Med. Mierobiol. Immunol. 157, 120--131 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Eine Methode zur spezifischen Reinigung der ersten Komplementkomponente C 1"

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Institut ffir Medizinische Mikrobiologie tier Johannes Gutenberg-Universit~t, Mainz

Eingegangen am 22. September 1971

A Two-Step Method for the Pur i f ica t ion of C1

Summary. A two-step method for the purification of C1 out of guinea-pig serum has been investigated. The first step consists in the precipitation of the euglobulin fraction of serum. An ionic strength of 0.015 and a pH-value of 6.7 have been found to be the optimal conditions for this precipitation. The second purification step consists in the following procedure: The C1 in the euglobulin preparation is incubated with heavily sensitized ghosts of sheep-erythrocytes at a low ionic strength; these cells with the antibody-bound C1 then are thouroughly washed and afterwards the C1 is eluted from the antigen-antibody-Cl-eomplex with a 1.5 molar NaCl-buffer. If this eluate is contaminated with proteins out of the celimembrane a second precipitation of the euglobulins or ultracentrifugation will separate these proteins from C1. The characteristics and the criteria for purity and functional activity of such Cl-preparations are described.

Zusammen/assung. Verschiedene Parameter fiir die Ausf~llung der Cl-ent- haltenden Euglobulinfraktion aus Serum fiir die Anlagerung yon C1 an sensibili- sierte Erythrocytenstromata nnd fiir die anschliel3ende Abdissoziation des C1 yore Antigen-An~ikSrperkomplex wurden untersucht mit Hinbliek auf optimale Aus- beute an funktionell aktivem C1. Die Untersuchungen fiihrten zu dem folgenden Pr~iparationsweg f(ir C1.

Im ersten Schritt erfolgt die :Euglobulinpr/~cipitation bei einem p]~ yon 6,7 und einer Ionenstarke yon 0,015. Diese Ionenst/~rke ist identisch mit einer Leit- f~ihigkeit yon 2 mS des mit H~O verdfinnten Serums.

Im zweiten Reinigungssehritt wird das C1 der Euglobulinfraktion gelSst in einem Puffer der Ionenstiirke 0,065, an sensibilisierte Erythrocytenstromata an- gelagert; der cellulare Komplex Antigen-AntikSrper-C1 wird dana yon allen yon der ZeUmembran austretenden Eiweillen freigewaschen. AnschlieBend wird C1 durch Verwendung eines 1,5 m NaC1-Puffers vom AntikSrper abdissoziiert. Gelegent- liche Kontamination des 1,5 m-Eluats mit EiweiBen aus der Membran der Zellen kann durch eine zweite Euglobulinfiillung oder durch Ultrazentrifugation aus- geschaltet werden.

Die Reinheitskriterien des C1-Pr~parates werden mit denen anderer Pr/ipara- tionsverfahren verglichen und diskutiert. Der tectmische und zeitliche Aufwand dieses Darstellungsweges ist erheblich geringer als bei anderen Verfahren.

* Die Arbeiten wurden unterstiltzt mit Forschungsmitteln der VW-Stiftung (11/1130) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Ri 118/3).

Die Komplementnomenklatur und die Abkiirzungen warden entsprechend den Empfehlungen des Bull. Wld Hlth Org. 89, 935 (1968) verwendet.

Methode zur spezifischen l~einigung der ersten Komplementkomponente C1 121

Einleitung Die erste Komplementkomponente, C1, wurde als 19S Makromolekiil

eharakterisiert mit einem Molekulargewicht yon 1000000; C1 gehSrt zur Eugloblfllnfraktion des Serums und wandert elektrophoretiseh mit den 7-Globulinen. Dureh Chromatographie in EDTA-haltigen Puffern kann C1 in die Untorkomponenten Clq, Clr und Cls dissoziiert werden [7, 9]. Unter dem EinfluB hoher Ionenstt~rke kann C1 in bis zu 12 loichte Monomere mi t einer Sedimentationskons~ante yon etwa 4S zerlegt wer- don [3,12]. Der Nachweis yon C1 ist auf zwei Wegen mSglich, entweder immunehemiseh mit ttilfe yon quantita~iven Prieipitat ionsmethoden oder durch die Funktionsanalyse im I-Is Mit dieser funktio- nellen MeBmethode der Molekulartitra$ion ist es mSglieh, die Zahl der hhmolytisch aktiven C1-Molekiile im Serum odor in einer LSsung zu be- stlmmen. Colten e~ al. (1967) haben naehgewiesen, dal3 ein einziges hiimolytisch aktives Molekiil C1 -- im weiteron e/]e]ctives Mole]~iil C1 genannt -- identisch ist einem einzigen Proteinmolekiil won C1. Im Meer- sehweinehenserum betr~gt die C1-Konzentration 5 - - 8 • TM effektive Molekfile C1 pro nil; im mensehlichen Serum kSnnen 2--4 • 10 TM effek- t i r e Molekiile C1 pro nil naehgewiesen werden. Auf Grund des bekannten Molekulargewichtes lt~i]t sieh aus diesen Angaben ffir Meersehweinchen- serum ein CI-Proteingehalt yon ca. 15 ttg/ml und won oa. 50 ~g/ml ffir menschHches Serum errechnen. C1 stellt also ungeft~hr 1/3000 der ge- samten Serumproteine dar.

In Tab. 1 sind die in der Literatur dokumentierten Darstellungs- methoden fib C1 zusammengostellt. Die bishorigen Methoden sind ent- weder teehniseh sehr aufwendig, oder man kann nur eine Anreiche- rung won C1 im Endpri~parat erzielen.

Ziel dioser Untersuehungen war es, die Parameter der einzelnen Prti- parationssehritte zu untersuchen mid sehlielMich mit mSglichst einfaehen technisehon Mitteln C1 aus dem Serum rein und funktionell aktiv dar- zustellen.

Ergebnisse 1. Prdclpltation der Gl haltigen Eufflobulin/raktion

C1 geh5rt zur Euglobulinfrak~ion des Serums, d. h. es wird bei Er- niedrigung der Ionenst~rke unl5slich. Der isoelektrische Punkt des Molekfils lieg$ in leicht sauren pH-Bereichon. I)er erste Sehritt bei alien Priiparationswegen (siehe Tab. 1) ist meist die Ausfifllung dot EuglobuHn- fraktion des Serums durch Erniedrigung der Ionensttirke bei neutralen p t t -Wer ten odor bei pt t -Werton im sauren Bereich bis p i t 5,2. In einer ersten Versuchsserie wurde versucht, die optimalen Bedingungen fiir diese Prieipi ta t ion zu ermitteln.

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LeitfS.higkeit

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Abb. I. EinfluB der Wassersk)ffionen-Konzentration und der Ionenst~rke auf die Prgcipitation der C1 haltigen Fraktion. Je 10 ml Serum wurden auf die an- gegebenen pH-Werte eingestellt und mit aqua dem. 1:10 verdiinn~; C1-Gehalt, pH und Leitfiihigkeit wurden gemessen. Die Serumverdfinnungen warden gegen jeweils 800 ml aqua dem. untmr st~ndigem Riihren im Eisbad dialysiert. Alle 30rain wurde die Konduktivit~it gemessen und 1 ml entnommen und bei 18000 U/rain zentrifugiert. Das zweimal in 0,015 m NaC1 gewaschene Praeipitat wurde in 1 ml VBS gelSst. Dot C1-Gehalt dieser L6sung ist auf der Ordinate

aufgetragen

Die Abb . 1 zeigt , daI3 C1 be i nu r le ich te r Ans i iuerung des Serums a u f p H - W e r t e zwischen 6,5 u n d 7,0 u n d du rch Verd i innen des Serums au f eine Leitf i~higkeit zwischen 2 m S u n d 1 m S - - dies e n t sp r i c h t e twa einer I o n e n s ~ r k e y o n T/2 ~ 0,015 - - vo l l s t~ndig pri~cipit iert wird. Dieses C I - P r ~ c i p i t a t k a n n in Puffern hSherer Ionens t i i rke wieder vol ls t i indig

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Methods zur speziiischen Reinigung der ersten Komplementkomponente C 1 125

und ohne Aktivit~tsverlust gelSst werden. Die Versuche zeigten dariiber hlnaus, dab dutch die Ausfs der Euglobulinfraktion bei noeh nied- rigerer Ionensts C1 unl6slieh wird und dabei irreversibel denaturiert wird. Aueh pH-Versehiebungen auf Werte unter pH 5,5 bewirken eine solche Denaturierung des Molekfils. Fiir die folgenden Versuehe wurden die in dieser Versuchsreihe als optimal ermittelten Bedingungen der Euglobulinlor~ciloitation , n/imlich Verdiinnen des Serums auf eine Ionen- sts yon um 0,015 naeh vorherigem Einstellen des Serum-pH auf Werte zwisehen 6,5 und 7,0, angewendet.

2. Spezi/ische Relnlgung yon C1 dutch Anlagerung an Immunaffgregate und darau//olffende Abspaltung

Von Becker (1959) wurde beschrieben, dab C1 in EDTAhaltigem Milieu yore Immunkomplex AgAkC1 abgesprengt wird. Klein (1967) mud Steinbreeher (1966} fanden sparer, daft C1 aueh in LSsungen hSherer Ionensts vom Immunkomplex wieder abdissoziiert und dabei funk- tionell intakt bleibt. Die An]agerung des C1-Molekfils an Immunpr~ci- pirate und die Absprengung davon bringt teehnische Schwierigkeiten mit sich: es mull sehr hoeh~ourig zentrifugiert werden, und bei Arbeiten im LabormaBstab k6nnen nut kleine Mengen erzielt werden. Mit sensibili- sierten EryChroeyten als Immunaggregate kann man diese Schwierig- keiten umgehen. Doeh die osmotisehe H~molyse der Erythrocyten beim Waschen in den Puffern hoher Ionensti~rke ffihrt zu neuen Problemen. Steinbrecher (1966) ffihrte deswegen diese Versuehe mit sensibilisierten Stromata dutch. Unsere Versuche zur spezitlschen Reinigung yon C1 dureh Anlagerung an sensibilisierte Erythroeytenstromata und an- schlieBendes Abdissoziieren davon wurden naeh dieser l~ethode in einer Modifikation durehgeffihrt (s. muter Material und Methoden).

In Tab.2 sind zwei Versuehe aus einer Reihe wiedergegeben. Die Tab. 2 gibt in der ersten SpaRe den C1-Gehalt des Serums an. Die zweite Spalte zeigt den Reinheitskoeffizienten und die Ausbeute nach der Euglobulinpr~eipitation. Dieser erste Reinigungssehritt, die Euglobulin- priicipitation, ffihrt zu gut reproduzierbaren Ergebnissen. Die angege- benen Werte fiir die Konzentration von effektiven Molekiilen C1 pro Milliliter und Eiweil] in Mflligramm sind auf das Ausgangsvolumen an Serum bereehnet. Das Euglobulinpr~cipitat wurde im Experiment nur in einem Zehntel des Ausgangsvolumens gelSst. In der dritten Reihe sind die Daten fiir das ,,1,5 m-Eluat" der Stromata angeffihrt. Dieses Eluat enth~lt das yon den sensibilisierten Stromata abdissoziierte C1; die Konzentrationen beziehen sich ebenfalls auf das Ausgangsvolumen des Serums. Das Gesamtvolumen dieses ,1,5 m-Eluats" wechselt von Versuch zu Yersuch sehr. Es ist bei den versehiedenen Versuehen aueh in stets wechselndem Mal]e mit Eiwei~en aus der Membran der Stromata

126 R. Wunderlieh und R. Ringelmann:

kontaminiert. Im Versuch a) ist ein solcher Versuch mi~ hoher EiweiB- kontamlna~ion dargestellt. Andere Pr~parationen ergaben aber sehon in diesem Sehritt einen hohen Reinheitsgrad der C1.Pr~paration; ein soleher Versueh ist unter b) dargestellt. Die Versuehe a) und b) markieren nach unserer Erfahrung die Grenzwerte bei diesem Pr~parationssehritt.

3. Methoden zur weiteren Reinigung yon C1

Wenn das Eluat neben C1 noeh andere Proteine enth~lt, so kann durch eine zweite Euglobulinf~llung aus dem ,,1,5 m-Eluat" eine zus~tz- fiche etwa 5--10fache Reinigung erzielt werden. Ein Zahlenbeispiel ist hierffir in der Tab. 2 nieh~ angegeben. Eine andere Pr~parationsmethode ist in der vierten Reihe der Tab. 2 dargestellt. Das ,1,5 m-Eluat" wurde mit Hflfe yon Druckfil~ration eingeengt und auf einen Saeeharose- Gradienten zwisehen 10--400/0 Saeeharose in einem Puffer niederer Ionenst~rke aufgetragen. Nach Ultrazentifugation wurden die sehweren Gradienten-Fraktionen gepoolt. Mit diesem Pr~parationssehritt wird ebenfalls eine etwa 10faehe Reinigung erziel~.

d. Charakterisierung der C1-Pr~t~ration

Das ,1,5 m-Eluat" yon den sensibilisierten Erythroeyten-Stromata und die 19 S-Fraktionen nazh Ultrazen~rffugation enthielten 5• is effektive Molek/ile C1 pro 1 mg Protein. Das Molekulargewicht der C1- Preparation wurde aus der Sedimen~ationskonstante in einem Saeeha- rose-Gradien~en ermi~tel~, wie in Abb. 2 dargestellt. Aus dem bekannten Molekulargewieht der Marker-Proteine und den respektiven Sedimen~a- tionsstreeken wurde graphisch das Molekulargewieht ffir C1 mi~ 1,1 • 10 s bestimmt. Zur Kl~rung der Frage, ob die Ct-Pr~para~ion auBer C1 noch andere kontaminierende Eiwei~e enbh~l~, warden folgende Versuehe durchgeffihr~.

Bei der analytisehen Polyaerylamidelektrophorese war im Gel keine Proteinbande naehzuweisen; das aufgetragene Protein wanderte wegen des hohen Molekulargewieh~es yon e~wa 1000000 nicht ein. Begleit- proteine mit einem niedrigeren Molekulargewicht waren also nieht naeh- weisbar. Die Immunpr~eipitation der C1-Pr~paration gegen ein Anti- Meersehweinehenserum und gegen ein Anti-Euglobulin-Fraktionsserum ergab eine einzige Pr~cipit~tlinie. In der lmmunelektrophorese zeigten sieh dagegen drei Linien. Diese Beobaehtung kann erkl~rt werden dureh die Dissoziation des C1-Molekiils in Untereinheiten in alkalisehen Puffern [13]. Die Immunabsorption des C1-Pr~parates mit einem Album]n-Anti- albumimPr~cipitat wurde folgendermaBen durehgeffihrt: das Albumiu- Antialbumin-Prs wurde gewaschen und ca. 2 mg davon mi~ der C1-Pr~paration 20 rain bei 37 ~ C inkubiert; naeh dem Abzentrifugieren war der Ubers~and der C1-LSsung optiseh leer bei 280 m~ und es war

5Iethode zur spezifischen Reinigung der erstcn Komplemen~komponente C 1 127

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Abb.2. Ultrazentrifugation yon gereinigtem Cl zusammen mi~ Markerprot~inen. 3 mg a~-Makroglobulin, 3 mg Ovalbumin und 2 mg Katalase wurden in je 1 ml S-VBS geI6st. 0,2 ml einer 1 : 1 : 1-Misehung dieser I~sungen wurden auf js einen Saeeharose-Gradienten in einem VBS-Puffer der Ionenst~irke 0,065 und einer Ca++-Konzentration aufgetragen. Alle verwendeten Puffer enthielten 1,5• 10 -4 m CaCl2. - - Von den abgetropften Fraktionen (10 Tropfen pro Fraktion) wurden die OD bei 280 m~ bestimmr Katalase wurden dariiber hinaus nach- gewiesen dutch l~essung der OD-Abnahme yon 3 ~ H~02-LSsung bei 310 mtt und dutch qualitative Beurteilung der Bl~ischenbildung in Tropfen yon 3 ~ tt202-LSsung in Gegenwar~ der katalasehaltigen Fraktionen. C1 wurde dutch seine

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128 R. Wunderlieh und R. Ringelmann:

Diskussion

Mit Hilfe yon zwei Schritten, nitmlich der Euglobulinpr~zipitation und der anschlieBenden Anlagerlmg der gel6sten Euglobulinfraktion an sensibilisierte Stromata, grfindlichem Wasehen der Stromata mit Puffern niederer Ionensti~rke und Abspaltung des C1 dutch Puffer hoher Ionen- sti~rke yon den sensibilisierten Stromata kann eine bis zu 600faehe An- reicherung yon C1 aus Serum erzielt werden. Die Zahl bezieht sich auf das Verh~ltnis yon effektiven Molekfilen C1 pro M~lllgramm Protein im Serum und im Endpr~parat. In der letzten Reihe der Tab.2 wurden Werte angeffihrt, die in unserem Laboratorium mit der yon Colten et al. [41 besehriebenen h~ethode erzielt wurden.

Hierbei wird yon der Euglobulinpr~paration ausgegangen. In der Euglobulin- fraktion wird C1 in Puffern hoher Ionenst~rke zu leichten Monomeren mit einem NIolekulargewicht yon ca. 100000 dissoziiert und in diesem Puffer auf einen Saceha- rose-Gradienten gebracht und zentrifugiert. Die in der Euglobulinfraktion ent- haltenen NIakroglobuline, die nicht dissoziieren, werden dabei in den Gradienten hinein sedimentiert, wogegen das dissoziierte C1 und alle leichteren Proteine in den leiehten Gradientenfraktionen bleiben. Diese Fraktionen werden nach Ab- schluB der Zentrifugation gepoolt, eingeengt und auf eine Ionenst~ixke yon 0,065 dialysiert. Dabei reassoziieren die C1-Monomere wieder zu MakromolekiiIen mit einem Molekulargewicht yon etwa 1,1 • e. Die Dissoziation und Reassoziation gehen mit hoher Ausbeute an h~molytiseher Funktion einher. Das Dialysat mit dem reassoziierten C1 wird erneut auf einen Saeeharose-Gradienten aufgetragen; die 19S-Fraktion dieses Gradienten enth~lt nach Absehlul~ der Zentrifugation die C1-Fraktion.

Ein Vergleich dieser Methode mit unserem Verfahren zeigt, dal3 sowohl in bezug auf den Reinigungskoeffizienten wie in bezug auf die Ausbeute vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Alle C1-Pr~parationen enthalten etwa 4 • 10 la effektive Molekfile C1 pro Milligramm Protein naeh den bier gew~hlten Bestimmungsmethoden fiir C1 und Protein. Absolut reines C1 sollte naeh der einleitend dargestellten Rechnung etwa 54 • 10 TM Molekfile Ci pro Milligramm Protein enthalten. Die Dislcrepanz zwisehen dem gefundenenWert 4 • 10 ~a effektive Molekfile proMilligramm und dem zu fordernden Weft yon 54 • 10 la Molekiilen k6nnte darauf sehlieBen lassen, dab noeh kontam~nlerende EiweiBe vorhanden oder dab funktionell stumme C1-Molekiile in der Pr/iparation enthalten sind. Wahrscheinlieher erscheint uns aber, dab dureh technische Sehwierig- keiten ein Defizit an effektiven 1YIolekfilen vorget~uscht wird: der EiweiB- gehalt yon eiweiBarmen C1-LSsungen ist schwer genau zu messen. Bei den dargestellten Versuehen wurde die Eiweil~konzentration aus der Extinktion der LSsungen bei 280 mbr errechnet. Da die Extinktions- koeffizienten der Proteine bei 280 m~t untersehiedlich groB sind und diese ~aktoren yon dem bier verwendeten Umreehnungsfaktor yon 0,98 -- dem Extinktionsfaktor eines Serum-Proteingemisehes - - u m das 5--10faehe

l~Iethode zur spezifisehen Reinigung der ersten Komplementkomponente C 1 129

abweiehen k5nnen, sind die in der Tabelle angegebenen EiweiBkonzen- trationen mit gro~er Sicherheit zu klein. Hinzukommt, dab die Messung yon Proteinkonzentration in stark verdfinnten LSsungen verf~lscht werden kann. Das Verh~ltnis zwisehen der Zahl der gemessenen effek- riven C1-Molekiile und der aus der Extinkrion der LSsung errechneten Zahl yon Proteinmolekiilen ist sieher kleiner als es den angegebenen Zahlenwerten entsprieht. Dies geht aus der Tatsache hervor, dal~ nach Absorption des C1-Pr~parats mit Immunkomplexen kein Proteingehalt und keine CI-Akrivits mehr meBbar sind. :Fiir eine C1-PrKparation, die reehnerisch 6,4 • 10 ~'~ pro Milligramm Protein enthielt, konnten Colten e~ al. (1967) dutch radioakrive Markierung des Proteins naehweisen, daB zumindest 70--80~ aller Proteinmolekiile aktive C1-Molekiile dar- stellen.

Das auf dem besehriebenen Pr~pararionsweg gewonnene C1 hat ein Molekulargewieht yon 1 100000 und ist voll aktiviert. Die Immun- priieipitation mit Anriseren gegen Serum, gegen die Euglobulinfraktion und gegen das gereinigte C1 yore Meersehweinchen zeigt nur eine einzige Pr/icipitatlinie. Das CI-Pr~parat ist nieht kontaminiert mit anderen Komplementkomponenten. Der Beweis, dab jedes Proteinmolekiil der Pr~pararion ein funkrioneU akrives C1-Molekiil ist, steht noeh aus. Auf Grund der oben dargestellten Daten und ~berlegungen ist dies aber in hohem Marie wahrseheinlieh.

ffiir die Zweeke der Pr~pararion yon Zell-Intermedi~rprodukten zur Messung von Komplementkomponenten ist der 2-Sehritt-Pr~parations- weg ausreiehend. Der zeigliche und appararive Aufwand zur Rein- darstellung im pr~parativen MaBstab ist erheblich geringer als bei den bisher beschriebenen Methoden.

Material und Methoden

VBS (veronal buffered saline), VBS-EDTA-, VBS-Saccharose wurde hergestellt wie in [13] besehrieben. 1,5 m-VBS enthielt die zehnfache Menge an NaCI.

Die Prhparation yon Hammelerythrocyten-E- und yon EAC4-ZeUen fiir die Molekulartitras is~ ebenfalls in [13] besehrieben.

~ensibitis~erte Erythrocyten-Stromata wurden wie folgt hergestellt: 50 ml Ham- melerythroeyten, aufgenommen in AlseverlSsung, werden in VBS gvwasehen und auf eino Zellkonzentration von 5)< 109[ml eingestellt. Dieser Suspension wird boi 20 ~ unter stetigem Rfthren die AntikSrperlSsung zugcgeben. Die Amboceptor- konzentration betr~gt 400 E/ml (charge RLB 24 dcr Behringwerke). Nach eincr Inknbation yon 20 rain bei 4 ~ werden 3 ml Glycerin zugegeben und erncut 20 rain bei 4 ~ C und 20 rain bei 37~ inkubiert. Nach dem Abzentrifugieren wird das Zellsediment dureh 3--Smaliges Wasehen in VBS yore ausgetretenen H~moglobin freigewasehen. AnschlieBend werden die sensibilisierten Stromata in 1,5 m VBS ca. 15--20mal gewaschen, bis der Oberstand bei 280 m~t optisch leer ist.

Die Anlagerung vo~ C1 an die Stromata und die Elution yon C1 wurde wie folgt durchgefiihrt. Das Stroma-Sediment wird in 25 ml VBS-Saccharose der Ionenstiirke

130 R. Wunderlieh und R. Ringelmarm:

0,065 resuspendiert (Zellkonzentration 10• 109/mI) und mit gleichcn Teilen der ]42uglobulinlSsung 30 min bei 37 ~ C und 12 Std bei 4 ~ C inkubier~. I)anach werden die Stromata in dem VBS-Saccharose-Puffer gewaschen, bis der ~0~bcrstand bei 280 m~z optisch leer int. I)as C1 wird yon dem sensibilisierten Stromata abdissoziiert dutch 3malige Inkubation mit je 10 ml 1,5 m VBS. Die resultierenden ~J~berstiinde werden gepoolt und bei 4 ~ (3 12 Std gegen VBS-Saccharose-Puffer der IonenstErke 0,065 dialysiert.

Die Komplementreagentien Vollkomplement C t, C'EDTA und C2 wurden ver- wendet wie in [13] angefiihrt.

Die Molekulartitrationen wurden mit Hilfe der Mikrolitermethodik durch- gefiihr~ [13]. Die Eiweiflmessungen erfolgten spektrophotometrisch (Photometer DBG Beck.mann) unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten 0.98 bei 280 mix fill" ein Sernmprotein-Eiweil]gemisch der Konzentration yon 1 mg/ml.

Die analytische Poly.a~ryl-amid-elektrophorese und die Immun-elektropharese wurden mit Hilfe der Shandon- bzw. LK_B-Ger/~tc nach den Empfehlungen des Herstellers durchgefiihr~.

Die Zonenzentri]ugation wurde mit einer L2-65B Spinco-Zentrifuge mit dem Rotor Ti14 naeh der Methode yon Colten et al. (1969) ausgefiihrt.

Frau J. Ffigner mSchten wir fiir die ausgezeichnete Hilfe bei den Versuchen herzlieh danken.

Literatur

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Prof. Dr. 1~. l~ingelmann Inst i tut ffir Medizinische NIikrobiologie der Johannes Gutenberg-Universit~t D-6500 Main~, Augustusplatz Deutschland