353-62.

133. Rubin, L.L., et al., A cell culture model of the blood-brain barrier. J Cell Biol, 1991. 115(6): p. 1725-35.

134. Biegel, D., D.D. Spencer, and J.S. Pachter, Isolation and culture of human brain

microvessel endothelial cells for the study of blood-brain barrier properties in vitro. Brain Res, 1995. 692(1-2): p. 183-9.

135. Audus, K.L. and R.T. Borchardt, Bovine brain microvessel endothelial cell monolayers as a

model system for the blood-brain barrier. Ann N Y Acad Sci, 1987. 507: p. 9-18. 136. Audus, K.L. and R.T. Borchardt, Characterization of an in vitro blood-brain barrier model

system for studying drug transport and metabolism. Pharmaceutical Research, 1986(3). 137. Meyer, J., et al., Blood-brain barrier characteristic enzymatic properties in cultured brain

capillary endothelial cells. Brain Res, 1990. 514(2): p. 305-9.

7. Literaturverzeichnis cci

138. Crone, C. and S.P. Olesen, Electrical resistance of brain microvascular endothelium. Brain Res, 1982. 241(1): p. 49-55.

139. Hoheisel, D., et al., Hydrocortisone reinforces the blood-brain barrier properties in a serum

free cell culture system. Biochem Biophys Res Commun, 1998. 244(1): p. 312-6. 140. DeBault, L.E., gamma-Glutamyltranspeptidase induction mediated by glial foot process-to

endothelium contact in co-culture. Brain Res, 1981. 220(2): p. 432-5. 141. Raub, T.J., S.L. Kuentzel, and G.A. Sawada, Permeability of bovine brain microvessel

endothelial cells in vitro: barrier tightening by a factor released from astroglioma cells. Exp Cell Res, 1992. 199(2): p. 330-40.

142. Tontsch, U. and H.C. Bauer, Glial cells and neurons induce blood-brain barrier related

enzymes in cultured cerebral endothelial cells. Brain Res, 1991. 539(2): p. 247-53. 143. Roux, F., et al., Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase

activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells. J Cell Physiol, 1994. 159(1): p. 101-13.

144. Durieu-Trautmann, O., et al., Immortalization of brain capillary endothelial cells with

maintenance of structural characteristics of the blood-brain barrier endothelium. In Vitro Cell Dev Biol, 1991. 27A(10): p. 771-8.

145. Vu, K., et al., Immortalized human brain endothelial cell line HCMEC/D3 as a model of the

blood-brain barrier facilitates in vitro studies of central nervous system infection by

Cryptococcus neoformans. Eukaryot Cell, 2009. 8(11): p. 1803-7. 146. Poller, B., et al., The human brain endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain

barrier model for drug transport studies. J Neurochem, 2008. 107(5): p. 1358-68. 147. Neuhaus, W., et al., Validation of in vitro cell culture models of the blood-brain barrier:

tightness characterization of two promising cell lines. J Pharm Sci, 2008. 97(12): p. 5158-75.

148. Yang, T., K.E. Roder, and T.J. Abbruscato, Evaluation of bEnd5 cell line as an in vitro

model for the blood-brain barrier under normal and hypoxic/aglycemic conditions. J Pharm Sci, 2007. 96(12): p. 3196-213.

149. Cucullo, L., et al., Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular

modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab, 2008. 28(2): p. 312-28.

150. Huwyler, J., D. Wu, and W.M. Pardridge, Brain drug delivery of small molecules using

immunoliposomes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(24): p. 14164-9. 151. Dan, N., Effect of liposome charge and PEG polymer layer thickness on cell-liposome

electrostatic interactions. Biochim Biophys Acta, 2002. 1564(2): p. 343-8. 152. Massing, U., S. Cicko, and V. Ziroli, Dual asymmetric centrifugation (DAC) — A new

technique for liposome preparation. Journal of Controlled Release, 2008(125): p. 16–24. 153. Wohlrab, W. and J. Lasch, Penetration kinetics of liposomal hydrocortisone in human skin.

Dermatologica, 1987. 174(1): p. 18-22. 154. Cevc, G. and G. Blume, Lipid vesicles penetrate into intact skin owing to the transdermal

osmotic gradients and hydration force. Biochim Biophys Acta, 1992. 1104(1): p. 226-32. 155. Cevc, G., et al., Ultraflexible vesicles, Transfersomes, have an extremely low pore

penetration resistance and transport therapeutic amounts of insulin across the intact

mammalian skin. Biochim Biophys Acta, 1998. 1368(2): p. 201-15. 156. Müller, R.H. and G.E. Hildebrand, Pharmazeutische Technolgie: Moderne Arzneiformen.

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1997. 157. Lasic, D.D., Doxorubicin in sterically stabilized liposomes. Nature, 1996. 380(6574): p.

561-2. 158. Forssen, E.A., et al., Fluorescence imaging studies for the disposition of daunorubicin

liposomes (DaunoXome) within tumor tissue. Cancer Res, 1996. 56(9): p. 2066-75.

ccii 7. Literaturverzeichnis

159. Taylor, R.L., et al., Amphotericin B in liposomes: a novel therapy for histoplasmosis. Am Rev Respir Dis, 1982. 125(5): p. 610-1.

160. Raab, W., Liposomen - eine neue Form dermatologischer Wirkstoffträger. Ärztliche Cosmetologie, 1988(18): p. 213-224.

161. Martin, G.P. and C. Marriott, Membrane damage by bile salts: the protective function of

phospholipids. J Pharm Pharmacol, 1981. 33(12): p. 754-9. 162. Lasic, D.D. and D. Papahadjopoulos, Liposomes revisited. Science, 1995. 267(5202): p.

1275-6. 163. Samad, A., Y. Sultana, and M. Aqil, Liposomal drug delivery systems: an update review.

Curr Drug Deliv, 2007. 4(4): p. 297-305. 164. Allen, T.M., et al., Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol)

show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim Biophys Acta, 1991. 1066(1): p. 29-36.

165. Allen, T.M., Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery. Trends Pharmacol Sci, 1994. 15(7): p. 215-20.

166. Lasic, D.D., et al., Sterically stabilized liposomes: a hypothesis on the molecular origin of

the extended circulation times. Biochim Biophys Acta, 1991. 1070(1): p. 187-92. 167. Blume, G. and G. Cevc, Liposomes for the sustained drug release in vivo. Biochim Biophys

Acta, 1990. 1029(1): p. 91-7. 168. Michaelis, K., et al., Covalent linkage of apolipoprotein E to albumin nanoparticles strongly

enhances drug transport into the brain. J Pharmacol Exp Ther, 2006. 317(3): p. 1246-53. 169. Huwyler, J. and W.M. Pardridge, Examination of blood-brain barrier transferrin receptor

by confocal fluorescent microscopy of unfixed isolated rat brain capillaries. J Neurochem, 1998. 70(2): p. 883-6.

170. Ulbrich, K., et al., Transferrin- and transferrin-receptor-antibody-modified nanoparticles

enable drug delivery across the blood-brain barrier (BBB). Eur J Pharm Biopharm, 2009. 71(2): p. 251-6.

171. Pardridge, W.M., J. Eisenberg, and J. Yang, Human blood-brain barrier insulin receptor. Journal of Neurochemistry, 1985. 44: p. 1771-1778.

172. Thöle, M., et al., Uptake of cationized albumin coupled liposomes by cultured porcine brain

microvessel endothelial cells and intact brain capillaries. Journal of Drug Targeting, 2002. 10 (4): p. 337-344.

173. Hülsermann, U., et al., Uptake of apolipoprotein E fragment coupled liposomes by cultured

brain microvessel endothelial cells and intact brain capillaries. J Drug Target, 2009. 17(8): p. 610-8.

174. Soni, V., D.V. Kohli, and S.K. Jain, Transferrin coupled liposomes as drug delivery carriers

for brain targeting of 5-florouracil. J Drug Target, 2005. 13(4): p. 245-50. 175. Mori, N., et al., Liposome-entrapped phenytoin locally suppresses amygdaloid epileptogenic

focus created by db-cAMP/EDTA in rats. Brain Res, 1995. 703(1-2): p. 184-90. 176. Kakinuma, K., et al., Drug delivery to the brain using thermosensitive liposome and local

hyperthermia. Int J Hyperthermia, 1996. 12(1): p. 157-65. 177. Spuch, C. and C. Navarro, Liposomes for Targeted Delivery of Active Agents against

!eurodegenerative Diseases (Alzheimer's Disease and Parkinson's Disease). J Drug Deliv, 2011. 2011: p. 469679.

178. Lehmann, O., !eue Untersuchungen über flüssige Kristalle, II. Teil. Carl Winter's Universitätsbuchhandlung, Heidelberg, 1912.

179. Bangham, A.D. and R.W. Horne, !egative Staining of Phospholipids and Their Structural

Modification by Surface-Active Agents as Observed in the Electron Microscope. J Mol Biol, 1964. 8: p. 660-8.

180. Bangham, A.D., M.M. Standish, and J.C. Watkins, Diffusion of univalent ions across the

lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology, 1965. 13: p. 238-252.

7. Literaturverzeichnis cciii

181. Bangham, A.D., Liposomes: the Babraham connection. Chem Phys Lipids, 1993. 64(1-3): p. 275-85.

182. Uster, P.S., et al., Insertion of poly(ethylene glycol) derivatized phospholipid into pre-

formed liposomes results in prolonged in vivo circulation time. FEBS Lett, 1996. 386(2-3): p. 243-6.

183. Avanti Polar Lipids, I., Product catalog. 2011. 184. Parmentier, J., et al., Oral peptide delivery by tetraether lipid liposomes. Int J Pharm. 415(1-

2): p. 150-7. 185. Parmentier, J., et al., Stability of liposomes containing bio-enhancers and tetraether lipids in

simulated gastro-intestinal fluids. Int J Pharm, 2010. 405(1-2): p. 210-7. 186. Parmentier, J., Liposomes for the oral delivery of peptide drugs, in Institut für

Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie. 2011, Ruprecht-Karls-Universität: Heidelberg. p. 124.

187. Collins, D.S., K. Findlay, and C.V. Harding, Processing of exogenous liposome-

encapsulated antigens in vivo generates class I MHC-restricted T cell responses. J Immunol, 1992. 148(11): p. 3336-41.

188. Collins, D., F. Maxfield, and L. Huang, Immunoliposomes with different acid sensitivities as

probes for the cellular endocytic pathway. Biochim Biophys Acta, 1989. 987(1): p. 47-55. 189. Torchilin, V.P., F. Zhou, and L. Huang, pH-sensitive liposomes. J. Liposome Res., 1993(3):

p. 201-255. 190. Cullis, P.R. and B. de Kruijff, Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in

biological membranes. Biochim Biophys Acta, 1979. 559(4): p. 399-420. 191. Seddon, J.M., G. Cevc, and D. Marsh, Calorimetric studies of the gel-fluid (L beta-L alpha)

and lamellar-inverted hexagonal (L alpha-HII) phase transitions in dialkyl- and

diacylphosphatidylethanolamines. Biochemistry, 1983. 22(5): p. 1280-9. 192. Lai, M.Z., N. Duzgunes, and F.C. Szoka, Effects of replacement of the hydroxyl group of

cholesterol and tocopherol on the thermotropic behavior of phospholipid membranes. Biochemistry, 1985. 24(7): p. 1646-53.

193. Duzgunes, N., et al., Proton-induced fusion of oleic acid-phosphatidylethanolamine

liposomes. Biochemistry, 1985. 24(13): p. 3091-8. 194. Drummond, D.C., M. Zignani, and J. Leroux, Current status of pH-sensitive liposomes in

drug delivery. Prog Lipid Res, 2000. 39(5): p. 409-60. 195. Karanth, H. and R.S.R. Murphy, pH-Sensitive liposomes - principle and application in

cancer therapy. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2007. 59: p. 469-483. 196. Bew, R.R.C., Liposomes: a practical approach. IRL Press, Oxford, 1990. 197. Hillery, A., Heat-sensitive liposomes for tumour targeting. Drug Discov Today, 2001. 6(5):

p. 224-225. 198. Avanti Polar Lipids, I., Product catalog. 1993. 199. Magin, R.L. and M.R. Niesman, Temperature-dependent permeability of large unilamellar

liposomes. Chem Phys Lipids, 1984. 34(3): p. 245-56. 200. Needham, D., et al., A new temperature-sensitive liposome for use with mild hyperthermia:

characterization and testing in a human tumor xenograft model. Cancer Res, 2000. 60(5): p. 1197-201.

201. Tagami, T., M.J. Ernsting, and S.D. Li, Optimization of a novel and improved

thermosensitive liposome formulated with DPPC and a Brij surfactant using a robust in

vitro system. J Control Release, 2011. 154(3): p. 290-7. 202. Szoka, F., Jr. and D. Papahadjopoulos, Comparative properties and methods of preparation

of lipid vesicles (liposomes). Annu Rev Biophys Bioeng, 1980. 9: p. 467-508. 203. Papahadjopoulos, D. and W.J. Vail, Incorporation of macromolecules within large

unilamellar vesicles (LUV). Ann N Y Acad Sci, 1978. 308: p. 259-67.

cciv 7. Literaturverzeichnis

204. Saunders, L., J. Perrin, and D. Gammack, Ultrasonic irradiation of some phospholipid sols. J Pharm Pharmacol, 1962. 14: p. 567-72.

205. Brandl, M., Vesicular Phospholipid Gels: A Technology Platform. Journal of Liposome Research, 2007. 17: p. 15–26.

206. Batzri, S. and E.D. Korn, Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochim Biophys Acta, 1973. 298(4): p. 1015-9.

207. Barenholz, Y., S. Amselem, and D. Lichtenberg, A new method for preparation of

phospholipid vesicles (liposomes) - French press. FEBS Lett, 1979. 99(1): p. 210-4. 208. Mimms, L.T., et al., Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein

incorporation using octyl glucoside. Biochemistry, 1981. 20(4): p. 833-40. 209. Szoka, F., Jr. and D. Papahadjopoulos, Procedure for preparation of liposomes with large

internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1978. 75(9): p. 4194-8.

210. Schieren, H., et al., Comparison of large unilamellar vesicles prepared by a petroleum ether

vaporization method with multilamellar vesicles: ESR, diffusion and entrapment analyses. Biochim Biophys Acta, 1978. 542(1): p. 137-53.

211. Enoch, H.G. and P. Strittmatter, Formation and properties of 1000-A-diameter, single-

bilayer phospholipid vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A, 1979. 76(1): p. 145-9. 212. Mayer, L.D., et al., Uptake of antineoplastic agents into large unilamellar vesicles in

response to a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta, 1985. 816: p. 294-302. 213. Mayer, L.D., M.B. Bally, and P.R. Cullis, Uptake of adriamycin into large unilamellar

vesicles in response to a pH gradient. Biochimica et Biophysica Acta, 1986. 857: p. 123-126.

214. Mayer, L.D., et al., Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and Physics of Lipids, 1986. 40: p. 333-345.

215. Harrigan, P.R., et al., Accumulation of doxorubicin and other lipophilic amines into large

unilamellar vesicles in response to transmembrane pH gradients. Biochimica et Biophysica Acta, 1993. 1149: p. 329-338.

216. Duncan, R.J.S., P.D. Weston, and R. Wrigglesworth, A new reagent which may be used to

introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for

immunoassay. Analytical Biochemistry, 1983. 132: p. 68-73. 217. Hoare, D.G. and D.E. Koshland, Jr., A method for the quantitative modification and

estimation of carboxylic acid groups in proteins. Journal of Biological Chemistry, 1967. 242(10): p. 2447-2453.

218. Zetasizer !ano user manual. Malvern Instruments Ltd., 2009. 219. Ellman, G.L., Tissue Sulfhydryl Groups. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959.

82: p. 70-77. 220. MacDonald, R.C., et al., Small-volume extrusion apparatus for preparation of large,

unilamellar vesicles. Biochim Biophys Acta, 1991. 1061(2): p. 297-303. 221. Hülsermann, U., et al., Uptake of apolipoprotein E fragment coupled liposomes by cultured

brain microvessel endothelial cells and intact brain capillaries. Journal of Drug Targeting, 2009. 17(8): p. 610-618.

222. Bovine Serum Albumin - Product Information, SIGMA. p. 5. 223. Charlwood, P.A., Differential sedimentation-velocity and gel-filtration measurements on

human apotransferrin and iron-transferrin. Biochem J, 1971. 125(4): p. 1019-26. 224. Sakajiri, T., et al., Absence of binding between the human transferrin receptor and the

transferrin complex of biological toxic trace element, aluminum, because of an incomplete

open/closed form of the complex. Biol Trace Elem Res, 2009. 136(3): p. 279-86. 225. Twigg, R.S., Oxidation-Reduction aspects of Resazurin. Nature, 1945. 155(3935): p. 401-

402.

7. Literaturverzeichnis ccv

226. Decker, T. and M.L. Lohmann-Matthes, A quick and simple method for the quantitation of

lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis

factor (T!F) activity. J Immunol Methods, 1988. 115(1): p. 61-9. 227. Versuchtierkunde und tierexperimentelle Methoden. Interfakultäre Biomedizinische For-

schungseinrichtung, Universität Heidelberg, 2009. 228. !CBI Reference Sequence: !P_851335.1.

229. MacGillivray, R.T., et al., The complete amino acid sequence of human serum transferrin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1982. 79(8): p. 2504-8.

8. Anhang ccix

8. Anhang

Anhang A

HPLC-Programm zur Bestimmung der Lipidkonzentration. In Abbildung 7.1 ist eine schematische

Darstellung des Fließmittelgradienten zu sehen.

ColumnOven.TempCtrl = On ColumnOven.Temperature.Nominal = 45.0 [°C] ColumnOven.Temperature.LowerLimit = 5.0 [°C] ColumnOven.Temperature.UpperLimit = 85.0 [°C] EquilibrationTime = 0.5 [min] ColumnOven.ReadyTempDelta = 1.0 [°C] Column_A.ActiveColumn = No Column_B.ActiveColumn = No Sampler.TempCtrl = On Sampler.Temperature.Nominal = 35.0 [°C] Sampler.Temperature.LowerLimit = 4.0 [°C] Sampler.Temperature.UpperLimit = 45.0 [°C] Sampler.ReadyTempDelta = 1.0 [°C] PumpLeft.Pressure.LowerLimit = 0 [bar] PumpLeft.Pressure.UpperLimit = 300 [bar] PumpLeft.MaximumFlowRampDown = 10.000 [ml/min²] PumpLeft.MaximumFlowRampUp = 10.000 [ml/min²] PumpLeft.%A.Equate = "%A" PumpLeft.%B.Equate = "%B" PumpLeft.%C.Equate = "%C" PumpRight.Pressure.LowerLimit = 3 [bar] PumpRight.Pressure.UpperLimit = 200 [bar] PumpRight.MaximumFlowRampDown = 1.000 [ml/min²] PumpRight.MaximumFlowRampUp = 1.000 [ml/min²] PumpRight.%A.Equate = "%A" PumpRight.%B.Equate = "%B" PumpRight.%C.Equate = "%C" DrawSpeed = 10.000 [µl/s] DrawDelay = 3000 [ms] DispSpeed = 20.000 [µl/s] DispenseDelay = 3000 [ms] WasteSpeed = 32.000 [µl/s] SampleHeight = 4.000 [mm] InjectWash = AfterDraw WashVolume = 100.000 [µl] WashSpeed = 20.000 [µl/s] PunctureOffset = 0.0 [mm] PumpDevice = "PumpRight" InjectMode = Normal SyncWithPump = On ColumnOven_Temp.Step = Auto ColumnOven_Temp.Average = On

ccx 8. Anhang

PumpRight_Pressure.Step = Auto PumpRight_Pressure.Average = On Data_Collection_Rate = 10.00 [Hz] Rise_Time = 0.50 [s] UV_VIS_1.Wavelength = 200 [nm] UV_VIS_1.Bandwidth = 4 [nm] UV_VIS_1.RefWavelength = Off UV_VIS_1.RefBandwidth = 1 [nm] UV_VIS_2.Wavelength = 210 [nm] UV_VIS_2.Bandwidth = 4 [nm] UV_VIS_2.RefWavelength = Off UV_VIS_2.RefBandwidth = 1 [nm] UV_VIS_3.Wavelength = 215 [nm] UV_VIS_3.Bandwidth = 4 [nm] UV_VIS_3.RefWavelength = Off UV_VIS_3.RefBandwidth = 1 [nm] UV_VIS_4.Wavelength = 220 [nm] UV_VIS_4.Bandwidth = 4 [nm] UV_VIS_4.RefWavelength = Off UV_VIS_4.RefBandwidth = 1 [nm] UV_VIS_5.Wavelength = 230 [nm] UV_VIS_5.Bandwidth = 4 [nm] UV_VIS_5.RefWavelength = Off UV_VIS_5.RefBandwidth = 1 [nm] 3DFIELD.RefWavelength = 220 [nm] 3DFIELD.RefBandwidth = 5 [nm] PumpLeft.Flow = 0.000 [ml/min] PumpLeft.%B = 0.0 [%] PumpLeft.%C = 0.0 [%] PumpLeft.Curve = 5 3DFIELD.MinWavelength = 200 [nm] 3DFIELD.MaxWavelength = 270 [nm] 3DFIELD.BunchWidth = 5 [nm] 0.000 Autozero Wait AZ_Done PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 0.0 [%] PumpRight.%C = 60.0 [%] Wait ColumnOven.Ready and Sampler.Ready Inject ColumnOven_Temp.AcqOn PumpRight_Pressure.AcqOn UV_VIS_1.AcqOn UV_VIS_2.AcqOn UV_VIS_3.AcqOn UV_VIS_4.AcqOn UV_VIS_5.AcqOn 3DFIELD.AcqOn PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 0.0 [%]

8. Anhang ccxi

PumpRight.%C = 60.0 [%] 4.000 PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 0.0 [%] PumpRight.%C = 80.0 [%] 6.000 PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 20.0 [%] PumpRight.%C = 80.0 [%] 28.000 PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 20.0 [%] PumpRight.%C = 80.0 [%] 29.000 PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 0.0 [%] PumpRight.%C = 60.0 [%] 31.000 PumpRight.Flow = 1.200 [ml/min] PumpRight.%B = 0.0 [%] PumpRight.%C = 60.0 [%] 33.000 ColumnOven_Temp.AcqOff PumpRight_Pressure.AcqOff UV_VIS_1.AcqOff UV_VIS_2.AcqOff UV_VIS_3.AcqOff UV_VIS_4.AcqOff UV_VIS_5.AcqOff 3DFIELD.AcqOff End

Abbildung 7.1: Zusammensetzung des Fließmittelgradienten

ccxii 8. Anhang

Anhang B

Aminosäuresequenz für Rinderserum-Albumin.[228]

1 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA

51 FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK

101 VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF

151 KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC

201 LLPKIETMRE KVLTSSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA RLSQKFPKAE

251 FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE

301 CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL

351 GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL

401 KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS

451 RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC

501 TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT

551 ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV

601 STQTALA

35 Cystein (davon 17 Disulfidbrücken) (Cys; C)

59 Lysin (Lys; K)

20 Glutamin (Gln; Q)

14 Asparagin (Asn; N)

58 Glutaminsäure (Glu; E)

40 Asparaginsäure (Asp; D)

8. Anhang ccxiii

Anhang C

Aminosäuresequenz für Transferrin.[229]

1 MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP

51 SDGPSVACVK KASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV

101 AEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP

151 IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST

201 LNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAFVKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT

251 RKPVDEYKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE

301 FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC

351 PEAPTDECKP VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI

401 MNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV

451 VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFS

501 EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS GLNLCEPNNK EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA

551 FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR

601 APNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF

651 RDDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP

38 Cystein (davon min. 9 (eher 19) Disulfidbrücken) (Cys; C)

58 Lysin (Lys; K)

17 Glutamin (Gln; Q)

34 Asparagin (Asn; N)

Danksagung ccxvii

Danksagung

Für die Möglichkeit meine Dissertation in seiner Arbeitsgruppe anfertigen zu dürfen, die Anleitung

und Unterstützung, sowie das äußerst interessante Thema, für den größtmöglichen Freiraum bei der

Gestaltung der Arbeitszeit und der Planung von Experimenten möchte ich mich herzlich bei Herrn

Prof. Dr. Gert Fricker bedanken.

Herrn Prof. Dr. Jürgen Reichling danke ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens.

Für die finanzielle Unterstützung meiner Forschungstätigkeit gilt mein Dank dem Phospholipid

Forschungszentrum, Heidelberg.

Für unzählige Hinweise, Vorschläge zur Verbesserung, sein unerschöpfliches Wissen zu Liposo-

men, dass er mit mir geteilt hat, für ein stets offenes Ohr bei Fragen und Problemen, sowie drei Jah-

re lang angenehme Laboratmosphäre möchte ich mich bei Dr. Johannes Parmentier bedanken.

Dr. Isolde Reimold danke ich für die Anleitung und Anregung bei der Planung und Durchführung

meiner in vivo Experimente.

Bei Dr. Anne Mahringer möchte ich mich für die stete Ansprechbarkeit bei Fragen zu den Ecken

und Kanten der Hirnkapillarzell-Pflege bedanken.

Für die Schlachthof-Fahrgemeinschaft danke ich Alexandra Bernd.

Tobias Bartl, Jörn Pezoldt, Christian Schröter, Anja Klein, Michael Schamberger, Daniel Grasbon,

Dominik Reitermayer, Diana Born und Guido Zeegers, die meine Arbeit durch Praktika, Bachelor-

und Masterarbeiten unterstützt haben, danke ich für die gute Zusammenarbeit und die schönen Er-

gebnisse.

Für den Versuch Liposomen im Hirn zu sehen, wenn auch erfolglos, möchte ich Dr. Götz Hofhaus

danken.

Bei Dominik Gartzke möchte ich mich für unvergessliche Tage in Washington, Philadelphia, Atlan-

tic City und New York, sowie die stets richtige Wellenlänge im Laboralltag bedanken. Der nächste

Schneesturm kann kommen.

ccxviii Danksagung

Allen bereits genannten, ehemaligen wie jetzigen Kollegen, sowie Caroline MacLean, Fabian Poly-

ak, Hendrik Schneider, Johanna Kanzer, Kerstin Frank, Marise Kolter, Sabrina Nickel, Sarah Fi-

scher, Silvia Pantze, und Sonja Rust möchte ich für angenehme Kaffeepausen und Mittagessen, die

stets gute Atmosphäre im Institut, sowie außeruniversitäre Unternehmungen danken. Außerdem

bedanke ich mich bei Anne, Dominik, Kerstin, Silvia und Marise für das Korrekturlesen dieser Ar-

beit.

Meiner Familie gilt mein ganz besonderer Dank für den schier unerschöpflichen Glauben daran,

dass ich das schon machen werde.