Dragoș CINTEZĂ Iulia PERSINARU Bogdan Mircea ...intramusculară la nivelul coapsei drepte a unui amestec de Ketamină (50-100mg/kg corp) și Xilazină (5-10mg/kg corp), cantitatea

Dragoș CINTEZĂ Iulia PERSINARU Bogdan Mircea MĂCIUCEANU ZĂRNESCU Dan IONESCU Ioan LASCĂR Clinica de Chirurgie Plastică-Microchirurgie Reconstructivă Spitalul Clinic de Urgență București

REGENERAREA NERVOASĂ ÎN LEZIUNILE DE NERV SCIATIC LA ȘOBOLAN REPARATE PRIN COAPTARE INDIRECTĂ - EVALUARE FUNCȚIONALĂ FUNCTIONAL ASSESMENT OF NERVOUS REGENERATION IN SCIATIC NERVE LESIONS IN RATS REPAIRED BY INDIRECT COAPTATION

Abstract. The purpose of this study is to find an appropriate alternative to

the classical treatment of a peripheral nerve defect, one that is at least as effective and without its inconveniences. The present study is part of a more extensive ongoing project, in this stage being evaluated the results of an experimental study performed on 20 Wistar rats aged between 3-6 months. A lesion was created by cutting 1 cm from the left sciatic nerve. The subjects were divided into 2 groups of study. In the first group the nervous gap was repaired by interpositioning a nerve graft, and in the second group an autologous composite graft made of skeletal muscle and vein was used. The recovery in rats was evaluated by functional tests such as walking track analysis. The results obtained reveal a better recovery in the second group comparing them to the first one.

Keywords: sciatic functional index, nerve graft, composite graft, nervous regeneration.

Clasificarea JEL: I10, C60, C99

1. INTRODUCERE Leziunea nervilor periferici este o afecțiune destul de comună (300.000 de

cazuri noi pe an în Europa) ce duce la afectarea funcției senzitive și motorii, cu afectarea calității vieții pacientului și cu un impact socio-economic major (Ciardelli și Chiono, 2006). Clasificarea consacrată a leziunilor nervoase după Seddon și Suderland, le împarte în funcție de severitatea acestora în neuropraxie, axonotmesis

194

Regenerarea nervoasă în leziunile de nerv sciatic la șobolan reparate prin coaptare indirectă - evaluare funcțională și neurotmesis, indicație chirurgicală absolută având cea din urmă (Sunderland, 1978).

Când secțiunea nervoasă este completă, apare un defect între capătul proximal și cel distal al nervului, iar capătul distal este supus imediat după momentul traumatic unui proces complex de denaturare, cunoscut sub numele de degenerare walleriană. Macrofagele și monocitele locale migrează în vederea eliminării resturilor de mielină și a axonilor, iar celulele Schwann se de-diferențiază într-un fenotip proregenerativ, aliniindu-se de-a lungul tubilor endoneurali formând benzile Bungner și stimulând regenerarea axonală prin producerea de factori neurotrofici și molecule ale matricii extracelulare (Wood și Mackinnon, 2015). Noii muguri axonali emerg la nivelul nodurilor Ranvier și își continuă creșterea până la atingerea reinervării funcționale. Deși capacitatea de regenerare a sistemului nervos periferic o depășește pe cea a sistemului nervos central datorită răspunsului diferit la leziune a celulelor gliale locale (Chen și colab., 2007), repararea spontană a unui defect de nerv este deficitară, cu rezultate funcționale nesatisfăcătoare (Terenghi, 1999; Battiston și colab. 2009). Recuperarea funcțională depinde de numărul de axoni, senzitivi sau motori, care se regenerează și reușesc să ajungă adecvat la receptorii senzitivi sau plăcuțele neuromotorii corespunzători (Wood și Mackinnon, 2015).

Cea mai utilizată tehnică chirurgicală pentru restabilirea continuității nervoase și stabilirea premizei esențiale pentru regenerarea axonală este coaptarea nervoasă directă (Lohmeyer și colab., 2009). Limitarea acestei metode apare atunci când defectul între capetele nervoase depășește 8 mm. Anastomoza microchirurgicală efectuată în aceste condiții duce la crearea unei tensiuni locale, cu scăderea consecutivă a fluxului sanguin, stimularea proceselor locale fibrotice și inhibarea regenerării axonale (Sedaghati și colab., 2014). În aceste condiții, metoda de elecție în repararea nervoasă o reprezintă coaptarea indirectă, prin care se interpune un conduct care face legătura între capătul proximal și cel distal.

Standardul de „aur” în activitatea clinică din ultimii 30 ani rămâne folosirea grefoanelor nervoase autoloage (Lundborg, 2000), dar cu prețul creșterii morbidității și cu rezultate pe termen lung nesatisfăcătoare. În plus, utilizarea nervilor senzitivi nu reprezinta metoda optimă pentru repararea defectelor de nervi motori sau micști (Kuffler, 2014), iar clinic s-a dovedit limitarea utilizării acestora pentru defecte ce nu depășesc 10 cm, în aceasta situație niciun axon nereușind să atingă capătul nervos distal de-a lungul grefei (Terzis și Kokkalis, 2008). Din păcate, folosirea cu încredere a grefoanelor nervoase rămâne rezervată defectelor ce nu depășesc 2 cm lungime (Kuffler, 2014).

Pentru rezolvarea tuturor acestor probleme, sau pentru situațiile în care defectul de nerv este atât de mare încât capetele nervoase nu pot fi puse în contact, s-au imaginat diferite metode de a interpune local un conduct care să permită și să promoveze regenerarea axonală de-a lungul defectului.

195

Dragoș Cinteză, Iulia Perșinaru, Bogdan Mircea Măciuceanu Zărnescu, Dan Ionescu, Ioan Lascăr

2. OBIECTIVE

Studiul de față face parte dintr-un proiect mai amplu încă în desfășurare,

care are ca scop găsirea unei metode sigure, ieftine și accesibile pentru repararea defectelor de nervi periferici, comparabilă ca rezultate clinice cu metoda clasică de tratament, dar care să nu aibă inconveniențele aferente. De aceea, în această etapă, se dorește evaluarea preliminară a indicelui funcțional sciatic pentru 20 de animale de laborator (șobolani Wistar) și interpretarea rezultatelor.

3. MATERIAL ȘI METODĂ

Studiul a fost efectuat pe 20 de animale de laborator (șobolani Wistar cu

vârste cuprinse între 3 și 6 luni, cântărind între 300 și 500g) cu leziune de nerv sciatic provocată prin secționarea unui segment de ~ 1 cm, împărțiți în 2 loturi de câte 10, în funcție de tipul de intervenție chirurgicală practicată.

Animalele au fost adăpostite în cuști cu fund neted de plastic, la o temperatură de aproximativ 23 grade celsius, cu un ciclu de 12 ore lumină/întuneric. Hrana, adecvată hrănirii șobolanilor, și apa au fost puse la discreție, iar talașul a fost schimbat zilnic. La intervale de timp regulate, se detemină greutatea fiecărui șobolan.

Animalele de laborator au fost supuse intervenției chirurgicale, realizându-se grefarea nervului sciatic cu grefon nervos, respectiv grefon musculo-venos.

Pentru intervențiile chirurgicale s-au folosit un microscop Zeiss pentru studii experimentale cu o mărire de 2,5x și o trusă de microchirurgie. Materialele utilizate pentru anestezierea și practicarea intervențiilor chirurgicale pe animalele de laborator sunt în conformitate cu legile românești și europene în vigoare.

a. Protocolul operator

După anestezierea animalului de laborator prin administrarea

intramusculară la nivelul coapsei drepte a unui amestec de Ketamină (50-100mg/kg corp) și Xilazină (5-10mg/kg corp), cantitatea injectată fiind calculată în funcție de greutatea șobolanului, se practică toaletarea părții posterioare a coapsei stângi cu soluție Povidone-iodine (betadină), se rade zona operatorie și se practică o incizie longitudinală de aproximativ 3 cm. Se deschide planul muscular posterior al coapsei stângi paralel cu fibrele musculare (m. semitendinos și capul lung al m. biceps femural), nervul sciatic stâng găsindu-se imediat sub planul muscular. Se disecă nervul sciatic pe o porțiune de aproximativ 3-4 cm, eliberându-l de țesuturile conjunctive înconjurătoare. Se secționează nervul sciatic realizându-se un defect de

196

Regenerarea nervoasă în leziunile de nerv sciatic la șobolan reparate prin coaptare indirectă - evaluare funcțională maxim 1 cm, aceasta fiind distanța maximă ce poate fi grefată cu succes la șobolan. Se suturează grefonul selectat după caz (nervos sau musculo-venos) folosind fire de sutură neresorbabile 10.0 cu ac rotund. După repararea nervoasă mușchii sunt suturați cu atenție cu fir resorbabil multifilament 4.0, iar la finalul intervenției se realizează sutura tegumentară cu același tip de fir ca la mușchi.

În cazul primului lot de șobolani, pentru repararea defectului nervos se practică interpoziția segmentului de nerv obținut în urma creării artificiale a defectului, după rotirea acestuia cu 180° (Figura 1).

Pentru cel de-al doilea lot, în vederea obținerii grefonului musculo-nervos se practică: toaletarea regiunii laterocervicale stângi cu soluție Povidone-iodine (betadină), se rade zona operatorie și se practică o incizie longitudinală de aproximativ 1 cm, disecție cu evidențierea venei jugulare externe, secțiunea acesteia pe o lungime de 1 cm, ligatura capetelor restante, sutura tegumentului cu fire separate; de la nivelul m. biceps femural se practică excizia unui fascicul muscular striat de 1 cm lungime, 0,3 cm diametru, care este introdus în lumenul grefonului venos recoltat anterior (Figura 2).

Figura 1. Grefon nervos

Sursă: Autori

Figura 2. Grefon musculo-venos

197


Sursă: Autori

Postoperator șobolanii au fost adăpostiți în cuști individuale, hrăniți în aceleași condiții, și au fost monitorizați pentru schimbări ale comportamentului obișnuit și ale activitaților motorii. Un singur șobolan, din primul lot, a decedat imediat postoperator.

b. Evaluarea funcțională

Evaluarea recuperării se face prin analiza funcțională a mersului. Aceasta a fost făcută prima dată de către Medinaceli în 1982, utilizând o formulă matematică ce utilizează 4 parametrii: lungimea amprentei (PL), lățimea amprentei (distanța dintre degetele I și V - TS), distanța dintre degetele II și IV (IT), distanța față de celălalt picior (TOF), măsurate la membrul operat (E), cât și cel neoperat (N). Aceasta formulă a evoluat în timp, aducându-i-se progresiv modificări, ajungându-se în cele din urma la formula actuală (Bain-Mackinon-Hunter) de calculare a indicelui funcțional sciatic (SFI) (Wood și colab., 2011). SFI =

Scorurile obținute variază între -100, ce semnifică secțiunea completă a nervului sciatic, și 0 (valoarea normală, de referință, în cazul șobolanilor neoperați).

Animalele de experiență au fost lăsate să meargă pe o hârtie albă, după impregnarea cu cerneală albastră a labelor posterioare, printr-un tunel cu pereții transparenți lung de aproximativ 1 m care comunică la unul dintre capete cu o cușcă din plastic cu pereți opaci. Determinarea SFI s-a făcut la 8 și 12 săptămâni (T1 și T2). S-au făcut măsurători manuale ale amprentelor, iar valorile obținute au fost introduse într-un tabel și prelucrate cu ajutorul programului Microsoft Excel.

198

Regenerarea nervoasă în leziunile de nerv sciatic la șobolan reparate prin coaptare indirectă - evaluare funcțională

4. REZULTATE Studierea curbei greutății arată o creștere progresivă în cazul șobolanilor

din primul lot, pe când cei din cel de-al doilea lot suferă o scădere în greutate în prima lună postoperator, urmată de o creștere liniară a greutății. Acest efect poate fi datorat, cel mai probabil, intervenției mai ample, cu un timp operator prelungit, necesar prelucrării grefonului compozit (Figura 3, Figura 4).

Tabelul 1. Media greutăţii şi abaterea standard pentru şobolanii din lotul 1 Nr. crt. Săptămâna Media greutăţii (g) Abaterea standard (g)

1 Săptămâna 1 368,75 28,3788 2 Săptămâna 2 372,88 21,4542 3 Săptămâna 9 400,75 33,4183 4 Săptămâna 13 418,38 31,5863

Figura 3. Media greutăţii pentru şobolanii din lotul 1

Tabelul 2. Media greutăţii şi abaterea standard pentru şobolanii din lotul 2 Nr. crt. Săptămâna Media greutăţii (g) Abaterea standard

(g)

1 Săptămâna 1 365,00 29,7610 2 Săptămâna 2 353,00 27,2397 3 Săptămâna 9 382,00 31,6363 4 Săptămâna 13 401,38 29,6356

199


Figura 4. Media greutăţii pentru şobolanii din lotul 2

Postoperator se observă apropierea degetelor la membrul operat, cu

scăderea valorilor TS și a IT, și mărirea lungimii amprentei (PL). În studiul nostru, în 2 cazuri s-a observat automutilarea piciorului operat, ambele în cel de-al doilea lot, calcularea SFI în această situație fiind imposibilă. În literatura de specialitate autofagia este menționată ca o complicație postoperatorie, datorată cel mai probabil anesteziei locale de durată.

Tabelul 3. Rezultate SFI – lotul 1 Nr. Crt. SFI 8 săptamâni SFI 12 săptămâni

1 -80,466 -52,7133 2 -52,5689 -49,6375 3 -80,3274 -75,3761 4 -46,118 -43,9991 5 -74,5463 -73,9011 6 -61,5526 -59,2538 7 -61,3659 -49,6245 8 -72,2164 -68,4347 9 -76,53 -72,5416

Tabelul 4. Rezultate SFI – lotul 2

Nr. Crt. SFI 8 săptămâni SFI 12 săptămâni 1 -67,2139 -41,2268 2 -59,2883 -49,4291 3 -- - 4 -81,15 -78,67

200


5 -84,9394 -56,4254 6 -67,6121 -61,3984 7 -66,0242 -65,9624 8 -69,5861 -59,8314 9 - - 10 -72,2522 -45,295

S-a aplicat ca analiză statistică între cele 2 loturi testul t (Student) cu

ajutorul programului software Microsoft Excel. Rezultatele obținute demonstrează creșterea semnificativ statistică a valorilor SFI la 12 săptămâni, atât în cazul lotului în cazul lotului 2 (p=0,012)

Tabelul 5. Media indicelui SFI şi abaterea standard pentru şobolanii din lotul

1 Nr. crt. Săptămâna Media indicelui SFI Abaterea standard

1 Săptămâna 8 - 69,95 10,2410 2 Săptămâna 12 - 62,69 11,1426

Figura 5. Media indicelui SFI pentru şobolanii din lotul 1

Tabelul 6. Media indicelui SFI şi abaterea standard pentru şobolanii din lotul 2

Nr. crt. Săptămâna Media indicelui SFI Abaterea standard 1 Săptămâna 8 - 71,01 8,3549 2 Săptămâna 12 - 57,28 12,0718

201


Figura 6. Media indicelui SFI pentru şobolanii din lotul 2

Tabelul 7. Comparaţii între indicele SFI pe loturi Nr. crt. Indicele SFI p Concluzii

1 SFI lotul 1 – săptămâna 8 şi SFI lotul 1 – săptămâna 12

p = 0,055 Nu există diferenţă semnificativă statistic în

cadrul lotului 1 2 SFI lotul 2 – săptămâna 8 şi

SFI lotul 2 – săptămâna 12 p = 0,012 Există diferenţă

semnificativă statistic în cadrul lotului 2

Tabelul 8. Comparaţii între indicele SFI între loturi Nr. crt.

Indicele SFI p Concluzii

1 SFI lotul 1 – săptămâna 8 şi SFI lotul 2 – săptămâna 8

p = 0,704 Nu există diferenţă semnificativă statistic

între loturi 2 SFI lotul 1 – săptămâna 12 şi

SFI lotul 2 – săptămâna 12 p = 0,299 Nu există diferenţă

semnificativă statistic între loturi

Între progresele observate în cadrul celor două loturi nu există diferențe

semnificative din punct de vedere statistic, deși poate fi observată o creștere mai accentuată a indicelui funcțional sciatic în cazul lotului 2.

202


Figura 7.Analiză comparativă a evoluției indicelui sciatic pentru cele două loturi

5. LIMITĂRI Utilizarea SFI pentru evaluarea regenerării nervoase este controversată

deoarece este influențată de mai mulți factori. În primul rând, recoltarea datelor nu se poate realiza în aceleași condiții, mai ales la intervale de timp diferite, existând o variabilitate atât între loturile studiate, cât și în cadrul acestora. Variațiile de greutate ale animalelor de experiență, cât și cele de viteză determină modificări ale mărimii amprentei. Există mai multe investigații complementare ce se pot face pentru evaluarea regenerării nervoase, precum numărarea axonilor și a neuronilor, determinarea forței contractile musculare și a greutății musculare, determinarea potențialelor de acțiune nervoasă, fiecare cu plusurile și minusurile corespunzătoare (Wood și colab., 2011).

6. CONCLUZII Rezultatele înregistrate în cadrul celor două loturi din punct de vedere al

indicelui sciatic scot în evidență faptul că regenerarea nervoasă la nivelul celui de-al doilea lot este cel puțin la fel de eficientă ca cea din primul lot.

Putem observa că, deși debutul regenerării nervoase se face mai rapid în cazul primului lot, evoluția ulterioară este mai bună în cadrul celui de-al doilea lot.

Rezultatele prezentate în acest articol sunt preliminarii, datele fiind obținute în cadrul unui studiu experimental desfășurat pe o perioada de 16 săptămâni.

Regenerarea nervoasă în cazul leziunilor de nervi periferici cu defect de substanță rămâne un subiect intens dezbătut. În ciuda progreselor tehnologice

203

Dragoș Cinteză, Iulia Perșinaru, Bogdan Mircea Măciuceanu Zărnescu, Dan Ionescu, Ioan Lascăr survenite în ultimele decenii și a nenumăratelor încercări de a găsi o alternativă viabilă, rezultatele sunt în continuare nesatisfăcătoare.

RECUNOAȘTERE

„Această lucrare a fost cofinanţată din Fondul Social European, prin

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013, proiect numărul POSDRU/159/1.5/S/138907„Excelenţă în Cercetarea Ştiinţifică, Interdisciplinară, Doctorală şi Postdoctorală, în Domeniile Economic, Social şi Medical - EXCELIS”, coordonator Academia de Studii Economice din Bucureşti”

BIBLIOGRAFIE

[1]. Battiston, B., Papalia, I., Tos, P., Genua, S. (2009), Peripheral nerve repair and regeneration research- a historical note; International Review of Neurobiology, 87, pg. 1-7; [2]. Chen, Z.I., Yu, W.M., Strickland, S. (2007), Peripheral regeneration; Annual Review of Neuroscience, 30, pg. 209-233; [3.] Ciardelli, G., Chiono, V. (2006), Materials for peripheral nerve regeneration. Macromolecular Bioscience, 6, pg. 13-26; [4]. Kuffler, D.P. (2014), An assessment of current techniques for inducing axon regeneration and neurological recovery following peripheral nerve trauma; Progress in Neurobiology, 116, pg. 1-12; [5]. Lohmeyer, J.A., Siemers, F., Machens, H.G., Mailander, P. (2009), The clinical use of artificial nerve conduits for digital nerve repair: a prospective cohort study and literature review; The Journal of Reconstructive Microsurgery, 25, pg. 55-61; [6]. Lundborg, G. (2000), A 25-year perspective of peripheral nerve surgery: evolving neuroscientific concepts and clinical significance; Journal of Hand Therapy, 25, pg. 391-414; [7]. Sedaghati, T., Jell, G., Seifalian, A.M. (2014), Nerve regeneration and Bioengineering. În: Regenerative Medicine Applications in Organ Transplantation (Orlando, G. ed), Elsevier, pg. 799-810; [8]. Sunderland, S. (1978), Nerves and nerve injuries; 2nd Ed., Churchill Livingstone, New York; [9]. Terenghi, G. (1999), Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors; Journal of Anatomy, 194, pg. 1-14;

204

Regenerarea nervoasă în leziunile de nerv sciatic la șobolan reparate prin coaptare indirectă - evaluare funcțională [10]. Terzis, J.K., Kokkalis, Z.T. (2008), Outcomes of secondary reconstruction of ulnar nerve lesions: our experience; Plastic and Reconstructive Surgery, 122, pg. 1100-1110; [11]. Wood, M.D., Mackinnon, S.E. (2015), Pathways regulating modality-specific axonal regeneration in peripheral nerve; Experimental Neurology, 265, pg. 171-175; [12]. Wood, M.D., Kemp, S., Weber, C., Borschel, G.H., Gordon, T. (2011), Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy, 193, pg. 321-333.

205

Documents

Dragoș CINTEZĂ Iulia PERSINARU Bogdan Mircea ...intramusculară la nivelul coapsei drepte a unui amestec de Ketamină (50-100mg/kg corp) și Xilazină (5-10mg/kg corp), cantitatea