172 WISSENSCHAFT · SPECIAL: NEXT GENERATION SEQUENCING

FRANZISKA L. LEDERER1, TOBIAS J. GÜNTHER1, JOHANNES RAFF1, 2,

KATRIN FLEMMING2, KATRIN POLLMANN1

1HELMHOLTZ-ZENTRUM DRESDEN-ROSSENDORF, HELMHOLTZ-INSTITUT FREIBERG

FÜR RESSOURCENTECHNOLOGIE2HELMHOLTZ-ZENTRUM DRESDEN-ROSSENDORF, INSTITUT FÜR RESSOURCEN -

ÖKOLOGIE

Bacterial isolates from a uranium mining waste pile are adapted in a veryspecial kind of way to their heavy metal contaminated environment.Genome analyses identified many genes that might support the incidenceof these strains in their special habitat. Using the next-generationsequencing technology multiple surface (S-) layer genes and differentkinds of metal transporter genes were identified. These data give thegenetic affirmation that these strains are adapted substantial to theirenvironment.

10.1007/s12268-014-0425-2© Springer-Verlag 2014

ó Im Erzgebirge wurde mit Beginn des19. Jahrhunderts intensiver Uranerzbergbaubetrieben, wobei bis 1990 etwa 3.000 mitSchwermetallen kontaminierte Abfallhaldenentstanden. Da diese Halden schutzlos demWetter ausgeliefert waren, galt ein Gebiet vonrund 168 Quadratkilometer als kontaminiert[1]. Die Verbreitung toxischer Schwermetall -

ionen in der Umwelt wird entscheidend durchphysikochemische Parameter, aber auchdurch biologische Aktivität beeinflusst. ImFokus unserer Untersuchungen stand dieAnpassung von Mikroorganismen an ihrenLebensraum Halde.

Die Entnahme von Bodenproben aus derUranabfallhalde Haberland bei Johanngeor-

genstadt beabsichtigte die Untersuchung dermikrobiellen Vielfalt in einem Schwermetall-belasteten Lebensraum. Hier vermutete manhoch spezialisierte Mikroorganismen, wel-che Strategien entwickelt haben, um in ihremHabitat leben zu können. Mit 16S-rDNA- Analysen konnten einzelne Arten bestimmtwerden. Eine Vielzahl der isolierten und identifizierten Mikroorganismen gehörtden Gattungen Bacillus und Lysinibacillus an,die typische Bodenbewohner sind [2]. Durchdie Kultivierung und Charakterisierung ein-zelner Arten wurden bei vielen untersuch-ten Stämmen morphologische Besonder -heiten nachgewiesen. Spezielle Hüllprotei-ne, die S-Layer-Proteine (surface layer pro-teins), bedecken in einem feinen zwei -dimensionalen Gitter die Oberfläche vielerdieser Bakterien. Da S- Layer in einem mehr-stufigen Verfahren von den Bakteriengetrennt werden können und dabei ihreFähigkeit zur Bildung zweidimensionaler Git-ter behalten, können diese Hüllpro teine zurgezielten Beschichtung von Materialien ein-gesetzt werden. In Untersuchungen an Zellenund gereinigtem S-Layer-Protein wurde beob-achtet, dass die Hüllproteine die Fähigkeitzur gezielten Bindung bestimmter Schwer-metallionen besitzen [3]. Sie schützen damit

Mikrobielle Ökologie

Eigenschaften von Bakterien ausSchwermetall-kontaminierten Halden

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˚ Abb. 1: Rasterkraftmikroskopische (AFM-) Aufnahmen von Lysinibacillus sphaericus JG-B53: A, Zellen; B, Zelloberfläche; C, Detailaufnahme derS-Layer-Schicht auf der Oberfläche der Zellen in p4-Symmetrie.

A B C

die Bakterien vor der Aufnahme derIonen in das Zellinnere. Mit Hüllpro-teinen beschichtetes Filtermaterialermöglicht es, gezielt Schwermetallio-nen aus kontaminiertem Wasser zu ent-fernen. Da die Proteine hoch selektivbestimmte Metallionen binden, könnenauch Verfahren zur Wertstoffrückge-winnung entwickelt werden.

Hüllproteine als natürlicheSchutzschilder im LebensraumHaldeS-Layer-Proteine sind unter den Proka-ryoten weit verbreitet und gelten als dieeinfachste und älteste Form von biolo-gischen Membranen. Sie dienen denMikroorganismen in vielfältiger Weise,beispielsweise zur Formgebung, alsSchutz vor Fressfeinden und als Mole-kularsieb [4–6]. Diese Proteine filterndabei neben lytischen Enzymen auchtoxische Schwermetallionen aus demumgebenden Milieu, gestatten aberessenziellen Spurenelementen denDurchtritt.

Über ihre charakteristische Amino-säurezusammensetzung sind ver-schlüsselte S- Layer-Proteine im bakte-riellen Genom relativ einfach zu iden-tifizieren. Einem Signalpeptid folgen invielen Fällen S-Layer-homologe Domä-nen, die für die Verankerung der Pro-teine in der Zellwand verantwortlichsind. Diese Segmente können aber auchC-terminal vorliegen oder wie beibestimmten Lactobacillus-Stämmenganz fehlen. Die Sekundärstruktur derS-Layer setzt sich in der Regel aus ca.20 Prozent α-Helices, 40 Prozent β-Falt-blättern und 5–45  Prozent β-turnszusammen [7].

Haldenisolat Lysinibacillussphaericus JG-B53Das bakterielle Haldenisolat Lysiniba-cillus sphaericus JG-B53 wurde nachgenetischen Untersuchungen zurStammspezifizierung mikrobiologischgenauer untersucht (Abb. 1). Dabei wur-de die Fähigkeit der Bakterien zur Bin-dung von Uran, Platin und anderenMetallen an der Oberfläche festgestellt.Die die Zellen umhüllende Protein-schicht konnte in einem mehrstufigenVerfahren von den Zellen getrennt undgereinigt werden. Die S-Layer-Proteinezeigten ebenfalls eine verstärkte Affi-

nität zur Bindung von Schwermetallio-nen. L. sphaericus-JG-B53-Zellen undihre gereinigten Oberflächenproteinewurden in vielen Untersuchungengenauer charakterisiert, wobei diebesonderen Eigenschaften der S-Layerim Fokus standen.

Diese Proteine lassen sich beispiels-weise sehr einfach an verschiedenenOberflächen zu einem zweidimensio-nalen Gitter kristallisieren. Außerdemkönnen in den Poren dieses S-Layer-Git-ters Nanopartikel abgeschieden odersynthetisiert werden. Der von den Zel-len abgelöste und gereinigte S-Layersowie die Zelloberfläche von L. sphae-ricus JG-B53 zeigen in rasterkraftmi-kroskopischen Aufnahmen Kristallgit-ter mit quadratischer p4-Symmetrie(Abb. 1C).

NGS-Technologie identifiziertgenetische VielfaltBesonderer Fokus unserer Untersu-chungen galt den S-Layer-Genen imGenom von L. sphaericus JG-B53. Bak-terien verschlüsseln häufig mehrereähnliche S-Layer-Proteine. Die Verwen-dung klassischer Verfahren wie Klo-nierung und Sequenzierung zur Iden-tifizierung und Zuordnung von aktivenGenen ist dabei oft schwierig und birgtVerwechslungsgefahren. Die korrekteErfassung von Kopien ist dabei nurschwer möglich. Mithilfe der Next Gene-ration Sequencing(NGS)-Technologiekönnen solche Schwierigkeiten ausge-schlossen werden.

Die NGS-Technologie basiert auf derVerwendung von genomischer DNA,welche durch Fragmentierung in eineBibliothek von kleinen Segmenten zer-legt wird. Anschließend werden diesekleinen Segmente einheitlich und exaktin Millionen von Parallelansätzensequenziert. Mithilfe geeigneter Pro-gramme werden die kurzen Basenket-ten zusammengefügt und ergeben sofür den untersuchten Organismus dieexakte Basenzusammensetzung dergenomischen DNA, welche nun ge -zielt nach Motiven untersucht werdenkann.

Die DNA von L. sphaericus-JG-B53-Zellen wurde extrahiert und gekühlt andie Firma AROS Applied BiotechnologyA/S verschickt, welche die DNA mithil-fe der NGS-Technologie mit dem Illu-

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mina HiSeq 2000 untersuchte. Die Rohdatenwurden anschließend eigenständig bioinfor-matisch mit der Software Genomics Work-bench (CLC bio) analysiert.

Mithilfe der Genomdaten wurde das funk-tionale Gen B53 slp1 (3.312 Basenpaare) iden-tifiziert. Das Gen verschlüsselt ein 1.104 Ami-nosäuren großes Protein mit einem theoreti-

schen Molekulargewicht von 116 Kilodalton.Dieses Protein besitzt ein 31 Aminosäurengroßes Signalpeptid, drei darauffolgende S-Layer-homologe Domänen sowie einen theo-retischen isoelektrischen Punkt von pH 5,5. InGröße und Aufbau ähnelt B53 Slp1 dem S-Lay-er-Protein SlfB von L. sphaericus JG-A12, einemweiteren Haldenisolat. Dieser S-Layer-Typscheint den Haldenbewohnern einen beson-deren Vorteil zu verschaffen [8].

Neben diesem Gen wurden zwölf weitereS-Layer-ähnliche Gene im Genom des Stammsentdeckt, welche sich stark in ihrer Größeund ihrem Aufbau unterscheiden (Tab. 1).Untersuchungen der mRNA von aktivenL. sphaericus-JG-B53-Zellen zu Beginn der sta-tionären Phase zeigten die Aktivität von sechsder 13 S-Layer-ähnlichen Proteine (Abb. 2).

Sowohl die große Menge an vorhandenenS-Layer-Genen im Genom als auch die Expres-sion einer ungewöhnlich hohen Zahl vonS-Layer-Proteinen zeugen von einer beson-deren Anpassung dieser Bakterien an ihrenLebensraum.

Die Vielzahl an S-Layer-Genen mit zum Teilsehr ähnlichen Sequenzen deutet auf denhorizontalen Transfer von Genen zwischenden Bakterienstämmen, die in der Haldeleben, hin. Genomanalysen an weiteren Haldenisolaten zeigten sehr häufig Ähnlich-keiten zu den S-Layer-Genen von L. sphaericusJG-B53. Das Vorkommen von S-Layer-Protei-nen sowie die Vielzahl an Kopien in den ein-zelnen Stämmen zeigen, dass diese Proteine

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˚ Abb. 2: Untersuchung der mRNA von aktiven Lysinibacillus sphaericus-JG-B53-Zellen zu Beginnder stationären Phase. Darstellung von Genfragmenten S-Layer-ähnlicher Proteine, erstellt unterVerwendung von cDNA (g) und gDNA (c). +: wird exprimiert, –: wird nicht exprimiert, M: Marker1 kb Plus DNA Ladder (Fermentas).

B53 Slp1 1.104 116 5,5 31 3 (N) 40,3 39,6 10,1 10

B53 Slp2 728 82,9 6,13 35 1 (C) 36,5 36 13,5 14

B53 Slp3 1.434 158,3 5,13 34 3 (N) 38,2 40,2 10,1 11,5

B53 Slp4 631 69 8,13 26 3 (N) 39,8 38,5 10,9 10,8

B53 Slp5 1.050 110 4,89 28 3 (N) 42,4 40,1 7,3 10,2

B53 Slp6 362 40,6 4,75 – 1 (N) 37,3 44,7 7,2 10,8

B53 Slp7 393 45,6 5,34 24 – 41 37,4 8,9 12,7

B53 Slp8 483 53,6 8,5 28 3 (C) 37,5 41,2 8,3 13

B53 Slp9 305 33,6 5,88 24 – 42,6 35,4 12,2 9,8

B53 Slp10 384 43 8,8 21 1 (N) 37,5 36,7 13,6 12,2

B53 Slp11 929 101,6 7,14 28 3 (N) 40,6 35,8 12,7 10,9

B53 Slp12 362 40,15 5,64 24 3 (N) 41,3 35,1 9,9 11,9

B53 Slp13 1.253 132,5 4,85 28 3 (C) 38,6 43,7 9,8 7,9

Tab. 1: Putative S-Layer-homologe Proteine von Lysinibacillus sphaericus JG-B53.

AS: Aminosäure, kDa: Kilodalton, pI: isoelektrischer Punkt, SLH-Domäne: S-Layer-homologe Domäne, N: N-terminal, C: C-terminal

S-Layer-Protein Proteingröße Molekulare pI Größe Signal- Zahl/Position Aminosäurezusammensetzung (mol%)(AS) Masse (kDa) peptid (AS) SLH-Domänen unpolar polar sauer basisch

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eine besondere Bedeutung für das Über-leben der Mikroorganismen in der Hal-de haben.

Metalltransporter schaffenÜberlebensvorteilIm Genom von L. sphaericus JG-B53wurden bei der Suche nach potenziellenS-Layer-Genen einige Metalltransporterund Metallbindemotive entdeckt. So las-sen sich hier verschlüsselte Proteine fürdie Bindung von Kupfer, Arsen, Kobalt,Zink und Cadmium identifizieren. IhreExpression wurde bisher nicht über-prüft. Durch den aktiven Abtransportder in die Zellen eingedrungenenSchwermetall ionen aus den Zellen her-aus verhindern viele Bakterien die toxi-schen Effekte, die durch die Metallio-nen im Zellinneren ausgelöst werden.Diese Ergebnisse untermauern eben-falls die Annahme, dass L. sphaericusJG-B53 sich an seinen Schwermetall-kontaminierten Lebensraum Halde inbesonderer Weise anpassen kann.

Die im L. sphaericus-JG-B53-Genomidentifizierten Gene scheinen zwischenden Bewohnern der Halde über mobileElemente wie Plasmide ausgetauschtzu werden.

DanksagungWir danken dem BMBF für die finan-zielle Unterstützung dieser Arbeiten(NanoFoto-BMBF/DLR01SF0717 undAptaSens-BMBF/ DLR01RB0805A). M.Dudek, F. Lehmann und C. Bobeth dan-ken wir für die Unterstützung unsererLaborarbeiten. ó

Literatur[1] Beleites M (1992) Altlast Wismut:Ausnahmezustand, Umweltkatastrophe und dasSanierungsproblem im deutschen Uranbergbau.Brandes & Apsel, Frankfurt a. M.[2] Selenska-Pobell S, Panak P, Miteva V et al. (1999)Selective accumulation of heavy metals by three indi-genous Bacillus strains, B. cereus, B. megaterium andB. sphaericus, from drain waters of a uranium wastepile. FEMS Microbiol Ecol 29:59–67[3] Merroun ML, Raff J, Rossberg A et al. (2005)Complexation of uranium by cells and S-layer sheetsof Bacillus sphaericus JG-A12. Appl Environ Microbiol 71:4473–4484[4] Koval SF, Murray R (1986) The superficial arrayson bacteria. Microbiol Sci 3:357–361[5] Wildhaber I, Baumeister W (1987) The cell envelo-pe of Thermoproteus tenax: three dimensional structu-re of the surface layer and its role in shape mainte-nance. EMBO J 6:1475–1480[6] Engelhardt H, Peters J (1998) Structural researchon surface layers: a focus on stability, surface layerhomology domains, and surface layer-cell wall interac-tions. J Struct Biol 124:276–302[7] Sára M, Sleytr UB (2000) S-layer proteins. J Bacteriol 182:859–868[8] Lederer FL, Weinert U, Günther TJ et al. (2013)Identification of multiple putative S-layer genes partlyexpressed by Lysinibacillus sphaericus JG-B53. Microbiology 159:1097–1108

Korrespondenzadresse:Dr. Franziska LedererHelmholtz-Zentrum Dresden-RossendorfHelmholtz-Institut Freiberg für RessourcentechnologieArbeitsgruppe BiotechnologieBautzner Landstraße 400D-01328 DresdenTel.: 0351-260-3138Fax: 0351-260 3553f.lederer@hzdr.dewww.hzdr.de

AUTOREN

Katrin Flemming, Katrin Pollmann, Tobias J.Günther, Franziska L. Lederer und JohannesRaff (v. l. n. r.)

Die Autoren erforschen seit vielenJahren die Wechselwirkungen vonMikroorganismen mit Metallen. Be-sonderer Schwerpunkt lag dabei aufbakteriellen S-Layer-Proteinen und ih-rer Nutzung für technische Anwen-dungen. Das Wissen über die Bakte-rienstämme in Uranabfallhalden wur-de mittels Next Generation Sequen-cing (NGS) entscheidend vorange-bracht. Inzwischen arbeitet die Grup-pe u. a. daran, mithilfe von Mikroorga-nismen wertvolle Metalle aus Erzen zugewinnen. Die im Vorfeld durch NGSerhaltenen Informationen tragen hierzur Technologieentwicklung bei, wiez. B. zum gezielten Design metallbin-dender S-Layer-Proteine.