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Bachelorarbeit
DoE gestützte Etablierung und Optimierung der Isolation zellinterner Produkte durch Tangentialflussfiltration mit Hohlfasern aus komplexen E. coli-Lysaten
von Cedric Tank
Sommersemester 2012
Betreuung:
Prof. Dr. Gesine Cornelissen
Dr. Jan Oschmann
HAW Hamburg
Fakultät Life Sciences
Studiengang Biotechnologie
In Zusammenarbeit mit:
Richter-Helm BioLogics
Betriebsstätte Hamburg
Abgabedatum:
9. Juli 2012
2
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit selbstständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Hamburg, den 9. Juli 2012
(Cedric Tank)
Danksagung
Diese Bachelorarbeit entstand bei der Firma Richter-Helm BioLogics, Betriebsstätte Hamburg, in
Kooperation mit der HAW Hamburg.
An dieser Stelle bedanke ich mich bei meinen beiden Betreuern Frau Prof. Dr. Gesine Cornelissen und
Herrn Dr. Jan Oschmann für die ausführliche und engagierte Betreuung und die vielen hilfreichen
Anregungen. Desweiteren bedanke ich mich bei der Firma Richter-Helm BioLogics und ihren
Mitarbeitern für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und Mittel sowie die Einführung und
Begleitung der firmeninternen Projekte.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern für die Durchsicht und Kontrolle der fertigen Arbeit und
meiner Freundin für die moralische Unterstützung.
Abbildung auf dem Titelblatt: ÄKTAcrossflow™
Quelle: GE Healthcare, ÄKTA™ Protein purification by design, 28-4026-97 AD 01/2010
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Zusammenfassung
Primäres Ziel der Bachelorarbeit war die Etablierung und Optimierung eines Tangentialfluss-
filtrationsverfahrens zur Aufreinigung von verschiedenen E. coli-Lysaten mit Hohlfaserfiltern. Dabei
wurde das neue vollautomatische Filtrationssystem ÄKTAcrossflow™ von GE Healthcare eingeführt
und das Filtrationsversuchsschema mit einem ausgewählten DoE-Modell aufgestellt und ausgewertet.
Als sekundäres Ziel erfolgte während der Bachelorarbeit ein Scale-down der Fermentationen um den
Faktor 10 (von 10 Liter auf 1 Liter) und dessen Auswertung, Vergleich und Diskussion. Dazu konnten
zwei firmeninterne E. coli Zellstämme erst im Schüttelkolben und dann im 1-L-Maßstab
standardmäßig fermentiert und das Wachstumsverhalten charakterisiert werden. Mit jedem der beiden
unterschiedlichen rekombinanten Organismen wurde jeweils ein Protein hergestellt, wobei eins als
Inclusion Bodies und eins in löslicher Form im Zytoplasma vorliegt. Nach der Fermentation und
Zellernte erfolgte ein spezifischer Zellaufschluss, um das rekombinant hergestellte Produkt
freizusetzen, und anschließend eine Filtration im Tangentialflussverfahren. Für die Filtration mit Hilfe
der neu eingeführten ÄKTAcrossflow™ von GE Healthcare wurden Hohlfasern mit Porengrößen
zwischen 500 kDa und 0,1 µm eingesetzt. Zur Untersuchung der Filtrationsleistung erfolgte die DoE-
Versuchsplanung mit dem Programm MODDE. Im Rahmen von 13 Versuchen für jedes Projekt
wurden erst die grundsätzlichen Eigenschaften der beiden verschiedenen Zelllysate in speziellen
Vorversuchen und dann die Filtrationsleistung in Abhängigkeit ausgesuchter Parameter bestimmt.
Dabei dienten die Scherrate, der Membranflux und die Porengröße als Eingangsparameter und die
Proteinwiederfindungsrate mit Ergänzung der Prozesszeit als Ausgangsparameter. In den
Vorversuchen konnte die Diversität der verschiedenen Zelllysate untersucht und diskutiert werden, da
zwischen den Zellsuspensionen der beiden Projekte deutliche Unterschiede zu verzeichnen waren. Das
System ÄKTAcrossflow™ konnte erfolgreich in den Prozessverlauf integriert und etabliert werden.
Im Rahmen der anschließenden DoE-Auswertung wurde besonders der bedeutende Einfluss der
Scherrate deutlich, der in Interaktion mit dem richtigen Membranflux zu Proteinwiederfindungsraten
von über 90% führte.
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Abstract
The primary objective of the Bachelor thesis was to establish and optimize tangential-flow filtration
processes for the purification of various E. coli lysates using hollow fiber filters. For this, the new
fully automatic filtration system ÄKTAcrossflow ™ by GE Healthcare was introduced. The filtration
test pattern was selected and evaluated using a DoE model. A secondary objective during the bachelor
thesis was a scale-down of the fermentations by a factor of 10 (10 liter to 1 liter) and its evaluation,
comparison and discussion. For this purpose, two strains of E. coli were primarily cultivated in shake
flasks and then fermented in 1-L-scale by default so that the growth and production behavior could be
characterized. With each of the two different recombinant organisms, one protein was prepared, one
being produced as inclusion bodies and one in soluble form in the cytoplasm. Fermentation and cell
harvest were followed by a specific cell disruption, to release the produced product, and a tangential-
flow filtration. For the filtration with the introduced ÄKTAcrossflow™ by GE Healthcare hollow
fibers were used with pore sizes of between 500 kDa and 0.1 microns. For the investigation of the
filtration performance the kind of experiments were planned with DoE and the program MODDE.
Within 13 experiments for each project the fundamental properties of the two different cell lysates
were determined in special preliminary tests and then the filtration performance as a function of
selected parameters was detected. Shear rate, membrane flux and pore size were selected as input
parameters and the protein recovery with the process time as a supplement as output parameters. In
preliminary experiments the diversity of the different cell lysates could be examined and discussed, as
the cell suspensions of the two projects marked obvious differences. The system ÄKTAcrossflow™
could be established as a superior system for high protein recovery in both projects. As part of the
DoE evaluation especially the significant influence of the shear rate became apparent, leading in
interaction with the correct membrane flux to protein recoveries of greater than 90%.
5
INHALTSVERZEICHNIS
1. Einleitung........................................................................................................................................ 7
2. Zielsetzung...................................................................................................................................... 9
3. Theoretische Grundlagen .............................................................................................................. 10
3.1. Escherichia coli ..................................................................................................................... 10
3.2. Eingesetzte Verfahren ........................................................................................................... 12
3.2.1. Zentrifugation ................................................................................................................ 12
3.2.2. Hochdruckhomogenisation ............................................................................................ 12
3.2.3. Ultraschallaufschluss ..................................................................................................... 13
3.2.4. Filtration/ State of the Art.............................................................................................. 13
3.3. Design of Experiments .......................................................................................................... 18
4. Material und Methoden ................................................................................................................ 20
4.1. Multifermenteranlage fedbatch-pro® .................................................................................... 20
4.1.1. Fermentationsanalytik ................................................................................................... 21
4.2. Zellaufschlussmethoden ........................................................................................................ 23
4.3. ÄKTAcrossflow™ ................................................................................................................ 23
4.4. Filtrationsablauf..................................................................................................................... 27
4.5. SDS-PAGE ............................................................................................................................ 28
5. Durchführung ................................................................................................................................ 29
5.1. Fermentation .......................................................................................................................... 30
5.1.1. Schüttelkolbenversuche ................................................................................................. 30
5.1.2. Fermentation B028 ........................................................................................................ 31
5.1.3. Fermentation B082 ........................................................................................................ 33
5.2. Zellaufschluss ........................................................................................................................ 34
5.2.1. Zellaufschluss B028 ...................................................................................................... 34
5.2.2. Zellaufschluss B082 ...................................................................................................... 35
5.3. Filtration ................................................................................................................................ 35
5.3.1. Prozessparameter/Versuchsplanung DoE ...................................................................... 35
6
5.3.2. Versuchsablauf Vorversuche ......................................................................................... 39
5.3.3. Transfer der Lysatprobe ................................................................................................ 40
5.3.4. Probenahme und Analytik ............................................................................................. 41
5.3.5. Lagerung der Prozessproben ......................................................................................... 42
6. Ergebnisse ..................................................................................................................................... 43
6.1. Schüttelkolbenversuche ......................................................................................................... 43
6.2. Fermentation .......................................................................................................................... 44
6.2.1. Fermentation B028 ........................................................................................................ 44
6.2.2. Fermentation B082 ........................................................................................................ 50
6.3. Filtrationsvorversuche ........................................................................................................... 54
6.3.1. Vorversuch 1: Ermittlung des optimalen Konzentrierungsfaktors ................................ 54
6.3.2. Vorversuch 2: Ermittlung des optimalen Membranfluxes ............................................ 55
6.3.3. Vergleich B028 und B082 Konzentrierung ................................................................... 57
6.4. Filtration ................................................................................................................................ 57
6.4.1. Filtration B028 .............................................................................................................. 57
6.4.2. Filtration B082 .............................................................................................................. 65
7. Filtration: Auswertung und Diskussion ........................................................................................ 70
7.1. DoE-Auswertung B028 ......................................................................................................... 70
7.2. DoE-Auswertung B082 ......................................................................................................... 78
7.3. Diskussion und Vergleich ..................................................................................................... 84
8. Fazit .............................................................................................................................................. 86
9. Anhang.......................................................................................................................................... 88
9.1. Quellenangaben ..................................................................................................................... 88
9.2. Eingesetzte Medien und Puffer ............................................................................................. 90
9.3. Gleichung Konzentrierungskoeffizient B028 ........................................................................ 93
Einleitung
7
1. EINLEITUNG
Die Arbeit ist entstanden in der Firma Richter-Helm BioLogics (RHB) am Standort Hamburg in der
Abteilung Prozessentwicklung/ Downstream Processing1.
Im Laufe der Wirkstoffproduktion in der pharmazeutischen Biotechnologie durchwandert das
Zielmolekül einen komplexen Produktionsvorgang [16]. Nach der molekularbiologischen Entwicklung
mit der Klonierung der richtigen DNA-Sequenz zur Produktion im Wirtsorganismus und der
Stammentwicklung erfolgt die Charakterisierung des Wachstums- und Produktionsverhaltens der
Zellen unter unterschiedlichsten Bedingungen. Dies ist besonders wichtig für die nachfolgende
Produktion und Vermehrung der Zellen in der Fermentation (Upstream Processing2).
Abbildung 1: Verlauf der Entwicklung und Produktion eines rekombinant hergestellten Produktes
in der Biotechnologie
1 Downstream Processing – Proteinaufreinigung nach der Fermentation
2 Upstream Processing - Fermentationsprozesse
Produktion der rekombinanten Zellen in der
Fermentation (Upstream Processing)
Abtrennen des Proteins von der Zellmasse und
chromatographische Aufreinigung
(Downstream Processing)
Analytik und Charakterisierung des hergestellten
Produktes
Molekularbiologischer
Bauplan des Produktes
rekombinanter Zellstamm
Zellmasse mit Produkt
aufgereinigtes Produkt
Molekularbiologische Stammentwicklung
Einleitung
8
Mit abgeschlossener Synthese des Zielproteins in der Zelle und nachdem genug Zellmasse vorhanden
ist, schließt sich der mitunter aufwendige Reinigungsprozess an.
Häufig befindet sich das Produkt noch innerhalb der Zellen [1][2][3], so dass als nächster Schritt ein
Zellaufschluss, zum Beispiel per Hochdruckhomogenisation oder Ultraschallbestrahlung, erfolgen
muss [1]. Die Zellwände werden durch die einwirkenden Kräfte aufgebrochen und das Zielprotein
freigesetzt.
Befindet sich das Protein durch Sekretion in das umgebende Medium bereits außerhalb der Zellen,
reicht meist eine einfache Abtrennung der intakten Zellen vom Fermentationsmedium [8].
Im Rahmen der Bachelorarbeit lag der Fokus ausschließlich auf Proteinen, die in der Zelle gebildet
und gelagert werden, so dass vorwiegend diese im weiteren Verlauf thematisiert werden.
Nach dem Aufschluss der Zellen muss das Zielprotein von den Zellwandfragmenten und den Host
Cell Proteins3 (HCP), den natürlichen Wirtszellproteinen, abgetrennt werden.
Für diesen Vorgang stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung.
Die gängigsten Methoden sind das Abzentrifugieren der Zellbruchstücke und das Filtrieren der
Suspension [24]. Problematisch ist bei beiden Verfahren häufig die Komplexität des vorhandenen
Zelllysats. So variiert die Größe der Zellwandbruchstücke stark, je nachdem welches
Aufschlussverfahren eingesetzt wird, unterscheiden sich die HCP je nach Wirtsorganismus oder führt
freigesetzte DNA zu hoher Viskosität im zu prozessierenden Medium [1][20].
Nach der ersten Aufreinigung des Produktes aus der umgebenden Zellmatrix erfolgt meist eine weitere
Aufreinigung des Zielproteins mittels verschiedenster Chromatographieschritte und weiterer
Filtrationen, bis das produzierte Arzneimittel (Zielprotein) in möglichst reiner Form vorliegt und so in
den Handel gehen kann.
3 Host Cell Proteins – natürliche Wirtszellproteine
Zielsetzung
9
2. ZIELSETZUNG
In der Bachelorarbeit lag der Fokus vorwiegend auf einer Variante des ersten Aufreinigungsschrittes,
der Filtration des Produktes aus dem Zelllysat.
Für diesen Zweck wurden Hohlfaserfilter im Querstromverfahren eingesetzt. Eine genaue
Beschreibung dieser Filtrationsmethode folgt in Kapitel 3.2.4 - Filtration.
Die Zellbänke und die damit einhergehenden rekombinanten Proteine stammen aus firmeninternen
Projekten.
Im Rahmen dieser Projekte wurden 2 verschiedene Proteine aus 2 verschiedenen E. coli-Zellbänken
untersucht, wobei beide Proteine während der Kultivierung im Zytoplasma synthetisiert, aber nicht
sekretiert werden. Protein A (im Laufe dieser Arbeit Protein B028) wurde in Form von unlöslichen
Inclusion bodies4 exprimiert, während Protein B (im Verlauf der Arbeit Protein B082) nach der
Synthese in löslicher Form vorlag.
Tabelle 1: Ort der Lagerung des Proteins in der Zelle (B028 +B082)
Projekt Ort der Lagerung in der Zelle
B028 Unlöslich in Inclusion Bodies
B082 Löslich im Zellplasma
Primäres Ziel dieser Bachelorarbeit war der Vergleich der beiden unterschiedlichen Zelllysate und
deren Verhalten während der Filtration und gesamten Aufreinigung sowie die Ermittlung
prozessrelevanter Parameter mit Hilfe des Design of Experiments5 und die Einführung der Methoden
in den Prozessablauf. Von sekundärer Priorität war weiterhin der Scale-down6 der zur Produktion
notwendigen Fermentation vom 10-Liter in den 1-Liter-Maßstab.
4 Inclusion Bodies – Interzellulare Einschlusskörper
5 Design of Experiments - statistische Versuchsplanung
6 Scale-down/Scale-up – Skalierung und Anpassung eines Verfahrens auf einen kleineren/größeren Maßstab
(Maßstabsübertragung),
Theoretische Grundlagen
10
3. THEORETISCHE GRUNDLAGEN
Die Produktion der untersuchten Zielproteine erfolgte für die Bachelorarbeit ausschließlich in
Escherichia coli. Daher folgt nun eine kurze Einleitung und Charakterisierung des Organismus.
3.1. ESCHERICHIA COLI
Escherichia coli (E. coli) gehört zu den am häufigsten eingesetzten
Mikroorganismen in der gesamten Biotechnologie. Besonders seit
der Revolution der Gentechnik und der damit einher gehenden
Veränderbarkeit der Genome wird dieses Darmbakterium aufgrund
seiner Eigenschaften gerne eingesetzt. Escherichia coli, kurz E. coli,
ist ein stäbchenförmiges, gramnegatives und fakultativ anaerobes
Abbildung 2: Escherichia coli [Quelle: National Institute of Allergy and Infectious Diseases U.S.
(NIAID)7
Bakterium und gehört zur Familie der Enterobacteriaceae.
Die Vorteile dieses Mikroorganismus sind:
E. coli wird sowohl in der Forschung als auch in der Industrie häufig für die Produktion bestimmter
Proteine verwendet, deren genetische Information in Form eines Plasmids oder DNA-Segments in die
Zelle inseriert werden.
Bei der Proteinproduktion kann das fertig synthetisierte Protein entweder löslich im Zytosol oder den
bereits erwähnten Inclusion bodies exprimiert oder aus dem Zytosol in das Periplasma sekretiert
7 unter: http://www.niaid.nih.gov/SiteCollectionImages/topics/biodefenserelated/e_coli.jpg, Stand 05.07.2012
Das gut erforschte Genom
Das schnelle Wachstum
Die leichte Manipulierbarkeit des Genoms
Die unkomplizierte Kultivierung
Die Erreichbarkeit hoher Zelldichten und Produktausbeuten
Das Vorhandensein von nicht pathogenen E. coli-Stämmen (z.B. E. coli K12)
Theoretische Grundlagen
11
werden. Durch zusätzliche molekularbiologische Veränderungen (Einbau von Transportsystemen)
besteht weiterhin die Möglichkeit der Sekretion des Produktes in das umgebende Medium.
Letzteres ermöglicht eine leichtere Aufreinigung des Zielproteins, da die Zellen im Laufe der Ernte
nur noch vom flüssigen Medium abgetrennt werden müssen (z.B. durch Zentrifugation). Weiterhin
wird die Zelle als Ganzes nicht zerstört, wodurch der Anteil der abzutrennenden zellinternen Proteine
(HCP) minimiert wird. Vorteilhaft an der Sekretion des Proteins ist auch der Schutz außerhalb der
Zelle vor zellinternen Proteasen, die zu einem beschleunigten Abbau des Produktes führen können.
Die Sekretion des Proteins in das umgebene Medium wird bei E. coli recht selten angewandt. Im
Zytoplasma bilden sich daher bei Überexpression von disulfidverbrückten Proteinen die schon
erwähnten IBs, intrazelluläre Einschlusskörper, in denen das Zielprotein zwar häufig als unlösliches,
inaktives Aggregat vorliegt, allerdings so ebenfalls vor den zellinternen Proteasen geschützt ist.
Im Laufe der Aufarbeitung und Reinigung muss das Protein daher in diesem Fall aufwendig wieder
gelöst und renaturiert werden.
In der Industrie wird als bekanntestes Beispiel mit Hilfe von gentechnisch veränderten E. coli im
großen Maßstab Insulin zur Behandlung von Diabetes hergestellt. Außerdem kommt E. coli häufig bei
der Herstellung von Aminosäuren, Interferonen oder menschlichen Wachstumshormonen zum Einsatz
und ist besonders bei neu entwickelten Pharmazeutika eine vermehrt verwendete
Produktionsgrundlage.
Die Proteinproduktion in E. coli kann physikalisch oder chemisch induziert werden.
Für die physikalische Induktion wird oft eine Gensequenz eingebaut, die die Expression des
Zielproteins erst bei Temperaturerhöhung induziert, für die chemische Induktion wird meist IPTG8
verwendet, ein Stoff, der in seiner Strukturformel Laktose ähnelt. Um die Expression des Zielproteins
steuern zu können, wird zusätzlich zu der Sequenz des Proteins noch ein so genanntes lac-Operon
eingebaut, das ursprünglich bei der Metabolisierung von Milchzucker (Laktose) Anwendung findet
und erst bei Zugabe des milchzuckerähnlichen IPTG das Ablesen der Gensequenz ermöglicht.
[vorwiegende Quellen:
Terpe, Kay: Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from
molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006)
72:211-222
Chmiel, Horst: Bioprozesstechnik, 3. Auflage (2011), S. 54-56]
8 IPTG - Isopropyl-ß-D-thogalactopyranosid
Theoretische Grundlagen
12
3.2. EINGESETZTE VERFAHREN
3.2.1. ZENTRIFUGATION
Grundlage der Zentrifugation ist das natürliche Absinken von Feststoffen in Flüssigkeiten durch die
Gravitation. Diese Sedimentation wird durch Anlegen einer Zentrifugalbeschleunigung wesentlich
beschleunigt. Die Beschleunigung entsteht dabei durch die Rotation der Zellsuspension um eine
Rotationsachse und ergibt sich aus dem mittleren Abstand der Partikel zur Drehachse und der
Winkelgeschwindigkeit.
Bei den diskontinuierlichen Zentrifugen erfolgt die Zentrifugation im Batch-Verfahren, das heißt, dass
jeweils eine bestimmte Menge an suspendierten Zellen abzentrifugiert und wieder entleert wird und
sich dann ein neuer Lauf anschließt. Die Zellsuspension wird dabei so beschleunigt, dass sich die
Partikel im Laufe des Verfahrens am äußeren Rand der Zentrifuge (im Normalfall am Boden des
eingesetzten Behälters) absetzen und sich ein so genanntes Zellpellet bildet. Die größten Teilchen
sedimentieren dabei zuerst. Die minimale Größe und Masse der Partikel, die zur Sedimentation im
Pellet notwendig ist, hängt von der einwirkenden Zentrifugalbeschleunigung und der Dauer der
Zentrifugation ab.
[vorwiegende Quelle: Cornelissen, Prof. Dr. Gesine: HAW Hamburg, Skript zur Vorlesung
Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren, Stand WS 2010/2011]
3.2.2. HOCHDRUCKHOMOGENISATION
Die Hochdruckhomogenisation stellt ein standardmäßiges Verfahren zum Zellaufschluss dar [2][19]
und stammt ursprünglich aus der Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrie. Der
Homogenisator besteht dabei im Wesentlichen aus einer Feed9-Pumpe, einer Hochdruckpumpe und
einer Homogenisiereinheit. Durch die Feed-Pumpe wird die aufzuschließende Zellsuspension in das
System eingetragen und mit der Hochdruckpumpe auf Drücke bis zu 1000 bar verdichtet. Ab einem
bestimmten eingestellten Druck öffnet sich ein Spalt von 10 bis 20 µm in der Homogenisiereinheit.
Die verdichtete Zellsuspension wird nun aufgrund des Druckausgleichs mit hoher Geschwindigkeit
durch den Spalt auf einen Prallring gedrückt und dort auf Atmosphärendruck entspannt.
Die Zellen werden bei diesen extremen Bedingungen durch Kavitation oder Scherung buchstäblich
zerrissen. Einflussgrößen für die Hochdruckhomogenisation sind der Homogenisierdruck, die
Konzentration der Zellen in der Suspension, das Design der Homogenisiereinheit, die
Homogenisiertemperatur und gegebenenfalls die Anzahl der Aufschlussdurchläufe.
9 Feed – Stoffstrom, der einer Anlage oder technischen Einheit zugeführt wird
Theoretische Grundlagen
13
Aufgrund der starken einwirkenden Kräfte während des Verfahrens erwärmt sich die Zellsuspension
im Laufe eines Aufschlusszyklus stark und muss regelmäßig gekühlt werden.
[vorwiegende Quelle: Cornelissen, Prof. Dr. Gesine: HAW Hamburg, Skript zur Vorlesung
Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren, Stand WS 2010/2011]
3.2.3. ULTRASCHALLAUFSCHLUSS
Besonders bei kleinen Proben im Labormaßstab wird der Ultraschallaufschluss verwendet. Dabei
zeichnet er sich durch einen geringen apparativen Aufwand und den schnellen Auf- und Abbau aus.
Ultraschall-Desintegratoren bestehen im Wesentlichen aus einem Hochfrequenzgenerator, einem
Wandler, der die Hochfrequenz in eine mechanische Ausgangsgröße verwandelt, und einer Sonotrode,
die die entstandene Schwingung direkt an die Zellsuspension weitergibt. Das Aufschlussprinzip basiert
dabei auf der Bildung von sogenannten Kavitationsblasen, die durch die Schwingungen der Sonotrode
entstehen. In den Kavitationsblasen herrscht, bezogen auf die Umgebung, ein Unterdruck. Fällt eine
solche Kavitationsblase in sich zusammen, entstehen hohe Geschwindigkeiten (bis zu 500 m s-1
), die
die Zellen ähnlich wie beim Hochdruckhomogenisator zerreißen.
Einflussgrößen für den Ultraschallaufschluss sind die eingestellte Amplitude und die Frequenz der
Schwingung, die Temperatur der Lösung, der vorliegende Druck, die Zellkonzentration und die
Beschaffenheit des Mediums oder der Matrix, in der die Zellen vorliegen. Zusätzlich ist auch die
Dauer der Ultraschalleinwirkung von Bedeutung.
Analog zur Hochdruckhomogenisation erwärmt sich die Zellsuspension während des Aufschlusses
stark, so dass kontinuierlich gekühlt werden muss, um Proteindegradation zu vermeiden.
[vorwiegende Quelle: Cornelissen, Prof. Dr. Gesine: HAW Hamburg, Skript zur Vorlesung
Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren, Stand WS 2010/2011]
3.2.4. FILTRATION/ STATE OF THE ART10
Unter Filtration versteht man allgemein die Abtrennung von Partikeln aus flüssigen Lösungen oder
Gasen durch ein Filtermittel. Die in der Lösung enthaltenen Feststoffe oder großen Partikel werden
dabei durch eine Barriere (z.B. eine Membran) zurückgehalten, während die klare Flüssigkeit mit
kleineren Bestandteilen hindurch gelangen kann. In der Biotechnologie wird die Filtration im
Wesentlichen zur Abtrennung von Zellen oder Zellbruchstücken aus Suspensionen oder zur
Auftrennung von Proteinlösungen eingesetzt [3][24].
10 State of the Art – Stand der Technik
Theoretische Grundlagen
14
Dabei unterscheidet man 3 gängige Verfahren:
1. Dead-End-Filtration
Bei der Dead-End- oder Kuchenfiltration trifft der Suspensionsstrom direkt auf das
Filtermittel (z.B. eine Membran), das eine spezifische Porengröße aufweist. Durch die
zurückgehaltenen Partikel bildet sich auf dem Filtermittel bald ein Filterkuchen, der als
effektive Barriere für weitere Feststoffe und damit als zentraler Filtrationsfaktor dient. Das
ursprüngliche Filtermittel hat jetzt nur noch Stützfunktion. Triebkraft für die Filtration sind
Druckgefälle, die durch Über- oder Unterdruck, Gravitation oder Zentrifugation erzeugt
werden. Der Filtrationswiderstand nimmt mit wachsendem Filterkuchen zu.
2. Tiefenfiltration
Bei der Tiefenfiltration erfolgt das Zurückhalten der Partikel im Inneren des Filtermittels.
Tiefenfilter sind oft poröse Materialien, deren Filtrationskörper einem Labyrinth aus
engmaschigen Verflechtungen gleicht. Die Retention der Feststoffe gelingt dabei durch
Ablagerung und Adsorption im Inneren des Filtermittels. Zur effektiven Filtration sind eine
lange Filterstrecke und damit ein dickes Filtermittel von Nöten. Durch die vielen Hohlräume
kann bei der Tiefenfiltration ein hoher Feststoffgehalt gefiltert werden, ohne dass der Filter
verstopft. Die Triebkräfte für die Tiefenfiltration entsprechen denen der Dead-End-Filtration.
3. Querstromfiltration
Bei der Querstromfiltration (auch Cross-Flow-Filtration, tangentiale Filtration,
Tangentialflussfiltration) trifft der Suspensionsstrom quer oder tangential auf das Filtermittel.
Im Gegensatz zur Dead-End-Filtration bildet sich dadurch im Idealfall kein Filterkuchen auf
dem Filtermittel aus, der nach längerem Gebrauch zur Verstopfung des Filters führen kann.
Der quer verlaufende Flüssigkeitsstrom übt bei der Tangentialflussfiltration eine Scherkraft
auf die Partikel aus, so dass bereits abgeschiedene Partikel wieder in das Retentat
zurückgeführt werden können. Vorteile der Querstromfiltration sind eine hohe Kapazität,
robuste, reproduzierbare Ergebnisse aufgrund der gleichbleibenden Prozessbedingungen, eine
gute Skalierbarkeit und die niedrigen Prozesskosten
pro Lauf [13].
Im Verlauf dieser Bachelorarbeit ist besonders die
Querstromfiltration zum Einsatz gekommen und wird
daher nochmal einmal genauer beschrieben.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Querstromfiltration mit den Bezeichnungen Feed,
Permeat und Retentat. (Quelle: GE Healthcare [15])
Theoretische Grundlagen
15
Zusätzlich findet im Rahmen dieses Kapitels eine Darstellung vorangegangener Forschungsergebnisse
in Bezug auf diese Filtrationsart statt.
Der Suspensionsstrom bei der Cross-Flow Filtration wird in Anlehnung an die englische Darstellung
als Feed bezeichnet. Während der Filtration überströmt der Feed die Filtrationsmembran, so dass
Flüssigkeit und Partikel, die durch das Porensystem gelangen können, die Membran passieren. Diesen
Flüssigkeitsstrom nennt man Permeat oder auch Filtrat. Am Ende des Filtrationsmoduls tritt der Feed-
Strom ohne das filtrierte Permeat wieder aus und wird hier als Retentat bezeichnet. Im Normalfall lässt
man das Retentat zirkulieren, so dass es als Feed-Strom wieder dem Filter zugefügt wird.
Filtrationsphänomene, die eine Minderung des Filtratstroms unter ansonsten konstanten Bedingungen
bewirken, werden dabei als Fouling bezeichnet.
Abbildung 4: Schematische Dar-
stellung einer Hohlfaserfiltration.
(Quelle: GE Healthcare [15])
Abbildung 5: Fließbild einer Querstromfiltration unter
Verwendung der Filtrationsparameter ΔP und TMP, die
in der folgenden Aufzählung unter Punkt 6 und 7 noch
einmal erläutert werden. P1 entspricht dabei pfeed, P2
entspricht pret und P0 stellt pperm dar. (Quelle: GE
Healthcare [13])
Wichtige Prozessparameter sind:
1. Der Volumenstrom des Feeds und des Retentats
2. Die Porengröße der Filtrationsmembran
Der Bereich zwischen 1 kDa und 750 kDa wird als Ultrafiltration bezeichnet,
Porengrößen zwischen 0,1 µm und 0,65µm rechnet man eher der Mikrofiltration zu.
3. Die Filterfläche bezogen auf die Filtrationsoberfläche der Membran
4. Die Konzentration der Partikel in der Suspension
5. Die Eigenschaften der abgetrennten Stoffe im Kreislauf
Theoretische Grundlagen
16
6. Delta p
Delta p oder auch ∆p stellt den Druckabfall der Zellsuspension über das
Filtrationsmodul dar und errechnet sich dementsprechend aus dem Druck am Eingang
des Filtrationsmoduls pfeed und dem Druck am Ausgang pret.
mit
Δp := Druckabfall über die Membran [bar]
pfeed := Eingangsdruck am Filtrationsmodul [bar]
pret := Ausgangsdruck am Filtrationsmodul [bar]
7. Der Transmembrandruck
oder auch TMP stellt bei der Tangentialflussfiltration die Triebkraft für die Filtration
dar. Er errechnet sich aus der Differenz des mittleren anliegenden Drucks auf der
Feed-Seite und des Gegendrucks auf der Permeat-Seite pperm und wird in der Einheit
bar oder kPa angegeben (1 bar = 100 kPa).
mit
ΔpTM := Transmembrandruck [bar]
pperm := Gegendruck auf der Permeatseite [bar]
Um die gesamte Filtrationslänge verwenden zu können, sollte der Permeatdruck
allerdings kleiner sein als der Retentatdruck.
8. Der Membranflux
Als Membranflux bezeichnet man den auf die Filtrationsfläche normierten
Volumenstrom des Permeats über die Membran. Er wird normalerweise in der Einheit
L m-2
h-1
(auch LMH) angegeben.
9. Die Scherkraft bzw. Scherrate
Die Scherrate charakterisiert die Scherkraft, die auf den Filterkuchen einwirkt und
damit eine Resolubilisierung dessen in den Suspensionsstrom forciert. Bei einer
(2)
(1)
Theoretische Grundlagen
17
Hohlfaserfiltration berechnet Sie sich aus dem Volumenstrom des Feeds, dem
Durchmesser des einzelnen Filtrationsmoduls und der Anzahl der parallel geschalteten
Fasern.
Bei den prozessierten Zelllysaten handelt es sich zumeist um stark partikelhaltige, viskose
Flüssigkeiten, was regelmäßig zu Schwierigkeiten bei der Filtration führen kann. Für die
stabile Durchführung der Filtration sind deshalb folgende Parametereinstellungen und
Verfahrensdurchführungen zu empfehlen:
1. Zur konstanten Abtragung des Filterkuchens empfiehlt sich eine vergleichsweise hohe
Scherrate, beispielsweise zwischen 8000 und 16000 s-1
[2][3][12].
2. Für den Permeatfluss sind wahlweise Flux- oder TMP-Kontrollen berichtet worden
[1][3][4][19][23][24]. Dabei konnten Fluxraten und die jeweiligen TMPs im Bereich von
25-35 LMH und 62,1 kPa [1],
20-30 LMH und 69 kPa [3],
20-30 LMH und 60 kPa [4],
1,7 LMH und 0,496 kPa [19],
18-20 LMH und 3,45 kPa [19]
festgestellt werden. Bei einer TMP-Kontrolle begünstigt ein niedriger TMP die
Filtrationsleistung, da mit steigendem TMP auch eine dickere Proteingelschichtbildung auf der
Membran einhergeht [3][4][12][19]. Für die stark partikelhaltigen Lysate empfiehlt sich
allerdings eine Flux-Kontrolle unter einem kritischen Wert für den Membranflux [7][24]. Zum
einen wird so zum Anfang ein sehr hoher Permeatflux, der unter TMP-Regelung auftreten und
leicht zur Verblockung der Membran führen kann, vermieden. Zum anderen konnte
festgestellt werden, dass es auch während der Filtration zu starkem Fouling kommt, wenn der
Membranflux so groß ist, dass der Feed-Strom und die damit einwirkende Scherkraft nicht
ausreichen, um der, durch den hohen Membranflux begünstigten, Anlagerung von Partikeln
mit
Nshear := Scherrate [s-1
]
Ffeed := Feed-Strom [ml min-1
]
N := Anzahl der Fasern [-]
d := Durchmesser der Fasern [mm]
a := Umrechnungskoeffizient a = [min s.1]
[Herstellerangabe s. ÄKTAcrossflow™ User Manual 11-0012-32 Edition AB]
(3)
Theoretische Grundlagen
18
auf der Membran entgegenzuwirken [24]. Die berichteten Ergebnisse sind dabei stark
abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Zelllysats und der Konzentration der
Zellmasse in der Suspension.
3. Für ähnliche Versuche auf dem Gebiet der Querstrommikrofiltration wurden
Zellkonzentrationen im Homogenisat von ungefähr 50 g l-1
verwendet, um gleichbleibende
und vergleichbare Bedingungen herzustellen [1][3][19].
4. Vor Beginn der Filtration sollte das Permeatventil zunächst geschlossen bleiben, so dass der
Feed rezirkulieren und sich konstante Bedingungen einstellen können [1][3]. Dies verhindert
ein signifikantes Fouling der Membran zu Anfang des Prozesses.
5. Für den Prozessablauf bieten sich zuerst eine Konzentrierungsphase und dann eine
Diafiltrationsphase an, die mit verschiedenen Puffern durchgeführt werden kann [3][19][24].
6. Vor Beginn des Hauptprozesses sollten Vorversuche zum Verhalten des spezifischen Lysats
während der Filtration durchgeführt werden, falls die Filtrationsleistung des Zelllysats noch
nicht bekannt ist, da die Eigenschaften je nach verwendetem Zellstamm, Produkt oder
Aufschlussverfahren stark variieren können [20]. Dabei ist vor allem die Auswahl der zu
verwendenden Porengröße, die Bestimmung des zu untersuchenden Membranfluxes bzw.
TMP und des optimalen Konzentrierungsfaktors von Bedeutung [10][14][23].
7. Das Verhalten des Zelllysats während der Filtration kann aufgrund der Größenverteilung der
Partikel, der Zellkonzentration, der Temperatur, des Drucks, des Zeitpunkts der IPTG-Zugabe
während der Fermentation, des pHs, der Rührgeschwindigkeit, der Lagerbedingungen, des
verwendeten Membranmaterials, des Antischaummittels der Fermentation und der
Unterschiede des produzierten Proteins sehr unterschiedlich sein [20].
8. Die für die Zelllysatfiltration am häufigsten verwendete Porengröße ist 0,1 µm [2][3][19] [23].
3.3. DESIGN OF EXPERIMENTS
Immer häufiger werden heutzutage experimentell planbare Forschungen mit den statistischen
Methoden des Design of Experiments (DoE) durchgeführt. DoE stellt dabei ein System dar, um die
Abhängigkeit ein oder mehrerer Ausgangsgrößen von den gewählten Eingangsgrößen zu bestimmen.
Die ermittelten Abhängigkeiten sind dabei rein experimentell und statistisch und sagen nicht zwingend
etwas direkt über den naturwissenschaftlichen Zusammenhang aus.
Im Normalfall steht am Anfang einer Versuchsplanung mit DoE ein weitestgehend wissenschaftliches
Problem, für das Eingangs- und Ausgangsparameter erst definiert und auf ein Modell übertragen
werden müssen. Mit Hilfe dieses Modells werden dann Versuche ermittelt, in denen die
Theoretische Grundlagen
19
Eingangsparameter gezielt variiert werden, um einen möglichst genauen Einblick in die
Abhängigkeiten zur Ausgangsgröße zu erlangen. DoE stellt damit eine strukturierte und optimierte
Versuchsplanung zur Verfügung und steht der rein intuitiv experimentellen Herangehensweise
gegenüber, bei der oft weit mehr Experimente benötigt werden, um das gleiche Ergebnis zu erzeugen.
Abbildung 6: Darstellung einer Versuchsplanung mit DoE. Typisch
dafür ist die Würfelform, an deren Eckpunkten die zu
untersuchenden Parametereinstellungen zu finden sind. In der
Mitte des Würfels sind die Centerpoint11-Versuche angesiedelt.
Im räumlichen Mittelpunkt der DoE-Versuche stehen zumeist ein
oder mehrere sogenannte Centerpoint-Versuche, um die die restlichen
Parameter variiert werden. Im Idealfall stellen Sie bei der späteren Auswertung auch einen Mittelpunkt
der Ergebnisse zwischen Minimum und Maximum des Resultats dar. Die Centerpoint-Versuche
werden standardmäßig zur Bewertung der Systemreproduzierbarkeit verwendet, falls mehrere dieser
Versuche mit den gleichen Eingangsparametern durchgeführt werden.
DoE wird standardmäßig in 3 Phasen der Entwicklung angewandt:
1. Screening12
Beim Screening geht es um das grundsätzliche Verhalten eines Systems, den Einfluss
verschiedenster Parameter auf die Ausgangsgröße, den bevorzugten Arbeitsbereich der
Parameter und die Machbarkeit eines Versuches.
2. Optimierung
Bei der Optimierung werden Versuche durchgeführt, um das optimale Ergebnis eines
Experimentes einzugrenzen. Damit stehen die genaue Abhängigkeit der einzelnen
Einflussgrößen und die Charakterisierung eines oder verschiedener Optima im Vordergrund.
3. Robustheit
Die Robustheitstests stellen das Ende der DoE-Versuche dar. Dabei werden die Faktoren so
gewählt, dass ein optimales, aber auch robustes Ergebnis ermittelt wird, das z.B. in der
11 Centerpoint – Zentraler Punkt in der Mitte eines DoE-Versuch-Designs
12 Screening – grobe Durchleuchtung und Rasterung eines Systems
Material und Methoden
20
Abbildung 7: 2 laufende Fermentation
im Multifermentersystem DASGIP®
fedbatch-pro®
Produktion Verwendung finden kann und gleichbleibende Resultate auch bei geringfügig
unterschiedlichen Eingangsparametern garantiert.
Mit DoE ist es also möglich, genaue Prognosen über das Verhalten eines Systems bei Variation
verschiedener Parameter zu machen und die Prozesslandschaft abzubilden. Bei steigender Komplexität
des Modells erhöht sich allerdings auch die Anzahl der durchzuführenden Versuche.
4. MATERIAL UND METHODEN
4.1. MULTIFERMENTERANLAGE FEDBATCH-PRO®
DASGIP® fedbatch-pro
® ist ein in der Entwicklung von mikrobiellen Fermentationsprozessen
eingesetztes Multifermentersystem, das bei Richter-Helm Biologics hauptsächlich als Seed13
-
Fermenter, aber auch teilweise zur Entwicklung von Prozessen im kleinen Maßstab eingesetzt wird.
Im Standort Hamburg stehen dazu vier 1L- Fermenter zur
Verfügung, die parallel betrieben werden können.
Bei dem Multifermentersystem müssen die fertig
zusammengebauten Bioreaktoren vor dem Start des
Prozesses mit dem zu autoklavierenden Fermentations-
medium extern autoklaviert werden. Dies erfolgt in einem
Dampfautoklaven bei 121 °C. Nach der Sterilisation werden
die hitzeempfindlichen Bestandteile des Mediums unter der
Sicherheitswerkbank Klasse II von Heraeus Instruments
sterilfiltriert und per Einwegspritze in den Fermenter
gegeben. Als Ergänzung zu der Dampfsterilisation der Multifermenter erfolgt parallel zur Reinigung
der mit dem Fermenter verbundenen Schlauchsysteme eine CIP14
-Prozedur mit 70 %igem Ethanol,
2 molarer Natronlauge und sterilem Wasser. Nach dem Anschließen der Korrekturlösungen und
gegebenenfalls der Feed-Vorlagen erfolgt die Kalibrierung der pO2-Sonden mit Stickstoff und
Sauerstoff. Der 1 L-Bioreaktor setzt sich zusammen aus einem Glasbehälter und einer abschraubbaren
Deckelplatte aus Edelstahl, in die verschiedene Sonden, ein Abluftkühler, ein Rührer und 2 Triple-
Ports 15
zum Anschließen der Korrekturlösungen oder der Probenahmevorrichtung angeschlossen
werden können.
13 Seed - Anzucht
14 CIP – Cleaning in place
15 Triple-Port – 3-fach-Anschluss
Material und Methoden
21
Die Temperierung erfolgt über Heizelemente in der Bodenplatte, in die die Multifermenter gestellt
werden. Sie umfasst einen Bereich von 5 bis 99° C. Die Temperatur im Fermenter wird mit einem Pt-
100 Messfühler ermittelt. Die Begasung erfolgt über einen 0,2 µm Membranfilter und einen so
genannten Sparger16
, eine Sinterglasfritte am Ende eines Tauchrohrs.
Über eine Gasmischstation kann mit Luft, aber auch mit Sauerstoff, Stickstoff und theoretisch mit
Kohlenstoffdioxid, welches aber selten zum Einsatz kommt, begast und auch der Anteil der einzelnen
Gase bestimmt werden. Während einer Fermentation wird die Begasungsrate meist konstant gehalten.
Der Sauerstoffpartialdruck wird in erster Linie durch die Veränderung der Rührerdrehzahl geregelt. Im
Laufe der Fermentation wird aber häufig zusätzlich zu der zugeführten Luft und der erhöhten
Rührerdrehzahl noch der Anteil an Sauerstoff in der Zuluft erhöht, um den gestiegenen
Sauerstoffbedarf der Zellen im Kulturmedium zu decken.
4.1.1. FERMENTATIONSANALYTIK
Während der Fermentation können folgende Parameter im DASGIP® fedbatch-pro
® Fermentersystem
online17
erfasst werden:
Die Probenahme erfolgt über ein Tauchrohr und ein Gummiventil in eine Luer-Lock-Spritze.
Für die Automatisierung und die Datenerfassung wird die zugehörige Software DASGIP® Control 4.0
verwendet.
16 Sparger – (Gas-)Verteiler
17 online – direkt während des Prozesses bestimmt
pH [-]
pO2 [%]
Temperatur [° C]
Rührerdrehzahl [rpm]
Korrekturmittelverbrauch (Säure, Base, Antischaum) [ml]
Begasungsrate [l/min]
Anteil von O2/CO2/N2 in der Zuluft [-]
Anteil von O2/CO2/N2 in der Abluft [-]
Material und Methoden
22
Optische Dichte bei 600 nm (OD/OD600)
Zellkonzentration (Biofeuchtmasse (BFM/CWW) und Biotrockenmasse (BTM/CDW))
Substratkonzentration (Glycerol)
Metabolitkonzentration (Acetat)
Produkt-/Proteinquantifizierung mit SDS-PAGE (Produktbildungskinetik,
Fermentationsendwert, Löslich/Unlöslich-Gel)
In der offline18
-Analytik werden folgende Parameter bestimmt:
Die Beschreibung der Quantifizierung der Proteinkonzentration mittels SDS-PAGE19
erfolgt in
Kapitel 4.5. Für die anschließende Filtration nach der Fermentation und dem Zellaufschluss erfolgt
zusätzlich zur standardmäßigen Produktquantifizierung noch eine Bestimmung der Löslichkeit des
Produktes. Dazu werden die Zellproben in der offline-Analytik erst mit dem jeweiligen Lysepuffer
resuspendiert und dann mit Hilfe eines Ultraschallaufschlusses lysiert. Die erhaltene Zellsuspension
wird zentrifugiert, bis sich ein festes Pellet der unlöslichen Suspensionsbestandteile gebildet hat. Nach
dem Abnehmen des Überstandes wird das Pellet noch einmal mit Solubilisierungspuffer SP1
(s. Tabelle 20) solubilisiert, so dass auch die unlöslichen Proteinbestandteile (IBs) in Lösung gehen.
Der vorher abgenommene Überstand, der den löslichen Produktanteil enthält, und das resolubilisierte
Pellet werden jeweils in Mehrfachbestimmung auf das Gel aufgetragen und analog zur Beschreibung
in Kapitel 4.5 quantifiziert.
18 offline – zeitverzögert zum Prozess und zur Probenahme
19 SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
Material und Methoden
23
4.2. ZELLAUFSCHLUSSMETHODEN
Tabelle 2: Zusammenfassung der Zellaufschlussparameter für die beiden Prozesse B028 und B082.
B028 B082
Aufschlussverfahren Hochdruckhomogenisation Hochdruckhomogenisation
Eingesetztes Gerät Niro Soavi S.p.A. EmulsiFlex-C3
Eingesetzter Lysepuffer Lysepuffer B028 (s.Tabelle 21) Lysepuffer B082 (s.Tabelle 22)
Aufschlusszeitpunkt 1 Tag nach der Fermentation 5-10 Wochen nach der
Fermentation
Resuspendierungsverfahren ca. 45 min auf Eis ca. 15 min auf Eis
Aufschlussvolumen pro Lauf 900 ml 50 ml
Verfahrensparameter 2 Durchgänge bei 800 bar auf
Eis
2 Durchgänge bei 800 bar auf
Eis
Lagerung des Lysats 100 ml Aliquots bei -70° C Direkter Einsatz nach dem
Aufschluss
4.3. ÄKTACROSSFLOW™
Die ÄKTAcrossflow™ von GE Healthcare stellt eines der ersten vollautomatischen Systeme zur
Prozessentwicklung von Cross-Flow Filtrationen dar. Standardmäßig wird sie zusammen mit der
Kontrollsoftware UNICORN™ verwendet. Dabei sind in den Standardanwendungen sowohl
Hohlfaser- als auch Kassettenapplikationen vorgesehen.
Während des Filtrationslaufes können verschiedene Parameter geregelt und überwacht werden. Die
ÄKTAcrossflow™ besitzt dafür Messsonden für UV, pH und Leitfähigkeit als auch Sensoren für Luft,
Druck und Temperatur. Die Ventile und das gesamte Schlauchsystem sind dafür ausgelegt, eine
komplette CIP-Prozedur durchzuführen, ohne Komponenten extern säubern zu müssen. Abbildung 8
zeigt das komplette System von außen und gibt Einblick auf die verschiedenen Bauteile.
Material und Methoden
24
Abbildung 8: Darstellung des Filtrationssystems ÄKTAcrossflow™. Die Abbildung zeigt die
Sicht auf das Gerät von außen und ermöglicht einen Einblick in die verschiedenen Bauteile.
(Quelle: GE Healthcare [13])
Abbildung 9: Fließbild des Filtrationssystems ÄKTAcrossflow™. Die verschiedenen
Bauteile und Fließwege sind in Transfer-, Rezirkulations- und Permeatstrecke aufgeteilt.
(Quelle: GE Healthcare [13])
Abbildung 9 zeigt ein Fließbild des ÄKTAcrossflow™-Systems. Es enthält eine Transferstrecke zum
Transport der benötigten flüssigen Komponenten in das System, einen Rezirkulationskreislauf zur
Rezirkulation des Retentats während der Filtration und eine Permeatstrecke mit verschiedenen
Messzellen zur Überwachung des Permeats.
Material und Methoden
25
Transferstrecke:
Für die Transferstrecke können mit Hilfe eines Ventilblocks 8 verschiedene Eingänge angewählt
werden, um Probe-, Puffer-, CIP- oder Spüllösungen in das System zu transferieren. Wie alle Pumpen
im ÄKTAcrossflow™-System handelt es sich bei den Transferpumpen um Präzisionspumpen, die
auch als Messeinheit für den Volumenstrom dienen. In der Transferleitung befinden sich außerdem ein
Druck- und ein Luftsensor, die unter anderem aus Sicherheitsgründen zur Überwachung des
Transferstroms eingebaut sind.
Rezirkulationskreislauf:
Im Rezirkulationskreislauf werden der Feed-Strom und damit die Scherrate über die Feed-Pumpe
eingestellt. Dabei stehen folgende Regelungen zur Verfügung:
1. Regelung über die Feed-Strom-Flussrate
2. Regelung über die Scherrate
3. Regelung über den Eingangsdruck des Feeds
Im Rezirkulationskreislauf befindet sich auch das Reservoir, in dem das Retentat bis zur Rückführung
auf die Membran gerührt wird. Das Reservoir ist je nach Prozess in verschiedenen Größen einbaubar.
Durch die Feed-Pumpe gelangt die zu filtrierende Suspension auf die Membran (Filter). Beim Eingang
und Ausgang findet jeweils eine Druckmessung statt, um den TMP oder wahlweise ∆P bestimmen zu
können (s. Kapitel 3.2.4). Für die Produktweiterverwendung sind im Rezirkulationskreislauf drei
Ausgänge anwählbar.
Permeatstrecke:
Auf der anderen Seite der Filtrationsmembran beginnt die Permeatstrecke. Hier sind Sensoren für den
Permeatdruck, die Leitfähigkeit, UV und pH installiert, die so eine Charakterisierung und Kontrolle
des Fortschrittes der Filtration ermöglichen. Die eingebaute Permeatpumpe ist dabei eine wichtige
Komponente, da sie wahlweise einen konstanten Permeatvolumenstrom (Permeatflux) oder einen
konstanten Permeatdruck, bzw. TMP, steuern kann. Die Permeatstrecke verfügt über 4 wahlweise
anwählbare Ausgänge, von denen einer zurück in den Rezirkulationskreislauf und damit in das
Reservoir führt.
Material und Methoden
26
Für die ÄKTAcrossflow™ gelten folgende technische Spezifikationen:
Tabelle 3: Technische Spezifikationen der ÄKTAcrossflow™
Parameter Technische Spezifikation
Feed-Strom-Pumprate
Genauigkeit
1-600 ml/min
< ±2%
Transferstrom-Pumprate
Genauigkeit
0,1-200 ml/min
< ±0,5%
Permeatstrom-Pumprate
Genauigkeit
0,1-200 ml/min
< ±0,5%
Max. Systemdruck 5,2 bar
Min. Rezirkulationsvolumen < 25 ml (1,7 mm Leitungsdurchmesser)
Totvolumen, Rezirkulationsleitung <20 ml (1,7 mm Leitungsdurchmesser)
Maximales Reservoir Volumen 350 ml (kleines Reservoir)
1100 ml (großes Reservoir)
Empfohlene Filtrationsoberflächen 40-150 cm²
Reinigung der Anlage
Die ÄKTAcrossflow™ besitzt standardmäßig ein automatisiertes Reinigungsprogramm, bei dem
wahlweise verschiedene Komponenten ausgewählt werden können.
Für die durchgeführten Filtrationsprozesse erfolgen vor dem Eintrag der Probe in das System erst ein
Spülvorgang mit Reinstwasser und dann eine Equilibrierung mit dem verwendeten Lyse- und
Diafiltrationspuffer.
Nach der Filtration kann das Retentat wahlweise zur Weiterverarbeitung abgeführt oder entsorgt
werden. Danach erfolgt erst wieder ein Spülvorgang mit Wasser, dem sich eine CIP-Prozedur mit 1
molarer Natronlauge anschließt. Die Natronlauge wird dabei erst im Rezirkulationskreislauf im Kreis
geführt, mehrere Male erneuert und dann zur Säuberung der Membran eingesetzt. Die CIP-Prozedur
dauert standardmäßig 60 Minuten. Anschließend erfolgt wieder ein Spülvorgang mit Reinstwasser und
wahlweise zur Lagerung ein Spülen mit 20%-Ethanol, je nachdem, ob sich direkt noch eine Filtration
anschließt oder die Membran über Nacht zur Lagerung übergeben wird.
Material und Methoden
27
4.4. FILTRATIONSABLAUF
Der durchgeführte Filtrationsablauf setzt sich im Wesentlichen aus 2 Phasen zusammen:
1. Der Konzentrierungsphase 2. Der Diafiltrationsphase
1. Nach dem Eintragen des Zelllysats in das System stellt die Konzentrierung den ersten
Filtrationsschritt dar. Dabei wird die lysierte Zellbrühe über die Hohlfaser filtriert, das heißt,
die Partikel, die die Porengröße nicht überschreiten, gelangen ins Filtrat und die größeren
Bestandteile bleiben im Retentat. Das Retentat und die darin befindlichen Proteine und
Zellbestandteile werden dabei durch den Flüssigkeitstransport über die Membran konzentriert.
Für die Proteinwiederfindungsrate stellt besonders dieser Schritt eine kritische Phase dar, weil
das Protein an die Membran binden und je nach Stabilität bei höheren Konzentration auch
aggregieren und ausfallen kann. Im Hinblick auf den späteren Prozess ist die
Konzentrierungsphase aus Kostengründen sehr entscheidend, da durch das verkleinerte
Volumen des zu filtrierenden Retentats eine geringere Puffermenge für die anschließende
Diafiltration benötigt wird und damit auch eine Zeitersparnis einhergeht.
2. Nach der Konzentrierung folgt eine Diafiltration, um auch die sich noch im Retentat
befindlichen Proteine und evtl. Produkte, die die Membran passieren können, auszuspülen. Für
den Fall, dass sich das Produkt im Retentat befindet und dort verbleibt, wird so eine
„Säuberung“ der umgebenden Matrix von störenden Zellproteinen erreicht. Das Produkt liegt
danach in einer reineren Form vor. Befindet sich das Zielmolekül allerdings im Filtrat, wird
durch das mehrmalige Ausspülen mit Diafiltrationspuffer eine wesentlich höhere
Wiederfindungsrate erreicht, da bedeutend mehr Produkt die Membran passieren kann.
Im Idealfall liegt nach der Diafiltration im Retentat ein Medium vor, aus dem alle Bestandteile
ausgewaschen sind, die die Membran passieren konnten.
Die Kinetik der Diafiltration folgt dabei theoretisch folgendem Muster:
Abbildung 10: Theoretischer Verlauf der
Diafiltration. Gezeigt ist dabei ein Graph für die
Sprungantwort eines PT1-Gliedes.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
An
teil
[%]
Anzahl Durchführungen [-]
Material und Methoden
28
Demnach sollte nach 3 Diafiltrationszyklen bereits ein zu 95% abgeschlossener Stofftransport über die
Membran abgeschlossen sein. Zu Beginn der Versuche wurden allerdings zur Sicherheit 5
Diafiltrationsvolumina gefahren, bis eine Einschätzung über die Diafiltrationskinetik möglich war.
4.5. SDS-PAGE
Zur Analyse der Proteinkonzentration während der Filtration und zur Bestimmung des
Filtrationserfolges wird die SDS-PAGE Methode eingesetzt.
Das dafür verwendete Arbeitsschema ist im Folgenden kurz vorgestellt:
Die im Gel aufzutrennende Probe wird vor dem Auftragen auf das Gel mit Probenpuffer versetzt, der
LithiumDodecylSulfat (LDS) und Glycerin enthält. Das LDS verhält sich ähnlich dem SDS und stellt
ein anionisches Tensid dar, das sich so an die Proteine anlagert, dass die spezifische Ladung des
Proteins maskiert wird. So verläuft die Auftrennung allein nach dem Molekulargewicht und nicht
mehr nach der Ladung. Das Glycerin im Probenpuffer sorgt für ein Absinken der Proben in den
Geltaschen, so dass die Probe nicht wieder aus der Tasche hinaus diffundieren kann. Bei allen
Analysen wird zu diesem Zeitpunkt noch ein Reducing Agent20
hinzu geführt, welches Dithioreitol
(DDT) enthält und dafür sorgt, dass die Proteine in den Proben reduziert werden (Spaltung der
Disulfidbrücken). Durch die Reduzierung in der Probenvorbereitung können, wie in den Abbildungen
11 und Abbildung 12 dargestellt, nach der Färbung wesentlich schärfere Banden nachgewiesen
werden.
Abbildung 11: Proteinquantifizierung
nicht reduzierter Proben mittels SDS-PAGE
20 Reducing Agent – Reduzierendes Agens
Abbildung 12: Proteinquantifizierung reduzierter
Proben mittels SDS-PAGE
Nicht reduziertes
Produkt
Reduziertes
Produkt
Durchführung
29
Nach der Präparation mit Probenpuffer werden die Proben 10 min bei 99° C erhitzt und anschließend
kurz abzentrifugiert.
Für die SDS-PAGE werden standardmäßig 4-12%ige Bis-Tris
Fertiggele mit 15 Taschen und MES-Laufpuffer (s. Tabelle 19)
verwendet. Zu dem eingesetzten Laufpuffer wird zusätzlich ein
Antioxidans in die Laufkammer gegeben, um die
Rückoxidation der jetzt reduzierten Proteine zu verhindern.
Nach einer Laufzeit von 40 min bei 200 V folgt nach einem
Ausspülen des LDS die Färbung mit dem Coomassie-Farbstoff.
Die sich anschließende Aufnahme des Gels erfolgt mit der
Geldokumentationsanlage Chemi Doc™ XRS von BioRad, die
Auswertung und Quantifizierung mit dem Programm Image
Lab, ebenfalls von BioRad.
5. DURCHFÜHRUNG
Die Durchführung der Versuche erfolgt in Zusammenarbeit mit den 2 bereits in Kapitel 2 erwähnten
firmeninternen Projekten B028 und B082. Im Laufe der Bachelorarbeit werden diese Bezeichnungen
weiterhin verwendet sowie die gängigen Prozessierungsschritte beibehalten, so dass ein Vergleich mit
firmeninternen Ergebnissen möglich ist und die Ergebnisse der Bachelorarbeit in diesen Prozessen
etabliert werden können.
Die praktische Durchführung der Versuche ist im Laufe der Bachelorarbeit in 4 Teile geteilt.
1. Schüttelkolbenvorversuche
2. Fermentation
3. Zellaufschluss
4. Filtration
Abbildung 13: Darstellung des
verwendeten Proteingrößen-
standards
Durchführung
30
Dadurch ergibt sich folgendes Prozessschema:
Abbildung 14: Prozessschema der Bachelorarbeit mit den verschiedenen
verwendeten Fermentations- und Aufarbeitungsschritten
Nach der Filtration könnten im späteren Prozess noch weitere Aufarbeitungsschritte folgen, während
der Bachelorarbeit steht allerdings die Untersuchung des Filtrationsverfahrens im Mittelpunkt, so dass
der Gesamtprozess in diesem Falle dort endet und das filtrierte Produkt verworfen wird.
5.1. FERMENTATION
Als Ausgangsmaterial dient für beide durchgeführten Fermentationsprozesse jeweils eine bei -80° C
gelagerte Kultur der Working Cell Bank 21
(WCB). Vor der Hauptfermentation werden die Zellen aus
den Cryokulturen aufgetaut und in einer Schüttelkolbenkultur herangezogen.
Die Versorgung der Zellen mit Sauerstoff wird dabei durch die im Schüttelkolben eingebauten
Schikanen und eine Belüftungsmembran im Deckel gewährleistet.
Im Anschluss erfolgt die Fermentation in der Multifermenteranlage fedbatch-pro®.
5.1.1. SCHÜTTELKOLBENVERSUCHE
Für beide Zellbänke wurden im Vorwege der Fermentation Schüttelkolbenversuche zur
Charakterisierung des Wachstums der Zellen durchgeführt.
Die dafür relevanten Parameter sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
21 Working Cell Bank – Zellbank eines Organismus für die Produktion
Vorkultur im Schüttelkolben
Fermentation im 1-L-Maßstab
Hochdruckhomogenisation
Tangentialflussfiltration
Inokulum
Zellmasse
Zelllysat
Zellbank
Durchführung
31
Tabelle 4: Zusammenfassung der Startparameter der Schüttelkolbenkultur beider Prozesse B028
und B082
Im Laufe der Kultivierung im Schüttelkolben wurden Proben zur Bestimmung der Optischen Dichte
(OD) genommen. Aus diesen Ergebnissen kann dann das Wachstumsverhalten ermitteln werden.
5.1.2. FERMENTATION B028
Bei Prozess B028 erfolgt die Kultivierung im Batch23
-Verfahren, das heißt, dass der gesamte Bedarf
an Nährstoffen zu Anfang der Fermentation bereits im Medium vorliegt und im Laufe der
Kultivierung weitestgehend verbraucht wird. Nach der bereits beschriebenen Anzucht der Vorkultur
im Schüttelkolben erfolgt der Transfer bei einer OD600 von 4-5 in die Fermenter. Um genug Zellmasse
zu produzieren, werden parallel 2 Fermenter im 1-L Maßstab gefahren. Im Laufe der Darstellung
dieser Prozesse werden diese 2 Fermentationen als Fermentation 1 und 2 bezeichnet.
Vor dem Transfer der Zellen erfolgt ein mindestens 8-stündiger Sterillauf der Fermenter mit dem
autoklavierten Medium unter Prozessbedingungen, um das System auf Sterilität zu testen.
Unter möglichst optimalen Wachstumsbedingungen wachsen die Zellen bis zu einer Optischen Dichte
von 10-11. Danach erfolgt die Induktion der Proteinproduktion durch Zugabe einer spezifischen
Menge an IPTG, so dass im Fermenter eine Konzentration von 1 mmol/l erreicht wird.
Die darauf folgende Expressionsphase dauert 3 Stunden. Zum Ende des Prozesses werden die
Fermenter abgeschaltet und abgebaut, die darin vorhandene Zellbrühe mittels Zentrifugation geerntet
und das daraus resultierende Zellpellet bei –20° C gelagert. Das während der Fermentation gebildete
Produkt wird standardmäßig über eine SDS-PAGE quantifiziert.
22 Medientyp – genaue Zusammensetzung im Anhang (s. Tabelle 15,Tabelle 16)
23 Batch – satzweise Prozessierung
Parameter B028 B082
Medientyp22
Komplettmedium Komplettmedium
Volumen Kultivierungsmedium [ml] 500 150
Volumen Cryokultur [µl] 50 150
Temperatur [° C] 30 35
Drehzahl [rpm] 150 200
Durchführung
32
Bei den während der Fermentation auftretenden wachstumsabhängigen Prozesszeitpunkten (wie dem
Transfer aus den Schüttelkolben oder der Induktion) wird der Fortschritt des Wachstums an der
Optischen Dichte der Zellbrühe gemessen, da dieser Wert als schnellster Wachstumsparameter
festgestellt werden kann.
Die Tabellen 5 und 6 stellen die Startbedingungen für die einzelnen Prozessschritte übersichtlich dar.
Tabelle 5: Startbedingungen der Vorkultur
Parameter Sollwert
Temperatur 30 ±1 °C
Drehzahl 150 ± 20 rpm
Tabelle 6: Startbedingungen des 1L-Fermenters
Parameter Sollwert
Startvolumen 1,0 l + Inokulum
Temperatur 37 ± 0,5 °C
Belüftung 1,0 l/min
Überdruck 0,0 bar
Start Rührerdrehzahl 500 ± 10 rpm
Sollwert pH-Wert 7,0 ± 0,1
Sollwert pO2-Wert 30 ± 2%
Maximale Rührerdrehzahl 1500 rpm
Durchführung
33
5.1.3. FERMENTATION B082
Bei Prozess B082 erfolgt die Kultivierung im Fed-Batch24
-Verfahren. Dabei wird ein begrenzter
Anteil an Substraten im Startmedium zu Beginn der Fermentation vorgelegt und im Laufe der
Kultivierung verbraucht. Nach dem Verbrauch vor allem der vorgelegten Kohlenstoffquelle beginnt
eine kontrollierte Zufütterung mit den sterilen wachstumsnotwendigen Komponenten. Ähnlich wie bei
Prozess B028 erfolgt der Transfer aus dem Schüttelkolben, allerdings wie später unter Punkt 6.1
festgelegt nach 8 Stunden bei einer OD600 von 4. Bei Prozess B082 wird nur eine Fermentation
durchgeführt, da die dort erwartete produzierte Zellmasse pro Liter für die kommenden
Aufarbeitungsschritte ausreicht. Als numerische Fortführung der beiden Fermentationen des Prozesses
B028 wird die Fermentation B082 im Graphen als Fermentation 3 bezeichnet.
Standardmäßig erfolgt wieder ein mindestens 8-stündiger Sterillauf mit dem einzusetzenden
autoklavierten Fermentationsmedium.
Nach der Inokulation des 1L-Fermenters wachsen die Zellen bis zum plötzlichen pO2-Anstieg. Ab hier
erfolgt das Zufüttern einer konzentrierten Feed-Lösung, der eigentliche Fed-Batch. Bei einer
Optischen Dichte von 65 bei 600 nm beginnt die Expressionsphase durch Zugabe von 1 mmol/l IPTG
im Medium. Die Expressionsphase dauert nach der Induktion 8 Stunden. Die Ernte erfolgt genau wie
bei Prozess B028 durch den Abbau der Fermenter und das Abzentrifugieren der Zellen. Die durch
diesen Vorgang erhaltene Zellmasse wird für die weiteren Aufarbeitungsschritte aliquotiert und bei
-20° C gelagert.
Das während der Fermentation gebildete Produkt wird standardmäßig über eine SDS-PAGE
quantifiziert.
Die Tabellen 7 und 8 stellen die Startbedingungen für die einzelnen Prozessschritte übersichtlich dar.
Tabelle 7: Startbedingungen der Vorkultur
Parameter Sollwert
Temperatur 30 ±1 °C
Drehzahl 200 ± 20 rpm
24 Fed-Batch - Zulaufverfahren
Durchführung
34
Tabelle 8: Startbedingungen des 1L-Fermenters
Parameter Sollwert
Startvolumen 780 ml + 20 ml Inokulum
Temperatur 35 ± 0,5 °C
Belüftung 0,7 l/min
Überdruck 0,0 bar
Start Rührerdrehzahl 300 ± 10 rpm
Sollwert pH-Wert 7,0 ± 0,1
Sollwert pO2-Wert 30 ± 2%
Maximale Rührerdrehzahl 1500 rpm
5.2. ZELLAUFSCHLUSS
Bei beiden durchgeführten Fermentationsprozessen liegt das Produkt, wie bereits beschrieben, am
Ende der Kultivierung im Zytoplasma vor. Zur Isolation und weiteren Aufreinigung ist daher eine
Zelllyse nötig. Das standardmäßig dafür eingesetzte Verfahren ist die unter 3.2.2 beschriebene
Hochdruckhomogenisierung. Aufgrund der unterschiedlichen Lagerstabilität der beiden Produkte
werden zwei in ihrer Ausführung etwas unterschiedliche Aufschlussprozeduren eingesetzt.
Ausgangsmaterial ist die nach der Fermentation abzentrifugierte und bei -20° C gelagerte Zellmasse.
Die Homogenisierung erfolgt dabei mit standardmäßig eingesetzten Parametern [1].
5.2.1. ZELLAUFSCHLUSS B028
Bei Prozess B028 ist die Lagerung des Zellhomogenates bei -70°C aufgrund der Inclusion bodies
problemlos möglich.
Nach der Zellernte mittels Zentrifugation und der Lagerung des abzentrifugierten Zellpellets bei
-20° C für 12-16 Stunden folgt nun also die Lyse der gesamten Zellmasse beider parallel
durchgeführten Fermentationen 1 und 2. Dazu werden die Zellen erst mit dem beschriebenen
Lysepuffer (s. Tabelle 21 im Anhang) auf Eis resuspendiert und mittels Hochdruckhomogenisation
aufgeschlossen.
Durchführung
35
Für den Aufschluss beträgt die Zellkonzentration im Lysepuffer ca. 100 g/l. Im Anschluss an die Lyse
wird die Zellkonzentration mit dem verwendeten Lysepuffer auf 50 g/l eingestellt und das gesamte
Zelllysat unter Rühren in 18 x 100 ml aliquotiert und bei -70° C gelagert.
Das gelagerte Zelllysat dient im weiteren Aufarbeitungsverlauf als Ausgangsmaterial für die Filtration.
5.2.2. ZELLAUFSCHLUSS B082
Leider ist das im Prozess B082 gebildete und im Zytoplasma vorhandene Produkt im Zelllysat nicht
stabil lagerbar. Aus diesem Grund wurden direkt bei der Zellernte Aliquots à 5 g der produzierten
Zellmasse abgewogen und bei -20° C gelagert.
Die Lyse im Hochdruckhomogenisator erfolgt aufgrund der eingeschränkten Lagerfähigkeit des Lysats
vor jedem später folgenden Filtrationslauf gesondert. Dabei wird ein Aliquot à 5 g Zellmasse mit 50
ml Lysepuffer (s. Tabelle 22) auf Eis resuspendiert und nach Standardverfahren aufgeschlossen
(s. Kapitel 4.2).
Nach dem Aufschluss wird die Zellkonzentration wiederum auf 50 g/l mit Lysepuffer eingestellt.
Zeitlich im Anschluss erfolgt jeweils direkt die Filtration des produzierten Lysats.
5.3. FILTRATION
Zur Abtrennung des Zielproteins von Zellbruchstücken und zellinternen Proteinen stellt die Filtration
häufig den ersten Aufarbeitungsschritt dar. Je nach Filtrationsart sind für den Filtrationserfolg
verschiedene Parameter von Bedeutung. In dieser Bachelorarbeit wird die Filtration im bereits in
Kapitel 3.2.4 beschriebenen Tangentialflussverfahren durch Hohlfaserfilter durchgeführt. Eingesetztes
Gerät ist dabei die ÄKTAcrossflow™. Die primäre Proteinanalytik erfolgt mittels SDS-PAGE.
Zur Ermittlung der optimalen Parameter wird für die Filtration im Rahmen des primären
Forschungsziels der Bachelorarbeit eine DoE (Design of Experiments)-Simulation (s. Kapitel 3.3)
zugrunde gelegt.
5.3.1. PROZESSPARAMETER/VERSUCHSPLANUNG DOE
Aufgabe der Versuchsplanung mit DoE ist die experimentelle Untersuchung eines Systems, bei dem
verschiedene Eingangsparameter variiert und die daraus resultierenden Ausgangsparameter
aufgezeichnet und analysiert werden.
Für die Durchführung der Tangentialflussfiltration mittels Hohlfasern werden unter Berücksichtigung
der unter Punkt 3.2.4 zusammengefassten Forschungsergebnisse und in Anpassung an die
Durchführbarkeit im Rahmen der Bachelorarbeit folgende Prozessparameter variiert und das Ergebnis
untersucht.
Durchführung
36
1. Die Porengröße („Cut Off“)
Bei jeder Art der Filtration spielt die Porengröße eine entscheidende Rolle, denn sie stellt in
der sonst undurchlässigen Filtrationsmembran die Grenze für die zu filtrierenden Stoffe und
Materialien dar. Nur Moleküle, die kleiner sind als die eingesetzte Porengröße, können die
Membran passieren und werden nicht zurückgehalten. Ist die Porengröße falsch gewählt, kann
es passieren, dass unerwünschte Bestandteile zurückgehalten werden oder die Poren
verstopfen. Im Laufe der Versuche werden für die Filtration des Lysats 3 unterschiedliche
Porengrößen verwendet:
Die Porengröße wird im DoE-Modell im Gegensatz zu den anderen beiden Eingangs-
parametern nur über diese 3 festen Größen variiert, da als optimales Ergebnis der Filtration
keine Zwischengröße akzeptabel ist.
4. Der Membranflux
Wie bereits unter 3.2.4 - Filtration/ State of the Art - beschrieben, stellt der Membranflux eine
auf die Filtrationsfläche normierte Fließgeschwindigkeit dar, die den Stoffübergang über die
Membran charakterisiert. Entgegen einiger vorgestellter Publikationen ist für diese
Bachelorarbeit eine Regelung des Membranfluxes statt einer TMP-Regelung gewählt worden.
Dies hat den Vorteil, dass gerade zu Beginn der Filtration durch den gebremsten Membranflux
wesentlich stabilere Filtrationsbedingungen gehalten werden können. Gerade bei komplexen
Medien wie Zelllysat kann es sonst zu Beginn des Prozesses zur Verblockung der Membran
kommen. Der zu untersuchende Bereich hängt dabei im Wesentlichen von der spezifischen
Beschaffenheit des Lysats ab und wird erst nach den Vorversuchen (s. Kapitel 5.3.2)
festgelegt.
5. Die Scherrate
Vorteil der Tangentialflussfiltration ist die kontinuierliche Scherkraft, die durch die
Überströmung auf den entstehenden Filterkuchen wirkt. Ein Parameter, in dem diese
Scherkraft festgelegt werden kann, ist die bereits in Kapitel 3.2.4 beschriebene Scherrate.
Durch die hohe Viskosität, die große Partikellast und die Diversität der Partikel ist es bei der
Filtration angebracht, im Verhältnis mit einer hohen Scherrate zu fahren, um den Aufbau eines
Filterkuchens weitestgehend zu verhindern. Im Hinblick auf die maximale Pumprate der
Anlage und ein mögliches Scale-up werden im Rahmen der Bachelorarbeit Scherraten
zwischen 8.000 s-1
und 16.000 s-1
untersucht.
1. 500 kDa 2. 750 kDa 3. 0,1 µm
Durchführung
37
Als Ausgangsgrößen werden zur Bewertung der Filtrationsergebnisse folgende Parameter analysiert:
1. Proteinwiederfindungsrate/Proteinausbeute (Recovery bzw. Protein Rec.)
Ziel der gesamten Filtration ist das Abtrennen des Zielproteins von Medienbestandteilen,
Fremdproteinen und eventuell Zellbruchstücken. Leider muss bei diesem Prozessschritt ein
gewisser Produktverlust in Kauf genommen werden. Der Filtrationserfolg hängt also zu einem
großen Teil von der Wiederfindungsrate des Zielproteins ab. Streng wissenschaftlich
bezeichnen die Produktausbeute und die Produktwiederfindungsrate etwas unterschiedliche
Prozessgrößen, während dieser Bachelorarbeit allerdings werden beide als Synonym für das
erhaltene Produkt am Ende der Filtration verwendet. Dieser Endwert kann dann auf die
Startkonzentration bezogen und so der Filtrationserfolg ermittelt werden. Die Angabe erfolgt
deshalb in %.
2. Prozesszeit
Wie für jeden weiteren Prozessschritt spielt auch die Prozesszeit eine wichtige Rolle bei der
Bewertung. So sollte die Dauer des Aufarbeitungsschrittes im Rahmen der Machbarkeit
liegen, zum Beispiel innerhalb der Dauer eines Arbeitstages. Insbesondere finanziell spielt
dieser Ausgangsparameter aber auch eine bedeutende Rolle, da durch kürzere Prozesszeiten
weniger bezahlte Arbeitskraft benötigt wird und auch die Anlage selbst schneller wieder für
andere Projekte zur Verfügung steht. Es gilt demnach die beste Kombination aus
Produktwiederfindungsrate und Prozesszeit zu finden.
In der Auswertung ist allerdings zu erwarten, dass lediglich der Membranflux einen Einfluss
auf die Prozesszeit haben wird, da die Filtration mit einem geregelten Permeatvolumenstrom
über die Membran gefahren wird. Auf eine detaillierte Analyse mit MODDE wird daher für
diesen Parameter verzichtet. Im Folgenden ist die Versuchsreihenfolge und –matrix der
Filtrationsversuche dargestellt:
Durchführung
38
Tabelle 9: Design-Matrix für die DoE-Auswertung beider Filtrationsprozesse.
Versuchsnummer Scherrate Membranflux Membranporengröße
1 -1 -1 -1
2 -1 0 0
3 -1 1 1
4 0 -1 0
5 0 0 1
6 0 1 -1
7 1 -1 1
8 1 0 -1
9 1 1 0
10 0 0 0
11 0 0 0
Tabelle 10: Versuchsablauf und Parameterkonstellation für die Filtrationsversuche
des Prozesses B028. Die Prozessnummern 1-3 wurden für die durchgeführten
Vorversuche (s. 5.3.2) vergeben.
Prozessnummer Scherrate Membranflux Membranporengröße
[-] [s-1] [LMH] [kDa]
P004 8000 40 750
P005 12000 20 750
P006 16000 60 750
P007 16000 40 500
P008 8000 20 500
P009 12000 60 500
P010 12000 40 1000
P011 16000 20 1000
P012 8000 60 1000
P013 12000 40 750
P014 12000 40 750
Durchführung
39
Tabelle 11: Versuchsablauf und Parameterkonstellation für die Filtrationsversuche
des Prozesses B082. Die Prozessnummern 1 und 2 wurden für die durchgeführten
Vorversuche (s. 5.3.2) vergeben.
Prozessnummer Scherrate Membranflux Membranporengröße
[-] [s-1] [l m-2h-1] [kDa]
P003 8000 25 750
P004 16000 35 750
P005 12000 15 750
P006 8000 15 500
P007 16000 25 500
P008 12000 35 500
P009 8000 35 1000
P010 16000 15 1000
P011 12000 25 1000
P012 12000 25 750
P013 12000 25 750
In Tabelle 9 ist die Versuchsmatrix für die Filtrationsdurchführungen dargestellt. Diese grundsätzliche
Matrix trifft bei beiden Prozessen zu.
Tabelle 10 und Tabelle 11 stellen die untersuchten Parameterkonstellationen für die Filtrations-
vorversuche dar. Die Prozessnummern ergeben sich aus der Durchführungsreihenfolge, dabei wurden
die ersten Nummern für die Vorversuche (s. 5.3.2) vergeben. Bei Prozess B028 wurde ein Vorversuch
mehr durchgeführt.
5.3.2. VERSUCHSABLAUF VORVERSUCHE
Vor Beginn der eigentlichen Versuchsreihe müssen 2 Vorversuche durchgeführt werden, um den
optimalen Konzentrierungsfaktor und den Membranfluxarbeitsbereich zu ermitteln.
Ausgangsparameter für die Vorversuche sind die mittlere zu untersuchende Porengröße 750 kDa und
die mittlere Scherrate für die späteren DoE-Versuche, 12.000 s-1
. Theoretisch müssten diese
Vorversuche mit allen verwendeten Porengrößen und Scherraten durchgeführt werden. Im Rahmen der
zeitlichen Durchführbarkeit wird darauf aber verzichtet, da diese Versuche nur der ungefähren
Prozesseinschätzung und dem Überblick dienen sollen. Die Ergebnisse für die genannten Parameter
wirken daher repräsentativ für die gesamte Versuchsreihe.
1. Ermittlung des optimalen Konzentrierungsfaktors
Zu Beginn der Filtration sollte - wie bereits in Kapitel 3.2.4 erwähnt - wenn möglich eine
Konzentrierung stehen, um für die weiteren Prozessschritte Puffervolumina und Zeit zu sparen. Je
nach Beschaffenheit des zu filtrierenden Mediums ist dies aber nur begrenzt möglich. In diesem
Durchführung
40
Vorversuch sollen daher die Eigenschaften der Lysatproben in Bezug auf die Konzentrierungsfähigkeit
untersucht werden. Leider muss für diesen Versuch ein Wert für den Membranflux festgelegt werden,
ohne vorher den optimalen Arbeitsbereich dafür bestimmen zu können, da dieser erst im zweiten
Vorversuch festgelegt werden kann. Grundlage dafür sind Forschungsergebnisse (Kapitel 3.2.4 -
Filtration/ State of the Art) und Erfahrungen mit ähnlichen Medien.
Für die Konzentrierungsvorversuche wird daher der Membranflux für die beiden Prozesse auf 40
LMH festgelegt. Dieser Wert sollte zwar bereits ungefähr im späteren Arbeitsbereich liegen, muss
aber noch keinen optimalen Wert darstellen. Er dient lediglich zur Durchführbarkeit des
Konzentrierungsversuchs.
Im Versuch wird mit dem dargestellten normierten Membranfluss so lange konzentriert, bis ein vorher
festgelegter kritischer TMP-Wert erreicht wird und daraus der optimale Konzentrierungsfaktor
ermittelt.
2. Ermittlung des optimalen Membranfluxes
Nach der Bestimmung des optimalen Konzentrierungsfaktors erfolgt die Festlegung des zu
untersuchenden Arbeitsbereiches hinsichtlich des Membranfluxes. Dabei wird wie in den
Hauptversuchen erst bis zum optimalen Konzentrierungsfaktor (wurde in Vorversuch 1 ermittelt)
aufkonzentriert und anschließend ein kaskadenartiger Fluxtest durchgeführt. Der anfangs eingestellte
Membranflux wird dafür stufenartig erhöht und der daraus resultierende TMP ermittelt. Damit sich
stabile Prozessbedingungen nach der Erhöhung des Membranflusses einstellen können, erfolgt die
jeweilige Erhöhung im zeitlichen Abstand von 30 Minuten. Dabei wird das erhaltene Permeat dem
Retentat zurückgeführt. Ziel ist ein Membranflux im subkritischen Bereich, aus dem also kein
irreversibles Fouling bei eingestellter Scherrate resultiert. Wie auch beim Konzentrierungsversuch
wird der Flux solange erhöht, bis ein kritischer TMP erreicht wird und im Nachhinein der
Arbeitsbereich für die zukünftigen Untersuchungen bestimmt.
5.3.3. TRANSFER DER LYSATPROBE
Bei der ÄKTAcrossflow™ handelt sich um ein komplett unter Flüssigkeit arbeitendes System. Alle
Leitungen sind also mit einer für den Prozess spezifischen Flüssigkeit wie Puffer, Reinigungssubstanz
oder einfach Wasser gefüllt. Vor dem Start der Filtration wird die Anlage mit dem verwendeten Lyse-,
bzw. Diafiltrationspuffer konditioniert. Über eine Transferpumpe erfolgt dann der Transport der
Lysatprobe in das Filtrationsreservoir. Dabei gelangt der sich noch im Schlauchsystem der
Pumpanlage befindliche Konditionierungspuffer teilweise ebenfalls ins Reservoir, die Probe wird also
verdünnt. Bei größeren Volumina fällt diese Verdünnung nicht zu sehr ins Gewicht, bei einem
Auftragsvolumen von maximal 100 ml ergibt sich aber nach Transfer der Probe und nicht zu
verhindernder Verdünnung ein Startkonzentrierungsfaktor von ca. 0,78. Darauf folgt die
Durchführung
41
Konzentrierung der Probe durch Filtration. Auch wenn retentatseitig im Laufe der Konzentrierung
wieder ein Konzentrierungsfaktor von 1 erreicht wird, handelt es sich nicht um eine vergleichbare
Konzentration der Ausgangsstoffe und -proteine, da bereits ein gewisses Volumen mit gelösten
Stoffen als Filtrat über die Membran transferiert wurde. Der Startwert für die Filtration und die
auszuwertende Wiederfindungsrate werden daher ermittelt, bevor das Lysat in das Pumpsystem
eingetragen wird.
5.3.4. PROBENAHME UND ANALYTIK
Während der Filtration werden an prozessspezifischen Punkten Proben entnommen, um den Fortschritt
des Filtrationsprozesses und das Gesamtergebnis beurteilen zu können.
Fokus der Analytik ist das rekombinant exprimierte Protein, das sich bei der Filtration je nach Prozess
entweder hinter der Membran oder im Filtrat befindet. Die Analyse und Quantifizierung erfolgt dabei
mittels SDS-PAGE.
Für die spätere Auswertung ergeben sich dabei folgende Probenzeitpunkte:
1. Direkt vor dem Eintragen des Zelllysats in das System
2. Nach dem ersten Konzentrierungsschritt
3. Nach jedem jeweils folgenden Diafiltrationsvolumen
Abbildung 15: Darstellung der Probenahmezeitpunkte im Filtrationsprozess am Beispiel von
Projekt B082. Aufgetragen sind dabei erst der steigende Konzentrierungsfaktor [---] und dann der
Diafiltrationsfaktor [---]. Nach dem Ende der Konzentrierungsphase wird der Konzentrierungs-
faktor zwar vom System auf 0 gesetzt, das Retentat bleibt aber dem widersprechend
gleichbleibend konzentriert..
Durchführung
42
Dabei werden jeweils das vorhandene Retentat, das Filtrat und das Gesamtfiltrat untersucht. Das zu
filtrierende Zelllysat, das hinter der Filtrationsmembran zurückbleibt, stellt das Retentat dar. Als
Filtrat wird in diesem Fall die direkt aus der Filtrationsanlage austretende Flüssigkeit bezeichnet, als
Gesamtfiltrat versteht man die Menge des, während der gesamten Filtration gesammelten Filtrats.
Zu Beginn der Filtrationsversuche wurden standardmäßig alle Proben zu allen Probezeitpunkten
genommen und untersucht, im Laufe des Gesamtprozesses allerdings nur noch die für die Bestimmung
der Ausgangsparameter relevanten.
5.3.5. LAGERUNG DER PROZESSPROBEN
Die Lagerung der Prozessproben erfolgt je nach Proteinstabilität bei den beiden Prozessen B028 und
B082 etwas unterschiedlich und ist in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: Vergleich der unterschiedlichen Lagerbedingungen der Filtrationsprozessproben
B028 B082
Anzahl der Proben pro
Probenzeitpunkt
2 2
Lagerungstemperatur -70° C 4° C/ -20° C
Lagerzeit bis zu Analyse 1-7 Tage 1-2 Tage
Für den Prozess B082 werden die beiden Proben pro Prozesszeitpunkt unterschiedlich gelagert, so
dass sich in Tabelle 12 zwei abweichende Angaben zu den Lagertemperaturen finden.
Eine der Proben wird direkt nach der Probenahme mit Solubilisierungspuffer SP1 (s. Tabelle 20)
versetzt und dann bei 4° C gelagert. Durch den im Solubilisierungspuffer enthaltenen Harnstoff und
das DDT werden die Proteine in der Probe denaturiert und bleiben in diesem Zustand stabil bis zur
Analyse mittels SDS-PAGE. Die andere Probe wird während des Prozesses auf Eis gelagert und
anschließend bei -20° C weggefroren.
Für den Prozess B028 werden jeweils beide Proben während der Filtration auf Eis gelagert und im
Anschluss bei -70° C weggefroren. Hier erfolgt die Solubilisierung mit Puffer SP1 nach dem Auftauen
zur Analyse.
Die für die Lagerung ausgewählten optimalen Zeiten und Temperaturen sind für die Prozesse bereits
vorher firmenintern untersucht worden und werden standardmäßig im jeweiligen Projekt eingesetzt. Es
ist daher keine Produktdegradation im Verlauf der Lagerung zu erwarten.
Ergebnisse
43
Zur Quantifizierung des im Filtrationsmedium vorliegenden Produktes wird auf jedes Gel zusätzlich
zur den Prozessproben und Größenstandards noch ein Vergleichsprotein bekannter Konzentration in
verschiedenen Verdünnungen aufgetragen. Durch die bekannten Proteinmengen dieser Referenz auf
dem Gel kann über eine Kalibriergerade eine Aussage zur Proteinkonzentration in den Prozessproben
gemacht werden. Die anschließende Auswertung basiert auf den Werten dieser Quantifizierung.
6. ERGEBNISSE
Es folgt eine Auflistung der Versuchsergebnisse, bezogen auf die Schüttelkolbenvorversuche, die
Fermentation, den Zellaufschluss und die Filtration beider Projekte.
6.1. SCHÜTTELKOLBENVERSUCHE
Abbildung 16: Verlauf der Optischen Dichte bei
600 nm während der Vorkultivierung im
Schüttelkolben. Verwendet wurde die Zellbank
und die Ausgangsbedingungen des späteren
Fermentationsprozesses B028.
Abbildung 17: Verlauf der Optischen Dichte bei
600 nm während der Vorkultivierung im
Schüttelkolben. Verwendet wurden die
Zellbank und die Ausgangsbedingungen des
späteren Fermentationsprozesses B082.
Für den Prozess B028 wird bereits standardmäßig eine Schüttelkolbenkultur als Vorkultur der
eigentlichen Fermentation eingesetzt, so dass die Ergebnisse in diesem Fall nur dazu dienen, diese
Standardprozedur abzusichern und das Verhalten dieser spezifischen Zellbank festzustellen.
Im Prozess B082 erfolgt die Vorkultur standardmäßig direkt im kleinen Vorfermenter, so dass
Prozesszeiten und Vorgehensweise für die Vorkultur im Schüttelkolben erst entwickelt werden
müssen. Im Idealfall erfolgt der Transfer der Zellen vom Schüttelkolben in den Fermenter noch in der
exponentiellen Wachstumsphase. Aufgrund der Sauerstofflimitierung im Kolben und des begrenzten
Nährstoffangebots befinden die Zellen sich allerdings nach relativ kurzer Zeit in einer stationären
Wachstumsphase. Erfolgt der Transfer zu spät, gelangen demnach Zellen in der stationären Phase in
Ergebnisse
44
den Fermenter. Diese müssen sich dann erst an die neuen Bedingungen anpassen, was in einer
Verzögerung des Wachstums resultiert.
Nach Aufnahme der Wachstumskurve über die Optische Dichte des Kultivierungsmediums ergibt sich
ein optimaler Bereich zum Zelltransfer zwischen 8 und 10 Stunden bei einer OD zwischen 2,5 und 7.
Für die nachfolgende Fermentation wird die Kultivierungszeit im Schüttelkolben in Abstimmung mit
anderen relevanten Prozesszeitpunkten für den Prozess B082 daher auf 8 Stunden festgelegt.
6.2. FERMENTATION
6.2.1. FERMENTATION B028
Fermentation 1:
Abbildung 18: Darstellung der Rührerdrehzahl NSt, des Sauerstoffanteils der Zuluft xO2in, des
Sauerstoffpartialdrucks pO2 und der Biofeuchtmasse CWW während der ersten Fermentation des
Prozesses B028
Ergebnisse
45
Fermentation 2:
Abbildung 19: Darstellung der Rührerdrehzahl NSt, des Sauerstoffanteils der Zuluft xO2in, des
Sauerstoffpartialdrucks pO2 und der Biofeuchtmasse CWW während der zweiten Fermentation des
Prozesses B028
Die Abbildungen 18 und 19 zeigen eine Zusammenstellung verschiedener Offline- und
Onlineparameter während der Fermentation. Dabei werden die Drehzahl NSt, der Anteil des
Sauerstoffs in der Zuluft xO2in und der Sauerstoffpartialdruck im Medium pO2 online gemessen und
das Biofeuchtgewicht CWW offline ermittelt.
Vergleicht man Fermentation 1 und 2 des Prozesses, fällt als erstes der sich stark unterscheidende
Startwert des pO2-Verlaufs auf. Der Unterschied resultiert dabei vorwiegend aus der starken Drift der,
in der ersten Fermentation eingesetzten, pO2-Messsonde. Im Laufe des Prozesses ergeben sich dadurch
aber keine Abweichungen.
Die Kultivierung unterteilt sich in 2 Phasen, die im Folgenden kurz erläutert werden:
1. Wachstumsphase:
Nach der Inokulation mit den Zellen aus der Schüttelkolbenkultur erfolgt die Wachstumsphase
im Fermenter. Im Idealfall benötigen die Zellen hier keine Adaptions- und Anpassungsphase
mehr, so dass direkt das exponentielle Wachstum einsetzen kann. Während der Batch-
Kultivierung liegen die notwendigen Substrate im Überfluss vor, so dass keine
Wachstumslimitierung aus Substratmangel resultiert. Während der gesamten Fermentation
kann sich allerdings Acetat als unvollständig verstoffwechseltes Produkt bei der
Substratumsetzung der Zellen im Medium ansammeln, wenn die Bakterien unter Stress
geraten. Dieses hemmt in erhöhten Konzentrationen das Wachstum. Während der
Fermentation sinkt der Anteil an gelöstem Sauerstoff im Medium durch das Wachstum und
Ergebnisse
46
den Verbrauch der Organismen unter konstanten Bedingungen bis zu einer Mindestgrenze von
30% pO2 ab. Dieser prozentuale Wert bezieht sich auf die Menge an gelöstem Sauerstoff vor
Beginn der Kultivierung unter Prozessbedingungen. Erreicht der Sauerstoffpartialdruck den
Wert von 30% beginnt eine Kaskadenregelung, um den Wert konstant zu halten. Zuerst wird
die Rührerdrehzahl bis zum maximalen Wert gesteigert, um die Sauerstoffeintragsrate zu
erhöhen. Danach kann über eine Gasmischstation zusätzlich Sauerstoff zur Zuluft in den
Fermenter hinzugefügt werden. Besonders in Abbildung 19 ist zu sehen, dass die Regelung
zum Sauerstoffeintrag nicht immer schnell genug arbeitet. Darum sinkt der Wert erst unter
30% und steigt dann langsam durch die erhöhte Drehzahl des Rührers wieder. Eine
Beschleunigung könnte durch die Optimierung der Regelparameter herbeigeführt werden.
Wird während der Wachstumsphase eine Optische Dichte zwischen 10 und 11 erreicht,
beginnt mit der Induktion durch IPTG die
2. Expressionsphase:
Wie bereits beschrieben, beginnt die Expression durch Zusatz von IPTG, so dass im Medium
eine Konzentration von 1mmol/l erreicht wird. Das im Organismus synthetisierte Protein
bildet während der Produktion intrazelluläre Einschlusskörper. In dieser Form ist das Protein
inkorrekt gefaltet und nicht aktiv. Zwischenzeitlich sind in Abbildung 18 starke
Schwankungen im pO2-Wert zu erkennen, die auf Schaumbildung im Fermenter
zurückzuführen sind. Nach 3 Stunden Expressionsphase endet die Fermentation und es erfolgt
die Ernte wie beschrieben per Zentrifugation, so dass die Zellen für die Lagerung vom
Medium getrennt werden.
In den Abbildungen 20-25 sind die gemessenen Offline-Parameter der beiden B028-Fermentationen
aufgetragen. Anhand dieser Prozessdaten können die beiden Fermentationen untereinander verglichen
und bewertet werden. Da es im Zuge der Bachelorarbeit auch relevant war, die beiden im Betrieb im
10-Liter-Maßstab durchgeführten Fermentationen auf ein 1-Liter-System zu übertragen, ist bei den
Parametern, zu denen die erforderlichen Daten vorlagen, noch eine Vergleichsfermentation des
Prozesses im 10-Liter-Maßstab aufgetragen, um auch hier die Vergleichbarkeit bewerten zu können.
Ergebnisse
47
Abbildung 20: Verlauf der Optischen Dichte
bei 600 nm während der Fermentation des
Prozesses B028. Zusätzlich ist der
Vergleichsprozess aufgetragen, dessen
Verlauf sehr gut übereinstimmt.
Abbildung 21: Verlauf der Biofeucht-
masse (engl. Cell Wet Weight - CWW)
während der Fermentation des Prozesses
B028.
Abbildung 22: Verlauf der Biotrocken-
masse (engl. Cell Dry Weight) während der
Fermentation des Prozesses B028.
Abbildung 23: Verlauf der Glycerin-
konzentration im Medium während der
Fermentation des Prozesses B028.
Glycerin stellt das primäre
Kohlenstoffsubstrat dar und wird
während des Batch-Versuches
weitestgehend verbraucht.
Ergebnisse
48
Abbildung 24: Verlauf der Acetat-
konzentration im Medium während der
Fermentation des Prozesses B028. Acetat
wird von den verwendeten E. coli-
Bakterien unter Stress gebildet und kann
in höheren Konzentrationen das
Zellwachstum und die Proteinsynthese
hemmen.
Abbildung 25: Verlauf der Zielprotein-
konzentration während der
Fermentation des Prozesses B028. Die
Produktion des Moleküls beginnt nach
der Induktion mit IPTG. Das Zielprotein
wird dabei zellintern in Inclusion Bodies
gelagert.
Leider liegen für den Vergleichsprozess nur Messwerte für die Optische Dichte und die
Glycerinkonzentration während der Kultivierung vor. Da die Zellkonzentration, also die Biofeucht-
und Biotrockenmasse, aber proportional zur OD600 verlaufen, kann davon ausgegangen werden, dass
die für die Optische Dichte getroffenen Aussagen auch für die Zellkonzentration gelten.
Vergleicht man also die Ergebnisse der OD600-Messungen, erkennt man den sehr synchronen Verlauf
der 3 dargestellten Fermentationen. Zwischen den beiden Kultivierungen des Prozesses B028
untereinander, aber auch im Abgleich mit der Vergleichsfermentation, sind kaum Unterschiede zu
vermerken. Man kann also davon ausgehen, dass der Scale-down des Fermentationsprozesses im
Bezug auf das Zellwachstum sehr gut gelungen ist.
Betrachtet man die Glycerolkonzentration im Medium, ist zwar ein geringfügig anderer Startwert bei
Fermentation 1 und 2 zu verzeichnen, der Verlauf während der Fermentation ist aber wieder gut zu
vergleichen. Des Weiteren ist, wie in den Abbildungen 20-25 gezeigt, eine sehr gute Vergleichbarkeit
der beiden Fermentationen des Prozesses B028 untereinander gewährleistet. Sowohl die gemessenen
Zellfeucht-, bzw. Zelltrockenmassen, als auch das während der Kultivierung gebildete Acetat und das
synthetisierte Zielprotein laufen sehr synchron, was für eine gute Stabilität des Prozesses spricht.
Aufgrund dieser Ergebnisse kann der Transfer vom 10-Liter-System in das 1-Liter-System als
erfolgreich bezeichnet werden. Leider ist keine Aussage zur Vergleichbarkeit der
Zielproteinkonzentration möglich.
Ergebnisse
49
Abbildung 26: Darstellung des Anteils an
Produkt des Prozesses B028 im löslichen
und unlöslichen Zustand. Dabei werden
die Mittelwerte aus Fermentation 1 und 2
verwendet.
Abbildung 27: SDS-PAGE des Löslich/Unlöslich-
Gels der Fermentationsprobe zu B028. 1
Marker, 2-4 Referenzprotein, 5-6/9-10 Protein
im Überstand Fermentation 1/2, 7-8/11-12
Protein im Pellet Fermentation 1/2
In Abbildung 26 ist das Endergebnis des Löslich/Unlöslich-Gels dargestellt, das sich aus Abbildung
27 ergibt. Dabei scheint ein relativ großer Teil des Produktes löslich zu sein und ist daher der
Filtration unzugänglich. Betrachtet man in Abbildung 27 allerdings die Auswertung der SDS-PAGE,
so erkennt man, dass der deutlich größere Teil des Produktes im Pellet vorliegt. Bei dem Protein auf
der gleichen Höhe im Überstand könnte es sich auch um ein gleich großes Molekül handeln, das
aufgrund seiner Größe mit quantifiziert wurde.
Bei der Fermentation des Prozesses B028 wurden insgesamt 126 g Zellmasse produziert.
71,51 %
27,49 %
B028
Produkt im Überstand (löslich)
Produkt im Pellet (unlöslich)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 kDa
205
116
97 80
66
55
45
30
21
14
6,5
Ergebnisse
50
6.2.2. FERMENTATION B082
Fermentation 3:
Abbildung 28: Darstellung der Rührerdrehzahl NSt, des Sauerstoffanteils der Zuluft xO2in, des
Sauerstoffpartialdrucks pO2 und der Biofeuchtmasse CWW während der Fermentation des
Prozesses B082
Abbildung 28 zeigt wie bei Prozess B028 den Verlauf der Fermentation 3 (B082) mit den für die
Fermentation relevanten Parametern: der Drehzahl NSt, dem Anteil des Sauerstoffs in der Zuluft xO2in,
dem Sauerstoffpartialdruck im Medium pO2 und dem offline ermittelten Biofeuchtgewicht CWW.
Die Kultivierung unterteilt sich in 3 Phasen:
1. Batch-Phase
Nach der Inokulation des Fermenters sind die für die Zellen notwendigen Substrate und
Wachstumskomponenten im Überfluss vorhanden. Liegt im Fermenter keine andere
Wachstumshemmung vor, erfolgt das Wachstum exponentiell. Wie bei Prozess B028 gelangt
der Prozess nach einiger Zeit in die pO2-geregelte Phase, in der der Sauerstoffpartialdruck
durch die bereits beschriebene Regelung auf 30% gehalten wird. Dabei erfolgt zuerst die
Steigerung der Rührerdrehzahl bis maximal 1500 rpm und bei Bedarf auch die Erhöhung des
Sauerstoffanteils in der Zuluft. In Abbildung 28 sieht man in der Expressionsphase deutlich
den Zeitpunkt, an dem in der Gasmischstation der Sauerstoffanteil erhöht wird, da das System
plötzlich zu schwingen anfängt. Eine Anpassung der dafür relevanten Regelparameter bewirkt
zwar nach einer gewissen Einstellphase eine Beruhigung der Regelung, offenbar reagiert das
Ergebnisse
51
System aber so empfindlich auf die erhöhte Sauerstoffzufuhr, dass eine vertretbare
Restschwingung erhalten bleibt.
Gelegentlich sinkt der Sauerstoffpartialdruck sehr stark ab, was auf eine Zufuhr von
Antischaummittel zurückzuführen ist. Durch das Antischaummittel wird der Übergang des
Sauerstoffs aus der Gasphase in das Medium kurzfristig erschwert.
Die Batch-Phase ist beendet, sobald das limitierende Substrat, in diesem Fall die
Kohlenstoffquelle, aufgebraucht ist. Dies äußert sich durch einen starken Anstieg im pO2-Wert
wie in Abbildung 28 zu sehen, da der Sauerstoffeintrag unverändert hoch ist, die Zellen aber
plötzlich nach dem Verbrauch der Kohlenstoffquelle wesentlich weniger Sauerstoff benötigen.
Mit dem Ende der Batch-Phase beginnt die
2. Fed-Batch-Phase
Während der Fed-Batch-Phase wird dem Prozess mit einer bestimmten Zufütterrate neues
steriles Substrat hinzugefügt. Das Wachstum der Zellen ist also in dieser Phase durch die
Zufütterrate beschränkt. Während der Fed-Batch-Phase und am Ende der Batch-Phase wird
aufgrund der C-Quellen-Limitierung (in diesem Fall Glycerin) auch das im Medium
vorhandene Acetat verstoffwechselt, so dass die Acetatinhibierung kein Problem mehr
darstellt. Die Fed-Batch-Phase dauert 10 bis 12 Stunden, je nach Induktionszeitpunkt.
3. Expressionsphase:
Nach Start der Zufütterung erfolgt bei einer OD600 von 65 die Expressionsphase wie
beschrieben durch Zugabe von IPTG. Der Induktion schließt sich die 8-stündige
Expressionsphase an. Das Zielprotein wird dabei löslich im Zytoplasma exprimiert.
Nach Abschluss der Expression erfolgt wie bereits beschrieben die Ernte per Zentrifugation.
In den Abbildungen 29-34 sind die offline ermittelten Parameter für den Prozess B082 und der zu
adaptierende Vergleichsprozess im 10-L-Maßstab aufgetragen, um den Prozess charakterisieren und
vergleichen zu können. Ein Teil der Fermentation erfolgte über Nacht, in der keine Messwerte
aufgenommen wurden. In der Zeitachse der Auftragung ist daher eine Unterbrechung zu sehen.
Ergebnisse
52
Abbildung 31: Verlauf der Biotrocken-
masse während der Fermentation des
Prozesses B082 und einer Vergleichs-
fermentation.
Abbildung 32: Verlauf der Glycerin-
konzentration während der Fermentation
des Prozesses B082 und einer Vergleichs-
fermentation.
Abbildung 29: Verlauf der optischen Dichte
während der Fermentation des Prozesses
B082 und einer Vergleichsfermentation.
Abbildung 30: Verlauf der Biofeuchtmasse
während der Fermentation des Prozesses
B082 und einer Vergleichsfermentation.
Ergebnisse
53
Wie bei Prozess B028 dienen die Abbildungen 29-34 dazu, den Erfolg der Fermentation und die
Skalierbarkeit zu bewerten.
Betrachtet man die Parameter für das Zellwachstum, die Optische Dichte, die Biofeuchtmasse und die
Biotrockenmasse, ist deutlich auch hier der synchrone Verlauf zu beobachten. Die Werte liegen bei
der durchgeführten Fermentation 3 zwar jeweils etwas tiefer, im Verlauf ergeben sich aber kaum
Unterschiede. Auch bei der Betrachtung der Glycerin- und Acetatkonzentration können nahezu
identische Verläufe verzeichnet werden.
Betrachtet man allerdings die Konzentration des gebildeten Proteins, werden bereits nach kurzer Zeit
signifikante Unterschiede deutlich. Während die Proteinkonzentration in der Vergleichsfermentation
bis zum Ende steigt, deutet sich bei Fermentation 3 schon nach kurzer Zeit eine schwächere Zunahme
an. Am Ende scheint die Proteinkonzentration in der durchgeführten Kultivierung sogar zu stagnieren,
so dass sich die Proteinausbeute halbiert.
In der Fermentation des Prozesses B082 konnten insgesamt 110 g Biofeuchtmasse geerntet werden.
Diesen Ergebnissen zufolge ist der Scale-down des Prozesses zwar weitestgehend erfolgreich, es
besteht aber gerade im Bereich der Zielproteinproduktion noch Optimierungsbedarf.
Abbildung 33: Verlauf der Acetat-
konzentration während der Fermentation
des Prozesses B082 und einer Vergleichs-
fermentation.
Abbildung 34: Verlauf der Produkt-
konzentration während der Fermentation
des Prozesses B082 und einer Vergleichs-
fermentation.
Ergebnisse
54
In Abbildung 35 ist abschließend das Verhältnis an löslichem Produkt zu unlöslichem Produkt zu
sehen. Bei Prozess B082 scheint über 90% des Zielproteins in der geplanten löslichen Form und damit
für die Filtration zugänglich zu sein.
6.3. FILTRATIONSVORVERSUCHE
6.3.1. VORVERSUCH 1: ERMITTLUNG DES OPTIMALEN KONZENTRIERUNGSFAKTORS
Wie in Kapitel 5.3.2 beschrieben, dient der Vorversuch 1 der Ermittlung des optimalen
Konzentrierungsfaktors für die nachfolgenden Filtrationsprozesse. Zur Auswertung wurde der aus der
Konzentrierung resultierende TMP gegen den Konzentrierungsfaktor aufgetragen.
B028
Abbildung 36: Verlauf des TMP bei steigendem
Konzentrierungsfaktor während des
Vorversuchs zur Filtration des Prozesses
B028. Mit der gestrichelten Linie wird der
spätere Arbeitsbereich gekennzeichnet.
Abbildung 36 zeigt, dass der TMP mit steigendem Konzentrierungsfaktor nur minimal ansteigt.
Maximal wäre demnach eine bis zu 7-fache Konzentrierung möglich. Leider stehen für die
Bachelorarbeit nur Aliquots à 100 ml zu Verfügung, wobei das minimale Probenvolumen für die
Anlage 32 ml beträgt. Der Arbeitsbereich wurde daher auf eine 2-fache Konzentrierung festgelegt.
9 %
91 %
B082
Produkt im Überstand (löslich)
Produkt im Pellet (unlöslich)
Abbildung 35: Darstellung des Anteils an
Produkt des Prozesses B082 im löslichen und
unlöslichen Zustand.
Ergebnisse
55
Findet der Prozess allerdings Anwendung im large-scale25
, könnte eine weitere Konzentrierung zur
Einsparung von Puffervolumen und Prozesszeit in Erwägung gezogen werden.
B082
Abbildung 37:Verlauf des TMP bei steigendem
Konzentrierungsfaktor während des
Vorversuchs zur Filtration des Prozesses B082.
Mit der gestrichelten Linie wird der spätere
Arbeitsbereich gekennzeichnet.
Abbildung 37 zeigt den Verlauf des TMP bei einer Erhöhung des Konzentrierungsfaktors im Prozess
B082. Dieser Prozess entspricht im Gegensatz zu Prozess B028 mehr dem erwarteten Verlauf einer
Zelllysatfiltration. Die aufgeschlossene Zellbrühe ist schon zu Beginn des Aufreinigungsschrittes sehr
partikelreich und viskos, so dass sie kaum aufkonzentriert werden kann. Letztendlich musste der
Arbeitsbereich daher auf einen maximalen Konzentrierungsfaktor von 1 festgelegt werden.
6.3.2. VORVERSUCH 2: ERMITTLUNG DES OPTIMALEN MEMBRANFLUXES
Wie unter Kapitel 5.3.2 beschrieben, kann der Arbeitsbereich des möglichen Membranfluxes dadurch
ermittelt werden, dass der Membranflux stufenförmig erhöht und der sich aus diesen
Prozessbedingungen ergebende TMP ermittelt wird. Da der Membranflux während des Versuches
jeweils für 30 min gehalten wird, können bei der Auftragung auch mehrere Werte für den TMP einem
einzigen Wert für den Membranflux zugeordnet sein.
25 large-scale- großer Maßstab
Ergebnisse
56
B028
Abbildung 38: Verlauf des TMP während
des Vorversuchs zur Bestimmung des
optimalen Arbeitsbereiches hinsichtlich
des Membranfluxes im Prozess B028.
Dieser wird während der Filtration
stufenförmig erhöht. Der Bereich
zwischen den gestrichelten Linien stellt
den späteren Arbeitsbereich dar.
Wie in Abbildung 38 zu sehen, steigt der resultierende TMP anfangs nur sehr wenig, was einen breiten
Arbeitsbereich zulässt. Ab einem Membranflux von 65 LMH allerdings sind schnell große TMP-
Änderungen zu verzeichnen, so dass der Arbeitsbereich demnach zwischen 20 und 60 LMH festgelegt
werden konnte.
B082
Abbildung 39: Verlauf des TMP
während des Vorversuchs zur
Bestimmung des optimalen
Arbeitsbereiches hinsichtlich des
Membranfluxes im Prozess B082. Die
Durchführung erfolgt wie bei Prozess
B028. Der Bereich zwischen den
gestrichelten Linien stellt den
späteren Arbeitsbereich dar.
In Abbildung 39 ist der Verlauf des TMP bei kaskadenartiger Erhöhung des Membranfluxes in
Prozess B082 dargestellt. Leider kann der Arbeitsbereich nicht so groß wie bei Prozess B028 gewählt
werden, da bereits bei 45 LMH ein starker Anstieg des TMP zu verzeichnen ist. Für die weiteren
Versuche wurde daher ein Arbeitsbereich zwischen 15 und 35 LMH festgelegt.
Ergebnisse
57
6.3.3. Vergleich der Konzentrierungsphasen
Abbildung 40: Vergleich der TMP-
Verläufe während des Konzentrie-
rungsvorversuches der beiden
Prozesse B028 und B082. Während bei
B082 ein starker Anstieg schon bei
einem niedrigen Konzentrie-
rungsfaktor zu sehen ist, steigt der
TMP bei Prozess B028 mit dem
steigenden Konzentrierungsfaktor nur
langsam an.
Abbildung 40 stellt noch einmal der Vergleich der beiden Prozesse im Hinblick auf den optimalen
Konzentrierungsfaktor dar. Deutlich sichtbar ist dabei der nur langsam mit dem Konzentrierungsfaktor
steigende Verlauf des TMPs bei Prozess B028. Selbst nach 7-facher Konzentrierung können keine
vergleichsweise hohen Werte wie bei Prozess B082 beobachtet werden. Bei diesem steigt der TMP
gleich bei Beginn derart stark an, dass kaum eine Konzentrierung möglich ist. Im Verlauf der
Bachelorarbeit ist zwar bei beiden Prozessen immer von einem E. coli-Zelllysat die Rede, wie aber in
der Vergangenheit gezeigt wurde [20], kann es große Unterschiede zwischen verschiedenen
Zelllysaten geben, auch wenn es sich um denselben Organismus handelt.
6.4. FILTRATION
6.4.1. FILTRATION B028
Abbildung 41: Verlauf der
prozessrelevanten Parameter
während einer Tangential-
flussfiltration des Prozesses
B028. Dargestellt sind der
Konzentrierungs- bzw. Dia-
filtrationsfaktor (Conc/DF
Factor), die Proteinausbeute
(Protein Rec.), der Trans-
membrandruck (TMP) und die
Absorption des Permeats bei 280
nm (UV).
Ergebnisse
58
Abbildung 41 zeigt ein Beispiel für einen typischen Verlauf der Tangentialflussfiltration. Dabei sind
die prozessrelevanten Parameter Konzentrierungs- bzw. Diafiltrationsfaktor (Conc/DF Factor),
Proteinausbeute (Protein Rec.), Transmembrandruck (TMP) und Absorption des Permeats bei 280 nm
(UV) gegen die Prozesszeit aufgetragen. Vor dem Start der Filtration ist ein Reinigungs- und
Equilibrierverfahren vorgeschaltet, so dass die dargestellte Prozesszeit (time) nicht bei null startet.
Die Filtration ist wie beschrieben in 2 Phasen unterteilt:
1. Konzentrierungsphase
Am Anfang der Konzentrierungsphase beginnt die Filtration mit einer kurzen Zirkulation der
Zellsuspension. Dabei ist das Permeatventil geschlossen, so dass sich retentatseitig konstante
Scher- und Fließbedingungen einstellen können. Nach dieser kurzen Einfahrphase öffnet sich
das Permeatventil und die Permeatpumpe beginnt den Permeatflux aufzubauen. Die
eigentliche Filtration beginnt. Dabei können gelöste und kleine Bestandteile des Lysats durch
die Filtrationsmembran gelangen, solange sie kleiner als die ausgewählte Porengröße sind.
Während der Konzentrierungsphase steigt die Konzentration der zurückgehaltenen Stoffe im
Retentat, in diesem Fall auch die des Produktes, das in Inclusion Bodies vorliegt, die das
Membransystem nicht passieren können. Diese erste Phase der Filtration stellt für das Produkt
oft die verlustreichste dar, da bereits zu Beginn der Filtration Proteine an die
Membranoberfläche adsorbieren können. Dieser Vorgang verstärkt sich häufig mit steigender
Konzentration des Biomoleküls. Je nach Art und Eigenschaften des Proteins kann es bei
erhöhter Konzentration auch zur Proteinaggregation und zum Ausfallen des Produktes
kommen. Bei der Ermittlung des optimalen Konzentrierungsfaktors ist also nicht nur eine
Filtrationsleistungsuntersuchung des gesamten Lysats, sondern auch des Zielproteins an sich
von Bedeutung. In Abbildung 41 sieht man, dass die Protein Recovery im Retentat sinkt,
obwohl das Protein in den Inclusion Bodies durch die Membran gänzlich zurückgehalten
werden sollte. Um die Proteinkonzentration am Start und nach der Konzentrierung vergleichen
zu können, erfolgt zur Ermittlung der Recovery eine Normierung auf den
Konzentrierungsfaktor. Ansonsten wäre dementsprechend keine Abnahme an Produkt,
sondern aufgrund der Konzentrierung eine Zunahme im Retentat zu verzeichnen. Neben der
Adsorption an die Membran könnte für die erwähnte Abnahme der kleine Anteil an gelöstem
Produkt verantwortlich sein, der in diesem Zustand die Membran passieren kann und
dementsprechend für das Endergebnis verloren geht. Während der Konzentrierungsphase
können zelleigene Proteine und andere Bestandteile aus dem Lysat filtriert werden. Die
Reinheit des Produktes im Retentat nimmt dadurch zu. Wichtiger Parameter der
Konzentrierungsphase ist der Konzentrierungsfaktor, der den Fortschritt der Konzentrierung
Ergebnisse
59
angibt. Ein Konzentrierungsfaktor von 2 kommt einer Volumenreduktion von 50% gleich. Zur
weiteren Aufreinigung schließt sich
2. die Diafiltrationsphase an. Bei der Diafiltration wird dem Retentat ein, für diesen Prozess
ausgewählter, Puffer zugeführt, in diesem Fall mit den gleichen Bestandteilen, die auch der
Lysepuffer beinhaltet. Durch die Diafiltration wird ein Auswaschen des Retentats bezweckt,
da dem Reservoir kontinuierlich zell- und proteinfreier Puffer zugeführt und über die
Membran stetig protein- und zellbestandteilhaltiges Permeat abgeführt wird. Die im Retentat
verbleibenden Zellkomponenten wie die Inclusions Bodies werden mit dem
Diafiltrationspuffer quasi ausgewaschen. Gelegentlich kann es durch die hohen Scherkräfte
des gesamten Prozesses in dieser Phase auch wieder zu einem Anstieg der
Proteinkonzentration kommen, da Proteine, die während der Konzentrierungsphase an die
Membran adsorbieren, im Laufe der Zeit wieder abgelöst werden können. Dieser Vorgang ist
allerdings nicht speziell auf die Diafiltrationsphase beschränkt. In Abbildung 41 ist allerdings
in diesem Fall zu sehen, dass die Zielproteinkonzentration im Laufe der Diafiltration eher
etwas sinkt. Grund dafür könnten weitere Moleküle des Produktes sein, die jetzt in löslicher
Form vorliegen. Betrachtet man die Größenordnung der Produktabnahme während der
Diafiltration, erscheint dieser Verlust hingegen marginal. Während der Diafiltrationsphase
sinkt der UV-Wert im Permeat kontinuierlich, da immer mehr Zellproteine bereits aus dem
Retentat ausgewaschen sind und sich im gesammelten Filtrat befinden. Der UV-Wert stellt
damit einen guten Parameter zum Fortschritt dieser Phase dar. Übergeordneter
Prozessparameter bei der Diafiltration ist analog zur Konzentrierungsphase der
Diafiltrationsfaktor. Er gibt die Anzahl ausgetauschter Puffervolumina, bezogen auf das
Retentatvolumen am Anfang der Diafiltrationsphase an. In Abbildung 41 endet die Filtration
bei einem Diafiltrationsfaktor von 5. Im Laufe der Versuchsreihen ist das Prozessende
allerdings auf einen Diafiltrationsfaktor von 3 festgelegt worden. Die Ergebnisse, die zu dieser
Entscheidung führten, sind im Folgenden dargestellt.
Abbildung 42 zeigt noch einmal im Detail den
Verlauf der Absorption bei 280 nm im Permeat,
der indirekt für die Gesamtproteinkonzentration
steht. Im Laufe der Diafiltration nimmt der Wert
erst stark und dann immer langsamer ab. In der
Abbildung 43 ist die Analyse der Filtration
mittels SDS-PAGE dargestellt. Nach dem
Proteingrößenstandard und einer Referenz für
die Quantifizierung sind erst die Retentat- und
dann die Permeatproben aufgetragen. Die Abbildung 42: Verlauf der Absorption des
Permeats bei 280 nm. Dieser Wert verläuft analog
zur Proteinkonzentration.
Ergebnisse
60
Permeatproben sind dabei aus dem laufenden Filtrat genommen worden. Betrachtet man den Verlauf
der Proteinkonzentration im Permeat, so sind mit dem gewählten Gelsystem nach 3
Diafiltrationszyklen kaum noch Zellproteine zu detektieren. Eine Fortsetzung der Diafiltration führt
nur zu einer Verlängerung der Prozesszeit, einer Erhöhung des Puffervolumens und eventuell zu
einem Produktverlust. Die Filtration wurde daher im weiteren Verlauf auf 3 Diafiltrationszyklen
beschränkt.
Abbildung 43: Analyse der Protein-
konzentrationen im Laufe der Filtration im
Retentat (3-9) und Filtrat (10-15) mittels SDS-
PAGE. 3 Startwert, 4/10 Konzentrierung, 5-
9/11-15 5 Diafiltrationszyklen
Abbildung 44: Analyse der Protein-
konzentration im Retentat zweier Filtrationen
mittels SDS-PAGE. 3-7 Filtration 1, 8-12
Filtration 2, 3/8 Startwert, 4/9 Konzentrierung,
5-7/10-12 3 Diafiltrationszyklen
Wie in Kapitel 5.3.4 beschrieben, erfolgt nach den
anfänglichen Analysen zur Filtrationsleistung nur
noch eine Proteinquantifizierung für die relevanten
Proben zur Bestimmung der Proteinwieder-
findungsrate, in diesem Fall durch Beprobung des
Retentats, in dem sich das Protein in Inclusion
Bodies befindet. Abbildung 44 zeigt ein typisches
Gel für die Analytik der Proteinkonzentration im
Filtrationsverlauf. Dabei sind wie beschrieben die
Retentatproben im Laufe der Filtration aufgetragen,
so dass eine Produktwiederfindungskinetik ermittelt
werden kann. In Abbildung 45 ist das Ergebnis der
Verdünnungsreihe zur Bestimmung des Verhaltens
des Proteins bei der Analytik mittels SDS-PAGE zu
sehen.
Abbildung 45: Analyse der Protein-
konzentrationen der Verdünnungsreihe einer
Probe aus dem Retentat einer Tangential-
flussfiltration mittels SDS-PAGE. 3 Startprobe
1:10, 4 Konzentrierung 1:10, 5
Konzentrierung 1:5, 6 Konzentrierung 1:10, 7
Konzentrierung 1:20, 8 Konzentrierung 1:40,
9 Konzentrierung 1:80, 10 Probe des
Reinigunsverfahrens.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
kDa 205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
kDa
205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
kDa
205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
Ergebnisse
61
Wie beschrieben sind jeweils 1:2 Verdünnungen einer Ausgangsprobe aufgetragen.
Die Auswertung der Verdünnungsreihe erfolgt mit Excel. Dazu werden die quantifizierten
Proteinmengen gegen den Verdünnungsfaktor aufgetragen und eine Regressionskurve bestimmt.
Abbildung 46: Darstellung der mittels SDS-PAGE ermittelten Proteinmenge, die sich aus dem
jeweiligen Verdünnungsfaktor ergibt. Die Auftragung erfolgt dabei analog zur Verdünnungsreihe
logarithmisch zur Basis 2.
Abbildung 46 zeigt das Ergebnis einer solchen Korrelation. Mit Hilfe einer logarithmischen
Regression lässt sich das Verhalten des Proteins bei der Gelanalytik sehr gut beschreiben. Ein
Kriterium für die erfolgreiche Annäherung ist der Regressionsfaktor R², der in diesen Fall bei 0,9999
liegt. Die aufgetragene Probe wurde bei einem Konzentrierungsfaktor von 2 während der Filtration
genommen, die standardmäßige Verdünnung für alle Proben beträgt 1:10. Den Startwert für die
Filtration stellt in dieser Verdünnungsreihe also quasi die 1:20 Verdünnung dar.
Proteinmenge = -145,7ng ln(Verdünnungsfaktor) + 658,88 ng
R² = 0,9999
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
5 10 20 40
Pro
tein
menge [ng]
Verdünnungsfaktor log 2 [-]
Ergebnisse
62
Bezieht man die durch die Verdünnungsreihe ermittelten Proteinmengen nun auf diese
Ausgangskonzentration, ergibt sich folgendes Bild:
Abbildung 47: Darstellung der mittels SDS-PAGE ermittelten Proteinmenge, diesmal abhängig von
der Startkonzentration oder dem Konzentrierungssfaktor. Die Auftragung erfolgt dabei analog zur
Verdünnungsreihe logarithmisch zur Basis 2.
In Abbildung 47 ist diese Art der Auftragung dargestellt. Um eine allgemeingültige Lösung ermitteln
zu können, ist die Korrelation auf die Ausgangskonzentration c0 normiert. Statt der normierten
Konzentration könnte man die Werte der x-Achse auch als Konzentrierungsfaktor bezeichnen. Dabei
ist zu ermitteln, wie sich die Proteinmenge auf dem Gel ändert, wenn sich die Proteinkonzentration in
der Probe verdoppelt, also zweifach konzentriert wird. Ausgangspunkt für diesen Faktor ist die
logarithmische Korrelation mit Excel. Zur Berechnung des Korrekturfaktors muss die ermittelte
logarithmische Funktion umgestellt werden. Es gilt dabei einen Faktor zu finden, um den die
Proteinmenge auf dem Gel steigt, wenn sich die Konzentration verdoppelt, also um den Faktor 2
konzentriert wird. Die dafür notwendige Berechnung ist im Folgenden dargestellt:
Durch logarithmische Regression mit Excel ermittelte Abhängigkeit der Proteinmenge auf dem Gel
abhängig vom Konzentrierungsfaktor:
(4)
mit
m = 145,67 ng, b = 222,49 ng
Für eine zweifache Konzentrierung ergibt sich, wie im Anhang unter 9.3 dargestellt, bezogen auf den
Startkonzentrierungsfaktor von 1, also nur eine Zunahme des Proteins auf dem Gel um den Faktor
1,45. Dieser Faktor wird für die Auswertung und Quantifizierung mit berücksichtigt. Zusätzlich ist in
Abbildung 45 noch eine Probe aus der CIP-Reinigungsprozedur der Membran mit NaOH zu sehen.
Proteinmenge = 145,67ng ln(Konzentrierungsfaktor) + 222,49 ng
R² = 0,9999
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1 1 2 4
Pro
tein
menge [ng]
Konzentrierungsfaktor log 2 [-] 0,
Ergebnisse
63
Das vorhandene Produkt lässt darauf schließen, dass ein Teil während der Filtration an der Membran
adsorbiert.
Abbildung 48: Verlauf der prozessrelevanten Parameter während einer Tangentialflussfiltration
mit hohem TMP des Prozesses B028. Dargestellt sind der Konzentrierungs- bzw.
Diafiltrationsfaktor, die Proteinausbeute, der Transmembrandruck und die Absorption des
Permeats bei 280 nm.
Wie in Kapitel 5.3.1 festgelegt, wird die Filtration mit einer Fluxkontrolle durchgeführt, also bei
einem konstanten, vorher festgelegten Membranflux geregelt. Ausgangsgröße ist in diesem Fall der
sich dadurch einstellende Transmembrandruck, der zusätzlich von der ausgewählten Scherrate
abhängt. Abbildung 41 zeigte einen beispielhaften Verlauf, in dem das Verhältnis der Scherrate zum
Membranflux offenbar günstig ist, so dass sich keine hohen TMPs einstellen können. Ein Beispiel für
einen Prozess mit niedriger Scherrate und hohem gewähltem Membranflux ist in Abbildung 48 zu
sehen. Besonders während der Konzentrierungsphase steigt der TMP stark an, da die Konzentration
der Zellpartikel und DNA-Fragmente im Lysat und damit die Viskosität stark zunehmen. Ein hoher
TMP begünstigt dabei die zunehmende Ausbildung einer Proteingelschicht auf der Oberfläche der
Filtrationsmembran. Die Auswirkungen für die Filtration werden bei der Produktkonzentration
deutlich, die in der Konzentrierungsphase deutlich sinkt. Erst durch das Ausspülen mit
Diafiltrationspuffer in der 2. Phase können bestimmte Anteile des Produktes wieder zugänglich
gemacht werden.
Die ermittelten Proteinausbeuten für die Filtrationsversuche sind in Abbildung 49 dargestellt.
Ergebnisse
64
Abbildung 49: Darstellung der ermittelten Proteinausbeuten während der Filtrationsversuche des
Prozesses B028. Die Experimente sind dabei nach laufender Prozessnummer und verwendeter
Porengröße geordnet.
Die Auswertung und Diskussion dieser Ergebnisse erfolgt mit Hilfe des gewählten DoE-Modells und
dem Programm MODDE.
77,9
82,3
78,9
92,2
82,5 82,5 84,8
89,9
84,3 85,1 87,6
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
P004 P005 P006 P007 P008 P009 P010 P011 P012 P013 P014
Rec
ove
ry [
%]
500 kDa 750 kDa 0,1 µm 750 kDa CP
Ergebnisse
65
6.4.2. FILTRATION B082
Abbildung 50: Verlauf der prozessrelevanten Parameter während einer Tangentialflussfiltration
des Prozesses B082. Dargestellt sind der Konzentrierungs- bzw. Diafiltrationsfaktor (Conc/DF
Factor), die Proteinausbeute (Protein Rec.), der Transmembrandruck (TMP) und die Absorption
des Permeats bei 280 nm (UV).
Abbildung 50 zeigt ein Beispiel für einen typischen Verlauf der Tangentialflussfiltration. Dabei sind
die prozessrelevanten Parameter Konzentrierungs- bzw. Diafiltrationsfaktor (Conc/DF Factor),
Proteinausbeute (Protein Rec.), Transmembrandruck (TMP) und Absorption des Permeats bei 280 nm
(UV) gegen die Prozesszeit aufgetragen. Sichtbar wird, dass die eigentliche Filtration erst bei einer
Prozesszeit (time) von einer Stunde beginnt. Die vorangegangene Zeit wurde für Reinigungs- und
Equilibrierungsschritte verwendet.
Ähnlich wie bei Prozess B028 und wie in Kapitel 4.4 beschrieben, ist die Filtration in 2 Teile geteilt.
1. Konzentrierungsphase:
Vom Prozessablauf her verläuft die Filtration analog zu Prozess B028. Nach einem
anfänglichen Rezirkulieren des Retentats öffnet sich das Permeatventil und das Filtrat kann
durch die Membran gelangen. Im Filtrat befinden sich alle Stoffe, die aufgrund ihrer Größe
die Poren des Membransystems passieren können. Im Gegensatz zu Prozess B028 befindet
sich bei Prozess B082 das Produkt im Filtrat. Dieses filtrierte Permeat wird also am Ausgang
der Anlage aufgefangen und auf Eis bis zum Ende der Filtration gekühlt. Während der
Konzentrierungsphase werden die Moleküle im Retentat, die von der Membran
zurückgehalten werden, konzentriert, so dass im ungünstigsten Fall Proteine in höheren
Ergebnisse
66
Konzentrationen ausfallen können. Durch Adsorption an der Membran besteht so die
Möglichkeit einer Gelschichtbildung, die die Filtrationsleistung erheblich beeinflussen kann.
Zur Vermeidung dieses Phänomens werden wie beschrieben möglichst hohe Scherraten mit
den daraus resultierenden TMP-Werten gefahren. Die Proteinausbeute steigt während der
Konzentrierungsphase mit steigendem Permeatvolumen, da immer mehr des im Retentat
vorliegendem Proteins die Membran passieren kann. Wie in den Vorversuchen (s. Kapitel 6.3)
ermittelt, endet die Konzentrierungsphase aufgrund der relativ schlechten
Filtrationseigenschaften des spezifischen Lysats bereits bei einem Konzentrierungsfaktor
von 1. Mit dem gleichen Puffer, der auch für den Zellaufschluss verwendet wurde, erfolgt nun
2. die Diafiltrationsphase. Wie bei Prozess B028 wird bei der Diafiltrationsphase dem Retentat
ein zell- und proteinfreier Diafiltrationspuffer zugeführt. Gleichzeitig erfolgt weiterhin eine
Abführung des Permeats mit gleicher Pumprate, so dass das Niveau des Retentats erhalten
bleibt. Durch die Diafiltration können weitere Bestandteile, die die Membran passieren
können, aus dem Lysat ausgewaschen werden. Das Zielprotein, das sich löslich im Zelllysat
befindet, kann dabei weiter im Filtrat wiedergefunden werden. Es sammelt sich also weiter
Produkt im gesammelten Permeat an. Die Quantifizierung wird bei Prozess B082 allerdings,
im Gegensatz zu Prozess B028, auf die Gesamtproteinmenge bezogen, die sich aus der
ermittelten Proteinkonzentration und dem Permeatvolumen ergibt. Notwendig ist dies, weil
das Volumen im Laufe der Filtration ständig steigt, wobei die Konzentration im Filtrat nicht
immer gleich bleibt. Am Ende der Diafiltration kann auch wieder eine Verdünnung des
Produktes zu verzeichnen sein. Diesen Punkt gilt es genau zu bestimmen. Zur Darstellung und
Auswertung der Filtration erfolgt die Analyse mittels SDS-PAGE.
Ergebnisse
67
Abbildung 51 und Abbildung 52 zeigen die Analyse der während der Prozesses genommen Proben für
das Retentat, Filtrat und Gesamtfiltrat. In Abbildung 51 ist dabei der Verlauf der Proteinkonzentration
im Retentat zu sehen. Wie erwartet nimmt die Konzentration zwar im Laufe der Filtration ab, es bleibt
aber ein gewisser Rest an Zielprotein im Retentat erhalten, der für die weitere Prozessierung nicht
mehr verfügbar ist. Abbildung 52 zeigt den Verlauf der Proteinkonzentration im Filtrat direkt aus der
Permeatleitung und im Gesamtfiltrat, das außerhalb der Anlage aufgefangen und auf Eis gekühlt
wurde. Die Zielproteinkonzentration nimmt dabei im Filtrat während der Filtration deutlich ab. Die
Konzentration des Produktes sinkt durch die Zufuhr des Filtrats mit weniger Proteinkonzentration
zwar, die Gesamtproteinmenge kann aber noch zunehmen. Nach einer 3-4-fachen Diafiltration ist im
Filtrat kein Zielprotein mehr zu detektieren. Die Filtration wird dementsprechend nach 3
Diafiltrationszyklen beendet, um Zeit und Puffervolumen zu sparen.
Abbildung 53 zeigt eine typische Proteinquantifizierung zweier Filtrationen im Prozess B082. Die
Proteinstartkonzentration wird wie beschrieben im Retentat und die Konzentration im Laufe des
Abbildung 51: Analyse der Protein-
konzentrationen während der Filtration
im Retentat während der Filtration mittels
SDS-PAGE. Bis zum Ende bleibt ein
gewisser Teil des Zielproteins im Retentat
erhalten. 1 Proteinmarker, 2-4
Referenzprotein, 5-12 Retentat, 5
Startwert, 6 Konzentrierung, 7-12
Diafiltrationsschritte
Abbildung 52: Analyse der Protein-
konzentrationen während der Filtration im
Filtrat und Gesamtfiltrat während der
Filtration mittels SDS-PAGE. 1 Proteinmarker,
2-3 Referenzprotein, 4-9 Filtrat, 10-15
Gesamtfiltrat, 4/10 Konzentrierung, 5-9/11-15
Diafiltration. Die Filtratproteinkonzentration
nimmt deutlich ab.
Abbildung 53: Analyse der Proteinkonzentrationen
zweier Filtrationen des Prozesses B082 erst im Retentat
und dann im Gesamtfiltrat während der Filtration
mittels SDS-PAGE. Auffällig ist dabei der starke
Hintergrund der Retentatproben. 1 Proteinmarker, 2-3
Referenzprotein, 4/9 Startprobe, 5-8/10-13 Gesamtfiltrat
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
kDa
205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
kDa
205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
kDa 205
116
97
80
66
55
45
30
21
14
6,5
Ergebnisse
68
Prozesses im Gesamtfiltrat ermittelt. Vor Beginn der eigentlichen Filtrationsversuche wurde die
Verdünnung der Prozessproben aufgrund vorheriger Erfahrungen mit diesem Produkt auf 1:3
festgelegt. Auffällig ist bei der dargestellten Analytik der starke Hintergrund der Startlysatprobe, der
sich unter Umständen auf die Quantifizierung auswirken könnte.
Analog zu Prozess B028 wurde daher eine Verdünnungsreihe einer Retentatprobe erstellt und mittels
SDS-PAGE quantifiziert. Das Ergebnis ist in Abbildung 54 dargestellt.
Abbildung 54: Mittels SDS-PAGE ermittelte Proteinkonzentration einer Retentatprobe des
Prozesses B082 abhängig vom Verdünnungsfaktor. Der gewählte Arbeitsbereich bei einer
Verdünnung von 1:3 scheint nicht das Optimum der Proteindetektion darzustellen.
Dabei wird das Zielprotein durch den starken Hintergrund offenbar nicht vollständig detektiert. Der
Anfangs gewählte Verdünnungsfaktor stellt dabei leider nicht das Optimum der Verdünnungsreihe
dar. Leider ist mit Excel für diesen Verlauf keine passende Regression verfügbar.
Abbildung 55: Verlauf der prozessrelevanten Parameter während einer Tangentialflussfiltration
des Prozesses B082 mit einer vergleichsweise niedrigen Scherrate von 8000 s-1 und einem
Membranflux von 35 LMH. Dargestellt sind der Konzentrierungs- bzw. Diafiltrationsfaktor, die
Proteinausbeute, der Transmembrandruck und die Absorption des Permeats bei 280 nm. Auffällig
ist der hohe TMP unter diesen Bedingungen.
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
2,5 5 10 20 40 Pro
tein
konzentr
atio
n (
g/l)
Verdünnunngsfaktor [-]
Ergebnisse
69
Wie bei Prozess B028 liegt auch bei Prozess B082 ein Versuch mit einer besonders interessanten
Parameterkonstellation vor. Dabei werden die niedrigste untersuchte Scherrate von 8000 s-1
und der
größte untersuchte Membranflux von 35 LMH kombiniert. Analog zu den Beschreibungen bei Prozess
B028 stellt sich, wie in Abbildung 55 zu sehen ist, auch hier ein hoher TMP ein. Hoher
Transmembrandruck resultiert aufgrund der sich bildenden Proteindeckschichten häufig in niedrigen
Produktausbeuten und so ist auch bei dem dargestellten Filtrationsprozess eine vergleichsweise
niedrige Ausbeute zwischen 40 und 50% sichtbar. Der Verlauf des TMPs sinkt in Abbildung 55
mehrere Male stark ab. Dies ist auf das Erreichen eines standardmäßig eingestellten TMP-
Maximalwertes zurückzuführen, durch das die Filtration kurz gestoppt werden musste. Nach der
Korrektur dieser Maximalwerte kann die Filtration unter gleich bleibenden Bedingungen fortgesetzt
werden.
Die Proteinausbeuten für die Filtrationsversuche des Prozesses B082 sind in Abbildung 56 dargestellt.
Abbildung 56: Darstellung der ermittelten Proteinausbeuten während der Filtrationsversuche des
Prozesses B082. Die Experimente sind dabei nach laufender Prozessnummer und verwendeter
Porengröße (500 kDa – 0,1 µm) geordnet.
Die Auswertung und Diskussion dieser Ergebnisse erfolgt wie bei Projekt B028 mit Hilfe des
gewählten DoE-Modells und dem Programm MODDE.
74,6
89,1
79,4
91,6
70,8
78,4
47,1
77,0
84,2
77,4
83,5
45,0
50,0
55,0
60,0
65,0
70,0
75,0
80,0
85,0
90,0
95,0
P003 P004 P005 P006 P007 P008 P009 P010 P011 P012 P013
Reco
very
[%
]
750 kDa 500 kDa 0,1 µm 750 kDa CP
Filtration: Auswertung und Diskussion
70
7. FILTRATION: AUSWERTUNG UND DISKUSSION
7.1. DOE-AUSWERTUNG B028
Primäres Ziel der Bachelorarbeit war der Vergleich und die Beschreibung des Verhaltens der beiden
unterschiedlichen Zelllysate während der Querstromfiltration. Die Auswertung und Diskussion der
Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Algorithmen und Graphiken des DoE Programmpaketes MODDE.
Abbildung 57: Modellumgebung der Parameterkonstellation für die Filtration des Prozesses B028.
Die bereits in Kapitel 5.3.1 gezeigte Tabelle 9 und Abbildung 57 definieren die Matrix der
untersuchten Parameterkonstellationen. In der Mitte befinden sich die Centerpoint-Versuche, an den
Kanten und Ecken des Würfels die verschiedenen Kombinationen. Die Kreise stellen dabei den
Ausgangsparameter Recovery dar. In der Abbildung des Design-Würfels ist durch die farbliche
Darstellung der Ausgangsgröße auch gleich eine grobe Ergebnisdarstellung präsentiert. Die
vergleichsweise hohen Ergebniswerte sind dabei rot dargestellt, die eher durchschnittlichen gelb und
die niedrigen blau. Diese Verteilung kann auch dem nachfolgenden Histogramm entnommen werden.
Abbildung 58: Replication Plot
der Versuchsergebnisse der
Filtration für Prozess B028.
Dabei sind die
Versuchsergebnisse in der
Nummerierung MODDEs
aufgetragen. Versuch Nummer
10 und 11 entsprechen den
Centerpoint-Versuchen.
Filtration: Auswertung und Diskussion
71
Abbildung 58 zeigt ähnlich wie Abbildung 49 noch einmal die ermittelten Filtrationsergebnisse
bezogen auf die Produktausbeute. Die laufende Nummer entspricht dabei allerdings nicht der
Reihenfolge der durchgeführten Versuche. Vielmehr liegt zur Auswertung eine eigene Nummerierung
in MODDE vor. Die Entsprechung dieser Nummer mit den zugehörigen Parametereinstellungen ist in
Tabelle 13 dargestellt. Zur Vereinfachung dieser Bezeichnung wird der Versuchsnummerierung der
durchgeführten Versuche ein „P“ vorangestellt.
Tabelle 13: Entsprechung der Prozessnummern während der Filtration zu den automatisch
vergebenen Versuchsnummern in MODDE für den Prozess B028.
Prozessnummer Versuchsnummer
MODDE
Scherrate Membranflux Membranporengröße
[-] [-] [s-1
] [l m-2
h-1
] [kDa]
P004 2 8000 40 750
P005 4 12000 20 750
P006 9 16000 60 750
P007 8 16000 40 500
P008 1 8000 20 500
P009 6 12000 60 500
P010 5 12000 40 1000
P011 7 16000 20 1000
P012 3 8000 60 1000
P013 10 12000 40 750
P014 11 12000 40 750
Versuch Nr. 10 und 11 im Replication Plot stellen die Centerpoint-Versuche dar. Sie entsprechen der
gleichen Parameterkonstellation und können deshalb zur Analyse der Reproduzierbarkeit
herangezogen werden. Dabei sollte die Differenz dieser beiden Versuche nicht größer sein als der
allgemeine Unterschied zwischen allen Ergebnissen. Dieser Sachverhalt spiegelt sich auch im
Summary of Fit wider.
Abbildung 59: Histogramm der
Versuchsergebnisse bezogen auf
die Proteinausbeute des Prozesses
B028. Die Versuchsergebnisse
erinnern unter optimalen
Bedingungen an eine Normal-
verteilung.
Filtration: Auswertung und Diskussion
72
Abbildung 59 zeigt das Histogramm zu den Versuchen des Prozesses B028. Dabei sind immer
Ergebnisse zwischen zwei Grenzwerten zu einer Gruppe zusammengefasst und die Häufigkeit dieser
Klasse aufgetragen worden. Im Idealfall erscheint dabei eine Normalverteilung.
In der Abbildung ist außerdem zu sehen, dass die Versuchsparameter ausgeglichen ausgewählt worden
sind. Es scheint einen Bereich für die Proteinausbeute zu geben, in den das Maximum der Versuche
fällt. Ergebnisse mit mehr oder weniger Ausbeute kommen dabei, einigermaßen normalverteilt,
entsprechend weniger vor. Dies kann Grundlage für eine aussagekräftige Versuchsauswertung sein.
Abbildung 60: Summary of Fit des Prozesses B028.
Abbildung 60 zeigt eines der aussagekräftigsten Diagramme in Bezug auf die Analyse mit DoE, das
bereits erwähnte Summary of Fit. Dabei werden die Versuchsergebnisse in Hinblick auf das gewählte
Modell bewertet. Der Korrelationsfaktor R² ist dabei ein Parameter für die Auswahl des richtigen
Modells und gibt an, wie gut das Modell auf die Versuchsergebnisse passt. In diesem Fall ist ein
lineares Modell, das sogenannte L9, gewählt worden, um das Arbeitsschema der durchzuführenden
Experimente zu erstellen. Ein signifikantes Modell sollte einen Korrelationsfaktor von größer als 0,5
erhalten. Schaut man auf das R² in Abbildung 60, so ist dies für den Ausgangsparameter Recovery
nicht zu sehen. Der Korrelationsfaktor liegt mit 0,4 knapp unter diesem Minimalwert. Anders verhält
es sich beim Ausgangsparameter Process time. Hier kann ein Wert größer als 0,9 festgestellt werden,
der für eine gute Annäherung der Daten an das System spricht. Als zweiten Auswertungsfaktor kann
man in der Darstellung Q² erkennen. Q² beschreibt die Aussagekraft und die Genauigkeit der
Vorhersage des gewählten Modells in Anlehnung an die ermittelten Versuchsergebnisse. Für ein
signifikantes Modell sollte Q² daher größer als 0,1 und für ein gutes Modell größer als 0,5 sein.
Betrachtet man in Abbildung 60 nun diesen Faktor für die Proteinausbeute, so muss leider festgestellt
werden, dass der Wert sogar im negativen, also deutlich unter 0,1 liegt. Das angenäherte Modell hat
Filtration: Auswertung und Diskussion
73
demnach wenig Vorhersagekraft auf kommende Versuche. Anders sieht es dagegen bei der
Auswertung der Prozesszeit aus. Ein Q²-Wert von annähernd 0,8 spricht für eine sehr gute
Vorhersagekraft des Modells bezogen auf diese Ausgangsgröße. Der gelbe Balken steht für die
Modell-Validität. Diese beinhaltet diverse Modellprobleme, wie das Vorhandensein von Ausreißern,
eines inkorrekten Modells oder der falschen Transformation der Messwerte. Ein signifikantes Modell
sollte einen Wert größer als 0,25 vorweisen. In Abbildung 60 ist zu sehen, dass die Modell-Validität
bezogen auf die Proteinausbeute mit einem Wert von 0,7 sehr gut ist, was für ein valides Modell
spricht, obwohl der Q²-Faktor vorher etwas anderes prognostiziert hat. Komplett gegenteilig verhält ist
es sich bei der Analyse der Prozesszeit. Hier kann nach einem guten Q²-Wert nur eine geringe Modell-
Validität verzeichnet werden. Dieses Verhalten ist typisch bei einem hohen Wert der Modell-
Reproduzierbarkeit, der als letzter Faktor in hellblau dargestellt ist. Dieser Wert bezieht sich auf die
bereits erwähnten Centerpoint-Versuche. Dabei wird anhand der beiden mit gleichen Parametern
durchgeführten Versuchsergebnisse die Reproduzierbarkeit eines Resultats (in diesem Fall der
Ausbeute oder der Prozesszeit) analysiert und auf das Gesamttestsystem übertragen. Es kann also eine
Vorhersage getroffen werden, inwiefern die ermittelten Ergebnisse überhaupt auswertbar sind. Die
Schwankung innerhalb der Centerpoint-Versuche sollte dabei wesentlich geringer sein als die
Unterschiede in den Resultaten aller anderen Versuchskonstellationen. Die Reproduzierbarkeit ist wie
in Abbildung 60 zu sehen bei beiden Ausgangsparametern sehr gut, bei der Prozesszeit sogar
annähernd 1.
Abbildung 61: Coeffient Plot für die Scherrate (SR), den Membranflux (Flux) und die Porengröße
(PS) des Prozesses B028 bezogen auf die Proteinausbeute.
In Abbildung 61 ist der Coefficient Plot zu sehen. In dieser graphischen Darstellung sind die
Eingangsparameter einzeln und ihre Auswirkung auf einen ausgewählten Ausgangsparameter zu
sehen. Über jedem Balken für die Größe des Einflusses ist die Schwankungsbreite des jeweiligen
Eingangsparameters dargestellt. Dabei können signifikante und nicht signifikante Modellterme
Filtration: Auswertung und Diskussion
74
unterschieden werden. Bei signifikanten Modellparametern reicht die Schwankungsbreite nur einseitig
aus dem Einflussfaktor ( ), so dass der Trend trotz Schwankungen erhalten bleibt. Bei nicht
signifikanten Parametern reicht die Schwankungsbreite sowohl oben als auch unten aus dem
Einflussbalken heraus( ), so dass nicht mit Sicherheit gesagt werden kann, ob der Einfluss dieses
Faktors wirklich positiv oder negativ ist. In der Abbildung wird deutlich, dass keiner der
Eingangsparameter wirklich einen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis der Proteinausbeute zu
haben scheint. Beim Membranflux (Flux) und der Porengröße (PS) scheint der gesamte Einfluss
marginal zu sein. Lediglich die Scherrate hat laut Abbildung einen bedeutenderen Einfluss, so dass die
Proteinausbeute mit größerer Scherrate steigt. Aufgrund der Schwankungsbreite ist allerdings nicht
mit vollständiger Sicherheit zu sagen, ob diese Auswirkungen wirklich positiv sind.
Abbildung 62: Auftragung der erwarteten
Werte zu den erhaltenen Werten für das
ausgewählte Modell des Prozesses B028.
Die gewählte Ausgangsgröße ist hier die
Proteinausbeute.
Abbildung 66 zeigt die Auftragung der erwarteten Ergebnisse zu den tatsächlich ermittelten. Dabei
wird das vorher bestimmte Regressionsmodell herangezogen und vorhergesagt, welche Versuche
demnach welche Ergebnisse haben sollten. Im Idealfall kann hier eine Gerade zwischen Observed und
Predicted beobachtet werden. In der dargestellten Abbildung zu Prozess B028 ist dies leider nicht
wirklich der Fall, so dass sich für eine mögliche Regressionsgerade der Punkte nur ein
Regressionsfaktor von 0,355 ergibt. Dies spricht für ein Modell, das nicht exakt zu dem
Versuchsaufbau und den untersuchten Parametern passt oder für eine Interaktion der Faktoren
untereinander, die mit dem gewählten Modell nicht untersucht werden konnte.
Filtration: Auswertung und Diskussion
75
In den Abbildungen 63-65 ist noch einmal graphisch das ermittelte Modell mit den vorhergesagten
Ergebnissen dargestellt. In jeder Abbildung wird dabei die Porengröße bei definierter Einstellung
konstant gehalten. Deutlich sichtbar ist in jeder dieser Darstellungen die Abhängigkeit der
Proteinausbeute von der Scherrate. Bei konstanter Porengröße und gleich bleibendem Flux kann die
Recovery bei Erhöhung der Scherrate um 6 bis 7% zunehmen. Der Flux hat bei konstanter Scherrate
nur relativ wenig Einfluss auf das Gesamtergebnis und auch die Porengröße erscheint beim
Vergleichen der 3 Abbildungen nur wenig signifikant. Bezieht man die Bewertungen des gewählten
Abbildung 63: Contour Plot des Prozesses B028
für die Recovery. Feste Porengröße ist dabei 500
kDa. Deutlich sind der größere Einfluss der
Scherrate und der kleinere Einfluss des
Membranfluxes auf das Ergebnis zu sehen.
Abbildung 64: Contour Plot des Prozesses B028
für die Recovery. Feste Porengröße ist dabei 750
kDa. Die Abhängigkeiten sind vergleichbar mit
den Prognosen für 500 kDa.
Abbildung 65: Contour Plot des Prozesses B028
für die Recovery. Feste Porengröße ist dabei 0,1
µm. Die Ergebnisse sind nahezu identisch zu
den anderen dargestellten Porengrößen.
Filtration: Auswertung und Diskussion
76
Modells und die Signifikanz der 3 Einflussgrößen allerdings mit in diese Ergebnisbetrachtung ein,
muss festgestellt werden, dass diese Vorhersage nur wenig Relevanz besitzt. Es scheint dabei einen
positiven Einfluss bei Erhöhung der Scherrate zu geben, mit Sicherheit kann man dies allerdings nicht
sagen. Zur weiteren Diskussion ist daher noch ein anderes DoE-Modell gewählt worden, mit dem die
gleichen Versuchsergebnisse unter verwendeter Parameterkonstellation ausgewertet werden. Dieses
vollfaktorielle Design ermöglicht zusätzlich die Analyse der Wechselwirkungen zwischen den
einzelnen Eingangsparametern.
Abbildung 66: Summary of Fit für die
Auswertung des Prozesses B028 mit
vollfaktoriellem Design für die
Recovery. Das R2 konnte durch dieses
Modell erheblich gesteigert werden.
Abbildung 66 zeigt, dass das gewählte Modell etwas besser zu den Versuchsergebnissen und damit
zum untersuchten Prozess passt. Dies wird im Wesentlichen an dem R2-Faktor deutlich, der mit über
0,7 jetzt eine verwertbare Annäherung der Daten an die MODDE-Matrix angibt. Die anderen
dargestellten Modellfaktoren sind allerdings wenig verändert.
Abbildung 67: Coefficient Plot für das vollfaktorielle Design des Prozesses B028 bezogen auf die
Recovery. Neben den Einzeleinflüssen können jetzt auch Interaktionen zwischen Parametern
untersucht werden.
Filtration: Auswertung und Diskussion
77
In Abbildung 67 ist der erweiterte Coefficient Plot für das vollfaktorielle DoE-Design mit den
zusätzlich analysierten Parameterinteraktionen zu sehen. Sofort sichtbar ist hier, dass die
Schwankungsbreite der Scherrate fast gänzlich im Positiven liegt, es kann hier also ein ansatzweise
signifikanter Einfluss festgestellt werden. Interessant ist der ermittelte Einfluss der Porengröße (PS),
der mit dem gewählten Analysemodell plötzlich wesentlich negativer erscheint, wenngleich nicht
signifikant. Eine Vergrößerung der Porengröße hätte demnach eine Verringerung der Proteinausbeute
zur Folge. Ebenfalls interessant ist der ermittelte Einfluss der Scherrate in Interaktion mit dem
Membranflux. So hat eine Vergrößerung der Scherrate parallel zur Erhöhung des Membranfluxes laut
Modell einen negativen Einfluss auf die Recovery, wohingegen die beiden Einzelgrößen eher einen
positiven Einfluss besitzen. Diese Schlussfolgerungen sind aber mit Vorsicht zu betrachten, da die
Schwankungsbreite bei allen genannten Koeffizienten so groß ist, dass keine genaue Aussage
getroffen werden kann. Der Einfluss des Membranfluxes beispielsweise erscheint im Diagramm zwar
leicht positiv, aufgrund der großen angegebenen Schwankung könnte er aber theoretisch auch weit im
negativen Bereich liegen.
Abbildung 68: Auftragung der erwarteten und ermittelten Werte für die Proteinausbeute mit
vollfaktoriellem Design.
In Abbildung 68 ist noch einmal die Auftragung der erwarteten und tatsächlich gemessenen
Ergebnisse für das vollfaktorielle Modell dargestellt. Sofort sichtbar ist der gestiegene
Korrelationsfaktor R², was für eine Verbesserung des gewählten Modells spricht und auch optisch
liegen die Werte weitestgehend mehr auf einer Geraden. Dabei ist deutlich ein Cluster im mittleren
Bereich der Messwerte zu verzeichnen.
Filtration: Auswertung und Diskussion
78
7.2. DOE-AUSWERTUNG B082
Abbildung 69: Modellumgebung der Parameterkonstellation für die Filtration des Prozesses B082.
Die Versuchsmatrix für die DoE-Versuchsplanung des Prozesses B082 entspricht dem Modell für
B028. In Abbildung 69 fallen allerdings besonders die vielen hohen Versuchsergebnisse auf. Diese
lassen sich auf ein einziges sehr niedriges Versuchsergebnis zurückführen, durch das der
Ergebnisbereich wesentlich breiter geworden ist. Der Hauptteil der anderen Resultate liegt im
Gesamtbereich im oberen Drittel und wird deshalb als hohes Ergebnis bezeichnet.
Abbildung 70: Replication Plot der Versuchsergebnisse des Prozesses B082 bezogen auf die
Recovery. Die Nummerierung entspricht den MODDE-Versuchsnummern. Versuch Nr. 10 und 11
stellen die Centerpoint-Versuche dar.
Wie bei Prozess B028 erfolgt auch hier zuerst die Darstellung der Versuchsergebnisse im Replication
Plot. Es kann eine recht breite Verteilung der Ergebnisse festgestellt werden. Die beiden Centerpoint-
Versuche liegen dabei dichter zusammen als der durchschnittliche Unterschied der
Versuchsergebnisse, was für eine gute Reproduzierbarkeit spricht.
Filtration: Auswertung und Diskussion
79
Tabelle 14: : Entsprechung der Prozessnummern während der Filtration zu den automatisch
vergebenen Versuchsnummern in MODDE für den Prozess B082.
Prozessnummer Versuchsnummer
MODDE
Scherrate Membranflux Membranporengröße
[-] [-] [s-1
] [l m-2
h-1
] [kDa]
P003 2 8000 25 750
P004 9 16000 35 750
P005 4 12000 15 750
P006 1 8000 15 500
P007 8 16000 25 500
P008 6 12000 35 500
P009 3 8000 35 1000
P010 7 16000 15 1000
P011 5 12000 25 1000
P012 10 12000 25 750
P013 11 12000 25 750
Abbildung 71: Histogramm des Prozesses B082 bezogen auf die Recovery. Neben der einigermaßen
normalverteilten Hauptmenge der Versuche existiert ein Ergebnis abseits.
Im Histogramm in Abbildung 71 ist die Verteilung der Resultate des Filtrationsprozesses B082 und
deren Häufigkeit zu sehen. Auffallend ist dabei die Häufigkeit der Ergebnisse zwischen 77 und 78%,
wobei diese Bereichsgrenzen relativ weit gewählt sind. Dabei grenzt die Verteilung bis an das
maximal erreichbare Ergebnis von 100%, das aufgrund der Versuchsanordnung nicht überschritten
werden kann. Eine Parameterkonstellation lieferte ein besonders niedriges Ergebnis, das im
Histogramm links abseits der anderen Versuche erscheint.
Filtration: Auswertung und Diskussion
80
Abbildung 72: Summary of Fit B082
Das Summary of Fit des Prozesses B082 enthält eine Bewertung des ausgewählten Modells zur
Analyse der Filtrationsergebnisse. Der Korrelationsfaktor für die Recovery ist mit 0,3 sehr niedrig und
der Q²-Faktor reicht sogar bis ins Negative, was dafür spricht, dass das ausgewählte Modell nicht
optimal zu der Versuchsdurchführung und den Resultaten passt. Dem widerspricht allerdings die
Modell-Validität, die im Summary of Fit mit einem Wert von 0,7 recht hoch eingeschätzt wird. Die
Reproduzierbarkeit ist, wie bereits im Replicate Plot erwartet, hoch. Bei der Prozesszeit sind ein guter
Korellationsfaktor und eine sehr gute Reproduzierbarkeit zu verzeichnen, während der Q²-Faktor und
die Modell-Validität überraschenderweise gering ausfallen. Da die Prozesszeit allerdings in der DoE-
Auswertung aufgrund der geringen Einflussnahme nicht im Zentrum der Filtrationsbewertung steht,
sind diese Werte weniger von Bedeutung.
Betrachtet man den Coefficient Plot des linearen
Modells L9 für den Prozess B082, so erkennt
man minimal positive Einflüsse auf die
Proteinausbeute und minimal negative
Beeinflussung durch den Membranflux und die
Porengröße. Die Schwankung dieser Ergebnisse
ist allerdings bei allen 3 Einflussgrößen so groß,
dass keiner der Eingangsparameter für das
gewählte Modell als signifikant bezeichnet
werden kann. Aufgrund der Schwankungen
lassen sich also nur Tendenzen auswerten.
Abbildung 73: Coefficient Plot B082.
Filtration: Auswertung und Diskussion
81
Abbildung 74: Auftragung der tatsächlich ermittelten Werte des Prozesses B082 gegen die
aufgrund der DoE-Auswertung erwarteten. Versuch Nummer 3 liegt wie auch schon in den anderen
Plots dargestellt etwas abseits, der Rest bildet ein relatives breites Cluster im oberen Bereich der
Ausbeute.
Wie bereits aus den anderen analysierten Graphen der DoE-Auswertung für den Prozess B082
hervorgeht, kann mit dem ausgewählten Modell keine sichere Aussage über das Verhalten der
Ausgangsgröße Proteinausbeute getroffen werden, da die Annäherung des linearen Modells nur
ungenügend auf das Versuchssystem und die gewählten Parameter passt. Aus diesem Grund ist wie
bei Prozess B028 noch einmal eine Auswertung der gleichen Ergebnisse mit einem vollfaktoriellen
Design vorgenommen worden, um eventuelle Interaktionen der Faktoren untereinander und damit eine
bessere Modellannäherung feststellen zu können.
Abbildung 75: Summary of Fit des Prozesses B082 mit dem vollfaktoriellen Design. Deutlich
sichtbar ist der enorm gestiegene Wert für R2.
Filtration: Auswertung und Diskussion
82
Wie in Abbildung 75 zu sehen, kann mit dem neuen Modell ein erheblich gesteigerter Wert für R2
festgestellt werden. Der Wert, der annähernd bei 1 liegt, weist darauf hin, dass die ermittelten Daten
sich sehr gut auf das gewählte Modell beziehen lassen. Zwar sind auch der Q2-Wert und die Modell-
Validität gestiegen, allerdings nicht so signifikant wie der Korrelationsfaktor.
Abbildung 76: Coefficient Plot des
vollfaktoriellen Designs des
Prozesses B082 mit Interaktionen
zwischen den Einflussgrößen.
Deutlich sichtbar ist der
signifikante Einfluss der Scherrate
in Interaktion mit dem
Membranflux.
Betrachtet man mit dem neuen Modell nun den Coefficient Plot, so blickt man auf ein völlig anderes
Bild der Einflussnahme. Während die Scherrate vorher noch leicht positiv dargestellt wurde, ergibt
sich jetzt ein nahezu nichtiger Einfluss, allerdings mit großer Schwankung, während die Porengröße,
die vorher eher negativ dargestellt war, jetzt leicht positiv beeinflusst. Am herausragendsten erscheint
allerdings die Interaktion zwischen der Scherrate und dem Membranflux, die im Zusammenspiel ein
deutlich positives und signifikantes Ergebnis für die Proteinwiederfindungsrate bewirken. Daraus ist
also abzuleiten, dass eine gleichzeitige Erhöhung der Scherrate und des Membranfluxes eine
Verbesserung der Ausbeute um einen erheblichen Faktor bewirken kann.
Abbildung 77: Auftragung der ermittelten Werte des Prozesses B082 für die Proteinausbeute
gegen die aufgrund des vollfaktoriellen Designs erwarteteten.
Filtration: Auswertung und Diskussion
83
In Abbildung 77 erkennt man die erhebliche Verbesserung des Modells durch Einführung eines
vollfaktoriellen Designs. Es befindet sich zwar immer noch ein recht großes Cluster an Ergebnissen in
der Mitte in Abbildung 77, allerdings ist durch das gewählte Modell auch eine recht genaue
Vorhersage der Extrempunkte in den Ecken des Diagramms möglich, so dass insgesamt eine sehr
genaue und lineare Regression möglich ist, wofür auch der hohe Regressionskoeffizient von 0,952
spricht. Dabei fällt vor allem Versuch Nummer 3 auf, der sehr weit abseits der restlichen Punkte liegt
und der aufgrund seiner Lage enorm zur erfolgreichen Regression beiträgt. Um den Einfluss dieser
einen Parameterkonstellation zu verdeutlichen, wurde der Messwert beispielsweise aus der Analyse
ausgeschlossen. Daraus ergeben sich dann folgende Diagramme:
Abbildung 78: Auftragung der tatsächlich ermittelten Werte des Prozesses B082 gegen die
aufgrund der DoE-Auswertung erwarteten. Dabei wurde Versuch Nummer 3 aus der Auswertung
ausgeschlossen.
In Abbildung 78 ist das Ergebnis eines solchen Ausschlusses dargestellt. Interessanterweise kann auch
ohne den Messwert Nummer 3 noch eine gute Regression und Vorhersage mit dem gewählten Modell
gemacht werden. Dies spricht für das vollfaktorielle Design und die Robustheit der erarbeiteten
Aussagen. Betrachtet man allerdings Abbildung 79, ist zu erkennen, dass keine genauen Aussagen
mehr zu den Einflüssen der einzelnen Parameter gemacht werden können und sich das Ergebnis
aufgrund eines einzelnen ausgeschlossenen Versuchs schnell verändern kann.
Filtration: Auswertung und Diskussion
84
Abbildung 79: Coefficient
Plot für das vollfaktorielle
Modell des Prozesses B082.
Versuch Nummer 3 wurde
dabei ausgeschlossen.
Letztendlich zeigt dieser kurze Exkurs also, dass das grundsätzliche Modell zwar bestehen bleibt, die
Aussagekraft aber erheblich sinkt, wenn ein wichtiges Resultat wie bei Versuchsnummer 3
ausgeschlossen wird.
7.3. DISKUSSION UND VERGLEICH
Wie bereits in Kapitel 3.2.4 bei der Aufzählung der aktuellen Forschungsergebnisse erwähnt, können
viele Faktoren die Filtrationsleistung und das Verhalten des Lysats auf der Membran beeinflussen. So
ist es wenig verwunderlich, dass bei den Vorversuchen der beiden untersuchten Filtrationsprozesse ein
recht unterschiedliches Ergebnis detektiert werden konnte. Um die entscheidenden Einflussfaktoren
herauszufiltern, wurde darauf geachtet, möglichst viele Parameter konstant und bei beiden Projekten
gleich zu lassen. Zu diesen Parametern gehören die Temperatur, die Rührerdrehzahl im Reservoir, das
Aufschlussverfahren, der Systemdruck und das verwendete Membranmaterial.
Während das Zelllysat aus Prozess B028 recht gute Filtrationseigenschaften aufweist, hohe
Membranflüsse zulässt und weit konzentriert werden kann, ist im Prozess B082 das Gegenteil der Fall.
Das Zelllysat scheint sehr zähflüssig und kaum zu konzentrieren.
Auch wenn die Ergebnisse der beiden DoE-Auswertungen aufgrund der begrenzten Anzahl der
Versuche und der beschränkten Möglichkeiten bei der Auswahl des Modells nicht immer vollständig
signifikant und statistisch einzuordnen waren, lässt sich für beide Prozesse ein grundlegendes Ergebnis
feststellen. Dabei sind allerdings die Ungenauigkeit des verwendeten Gelsystems, die diskutierten
Verdünnungsreihen und die Ergebnisse der Löslich/Unlöslich-Gele zu berücksichtigen. So ist
anzunehmen, dass bei den jeweiligen Prozessen immer nur maximal der unlösliche (B028) bzw.
lösliche (B082) Anteil des Produktes bei der Filtration wiedergewonnen werden kann. Höhere
Proteinausbeuten deuten auf Ungenauigkeiten des analytischen Systems hin.
Filtration: Auswertung und Diskussion
85
Bei Prozess B028 scheint es sich um eine sehr stabile Filtration zu handeln. Die Wahl der
Parametergrenzen und die ausgeführten Versuche führten nur zu kleinen Schwankungen in der sonst
sehr stabilen Proteinausbeute. Sowohl bei der Auswertung des linearen L9-Modells als auch bei der
Analyse mit Hilfe des vollfaktoriellen Designs scheint sich ein leicht positiver Einfluss der Scherrate
zu ergeben, der sich auch in den gemessenen Ergebnissen widerspiegelt. Überraschend ist hier
allerdings der geringe Einfluss des Membranfluxes und der Porengröße, die bei beiden
Auswertemethoden keinen wirklich signifikanten Einfluss auf die Proteinwiederfindungsrate zu haben
scheinen. Dabei sind die Prozessbedingungen allerdings auch in nicht so extremen Bereich
durchgeführt worden wie teilweise im Prozess B082. Für eine sichere Aussage wären demnach
eventuell Versuche mit extremeren Parametereinstellungen nötig, da die jetzigen Prozessbedingungen
zu stabile und eventuell auch zu hohe Werte lieferten.
In Prozess B082 gab es im Gegensatz dazu bei der Auswertung mittels linearen L9-Designs keine
klare Aussage über den Einfluss eines der Eingangsparameter. Erst durch die Ermittlung der
Interaktion der Prozessgrößen untereinander konnte eine signifikante Abhängigkeit des
Filtrationsergebnisses von der Scherrate mit dem Membranflux detektiert werden. Dabei ist zu sehen,
dass eine Erhöhung des Membranfluxes auch eine Erhöhung der Scherrate nach sich ziehen sollte.
Zwischen diesen beiden Einflussgrößen scheint es eine prozessrelevante Interaktion zu geben und so
kann man in Abbildung 77 sehr gut erkennen, dass die Parameterkonstellationen bei einem
ungünstigen Verhältnis einer niedrigen Scherrate und eines hohen Membranfluxes extrem niedrige
Proteinwiederfindungsraten erzielen. Besonders hohe Ausbeuten sind allerdings entweder durch
Kombination einer hohen Scherrate mit einem hohen Membranflux (Versuchsnummer 9 – B082) oder
einer niedrigen Scherrate mit einem niedrigen Membranflux (Versuchsnummer 1 – B082) zu
erreichen. Es scheint also nicht direkt auf die Größe eines dieser Parameter anzukommen, sondern
eher auf das richtige Verhältnis der beiden Einzeleinflussgrößen.
Mit Vorsicht sollte bei der Auswertung beider Prozesse jedoch die Höhe der ermittelten
Proteinausbeute betrachtet werden, da sich durch die Ungenauigkeit des Gelsystems und das Verhalten
des Proteins nicht zwingend exakte Angaben über die Höhe der Proteinkonzentration machen lassen.
Gleichbleibend ist allerdings das Verhältnis der Proben untereinander und so ist die Analyse über die
Recovery durchaus möglich.
Weitgehend ohne Einfluss ist allerdings dieses Mal wieder die Porengröße. Dabei ist zu diskutieren,
ob es sich bei den gewählten Porengrößen überhaupt um systemverändernde Variationsbreiten handelt
oder ob der Wechsel von einer 500 kDa-Membran auf eine 0,1 µm-Membran gar keinen Einfluss auf
das Ergebnis haben konnte. In Prozess B028 wurden die Inclusion Bodies durch die Membran
zurückgehalten. Diese interzellularen Einschlusskörper sind eventuell so groß, dass die gewählte
Porengröße schlicht alle dieser Einschlusskörper zurückhielt. Dabei scheint der gewählte
Variationsbereich zumindest für den Ausgangsparameter Recovery wenig relevant zu sein. Zu
Fazit
86
erwarten wäre eine sichtbare Änderung eventuell bei wesentlich größeren Porensystemen. Während
der gewählte Arbeitsbereich der Porengröße zwar keinen sichtbaren Einfluss auf die Proteinausbeute
hat, kann aber trotzdem ein Unterschied in der Reinheit festzustellen sein. Bei größeren Poren können
mehr und größere zellinterne Wirtszellproteine durch die Membran gelangen, während die Inclusion
Bodies noch zurückgehalten werden. Das Produkt liegt danach also in einer reineren Form vor.
Demnach wäre tendenziell eher eine größere Ausschlussgrenze von Vorteil. Dieser Sachverhalt konnte
im Rahmen des in der Bachelorarbeit verwendeten Testsystems allerdings nicht abgebildet werden.
Genau gegenteilig verhält es sich bei Prozess B082. Auch hier scheint die Porengröße im Bereich
zwischen 500 kDa und 0,1µm wenig Einfluss auf die Proteinwiederfindungsrate zu haben, tendenziell
wäre aber eine eher kleinere Porengröße von Vorteil. Das etwa 20 kDa große Protein könnte auch bei
kleineren Ausschlussgrenzen noch die Membran passieren, während größere Wirtszellproteine hinter
der Membran zurückgehalten würden. So wäre das Produkt im Permeat in reinerer Form zu finden.
Zu untersuchen ist bei beiden Prozessen allerdings die Machbarkeit der eher problematischen
Zelllysatfiltration mit den kleineren und größeren Porengrößen, da es unter Umständen zu
Verblockungen und Fouling kommen könnte.
8. FAZIT
Im Rahmen der Bachelorarbeit konnte das dargestellte Prozessschema für beide firmeninternen
Projekte erfolgreich durchgeführt und in den Projektablauf integriert werden. Dazu gehörten im
Upstream-Bereich die Aufnahme der Wachstumskurven der rekombinanten Zellstämme im
Schüttelkolben und die Fermentationsvor- und nachbereitung sowie die Produktion der Zellmasse und
des rekombinanten Proteins im 1-Liter-Fermentersystem. Im Zuge dieser Fermentation konnte ein
erfolgreiches Scale-down vom 10-Liter-Maßstab auf den 1-Liter-Maßstab durchgeführt und diskutiert
werden. Im Bereich des Downstream konnte die produzierte Zellmasse projektspezifisch und
vergleichbar aufgeschlossen werden, so dass möglichst konstante und analoge Ausgangsbedingungen
für die anschließende Querstromfiltration geschaffen wurden. Im Rahmen der Versuchsplanung mit
Hilfe des Design of Experiments wurde eine Versuchslandschaft festgelegt, um die Abhängigkeit der
Ausgangsparameter bei Variation der Eingangsgrößen festzustellen und ein entsprechendes
Vorhersagemodell mit dem Programm MODDE zu ermitteln. Dabei wurden 2 verschiedene Designs,
L9 und das vollfaktorielle Interaktionsmodell, zur Datenauswertung verwendet und die Ergebnisse
verglichen.
Bei der Auswertung der Versuche fiel bei beiden Projekten die vergleichsweise hohe Ausbeute bei den
meisten Parameterkonstellationen auf. Einen bedeutenden Einfluss im Variationsbereich scheint die
Scherrate in Interaktion mit dem Membranflux zu besitzen. In Prozess B028 konnte eine teilweise
Fazit
87
starke Abhängigkeit des Filtrationsergebnisses von der Scherrate ermittelt werden. Dabei führen hohe
Scherraten zu guten Proteinausbeuten. In Prozess B082 ist weniger die Größe der Einzeleinflüsse,
sondern vielmehr die Kombination beider Parameter Scherrate und Flux im richtigen Verhältnis von
Bedeutung. Dabei konnten sowohl hohe Proteinausbeuten bei hoher Scherrate und hohem Flux als
auch bei niedriger Scherrate und niedrigem Membranflux ermittelt werden. Das optimale Verhältnis
beider Eingangsparameter ist allerdings noch genauer zu bestimmen.
Es ist zu vermuten, dass unter extremeren Prozessbedingungen bei der Filtration des Projektes B028
auch ein stärkerer Einfluss durch die Interaktion der Scherrate und des Fluxes zu verzeichnen ist.
Beide Filtrationen scheinen allerdings im gewählten Arbeitsbereich für die Porengröße wenig
Variation und Abhängigkeit im Bezug auf die Proteinausbeute zu besitzen. Vermutlich ist die
gewählte Analysebreite entweder zu klein oder statisch positioniert gewesen. Bei Prozess B028 ist zu
vermuten, dass größere Porengrößen eine größere Reinheit des Produktes im Retentat bewirken, bei
Prozess B082 sollten eher kleinere Ausschlussgrenzen für die Reinheit von Vorteil sein.
Im Rahmen dieser Bachelorarbeit konnten also die gute Durchführbarkeit der Filtration im
Tangentialflussverfahren in den Projektabläufen und die damit einhergehenden hohen Ausbeuten
gezeigt und diskutiert werden. Es konnte das grundlegende Verhalten der beiden unterschiedlichen
Zelllysate während des Filtrationsschrittes charakterisiert und in den Prozess eingebunden und eine
Tendenz der wichtigen Einflussgrößen detektiert werden. Dabei wurde das Filtrationsverfahren in der
Firma auf der ÄKTAcrossflow™ eingeführt, umgesetzt und ausgewertet. Zur weiteren Etablierung im
Projektverlauf sollten allerdings noch weitere Screening- und Optimierungsläufe durchgeführt werden,
bei denen die Filtration auch in den Gesamtaufreinigungsprozess eingebunden werden kann.
Anhang
88
9. ANHANG
9.1. QUELLENANGABEN
[1] Bailey, M., Meagher, M.: Crossflow Microfiltration of Recombinant Escherichia coli
Lysates after High Pressure Homogenization, Papers in Biotechnology, paper 17 (1997)
[2] Bailey, Meagher: Crossflow Microfiltration of Recombinant Escherichia coli Lysates after
High Pressure Homogenization, Biotechnol. Bioeng. 56, pp. 304-310 (1997)
[3] Bailey, Meagher: Separation of soluble protein from inclusion bodies in Escherichia coli
lysate using crossflow microfiltration, journal of Membrane Science 166, pp. 137-146 (2000)
[4] Bowen, Blake, Cohen, Walsh: Optimizing Clarification and Concentration Steps Using an
Automated Process System and Design of Experiments (DoE), BioProcessing Journal (2010)
[5] Chmiel, Horst: Bioprozesstechnik, 3. Auflage (2011)
[6] Cornelissen, Prof. Dr. Gesine: HAW Hamburg, Skript zur Vorlesung Aufarbeitungs- und
Reinigungsverfahren, Stand WS 2010/2011
[7] Field, Wu, Howell, Gupta: Critical flux concept for microfiltration fouling, Journal of
Membrane Science 100, pp. 259-272 (1995)
[8] Frenander, Jönsson: Cell harvesting by cross-flow microfiltration using a shear-enhanced
module, Biotechnology and Bioengineering, Volume 52, Issue 3, pp. 397-403 (Nov. 1996)
[9] GE Healthcare: ÄKTAcrossflow automated cross flow filtration for process development,
Data File 11-0032-71 AB
[10] GE Healthcare: Automated Microfiltration using Äkta Crossflow, Application note 28-
4063-76 AA
[11] GE Healthcare: Factors for successful clarification and cell harvesting, Technical Brief 18-
1171-59 AA
[12] GE Healthcare: Factors for successful clarification and cell harvesting, Technical Brief 18-
1171-59 AA
[13] GE Healthcare: Life Sciences, Knut Kuss: Seminar Filtration
[14] GE Healthcare: MEM 1 Process Optimization 7D7 (2008)
Anhang
89
[15] GE Healthcare: Operating Handbook: Hollow fiber cartridges for membrane separations,
18-1165-30 AB
[16] Kayser, Oliver: Pharmaceutical Biotechnology, Wiley-VCH, 1. edition (April 12, 2004)
[17] L. Eriksson et al. : Design of Experiments, Principles and Applications, Umetrics (Jan.
2008)
[18] Ledung, Eriksson, Oscarsson: A strategic crossflow filtration methodology for the initial
purification of promegapoietin from inclusion bodies, Journal of Biotechnology 141, pp. 64-
72 (2009)
[19] Meagher et al.: Extraction of rIL-2 Inclusion Bodies from Escherichia coli Using Cross-
Flow Filtration, Biotechnology and Bioengineering, Vol.43, pp. 969-977 (1994)
[20] Meyer et al.: Analysis and Simulation of Complex Interactions During Dynamic
Microfiltration of Escherichia coli Suspensions, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 59,
No. 2 (20. Juli 1998)
[21] Seidel, Cesare: Improving Primary Recovery, Genetic Engineering & Biotechnology News,
Vol. 31, No. 15 (2011)
[22] Terpe, Kay: Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production:
from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, Appl. Microbiol.
Biotechnol. (2006) 72:211-222
[23] Venkiteshwaran et al.: Optimized Removal of Soluble Host Cell Proteins fort he Recovery
of met-Human Growth Hormone Inclusion Bodies from Escherichia coli Cell Lysate Using
Corssflow Microfiltration, Biotechnol. Prog., Vol. 23, No. 3 (2007)
[24] Wang et al.: Harvest comparison: Comparison of Different Options for Harvest of a
Therapeutic Protein Product from High Density Yeast Fermentation Broth, Biotechnology
and Bioengineering Vol. 94, pp. 91-104 (2006)
Anhang
90
9.2. EINGESETZTE MEDIEN UND PUFFER
Tabelle 15: Zusammensetzung des Vorkultur- und Fermentationsmediums des Prozesses B028
Substanz Massenanteil im Medium [%]
Soja-Pepton 2,7
Hefeextrakt 1,4
NaCl 0,5
K2HPO4 0,6
KH2PO4 0,3
MgSO4 0,024
Glycerin 2,5
Tabelle 16: Zusammensetzung des Vorkultur- und Fermentationsmediums des Prozesses B082
Substanz Massenanteil im Medium [%]
Hefeextrakt 2
L-Methionin 0,2
Citronensäure 0,35
NaCl 0,1
K2HPO4 0,865
KH2PO4 0,685
MgSO4*7H2O 0,2
Glycerin 0,5
Sonstige Bestandteile Anteil am Medium
Spurenelemente 10 ml/l
Thiamin 5 mg/l
Antischaummittel Desmophen (nur im
Fermentationsmedium)
0,02%
Anhang
91
Tabelle 17: Spurenelementelösung Fermentationsmedium B082
Substanz Konzentration in der Lösung [g/l]
Fe-(II)-SO4*7H2O 4,232
CoCl2*6H2O 0,2672
CuSO4*5H2O 0,222
MnCl*2H2O 1,676
H3BO3 0,3334
Na2MoO4*H2O 0,2672
ZnCl2 0,7
EDTA26
0,496
Sonstige Bestandteile Anteil am Medium
HCl 10% 80 ml/l
Tabelle 18: Feed-Lösung der Fermentation B082
Substanz Anteil am Medium
Glycerin 25%
K2HPO4 0,03 mol/l
KH2PO4 0,015 mol/l
Hefeextrakt 10%
L-Methionin 0,25%
26 EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure
Anhang
92
Tabelle 19: MES-Laufpuffer für SDS-PAGE, pH 7,3
Substanz Anteil am Puffer
MES27
50 mmol/l
Tris28
50 mmol/l
SDS 0,1%
EDTA 1 mmol/l
Tabelle 20: Solubilisierungspuffer SP1, pH 8,0
Substanz Anteil am Puffer
Harnstoff 8 mol/l
Tris 100 mmol/l
DTT29
50 mmol/l
Tabelle 21: Lysepuffer B028 (HW-Puffer), pH 7,5
Substanz Anteil am Puffer
Tris 10 mmol/l
EDTA 5 mmol/l
Tabelle 22: Lysepuffer B082, pH 8,0
Substanz Anteil am Puffer
Tris 20 mmol/l
MgSO4 2 mmol/l
NaCl 150 mmol/l
Tween-20 0,1%
27 MES - 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
28 Tris - Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
29 DTT - Dithiothreitol
Anhang
93
9.3. GLEICHUNG KONZENTRIERUNGSKOEFFIZIENT B028
Proteinmenge = y
Konzentrierungsfaktor = x
z = Verhältnis zweier Konzentrierungsfaktoren oder Konzentrationen
Bezug auf den Konzentrierungsfaktor 1
Bezug auf eine 2 fache Konzentrierung
![LATEXKurs Literaturverzeichnisse · 2017. 12. 10. · nur ein Test (Doe 50 v. Chr., S. 4) nur ein Test ([Doe, S. 4]) Hinweis. Wenn die Punkt Option verwendet wird, muss die Quellen](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/610ae5e8ab0e4e1c7d63e009/latexkurs-literaturverzeichnisse-2017-12-10-nur-ein-test-doe-50-v-chr-s.jpg)
![R.S.Acerrellios - Die Freimaurerei in ihrem Zusammenhang [1836] [OCR]](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/5571fa0c4979599169911b66/rsacerrellios-die-freimaurerei-in-ihrem-zusammenhang-1836-ocr.jpg)
