DNA - Sequenzierstrategien

Von Theresa Köhler

Was ist Sequenzieren?

Bestimmen der Basensequenz eines DNA - oder RNA -Strangs

Schlussfolgerung auf Aminosäuresequenz in einem Protein

Identifikation von Genen und kleinsten Veränderungen im Genom

 

Wozu braucht man Strategien?

Genome sind zu groß, um in einem einzigen Schritt sequenziert werden zu können

eine Sequenzierungsreaktion (‚read'): ca. 600 Nukleotide

Genomgrößen:– Escherichia coli: 4,64 Mb– Saccharomyces cerevisiae: 12,1 Mb– Arabidopsis thaliana: 125 Mb– Homo sapiens: 3200 Mb– Triticum aestivum: 17000Mb

Strategien

Shot-Gun-Methode Chromosome Walking Clone Fingerprinting Nested Deletion Delta-Restriktionsklonierung

Shot-Gun-Methode Das Genom

wird nach Zufallsprinzip in kurze Fragmente (1,6 – 2,0 kb) zerbrochen (Restriktionsendonukleasen, Ultraschall)

Klonierung Sequenzierung Suche nach

Überlappungen

Shot-Gun-Methode

Vorteil: – schnelle Analyse der Fragmente

Nachteile: – Ermittlung der Gesamtsequenz bedarf enormen

Computeraufwand, um anhand von Überlappungen die Gesamtsequenz zu erhalten

– Sich wiederholende Sequenzen im Genom können falsch eingeordnet werden oder völlig übergangen

– Lücken können auftreten

Chromosome Walking Bekanntes DNA-Stück wird langsam mit Hilfe von

Hybridisierungssonden erweitert Wahl eines beliebigen Klons aus der Bibliothek Markierung Verwendung als Sonde für alle anderen Klone in

Bibliothek Suche nach Überlappungen erneute Markierung und Hybridisierung

Chromosome Walking

Vorteile:– Position und Laufrichtung der Sequenz sind jederzeit

bekannt.– Redundanz von 2 durch die zusätzliche Anbringung

von Primern in Gegenrichtung, s.d. der komplementäre Sequenzstrang bestimmt werden kann

Nachteil: – Arbeitsaufwändig, da Sequenzdaten nur Schritt für

Schritt erhalten werden können (bis 200 kb)– Synthese eines neuen Primers für jede Reaktion

Clone Fingerprinting

Nachweis von Sequenzelementen, die zwei Klonen gemeinsam sind

Behandlung mit Restriktionsendonukleasen Suche nach Fragmenten gleicher Größe Vorteile:

– schneller– Keine feste Ausgangsposition

Nachteile:– Hoher Arbeitsaufwand, Agarosegele nach

gleichgroßen Fragmenten zu untersuchen

Clone Fingerprinting

Nested Deletion

Behandlung mit Exonukleasen zur Verkürzung (Deletion)

Probenentnahme in regelmäßigen Abständen

Vorteil: – Nur ein Standard-Primer wird benötigt– Repetive Sequenzen werden nicht

übersehen

Delta-Restriktionsklonierung Zerkleinerung des DNA - Fragment

und GelAnalyse Verkürzung des Klons durch

Kopplung mit bestimmten Enzymen

Lage der Verkürzungen weist unter Verwendung von Standardprimern auf die Sequenz hin

Literatur

S.B.Primose – Genomanalyse T.Strachan – Das menschliche Genom T.A.Brown – Genomes 2nd Edition