Eigenschaften der Adenovirus-Hämagglutinine

ZeRschrift f. Hygiene 149, 96--113 (1963)

Aus dem Institut fiir Hygiene und 1Vtikrobiologie der Universit~t des Saaxlandes, Homburg (Saar) (Direktor: Profi Dr. Dr., Dipl. chem. W. Z ~ E ~ - r r r }

Eigenschaften der Adenovirus-H~magglutinine ~ Von

H. BAUER und R. WI~AND

(Eingeganffen am 19. Januar 1963)

Die Adenoviren wurden auf Grund ihrer Eigenschaft, Blutzellen verschiedener Tierspecies zu agglutinieren, yon ROSEN (1960) in vier Gruppen eingeteilt. In friiheren Untersuchungen an j e einem Vertreter der drei ersben Gruppen war gezeigt worden (WIGAND U. BAUER 1962), dal] sich das H~tmagglutinin yon Typ 6 als Vertreter der Gruppe I I I einerseits und die tts der Typen 9 und 11 als Ver~re~er der Gruppen I und I I andererseits in wesentlichen Eigenschaften voneinander unterseheiden. Im Gegensatz zu den Typen 9 und 11 zeigte sich das tt~magglutinin yon Typ 6 extrem thermolabil, wurde dureh kri- s~allisiertes Trypsin vollstandig in~k~iviert, blieb bei hoehtourigem Zentrifugieren (90 rain 20000 g) im (~berstand und liel~ sich -- ebenso wie die infektiSse Viruspartikel -- nicht an Erythroeyten adsorbieren. Versuche, die Eigenschaften von Adenovirus Typ 6 uueh ffir die fibrigen Viren der Gruppe I I I (Typ ], 2, 4 und 5) zu bests fiihrten zur Dif- ferenziertmg yon insgesamt ffinf It~magglutininen in der Adenovirus- gruppe mit unterschiedliehen Eigenschaften, die der Kfirze halber als H~magglutinin A, B, C, D und E bezeichnet wurden (BAvv, R u. WIGAND 1962). /)aS A-H~magglutinin ist allen Adenoviren der Gruppe I I I nach RosE~ gemeinsam und agglutinier~ nur bei Gegenwart eines heterologen Adenovirus-Immunserums. Daneben besitzen Typ 5 und 6 ein weiteres tt~magglutinin B, das dem frfiher untersuehten yon Typ 6 entsprichb, und die Adenoviren 1, 2 und 4 ein Hamagglutinin C, das sich wesentlich yon den beiden ersten unterscheidet. Mit D und E wurden die bereits frfiher untersuchten Hi~magglutinine der Adenoviren Typ 9 bzw. 11 bezeichne~.

Eine Zusammenstellung der vorwiegend un~ersuchten Virustypen in Beziehung zu ihren ttiimagglutininen und den Gruppen naeh ROSESZ finder sieh im oberen Teil der Tab. 12 auf S. 109.

Im folgenden soll ausffibz'lieh fiber die Eigenschaften der Hi~magglutinine sowie fiber die yon uns ~ngewendeten Teehniken beriehtet werden. Die wichtigsten Ergebnisse wurden berei~s in kurzer Form mib- geteilt (BxuER u. Wm~'~D 1962).

* Die vorliegenden Untersuchungen wurden mit Unterstfitzung der Deutsehen Forschungsgemeinschaft durchgeffihrt.

Eigenschaften tier Adenovirus-H~magglutinine 97

Material und Methodik lZiren. Wit untersuchten die Adenovimls-Prototypen 1--28, auBerdem 12 selbst

isolierte bzw. yon anderer Seite erhaltene St~mme der Typen 1, 2, 4, 5, 6 und 12. Die Viren wurden in I-IeLa- oder prim~iren Sctfilddriisen-Zellkulturen geziichtet. ])as Waehstumsmedium bestand fiir tteLa-Zellen aus 0,5% Caseinhydrolysat und 7,5~ inaktiviertem Kalbsserum in Hanks-L5sung, fiir die Sehilddriisenkulturen aus 0,5o/o Lactalbumin-I~ydrolysat und 5~ Kalbsserum in Hanks-LSsung. ])as Erhaltungsmedium enthielt fiir HeLa-Zellen 5~ Ftir Strumazellen 2,50/0 Kalbs- serum. Bei der Herstellung grSl3erer Virusvorr~te wurde manchmal statt 5% Kalbsserum 2% Kaninchenserum verwendet.

Die beimpften Zellkulturen wurden bei vollst~ndigem cytopathogenem ]~ffekt bei --20 ~ C eingefroren und aufgehoben. Vor Gebrauch wurden die Viren 10 rain bei 2000 rpm zentrifugiert, um die Zellbestandteile zu entfernen.

Virustitrationen fiihrten wit in HeLa-Zellen mit zehnfachen Verdfin~ungen und mit drei RShrchen je Verdfinnung durch. 4 Tage nach Inoculation wurde das Medium geweehselt, die Endablesung erfolgte nach 8 Tagen, die Titerbereehnung nach der 5Iethode yon REED U. ~V~uEI~C2t.

Ffir die Trypsinbehandlunff der Viren wurde kristallisiertes Trypsin der Firman Novo bzw. Worthington und Sojabotmen-Inhibitor (Novo) zum Stoppen der Trypsinaktivit~t benutzt. Zu 1 ml Virus (1 : 10 in Hanks-LSsung oder gepufferter KoehsalzlSsung verdiinnt) wurde 0,1 ml einer l~ TrypsinlSsung gegeben, der pH-Wer~ mittels Natriumbicarbonat auf 7,5--8,0 eingestellt und das Gemisch 1 Std bei 37~ stehengelassen. Danach wurde 0,1 ml einer l~ LSsung des Soja- bolmen-Inhibitors zugefiigt.

Die Technik fiir die Adsorption der Viren an BlutzeUen war folgende: 0,1 ml Virus (unverdfinnt) wurde mit 1,9 ml 2~ Blutzellsuspension wiihrend 1 Std bei Zimmertemperatur mehrmals durchmischt, die Blutzellen anschlieBend dureh 10 rain Zentrifugieren bei 2000 rpm abzentrifugiert und der ]~berstand auf H~m- agglutination (HA) getestet. Wenn die Blutzellen auf Agglutinierbarkeit gepriift warden sollten, wurden sle vorher noch einmal in gepuffer~er KochsalzlSsung aus- gewasehen.

JBlutkTrperchen. ge nach Virustyp wurde Blur yon weiBen Rattan, yon Pavian- bzw. Cynomolgusaffen oder Menschen der Blutgruppe 0 verwendet. Das Blur wurde durch Herz- bzw. Venenpunktion gewonnen und in gleiehen Mengen Alseverseher oder 3,8~ NatriumcitratlSsung aufgenommen und bei 4~ aufbewahrb. Vor Gebrauch wurden die Blutzellen in 0,14 m NaCI-LOsung, gepuffert mit 0,004 m McIlvaine-Puffer yon PH 7,2, gewaschen und mit dieser L5sung 2~ eingestellt.

Hdmagglutinatlon. Das tti~magglutinin verdiinnten wir in der gegel unter Be- nutzung yon Plexiglasplatten in zweifacher Verdiinnungsreihe in MeIlvaine- gepufferter Koehsalzl5sung mit einem Zusatz yon 0,5~ 30 rain bei 56 ~ inaktiviertem und mit Rattenblut absorbiertem Kaninchen-Normalserum bzw. -- zur Demonstration des ,,Verstiirkereffektes" -- mit heterologem Immunserum (siehe unten). 0,4 ml tI~magglutinin wurde mit 0,2 ml einer 2~ Blutzell- suspension gemischt und bei Zimmertemperatur stehengclassen. Das Ablesen erfolgte nach 1--2 Std, manehmal auch erst nach Aufschtitteln und nochmaligem Absetzenlassen der sedimentierten Blutzellen, mit Hilfe der ,,Pattern"-Methode.

lmmunseren. ~iir den ,,Verstgrkereffekt" und die HA-Hemmung benutzten wir selbsthergestelRe Adenovirus-Kaninchcnimmunseren. Zur Immunisierung der Kaninchen wurde Prototyp-Virus verwendet, dessen Titer je nach Typ zwisehen 104. 5 und 107, 5 IDs0 pro ml betrug. Den Tieren wurde im Abstand yon jeweils 4 Wochen dreimal 2 ml Virus i.v. gespritzt. 10 Tage nach der letzten Inoculation

98 H. BAUER Ujld R. WI(~AI~D :

entbluteten wir die Tiere dureh Herzpunktion. Die Seren wurden nach der Me- thode yon l~owE u.a. (1958) auf neutralisierende AntikSrpcr gctestet und vor Gebrauch in der HA mit Rattenb]utkSrperchen absorbiert, indem das Serum mit 2~ Blutzellsuspension im VerhJJltnis 1 : 10 vermischt, 1--2 Std bei Zimmer- temperatur gehalten und w~hrend dieser Zeit mehrmuls durehmischb wurde. Die Blutzellen wurden anschlleBend abzentrifugiert.

HA-Hemmung. 0,2 ml einer zweifachen Verdfinnungsreihe yon Immunseren, die vorher mit entsprechenden Blutzellen absorbiert worden waren, wurden mit der gleichen Menge Virus, die 8 I-IA-Einheiten enthielt, vermiseht und 1 Std bei Zimmertemperatur gehalten. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 2~ Blutzell- suspension wurde erneut durchmischt. Die Ablesung erfolgte nach weiteren 60 bis 90 min.

Ergebnisse

Untersuchungen zur Methodilc Die Auswahl yon Menschen- oder Affenblut maehte keine Schwierigkeiten,

denn die versehiedenen Chargen wurden anseheinend alle gleieh gut agglutiniert. Anders verhielt es sich mit l~attenblut. Obereinstimmend mit ROSEN (1960) fanden wit, dab die Erythrocyten nicht aller Ratten eines Stammes di~rch Adenoviren der Gruppe :[II nach R o s ~ agglutiniert wurden. Die Aggluthfierbarkeit einer Ratten- blutcharge blieb jedoch fiber Monate konstant, t~iir die HA mit Viren der Gruppe I I nach ROSEN eigneten sich alle Rattenblutchargen. Die Beobachtung yon NJsz u. a. (1962), dal~ aueh bei dieser Virnsgruppe Unterschiede in der Agglutinierbarkeit versehledener Menschen- und Rattenblutproben bestehen sollen, bedarf noch der Best~tigung.

Eine Spontanagglutination einiger Rattenblutchargen, die bei derselben Charge jedoch nicht immer gleich war, versuchten wir durch Zusatz yon Kalbs- oder Kaninchensernm zu verhindern. Hierbei zeigte sich, dal3 diese Seren selbst Ratten- blutzel|en agglutii~ieren kOnnen. Jus diesem Grund wurden s~mtliehe Seren, die bei der HA mit l~attenblut verwendet wurden, mit RattenblutkSrperchen absorbiert. Zur Verhinderung der Spontan-ttA setzten wit der Verdfinmmgsflfisslgkeit ffir die Virustitrationen 0,50/0 absorbiertes, inaktiviertes Kaninchenserum zu. Kalbsserum zeigte den gleichen Effekt nur bei einer etwa fiinffach hSheren Konzentration. Auch P~.~Er~A u. DE FmVEIREDO (1962) verwendeten aus dem gleichen Grund einen Zusatz yon 0,06--0,5~ Kanlnchenserum fiir die Adenovirus-HA.

Ffir die HA der Gruppe I I I mit Rattenblutzellen testeten wir fiinf verschiedene Arten yon GlasrShrchen im Vergleich zu Plexiglasplatten. Der HA-Titer war in allen Gef~Ben gleich, jedoch war das Pattern in den Platten durchweg am besten ausgepri~gt, so dal] sie die genaueste Ablesung yon allen untersuchten Reaktions- gef~13en erlaubten. Fiir si~mtliche Versuche wurden daher Plexiglasplatten benutzt.

Das Pattern der HA bei Gruppe I I I war, entsprechend den Beobaehtungen yon ROSEN (1960), bei den Hi~magglutininen A und B fast immer unvollsts Im Gegensatz zu seinen Ergebnissen sahen wir jedoeh bei den C-ttSmagglutininen stets ein voUsti~ndiges HA-Pattern.

Zur Auf f indung der op t imalen Blu tze l lkonzen t ra t ion t es te ten wi t im Sehaehbre t tes t eine 1,4fache Verdf innungsreihe der BlutkSrperchen gegen eine ebensolche Reihe der Adenov i ren Typ 6 bzw. 9. Tab. 1 zeigt e inen solehen Versuch mi t Typ 9 ; Versuche mi t Typ 6 fielen entsprechend aus. Wie erwartet , ergab sieh eine quan t i t a t i ve Beziehung zwisehen t tA-T i t e r u n d Blu tkSrperchenmenge derart , daI~ die TiterhShe umgekehr~ propor t iona l der E r y t h r o c y t e n k o n z e n t r a t i o n war. Ffir unsere Versuche

Eigenschaften der Adenovirus-Hiimagglutinine 99

w~hlten wir eine 2~ B lu tze l lkonzen t ra t ion , d a in d iesem Bereich die Ablesung a m deu t l i ehs t en u n d s iehers ten war.

Wi~hrend ROSEN (1960) versch iedent I ieh bei 37 ~ C h6here T i t e r l a n d als bei 4 ~ C, war bei den yon uns d a r a u f h i n un t e r sue h t e n V i r u s t y p e n

Tabelie 1. Abhdngigkeit des H~imagglutinationstiters yon der Blutzellkonzentration Adenovirus Typ 9 mit MenschenblutkSrperchen als Beispiel

Blutzellkon- zentrat ion

(~

5,6 4,0 2,8 2,0 1,4 1,0

Virus ve rd i inn t 1 :

25 35 50 70 100 140 200 280 400 560

41 3 2 Sp. 0 0 4 4 3 Sp. 0 0

4 4 3 Sp. Sp. 0 4 4 4 Sp. Sp. Sp. Sp.

4 4 4 Sp. Sp. Sp. 4 4 4 1 Sp.

1 Die ZaMen bedeuten die Sts der HA; Sp. = Spur.

NaCl

0 0 0 Sp. Sp. Sp.--1

Tabelle 2..~nderung des Hdmagflutinatlon.~titer8 nach Au/schiitteln bei unvollstdndig agfflutinierenden Adenoviren

RattenblutkSrperchen; kein heterologes Immunserum

Adenovirus- Typ

Ablesung t Virus verdf innt 1 :

10 20 40 80 160

0 0 0 0 0 0 Sp. 1 1 Sp. 02 2 3 2 1

0 0 0 0 0 3 2 Sp. 0 0 2 4 3 2 Sp.

~aCl

0 0 0

1 Zweite und dritte Ablesung jeweils nach Aufschiitteln und erneutem Sedi- mentieren bei Zimmertemperatur.

s ,,Zonenph~nomen".

die R e a k t i o n s t e m p e r a t u r ohne wesent l iehen EinfluB a u f den HA-Ti t e r , wobei wi r T e m p o r a t u r e n yon 4 ~ 22 ~ u n d 37 ~ m i t e i n a n d e r vergl ichen. Die Ablesung k a n n in de r Rege l jeweils nach 90 rain erfolgen. Wieder - aufschi i t te in des Vi rus-EryChrocyten-Gemisches , na e hde m sich die B lu t - k6rperehen a b g e s e t z t haben , e rb raeh te bei gu t agg lu t in ie renden Viren (Typ 9, 11) se l ten einen h6heren Ti ter . Ander s verh ie l t es sich bei den A- und B-H~magg lu t in inen , die ke in vol ls t~ndiges P a t t e r n ergeben bzw. des , ,Vers t~rkeref fektes" dureh ein heterologes I m m u n s e r u m bedfirfen. Hie r k a n n es vo rkommen , d a b bei d e r e rs ten Ab lesung noeh keine H A zu sehen i s t und diese ers t s i eh tba r wird, wenn m a n die B1utzellen nach 1- -2 S td wieder aufsehf i t te l t und naeh e rneu tem Sed iment ie ren wiede r

1O0 H. ~B.4.UER und R. WIGAIqD :

abliest. I n solchen l~/illen vermag m a n c h m a l ein zweites Aufschfit teln sogar noch eine Ti tererhShung zu bewirken, wie aus Tab. 2 zu ersehen is$.

Hiimagglutination verschiedener E, rythrocytenarten durch Adenoviren

Wir un t e r such t en die Pro to typs t / imme yon Typ 1 - -28 auf I-IA mi t Ra t t en - , Menschen- u n d P a r i a n - oder Cynomolgusblu tkbrperchen und kamen bezfiglich Ra t t en - u n d Menschenblu t zu / ihnlichen Ergebnissen wie Ros~N (1960), B~.Im u. a (1960) u n d R o s ~ r u. a. (1961) (Tab 3). Bemerkenswerterweise zeigten jedoch aus der Gruppe I nach Rosvar

Tabelle 3. Agglutination von Blutk6rperchen verschiedener Tierspecies dutch Adenoviren

Blutk6rperchen yon

Virustyp Mcnsch l~atte (Blutgr. 0) Pavian Cynomolgus :Rhesus 8

1

2 3 4 5 6 7 7a 8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

401

8O 0 40

160 320

|

0 > 40 1280

> 320 0

O 2

0 0 0 0 0 | 0 80

1280 >320

0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1280

0 0 0 0 0 | 0 0 0 20 0 20

20 0 320 > 40

0 0 >320 0

0 0 >320 Q

0 0 >320 >32O

5 0

0 0 >320 5 ; 5

80 0 >320 0

0 0 320 > 4O

> 160 > 160 0 0

0 0 lO 20 | 0 10 10 20 40 Q 0 0 0 _ 4 20 - - 1 0

8 1 6 0

- - 2 0

- - 1 0

- - 0

0 0 0 0 0 20 0 0

1 Reziproker Wert des ItA-Titers. 2 O bedeutet: < 5. a Befunde yon RosEN (1960), BELL U. a. (1960), ROSEN u. a. (1961). 4 _ = nicht untersucht.

@ | + | | | + + @

(+) | + |

(+) +

(+) + @ | @

(+) + | | | + | | +

Eigenschaften der Adenovirus-H~magglutinine 101

mit Pavian- und Cynomolgusblutk6rperchen nur die Typen 11, 16 und 21 eine HA, w/s mit Rhesusblutzellen auBerdem die Typen 3, 7, 14, 25 und 28 agglutinieren sollen. Dieser durch die verschiedenen Affen- species bedingte Unterschied dfirfte insofern yon Bedeutung sein, als SrMoN (1962a) kiirzlich ausgepr~gte Untersehiede in den Eigensehaften der H~magglutinine der Typen I1 und 16 einerseits und 3, 7 und 14 andererseits nachweisen konnte. Cynomolgus- und Pavianblutk6rper- chen verhielten sich bezfiglich der HA durch Adenoviren nicht vSllig gleieh. So zeigten aus der Gruppe I I nach Ros~.~ die Typen 9, 13, 15, 19, 22, 23 und 27 eine HA mit Cynomolgusblut mit niedrigem Titer, doeh reagierte nur ein Teil yon ihnen mit Pavianblut.

Mit Rattenblutzellen testeten wir auBer den Prototypen noch drei Wildsthmme vom Typ 1, fiinf yon Typ 2 und je einen yon Typ 4 und 5. Abweichend yon ]~OSENS Beobachtung zeigte sich, dab diese Typen nieht immer Rattenblutzellen agglutinierten. Die F~ihigkeit zur HA war jedoch nicht auf bestimmte Virusstiimme besehri~nkt, sondern schwankte mit den versehiedenen Passagen der einzelnen Viren. Auf eine agglutinierende Passage konnte ohne erkennbare Gesetzm~Bigkeit eine nicht agglutinierende folgen und umgekehrt, wobei bei den agglutinierenden Passagen wieder zu unterscheiden ist zwischen solchen, die ohne, und solchen, die nur mit ,,Verst~rkereffekt" aggluthfieren (siehe unten).

Ein/lufl heterologer Immunseren au/ die Hdimagglutination Von ROSEN (1960) wurde das ungewShnliche Ph/~nomen beschrieben,

dab heterologe l-mmunseren der Adenovirus-Typen 1, 2, 5 und 6 die unvollst~ndige HA dieser Virustypen bis zu einem oft vollst/~ndigen Pattern verst/trken, ohne den Titer wesentlieh zu erhShen. Diesen Effekt konnten wir ebenfalls bei den Typen i, 2, 5, 6 und -- ira Gegensatz zu RosEN -- auch bei Typ 4 beobachten. Meist kam es dabei zu einer Titer- erh6hung, soweit fiberhaupt ohne Immunserum eine HA naehweisbar war. Wit haben Grund zu der Annahme, dab es sich hierbel nicht um einen Verst/irkereffekt handelt, sondern dab damit ein besonderes H/~magglu~inin erfaBt wird. Die entsprechenden Ergebnisse werden weiter unten beschrieben. Zu dem gleichen SehluB gelangten kiirzlieh auch PEREn~A U. DP. FIGUEIREDO (1962). Dieser ,,Verst/~rkereffekt" wurde yon ROSEN (1960) sowie yon PEREIRA U. ~)E FIGVEmEDO (1962) nur bei Verwendung yon Immunseren dieser Virusgruppe I I I gefunden. Im Gegensatz dazu beobachteten wir, dab aueh Immunseren gegen Adenovirus Typ 3, 9 und 12 die Adenovirus-HA ,,verst/trkten" (Tab.4), w/ihrend Kaninehen-Immunseren gegen Poliovirus Typ 2 und 3, ECHO- Virus Typ 20 uncl Reovirus Typ 1 keinen Effekt zeigten. Dabei wurden diese Enteroviren zur Immunisierung der Tiere in gleicher Weise in HeLa-Zellkulturen gewonnen wie die Adenoviren, Reovirus 1 allerdings

102 H. BAUER und R. WIOAND :

yon Affennierenkulburen. Danach schein~ es sich u m einen Effekt zu handeln , der den I m m u n s e r e n aller Adenov i rus -Typen eigen sein kann. Al lerdings war die , ,Verst~rkereigenschaft" n ich t bei al ien Serum- Vi rus -Kombina t ionen e indeut ig nachweisbar (Tab.4). Dies k6nn te zu- fa l lsbedingt sein, zumal P ] ~ A u. a)~ Fxouv, n~v, Do (1962) bei allen Seren, die i iberhaupt e inen Versti~rkereffekt zeigten, ihn auch mi t allen Viren dieser Gruppe naehweisen konn ten .

Tabelle 4. ,, Verst~irkere//ekt" verschiedener Kaninchen-lmmunserer~ a,u/ die Hiimagglutination yon Adenoviren der Gruppe I I I nach RosE~

, ,Verst~rker" der Hiimagglutination yon Immunserum /~attcnblutzellen, Adenovirus-Typ

(Virustyp) 1 2 4 5 8

~deno 1 .~deno 2 ~deno 4 ~deno 5 .~deno 6

0 + |

+

. ~ t

0 @

+

+ | 0

(+) +

+ + @ 0 +

+ __2

V 0

hdeno 3 @ @ + + + Adeno 9 + + (+) (+) + &deno 12 -t- O -~- V +

|

|

|

Poliovirus Typ 3

ECH0-Virus Typ 20

Reovirus T y p i

|

|

|

|

|

t + VerstBrkung regelm~13ig, deutlich; (+) Verst~rkung schwach; st~irkung variabel; @ keine VerstBrkung nachgewiesen; 0 homologes HA-Hemmung.

2 _ = nieht untersucht.

|

|

|

V Ver- Serum,

Es wi~re denkbar, dab allen Adenoviren eine Art Inhibitor gegen das A-tti~m- agglutinin gcmeinsam w~re, gegen welchen dann yon Kaninchen AntikOrper ge- bildet werden kSnnten. Diese wfirden ihrerseits die Hemmwirkung dieses Inhibitors neutralisieren, so dal3 das A-H~magglutinin dann zur Wirkung kKme. In diesem Falle liel3e sich der im Immunserum enthaltene Antik6rper eventuell an ein Virus binden, das Rattcnblutzcllcn nicht agglutiniert, so dab das Immunserum anschlie~end keine ,,Verst~rkerwirkung" mehr zeigcn wiirde. Entsprechende Versuehe mit Immunserum gegen Adenovirus Typ 6, das mit Typ 3 bzw. 16 in verschiedenen Konzentra~ionen gemischt, 1 Std bei Zimmertemperatur gehalten und dann mit A-HBmagglutinin yon Typ 5 getestet wurde, fielen jedochim obigen Sinn negativ aus.

Ehl Versuch zu der Frage, ob sieh dieser hypothetische Inhibitor durch.Ultra- zentrifugieren yon den Viruspartikeln ab~rennen ls erbrachge ebenfalls kein sicheres Ergebnis. Wir zentrifugierten Adenovirus Typ 6 90 rain lang bei 20000 g, den ]~berstand und das im Erhaltungsmedium resuspendierte Sediment ein zweites Mal und auf die gleiehe Art ein drittes Mal. Danaeh war eine weitgehende Trennung

Eigenschaften der Adenovirus-Hgmagglutinine 103

yon Viruspartikeln und tt~magglutinin A und B bzw. anderen ,,15slichen" An- tigenen anzunehmen. Mit den beiden Frak~ionen (Sedimen~ und ~rberstand) wurden je zwei Kaninchen immunisiert. Die Seren beider mit dem Sediment und eines der beiden mit dem Uberstand immunisierten Tiere zeigten einen ,,Verstiirkereffekt".

Thermostabilitlit der Hlimagglutinine

Frfihere Untersuchungen haben gezeigt, dab das A-H~magglutinin yon Typ 6-Virus extrem thermolabil ist (Wzo~'cD u. BAUER 1962). Gleiche Versuche mit den H&magglutininen der Typen 1, 2, 4 und 5 erbrachten die ersten Hhlweise, dal3 man es offensichtlich nicht mit gleichartigen H~magglutininen zu tun hat. W/~hrend sich das ohne heterologes Immunserum agglutinierende Typ 5-Virus wie Typ 6 verhielt, blieben die entsprechenden Hamagglutinine yon Typ 1, 2 und 4

TabeUe 5. Hitzeemp]indlichkeit der Adenovirus.Hdmagglutlnine

10 rain Virustyp getestet

erhitzt ohne Immunserum mi t Immunserum bei ~

1 2 4 5 6 9 11 1 2 4 5 6

4 2

45 55 6O 65 7O 75 8O 85

40 80 80 80 160 80 320 - - - - 1 6 0 - - - -

- - 80 80 <10 <10 - - - -

4 0 80 80 -- - -

- - - - - - 80 160 40 <20 <20

<5 10 10

160 320 80

- - - - 80 - - - - 80

160 160 --

160 160 10

<20 <20

80 320

- - 320 - - 320

80 - 320

80 -

1 0 -

noch nach 10 rain Erhitzung bei 65 ~ aktiv und wurden erst durch 10 min Erhitzung bei 75 ~ C inaktiviert. Alle ffinf Virustypen, also auch Typ 6, zeigten abet bel Testung mib he~erologem Immunserum ein H/imagglutinin, das auch noch 10 rain Erhitzung bei 75 ~ fiberdauerte und erst nach 10 rain Erhitzung bei 85 ~ nicht mehr nachweisbar war (Tab. 5).

Trypsinemp/indlichkeit Eine Trypsinbehandlung der H/s bestis eine sich

abzeichnende Grupplerung. W/~hrend das B-H&magglu~inin yon Typ 5 nach einstfindiger Trypsinbehandlung fast vSllig zerstSrt wurde, sich also &hnlich verhielt wie das entsprechende H/~magglutinin yon Typ 6 (WmA~D u. BAVE~ 1962), blieben alle fibrigen H/imagglutinino dieser Gruppe (A und C) bei entsprechender Behandlung vSllig unbeeinflul3t (Tab. 6). PV.RE~ u. DE FmuEmv.Do (1962)fanden bei chromatographisch fraktionicrtem Material ebenfalls, da$ die ohne heterologes Immunserum

Z. Hyg. Infekt .-Kr. , Bd. 149 8

104 H. BAUER und R. WIGA~D :

wirkende H A - A k t i v i t a t durch T ryps inbehand l ung inaktivier~ wird, die mi t I m m u n s e r u m wirksame dagcgen erha l ten bleibt .

E in weiteres Kri~erium fiir eine E in te i lung der His ergab folgende Beobach tung : Bei den H/~magglut ininen yon Typ 9 u n d 11 bewirken sowohl Tryps in wie 30 min lange E rh i t zung auf 56~ nur

Tabelle 6. Wirkung yon Trypsin au/ Adenovirus- Hdmagglutinine

H~magglutinationstiter

Virustyp ohne Immunserum mit Immunserum

Kontr. I TrYPstnbeh.

1 2 4 5 6 9

l l

40 80 80 80

160 400 400

40 80 80 10

~10 100 200

Kontr. Trypsinbeh,

320 320 160 160 160 160 320 320 320 320

eine geringe Titerver- minderung . Unterz ieh t m a n jedoch diese Viren beiden Prozeduren nach- e inander , so ist anschlie- Bend kein H/imagglut i - n i n mehr nachweisbar , was da rau f h indeute t , dab Tryps in die H/imag- g lu t in ine dieser beiden Viren t ro tz des n u t ger ingen Titerabfal ls grundlegend verhnder t

hat . I m Gegensa~z zu obigen Viron beha l ten dio A- u n d C-H/~mag- g lu t in ine nach einer solchen :Behandlung ihren vollen Ti te r (Tab.7). Die bei T y p 9 in K l a m m e r n angegebenen Wer te geben e inen Versuch wieder, bei dem das Virus s ta r t 30 rain n u r 10 rain lang erhi tz t wurde. Dabei bewirkte die T ryps inbehand lung wie auch die E rh i t zung allein

Tabelle 7. Kombinierte Wirkung von Trypsin und anschlieflender Erhitzung au] Adenovirus-Hdmagglutinine

Hamagglutinationstiter

ohne Immunserum mit Immunserum

Virus~yp Trypsin, Trypsin, unbeh. Trypsin- 30 min anschl, unbeh. Trypsin- 30 min anschl.

bch. 56oc 30min bch. 56oc 30 min 56 ~ C 560 C

11

2O 2O 8O 1

(sop 1280

2O 20 20 20 8O 40

160 80 (80) (80) 640 32O

20 20 80

<10 (<5) <10

400 2OO

8O 160

400 400 200 200

80 80 160 160

400 200

8O 160

1 Nicht untersucht. Typ 5 und Typ 6 bereits gegen Trypsin allein unstabil (siehe Tab. 6).

2 Versuch, bei dem jewcfls nur 10 rain lang erhitzt wurde.

Eigensehaften der Adenovirus-H~magglutinine 105

keinerlei Titerverminderung, wKhrend der Titerabfall naeh kombinierter Behandlung genau so signifikant ist wie in dem Versuch mit 30 min Erhitzung.

Abtrennung des H;imagglutinins yon den Viruspartikeln dutch Zentri]ugieren

Das B-tt~imagglutinia yon Typ 6 lieB sieh dureh Zentrifugieren mi t 20000 g vollst~ndig, das ttiimagglutinin yon Typ 9 und 11 nur teilweise abtrennen (WI(~'r u. BAu]~n 1962). Entspre- ehende Versuche mit den C- l-Ti~magglutininen der Typen 1 und 4 zeigten demgegeniiber eine weitgehende Sedimen- t ierbarkeit sowohl des H/imagglutinins wie der infektiSsen Virusparti- keln naeh dem ersten Zentrifugiergang (Tab. 8 und 9). I m Gegensatz dazu ergab die Testung der Zentrifugierfraktio- nen der Typen 1 bzw. 6 mit heterologem Im- munserum - - womit also das A-It/imagglutinin er- faBt wurde - - eindeutig, dab diese I=Iitmaggluti- nine bei der angewende- ten Zentrifugalkraft nicht sedimentierbar sin& Dies war besonders deutlich bei Typ 1 (Tab.9), bei dem das C-H/imaggluginin nur im Sediment, das A-Hi~m- agglutinin aber mit vollem Titer im Uber- stand gefunden wurde,

Tabelle 8. Verhalten yon H~imagglutinin und in/ek- ti6sem Virus bei hochtourigem Zentri/ugieren I vo~

Adenovirus Typ 4 ~

Zcntrifugier- HA-Ti ter Infektiosi tats- fraktion ti ter (ID,o/ml)

V i r u s v o r

Zentrifugieren

1. ~berstand t~berstand Sediment

1. Sediment lJberstand Sediment

32

2 <2

2

16 2

16

101, 5

101 < 101

104, 3

10a,s

1 120 min mit 20000 9 im Rotor 40,3 der Spinco Model L Ultrazentrifuge.

Getestet ohne heterologes Immunserum =Hiim- agglutinin C.

Tabelle 9. Verhalten yon Hdmagfflutlnln und iu/ek- tiSsem Virus bei hochtourigem Zentri[ugieren vo~

Adenovirus Typ 1

Zentrier fugier- fraktion

Virus vor Zentrifugieren

1. Uberstand t~berstand Sediment

1. Sediment

HA-Titcr

C-HAG ~ A-HAG

40 320

<2 320 <5 320 <5 20 =<20

1 C-Hilmagglutinin bestimmt ohne, agglutinin mit heterologem Immunserum.

Infcktio- sitlttstiter (ID~o/ml)

I0;,5

102,o

10t, 5

A-H/im-

auch noch naeh einem zweiten Zentrifugiergang. Nach diesen Versuchen scheinen lediglich die A- und B-It/tmagglutinine mechanisch yon Viruspartikeln abtrennbar zu sein.

8*

t06 H. BAU:ER und R. WZOA~D:

Adsorpt ion an Blutzellen

D u r c h die Untersuchung der Adsorbierbarkeit der Viren bzw. der Hamagglutinine lieB sich einerseits die Frage nach der Abtrennbarkeit des H/imagglutinins yon Viruspartikeln weiter kl~ren uud zum anderen lieBen sieh weitere Unterschiede zwischen den Hiimagglutininen der einzelnen Gruppen erkennen. Bei allen Hamagglutininen der Gruppe A ebenso wie beim B-H/~magglutinin von Typ 6 war unter den gew/ihlten Versuchsbedingungen (siehe Methodik ) keine Adsorption an die Blut- zellen naehweisbar. Es zeigte sieh also im ~berstand keine Titerver- minderung, auch nicht, wenn die Adsorption bei 4~ vorgenommen

Tabelle 10. Adsorbierbarkeit der Hgmaggluilnine und des infekti6sen Virus verschiedener Adenoviren an Rattenblutlc6rperchen

H/imagglutinat ions t i ter Infektiositiitstiter (ID~o/ml) u ]ff~magglutinin

unbeh, nach Ads. unbeh, nach Ads.

1 C 40 < 5 103,a 103's 4 O 160 < 20 positiv 1 1 A 320 320 102,5 102,5 4 A 160 160 -- -- 5 A 320 320 102,5 102,5 6 A, ]3 160 160 105, 5 105, ~

112 E 640 < 10 103,0 101,7

1 Nicht austitr~ert. 2 PavianblutkSrperchen.

wardo. Im Gegensatz dazu wurden die C-H/imagglutinine vollst/indig an die Blutzellen adsorbiert. Bemerkenswert ist bei diesen, dal3 die infektiSsen Viruspartikeln nieht mit adsorbiert wurden, wie sich aus der Testung des 3~berstandes auf Infekbiosit/~t ergab (Tab. 10). Bezieht man die Er- gebnisse der Ultrazentrffugen-Untersuchungen mit in die Uberlegungen ein, so kommt man zu dem Schlu6, daft die C-H/~magglutinine etwa gleich gr0B sein miissen wie das infektiSse Virus, dab sie sieh abet you diesem in ihrer Affinit/~t zu der Oberfl/s der Blutzellen unterscheiden. Damit ist ein weiteres Unterscheidungsmerkmal gegenfiber den D- und E-H/~m- agglutininen gegeben, bei denen Virus und H/~magglutinin an die Blut- zelleu adsorbiert werden (siehe Typ 11 in Tab. 10).

Eine Adsorption yon H~magglutinin und infektiSsem Virus an die BlutkSrperehcn bei der HA wurde yon KASEL U.a. (1960, 1961) ffir Typ 10 und 15, wei~erhhl von Simon (1962b) fiir Typ 3 und 7 gefunden. Die entspreehenden Befunde yon PEI~EIRA U. DE FIalYEIREDO (1962) werden sp/iter diskutiert.

Eigenschaften der Adenovirus-tt~magglutinine 107

Verdnderung der Blutzellreceptoren Die Vieffalt der tt~magglutinine legte die Frage nahe, ob dem aucll

verschiedenartige Blutzellreceptoren entsprechen. In diesem FaR mii$ten mit einem bestimmten HKmagglutinin behandelte Erythrocyten dutch ein anderes noch agglutiniert werden kSnnen. Wir brachten zur Untersuchung dieser Frage virusbehandelte Blutzellen nach Auswaschen mit einem anderen Virus zusammen. Rattenblutzellen, die mit C- und D-Agglutininen behandel$ worden waren, zeigten nach Auswaschen, wie zu erwarten, vollstKndige Agglutination, so dab eine zus&tzliche HA dutch ein anderes Virus nicht nachzuweisen war. Wurden Erythrocyten mit einem der unvollst~ndig agglutinierenden Viren behandelt (A- oder B-H~magglutinin), so waren sie anschlieflend sowohl durch Adenovirus Typ 9 wie auch dutch Influenzavirus Typ A 1, A 2 und Sendaivirus noch agglutinierbar. (Verwendet wurden an Aluminium-Hydroxyd adsorbierte Antigene der ASTA-Werke.) Uberraschend war der Befund, dab mit Adenovirus Typ 1 und 2 (A-H~magglutinin) behandelte Blut- zellen nicht mehr durch ein anderes H~magglutinin der gleichen Gruppe in Gegenwart yon heterologem Immunserum, auch nicht durch das homologe, agglutiniert wurden, obwohl die Blutzellen keine Spontan-ItA zeigten.

Diese Ergebnisso machen es wahrscheinlich, dab allo A-H~imagglutinine die gleichen Erythrocytenreceptoron angreifen. Sie scheinen abet auch zu bedeuten, dab diese Viren mit den Receptoren reagieren, obwohl es ohne die Anwesenheit eines heterologen Immunserums nicht zur Agglutination kommt.

KAS]~L U.a. (1960) beschrieben oinen m6glicherweise ~hnlichen Effekt. Sie fanden in dem Oberstand yon mit Typ 1-Virus infizierten HeLa-Zellen einen Faktor, der die Recoptoren yon Menschenblutzellen ffir Adenovirus Typ 10, 13 und 26 so modifizierte, dal] es zu einem signifikanten Abfall des ItA-Titers kam. Die HA durch die ebenfalls Menschonblu~zellen agglutinierenden Typen 8 und 9 blieb unverhndert. Ein Zusammenhang zwischen diesem ,,Receptor-modifizierenden Faktor" und dem A-tthmagglutinin scheint aber nicht zu bestehen. W&hrend wit nhmlich die Ergebnisse obiger Autoren bei Behandlung yon Men- schenblutk6rporchen mit Adenovirus Typ 1 best/~tigen konnton, ffihrte eine gleiehartige Behandlung yon Rattenblutzellen nicht zur Ver- ~nderung ihrer Receptoren ffir Typ 10-Virus (Tab. 11).

Eine Beziehung zwischen dem ,,Receptor-modifizierenden Faktor" und unserem C-Hi~magglutinin, die beide bei den Typen 1, 2 und 4 vor- kommen, ist gleichfalls nicht anzunehmen, da der Faktor bei 100000 g nicht sedimentierbar ist (KASEL U. a. 1961).

Zur weiteren Kl~irung einer m6glichen Beziehung zwischen den Blut- ze]]receptoren fiir Myxoviren und ffir Adenoviren versuchten wit,

108 H. BAUER und R. WIGAND :

RattenblutkSrperchen mit Infiuenzavirus bzw. mit RDE zu behandeln. Die BlutkSrperchen zeigten nach Behandlung mit Infiuenzavirus Typ A (Stamm PR 8) einen 8--64fach reduzierten HA-Titer mit dem gleichen Influenzavirus, w~hrend die HA durch die A-H~magglutinine yon Typ 1, 2 und 4, B-H~imagglutinin von Typ 6 und durch D-Hamagglutinin yon Typ 9 nieht beeinflugt wurde. Eine Behandlung yon Rattenblutzellen

Tab elle 11. Behandlung von Menschen- und Batten- blutkSrTerchen mit Adenovirus Typ 1 und anschlie- flende Agglutination durch Adenovirus Typ 9 und 10

Blutzellen I H~tmagglutinationstit er mit Adenovirus-Typ

Species Vorbehandlung 9 10

Mensch Mensch Rathe Ratte

- - 160 Adeno 1 160

- - 80 Adeno 1 40

1280 80

1280 1280

mit RDE ffihrte nicht zum Ziel, da diese -- auch nach vorheriger Adsorption yon RDE mit RattenblutkSrper- ehen -- nach dieser Be- handlung stets spontan agglutinierten. Anderer- seits stellten KAS~L u. a. (1960) an Mensehen- blutkSrperehenfest, dab naeh Behandlung mit

Influenzavirus Typ A und B sich der HA-Titer dureh Adenovirus Typ 8, 9, 10, 13 und 26 verringerte und nach Behandlung mit RDE die Blutzellen sogar inagglutinabel durch diese Viren wurden. Im Gegensatz dazu sprieht der Befund 'yon BUCKLA•D (1959), wonaeh durch Formalin- behandlung yon MenschenblugkSrperchen die Receptoren ffir Adeno- virus Typ 9 zerstSrt wurden, whhrend sic unter den gleichen Bedingungen fiir Influenzavirus erhalten blieben, ffir eine Versehiedenheit der Blut- zellreeeptoren, gleich unserem an Rattenblutzellen gewonnenem Er- gebnis. Die Beziehungen zwischen den Receptoren ffir Myxo- und Adeno- viren bedfirfen danaeh weiterer Untersuehungen.

D i s k u s s i o n

Die yon uns untersuchten Eigenschaften der Hs A - - E sind in Tab. 12 zusammengestellt. Ihre Unterschiede sind bereits in den Ergebnissen herausgestellt worden.

R o s ] ~ (1960) schlug vor, die HA bzw. die HA-Hemmung zur Typi- sierung neuisolierter Adonovirusstiimme zu benutzen und hat dies an einer groBen Anzahl yon Virusst~mmen praktisch erprobt. Nach den Schwierigkeiten, die wir bei der Iterstellung fiir die HA geeigneter Virus- passagen bei den ersten Serotypen hat ten (siehe oben), kSnnen wir diese Methode nicht empfehlen, da nach unseren Erfahrungen immer die MSg- lichkeit bes teht , dab die getestete Viruspassage kein H~magglutinin onthglt. Weiterhin beobachteten N~sz u. a. (1962), daB nicht alle St~imme des gleiehen Typs (selbst innerhalb der gut agglutinierenden Gruppe I I naeh ROSEN) ein H~magglutinin bilden.

Eigenschaften der Adenovirus-H/~magglutinine 109

P~R~mA u. DE FmU~mEI)O (1962) haben kiirzlich Adenovirus- H/imagglutinine der Typen 1, 2, 4, 5 und 6 nach vorheriger Fluorocarbon- reinigung durch Chromatographie an DEAE-S/iulen fraktioniert. Sie fanden eine Beziehung zu den frfiher (P]~I~EmA u. a. 1959) yon dieser Arbeitsgruppe gefundenen A n t l g e n e n A, B und C in der Weise, dab die Frakfion A keine HA-Aktivit/~t, Fraktion B H_A-Aktivit/it ohne und mit

Tabelle 12. Zusammenstellunff der yon uns untersuchten Eiffenschaflen der Adenovirus.Hiimayglutinine

HRmagglutinin

Untersuchte Virustypen

Virusgruppe nach ROSEN (1960)

BlutkSrperchen yon

�9 �9 o fnochaktiv 10 mm ErhRzung (C) / inaktiviert

Inaktivierung durch Trypsin Inaktivierung dutch Trypsin und

ansctdiel~ende Erhitzung (30 rain 56 ~ C)

Adsorption { Hi~magglutinin an Blutzellen infektiSses Virus

Sedimen$ierbarkeit des HKmagglu- tinins bei 20000 g, 120 rain

1, 2, 4, 5, 6

B C D E

I I I I I I 1 I I I

Rat te Ra t tc Rat te , ~Iensch

6O 65

nein

j~

I I I

Ra t te

75 42 65 85 45 75

nein ja nein

nein nein

nein nein ja nein nein nein

nein ja

Affe

60 65

nein

j~

j& ja

teilweise

1 H/imagglutination nur in Gegenwart von heterologem Immunserum nachweisbar.

Immunserum, Fraktion C HA-Aktivit/~t nur mit heterologem Immun- serum aufweist. Letztere dfirfte also unserem A-H/imagglutinin entsprechen. Die englischen Untersucher fanden gleich uns, dab dies H/~magglutinin nicht an die Blutzellen adsorbiert ~ r d . Auch die In- aktivierung der in dor Pr/icipita~ion nachweisbaren sorologisehen Akti- vit/~t durch 10 rain Erhitzung auf 80 ~ C (ALLZSO~ u. a. 1960) stimmt gut mi~ unseren Ergebnissen bei der HA iiberein.

Schwer verst~ndlich erscheinen die Vorg/~nge bei der HA durch dieso A-H/~magglutinhm. Obwoh] das H~magglutinin nur beiAnwesenheit eines heterologen Immunsorums Blutzellen agglutiniert, scheint es auch ohno dieses die Blutzellreeeptoren zu ver/~ndern, da die ZeUen naeh Behandlung mit A-Hiimagagglutinin der Typen 1 und 2 zwar nicht - - wie nach Behandlung mit B-tt~magglutinin - - spontan agglutinieren, aber auch anschlioBend nicht mehr durch ein neues Virus dieser Gruppe agglutinierbar sind (siehe oben). Im gleichen Sinne spricht weiterhin der Befund von PEREII~A U. DE FIGUEmEDO (1962), dab Rattenblu~kSrperchen, die mit

110 H. BAUER und R. WmA~D :

C-Fraktion yon Typ 5.Virus behandel$ wurden, dutch heterologe Im- munseren ohne Gegenwart yon Virus agglutiniert werden, dab sic aber diese Agglutinierbarkeit durch Behandlung mit homologem Immun- serum (Typ 5-Antiserum) verlieren. Derart behandelte Blutzellen verhielten sich hinsich$1ich ihrer Agglutinierbarkeit wie normale Blut- zellen. Nach unseren Erfahrungen mit Rattenblutzellen nach Behand- lung mit Typ 1 oder 2 ist es allerdings unwahrseheinlich, dab sich die Befunde der englischen Autoren yon Typ 5 auf die anderen Typen fiber. tragen lassen.

Der Mechanismus der HA durch A-H/imagglutinin ist auf Grund der vorliegenden Befunde nicht eindeutig zu interpretieren. Drei Hypothesen erscheinen denkbar :

1. Die bereits erw/ihnte Vorstellung, dab Adenoviren einen Inhibitor der HA enthalten, der durch Antik6rper im Immunserum neutralisiert wird, konnten wir experimente]l nicht belegen. P n R E I ~ u. DE FIGUEI~EDO (1962) diskutieren zwei weitere M6gliehkeiten:

2. A-Hiimagglutinin k6nnte zu einer Sensibilisierung der Ery~hro- cyten-Oberfl&che f/ihren, ohne dab es an diese adsorbierb wLrd, oder

3. A-H/imagglutinin wiirde an die Oberfl/~che der Blutzellen adsorbiert und w/~re dort in der Lage, mit einem Antik6rper der heterologen Immunseren unter H~magglutination zu reagieren, ein Vorgang, der mit der sogenannten passiven Iti~magglutination vergleichbar w~re. Bei der zweiten M6glichkeit ist die Reversion der HA dutch nachtr/igliche Ein- wirkung yon homologem Immunserum, den diese Autoren bei Typ 5 gefunden haben, sehwer verst/indlieh, und auch der Meehanismus der HA dureh heterologes Immunserum bliebe unklar. Die englischen Autoren bevorzugen daher die drit te M6glichkeit. Dabei wfirde die Re- version dutch gr6Bere Affinit/it des homologen Immunsermns zum H/imagglutinin zu dessen Absprengung yon der Zelloberfliiehe ffihren. Die HA durch heterologes Immunserum k6nnte dadurch erkl~rt werden, dal3 Frakt ion C bzw. ]:[/imagglutinin A zwei Komponenten en$hi~lt, yon denen eine mit den Blutk6rperchen, die andere mit dem Antik6rper des heterologen Serums reagiert. Nach Ansicht dieser Autoren wfirde es sich bei der zweiten Komponente um ein untergruppenspezifisches Antigen handeln; auf Grund unserer ]3efunde mfigte es dagegen gruppenspezifisch sein, da such Adenovirus-Inmlunseren auBerhalb der Untergruppe I I I naeh ROSEN die H/~magglutination ,,verstiirken" k6nnen. Die Sehwierig- keit bei dieser Deutung ]iegt darin, dab bei ttKmagglubinin A keine Ad- sorption an die Blutzellen nachgewiesen werden konnte. Es ist allerdings denkbar, dab nur ein so geringer Tell adsorbiert wird, dab es zu keiner merkbaren Titerverminderung kommt.

PER~raA (1960) konn~e in Gewebekulturfiberst~inden nach Infek$ion mi$ Adenoviren einen Faktor nachweisen, der die intracellul~re Vermehrtmg anderer

Eigenschaften der Adenovirus-H~,magglutinine 111

Viren hemmt. Dieser Faktor, der wegen abweichender Eigenschaften nicht als Interferon angesehen werden kann, hat manche ~hnlichkei$ mit dem Hhmagglu- tinin A: Er fand sich bei den Typen 1, 2, 4, 5 und 6, nicht dagegen bei Typ 3, lieB sich vom Virus durch Zentrifugieren abtrennen, war nach Chromatographie in den leraktionen B und C nach P~REmA U. a. (1959) ZU finden und wurde durch 1 Std Erhitzm~g auf 70~ zerstSrt. Die Frage, ob diese beiden Faktoren miteinander identisch sind, w~ire yon gro~em Interesse.

Auf Grund unserer Untersuchungen unterscheiden sich die ohne lmmunserum wirkenden H~magglutinine B und C in wesentlichen Eigenschaften voneinander (Tab. 12). Da das B-tt~magglutinin durch Trypsin vSllig inaktiviert wird, kann man annehmen, dab es zumindest in einem ffir die HA wesentlichen Tefl aus Protein besteht. Eine andere Eigenschaft - - namlich die fehlende Adsorbierbarkeit an Blutzellen, obwohl diese nach Behandlung mit dem H~magglutinin anschlieBend spontan agglutinierten -- fiihrte frfiher schon zu der Annahme (WIGAND u. BAvv.~ 1962), es mSge sich hierbei um ein It~magglutinin mit Ferment- charakter handeln. PER~mA U. DE FIOU]~n~EDO (1962) unterschieden nut ein ohne Immunserum wirksames H~magglutinin in dieser Virusgruppe, das in seinen Eigenschaften teflweise unserem B- und teilweise unserem C-Hiimaggluthlin entspricht. Sie fanden, da~ dieses Hamagglutinin - - entsprechend unserem B-II~magglutinin -- durch Trypsin inaktiviert wird; andererseits wurde es bei 37 ~ vollst~ndig, bei 20 ~ teilweise an Erythrocyten adsorbiert, ein Verhalten hhnlich unserem H~imagglutinin C. Diese Diskrepanz in den Befunden bedarf weiterer Kl~rung. Es is~ vorstellbar, dab bestimmte Viruspassagen aller ffinf Virustypen H~imagglutinine B oder C enthalten kSnnen, abh~ngig yon Versuehs- bedingungen, die wir noch nicht kennen.

Den Mechanismus der HA durch die H~imagglutinine C, D und E kann man sich auf Grund ihrer Adsorbierbarkeit an die Blubzellen in einer einfachen Kopplung der Erythrocyten mit den H~magglutininen als Bindeglied vorstellen. Die Hamagglutinine D und E seheinen eine wichtige Pro~einkomponen~e zu enthal~en, da ihre Trypsinbehandlung eine st~rkere Ititzeempfindlichkeit zur Folge hat. l~ach den Ergebnissen frfiherer Ultrazentrifugierversuche (WmAND U. BAUER 1962) iSt bei diesen Viren an das Vorhandensein zweier in Gr6Be oder Dichte verschiedener I-[s zu denken. Ffir eine Unterscheidung zwischen D- und E-Hi~magglutininen sprechen zun~chst nur die unterschiedlichen Erythrocytenar~en, die agglutiniert werden. Auf Grund der Befunde yon SIMO~ (1962a) unterseheiden sich jedoch innerhalb der Gruppe I naeh ROSEN die yon uns nieht untersuchten Typen 3, 7 und 14 in den Eigenschaften ihrer H~magglutinine yon den Typen 11 und 16, so dab wahrscheinlich die Einffihrung der Bezeiehnung ,,H~magglutinin F" ffir Typ 3, 7 und 14 angebraeht ist. Die Unterschiede beziehen sich auf den Einflu~ versehiedener Rhesusblutehargen, der Reaktionstemperatur,

112 I-I. BAv]~R und R. WIOXND:

der Beeinitussung der Zellreceptoren durch Trypsin bzw. Perjodat, der pmStabilit/it des H/~magglutinins und der Temperaturabh/ingigkeit yon Adsorption und Elution der tt/~magglutinine an bzw. yon den Blutzellen. Wie wir feststellen konnten, werden weiterhin die BlutkSrperchen yon Cynomolgus- und Pavianaffen nur dutch die Typen 11 und 16, nieht durch Typ 3, 7 und 14 agglutiniert. Gemeinsam seheint der Gruppe I die Ad- sorbierbarkeit des H/~magglutinins und des infekti6sen Virus an die Blut- zellen zu sein (Zvsc~K 1961, SI~o~ 1962a, b). Auch mit Hilfe yon chromatographischen Methoden gelang es nicht, H/~magglutinin und infektiSses Virus bei Typ 3, 7 und 11 voneinander zu trermen (Z~rDA~OV u. M~Y~_L~ 1962; SIMO~ 1962 b). Dermoeh spreehen unsere Zentrifugier- versuehe daffir, dab H/imagglutinin D und E nicht v611ig mit den Virus- partikeln identisch sind, da ein Tell des H/~magglutinins im Uberstand blieb. Die Zentrifugierversuche yon Zvsc'-g~K (1961) mit Typ 3 (keine Sedimentation des H/imagglutinins bei 60 rain 25000 g, vollst/indige naeh 90 rain 100000 g) lassen sieh, da die Infektiosit/it nicht untersucht wurde, nicht sicher mit unseren an Typ 11 durehgeffihrten vergleichen.

Interessant ist weiterhin der Befund von ZHDANOV U. MEXL~R, wonaeh sieh bei Adenovirus Typ 9, 10 nnd 15 t{/~magglutinin und in- fekti6ses Virus chromatographisch voneinander trennen lassen, was allerdings wenig fiberzeugend dargestellt ist and daher noch der Be- st/itigung bedarf. Ein weiterer Untersehied zwischen H/~magglutinin F und D liegt in der Resistenz gegen p-chlor-mercuribeIrzoat. So land BUCKLAND (1960), dab das H/~magglutinin yon Typ 7 inaktiviert wird, nicht dagegen diejenigen der Typen 9 und 17. Die H/~magglutinine der anderen Gruppen wurden in dieser Itinsicht noeh nicht untersucht.

Das H/imagglutinin des t{undehepatitisvirus besitzt naeh den Unter- suchungen von FASTIEI~ (1957) wiederum abweichende Eigenschaften (enger pm]3ereieh der HA, Adsorption und Elution). Die Erforschung der tteterogenit/~t der Adenovirus-tt/~magglutinine dfirfte danach noch nich~ am Ende sein.

Summary Adenovirus hemagglutinins were classified into five groups designated

as A to E according to differences in heat stabihty, sensitivity to trypsin treatment or to trypsin plus subsequent heating, adsorption of hemagglutinin and infectious virus to red cells and separation of hemagglutinin from infectious virus by nltracentrifugation. These properties are summarized in Table 12. Hemagglutination by A hemagglutinin is demonstrable only in the presence of heterologous adenovirus immune serum, probably of all serotypes. Hemagglutinin A may modify red cell receptors in absence of heterologous serum ; these receptors appear to be different from those involved in hemagglutination by myxoviruses. The mechanism of hemagglutinationby the various hemagglutininsis discussed.

Eigenschaften der Adenovirus-Hi~magglutinine 1 1 3

Wir danken Fraulein E. BASCHLEBEI~, H. HAEFNER und I. L ~ I r fiir ihre Hilfe bci den Untersuchungen, Herrn Dr. habil. J. POTEL (ASTA-Werke, Brackwede) fiir die freundliehe/2~berlassung yon Infiuenzaviren und Virusantigenen.

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Professor Dr. R. WICAND und Dr. H. BAUE~t, Institut ffir Hygiene und Mikrobiologie der Universit~t des Saarlandes,

665 ttomburg/Saar, Med. Fakult~,t, ~aus 5

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Eigenschaften der Adenovirus-Hämagglutinine