Eine selbstreplizierende Peptidnukleinsäure - ... · Eine selbstreplizierende Peptidnukleinsäure Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Biochemie

Eine selbstreplizierende Peptidnukleinsäure

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Tobias A. Plöger

aus Remscheid

Bochum 2011

1. Referent: Prof. Dr. G. von Kiedrowski, Ruhr-Universität Bochum

2. Referent: Prof. Dr. M. Feigel, Ruhr-Universität Bochum

3. Referent: Prof. Dr. R. Heumann, Ruhr-Universität Bochum

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von November 2006 bis Oktober 2011 an der

Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von

Prof. Dr. Günter von Kiedrowski angefertigt.

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht:

Artikel

T. A. Plöger, G. von Kiedrowski:

Improved Large Scale Liquid Phase Synthesis and High Temperature NMR

Characterization of Short (F-)PNAs

Helv. Chim. Acta 2011, 94, 1952.

Vorträge

06/06 Improved Synthesis of F-PNA Monomers

PACE Annual Review Meeting, Venedig (Italien)

06/07 Toward PNA replication analysis via kinetic titrations using 19F-NMR spectroscopy

ECLT-Workshop „Dynamic Modelling and Kinetic Data Fitting Using

SimFit”, Venedig (Italien)

10/08 Synthesis of F-PNA Monomers and Oligomers

PACE Final Review Meeting, BMZ Dortmund

Poster

09/08 F-PNA: Synthesis and Potential Application in PNA Replication Analysis

III. Nucleinsäurechemie-Treffen, Stuttgart

“Few organic chemists willingly undertake syntheses in an unsuitable solvent using

unpromising starting materials, or attempt fusion reactions between unprotected, unactivated,

multifunctional reagents at 65°C.”

L. E. Orgel, R. Lohrmann, Acc. Chem. Res. 1974, 7, 368.

Inhaltsverzeichnis

i

Inhaltsverzeichnis

Allgemeiner Teil ........................................................................................................................ 1

1 Einleitung ............................................................................................................................ 1

1.1 Grundlagen der präbiotischen Chemie......................................................................... 1

1.2 Die RNA-Welt-Hypothese ........................................................................................... 5

1.3 Die Bedeutung selbstreplizierender Systeme für die präbiotische Chemie ................. 7

1.3.1 Templatgesteuerte Synthesen................................................................................ 7

1.3.2 Selbstreplizierende Systeme auf der Basis von Nukleinsäuren ............................ 9

1.3.3 Selbstreplizierende Systeme auf der Basis von Peptiden.................................... 20

1.3.4 Artifizielle Replikatoren...................................................................................... 24

1.4 Die PNA-Welt als Modell einer Prä-RNA-Welt........................................................ 29

1.4.1 Intention des PNA-Designs................................................................................. 29

1.4.2 Das Potential einer PNA-Welt ............................................................................ 33

1.4.3 Schlüssige präbiotische Synthesewege für PNA-Bausteine................................ 35

1.4.4 Chemische Stabilität............................................................................................ 37

1.4.5 Katalytische Aktivität.......................................................................................... 41

1.4.6 PNA und der Ursprung der Homochiralität ........................................................ 42

1.4.7 Speicherung und Weitergabe genetischer Informationen ................................... 43

1.5 Kinetische 1H-NMR-Titration.................................................................................... 48

2 Aufgabenstellung .............................................................................................................. 50

3 System-Design .................................................................................................................. 52

3.1 Auswahl der NMR-Sonde .......................................................................................... 52

3.2 Wasserlöslichkeit ....................................................................................................... 54

3.3 Effektive Synthese...................................................................................................... 55

3.4 Vergleichbarkeit mit bekannten Systemen................................................................. 55

4 Synthesen und Spektroskopie............................................................................................ 57

4.1 Synthesestrategie I: Festphasensynthese.................................................................... 57

4.1.1 Retrosynthese ...................................................................................................... 57

4.1.2 Fluorlabel ............................................................................................................ 58

4.1.3 Geschützte Nukleobasen-essigsäuren ................................................................. 62

4.1.4 Rückgrat .............................................................................................................. 66

Inhaltsverzeichnis

ii

4.1.5 Monomere ........................................................................................................... 68

4.1.6 Löslichkeitsvermittler.......................................................................................... 71

4.1.7 Oligomersynthese................................................................................................ 73

4.2 Synthesestrategie II: Konvergente Flüssigphasensynthese ........................................ 81

4.2.1 Vorüberlegungen................................................................................................. 81

4.2.2 Fmoc/Bhoc-Chemie ............................................................................................ 82

4.2.3 Boc/Z-Chemie ..................................................................................................... 83

4.3 Synthesestrategie III: Zugang über ein vollständig geschütztes Rückgrat................. 91

4.3.1 Grundlagen .......................................................................................................... 91

4.3.2 Synthese des C-terminalen Trimers .................................................................... 94

4.3.3 Synthese des N-terminalen Trimers .................................................................. 102

4.4 NMR-Spektroskopie................................................................................................. 111

4.4.1 PNA und das Rotamer-Problem........................................................................ 111

4.4.2 Hochtemperatur-NMR-Spektroskopie .............................................................. 114

4.4.3 19F-NMR-Spektroskopie ................................................................................... 126

5 Ligation und Replikation................................................................................................. 130

5.1 Voruntersuchungen .................................................................................................. 130

5.2 HPLC-Kinetiken....................................................................................................... 136

5.2.1 Kalibrierung ...................................................................................................... 136

5.2.2 Auswertungsverfahren ...................................................................................... 138

5.2.3 Ligation und Replikation in Imidazol-Puffern .................................................. 140

5.2.4 Ligation und Replikation in Sulfonsäure-Puffern ............................................. 147

6 Zusammenfassung und Ausblick .................................................................................... 162

6.1 Zusammenfassung.................................................................................................... 162

6.2 Ausblick ................................................................................................................... 173

Experimenteller Teil............................................................................................................... 176

7 Geräte und Materialien.................................................................................................... 176

7.1 Magnetische Kernresonanzspektroskopie ................................................................ 176

7.2 Massenspektrometer................................................................................................. 176

7.2.1 FAB-MS............................................................................................................ 176

7.2.2 EI-MS................................................................................................................ 176

7.2.3 MALDI-TOF-MS.............................................................................................. 177

7.2.4 HR-ESI-MS....................................................................................................... 177

Inhaltsverzeichnis

iii

7.3 Chromatographische Methoden ............................................................................... 177

7.3.1 Dünnschichtchromatographie............................................................................ 177

7.3.2 Säulenchromatographie..................................................................................... 177

7.3.3 HPLC................................................................................................................. 177

7.4 UV-Spektroskopie.................................................................................................... 178

7.5 Automatisierte Peptidsynthese ................................................................................. 178

7.6 Gefriertrocknung ...................................................................................................... 178

7.7 Chemikalien ............................................................................................................. 178

8 Maschinelle Festphasensynthese..................................................................................... 180

9 Allgemeine Arbeitsvorschriften ...................................................................................... 181

9.1 Grignard-Reaktion mit Trockeneis (AAV 1) ........................................................... 181

9.2 Darstellung von Aminosäuremethylestern (AAV 2)................................................ 181

9.3 Verseifung von Aminosäuremethylestern (AAV 3)................................................. 181

9.4 Reduktive Aminierung mit elementarem Wasserstoff (AAV 4).............................. 182

9.5 Brommethylierung von Fluoraromaten (AAV 5)..................................................... 182

9.6 N9-Alkylierung bei Purin-Derivaten (AAV 6)......................................................... 182

9.7 Einführung von Carbamaten an der N6-Position von Adenin (AAV 7) .................. 183

9.8 Einführung von Carbamaten an der N4-Position von Cytosin (AAV 8).................. 183

9.9 Esterspaltung und Einführung des Carbonyls an Guanin-Derivaten (AAV 9) ........ 183

9.10 N9-Alkylierung am Guanin (AAV 10)................................................................... 184

9.11 Einführung von Carbamaten an der N2-Position von Guanin (AAV 11) .............. 184

9.12 TOTU-Kopplung (AAV 12) .................................................................................. 184

9.13 Esterspaltung mit Aluminium(III)chlorid in Ethanthiol (AAV 13) ....................... 184

9.14 EDC-Kopplung (AAV 14) ..................................................................................... 185

9.15 Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure (AAV 15)................... 185

9.16 Abspaltung der Z-Schutzgruppe mit TFMSA (AAV 16)....................................... 185

9.17 HBTU-Kopplung (AAV 17) .................................................................................. 186

9.18 DCC/HOSu-Kopplung (AAV 18).......................................................................... 186

9.19 Fmoc-Abspaltung mit Diethylamin (AAV 19) ...................................................... 186

9.20 Brop-Kopplung (AAV 20) ..................................................................................... 186

10 Synthesen ...................................................................................................................... 187

10.1 F-AcOH (70) .......................................................................................................... 187

10.2 Me2-Aeg(H)-OMe*2HCl (78)................................................................................ 188

Inhaltsverzeichnis

iv

10.3 Fmoc-Aeg(CBhoc)-OH (82) ..................................................................................... 189

10.4 Fmoc-Aeg(H)-OMe (83) ........................................................................................ 190

10.5 CBhoc-AcOH (84) .................................................................................................... 192

10.6 H-Aeg(H)-OH (85)................................................................................................. 193

10.7 H-Aeg(H)-OH (85)................................................................................................. 194

10.8 F-CH2Br (92).......................................................................................................... 195

10.9 F’-CH2Br (95) ........................................................................................................ 196

10.10 F’-AcOH (96)....................................................................................................... 197

10.11 A-AcOBn (104).................................................................................................... 198

10.12 C-AcOBn (105) .................................................................................................... 199

10.13 ABhoc-AcOBn (106) .............................................................................................. 200

10.14 CBhoc-AcOBn (107) .............................................................................................. 201

10.15 ABhoc-AcOH (108)................................................................................................ 203

10.16 ABhoc-AcOH (108)................................................................................................ 204

10.17 T-AcOH (109) ...................................................................................................... 205

10.18 GBhoc-AcOH (110)................................................................................................ 206

10.19 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-benzylester (112)................................. 208

10.20 (2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-benzylester......

(113) ..................................................................................................................... 209

10.21 A-AcOEt (120)..................................................................................................... 210

10.22 ABhoc-AcOEt (121) ............................................................................................... 211

10.23 H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124)................................................................................ 212

10.24 Fmoc-Aeg(ABhoc)-OMe (125) .............................................................................. 213

10.25 Fmoc-Aeg(CBhoc)-OMe (126)............................................................................... 215

10.26 Fmoc-Aeg(GBhoc)-OH (127)................................................................................. 216

10.27 Fmoc-Aeg(F)-OH (128a) ..................................................................................... 217

10.28 Fmoc-Aeg(F’)-OH (128b).................................................................................... 219

10.29 Fmoc-Aeg(F4)-OH (128c) .................................................................................... 220

10.30 Fmoc-Aeg(H)-OH (129) ...................................................................................... 222

10.31 Fmoc-Aeg(T)-OH (132)....................................................................................... 223

10.32 Fmoc-Aeg(ABhoc)-OH (133)................................................................................. 225

10.33 Fmoc-Aeg(GBhoc)-OMe (134) .............................................................................. 226

10.34 Fmoc-Aeg(F)-OMe (135a)................................................................................... 227

Inhaltsverzeichnis

v

10.35 Fmoc-Aeg(F’)-OMe (135b) ................................................................................. 229

10.36 Fmoc-Aeg(F4)-OMe (135c).................................................................................. 231

10.37 N,N-Dimethyl-β-alanin Hydrochlorid (140) ........................................................ 233

10.38 Me2-Aeg(CBhoc)-OMe (141) ................................................................................. 234

10.39 (Me)2-Aeg(CBhoc)-OH*HCl (142) ........................................................................ 235

10.40 Me2-Aeg(H)-OH (145)......................................................................................... 237

10.41 H-Aeg(F)-OMe*TFA (185) ................................................................................. 238

10.42 Boc-Aeg(H)-OMe (187)....................................................................................... 239

10.43 Boc-Aeg(H)-OMe (187)....................................................................................... 240

10.44 Boc-Aeg(AZ)-OH (188) ....................................................................................... 241

10.45 AZ-AcOEt (189) ................................................................................................... 243

10.46 AZ-AcOH (190).................................................................................................... 244

10.47 Boc-Aeg(AZ)-OMe (191) ..................................................................................... 245

10.48 CZ-AcOH (192) .................................................................................................... 247

10.49 CZ-AcOH (192) .................................................................................................... 248

10.50 CZ (193)................................................................................................................ 249

10.51 CZ-AcOBn (194) .................................................................................................. 250

10.52 Boc-Aeg(CZ)-OH (195)........................................................................................ 251

10.53 CZ-AcOMe (196).................................................................................................. 252

10.54 Boc-Aeg(CZ)-OMe (197) ..................................................................................... 254

10.55 Boc-Aeg(GZ)-OH (198) ....................................................................................... 256

10.56 GZ-AcOH (199).................................................................................................... 257

10.57 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (200) ................................ 258

10.58 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (200) ................................ 259

10.59 (2-Benzyloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (201) .. 260

10.60 Boc-Aeg(GZ)-OMe (202) ..................................................................................... 261

10.61 H-Aeg(GZ)-OMe*TFA (203) ............................................................................... 263

10.62 Boc-Aeg(F)-OMe (204) ....................................................................................... 264

10.63 2-Amino-N-(2-dimethylamino-ethyl)-acetamid Di-trifluoracetat (205) .............. 266

10.64 [(2-Dimethylamino-ethylcarbamoyl)-methyl]carbaminsäure-tert-butylester.......

(207) ..................................................................................................................... 267

10.65 H-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(G)-Aem*4TFA (224) .................................................... 268

10.66 Boc-Aeg(Alloc)-OMe (225)................................................................................. 269

Inhaltsverzeichnis

vi

10.67 Boc-Aeg(Fmoc)-OMe (226) ................................................................................ 270

10.68 Z-Aeg(H)-OMe (227)........................................................................................... 272

10.69 Boc-Aeg(Alloc)-OH (228) ................................................................................... 274

10.70 H-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (229) .......................................................................... 275

10.71 Z-Aeg(Boc)-OMe (230) ....................................................................................... 276

10.72 Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (231)............................................................. 277

10.73 Z-Aeg(Boc)-OH (232).......................................................................................... 280

10.74 H-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (233)....................................................... 281

10.75 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (234)................................................ 282

10.76 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OH (235) .................................................. 284

10.77 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-Aem (236) ................................................ 286

10.78 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-Aem (237) ...................................................... 288

10.79 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-Aem (238)..................................................... 289

10.80 Z-Aeg(Boc)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-Aem (239)........................................................... 290

10.81 Z-Aeg(Boc)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem (240) ......................................................... 292

10.82 Z-Aeg(H)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem*2TFA (241) ................................................. 294

10.83 Z-Aeg(CZ)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem*TFA (242).................................................. 295

10.84 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OH*3TFA (248) ................................... 296

10.85 Me2-Aeg(Me)-OH*2HCl (249)............................................................................ 298

10.86 Me2-Aeg(Me)-OH (249) ...................................................................................... 299

10.87 H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253) ........................................................................... 300

10.88 Boc-Aeg(H)-OBn (254) ....................................................................................... 301

10.89 Boc-Aeg(Fmoc)-OBn (255) ................................................................................. 302

10.90 Boc-Aeg(Fmoc)-OBn (255) ................................................................................. 303

10.91 H-Aeg(Fmoc)-OBn (256)..................................................................................... 304

10.92 Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (257).............................................................. 305

10.93 H-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn*TFA (258)........................................................ 307

10.94 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (259)............................................... 308

10.95 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-OBn (260)..................................................... 309

10.96 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-OBn (261) ................................................... 310

10.97 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-OBn (262) ......................................................... 312

10.98 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn (263).......................................................... 313

10.99 H-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn*TFA (264).................................................... 315

Inhaltsverzeichnis

vii

10.100 Me2-Aeg(Me)-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn*2TFA (265) ............................ 316

10.101 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(G)-Aem*6TFA

(268) ................................................................................................................... 318

10.102 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OMe*3TFA (291)............................... 319

11 Ligations- und Replikationsexperimente ...................................................................... 320

Anhang ........................................................................................................................................I

12 Zur Nomenklatur der hier beschriebenen Verbindungen...................................................I

13 Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................I

14 HR-ESI-MS-Spektren von PNA 224, F-PNA 248 und F-PNA 268 ................................ V

15 SimFit-Dateien ................................................................................................................VI

15.1 SimFit-Eingabedateien .............................................................................................VI

15.1.1 A-Modell ...........................................................................................................VI

15.1.2 B-Modell ..........................................................................................................VII

15.2 Konzentrations-Zeit-Daten.................................................................................... VIII

15.2.1 Ligation in 1-Methylimidazol-Puffer ............................................................. VIII

15.2.2 Ligation in Imidazol-Puffer................................................................................ X

15.2.3 Ligation in HEPES- und MOPS-Puffer ...........................................................XII

15.2.4 Ligation in Gegenwart von Pyridin oder HOAt ............................................. XIV

15.2.5 Ligation in Anwesenheit verschiedener Salze ............................................... XVI

15.2.6 Ligation in Gegenwart von 0.4 M EDC ....................................................... XVIII

15.2.7 Ligation bei pH 6.6...................................................................................... XVIII

15.2.8 Ligation in Gegenwart von PEG .................................................................... XIX

15.2.9 Ligation bei unterschiedlichen Imidazol-Konzentrationen ............................. XX

15.2.10 Ligation bei vier unterschiedlichen intialen Hexamerkonzentrationen........ XXI

16 Danksagung.................................................................................................................XXII

17 Lebenslauf ................................................................................................................. XXIII

18 Literaturverzeichnis................................................................................................... XXIV

Allgemeiner Teil 1 Einleitung

1

Allgemeiner Teil

1 Einleitung

1.1 Grundlagen der präbiotischen Chemie

Die präbiotische Chemie versteht die Entstehung des Lebens als einen chemischen

Evolutionsprozess und versucht diesen nachzuvollziehen. Dabei ist die Frage nach der Natur

des Lebens im wissenschaftlichen Kontext weiterhin Gegenstand der Diskussion. Minimale

Anforderungen formulierte die NASA im Rahmen ihres Exobiology Programms, indem sie

Leben als ein sich selbst erhaltendes System definierte, das im Sinne Darwins evolvieren

kann. Drei fundamentale Voraussetzungen hierfür wurden von Oparin definiert:[1]

Metabolismus: Der Stoffwechsel, also der Austausch von Energie und Materie, hält

ein lebendes System im Nichtgleichgewichtszustand und bildet somit die Grundlage

für eine Weiterentwicklung;

Selbstreplikation: Das System katalysiert nicht nur seine eigene Synthese, sondern

gibt gleichzeitig Informationen über seine chemische Struktur an die nächste

Generation weiter;

Mutation: Eine gewisse Fehlerquote bei der Replikation kann zu einer Verbesserung

des bestehenden Systems und so zur Evolution im Sinne Darwins führen.

Historisch betrachtet galt die Aufmerksamkeit zunächst der Suche nach plausiblen Ent-

stehungswegen für Monomere und Submonomere der heutigen Biopolymere. Ausgangspunkt

war anfänglich die Annahme einer reduzierenden präbiotischen Atmosphäre, in der die

biologisch relevanten Elemente C, O, N und S in ihren reduzierten Formen CH4, H2O, NH3

und H2S vorlagen. Weiterhin nahm man an, dass diese Uratmosphäre verschiedenen Energie-

formen (solare Strahlung, elektrische Entladung, Hitze) ausgesetzt war, was zur Synthese

einfachster organischer Vorläufermoleküle führte, die sich in der Hydrosphäre sammelten.

Aus der sogenannten „Ursuppe“ sollen sich dann spontan die ersten Formen von Leben

gebildet haben. Diese Modellvorstellung wurde von Oparin[2, 3] und Haldane[4] unabhängig


2

voneinander entwickelt und ist als Oparin-Haldane-Hypothese in die Wissenschafts-

geschichte eingegangen, wobei Haldane im Gegensatz zu Oparin von einer Atmosphäre aus

CO2 und NH3 ausging.

1953, einem Annus Mirabilis der Naturwissenschaften,[5] gelang es Miller, Aminosäuren

(insbesondere Glycin und Alanin) und einige einfache organische Verbindungen (speziell

Ameisen- und Milchsäure) aus einem „Ursuppen“-Experiment zu isolieren.[6] Miller folgte

dem Hinweis seines Doktorvaters Urey, indem er in einer Glasapparatur die Oparinsche

Uratmosphäre (CH4, NH3, H2O, H2) elektrischen Entladungen aussetzte, wobei er die

Parameter Temperatur sowie Reaktionsdauer variierte und die Produkte anschließend

analysierte. Das Miller-Urey-Experiment wird als Startpunkt der (neueren und experimen-

tellen) präbiotischen Chemie verstanden, da hier erstmalig die Frage nach dem Ursprung des

Lebens mit naturwissenschaftlichen Methoden bearbeitet wurde.

Schon 1862 gelang Butlerow die Synthese von Zuckern aus einer wässrigen Formaldehyd-

Lösung unter basischen Bedingungen.[7] Dieser komplex verlaufende Prozess wird als

Formose-Reaktion bezeichnet und liefert ein Gemisch von ca. 40 Zuckern, darunter auch

Ribose und Desoxyribose.[8] Während die Synthese des Primärprodukts Glykolaldehyd durch

anorganische Verbindungen wie Ca(OH)2[9] oder CaCO3

[10] katalysiert wird, verläuft die

Reaktionskaskade in ihrer Gesamtheit autokatalytisch.[11] Problematisch ist hierbei zum einen

die geringe Ausbeute an Zuckern, die für die Nukleinsäurechemie relevant sind (< 1 %), und

zum anderen das Fehlen eines Trennmechanismus unter präbiotischen Bedingungen. Daneben

gibt die geringe Stabilität der Ribose Anlass, an der präbiotischen Relevanz dieser Reaktion

zu zweifeln, sodass an der Synthese stabilisierter Ribose-Derivate wie Ribose-2,4-bisphos-

phat[12] und Diribose-Borat-Komplexen[13] gearbeitet wurde.

Durch das Erhitzen von Ammoniumcyanid auf 70 °C gelang Oro 1960 die Synthese der

Nukleobase Adenin.[14] Wenig später zeigte er, dass dabei fünf Moleküle HCN zu einem

Molekül Adenin reagieren.[15] Mittels Variation der Reaktionsbedingungen gelang auch die

Synthese weiterer Purinderivate wie der Nukleobase Guanin, zwei Zwischenprodukten des

Purinabbaus (Hypoxanthin, Xanthin) und Diaminopurin.[16] Den beiden Letztgenannten

spricht man auch eine Bedeutung in frühen Phasen der molekularen Erkennung zu.[17, 18]

Gerade die Synthese von Adenin ist von hoher präbiotischer Relevanz, da Adenin nicht nur

Bestandteil der Nukleinsäuren ist, sondern auch als Bestandteil von ATP eine zentrale Rolle

im Stoffwechsel der Zellen spielt. Erklären lässt sich dies durch einen Vorteil im Selektions-


3

prozess der Biomoleküle: Adenin weist in der Stoffklasse der Purine die höchste Resonanz-

energie je π-Elektron auf.[19]

Während Cytosin aus Cyanoacetylen und Harnstoff bzw. Kaliumcyanat zunächst nur in

geringem Umfang hergestellt werden konnte,[20, 21] gelang die Synthese später ausgehend von

Cyanoacetaldehyd und Harnstoff in hohen Ausbeuten von bis zu 50 %.[22] Hierbei entstand

auch Uracil. Weiterhin wurde aus Cyanoacetaldehyd und Guanidinhydrochlorid 2,4-Diamino-

pyrimidin synthetisiert, das sich zu Cytosin, Isocytosin und Uracil hydrolysieren ließ.[23] Die

erfolgreichen Purin- und Pyrimidin-Synthesen erfordern allesamt hohe Konzentrationen an

Startbausteinen, die als unrealistisch für die postulierte Urerde gelten. In vielen Arbeiten

werden daher Möglichkeiten zur Konzentration von Lösungen durch Trocknungsprozesse an

Lagunen und Stränden sowie durch eutektisches Ausfrieren diskutiert.[22-24]

Die Annahme einer reduzierenden Uratmosphäre erschien zunächst folgerichtig, wenn man

bedenkt, dass Wasserstoff das am häufigsten vorkommenden Element im Universum ist.

Allerdings besteht die Atmosphäre unserer direkten Nachbarplaneten Venus und Mars zu

93-98 % aus CO2. Auch Untersuchungen an ältesten Sedimentgesteinen deuten auf eine Ur-

atmosphäre hin, die einen hohen Gehalt an CO2 und N2 aufwies. Miller selbst führte in den

80er Jahren Untersuchungen mit verschiedenen Gasmischungen aus N2, NH3, H2 und H2O

durch, denen entweder CH4, CO oder CO2 als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurde.[25, 26] Es

zeigte sich, dass die Synthese von HCN, HCHO, NH3 und Harnstoff, ausgehend von CO oder

CO2, nur bei molaren Verhältnissen von H2 zu CO bzw. CO2 größer als 1.0 gelingt. Auch die

Aminosäuresynthese auf der Basis von CO oder CO2 erfordert hohe molare Verhältnisse von

H2 zu CO bzw. CO2, wobei aber fast ausschließlich Glycin entsteht. In neueren Experimenten

konnten allerdings größere Mengen verschiedener Aminosäuren nachgewiesen werden.[27]

Verneint man die zunächst angenommene reduzierende Uratmosphäre, so stellt sich die Frage

nach den Reduktionsäquivalenten, die für den Aufbau von Biomolekülen benötigt werden. In

Millers Experimenten wurden diese vom Wasserstoff geliefert, wobei die Flucht des

Wasserstoffs ins All gegen das Vorhandensein hoher H2-Partialdrücke spricht. Alternative

Modelle sehen Eisen als Elektronenquelle. In der Thioester-Welt[28] von de Duve liefert Fe2+

durch Bestrahlung mit dem UV-Licht der Sonne ein Elektron je Atom, während in

Wächtershäusers Theorie des Chemoautotrophen Lebensursprungs[29] die oxidative Bildung

von Pyrit aus Fe2+-haltigen Mineralien (z.B. Pyrrhotin) und Schwefelwasserstoff Ursprung

der Reduktionsäquivalente ist.


4

Auch ein extraterrestrischer Ursprung organischen Materials wird diskutiert, da die frühe Erde

Ort zahlreicher Einschläge von Asteroiden, Meteoriten und Kometen war.[30] In sogenannten

kohligen Chlondriten wie dem Murchinson-Meteoriten wurden ca. 500 organische Verbin-

dungen gefunden[31] – unter ihnen präbiotisch relevante Moleküle wie Di- und Mono-

Aminosäuren, Purine, Pyrimidine und Zucker-Alkohole. Als molekularer Ursprung dieses

Materials gelten interstellare Molekülwolken, die CO, CO2, MeOH, NH3 und H2O enthielten

und im Laufe der Entwicklung des Sonnensystems akkretierten. Im Jahre 2002 gelang zwei

Forschergruppen unabhängig voneinander die Synthese von Aminosäuren bei der Herstellung

von künstlichem interstellarem Eis aus den genannten Ausgangsstoffen im Hochvakuum unter

UV-Licht-Bestrahlung.[32, 33]


5

1.2 Die RNA-Welt-Hypothese

Unsere moderne DNA-RNA-Protein-Welt ist von sehr großer Komplexität geprägt, sodass

eine de novo Synthese unter präbiotischen Bedingungen ausgeschlossen scheint. Denkbarer

erscheinen evolvierbare Systeme, die nur aus einer Verbindungsklasse bestehen, welche

sowohl in der Lage ist, Informationen zu speichern und weiterzugeben als auch katalytische

Aktivität aufzuweisen. Noch bevor der spätere Nobelpreisträger Gilbert den Begriff der

RNA-Welt prägte[34], erkannten Woese[35], Crick[36] und Orgel[37] das Potential der RNA,

einen solchen autonomen „Organismus“ zu bilden. Auch Eigen[38-41] und Kuhn[42-44] wiesen in

unabhängigen Arbeiten zu Selbstorganisation und Evolution auf die besondere Rolle hin, die

die RNA bei der Entstehung des Lebens eingenommen haben könnte. Die Entdeckung der re-

versen Transkriptase,[45, 46] einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase, und der Ribozyme,[47-50]

also enzymatisch wirkender RNA, führte nicht nur zur Erweiterung bzw. Revision molekular-

biologischer Dogmen, sondern gab auch der RNA-Welt-Hypothese Auftrieb.[51]

Die besondere Bedeutung und Flexibilität der RNA zeigt sich auch darin, dass sie in drei

verschiedenen Formen und Funktionen auftritt (tRNA, mRNA, rRNA) und wichtige

Coenzyme von ihren Nukleotiden abstammen. In den Ribosomen wird die Knüpfung der

Peptidbindungen von der RNA und nicht von den ribosomalen Proteinen katalysiert, was als

biologisches Relikt der RNA-Welt verstanden werden kann. Für das im Vergleich zur DNA

frühe Auftreten der RNA spricht, dass RNA in heutigen Zellen vor allem in entwicklungsge-

schichtlich alten Prozessen vorkommt. Darüber hinaus werden Desoxyribonukleotide durch

enzymatische Reduktion von Ribonukleotiden gebildet und Desoxythymidylsäure entsteht

durch die Methylierung der Desoxyuridylsäure. Gegen das frühere Auftreten der RNA lässt

sich anführen, dass 2’-Desoxyribose im Vergleich zu Ribose stabiler und besser löslich ist

und durch die Abwesenheit der 2’-Hydroxyfunktion keine Konkurrenz zwischen 2’-5’- und

3’-5’-Verknüpfungen besteht.[52]

Neben möglichen präbiotischen Verfahren zur Herstellung von Ribose und Nukleobasen stellt

sich im RNA-Welt-Szenario auch die Frage nach der Synthese von Nukleosiden und

Nukleotiden. Obwohl präbiotische Nukleosidsynthesen bislang nur in geringen Ausbeuten

und exklusiv für Purinbasen gelangen,[53, 54] wird die Phosphorylierung von Nukleosiden bis

heute als wahrscheinlichster Zugang zu Nukleotiden diskutiert.[55] Alternative Syntheserouten,

wie sie von Sutherland vorgeschlagen wurden, umgehen freie Ribose und freie Pyrimidin-


6

Basen.[56, 57] Daneben wird die Beteiligung von Ribozymen bei der Nukleosid- bzw.

Nukleotidsynthese in Erwägung gezogen.[58]

Aufgrund der genannten Probleme wird mittlerweile von mindestens einem einfacheren und

niedriger organisierten System ausgegangen, welches der RNA-Welt als „Prä-RNA-Welt“

voranging.[55, 59-61] Die Vereinfachungen zielen dabei vor allem auf das Zucker-Phosphat-

Rückgrat der RNA ab, während die Basenpaarung als zentrales Element der Informations-

weitergabe beibehalten wird.


7

1.3 Die Bedeutung selbstreplizierender Systeme für die präbiotische Chemie

1.3.1 Templatgesteuerte Synthesen

Naylor und Gilham beschrieben 1966 die erste nichtenzymatische templatgesteuerte Konden-

sation zweier kurzer DNA-Fragmente an einer komplementären Matrize.[62] Sie setzten die

Thymidin-Oligonukleotide d(pT)5 bzw. d(pT)6 in Gegenwart von Polydesoxyadenosin-

Oligonukleotiden als komplementärer Matrize mit dem wasserlöslichen Carbodiimid CMC 1

um und erhielten die entsprechenden Ligationsprodukte d(pT)10 und d(pT)12 in 3 bzw. 5 %

Ausbeute (Abbildung 1).

CNH

NH

N+

O

O

C

N

N

N+

OC

NH

NH

N+

O O

PO

O

O

OH

P

O

O

O

CNH

NH

N+

O

O

OH

PO

O

O

O

PO

O

O

OH

+

H2O

+

R2

R1 R1 R1R2

1 2 2* 5

3

4

3

R1

2

Abbildung 1. CMC-vermittelte Kondensation von Phosphat-Komponente 2 und Hydroxyl-Komponente 4 zum Phosphodiester 5. – Gezeigt ist sowohl die Hinreaktion als auch die konkurrierende Hydrolyse des aktivierten Phosphats 2*.

Für die präbiotische Chemie stellt sich die Frage, wie ihrerseits die Penta- und Hexamere ent-

standen sind. In diesem Zusammenhang untersuchten Orgel und seine Mitarbeiter ausführlich

die nichtenzymatische Polymerisation von Monomeren an komplementären Matrizen.[63]

Zunächst wurden Poly-U- bzw. Poly-C-Matrizen verwendet, da Purin-Mononukleoside

(tripel-)helicale Strukturen mit Poly-Pyrimidin-Sequenzen bilden. Pyrimidin-Mononukleoside

hingegen bilden keine stabilen Strukturen mit Poly-Purin-Sequenzen, was in ihrer geringeren


8

Tendenz zur Basenstapelung begründet ist. Als Kondensationsmittel wurde mit EDC wieder-

um ein wasserlösliches Carbodiimid verwendet. Statt der natürlichen 3’-5’-Verknüpfung

beobachtete man überwiegend 2’-5’- und auch 5’-5’-Bindungen.[64, 65] Die Verwendung

präaktivierter Mononukleotide in Form ihrer 5’-Phosphoimidazolide (ImpA bzw. ImpG)

konnte die Effizienz der Bindungsbildung beschleunigen, aber nicht deren Regioselektivität

verändern.[66] Dies gelang erst durch die Verwendung zweiwertiger Metall-Ionen[67, 68] und

durch eine Variation am Imidazolring[69]. So lässt sich im ImpA/Poly-U-System mittels

Zugabe von Pb2+ nicht nur die Ausbeute an längeren Oligomeren deutlich steigern, sondern

auch die Regiochemie in einem beträchtlichen Umfang hin zur 3’-5’-Verknüpfung

umkehren.[67] Im Falle des ImpG/Poly-(C)-Systems bedingt Pb2+-Katalyse hingegen

2’-5’-Verknüpfungen, während Zn2+-Katalyse zu den gewünschten 3’-5’-Bindungen führt.[68]

Wird zur Synthese der aktivierten Nukleotide nun 2-Methylimidazol anstelle von Imidazol

verwendet (Abbildung 2), erhält man auch ohne Zusatz zweiwertiger Metall-Ionen längere

3’-5’-verknüpfte Oligomere.[69]

O

OHOH

OP

O

OH

NN

B

6

Abbildung 2. Struktur eines 5’-Phosphoro(2-methyl)imidazolids 6.

Diese drei Untersuchungen verdeutlichen, wie groß der Einfluss kleiner Änderungen des

Systems auf die Konformationen der beteiligten Komplexe sein kann und wie diese ihrerseits

die Effizienz einer templatierten Reaktion beeinflussen.

Auch die Zusammensetzung des Templats ist entscheidend. So nimmt bei der Verwendung

von Copolymeren aus Pyrimidin- und Purin-Basen als Matrize deren Wirkung mit steigendem

Purinanteil ab.[70] Als Erklärung dient einerseits die schlechte Basenstapelung von Uracil und

Cytosin, andererseits bilden Poly-G-Bereiche stabile Quadruplex-Strukturen, die Interaktio-

nen zwischen C und G unterdrücken. An einer Matrize der Sequenz CCGCC gelang 1984 die

erste nichtenzymatische Oligonukleotidsynthese mit sequenziellem Informationstransfer.[71]

Das purinreiche Produkt kann aber seinerseits nicht als Matrize wirken, was zur Selbstreplika-

tion geführt hätte.


9

1.3.2 Selbstreplizierende Systeme auf der Basis von Nukleinsäuren

Das erste enzymfreie selbstreplizierende System konnte 1986 durch von Kiedrowski

vorgestellt werden.[72] Das in Abbildung 3 dargestellte Design umfasst das terminal

geschützte DNA-Hexamer d(MeCCGCGGClPh) (C/7) mit palindromischer Sequenz, das als

Templat dient, und zwei Trimere d(MeCCGp) (A/8) und d(CGGClPh) (B/9), aus denen unter

EDC-Aktivierung neues Templat C (7) gebildet werden kann.

N N

N NH

O

NH2O

O

PO OH

O

O

O

PO O

O

N

O

O

PO O

O

MeO N

N

O

NH2

N

O

NH2

N N

N NH

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

OH N

Cl

N

O

NH2

EDC

N N

N NH

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

O N

Cl

N

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO

O

O

O

PO O

O

N

O

O

PO O

O

MeO N

N

O

NH2

N

O

NH2

A / 8

B / 9 C / 7

Abbildung 3. Selbstreplizierendes Minimalsystem nach von Kiedrowski.[72]

Die Verwendung von DNA verhindert unerwünschte Nebenprodukte, da sie die unnatürliche

2’-5’-Verknüpfung von vornherein ausschließt, ebenso die Einführung von Schutzgruppen am

3’-Terminus von A, am 5’-Terminus von B und damit am 3’- und 5’-Ende von C. Purin- und

Pyrimidin-Basen stehen in einem ausgewogenen Verhältnis zueinander und sorgen für einen

ausreichenden Templateffekt, der außerdem durch die höhere Komplexstabilität von Trimeren

gegenüber Monomeren beeinflusst wird. Die Reaktion erfolgt durch den nukleophilen Angriff

der 5’-Hydroxylgruppe von B auf die aktivierte 3’-Phosphatgruppe von A. Nebenprodukt ist


10

das 3’-3’-verknüpfte Pyrophosphat AppA. EDC muss im Überschuss (ca. 17-fach) zugesetzt

werden, da aktiviertes A* hydrolysiert und verbraucht wird.

Zum Nachweis der Autokatalyse wurde die Anfangskonzentration der Matrize C (7) c0

variiert und die Bildungsgeschwindigkeiten von C (7) und AppA wurden kinetisch

untersucht. Während letztere nicht durch initiale Templatzugabe beeinflusst wird, erhöht sich

die Reaktionsgeschwindigkeit der Produktbildung proportional zur Quadratwurzel von c0.

Daraus wurde folgende Gleichung abgeleitet, die als „Quadratwurzelgesetz der Autokatalyse“

bekannt ist.

βcαt

cv 0c

d

d (1)

Eine Auftragung der ermittelten Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten vc gegen die Quadrat-

wurzeln der initialen Konzentrationen an C ergibt eine Gerade, deren Steigung α ein Maß für

die Autokatalyse ist. Der Ordinatenabschnitt β hingegen ist ein Maß für die Synthese von C in

Abwesenheit einer Matrize, die oft auch als Hintergrundreaktion bezeichnet wird. Das

Quadratwurzelgesetz wurde 1987 von Zielinski und Orgel an einem tetrameren System auf

Basis rückgratmodifizierter Ribonukleotide bestätigt (Abbildung 4).[73]

OH

OH

OH

OH

N

N

O

NH2

N

N

O

NH2

O

NH

O

NH

PO O

O

NOH N

NNH

O

NH2

N N

N NH

O

NH2

O

O

NH

PO O

O

PO O

O

N3

OH

OH

N

N

O

NH2

O

NH2

O

NH

PO O

O

NOH N

NNH

O

NH2

OH

N

N

O

NH2

N N

N NH

O

NH2

O

O

NH

PO O

O

O

POH O

O

N3 OH

A / 10

B / 11 C / 12

EDC

Abbildung 4. Selbstreplizierendes Minimalsystem nach Zielinski und Orgel.[73]

Abbildung 5 zeigt ein einfaches Reaktionsmodell für ein selbstreplizierendes System. Die bei-

den Eduktbausteine A und B werden hierbei reversibel vom Templat C gebunden, wobei der

termolekulare Komplex ABC entsteht. Da in diesem Komplex die reaktiven Enden von A und


11

B in räumlicher Nähe preorganisiert sind, wird der folgende irreversible Ligationsschritt be-

günstigt. Es bildet sich der Templatduplex C2, der reversibel zu zwei Molekülen C

dissozieren kann, die in weiteren Cyclen als Templat zur Verfügung stehen.

Abbildung 5. Reaktionsmodell für ein autokatalytisches und selbstreplizierendes System.

Gleichung 2 gibt die Reaktionsgeschwindigkeit an, mit der C gebildet wird, und berücksich-

tigt neben dem autokatalytischen auch den nicht-autokatalytischen Reaktionsweg. Zu Beginn

der Reaktion ist die Konzentration an C noch gering und der Großteil des Produkts wird über

den nicht-autokatalytischen Weg gebildet. Erst wenn genug C gebildet wurde, endet die

Induktionsphase und die Kurve steigt steil an, um schließlich durch Verbrauch der Edukte A

und B in die Sättigung zu laufen. Auf diesem Weg kommt die sigmoide Form der

Konzentrations-Zeit-Kurve zustande.


12

])()[)((d

db0a00 kcckcbca

t

c p (2)

c = zur Zeit t neu gebildete Konzentration an C

a0 = Ausgangskonzentration von A

b0 = Ausgangskonzentration von B

c0 = Ausgangskonzentration von C

ka = Geschwindigkeitskonstante des autokatalytischen Reaktionskanals

kb = Geschwindigkeitskonstante des nicht-autokatalytischen Reaktionskanals

p = autokatalytische Reaktionsordnung

Die autokatalytische Reaktionsordnung p kann, wie nachfolgend gezeigt wird, theoretisch die

Werte ½ oder 1 annehmen, während in realen Systemen auch Werte zwischen ½ und 1

möglich sind. Betrachtet man den autokatalytischen Teil von Gleichung 1 zu frühen

Reaktionszeiten, ergibt sich:

pct

c d

d (3)

Trennung der Variablen und Integration im Zeitintervall zwischen 0 und t und im

dazugehörigen Konzentrationsintervall zwischen c0 und c ergibt:

c

c

t

pt

c

c

0 0

dd (4)

Nun muss zwischen p = ½ und p = 1 unterschieden werden.

Für p = ½ gilt:

1

1

1

d

d nn xn

xx

y (5)


13

Es ergibt sich die Lösung:

2

00 22

tcctcc

(6)

Für p = 1 gilt:

xxx

yln

1

d

d (7)

Somit lautet die Lösung von (4):

tcctcc elnln 00 (8)

Während Gleichung 8 eine exponentielle Wachstumsfunktion beschreibt, nimmt die Konzen-

tration in Gleichung 6 mit dem Quadrat der Zeit zu. Da die Auftragung der Konzentration c in

Abhängigkeit der Zeit t eine Parabel ergibt, spricht man hier von parabolischem Wachstum.

Die Näherung gilt nur für frühe Reaktionszeiten, weil der Verbrauch der Edukte hier nicht

betrachtet wurde. Nimmt p den Wert 0 an, gibt es keinen autokatalytischen Effekt und es

kommt gemäß Gleichung 9 zu linearem Wachstum:

tcctctc

c c

c

tc

c

t

0

000 00

dddd

(9)

Ursache des parabolischen Wachstums ist die Produktinhibition, die dadurch entsteht, dass

ein Großteil der gebildeten Templatmoleküle in inaktiven Duplexen C2 vorliegen, da die

Komplexbildungskonstante für den Templatduplex C2 (K2) in der Regel ein bis zwei Größen-

ordnungen höher ist als für den termolekularen Komplex ABC (K1). Erst ein System mit

K1 > K2 ist daher zu exponentiellem Wachstum fähig. Dieses ist jedoch, wie Szathmary 1989

theoretisch gezeigt hat, Voraussetzung für Selektion (survival of the fittest), also ein Szenario,

in dem der effizienteste Replikator seine Konkurrenten verdrängt, während parabolisches

Wachstum zu Koexistenz (survival of everybody) führt.[74] Im Falle der Koexistenz liegt der

effizienteste Replikator zwar in höheren Konzentrationen vor, kann aber seine Mitbewerber


14

nicht verdrängen. Die durch parabolisches Wachstum garantierte Sequenz-Vielfalt muss dem

exponentiellen Wachstum der RNA-Welt vorausgegangen sein, da sie den Aufbau funktio-

neller Moleküle wie der Ribozyme begünstigen konnte.

In den folgenden Jahren variierte und erweiterte die Arbeitsgruppe von Kiedrowski das 1986

vorgestellte System mit dem Ziel den templatierten Reaktionskanal zu verstärken und gleich-

zeitig die Hintergrundreaktion zurückzudrängen (Abbildung 6). Die Dominanz der Hinter-

grundreaktion hatte dazu geführt, dass das theoretisch erwartete sigmoide Konzentrations-

Zeit-Profil (s.o.) nicht beobachtet werden konnte. So wurde ein katalytisches System

untersucht, bei dem die Matrize C (7) (im Folgenden C1) beibehalten wurde, während die

Eduktbausteine A2 (13) und B2 (14) so designt waren, dass im reaktionsbestimmenden Schritt

eine Pyrophosphatbindung gebildet wird.[75] Das resultierende Hexamer C2 (15) ist nicht mit

C1 (7) identisch, kann aber als chemisch markiertes Produkt angesehen werden, welches die

HPLC-Analyse des Systems erleichtert.i Streng genommen findet keine echte Selbstreplika-

tion statt. Man fand heraus, dass unter gleichen Bedingungen C2 (15) im matrizenabhängigen

Reaktionskanal 21-mal schneller gebildet wird als C1 (7), während der nicht-matrizen-

abhängige Weg nur zehnmal schneller ist. Das System profitiert daher von der größeren

Nukleophilie der angreifenden 5’-Gruppe und der damit verbundenen schnelleren Replikati-

on. Die Verwendung von Trimeren, welche nur teilweise oder gar nicht komplementär zu C

sind, zeigt erwartungsgemäß einen Rückgang in der Reaktionsgeschwindigkeit (2- bis 50-mal

langsamer), der sich am stärksten im matrizenabhängigen Reaktionskanal bemerkbar macht.

Schließlich gelang es im Jahr 1992 das erste System vorzustellen, das sigmoides (s-förmiges)

Wachstum zeigt.[76] Hierbei reagiert ein Tridesoxynukleotid-3’-phosphat A2 (13) mit einem

5’-Amino-Trimer B3 (16) zu einem selbstkomplementären hexameren 3’-5’-Phosphoamidat

C3 (17). Die Nukleophilie der angreifenden 5’-Gruppe ist erneut gesteigert. Aus Gründen der

einfacheren Analyse (s.o.) wurde erneut die Phophodiester-Matrize C1 (7) als Templat ge-

wählt, da sie einen vergleichbaren katalytischen Effekt wie die Phosphoamidat-Matrize

C4 (18) besitzt. Letztere liefert somit ein indirektes Maß für den autokatalytischen Effekt von

C3 (17). Das Verhältnis von templatierter zu nicht-templatierter Synthese, definiert durch

b

a

k

k (10)

i C1 und C2 unterscheiden sich nur durch eine Schutzgruppe am 5’-Ende, d.h. sie können als chemisch sehr ähnlich betrachtet werden. Da sie sich durch Chromatographie trennen lassen, entfällt die Differenzbildung von HPLC-Integralen, die eine mögliche Fehlerquelle darstellt.


15

kann beim Übergang vom Phosphodiester-System zum Phosphoamidat-System von 25 auf

420 M-1/2 gesteigert werden. Weitere Untersuchungen zeigen, dass die Reaktivität der Kon-

densation maßgeblich von der Stapelung der beiden Nukleobasen bestimmt wird, die der

Verknüpfungsstelle benachbart sind. Dies geschieht in der Reihe G-G > G-C > C-G > C-C,

wobei beispielsweise der Reaktivitätsunterschied zwischen G-C und C-G etwa eine Größen-

ordnung beträgt. Da ka nach Arrhenius mit steigender Temperatur zunimmt, während die

Konzentration an C durch das Schmelzen der termolekularen Komplexe ABC abnimmt, ist es

zu erwarten, dass die Auftragung von ka gegen die Temperatur ein Maximum durchläuft.

Diese optimale Reaktionstemperatur liegt in der Nähe der Schmelztemperatur des Templat-

duplexes des jeweiligen Replikators.[77]

N N

N NH

O

NH2O

O

PO OH

O

O

O

PO O

O

N

O

O

PO O

O

O N

N

O

NH2

N

O

NH2

R1

N N

N NH

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

R2 N

Cl

N

O

NH2

N N

N NH

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

O

O

PO O

O

X N

Cl

N

O

NH2

N N

N NH

O

NH2O

O

PO

O

O

O

PO O

O

N

O

O

PO O

O

O N

N

O

NH2

N

O

NH2

R1

EDC

A1 / 8: R1 = CH3

A2 / 13: R1 = CH2SCH3

B1 / 9: R2 = HOB2 / 14: R2 = HO3PO-

B3 / 16: R2 = H2N

C1 / 7: R1 = CH3, X = OC2 / 15: R1 = CH2SCH3, X = PO4

-

C3 / 17: R1 = CH2SCH3, X = NHC4 / 18: R1 = H, X = NH

Abbildung 6. (Selbst)replizierende Minimalsysteme nach von Kiedrowski.[72, 75, 76]


16

Die bislang untersuchten Replikatoren waren alle selbstkomplementär, wohingegen das

natürliche Vorbild der Nukleinsäure-Replikation mit komplementären Strängen arbeitet, die

wechselseitig ihre Synthese katalysieren. Im Falle eines solchen kreuzkatalytischen Prozesses

wird im ersten Cyclus das zu C komplementäre Produkt C’ gebildet, welches im zweiten

Cyclus die Synthese des ursprünglichen Templates C katalysiert. Parallel hierzu wird im

zweiten Cyclus das zu C’ komplementäre Produkt C gebildet, welches im ersten die Synthese

des ursprünglichen Templates C’ katalysiert. Diese beiden Reaktionswege sind über die

Bildung desselben Templatduplexes CC’ miteinander verknüpft (Abbildung 7).

Abbildung 7. Reaktionsmodell für ein kreuzkatalytisches System.

Im Jahr 1994 stellten Sievers und von Kiedrowski ein minimales kreuzkatalytisches System

ausgehend von den vier trimeren Vorstufen N3CCGp (A), MTMCGGp (A’), nCCGClPh (B) und

nCGGClPh (B’) vor.[78, 79] Da in diesem System die beiden komplementären Matrizen N3CCGpnCCGClPh (C) und MTMCGGpnCGGClPh (C’) das Produkt der gleichen Ligations-

chemie sind, kommt es gleichzeitig zur autokatalytischen Selbstreplikation der beiden selbst-

komplementären Produkte N3CCGpnCGGClPh (C’’) und MTMCGGpnCCGClPh (C’’’) gemäß:


17

A’ + B + C’’ → C’’2 (11)

und

A + B’ + C’’’ → C’’’2 (12)

Weil die vier Produkte die gleiche zentrale Subsequenz G-C aufweisen (s.o.), zeigen alle

Kondensationen eine ähnliche Effizienz, unabhängig vom Pyrimidin-Gehalt und unabhängig

davon, ob die Reaktion auto- oder kreuzkatalytisch verläuft. Informationstransfer kann durch

Zugabe eines der vier Produkte in chemisch markierter Form nachgewiesen werden, da

hierdurch nur die Synthese der entsprechenden Sequenz selektiv stimuliert wird.

Schon 1993 wurden erste Anstrengungen unternommen, ein System zu realisieren, in dem

Wettbewerb um die Ressource Precursor besteht.[80] Dies gelang dadurch, dass die bereits

bekannte Sequenz CCGCGG nun aus drei Startbausteinen aufgebaut wurde, nämlich PGCCG, H2NCGp und H2NG. Das Ergebnis ist ein gekoppeltes katalytisches Netzwerk mit sechs ver-

schiedenen Rückkopplungen unterschiedlicher Effizienz. Zur Untersuchung wurde das Netz-

werk in Subsysteme zerlegt, die auf ihren jeweiligen Beitrag zum Gesamtsystem untersucht

wurden. Das Hexamer PGCCGpnCGpnG und das Pentamer PGCCGpnCGp verhalten sich als

gekoppelte Autokatalysatoren, indem sie einerseits egoistisch um die gleichen Startbausteine

konkurrieren, andererseits altruistisch ihre wechselseitige Synthese katalysieren. Das Haupt-

produkt der nicht-templatierten Synthese, PGCCGpnG, stellt hingegen einen isolierten Auto-

katalysator dar, der mit den anderen Spezies um die Vorstufen konkurriert. Die nächste Hürde

bestand nun darin, ein System zu entwerfen, das exponentielles Wachstum zeigt und so

Darwinsche Selektion möglich macht.

Das 1998 vorgestellte SPREAD-Verfahren (SPREAD = Surface Promoted Replication and

Exponential Amplification of DNA-analogues) ermöglicht erstmals eine Überwindung der

Produktinhibition.[81] Wie in Abbildung 8 dargestellt, werden zunächst Templatmoleküle über

Disulfidbrücken irreversibel auf einer Festphase immobilisiert (1). Nach Zugabe einer Lösung

komplementärer Fragmente, die über Wasserstoffbrückenbindungen reversibel an das

jeweilige Templat binden (2), kommt es durch Zugabe von EDC zur Ligation (3) und damit

zur Synthese eines zum ursprünglichen Templat komplementären Stranges. Dieser wird von

der immobilisierten Matrize getrennt (4), seinerseits immobilisiert und im nächsten

Synthesecyclus eingesetzt. Durch diese räumliche Trennung der Kopie vom Templat wird die

Reassoziation unterdrückt und die Produktinhibition umgangen. Das SPREAD-Verfahren ist

ein iterativer Prozess und erfordert daher das Eingreifen eines Experimentators.


18

Eine autonome SPREAD-Variante würde ein sich selbst erhaltendes chemisches System

darstellen, welches in der Lage wäre, Darwinsche Evolution zu zeigen.

Abbildung 8. Schematische Darstellung der SPREAD-Technik. – Die Abbildung ist aus der Originalarbeit entnommen worden.[81]

Paul und Joyce präsentierten 2002 ein Ligase-Ribozym, das seine eigene Bildung aus zwei

RNA-Fragmenten katalysiert (Abbildung 9).[82] Hierbei wird das Fragment A zu einer Lösung

des vorher hergestellten Komplexes BT aus Fragment B und Templat T gegeben, wodurch

sich der reaktive termolekulare Komplex ABT bilden kann. Für frühe Reaktionszeiten wurde

eine autokatalytische Reaktionsordnung von p = 1 gefunden, die charakteristisch für exponen-

tielles Wachstum ist und sich durch einen verhältnismäßig instabilen Templat-Duplex TT

erklären lässt. Allerdings können die neu gebildeten Ribozymmoleküle kaum als Matrize

wirken, da die Edukt-Fragmente als stabile AB-Komplexe vorliegen, was die Bildung des

termolekularen Komplexes erschwert. Als Folge lässt sich kein exponentielles Wachstum

beobachten. Dieses autokatalytische System wurde nachfolgend von Lincoln und Joyce zu

einem kreuz-katalytischen System weiterentwickelt, dessen Effizienz durch in vitro Evolution

der beteiligten Ribozyme optimiert wurde.[83] Dadurch beträgt die Verdopplungszeit statt

17 Stunden nur noch eine Stunde und die Replikation bricht nicht mehr nach zwei Cyclen ab,


19

sondern kann bei entsprechender Versorgung mit Edukten unendlich fortgesetzt werden. Lam

und Joyce überführten die Ribozyme in sogenannte „Adaptazyme“ und konnten so gezielt

exponentielles Wachstum durch die Zugabe von bestimmten Liganden einschalten.[84]

Abbildung 9. Selbstreplizierendes Ligase-Ribozym nach Joyce. – Die Abbildung ist aus der Originalarbeit entnommen worden.[82]


20

1.3.3 Selbstreplizierende Systeme auf der Basis von Peptiden

Als das erste selbstreplizierende Peptid 1996 von Ghadiri vorgestellt wurde,[85] waren

mögliche präbiotische Szenarien für die Entstehung von Aminosäuren (s. 1.1) und die

Kondensation zu Polypeptiden schon lange bekannt. Da Peptide in heutigen Organismen als

Funktionsmoleküle wirken und nicht direkt an Replikationsprozessen beteiligt sind, wurden

neue Modelle molekularer Evolution möglich.

Während die molekulare Erkennung bei Nukleinsäuren nachvollziehbar durch die Basen-

paarung erfolgt, also durch die Sequenz gegeben ist, spielen bei peptidischen Systemen auch

höhere Strukturebenen (Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur) eine wichtige Rolle. Der

Großteil der bisher beschriebenen Peptid-Replikatoren basiert auf dem Tertiär-Strukturmotiv

des Coiled-Coil (engl.: Doppelwendel). Hierbei handelt es sich um oligomere Anordnungen

von mindestens zwei amphipathischen (α)-Helices, deren Primärsequenz aus charakteristi-

schen heptameren Wiederholungseinheiten (abcdefg)n besteht (Abbildung 10).

Abbildung 10. Helixrad-Projektion einer Heptade eines dimeren Coiled-Coil. – Die molekulare Erkennung findet sowohl durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Positionen a und d statt als auch aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen den Positionen e und g. Die Reste in den Positionen b, c und f sind dem Lösungsmittel zugewandt und nehmen nicht direkt an der Ausbildung der Tertiärstruktur teil.

Der 1996 von Ghadiri beschriebene Replikator T ist ein Peptid aus 32 Aminosäureresten,

dessen Sequenz an die Leucin-Reißverschluss-Domäne des Transkriptionsfaktors GCN4 der

Hefe angelehnt ist und das in einem Gleichgewicht dimerer und trimerer Strukturen vorliegt.

Dieses Peptid T ist in der Lage, seine eigene Bildung aus einem elektrophilen Fragment E

(17mer) und einem nukleophilen Fragment N (15mer) zu katalysieren. Die dabei neu

entstehende Amidbindung wird unter den Bedingungen der nativen chemischen Ligation[86]

gebildet (Abbildung 11).


21

S

O

NH

R1 NH2

NH

O

SH

NH2

NH

O

S

O

NH

R1

NH

O

NH

R1

SH

O

+

E N T

Abbildung 11. Native Ligation nach Kent.[86] – Der C-terminale Thiobenzylester von E wird durch den N-terminalen Cyteinrest von N unter Ausbildung eines intermediären Thioesters angegriffen, der sich nachfol-gend in die thermodynamisch stabilere Amidbindung umlagert, wobei T entsteht.

Erste kinetische Untersuchungen zeigten parabolisches Wachstum gemäß dem Quadratwur-

zelgesetz der Autokatalyse und demzufolge eine Reaktionsordnung von p = 0.5. Die autokata-

lytische Effizienz betrug in diesem Fall ca. 500 M-1/2. Aufgrund einer verdoppelten initialen

Fragmentkonzentration konnte später eine Reaktionsordnung von p = 0.63 gefunden werden,

was die Beteiligung von quartermolekularen Komplexen des Typs ENTT neben den vorher

postulierten termolekularen Komplexen vom Typ ENT wahrscheinlich macht.ii

Bald darauf wurde ein Peptidnetzwerk vorgestellt, das eine dynamische Fehlerkorrektur

zeigt.[87] Hierbei werden neben den ursprünglichen Fragmenten E und N auch die beiden

Alanin-Mutanten E9A und N26A eingesetzt, sodass die vier Produkte T, T9A, T26A und T9A/26A

erwartet werden. Es zeigt sich, dass T als egoistischer Autokatalysator nur seine eigene Bil-

dung katalysiert, während T9A und T26A anstatt ihrer eigenen die Synthese von T katalysieren

(Abbildung 12). Dabei liegt die katalytische Effizienz der mutierten Peptide bei 75 % der

Aktivität von T. Das doppelt mutierte Produkt T9A/26A ist autokatalytisch sowie katalytisch

inaktiv.

ii Unter Berücksichtigung der Produktinhibition ergibt sich für ein quartermolekulares System im geschwindig-keitsbestimmenden Reaktionsschritt eine autokatalytische Reaktionsordnung von 2/3.


22

Abbildung 12. Peptidnetzwerk mit dynamischer Fehlerkorrektur.[87] – Der obere Cyclus entspricht dem Ursystem.

Später wurde ein System aus zwei mutualistischen Replikatoren beschrieben, die nicht nur

ihre eigene Synthese im Sinne der Autokatalyse beschleunigen, sondern auch als Kreuzkataly-

satoren auf die Synthese der jeweils anderen Spezies einwirken. Die Katalyse verläuft dabei

mit größerer Effizienz als die Autokatalyse. Diese Ergebnisse wurden zunächst im Sinne der

Hypercyclus-Theorie[39-41] gedeutet, was mangels Beweisen für eine autokatalytische Kreuz-

kopplung und Spezies höherer Ordnung zurückgezogen wurde.[88]

Das stereochemische Verhalten von Peptid-Replikatoren wurde untersucht, indem neben den

Homo-L-Fragmenten EL und NL auch die entsprechenden D-Enantiomere ED und ND einge-

setzt wurden.[89] Aus racemischen Ansätzen können so die vier möglichen Template TLL, TLD,

TDL und TDD entstehen. Aber nur die homochiralen Template TLL und TDD sind in der Lage,

ihre eigene Synthese autokatalytisch zu beschleunigen, wobei keine enantiomere Kreuz-

Inhibition beobachtet wird, wie sie für Oligonukleotide typisch ist. Die heterochiralen Spezies

TDL und TLD entstehen nur durch die entsprechenden untemplatierten Hintergrundreaktionen.


23

Erstaunlicherweise findet selbst bei Einzelmutationen in den Edukt-Fragmenten keine

Autokatalyse statt.

Auch bei peptischen Replikatoren gibt es die Bemühung, die autokatalytische Effizienz ε zu

steigern, indem zum einen die Hintergrundreaktion zurückgedrängt und zum anderen die Pro-

duktinhibition vermindert wird. Letzteres führt auch zu einer Erhöhung der autokatalytischen

Reaktionsordnung p. Die Überwindung der Produktinhibition wird wegen eines intrinsischen

Problems erschwert, da alle Maßnahmen zur Destabilisierung des Templat-Duplexes höchst-

wahrscheinlich auch zu einer Destabilisierung des termolekularen Komplexes führen werden.

Die Gruppe von Chmielewski entwickelte Peptid-Replikatoren, deren Autokatalyse durch den

Einfluss von pH-Wert[90] oder Salzkonzentration[91] moduliert werden kann. Später präsentier-

ten Issac und Chmielewski die Variante RI26 ihres ursprünglichen Replikators E1E2, welche

um eine Heptade verkürzt ist und unter vergleichbaren Bedingungen nicht als Dimer, sondern

als Tetramer vorliegt.[92] Im Vergleich zum Ursprungssytem wurde eine 90-fach langsamere

Hintergrundreaktion ermittelt (ε = 1.0 × 105 M

2.09) und durch die geringere Anzahl an Leucin-

Resten und die dadurch reduzierten hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Fragmen-

ten RI26a und RI26b erklärt. Die Reaktionsordnung p liegt mit 0.91 deutlich über dem Wert

von 0.75, welcher für ein produktinhibiertes tetrameres System zu erwarten ist, sodass das

System als schwach exponentiell charakterisiert wird. Als Ursache für die Reduktion der

Produktinhibition wird die verringerte Stabilität quaternärer Komplexe (RI26)4 gegenüber

dimeren (E1E2)2 Komplexen angenommen.

Auch der Austausch einzelner Aminosäure-Reste im Ursprungssystem E1E2 führt zu interes-

santen Ergebnissen. So verursacht die Destabilisierung des hydrophoben Kerns durch Aus-

tausch eines einzelnen Leucin-Rests in Position 19 gegen Alanin bzw. Glycin eine 50- bzw.

75-fach langsamere Hintergrundreaktion.[93] Der Austausch des Glutaminsäure-Rests an

Position 20 durch den Helixbrecher Prolin führt zu einer 35-fach langsameren Hintergrund-

reaktion (ε = 3.2 × 104 M2.09).[94] Wie im Falle von RI26 liegt das Produkt in Lösung als

Tetramer vor und wird durch eine ermittelte Reaktionsordnung von p = 0.91 als schwach

exponentiell charakterisiert.


24

1.3.4 Artifizielle Replikatoren

Ein erstes System auf dem Weg zu artifizieller Replikation publizierten Rebek et al 1990.[95]

Das Templat C (19) enthält ein Erkennungsmotiv auf der Basis eines Adenosin-Derivats und

ein dazu komplementäres Amid-Derivat der Kempschen Trisäure (Abbildung 13). Die

Ligation der Bausteine erfolgt durch die Knüpfung einer Amidbindung zwischen einem Amin

A (20) und einem Carbonsäure-Aktivester B (21) in Chloroform. Die hier beobachtete

Autokatalyse gehorcht ebenfalls dem Quadratwurzelgesetz (ε = 80 M-1/2).[96]

NO

O

O

O

O

O

F

F F

F

F

H NN

NN

O

O

O

NH

NH2

H

NN

NN

O

O O

NH

NO

O

O

O

H

ONH

H

NN

NN

O

OO

NH

NO

O

O

O

H

ONH

H

NN

NN

O

O O

NH

NO

O

O

O

H

ONH

H

O

OO

NNN

NNH

H

NH2

N

O

O

O

O

H

O

OFF

F

FF

NO

O

O

O

NH

O

NN

NN

O

O

O

NH

HH

A / 20

B / 21

C / 19 C / 19

C / 19

C / 19

A / 20B / 21

Abbildung 13. Replikator nach Rebek et al.[95] – Reaktion des bimolekularen AB-Komplexes zum cis-konfigu-rierten Produkt (links) und des termolekularen ABC-Komplexes zum trans-konfigurierten Produkt (rechts).

In den folgenden Jahren wurde der Mechanismus des Replikators intensiv diskutiert.[97-100]

Reinhoudt et al. untersuchten daher das komplexe System genauer und identifizierten fünf

verschiedene Reaktionswege für die Bildung des Templats C: (i) durch die Hintergrund-

reaktion, (ii) über einen binären Komplex AB, (iii) über den termolekularen Komplex ABC,

(iv) über den aktivierten Aktivester und schließlich (v) über das aktivierte Amid.[101] Die

Arbeit beendete die Kontroverse, da sie sowohl Rebek als auch seinem Kontrahenten Menger

Recht gibt: In Lösungen niedriger Konzentration findet Selbstreplikation statt, in Lösungen


25

hoher Konzentration auch Amid-Katalyse. Den bis dahin präferierten Reaktionskanal über

den binären Komplex konnte Rebek durch die Substitution des Naphtyl- mittels eines

Biphenyl-Spacers zurückdrängen und ein sigmoides Reaktionsprofil erhalten.[102]

Ein erster vollsynthetischer Replikator wurde 1992 von Terfort und von Kiedrowski

vorgestellt (Abbildung 14).[103] Hierbei basiert die molekulare Erkennung nicht auf Motiven

aus der Natur wie der Basenpaarung, sondern auf organischen Analoga wie in diesem Fall auf

Amidinium-Carboxylat-Salzbrücken. Die Kondensation von Amin A/22a und Aldehyd B/23a

ist autokatalytisch und wird durch Zugabe von Templat C/24a gemäß dem

Quadratwurzelgesetz beschleunigt (p = 0.5, ε = 16 M-1/2). Die Geschwindigkeit der Reaktion

von A/22b mit B/23b zu Produkt C/24b kann durch Zugabe der strukturell analogen Matrize

C/24c erhöht werden; dabei kann man allerdings eine lineare Abhängigkeit der Reaktionsrate

von der Konzentration an C/24c beobachten. Die Katalyse erster Ordnung lässt sich durch

einen ternären Komplex ABC (hier: 22b23b24c) erklären, der stabiler ist als der Templat-

Duplex CC (hier: 24c24c).

O

R1

O

O O

N

H

R3

R4

O

OONN

H H

H H

N

H

R2

R1

O

O O N N

HH

HH

N

H

R3

R4

O

OONN

H H

H H

NH2

R2

N N

HH

HH-

+

+

a: R1 = R4 = NO2, R2 = R3 = tBub: R1 = NO2, R2 = Me, R3 = tBu, R4 = Hc: R1 = R4 = H, R2 = R3 = tBu

-

+

+

A / 22 B / 23 C / 24

C / 24 C / 24

- -

Abbildung 14. Artifizielles Replikations-System nach Terfort und von Kiedrowski.[103]

Im Jahr 1997 beschrieben Wang und Sutherland ein selbstreplizierendes System auf der Basis

einer Diels-Alder-Cycloaddition zwischen dem Dien 25 und dem Maleinimid 26 (Abbildung

15).[104] Die autokatalytische Reaktionsordnung liegt mit p = 0.8 zwischen parabolischer und

exponentieller Replikation, was sich anhand einer sterisch gehinderten Templatassoziation

erklären lässt.


26

NN

NH

O

NN

O

O

O

NH

C5H11

O

H

H

N

O

N N

HH

N N

H

C5H11

O

O

N

O

O

H25 26

27

Abbildung 15. Selbstreplizierendes System nach Wang und Sutherland.[104]

Zwei Varianten dieses Systems wurden 2005 vorgestellt, um seine stereochemischen Eigen-

schaften besser untersuchen zu können.[105] Während Wang und Sutherland 1997 von einer

endo-Konfiguration von 27 ausgingen, konnte im Rahmen der Untersuchungen von Kinder-

mann et al. nur das exo-Produkt nachgewiesen werden. Die Analyse der individuellen Reak-

tionen von Dien (R)-28 bzw. (S)-28 mit Dienophil 29 in Gegenwart von 10 % Templat 30

zeigt, dass es homochirale autokatalytische sowie heterochirale kreuzkatalytische Reaktions-

kanäle gibt, deren Templatduplexe vergleichbar populiert sind (Abbildung 16).

R2

N

O

O

R3 R2 N

O

O

R3

R2

N

O

O

R3 N

O

O

R3R2

N

NH

O N

O

O O

OH

R1 R1

O

O

N

O

O

H

R1 R1

N

NH

O

+

+

28 29 30

A / 28 B / 29

C / 30

Abbildung 16. Selbstreplikations-System nach Kindermann und von Kiedrowski. – Termolekularer Komplex (links) und homo-und heterochirale Reaktionskanäle (rechts).

Ein weiteres minimales Selbstreplikations-System auf der Basis einer Cycloaddition wurde

2001 von Philp vorgestellt (p = 0.9, ε = 5000 M-1/2).[106] Hier reagiert ein Nitron 31 als

1,3-Dipol mit einem Maleinimid 32 als Dipolarophil in einer Huisgen-Reaktion; dabei kann

nur eins der diastereomeren Produkte 33 als Katalysator für seine eigene Bildung dienen

(Abbildung 17). Dies lässt sich damit erklären, dass das cis-Isomer eine geschlossene Geome-

trie annimmt und daher nicht fähig ist, einen ternären Komplex auszubilden, während das


27

trans-Isomer als egoistischer Replikator fungiert und die eigene Bildung exklusiv beschleu-

nigt. Dieses System wurde später durch geringe strukturelle Variationen optimiert.[107]

N NH

O

N+

ON

O

O

OO H

ON N

O

OO

O HO

NH

N

H

H

+

31 32 33

Abbildung 17. Replikations-System auf der Basis einer 1,3-dipolaren Huisgen-Cycloaddition.[106] – Gezeigt ist nur das autokatalytisch aktive trans-Isomer.

Dieckmann et al. stellten 2010 ein System vor, das auf der Cycloaddition eines Fulvens 34 mit

einem Maleinimid 35 basiert, und untersuchten es mit Hilfe von zeitaufgelöster NMR-

Spektroskopie und Computer-Simulationen (Abbildung 18).[108, 109]

N

O

H

N

O

O

ORO

N

O

H

N

O

OOR

O

N

O

N

O

OOR

O

H

+

35a: R = H 3435b: R = Me

36a: R = H: NN 36b: R = Me: NN'

36c: R = H: NX36d: R = Me: NX'

Abbildung 18. Bimolekulare Hintergrundreaktion des Replikators nach Dieckmann und von Kiedrowski.[108, 109]

Unter Blockierung der supramolekularen Erkennungsstellen werden im Laufe der Reaktion

zwei Diastereomere NN und NX mit gleichen Raten gebildet. Ist molekulare Erkennung

möglich, entsteht ein Netzwerk, in dem das Diastereomer NN als egoistischer Autokatalysator

wirkt, während das andere Isomer NX als schwacher Altruist fungiert (Abbildung 19). Daher

wird NN im Vergleich zu NX mit einer Diastereoselektivität von 16:1 gebildet.


28

Abbildung 19. Fulven-Replikator-System nach Dieckmann und von Kiedrowski. – Ein Zwei-Buchstaben-Code wird zur Bezeichnung der Produkte verwendet. Der erste differenziert die Diels-Alder-Produkte (N: endo, X: exo), der zweite die Orientierung der Amidopyridin-Erkennungsstelle (N: auf der gleichen Seite wie die Brücke, X: auf der entgegengesetzten Seite der Brücke). Die Abbildung ist der Originalarbeit entnommen.[108]


29

1.4 Die PNA-Welt als Modell einer Prä-RNA-Welt

1.4.1 Intention des PNA-Designs

PNA wurde ursprünglich entworfen, um mit DNA-Duplexen Triplex-Strukturen auszu-

bilden.[110] Solche Triplex-Strukturen bilden sich in der großen Furche der DNA mit

Homopurin-Regionen, indem der dritte und Triplex-bildende Strang durch Hoogsteen- statt

durch Watson-Crick-Basenpaarung bindet (Abbildung 20).

N N

N N

NHH

N

O

O

HN

N

O

N

O

H

N N

N N

O

N

H

H

H

NN

O

N

H

HN

N+

O

NH

H

H

Abbildung 20. Watson-Crick- (blau) und Hoogsteen-Basenpaarungen (rot) beim T·A-T-Triplett (links) und C+·G-C-Triplett (rechts). – Der Triplex-bildende Strang bindet an die Seiten der Purine, die nicht an der Watson-Crick-Basenpaarung teilnehmen (N7 und N6 bei Adenin, N7 und O6 bei Guanin).

Beim computergestützten Design gingen Nielsen et al. 1991 daher von einem normalen

T·A-T-Triplex aus, entfernten das Zucker-Phosphat-Rückgrat und ersetzten es durch ein

Polyamid-Rückgrat.[110] Es erwies sich, dass die sechs Bindungen einer monomeren

2-(Aminoethyl)glycin-Einheit (AEG) und die drei Bindungen eines Methylencarbonyl-

Spacers optimal für die Bindung an DNA in der B-Konformation sind. Eine unabhängige

Studie auf Basis von Molecular-Modelling im selben Jahr führte zu vergleichbaren

Ergebnissen.[111] Darüber hinaus wurde AEG schon 1987 als Baustein für ein alternatives

Rückgrat vorgeschlagen.[112] Abbildung 21 zeigt die Primärstruktur von PNA im Vergleich zu

den Strukturen der natürlichen Biopolymere.


30

OH

O

O

OB

PO O

O

O

OB

PO O

O

O

OHB

PO O

n

n

NH2

NO

O

NH

N

O

B

O

NH

NO

B

O

NH2

B

OH

O

O

OB

PO O

O

O

OB

PO O

O

O

OHB

PO O

OH

OH

OH

n

NHO

NHR

R

OHO

NHR

O

O

NH2

R

n

Abbildung 21. Primärstrukturen von PNA, DNA, RNA und Peptiden (von links nach rechts).

Pyrimidinreiche PNAs bilden in der Regel keine Triplexstrukturen der Form

DNA·DNA-PNA, sondern des Typs PNA-DNA·PNA. Aus doppelsträngiger DNA verdrängen

sie den nicht-komplementären Strang (Strand-Invasion). Bei diesen Komplexen bindet ein

PNA-Strang über Watson-Crick-Basenpaare im antiparallelen Modus, der andere über

Hoogsteen-Basenpaare im parallelen Modus. Dieses und weitere Strukturmotive für die

Hybridisierung von PNA an doppelsträngige DNA zeigt Abbildung 22. PNAs mit

ausgeglichenem Pyrimidin/Purin-Verhältnis bilden mit DNA und RNA Duplexe, deren

antiparallele Orientierung ebenfalls bevorzugt ist. Die Struktur wird hierbei von der DNA

oder RNA beeinflusst, während der PNA-Strang die Struktur des Bindungspartners adaptiert.

Abbildung 22. Strukturmotive für die Hybridisierung von PNA an doppelsträngige DNA. – a) Triplex; b) Triplex-Invasion; c) Duplex-Invasion; d) Double-Duplex-Invasion.


31

Untersuchungen an einem nicht-selbstkomplementären PNA-15mer mit einer zentralen

gtac-Einheit und einem ausgeglichenen Pyrimidin/Purin-Gehalt zeigten, dass die geringere

elektrostatische Abstoßung zwischen PNA und DNA bzw. RNA sowohl eine Steigerung der

Affinität als auch der Spezifität verursacht.[113] Die untersuchten PNA/DNA- und PNA/RNA-

Komplexe schmelzen in der antiparallelen Orientierung 16.2 °C bzw. 21.7 °C später als die

korrespondierenden DNA/DNA- bzw. RNA/RNA-Duplexe. In der parallelen Orientierung

betragen die Werte für ΔTm 13.4 °C bzw. 21.1 °C. Diese erhöhte Stabilität zeigt sich wie

erwartet bei niedrigen bis hohen Salzkonzentrationen, während PNA/DNA- und DNA/DNA-

Duplexe oberhalb von 1 M Na+ identische thermische Stabilitäten besitzen, da hohe Salzkon-

zentrationen die Stabilität doppelsträngiger DNA erhöhen. Detaillierte Messungen mit Hilfe

der BIAcore Technik und weitere thermische Messungen zeigen, dass PNA/RNA-Duplexe

durchschnittlich 4 °C später schmelzen als die korrespondierenden PNA/DNA-Komplexe und

schnellere Assoziationskonstanten und langsamere Dissoziationskonstanten aufweisen.[114]

Basenfehlpaarungen führen in PNA/DNA-Duplexen zu deutlicheren Destabilisierungen als in

DNA/DNA-Duplexen. Im Beispielsystem (H-tgtacgtcacaacta-NH2) wurden nacheinander die

Basen der zentralen gtac-Einheit ausgetauscht und ein durchschnittlicher Wert für ΔTm von

15 °C ermittelt. Die geringste Diskriminierung im PNA/DNA-Duplex beträg 8 °C, im

DNA/DNA-Duplex 4 °C. Komplementäre PNAs bilden unter Beachtung der Watson-Crick-

Basenpaarung helicale Duplexe, deren Stabilität gegenüber allen anderen Kombinationen von

DNA, RNA und PNA deutlich höher ist.[115, 116] Die entstehende Struktur wird P-Form

genannt und unterscheidet sich von den bisher bekannten Nukleinsäurestrukturen (Tabelle 1,

Abbildung 23). Sie wird auch im Falle von Triplexen beobachtet.


32

Tabelle 1. Vergleich der A- B- und Z-Form von DNA mit der P-Form von PNA

A-DNA B-DNA Z-DNA P-PNA

Drehsinn der Helix rechts rechts links rechts und links (1:1)

Durchmesser ~ 26 Å ~ 20 Å ~ 18 Å ~ 28 Å

Basenpaare pro Windung 11 10.5 12 18

Anstieg der Helix je Basenpaar 2.6 Å 3.4 Å 3.7 Å 3.2 Å

Neigung der Basen gegenüber der Helix-Achse

20 ° 6 ° 7 ° < 1 %

Twist 31 ° 36 ° 60 °/2 19.8 °

Abbildung 23. Strukturen gelöster PNA-Komplexe. – Die Abbildung wurde aus Referenz[117] entnommen; das Original stammt aus [118].


33

1.4.2 Das Potential einer PNA-Welt

Alles bisher bekannte Leben auf der Erde basiert auf Zellen, also auf geschlossenen Kompar-

timenten. In den Zellen selbst können sich, z.B. in Form vom Organellen, weitere

Kompartimente befinden, die verschiedene Reaktionsräume formen. Die Kompartimentierung

hat eine Reihe von Auswirkungen auf die Bestandteile eines chemischen Systems: Sie werden

in einem definierten Bereich lokalisiert, ihre Diffusion wird limitiert und sie werden vor

äußeren chemischen Einflüssen geschützt. Die damit verbundene Konzentrationserhöhung im

Inneren der Kompartimente begünstigt Reaktionen wie die Bildung von Biopolymeren und

stellt einen alternativen Weg zur Konzentrierung von Monomeren durch Austrocknung oder

eutektisches Ausfrieren dar. Die Frage nach der Entstehung erster Zellen und Zellvorläufer,

der sogenannten Protozellen, ist ebenfalls Gegenstand der präbiotischen Chemie; dabei muss

die Struktur einer Protozelle und die ihr zu Grunde liegende Chemie nicht zwangsläufig ein

Abbild der heutigen hoch spezialisierten Zellen sein.[119-128] Eine lebende Zelle wird in diesem

Zusammenhang durch die Kooperation von Genen, Metabolismus und Kompartimentier-

ung charakterisiert. Im Vergleich zu den von Oparin formulierten Voraussetzungen für Leben

(Selbstreplikation, Mutation, Metabolismus; vgl. 1.1) werden hier Selbstreplikation und

Mutation im Begriff Gen zusammengefasst und die Anforderungen um das Konzept der

Kompartimentierung erweitert. Ein leistungsfähiges Modell zur Beschreibung minimaler

Zellen, das Chemoton-Modell, wurde 1971 von Ganti vorgestellt und in den folgenden Jahren

weiter ausgebaut.[129-134] In diesem Modell sind ein genetisches, ein metabolisches und ein

membranformendes Subsystem stöchiometrisch gekoppelt.

Das Potential der PNA als genetisches Material in Protozellen wurde während des PACE-

Projekts (Programmable Artificial Cell Evolution) intensiv theoretisch und experimentell

untersucht.[135-138] Während die Gene moderner Zellen von Lipid-Membranen umschlossen

sind, war es Teil dieses Protozellen-Konzeptes, sie in Form von PNA an der Oberfläche eines

Lipid-Aggregats oder in diesem selbst physikalisch zu binden, um eine starke Verbindung

zwischen Geno- und Phänotyp zu garantieren. Die gewünschte Assoziation der PNA zur

Lipid-Hülle sollte durch die Konjugation mit Lipiden[139, 140] oder durch chemische Modifi-

zierung des Rückgrats[141, 142] erreicht werden (Abbildung 24, links und Mitte). Auf diese

Weise sollten PNAs synthetisiert werden, die in einem hydrophoben organischen Medium

löslich sind, wie es im Inneren von Mizellen vorherrscht. Bereits unmodifizierte PNA zeigt

unter Zugabe aprotischer organischer Solventien (DMF, 1,4-Dioxan) eine nahezu unbeein-

trächtigte Duplexstabilität, die auch in der Extrapolation hin zu 100 % organischem Solvenz


34

nur geringfügig abnimmt.[143] Es war außerdem vorgesehen, das genetische Material PNA

direkt mit dem Metabolismus der Protozelle zu verbinden, um Selektion und damit Evolution

auf Basis der metabolischen Leistung zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde ein

Ruthenium-Komplex mit einem PNA-Strang verknüpft (Abbildung 24, rechts). Der resul-

tierende Metallkomplex 39 soll als Photo-Sensibilisator fungieren, dem Metabolismus der

Zelle Energie zur Verfügung stellen und Nukleobasen der PNA als Elektronen-Relais nutzen.

NO

OO

NH

NO

OO

NH

NH

O

N

N

NH

O

N

OO

Ru2+

N

N

N

N

B B B

37 38 39

Abbildung 24. Strukturen von Lecine-PNA (links), Octanoly-lysin-PNA (Mitte) und eines PNA-Photo-Sensibilisator-Konjugats (rechts).


35

1.4.3 Schlüssige präbiotische Synthesewege für PNA-Bausteine

Schon 1988 berichteten Ogura et al., dass Ethylendiamin neben Methylamin das Hauptpro-

dukt der Photolyse von CH4 und NH3 ist.[144] Interessanterweise wird gerade die photolytische

Instabilität dieser beiden Verbindungen oft als Gegenargument einer reduzierenden Uratmos-

phäre angeführt. Miller und Nelson gelang 1996 die Synthese von 2-(Aminoethyl)glycin

(AEG) durch eine Strecker-Synthese mit Ethylendiamin (ED), Formaldehyd und Blausäu-

re.[145] Bei Ausgangskonzentrationen von 10-1 M bis hin zu 10-4 M erreichten sie Ausbeuten

von 11-79 % an AEG, als Nebenprodukte wurden N,N’-Ethylendiamindiessigsäure und

N,N-Ethylendiamindiessigsäure gefunden. Später konnte die Ausgangskonzentration sogar

noch auf 10-5 M erniedrigt werden, bei Ausbeuten von 18 bzw. 33 %.[146] Aus Gemischen von

CH4, NH3, N2 und H2O sind unter elektrischer Entladung bei 25 und 100 °C sowohl AEG als

auch ED zugänglich, während sich bei der Polymerisation von NH4CN ohne und mit Zusatz

von Formaldehyd nur ED nachweisen lässt. Die hohe Löslichkeit von AEG*H2O und seines

Hydrochlorids in Wasser (6.4 bzw. 13.7 mol/l) ermöglicht eine Konzentrierung dieser Verbin-

dung durch trocknende Strände und Lagunen. Adenin- und Guanin-N9-essigsäure sind aus der

Polymerisation von NH4CN in der Gegenwart von Glycin zugänglich, während Cytosin- und

Uracil-N1-essigsäure aus der Umsetzung von Hydantoinsäure und Cyanoacetaldehyd

hergestellt werden können.[146]

Im Falle der PNA-Bausteine scheint auch ein extraterrestrischer Ursprung möglich. So fanden

Meierhenrich et al. bei der künstlichen Herstellung von interstellarem Eis neben 16 Amino-

säuren einige Diaminosäuren,[33] die später auch in einer Probe des Murchinson-Meteoriten

nachgewiesen wurden.[147] Bereits eine Dekade vor diesen Ergebnissen schlug Nielsen

präbiotische PNA-Varianten vor, die auf 2,4-Diaminobutansäure (40) und 2,5-Diamino-

pentansäure (41) basieren (Abbildung 25).[148]


36

NH2 OH

NH2

O

NH2 OH

NH2

O

NH2

NH2

OH

ONH2

NH2

OH

O

OH

O

NH2

NH2

NH2 OH

O

NH2

NH

NH2

ONH

O

B

NH

ONH

O

B

NH2

ONH

O

B

n

NH2

ONH

O

B

NHO

NH

O

B

NHO

NH

O

B

NH2

n

42 40 41

43 44 45 46 47

Abbildung 25. Diaminosäuren extraterristrischen Ursprungs (40-45) und PNA-Varianten auf der Basis von 2,4-Diaminobutansäure und 2,5-Diaminopentansäure (46, 47).


37

1.4.4 Chemische Stabilität

Auf die Stabilität der PNA gegenüber biologischen Enzymen wie Proteasen und Peptidasen

ist schon früh hingewiesen worden.[149] In einem präbiotischen Kontext ist zunächst die

Langzeitstabilität der Monomere in wässrigen Lösungen von Bedeutung, damit eine kritische

Konzentration zur Oligomerisierung erreicht werden kann.

Die terminale Amino-Gruppe der PNA besitzt einen pKa-Wert von etwa 10-11 und ist sterisch

deutlich flexibler als die α-Amino-Funktion einer natürlichen Aminosäure, die darüber hinaus

nur einen pKa-Wert von 9-10 aufweist. Diese erhöhte Basizität und Reaktivität führt zu

Nebenreaktionen, die abhängig vom pH-Wert der Lösung sind. Experimentell konnte gezeigt

werden, dass das t-Monomer 48 bei 20 °C im pH-Bereich von 7.0 bis 10.0 über mehrere

Wochen chemisch stabil ist und erst bei pH 11 die in Abbildung 26 gezeigte Umlagerung zu

49 mit einer Halbwertszeit von 34 Tagen eingeht.[150] Der pH-Wert hat Einfluss auf die

Population der beiden Rotamere der tertiären Amid-Gruppe und verschiebt das Gleichgewicht

in Richtung cis-Isomer, von dem aus der Acyl-Transfer stattfinden kann.

NOH

O

N

O

NH2

NH

O

O

N

NH

O

O

NOH

O

NH2

O

NH

OH

O

NH

O

N

NH

OO

trans-48 cis-48 49

Abbildung 26. N-Acyl-Transfer am PNA-Thymin-Monomer 48 ausgehend vom cis-Rotamer.

Die Halbwertszeit und damit die Langzeitstabilität bei pH 7 und 20 °C wird auf 1000 Jahre

geschätzt, was in präbiotischen Dimensionen ein kurzer Zeitraum ist. Weiterhin scheint die

Cyclisierung des PNA-Rückgrats unter dem Einfluss erhöhter Temperatur oder durch

Aktivierung der Carboxylfunktion unvermeidbar (Abbildung 27). So cyclisiert AEG 50 bei

100 °C unter neutralen Bedingungen zum Monoketopiperazin 51,[146] ebenso wie PNA-

Monomere 52 unter den Bedingungen der EDC-Aktivierung zu 53 reagieren[151]. Auch

Monomer-Alkylester 54 cyclisieren unter neutralen oder basischen Bedingungen.[152] Daher

werden bei Ligations-Experimenten stets Dimere oder höhere Oligomere verwendet, was als

Schwachpunkt der PNA-Welt-Hypothese gilt.[153] Bei der präbiotischen Peptidsynthese ist das


38

Problem der Cyclisierung auf der Stufe der aktivierten Dipeptide 55 bekannt, wobei

Diketopiperazine 56 entstehen.[154]

NH2

N

OO

O

B

NH2

NH

O

X

O

R

RNH

N

O

O

B

NH

NH

O

O R

R

NH2

NH

O

OH

NH

NH

O

NH2

N

OO

OH

B

NH

N

O

O

B

-HX

100 °C EDCa) b)

c) d)

50 51 52 53

54 53 55 56

Abbildung 27. a) – c) Cyclisierung monomerer PNA-Strukturen; d) Cyclisierung aktivierter Dipeptide.

Dessen ungeachtet können PNA-Monomere auch nach der Reaktion zum Monoketopiperazin

einer Oligomerisierung zur Verfügung stehen, wenn sie geeignet aktiviert werden. Die

koreanische Firma Panagene hat ein Verfahren entwickelt, bei dem PNA-Oligomere aus

selbstaktivierten stabilen Monomeren 57 aufgebaut werden.[155] Diese enthalten elektronenzie-

hende Schutzgruppen wie Benzothiazol-2-sulfonyl (Bts), Nitrobenzolsulfonyl oder Thiadia-

zolsulfonylderivate (Abbildung 28). Natürlich können diese Gruppen nicht unbedingt als

präbiotisch angesehen werden, was auch nicht die Intention des Designs war. Jedoch zeigt das

Verfahren einen möglichen Ausweg aus dem Monomer-Problem.


39

NOH

O

B

O

NH

PG N

O

N O

B

PG

O OS

N S

O OS

NO2

O OS

N SN

Ph

O OS

N SN

O

Ph

N

O

B

O

NH2

N

O

N O

B

PG

N

O

B

O

NH

N

O

B

O

NH

PG

EDC

PG:

+

DIPEA, DMF,40 °C, 2 h

58 57

57 59 60

Abbildung 28. Selbstaktivierte Monomere der Firma Panagene (oben) und ihre Oligomerisierung ohne Zugabe von Kopplungsreagenzien (unten).

Interessanterweise berichteten vor kurzem Luisi und Mitarbeiter, dass Dimere, Trimere und

Tetramere 61a-c in geringer Ausbeute aus Monomer-Ethylestern 62 unter Katalyse des

einfachen Dipeptids Ser-His entstehen können (Abbildung 29).[156]

NH2

N

OO

O

N

NH

O

O

NN

OO

O

N

NH

O

O

H

Hn

v n = 2, 6.5 % v n = 3, 3.6 %v n = 4, 9.1 %

a: b: c:n

Ser-His

62 61

Abbildung 29. Bildung von kurzen PNA-Oligomeren. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: 10 mM PNA Monomer, 1.5 mM Ser-His, 100 mM Natriumborat pH 10, 6 % (v/v) DMF, 35 h, 25 °C.

Auf der Stufe der Oligomere tritt neben dem bereits besprochenen Acyl-Transfer, der zu

einem umgelagerten Produkt gleicher Masse führt, zusätzlich eine Abbaureaktion unter

Transamidierung auf, bei der die letzte monomere Einheit abgespalten wird (Abbildung 30).


40

NH2

N

OO

NH

N

OO

NH O

NH

R NH

NH

O

NH

N

OO

NH

O

NH

R

O

n-1

B

NH2N

OO

NH

O

NH

R

NH

N

O

O

B B

a)

b)

a)

b)

nB

63 64

53 65

B

+n

B

Abbildung 30. Transamidierung von PNA-Oligomeren. – a) unter Wanderung der N-terminalen Nukleobase; b) unter Abspaltung des N-terminalen Monomers. Generell lassen sich chemische Veränderungen erst ab pH 9 beobachten, typische Halbwertszeiten liegen zwischen 15 und 163 Tagen bei pH 9 und 1.5 Stunden bis 21 Tagen bei pH 12.

Neben der Abhängigkeit vom pH-Wert lässt sich auch ein entscheidender Einfluss der

Sequenz beobachten, wobei vor allem die beiden N-terminalen Basen entscheidend sind.

Ursächlich könnte eine Veränderung der Rotamer-Population sein, da der Abbau vom

cis-Isomer auszugehen scheint (s.o.). Da sich die Abbaureaktionen durch Alkylierung des

N-Terminus zum sekundären Amin deutlich verlangsamen und sich nach Acylierung gar nicht

mehr beobachten lassen, scheint die Stabilität der Oligomere im präbiotischen Kontext

weniger kritisch als die der Monomere.


41

1.4.5 Katalytische Aktivität

Voraussetzung für katalytisch aktive PNA ist in Analogie zu RNA die Ausbildung von

Sekundär- bzw. Tertiärstrukturen. Diese Bedingung ist zwar erfüllt, da PNA sowohl

Triplexe[157] und Quadruplexe[158, 159] als auch komplexere Strukturen[160] bilden kann, es gibt

aber noch kein Beispiel katalytischer Aktivität, wie sie für ein evolvierendes System auf

PNA-Basis nötig wäre. Nielsen äußerte 1993 die Möglichkeit einer kombinierten PNA/RNA-

Welt, in der PNA als stabiler Träger der genetischen Information fungiert, während RNA

katalytische Funktionen wie die PNA-Replikation übernimmt.[148] Dies scheint nicht abwegig

zu sein, da die Knüpfung von Peptidbindungen in den Ribosomen von der RNA katalysiert

wird. Unter dem Namen „PNAzymes“ stellten Strömberg et al. künstliche RNA-Restriktions-

Enzyme vor.[161, 162] Die katalytische Aktivität kommt hier allein durch chelatisierte Zn(II)-

bzw. Cu(II)-Ionen zustande, während die PNA zum einen als Trägermaterial für den Chelat-

Komplex dient, zum anderen durch Watson-Crick-Basenpaarung an die Zielsequenz bindet.

Diese Funktionen kann auch ein Rückgrat aus 2′-O-Methyl-oligoribonukleotiden über-

nehmen,[163] das allerdings anfälliger für eine Degradierung durch natürliche Nukleasen ist.


42

1.4.6 PNA und der Ursprung der Homochiralität

Das sogenannte Homopolymer-Problem beschreibt die Schwierigkeiten, aus einer racemi-

schen Lösung von Monomeren homochirale Oligomere zu bilden und diese erfolgreich zu

replizieren. Zum einen ist die Wahrscheinlichkeit unter diesen Bedingungen ein homochirales

n-mer zu erhalten gleich (½)n, wenn die untemplatierte Primerverlängerung nicht enantio-

selektiv ist. Zum anderen führt die enantioselektive Kreuz-Inhibition zu Kettenabbrüchen

während der Replikation.[164, 165]

Die Achiralität der PNA umgeht das erste Teilproblem. Aber die enantioselektive Kreuz-

Inhibition lässt sich durch die bloße Verwendung einer achiralen PNA-Matrize nicht lösen,

wie bei der Oligomerisierung von z.B. 2-MeImG an einem PNA-C10-Templat gezeigt

wurde.[166] Einen möglichen Ausweg stellt der graduelle Übergang von einem achiralen

genetischen Material wie der PNA zu einem chiralen Homopolymer wie der RNA dar. Da das

AEG-Rückgrat von sich aus achiral ist, bildet sich in Lösung ein 1:1 Gleichgewicht zwischen

links- und rechtsgängigen Helices, das erst durch die Einführung chiraler Liganden wie

einfacher α-Aminosäuren oder auch von Didesoxynukleotiden zu einer bevorzugten Chiralität

verschoben werden kann.[115, 116, 167-169] Die Chiralität, die durch den bloßen Ersatz zweier

PNA-Einheiten durch Desoxynukleotide in einem PNA-Templatstrang entsteht, wird durch

den an sich achiralen Strang weitergeleitet, sodass es bei einer templatierten Verlängerung

eines achiralen Primers zur ferngesteuerten Enantioselektion kommt.[168] Diese Übertragung

chiraler Informationen über größere Entfernung durch kovalente und nicht-kovalente

Bindungen führt zu einem möglichen Szenario, in dem kleine homochirale DNA- oder RNA-

Segmente ihre enantioselektive Replikation durch den Einbau in eine PNA-Helix gewährleis-

ten. Evolutive Prozesse könnten im weiteren Verlauf für eine schrittweise Reduzierung des

PNA-Anteils in den Chimären sorgen. In einem von Nielsen 2007 aufgestellten Modell findet

diese Abfolge von Induktion, Replikation und Evolution in einer Population von Protozellen

statt, und führt zu einem homochiralen Genom auf der Basis von RNA.[170] Hierbei ging er

von einer Population aus, in der jede Zelle bedingt durch eine hohe Mutationsrate über ein

einzigartiges Genom verfügt. Wenn nun eine dieser Zellen einen deutlichen evolutiven

Vorteil besitzt, kann sie zum Urahn der RNA-Welt werden.


43

1.4.7 Speicherung und Weitergabe genetischer Informationen

Mit eingeschränkter Effizienz und unter geeigneten Ligationsbedingungen kann ein

PNA-C10-Strang die Oligomerisierung von PNA-G-Dimeren katalysieren (Abbildung 31).[171]

Da das gleiche Templat auch die Oligomerisierung von aktiviertem Guanidinmonophosphat

und somit die Bildung von RNA katalysiert, scheint ein genetischer Übergang von einer

PNA- zu einer RNA-Welt chemisch möglich.[170, 171] In analogen Experimenten dienten DNA-

Stränge als Templat für die Oligomerisierung von aktivierten RNA-Monomeren und PNA-

Dimeren.[171, 172]

Abbildung 31. Genetischer Übergang zwischen PNA, RNA und DNA am Beispiel von Homo-Sequenzen.


44

Auch ein Informationstransfer auf der Basis von Heterosequenzen ist möglich (Abbildung

32).[173] DNA-templatierte PNA-Synthesen zeigen im Falle von Polypyrimidin-Templaten

eine gute Spezifität und Effizienz, während purinhaltige Sequenzen besonders im Falle von

Adenin eine deutlich geringere Genauigkeit aufweisen.[172] Letzteres ist auch bei der Synthese

von RNA an RNA- und DNA-Templaten beobachtet worden.[174] In jedem Fall benötigen

effiziente RNA-Synthesen an einem PNA-Templat einen Primer bestehend aus wenigstens

drei Basen, da erst unter diesen Bedingungen eine Helix-Struktur entsteht, die einem

DNA/RNA-Hybrid ähnelt. Ohne diese Präorganisation der Helix kommt es durch 2’-5’-

Verknüpfungen, Cyclisierungen und Pyrophosphatbildungen zum Abbruch der Synthese.

Abbildung 32. Genetischer Übergang zwischen PNA, RNA und DNA am Beispiel von Hetero-Sequenzen. – x/X = A, C, G, T; y/Y = die zu x/X komplementäre Base.

Bei Untersuchungen zu templatgesteuerten PNA-Ligationsreaktionen benutzten Mattes und

Seitz ein heptameres PNA-Templat der Sequenz gcbacgg, wobei bei b = c ein komple-

mentäres Templat und bei b = g ein Templat mit Fehlpaarung erhalten wird.[175, 176] Wie in

Abbildung 33 dargestellt, hängt die Wirkung der Template in hohem Ausmaß von den unter-

schiedlichen Ligationsbedingungen ab. Im Falle der durch EDC und Imidazol vermittelten

Kondensation ist die untemplatierte Reaktion ineffizient, während das komplementäre

Templat die Ausbeute steigert und das fehlpaarende Templat sogar zum besten Ergebnis

führt. Dieses Ergebnis weist auf die Bedeutung von Flexibilität für Ligationsreaktionen hin.

Durch die Substitution einer PNA-Einheit durch ein isosteres Dipeptid gewinnt das System

zum einen zusätzliche Flexibilität, zum anderen wird der unspezifische kooperative Effekt der


45

Basenstapelung zugunsten der selektiven Watson-Crick-Basenpaarung zurückgedrängt.

Während sich bei der nativen chemischen Ligation[86] bei hohen Ausbeuten kein Einfluss der

Template feststellen lässt, führt die EDC-vermittelte Reaktion zu einer erstaunlichen

Selektivität. So lassen sich die untemplatierte Reaktion und die Reaktion in Anwesenheit des

fehlpaarenden Templats nicht unterscheiden, wohingegen das perfekt komplementäre Templat

die Effizienz der Reaktion verfünffachen kann. Basenfehlstellen können auch die Selektivität

DNA-kontrollierter nativer PNA-Ligationen um eine Größenordnung erhöhen.[177]

Abbildung 33. Untersuchungen zur templatgesteuerten PNA-Ligation. – Die Zugabe von Templat ist durch das gefüllte Quadrat markiert, die Zugabe von fehlpaarendem Templat durch die gefüllte Raute, keine Templatzu-gabe wird durch den offenen Kreis angezeigt. Die Abbildung ist aus der Originalarbeit entnommen worden.[175]

Liu et al. wählten für ihre Arbeit zur DNA-gesteuerten PNA-Polymerisierung die reduktive

Aminierung von PNA-Aldehyden als Verknüpfungschemie (Abbildung 34). Weitere Untersu-

chungen zeigten eine erstaunliche Toleranz der Reaktion gegenüber Seitenkettenmodifi-

zierungen an der α-Postion der PNA-Bausteine und mit Einschränkungen auch an der

γ-Position.[178]

Abbildung 34. Reduktive Aminierung von PNA-Aldehyden 66 an einem DNA-Templat. – Die Verknüpfung wird nach erfolgter Hybridisierung durch Zugabe von NaCNBH3 initiiert.


46

Bei den bisher vorgestellten templatgesteuerten PNA-Synthesen fand die Ligation jeweils am

Rückgrat statt. Eine andere Herangehensweise stellt das sequenzspezifische Auffüllen von

Basenlücken dar. Diese Möglichkeit wurde bislang wenig in Betracht gezogen, da die Bildung

der analogen N-glycosidischen Bindungen in Wasser eine ungünstige Gleichgewichtslage

besitzt.[63] Im Jahr 2009 wurden dennoch zwei Arbeiten veröffentlich, bei denen PNA bzw.

PNA-Derivate durch das Auffüllen von Basenlücken templatgesteuert synthetisiert

wurden.[179, 180]

In dem von Heemstra und Liu vorgestellten System werden native dodecamere PNA-

Template und komplementäre Substrate mit ein oder zwei Basenlücken in der Strangmitte

oder am Strangende verwendet.[180] Hinzu kommen Nukleobasen, die an den Positionen N1

(Pyrimidine) bzw. N9 (Purine) mit einem Essigsäure- oder Acetaldehyd-Linker versehen sind

und durch Peptidkopplung beziehungsweise reduktive Aminierung mit dem Substrat

verknüpft werden. Dabei stellt sich heraus, dass die Auffüllreaktion in der Strangmitte

effizienter als am Strangende ist, was sich durch die günstigere sterische Präorganisation und

ein erhöhtes Maß an Basenstapelung erklären lässt. Weiterhin spielen die Basenpaarungen

eine Rolle, da Guanin und Cytosin bereitwilliger eingebaut werden als Adenin und Thymin.

Das Auffüllen der Basenfehlstellen gelingt durch reduktive Aminierung effektiver und

spezifischer als unter Einsatz von Kopplungsreagenzien. Als negativ erwies sich die Tatsache,

dass bei diesem Vorgang eine desoxyPNA-Einheit entsteht, die aufgrund ihrer hohen

Flexibilität zu einer starken Destabilisierung von PNA/DNA-Duplexen und (PNA)2/DNA-

Triplexen führt.[181]

Das von Ghadiri vorgestellte System basiert auf einem Rückgrat 67 aus sich wiederholenden

Dipeptideinheiten.[179] Eine der beiden Aminosäuren ist stets Cytosin, über dessen Thiol-

funktion die Nukleobasenthioester 68 durch Transthioesterbildung reversibel gebunden

werden, während sich durch die Wahl der zweiten Aminosäure Löslichkeitseigenschaften,

elektrostatische Eigenschaften und die Flexibilität des Rückgrats steuern lassen. Nach dem

Mischen eines decameren Poly-Cystein-Rückgrats 67 mit Nukleobasenthioestern 68 stellt sich

innerhalb von ca. 30 Minuten ein stabiles Produkt-Gleichgewicht aus tPNAs 69 ein, das sich

jedoch durch die Zugabe eines Überschusses von Nukleobasenthioesters 68 verschieben lässt

(Abbildung 35, oben). Die gebildeten tPNAs binden sequenzspezifisch an komplementäre

DNA-, RNA- und tPNA-Stränge. Wenn die Bildung der tPNAs 69 in Gegenwart eines DNA-

Templats stattfindet, bestimmt dieses die Zusammensetzung und Sequenz der tPNAs 69.

Verändert man im Laufe der Zeit die äußeren Bedingungen durch Zugabe von DNA-


47

Templaten unterschiedlicher Sequenz, beugt sich das System dem Selektionsdruck und die

Zusammensetzung der tPNAs 69 passt sich an (Abbildung 35, unten).

O

S

A

O

S

A

O

SR

A

O

SR

G

O

SR

A

O

SR

G

O

SR

G

O

SR

G

O

SR

A

O

SR

A

O

SR

B

RSH

NH

NH

NH

NH

O

O

O

OSH

R

SH

R

S

O

B

S

O

B

NH

NH

NH

NH

O

O

O

O

R R

SH

SH

O

S

G

O

S

G

tPNA

dT20

tPNA

+ dA20, dC20

tPNA

67 69

68

67 69a 69b

68a 68b- RSH - d(AT)20

Abbildung 35. Bildung von tPNA aus einem peptidischen Rückgrat und Nukleobasenthioestern (oben) und Änderung der Sequenz unter Selektionsdruck (unten).

Alle vorgestellten Studien nutzten zur Analyse chromatographische oder gelelektrophore-

tische Methoden, die zu einer begrenzten Anzahl an Messpunkten führen, was unter anderem

durch die Dauer der entsprechenden Elutionsprogramme bedingt ist. Darüber hinaus kommt

es unausweichlich zu experimentellen Fehlern, z.B. durch die Injektion auf die

Chromatographie-Säule, das Auftragen auf das Gel oder das Quenchen der Reaktionslösung

unter gleichzeitiger Verdünnung. Die Notwendigkeit des Quenchens kann ferner Einfluss auf

die detektierten Spezies haben. Kinetisches Online-Monitoring umgeht diese Problematiken

und wurde in diesem Kontext zuerst von Nielsen auf der Basis verschiedener FRET-Paare

durchgeführt.[136] Gerade bei kurzen Sequenzen ist jedoch davon auszugehen, dass die

Konjugation mit großen Farbstoffmolekülen zu deutlichen Veränderungen von Moleküleigen-

schaften wie der Löslichkeit führt. Einen Ausweg bietet die NMR-Spektroskopie, die

ebenfalls ein Online-Monitoring erlaubt, allerdings keine oder nur geringe Modifizierung der

untersuchten PNA-Sequenzen mit sich bringt.


48

1.5 Kinetische 1H-NMR-Titration

Durch zeitaufgelöste NMR-Spektroskopie können vielfältige Informationen über den Verlauf

einer Reaktion und die beteiligten Spezies gewonnen werden. Dabei werden typischerweise

die Veränderungen der Integrale und der chemischen Verschiebung getrennt voneinander

behandelt, um kinetische bzw. thermodynamische Informationen zu gewinnen.

Aus der zeitlichen Veränderung der Integrale von Edukten und Produkten lassen sich

Erkenntnisse über den Konzentrations-Zeitverlauf einer Reaktion gewinnen, und durch die

Anpassung der experimentellen Daten an ein Reaktionsmodell können anschließend die

Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Reaktionsschritte bestimmt werden.

Treten im Reaktionsverlauf nicht-kovalente Wechselwirkungen und supramolekulare Kom-

plexe auf, hat dies Einfluss auf die chemische Umgebung eines gegebenen Protons.

Äquilibrieren die Komplexe im Verhältnis zur NMR-Zeitskala schnell, beobachtet man für

das Proton in den verschiedenen Spezies keine unterschiedlichen Signale, sondern eine

Veränderung der Verschiebung im Reaktionsverlauf (Shift-Shifting, Abbildung 36).

Abbildung 36. 1H-NMR-Stackplot zur Verdeutlichung des Shift-Shifting-Effekts. – Die Grafik wurde der Originalarbeit entnommen.[182]

Diese kann man mittels NMR-Titrationen zum Gewinn thermodynamischer Informationen

auswerten.[183, 184] Dabei misst man eine Reihe von Proben, in denen die interagierenden

Spezies in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen vorliegen, wobei zweckmäßiger-

weise die Konzentration einer Spezies konstant gehalten wird. Anschließend wird die chemi-

sche Verschiebung als Funktion des Konzentrationsverhältnisses aufgetragen und durch Aus-

wertung der resultierenden Kurve die Assoziationskonstante des Komplexes bestimmt. Ferner


49

lassen sich die freie Energie und die Entropie der Komplexbildung durch Titrationen bei

variabler Temperatur bestimmen. Die 2006 von Stahl und von Kiedrowski vorgestellte

kinetische NMR-Titration erlaubt es erstmals, die zeitlichen Veränderungen der Integrale und

der Verschiebungen gleichzeitig durch das Programm SimFit auszuwerten.[182, 185] Anders als

bei der klassischen NMR-Titration ist es dadurch nicht mehr nötig, verschiedene Konzentrati-

onen manuell einzustellen, da dies in situ durch das Reaktionssystem selbst erfolgt. Daher

werden manuelle Fehler reduziert und ein Online-Monitoring des betrachteten Systems wird

möglich. Die Analyse der zeitabhängigen Veränderung der chemischen Verschiebung erfolgt

dabei anhand:

i

n

i i tt

1obs )()( (13)

δobs(t) = beobachtete chemische Verschiebung des betrachteten Protons zu Zeit t

γi = Molenbruch der Spezies i

δi = chemische Verschiebung des Protons in Spezies i

Der Molenbruch einer Spezies i wird aus ihrer aktuellen Konzentration und der Konzentration

aller Spezies n, die zu dem Signal des beobachteten Protons beitragen, berechnet. Die chemi-

schen Verschiebungen der reinen Spezies werden entweder durch Einzelmessungen bestimmt

oder im Rahmen des Fittings angepasst.

Allgemeiner Teil 2 Aufgabenstellung

50

2 Aufgabenstellung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung und Synthese eines

Selbstreplikations-Systems auf der Basis von PNA, das durch kinetischen NMR-Titration

untersucht werden kann. Anders als in den bisherigen Studien zur templatierten Ligation von

PNA sollte daher von selbstkomplementären Sequenzen ausgegangen werden, deren Synthese

und Reinigung als schwierig bekannt ist.[186] Beim Design des Systems sollten vier Aspekte

besonders berücksichtigt werden:

1. Auswahl einer geeigneten NMR-Sonde

Das von Stahl und von Kiedrowski entwickelte Konzept der kinetischen NMR-Titration

(siehe 1.5) wird unter Verwendung der 1H-NMR-Spektroskopie erfolgreich bei der Analyse

artifizieller Replikatoren eingesetzt.[108, 109, 182] Dabei wird die Änderung der chemischen Ver-

schiebung mindestens eines Protons über die Zeit verfolgt. Zweckmäßigerweise wählt man

Kerne aus, deren Signal keine Überlappungen aufweisen, weil diese die Auswertung der Da-

ten erheblich erschweren. Artifizielle Replikatoren erfüllen in der Regel diese Anforderung,

da sie eine überschaubare Anzahl an Protonen mit hinreichend unterschiedlicher magnetischer

Umgebung aufweisen. Die aus monomeren Einheiten aufgebauten Oligonukleotide und deren

Analoga besitzen dagegen eine große Anzahl an 1H-Kernen mit sehr ähnlicher magnetischer

Umgebung, sodass die entsprechenden Spektren durch komplexe Kopplungsmuster und

Signalüberlappungen geprägt sind. Es war demgemäß das Ziel, das Konzept der kinetischen 1H-NMR-Titration auf einen anderen NMR-aktiven Kern zu übertragen und ggf. die

notwendigen Modifizierungen an der PNA durchzuführen.

2. Wasserlöslichkeit

Die elektrische Neutralität des PNA-Rückgrats ist ursächlich für die besondere Stabilität von

Duplexen und Triplixen unter der Beteiligung von PNA, führt aber auch zu einer Reihe von

Problemen. Hierunter fallen eine reduzierte Wasserlöslichkeit,[187] eine ausgeprägte Tendenz

zur Aggregation und Selbstorganisation[116] und die limitierte Aufnahme in Zellen[188]. Um

dem entgegenzuwirken, werden typischerweise die Strangenden durch die Einführung termi-

naler, positiv geladener Gruppen modifiziert, beispielsweise durch L-Lysin[110] oder Sper-

min[189]. Alternativ wird das Rückgrat selbst durch geladene Gruppen modifiziert.[181, 190, 191]

Allgemeiner Teil 2 Aufgabenstellung

51

Darüber hinaus wurden PNA/DNA-Chimären,[192, 193], PNA-Peptid-Konjugate[139, 140] und

PNA-Konjugate mit hochmolekularem Polyethylenglykol[194] oder mit Polyethylenimin[195]

entwickelt. Diese Methoden gehen jedoch mit der Einführung zusätzlicher reaktiver Gruppen

und/oder Chiralitätszentren einher.[116] Die Synthese von Fmoc-geschützten Monomeren, die

an ihren sekundären Aminen anstelle von Nukleobasen neutrale oder positiv geladene

Löslichkeitsvermittler als Seitenketten tragen, konnte dies vermeiden.[196]

Das aufzubauende Replikations-System sollte so wenig wie möglich von der originalen PNA-

Struktur abweichen und keinesfalls Chiralitätszentren besitzen. Besondere Aufmerksamkeit

erfordert hierbei, dass gerade selbstkomplementäre Sequenzen für ihre Tendenz zur

Aggregation bekannt sind.[186]

3. Effektive Synthese

Im Vergleich zur Analytik durch HPLC, Gel-Elektrophorese oder FRET benötigen NMR-

Experimente größere Mengen der zu analysierenden Substanzen, welche im Rahmen dieser

Arbeit hergestellt werden sollten. Dabei sollte von einfachen Vorstufen ausgegangen werden,

um eine kostengünstige Synthese zu gewährleisten.

4. Vergleichbarkeit mit bekannten Systemen

Aus thermodynamischen Überlegungen basieren die meisten im Arbeitskreis von Kiedrowski

veröffentlichten Arbeiten zur (Selbst-)Replikation von Nukleinsäuren auf hexameren

Templaten.[72, 75, 76, 78-80] Dies sollte in dieser Arbeit beibehalten werden, auch um Systeme auf

Basis von DNA und PNA vergleichen zu können. Langfristig sollte es dieses Vorgehen auch

ermöglichen, komplexere Systeme mit genetischen Übergängen zwischen PNA und DNA zu

untersuchen.

Allgemeiner Teil 3 System-Design

52

3 System-Design

3.1 Auswahl der NMR-Sonde

Fluor nimmt unter den NMR-aktiven Kernen eine besondere Stellung ein, da 19F im Vergleich

zu 1H nur eine geringfügig auf 83 % reduzierte Empfindlichkeit aufweist. Zudem stellt 19F das

einzig natürlich vorkommende Isotop des Elements dar. Es besitzt einen großen chemischen

Verschiebungsbereich, was die Gefahr der Signalüberlappung reduziert. Betont werden muss

auch die Fähigkeit, auf geringe Änderungen der supramolekularen Umgebung mit einer deut-

lichen Änderung der chemischen Verschiebung zu reagieren. Beispielsweise lässt sich durch 19F-Sonden der Hybridisierungs-Zustand von Nukleinsäuren bestimmen, da beim Übergang

vom Einzel- zum Doppelstrang Verschiebungsänderungen von bis zu 1.5 ppm gemessen

werden können.[197] Daher hat sich der Einsatz von 19F-NMR-Sonden in den letzten Jahren als

nützliches Werkzeug zur Untersuchung von Sekundärstrukturen in der DNA- und

RNA-Chemie bewährt.[197-205] Ein Beispiel zeigt Abbildung 37:

Abbildung 37. Populationsanalysen durch 19F-NMR-Spektroskopie. – Diese Technik lässt sich z.B. verwenden, um die Schmelztemperaturen einer intramolekularen Hairpin-Struktur (oben) bzw. eines Doppelstrangs (unten) zu bestimmen. Abhängig von der Stabilität der beteiligten Komplexe beobachtet man Shift-Shifting (oben) oder separate Signalsätze (unten). Die Abbildungen sind der Originalarbeit entnommen.[204]


53

Eine Anwendung im Bereich der PNA-Forschung gibt es noch nicht. Darüber hinaus sind

bislang nur fünf Arbeiten veröffentlicht worden, die sich mit Fluor-modifizierter PNA

befassen:

1. eine mehrstufige Synthese von (2,4-Difluor-5-methylphenyl)essigsäure 70 und dem

entsprechenden Boc-geschützten Monomer[206]

2. eine Studie zum Einfluss von Fluoraromaten auf die Hybridisierungseigenschaften[207]

3. zwei Arbeiten zur Synthese und Hybridisierung fluorierter olefinischer PNA[208, 209]

4. eine Studie zur 18F-Markierung.[210]

Betrachtet man die Studien zur DNA- und RNA-Chemie, ist ein deutlicher Trend zur Fluor-

Markierung durch modifizierte Basen festzustellen, da die Sonde in direkte räumliche Nähe

zur supramolekularen Erkennungsstelle gebracht wird. Für diese Arbeit wurde 2,4-Difluor-

toluol (F) (71) ausgewählt, weil dieses Molekül ein fast perfektes Isoster der natürlichen Base

Thymin (72) ist (Abbildung 38).[211, 212]

NH

NH

O

O F

F

72 71

Abbildung 38. Vergleich von Thymin (72) und 2,4-Difluortoluol (F) (71). – Die Carbonylfunktionen der natürlichen Base sind im Isoster durch CF-Gruppen ersetzt worden, die NH-Funktionalitäten durch CH-Gruppen.

Die entsprechende Essigsäure 70 war kommerziell nicht erhältlich und die einzig bislang

beschriebene Synthese erfordert hochtoxische Reagenzien und einen erheblichen Arbeitsauf-

wand über sechs Synthesestufen.[206] Daher bestand das erste Ziel der Arbeit in der Planung

und Durchführung einer kurzen und effektiven Synthese für dieses Molekül.


54

3.2 Wasserlöslichkeit

N-Methyl- und N-Ethylaminogruppen sind Bestandteile der originalen PNA-Struktur. Die aus

ihnen abgeleiteten N,N-Dimethyl- und N,N-Diethylaminogruppen liegen im physiologischen

pH-Bereich überwiegend protoniert vor und sind somit ideale Löslichkeitsvermittler. Voraus-

setzung ist allerdings, dass bei ihrer Implementierung keine Stereozentren entstehen, die eine

bevorzugte Chiralität induzieren und so das 1:1-Gleichgewicht zwischen links- und rechtsgän-

gigen Helices stören (vgl. 1.4.6).[115, 116, 167-169]

N

O

NH

O

NH2

B

N

O

NH

O

NH

B

N

OH

O

NH

N

O

NH2

O

B

N

O

N

O

B

NH

O

N O

PEG

73 76 75

74 77 78

Abbildung 39. Modifizierung der Termini. – Das primäre Amid 73 und das freie Amin 74 (jeweils orange) sollen durch vergleichbare N,N-Dimethylamino-Derivate 76 und 77 (jeweils grün) ersetzt werden. Hierzu werden ein spezieller Linker 75 und ein modifiziertes Rückgrat 78 benötigt.

Im Rahmen einer Festphasensynthese (siehe 3.3) werden PNAs wie Peptide ausgehend vom

C-Terminus synthetisiert; hierbei entsteht typischerweise C-terminal ein primäres Amid 73

und N-terminal ein freies Amin 74. Eine Modifizierung des C-Terminus kann während der

Abspaltung des Oligomers vom Harz erfolgen. Hierzu schien der HMBA-Linker 75 sehr gut

geeignet, da sich die Esterfunktion dieses Linkers durch eine Vielzahl von Nukleophilen spal-

ten lässt. Bei der Umsetzung mit Alkali entsteht die freie Säure, mit Alkohol der entsprechen-

de Ester, mit Hydrazin das Hydrazon, mit Ammoniak das primäre und mit primären Aminen

das jeweilige sekundäre Amid.[213, 214] Für die gewünschte Modifizierung bot sich daher die

Reaktion mit N,N-Dimethylaminoethylamin an (Abbildung 39, oben). Aufgrund seiner guten

Quelleigenschaften in polaren Lösungsmitteln (DMF, NMP) wurde Tentagel als

Trägermaterial gewählt. Der N-Terminus lässt sich durch den Einsatz eines modifizierten

Monomers variieren. Im konkreten Fall bot sich demzufolge die Synthese des Rückgrats 78

an, dessen terminale Aminofunktion dimethyliert ist (Abbildung 39, unten).


55

3.3 Effektive Synthese

Typischerweise wird PNA an der festen Phase ausgehend von Fmoc/Bhoc-[39], Boc/Z-[40],

Fmoc/Mmt- oder Fmoc/Z-[41] geschützten Monomeren dargestellt. Dies kann sowohl manuell

als auch maschinell am Peptid- und, mit Einschränkung, am DNA-Synthesizer unter Verwen-

dung modifizierter Protokolle für die Peptidsynthese geschehen. Bei der Festphasensynthese

von PNA bietet es sich prinzipiell an, die Sequenz C-terminal mit einer Aminosäure zu begin-

nen, um der Aggregation des wachsenden Oligomers an der Festphase entgegenzuwirken.

Hier wurde Glycin wegen seiner Achiralität gewählt.

Der Lehrstuhl besitzt einen Peptidsynthesizer sowie die Erfahrung mit maschineller Peptid-

synthese, sodass zunächst dieser Weg eingeschlagen wurde. Die Wahl fiel auf die

Fmoc/Bhoc-Schutzgruppenstrategie, da diese die Verwendung starker Säuren sowohl

während der Synthese als auch bei der anschließenden Abspaltung von der Festphase umgeht.

Außerdem erlaubt sie auf einfache Weise die Synthese von Peptidkonjugaten; dies war inner-

halb der Arbeitsgruppe ebenfalls angedacht. Fmoc/Bhoc-Monomere sind kommerziell erhält-

lich, aber ihre Anschaffung war im Rahmen dieses Projekts nicht finanzierbar. Des Weiteren

sollte die Synthese der Monomere zu einem grundlegenden synthetischen Verständnis der

PNA-Synthese führen, um gezielt Modifizierungen einführen zu können.

3.4 Vergleichbarkeit mit bekannten Systemen

Bereits 1997 wurde die Kristallstruktur eines PNA-Duplex gelöst, dem eine hexamere

selbstkomplementäre Sequenz (79a, NcgtacgC) zu Grunde lag.[115] Auf dieser Struktur basierte

das System-Design (Abbildung 40). Wie bereits erwähnt, wurde zunächst die natürliche

Nukleobase Thymin (72) gegen 2,4-Difluortoluol (71) ausgetauscht und die Strangenden mit

nicht-reaktiven Löslichkeitsvermittlern sowie der C-Terminus zusätzlich mit Glycin

modifiziert. Außerdem wurde die Sequenz selbst leicht variiert, um das Isoster in der

mittleren Position des N-terminalen Trimers zu positionieren und den Einfluss auf die

Ligation zu minimieren, während die Fluorsonde im gleichen Abstand von der

supramolekularen Erkennungsseite verbleibt (79b, N’cfgcagGlyC’).


56

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

NH ON N

O

NH2

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

N

NH

NHO

N

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

ON N

O

NH2

NH

NHO

N

NH2

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

N

OH

79b

80

81

Abbildung 40. Kristallstruktur eines PNA-Duplex (oben links),[115] Strukturformel des Einzelstrangs (oben rechts) und erstes Design eines Replikations-Systems auf der Basis von PNA (unten). – Grün: nicht-reaktive Löslichkeitsvermittler; gelb: 19F-NMR-Sonden; blau: Glycin-Einheit; rot: Ligationsstellen und daraus resul-tierende zentrale Amidbindung.

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

O

ON

NH O

N

NH

O

O

N

NH

NO

O

O

O

N

N N

O

NH2

NH2

NH2

N

N

N

NH

O

O

N

N

N

NH2

N

N

NH

O

NH2

N

O

NH2

79a

Allgemeiner Teil 4 Synthesen und Spektroskopie

57

4 Synthesen und Spektroskopie

4.1 Synthesestrategie I: Festphasensynthese

4.1.1 Retrosynthese

Die retrosynthetische Analyse von Fmoc/Bhoc-Monomeren ist in Abbildung 41 am Beispiel

des Cytosin-Monomers 82 dargestellt. Das tertiäre Amid stellt hierbei die strategische

Bindung dar, die durch die Reaktion eines sekundären Amins 83 mit einer Carbonsäure 84

unter den Bedingungen einer Peptidkopplung aufgebaut werden kann. Daher gilt es generell,

die gewünschten Nukleobasen bzw. deren Isostere mit einem Essigsäure-Linker zu versehen

und, sofern vorhanden, die reaktionsfreudigen exocyclischen Aminofunktionen orthogonal

zum Rückgrat zu schützen.

N

O

O NH

OH

OO

N

N

O

NH O

O

NH

O NH

O

OO

O

N

N

O

NH O

O

OH

NH

NH2 OH

O

NH

N

O

NH2

+

82 83

85

84

86

Abbildung 41. Retrosynthetische Analyse des Fmoc/Bhoc-Monomers 82.


58

4.1.2 Fluorlabel

Eine mögliche Syntheseroute für F-Essigsäure 70 ist aus der Literatur bekannt.[206] Die

Autoren wählten einen arbeitsintensiven Weg über sechs Stufen und verwendeten eine Reihe

hochtoxischer Stoffe (Abbildung 42).

F

F

F

F

Br

F

F

CN

F

F

COOH

F

F

O

N2

F

F

O

O

F

F

OH

O

50 % 100 % 98 % 60 %

58 %

71 87 88 89 90

91 70

nichtangegeben

a b c d e

f

Abbildung 42. Synthese von F-Essigsäure 70 nach Takeuchi et al.[206] – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Br2, Fe; (b) CuCN, DMF, 60 °C, 3 h; (c) H2SO4, H2O, Rückfluss, 1 h; (d) (1) ClCO2Et, TEA, THF, -15 °C, 15 min; (2) CH2N2, Et2O, 0 °C → RT, 3 h; (e) PhCOOAg, MeOH, -25 °C → RT, 3 h; (f) 1 M aq. LiOH, THF.

Daher bot sich die Suche nach einem überschaubareren Weg an, und dies möglichst mit

weniger toxischen Reagenzien. Ausgehend von dem gleichen Startmaterial 71 wurde eine

zweistufige Synthese entwickelt, die aus der Reaktionsfolge Brommethylierung und

Grignard-Reaktion bestand. Zunächst lieferte die Umsetzung von 2,4-Difluortoluol (71) mit

para-Formaldehyd in 33%iger essigsaurer Bromwasserstoffsäure nur geringe Mengen der

gewünschten Substanz 92. Erst durch die Zugabe der Lewis-Säure Zinkbromid wurde die

brommethylierte Verbindung 92 in guter Ausbeute erhalten. Die Notwendigkeit der

Modifizierung der ursprünglich entwickelten Vorschrift zur Brommethylierung von van der

Made und van der Made[215] dürfte dem deaktivierenden Einfluss der Fluorsubstituenten

geschuldet sein und stellt die Analogie zur Chlormethylierung nach Blanc stärker heraus.

Durch die sorgfältige Analyse der Kopplungsmuster des 1H-NMR- und besonders des 13C-

NMR-Spektrums (Abbildung 43 und Abbildung 44) konnte die Substitution an der

gewünschten Position bestätigt werden.


59

C

F

C

F

C

F

C

F

1J(C,F) = 245 Hz 2J(C,F) = 21 Hz 3J(C,F) = 8 Hz 4J(C,F) = 3 Hz

Abbildung 43. Charakteristische Werte für C-F-Kopplungskonstanten.[216]

Abbildung 44. 13C-NMR-Spektrum (50 MHz, CDCl3) von Fluor-Aromat 92. – Zuordnung der Signale: δ = 161.28 (dd, 1J(C,F) = 250, 3J(C,F) = 11.9, C(4)); 159.01 (dd, 1J(C,F) = 250, 3J(C,F) = 12.3, C(2)); 133.21 (dd, 3J(C,F) = 6.90, 3J(C,F) = 4.20, C(6)); 120.91 (dd, 2J(C,F) = 29.1, 3J(C,F) = 4.20, C(5)); 121.23 (dd, 2J(C,F) = 26.1, 4J(C,F) = 4.20, C(1)); 103.89 (dd, 2J(C,F) = 24.9, 2J(C,F) = 26.5, C(3)); 25.39 (d, 3J(C,F) = 3.8, CH2); 14.01 (d, 3J(C,F) = 3.10, CH3).

Die Überführung in das entsprechende Grignard-Reagenz und die folgende Umsetzung mit

trockenem CO2 erfolgte nach der Standard-Vorschrift aus dem Lehrbuch „Organikum“.[217]

Die Zielverbindung 70 ließ sich in einer Ausbeute von 38 % über zwei Stufen darstellen

(Abbildung 45).


60

F

F

F

F

Br

F

F

OH

O

NH

NH

O

O

71 92 70 72

a b

66 % 57 %

Abbildung 45. Synthese des hydrophoben Isosters 70 des Thymins (72) – Reagenzien und Reaktionsbedin-gungen: (a) (CH2O)n, ZnBr2, 33 % HBr in AcOH, 120 °C, 4 h; (b) (1) Mg, I2, Et2O, Rückfluss, 2 h; (2) CO2, 0 °C, 1 h; (3) H+, H2O.

Anschließend wurde versucht, diese Reaktions-Sequenz auch auf Derivate des 2,4-Difluor-

toluols (71) anzuwenden. Tatsächlich ließ sich 1,3-Difluorbenzol (93), ein Isoster des Uracils

(94), zunächst in die brommethylierete Verbindung 95 und dann in die entsprechende

Essigsäure 96 überführen (Abbildung 46).

F

F

F

F

Br

F

F

OH

O

NH

NH

O

O

93 95 96 94

a b

40 % 56 %

Abbildung 46. Synthese des hydrophoben Isosters 96 des Uracils (94). – Reagenzien und Reaktionsbedin-gungen: (a) (CH2O)n, ZnBr2, 33 % HBr in AcOH, 120 °C, 4 h; (b) (1) Mg, I2, Et2O, Rückfluss, 2 h; (2) CO2, 0 °C, 1 h; (3) H+, H2O.

Die Umsetzung von Pentafluor-benzol (97) zeigte hingegen unter den Bedingungen der

Brommethylierung keine Reaktion zu 98, was durch den hohen Grad der Deaktivierung

verständlich ist. Das Substitutionsmuster des 1-Fluor-3-methylbenzol (99) bedingte ein

Gemisch von Regio-Isomeren 100, das sich nicht auftrennen ließ (Abbildung 47, links).

Weitere interessante Fluor-Label sind kommerziell bereits als Essigsäuren erhältlich

(Abbildung 47, rechts). So können die beiden Verbindungen 101 und 102 als Isostere des

Uracils (94) angesehen werden. Der Ersatz des Carbonylsauerstoffs durch CF3-Gruppen ist

zwar sterisch nicht annähernd so gut wie der durch Fluor, bietet jedoch ein intensives Signal

in einem anderen Verschiebungsbereich, das außerdem ein abweichend schwächeres Shift-

Shifting erwarten lässt.


61

F

F

FF

F

F

F

Br

FF

F

F F

Br

FFF

F

OH

O

F

OH

O F

F

F

97 98 101 102

99 100

a

a

Abbildung 47. Grenzen der selektiven Brommethylierung (links) und kommerziell erhältliche Isostere mit Trifluormethylgruppen (rechts). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (CH2O)n, ZnBr2, 33 % HBr in AcOH, 120 °C, 4 h; (b) (1) Mg, I2, Et2O, Rückfluss, 2 h; (2) CO2, 0 °C, 1 h; (3) H+, H2O.


62

4.1.3 Geschützte Nukleobasen-essigsäuren

Neben dem Backbone und den Fluor-Labeln wurden geschützte Nukleobasen in Form ihrer

Essigsäuren benötigt. Ausgehend von den freien Basen bietet sich zum einen die Möglichkeit,

die exocyclischen Aminofunktionen zu schützen, um anschließend den Essigsäure-Linker ein-

zuführen. Zum anderen kann erst der Linker eingeführt werden, um anschließend die Amino-

funktionen zu schützen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der zweite Ansatz gewählt, wobei

auf Vorschriften aus der Literatur zurückgegriffen werden konnte (Abbildung 48).[218, 219]

Adenin (103) und Cytosin (86) wurden jeweils mit starken Basen in DMF umgesetzt und

anschließend an N9 bzw. N1 durch Bromessigsäure-benzylester alkyliert. Die beiden

Nukleobasen-benzylester 104 und 105 entstanden mit guten Ausbeuten und wurden im

folgenden Reaktionsschritt durch das Kopplungsreagenz N,N-Carbonyl-diimidazol (CDI) in

die Bhoc-geschützten Derivate 106 und 107 überführt. Bei dieser Reaktion wird CDI zunächst

durch das jeweilige Amin am zentralen Carbonyl-Kohlenstoffatom angegriffen, was zu einem

tetraedischen Übergangszustand führt. Aus diesem wird Imidazol eliminiert und es entsteht

ein N-Carbonyl-imidazol-Derivat, welches in einer weiteren Additions-Eliminierungs-

Reaktion mit Benzhydrol zur Bhoc-geschützten Verbindung 106 bzw. 107 reagiert. Die ab-

schließende basische Verseifung der Benzylester ergab die gewünschten Zielverbindungen

108 und 84 mit Ausbeuten von 38 bzw. 54 % über je drei Stufen.

Bei Thymin (72) entfällt die Schützung einer exocyclischen Funktion, sodass nach der

Alkylierung mit Bromessigsäure-methylester direkt verseift werden konnte. Dabei entstand

Thymin-1-essigsäure (109) mit einer Ausbeute von 62 %.

Die Synthese des Guanin-Derivats 110 erfolgte nicht ausgehend vom freien Guanin, da

Guanin und Guanin-Derivate in der Keto-Form bevorzugt in der Position N7 alkyliert

werden.[220, 221] Stattdessen wurde von kommerziell erhältlichem 2-Amino-6-chlor-purin (111)

ausgegangen, das als Guanin-Derivat in der Enol-Form verstanden werden kann und

bevorzugt in der Position N9 alkyliert wird. Die Alkylierung mit Bromessigsäure-benzylester

verlief unter Verwendung von Kaliumcarbonat in DMF mit einer Ausbeute von 71 % nach

Umkristallisation. Zur Einführung der Bhoc-Schutzgruppe wurde 112 zunächst mit dem

Phosgenspender Triphosgen in trockenem THF umgesetzt, anschließend wurde der dabei ent-

standene Chlorwasserstoff mit Hüning-Base neutralisiert und dann Benzhydrol zugegeben.

Nach Rühren, wässriger Aufarbeitung und Umkristallisation aus Methanol konnte der Bhoc-

geschützte Guanin-essigsäure-ester 113 mit einer Ausbeute von 67 % isoliert werden.


63

N N

N N

NH2

O

O

NH N

N N

NH2

N N

N N

NH

O

O

O

ON N

N N

NH

O

O

OH

O

NH

N

O

NH2

N

N

O

NH2

O

O

N

N

O

NH

OH

O

O

O

N

N

O

NH

O

O

O

O

NH

NH

O

O

N

NH

O

O

OH

O

NH N

N N

Cl

NH2

O

ON N

N N

Cl

NH2

O

O

N N

N N

Cl

NH

OOOH

O

N N

N NH

O

NH

OO

103 104 106 108

a b c

70 % 67 % 80 %

d e f

97% 65 % 86 %

g

86 105 107 84

72 109

h i j

71% 67 % 58 %

111 112 113 110

62 %

Abbildung 48. Synthese Bhoc-geschützter Nukleobasen-essigsäuren. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) NaH, DMF, RT, 3 h; (2) Bromessigsäure-benzylester, 0 °C → RT, 16 h; (b) (1) CDI, DMF, 105 °C, 2 h; (2) Benzhydrol, 105 °C, 3 h; (c) (1) LiOH, MeCN, EtOH, H2O, 0 °C, 1 h; (d) (1) KOtBu, DMF, 100 °C, 2 h; (2) Bromessigsäure-benzylester, 0 °C → RT, 16 h; (3) AcOH, H2O; (e) (1) CDI, THF, Rückfluss, 2 h; (2) Benzhydrol, Rückfluss → RT, 16 h; (f) (1) LiOH, MeOH, H2O, 1 h; (2) Zitronensäure; (g) (1) K2CO3, Bromessigsäure-methylester, DMF, RT, 16 h; (2) NaOH, H2O, Rückfluss, 10 min; (h) (1) K2CO3, DMF, 85 °C, 30 min; (2) Bromessigsäure-benzylester, 0 °C → RT, 16 h; (3) 1 N HCl; (i) (1) Triphosgen, THF, 0 °C, 1 h; (2) DIPEA, 0 °C, 30 min; (3) Benzhydrol, 0 °C → RT, 16 h; (j) (1) NaH, 3-Hydroxypropionitril, THF, -78 °C → 0 °C; (2) 113, 0 °C → RT, 16 h.


64

Im abschließenden Reaktionsschritt erfolgte die Abspaltung des Benzylesters parallel mit der

Einführung der Carbonylfunktion in der Position N6. Hierzu wurde bei -78 °C das Natriumal-

koholat des Hydroxypropionitrils 114 in trockenem THF dargestellt und anschließend unter

Eisbadkühlung mit dem geschützten Guanin-benzylester 113 versetzt. Aus dem Benzylester

113 entstand der 2-Cyanoethyl-ester 115, der durch ß-Eliminierung weiter zum Carboxylat

110 reagierte (Abbildung 49). Gleichzeitig wurde der Chlorsubstituent in der Position N6

durch eine 2-Cyanoethoxy-Gruppe substituiert, welche daraufhin ihr Sauerstoffatom unter

ß-Eliminierung an den Purinring abgab. Nach Ausfällen erhielt man die geschützte Guanin-

essigsäure 110 mit einer Ausbeute von 28 % über drei Stufen. Als problematisch erwies sich

die Abtrennung des Benzylalkohols (116) im letzten Schritt, da dieser sowohl Löslichkeit in

organischen Lösungsmitteln als auch in Wasser besitzt und aufgrund seines hohen

Siedepunkts auch durch Trocknung nur schwer zu entfernen war.

N N

N N

Cl

NH

OOO

O

PhPh

N

N NH

O

NH

OOOH

O

N

Ph Ph

NaO

N

N

N N

O

NH

OO

NH

O

O

N

HN

Ph Ph

ON

ON

O

N

OHN

HO

ONa

- NaCl

4

- 2

-

-

oder

oder

-

H2O

113 115 110

114

114

117 114

116

117

118

119

Abbildung 49. Mechanismus der Esterspaltung und der Einführung der Carbonylfunktion.

Im Verlauf der Arbeit konnte die Synthese der geschützten Adenin-essigsäure 108 durch die

Verwendung einer alternativen Vorschrift optimiert werden.[218] Hierzu wurde Adenin-

ethylester 103 synthetisiert, der genau wie das entsprechende Bhoc-Derivat 121 deutlich

besser zu kristallisieren war als die entsprechenden Benzyl-Analoga. Die Gesamtausbeute an

108 betrug 40 % über drei Stufen (Abbildung 50).


65

N N

N N

NH2

O

O

NH N

N N

NH2

N N

N N

NH

O

O

O

ON N

N N

NH

O

O

OH

O 103 120 121 108

a b c

67% 67 % 88 %

Abbildung 50. Synthese von ABhoc-AcOH (108) über Adenin-essigsäure-ethylester 120. – Reagenzien und Reak-tionsbedingungen: (a) (1) NaH, DMF, RT, 3 h; (2) Bromessigsäure-ethylester, 0 °C → RT, 16 h; (b) (1) CDI, DMF, 105 °C, 2 h; (2) Benzhydrol, 105 °C, 3 h; (c) (1) LiOH, MeCN, EtOH, H2O, 0 °C, 1 h.


66

4.1.4 Rückgrat

Des Weiteren galt es N- und C-terminal orthogonal geschütztes AEG herzustellen, welches

ausgehend von der freien Diaminosäure 85 darstellbar ist. 2-Amino-ethylglycin (85) ist durch

Alkylierung von Ethylendiamin (122) mit Halogenessigsäuren[222] oder durch reduktive

Aminierung von Glyoxylsäure (123) mit Ethylendiamin (122)[223] zugänglich. In beiden

Fällen stellt die Monofunktionalisierung des Ethylendiamins (122) die entscheidende Hürde

dar, sodass mit einem Überschuss an Diamin gearbeitet werden muss. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde zunächst der Weg über die reduktive Aminierung gewählt, da er hohe

Ausbeuten bei einfacher Durchführung versprach. Tatsächlich konnte die Zielverbindung

durch katalytische Hydrierung des zunächst gebildeten Imins mit einer Ausbeute von 65 %

gewonnen werden (Abbildung 51). Nach Abtrennung des Katalysators durch Filtration,

Entfernen der leichtflüchtigen Komponenten und Ausfällen durch Zugabe von 2-Propanol war

keine weitere Reinigung mehr notwendig. Ethylendiamin (122) ist durch den Chelateffekt ein

guter Komplexbildner, daher konnte der Palladium-Katalysator nicht erneut eingesetzt

werden. Darüber hinaus ist eine lebhafte Durchmischung des Reaktionsgemisches, bevorzugt

unter Überdruck, unabdingbar, da ansonsten keine Reaktion einsetzt. Die nachfolgende

Schützung der Carboxylfunktion als Methylester wurde durch Umsetzung mit Thionylchlorid

in Methanol erreicht und lieferte das Dihydrochlorid 124 mit einer Ausbeute von 81 %. Die

nachfolgende Schützung des terminalen primären Amins mit der Fmoc-Gruppe erforderte

aufgrund zahlreicher Möglichkeiten zur Nebenreaktion besondere Aufmerksamkeit:

1. Das primäre Amin muss vor der Umsetzung zunächst aus seinem Hydrochlorid freige-

setzt werden. Sobald dies geschehen ist, kann es zur intramolekularen Aminolyse des

Methylesters unter Entstehung von Ketopiperazin 53 kommen. Aufgrund dieser

Tatsache empfiehlt sich eine zügige Zugabe von Fmoc-Cl.

2. Auch das sekundäre Amin lässt sich mit Fmoc-Cl schützen, sodass unter diesem

Blickwinkel das Reagenz in der Kälte langsam hinzugegeben werden sollte. Die

Verwendung eines Überschusses an Diaminosäure-methylester 124 bietet sich wegen

der teuren Darstellung nicht an.

3. Sekundäre Amine (z.B. Piperidin, Diethylamin) sind bevorzugte Reagenzien, um die

Fmoc-Gruppe abzuspalten. Daher sollte die Reaktionsmischung nicht unnötig lange

rühren, rasch gereinigt und weiter umgesetzt werden.


67

Die Reaktionsbedingungen wurden durch die Aufnahme einer Verdünnungsreihe optimiert,

wodurch das Produkt 83 nach säulenchromatographischer Aufreinigung mit einer Ausbeute

von 73 % erhalten werden konnte.

NH

O

O

NH

O

O

NH

O

O

NH2

NH

OH

O

NH2NH2

NH2

HOH

O

O * 2 HCl

+

65 % 81 % 73 %

122 123 85 124

83

a b c

Abbildung 51. Synthese des orthogonal geschützten Rückgrats 83. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) H2, Pd/C, H2O, 0 °C → RT; (b) SOCl2, MeOH, 0 °C → Rückfluss, 16 h; (c) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 30 min.


68

4.1.5 Monomere

Die Kopplung der modifizierten Nukleobasen und der Isostere an das Rückgrat 83 erfolgte

mit dem Kopplungsreagenz TOTU in guten Ausbeuten. Während die nachfolgenden

alkalischen Verseifungen im Falle der Adenin- und Cytosin-Derivate 125 und 126 problemlos

verliefen (Abbildung 52), ließen sich das Monomer des Guanins 127 und die der Isostere

128a-c nicht isolieren (Abbildung 53).

N N

N N

NHBhoc

N

O

NH

O

OMe

N N

N N

NHBhoc

N

O

NH

O

OH

N N

N N

NHBhoc

O

OH

NH

NH

O

OMe

N

N

O

NH

OH

O

Bhoc

NH

O

OH

N

N

O

NH

N

O

Bhoc

NH

NH

O

OMe

N

N

O

NH

N

O

Bhoc

NH

O

OMe

67 % 68 %

83 125 133

Fmoc FmocFmoc

+

a b

108

48 % 94 %

83 126 82

Fmoc FmocFmoc

+

a c

84

Abbildung 52. Synthese der Monomere von Adenin und Cytosin über die Reaktionsfolge Peptidkopplung und Verseifung. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h; (b) (1) LiOH (2 eq.), THF, H2O; (2) Zitronensäure; (c) (1) LiOH (1.5 eq.), THF, H2O; (2) HCl.


69

N

N NH

O

NH

OH

O

N Bhoc

NH

O

OH

N

N NH

O

NH

N

O

N Bhoc

NH

NH

O

OMe NH

O

OMe

N

N NH

O

NH

O

O

N Bhoc

NH

NH

O

OMe NH

O

OMe

R2

F

N

O

R1

R2

F

OH

O

R1

R2

F

N

O

R1

NH

O

OH

62 %

83 134 127

Fmoc FmocFmoc

+

a c,d

111

83 135 128

Fmoc FmocFmoc

+

a c

47 %50 %50 %

70: R1 = Me, R2 = F 96: R1 = H, R2 = F101: R1 = H, R2 = CF3

a:b:c:

R1 = Me, R2 = FR1 = H, R2 = FR1 = H, R2 = CF3

a:b:c:

Abbildung 53. Synthese der Monomer-Methylester von Guanin und der Isostere. – Die anschließende Versei-fung misslang. Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h; (b) (1) LiOH (2 eq.), THF, H2O; (2) Zitronensäure; (c) (1) LiOH (1.5 eq.), THF, H2O; (2) HCl; (d) (1) LiOH (10 eq.), Aceton/H2O (8:2); (2) Fmoc-OSu; (3) HCl.

Bei der Darstellung des Guanin-Monomers 127 wurde daher eine abschließende Verseifung

umgangen, indem ein ausschließlich N-terminal geschütztes Rückgrat 129 synthetisiert wurde

(Abbildung 54). Um Nebenreaktionen dieses bifunktionalisierten Moleküls mit dem Kopp-

lungsreagenz zu unterdrücken, wurde Guanin-essigsäure 110 zunächst mit Pivaloyl-

chlorid 130 zum gemischten Anhydrid 131 umgesetzt und erst in dieser aktivierten Form zum

Rückgrat gegeben. Auf diese Weise ließ sich das Zielprodukt mit einer Ausbeute von 71 %

darstellen. Das Monomer des Thymins 132 wurde analog dargestellt.

Die Monomere der Isostere 128a-c ließen sich durch die Reaktion der entsprechenden Ester

135a-c mit Aluminium(III)chlorid in Ethanthiol (137) mit guten Ausbeuten erhalten.[224, 225]

Der Reaktionsmechanismus lässt sich durch die H.S.A.B.-Theorie erklären (Abbildung 55).


70

OH

O

NBhoc

N

N NH

O

NH

OCl

O

O

NBhoc

N

N NH

O

NH

O

NH

O

OH

N

N NH

O

NH

N

O

N Bhoc

N

NH

O

O

OH

O

NH

NH2 OH

O

NH

O

OHNH

Fmoc

OCl

N

NH

O

O

N

O

NH

O

OH

N

NH

O

O

O

O

O

+

71 %

110 131 127

130

Fmoc

b c

34 %

85 129

a

+

130

63 %

Fmoc

d e

109 136 132

Abbildung 54. Synthese des N-terminal geschützten Rückgrats 129 (oben), des G-Monomers 127 (Mitte) und des T-Monomers 132 (unten). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) SiMe3Cl, DCM, DMF, RT, 40 min; (2) Fmoc-OSu, NMM, 0 °C → RT, 2 h; (3) MeOH, RT, 20 min; (4) EtOAc, RT, 20 min; (5) H2O, 1 h, RT; (b) NMM, MeCN/DMF (3:2), 0 °C, 20 min; (c) (1) Fmoc-Aeg-OH (129), MeCN/H2O (3:2), RT, 20 min; (2) pH 4 (20%ige Zitronensäure); (d) MeCN, RT, 30 min; (e) (1) Fmoc-Aeg-OH (129), MeCN/H2O (4:3), RT, 2 h; (2) pH 2 (3 M HCl).

R2

F

N

O

OH

O

NH

R1R2

F

N

O

O

O

NH

R1

R O

O

AlCl3 SH SR O

OAlCl3

FmocFmoc

135 128

+ + +-HCl

H.B. H.A. S.B

S.A.

a

134 137 138 139

R1 = Me, R2 = FR1 = H, R2 = FR1 = H, R2 = CF3

a:b:c:

93 %74 %88 %

a:b:c:

Abbildung 55. Esterspaltung mit Aluminium(III)chlorid und Ethanthiol (137). – Synthese der Monomere mit Fluoraromaten 128a-c (oben) und Mechanismus der Spaltung (unten). Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) AlCl3 (3.0 eq), Ethanthiol, RT, 24 h; (2) H2O.


71

4.1.6 Löslichkeitsvermittler

Als N-terminale Löslichkeitsvermittler wurden sowohl zweifach methyliertes ß-Alanin 140

als auch ein terminal N-methyliertes Rückgrat 78 synthetisiert (Abbildung 56). Die letztge-

nannte Verbindung wurde anschließend mit geschützter Cytosin-essigsäure 84 gekoppelt, was

in moderater Ausbeute gelang. Bei der Synthese von 141 zeigte sich die Verwendung von

EDC als Kopplungsreagenz gegenüber der von TOTU als überlegen. Da das Produkt der

anschließenden Verseifung 142 ein inneres Salz ist, gestalteten sich die Aufarbeitung und die

Reinigung durch Säulenchromatographie schwierig.

NH

O

O

NNH

OH

O

NN

NH2

HOH

O

O

N

N

NH

O

N

O

Bhoc

N O

O

OH

O

NOH

O

NH2

N

N

NH

O

N

O

Bhoc

N OH

O

*2HCl

+95 % 98 % 54 %

144 123 145 78

*HCl

31 %143 140

a

b c d

79 %

e

141 142

Abbildung 56. Synthese zweier N-terminaler Löslichkeitsvermittler. – N,N-Dimethyl-ß-alanin (140) (oben) und ein C-Monomer 142 mit terminal methyliertem Rückgrat 78 (unten). Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) Formalin, Ameisensäure, Rückfluss, 16 h; (2) HCl; (b) H2, Pd/C, H2O, RT; (c) SOCl2, MeOH, 0 °C → Rückfluss, 16 h; (d) CBhoc-AcOH (84), EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h; (e) (1) LiOH (2 eq.), THF, H2O, 0 °C → RT, 2 h; (2) HCl.

Die Modifizierung des C-Terminus sollte durch die Abspaltung des Oligomers vom

HMBA-Linker 75 durch Reaktion mit N,N-Dimethylaminoethylamin 143 erfolgen

(Abbildung 57, oben). Bei HMBA 75 und anderen Hydroxymethyl-funktionalisierten

Festphasen wird das erste Monomer typischerweise manuell gekoppelt, da hierbei eine Ester-

funktion entsteht, deren Bildung andere Bedingungen erfordert als die folgenden Kopplungen

zur Amidbindung. Das Templat und somit auch das C-terminale Trimer sollten als ersten

Baustein eine Glycin-Einheit enthalten, die zum einen der Aggregation des wachsenden


72

Oligomers an der Festphase entgegenwirkt und zum anderen die Selbstabspaltung nach dem

ersten Monomer verhindert. Diese tritt auf, wenn das freie Amin 144 die Esterbindung zum

Linker unter Ausbildung eines Sechsrings 145 nukleophil angreifen kann (Abbildung 57,

unten). Bei Peptiden ist dieser Effekt auf der Stufe des Dipeptids bekannt.

N

O

NH2 O

O

B(Bhoc)O

B(Bhoc)

N

NH

O

N

O

NH2 NH

O

B(Bhoc)

O

O

NH

NNH

O

N

O

B(Bhoc)

O

NHN

H

NO

OO

B(Bhoc)

NH2

N

O

NH

OH

linker

144 145 146

PEG

PEG

+

linker

PNA PNA

143 75

147 148

Abbildung 57. Abspaltung des Oligomers von der Festphase durch Umsetzung mit N,N-Dimethylaminoethyl-amin (143) (oben) und Selbstabspaltung von der Festphase und deren Unterdrückung durch Einbau einer Glycin Einheit (unten).

Bei dem folgenden Screening verschiedener Reaktionsbedingungen erwies sich MSNT (149)

als effektivstes Reagenz zum Koppeln von Fmoc-geschütztem Glycin an den HMBA-

Linker 75 (Abbildung 58). Mit dieser aus der Oligonukleotid-Synthese bekannten Verbindung

ließ sich die Glycin-Einheit mit einer Ausbeute von 82 % an die Festphase koppeln, während

sich das anspruchsvolle Guanin-Monomer 127 immerhin noch mit moderaten 54 % koppeln

ließ.

O

NH

ONH

O

Fmoc

S N

O

O N

N

NO2

OH

O

NH

75 150

a: 20 %b: 26 %c: 65 %d: 82 %

PEG

MSNT149

PEG

Abbildung 58. Kopplung von Fmoc-Gly-OH an die HMBA-Festphase. – Reagenzien und Reaktionsbedingung-en: (a) Fmoc-Gly-OH (3.2 eq.), HBTU, DIPEA, DMF, RT, 1.5 h; (b) Fmoc-Gly-OH (5.0 eq.), TOTU, DIPEA, DMF, RT, 24 h; (c) Fmoc-Gly-OH (10 eq.), DIC, DIPEA, DMAP, DCM, RT, 24 h; (d) Fmoc-Gly-OH (5.0 eq.), MSNT, MeIm, DCM, RT, 24 h.


73

4.1.7 Oligomersynthese

Die folgenden maschinellen Festphasensynthesen erfolgten jeweils im Maßstab von 10 µmol

in einem 3 ml Reaktionsgefäß. Als N-terminaler Löslichkeitsvermittler wurde zunächst

ß-Alanin 140 ausgewählt. Vom Kopplungsreagenz HBTU (151) wurden pro Kopplungsschritt

5.0 Äquivalente eingesetzt, während von den PNA-Monomeren jeweils 5.3 Äquivalente ver-

wendet wurden (Abbildung 59).

O

N

NN

NN

O

O

NNH

O

B(Bhoc)

N

NN

O

N N

O

N

N

O

ON

NH

O

B(Bhoc)

N

N

N

O

O

NH

O

B(Bhoc)

N

N

O

NH2 NH

O

B(Bhoc)

O

On

N

O

NH

NH

O

B(Bhoc)

O

O

ON

NH n

O

B(Bhoc)

PF6-

PF6

-

PF6

-+

+

-

-

Fmoc Fmoc+ +

Fmoclinker

Fmoclinker

+

152 151 153 154

156 155

157

158

Abbildung 59. Aktivierung mit HBTU(N-Form bzw. Guanidinium-Salz) und anschließende Kopplung.

Dieser leichte Überschuss an Monomeren 152 gegenüber dem Kopplungsreagenz erklärt sich

aus der in 1.4.4 besprochenen besonderen Reaktivität der Aminofunktion. Diese kann mit

nicht umgesetztem HBTU zum entsprechenden Guanidinium-Salz 159 reagieren und würde

danach einer Kettenverlängerung nicht mehr zur Verfügung stehen (Abbildung 60).

Nach der Kopplung wurden nicht umgesetzte Aminofunktionen durch eine Mischung von

Essigsäureanhydrid, Pyridin und NMP acetyliert, um Deletionsmutanten zu vermeiden und

die chromatographische Abtrennung von Nebenprodukten zu erleichtern.


74

N

NN

NN

O

N

O

NH2 NH

O

B(Bhoc)

On

O

N

O

NH

NH

O

B(Bhoc)

On

N

N

O

N

NN

O

PF6

-

PF6

-

+

+ + linker

linker

+

-

159

154

151 160

Abbildung 60. Guanidiniumcapping mit überschüssigem HBTU.

Daraufhin erfolgte die Abspaltung der Fmoc-Gruppe mit Piperidin (162) (Abbildung 61) oder

mit der nicht nukleophilen Base DBU. Diese ist weniger giftig als Piperidin (162) und ihre

Verwendung führte zu einer präziseren Basislinie bei der Leitfähigkeitsmessung, die nach je-

der Fmoc-Abspaltung als Reaktionskontrolle erfolgte. Darüber hinaus empfiehlt sich die Ver-

wendung von DBU auch bei der UV-metrischen Bestimmung der Beladung von Festphasen,

da eine nicht-nukleophile Base keine Michaeladdition mit dem Fmoc-Fulven 165 eingehen

kann.[226] Diese Reaktion führt zu einer Veränderung des Absorptionsverhaltens und somit zu

Fehlern bei der Beladungsbestimmung. Anschließend begann der nächste Synthesecyclus.

O NH

O

RO NH

O

R

H

NH

H

N

NH

NH2

+

O NH

O

R

H+

O NH

O

RH

+

CO2

H

NNH2

R

-

-

+

+

+

+

++

161 163 164 165 166

162 162

167 166 168 167

Abbildung 61. Abspaltung der temporären Fmoc-Gruppe durch Piperidin (162).


75

Nach erfolgter Festphasensynthese wurden zunächst die Bhoc-Schutzgruppen durch

Umsetzung mit Trifluoressigsäure entfernt (Abbildung 62). Dabei wurden 5 % m-Cresol (169)

zugesetzt, um reaktive Carbenium-Ionen 170 abzufangen und eine unerwünschte Alkylierung

der Nukleobasen zu unterdrücken.

OHPh

Ph

OH NH

O

RC+

Ph

Ph H NH2

R CO2O

HNH

O

RPh

Ph

OH

NH

OH+

R

Ph

Ph

OH

OH

PhPh

OH Ph

Ph

+ +

TFA

oder oder

und Folgeprodukte

171 172 170 173 168

169

174 175 176

Abbildung 62. Abspaltung der permanenten Bhoc-Gruppe durch TFA.

Im Anschluss wurde das Zielmolekül 177 abgespalten, indem die Festphase über Nacht mit

einer Lösung von N,N-Dimethylaminoethylamin (143) in DMF bei Raumtemperatur behan-

delt wurde. Nachdem die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt wurden, erfolgte die

Analyse des Rohprodukts durch RP-HPLC und MALDI-TOF-MS (Abbildung 63). Bei der

Analyse der ersten Templat-Synthese konnten neben dem Zielmolekül 177 auch zwei

Fragmente 178 und 179 nachgewiesen werden, deren Synthese jeweils bei der Kopplung der

Cytosin-Monomere 82 abgebrochen war (Abbildung 64). Im Folgenden wurden daher pro

Cytosin-Einheit zwei Kopplungscyclen mit jeweils frischen Reagenzien angewandt.


76

Abbildung 63. Analyse der ersten Oligomersynthese von 177. – Im RP-HPLC-Plot des Rohprodukts (innen) erkennt man die Signale des Produkts 177 und der Abbruch-Fragmente 178 und 179. Das MALDI-TOF-Spektrum (außen) zeigt die Analyse des Produkt-Peaks.

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH

O

N

N

O

NH2

NNH

OO

N N

NNH

O

NH2

NH

N

OOO

F

F

NH

O

NH

N

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NH

O

NH

N

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH

O

N

N

O

NH2

NNH

OO

N N

NNH

O

NH2

NNH

N

OOOO

F

FN

N

O

NH2

NH

O

NH

NO

NH

N

178

179

177Exakte Masse = 1871.8249 Summenformel: C77H103F2N37O18

Abbildung 64. Strukturen des Templats 177 und der beiden nachgewiesenen Abbruch-Fragmente 178 und 179.

m/z

1874.003

0

50

100

150

200

Int. (a.u.)

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

0 10 20 30 40 50

0

500

1000

1500

A2

54

t (min)

177 179

178


77

Nachdem das Lösungsmittel am Synthesizer von DMF auf NMP umgestellt wurde, ergaben

sich generell sauberere Rohprodukte, wie in Abbildung 65 zu sehen ist.

Abbildung 65. RP-HPLC-Analyse von zwei verschiedenen Templat-Synthesen. – Bei ansonsten identischen Be-dingungen wurde DMF (links) bzw. NMP (rechts) als Lösungsmittel verwendet.

Es wurde auch ein Templat 180 mit dem Monomer 127c hergestellt, das eine CF3-Gruppe

trägt (Abbildung 66). Die erzielten und in Abbildung 67 dargestellten Ergebnisse waren dabei

mit den vorangegangenen vergleichbar.

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH

O

N

N

O

NH2

NNH

OO

N N

NNH

O

NH2

NNH

N

OOOO

FN

N

O

NH2

NH

O

NH

NO

NH

N

FFF

Exakte Masse = 1907.8061 Summenformel: C77H101F4N37O18 Abbildung 66. Templat 180 mit CF3-Gruppe am Isoster.

Die Aufreinigung von PNA erfolgt wie bei Peptiden typischerweise durch RP-HPLC unter

Verwendung eines Wasser-Acetonitril-Gradienten, wobei den beiden Eluenten jeweils

0.1 % Trifluoressigsäure (TFA) zugesetzt werden. Allerdings wird im Falle von PNA die

Säule auf eine Temperatur von 50-60 °C geheizt, um die typische Selbstassoziation dieser

Verbindungsklasse zu unterdrücken.[227, 228] Abbildung 68 zeigt am Beispiel der Reinigung

des PNA-Trimers 81, wie drastisch sich die Säulentemperatur auf das Trennergebnis

auswirkt. Bei Raumtemperatur findet man eine Reihe zum Teil stark verbreiterter Signale,

während man bei 55 °C hauptsächlich drei definierte Signale für das Trimer und die beiden

möglichen Abbruch-Fragmente findet.

0 10 20 30 40 50 600.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

A2

54

t (min)

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

A2

54

t (min)


78

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH2

O

N

N

O

NH2

NH

O

NH

N

Abbildung 67. Analyse der Synthese von 180. – RP-HPLC-Plot (innen) und MALDI-TOF-Spektrum (außen).

Abbildung 68. RP-HPLC Analyse des C-terminalen Trimers 81. – Bei 55 °C Säulentemperatur (links) und bei Raumtemperatur (rechts).

0 20 40 60

0.0

0.5

1.0

1.5

A2

54

t (min)

0 20 40 60

0.0

0.5

1.0

1.5

A2

54

t (min)

1910.858

0

5

10

15

20

25

30

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z

Int. (a.u.)

0 20 40 60 80 100

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5A

254

t (min)


79

An diesem Punkt wurde der Weg zu (F-)PNA-Bausteinen über die maschinelle Festphasen-

synthese aus drei Gründen verlassen:

1. Nach Abspaltung von der Festphase und Reinigung durch HPLC lagen die Ausbeuten

an Oligomer im Bereich von 10 %. Dies ist für PNA-Synthesen sehr gering, für die

Ausbeuten im Bereich von 26-38.5 % (15-32mere, Fmoc/Bhoc)[229] bis hin zu 61 %

(17mer, Boc/Z)[230] berichtet werden. Der Wechsel des verwendeten Lösungsmittels

und die Einführung doppelter Kopplungen führten zu sichtbaren Fortschritten. In der

Summe reichten diese Verbesserungen aber nicht aus, um die zeitnahe Synthese der

benötigten Substanzen zu gewährleisten.

2. Die maschinelle Festphasensynthese erforderte einen hohen Überschuss an den teuren

bzw. aufwendig herzustellenden Monomeren. Der damit verbundene Aufwand an Zeit,

Geld und Arbeitskraft schien nach Analyse der eben beschriebenen Ergebnisse nicht

mit einer effektiven und fristgerechten Durchführung des Projekts vereinbar.

3. Die Trennung der PNA-Trimere von ihren Abbruch-Fragmenten, dem acetylierten

Mono- und Dimer, gestaltete sich schwierig. Ursächlich war hier die geringe Reten-

tion dieser stark hydrophilen Verbindungen auf der zur Verfügung stehenden Säule.

Weder die Verwendung sehr flacher Gradienten noch der Wechsel zum Wasser-

Methanol-Gradienten brachten hier greifbare Ergebnisse.

Zunächst war nicht eindeutig zu klären, an welcher Stelle die Ausbeuten so drastisch einbra-

chen. Daher wurde in einem gemeinsamen Projekt mit Dietz sowohl die Effizienz der

Kopplungen als auch die Effektivität der Abspaltung untersucht. Aus Kostengründen geschah

dies anhand einer Modellverbindung: einem Peptid mit der Sequenz H-Lys-Lys-Pro-Tyr-Ile-

Leu-OH.[231] Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Synthese der Modellverbin-

dung am standardmäßig verwendeten Wang-Linker sowie am HMBA-Linker mit guten

Effizienzen gelang. Die Abspaltung des Peptids in Form seiner freien Säure erfolgte von

beiden Linkern durch die Behandlung mit TFA bzw. NaOH in zufriedenstellender Ausbeute.

Allerdings war es nicht möglich, das Oligomer mit N,N-Dimethylaminoethylamin (143) von

der Festphase abzuspalten. Dies deckte sich zwar mit den Erfahrungen bei den voran-

gegangenen PNA-Synthesen, erschien aber verwunderlich, da die Reaktionsbedingungen

analog zu einem Beispiel aus vertrauenswürdiger Literatur gewählt wurden.[213] In diesem

Beispiel wurde ein Peptid mit Ethanolamin von der HMBA-Festphase abgespalten.


80

Leider ist die Anzahl der literaturbekannten Anwendungen des HMBA-Linkers und der

beschriebenen Variationen der Reaktionsbedingungen begrenzt. Der einzig bekannte

alternative Weg zu C-terminalen sekundären Amiden führt über die sogenannten Backbone

Amide Linker (BAL) (181a-b).[232] Hierbei handelt es sich um Linker mit einer Aldehyd-

funktion, die zunächst manuell in einer reduktiven Aminierung mit einem primären Amin

zum sekundären Amin umgesetzt wird. Bevor das gewünschte Oligomer durch maschinelle

oder manuelle Fmoc-Festphasenchemie aufgebaut werden kann, muss zunächst das erste

Monomer in einem weiteren manuellen Schritt gekoppelt werden. Die Abspaltung mit TFA in

Dichlormethan führt dann zum gewünschten C-terminalen Amid. Erste Versuche mit dem

Modellpeptid am MALDRE-Linker (181b)[233] führten zum gewünschten sekundären Amid

mit Ausbeuten von bis zu 48 %. Abbildung 69 zeigt, wie prinzipiell auch PNAs an diesem

Linker aufgebaut werden können.

O

R

O NH

ON

N

O

N

NH

O

PG1

OO

R

O NH

O

NNH2

N

NH

O

R

O NH

O

NHN

OO

NHN

O

NH

O

X

n

N

NaCNBH3

Kopplung

a: R = OMe (BAL) b: R = H (AMEBA oder MALDRE)

B

B

PNA-Monomer

181 143 182a-b

reduktive Aminierung

183a-b

184

TFA

Fmoc-SPPS

Abspaltung

B(PG2)

Abbildung 69. Potentieller Zugang zu C-terminal Amid-funktionalisierten PNAs 184 über Festphasen mit Aldehydfunktion 181.


81

4.2 Synthesestrategie II: Konvergente Flüssigphasensynthese

4.2.1 Vorüberlegungen

Die Alternative zur Festphasensynthese ist die Synthese der Oligomere in Lösung, wie sie vor

den bahnbrechenden Arbeiten von Merrifield standardmäßig zum Aufbau von Peptiden be-

nutzt wurde. Auch wenn sie sich nicht automatisieren lässt, bietet sie doch eine Reihe von

Vorteilen:

1. Typischerweise wird mit nur geringen oder gar keinen Überschüssen an Reagenzien

und Monomeren bzw. Fragmenten gearbeitet, sodass weniger wertvolle Substanzen

verbraucht werden.

2. Das wachsende Oligomer kann nach jedem Reaktionsschritt isoliert und aufgereinigt

werden, wohingegen bei der SPPS nach den einzelnen Reaktionsschritten nur

gewaschen wird, was zu einer Akkumulation von Verunreinigungen bzw. Mutanten

führen kann.

3. Nach jedem Reaktionsschritt kann eine vollständige Charakterisierung erfolgen

(NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie, HPLC u.a.). Auf diese Weise werden

Probleme früh eingegrenzt und erkannt. Hingegen erfolgt die Kontrolle des Reaktions-

fortschritts bei der manuellen SPPS typischerweise durch Testreaktionen (z.B. Kaiser-

Test), am Synthesizer auch UV-spektroskopisch oder wie im Falle des hier

verwendeten Geräts durch Leitfähigkeitsmessung.

4. Dem Hochskalieren von Synthesen sind in flüssiger Phase deutlich weniger Grenzen

gesetzt, sodass ein rascher Zugang zu den benötigten Mengen möglich erschien.

Es war nun das Ziel, die zwei Trimere, die zum Aufbau des Replikations-Systems benötigt

wurden, in Lösung herzustellen und anschließend zum hexameren Templat zu ligieren.


82

4.2.2 Fmoc/Bhoc-Chemie

Zunächst wurde auf Basis der vorhandenen Substanzen versucht, eine erste Kondensations-

reaktion zum Dimer durchzuführen. Als Säure-Komponente wurde für diesen Versuch das

bereits vorhandene Cytosin-Monommer 82 ausgewählt, während sich die Wahl der Amino-

Komponente schwieriger gestaltete. Es erscheint zunächst logisch, vom vollständig

geschützten Monomer auszugehen und anstatt der Esterverseifung eine Fmoc-Abspaltung

durchzuführen. Jedoch greift das freigesetzte Amin entweder sofort die Carbonylfunktion des

Esters unter Ringschlussbildung an oder attackiert die Carbonylfunktion des Essigsäurelinkers

unter Transamidierung (Abbildung 30). Diese Problematiken setzten sich bei der Lagerung

fort und stellen zudem in einem Kopplungsansatz Konkurrenzreaktionen dar. Die Schwierig-

keiten bei Synthese und Lagerung wurden zunächst hintangestellt, indem, ausgehend von

einem Boc-geschützten Monomer, das TFA-Salz 185 dargestellt wurde. Die Synthese des

geschützten PNA-Dimers 186 (Abbildung 70) konnte zwar durch DC- und 1H-NMR-Analyse

bestätigt werden, aber es war nicht möglich, die Zielverbindung zu reinigen, da eine

Löslichkeit nur in extrem polaren Solventien wie DMF und DMSO gegeben war, die sich

nicht zur Chromatographie eigneten. Ebenso war eine Kristallisation nicht möglich.

N

N

NH

O

N

O

Bhoc

NH

OH

O

NH2

O

F

F

N

O

OMe NH

O

F

F

N

O

N

N

NH

O

N

O

NH

O

OMe

Bhoc

*TFA+

82 185 186

Fmoc Fmoca

Abbildung 70. Konvergente Flüssigphasensynthese. – Modellreaktion mit einem Fmoc/Bhoc-Monomer. Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) HATU, DIPEA, DMF, RT, 16 h.

Neben der generellen Tendenz von PNA zu aggregieren, lässt sich auch die Wahl der Schutz-

gruppen als Erklärung für die hier aufgetretene minimale Löslichkeit heranziehen. Betrachtet

man typische Peptidsynthesen an der festen Phase, so wird bei der Verwendung Fmoc-

geschützter Aminosäuren in der Regel polares DMF oder NMP als Lösungsmittel verwendet,

wohingegen bei Synthesen mit Boc-geschützten Aminosäuren weitaus unpolareres DCM

eingesetzt wird. Daraus wurde geschlossen, dass eine Synthese auf Basis von Boc-geschütz-

ten Verbindungen zu deutlich verbesserter Löslichkeit bei den jeweiligen Reaktionen und vor

allem während der folgenden Reinigungsschritte durch Chromatographie führen würde.


83

4.2.3 Boc/Z-Chemie

Die Synthese der entsprechenden Boc/Z-Monomere war notwendig, da diese Verbindungen

nur zu sehr hohen Preisen erhältlich waren. Zur Darstellung von N-terminal Boc-geschütztem

Rückgrat 187 wurde der Methylester 124 unter nukleophiler DMAP-Katalyse mit Boc-

Anhydrid in DCM umgesetzt (Abbildung 71). Nach säulenchromatographischer Reinigung

ließen sich nur 54 % der Zielverbindung isolieren, sodass in einem weiteren Experiment die

Bedingungen der Fmoc-Schützung von 124 auf die Einführung der Boc-Gruppe übertragen

wurden. Hierdurch ließ sich die Ausbeute auf 63 % steigern. Anzumerken ist, dass die bei der

Synthese von Fmoc-Aeg-OMe (83) beschriebenen Konkurrenzreaktionen auch bei der

analogen Boc-Schützung auftreten.

OO NH

NH

OO

ONH2

NH

O

*2HCl

124 187

a oder b

a: 54 %b: 63 %

Abbildung 71. Synthese von Boc-Aeg-OMe (187). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Boc2O, DMAP, NMM, DCM, -15 °C → RT, 5 h; (b) Boc2O, TEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h.

Die Synthese des Adenin-Monomers 188 wurde analog zu dem beschriebenen Fmoc/Bhoc-

Derivat 132 durchgeführt (Abbildung 72): Der bereits dargestellte Ethylester 120 wurde

zunächst mit CDI umgesetzt und dann wurde Benzylalkohol anstelle von Benzhydrol zugege-

ben. Nach Durchführung der schon bekannten Reaktionssequenz aus Verseifung, Kopplung

und Verseifung wurde das Boc/Z-geschützte Adenin-Monomer 188 mit einer Ausbeute von

32 % über fünf Synthesestufen erhalten.


84

N N

N N

NH2

O

O

N N

N N

NH

O

O

OH

ON N

N N

NH

O

O

O

O

N N

N N

NH

O

O

OHO NH

OO

N

O

N N

N N

NH

O

O

OO NH

OO

N

O

55 % 80 % 81 %

a b c

90 %

b

120 189 190

191 188

Abbildung 72. Synthese von Boc-Aeg(AZ)-OH (188). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) CDI, DMF, 105 °C, 2 h; (2) Benzylalkohol, 105 °C, 3 h; (b) (1) LiOH, THF, H2O, 0 °C → RT, 2 h; (2) 1 M HCl; (c) Boc-Aeg-OMe (187), TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h.

Die Synthese der Boc-geschützten Cytosin-essigsäure 192 wurde zum einen analog zum

Fmoc-Derivat 84 durchgeführt, zum anderen wurde ein Weg gewählt, bei dem zunächst die

exocyclische Aminofunktion geschützt wird. Bei dieser Synthese wurde Cytosin (86) unter

Schützung der Positionen N1 und N4 mit 2.2 Äquivalenten Chlorameisensäure-benzylester

versetzt. Die Schutzgruppe an N1 ist instabil und wurde durch die folgende wässrige

Aufarbeitung wieder entfernt. Anschließend wurde 193 mit Chloressigsäure-methylester

alkyliert und dann zu Essigsäure 192 verseift. Aufgrund der geringen Ausbeute des ersten

Schritts zeigte sich der bereits bekannte Zugang über 105 und 194 überlegen. Die Synthese

des Monomers 195 erfolgte über die bekannte Sequenz Peptidkopplung und Verseifung. Nach

fünf Stufen konnte das Cytosin-Monomer 195 mit einer Ausbeute von 12 bzw. 45 % erhalten

werden (Abbildung 73).


85

O

O

NH

NH

N

O

O

O

NH

N

N

O

O

O

NH

N

O

NH2

N

N

O

NH2

O

O

N

N

O

NH

O

O

OH

O

N

N

O

NH

O

O

O

O

N

N

O

NH

OH

O

NH

O

OH

N

N

O

NH

N

O

NH

NH

O

OMe

N

N

O

NH

N

O

NH

O

OMe

21 % 90 % 61 %

86

193 196

105 194

192

a b c

97 % 50 % 92 %

d e c

61 % 97 %

187 197 195

Boc Boc Boc

+

f c

192

Z

Z Z

Abbildung 73. Synthese von CZ-AcOH (192) (oben) und Boc-Aeg(CZ)-OH (195) (unten). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Chlorameisensäure-benzylester, DMAP, Pyridin, RT, 4 d; (b) (1) K2CO3, DMF, RT, 10 min; (2) Bromessigsäure-methylester, RT, 16 h; (c) (1) LiOH, THF, H2O, 0 °C → RT, 2 h; (2) 1 M HCl (d) (1) KOtBu, DMF, 100 °C, 2 h; (2) Bromessigsäure-benzylester, 0 °C → RT, 16 h; (3) AcOH, H2O; (e) (1) CDI, THF, Rückfluss, 2 h; (2) Benzylalkohol, Rückfluss → RT, 16 h; (f) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h.

Bei der Synthese des Guanin-Monomers 198 wurde mit dem Methylester der Chlorameisen-

säure alkyliert, da die Verwendung des Benzylesters bei der Synthese des analogen

Fmoc/Bhoc-Monomers 110 zu einer schwierigen Abtrennung des Benzylalkohols in der

dritten Stufe geführt hatte (vgl. 4.1.3). Tatsächlich wurde die Isolierung von Guanin-

essigsäure 199 durch diese Variation erheblich vereinfacht. Nach Kopplung zum Rückgrat

187 und Verseifung konnte die Zielverbindung 198 über fünf Stufen mit einer Ausbeute von

6 % erhalten werden (Abbildung 74).


86

NH N

N N

Cl

NH2N N

N N

Cl

NH2O

O

N N

N N

Cl

NH

O

O

N N

N NH

O

NH

OH

O

N N

NNH

O

NH

N

O

NH

O

OMe

N N

NNH

O

NH

N

O

NH

O

OH

N N

NNH

O

NH

N

O

NH2

O

OMe

a: 44 %b: 56 %

49 % 58 %

a oder b c d

59 % 62 %

Z

Boc Boc

Z

Z Z

Z

e f

g

quant.

111 200 201 199

202 198

203

Abbildung 74. Synthese von GZ-AcOH (199) (oben), Boc-Aeg(GZ)-OH (199) (Mitte) und H-Aeg(GZ)-OMe*TFA (203) (unten). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) K2CO3, DMF, 85 °C, 30 min; (2) Bromessigsäure-methylester, 0 °C → RT, 16 h; (3) 1 M HCl; (b) (1) NaH, DMF; (2) Bromessigsäure-methylester; (c) (1) Triphosgen, THF, 0 °C, 1 h; (2) DIPEA, 0 °C, 30 min; (3) Benzylalkohol, 0 °C → RT, 16 h; (d) (1) NaH, 3-Hydroxypropionitril, THF, -78 °C → RT, 3 h; (2) 201, 0 °C → RT, 16 h; (e) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h, SC; (f) (1) LiOH, THF, H2O, 0 °C → RT, 2 h; (2) 1 M HCl; (g) TFA, DCM, 0 °C → RT, 2 h.

Zur Synthese des fluoraromatischen Monomers 182 wurde die bereits dargestellte

F-Essigsäure 70 an das geschützte Rückgrat 187 gekoppelt und anschließend die Boc-Gruppe

acidolytisch entfernt (Abbildung 75).

OO NH

OO

F

F

N

O

OO NH

NH

OO

F

F

OH

O

ONH2

O

F

F

N

O+

83 % 55 %

70

187 204 182

a b

*TFA

Abbildung 75. Synthese von H-Aeg(F)-OMe*TFA (182). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h; (b) TFA, DCM, 0 °C → RT, 2 h.


87

Darüber hinaus wurde Verbindung 205 hergestellt, das Amid von Glycin mit N,N-Dimethyl-

amioethylamin (143), welches zur Modifizierung des C-Teminus dienen sollte (Abbildung

76). Hierzu wurde Boc-geschütztes Glycin 206 zunächst in einer durch EDC vermittelten

Kopplung mit dem Amin 143 umgesetzt und im Anschluss die Schutzgruppe entfernt.

NH

O

NNH

O

ONH2

NOH

O

NH

O

O

NH

O

NNH2+52 % 100 %

* 2TFA206 143 207 205

a b

Abbildung 76. Synthese des C-terminalen Löslichkeitsvermittlers 205 ausgehend von N-Boc-Glycin (206). –Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) EDC, HOBt, TEA, Chloroform, 0 °C → RT, 16 h; (b) TFA, DCM, 0 °C → RT, 2 h.

Zuerst wurde das Dimer 208a aus Cytosin 195 und Fluoraromat 182 synthetisiert, um so die

Ergebnisse mit denen der Synthese von 186 unter Verwendung der Fmoc/Bhoc-Strategie ver-

gleichen zu können (Abbildung 77). Die Kopplung erfolgte unter Verwendung des sehr effek-

tiven Kopplungsreagenzes HATU (209) und lieferte nach Säulenchromatographie das Ziel-

molekül mit einer Ausbeute von 51 %. Der Wechsel der Schutzgruppenstrategie brachte auf

der Stufe des Dimers 208a einen greifbaren Fortschritt, indem nun das Produkt unter üblichen

Bedingungen chromatographiert werden konnte. Zudem wurde das Dimer 210 aus Adenin

188 und Guanin 203 hergestellt. Dabei wurden nacheinander eine Reihe von Reaktions-

parametern variiert und der Einfluss auf die Effizienz qualitativ durch HPLC-Analyse

bestimmt. Der Wechsel des Lösungsmittels von DMF zu NMP, die Erhöhung der Temperatur

von 25 auf 55 °C und die Zugabe von insgesamt vier Äquivalenten Basen führten zu

sichtbaren Verbesserungen, denen zufolge die Zielverbindung schließlich mit einer Ausbeute

von 40 % erhalten werden konnte.


88

N

N

NH

O

N

O

NH

OH

O

NH2

O

F

F

N

O

OMe NH

O

F

F

N

O

N

N

NH

O

N

O

NH

O

OMe

OHNH

O

N

O

N N

N N

NH

N N

N NH

O

NH

NH2

O

N

O

OMe

N N

N NH

O

NH

N N

N N

NH

NH

O

N

O

NH

O

N

O

OMe

*TFA

+51 %

a

195 182 208a

Z

Boc

Z

Boc

*TFA

+Boc

Z

40 %

b

Z

Z

Z

Boc

188 203 210

Abbildung 77. Konvergente Flüssigphasensynthese I. – Synthese von Boc-Aeg(CZ)-Aeg(F)-OMe (208a) (oben) und Boc-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-OMe (210) (unten). Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) HATU, DMF, DIPEA, RT, 16 h; (b) HBTU, DIPEA, NMP, 55 °C, 16 h.

Beachtet man, dass hierbei HBTU (151) verwendet wurde, das im Gegensatz zu HATU (209)

nicht zu intramolekularer Basenkatalyse (Abbildung 78) imstande ist, und die Tatsache, dass

purinreiche Sequenzen in besonderem Maße zur Aggregation neigen, ist die erzielte Ausbeute

an 210 durchaus zufriedenstellend.

N

N

NN

OO

N

NH

O

PG

NH

H

NO

OO

PF6

-N

N

NN

O

N

N

BPG

BPG

+

211 212 209

Abbildung 78. Intramolekulare Basenkatalyse bei der Verwendung des Kopplungsreagenzes HATU (209) (links) und seine O- bzw. Uronium-Form (rechts).

Bei der nachfolgenden Synthese des Trimers 213 der Sequenz cfg kam es zu einem

drastischen Einbruch der Kopplungsausbeute auf 19 % nach Reinigung durch HPLC

(Abbildung 79).


89

OHNH

O

F

F

N

O

N

N

NH

O

N

O

NH

O

N N

N NH

O

NH

NH

O

N

O

NH

O

F

F

N

O

N

N

NH

O

N

O

NH

O

OMe

208b 213

Boc

Z

Boc

Z

Z

a

19 %

Abbildung 79. Konvergente Flüssigphasensynthese II: Boc-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OMe (213). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) H-Aeg(GZ)-OMe*TFA (203), TOTU, DIPEA, DMF, 16 h, RT.

In dieser Versuchsreihe wurden sowohl für die analytische als auch für die präparative HPLC

Säulen mit einer Nitrophenyl-Normalphase verwendet. Dieses Material eignet sich insbeson-

dere für die Trennung von Verbindungen mit einer unterschiedlichen Anzahl von aromati-

schen Ringen, da die Nitroaromaten der stationären Phase mit den Aromaten der Analyten

wechselwirken. Interessant ist, welch starken Einfluss das Mischungsverhältnis des Laufmit-

tels hat, insbesondere da es sich bei beiden Komponenten um Alkohole handelt (Abbildung

80). Die zur Verfügung stehende präparative Säule war schon etliche Jahre alt und verlor

unter den Bedingungen der Trennung kontinuierlich geringe Mengen Substanz, sodass alle

erhaltenen Produkte leicht verunreinigt waren. Dies und der Einbruch der ohnehin mäßigen

Kopplungsausbeuten auf dem Weg zum Trimer führten zu einem erneuten Umdenken und zu

einem Wechsel der Synthesestrategie.


90

Abbildung 80. Optimierung der NP-HPLC-Analyse von Monomer 195, Dimer 208a, Trimer 213 und einer unbekannten Verunreinigung. – Unter isokratischen Bedingungen wurden folgende Mischungen von 2-Propanol und Methanol verwendet: 1:9 (oben links), 4:6 (oben rechts), 7:3 (unten links) und 8:2 (unten rechts). Ebenfalls unten rechts ist die verwendete Nitrophenylphase dargestellt.

0 10 20 30 40 50

0

2

4

6

A2

54

t (min)

OH

OH

NO2

NO2

NO2

0 5 10 15 20 25 30

0

2

4

6

A2

54

t (min)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6A

254

t (min)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6

A25

4

t (min)


91

4.3 Synthesestrategie III: Zugang über ein vollständig geschütztes Rückgrat

4.3.1 Grundlagen

Strategien zur Synthese von PNA in flüssiger Phase sind intensiv von Condom und

Mitarbeitern erarbeitet worden.[234-241] In der Literatur ist nur ein einfaches Beispiel bekannt,

das nicht aus seiner Arbeitsgruppe stammt; dabei handelt es sich um eine Dimerisierung mit

anschließender Cyclisierung.[242] In den Arbeiten von Condom lassen sich insgesamt fünf

Strategien zum Aufbau von PNAs erkennen, die je nach Syntheseproblem kombiniert und

variiert werden:

1. Der einfache konvergente Weg entspricht im Wesentlichen dem im vorherigen

Abschnitt beschriebenen Verfahren: Ein C-und ein N-terminal entschütztes Monomer

werden unter geeigneten Kopplungsbedingungen zum Dimer umgesetzt. Hierbei ist

die Ausbeute der Kopplung gering. Eine weitere Kettenverlängerung führt zu

erneuten Effizienzverlusten.

2. Beim konvergenten Ansatz wird zuerst die Carboxylform eines Monomers 214 mit

dem Alkylester 124 des Rückgrats gekoppelt (Abbildung 81). Daraufhin wird das

sekundäre Amin von 215 mit einer geschützten Nukleobasen-essigsäure 216 zum

tertiären Amid umgesetzt und nachfolgend der Alkylester verseift. Problematisch ist

hier vor allem die Diskriminierung zwischen primärem und sekundärem Amin im

ersten Kopplungsschritt. Außerdem bricht auch hier die Ausbeute mit wachsender

Kettenlänge ein, sodass diese Herangehensweise auf Di- und Trimere beschränkt ist.

3. Der Zugang über ein komplett geschütztes Rückgrat führt die geschützten

Nukleobasen möglichst spät in das Zielmolekül ein, da diese die Hauptursache für

Löslichkeitsprobleme sind (Abbildung 81). Für die Maskierung der sekundären

Amine des Rückgrats benötigt man bei dieser Strategie so viele orthogonale Schutz-

gruppen, wie es unterschiedliche Basen in der Zielverbindung gibt. Diese Schutzgrup-

pen müssen darüber hinaus orthogonal zu denen der exocyclischen Aminofunktionen

der Basen sein. Zusätzlich können die gewünschten Modifizierungen am N- und

C-Terminus den Einsatz von ein oder zwei weiteren Schutzgruppen erforderlich


92

machen. Diese Herangehensweise wird von Condom „Fully Protected Polyamide

Backbone Approach“ genannt und soll im Folgenden durch FPBA abgekürzt werden.

Besonders elegant ist diese Strategie für die Synthese von Homo-Sequenzen, da hier

alle Nukleobasen in einem Schritt eingeführt werden können. Im Weiteren kann man

ausgehend von einem komplett geschützten Rückgrat zu mehreren verschiedenen

Sequenzen gelangen. Später wurde dieser Ansatz auch auf die Festphasensynthese

von PNA übertragen.[243]

4. Eine Erweiterung der letztgenannten Strategie ist der kombinierte Einsatz von ge-

schützten Rückgrat-Einheiten und geschützten PNA-Einheiten. Dies empfiehlt sich,

wenn drei oder mehr verschiedene Nukleobasen und/oder andere Funktionalitäten im

Zielmolekül vorhanden sind, da in diesen Fällen die Anforderungen an die Schutz-

gruppenstrategie enorm steigen.

5. Die Fragmentkondensation von kleinen Einheiten wie Di-, Tri- und Tetrameren zu

größeren Einheiten bietet einen eleganten Zugang zu längeren PNAs. Hierbei sind die

Fragmente selbst durch eine der anderen Herangehensweisen synthetisiert worden.


93

N

O

NH

N

O

NH

N

O

NH

O

n

N

O

NH

N

O

NH

O

N

O

NH

O

n

N

O

NH

O

N

O

NH

O

N

O

NH

O

n

N

O

NH

N

O

NH

N

O

NH

n

ONH

O

NH

N

O

NH

O

NH

O

O

NH2

OHN

O

NH

O

O

OH

ON

O

NH

O

N

O

NH

O

OHN

O

NH

O

N

O

NH

O

N

O

NH

O

N

O

NH

O

N

O

NH

O

n

R1

R2

R1

R2

B(PG)1

R1

R2

B(PG)1 B(PG)2

R1

R2

B(PG)1 B(PG)2 B(PG)n

B(PG)1

B(PG)1

B(PG)1 B(PG)2

B(PG)1 B(PG)2

B(PG)2

R3

R4

B1 B2 Bn

124

214

215

217

218

219

220

221

222

216

223

PG1 PG2 PGn

PG2 PGn

PGn

R1

R1

R1

R1

Abbildung 81. Strategien zum Aufbau kurzer PNAs nach Condom et al. – Konvergenter Ansatz (links) und Zugang über ein vollständig geschütztes Rückgrat (FPBA) (rechts). R1 und R2 können sowohl weitere Schutz-gruppen als auch diverse terminale Modifizierungen sein, die während des Aufbaus der geschützten PNA inert sind. Im Zuge der Entschützung zum Zielmolekül erfahren diese Reste entweder eine Veränderung (z.B. R2 = OMe, R4 = OH) oder bleiben unberührt (z.B. R2 = R4 = NH2).


94

4.3.2 Synthese des C-terminalen Trimers

Auf Basis dieser Arbeiten wurde zunächst ein Syntheseschema für das C-terminale Trimer

224 aufgestellt und dabei der Weg über ein vollständig geschütztes Rückgrat gewählt

(Abbildung 82). PNA 224 weist eine Sequenz aus drei verschiedenen Basen auf, sodass es ein

Rückgrat mit drei orthogonalen Schutzgruppen zu synthetisieren galt. Zum einen fiel die

Wahl auf Fmoc und Boc, da diese komplett orthogonal zueinander sind und ausgiebige

Erfahrungen im Umgang mit diesen Schutzgruppen vorlagen. Zum anderen wurde die Alloc-

Gruppe gewählt, da diese im Arbeitskreis bei der Synthese von Tris-Linkern bereits

erfolgreich verwendet wurde und bei geeigneter Wahl der Abspaltbedingungen komplett

orthogonal zu Boc und Fmoc ist. Im Weiteren sollte der C-Terminus des Rückgrats temporär

als Methylester geschützt werden, bis der Löslichkeitsvermittler eingeführt wird. Dieser

erfuhr eine Modifizierung hin zum Morpholin-Ring, da diese Funktionalität günstigere

Eigenschaften bei den beabsichtigten Normalphasen-Chromatographien versprach. Ort der

positiven Ladung in wässriger Lösung sollte nun das Ring-Stickstoffatom sein. Die

beabsichtigte strukturelle Nähe zur PNA ist auch hier ausreichend gegeben, da

N-Ethyleinheiten ebenfalls Teil der PNA-Struktur sind; die Etherfunktionalität und der

Ringschluss stellen allerdings eine Erweiterung dar. Die Nukleobasen und das Isoster sollten

am Ende der Synthese in Form ihrer Essigsäuren eingeführt werden und wenn nötig Z-

geschützt sein. Daher erschien es sinnvoll auch den N-Terminus auf diese Weise zu schützen,

um die Basen und die Ligationsstelle in einem Schritt entschützen zu können.


95

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

XNH

NR2

OR1

Boc OHAlloc

Alloc

OMe

Alloc

H

Boc

OMeFmoc

Z OH

AllocZ

Boc GZ

AllocZ

Boc H

AllocZ

Boc Fmoc

HZ

Boc GZ

AZ

Z

Boc GZ

AZ

ZH GZ

AZ

ZCZ GZ

AH

C G

N

N

N

N

N

N

N

N

Alloc

ZBoc

OMe

Fmoc

Boc

OMeH

Boc OMe

Boc OMe

Alloc

H

OMe

Fmoc

OMe

H

Boc

Boc

Boc

Z OMe

HZ OMe

H

H OMe

Fmoc

Fmoc

AllocZ

BocOH

Fmoc

187

226

229

231

233

234

235

236

237

238

239

240

241

242

224

187

225124

227 228

230

232

X R2R1

=

X = H, Z, Boc

R1 = H, Boc, Alloc, Fmoc, (geschützte) Nukleobasen-essigsäuren

R2 = OH, OMe, N-CH2-CH2-N(-CH2-CH2-)2O

Abbildung 82. Syntheseschema des C-terminalen Trimers 224. – Der Kasten erläutert die Notation.

Das benötigte Rückgrat 85 wurde nun nicht mehr durch die in Abbildung 51 gezeigte

reduktive Aminierung mit elementarem Wasserstoff dargestellt, da die Kapazitäten der zur

Verfügung stehenden Hydrier-Anlagen zu gering waren und außerdem die Verwendung des

teuren Palladium-Katalysators vermieden werden sollte. Stattdessen wurde Chloressig-

säure (243) über einen Zeitraum von acht Stunden in einen Überschuss an heftig gerührtem

und gekühltem Ethylendiamin (122) eingetragen (Abbildung 83).[222] Typischerweise


96

verlaufen Alkylierungen an Diaminen rasch und mit geringer Selektivität, sodass es zur

Bildung von mono-, bi-, tri- und tetra-alkylierten Produkten kommt.[244] Da sich Chlor-

essigsäure (243) nur langsam in Ethylendiamin (122) löst, kann hier der Anteil an mehrfach

alkyliertem Produkt zurückgedrängt werden. Überschüssiges Ethylendiamin wurde nach einer

Nachrührzeit von 16 Stunden destillativ entfernt und in Folgeansätzen recycelt. Durch Zugabe

von DMSO konnte die Zielverbindung 85 aus dem Rohprodukt ausgefällt werden.

NH2 NH2 OHNH

O

NH2OHCl

O

+a

122 243 8570 %

Abbildung 83. Alternativer Zugang zum PNA-Rückgrat 85. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) Eisbadkühlung, 8 h; (2) RT, 16 h.

Wie beschrieben wurde dann zum Methylester Hydrochlorid 124 umgesetzt. Anschließend

wurde ein Teil dieses Ansatzes durch Reaktion mit Benzyl-N-succinimidyl-carbonat zum

N-terminal Z-geschützten Derivat 227 umgesetzt. Zwei weitere Teile wurden durch Reaktion

mit Boc-Anhydrid in das bereits bekannte Rückgrat 185 überführt. Nachfolgend galt es die

sekundären Amine orthogonal zu schützen, was durch Umsetzung von 227 mit Boc-Anhydrid

und von 185 mit den Chlorameisensäure-estern der 9-Fluorenylmethyl- bzw. Allyl-Gruppe

gelang. Vor der Kopplung zum Di- bzw. Trimer bestand noch die Notwendigkeit, die Ester-

funktionen von 230 und 225 zu verseifen und den N-Terminus von 226 freizusetzen. Bis

hierhin konnten alle beschriebenen Reaktionsschritte in großem Maßstab bei guten bis sehr

guten Ausbeuten durchgeführt werden; eine Reinigung durch Säulenchromatographie war nur

nach der Fmoc-Schützung notwendig. Die orthogonal entschützten Rückgrat-Fragmente 228

und 229 wurden durch Umsetzung mit HBTU (151) und DIPEA in DMF zu Dimer 231

gekoppelt, das nach Chromatographie an Kieselgel in 76%iger Ausbeute als farbloser Schaum

erhalten wurde. Auf die Boc-Abspaltung folgte die Elongation zu Trimer 234 durch Reaktion

mit 232 unter den gleichen Bedingungen. Nach der Aufreinigung ließ sich das vollständig

geschützte Rückgrat 234 mit einer im Vergleich zu 231 deutlich geringeren Ausbeute von

62 % isolieren (Abbildung 84).


97

Boc OHAlloc

Alloc

OMe

Alloc

H

Boc

OMeFmoc

Z OH

a b

c d e

f

(62 %)

(85 %)

g

AllocZ

BocOMe

Fmoc

Boc

OMeH

(76 %)

Boc OMe

Boc OMe

Alloc

H

OMeFmoc

OMe

HBoc

Boc

Boc

Z OMe

HZ OMe

H

H OMe

Fmoc

Fmoc

(86 %)

(63 %) (94 %) (91 %)

(96 %)

(93 %) (99 %)d e

g

187

226

229

231

233

234

187

225124

227 228

230

232

Abbildung 84. Synthese des vollständig geschützten Rückgrats 234. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Alloc-Cl, TEA, DCM, 0 °C → RT, 2 h; (b) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 4 h, SC; (c) Z-OSu, NMM, MeCN, -15 °C → RT, 5 h; (d) 1 M LiOH, THF, 0 °C → RT, 2 h; (e) TFA, DCM, 0 °C → RT, 2 h, Ausfällen, (f) Boc2O, TEA, DCM, RT, 16 h; (g) HBTU, DIPEA, DMF, RT, 16 h, SC.

Zur Einführung des Löslichkeitsvermittlers wurde zunächst der Methylester von 234 alkalisch

verseift. Obwohl die Fmoc-Gruppe unter den verwendeten Reaktionsbedingungen als stabil

gilt,[245] konnte in der Dünnschichtchromatographie eine quantitative Abspaltung beobachtet

werden, sodass vor der Aufarbeitung erneut geschützt werden musste. Ein vergleichbarer

Effekt ist auch von der Verseifung N-terminal Fmoc-geschützter Monomere bekannt.[246]

Einen möglichen Mechanismus soll Abbildung 85 aufzeigen.

NOH

O

NH

R

OHO

NNH

R

OO

ON

O

O

NH

R

OO

NH

OH

O

NH

R

OH

H2O

-CO2

-

244

234 245 246 247

Abbildung 85. Postulierter Mechanismus für die Fmoc-Abspaltung während der Esterverseifung von 234.

Die Kopplung von 235 mit 2-Morpholinoethylamin (143) wurde zunächst mit HBTU (151)

durchgeführt (Abbildung 86) und führte zu einer mäßigen Ausbeute von 44 %. Daher wurde

ein alternativer Weg gewählt, indem 235 zunächst durch Umsetzung mit DCC und

N-Hydroxysuccinimid in DCM in den entsprechenden N-Hydroxysuccinimidyl-ester über-

führt wurde. Dieser wurde am nächsten Tag bei -15 °C mit dem Amin 143 zum Zielmolekül


98

236 umgesetzt, welches nach Säulenchromatographie mit nunmehr 84 % Ausbeute isoliert

werden konnte.

N

OAlloc

ZBoc Fmoc

Nb

(69 %)

Alloc

ZBoc

OMe

Fmoc

Alloc

ZBoc

OH

Fmoca

(84 %)

234

235

236 Abbildung 86. Vom vollständig geschützten Rückgrat 234 zum C-terminalen Amid 236. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) 1 M LiOH, THF, 0 °C → RT, 2 h; (2) Fmoc-Cl, 0 °C, 1 h, SC; (b) (1) DCC, HOSu, DCM, 0 °C → RT; (2) 4-(2-Aminoethyl)morpholin (143), -15 °C → RT, 4 h, SC.

Nun konnte damit begonnen werden, sukzessiv die sekundären Amine zu entschützen und die

Nukleobasen einzuführen. Den Startpunkt bildete die Fmoc-Gruppe, die durch Umsetzung mit

Diethylamin in DCM abgespalten wurde (Mechanismus siehe Abbildung 61). Die Kopplung

von Guanin-essigsäure 199 wurde zunächst mit HBTU (151) durchgeführt. Da die Ausbeute

mit 53 % aber deutlich hinter den Erwartungen zurückblieb, wurde anschließend das von

Condom vorgeschlagenen Reagenz Brop verwendet, wodurch sich das Ergebnis erheblich

verbessern ließ (Abbildung 87). Dieser Effekt konnte im Folgenden auch bei der Kopplung

der anderen Nukleobasen beobachtet werden.

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

AllocZ

Boc GZ

AllocZ

Boc H

AllocZ

Boc Fmoc

H

ZBoc GZ

AZ

ZBoc GZ

AZ

ZH GZ

AZ

ZCZ GZ

N

N

N

N

N

N

N

b

d

f

a

c

e

(79 %)

(86 %)

(61 %)

(67 %)

(47 %)

(95 %)

236

237

238

239

240

241

242

Abbildung 87. Vom komplett aufgebauten Rückgrat 236 zur komplett geschützten PNA 242. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) DEA, DCM, RT, 1.5 h, SC; (b) GZ-AcOH (199), Brop, TEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (c) Pd[P(Ph)3]4, DEA, DCM, 0 °C → RT, 1 h, SC; (d) AZ-AcOH (190), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h, SC; (e) TFA, HSiEt3, DCM, 0 °C → RT, 2 h, Ausfällen; (f) CZ-AcOH (192), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h, Ausfällen, RP-HPLC.


99

Im nächsten Schritt wurde die Alloc-Schutzgruppe Palladium-katalysiert entfernt, um darauf-

hin Adenin-essigsäure 190 an das Rückgrat von 239 zu koppeln. Während die Einführung der

ersten Nukleobase noch in DCM durchgeführt werden konnte, musste hier bereits das deutlich

polarere DMF als Lösungsmittel verwendet werden. Auch die abschließende Säulenchromato-

graphie erforderte stark polare Bedingungen, sodass ein Stufengradient ausgehend von einer

Ethylacetat/Methanol-Mischung hin zu purem Methanol verwendet wurde. Die Zielverbin-

dung 240 konnte mit einer Ausbeute von 67 % isoliert werden, die somit knapp 20 % unter

der vorangegangenen Kopplung lag.

Schließlich wurde die Boc-Gruppe durch Behandlung mit TFA in DCM abgespalten. Die

hierbei entstehenden reaktiven tert-Butyl-Kationen können durch Eliminierung zu Isobuten

reagieren oder die Nukleobasen in einer Friedel-Crafts-artigen Reaktion alkylieren

(vgl. Abbildung 62). Letzteres wurde durch die Zugabe des Opfernukleophils Triethylsilan

verhindert. Nachdem mit Cytosin die letzte der drei Nukleobasen in das Zielmolekül

eingeführt worden war, erfolgte die Aufreinigung von 242 durch RP-HPLC, da sich das

Rohprodukt auch in purem Methanol nicht mehr lösen ließ und daher eine Reinigung unter

Normalphasen-Bedingungen nicht mehr möglich war. Auch hier war die erreichte Ausbeute

im Vergleich zur vorangegangenen Kopplung um 20 % reduziert. Die finale acidolytische

Abspaltung der drei Z-Schutzgruppen erfolgte durch Umsetzung mit Trifluormethan-

sulfonsäure in TFA (Abbildung 88). Zum Abfangen der entstehenden Carbokationen wurden

Thioanisol und m-Cresol (169) zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von zwei Stunden wurde

das Rohprodukt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt, zentrifugiert und mehrfach mit

Diethylether gewaschen. Damit entsprachen die Reaktionsbedingungen etwa denen, die von

Nielsen in seinen Laboratorien bei der Festphasensynthese verwendet werden. Anschließend

wurde durch RP-HPLC gereinigt und die Zielverbindung in 55%iger Ausbeute isoliert.

N

O

N

O

AZ

Z

CZ GZ

A

H

C G

N

Na

(55 %)

242

224

Abbildung 88. Finale Entschützung zum Trimer 224. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) TFMSA, TFA, m-Cresol, Thioanisol, RT, 2 h, Ausfällen, RP-HPLC.

Eine Alternative zu Trifluormethansulfonsäure ist der ebenfalls stark saure (wasserfreie)

Fluorwasserstoff. Seine Verwendung wurde ausgeschlossen, da er schwerer zu handhaben ist


100

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH2

O

N

N

O

NH2

NH

N

O

Exakte Masse = 947.4335 Summenformel: C38H53N21O9

*4TFA

0 10 20 30 40

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

t (min)

A2

20

und ein deutlich höheres Gefährdungspotential aufweist. Die von Condom verwendete

33%ige essigsaure Bromwasserstoffsäure liefert die jeweiligen Zielmoleküle in Form ihrer

Hydrobromide, welche in der Peptidchemie als stark hygroskopisch gelten.[247] Eine

Palladium-katalysierte hydrogenolytische Abspaltung wurde aufgrund des Fehlens kleinvolu-

miger Hydrierreaktoren hintangestellt.

Abbildung 89 zeigt die Analyse der aufgereinigten Zielverbindung durch HPLC und Massen-

spektrometrie. Das komplette Syntheseschema unter Angabe aller Reaktionsbedingungen und

Ausbeuten ist in Abbildung 90 wiedergegeben.

Abbildung 89. Analyse der tri-PNA 224. – MALDI-TOF-MS-Spektrum (LP, DHB), darin der RP-HPLC-Plot (RP-Amide, 55 °C, 1 ml/min, 5 → 30 %B in 25 min, 30 → 80 %B in 15 min, 6 min 80 %B) und die Strukturfor-mel. Man erkennt den [M+2H]+-Peak.

150

100

50

Int.

(a.u.)

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

949.320


101

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

N

O

XNH

NR2

OR1

Boc OH

Alloc

Alloc

OMe

Alloc

H

Boc

OMeFmoc

Z OH

AllocZ

Boc GZ

AllocZ

Boc H

AllocZ

Boc Fmoc

HZ

Boc GZ

AZ

Z

Boc GZ

AZ

ZH GZ

AZ

ZCZ GZ

AH

C G

N

N

N

N

N

N

N

N

a b

c

i

d

k

m

e

f

(69 %)

(62 %)

(85 %)

o

g

Alloc

ZBoc

OMe

Fmoc

Boc

OMeH

(76 %)

Boc OMe

Boc OMe

Alloc

H

OMeFmoc

OMe

H

Boc

Boc

Boc

Z OMe

HZ OMe

HH OMe

Fmoc

Fmoc

(86 %)

(63 %) (94 %) (91 %)

(96 %)

(93 %) (99 %)d e

g

AllocZ

BocOH

Fmoch

j

l

n

p

(84 %)

(79 %)

(86 %)

(61 %)

(67 %)

(47 %)

(95 %)

(55 %)

187

226

229

231

233

234

235

236

237

238

239

240

241

242

224

187

225124

227 228

230

232

X R2R1

=

X = H, Z, Boc

R1 = H, Boc, Alloc, Fmoc, (geschützte) Nukleobasen-essigsäuren

R2 = OH, OMe, N-CH2-CH2-N(-CH2-CH2-)2O

Abbildung 90. Syntheseschema des C-terminalen Trimers 224 inklusive Reaktionsbedingungen und Ausbeuten; der Kasten erläutert die Notation. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Alloc-Cl, TEA, DCM, 0 °C → RT, 2 h; (b) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 4 h, SC; (c) Z-OSu, NMM, MeCN, -15 °C → RT, 5 h; (d) 1 M

LiOH, THF, 0 °C → RT, 2 h; (e) TFA, DCM, 0 °C → RT, 2 h, Ausfällen, (f) Boc2O, TEA, DCM, RT, 16 h; (g) HBTU, DIPEA, DMF, RT, 16 h, SC; (h) (1) 1 M LiOH, THF, 0 °C → RT, 2 h; (2) Fmoc-Cl, 0 °C, 1 h, SC; (i) (1) DCC, HOSu, DCM, 0 °C → RT; (2) 4-(2-Aminoethyl)morpholin (143), -15 °C → RT, 4 h, SC; (j) DEA, DCM, RT, 1.5 h, SC; (k) GZ-AcOH (199), Brop, TEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (l) Pd[P(Ph)3]4, DEA, DCM, 0 °C → RT, 1 h, SC; (m) AZ-AcOH (190), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h, SC; (n) TFA, HSiEt3, DCM, 0 °C → RT, 2 h, Ausfällen; (o) CZ-AcOH (192), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h, Ausfällen, RP-HPLC; (p) TFMSA, TFA, m-Cresol, Thioanisol, RT, 2 h, Ausfällen, RP-HPLC.


102

4.3.3 Synthese des N-terminalen Trimers

Die Darstellung des N-terminalen Trimers 248 hätte im Prinzip analog zum C-terminalen

Pendant erfolgen können, da es sich auch in diesem Fall um eine Sequenz aus drei

verschiedenen Basen handelte. Ebenso galt es eine freie Ligationsstelle und einen Löslich-

keitsvermittler einzuführen.

Gerade der Löslichkeitsvermittler gab den Ausschlag ein Schema zu entwickeln, das den

Einsatz von geschützten Rückgrat-Einheiten und einer geschützten PNA-Einheit kombiniert.

Denn im Verlauf des Projekts kam die Idee auf, mehr als eine positive Ladung pro Trimer

einzuführen. Tatsächlich bot es sich gerade in diesem Fragment an, da hier die stark hydro-

phobe Fluorsonde platziert ist. Zusätzlich war es beabsichtigt, sich so nah wie möglich an der

originalen PNA-Struktur zu orientieren und somit kein Chiralitätszentrum einzuführen. Dies

gelang durch die Synthese der vollständig N-methylierten Rückgrateinheit 249, deren

N-Methylgruppen intrinsische PNA-Strukturelemente darstellen (Abbildung 91). Eine mögli-

che Variation stellt das N-ethylierte Derivat 250 dar, das die gleichen Anforderungen erfüllt.

Darüber hinaus kann dieser Ansatz auch noch erweitert werden, indem bereits

oligomerisiertes Rückgrat 251 als Startmaterial eingesetzt wird, sodass pro Einheit eine

zusätzliche Ladung zur Verfügung steht. Zuerst wurde die Methylierung von AEG 85 durch

die Umsetzung mit Formalin-Lösung und Ameisensäure nach Leuckart und Wallach erreicht,

allerdings führte die reduktive Aminierungen unter der Verwendung von elementarem

Wasserstoff zu einer deutlich höheren Ausbeute von 75 % im Vergleich zu 41 %.

NR

O

NH

O

NN n

O

NH

NH2 OH

O

NN OH

O

NN OH

NH

R

O

NH

O

NH

NH2 n

a oder b

*2HCl *2HCla: 41 %b: 75 %

85 249 250

251 252

Abbildung 91. N-terminale Löslichkeitsvermittler auf Basis von AEG (85). – Synthese von Me2-Aeg(Me)-OH (249) (oben links), Struktur der Ethyl-Variante 250 (oben rechts) und möglicher Zugang zu höheren Homologen 252 (unten). Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) Formalin-Lsg., Ameisensäure, Rückfluss, 16 h; (2) HCl; (b) (1) Formalin-Lsg., H2O, 0 °C → RT, 1 h; (2) H2, Pd/C.


103

N

N

N

XNH

NR2

OR1

Boc OHAlloc

Alloc

OBnAlloc

H

CZ

OBnFmoc

OH

Alloc GZ

Alloc H

Alloc Fmoc

H GZ

F GZ

F GZ

FCZ GZ

FC G

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OH

FmocBoc

OBnH

Boc OMe

Boc OMe

Alloc

H

OBnFmoc

OBn

H

Boc

Boc

Fmoc

OBn

H

H

OHH

H

254

255

256

257

258

259

260

261

262

263

264

265

248

187

253

228

195

85

Boc

CZ

Boc

CZ

Boc

Boc

Boc

Boc

CZ

CZ

CZ

H

Me

Me

OH

Me

OH

H

H

CZ

85

249

X R2R1

=

X = H, Boc, (Me)2

R1 = H, Me, Alloc, Fmoc, (geschützte) Nukleobasen-essigsäuren, F-Essigsäure

R2 = OH, OMe, OBn

225

Abbildung 92. Syntheseschema für die N-terminale tri-PNA 248. – Der Kasten erläutert die Notation.

Wie aus Abbildung 92 zu ersehen ist, wurde für die Synthese des N-terminalen Trimers 248

neben dem Löslichkeitsvermittler auch Cytosin-Monomer 195 gebraucht, welches bereits im

Rahmen der konvergenten Flüssigphasensynthese synthetisiert worden war. Das benötigte

Alloc-geschützte Fragment 228 war aus der Synthese des ersten Trimers bekannt, sodass es

noch ein Fmoc-geschütztes Fragment zu synthetisieren galt. Dessen Carboxylfunktion würde

im fertigen Trimer der Ligationsstelle entsprechen und sollte als Benzylester geschützt

werden. Benzylester sind ebenso wie Z-Gruppen in stark saurer Lösung instabil, daher sollte

es auch hier möglich sein, die Basen und die Ligationsstelle parallel im letzten Schritt zu ent-


104

schützen. Das freie Rückgrat 85 wurde dazu säurekatalysiert mit Benzylalkohol in Toluol

verestert (Abbildung 93). Die Reaktion wurde am Wasserabscheider durchgeführt, um sowohl

das Kristallwasser der eingesetzten para-Toluolsulfonsäure als auch das durch die Reaktion

entstandene Wasser aus dem Gleichgewicht zu entfernen. Wichtig war es hierbei, nicht nur

die Siedetemperatur des Lösungsmittels von 110 °C zu überschreiten, sondern eine konstante

Temperatur von 135-140 °C zu erreichen, da andernfalls keine Reaktion erfolgte. Die

sukzessive Schützung von primärer und sekundärer Aminofunktion mit der Boc- bzw. der

Fmoc-Gruppe erlaubte es, ausgehend vom Benzylester 253, das vollständig geschützte

Fragment 255 mit einer Ausbeute von 41 % herzustellen. Dieses mäßige Ergebnis ließ sich

auf 73 % verbessern, indem das Produkt der ersten Schützung 250 nicht isoliert, sondern in

einem Eintopf-Verfahren direkt weiter zu 255 umgesetzt wurde.

O

NH

NH2 OH

O

NH

NH2 O

O

NNH

O

O

NH

NH

O

c 48 %

a b

*pTsOH

Boc

Fmoc

73 % 84 %

Boc d

73 %

85 253 255

254

Abbildung 93. Zugang zum Alloc-geschützten Fragment 255. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) BnOH, pTsOH, Toluol, 140 °C, 16 h; (b) (1) Boc2O, TEA, DCM, 0 °C → RT, 5 h, SC; (2) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (c) Boc2O, TEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (d) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC.

Danach wurde die Boc-Gruppe abgespalten und das mit nahezu quantitativer Ausbeute

erhaltene Amino-Fragment 256 HBTU-vermittelt mit der Carboxyl-Komponente 228

gekoppelt (Abbildung 94). Nach säulenchromatographischer Aufreinigung ließ sich das

vollständig geschützte Dimer 253 in 73%iger Ausbeute isolieren. Nun wurde die temporäre

Boc-Schutzgruppe abgespalten und das entstandene Amino-Fragment 254 mit dem Cytosin-

Monomer 195 zum trimeren Produkt 259 umgesetzt. Wie im Falle des C-terminalen Trimers

234 kam es hierbei zu einem Einbruch der Kopplungsausbeute, die mit 65 % wiederum gut

10 % unter dem Wert für die Kopplung zum Dimer lag.


105

Boc OHAlloc

Alloc

OBnAlloc

H

CZ

OBn

Fmoc

OH

Alloc FmocOBn

FmocBoc

OBnH

Boc OMeAlloc

OBnFmoc

Boc

Fmoc

255

256

257

258

259

228

195Boc

CZ

Boc

(86 %)(85 %)

(73 %)

(100 %)

(65 %)

a b

c

d

c

225

Abbildung 94. Aufbau von Dimer 257 und Trimer 259. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) 1 M LiOH, THF, 0° → RT, 2 h; (b) TFA, DCM, 0° → RT, 2 h, Ausfällen; (c) HBTU, DIPEA, DMF, RT, 16 h, SC; (d) TFA, HSiEt3, DCM, 0 °C → RT, 2 h.

Hiernach wurde die Fmoc-Gruppe durch Umsetzung mit Diethylamin entfernt und die so

freigesetzte sekundäre Aminofunktion Brop-vermittelt mit Guanin-essigsäure 199 gekoppelt

(Abbildung 95). Die erzielten Ausbeuten entsprachen mit 88 bzw. 72 % den Erwartungen.

Hingegen waren die Ergebnisse der folgenden Abspaltung der Alloc-Gruppe aufgrund der

geringen Ausbeute nicht zufriedenstellend, sodass nach Alternativen zu den von Condom vor-

geschlagenen Bedingungen gesucht wurde.

Alloc GZ

Alloc H

H GZ

OBn

OBn

OBn

OBn

259

260

261

262

CZ

Boc

CZ

Boc

Boc

Boc

CZ

CZ

(86 %)

(72 %)

(57 %)

a

b

c

Alloc Fmoc

Abbildung 95. Von Trimer 259 zu 263. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) DEA, DCM, RT 1.5 h; (b) GZ-AcOH (199), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h; (c) Pd[P(Ph)3]4, DEA, DCM, RT, 1.5 h.

Hierbei half ein Blick auf den Mechanismus der Palladium-katalysierten Abspaltung.[248] Als

katalytisch aktive Spezies wird näherungsweise ein koordinativ ungesättigter Palladium(0)-

Komplex wie z.B. Pd(0)L2 angenommen, der im ersten Schritt an die Doppelbindung

koordiniert, bevor er als Nukleophil unter Ausbildung eines π-Allyl-Komplexes reagiert

(Abbildung 96). Nach dieser oxidativen Addition erfolgt durch den Angriff des Nukleophils

eine reduktive Eliminierung, bei der der Katalysator zurückgebildet wird.


106

NR2

NR2

Nu

Nu -

Pd(0)

L L

NR2

-

Pd(II)

L L

Pd0L2

+

Abbildung 96. Katalysecyclus der Palladium-vermittelten Alloc-Abspaltung.

Setzt man kein externes Nukleophil als Abfangreagenz hinzu, reagiert das freigesetzte Amin

mit dem π-Allyl-Komplex und es entsteht ein Allylamin als Ergebnis einer decarboxylativen

Umlagerung (Abbildung 97). Dieser Prozess verläuft schneller bei sekundären als bei

primären Aminen. Der Einsatz des sekundären Diethylamis (DEA) als Akzeptor, wie Condom

ihn vorschlägt, führt demnach zu einer Situation, in der Substrat und DEA um die Allyl-

Gruppe konkurrieren. Daher ist es folgerichtig DEA in hohem Überschuss einzusetzen. Auch

die Wahl einer sterisch unanspruchsvollen Verbindung ist sinnvoll, um eine rasche Reaktion

zu begünstigen. Jedoch muss man hinterfragen, ob und wie weit sich die entschützte

PNA (-NR2) überhaupt vom Palladium-Komplex entfernt, bevor es zur reduktiven

Eliminierung kommt, also ob das zugesetzte DEA überhaupt ausreichende Gelegenheit

bekommt, in der gewünschten Art zu wirken.

C

O

O- Pd0L2- CO2

Pd(II)

L LR1R2N R1R2N

+

Abbildung 97. Bildung von Allylaminen in Abwesenheit eines Abfangreagenzes.

Erschwerend kommt hinzu, dass der Allyl-Abfang reversibel ist, da Allylammonium-

Verbindungen in der Lage sind, ihre Allylfunktion auf Nukleophile zu übertragen und es

daher zur Rückreaktion kommen kann (Abbildung 98). Hingegen sind C-Opfernukleophile in

der Lage, die Allylfunktion irreversibel abzufangen. Hier eignen sich CH-acide Verbindungen


107

wie Dimedon (266) (pKa = 5.3) oder N,N’-Dimethylbarbitursäure (267) (pKa = 4.7), die zu

ihren entsprechenden Mono- oder Diallylderivaten reagieren.

NuH Nu

NH

O

NH

NuH

O O

N N

O

OO

EH

EH2C

O

OH EH

C

O

OHEH2

Pd(II)

L LPd

(II)

L L

EH Pd(II)

L L

COO

Pd0 Pd0

- CO2

+ + +

+

mit Nu =

mit Nu = E =

+ + -

- CO2

+ +

-

+

- Pd0L2

R1R2NCO2 R1R2N+H R1R2HN+

R1R2N

R1R2N-

R1R2N

R1R2N R1R2NH R1R2NH+EH-

Nu-

266 267

Abbildung 98. Einfluss des Opfernukleophils auf den Reaktionsverlauf der Alloc-Abspaltung. – Reversible Übertragung von Allylgruppen durch Allylamoniumsalze (oben) und irreversibler Abfang durch CH-acide Verbindungen (unten).

Für die Alloc-Entschützung wurde nachfolgend N,N’-Dimethylbarbitursäure (267) verwendet,

da Dimedon (266) dazu neigt, hydrolytisch stabile Ketoenamine zu bilden. So ließ sich die

Ausbeute in diesem Schritt von 57 auf 88 bzw. 90 % steigern (Abbildung 99). Mit der

folgenden Einführung von F-Essigsäure 70 war der Aufbau der Basensequenz komplett,

sodass die temporäre Boc-Schutzgruppe säurekatalysiert entfernt werden konnte. Das

resultierende Produkt 264 wurde mit dem Löslichkeitsvermittler 249 in Form seines

N-Hydroxysuccinimidyl-esters zum geschützten Trimer 265 umgesetzt. Nach Aufreinigung

durch präparative RP-HPLC konnte dieses mit 46 % Ausbeute isoliert werden.


108

N

N

Alloc GZ

H GZ

F GZ

F GZ

FCZ GZ

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

261

262

263

264

265

Boc

Boc

Boc

CZ

CZ

CZ

H

Me

OHMe

OHH

H

CZ

85

249

(88 %)

(75 %)

(88 %)

(46 %)

a

b

dc

e

(75 %)

Abbildung 99. Einführung von F-Essigsäure 70 und Löslichkeitsvermittler 249. – Reagenzien und Reaktionsbe-dingungen: (a) Pd[P(Ph)3]4, NDMBA, THF, 0° → RT, 2 h; (b) F-AcOH (70), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h; (c) (1) Formalin-Lsg., H2O, 0 °C → RT, 1 h; (2) H2, Pd/C; (d) TFA, HSiEt3, DCM, 0 °C → RT, 2 h; (e) (1) 249, DCC, HOSu, DCM, 0° → RT; (2) 264, -15° → RT, 4 h.

Die nachfolgende Abspaltung der Z-Gruppen und des Benzylesters erfolgte auch hier mit

Trifluormethansulfonsäure in Gegenwart von Thioanisol und m-Cresol (169) in TFA. Die

Ausbeute an F-PNA-Trimer 248 nach Reinigung durch RP-HPLC betrug 56 %; die

Analysedaten sind in Abbildung 100 gezeigt. Die PNA liegt als dreifaches TFA-Salz vor

(vgl. Abbildung 122), was einer Protonierung der beiden Aminen des Löslichkeitsvermittlers

und der Position N3 (pKa = 4.17) des Cytosins entspricht. Die Position N7 des Guanins ist

unter den gegebenen Bedingungen nicht protoniert (pKa = 3.3).[249] Abbildung 101 gibt das

komplette Syntheseschema unter Angabe aller Reagenzien und Reaktionsbedingungen

wieder.


109

Abbildung 100. Analyse der tri-PNA 248. – MALDI-TOF-MS-Spektrum (LP, DHB), darin der RP-HPLC-Plot (RP-Amide, 55 °C, 1 ml/min, 5 → 30 %B in 25 min, 30 → 80 %B in 15 min, 6 min 80 %B) und die Struktur-formel. Man erkennt den [M+2H]+- und den [M+2Na]+-Peak.

972.971

0

200

400

600

800

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

1120.598

N N

NNH

O

NH2

NH

N

O

NH

NNH

NOH

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

*3TFA

Exakte Masse = 970.4333 Summenformel: C41H56F2N16O10

0 10 20 30 40

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

A2

20

t (min)

1200

1000

Int. (a.u.)


110

N

N

N

XNH

NR2

OR1

Boc OHAlloc

Alloc

OBnAlloc

H

CZ

OBnFmoc

OH

Alloc GZ

Alloc H

Alloc Fmoc

H GZ

F GZ

F GZ

FCZ GZ

FC G

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OBn

OH

FmocBoc

OBnH

Boc OMe

Boc OMe

Alloc

H

OBn

Fmoc

OBn

H

Boc

Boc

Fmoc

OBn

H

H

OH

H

H

254

255

256

257

258

259

260

261

262

263

264

265

248

187

253

228

195

85

Boc

CZ

Boc

CZ

Boc

Boc

Boc

Boc

CZ

CZ

CZ

H

Me

Me

OH

Me

OHH

H

CZ

85

249

(86 %)

(86 %)

(86 %)

(85 %)

(85 %)

(73 %)

b'(48 %)

(73 %)

(100 %)

(65 %)

(86 %)

(72 %)

(88 %)

(75 %)

(88 %)

(46 %)

a

b

c d

e f

g

h

g

i

j

k

j

hl

m

n

(75 %)

(56 %)

X R2R1

=

X = H, Boc, (Me)2

R1 = H, Me, Alloc, Fmoc, (geschützte) Nukleobasen-essigsäuren, F-Essigsäure

R2 = OH, OMe, OBn

225

Abbildung 101. Syntheseschema des N-terminalen Trimers 248 inklusive Reaktionsbedingungen und Ausbeuten; der Kasten erläutert die Notation. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) BnOH, pTsOH, Toluol, 140 °C, 16 h; (b) Boc2O, TEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (b’) (1) Boc2O, TEA, DCM, 0 °C → RT, 5 h, SC; (2) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; c) Alloc-Cl, TEA, DCM, 0 °C → RT, 2 h; (d) Fmoc-Cl, DIPEA, DCM, 0 °C → RT, 16 h, SC; (e) 1 M LiOH, THF, 0° → RT, 2 h; (f) TFA, DCM, 0° → RT, 2 h, Ausfällen; (g) HBTU, DIPEA, DMF, RT, 16 h, SC; (h) TFA, HSiEt3, DCM, 0 °C → RT, 2 h; (i) DEA, DCM, RT 1.5 h; (j) GZ-AcOH (199) oder F-AcOH (70), Brop, TEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h; (k) Pd[P(Ph)3]4, NDMBA, THF, 0 °C → RT, 2 h; (l) (1) Formalin-Lsg., H2O, 0 °C → RT, 1 h; (2) H2, Pd/C; (m) (1) 249, DCC, HOSu, DCM, 0 °C → RT; (2) 264, -15 °C → RT, 4 h; (n) TFMSA, TFA, m-Cresol, Thioanisol, RT, 2 h, Ausfällen, RP-HPLC.


111

4.4 NMR-Spektroskopie

4.4.1 PNA und das Rotamer-Problem

Die tertiäre Amidbindung einer PNA-Einheit ist in der Lage zwei verschiedene Konformatio-

nen anzunehmen (Abbildung 102). So kann die Carbonylgruppe des Essigsäure-Linkers

entweder in Richtung des C-Terminus zeigen oder von ihm abgewandt sein. Im ersten Fall

spricht man vom cis-Rotamer, im zweiten vom trans-Rotamer. Dabei ist die Rotation um die

Amidbindung derart gehindert, dass der Austausch zwischen beiden Formen bei Raum-

temperatur langsam im Verhältnis zur NMR-Zeitskala ist. Dies gilt auch für Carbamat-

Schutzgruppen am sekundären Amin. Durch temperaturabhängige 1H-NMR-Messungen an

vier Monomeren und einem Dimer wurde für die Aktivierungsenergie der cis-trans-

Isomerisierung ein Wert von 19±2 kcal mol-1 bestimmt, die Austauschrate bei 37 °C beträgt

0.5-2 s-1.[250]

B

N

O

R

O

NH

Hn N

R

O

NH

Hn

O

BR

N+

O

RR

R

N

O

RR

Abbildung 102. Gehinderte Rotation um die tertiäre Amidbindung (links) und ihre mesomeren Grenzstrukturen.

In Komplexen mit DNA[251, 252], RNA[253] oder einem anderen PNA-Strang[115] liegen alle

tertiären Amide in der cis-Konformation vor, wohingegen Monomere und ungepaarte PNAs

in einem Gemisch aus trans- und cis-Rotameren existieren. Die Anzahl der in Lösung be-

findlichen unterschiedlichen Rotamere lässt sich durch 2n berechnen, wobei n die Anzahl der

PNA-Einheiten ist. In jedem Rotamer erfahren die Kerne eine Änderung ihrer magnetischen

Umgebung und damit ihrer chemischen Verschiebung. Weil diese Änderung abhängig von

der Entfernung des entsprechenden Kerns zum Ursprung der Rotation ist, lassen sich im

Spektrum nicht zwingend alle theoretisch vorliegenden Rotamere beobachten. Beispielsweise

erkennt man bei terminalen Gruppen wie N-Boc meist nur zwei unterschiedliche Signale, die

durch die Rotation des nächstliegenden Amids verursacht werden, obwohl aufgrund der

Sequenzlänge vier oder acht unterschiedliche Rotamere in Lösung vorliegen. Da typischer-

weise bereits diese beiden Signale überlappen, ist der Effekt weiter entfernter Rotations-


112

zentren in einer Linienverbreiterung zu suchen, die oftmals die präzise Integration der

Spektren erschwert. Trotz dieser Effekte sind die NMR-Spektren von Monomeren (n = 1,

2 Rotamere) meist gut interpretierbar, wohingegen die Komplexität der Daten bereits auf der

Stufe des Trimers (n = 3, 8 Rotamere) eine detaillierte Analyse ausschließt. Des Weiteren

entstehen Probleme bei der praktischen Durchführung der Messungen, da das Auftreten von

mehrfachen Signalsätzen die Signalintensität herabsetzt. Daher muss, bei angenommener

gleichmäßiger Population aller Rotamere, entweder eine n-fach höher konzentrierte Probe

bereitgestellt oder die n-fache Messzeit aufgewandt werden. In der Regel sind die verschie-

denen Rotamere aber ungleich populiert, wodurch sich der Aufwand für ein gutes Signal-

Rausch-Verhältnis nochmals erhöht. Dadurch nimmt besonders die Aufnahme von relevanten 13C-NMR-Spektren viel Zeit in Anspruch und entzieht sich damit der Routineanalytik.

Abbildung 103 zeigt Ausschnitte eines 13C-NMR-Spektrums vom geschützten trimeren

Rückgrat 234, das mit 10835 Scans aufgenommen wurde. Trotz dieses hohen Aufwands lässt

sich in vielen Fällen nicht eindeutig zwischen Grundrauschen und Signal unterscheiden. In

den bisherigen Arbeiten zur Flüssigphasen-Synthese kurzer PNAs wurden keine 13C-NMR-

Daten angegeben[234, 235] bzw. diese nicht interpretiert[236, 239]; darüber hinaus wurden die 1H-NMR-Signale nur zum Teil zugeordnet. Im Zuge der in den vorangegangenen Abschnitten

vorgestellten Synthesen kam der Wunsch auf, sich diesem Problem zu nähern, da gerade die

zahlreichen Möglichkeiten zur genauen Analytik als großer Vorteil der Synthese in flüssiger

Phase erkannt wurden.


113

Abbildung 103. 13C-NMR-Spektrum von 234. – Aufgenommen in DMSO-d6 bei 30 °C (100 MHz, 10835 Scans, 40 mg Substanz in 600 µl Lösungsmittel). Die Vergrößerungen zeigen den Bereich der Carbonyl-signale von Amid- bzw. Ester-Funktionen (links) und Carbamat-Funktionen (rechts).

NH

N

OOO

NH

NO

OOO

O

NNH

O

OOO


114

4.4.2 Hochtemperatur-NMR-Spektroskopie

Eine Lösung des beschriebenen Problems versprach die Erhöhung der Messtemperatur, da

hierdurch die Rotationsbarrieren leichter überwunden werden und folglich die Rotationsraten

zunehmen. Daher wurden NMR-Experimente bei variabler Temperatur durchgeführt und die

Änderungen der Linienformen beobachtet. Typischerweise ließen sich dabei im Bereich des

langsamen Austauschs für einen Kern zwei oder mehr breite Linien beobachten, die sich bei

Temperaturerhöhung in einem Übergangsbereich weiter verbreiterten und zunehmend über-

lappten, um schließlich am Koaleszenzpunkt in ein breites flaches Signal überzugehen. Dieses

wurde in einem weiteren Übergangsbereich immer schmaler, bis es schließlich im Bereich des

schnellen Austauschs die Form einer scharfen Linie annahm. Solch ein Experiment wurde

zunächst für das vollständig geschützte Rückgrat 234 durchgeführt, bei dem alle während der

Synthese relevanten Schutzgruppen anwesend sind. Abbildung 104 zeigt Spektrenausschnitte,

die im Abstand von jeweils 10 °C aufgenommen worden sind. Die Ausschnitte zeigen

relevante Signale von Fmoc-, Alloc- und Boc-Schutzgruppe.

Abbildung 104. Ausschnitte aus 1H-NMR-Spektren (250 MHz, DMSO-d6) von 234 bei verschiedenen Temperaturen. – FmocCHarom. und Amid-NHs (links), AllocCH2CH=CH2 (Mitte) und BocCH3 (rechts).


115

Tabelle 2 gibt die im Rahmen der vorliegenden Daten abgeschätzten Temperaturen für

Koaleszenz und schnellen Austausch der drei Schutzgruppen an. Die Koaleszenztemperatur

Tc ist allerdings keine Konstante, sondern eine von der Messfrequenz abhängige Größe, die

sich näherungsweise bei verdoppelter Messfrequenz um 10 °C erhöht.

Tabelle 2. Temperaturen für Koaleszenz und schnellen Austausch der Boc-, Alloc- und Fmoc-Gruppe von 234.

Schutzgruppe Koaleszenztemp. Tc (°C) schneller Austausch (°C)

Boc 40 80

Alloc 60 110

Fmoc 70 110

Man erkennt deutlich, dass die Gruppen unterschiedliche Koaleszenztemperaturen aufweisen,

die sowohl mit den jeweiligen sterischen Eigenschaften als auch mit den Positionen im

Molekül korrelieren. Wie man erwarten kann, hat die sterisch sehr anspruchsvolle Fmoc-

Gruppe mit 70 °C die höchste Koaleszenztemperatur. Betrachtet man nun die verbleibenden

beiden Gruppen isoliert, ist die Boc-Gruppe aufgrund ihrer Struktur unbeweglicher und

sterisch anspruchvoller als die Alloc-Gruppe. Dieser Effekt wird jedoch durch die mit der

Positionierung am C-Terminus gewonnenen Flexibilität derart überkompensiert, dass sie mit

40 °C den geringsten Wert für Tc aufweist. Ab 110 °C kommt es zur thermisch induzierten

Abspaltung der Fmoc-Gruppe, deren Fortgang sich durch das Erscheinen eines Singuletts bei

6.2 ppm verfolgen lässt, das den terminalen olefinischen Protonen des Fmoc-Fulvens

entspricht (vgl. Abbildung 61).

Die Entwicklungen aller Signale der Alloc-Gruppe sind in Abbildung 105 dargestellt. Aus

den zunächst undefinierten Signalen entstehen bei 110 °C genau die Kopplungsmuster, die

man erwarten kann. Auch das Signal-Rausch-Verhältnis des 13C-NMR-Spektrums verbessert

sich durch hohe Messtemperaturen merklich, sodass die Carbonylregion problemlos analysiert

werden kann (Abbildung 106). Eine Analyse des Methylenbereichs (nicht gezeigt) ist wegen

der hohen Anzahl ähnlicher Signale nicht in Gänze möglich.


116

Abbildung 105. Kopplungsmuster der Alloc-Gruppe von 234 bei verschiedenen Temperaturen (1H-NMR, 250 MHz, DMSO-d6).

Abbildung 106. 13C-NMR-Spektren von 234. Aufgenommen in DMSO-d6 bei 30 °C (100 MHz, 10835 Scans, 40 mg Substanz in 600 µl Lösungsmittel) (oben) bzw. 100 °C (63 MHz, 1024 Scans) (unten). Gezeigt ist der Bereich der Carbonylsignale von Amid- bzw. Ester-Funktionen (links) und Carbamat-Funktionen (rechts).


117

Auf dem preprativen Weg zu den freien tri-PNAs wurden neben den vollständig geschützten

tri-AEGs und tri-PNAs auch Hybridmoleküle synthetisiert, in denen die internen Amine teils

frei, teils geschützt und teils mit geschützten Nukleobasen versehen, vorlagen. In Abbildung

107 sind Hochtemperaturspektren eines solchen Hybrids gezeigt. Durch den vergleichsweise

geringen sterischen Anspruch des Alloc- und CZ-Substituenten und das Fehlen eines dritten

lassen sich in diesem Fall gut interpretierbare Spektren schon ab 90 °C erhalten. Hier werden

zwischen 3.5 und 2.7 ppm sogar definierte Kopplungsmuster für das CH2CH2-Motiv des

Rückgrats sichtbar.

Abbildung 107. 1H-NMR-Spektren (200 MHz, DMSO-d6) von Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-OBn (260) bei verschiedenen Temperaturen.

Parallel mit dem Anspruch bei Synthese und Aufreinigung wird auch die Interpretation der

NMR-Spektren mit jeder zusätzlichen Nukleobasen-Einheit kontinuierlich schwieriger, da die

Koaleszenztemperaturen steigen und der Bereich des schnellen Austauschs oft nicht mehr vor

der Zersetzung erreicht wird. Abbildung 108 illustriert dies am Beispiel der beiden Verbin-

dungen 259 und 261, die sich nur durch den Substituenten am C-terminalen Amin

unterscheiden. Während das Spektrum der Fmoc-geschützten PNA 259 bei 110 °C nur einen

Signalsatz zeigt, erkennt man für das GZ-modifizierte Analogon mehrere Signalsätze bzw.

deutlich verbreiterte Linienformen im Methylenbereich.


118

Abbildung 108. Ausschnitte aus 1H-NMR-Spektren (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) von Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (259) (unten) und Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-OBn (261) (oben). – Signale von Nukleobasen, Aromaten und Amid-NHs (links), AllocCH2CH=CH2 (Mitte) und Methylenbereich inkl. FmocCH (rechts).

Abbildung 109 zeigt einige Spektren-Ausschnitte der vollständig geschützten PNA 262.

Betrachtet man den Bereich zwischen 2.0 und 2.2 ppm, welcher der Methylgruppe am Fluor-

aromaten zugeordnet werden kann, lässt sich der gewünschte Effekt beobachten. Ausgehend

von drei verbreiterten Signalen, gelangt man bei geschätzten 70 °C zum Koaleszenzpunkt und

schließlich bei 90 °C zu einem scharfen Signal, wie es unter den gegebenen Bedingungen zu

erwarten ist. Es lohnt sich auch ein Blick auf die Entwicklung der Signale, die von den

N-Methylgruppen des Löslichkeitsvermittlers ausgehen. Änderungen der magnetischen Um-

gebung des Löslichkeitsvermittlers werden primär von der Konformation des Cytosins ausge-

löst und betreffen in ihrer Tendenz alle seine Methylgruppen. Die terminale N,N-Dimethyl-

gruppe besitzt im Vergleich zur internen N-Methylgruppe eine größere Flexibilität bezüglich

ihrer eigenen Rotation und ist auch weiter vom Cytosin entfernt. Bei 30 °C liegt ihr Signal als

Multiplett im Bereich zwischen 2.8 und 2.9 ppm vor. Der Koaleszenzpunkt befindet sich bei

ungefähr 60 °C, sodass bei 70 °C nur ein Signal vorhanden ist, welches bei 90 °C noch einmal

schärfer erscheint. Das Signal der N-Methylgruppe befindet sich Bereich höheren Felds und

erreicht seinen Koaleszenzpunkt und den Bereich des schnellen Austauschs je ca. 20 °C später

und zeigt ein deutlich ausgeprägtes Shift-Shifting: Es befindet sich zunächst links vom


119

DMSO-Signal, kreuzt es bei 70 °C und ist schließlich ab 90 °C rechts von ihm zu erkennen.

Indirekt lässt sich durch diese Betrachtungen die Koaleszenztemperatur des geschützten

Cytosins auf 80 °C abschätzen. Diese deckt sich mit der Analyse der Signale für CZ-C(6)H

und CZ-C(5)H bei 7.82 bzw. 6.91 ppm. Schließlich taucht ab 110 °C bei ca. 4.5 ppm ein

Signal auf, das aus einer nicht bekannten Zersetzung des Moleküls herrührt. Zu diesem Zeit-

punkt hat sich das Spektrum bereits vereinfacht, aber es liegen immer noch breite Signale für

die CH2-Gruppen der Glycin- und Linker-Einheiten (5.1-3.6 ppm) und eine benzylische CH2-

Gruppe (5.20 ppm) vor (Abbildung 110). Zusammenfassend ließ sich die Analyse der

vollständig geschützten PNA 262 vereinfachen. So konnten einige Signale zugeordnet werden

und es war möglich, erste Aussagen über die Koaleszenzpunkte der geschützten Basen bzw.

des Isosters zu treffen. Einer vollständigen Analyse stand die Zersetzung des Moleküls vor

der optimalen Messtemperatur entgegen.

Abbildung 109. Ausschnitte aus 1H-NMR-Spektren (200 MHz, DMSO-d6) von 262 bei verschiedenen Tem-peraturen. – Signale der Nukleobasen und Aromaten (links), der Methylen-Protonen (Mitte) und der Methyl-Protonen inkl. eines Methylen-Signals (rechts).


120

Abbildung 110. 1H-NMR-Spektrum (200 MHz, DMSO-d6) der geschützten N-terminalen tri-PNA 262 bei 110 °C. – Zuordnung der Signale: δ = 8.62 (s(br), div. N+R3); 8.08 (s(br), 1 H, NH); 7.76 (m, 5 H, C-C(6)H, FCHarom., G-C(8)H, 2 × NH); 7.41 - 7.34 (m, 15 H, 10 × ZCHarom., 5 × BnCHarom.), 7.12 (t(br), 1 H, NH); 6.89 (m, 2 H, C-C(6)H, FCHarom.); 5.27 (s, 2 H, OCH2Ph); 5.21 (s, 2 H, OCH2Ph); 5.18 (s(br), 2 H, OCH2Ph); 5.02 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.69 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.24 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.02 (s(br), 4 H, 2 × GlyCH2); 3.63 - 3.20 (m(br), 18 H, 2 × GlyCH2, 3.5 × CH2CH2); darunter das Signal für Wasserreste aus dem LM; 2.90 (t, 3J = 6.0, 2 H, 0.5 × CH2CH2); 2.84 (s, 6 H, N(CH3)3); 2.40 (s, 3 H, NCH3); 2.12 (s(br), 3 H, FCH3).

Abbildung 111 zeigt das Spektrum der C-terminalen geschützten tri-PNA 242. Auch hier fällt

der scharfe Peak bei 4.5 ppm auf, der aus der beginnenden Zersetzung des Moleküls stammt.

Der mehrfache Signalsatz für die Wasserstoffatome an C(2) und C(8) des Adenins weisen auf

eine gehinderte Rotation dieser Nukleobase hin, die sich aus ihrem sterischen Anspruch und

der Position in der Sequenzmitte erklären lässt. Im Gegensatz hierzu liegt das Signal für das

Wasserstoffatom an C(5) des Cytosins als scharfes Dublett vor. Auch die Resonanzen für das

C(6)H des Cytosins und das C(8)H des Guanins lassen nur einen Signalsatz erkennen, obwohl

die Signale überlappen. Diese Situation spiegelt sich auch in der Linienform der Resonanzen

wieder, die von den an die Basen gebundenen Methylengruppen stammen. Es lassen sich drei

Linien unterschiedlicher Höhe und Breite erkennen, die auf Basis der Analyse der aromati-

schen Protonen zugeordnet werden können. Das schärfste und daher intensivste Signal lässt

sich der an das Cytosin gebundenen Methylengruppe zuordnen, das breiteste der drei Signale

sollte vom Methylencarbonyl-Linker am Adenin stammen und das Signal mittlerer Breite und

Intensität vom Linker am Guanin. Zwischen 8.1 und 7.6 und bei 6.4 ppm erkennt man sehr

N N

NNH

O

NH

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

O

F

F

OO

NN

O

O

*2TFA


121

breite Singuletts, welche den diversen und z.T. protonierten NH-Spezies entsprechen und

schwer zu integrieren sind, sodass bei der Angabe von Integralen extrapoliert werden muss.

Abbildung 111. 1H-NMR-Spektrum (200 MHz, DMSO-d6) von tri-PNA 242 bei 110 °C.

Auch von den beiden ungeschützten tri-PNAs 224 und 248 wurden NMR-Spektren bei

variabler Temperatur aufgenommen. Dabei wurde zunächst D2O als Lösungsmittel verwen-

det. Da die chemische Verschiebung des undeuterierten Anteils des Lösungsmittels im Falle

von D2O deutlich stärker temperaturabhängig ist als bei DMSO-d6, wurde nur das Spektrum

bei 30 °C auf das Signal von H2O kalibriert. Aus diesem Spektrum wurde ein prägnantes

Signal gewählt, das auch in den Folgespektren gut zu erkennen war, und dessen chemische

Verschiebung zum Kalibrieren der weiteren Spektren verwendet. Im Falle von tri-PNA 224

wurde dazu das Signal des Acetonitrilrests benutzt, der seinen Ursprung in der HPLC-

Reinigung der Verbindung hat (2.28 ppm); bei tri-PNA 248 kam das Signal der

N,N-Dimethylgruppe (3.04 ppm) zur Anwendung. Auch bei diesen Spektren erschweren

überaus breite Signale für die diversen teils protonierten NH-Spezies die Integration der

Spektren; es muss bei der Angabe von Integralen daher extrapoliert werden.

N

N

O

NH

N

O

N N

NN

NH

O

O

NH

O

NH

NNH

NNH

OOO

ON

OO

N N

NNH

O

NH

O

O

O

O

O

*TFA


122

Betrachtet man nun zunächst den in Abbildung 112 gezeigten Stack-Plot für tri-PNA 248,

erkennt man bei 30 °C und 2.1 ppm einen mehrfachen Signalsatz für F-CH3, welcher bei

90 °C koalesziert und bei 100 °C in einen scharfen Peak übergeht. Parallel hierzu entwickeln

sich die Signale für die beiden aromatischen Protonen des Isosters, welche ab 100 °C jeweils

als Triplett bei 7.2 bzw. 6.9 ppm vorliegen. Auch die Signale für C-C(6)H (7.7 ppm),

C-C(5)H (6.0 ppm) und G-C(8)H (7.6 ppm) verändern sich analog und man kann bei 100 °C

keine Rotamere mehr beobachten. Allerdings erfährt das Triplett bei 7.2 ppm bei 120 °C noch

einmal eine deutliche Reduzierung der Linienbreite, ebenso die Singuletts im Methylen-

Bereich zwischen 5.0 und 3.6 ppm. Im letzteren Fall führt sogar eine nochmalige Erhöhung

der Temperatur auf nunmehr 140 °C zu erheblich schmaleren Linien, sodass auch die beiden

Singuletts bei 4.0 ppm aufgelöst werden können. Mit 140 °C ist aber die thermische Belast-

barkeit des Moleküls erreicht, wie sich an dem neu bei 7.3 ppm auftauchenden Peak erkennen

lässt, der aus einer nicht näher bekannten Zersetzung der PNA herrührt. Zur eigentlichen

Auswertung wurde nachfolgend das Spektrum bei 140 °C ausgewählt (Abbildung 113).

Abbildung 112. 1H-NMR-Spektren (200 MHz, D2O bzw. DMSO-d6) der N-terminalen tri-PNA 248 bei ver-schiedenen Temperaturen. – Signale der Nukleobasen (links) und der restlichen Protonen (rechts).


123

Abbildung 113. 1H-NMR-Spektrum (200 MHz, DMSO-d6) der N-terminalen tri-PNA 248 bei 140 °C. – Zuordnung der Signale: δ = 7.63 (d, 3J = 7.4, 1 H, C-C(6)H); 7.57 (s, 1 H, G-C(8)H); darunter (s(br), 3 H, 3 × Amid-NH); 7.16 (t, 3J = 8.7, 1 H, F-CHarom.); 6.89 (t, 3J = 9.8, 1 H, F-CHarom.); 6.21 (s(br), div. HN+R3, COOH); 5.96 (d, 3J = 7.4, 1 H, C-C(5)H); 4.88 (s, 2 H, CH2); 4.65 (s, 2 H, CH2); 4.15 (s, 2 H, CH2); 4.04 (s, 2 H, CH2); 4.02 (s, 2 H, CH2); 3.65 (s, 2 H, CH2); 3.58 - 3.17 (m, 16 H, 3.5 × CH2CH2, CH2); 2.85 (s, 6 H, N(CH3)2); darunter (m, 2 H, 0.5 × CH2CH2); 2.37 (s, 3 H, CH3); 2.17 (s, 3 H, CH3).

Die C-terminale tri-PNA 224 unterscheidet sich von ihrem N-terminalen Pendant 248 durch

die Endmodifizierungen und die mittlere Nukleobase, die hier das – im Vergleich zum

Thymin-Isoster F – sterisch anspruchsvollere Adenin ist. Dies hat zur Folge, dass auch bei

140 °C die Koaleszenztemperatur für keine der drei Nukleobasen erreicht ist und sich

mehrfache Signalsätze für die charakteristischen Signale A-C(8)H (8.2 ppm), A-C(2)H

(8.0 ppm), C-C(6)H (7.7 ppm), G-C(8)H (7.6 pm) und C-C(5)H (6.0 ppm) beobachten lassen

(Abbildung 114). Auch hier wurde zur eigentlichen Analyse das Spektrum bei 140 °C

herangezogen (Abbildung 115).

N N

NNH

O

NH2

NH

N

O

NH

NNH

NOH

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

*3TFA


124

Abbildung 114. 1H-NMR-Spektren (200 MHz, D2O bzw. DMSO-d6) der C-terminalen tri-PNA 224 bei ver-schiedenen Temperaturen.

Abbildung 115. 1H-NMR-Spektrum (200 MHz, DMSO-d6) der C-terminalen tri-PNA 224 bei 140 °C. – Zuordnung der Signale: δ = 8.56, 8.22, 8.21, 8.02 (je s, zusammen 2 H, A-C(8)H, A-(C2)H); 7.76 (m, 2 H, C-C(6)H, G-C(8)H); 7.88 (m(br), 3 H, 3 × Amid-NH); 7.92 - 7.17 (m, 20 H, ZCHarom.); 6.88 (m, 1 H, C-C(5)H); 6.42 (s(br), div. HN+R3); 5.12 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.89 (m, 2 H, BaseCH2); 4.57 (s(br), 2 H, BaseCH2); 3.78 - 3.10 (m, 30 H, 2 × NCH2CH2O, 4 × CH2CH2, 3 × GlyCH2).

N

N

O

NH2

N

O

N N

NN

NH2

NH2

O

NH

NNH

NNH

OO

N

OO

N N

NNH

O

NH2

O

*4TFA


125

Die Grenzen der verwendeten Methode liegen in der thermischen Belastbarkeit der analysier-

ten Substanzen und der verwendeten Geräte. Denn Temperaturen oberhalb von 100 °C

schränken nicht nur die Wahl des Lösungsmittels ein, sondern auch die des zu verwendenden

Spektrometers. Von den in Bochum vorhandenen Geräten konnte zunächst das Modell

DRX-250 der Firma Bruker verwendet werden, bis dieses im Laufe der Arbeit einen moder-

nen Probenkopf mit Gradientenspulen erhielt. Die Spezifikationen erlaubten keine weiteren

Messungen oberhalb von ca. 80 °C, demzufolge wurden spätere Messungen am Modell

DPX-200 durchgeführt. Daneben kann es zu chemischen Veränderungen des Analyten

kommen – wie zur Abspaltungen von Schutzgruppen und daraus resultierenden Folgereakti-

onen. Diese chemischen Modifizierungen können zum einen bereits vor dem Erreichen des

schnellen chemischen Austauschs an allen Rotationszentren auftreten. Zum anderen können

sie im Bereich des schnellen Austauschs langsam z.B. während einer 13C-NMR-Messung

stattfinden. Besonders betroffen davon sind Moleküle mit ungeschützten funktionellen

Gruppen wie das aus 234 gewonnene Carbonsäurederivat 235. Während vom Methylester 234

sogar ein 13C-NMR-Spektrum bei 100 °C aufgenommen werden konnte (Messzeit ca. 1 h),

setzte die Abspaltung der Fmoc-Gruppe aus 235 so rasch ein, dass nicht einmal ein Protonen-

Spektrum gewonnen werden konnte. Der Mechanismus der Abspaltung folgt vermutlich dem

in Abbildung 85 dargestellten Weg.


126

4.4.3 19F-NMR-Spektroskopie

In den letzten Jahren haben sich 19F-NMR-Sonden zu einem wertvollen Werkzeug bei der

Analyse von DNA- und RNA-Sekundärstrukturen entwickelt (siehe 3.1), da 19F eine hohe

Empfindlichkeit gegenüber Änderungen der supramolekularen Umgebung besitzt und z.B.

darüber Auskunft gibt, ob ein Nukleinsäurestrang gepaart oder ungepaart vorliegt (Abbildung

116, siehe auch Abbildung 37).

Abbildung 116. Beispiel für den Einfluss der supramolekularen Umgebung auf die chemische Verschiebung von 19F-Kernen.[197] – P = 2-Aminopurin, F = 2,4-Difluorphenyl; F(2) (rechts) und F(4) (links). Das H-F-entkoppelte 19F-NMR-Spektrum wurde der Originalarbeit entnommen.

19F ist wie das Proton und 13C ein Kern mit dem Spin ½ und koppelt mit diesen (Abbildung

117), was besonders im Falle komplexer oder hochsymmetrischer Moleküle zu Kopplungs-

mustern höherer Ordnung führen kann (siehe auch Abbildung 43 und Abbildung 44). In

konjugierten π-Systemen kann man Kopplungen über bis zu sieben Bindungen beobachten;

beispielsweise beträgt 6J(F-H) im para-Fluortoluol noch 1.1 Hz.[254] Ferner gibt es

Kopplungen durch den Raum mit Kopplungskonstanten von bis zu 15 Hz.

F

H

F

H

F

H

F

FF

F

F

F

3J(H,F) = 9.0 Hz 4J(H,F) = 5.7 Hz 5J(H,F) = 0.2 Hz 3J(F,F) = 21 Hz 4J(F,F) = 7 Hz 5J(F,F) = 18 Hz

Abbildung 117. Charakteristische Werte für H-F- und F-F-Kopplungskonstanten.[216]

5’-d(GCGCPFAGTCG)-3’

3’-d(CGCGTATCAGC)-5’

5’-d(GCGCPFAGTCG)-3’


127

Um die resultierenden Spektren zu vereinfachen, wird daher oft unter 1H-Breitband-

Entkopplung gemessen, was in Bochum nur mit einem speziellen Probenkopf am Gerät

DRX-250 möglich ist. Als Beispiel zeigt Abbildung 118 daher das nicht 1H-Breitband-

entkoppelte 19F-NMR-Spektrum des brommethylierten Difluortoluols 92. Darunter sieht man

eine Analyse des Kopplungsmusters (Abbildung 119).

Auch in 19F-NMR-Spektren lassen sich bei Raumtemperatur Rotamere beobachten. Dies ist

unten am Beispiel der Monomere Fmoc-Aeg(F)-OMe (135a) und Fmoc-Aeg(F)-OH (128a)

bzw. Fmoc-Aeg(F4)-OH (128b) gezeigt (Abbildung 120 und Abbildung 121). Man erkennt

deutlich den Nutzen der CF3-Gruppe, deren sehr intensives Signal eine chemische

Verschiebung aufweist, die außerhalb des typischen Bereichs für Fluoraromaten (~ -105 ppm

bis -165 ppm) liegt.

Abbildung 118. 19F-NMR-Spektrum (565 MHz, DMSO-d6) von F-CH2Br (92).

F

F

Br


128

Abbildung 119. 19F-NMR-Spektrum (565 MHz, DMSO-d6) von F-CH2Br (92). – Analyse des Kopplungsmus-ters für F(4). Die Beträge der Kopplungskonstanten sind in Hz angegeben.

Abbildung 120. 19F-NMR-Spektren (565 MHz, DMSO-d6) von Fmoc-Aeg(F)-OMe (135a) (unten) und Fmoc-Aeg(F)-OH (128a) (oben).

N

O

O NH

OR

OO

F

F

135a: R = Me128a: R = H


129

Abbildung 121. 19F-NMR-Spektrum (235 MHz, DMSO-d6) von Fmoc-Aeg(F4)-OH (128b). – Die Dehnung zeigt das Signal für F(2).

Abbildung 122. 19F-NMR-Spektrum (235 MHz, DMSO-d6) von Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OH*3TFA (248) – Die Dehnung zeigt das Signal für F(4) (links) und F(2) (rechts).

N

O

O N OH

OO

F

FFF

N N

NNH

O

NH2

NH

N

O

NH

NNH

NOH

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

*3TFA

Allgemeiner Teil 5 Ligation und Replikation

130

5 Ligation und Replikation

5.1 Voruntersuchungen

Der nächste Schritt bestand darin, geeignete Bedingungen für die Ligation der beiden Trimere

224 (A) und 248 (B) zum hexameren Templat 268 (T) zu finden (Abbildung 123). Dabei

wurde ein besonderes Augenmerk auf die Wahl des Kopplungsreagenzes und möglicher

nukleophiler Katalysatoren gelegt.

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

NH ON N

O

NH2

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

NH

NH

NO

ON

N

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

ON N

O

NH2

NH

NH2

NO

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

NH

OH

N

N

O

268 / T

248 / A

224 / B

Abbildung 123. Potentielles Selbstreplikations-System auf der Basis der tri-PNAs 224 und 248. – Grün: nicht-reaktive Löslichkeitsvermittler; gelb: 19F-NMR-Sonden; rot: Ligationsstellen und daraus resultierende zentrale Amidbindung.

Die Autoren der ersten richtungsweisenden Arbeit zur PNA-Ligation benutzten für ihre Expe-

rimente das Kopplungsreagenz EDC und Imidazol-Puffer, nachdem sie festgestellt hatten,

dass die Verwendung von 2-Methylimidazol-Puffer die Oligomerisierung unterdrückt.[171]


131

Dennoch wurde in einer folgenden Studie der gleichen Arbeitsgruppen 2-Methylimidazol-

Puffer verwendet und das fehlgeschlagene Experiment erfolgreich wiederholt.[172] Für die

Synthese von DNA/PNA-Chimären an PNA- und DNA-Templaten wurde hingegen erneut

Imidazol-Puffer verwendet.[255] Die Aufgabe der Imidazole 269 besteht nicht allein in der Re-

gulierung des pH-Werts, sondern vor allem in der nukleophilen Katalyse: Sie reagieren mit

dem zunächst aus EDC und Säure-Komponente 270 gebildeten O-Acylisoharnstoff 271 zu

den weniger hydrolyseempfindlichen Imidazoliden 272, die als effizientes Acylierungsmittel

mit der Amino-Komponente 273 zum Amid 274 reagieren (Abbildung 124).

OHR1

O

NR1

O

N

R2

NH N

R2

R3 NH2

NH N

R2

269

NH

R1

O

R3OR1

O

NH

NH

N+

H

EDC

- EDU270 272 274

269 273

-

+

271

Abbildung 124. Nukleophile Katalyse bei der EDC-vermittelten Knüpfung einer Amidbindung. – Aktivierung der Carbonsäure 270 durch Umsetzung mit EDC zum O-Acylisoharnstoff 271, Reaktion zum Imidazolid 272 und anschließende Acylierung des Amins 273.

Der Einfluss der verwendeten Imidazol-Derivate auf die Kopplungseffizienz templatgesteuer-

ter Reaktionen ist aus den Arbeiten von Orgel zur RNA-Polymerisation wohlbekannt,[69] doch

gibt es bislang keine systematische Untersuchung zum Einfluss verschiedener Imidazole auf

die Ligation von PNA. Eine entsprechende Studie wurde vor 15 Jahren angekündigt, aber bis-

lang nicht veröffentlicht,[171] sodass es sich anbot, diese Lücke durch ein Screening verschie-

dener Aktivierungsreagenzien und Imidazol-Puffer zu schließen. Daher wurde der Effekt von

Imidazol (275), 1-Methylimidazol (276), 2-Methylimidazol (277) und 4(5)-Hydroxymethyl-

imidazol (278) auf die Ligation von A und B zu T durch RP-HPLC und MALDI-TOF-MS

untersucht (Abbildung 125, Tabelle 3); die übrigen Reaktionsbedingungen orientierten sich an

den eben erwähnten Studien. Zum Vergleich wurde auch imidazolfrei mit MOPS-Puffer

gearbeitet. Neben EDC (279) kamen das ebenfalls wasserlösliche Carbodiimid CMC (1) und

das Triazin-basierte Reagenz DMT-MM (280) zum Einsatz. Durch seine beiden Sechsringe

besitzt CMC (1) einen größeren sterischen Anspruch und ist, im Gegensatz zu EDC (279),

durch das quartäre Stickstoff-Atom am Morpholin-Ring nicht in der Lage, cyclische

Strukturen auszubilden (Abbildung 126).


132

N

NH

N

N

N

NH

N

NH OH

C

N

N

N+

O

C

N

N

N

O

N+

N

N

N

OO

*pTsOH *HCl275 276

277 278

1 279

280

Abbildung 125. Eingesetzte Imidazole 275-278 (links), verwendete Carbodiimide 1 und 279 (Mitte) und DMT-MM (280, rechts).

CN N N+

HCl NH N

+

NCH3CH2

NH N+

NCH2CH3

N N+

NCH3CH2 H

Cl

Cl

Cl Cl

CN N N+

HCl N N

+

NCH3CH2 H

279

279

281

281 282 283

Abbildung 126. Strukturen von EDC*HCl in D2O[256] (oben) und in DMSO-d6[257] (unten). – Auch in

gepufferten wässrigen Lösungen liegen cyclische und offenkettige Spezies nebeneinander vor; das Verhältnis ist pH-abhängig.[258]

Die mit Abstand größte Ausbeute an Ligationsprodukt 268 konnte bei der Verwendung von

1-Methylimidazol-Puffer (276) und EDC (279) erreicht werden (Tabelle 3). Erstaunlicherwei-

se war die Reaktion in MOPS-Puffer deutlich effizienter als bei Verwendung der Imidazole

275, 277 und 278, obwohl in diesem Fall keine nukleophile Katalyse möglich ist. Als Neben-

produkt ließ sich in allen Fällen das Guanidinium-Derivat 284 des C-terminalen Trimers 224

identifizieren (Abbildung 127, vgl. Abbildung 60). Beim Einsatz des sterisch anspruchs-

volleren Reagenzes CMC (1) konnte in keinem Fall die gewünschte hexa-PNA 268

nachgewiesen werden.

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH

O

N

N

O

NH2

NH

N

O

NH

NH

N

+

284

Abbildung 127. Nebenprodukt 284 der EDC vermittelten PNA-Ligation.


133

Tabelle 3. Screening unterschiedlicher Reaktionsbedingungen für die Ligation der Trimere 224 und 248 zum Hexamer 268. – Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere, RT, 4 d. Die Ausbeuten wurden durch RP-HPLC-Analyse und UV-Detektion bei 260 nm unter Vernachlässigung von Hyperchromieeffekten bestimmt.

Nr. Puffer Kopplungsreagenz Ausbeute

1 0.4 M Im pH 7.5 0.2 M EDC 5 %

2 0.4 M 1-MeIm pH 7.5 0.2 M EDC 63 %

3 0.4 M 2-MeIm pH 7.5 0.2 M EDC 8 %

4 0.2 M 4-HOCH2-Im pH 7.2 0.2 M EDC 3 %

5 0.2 M MOPS pH 7.0 0.2 M EDC 17 %

6 0.4 M Im pH 7.5 0.2 M CMC -

7 0.4 M 1-MeIm pH 7.5 0.2 M CMC -

8 0.4 M 2-MeIm pH 7.5 0.2 M CMC -

9 0.2 M 4-HOCH2-Im pH 7.2 0.2 M CMC -

10 0.2 M MOPS pH 7.0 0.2 M CMC -

11 0.4 M MOPS pH 7.0 0.2 M DMT-MM 16 %

Die Ligation der beiden Trimere 224 und 248 wurde ferner in wasserfreiem DMF untersucht,

da die PNA-Replikation im Kontext des PACE-Projektes auch in einem hydrophoben

organischen Medium diskutiert wurde, wie es im Inneren von Mizellen vorherrscht

(vgl. 1.4.2). Weil die Zugabe aprotischer organischer Solventien (DMF, 1,4-Dioxan) die

Stabilität von PNA-Duplexen nur wenig beeinflusst,[143] sollten templatierte Reaktionen auch

unter diesen Bedingungen möglich sein. Die Uronium-Kopplungsreagenzien COMU (285)

und HBTU (151) zeigten eine vergleichbare Effizienz, während von den drei verwendeten

Carbodiimid-Reagenzien nur EDC (279) Umsatz zur hexa-PNA 268 zeigte (Abbildung 128,

Tabelle 4).

O

O

N

NC

O

N N+

O

C

N

NPF6

-N

NN

O

N

N+

285 151 286

Abbildung 128. Die Kopplungsreagenzien COMU (285), HBTU (151) und DIC (286) (von links nach rechts).


134

Tabelle 4. Screening unterschiedlicher Kopplungsreagenzien für die Ligation der Trimere 224 und 248 zu Hexamer 268 in DMF. – Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere, 50 mM DIPEA, DMF, RT, 4 d. Die Ausbeuten wurden durch RP-HPLC-Analyse und UV-Detektion bei 260 nm unter Vernachlässigung von Hyperchromieeffekten bestimmt.

Nr. Kopplungsreagenz Ausbeute

1 1.2 eq. COMU 62 %

2 1.2 eq. HBTU 59 %

3 1.2 eq. EDC 22 %

4 1.2 eq. CMC -

5 1.2 eq. DIC -

6 1.2 eq. DIC, 1.2 eq. DMAP -

Analytische Daten für die isolierte hexa-PNA 268 zeigen Abbildung 129 und Abbildung 130,

ein HR-ESI-MS-Spektrum ist im Anhang dargestellt. Die UV-Schmelzkurve der PNA 268

wurde mit der einer analogen DNA 287 verglichen, deren Sequenz d(CTGCAG) sich nur

durch den Ersatz des hydrophoben Isosters durch Thymin unterscheidet. Der experimentell

ermittelte Schmelzpunkt der PNA 268 ist im Vergleich zu dem der DNA 287 um ca. 3 °C

niedriger, obwohl PNA-Duplexe in der Regel deutlich stabiler sind. Darüber hinaus besitzt die

UV-Schmelzkurve der hexa-PNA 268 eine deutlich geringere Steilheit als die der DNA 287

und lässt so auf ein reduziertes Maß an Kooperativität schließen. Beide Befunde lassen sich

mit dem isosteren Ersatz des Thymins durch den Fluoraromaten erklären. So zeigen Untersu-

chungen von Frey und Woski an PNA-15meren, dass der Einbau des strukturell vergleich-

baren Thymin-Isosters 4-Fluorbenzol gegenüber Adenin den Schmelzpunkt ansonsten kom-

plementärer PNA/DNA-Duplexe um 12.2 °C vermindert.[207] Auch die geringe Kooperativität

lässt sich auf den Einbau des Fluoraromaten zurückführen, der in Lösung keine Wasserstoff-

brücken ausbildet, wodurch nur vier der sechs Basenpaare im Duplex auf diese Art stabilisiert

sind. Als Nukleationskeim für die kooperative Helixbildung werden allerdings wenigstens

zwei intakte und benachbarte Basenpaare benötigt. Die Kenntnis des Schmelzpunkts ist von

Bedeutung, da die optimale Reaktionstemperatur natürlicher Replikatoren im Bereich der

Schmelztemperatur der jeweiligen Templatduplexe liegt (vgl. 1.3.2).[77]


135

Abbildung 129. Analyse der hexa-PNA 268. – MALDI-TOF-MS-Spektrum (LP, THAP), darin der RP-HPLC-Plot (RP-Amide, 55 °C, 1 ml/min, 2 min 5 %B, 5 → 40 %B in 35 min, 40 → 80 %B in 10 min, 80 %B → 5 %B in 15 min).

Abbildung 130. UV-Schmelzkurven von hexa-PNA 268 (NcfgcagC, links) und einer vergleichbaren hexa-DNA 287 (5‘-CTGCAG-3‘, rechts). – Bedingungen: 0.25 M Natriumphosphat-Puffer pH 7, 0.1 M NaCl, 1 °C/min.

0 20 40 60 80 100

0.66

0.67

0.68

0.69

Tm = 23.5±0.9 °C

A2

60

T (°C)

hexa-PNA 268

0 20 40 60 80 100

0.44

0.46

0.48

0.50

A2

60

T (°C)

Tm = 26.3±0.3 °C

hexa-DNA 287

0

20

40

60

80

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z

Int.

(a.u.) 1903.197

0 10 20 30 40 50 60

0

5000

10000

15000

20000

A2

60

t (min)


136

5.2 HPLC-Kinetiken

5.2.1 Kalibrierung

Nachdem Kopplungsbedingungen für eine effektive Reaktion gefunden waren, galt es den

zeitlichen Verlauf der Ligationsreaktion zu untersuchen. Hierbei wurde mittels RP-HPLC

analysiert, um Substanz zu sparen. Die bei den Voruntersuchungen entstandene hexa-PNA

268 wurde isoliert, sodass sie weiteren Experimenten in variabler Konzentration zugesetzt

werden konnte. Ein typisches Chromatogramm ist in Abbildung 131 wiedergegeben und zeigt

deutlich den dominierenden Einfluss des Fluoraromaten auf die Retentionszeit.

0 5 10 15 20 25

0

5000

10000

15000

20000

25000

A2

60

t (h)

4.40

7.67

11.6

12.2

12.8

Abbildung 131. Typisches RP-HPLC-Chromatogramm. – Die verschiedenen Peaks wurden isoliert und durch MALDI-TOF-MS zugeordnet: tr = 4.40 min: 224; tr = 7.67 min 224+EDC (284); tr = 11.6 min: 268; tr = 12.2 min: 248; tr = 12.8 min: 248+EDC (288).

Zur Auswertung der Chromatogramme wurde das Verhältnis der Peakflächen von poten-

tiellem Templat 268 und Trimer 248 bestimmt, da beide Substanzen ähnliche Reten-

tionszeiten aufweisen und im Chromatogramm scharfe Signale zeigen. Die Verwendung

dieser internen Kalibrierung macht die Messergebnisse unabhängig von Änderungen der

Probenkonzentration und von Volumenfehlern bei Entnahme, Verdünnung und Auftragung

auf die Säule. Die größte Fehlerquelle bei diesem Vorgehen ist die Differenzbildung der

HPLC-Integrale, um zu einem gegebenen Zeitpunkt die initiale Hexamerzugabe aus der ge-

samten Hexamerkonzentration herauszurechnen. Zur Umrechnung der Peakflächenverhält-

nisse in Konzentrationsverhältnisse wurde eine Kalibrierkurve aufgenommen, indem sechs

Proben mit bekannten Konzentrationen von 248 und 268 gemessen und die Flächen-


137

verhältnisse gegen die Konzentrationsverhältnisse aufgetragen wurden. Wie in Abbildung 132

dargestellt, wurde dabei ein linearer Zusammenhang gefunden.

0 2 4 6 8

0

1

2

3

4

Datenpunkte lineare RegressionK

onz

en

tra

tion

sve

rhäl

tnis

Flächenverhältnis

Abbildung 132. Kalibrierkurve zur Umrechnung von Flächen- in Konzentrationsverhältnisse. – Ergebnis der linearen Regression: f(x) = (-0.02±0.09) + (0.48±0.02) × x. Fitparameter: R2 = 0.9936, SD = 0.1417.

Unter der Annahme, dass tri-PNA A (248) entweder unverbraucht vorliegt oder zur hexa-

PNA T (268) reagiert, gilt:

00 ATAT (14)

[T] = Konzentration von T zum Zeitpunkt t

[A] = Konzentration von A zum Zeitpunkt t

[T]0 = Ausgangskonzentration von T

[A]0 = Ausgangskonzentration von A

Das Konzentrationsverhältnis κ lässt sich daher wie folgt ausdrücken:

TTA

T

A

T

00 (15)

Durch Auflösen nach [T] lässt sich aus der Kenntnis der Ausgangskonzentrationen und des

Konzentrationsverhältnisses die tatsächliche Konzentration zum Zeitpunkt t berechnen:

1

)AT(T 00

(16)


138

5.2.2 Auswertungsverfahren

Die Auswertung der experimentellen Daten erfolgte mit Hilfe des Programms SimFit

(Nonlinear Fitting by Dynamic Simulation), das die Berechnung theoretischer Konzen-

trations-Zeit-Kurven durch dynamische Simulation mit der Kurvenanpassung durch nicht-

lineare Regression kombiniert.[185] Grundlage der Analyse der Reaktionskinetiken waren zwei

Reaktionsgleichungssysteme, die nachfolgend als A-Fitting (zwei Parameter) und B-Fitting

(drei Parameter) bezeichnet werden. Das A-Fitting bezieht neben einem nicht katalysierten

Reaktionskanal (k1, Gleichung 17) zwei Abklingprozesse ein, für die jeweils die gleiche

Geschwindigkeitskonstante k2 angenommen wird (Gleichung 18 und 19).

T BA 1 k (17)

X A 2k (18)

Y B 2k (19)

Das B-Fitting enthält zusätzlich einen katalysierten Reaktionskanal, in dem als Folge des

Quadratwurzelgesetzes der Autokatalyse der Koeffizient 0.5 auftritt (Gleichung 20, vgl.

1.3.2). Der Quotient von k3 und k1 entspricht hier somit dem autokatalytischen Überschuss-

Faktor ε, mit dessen Hilfe die Effizienz verschiedener Replikations-Systeme verglichen

werden kann (Tabelle 5, vgl. Gleichung 10).

T 1.5 T 0.5 BA 3 k (20)

Tabelle 5. Auswertung von Selbstreplikations-Systemen auf Nukleinsäurebasis anhand des autokatalytischen Überschuss-Faktors ε.

System [Bausteine]

(mM)

T

(°C)

Puffer

(1 M)

pH [MgCl2]

(M)

[EDC]

(M)

[T]init.

(%)

ε

(M-1/2)

v. Kiedrowski 1986[72] 10 0 MES 6.15 0.05 0.2 0-8 25

Zielinski u. Orgel 1987[73] 1 5 HEPES 7.5 - 0.06 0-100 340

v. Kiedrowski et al. 1989[75] 4 20 MES 6.15 0.05 0.2 0-40 80

v. Kiedrowski et al. 1991[76] 1 30 HEPES 7.5 - 0.2 0-32 420

Sievers u. v. Kiedrowski 1994

(ApB bzw. BpA)[78, 79]

1 30 HEPES 7.55 - 0.2 0-32 408

354


139

In beiden Modellen berücksichtigen die Abklingprozesse sowohl die Bildung von Nebenpro-

dukten aus EDC und den Trimeren als auch die Hydrolyse des EDCs zum Harnstoff und die

damit einhergehende Desaktivierung der Carbonsäure-Komponente 248. Auch die durch den

entstehenden Harnstoff beeinträchtigte Bildung von Komplexen wird hier miteinbezogen. Da

die EDC-Hydrolyse durch Carbonsäuren katalysiert wird, variiert ihre Geschwindigkeit

vermutlich mit der Konzentration an PNA-Carbonsäure 248 und an Trifluoressigsäure, die

sich in allen Reaktionslösungen befand, weil die PNAs in Form ihrer mehrfachen TFA-Salze

vorlagen. Dieser Zusammenhang wird durch das verwendete Modell allerdings nicht

berücksichtigt.

Wie gut ein Modell mit den Daten übereinstimmt, kann anhand der Fehlerquadratsumme

(RMS) abgelesen werden. Ein Wert von unter 2 % wird als Hinweis auf einen guten Fit

gewertet, ein Wert von 2 % gilt als gut annehmbar und ein Wert zwischen 2 und 5 % als

annehmbar. Zwischen 5 und 10 % spricht man von einem schlechten Fit, während ein RMS-

Wert von über 10 % nicht mehr akzeptiert wird. Allerdings gibt ein Modell mit kleinem

RMS-Wert vor allem dann nicht zwangsläufig die chemische Realität wieder, wenn den

gegebenen Observablen zu viele Variablen gegenüberstehen und daher deutliche Kovarianzen

auftreten. Die Kovarianz cov(k1, k2) zweier variabler Geschwindigkeitskonstanten k1 und k2 ist

ein Maß für ihre Abhängigkeit voneinander und gibt somit Auskunft über die Verlässlichkeit

eines Modells. Bei einer Kovarianz von 0 sind die beiden Variablen völlig unabhängig

voneinander, eine Kovarianz nahe 1 bedeutet indessen, dass ein höherer Wert von k1 ebenfalls

einen höheren Wert von k2 bedingt. Wenn die Kovarianz hingegen nahe -1 ist, führt ein

höherer Wert von k1 zu einem niedrigeren Wert von k2 und umgekehrt. Ein Absolutwert der

Kovarianz von unter 0.9 soll hier als akzeptabel angesehen werden. In diesem Zusammenhang

muss außerdem erwähnt werden, dass die von SimFit angegebenen Fehlergrenzen der

berechneten Geschwindigkeitskonstanten den mathematischen Fehler bei der Simulation,

nicht aber die systematischen experimentellen Fehler berücksichtigen.


140

5.2.3 Ligation und Replikation in Imidazol-Puffern

Zunächst wurden Versuchsreihen bei vier verschiedenen Temperaturen unter der Verwendung

von 1-Methylimidazol-Puffer aufgenommen. Dabei wurden jeweils Reaktionen ohne und mit

zwei verschiedenen initialen Hexamerzugaben verfolgt (Abbildung 133, Tabelle 6). Der

Beitrag des initial zugegebenen Hexamers wurde hier und in allen folgenden Experimenten

herausgerechnet.

Abbildung 133. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 in 1-Methylimidazol-Puffer. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.4 M 1-Methylimidazol-Puffer pH 7.5, 25 µl Ansatzgröße. A: cov(k1, k2) = 0.591, cov(k1, k3) = -0.628 und cov(k2, k3) = 0.205. B: cov(k1, k2) = 0.547, cov(k1, k3) = -0.553 und cov(k2, k3) = 0.337. C: cov(k1, k2) = 0.788, cov(k1, k3) = -0.260 und cov(k2, k3) = 0.335. D: cov(k1, k2) = -0.131, cov(k1, k3) = -0.793 und cov(k2, k3) = 0.814.

0 2 4 6 8 10

0.0

0.4

0.8

1.2

[T] (

mM

)

t (h)

0 % T20 % T30 % T

C 20 °C

0 2 4 6 8 10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 % T16 % T55 % T

[T] (

mM

)

t (h)

D 30 °C

0 20 40 60 80 100

0.0

0.4

0.8

1.2

0 % T20 % T40 % T

[T] (

mM

)

t (h)

A 0 °C

0 5 10 15 20 25

0.0

0.4

0.8

1.2

[T] (

mM

)

t (h)

0 % T20 % T40 % T

B 10 °C


141

Tabelle 6. Kinetische Auswertung der Ligation in 1-Methylimidazol-Puffer. – Die Modelle A’ und B’ vernachlässigen die Abklingprozesse.

Nr. T (°C) Fit RMS (%) k1 (M-1 s-1) k2 (s

-1) k3 (M-3/2 s-1) ε (M

-1/2)

1 0 A 1.17 (2.60±0.05)×10-4 (1.20±0.09)×10-6 - -

2 B 1.20 (2.50±0.07)×10-4 (1.05±0.09)×10-6 (1.7±14.4)×10-5 0.58

3 10 A 1.13 (6.9±0.2)×10-4 (9±4)×10-7 - -

4 A’ 1.21 (6.39±0.08)×10-4 - - -

5 B 0.287 (5.79±0.07)×10-4 (1.3±0.1)×10-6 (3.7± 0.2)×10-3 6.4

6 B’ 0.726 (5.3±0.1)×10-4 - (2.9±0.4)×10-3 5.5

7 20 A 1.79 (1.24±0.09)×10-3 (0.02±2.20)×10-6 - -

8 B 0.999 (9.7±0.5)×10-4 (1±1)×10-6 (9.9± 0.9)×10-3 10

9 30 A 4.27 (4.1±0.4)×10-3 (0.4±2.6)×10-6 - -

10 B 1.23 (2.4±0.1)×10-3 (0.3±1.0)×10-6 (3.9±0.5)×10-2 16

Bei 0 °C hat die initiale Templatzugabe qualitativ keinen Einfluss auf die Geschwindigkeit

oder die Ausbeute der Reaktion. Dies äußert sich bei der kinetischen Modellierung durch

vergleichbare RMS-Werte für das A- und B-Fitting, eine schlecht bestimmte Geschwindig-

keitskonstante für den autokatalytischen Reaktionskanal und einen ε-Wert von 0.58 M-1/2.

Erhöht man die Temperatur auf 10 °C, sind die Datenpunkte in besserem Einklang mit dem

B- als mit dem A-Modell und man erhält einen zehnfach höheren Wert für ε, sodass auf einen

schwachen autokatalytischen Reaktionskanal geschlossen werden kann. Werden keine

Abklingprozesse berücksichtigt, erhält man ähnliche Werte für k1, k3 und ε, während die

entsprechenden RMS-Werte ansteigen (Modell A’ und B’ in Tabelle 6). Die deutlichsten

Änderungen des Reaktionsverlaufs treten durch Zugabe der ersten 20 % Templat auf,

während die Zugabe von weiteren 20 % relativ betrachtet einen geringeren Einfluss hat.

Dieses Verhalten ist in seiner Tendenz typisch für parabolische Replikatoren: Variiert man bei

ihnen die initiale Templatzugabe [T]0 in der Reihe [T]0(1) = 0, [T]0(2) = y, [T]0(3) = 2y und

[T]0(4) = 4y (y = 2-10 %), spiegelt der Konzentrationsverlauf [T] = [T](i) - [T](1) das Ver-

hältnis 1 : 2½ : 4½ wieder.[77] Folglich ist der stärkste relative Einfluss bei der geringsten

initialen Templatzugabe zu finden; der stärkste absolute Einfluss bei der größten Zugabe. Das

Experiment bei 20 °C zeigt hingegen bei der größten Templatzugabe auch den stärksten

relativen Einfluss auf den Konzentrationsverlauf. Bei 30 °C konnte mit 16 M-1/2 der höchste

Wert für den autokatalytischen Überschuss-Faktor ε bestimmt werden. Dieser Befund ist

allerdings mit Vorsicht zu betrachten, da der Verlauf der theoretischen Kurve für das

Experiment bei 55 % Templatzugabe erkennbar von den Datenpunkten nach oben abweicht,

wodurch auch der größte RMS-Wert innerhalb dieser Serie zustande kommt. Als Erklärung


142

kann zum einen die Carbonsäure-katalysierte EDC-Hydrolyse herangezogen werden. Denn

während die Konzentration der PNA-Carbonsäure 248 in allen Experimenten konstant bei

5 mM liegt, korreliert die Konzentration an Trifluoressigsäure mit der Menge des zugesetzten

Templats: Ohne Zugabe von Templat beträgt sie 35 mol/l, bei Zusatz von 16 % Templat

40 mol/l und bei 55 % Templatzugabe schon 52 mol/l. Daher kann angenommen werden, dass

die EDC-Hydrolyse mit steigender initialer Templatzugabe schneller verläuft; ein Umstand,

der im Reaktionsmodell nicht berücksichtigt wird. Zum anderen sind durch die hohe Templat-

konzentration auch größere Fehler bei der Subtraktion der HPLC-Integrale möglich. Es muss

an dieser Stelle angemerkt werden, dass Templatzugaben von mehr als 30 % nur in der frühen

Phase des Forschungsfelds üblich waren, sodass zum Vergleich nur das von Zielinski und

Orgel untersuchte tetramere System auf der Basis modifizierter Ribonukleotide herangezogen

werden kann.[73] Bei diesem wurden nach Zusatz von 25, 50 und 100 % Templat jeweils die

theoretisch erwarteten Steigerungen von Anfangsgeschwindigkeit und Ausbeute beobachtet.

Unter der Annahme, dass in keiner der vier Versuchsreihen nennenswerte Selbstreplikation zu

beobachten war, wurden die Experimente ohne initiale Templatzugabe als Reaktionen zweiter

Ordnung behandelt, um sowohl die Geschwindigkeitskonstanten für die einzelnen Reaktionen

zu ermitteln als auch Ea aus einer Arrhenius-Auftragung zu bestimmen. Hierzu wurde

zunächst die reziproke Konzentration an Trimer A (248) gegen die Zeit aufgetragen und an

die ersten, augenscheinlich linear verlaufenden Datenpunkte eine Gerade angepasst, aus deren

Steigung sich gemäß

ktAA t

0][

1

][

1 (21)

die jeweilige Geschwindigkeitskonstante ablesen ließ. Abbildung 134 zeigt dieses Vorgehen

am Beispiel der Reaktion bei 30 °C.


143

Abbildung 134. Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten gemäß Gleichung 21. – Ergebnis der linearen Regression: f(x) = (202.3±0.8) + [(3.84±0.02) × 10-3] × x. Fitparameter: R2 = 0.9980, SD = 2.3508.

Trägt man nun die logarithmierten Werte der Geschwindigkeitskonstanten gegen die

reziproke Temperatur auf, lässt sich aus der Steigung der resultierenden Geraden die

Aktivierungsenergie bestimmen (Gleichung 22, Abbildung 135).

RT

EAk alnln (22)

3.30x10-3 3.45x10-3 3.60x10-3 3.75x10-3

-9

-8

-7

-6

-5

ln k lineare Regression

ln k

(s-1

M-1)

1/T (K-1)

Abbildung 135. Arrhenius-Auftragung zur Bestimmung der Aktivierungsenergie. – Ergebnis der linearen Regression: f(x) = (22±2) - [(8.5±0.5) × 103] × x. Fitparameter: R2 = 0.9944, SD = 0.1214.

Schema 1 gibt die ermittelten Werte für die Geschwindigkeitskontanten, die Aktivierungs-

energie und die Reaktionsrate an, denen die entsprechenden Werte für die cis-trans-Isomeri-

sierung aus der Literatur[250] gegenübergestellt sind.

0 20 40 60 80

0

1

2

3

4

5

[T] [B]

c (m

M)

t (h)

0.00 1.50x105 3.00x105 4.50x105

200

400

600

800

1000

1/[A

] (M

-1)

t (s)

1/[A] lineare Regression


144

k (Ligation, 0 °C) = (1.78±0.06)×10-4 s-1 M-1 k (Ligation, 10 °C) = (3.19±0.02)×10-4 s-1 M-1 k (Ligation, 20 °C) = (1.68±0.02)×10-3 s-1 M-1 k (Ligation, 30 °C) = (3.84±0.02)×10-3 s-1 M-1 k (Ligation, 37 °C)b = (7.01±0.05)×10-3 s-1 M-1 k (cis-trans, 37 °C)a = 0.5-2 s-1 Ea (Ligation) = 70±4 kJ/mol

Ea (cis-trans)a = 79±8 kJ/mol

ν (Ligation) = 7.01×10-3 s-1 M-1 × (5 mM)2 = 2×10-7 M s-1 ν (cis-trans)a = 1.25 s-1 × 5 mM = 6×10-3 M s-1

Schema 1. Vergleich der experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten für die Ligation und der daraus abgeleiteten Werte für Aktivierungsenergie und Reaktionsrate mit Literaturwerten für die cis-trans-Isomerierung. – ader Literatur entnommen.[250] bextrapoliert.

Während die Aktivierungsenergie einer cis-trans-Isomerisierung und die der Ligation

dieselbe Größenordnung aufweisen, unterscheiden sich die Geschwindigkeitskonstanten bei

37 °C um drei und die entsprechenden Reaktionsraten um vier Größenordnungen zu Gunsten

der Isomerisierung. Trotz dieser Daten ist es schwierig, den Einfluss der gehinderten Rotation

auf eine mögliche templatierte Ligation abzuschätzen: In den bekannten PNA-Komplexen

liegen alle tertiären Amide in der cis-Konformation vor (vgl. 4.4.1), was daher auch für den

potentiellen ternären Komplex ABT und den resultierenden Produkt-Duplex T2 angenommen

werden kann. In beiden Fällen müssen acht oder zwölf Amidbindungen cis-orientiert sein,

abhängig davon, welche Rolle die Konformation der nicht durch H-Brücken gebundenen

Adenin- und Fluoraromat-Reste spielt. Das Ausmaß einer möglichen Präorientierung ist für

das vorliegende System nicht eindeutig bestimmt. Die NMR-Untersuchungen an den

Trimeren 224 und 248 haben gezeigt, dass diese als Rotamerengemisch vorliegen, wobei

keine Aussagen zur energetischen Bevorzugung bestimmter Konformationen gemacht werden

konnten. Aus 1D- und 2D-NMR-Untersuchungen von Chen et al. ist hingegen bekannt, dass

ein nicht-selbstkomplementäres PNA-Oktamer (NAla-gcacagcc-LysC) bevorzugt in der

cis-Konformation vorliegt.[250] Darüber hinaus ist die Kinetik der Komplexbildung nicht

aufgeklärt, z.B. inwiefern ein oder zwei intakte Basenpaare in cis-Konformation als

Nukleationskeime fungieren und Einfluss auf die Rotamerenpopulation sowie auf den

Fortgang der Komplexierung nehmen. Ist dies der Fall, kann die Aktivierungsenergie für die

komplette cis-trans-Isomerisierung eines Oligomers oder eines Komplexes nicht additiv aus

dem Wert einer einzelnen Isomerisierung berechnet werden. Um den möglichen Einfluss

einer Prääquilibrierung der Rotamerenpopulation auf die Ligation zu untersuchen, wurde eine

Lösung der Trimere und des Hexamers (10 bzw. 8 mM) in 1-Methylimidazol-Puffer (0.8 M,


145

pH 7.5) auf zwei Ansätze verteilt. Ein Ansatz wurde 72 h bei -20 °C eingefroren, der andere

verblieb bei Raumtemperatur. Danach wurden beide Ansätze mit dem gleichen Volumen

einer 0.4 M wässrigen Lösung von EDC versetzt und der Reaktionsverlauf bei

Raumtemperatur durch HPLC-Analyse verfolgt und verglichen. Dabei ließen sich keine

Unterschiede feststellen.

Imidazol-Puffer wurde u.a. von Mattes und Seitz in ihren Arbeiten zur templatierten Ligation

komplementärer PNAs verwendet (vgl. 1.4.7).[175, 176] Wie bei den in Tabelle 3 vorgestellten

Screeningexperimenten konnte ohne Templatzugabe nur ca. 6 % an Ligationsprodukt nach-

gewiesen werden. Aufgrund dieser Parallele wurden auch im Rahmen dieser Arbeit

Replikationsexperimente in Imidazol-Puffer durchgeführt, wobei die Reaktionstemperaturen

mit 0 bzw. 10 °C den hier vorliegenden kürzeren Sequenzen und der Fehlpaarung angepasst

wurden (Abbildung 136, Tabelle 7). Qualitativ betrachtet weisen die Konzentrationsverläufe

mit und ohne Templatzugabe deutlichere Unterschiede auf, als es bei Verwendung von

1-Methylimidazol der Fall ist (Abbildung 133). Dies wird durch die kinetische Auswertung

bestätigt: Sowohl bei 0 als auch bei 10 °C führt das B-Modell zu einer besseren Anpassung an

die Datenpunkte als das A-Modell und für den autokatalytischen Überschuss-Faktor ε können

Werte von 12 bzw. 33 M-1/2 ermittelt werden. Den größten Effekt des Templats zeigt somit die

Versuchsreihe bei 10 °C. Generell haben niedrige Temperaturen einen positiven Einfluss auf

die Effizienz der Ligation, wie ein parallel bei Raumtemperatur durchgeführtes Experiment

zeigt. Hier erreicht die Produktbildung deutlich früher ihre Sättigung als bei 0 bzw. 10 °C, ein

Effekt, der sowohl durch das Fehlen des autokatalytischen Reaktionskanals (ε = 0.14 M-1/2) als

auch die Begünstigung der Nebenreaktionen (EDC-Hydrolyse, EDC-Addukte 284 und 288)

erklärt werden kann. Die Datenpunkte für 30 und 50 % Templatzugabe unterscheiden sich im

Rahmen der angenommenen Messungenauigkeit nicht, was sich wiederum durch die

TFA-katalysierte Hydrolyse des Kopplungsreagenzes und Fehler bei der Subtraktion der

HPLC-Integrale erklären lässt. Betrachtet man die Zeit bis zum 10%igen Umsatz, so ist die

Reaktion ohne Templatzugabe in Imidazol-Puffer zwar deutlich langsamer als in 1-Methyl-

imidazol-Puffer (16 bzw. 10 h), zeigt aber bei Zugabe von Hexamer 268 den größeren

Templateffekt (ε = 33 bzw. 6.4 M-1/2). Daher wurde zu diesem Zeitpunkt als Arbeitshypothese

angenommen, dass eine langsame Kopplung den templatierten Reaktionskanal generell

begünstigt. Aus den Arbeiten zur Selbstreplikation von DNA ist der gegenläufige Effekt be-

kannt. Hier führte die Variation der Verknüpfungschemie ausgehend von der Phosphodiester-


146

über die Pyrophosphat- hin zur Phosphoamidatbindung zu schnelleren und gleichzeitig

effizienteren Replikatoren.[72, 75, 76]

Abbildung 136. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 in Imidazol-Puffer. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.4 M Imidazol-Puffer pH 7.5, 25 µl Ansatzgröße. 0 °C: cov(k1, k2) = 0.641, cov(k1, k3) = 0.229 und cov(k2, k3) = -0.558. 10 °C: cov(k1, k2) = 0.501, cov(k1, k3) = -0.153 und cov(k2, k3) = 0.740. RT: cov(k1, k2) = -0.670, cov(k1, k3) = -0.968 und cov(k2, k3) = 0.833.

Tabelle 7. Kinetische Auswertung der Ligation in Imidazol-Puffer.

Nr. T (°C) Fit RMS (%) k1 (M-1 s-1) k2 (s

-1) k3 (M-3/2 s-1) ε (M

-1/2)

1 0 A 1.75 (4.5±0.4)×10-4 (5±1)×10-6 - -

2 B 0.977 (3.3±0.2)×10-4 (5.5±0.6)×10-6 (3.7±0.5)×10-3 12

3 10 A 4.06 (7±1)×10-4 (5±2)×10-6 - -

4 B 1.35 (3.6±0.2)×10-4 (5.7±0.6)×10-6 (1.18±0.09)×10-2 33

5 RT A 0.112 (6.7±0.1)×10-4 (1.72±0.03)×10-5 - -

6 B 0.130 (6.6±0.5)×10-4 (1.69±0.07)×10-5 (0.09±4.90)×10-3 0.14

0 10 20 30

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

[T] (

mM

)

t (h)

0 % T, 0 °C30 % T, 0 °C50 % T, 0 °C 0 % T, RT

A

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6B

[T] (

mM

)

t (h)

0 % T, 10 °C30 % T, 10 °C50 % T, 10 °C 0 % T, RT


147

5.2.4 Ligation und Replikation in Sulfonsäure-Puffern

Die oben dargestellten Experimente zeigten einen merklichen Einfluss des verwendeten

nukleophilen Katalysators auf die Reaktionsgeschwindigkeit und die mögliche Templatierung

der Ligation. Daher wurden nun der nukleophile Katalysator und weitere Reaktionsbe-

dingungen variiert. Ziel war es einerseits, den postulierten termolekularen Komplex zu

stabilisieren, zumal schon die in Abbildung 130 gezeigte Schmelzkurve des Hexamers keinen

definierten Schmelzpunkt erkennen ließ. Andererseits sollte die Ligationsgeschwindigkeit

weiter herabgesetzt werden, da als Hypothese angenommen wurde, dass dies den

templatierten Reaktionskanal begünstigt (s.o.).

Da nicht alle potentiellen nukleophilen Katalysatoren wie Imidazol auch als Puffersubstanz

dienen können, galt es zunächst einen geeigneten Puffer auszuwählen, dem anschließend die

jeweiligen Katalysatoren zugesetzt werden sollten. Hierzu wurden Ligationen in MOPS- und

HEPES-Puffer in An- und Abwesenheit von Imidazol bzw. 1-Methylimidazol durchgeführt

(Abbildung 137, Tabelle 8). Um eine effektive Pufferung zu erreichen, wurde als pH- der

jeweilige pKa-Wert der Puffersubstanz gewählt. Ohne Zusatz eines nukleophilen Katalysators

ließ sich für die Ligation in HEPES-Puffer bei 10 °C nur ein sehr geringer Templateffekt

ausmachen (ε = 5 M-1/2), für die analoge Reaktion in MOPS-Puffer hingegen der bislang

deutlichste (ε = 91 M-1/2). In Anwesenheit von Imidazol konnten für beide Puffersysteme

ähnlich starke Templateffekte nachgewiesen werden (ε = 59 bzw. 40 M-1/2). Diese Experimen-

te zeigen, dass der Zusammenhang zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Templatierung

komplexer ist, als zunächst angenommen wurde. Denn trotz eines vergleichbaren

Templateffekts verläuft die Imidazol-katalysierte Reaktion in MOPS- wesentlich schneller als

in HEPES-Puffer. Da die Ligation in MOPS-Puffer außerdem zu deutlich höheren Ausbeuten

führt, wurde dieser auch für die folgenden Experimente verwendet. Bei Zusatz von 1-Methyl-

imidazol zeigte sich kein Templateffekt, dafür ergab die entsprechende Reaktion bei

Raumtemperatur mit gut 60 % eine ähnlich hohe Ausbeute wie die Verwendung von

1-Methylimidazol-Puffer (vgl. 5.1). Die kinetische Modellierung der bei Raumtemperatur

durchgeführten Experimente nach dem B-Modell ergab generell starke Kovarianzen und sehr

kleine Werten für ε. Da zudem die RMS-Werte von A- und B-Modell ähnlich sind, kann man

unter diesen Bedingungen nicht von nennenswerter Selbstreplikation ausgehen.


148

Abbildung 137. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 in MOPS- und HEPES-Puffer. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M Puffer (MOPS pH 7.2 oder HEPES pH 7.5), 0.2 M NaCl, C und D: 0.1 M Imidazol, E: 0.1 M 1-Methylimidazol, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = 0.330, cov(k1, k3) = -0.616 und cov(k2, k3) = 0.513; A/RT: cov(k1, k2) = 0.964, cov(k1, k3) = 0.115 und cov(k2, k3) = -0.069. B/10 °C: cov(k1, k2) = 0.490, cov(k1, k3) = -0.307 und cov(k2, k3) = 0.626; B/RT: cov(k1, k2) = -0.835, cov(k1, k3) = -0.971 und cov(k2, k3) = 0.940. C/10 °C: cov(k1, k2) = 0.610, cov(k1, k3) = -0.022 und cov(k2, k3) = 0.749; C/RT: cov(k1, k2) = 1.566, cov(k1, k3) = 0.635 und cov(k2, k3) = -0.493. D/10 °C: cov(k1, k2) = 0.297, cov(k1, k3) = -0.521 und cov(k2, k3) = 0.620; D/RT: cov(k1, k3) = 4.119, cov(k1, k3) = 1.214 und cov(k2, k3) = -1.358. E/10 °C: cov(k1, k2) = -0.179, cov(k1, k3) = -0.746 und cov(k2, k3) = 0.778; E/RT: cov(k1, k2) = 0.045, cov(k1, k3) = -0.721 und cov(k2, k3) = 0.578.

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2[T

] (m

M)

t (h)

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

A HEPES

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2 B MOPS

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0

1

2

3

4E MOPS/0.1 M 1-MeIm

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2

0 % T, 10 °C 10 % T, 10 °C 0 % T, RT

C HEPES/0.1 M Im

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2

0 % T, 10 °C 10 % T, 10 °C 0 % T, RT

D MOPS/0.1 M Im

[T] (

mM

)

t (h)


149

Tabelle 8. Kinetische Auswertung der Ligation in MOPS- und HEPES-Puffer.

Nr. Puffer Kat. T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 HEPES - 10 A 1.08 (2.2±0.2)×10-4 (3.5±0.8)×10-6 - -

2 B 1.05 (2.0±0.2)×10-4 (3.8±0.9)×10-6 (1±1)×10-3 5

3 RT A 2.12 (3.4±0.2)×10-3 (2.8±0.2)×10-5 - -

4 B 2.23 (3.2±0.2)×10-3 (3.0±0.2)×10-5 (2.0±0.2)×10-2 6.7

5 MOPS - 10 A 3.18 (4.2±0.5)×10-4 (3±1)×10-6 - -

6 B 0.864 (1.7±0.1)×10-4 (4.9±0.3)×10-6 (1.55±0.06)×10-2 91

7 RT A 0.359 (9.3±0.1)×10-4 (1.04±0.02)×10-5 - -

8 B 0.359 (9.3±0.5)×10-4 (1.04±0.07)×10-5 (0.1±4.8)×10-4 0.01

9 HEPES Im 10 A 1.70 (1.8±0.3)×10-4 (1±1)×10-6 - -

10 B 0.477 (1.04±0.05)×10-4 (2.8±0.4)×10-6 (5.9±0.3)×10-3 59

11 RT A 0.539 (2.9±0.2)×10-4 (1.1±0.1)×10-5 - -

12 B 0.539 (2.7±0.2)×10-4 (1.21±0.09)×10-5 (3±2)×10-3 11

13 MOPS Im 10 A 2.68 (4.7±0.3)×10-4 (1±6)×10-7 - -

14 B 1.47 (2.5±0.2)×10-4 (8±3)×10-7 (9.9±0.9)×10-3 40

15 RT A 1.10 (5.4±0.2)×10-4 (3.9±0.5)×10-6 - -

16 B 1.10 (5.4±0.2)×10-4 (4.1±0.3)×10-6 (1±2)×10-3 2

17 MOPS 1-MeIm 10 A 1.22 (5.6±0.2)×10-4 (2.5±0.4)×10-6 - -

18 B 1.28 (5.5±0.4)×10-4 (2.2±0.6)×10-6 (0.1±2.1)×10-3 0.2

19 RT A 2.14 (3.50±0.08)×10-3 (0.5±2.1)×10-7 - -

20 B 1.99 (3.5±0.1)×10-3 (0.3±2.5)×10-7 (2±4)×10-3 0.6

Die Produktverteilung nach zwei Tagen zeigt, dass der Zusatz von Imidazolen die Bildung

von Nebenprodukten bei 10 °C nahezu vollständig und bei Raumtemperatur um wenigstens

die Hälfte zurückdrängt (Tabelle 9). Der Fortgang der Reaktionen wird bei 10 °C oder

Imidazolzugabe nicht durch den Verbrauch des N-terminalen Trimers 248 in Nebenreaktionen

begrenzt. Auch das Guanidinium-Capping des C-terminalen Trimers 224 spielt keine

entscheidende Rolle (Daten nicht gezeigt). Wahrscheinlicher ist die Limitierung durch

Carbonsäure-katalysierte EDC-Hydrolyse.


150

Tabelle 9. Produktverteilung der Ligation in MOPS- und HEPES-Puffer ohne initiale Templatzugabe nach zwei Tagen Reaktionszeit. – Das Nebenprodukt mit der Masse 1200 konnte nicht zugeordnet werden, aufgrund seiner Retentionszeit kann angenommen werden, dass es den Fluoraromaten enthält (vgl. 5.2.1).

Nr. Puffer Kat. T (°C) 268 (%) 248 (%) 248+EDC (%) M = 1200 (%)

1 HEPES - 10 11 60 20 9

2 RT 23 6 52 19

3 MOPS - 10 14 46 30 10

4 RT 18 7 55 20

5 HEPES Im 10 11 88 < 1 < 1

6 RT 6 69 18 7

7 MOPS Im 10 24 73 1 2

8 RT 18 52 23 7

9 MOPS 1-MeIm 10 28 69 1 2

10 RT 69 11 14 5

Als alternative Zusätze wurden Pyridin (289) und HOAt (290) getestet (Abbildung 139,

Tabelle 10). Beide Substanzen konnten von Richert und Mitarbeitern im Kontext ihrer

Arbeiten zur RNA- bzw. DNA-Primerverlängerung in umfangreichen Screenings als effektive

nukleophile Katalysatoren identifiziert werden.[259-265] In Gegenwart von Pyridin veläuft die

Ligation bei Raumtemperatur mit 69 % Ausbeute an hexa-PNA 268 ebenso effizient wie in

Anwesenheit von 1-Methylimidazol (s.o.). Allerdings ist der Einfluss initialer Templatzugabe

bei 10 °C auf den Reaktionsverlauf gering (ε = 0.19 M-1/2). Dieser Zusammenhang konnte

bereits mehrfach bei den vorangegangenen Experimenten beobachtet werden: Reaktionsbe-

dingungen die bei Raumtemperatur zu einer effizienten Ligation führen, bedingen bei 10 °C

keine oder eine sehr geringen Auswirkung des zugesetzten Hexamers. Ist der Templateffekt

indessen unter den gegebenen Bedingungen ausgeprägter, erhält man nach einem Tag bei

10 °C mehr Hexamer als bei Raumtemperatur. Die mit Abstand schnellsten und effizientesten

Ligationen konnten bei Zusatz des O-Nukleophils HOAt beobachtet werden. So wurden

bereits nach einer halben Stunde Reaktionszeit 30-40 % neu gebildetes Hexamer nach-

gewiesen. Als Ausnahme zum oben Gesagten war hier trotz effizienter Ligation bei Raum-

temperatur die Ausbeute nach einem Tag bei 10 °C größer. Betrachtet man die in Abbildung

138 dargestellten Messpunkte, erkennt man außerdem einen tendenziell negativen Effekt der

zugesetzten hexa-PNA auf die Reaktionsgeschwindigkeit und die Ausbeute.


151

Abbildung 138. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 unter Pyridin- bzw. HOAt-Katalyse. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.2, 0.2 M NaCl, A: 0.1 M Pyridin, B: 0.1 M HOAt, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = 0.168, cov(k1, k3) = -0.627 und cov(k2, k3) = 0.630; A/RT: cov(k1, k2) = 1.568, cov(k1, k3) = 0.970 und cov(k2, k3) = -0.408. B/10 °C: cov(k1, k2) = 0.673, cov(k1, k3) = -0.418 und cov(k2, k3) = -0.355; B/RT: cov(k1, k2) = -1.035, cov(k1, k3) = 0.467 und cov(k2, k3) = -0.465.

Tabelle 10. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer unter Pyridin- bzw. HOAt-Katalyse.

Nr. Kat. T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 Pyridin 10 A 1.32 (5.2±0.2)×10-4 (0.3±5.6)×10-7 - -

2 B 0.622 (3.7±0.1)×10-4 (3±3)×10-7 (6.9±0.7)×10-3 0.19

3 RT A 1.27 (4.44±0.06)×10-3 (7±2)×10-7 - -

4 B 1.27 (4.42±0.05)×10-3 (6±2)×10-7 (0.3±2.1)×10-3 0.07

5 HOAt 10 A 7.64 (3.8±0.2)×10-3 (9±2)×10-6 - -

6 B 7.74 (3.7±0.2)×10-2 (9±2)×10-6 (2.8±0.3)×10-2 0.76

7 RT A 4.40 (9±1)×10-2 (8±1)×10-5 - -

8 B 4.42 (9±1)×10-2 (8±1)×10-5 (7.1±0.5)×10-2 0.8

Als Nächstes wurde der Einfluss verschiedener Salze auf die Ligation untersucht. Im Falle der

natürlichen polyanionischen Nukleinsäuren hat die Zugabe von Salzen erhebliche Auswirkun-

gen auf die Sekundär- und Tertiärstrukturen sowie deren Stabilität, da es die elektrostatische

Abstoßung des negativ geladenen Rückgrats zu kompensieren gilt.[266, 267] Besonders bei

RNA, aber auch bei DNA spielen dabei zweiwertige Magnesium-Ionen eine herausragende

Rolle.[268-270] Da das Rückgrat unmodifizierter PNA keine Ladungen aufweist, ist die

Stabilität von PNA/PNA- und PNA/DNA-Komplexen weitgehend unabhängig von der Salz-

konzentration.[113] Im vorliegenden System sind dagegen sowohl die Bausteine als auch das

potentielle Templat durch die Löslichkeitsvermittler mit positiven Ladungen modifiziert,

0 5 10 15 20 25

0

1

2

3

4

5

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

A 0.1 M Pyridin[T

] (m

M)

t (h)

0 5 10 15 20 25

0

1

2

3

4

5B 0.1 M HOAt

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

[T] (

mM

)

t (h)


152

sodass ein stabilisierender Einfluss verschiedener Anionen möglich scheint. Als Kation wurde

in allen Experimenten Natrium gewählt, das durch die Einstellung des pH-Werts mit

Natronlauge bereits im Puffer vorhanden war; auch Chlorid befand sich in allen Proben, da

EDC in Form seines Hydrochlorids eingesetzt wurde.

Abbildung 139. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 unter dem Einfluss ver-schiedener Salze. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.1 M Imidazol, A: kein Salz, B: 0.2 M NaCl, C: 0.2 M Na2SO4, D: 0.2 M NaI, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = 0.291, cov(k1, k3) = -0.362 und cov(k2, k3) = 0.762; A/RT: cov(k1, k2) = 1.232, cov(k1, k3) = 0.461 und cov(k2, k3) = -0.317. B/10 °C: cov(k1, k2) = 0.342, cov(k1, k3) = -0.386 und cov(k2, k3) = 0.697; B/RT: cov(k1, k2) = 1.185, cov(k1, k3) = 0.321 und cov(k2, k3) = -0.374. C/10 °C: cov(k1, k2) = 0.335, cov(k1, k3) = -0.168 und cov(k2, k3) = 0.853; C/RT: cov(k1, k2) = 1.686, cov(k1, k3) = 0.588 und cov(k2, k3) = -0.632. D/10 °C: cov(k1, k2) = 0.312, cov(k1, k3) = -0.383 und cov(k2, k3) = 0.725; D/RT: cov(k1, k2) = 1.004, cov(k1, k3) = 0.288 und cov(k2, k3) = -0.186.

Ohne zugesetztes Salz und in Gegenwart von zusätzlichem harten Chlorid unterscheiden sich

die Werte für den autokatalytischen Überschuss-Faktor ε kaum (Abbildung 139, Tabelle 11).

Sulfatzusatz führt zum größten Templateffekt innerhalb der Versuchsreihe (ε = 100 M-1/2),

bewirkt aber auch einen Einbruch der Kopplungseffizienz, die sich unter Umständen durch

Beschleunigung der EDC-Hydrolyse erklären lässt. Bei Zugabe des weichen Iodids ist ε mit

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2 0 % T, 10 °C 10 % T, 10 °C 0 % T, RT

C 0.2 M Na2SO4

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2 0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

D 0.2 M NaI

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2 0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

A kein Salz

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2 0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

B 0.2 M NaCl

[T] (

mM

)t (h)


153

94.9 M-1/2 nur wenig kleiner, während der größte Umsatz zum Hexamer beobachtet werden

konnte.

Tabelle 11. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer unter dem Einfluss verschiedener Salze.

Nr. Salz T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 - 10 A 2.65 (3.7±0.4)×10-4 (0.06±1.04)×10-6 - -

2 B 0.674 (1.73±0.08)×10-4 (1.5±0.3)×10-6 (1.11±0.05)×10-2 64.2

3 RT A 0.920 (5.7±0.3)×10-4 (1.2±0.1)×10-5 - -

4 B 0.913 (5.3±0.3)×10-4 (1.3±0.1)×10-6 (5±2)×10-3 10

5 NaCl 10 A 3.02 (4.6±0.5)×10-4 (2±1)×10-6 - -

6 B 0.947 (2.2±0.1)×10-4 (4.3±0.4)×10-6 (1.60±0.08)×10-2 67

7 RT A 1.12 (3.7±0.3)×10-4 (3.2±0.8)×10-6 - -

8 B 0.916 (2.6±0.2)×10-4 (6.2±0.5)×10-6 (2±1)×10-3 6

9 Na2SO4 10 A 3.03 (2.8±0.4)×10-4 (0.05±1.40)×10-6 - -

10 B 1.10 (1.1±0.1)×10-4 (2.0±0.6)×10-6 (1.1±0.1)×10-2 100

11 RT A 0.409 (2.1±0.1)×10-4 (6.0±0.7)×10-6 - -

12 B 0.409 (2.1±0.1)×10-4 (6.0±0.6)×10-6 (0.07±1.10)×10-2 3

13 NaI 10 A 3.52 (4.9±0.5)×10-4 (0.03±1.00)×10-6 - -

14 B 0.782 (1.75±0.09)×10-4 (1.7±0.2)×10-6 (1.66±0.05)×10-2 94.9

15 RT A 1.53 (6.5±0.6)×10-4 (1.2±0.2)×10-6 - -

16 B 1.51 (6.2±0.6)×10-4 (1.2±0.2)×10-5 (3±2)×10-3 5

Da die Carbonsäure-katalysierte EDC-Hydrolyse indirekt als limitierender Faktor der

Ligation bestimmt wurde, lag es nahe, diesem Effekt durch größeren EDC-Zusatz entgegen-

zuwirken. Tatsächlich konnte nach Verdoppelung der EDC-Konzentration von 0.2 auf

0.4 mol/l bei vergleichbarem ε-Wert auch ungefähr die doppelte Menge an Hexamer nachge-

wiesen werden (Abbildung 140, Tabelle 12).


154

Abbildung 140. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 bei zwei verschiedenen EDC-Konzentrationen. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, A: 0.4 M EDC, B: 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.1 M Imidazol, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = -0.316, cov(k1, k3) = -0.814 und cov(k2, k3) = 0.779; A/RT: cov(k1, k2) = 1.377, cov(k1, k3) = 0.596 und cov(k2, k3) = -0.397. B/10 °C: cov(k1, k2) = 0.342, cov(k1, k3) = -0.386 und cov(k2, k3) = 0.697; B/RT: cov(k1, k2) = 1.185, cov(k1, k3) = 0.321 und cov(k2, k3) = 0.374.

Tabelle 12. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer bei zwei verschiedenen EDC-Konzentrationen.

Nr. EDC T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 0.4 10 A 3.18 (9.9±0.7)×10-4 (5±8)×10-7 - -

2 B 0.674 (4.6±0.2)×10-4 (3.9±0.2)×10-6 (3.0±0.1)×10-2 65

3 RT A 0.592 (1.01±0.02)×10-3 (8.5±0.4)×10-6 - -

4 B 0.632 (9.5±0.2)×10-4 (9.3±0.4)×10-6 (6±1)×10-3 6

5 0.2 10 A 3.02 (4.6±0.5)×10-4 (2±1)×10-6 - -

6 B 0.947 (2.2±0.1)×10-4 (4.3±0.4)×10-6 (1.60±0.08)×10-2 67

7 RT A 1.12 (3.7±0.3)×10-4 (3.2±0.8)×10-6 - -

8 B 1.09 (3.5±0.3)×10-4 (3.7±0.7)×10-6 (2±1)×10-3 6

Nakajima und Ikada zeigten 1995, dass die Aktivierung einer Carbonsäure durch EDC am

effektivsten bei pH 3.5-4.5 verläuft, während die optimale Bildung der Peptidbindung bei

pH 4-6 stattfindet.[271] Da EDC besonders schnell im sauren pH-Bereich hydrolysiert wird,

werden EDC-vermittelte Kopplungen von Peptiden und Proteinen bevorzugt bei pH 4.5-7.5

durchgeführt.[272] Bei noch höheren pH-Werten sinkt die Reaktionsgeschwindigkeit und die

Ausbeute bricht ein. Tatsächlich findet auch die PNA-Ligation im untersuchten System mit

sinkendem pH-Wert schneller und effektiver statt (Abbildung 141). Betrachtet man den

autokatalytischen Überschuss-Faktor, so tritt mit ε = 112 M-1/2 der größte Templateffekt bei

pH 6.6 auf, der kleinste mit ε = 40 M-1/2 bei pH 7.2 (Tabelle 13).

0 5 10 15 20 25

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

A 0.4 M EDC[T

] (m

M)

t (h)

0 5 10 15 20 25

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

B 0.2 M EDC

[T] (

mM

)

t (h)


155

Abbildung 141. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 bei unterschiedlichen pH-Werten. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer, 0.1 M Imidazol, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = 0.847, cov(k1, k3) = -0.156 und cov(k2, k3) = 0.163; A/RT: cov(k1, k2) = 1.585, cov(k1, k3) = 0.630 und cov(k2, k3) = -0.554. B/pH 7.2: cov(k1, k2) = 0.297, cov(k1, k3) = -0.521 und cov(k2, k3) = 0.620; B/pH 7.6: cov(k1, k2) = 0.342, cov(k1, k3) = -0.386 und cov(k2, k3) = 0.697.

Tabelle 13. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer bei unterschiedlichen pH-Werten.

Nr. pH T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 7.6 10 A 3.02 (4.6±0.5)×10-4 - (2±1)×10-6 -

2 B 0.947 (2.2±0.1)×10-4 (1.60±0.08)×10-2 (4.3±0.4)×10-6 67

3 RT A 1.12 (3.7±0.3)×10-4 - (3.2±0.8)×10-6 -

4 B 1.09 (3.5±0.3)×10-4 (3.7±0.7)×10-6 (2±1)×10-3 6

5 7.2 10 A 2.68 (4.7±0.3)×10-4 - (1±6)×10-7 -

6 B 1.47 (2.5±0.2)×10-4 (9.9±0.9)×10-3 (7±3)×10-7 40

7 RT A 1.10 (5.4±0.2)×10-4 - (3.9±0.5)×10-6 -

8 B 1.10 (5.4±0.2)×10-4 (1±2)×10-3 (4.1±0.3)×10-6 2

9 6.6 10 A - - - - -

10 B 2.65 (4.3±0.8)×10-4 (4.8±0.1)×10-2 (0.07±1.72)×10-6 112

11 RT A 2.03 (1.9±0.1)×10-3 - (0.1±2.6)×10-6 -

12 B 1.37 (1.23±0.08)×10-3 (4.6±0.4)×10-2 (3±1)×10-6 37

Ungeladene wasserlösliche Cosolventien kommen oft zum Einsatz, um Nukleinsäuren und

Peptide unter Bedingungen zu studieren, die lebenden Zellen nachempfunden sind.[273-275]

Denn das Medium in einer Zelle ist sowohl durch die große Konzentration an Biomolekülen

(ca. 300-400 g/l) als auch durch die Hydratation kleiner hydrophiler Moleküle nicht mit einer

wässrigen Lösung vergleichbar.[276-278] Dies führt unter anderem zur Stabilisierung unge-

wöhnlicher DNA/RNA-Strukturen. Um den Einfluss von Cosolventien auf die Stabilität des

0 2 4 6 8 10

0.0

0.5

1.0

1.5

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

[T] (

mM

)

t (h)

A pH 6.6

0 10 20 30

0.0

0.5

1.0

1.5

0 % T, pH 7.210 % T, pH 7.2 0 % T, pH 7.610 % T, pH 7.6

[T] (

mM

)

t (h)

B pH 7.2 und pH 7.6 bei 10 °C


156

postulierten termolekularen Komplexes ABT zu studieren, wurden zwei Versuchsreihen

durchgeführt und den Reaktionsmischungen jeweils 20 % Polyethylenglykol (PEG) mit der

mittleren molaren Masse 400 bzw. 3350 zugesetzt (Abbildung 142, Tabelle 14). Die Zugabe

von PEG400 führt mit einem ε-Wert von 321 M-1/2 zum stärksten Templateffekt, reduziert in

Bezug auf die Vergleichsexperimente aber die Ausbeute an Hexamer um den Faktor zwei bis

drei. Durch Zusatz von 20 % PEG3350 wird dagegen sowohl der Umsatz zum

Ligationsprodukt als auch der Wert des autokatalytischen Überschuss-Faktors (ε = 126 M-1/2)

erhöht. In beiden Fällen konnten nach einem Tag Reaktionszeit bei Raumtemperatur mehr

Nebenprodukte nachgewiesen werden als in Abwesenheit von PEG (Tabelle 15).

Abbildung 142. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 bei Zugabe von PEG – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.2 M NaCl, 0.1 M Imidazol, A: 20 % PEG400, B: 20 % PEG3350, 6 µl Ansatzgröße. A/10 °C: cov(k1, k2) = -0.173, cov(k1, k3) = 0.208 und cov(k2, k3) = 0.895; A/RT: cov(k1, k2) = 1.435, cov(k1, k3) = 0.383 und cov(k2, k3) = -0.626. B/10 °C: cov(k1, k2) = -0.039, cov(k1, k3) = -0.619 und cov(k2, k3) = 0.774; B/RT: cov(k1, k2) = 0.321, cov(k1, k3) = 1.218 und cov(k2, k3) = -0.457.

0 5 10 15 20 25

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6 0 % T, 10 °C14 % T, 10 °C 0 % T, RT

A 20 % PEG400

[T] (

mM

)

t (h)

0 5 10 15 20 25

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6 0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C 0 % T, RT

B 20 % PEG3350

[T] (

mM

)

t (h)


157

Tabelle 14. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer bei Zugabe von PEG. – Die ersten Zeilen geben zum Vergleich das entsprechende Experiment ohne PEG-Zugabe wieder (s. Abbildung 139 u. Tabelle 11).

Nr. PEG T

(°C)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 - 10 A 3.02 (4.6±0.5)×10-4 (2±1)×10-6 - -

2 B 0.947 (2.2±0.1)×10-4 (4.3±0.4)×10-6 (1.60±0.08)×10-2 67

3 RT A 1.12 (3.7±0.3)×10-4 (3.2±0.8)×10-6 - -

4 B 1.09 (3.5±0.3)×10-4 (3.7±0.7)×10-6 (2±1)×10-3 6

5 400 10 A 3.79 (2.7±0.7)×10-4 (0.05±3.00)×10-6 - -

6 B 0.603 (4.2±0.5)×10-5 (2.0±0.5)×10-6 (1.35±0.06)×10-2 321

7 RT A 0.756 (1.5±0.2)×10-4 (1±2)×10-6 - -

8 B 0.752 (1.5±0.2)×10-4 (2±1)×10-6 (1±2)×10-3 7

9 3350 10 A 4.89 (7.9±0.9)×10-4 (0.3±1.6)×10-6 - -

10 B 1.45 (1.9±0.2)×10-4 (0.06±4.27)×10-7 (2.4±0.2)×10-2 126

11 RT A 1.10 (6.5±0.3)×10-4 (1.3±0.6)×10-6 - -

12 B 1.09 (6.4±0.3)×10-4 (1.5±0.6)×10-6 (0.9±1.2)×10-3 1

Tabelle 15. Produktverteilung ohne initiale Hexamerzugabe in An- und Abwesenheit von PEG nach einem Tag.

Nr. T (°C) PEG 268 (%) 248 (%) 248+EDC (%) M = 1200 (%)

1 10 - 12 83 2 3

2 RT 11 70 7 12

3 10 400 7 84 4 5

4 RT 6 62 10 22

5 10 3350 25 69 3 3

6 RT 19 45 11 25

Die Verdoppelung der Imidazol-Konzentration führt zu einer langsameren Ligation, was sich

durch den Einfluss des Katalysators auf den pH-Wert erklären lässt, hat aber keinen nennens-

werten Einfluss auf die autokatalytische Effizienz (Abbildung 143, Tabelle 16). Auch die

Konzentration der den Fluoraromat enthaltenen Nebenprodukte wird durch die erhöhte

Imidazol-Konzentration nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).


158

Abbildung 143. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 bei unterschiedlichen Imidazol-Konzentrationen. – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des B-Fittings. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.4 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.2, 0.2 M NaI, 6 µl Ansatzgröße. A: cov(k1, k2) = -0.060, cov(k1, k3) = -0.770 und cov(k2, k3) = 0.619. B: cov(k1, k3) = 0.327, cov(k1, k3) = -0.597 und cov(k2, k3) = 0.482.

Tabelle 16. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer bei unterschiedlichen Imidazol-Konzentrationen.

Nr. [Im]

(mM)

Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 0.1 A 3.52 (1.44±0.07)×10-3 (0.3±5.9)×10-7 - -

2 B 0.920 (6.6±0.2)×10-4 (1.1±0.1)×10-6 (3.1±0.1)×10-2 47

3 0.2 A 2.97 (9.6±0.6)×10-4 (2.1±0.8)×10-6 - -

4 B 1.17 (5.0±0.2)×10-4 (5.0±0.3)×10-6 (2.6±0.1)×10-2 52

Die in Abbildung 144 gezeigte Versuchsreihe kombiniert einen leicht sauren pH-Wert mit

einer hohen EDC-Konzentration, um eine schnelle und effiziente Replikation zu begünstigen

(Tabelle 17). Die Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit gegen die Quadratwurzel der

initialen Templatkonzentration (vgl. 1.3.2) zeigt qualitativ sowie auch bei Betrachtung der

Fitparameter keinen linearen Zusammenhang. Weiterhin befinden sich weder die Datenpunkte

noch die theoretischen Kurven in dem für einen parabolischen Replikator erwarteten

Verhältnis von 1 : 2½ :2 (s.o.), sondern verhalten sich z.B. nach 8 h wie 1 : 1.2 : 1.8 bzw.

1 : 1.6 : 2.5. Ein parallel durchgeführtes Experiment, dem 20 % PEG400 zugesetzt wurden,

zeigte gar keinen Umsatz zum Ligationsprodukt.

0 5 10 15 20 25

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C

A 0.1 M Im[T

] (m

M)

t (h)

0 5 10 15 20 25

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 % T, 10 °C10 % T, 10 °C

B 0.2 M Im

[T] (

mM

)

t (h)


159

Abbildung 144. Konzentrations-Zeit-Verläufe der Bildung des PNA-Hexamers 268 bei vier unterschiedlichen intialen Hexamerkonzentrationen (A), parabolische Regression zur Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeiten (B) und deren Auftragung gegen die Quadratwurzel der initialen Hexamerzugabe (C). – Aufgetragen sind die experimentell bestimmten Datenpunkte und die theoretischen Kurven des jeweiligen Fittings (A, B) bzw. die ermittelten Anfangsgeschwindigkeiten und die lineare Regression (C). Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden durch Ableitung der in Teil B angepassten Parabeln ermittelt. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.4 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 6.6, 0.1 M Imidazol, 10 °C, 6 µl Ansatzgröße. A: cov(k1, k2) = 0.288, cov(k1, k3) = -0.635 und cov(k2, k3) = 0.263. B: 0 % T (R2 = 0.9987, SD = 2.4011×10-2), 5 % T (R2 = 1.000, SD = 5.0043×10-2), 10 % T (R2 = 0.9993, SD = 2.1564×10-2) und 20 % T (R2 = 0.9998, SD = 1.1652×10-2). C: f(x) = (4.5±0.5) × 10-8 + [(3.2±0.8) × 10-8] × x (R2 = 0.9444, SD = 5.7212×10-9).

Tabelle 17. Kinetische Auswertung der Ligation bei vier unterschiedlichen intialen Hexamerkonzentrationen.

Nr. Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 A 7.41 (4.6±0.1)×10-3 (2±6)×10-7 - -

2 B 2.56 (1.14±0.05)×10-3 (0.08±1.38)×10-7 (9.2±0.1)×10-2 81

Weitere Ligationen wurden im eutektischen Phasensystem durchgeführt, dessen besondere

Eigenschaften bislang vor allem im Kontext der RNA-Welt-Hypothese untersucht worden

sind.[261, 279-283] Generell werden dazu die entsprechenden wässrigen Lösungen auf eine

Temperatur abgekühlt, die unterhalb des Gefrierpunkts, aber oberhalb des eutektischen Punkts

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.04

5

6

7

8

v0 × 108

lineare Regression

v 0 ×

10

8 (

mol

s-1)

[T]1/2

init. (M)1/2

C

0 5 10 15 20 25

0

1

2

3

4

0 % T 5 % T10 % T20 % T

[T] (

mM

)

t (h)

A B-Fitting

0 2 4 6

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0B parabolisches Fitting

0 % T 5 % T10 % T20 % T

[T] (

mM

)

t (h)


160

liegt. So erhält man ein Zwei-Phasen-System aus Wasser und Wasser-Eis. Die feste Phase

besteht dabei aus reinem Wasser, während die flüssige Phase alle gelösten Stoffe enthält.

Dadurch werden diese im Vergleich zur homogenen Lösung aufkonzentriert (~ Faktor

10-100) und mögliche (Kondensations-)Reaktionen zwischen ihnen begünstigt. Gleichzeitig

wird die Hydrolyse der Reaktionsbausteine, ihrer aktivierten Formen und der resultierenden

Produkte durch die geringere Wasseraktivität und die niedrige Temperatur zurückgedrängt.

Das eutektische Phasensystem favorisiert außerdem die Bildung von Aggregaten und

organisierten Strukturen, die wiederum einen positiven Einfluss auf Kondensation und Poly-

merisation haben. Besonders dieser Aspekt stellte die Motivation dar, die Ligation der beiden

Trimere in der eutektischen Phase zu untersuchen, da die geringe Stabilität des postulierten

termolekularen Komplexes als Ursache für den schwachen Templateffekt angenommen

wurde. Abbildung 145 zeigt, dass sich die Ausbeuten in An- und Abwesenheit von initialem

Templat nach zwei Tagen Reaktionszeit nur wenig unterscheiden. Im Einklang damit steht

das Fitting der Daten nach dem B-Modell, das einen ε-Wert von 16 M-1/2 ergab (Tabelle18).

0 10 20 30 40 50

0.0

0.4

0.8

1.2 0 % T, eutektisch10 % T, eutektisch10 % T, flüssig

-19 °C

[T] (

mM

)

t (h)

Abbildung 145. Zeitlicher Verlauf der Ligation zum Hexamer in der eutektischen Phase. – Aufgetragen sind die experimentellen Datenpunkte und das parabolische Fitting. Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.2 M NaCl, 0.1 M Imidazol, -19 °C, 12 µl Ansatzgröße. cov(k1, k2) = 0.381, cov(k1, k3) = -0.395 und cov(k2, k3) = 0.673. Das blaue Dreieck entspricht einer Probe, in der sich kein Eis gebildet hatte.

Tabelle 18. Kinetische Auswertung der Ligation zum Hexamer in der eutektischen Phase.

Nr. Fit RMS

(%)

k1

(M-1 s-1)

k2

(s-1)

k3

(M-3/2 s-1)

ε

(M-1/2)

1 A 1.45 (2.2±0.1)×10-4 (0.5±3.5)×10-7 - -

2 B 1.02 (1.70±0.09)×10-4 (5±3)×10-7 (2.7±0.5)×10-3 16


161

Eine Carbonsäure kann auch durch die Überführung in den entsprechenden Methylester in ge-

ringem Maße für die Reaktion mit einem Amin aktiviert werden. Die schwache Aktivierung

führt zu einer langsamen Reaktion, die im vorliegenden System den katalytischen Einfluss

des zugesetzten Templats begünstigen sollte. Als potentielle Nebenreaktion wird hier anstelle

der Carbonsäure-katalysierten Hydrolyse des EDCs die Hydrolyse des Methylesters zurück

zur Säure erwartet, die durch die HPLC-Analyse verfolgt werden kann. Methylester wurden

bereits von Luisi und Mitarbeitern bei der Ser-His-katalysierten Kondensation von PNA-

Monomeren in basischem Milieu verwendet (s. 1.4.4).[156] Durch Umsetzung von 248 mit

HATU, DIPEA und Methanol in DMF konnte der in Abbildung 146 dargestellte PNA-

Methylester 291 nach Aufreinigung mittels RP-HPLC in 15%iger Ausbeute erhalten werden.

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

N N

NNH

O

NH2

291

Abbildung 146. PNA-Methylester 291.

Dieser wurde dann mit dem Amino-Fragment 224 in gepufferter wässriger Lösung (0.2 M

MOPS pH 7.2, 0.2 M NaI) bei 10 °C bzw. Raumtemperatur in An- und Abwesenheit des

potentiellen Templats umgesetzt. Nach fünf Tagen Reaktionszeit konnte weder bei

Raumtemperatur noch bei 10 °C das gewünschte Ligationsprodukt nachgewiesen werden.

Eine minimale Hydrolyse des Methylesters 291 wurde nur bei Raumtemperatur festgestellt

und war unabhängig vom zugegebenen Hexamer.

Allgemeiner Teil 6 Zusammenfassung und Ausblick

162

6 Zusammenfassung und Ausblick

6.1 Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Selbstreplikations-System auf der Basis von

PNA entwickelt und synthetisiert. Dieses besteht aus zwei kurzen Fragmenten, deren Ligation

zu einem selbstkomplementären Templat durch verschiedene Peptidkopplungsreagenzien

vermittelt wird. Besonderes Augenmerk wurde auf die Einführung einer Heterokern-NMR-

Sonde gelegt, um das System durch kinetische NMR-Titration analysieren zu können. Da

NMR-Experimente vergleichsweise hohe Substanz-Konzentrationen erfordern, wurde auf

eine hohe Wasserlöslichkeit der Oligomere geachtet. Außerdem wurde eine effektive und

modulare Syntheseroute gefunden, um die benötigten Substanzmengen bereitzustellen und

Sequenz-Variationen zu ermöglichen.

Als Heterokern-NMR-Sonde wurde der 19F-Kern gewählt, da dieser eine Reihe von

wünschenswerten Eigenschaften besitzt: Zum einen reagiert er auf geringe Änderungen der

supramolekularen Umgebung mit einer deutlichen Änderung der chemischen Verschiebung.

Zum anderen weist 19F einen großen chemischen Verschiebungsbereich auf, der die Gefahr

der Signalüberlappung reduziert und die Analyse der Messungen vereinfacht. Im Vergleich zu 1H besitzt er eine nur geringfügig auf 83 % reduzierte Empfindlichkeit und stellt das einzig

natürlich vorkommende Isotop des Elements dar. Dies sollte kinetische NMR-Messungen mit

einer geringen Anzahl von Scans und somit einer hohen Dichte von Messpunkten erlauben.

Das Fluor-Label kann entweder am Rückgrat oder an den Basen lokalisiert werden. Für

letztere Lokalisation sprach, dass die Sonde in direkter räumlicher Nähe zur supramolekularen

Erkennungsstelle gebracht wird. Unter den möglichen Kandidaten wurde für diese Arbeit

2,4-Difluortoluol (F) (71) ausgewählt, da dieses Molekül ein nahezu perfektes Isoster der

natürlichen Base Thymin (72) ist (Abbildung 147).[211, 212]


163

F

F

F

F

OH

O

NH

NH

O

O

72 71 70

Abbildung 147. Die natürliche Nukleobase Thymin (72) und ihr fluoraromatisches Isoster 71; daneben die für den Einbau in PNA benötigte Essigsäure 70.

Für die entsprechende Essigsäure 70 gibt es eine literaturbekannte sechsstufige Synthese bei

der eine Reihe hochtoxischer Stoffe verwendet werden (Abbildung 148).[206] Um diesen

arbeitsintensiven Weg abzukürzen, wurde von 2,4-Difluortoluol (71) ausgehend eine

zweistufige Synthese entwickelt, die aus der Reaktionsfolge Brommethylierung und

Grignard-Reaktion besteht. Dabei wurde die ursprünglich entwickelte Vorschrift zur

Brommethylierung von van der Made und van der Made durch Zugabe der Lewis-Säure Zink-

bromid modifiziert, da der durch die Fluorsubstituenten stark deaktivierte Aromat sonst nicht

zur Reaktion zu bringen ist.[215] Durch die gleiche Sequenz ließ sich auch 1,3-Difluorbenzol

(93), ein Isoster des Uracils (94), in die entsprechende Essigsäure 95 überführen.

F

F

F

F

Br

F

F

CN

F

F

OOH

F

F

O

N2

F

F

O

O

F

F

OH

O

F

F

Br

50 % 100 % 98 % 60 %

58 %

71 87 88 89 90 91

92 70

nichtangegeben

a b c d e

f

g 66 %

57 %

h

Abbildung 148. Synthese von F-Essigsäure 70 ausgehend von 2,4-Difluortoluol (71). – Nach Takeuchi et al.[206] (grün) und nach Plöger und von Kiedrowski (blau). Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) Br2, Fe; (b) CuCN, DMF, 60 °C, 3 h; (c) H2SO4, H2O, Rückfluss, 1 h; (d) (1) ClCO2Et, TEA, THF, -15 °C, 15 min; (2) CH2N2, Et2O, 0 °C → RT, 3 h; (e) PhCOOAg, MeOH, -25 °C → RT, 3 h; (f) 1 M LiOH, THF; (g) (CH2O)n, ZnBr2, 33 % HBr in AcOH, 120 °C, 4 h; (h) (1) Mg, I2, Et2O, Rückfluss, 2 h; (2) CO2, 0 °C, 1 h; (3) H+, H2O.

Eine bekannte Möglichkeit, die Wasserlöslichkeit von PNA zu erhöhen und ihrer ausgepräg-

ten Tendenz zur Aggregation und Selbstorganisation entgegenzuwirken, besteht in der

Modifizierung mit positiven Ladungen. Hierbei kommt es durch die Einführung von

Chiralitätszentren und/oder zusätzlichen Funktionalitäten häufig zu Abweichungen von der


164

originalen PNA-Struktur. Dies sollte hier vermieden werden, um die Struktur der beteiligten

Komplexe nicht zu beeinflussen und Nebenreaktionen bei der EDC-Ligation auszuschließen.

Daher wurde als Strukturmotiv die PNA-inherente N,N-Dimethylaminogruppe gewählt.

Bei der Festphasensynthese lässt sich der N-Terminus mittels eines modifizierten Monomers

oder durch Anhängen einer modifizierten Aminosäure variieren, sodass sowohl zweifach

methyliertes ß-Alanin 140 als auch ein terminal N,N-dimethyliertes Rückgrat 78 synthetisiert

wurde, das anschließend mit geschützter Cytosin-essigsäure 84 gekoppelt wurde (Abbildung

149). Die Modifizierung des C-Terminus kann während der Abspaltung des Oligomers vom

Harz erfolgen. Hierzu schien der HMBA Linker 75 sehr gut geeignet, weil sich die

Esterfunktion dieses Linkers durch eine Vielzahl von Nukleophilen spalten lässt. Im

konkreten Fall sollte dies durch Reaktion mit N,N-Dimethylaminoethylamin 143 erfolgen. Die

Abspaltung eines Peptids durch Ethanolamin war aus vertrauenswürdiger Literatur

bekannt.[213]

NH

OH

O

NN

NH2

HOH

O

O

N

N

NH

O

N

O

Bhoc

N OH

O

+

144 123 145 142

b

a

95 %

98 % c

54 % d

79 %

Abbildung 149. Synthese eines C-Monomers 142 mit modifiziertem Rückgrat. – Reagenzien und Reaktionsbe-dingungen: (a) H2, Pd/C, H2O, RT; (b) SOCl2, MeOH, 0 °C → Rückfluss, 16 h; (c) CBhoc-AcOH (84), EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 0 °C → RT, 16 h; (d) (1) LiOH (2 eq.), THF, H2O, 0 °C → RT, 2 h; (2) HCl.

Die benötigten Oligomere sollten durch maschinelle Festphasensynthese nach der

Fmoc/Bhoc-Strategie synthetisiert werden. Hierzu wurden im ersten Schritt die Fmoc/Bhoc-

geschützten Monomere der vier natürlichen Nukleobasen ausgehend von Ethylendiamin,

Glyoxylsäure und den freien Basen nach teils modifizierten literaturbekannten Vorschriften in

25 Schritten synthetisiert. Außerdem wurden drei Fluorlabel in insgesamt zehn Schritten in

ihre Fmoc-geschützten Monomere überführt (Abbildung 150).


165

NH

NH

O

OMe NH

O

OMe

R2

F

N

O

R1

R2

F

OH

O

R1

R2

F

N

O

R1

NH

O

OH

83 135 128

Fmoc FmocFmoc

+

a b

47 %50 %50 %

70: R1 = Me, R2 = F96: R1= H, R2 = F101: R1 = H, R2 = CF3

a:b:c:

93 %74 %88 %

a:b:c:

R1 = Me, R2 = FR1= H, R2 = FR1 = H, R2 = CF3

a:b:c:

Abbildung 150. Synthese von Fmoc-geschützten Monomeren verschiedener Thymin- bzw. Uracil-Isostere. – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) TOTU, DIPEA, DMF, RT, 3 h; (b) (1) AlCl3 (3.0 eq), Ethanthiol, RT, 24 h; (2) H2O.

Startpunkt für das Sequenzdesign war die Betrachtung der Kristallstruktur einer selbstkomple-

mentären hexa-PNA.[115] Die meisten im Arbeitskreis von Kiedrowski veröffentlichten

Arbeiten zur (Selbst-)Replikation von Nukleinsäuren basieren aufgrund von thermodynami-

schen Überlegungen auf hexameren Templaten und trimeren Fragmenten.[72, 75, 76, 78-80] Diese

Sequenzlängen wurden beibehalten, um Systeme auf Basis von DNA und PNA miteinander

vergleichen zu können und – auf längere Sicht – komplexere Systeme mit genetischen Über-

gängen zwischen PNA und DNA zu entwerfen. Die natürliche Nukleobase Thymin (72)

wurde durch 2,4-Difluortoluol (71) substituiert und die Strangenden mit den achiralen nicht-

reaktiven Löslichkeitsvermittlern modifiziert. Darüber hinaus wurde die Sequenz selbst leicht

variiert, um das Isoster in der mittleren Position des N-terminalen Trimers zu platzieren.

Dadurch sollte der Einfluss des Fluoraromaten auf die Ligation minimiert werden, während

die Distanz zur supramolekularen Erkennungsseite unverändert bleibt.

Die beiden Template 177 und 180 wurden durch maschinelle Festphasensynthese am Peptid-

Synthesizer hergestellt, mittels RP-HPLC gereinigt und durch MALDI-MS charakterisiert

(Abbildung 151). Der Wechsel des Lösungsmittels von DMF zu NMP und die Einführung

doppelter Kopplungen steigerten die Ausbeuten und Reinheit der Rohprodukte. Allerdings be-

trugen die Ausbeuten an gereinigtem Produkt je ca. 10 % und lagen damit in einem für

PNA-Synthesen unbefriedigenden Bereich, sodass eine zeitnahe und wirtschaftliche Synthese

der benötigten Substanzen nicht gewährleistet war. Ursächlich für die schlechten Ausbeuten

war der verwendete HMBA-Linker, der es überraschenderweise nicht gestattete, das syntheti-

sierte Oligomer quantitativ von der Festphase abzuspalten. Eine weitere Schwierigkeit be-

stand in der chromatographischen Abtrennung der Trimere von ihren jeweiligen Deletions-

mutanten.


166

NNH

N

OO

NH

O

N N

NNH

O

NH2

O

N N

NN

NH2

O

NNH

O

N

N

O

NH2

NNH

OO

N N

NNH

O

NH2

NNH

N

OOOO

FN

N

O

NH2

NH

O

NH

NO

NH

N

R2

R1

177: R1 = CH3, R2 = F; 180: R1 = H, R2 = CF3

Abbildung 151. Durch Festphasensynthese hergestellte Template 177 und 180.

Diese Probleme konnten umgangen werden, indem die beiden Trimere 224 und 248 durch

Flüssigphasensynthesen dargestellt wurden (Abbildung 152). Dazu wurden zwei von Condom

entwickelte Synthesestrategien angewandt. Beide Trimere stehen dadurch in ausreichender

Mengen zur Verfügung, um Replikationsexperimente durchführen zu können.

NH

N

O

NH

NNH

NOH

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

N N

NNH

O

NH2

NN

N

O

NH2

N

O

NH2

O

NH

NNH

NNH

OO

N

OOO

N N

NNH

O

NH2N

NN

NH2

248 224

Abbildung 152. Durch Flüssigphasensynthese dargestellte tri-PNAs 248 und 224.

Zur Darstellung des C-terminalen Trimers 224 wurde der „Fully Protected Polyamide

Backbone Approach“ adaptiert, der Löslichkeitsprobleme umgeht, indem die geschützten

Nukleobasen möglichst spät in das Zielmolekül implementiert werden. Die exocyclischen

Aminofunktionen der Nukleobasen wurden hierbei nicht mehr durch die Bhoc-Gruppe,

sondern durch die Z-Gruppe geschützt, die erst durch Behandlung mit sehr starken Säuren

abgespalten wird. Die Synthese der entsprechenden Nukleobasen-essigsäuren erfolgte

ausgehend von Adenin, Cytosin und Guanin in neun Syntheseschritten. Als Löslichkeits-

vermittler wurde anstelle des gebräuchlichen L-Lysin-amids 292 das N-Ethyl-morpholino-

amid 293 gewählt, da es die achirale PNA-Struktur aufrechterhält und eine positive Ladung

bereitstellt. Die Löslichkeit des N-terminalen Pendants 248 wurde durch das vollständig

N-methylierte Rückgrat 249 sichergestellt, das nur PNA-immanente Struktureinheiten auf-

weist und unter physiologischen Bedingungen zweifach geladen ist. Seine Synthese gelang

ausgehend von AEG (85) durch reduktive Aminierung in guter Ausbeute (Abbildung 153).


167

O

NH

NH2 OH

O

NN OH

RNH

N

OO

B

NH

n

NH2

NH2

O

RNH

N

OO

B

NH

N

O

n

a oder b

*2HCla: 41 %b: 75 %

85 249

292 293

Abbildung 153. Vergleich der Strukturen von L-Lysin-amid 292 und N-Ethyl-morpholino-amid 293 (oben) und Synthese des N-terminalen Löslichkeitsvermittlers 249 auf Basis von AEG (85) (unten). – Reagenzien und Reaktionsbedingungen: (a) (1) Formalin-Lsg., Ameisensäure, Rückfluss, 16 h; (2) HCl; (b) (1) Formalin-Lsg., H2O, 0 °C → RT, 1 h; (2) H2, Pd/C.

Zur Synthese des N-terminalen Trimers 248 wurde ein Schema entwickelt, das den sehr

polaren Löslichkeitsvermittler 249 erst zu einem späten Zeitpunkt der Synthese einführt, um

Probleme bei der Chromatographie zu vermeiden. Der Einsatz einer weiteren orthogonalen

Schutzgruppe konnte hierbei vermieden werden, indem sowohl geschützte Rückgrat-

Einheiten als auch eine geschützte PNA-Einheit kombiniert wurden. Schlüsselbausteine

beider Strategien sind vollständig orthogonal geschützte AEG-Monomere, aus denen durch

geeignete Schützung und Kopplung sukzessive Oligomere aufgebaut werden. Vier dieser

Bausteine wurden auf Basis von AEG (85) in insgesamt acht Schritten synthetisiert.

Ausgehend von den Z-geschützten Nukleobasen-essigsäuren, F-Essigsäure, dem Löslichkeits-

vermittler und den vier geschützten AEG-Monomeren wurden beide Trimere in weiteren 28

Schritten aufgebaut.

Die Synthese in flüssiger Phase ist prinzipiell auch deshalb reizvoll, weil alle Zwischen-

produkte mit Standardmethoden analysiert werden können. Im Fall der PNA-Flüssigphasen-

synthese tritt allerdings ein Problem auf, für das in der Literatur bisher keine Lösung

vorgeschlagen wurde: Bei Raumtemperatur erhält man für AEGs und ungepaarte PNAs

komplexe NMR-Spektren, da die tertiäre Amid- oder Carbamatbindung jeder AEG-Einheit

sowohl in der cis- als auch in der trans-Konformation vorliegen kann und der Austausch

zwischen den möglichen 2n Konformeren langsam im Verhältnis zur NMR-Zeitskala ist.

Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit insgesamt 22 Monomere, Dimere und Trimere durch 1H-NMR-Spektroskopie bei erhöhten Temperaturen von bis zu 160 °C untersucht, um die

Rotationsraten zu erhöhen. Von zehn dieser Verbindungen konnten Spektren im Bereich des

schnellen Austauschs erhalten werden (Abbildung 154). Bei Spektren von weiteren neun

Substanzen konnte die Anzahl an Signalsätzen deutlich reduziert und eine beachtliche


168

Verringerung der Linienbreiten erreicht werden. Zwei Verbindungen zersetzten sich unter den

Messbedingungen und in einem Fall führte die Temperaturerhöhung zu einer Komplikation

des Spektrums. Trotz dieser Einschränkungen konnte die Strukturanalyse geschützter und

ungeschützter AEGs und PNAs deutlich verbessert werden. Außerdem lassen sich aus den

vorliegenden Spektren erstmals Erkenntnisse über das dynamische Verhalten geschützter

AEGs und PNAs gewinnen.

Abbildung 154. 1H-NMR-Spektren von Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (257) in DMSO-d6 bei 30 °C (200 MHz, oben) bzw. 100 °C (250 MHz, unten).

Anschließend wurde die Ligation der beiden Trimere 224 und 248 in wässrigen gepufferten

Lösungen mittels RP-HPLC untersucht (Abbildung 155). Ziel war es dabei, Bedingungen zu

finden, unter denen das Ligationsprodukt 268 als Templat wirkt und dadurch seine eigene

Synthese katalysiert. Hierzu wurden die Reaktionstemperatur und der pH-Wert variiert, ver-

schiedene Puffer und nukleophile Katalysatoren getestet und die Einflüsse unterschiedlicher

Anionen bestimmt. Daneben wurden Versuchsreihen unter Zugabe von PEG, in der eutek-

tischen Phase und mit dem PNA-Methylester 289 als aktivierter Komponente durchgeführt.

Zur kinetischen Modellierung der experimentellen Daten wurde das Programm SimFit

verwendet, das die Berechnung theoretischer Konzentrations-Zeit-Kurven durch dynamische

Simulation mit der Kurvenanpassung durch nichtlineare Regression verbindet. Die Messwerte


169

wurden dabei auf der Basis zweier Reaktionsgleichungssysteme ausgewertet: Das A-Modell

berücksichtigt neben einem unkatalysierten Reaktionskanal (k1) zwei Abklingprozesse (k2),

während das B-Modell zusätzlich einen autokatalytischen Reaktionskanal (k3) einbezieht. Die

Übereinstimmung eines Modells mit den Daten wurde anhand des RMS-Werts bestimmt und

die Verlässlichkeit der ermittelten Geschwindigkeitskonstanten durch deren Kovarianzen

überprüft. Stimmt unter gegebenen Reaktionsbedingungen das B-Modell besser mit den

Daten überein als das A-Modell, wird dies als Hinweis auf Selbstreplikation gewertet und

deren Effizienz durch den autokatalytischen Überschuss-Faktor ε angegeben.

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

NH ON N

O

NH2

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

NH

NH

NO

ON

N

N

NH

NO

O

NH

ON

N

N

NH

O

NH2

ON

N

N

N

NH2

ON

ON N

O

NH2

NH

NH2

NO

N

NH

O

ON

N

N

NH

O

NH2

N

NH

NO

O

O

O

F

F

N N

O

NH2

NH

OH

N

N

O

268 / T

248 / A

224 / B

Abbildung 155. Selbstreplikations-System auf der Basis der tri-PNAs 224 und 248. – Grün: nicht-reaktive Lös-lichkeitsvermittler; gelb: 19F-NMR-Sonden; rot: Ligationsstellen und daraus resultierende zentrale Amidbindung.

Die optimale Reaktionstemperatur wurde nicht aus der Schmelztemperatur des Templat-

duplexes abgeleitet, da diese aufgrund einer flachen Schmelzkurve nicht genau definiert ist.

Infolgedessen wurden 10 °C durch Experimente bei variabler Temperatur und den Vergleich

von Literaturwerten als geeignet bestimmt. Als Puffersubstanzen wurden zum einen Imidazol

und 1-Methylimidazol gewählt, die gleichzeitig als nukleophile Katalysatoren wirken, zum


170

anderen die Sulfonsäure-Puffer MOPS und HEPES, denen die jeweiligen Katalysatoren

zugesetzt wurden. Da EDC in Form seines Hydrochlorids verwendet wurde, enthielten alle

Reaktionsmischungen Chlorid-Ionen, die Ansätze in Sulfonsäure-Puffern enthielten darüber

hinaus, durch die Einstellung des pH-Werts mit Natronlauge, Natrium-Ionen. Alle verwende-

ten nukleophilen Katalysatoren konnten die Bildung von Nebenprodukten, die durch die

Addition von EDC an die Trimere entstehen, zurückdrängen. Als unerheblich erwies es sich,

ob die Katalysatoren einem Sulfonsäure-Puffer zugesetzt wurden (0.1-0.2 M) oder selbst die

Puffersubstanz darstellten (0.4 M). Pyridin, 1-Methylimidazol und vor allem HOAt konnten

als effiziente nukleophile Katalysatoren für die PNA-Ligation bei Raumtemperatur iden-

tifiziert werden: In ihrer Gegenwart wurden mit bis zu 90 % die größten Ausbeuten an

hexa-PNA 268 nachgewiesen. Hinweise auf einen nennenswerten Templateffekt gab es dabei

nicht. Ähnlich effektive Methoden zur PNA-Ligation in wässriger Phase nutzen die native

chemische Ligation nach Kent oder die daraus abgeleitete native chemische

iCys-Verknüpfung und sind daher in Bezug auf die verwendeten Sequenzen einge-

schränkt.[175-177, 284, 285] Templateffekte konnten hingegen sowohl in reinem Imidazol- und

MOPS-Puffer als auch in Imidazol-haltigem MOPS- und HEPES-Puffer beobachtet werden.

Während bei Replikatoren auf DNA-Basis die Variation der Verknüpfungschemie ausgehend

von der Phosphodiester- über die Pyrophosphat- hin zur Phosphoamidatbindung zu

schnelleren und gleichzeitig effizienteren Replikatoren geführt hat,[72, 75, 76] ist der Zusammen-

hang zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Templateffekt im vorliegenden System

komplexer: Vergleicht man die Ligationen in Imidazol- und 1-Methylimidazol-Puffer über

zwei Tage, so verläuft erstere langsamer und zeigt einen Templateffekt (ε = 28 M-1/2), während

letztere deutlich schneller ist und kaum Einfluss des Templats zeigt (ε = 6.7 M-1/2) (Abbildung

156). Hingegen erfolgt die Reaktion unter Imidazol-Katalyse in MOPS-Puffer fast dreimal so

schnell wie in HEPES-Puffer, während die autokatalytische Effizienz mit ε = 40 bzw. 59 M-1/2

vergleichbar ist (Abbildung 157). Zum Ausgangspunkt der weiteren Optimierungen wurde

jeweils das MOPS/Imidazol-System gewählt, da es, verglichen mit der HEPES-Variante,

einen größeren Umsatz zeigt und im Gegensatz zum Imidazol-Puffer auch die Variation des

nukleophilen Katalysators erlaubt. Der pH-Wert wurde für das Referenzexperiment von 7.2

auf 7.6 erhöht, wodurch ε von 40 auf 67 M-1/2 gesteigert werden konnte.


171

Abbildung 156. PNA-Ligation in Imidazol- und 1-Methylimidazol-Puffer bei 10 °C. – Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.4 M Puffer pH 7.5, 25 µl Ansatzgröße.

Abbildung 157. PNA-Ligation unter Imidazol-Katalyse in MOPS und HEPES-Puffer bei 10 °C. – Reaktions-bedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M Puffer pH 7.2 (MOPS) bzw. 7.5 (HEPES), 0.2 M NaCl, 6 µl Ansatzgröße.

Ohne zugesetztes Salz wich der Wert für den autokatalytischen Überschuss-Faktor ε mit

64.2 M-1/2 nur wenig vom Referenzsystem ab, während die Zugabe von NaI einen positiven

Einfluss auf die Ausbeute und Templatierung der Reaktion zeigte (ε = 94.9 M-1/2). Sulfatzusatz

führte zwar zu einem geringfügig größeren autokatalytischen Überschuss-Faktor von

ε = 100 M-1/2, bewirkte aber parallel einen Einbruch der Kopplungseffizienz. Durch die

Verdoppelung der EDC-Konzentration auf 0.4 mol/l ließ sich dessen Hydrolyse z.T.

kompensieren, sodass man die doppelte Ausbeute an Ligationsprodukt bei ähnlichem Tem-

plateffekt erhielt (ε = 65 M-1/2). Die Erniedrigung des pH-Werts von 7.6 auf 6.6 beschleunigte

die Ligation und verstärkte den beobachtbaren Einfluss des Templats beträchtlich

(ε = 112 M-1/2). Auch die Zugabe von Polyethylenglykolen zeigte einen positiven Einfluss auf

den autokatalytischen Überschuss-Faktor: In Gegenwart von 20 % PEG400 konnte mit

0 10 20 30 40 50

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0 0 % T30 % T50 % T

Imidazol-Puffer[T

] (m

M)

t (h)

0 10 20 30 40 50

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0 0 % T20 % T40 % T

1-Methylimidazol-Puffer

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2

0 % T10 % T

MOPS-Puffer/0.1 M Imidazol

[T] (

mM

)

t (h)

0 10 20 30

0.0

0.4

0.8

1.2

0 % T10 % T

HEPES-Puffer/0.1 M Imidazol

[T] (

mM

)

t (h)


172

321 M-1/2 der für das vorliegende System größte Wert von ε bestimmt werden, während die

Ausbeute gleichzeitig um den Faktor zwei bis drei reduziert wurde. Durch Zusatz von 20 %

PEG3350 wurde hingegen sowohl der Umsatz zum Ligationsprodukt als auch der Wert des

autokatalytischen Überschuss-Faktors (ε = 126 M-1/2) erhöht. Im eutektischen Phasensystem

zeigte die initiale Templatzugabe wenig Einfluss auf den Reaktionsverlauf, sodass für ε nur

ein Wert von 16 M-1/2 gefunden wurde. Ein erstes Experiment unter Verwendung des PNA-

Methylesters 289 als aktivierter Komponente zeigte keinen Umsatz.

Bei allen Versuchsreihen korrelierte die Abweichung der theoretischen Kurven von den

Messpunkten qualitativ mit der Menge an initial zugesetztem Templat. Dabei sagte das

Modell generell einen höheren Umsatz voraus, als tatsächlich experimentell beobachtet

werden konnte. Dies kann zum einen dadurch erklärt werden, dass bei hohen Templatkonzen-

trationen auch größere Fehler bei der Subtraktion der HPLC-Integrale möglich sind. Zum

anderen erfassen die Abklingprozesse im Reaktionsmodell nur die Carbonsäure-katalysierte

EDC-Hydrolyse an sich, während die potentielle Abhängigkeit ihrer Geschwindigkeit von der

initialen Carbonsäurekonzentration unberücksichtigt bleibt. Diese war bei den durchgeführten

Experimenten proportional zur Templatzugabe, da alle PNAs in Form ihrer mehrfachen

Trifluoracetate eingesetzt wurden.


173

6.2 Ausblick

Die vorliegende Arbeit hat die konzeptionellen und synthetischen Grundlagen geschaffen, um

die potentielle PNA-Selbstreplikation durch kinetische 19F-NMR-Titration zu untersuchen.

Erste mittels RP-HPLC ausgewertete Ligations- und Replikationsexperimente zeigen, dass

PNA-Selbstreplikation prinzipiell möglich ist. Zukünftig gilt es daher, den beobachteten, bis-

lang schwachen Templateffekt zu verstärken, um einen effektiven Replikator zu entwickeln.

Hierzu können die Reaktionsbedingungen für das untersuchte System weiter modifiziert und

optimiert werden. Vielversprechende Ansatzpunkte bietet dabei sowohl das Screening

wasserlöslicher Cosolventien und nukleophiler Katalysatoren (Abbildung 158) als auch die

Variation des pH-Werts.

N

NH

N

N

N

NH

N

NH

N

NH

N

N

N

NH

NO2

N

NH

CN

CNN

NH

OH275 276 277 294 295 296 297 298 278

NH

NN

NN

N

OHN

NN

OHCl N

N

N

O

OH

N NN

N

OH299 154 300 290 301

N NN

N

NOH N+

O

O

N

289 302 303 304 305 306

N OO

OH

NH N

N N

NH2

NH

NN

NH

N NN

307 103 308 309

Abbildung 158. Potentielle nukleophile Katalysatoren für die PNA-Ligation und Replikation auf der Basis von Imidazolen (275-278, 294-298), Benzotriazolen (154, 299-300) bzw. -trazin (301), Pyridinderivaten (289, 302-306) und weiteren Heterocyclen (103, 307-309). – Die blau dargestellten Verbindungen wurden im Rahmen der Arbeit bereits getestet.

Alternativ kann die Stabilität des postulierten termolekularen Komplexes durch den Einsatz

längerer Bausteine gesteigert werden. Dies erscheint sinnvoll, da die flache UV-Schmelz-

kurve des resultierenden Produktduplexes 268 (Abbildung 130) auf einen wenig kooperativen

Prozess hinweist und darüber hinaus nicht die zuverlässige Bestimmung der Schmelztempe-


174

ratur erlaubt, deren Kenntnis wichtig für die Wahl der optimalen Reaktionstemperatur ist. In

diesem Zusammenhang kann auch eine alternative Positionierung des Fluoraromaten in

Betracht gezogen werden. Seine jetzige Lage in der Sequenzmitte von Trimer 248 sollte den

Einfluss auf die Ligation minimieren und einen geeigneten Abstand zur molekularen

Erkennungsseite gewährleisten. Im Sinne stabiler Komplexe und eines kooperativen Schmel-

zens scheint auch ein Einbau des Isosters am N-Terminus sinnvoll, da hierdurch mehr Basen-

paare direkt benachbart wären, die an Watson-Crick-Wasserstoffbrücken beteiligt sind. Die

Carbonsäure-katalysierte EDC-Hydrolyse kann in künftigen Experimenten zurückgedrängt

werden, indem die HPLC-gereinigten PNA-Trifluoracetate freigesetzt und anschließend durch

Gel-Permeations-Chromatographie entsalzt werden. Hierdurch würde außerdem die zugege-

bene Templatmenge nicht mehr die initiale Carbonsäurekonzentration beeinflussen, die

ihrerseits Auswirkungen auf die Geschwindigkeit der EDC-Hydrolyse haben sollte. Dieser

Zusammenhang wird als Hauptursache dafür angenommen, dass die Diskrepanz zwischen den

theoretischen Kurven und den Messpunkten bei hohen Templatkonzentrationen ausgeprägter

ist als bei niedrigen. Um zudem die Fehler bei der Auswertung der HPLC-Integrale zu

minimieren, bietet sich die Synthese und Verwendung eines chemisch markierten Templats

an. Auch der Einsatz des PNA-Methylesters 291 als aktivierter Komponente bleibt weiterhin

interessant, wenn günstigere Reaktionsbedingungen gefunden werden. Ein wichtiger Aspekt

wird dabei die Wahl eines geeigneten pH-Werts sein, dessen Erhöhung gleichzeitig die Kon-

zentration an Hydroxid-Ionen und an unprotoniertem Amin erhöht, und somit die Hydrolyse

des Methylesters sowie dessen Aminolyse zum Ligationsprodukt beschleunigt. Darüber

hinaus kann der Reaktionsmischung das Dipeptid Ser-His zugesetzt werden, von dem bekannt

ist, dass es die Kondensation von PNA-Monomeren in basischem Milieu katalysiert.[156]

Sobald Bedingungen für eine effektive Replikation geschaffen worden sind, soll diese durch

zeitaufgelöste 19F-NMR-Spektroskopie verfolgt und analysiert werden. Neben einer präzisen

Temperaturkontrolle ist auch die H-F-Entkopplung von Bedeutung, da durch eine reduzierte

Signal-Aufspaltung eine höhere Intensität erreicht werden kann und eine einfachere Analyse

möglich ist. Nach der Durchführung und NMR-Analyse erster erfolgreicher Selbsteplikations-

experimente bieten sich eine Reihe interessanter chemischer Modifizierungen am System an:

Dazu zählt neben weiteren Sequenz-Variationen auch die Verwendung von Fluorsonden mit

CF3-Gruppen, da diese alternative Shift-Shifting-Informationen bieten. Auch das Design eines

kreuzkatalytischen Systems ist möglich. Ein Fernziel ist weiterhin der Einsatz eines Diamino-

Fragments 310, das zu zwei enantiomeren hexa-PNAs 311 führt (Abbildung 159). Auf diese


175

Weise entstünde ein denkbares Szenario für den Übergang von achiraler PNA zu einem

(homo-)chiralen Derivat. Außerdem erlauben die Amino-modifizierten PNAs 311 den Aufbau

verzweigter Strukturen. Für alle angesprochenen synthetischen Modifikationen des Systems

bietet die in dieser Arbeit verwendete modulare PNA-Flüssigphasensynthese einen guten

Ausgangspunkt.

NH

N

OO

B

OH NH2

N

OO

B

NH2

PNA

NH

N

OO

B

NH2

NH

N

OO

B

NH

N

OO

B

NH2

NH

N

OO

B

PNA +

PNAPNA

PNAPNA

312 310

(S)-311

(R)-311

Abbildung 159. Durch den Einsatz eines Diamino-Fragments 310 entstehen bei der Ligation zwei enantiomere Produkte 311 mit Verzweigungsstellen (durch den grünen Pfeil markiert).

Experimenteller Teil 7 Geräte und Materialien

176

Experimenteller Teil

7 Geräte und Materialien

7.1 Magnetische Kernresonanzspektroskopie

Zur Aufnahme von Kernresonanzspektren wurden die Geräte DPX-200 (200 MHz), DPX-250

(250 MHz) und DRX-400 (400 MHz) der Fa. Bruker verwendet. Das jeweilige Lösungsmittel

diente bei der Kalibrierung der 1H- und 13C-Spektren als interner Standard.[286, 287] Zur

Kalibrierung der 19F-Spektren wurde Trifluoressigsäure als externer Standard verwendet.[254]

Die chemischen Verschiebungen sind in der δ-Skala (Einheit ppm) und die Kopplungskon-

stanten in der Einheit Hz angegeben. Sofern es nicht anders angegeben ist, wurden die

Spektren bei 30 °C aufgenommen.

7.2 Massenspektrometer

7.2.1 FAB-MS

Die Aufnahme von Spektren für die Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB-

MS) erfolgte mit dem Spektrometer Autospec der Firma VG Instruments bei einer

Beschleunigungsspannung von 8 kV und Beschuss durch Cs+. Als Matrix fanden 3-Nitro-

benzylalkohol, Glycerin und Milchsäure Verwendung. Die relativen Peakintensitäten

beziehen sich auf den Basispeak (I = 100 %).

7.2.2 EI-MS

Die Aufnahme der Elektronenstoß-Ionisations-Spektren (EI-MS) erfolgte mit dem

Spektrometer Autospec der Firma VG Instruments. Auch hier beziehen sich die relativen

Peakintensitäten auf den Basispeak (I = 100 %).


177

7.2.3 MALDI-TOF-MS

Für die Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization-Time-Of-Flight-Massenspektrometrie

(MALDI-TOF-MS) wurde das Gerät Daltonics autoflex der Fa. Bruker verwendet. Als

Matrizes kamen 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), 2,4,6-Trihydroxyacetophenon (THAP)

und α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) zum Einsatz.

7.2.4 HR-ESI-MS

Die Aufnahme der hochauflösenden Elektrospray-Ionisations-Spektren (HR-ESI-MS) erfolgte

mit dem Spektrometer LTQ-Orbitrap XL der Fa. Thermo Scientific.

7.3 Chromatographische Methoden

7.3.1 Dünnschichtchromatographie

Für die Dünnschichtchromatographie wurden Fertigfolien des Typs Kieselgel 60 F254 der Fa.

Merck (10 × 10 cm, Schichtdicke 0.25 mm Kieselgel, Fluoreszenzindikator) verwendet.

Detektiert wurde durch UV-Licht der Wellenlänge 254 nm bzw. durch Anfärben mit einer

Lösung von 4.00 g Molybdatophosphorsäure in 100 ml Methanol.

7.3.2 Säulenchromatographie

Für die Säulenchromatographie wurde Kieselgel des Typs ICN Silica 32-63 60 Å unter

Normal- oder Überdruck verwendet.

7.3.3 HPLC

Für die präparative Reinigung der PNAs wurde die VisionTM Workstation der Fa. Applied

Biosystems mit einem AFC2000 Roboter benutzt. Für die analytische HPLC wurde entweder

eine HPLC-Anlage der Firma Kontron verwendet (HPLC-Pumpe 422, Autosampler 460, UV-

Detektor 430, Mischkammer M494, Steuerungssoftware: Kroma System 2000) oder ebenfalls

die VisionTM Workstation der Fa. Applied Biosystems. Bei der Aufnahme der HPLC-

Kinetiken kam eine Anlage des Typs Beckman Gold® zum Einsatz (126 Solvent Module, 168

Detector). Alle Trennungen wurden bei einer Säulentemperatur von 55 °C durchgeführt.


178

Die verwendeten Säulen für die präparative und semipräparative HPLC waren:

Bischoff: Prontosil 200-5-C18-ace-EPS, 5 μm, 100 × 20 mm

Bischoff: Prontosil 200-5-C18-ace-EPS, 5 μm, 50 × 20 mm

Supelco: Discovery BIO Wide Pore C18, 5 µm, 250 × 10 mm

Die eingesetzten Säulen für die analytische HPLC waren:

Macherey-Nagel: Nucleodur 100-5 C18 ec, 250 × 4.0 mm

Supelco: Ascentis RP-Amide, 5 μm, 250 × 4.6 mm

Elutionsmittel:

A: 0.1 % TFA in ddH2O

B: 0.1 % TFA in MeCN

7.4 UV-Spektroskopie

Die UV-Spektren wurden mit dem Modell Cary 1E der Firma Varian aufgenommen.

7.5 Automatisierte Peptidsynthese

Die automatisierte Synthese der Peptide wurde am Synthesizer ABI 433A der Firma Applied

Biosystems durchgeführt.

7.6 Gefriertrocknung

Die Gefriertrocknung von wasserlöslichen Verbindungen erfolgte mit der Anlage Alpha 1-2

der Firma Christ.

7.7 Chemikalien

Die verwendeten Lösungsmittel wurden wie folgt getrocknet und aufgereinigt:

Cyclohexan wurde destilliert.

Ethylacetat wurde destilliert.

DCM für die Säulenchromatographie wurde destilliert.

DCM der Qualitätsstufe „peptide grade“ wurde von Biosolve erworben.


179

DMF der Qualitätsstufe „peptide grade“ wurde von Biosolve erworben.

NMP der Qualitätsstufe „peptide grade“ wurde von Applied Biosystems erworben.

Pyridinabs. wurde über Calciumhydrid refluxiert und destilliert.

Tetrahydrofuranabs. wurde über Natrium refluxiert und destilliert.

HMBA-Tentagel-Festphase wurde von Novabiochem bezogen. Alle weiteren Chemikalien

wurden in den Qualitätsstufen „p.a.“ bzw. „zur Synthese“ eingesetzt.

Experimenteller Teil 8 Maschinelle Festphasensynthese

180

8 Maschinelle Festphasensynthese

Die Synthese von PNAs nach der Fmoc/Bhoc-Chemie mit dem Synthesizer ABI 433A der Fa.

Applied Biosystems erfolgte mit modifizierten Prozeduren für die Peptidsynthese in einem

Reaktor mit einem Volumen von 3 ml. Die Synthesen wurden im Maßstab von 10 µmol

durchgeführt, wobei die verwendeten Festphasen Beladungen zwischen 0.1 und 0.2 mmol/g

aufwiesen. Pro Synthesecyclus wurden 5.3 eq. PNA-Monomere bzw. 5.0 eq. N,N-Dimethyl-β-

alanin eingesetzt. Bei schwierigen Kopplungen wurden zwei Cyclen hintereinander

durchgeführt. Als Kopplungsreagenz wurde HBTU verwendet. Zum Cappen nicht-reagierter

Aminofunktionen wurde eine Lösung von Essigsäureanhydrid, Pyridin und NMP im

Verhältnis 1:25:25 benutzt.

Während der Arbeit wurden weitere Modifizierungen bezüglich der Chemikalien und Materi-

alien vorgenommen. So wurde das Lösungsmittel von DMF auf NMP umgestellt und anstatt

Piperidin wurde eine 6%ige Lösung von DBU in NMP zum Abspalten der Fmoc-Gruppe

verwendet.

Nach der Synthese wurde die Festphase in eine Spritze mit Fritte überführt, 2 h im Ölpumpen-

vakuum getrocknet und zur Abspaltung der temporären Bhoc-Schutzgruppen mit 2 ml einer

5%igen Lösung von m-Cresol in TFA behandelt. Nach 2 h wurde mit DMF und DCM

gewaschen und 1 h im Ölpumpenvakuum getrocknet. Danach ließ man die Festphase in DMF

quellen und gab 296 mg (3.36 mmol, 367 µl) N,N-Dimethylaminoethylamin hinzu. Nach 24 h

wurde die Abspaltlösung aufgefangen und die Festsphase mit 4 ml DMF gewaschen. Die

produkthaltigen Lösungen wurden vereinigt und vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand

wurde mit DEE versetzt und im Ultraschallbad behandelt, wobei das Produkt als farbloser

Feststoff ausfiel. Dieser wurde durch Zentrifugieren isoliert und anschließend mehrmals mit

kaltem Diethylether gewaschen. Das so erhaltene Rohprodukt wurde anschließend mittels

RP-HPLC gereinigt und die produkthaltigen Fraktionen wurden dann gefriergetrocknet.

Experimenteller Teil 9 Allgemeine Arbeitsvorschriften

181

9 Allgemeine Arbeitsvorschriften

9.1 Grignard-Reaktion mit Trockeneis (AAV 1)

Man legt Magnesium-Späne (2 eq.) in Diethyletherabs. (0.1 ml pro mmol Substrat) vor und

tropft derart 1/20 der Gesamtmenge an Substrat (0.050 eq.) hinzu, dass die Reaktion initiiert

wird. Die restliche Menge des Substrats (0.95 eq.) wird in Diethyletherabs. (0.25 ml pro mmol

Substrat) gelöst und innerhalb von 10 min so hinzugegeben, dass der Ether leicht siedet. Es

wird 2.5 h refluxiert und anschließend auf -10 °C abgekühlt. Daraufhin wird 1 h lang ein

kräftiger Strom von trockenem CO2 eingeleitet, wobei die Temperatur 0 °C nicht übersteigen

darf. Danach wird mit Eis und 6 M Salzsäure hydrolysiert, die Etherphase abgetrennt und die

wässrige Phase mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit

gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und destillativ vom

Lösungsmittel befreit.

9.2 Darstellung von Aminosäuremethylestern (AAV 2)

Man suspendiert die Aminosäure (1 eq.) in Methanol, tropft unter Eisbadkühlung vorsichtig

Thionylchlorid (2.4 eq.) hinzu und erhitzt über Nacht unter Rückfluss. Anschließend wird die

Reaktionsmischung im Eisbad abgekühlt und mit dem doppelten Volumen Diethylether

versetzt, wobei das Produkt in Form seines (Di-)Hydrochlorids als farbloser Feststoff ausfällt.

Man lässt 30 min rühren und saugt das Produkt über eine Fritte ab. Abschließend wäscht man

das Produkt mit Diethylether und trocknet es im Ölpumpenvakuum.

9.3 Verseifung von Aminosäuremethylestern (AAV 3)

Der Methylester wird entweder in H2O/THF (1:1) gelöst, im Eisbad auf 0 °C abgekühlt und

mit LiOH*H2O versetzt oder zuerst nur in THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1 M LiOH-Lösung

behandelt. Man lässt 1 h bei 0 °C und 1 h bei RT rühren. Daraufhin wird das Reaktionsge-

misch unter Eisbadkühlung mit 20%iger Zitronensäure-Lösung (Bhoc-geschützte Verbindun-


182

gen) oder 1 M HCl (Boc-geschützte Verbindungen) auf pH 2-3 eingestellt und anschließend

dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit ges.

NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Man erhält das Produkt nach Entfernen

des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer.

9.4 Reduktive Aminierung mit elementarem Wasserstoff (AAV 4)

Man legt das Amin in Wasser vor (2/3 der Gesamtmenge), kühlt im Eisbad ab und tropft lang-

sam und unter heftigem Rühren eine Lösung des Aldehyds in Wasser (1/3 der Gesamtmenge)

hinzu. Es wird 1 h bei RT nachgerührt. Nach Zugabe des Palladium-Katalysators (10 % auf

Aktivkohle) wird unter leichtem Druck (1-3 bar) mit Wasserstoff hydriert. Anschließend

filtriert man den Katalysator über Kieselgur ab, engt die Reaktionsmischung ein und

coevaporiert zweimal mit je 100 ml Toluol.

9.5 Brommethylierung von Fluoraromaten (AAV 5)

Man löst Paraformaldehyd (1.0 eq.) in einer 33%igen Lösung von HBr in Essigsäure (0.5 ml

pro mmol Substrat) und gibt anschließend den Fluoraromaten (1.0 eq.) und Zinkbromid

(22-45 mol%) hinzu. Danach lässt man 4 h bei 120 °C rühren. Nachdem die Reaktionsmi-

schung abgekühlt ist, gibt man Wasser hinzu und extrahiert dreimal mit Dichlormethan. Die

vereinigten organischen Phasen werden vorsichtig mit gesättigter NaHCO3-Lösung und

NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und destillativ vom Lösungsmittel befreit.

9.6 N9-Alkylierung bei Purin-Derivaten (AAV 6)

Das Purin-Derivat (1.0 eq.) wird in DMF suspendiert und mit Natriumhydrid (60%ig in

Mineralöl, 1.2 eq.) in zwei Portionen im Abstand von 1 h versetzt. Nach Beendigung der

Gasentwicklung (2-3 h) wird der Ansatz mit einem Eisbad gekühlt und der entsprechende

Bromessigsäureester (1.1 eq.) innerhalb von 30 min zugetropft. Der Ansatz wird über Nacht

bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird am Trockeneisrotationsverdampfer vollständig

entfernt. Der zähflüssige Rückstand wird mit Wasser versetzt und intensiv gerührt oder im


183

Ultraschallbad behandelt, bis eine gleichmäßige Suspension entsteht. Der ausgefallene Fest-

stoff wird abgesaugt, ausgiebig mit Wasser und anschließend mit Diethylether gewaschen.

9.7 Einführung von Carbamaten an der N6-Position von Adenin (AAV 7)

Der entsprechende Adenin-9-essigsäure-ester (1.0 eq.) und Carbonyldiimidazol (1.5 eq.)

werden in DMF gelöst. Die Lösung wird unter Argon auf 105 °C erwärmt und 2 h bei dieser

Temperatur gerührt. Anschließend wird um ca. 10 °C abgekühlt, mit Benzhydrol (1.5 eq.)

versetzt und weitere 3 h bei 105 °C gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von Wasser

abgebrochen. Danach wird dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und bis zur

Trockene evaporiert.

9.8 Einführung von Carbamaten an der N4-Position von Cytosin (AAV 8)

Man erhitzt eine Suspension aus Cytosin-1-essigsäure-ester (1.0 eq.) und Carbonyldiimidazol

in THFabs. für 2 h zum Rückfluss. Im Anschluss wird die Suspension unter Argon-

Schutzgasatmosphäre etwas abgekühlt und mit Benzhydrol (1.6 eq.) versetzt. Man rührt wei-

tere 2 h bei Rückflusstemperatur und danach über Nacht bei RT. Nach der Zugabe von

Methanol wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt.

9.9 Esterspaltung und Einführung des Carbonyls an Guanin-Derivaten (AAV 9)

Vorgelegt wird eine 60%ige Dispersion von NaH in Mineralöl (5.0 eq.) in absolutem THF.

Nachdem die Suspension in einem iso-Propanol/Trockeneis-Bad auf -78 °C abgekühlt wurde,

wird langsam 3-Hydroxypropionitril (5.0 eq.) zugetropft. Es wird 30 min bei -78 °C und wei-

tere 2.5 h bei 0 °C gerührt. Man gibt dann den geschützten Guanin-9-essigsäure-ester (1.0 eq.)

hinzu und lässt die Reaktionsmischung über Nacht rühren.


184

9.10 N9-Alkylierung am Guanin (AAV 10)

Eine Suspension von 2-Amino-6-chlor-purin (1.0 eq.) in DMF wird für 30 min auf 85 °C

erwärmt und mit K2CO3 (1.5 eq.) versetzt. Anschließend lässt man 30 min bei 85 °C rühren.

Danach wird im Eisbad auf 0 °C abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung des jeweiligen

Bromessigsäureesters (1.1 eq.) in DMF versetzt. Man lässt über Nacht bei RT rühren, filtriert

und versetzt das Filtrat unter Rühren mit gekühlter 1 M HCl. Nach 30 min saugt man den

entstandenen Niederschlag ab, wäscht ihn mit wenig Wasser und reichlich Diethylether und

trocknet ihn im Vakuum.

9.11 Einführung von Carbamaten an der N2-Position von Guanin (AAV 11)

Eine Suspension des entsprechenden (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäureesters (1.0 eq.)

in THF wird bei 0 °C mit Triphosgen (0.37 eq.) versetzt und 1 h bei dieser Temperatur ge-

rührt. Danach tropft man langsam DIPEA (2.2 eq.) hinzu, lässt 30 min rühren und gibt dann

den jeweiligen Alkohol (1.2 eq.) hinzu. Man lässt die Reaktionsmischung über Nacht rühren,

gibt Methanol hinzu und entfernt die Lösungsmittel destillativ am Rotationsverdampfer.

9.12 TOTU-Kopplung (AAV 12)

Vorgelegt werden die Amin- und die Carboxyl-Komponente (je 1.0 eq.) in DMF. Hierzu

werden nacheinander DIPEA (1.0 eq.) und TOTU (1.0 eq.) gegeben. Man läst die Reaktions-

mischung über Nacht bei RT rühren. Anschließend wird mit dem zehnfachen Volumen Ethyl-

acetat verdünnt und mit je dem gleichen Volumen ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung

gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO4 wird das Lösungsmittel am Rotationsverdam-

pfer entfernt

9.13 Esterspaltung mit Aluminium(III)chlorid in Ethanthiol (AAV 13)

Man legt AlCl3 (3.0 eq) in Ethanthiol (1 ml pro mmol AlCl3) vor und gibt anschließend den

Ester (1.0 eq.) hinzu. Die Reaktionsmischung wird 24 h bei RT gerührt und anschließend auf


185

die dreifache Menge Wasser gegossen. Man extrahiert dreimal mit Dichlormethan, wäscht die

vereinigten organischen Phasen mit ges. NaCl-Lösung und trocknet über MgSO4.

9.14 EDC-Kopplung (AAV 14)

Vorgelegt wird eine Lösung des Amino-Fragments in Form seines Trifluoracetats bzw.

Hydrochlorids (1.0 eq.); HOBt (1.2 eq.) und TEA bzw. DIPEA (4.0 eq.) in Chloroform bzw.

DMF. Unter Eisbadkühlung wird das geschützte Carboxyl-Fragment, gelöst im gleichen

Volumen Chloroform bzw. DMF, zugegeben. Anschließend gibt man EDC*HCl (1.2 eq.)

hinzu und lässt das Reaktionsgemisch 1 h bei 0 °C und 24 h bei RT rühren. Danach wird ggf.

mit Chloroform bzw. Ethylacetat verdünnt, mit ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen,

über MgSO4 getrocknet und vom Lösungsmittel befreit.

9.15 Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure (AAV 15)

Man löst die Boc-geschützte Verbindung in Dichlormethan. Wenn das Substrat Nukleobasen

oder Fmoc-Gruppen enthält, wird Triethylsilan als Abfangreagenz hinzugegeben. Dann wird

unter Eisbadkühlung mit Trifluoressigsäure versetzt und die Reaktionsmischung 1 h bei 0 °C

und 1 h bei RT gerührt. Danach wird am Rotationsverdampfer eingeengt und verbleibende

Trifluoressigsäure durch viermalige Coevaporation mit Toluol entfernt.

9.16 Abspaltung der Z-Schutzgruppe mit TFMSA (AAV 16)

Die Z-geschützte Verbindung wird in TFA gelöst und mit m-Cresol und Thioanisol versetzt.

Danach gibt man tropfenweise TFMSA zu und schüttelt die Reaktionsmischung für 2 h bei

RT. Nun wird die Reaktion durch die Zugabe von 45 ml Diethylether abgebrochen und die

entstandene Suspension auf 0 °C abgekühlt. Man zentrifugiert, dekantiert und wäscht das

Produkt zweimal mit Diethylether. Das so erhaltene Rohprodukt wird durch präparative

RP-HPLC gereinigt und die produkthaltigen Fraktionen werden gefriergetrocknet.


186

9.17 HBTU-Kopplung (AAV 17)

Zu einer Lösung der Carboxyl-Komponente (1.0 eq.) und DIPEA (2.0 eq.) in DMF wird unter

Argon-Schutzgasatmosphäre HBTU (1.0 eq.). gegeben. Man rührt 30 min, fügt dann die

Amino-Komponente hinzu und lässt über Nacht bei RT unter Argon-Schutzgasatmosphäre

rühren. Am nächsten Tag wird mit dem zehnfachen Volumen Ethylacetat verdünnt und nach-

einander mit 1 M KHSO4-, ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen. Man trocknet über

MgSO4 und entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer.

9.18 DCC/HOSu-Kopplung (AAV 18)

Die Carboxyl-Komponente (1.0 eq.) und HOSu (1.5 eq.) werden in DCM bzw. DMF

vorgelegt und unter Argon-Schutzgasatmosphäre auf 0 °C abgekühlt. Man gibt DCC (1.1 eq.)

hinzu und rührt über Nacht. Danach kühlt man die Reaktionsmischung auf -15 °C ab, versetzt

mit der Amino-Komponente (1.0 eq.) und rührt 1 h bei -15 °C und weitere 3 h bei RT. Der

entstandene Dicyclohexylharnstoff wird dann abfiltriert und das Filtrat am

(Trockeneis-)Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wird in 500 ml EtOAc

aufgenommen und mit ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen. Danach trocknet man die

organische Phase über MgSO4 und entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck.

9.19 Fmoc-Abspaltung mit Diethylamin (AAV 19)

Man löst die Fmoc-geschützte Verbindung in DCM, versetzt mit Diethylamin und rührt 1.5 h

bei RT. Anschließend werden die flüchtigen Komponenten am Rotationsverdampfer entfernt.

9.20 Brop-Kopplung (AAV 20)

Man legt das Carboxyl- und das Amino-Fragment (je 1.0 eq.) in DCM bzw. DMF vor, gibt

TEA (2.2 eq.) hinzu und kühlt unter Argon-Schutzgasatmosphäre auf 0 °C ab. Nach Zugabe

von Brop (1.1-1.3 eq.) rührt man über Nacht bei RT.

Experimenteller Teil 10 Synthesen

187

10 Synthesen

10.1 F-AcOH (70)

(2,4-Difluor-5-methyl-phenyl)essigsäure

F

F

OH

O

Summenformel: C9H8F2O2 M = 186.16 g/mol

Ansatz:

22.1 g 100 mmol 1-Brommethyl-2,4-difluor-5-methyl-benzol (92)

4.87 g 200 mmol Magnesiumspäne

35 ml Diethyletherabs.

Trockeneis

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 1. Dabei bleibt ein weißer Feststoff zurück, der

säulenchromatographisch (Silica, DCM DCM/MeOH 10:1) gereinigt wird.

Ausbeute:

10.7 g (57.5 mmol) = 57 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (DCM): 0.20. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 9.86 (s(br) 1 H, COOH); 7.06 (dd aa t,

2 × J = 8.3, 1 H, CHarom.); 6.78 (dd aa t, 2 × J = 9.6, 1 H, CHarom.); 3.64 (s, 2 H, CH2); 2.22 (s,

3 H, CH3). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 177.12 (C=O); 160.56 (dd, 1J(C,F) = 247,

3J(C,F) = 11.5, C(4)); 159.26 (dd, 1J(C,F) = 247, 3J(C,F) = 11.9, C(2)); 133.37 (dd, 3J(C,F) = 6.50, 3J(C,F) = 5.40, C(6)); 121.10 (dd, 2J(C,F) = 17.3, 3J(C,F) = 3.80, C(5)); 116.33

(dd, 2J(C,F) = 15.7, 4J(C,F) = 3.80, C(1)); 103.54 (dd aa t, 2 × 2J(C,F) = 26.1, C(3)); 33.77 (d, 3J(C,F) = 2.70, CH2); 14.02 (d, 3J(C,F) = 3.50, CH3).

19F-NMR (565 MHz, DMSO-d6):

-115.57 (m, 1 F, F(4)); -117.17 (m, 1 F, F(2)). EI-MS: 186.0 (32) [M]+•; 141.0 (100)

[M-COOH] +. HR-EI-MS: 186.0502 (30) [M]+• (ber.: 186.0492).


188

10.2 Me2-Aeg(H)-OMe*2HCl (78)

(2-Dimethylamino-ethylamino)essigsäure-methylester Dihydrochlorid

O

O

NH

N

*2HCl

Summenformel: C7H16N2O2*2HCl M = 196.68 g/mol

Ansatz:

1.86 g 12.7 mmol Me2-Aeg(H)-OH (145)

2.22 ml 30.5 mmol Thionylchlorid

100 ml Methanol

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 2. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

2.44 g (12.4 mmol) = 98 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 4.11 (s, 2 H, GlyCH2); 3.84 (s, 3 H, OCH3); 3.60 (s, 4 H,

CH2CH2); 2.99 (s, 6 H, (H3C)2N). 13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 168.00 (C=O); 53.93,

52.81, 48.16, 43.75, 42.02 (OCH3, GlyCH2, (CH3)2NCH2CH2). FAB-MS: 161.1 (100)

[M+H]+.


189

10.3 Fmoc-Aeg(CBhoc)-OH (82)

{[2-(4-Benzhydryloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-

amino)-ethyl]-amino}essigsäure

N

N

N

O

N

O

O

O

O N OH

OO

Summenformel: C39H35N5O8 M = 701.74 g/mol

Ansatz:

500 mg 699 µmol Fmoc-Aeg(CBhoc)-OMe (126)

43.8 mg 1.05 mmol LiOH*H2O

10 ml H2O

10 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 3. Das Rohprodukt wird in 30 ml Acetonitril für

30 min bei Rückflusstemperatur gerührt, abgesaugt und mit Acetonitril und Ether gewaschen.

Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

457 mg (651 µmol) = 93 % d.Th.


190

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.87 (m, 3 H, C(6)H, FmocCHarom.);

7.68 (d, 3J = 6.8, 2 H, FmocCHarom.); 7.36 (m, 16 H, 10 × BhocCHarom., 4 × FmocCHarom.,

2 ×NH); 6.94, 6.92 (je d, 3J = 7.3, zusammen 1 H, C(5)H); 6.80 (s, 1 H, BhocCH); 4.35 - 3.99

(m, 5 H, FmocCH, FmocCH2, GlyCH2); 4.82 (s, 1.1 H, N(1)CH2); 4.63 (s, 0.9 H, N(1)CH2);

3.44 - 3.10 (m, 4 H, CH2CH2). MALDI-TOF-MS: 700.64 (116) [M-H]-.

10.4 Fmoc-Aeg(H)-OMe (83)

[2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethylamino]essigsäure-methylester

NH

O

O

NH

O

O


Ansatz:

4.00 g 19.7 mmol H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124)

5.10 g 19.7 mmol Fmoc-Cl

12.9 ml 73.8 mmol DIPEA

500 ml DCM

Durchführung:

Man legt 4.00 g (19.7 mmol) H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124) in 400 ml DCM vor und kühlt die

Suspension im Eisbad ab. Nach der Zugabe von 12.9 ml (73.8 mmol) DIPEA wird zügig eine

Lösung von 5.10 g (19.7 mmol) Fmoc-Cl in 100 ml DCM zugetropft. Man lässt 30 min bei

RT rühren und entfernt danach das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. Nach

Säulenchromatographie (Silica, DCM/MeOH 20:1) erhält man das Produkt als farbloses Öl,

das langsam erstarrt.

Ausbeute:

5.12 g (14.4 mmol) = 73 % d.Th.


191

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 10:1): 0.60. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.78 (m, 2 H, Fmoc-

CHarom.); 7.60 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.35 (m, 4 H, FmocCHarom.); 5.48 (t(br), 1 H, NH); 4.44

(m, 2 H, FmocCH2); 4.21 (m, 1 H, FmocCH); 3.72 (s, 3 H, OCH3); 3.39 (s, 2 H, GlyCH2);

3.27 (dt aa q, 3J = 5.5, 2 H, FmocNHCH2); 2.75 (t, 3J = 5.5, 2 H, FmocNHCH2CH2); 1.80

(s(br), 1 H, NH). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 173.04 (COOMe); 156.75 (FmocC=O);

144.16 (FmocCarom.); 141.45 (FmocCarom.); 127.79 (FmocCHarom.); 127.18 (FmocCHarom.);

125.22 (FmocCHarom.); 120.09 (FmocCHarom.); 66.71 (FmocCH2); 52.01 (OCH3); 50.38,

48.79, 47.42, 40.75 (FmocCH, GlyCH2, CH2CH2). FAB-MS: 355.1 (100) [M+H] +.


192

10.5 CBhoc-AcOH (84)

4-N-(Benzhydryloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure

N

N

O

NH

OH

O

O

O


Ansatz:

16.2 g 34.5 mmol CBhoc-AcOMe (107)

15.9 g 37.9 mmol LiOH*H2O

250 ml Methanol

Durchführung:

16.2 g (34.5 mmol) CBhoc-AcOMe (107) werden in 250 ml Methanol suspendiert und danach

auf 0 °C abgekühlt. Nach der Zugabe von 15.9 g (37.9 mmol) LiOH*H2O lässt man 1 h bei

0 °C rühren. Anschließend gibt man eine Lösung von 36.5 g Zitronensäure (190 mmol) in

123 ml Wasser hinzu und saugt den entstandenen Niederschlag ab. Nach dem Trocknen im

Ölpumpenvakuum erhält man das Produkt in Form eines farblosen Feststoffs.

Ausbeute:

11.3 g (29.8 mmol) = 86 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 7.91 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(6)H); 7.46 - 7.26 (m, 10 H,

BhocCHarom.); 6.87 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H); 6.78 (s, 1 H, BhocCH); 4.27 (N(1)CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 170.01 (COOH); 162.51 (C(4)), 155.28 (BhocC=O);

152.60 (C(2)); 151.22 (C(6)), 140.53 (BhocCarom.); 128.63, 127.91, 126.52 (3 × BhocCHarom.);

93.33 (C(5)); 77.43 (BhocCH); 52.29 (N(1)CH2). FAB-MS: 409 (30) [M+Na]+; 386 (85)

[M+H]+; 167.1 (100).


193

10.6 H-Aeg(H)-OH (85)

N-(2-Aminoethyl)glycin

NH

OH

O

NH2


Ansatz:

4.60 g 50.0 mmol Glyoxylsäure Monohydrat (123)

8.97 g 149 mmol Ethylendiamin (122)

300 ml Wasser

2.00 g Pd/C (10 %)

1.12 l H2

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 4. Das zurückbleibende Öl versetzt man mit 100 ml

iso-Propanol und behandelt es im Ultraschallbad, wobei ein weißer Feststoff ausfällt. Man

lässt die Mischung über Nacht bei -20 °C im Kühlschrank stehen, filtriert den ausgefallenen

Feststoff ab und wäscht ihn mit kaltem iso-Propanol.

Ausbeute:

3.86 g (32.7 mmol) = 65 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 3.24 (s, 2 H, GlyCH2); 3.04 - 2.83 (m, 4 H, CH2CH2).

13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 178.26 (C=O); 51.56 (GlyCH2); 46.53 (NH2CH2CH2); 38.56

(NH2CH2CH2). FAB-MS: 119.1 (100) [M+H] +.


194

10.7 H-Aeg(H)-OH (85)

N-(2-Aminoethyl)glycin

NH

OH

O

NH2


Ansatz:

131 g 1.39 mol Chloressigsäure (243)

823 g 13.7 mol Ethylendiamin (122)

Durchführung:

Man legt 823 g (13.7 mol) Ethylendiamin (122) vor und kühlt im Eisbad. Unter heftigem

Rühren werden innerhalb von 8 h portionsweise 131 g (1.39 mol) Chloressigsäure (243) ein-

getragen. Dabei wird jeweils gewartet bis sich die vorangegangene Portion komplett gelöst

hat. Man rührt über Nacht bei RT nach und entfernt am nächsten Morgen überschüssiges

Ethylendiamin (122), das für weitere Ansätze aufgehoben wird. Der erhaltene Rückstand wird

mit 2 l DMSO versetzt und über Nacht kräftig gerührt, wodurch das Produkt als farbloser

Feststoff ausfällt. Man saugt es ab, wäscht es mit DMSO und Diethylether und trocknet es im

Ölpumpenvakuum.

Ausbeute:

116 g (980 mmol) = 70 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.6


195

10.8 F-CH2Br (92)

1-(Brommethyl)-2,4-difluor-5-methylbenzol

F

F

Br

Summenformel: C8H7BrF2 M = 221.05 g/mol

Ansatz:

20.0 g 156 mmol 2,4-Difluortoluol (71)

4.93 g 156 mmol Paraformaldehyd

15.8 g 70.0 mmol Zinkbromid

80 ml 33% HBr in Essigsäure

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 5. Dabei bleibt ein braunes Öl zurück, das säulenchro-

matographisch (Silica, CH) gereinigt wird. Man erhält das Produkt als farblose Flüssigkeit.

Ausbeute:

22.6 g (0.120 mol) = 66 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (CH): 0.34. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.20 (dd aa t, 2 × J = 8.3, 1 H, CHarom.);

6.77 (dd aa t, 2 × J = 9.6, 1 H, CHarom.); 4.46 (s, 2 H, CH2); 2.23 (s, 3 H, CH3). 13C-NMR

(50 MHz, CDCl3): δ = 161.28 (dd, 1J(C,F) = 250, 3J(C,F) = 11.9, C(4)); 159.01 (dd, 1J(C,F) = 250, 3J(C,F) = 12.3, C(2)); 133.21 (dd, 3J(C,F) = 6.90, 3J(C,F) = 4.20, C(6)); 120.91

(dd, 2J(C,F) = 29.1, 3J(C,F) = 4.20, C(5)); 121.23 (dd, 2J(C,F) = 26.1, 4J(C,F) = 4.20, C(1));

103.89 (dd, 2J(C,F) = 24.9, 2J(C,F) = 26.5, C(3)); 25.39 (d, 3J(C,F) = 3.8, CH2); 14.01 (d, 3J(C,F) = 3.10, CH3).

19F-NMR (565 MHz, DMSO-d6): -111.49 (m, 1 F, F(4)); -115.88

(m, 1 F, F(2)). EI-MS: 268 (72) [M+2Na]+; 253 (100); 141.0 (78) [M-Br]+.


196

10.9 F’-CH2Br (95)

1-(Brommethyl)-2,4-difluor-benzol

F

F

Br

Summenformel: C7H5BrF2 M = 207.02 g/mol

Ansatz:

2.28 g 20.0 mmol 1,3-Difluorbenzol (93)

600 mg 20.0 mmol Paraformaldehyd

900 mg 4.00 mmol Zinkbromid

10 ml 33% HBr in Essigsäure

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 5. Man erhält das Produkt nach säulenchromatogra-

phischer Reinigung (Silica, CH) als farblose Flüssigkeit.

Ausbeute:

1.66 g (8.02 mmol) = 40 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (CH): 0.14. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.43 - 7.31 (m, 1 H, CHarom.); 6.92 - 6.77

(m, 2 H, 2 × CH); 4.48 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 163.51 (dd,

1J(C,F) = 251, 3J(C,F) = 11.9, C(4)); 163.74 (dd, 1J(C,F) = 253, 3J(C,F) = 12.3, C(2)); 132.48

(dd, 3J(C,F) = 9.90, 3J(C,F) = 4.60, C(6)); 121.74 (dd, 2J(C,F) = 14.6, 4J(C,F) = 4.90, C(1));

112.20 (dd, 2J(C,F) = 21.8, 4J(C,F) = 3.80, C(5)); 104.74 (dd aa t, 2 × 2J(C,F) = 25.4, C(3));

25.36 (d, 3J(C,F) = 4.20, CH2). FAB-MS: 253.3 (100) [M+2Na]+.


197

10.10 F’-AcOH (96)

(2,4-Difluor-phenyl)essigsäure

O

F

F

OH

Summenformel: C8H6F2O4 M = 172.13 g/mol

Ansatz:

3.00 g 14.5 mmol 1-(Brommethyl)-2,4-difluor-benzol (95)

4.87 g 26.0 mmol Magnesiumspäne

30 ml Diethyletherabs.

nach Bedarf Trockeneis

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 2. Man erhält das Produkt nach säulenchromatogra-

phischer Reinigung (Silica, DCM/MeOH 10:1) als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

1.40 g (8.13 mmol) = 56 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 10:1): 0.57. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 10.03 (s(br), 1 H, COOH);

7.05 (m 1 H, CHarom.); 6.71 (m, 2 H, 2 × CHarom.); 3.43 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR (50 MHz,

CDCl3): δ = 177.57 (d, 4J = 2.6, C=O); 162.25 (dd, 1J(C,F) = 248, 3J(C,F) = 12.3, C(4));

161.09 (dd, 1J(C,F) = 248, 3J(C,F) = 11.1, C(2)); 132.23 (m, C(6)); 117.93 (m, C(1)); 111.22

(dd, 2J(C,F) = 21.1, 4J(C,F) = 2.30, C(5)); 103.78 (dd aa t, 2 × 2J(C,F) = 26.5, C(3)); 34.74 (d, 3J(C,F) = 2.70, CH2). EI-MS: 172.0 (26) [M]+•; 127.0 (100) [M+-COOH].


198

10.11 A-AcOBn (104)

Adenin-9-essigsäure-benzylester

N N

N N

NH2

O

O


Ansatz:

6.76 g 50.0 mmol Adenin (103)

2.40 g 60.0 mmol NaH 60%ig in Mineralöl

12.6 g 55.0 mmol Bromessigsäure-benzylester

230 ml DMF

130 ml Wasser

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 6. Nach Trocknung im Ölpumpenvakuum erhält man

das Produkt in Form eines farblosen Feststoffs.

Ausbeute:

9.90 g (34.9 mmol) = 70 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.14 (s, 2 H, C(2)H, C(8)H); 7.36 (s, 5 H, BnCHarom.);

7.29 (s, 2 H, NH2); 5.20 (s, 2 H, CH2); 5.15 (s, 2 H, CH2). FAB-MS: 307.0 (20) [M+Na]+;

284.0 (100) [M+H]+.


199

10.12 C-AcOBn (105)

Cytosin-1-essigsäure-benzylester

N

N

O

NH2

O

O


Ansatz:

20.6 g 185 mmol Cytosin (86)

23.2 g 207 mmol Kalium-tert-butoxid

46.7 g 204 mmol Bromessigsäure-benzylester

300 ml DMF

250 ml Wasser

Durchführung:

20.6 g (185 mmol) Cytosin (86) und 23.2 g (207 mmol) Kalium-tert-butoxid werden in

300 ml DMF suspendiert und anschließend unter Argon-Schutzgasatmosphäre 2 h bei 100 °C

gerührt. Anschließend wird die Suspension zunächst langsam auf RT und dann auf 0 °C

abgekühlt. Nachdem innerhalb von 30 min 46.7 g (204 mmol) Bromessigsäure-benzylester

hinzugetropft wurden, wird die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktion

wird durch Zugabe von 12 ml Essigsäure gequencht und das Lösungsmittel am Trockeneis-

Rotationsverdampfer entfernt. Man versetzt den Rückstand mit 250 ml Wasser und lässt 1 h

kräftig rühren. Dann wird der Rückstand abgesaugt, ausgiebig mit Wasser gewaschen und im

Ölpumpenvakuum getrocknet.

Ausbeute:

46.5 g (179 mmol) = 97 % d.Th.


200

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 7.58 (d, 3J = 7.3, 2 H, C(6)H); 7.17 (d(br), 3J = 8.3,

2 H, NH2); 7.36 (s, 5 H, BnCHarom.); 5.69 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H); 5.16 (s, 2 H, GlyCH2);

4.51 (s, 2 H, N(1)CH2). FAB-MS: 260.1 (35) [M+H]+; 167.1 (100).

10.13 ABhoc-AcOBn (106)

6-N-(Benzhydryloxycarbonyl)adenin-9-essigsäure-benzylester

N N

N N

NH

O

O

O

O


Ansatz:

9.90 g 34.9 mmol A-AcOBn (104)

8.49 g 52.4 mmol CDI

9.65 g 52.4 mmol Benzhydrol

50 ml DMF

200 ml Wasser

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 7. Der Rückstand wird säulenchromatographisch

aufgereinigt (Silica, 30 % EtOAc in CH → 70 % EtOAc in CH, Gradient in Schritten von je

10 %, je ein Säulenvolumen).

Ausbeute:

11.6 g (23.5 mmol) = 67 % d.Th.


201

Analysedaten:

Rf (30 % EtOAc in CH): 0.53. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.96 (s, 1 H,

BhocNH); 8.63 (s, 1 H, C(2)H); 8.47 (s, 1 H, C(8)H); 7.56 - 7.28 (m, 15 H, BnCHarom.,

BhocCHarom.); 6.83 (s, 1 H, BhocCH); 5.29 (s, 2 H, CH2); 5.21 (s, 2 H, CH2).

10.14 CBhoc-AcOBn (107)

4-N-(Benzhydryloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure-benzylester

N

N

O

NH

O

O

O

O


Ansatz:

13.7 g 52.8 mmol C-AcOBn (105)



350 ml THFabs.

50 ml Methanol

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 8. Der so erhaltene Rückstand wird mit 500 ml

Ethanol versetzt und 30 min bei Rückflusstemperatur gerührt. Anschließend wird das Produkt

in Form eines farblosen Feststoffs abgesaugt.

Ausbeute:

16.2 g (34.5 mmol) = 65 % d.Th.


202

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.08 (s, 1 H, BhocNH); 8.07 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(6)H);

7.49 - 7.25 (m, 15 H, 5 × BnCHarom., 10 × BhocCHarom.); 7.00 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H); 6.82

(s, 1 H, BhocCH); 5.19 (s, 2 H, BnCH2); 4.71 (s, 2 H, N(1)CH2). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6): δ = 167.89 (COOBn); 163.42 (C(4)); 154.98 (BhocC=O); 152.30 (C(2)); 150.40

(C(6)); 140.33 (BhocCarom.); 135.54 (BnCarom.); 128.55, 128.45, 128.18, 127.92, 127.87,

126.46 (3 × BnCHarom., 3 × BhocCHarom.); 94.20 (C(5)); 77.52 (BhocCH); 66.41 (BnCH2);

50.67 (N(1)CH2). FAB-MS: 492.1 (29) [M+Na]+; 470.1 (36) [M+H]+, 167.1 (100).


203

10.15 ABhoc-AcOH (108)

6-N-(Benzhydryloxycarbonyl)adenin-9-essigsäure

N N

N N

NH

O

O

OH

O


Ansatz:

11.6 g 23.5 mmol ABhoc-AcOBn (106)

90 ml 1 M NaOH

45 ml Ethanol

45 ml Acetonitril

Durchführung:

11.6 g (23.5 mmol) ABhoc-AcOBn (106) werden in 45 ml Ethanol und 45 ml Acetonitril ge-

löst, mit einem Eisbad gekühlt und mit 90 ml 1 M NaOH-Lösung versetzt. Nach 1 h Rühren

bei 0 °C wird die Reaktionsmischung mit 20%iger Zitronensäure-Lösung auf pH-Wert 2-3

eingestellt. Der entstehende Feststoff wird abgesaugt, mit 200 ml Wasser und etwas Diethyl-

ether gewaschen und im Ölpumpenvakuum getrocknet.

Ausbeute:

7.60 g (18.8 mmol) = 80 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.94 (s, 1 H, BhocNH); 8.62 (s, 1 H, C(2)H); 8.45 (s,

1H, C(8)H); 7.55 - 7.28 (m, 10 H, BhocCarom.); 6.83 (s, 1 H, BhocCH); 5.09 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 169.01 (COOMe); 152.11, 151.64, 151.13 (C(2), C(4),

BhocC=O); 149.34 (C(6)); 144.81 (C(8)); 140.84 (BhocCarom.); 128.44 (Bhoc-o-CHarom.);

127.66 (Bhoc-p-CHarom.) 126.48 (Bhoc-m-CHarom.); 122.68 (C(5)); 77.24 (BhocCH2); 44.24

(N(9)CH2). FAB-MS: 426.0 (10) [M+Na]+; 404.0 (7) [M]+; 154.0 (100).


204

10.16 ABhoc-AcOH (108)

6-N-(Benzhydryloxycarbonyl)adenin-9-essigsäure

N N

N N

NH

O

O

OH

O


Ansatz:

10.0 g 23.2 mmol ABhoc-AcOEt (121)

90 ml 1 M NaOH

45 ml Ethanol

45 ml Acetonitril

Durchführung:

s. 10.15

Ausbeute:

8.34 g (20.7 mmol) = 88 % d.Th.

Analysedaten:

s. 10.15


205

10.17 T-AcOH (109)

Thymin-1-essigsäure

N

NH

O

O

OH

O


Ansatz:

10.0 g 79.3 mmol Thymin (72)

11.0 g 80.0 mmol K2CO3

7.60 ml 80.0 mmol Bromessigsäure-methylester

80 ml 1 M NaOH

240 ml DMF

Durchführung:

Zu einer Suspension aus 10.0 g (79.3 mmol) Thymin (72) und 11.0 g (80.0 mmol) K2CO3 in

DMF werden 12.3 g (80.0 mmol, 7.60 ml) Bromessigsäure-methylester innerhalb von 10 min

zugetropft. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei RT gerührt, filtriert und bis zur

Trockenheit eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser (70 ml) und 4 M HCl (3.2 ml)

behandelt und 30 min gerührt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen

(2 × 40 ml). Zu dem Feststoff werden 80 ml 1 M NaOH gegeben. Die Lösung wird für 10 min

unter Rückfluss gerührt, dann auf 0 °C abgekühlt, vorsichtig mit 30 ml 4 M HCl versetzt und

30 min gerührt. Das Produkt wird durch Filtration erhalten und dreimal mit je 50 ml Wasser

und einmal mit 40 ml Diethylether gewaschen. Abschließend wird es im Ölpumpenvakuum

getrocknet.

Ausbeute:

9.05 g (49.2 mmol) = 62 % d.Th.


206

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 13.11 (s(br), 1 H, COOH); 11.34 (s, 1 H, NH); 7.49 (d,

3J = 1.3, 1 H, CH); 4.36 (s, 2 H, CH2); 1.75 (s, 3 H, CH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6):

δ = 169.71 (COOH); 164.40 (C(4)); 151.03 (C(2)); 141.84 (C(6)); 108.38 (C(5)); 48.43

(CH2); 11.94 (CH3). FAB-MS: 207.0 (5) [M+Na]+; 185.0 (36) [M]+; 154.0 (100).

10.18 GBhoc-AcOH (110)

(2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure

N N

N NH

O

NH

OH

O

OO


Ansatz:

19.0 g 37.0 mmol (2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essig-

säure-benzylester (113)

7.16 g 180 mmol NaH 60%ig in Mineralöl

12.2 ml 180 mmol 3-Hydroxypropionitril

200 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 9. Anschließend wird das Lösungsmittel am Rotati-

onsverdampfer entfernt und der Rückstand in 150 ml Wasser aufgenommen. Man stellt den

pH-Wert der Lösung mit 20%iger Zitronensäure-Lösung auf 4 ein und kühlt auf 0 °C ab. Der

entstandene Feststoff wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und aus Methanol um-

kristallisiert.

Ausbeute:

5.32 g (15.5 mmol) = 58 % d.Th.


207

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.71 (s, 1 H, NH); 11.24 (s, 1 H, NH); 7.93 (s, 1 H,

C(8)H); 7.48 - 7.26 (m, 1 H, 10 × BhocCHarom.); 6.86 (s, 1 H, BhocCH); 4.87 (CH2).

13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 169.96 (COOH); 157.53, 155.98, 154.24, 149.46,

147.84 (C(2), C(4), C(6), C(8), BhocC=O); 140.55 (BhocCarom.); 128.05, 127.78, 126.42,

(BhocCHarom.); 118.91 (C(5)); 77.55 (BhocCH); 46.89 (CH2). FAB-MS: 464.1 (4) [M+2Na];

442.1 (14) [M+Na]+; 420.2 (3), [M+H]+; 154.0 (100).


208

10.19 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-benzylester (112)

N N

N N

Cl

NH2

O

O

Summenformel: C14H12ClN5O2 M = 317.74 g/mol

Ansatz:

50.0 g 295 mmol 2-Amino-6-chlor-purin (111)

60.1 g 437 mmol K2CO3

50.3 ml 322 mol Bromessigsäure-benzylester

500 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 10. Das erhaltene Rohprodukt wird aus Acetonitril

umkristallisiert. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

65.4 g (205 mmol) = 71 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.13 (s, 1 H, C(8)H); 7.37 (s, 5 H, BnCHarom.); 7.01 (s,

2 H, NH2); 5.20 (s, 2 H, BnCH2); 5.07 (s, 2 H, N(9)CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6):

δ = 167.63 (COOBn); 159.97, 154.27, 149.51, 143.44 (C(2), C(4), C(6), C(8)); 135.31

(BnCarom.); 128.50, 128.30, 128.09 (3 × BnCHarom.); 122.94 (C(5)); 66.79 (BnCH2); 44.07

(N(9)CH2). FAB-MS: 340.0 (5) [M+Na]+; 318.0 (100) [M+H]+.


209

10.20 (2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-benzylester (113)

N N

N N

Cl

NH

O

O

OO

Summenformel: C28H22ClN5O4 M = 527.97 g/mol

Ansatz:

31.0 g 97.6 mmol (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-benzylester (112)

10.8 g 36.4 mmol Triphosgen

21.5 g 117 mmol Diphenylcarbinol

36.8 ml 215 mmol DIPEA

500 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 11. Der Rückstand wird in 500 ml DCM aufgenom-

men und mit 10%iger Zitronensäure-Lösung, ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen.

Nach dem Trocknen über MgSO4 wird das DCM am Rotationsverdampfer entfernt und der

Rückstand aus Methanol umkristallisiert. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

34.7 g (65.8 mmol) = 67 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.02 (s, 1 H, BhocNH); 8.52 (s, 1 H, C(8)H); 7.54 -

7.27 (m, 15 H, 5 × BnCHarom.., 10 × BhocCHarom.); 6.83 (s, 1 H, BhocCH); 5.22 (BnCH2); 5.19

(N(9)CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 167.28 (COOBn); 153.13, 152.30, 150.91,

149.25, 146.72 (C(2), C(4), C(6), C(8), BhocC=O); 140.84 (BhocCarom.); 135.17 (BnCarom.);

128.48, 128.44, 128.23, 127.97, 127.70, 126.77, 126.45 (3 × BnCHarom., 3 × BhocCHarom.,

C(5)); 77.06 (BhocCH); 66.89 (BnCH2); 44.47 (N(9)CH2). FAB-MS: 550.1 (29) [M+Na]+;

528.1 (63) [M+H]+; 167.1 (100).


210

10.21 A-AcOEt (120)

Adenin-9-essigsäure-ethylester

N N

N N

NH2

O

O


Ansatz:

50.0 g 370 mmol Adenin (103)

17.8 g 445 mmol NaH (60%ig in Mineralöl)

45.1 ml 408 mmol Bromessigsäure-ethylester

1 l DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 6. Der entstandene beige Feststoff wird in 500 ml

Ethanol für 45 min zum Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf RT saugt man das Produkt

in Form farbloser Kristalle ab, wäscht es mit Ethanol und trocknet es im Ölpumpenvakuum.

Ausbeute:

55.6 g (251 mmol) = 67 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.14 (s, 1 H, C(2)H); 8.12 (s, 1 H, C(8)H); 7.30 (s(br),

2 H, NH2); 5.07 (s, 2 H, N(9)CH2); 4.16 (q, 3J = 7.1, 2 H, CH2CH3); 1.20 (t, 3J = 7.1, 3 H,

CH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 168.00 (C=O); 155.99 (C(6)); 152.68 (C(2));

149.73 (C(4)); 141.29 (C(8)); 118.27 (C(5)); 61.37 (CH2CH3); 43.94 (N(9)CH2); 14.00 (CH3).

FAB-MS: 221.1 (100) [M+H]+.


211

10.22 ABhoc-AcOEt (121)

6-N-(Benzhydryloxycarbonyl)adenin-9-essigsäure-ethylester

N N

N N

NH

O

O

O

O


Ansatz:

7.72 g 34.9 mmol A-AcOEt (120)



50 ml DMF

200 ml Wasser

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 7. Das Rohprodukt wird abgesaugt, mit Wasser

gewaschen und aus Ethanol umkristallisiert. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum erhält man

das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

10.1 g (23.4 mmol) = 67 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.96 (s, 1 H, BhocNH); 8.63 (s, 1 H, C(2)H); 8.45 (s,

1 H, C(8)H); 7.77 - 7.19 (m, 10 H, BhocCHarom.); 6.83 (s, 1 H, BhocCH); 5.20 (s, 2 H,

N(9)CH2); 4.18 (q, 3J = 7.1, 2 H, CH2CH3); 1.21 (t, 3J = 7.1, 3 H, CH3). FAB-MS: 454.0 (19)

[M+Na]+; 432.0 (23) [M]+; 388.0 (24) [M-CO2]+; 167.0 (100).


212

10.23 H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124)

(2-Amino-ethylamino)essigsäure-methylester Dihydrochlorid

NH

O

O

NH2

*2HCl


Ansatz:

93.0 g 787 mmol Aeg (85)

138 ml 1.90 mol Thionylchlorid

1.5 l Methanol

Durchführung:


Ausbeute:

130 g (641 mmol) = 81 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 4.14 (s, 2 H, GlyCH2); 3.86 (s, 3 H, OCH3); 3.56 - 3.39 (m,

4 H, CH2CH2). 13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 167.73 (C=O); 54.03 (OCH3); 48.03

(GlyCH2); 39.81 (NH2CH2CH2); 35.79 (NH2CH2). FAB-MS: 154.0 (100) [M+Na]+; 133.1

(70) [M]+.


213

10.24 Fmoc-Aeg(ABhoc)-OMe (125)

{[2-(6-Benzhydryloxycarbonylamino-purin-9-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-

amino}essigsäure-methylester

O

ONH

N

O

N N

N N

O NH

O

OO


Ansatz:

1.77 g 5.00 mmol Fmoc-Aeg(H)-OMe (83)

2.02 g 5.00 mmol ABhoc-AcOH (108)

1.64 g 5.00 mmol TOTU

871 µl 5.00 mmol DIPEA

10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Man erhält das Produkt nach säulenchromatographi-

scher Reinigung (Silica, DCM/MeOH 80:1) als farblosen Schaum.

Ausbeute:

2.72 g (3.68 mmol) = 74 % d.Th.


214

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 30:1): 0.15. 1H-NMR (2 Rotamere) (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.93 (s,

1 H, BhocNH); 8.60 (s, 0.30 H, C(2)H); 8.55 (s, 0.60 H, C(2)H); 8.34 (s, 1 H, C(8)H); 7.87 (d, 3J = 7.3, 2 H, FmocCHarom.); 7.67 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.54 (d, 3J = 7.1, 4 H,

FmocCHarom.); 7.34 (m, 11 H, BhocCHarom., FmocNH); 6.84 (s, 1 H, BhocCH); 5.38 (s, 1.08,

N(9)CH2); 5.20 (s, 0.75, N(9)CH2); 4.47 - 4.22 (m, 4 H, FmocCH, FmocCH2, GlyCH); 4.11

(s, 1 H, GlyCH); 3.76 (s, 0.85, OCH3); 3.61 (s, 2.15 H, OCH3); 3.83 - 3.19 (m(br), CH2CH2). 13C-NMR (2 Rotamere) (50 MHz, DMSO-d6): δ = 169.89 (COOMe); 169.41 (COOMe);

167.12 (N(9)CH2CO); 166.78 (N(9)CH2CO); 156.47, 156.18, 154.03, 152.31, 151.56, 151.13,

149.28 (FmocC=O, BhocC=O, C(2), C(4), C(6)); 145.19, 143.88, 140.91, 140.77 (C(8),

BhocCarom., 2 × FmocCarom.); 128.47, 127.69, 127.62, 127.14, 127.05, 125.09, 124.95

(BhocCHarom., FmocCHarom.); 122.62 (C(5)); 120.14 (FmocCHarom.); 77.29 (BhocCH); 65.52

(FmocCH2); 54.92, 52.37, 51.82, 46.75 (GlyCH2, OCH3, N(9)CH2, CH2CH2, FmocCH). FAB-

MS: 762.3 (47) [M+Na]+; 740 (37) [M+H]+; 696.3 (40) [M-NH=C=O]+; 167.1 (100).


215

10.25 Fmoc-Aeg(CBhoc)-OMe (126)

{[2-(4-Benzhydryloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl-

amino)-ethyl]-amino}essigsäure-methylester

N

N

NH

O

N

O

O

O

O NH

O

OO


Ansatz:


2.02 g 5.00 mmol CBhoc-AcOH (84)



10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Man kristallisiert aus Acetonitril um und erhält das

Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

1.33 g (1.86 mmol) = 37 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 11.01 (s, 1 H, BhocNH); 7.87 (m, 3 H,

C(6)H, FmocCHarom.); 7.69 (d, 3J = 7.1, 2 H, FmocCHarom.); 7.52 (m, 16 H, 10 × BhocCHarom.,

4 × FmocCHarom., 2 × NH); 6.94 (d(br), 3J = 7.2, 1 H, C(5)H); 6.80 (s, 1 H, BhocCH); 4.83 (s,

1.2 H, N(1)CH2); 4.64 (s, 0.8 H, N(1)CH2); 4.36 - 4.08 (m, 5 H, FmocCH, FmocCH2,

GlyCH2); 3.71 (s, 0.9 H, OCH3); 3.62 (s, 2.1 H, OCH3); 3.47 - 3.10 (m, 4 H, CH2CH2).


216

10.26 Fmoc-Aeg(GBhoc)-OH (127)

{[2-(2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-

carbonylamino)-ethyl]-amino}essigsäure

N

O

N

O

ON

N NH

O

NH

O NH

OH

OO


Ansatz:

200 mg 588 µmol Fmoc-Aeg(H)-OH (129)

247 mg 588 µmol GBhoc-AcOH (110)

73.8 µl 600 µmol Pivaloylchlorid (130)

130 µl 1.18 mmol NMM

nach Bedarf Triethylamin

6 ml Acetonitril

2 ml DMF

2 ml Wasser

Durchführung:

Zu einer Lösung von 247 mg (588 µmol) GBhoc-AcOH (110) und 130 µl (1.18 mmol) NMM in

5 ml MeCN/DMF (3:2) werden bei 0 °C 73.8 µl (600 µmol) Pivaloylchlorid gegeben. An-

schließend wird der Ansatz für 20 min bei 0 °C gerührt. Parallel suspendiert man

200 mg (588 µmol) Fmoc-Aeg(H)-OH (129) in 5 ml MeCN/H2O (3:2) und bringt den

Feststoff durch tropfenweise Zugabe von Triethylamin in Lösung. Danach gibt man die

Lösung zur ersten Reaktionsmischung, rührt 20 min bei RT und stellt anschließend mit

20%iger Zitronensäure-Lösung auf pH 4 ein. Die Lösungsmittel werden bei einer Badtempe-

ratur von 40 °C am Trockeneis-Rotationsverdampfer entfernt, der Rückstand in 2 ml

Methanol aufgenommen und tropfenweise zu 25 ml Eiswasser gegeben. Der resultierende

Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser und Diethylether gewaschen und im Vakuum

getrocknet. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.


217

Ausbeute:

311 mg (419 µmol) = 71 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.90 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.81, 7.80

(je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.66 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.37 (m, 16 H, 10 × BhocCHarom.,

4 × FmocCHarom., 2 × NH); 6.86 (s, 1 H, BhocCH); 5.1 (s, 1.1 H, N(9)CH2); 4.94 (s, 0.9 H,

N(9)CH2); 4.39 - 4.01 (m, 5 H, FmocCH, FmocCH2, GlyCH2); 3.49 - 3.14 (m, 4 H, CH2CH2).

MALDI-TOF-MS: 762.34 (125) [M-H+Na]-.

10.27 Fmoc-Aeg(F)-OH (128a)

{[2-(2,4-Difluor-5-methyl-phenyl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-amino}-

essigsäure-methylester

N

O

O NH

OH

OO

F

F

Summenformel: C28H26F2N2O5 M = 508.53 g/mol

Ansatz:

565 mg 1.00 mmol Fmoc-Aeg(F)-OMe (135a)

400 mg 3.00 mmol AlCl3

3 ml Ethanthiol (137)

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 13. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch

(Silica, DCM/MeOH 30:1) gereinigt. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.


218

Ausbeute:

473 mg (930 µmol) = 93 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):δ =7.87 (d, 3J = 7.6, 2 H, FmocCHarom.);

7.66 (d, 3J = 7.6, 2 H, FmocCHarom.); 7.50 (s(br), 1 H, FmocNH); 7.35 (m, 4 H, FmocCHarom.);

7.24 - 6.92 (m, 2 H, FCHarom.); 4.47 - 4.12 (m, 3 H, FmocCH, FmocCH2); 3.96 (s, 1.01 H,

FCH2); 3.92 (s, 0.89 H, FCH2); 3.67 (s, 0.78 H, GlyCH2); 3.53 (s, 1.22 H, GlyCH2); 3.45 (t, 3J = 6.1, 0.78 H, FmocNHCH2CH2); 3.37 (t, 3J = 6.1, 1.16 H, FmocNHCH2CH2); 3.23 (m,

0.88 H, FmocNHCH2CH2); 3.15 (m, 1.17 H, FmocNHCH2CH2); 2.13 (s, 1.5 H, CH3); 2.10 (s,

1.5 H, CH3). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 160.00 (C=O); 159.87

(C=O); 156.26 (FmocC=O); 156.06 (FmocC=O); 143.86 (FmocCarom.); 143.79 (FmocCarom.);

140.70 (FmocCarom.); 140.64 (FmocCarom.); 133.72 (m, FC(6)); 133.43 (m, FC(6)); 127.53

(FmocCHarom.); 127.03 (FmocCHarom.); 125.19 (FmocCHarom.); 125.03 (FmocCHarom.); 119.68

(m, FC(5)); 119.18 (m, FC(1)); 102.24 (m, FC(3)); 65.47 (FmocCH2); 52.20 (FmocCH);

48.27 (s(br), FmocNHCH2CH2); 47.80 (s(br), FmocNHCH2CH2); 47.09 (GlyCH2); 46.70

(GlyCH2); 38.64 (s(br), FmocNHCH2CH2); 38.21 (s(br), FmocNHCH2CH2); 32.20 (FCH2);

31.88 (FCH2); 13.35 (CH3). Die 13C-Signale für FC(2) und FC(4) sind aufgrund der

Aufspaltung und der damit verbundenen geringen Intensität nicht zu sehen. 19F-NMR

(2 Rotamere) (545 MHz, DMSO-d6): = -115.85 (m, 0.44 F, F(4)); -116.11 (m, 0.56 F,

F(4)); -116.32 (m, 0.44 F, F(2)); -116.52 (m, 0.56 F, F(2)). FAB-MS: 154.0 (100); 509.1 (19)

[M+H]+, 531.1 (20) [M++Na]. MALDI-TOF-MS: 507.5 (55) [M-H]-.


219

10.28 Fmoc-Aeg(F’)-OH (128b)

{[2-(2,4-Difluor-phenyl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-amino}essigsäure-

methylester

N

O

O N OH

OO

F

F


Ansatz:

500 mg 983 µmol Fmoc-Aeg(F’)-OMe (135b)

393 mg 2.95 mmol AlCl3

5 ml Ethanthiol

Durchführung:


(Silica, DCM/MeOH 30:1) gereinigt. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

358 mg (724 µmol) = 74 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 12.7 (s(br), 1 H, COOH); 7.88 (d, 3J = 7.2, 2 H, FmocCHarom.); 7.68 (d, 3J = 7.1, 2 H, FmocCHarom.); 7.41 - 7.10 (m, 7 H,

4 × FmocCHarom., 2 × F’CHarom., FmocNH); 6.98 (m, 1 H, F’CHarom.); 4.00 (m, 3 H,

FmocCH2, FmocCH); 3.92 (s, 2 H, F’CH2); 3.75, 3.60 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.49 -

3.15 (m(br), 4 H, CH2CH2). FAB-MS: 495.2 (28) [M+H]+; 517.1 (82) [M+Na]+; 179.1 (100).


220

10.29 Fmoc-Aeg(F4)-OH (128c)

{[2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-[2-(2-fluor-4-trifluormethyl-phenyl)-acetyl]-amino}-

essigsäure

N

O

O N OH

OO

F

FFF


Ansatz:

3.00 g 5.22 mmol Fmoc-Aeg(F4)-OMe (135c)

2.09 g 15.7 mmol AlCl3

16.1 ml Ethanthiol

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 13. Nach Säulenchromatographie (Silica,

Toluol/MeOH/Essigsäure 53:8:8) erhält man das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

2.49 g (4.57 mmol) = 88 % d.Th.


221

Analysedaten:

Rf (Toluol/MeOH/AcOH 53:8:8): 0.35. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 7.88 (d(br), 3J = 7.3, 2 H, FmocCHarom.); 7.81 (m(br), 2 H, FmocCHarom.); 7.59 - 7.29 (m,

8 H, 3 × F4CHarom., 4 × FmocCHarom., NH); 4.35 - 4.25 (m, 3 H, FmocCH2, FmocCH); 3.98,

3.89 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.73, 3.50 (je s, zusammen 2 H, F4CH2); 3.50 - 3.14 (m,

4 H, F4CH2, FmocNHCH2CH2). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 171.23

(COOH); 170.69 (COOH); 169.41 (GlyC=O); 168.94 (GlyC=O); 160.42 (dq aa dm, 1J(C,F) = 247, F4C(2)); 156.36 (FmocC=O); 156.13 (FmocC=O); 143.87 (FmocCarom.);

143.84 (FmocCarom.); 140.74 (FmocCarom.); 140.70 (FmocCarom.); 133.22 (d, 3J(C,F) = 4.42,

F4C(1)); 133.02 (d, 3J(C,F) = 4.56, F4C(6)); 129.24 (dq aa m, F4C(4)); 128.23 (d, 2J(C,F) = 16.9, F4C(1)); 127.57 (FmocCHarom.); 127.02 (FmocCHarom.); 125.12 (FmocCHarom.);

125.04 (FmocCHarom.); 126.98 (FmocCHarom.); 123.89 (dq, 1J(C,F) = 272, 4J(C,F) = 2.30,

F4CH3); 120.83 (dq aa m, F4C(5)); 120.07 (FmocCHarom.); 119.95 (FmocCHarom.); 112.25 (dq

aa dm, 2J(C,F) = 26.7, F4C(3)); 65.47 (FmocCH2); 65.39 (FmocCH2); 50.40, 50.38 49.82,

48.59, 46.80; 45.72; (FmocCH, GlyCH2, FmocNHCH2CH2); 38.74 (FmocNHCH2); 38.13

(FmocNHCH2); 32.82 (F4CH2); 32.45 (F4CH2). 19F-NMR (235 MHz, DMSO-d6)

(Rotamere): δ = -64.28 (s, 3 F, CF3), -117.21 (m, 0.7 F, F4C(2)F); -117.57 (m, 0.7 F,

F4C(2)F). FAB-MS: 589.1 (18) [M+2Na]+; 567.1 (100) [M+Na]+; 545.1 (20) [M+H]+.


222

10.30 Fmoc-Aeg(H)-OH (129)

[2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethylamino]essigsäure

NH

O NH

OH

OO


Ansatz:

3.00 g 25.4 mmol H-Aeg(H)-OH (85)

8.04 ml 63.3 mmol SiMe3Cl

8.04 g 23.8 mmol Fmoc-OSu

11.2 ml 101 mmol NMM

51 ml DCM

3 ml DMF

Durchführung:

3.00 g (25.4 mmol) H-Aeg(H)-OH (85) werden fein gemörsert und in einer Mischung aus

51 ml DCM und 3 ml DMF suspendiert. Man gibt 8.04 ml (6.88 g, 63.3 mol) SiMe3Cl hinzu

und rührt 40 min bei RT. Danach wird auf 0 °C abgekühlt und mit 8.04 g (23.8 mmol)

Fmoc-OSu versetzt. Anschließend werden innerhalb von 30 min 11.2 ml (10.3 g, 101 mmol)

NMM hinzugetropft. Man rührt 2 h bei RT, gibt 6 ml Methanol hinzu und rührt weitere

20 min. Dann werden 60 ml Ethylacetat hinzugegeben und es wird weitere 20 min gerührt.

Man saugt den Feststoff ab, wäscht ihn mit Ethylacetat und trocknet ihm im Membranpum-

penvakuum. Danach wird der Feststoff in 90 ml Wasser aufgenommen und die entstandene

Suspension 1 h bei RT gerührt. Man saugt ab, suspendiert den Feststoff in 150 ml Methanol,

rührt 30 min bei RT, saugt erneut ab und wäscht mit Methanol. Nach dem Trocknen im

Ölpumpenvakuum erhält man das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

2.94 g (8.64 mmol) = 34 % d.Th.


223

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 7.89 (d, 3J = 6.8, 2 H, FmocCHarom.); 7.68 (d, 3J = 7.2,

2 H, FmocCHarom.); 7.60 - 7.21 (m, 4 H, FmocCHarom.); 4.35 (d, 3J = 6.9, 2 H, FmocCH2); 4.23

(t, 3J = 6.9, 1 H, FmocCH); 3.88 (s, 2 H, GlyCH2); 3.45 - 3.16 (m, 2 H, FmocNHCH2CH2);

3.03 (m, 2 H, FmocNHCH2CH2). FAB-MS: 363.0 (36) [M+Na]+; 341.0 (100) [M]+.

10.31 Fmoc-Aeg(T)-OH (132)

{[2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-[2-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydro-2H-pyrimidin-1-yl)-ac

etyl]-amino}essigsäure

N

NH

O

O

NOH

O

NH

O

OO


Ansatz:

764 mg 4.15 mmol T-OAc (109)

1.43 g 4.15 mmol Fmoc-Aeg(H)-OH (129)

536 µl 4.36 mmol Pivaloylchlorid (130)

915 µl 8.30 mmol NMM

nach Bedarf Triethylamin

15 ml Acetonitril

20 ml Acetonitril / H2O (4:3)


224

Durchführung:

Zu einer Lösung von 764 mg (4.15 mmol) T-AcOH (109) und 915 µl (8.30 mmol) NMM in

15 ml Acetonitril werden bei 0 °C 536 µl (4.36 mmol) Pivaloylchlorid gegeben. Anschließend

wird der Ansatz für 30 min bei 0 °C gerührt. Parallel suspendiert man 1.43 g (4.15 mmol)

Fmoc-Aeg(H)-OH (129) in 20 ml MeCN/H2O (4:3) und bringt den Feststoff durch Zugabe

von TEA in Lösung. Man gibt diese Lösung zur ersten, rührt 2 h bei RT, stellt mit 3 M HCl

auf pH 2 ein und lässt über Nacht rühren. Anschließend wird zentrifugiert, dekantiert und der

Niederschlag mit Diethylether gewaschen.

Ausbeute:

1.33 g (2.62 mmol) = 63 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): 12.75 (s(br), 1 H, COOH); 11.30, 11.29 (je

s, zusammen 1 H, N(3)H); 7.89 (d, 3J = 6.9, 2 H, FmocCHarom.); 7.68 (d, 3J = 7.1, 2 H,

FmocCHarom.); 7.34 (m, 6 H, 4 × FmocCHarom., 2 × NH); 4.65 (s, 1.1 H, N(1)CH2); 4.48 (s,

0.9 H, N(1)CH2); 4.2 (m, 5 H, FmocCH2, FmocCH, GlyCH2); 3.26 (m, 4 H, CH2CH2); 1.73

(s, 3 H, CH3). MALDI-TOF-MS: 505.37 (154) [M-H] -.


225

10.32 Fmoc-Aeg(ABhoc)-OH (133)

{[2-(6-Benzhydryloxycarbonylamino-purin-9-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-

amino}essigsäure

O

ONH

N

O

N N

N N

O NH

OH

OO


Ansatz:

2.11 g 2.86 mmol Fmoc-Aeg(ABhoc)-OMe (125)

240 mg 5.72 mmol LiOH*H2O

120 ml H2O/THF 1:1

Durchführung:


scher Reinigung (Silica, DCM/MeOH 10:1) als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

1.41 g (1.94 mmol) = 68 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 10.65 (s(br), 1 H, COOH); 8.62, 8.55 (je

s, zusammen 1 H, C(2)H); 8.36, 8.33 (je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.90 (m, 3 H,

2 × FmocCHarom., NH); 7.70 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.58 (m, 4 H, FmocCHarom.); 7.38 (m,

10 H, BhocCHarom.); 6.87 (s, 1 H, BhocCH); 5.30, 5.20 (je s, zusammen 1 H, N(9)CH2); 4.07

(m, 5 H, FmocCH2, FmocCH, GlyCH); 3.45, 3.22 (je m(br), zusammen 4 H, CH2CH2).

MALDI-TOF-MS: 724.54 (124) [M-H] -.


226

10.33 Fmoc-Aeg(GBhoc)-OMe (134)

{[2-(2-Benzhydryloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxy-

carbonylamino)-ethyl]-amino}essigsäure-methylester

N

O

N

O

ON

N NH

O

NH

O NH

O

OO


Ansatz:


1.59 g 3.79 mmol GBhoc-AcOH (111)



10 ml DMF

Durchführung:



Ausbeute:

1.78 g (2.36 mmol) = 62 % d.Th.


227

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 30:1): 0.03. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 11.67,

11.62 (je s, zusammen 1 H, NH); 11.23 (s, 1 H, NH); 7.84 (m, 3 H, 2 × FmocCHarom., C(8)H);

7.66 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.38 (m, 16 H, 10 × BhocCHarom., 4 × FmocCHarom., 2 × NH);

6.86 (s, 1 H, BhocCH); 5.12 (s, 1.2 H, N(9)CH2); 4.94 (s, 0.8 H, N(9)CH2); 4.28 (m, 5 H,

FmocCH, FmocCH2, GlyCH2); 3.75 (s, 1 H, CH3); 3.75 (s, 2 H, CH3); 3.50, 3.14 (je m,

zusammen 4 H, CH2CH2). FAB-MS: 778.0 (3) [M+Na]+; 756.0 (4) [M]+; 712.0 (3)

[M-CO2]+; 167.0 (100).

10.34 Fmoc-Aeg(F)-OMe (135a)

{[2-(2,4-Difluor-5-methyl-phenyl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-amino}-


N

O

O NH

O

OO

F

F


Ansatz:


931 mg 5.00 mmol F-AcOH (70)



10 ml DMF

Durchführung:


scher Reinigung (Silica, CH/EtOAc 1:4) als farblosen Feststoff.


228

Ausbeute:

1.66 g (4.15 mmol) = 83 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (CH/EtOAc 1:4): 0.62. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.88 (d, 3J = 7.1, 2 H, FmocCHarom.); 7.68 (d, 3J = 7.6, 2 H, FmocCHarom.); 7.41 (m u. s(br), 3 H,

FmocCHarom., FmocNH); 7.36 - 7.28 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.19 - 6.99 (m, 2 H, FCHarom.);

4.53 - 3.95 (m, 5 H, FmocCH, FmocCH2, FCH2); 3.72 (s, 1.1 H, GlyCH2); 3.70 (s, 0.9 H,

GlyCH2); 3.63 (s, 2.2 H, OCH3); 3.57 (s, 0.8 H, OCH3); 3.49 (t, 3J = 6.3, 1.35 H,

FmocNHCH2CH2); 3.37 (m, 0.57 H, FmocNHCH2CH2); 3.25 (m, 1.4 H, FmocNHCH2CH2);

3.14 (m, 0.6 H, FmocNHCH2CH2); 2.15 (s, 3 H, CH3). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)

(2 Rotamere): δ = 170.10 (C=O); 169.89 (C=O); 169.75 (C=O); 169.67 (C=O); 159.14 (dd, 1J(C,F) = 244, 3J(C,F) = 12.3, FC(4)); 158.55 (dd, 1J(C,F) = 244, 3J(C,F) = 12.3, FC(2));

156.29 (FmocC=O); 156.09 (FmocC=O); 143.84 (FmocCarom.); 143.79 (FmocCarom.); 140.72

(FmocCarom.); 140.69 (FmocCarom.); 133.69 (m, FC(6)); 133.40 (m, FC(6)); 127.55


(FmocCHarom.); 119.52 (dd, 4J(C,F) = 3.07, 2J(C,F) = 16.8, FC(5)); 118.62 (m, C(1)); 102.86

(dd aa t, 2 × 3J(C,F) = 26.1, FC(3)); 102.80 (dd aa t, 2 × 3J(C,F) = 26.1, FC(3)); 65.43

(FmocCH2); 65.34 (FmocCH2); 52.08 (OCH3); 51.62 (OCH3); 49.81 (FmocCH) 47.86

(FmocNHCH2CH2); 47.57 (FmocNHCH2CH2); 46.73 (GlyCH2); 46.65 (GlyCH2); 38.80

(FmocNHCH2CH2); 38.18 (FmocNHCH2CH2); 32.26 (FCH2); 31.76 (FCH2); 13.38 (m,

FCH3). 19F-NMR (546 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):δ = -115.64 (m, 1 F, F(4)); -116.26

(m, 0.69 F, F(2)); -116.47 (m, 0.27 F, F(2)). FAB-MS: 545.2 (23) [M+Na] +; 523.2 (40)

[M+H]+; 178.1 (100).


229

10.35 Fmoc-Aeg(F’)-OMe (135b)

{[2-(2,4-Difluor-phenyl)-acetyl]-[2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-amino}essigsäure-

methylester

N

O

O N O

OO

F

F


Ansatz:


860 mg 5.00 mmol F’-AcOH (96)



10 ml DMF

Durchführung:



Ausbeute:

1.28 g (2.52 mmol) = 50 % d.Th.


230

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 50:1): 0.19. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.88 (d, 3J = 7.1, 2 H, FmocCHarom.); 7.68 (d, 3J = 7.07, 2 H, FmocCHarom.); 7.61 - 7.45 (m, 7 H,

4 × FmocCHarom., 2 × F’CHarom., FmocNH); 6.99 (m, 1 H, F’CHarom.); 4.36 - 4.22 (m, 3.7 H,

FmocCH2, FmocCH, F’CH2); 4.06 (s, 1.3 H, F’CH2); 3.76 (s, 1.1 H, GlyCH2); 3.70 (s, 0.9 H,

GlyCH2); 3.62 (s, 3 H, OCH3); 3.54 - 3.09 (m(br), 4 H, CH2CH2). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 170.20, 169.94, 169.84, 169.69 (F’CH2CO, COOMe); 161.29

(dd, 1J(C,F) = 245, 3J(C,F) = 12.7, F’C(4)); 160.61 (dd, 1J(C,F) = 247, 3J(C,F) = 12.7,

F’C(2)); 156.40 (FmocC=O); 156.18 (FmocC=O); 143.87 (FmocCarom.); 140.79 (FmocCarom.);

132.57 (dd, 3J(C,F) = 6.14, 3J(C,F) = 9.59, F’C(6)); 127.63 (FmocCHarom.); 127.07

(FmocCHarom.); 125.08 (FmocCHarom.); 120.13 (FmocCHarom.); 119.32 (m, F’C(1)); 110.96

(dd, 2J(C,F) = 20.7, 4J(C,F) = 3.45, F’C(5)); 103.44 (dd aa t, 2 × 2J(C,F) = 26.1, F’C(3));

65.47 (FmocCH2); 51.70 (OCH3); 52.17, 49.85, 47.90, 47.61, 46.77 (CH2CH2, GlyCH2,

FmocCH); 32.37 (F’CH2); 31.09 (F’CH2). FAB-MS: 531.2 (20) [M+Na]+; 509.2 (28)

[M+H]+; 178.1 (100).


231

10.36 Fmoc-Aeg(F4)-OMe (135c)

{[2-(9H-Fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-ethyl]-[2-(2-fluor-4-trifluormethyl-phenyl)-acetyl]-amino}-


N

O

O NH

O

OO

F

FFF


Ansatz:


2.48 g 11.2 mmol F4-AcOH (101)



25 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Der Rückstand wird mit 40 ml Methanol versetzt,

15 min im Ultraschallbad behandelt und anschließend abgesaugt. Nach dem Waschen mit

Methanol und Trocknen im Vakuum erhält man das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

3.44 g (6.16 mmol) = 55 % d.Th.


232

Analysedaten: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.85 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.69 - 7.23

(m, 10 H, 6 × FmocCHarom., 3 × F4CHarom., 1 NH); 4.34 (m, 2 H, FmocCH2); 4.22 (m, 1 H,

FmocCH); 4.06, 3.92 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.90, 3.75 (je m, zusammen 2 H,

F4CH2); 3.71, 3.62 (je s, zusammen 3 H, CH3); 3.53 - 3.13 (m, 4 H, F4CH2, CH2CH2). 13C-

NMR (100 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 170.07 (COOMe); 169.66 (COOMe);

169.40 (GlyC=O); 169.14 (GlyC=O); 160.42 (dq aa dm, 1J(C,F) = 247, F4C(2)); 156.34

(FmocC=O); 156.11 (FmocC=O); 143.85 (FmocCarom.); 143.82 (FmocCarom.); 140.72

(FmocCarom.); 140.70 (FmocCarom.); 133.22 (dq aa t, 3J(C,F) = 4.98, F4C(6)); 132.93 (dq aa d, 3J(C,F) = 4.56, F4C(6)); 128.76 (dq aa m, F4C(4)); 127.54 (FmocCHarom.); 127.09 (d, 2J(C,F) = 23.8, F4C(1)); 126.98 (FmocCHarom.); 125.06 (FmocCHarom.); 125.00 (FmocCHarom.);

123.41 (dq, 1J(C F) = 272, 4J(C,F) = 2.30, F4CH3); 120.85 (dq aa t, 4J(C,F) ~ 3J(C,F) = 3.87,

F4C(5)); 120.05 (FmocCHarom.); 119.95 (FmocCHarom.); 112.25 (dq aa dm, 2J(C,F) = 25.7,

F4C(3)); 65.43 (FmocCH2); 65.34 (FmocCH2); 52.11 (OCH3); 51.63 (OCH3); 49.84, 47.59;

46.72; (FmocCH, GlyCH2, FmocNHCH2CH2); 38.79 (FmocNHCH2); 38.12 (FmocNHCH2);

32.90 (F4CH2); 32.42 (F4CH2). 19F-NMR (235 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = -64.28

(s, 3 F, CF3), -117.22 (m, 0.7 F, F4C(2)F); -117.56 (m, 0.3 F, F4C(2)F). FAB-MS: 582.1 (39)

[M+Na]+; 559.1 (40) [M+H]+; 178.1 (100).


233

10.37 N,N-Dimethyl-β-alanin Hydrochlorid (140)

3-Dimethylamino-propionsäure Hydrochlorid

OH

O

N*HCl

Summenformel: C5H11NO2*HCl M = 153.61 g/mol

Ansatz:

3.56 g 40.0 mmol β-Alanin (143)

25 ml Ameisensäure

5 ml Formalin

5 ml HClkonz.

Durchführung:

Man erhitzt eine Mischung aus 3.56 g (40.0 mmol) β-Alanin, 25 ml Ameisensäure und 5 ml

Formalin über Nacht unter Rückfluss. Im Anschluss wird die Reaktionsmischung auf RT ab-

gekühlt und mit 5 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Danach werden die Lösungsmittel

destillativ entfernt und der erhaltene Rückstand abgesaugt. Nach dem Waschen mit Essig-

säure erhält man das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

1.90 g (12.3 mmol) = 31 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 3.42 (t, 3J = 6.7, 2 H, CH2); 2.91 - 2.85 (m, 8 H, 2 × CH3,

CH2). 13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 174.34 (C=O); 53.52 (Me2NCH2); 43.32 (CH3); 29.22

(CH2COOH). FAB-MS: 154.1 (13) [M+HCl]+; 118.1 (100) [M+H]+.


234

10.38 Me2-Aeg(CBhoc)-OMe (141)

[[2-(4-Benzhydryloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-(2-dimethylamino-ethyl)-amino]-


N

N

NH

O

N

O

O

O

N O

O


Ansatz:

983 mg 5.00 mmol Me2-Aeg(H)-OMe*HCl (78)

1.90 g 5.00 mmol CBhoc-AcOH (84)

960 mg 5.00 mmol EDC*HCl

810 mg 6.00 mmol HOBt


10 ml DMF

Durchführung:


(Silica, DCM/MeOH/TEA 10:1:0.1) gereinigt. Man erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

1.42 g (2.72 mmol) = 54 % d.Th.


235

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH/TEA 10:1:0.1): 0.31. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 10.99 (s, 1 H, BhocNH); 7.91 (m, 1 H, C(6)H); 7.48 - 7.25 (m, 10 H, BhocCHarom.); 6.93

(m, 1 H, C(5)H); 6.80 (s, 1 H, BhocCH); 4.83 (s, 1.15 H, N(1)CH2); 4.64 (s, 0.77 H,

N(1)CH2); 4.37 (s, 0.69 H, GlyCH2); 4.10 (s, 1.09 H, GlyCH2); 3.70 (s, 1.10 H, OCH3); 3.61

(s, 1.80 H, OCH3); 3.51 - 3.28 (m, 4 H, CH2CH2); 2.19 (s, 3.56 H, (H3C)2N); 2.12 (s, 2.18 H,

(H3C)2N). 13C-NMR (2 Rotamere) (50 MHz, DMSO-d6): δ = 170.15 (COOMe); 169.83

(COOMe); 167.65 (N(1)CH2C=O); 167.47 (N(1)CH2C=O); 163.40 (C(4)); 163.34 (C(4));

155.31 (BhocC=O); 152.75 (C(2)); 151.40 (C(6)); 140.75 (BhocCarom.); 128.91 (BhocCHrom.);

128.21 (BhocCHrom.); 126.80 (BhocCHrom.); 94.10 (C(5)); 77.79 (BhocCH); 57.86

(Me2NCH2); 57.19 (Me2NCH2); 52.45 (N(1)CH2); 52.05 (OCH3); 45.94, 45.73, 45.44

(Me2NCH2CH2, GlyCH2, (H3C)2N). FAB-MS: 544.2 (14) [M+Na]+; 522.2 (32) [M+H]+;

167.1 (100).

10.39 (Me)2-Aeg(CBhoc)-OH*HCl (142)

[[2-(4-Benzhydryloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-(2-dimethylamino-ethyl)-amino]-

essigsäure Hydrochlorid

N

N

NH

O

N

O

O

O

N O

O

*HCl

Summenformel: C26H29N5O6*HCl M = 544.01 g/mol


236

Ansatz:

1.16 g 2.22 mmol Me2-Aeg(CBhoc)-OMe (142)


20 ml THF

20 ml H2O

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 3. Man erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

960 mg (1.77 mmol) = 79 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, D2O-d6) (2 Rotamere): δ = 7.54 (d, 3J = 7.6, 1 H, C(6)H); 7.47 - 7.33

(m, 10 H, BhocCHarom.); 6.02 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H); 5.91 (s, 1 H, BhocCH); 5.27 (s,

0.20 H, N(1)CH2); 4.99 (s, 1.70 H, N(1)CH2); 4.09 (s, 1.80 H, GlyCH2); 3.95 (s, 0.20 H,

GlyCH2); 3.86 (t, 3J = 5.3, 2 H, Me2NCH2CH2); 3.37 (t, 3J = 5.3, 2 H, Me2NCH2CH2); 2.91 (s,

6 H, (H3C)2N). 1H-NMR (200 MHz, MeOH-d4) (2 Rotamere): = 7.82 (d, 3J = 7.3, 1 H,

C(6)); 7.31 (m, 11 H, BhocCHarom., C(5)H); 6.83 (s, 1 H, BhocCH); 4.68 (s, 2 H, N(1)CH2);

4.07 (GlyCH2); 3.84 (Me2NCH2CH2); 3.30 (Me2NCH2CH2); 2.85 (s, 6 H, CH3). 13C-NMR

(50 MHz, MeOH-d4) (2 Rotamere): = 176.16 (COOH); 170.48 (N(1)CH2C=O); 165.53

(C(4)); 161.35, 158.64 (C(2), BhocC=O); 151.70 (C(6)); 141.49 (BhocCarom.); 129.68, 129.21,

128.11 (BhocCHarom.); 96.89 (C(5)); 80.07 (BhocCH); 56.43 (Me2NCH2); 53.44 (GlyCH2);

52.39 (N(1)CH2); 44.95 (Me2NCH2CH2); 43.78 (CH3). FAB-MS: 530.2 (11) [M+Na]+; 508.2

(22) [M+H]+, 167.1 (100).


237

10.40 Me2-Aeg(H)-OH (145)

N-[2-(Dimethylamino)ethyl]glycin

NNH

OH

O


Ansatz:

4.60 g 50.0 mmol Glyoxylsäure Monohydrat (123)

5.50 ml 50.4 mmol 2-Dimethylamino-ethlyamin (143)

300 ml Wasser

2.00 g Pd/C (10 %)

1.12 l H2

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 4. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff, der

im Ölpumpenvakuum getrocknet wird.

Ausbeute:

6.96 g (47.7 mmol) = 95 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 3.30 (s, 2 H, GlyCH2); 2.99 (d, 3J = 3.0, 2 H,

(Me2NCH2CH2); 2.98 (d, 3J = 3.0, 2 H, (Me2NCH2CH2); 2.67 (s, 6 H (H3C)2N). 13C-NMR

(50 MHz, D2O): δ = 177.87 (C=O); 56.14 (GlyCH2); 51.50, 43.80, 43.39 ((H3C)2NCH2CH2).

FAB-MS: 169.1 (14) [M+Na] +; 147.1 (100) [M+H] +.


238

10.41 H-Aeg(F)-OMe*TFA (185)

{(2-Amino-ethyl)-[2-(2,4-difluor-5-methyl-phenyl)-acetyl]-amino}essigsäure-methylester Trifluoracetat

ONH2

O

F

F

N

O

*TFA

Summenformel: C14H18F2N2O3*TFA M = 414.33 g/mol

Ansatz:

936 mg 2.40 mmol Boc-Aeg(F)-OMe (204)

5 ml TFA

10 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt anhand AAV 15. Man erhält das Produkt quantitativ als leicht

gelbliches Öl, das auch nach intensiver Trocknung im Ölpumpenvakuum noch 0.5 eq. Toluol

enthält.

Ausbeute:

994 mg (2.40 mmol) = 100 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 8.01, 7.81 (je s(br), zusammen 3 H,

H3N+); 7.26 - 7.04 (m, 2 H, FCHarom.); 4.40 (s, 0.79 H, C(1)CH2); 4.03 (s, 1.03 H, C(1)CH2);

3.10, 2.96 (je m(br), zusammen 2 H, H3N+CH2); 3.77 - 3.47 (m, 7 H, OCH3, GlyCH2,

H3N+CH2CH2); 2.18 (s(br), 3 H, FCH3).


239

10.42 Boc-Aeg(H)-OMe (187)

Methyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycinat

OO NH

NH

OO


Ansatz:

14.8 g 69.8 mmol H-Aeg(H)-OMe*2 HCl (124)

4.30 g 69.8 mmol Boc2O

8.52 g 69.8 mmol DMAP


45 ml DCM

Durchführung:

Man legt 8.52 g (69.8 mmol) DMAP in 30 ml DCM vor und kühlt unter Argon-Schutzgas-

atmosphäre im Eis-Kochsalz-Bad auf -15 °C ab. Hierzu tropft man langsam eine Lösung von

4.30 g (69.8 mmol) Boc2O in 15 ml DCM. Anschließend gibt man 14.8 g (69.8 mmol)

H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124) und 15.4 ml (14.1 g, 140 mmol) NMM hinzu, rührt 3 h bei

-15 °C und 2 h bei RT. Man entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer, nimmt den

Rückstand in 80 ml 1 M KHSO4-Lösung auf und wäscht mit 80 ml EtOAc. Danach stellt man

die wässrige Phase mit NaHCO3 auf pH 8-9 ein und extrahiert dreimal mit je 100 ml EtOAc.

Die vereinigten organischen Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4

getrocknet und vom Lösungsmittel befreit. Das so erhaltene Rohprodukt wird durch

Säulenchromatographie (Silica, EtOAc/MeOH 9:1) gereinigt. Man erhält das Produkt als

farbloses Öl.

Ausbeute:

8.72 g (37.5 mmol) = 54 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.43


240

10.43 Boc-Aeg(H)-OMe (187)

Methyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycinat

OO NH

NH

OO


Ansatz:

20.0 g 98.5 mmol H-Aeg(H)-OMe*2 HCl (124)


27.3 ml 197 mmol TEA

1.5 l DCM

Durchführung:

Man legt 20.0 g (98.5 mmol) H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124) in 1.2 l DCM vor und kühlt im

Eisbad auf -10 °C ab. Nach der Zugabe von 27.3 ml (197 mmol) TEA wird über einen Zeit-

raum von 30 min eine Lösung von 21.5 g (98.5 mmol) Boc2O in 300 ml DCM hinzugetropft.

Man lässt über Nacht nachrühren, wäscht mit 500 ml Wasser und 500 ml ges. NaCl-Lösung

und trocknet über MgSO4. Nachdem das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt

wurde, wird das Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt (Silica, DCM/MeOH 50:1).

Alternativ kann auch durch fraktionierte Destillation im Ölpumpenvakuum aufgereinigt

werden. Man erhält das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

14.4 g (62.0 mmol) = 63 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 10:1): 0.55. Rf (EtOAc/MeOH 4:1): 0.45. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3):

δ = 3.72 (s, 3 H, OCH3); 3.40 (s, 2 H, GlyCH2); 3.20 (dt aa q, 2 × 3J = 5.8, 2 H, BocNHCH2);

2.73 (t, 3J = 5.8, 2 H, BocNHCH2CH2); 1.43 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3):

δ = 173.04 (GlyC=O); 156.21 (BocC=O); 79.34 (C(CH3)3); 51.97 (OCH3); 50.41 (GlyCH2);

48.90, 41.02 (CH2CH2); 28.53 (BocCH3). FAB-MS: 255.1 (19) [M+Na]+; 233.1 (100)

[M+H]+.


241

10.44 Boc-Aeg(AZ)-OH (188)

[[2-(6-Benzyloxycarbonylamino-purin-9-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-amino]essigsäure

OHO NH

OO

N N

NN

NH

N

O

O

O


Ansatz:

2.90 g 5.35 mmol Boc-Aeg(AZ)-OMe (189)


30 ml THF

30 ml H2O

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 3. Man erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

2.55 g (4.83 mmol) = 90 % d.Th.


242

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 12.81 (COOH); 10.67 (s, 1 H, NH);

8.60, 8.59 (je s, zusammen 1 H, C(2)H); 8.32, 8.31 (je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.49 - 7.30

(m, 5 H, ZCHarom.); 7.05 (t(br), 3J = 5.1, 0.57 H, NH); 6.77 (t(br), 3J = 5.1, 0.31 H, NH); 5.34

(s, 1.29 H, N(9)CH2); 5.22 (s, 2 H, ZCH2); 5.16 (s, 0.69 H, N(9)CH2); 4.34 (s, 0.64 H,

GlyCH2); 3.99 (s, 1.37 H, GlyCH2); 3.82 - 3.02 (m(br), 4 H, CH2CH2); 1.38 (s, 5.80 H,

BocCH3); 1.36 (s, 3.20 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 170.84 (GlyC=O); 170.36 (GlyC=O); 166.99 (N(9)CH2C=O); 166.54 (N(9)CH2C=O);

155.81 (BocC=O); 152.42, 152.20, 151.47 (ZC=O, C(2), C(4)); 149.39 (C(6)); 145.25 (C(8));

145.12 (C(8)); 136.40 (ZCarom.); 128.41 (Z-o-CHarom.); 127.98 (Z-p-CHarom.); 127.84 (Z-m-

CHarom.); 122.96 (C(5)); 78.13 (C(CH3)3); 77.78 (C(CH3)3); 66.25 (ZCH2); 47.55

(BocNHCH2CH2); 46.95 (BocNHCH2CH2); 44.06 (N(9)CH2); 43.81 (N(9)CH2); 28.16

BocCH3). FAB-MS: 550.4 (51) [M+Na]+; 528.4 (99) [M+H]+; 91.1 (100). Die Signale einer

Methylengruppe (BocHNCH2CH2) befinden sich unter dem Signal von DMSO. Darauf kann

man durch Vergleich mit dem Spektrum von Boc-Aeg(AZ)-OH schließen, das mit einer

Frequenz von 100 MHz aufgezeichnet wurde. Hierbei befinden sich die Signale der

entsprechenden Kohlenstoffatome bei 37.59 und 38.13 ppm.


243

10.45 AZ-AcOEt (189)

6-N-Benzyloxycarbonyl-adenin-9-essigsäure-ethylester

N N

N N

NH

O

O

O

O


Ansatz:

50.0 g 226 mmol A-AcOEt (120)

35.7 ml 345 mmol Benzylalkohol

56.8 g 345 mmol CDI

1 l DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 7. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt und

30 min im Ultraschallbad behandelt. Das Rohprodukt wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen

und aus Methanol umkristallisiert. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum erhält man das

Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

45.1 g (127 mmol) = 55 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.68 (s, 1 H, NH); 8.63 (s, 1 H, C(2)H); 8.44 (s, 1 H,

C(8)H); 7.47 - 7.33 (m, 5 H, ZCHarom.); 5.23 (s, 2 H, ZCH2); 5.20 (s, 2 H, N(9)CH2); 4.18 (q, 3J = 7.1, 2 H, CH2CH3); 1.21 (t, 3J = 7.1, 3 H, CH3).

13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ =

167.66 (COOMe, N(9)CH2C=O); 152.13 (C(4)); 151.72 (C(2)); unter C(2) oder C(4) liegt das

Signal für ZC=O; 149.52 (C(6)); 144.65 (C(8)); 136.34 (ZCarom.); 128.37 (Z-o-CHarom.);

127.95 (Z-p-CHarom.); 127.81 (Z-m-CHarom.); 122.93 (C(5)); 66.27 (ZCH2); 61.48 (CH2CH3);

44.20 (N(9)CH2); 13.94 (CH3). FAB-MS: 378.1 (27) [M+Na]+; 356.1 (100) [M+H]+. Die

Zuordnung der NMR-Signale ist durch HMBC- und HMQC-Spektroskopie abgesichert.


244

10.46 AZ-AcOH (190)

6-N-Benzyloxycarbonyl-adenin-9-essigsäure

N N

N N

NH

OH

O

O

O


Ansatz:

44.0 g 124 mmol AZ-AcOEt (189)

7.79 g 186 mmol LiOH*H2O

250 ml THF

250 ml H2O

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 3. Das erhaltene Rohprodukt wird in 220 ml Aceton

suspendiert und die Mischung 30 min bei Rückflusstemperatur gerührt. Man saugt ab, wäscht

mit Aceton und erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

31.3 g (95.6 mmol) = 80 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 13.42 (s(br), 1 H, COOH); 10.71 (s(br), 1 H, NH);

8.62 (s, 1 H, C(2)H); 8.44 (s, 1 H, C(8)H); 7.48 - 7.33 (m, 5 H, ZCHarom.); 5.22 (s, 2 H, CH2);

5.09 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 169.11 (COOH, N(9)CH2C=O);

152.20 (C(4)); 151.65 (C(2)); 149.43 (C(6)); 144.84 (C(8)); 136.38 (ZCarom.); 128.41

(Z-o-CHarom.); 127.99 (Z-p-CHarom.); 127.87 (Z-m-CHarom.); 123.02 (C(5)); 66.29 (ZCH2);

44.29 (N(9)CH2). FAB-MS: 350.1 (24) [M+Na]+; 328 (90) [M+H]+; 154.0 (100).


245

10.47 Boc-Aeg(AZ)-OMe (191)

[[2-(6-Benzyloxycarbonylamino-purin-9-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-amino]essigsäure-

methylester

OO NH

OO

N N

NN

NH

N

O

O

O


Ansatz:

1.57 g 6.76 mmol Boc-Aeg(H)-OMe (187)

2.22 g 6.76 mmol AZ-AcOH (190)



15 ml DMF

Durchführung:


scher Reinigung (Silica, DCM/MeOH 20:1) als farblosen Schaum.

Ausbeute:

2.98 g (5.50 mmol) = 81 % d.Th.


246

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 20:1): 0.20. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 10.63 (s, 1 H, NH); 8.60

(s, 1 H, C(2)H); 8.30, 8.31 (je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.47 - 7.31 (m, 5 H, ZCHarom.); 7.03

(t(br), 0.69 H, NH); 6.73 (t(br), 0.31 H, NH); 5.35 (s, 1.4 H, N(9)CH2); 5.22 (s, 2 H, ZCH2);

5.17 (s, 0.6 H, N(9)CH2); 4.46 (s, 0.57 H, GlyCH2); 4.09 (s, 1.43 H, GlyCH2); 3.77 (s, 0.91 H,

OCH3); 3.62 (s, 2.10 H, OCH3); 3.58 - 3.04 (m(br), 4 H, CH2CH2); 1.39 (s, 5.94 H, BocCH3);

1.37 (s, 3.04 H, BocCH3). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 169.85

(GlyC=O); 169.39 (GlyC=O); 167.01 (N(9)CH2C=O); 166.70 (N(9)CH2C=O); 155.80

(BocC=O); 155.53 (BocC=O); 152.38 (C(4)); 152.12 (ZC=O); 151.47 (C(2)); 149.35 (C(6));

149.32 (C(6)); 145.14 (C(8)); 145.04 (C(8)); 136.35 (ZCarom.); 128.35 (Z-o-CHarom.); 127.92

(Z-p-CHarom.); 127.78 (Z-m-CHarom.); 122.92 (C(5)); 122.87 (C(5)); 78.11 (C(CH3)3); 77.74

(C(CH3)3); 66.21 (ZCH2); 52.31 (OCH3); 51.78 (OCH3); 49.00 (GlyCH2); 47.57 (GlyCH2);

47.07 (BocNHCH2CH2); 46.86 (BocNHCH2CH2); 44.08 (N(9)CH2); 43.72 (N(9)CH2); 38.13

(BocNHCH2CH2); 37.59 (BocNHCH2CH2); 28.16 (BocCH3); 28.12 (BocCH3). FAB-MS:

564.4 (67) [M+Na]+; 542.5 (100) [M+H]+. Die Zuordnung der NMR-Signale ist durch

HMBC- und HMQC-Spektroskopie abgesichert.


247

10.48 CZ-AcOH (192)

4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure

O

O

NH

N

N

O

OH

O


Ansatz:

1.22 g 3.84 mmol CZ-AcOMe (196)


20 ml THF

20 ml H2O

Durchführung:


Ausbeute:

706 mg (2.33 mmol) = 61 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.03 (d, 3J = 7.7, 1 H, C(6)H); 7.38 (m, 5 H,

ZCHarom.); 7.02 (d, 3J = 7.7, 1 H, C(5)H); 5.19 (s, 2 H, ZCH2); 4.52 (s, 2 H, N(1)CH2). 13C-

NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 169.34 (COOH); 163.31 (C(4)), 155.04 (ZC=O), 153.19

(C(2)), 150.41 (C(6)); 135.96 (ZCarom.); 128.50 (Z-o-CHarom.); 128.17 (Z-p-CHarom.); 127.94

(Z-m-CHarom.); 94.05 (C(5)); 66.54 (ZCH2); 50.54 (N(1)CH2). FAB-MS: 154.0 (100); 304.0

(30) [M+H]+, 326 (17) [M+Na]+.


248

10.49 CZ-AcOH (192)

4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure

O

O

NH

N

N

O

OH

O


Ansatz:

5.71 g 14.5 mmol CZ-AcOBn (194)


60 ml THF

60 ml H2O

Durchführung:


Ausbeute:

4.06 g (13.4 mmol) = 92 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.48


249

10.50 CZ (193)

4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin

O

O

NH

NH

N

O


Ansatz:

3.00 g 27.0 mmol Cytosin (86)

7.60 ml 59.4 mmol Chlorameisensäure-benzylester

659 mg 5.39 mmol DMAP

48 ml Pyridin

Durchführung:

Zu einer Suspension von 3.00 g (27.0 mmol) Cytosin in 48 ml Pyridinabs. werden 659 mg

(5.40 mmol) DMAP gegeben und anschließend werden langsam 7.60 ml (9.04 g, 59.4 mmol)

Chlorameisensäure-benzylester zugetropft. Man lässt 4 Tage rühren, gießt die Reaktions-

mischung auf 100 ml Eiswasser und lässt 30 min rühren. Anschließend wird abgesaugt und

der erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

1.41 g (5.75 mmol) = 21 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.09 (s(br), 2 H, 2 × NH); 7.80 (d, 1 H, 3J = 7.1,

C(6)H); 7.38 (m, 5 H, ZCHarom.); 6.92 (d, 1 H, 3J = 7.1, C(5)H); 5.17 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR

(50 MHz, DMSO-d6): δ = 163.61 (C(4)); 155.75 (ZC=O); 153.40 (C(2)); 146.67 (C(6));

136.02 (ZCarom.); 128.45 (Z-o-CHarom.); 128.10 (Z-p-CHarom.); 127.88 (Z-m-CHarom.); 93.52

(C(5)), 66.38 (ZCH2). FAB-MS: 246.1 (37) [M+H]+; 163.0 (100).


250

10.51 CZ-AcOBn (194)

4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure-benzylester

NH

N

N

O

O

O

O

O


Ansatz :

7.54 g 29.1 mmol C-AcOBn (105)


4.73 g 43.7 mmol Benzylalkohol

190 ml THFabs.

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 8. Der erhaltene Rückstand wird mit 280 ml Ethanol

versetzt und 30 min bei Rückflusstemperatur gerührt. Anschließend wird das Produkt in Form

eines farblosen Feststoffs abgesaugt, mit Ethanol gewaschen und im Ölpumpenvakuum

getrocknet.

Ausbeute:

5.72 g (14.5 mmol) = 50 % d.Th.


251

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.06 (s, 1 H, NH); 8.06 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(6)H);

7.29 - 7.48 (m, 10 H, GlyCH, ZCHarom.); 6.98 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H); 5.18 (s, 2 H, CH2);

4.69 (s, 2 H, CH2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 167.82 (COOMe); 163.36 (C(4));

154.89 (ZC=O); 153.26 (C(2)); 150.32 (C(6)); 136.06 (Carom.); 135.51 (Carom.); 128.50,

128.40, 128.13, 127.82, 127.82, 126.42 (CHarom.); 94.15 (C(5)); 77.48 (BnCH2); 66.35

(ZCH2); 50.60 (N(1)CH2). FAB-MS: 426.1 (13) [M+Na]+; 394.1 (5) [M]+; 167.0 (100).

10.52 Boc-Aeg(CZ)-OH (195)

[[2-(4-Benzyloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-amino]-

essigsäure

OHO NH

N

OO

O

O

NH

N

N

O

O


Ansatz:

720 mg 1.39 mmol Boc-Aeg(CZ)-OMe (197)

88.0 mg 2.09 mmol LiOH*H2O

10 ml THF

10 ml H2O

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 3. Anschließend versetzt man das Rohprodukt mit

Diethylether, behandelt es kurz im Ultraschallbad, saugt den entstandenen Feststoff ab und

wäscht mit Diethylether. Zur weiteren Reinigung wird aus Methanol umkristallisiert. Man

erhält das Produkt als farblosen Feststoff.


252

Ausbeute:

676 mg (1.34 mmol) = 97 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.90, 7.88 (je d, 3J = 7.3, zusammen

1 H, C(6)H); 7.37 (m, 5 H, ZCHarom.); 7.02 u. 7.00 (je d, 3J = 7.33, 1 H, C(5)H); 6.95 (t(br), 3J = 5.1, 0.54 H, ZNH); 6.74 (t(br), 3J = 5.1, 0.23 H, ZNH); 5.19 (s, 2 H, ZCH2); 4.81 (s,

1.45 H, N(1)CH2); 4.63 (s, 0.55 H, N(1)CH2); 4.32 (s, 0.55 H, GlyCH2); 3.98 (s, 1.45 H,

GlyCH2); 3.62 - 3.00 (m(br), 4 H, CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 170.82 (COOH); 170.44 (COOH); 167.47 (N(1)CH2C=O);

167.04 (N(1)CH2C=O); 163.14 (C(4)); 155.74, 154.96 (BocC=O, ZC=O); 153.21, 153.11

(C(2)); 150.78 (C(6)); 135.97 (ZCarom.); 128.47 (Z-o-CHarom.); 128.14 (Z-p-CHarom.); 127.91

(Z-m-CHarom.); 93.85 (C(5)); 78.03 (C(CH3)3); 66.49 (ZCH2); 28.15 (BocCH3). FAB-MS:

526.2 (26) [M+Na]+; 504.20 (5) [M+H]+; 91.0 (100). Die Signale für N(1)CH2, GlyCH2,

BocHNCH2CH2 und BocHNCH2 sind aufgrund der Signalintensität nicht zu erkennen bzw.

liegen unter den Signalen für DMSO.

10.53 CZ-AcOMe (196)

4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin-1-essigsäure-methylester

O

O

NH

N

N

O

O

O


Ansatz:

1.36 g 5.55 mmol CZ (193)

561 µl 59.4 mmol Bromessigsäure-methylester

767 mg 5.55 mmol K2CO3

30 ml DMF


253

Durchführung:

Vorgelegt werden 1.36 g (5.55 mmol) 4-N-(Benzyloxycarbonyl)cytosin (193) und 767 mg

(5.55 mmol) K2CO3 in 30 ml DMF. Man lässt 10 min rühren, gibt innerhalb von 1 min

561 µl (935 mg, 59.4 mmol) Bromessigsäure-methylester hinzu und lässt einen Tag rühren.

Nachfolgend wird das Lösungsmittel am Trockeneis-Rotationsverdampfer entfernt und das

Produkt durch Zugabe von Ethylacetat ausgefällt. Man saugt ab, wäscht mit Ethylacetat und


Ausbeute:

1.59 g (5.00 mmol) = 90 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.83 (s, 1 H, NH); 8.09 (d, 3J = 7.1, 1 H, C(6)H); 7.39

(m, 5 H, ZCHarom.); 7.04 (d, 3J = 7.1, 1 H, C(5)H); 5.19 (s, 2 H, ZCH2); 4.65 (s, 2 H,

N(1)CH2); 3.68 (s, 3 H, OCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 168.44 (COOMe);

163.43 (C(4)); 155.02 (ZC=O); 153.07 (C(2)); 150.34 (C(6)); 135.88 (ZCarom.); 128.48 (Z-o-

CHarom.); 128.18 (Z-p-CHarom.); 127.98 (Z-m-CHarom.); 94.26 (C(5)); 66.78 (ZCH2); 52.26

(OCH3); 50.51 (N(1)CH2). FAB-MS: 356.2 (87) [M+K]+; 340.2 (35) [M+Na]+; 318.2 (100)

[M+H]+.


254

10.54 Boc-Aeg(CZ)-OMe (197)

[[2-(4-Benzyloxycarbonylamino-2-oxo-2H-pyrimidin-1-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-amino]-


OO NH

N

OO

O

O

NH

N

N

O

O


Ansatz:

700 mg 2.31 mmol CZ-AcOH (192)

537 mg 2.31 mmol Boc-Aeg(H)-OMe (187)

758 mg 2.31 mmol TOTU


10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Anschließend versetzt man das Rohprodukt mit


wäscht mit Diethylether. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

728 mg (1.41 mmol) = 61 % d.Th.


255

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 10.79 (s(br), 1 H, C(4)NH); 7.93, 7.89

(je d, 3J = 7.3, zusammen 1 H, C(6)H); 7.37 (m, 5 H, ZCHarom.); 7.02 (d, 3J = 7.3, 1 H, C(5)H);

6.94 (t(br), 3J = 5.3, 0.63 H, ZNH); 6.75 (t(br), 3J = 5.3, 0.25 H, ZNH); 5.19 (s, 2 H, ZCH2);

4.82 (s, 1.45 H, N(1)CH2); 4.64 (s, 0.55 H, N(1)CH2); 4.35 (s, 0.55 H, GlyCH2); 4.07 (s,

1.45 H, GlyCH2); 3.72 (s, 0.79 H, OCH3); 3.62 (s, 2.21 H, OCH3); 3.54 - 3.00 (m(br), 4 H,

CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 169.82 (COOMe); 169.47 (COOMe); 167.50 (N(1)CH2C=O); 167.21 (N(1)CH2C=O);

163.11 (C(4)); 163.05 (C(4)); 155.71 (BocC=O); 155.52 (BocC=O); 154.89 (ZC=O); 153.11

(C(2)); 150.65 (C(6)); 135.93 (ZCarom.); 128.41 (Z-o-CHarom.); 128.08 (Z-p-CHarom.); 127.85

(Z-m-CHarom.); 93.85 (C(5)); 78.00 (C(CH3)3); 77.71 (C(CH3)3); 66.45 (ZCH2); 52.20 (OCH3);

51.72 (OCH3); 49.53 (N(1)CH2); 49.31 (N(1)CH2); 49.04 (GlyCH2); 47.68 (GlyCH2); 47.00

(BocNHCH2CH2); 46.83 (BocNHCH2CH2); 38.17 (BocNHCH2); 37.64 (BocNHCH2); 28.16

(BocCH3); 28.11 (BocCH3). FAB-MS: 540.2 (32) [M+Na]+; 518.0 (16) [M+H]+; 91.0 (100).


256

10.55 Boc-Aeg(GZ)-OH (198)

[[2-(2-Benzyloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-

amino]essigsäure

OHO NH

OO

N

NN

NNH

O

NH

O

O

O


Ansatz:

342 mg 613 µmol Boc-Aeg(GZ)-OH (202)

6 ml 1 M LiOH

6 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 3. Anschließend behandelt man den Rückstand mit

Methanol, saugt den entstandenen Feststoff ab und wäscht mit Diethylether. Man erhält das


Ausbeute:

205 mg (377 µmol) = 62 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 12.88 (s(br), 1 H, COOH); 11.52 (s,

0.28 H, NH); 11.59, 11.50 (je s(br), zusammen 1 H, NH); 11.37 (s(br), 1 H, NH); 7.83, 7.82

(je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.45 - 7.34 (m, 5 H, ZCHarom.); 7.05 (t(br), 0.63 H, NH); 6.75

(t(br), 0.37 H, NH); 5.25 (s, 2 H, ZCH2); 5.09 (s, 1.26 H, N(9)CH2); 4.93 (s, 0.76 H,

N(9)CH2); 4.32 (s, 0.76 H, GlyCH2); 4.99 (s, 1.26 H, GlyCH2); 3.48 - 2.97 (m(br), 4 H,

CH2CH2); 1.35, 1.34 (je s, zusammen 9 H, BocCH3). FAB-MS: 566.0 (9) [M+Na]+; 544.0 (4)

[M]+; 154 (100).


257

10.56 GZ-AcOH (199)

(2-Benzyloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)essigsäure

N N

N NH

O

NH

OH

O

OO


Ansatz:

10.0 g 26.6 mmol (2-Benzyloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essig-

säure-methylester (201)


9.05 ml 133 mmol 3-Hydroxypropionitril

120 ml THFabs.

100 ml H2O

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 9. Man saugt den ausgefallenen Feststoff ab und wäscht

zunächst mit Wasser und dann mit Ethylacetat. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

5.32 g (15.5 mmol) = 58 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 11.41 (s(br), 2 H, 2 × NH); 7.84 (s, 1 H, C(8)H);

7.45 - 7.34 (m, 5 H, ZCHarom.); 5.24 (ZCH2); 4.53 (N(9)CH2). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6): δ = 169.07 (COOH); 155.32, 154.61 (C(6); ZC=O); 149.19, 146.92 (C(2), C(4));

140.73 (C(8)); 135.59 (ZCarom.); 128.49 (Z-o-CHarom.); 128.23 (Z-p-CHarom.); 127.96

(Z-m-CHarom.); 119.10 (C(5)); 67.02 (ZCH2); 46.17 (N(9)CH2). FAB-MS: 388.0 (33)

[M+2Na]+; 366.0 (31) [M+Na]+; 344.0 (31) [M+H]+, 154.0 (100).


258

10.57 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (200)

N N

N N

Cl

NH2

O

O

Summenformel: C8H8Cl1N5O2 M = 241.64 g/mol

Ansatz:



18.4 ml 200 mmol Bromessigsäure-methylester

400 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 6. Man kristallisiert aus THF um und erhält das


Ausbeute:

24.3 g (100 mmol) = 56 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.10 (s, 1 H, C(8)H); 6.99 (s, 2 H, NH2); 5.00 (CH2);

3.70 (OCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 168.21 (C=O); 159.97 (C(6)); 154.24

(C(2)); 149.50 (C(4)); 143.47 (C(8)); 122.91 (C(5)); 52.46 (OCH3); 43.94 (CH2). FAB-MS:

242.0 (100) [M]+.


259

10.58 (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (200)

N N

N N

Cl

NH2

O

O


Ansatz:


7.17 g 177 mmol K2CO3

29.4 ml 320 mmol Bromessigsäure-methylester

500 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt anhand AAV 10. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

31.1 g (129 mmol) = 44 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.57


260

10.59 (2-Benzyloxycarbonylamino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (201)

N N

N N

Cl

NH

O

O

OO


Ansatz:

18.5 g 76.6 mmol (2-Amino-6-chlor-purin-9-yl)essigsäure-methylester (200)

8.50 g 28.6 mmol Triphosgen

9.90 g 91.5 mmol Benzylalkohol


400 ml THFabs.

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt anhand AAV 11. Der erhaltene Rückstand wird aus Methanol um-

kristallisiert. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

14.0 g (37.3 mmol) = 49 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 10.84 (s, 1 H, NH); 8.48 (s, 1 H, C(8)H); 7.45 - 7.32

(m, 5 H, ZCHarom.); 5.18 (CH2); 5.13 (CH2); 3.71 (OCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6):

δ = 167.92 (COOMe); 153.08, 152.38 (C(6), ZC=O); 151.79, 149.23 (C(2), C(4)); 146.75

(C(8)); 136.50 (ZCarom.); 128.45 (Z-o-CHarom.); 127.99 (Z-p-CHarom.); 127.74 (Z-m-CHarom.);

126.75 (C(5)); 65.96 (ZCH2); 52.72 (OCH3); 43.94 (N(9)CH2). FAB-MS: 376.1 (40) [M+H]+;

55.0 (100).


261

10.60 Boc-Aeg(GZ)-OMe (202)

[[2-(2-Benzyloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)-acetyl]-(2-tert-butoxycarbonylamino-ethyl)-

amino]essigsäure-methylester

OO NH

OO

N

NN

NNH

O

NH

O

O

O


Ansatz:

1.72 g 5.00 mmol GZ-AcOH (199)




10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Anschließend versetzt man das Rohprodukt mit


wäscht mit Diethylether. Zur weiteren Reinigung wird aus Methanol umkristallisiert. Man


Ausbeute:

1.65 g (2.96 mmol) = 59 % d.Th.


262

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 11.52 (s, 0.28 H, NH); 11.48 (s, 0.66 H,

NH); 11.35 (s, 1 H, NH); 7.82 (s, 0.70 H, C(8)H); 7.80 (s, 0.30 H, C(8)H); 7.46 - 7.31 (m,

5 H, ZCHarom.); 7.01 (t(br), 3J = 5.3, 0.60 H, NH); 6.75 (t(br), 0.30 H, NH); 5.26 (s, 2 H,

ZCH2); 5.09 (s, 1.38 H, N(9)CH2); 4.93 (s, 0.58 H, N(9)CH2); 4.42 (s, 0.57 H, GlyCH2); 4.08

(s, 1.45 H, GlyCH2); 3.75 (s, 0.88 H, OCH3); 3.62 (s, 2.14 H, OCH3); 3.50 - 3.22 (m(br), 4 H,

CH2CH2-; 1.39 (s, 5.94 H, BocCH3); 1.35 (s, 3.04 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 169.99 (COOMe); 169.48 (COOMe); 167.06 (N(9)CH2C=O);

166.67 (N(9)CH2C=O); 155.77, 155.12, 154.54 (BocC=O, C(6)); 149.49, 147.17 (C(2), C(4));

140.38 (C(8)); 135.45 (ZCarom.); 128.50 (Z-o-CHarom.); 128.33 (Z-p-CHarom.); 128.11 (Z-m-

CHarom.); 123.39, 119.18, 89.13 (C(CH3)3); 67.23, 51.83, 28.11 (BocCH3). FAB-MS: 580.2

(41) [M+Na]+; 558.2 (50) [M+H]+; 91 (100).


263

10.61 H-Aeg(GZ)-OMe*TFA (203)

[[2-(2-Benzyloxycarbonylamino-6-oxo-1,6-dihydro-purin-9-yl)-acetyl]-(2-ethylamino)]essigsäure-methylester

Trifluoracetat

ONH2

O

N

NN

NNH

O

NH

O

O

O

*TFA

Summenformel: C20H23N7O6*TFA M = 571.47 g/mol

Ansatz:

460mg 825 µmol Boc-Aeg(GZ)-OMe (202)

1.60 ml 10.0 mmol HSiEt3

3 ml TFA

6 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 15. Man erhält das Produkt als leicht gelbliches Öl, das

auch noch intensiver Trocknung im Ölpumpenvakuum noch 1 eq. Toluol enthält.

Ausbeute:

471 mg (825 µmol) = 100 % d.Th.

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 11.52 (s, 1 H, NH); 11.45 (s, 1 H, NH);

9.15 (s(br), 3 H, NH3+); 7.91, 7.86 (je s, zusammen 1 H, C(8)H); 7.80 (s, 0.30 H, C(8)H);

7.45 - 7.35 (m, 5 H, ZCHarom.); 5.26 (s, 2 H, ZCH2); 5.16 (s, 0.95 H, N(9)CH2); 4.96 (s,

1.05 H, N(9)CH2); 4.47 (s, 1.13 H, GlyCH2); 4.13 (s, 0.87 H, GlyCH2); 3.76 (s, 3 H, OCH3);

3.70, 3.53 (je t(br), zusammen 2 H, H3N+CH2CH2); 3.18, 2.97 (je m, zusammen 2 H,

H3N+CH2CH2).


264

10.62 Boc-Aeg(F)-OMe (204)

{(2-tert-Butoxycarbonylamino-ethyl)-[2-(2,4-difluor-5-methyl-phenyl)-acetyl]-amino}essigsäure-methylester

OO NH

OO

F

F

N

O


Ansatz:

930 mg 5.00 mmol F-AcOH (70)




10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 12. Nach Reinigung durch Säulenchromatographie

(Silica, DCM/MeOH 80:1) erhält man das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

1.66 g (4.15 mmol) = 83 % d.Th.


265

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 50:1): 0.19. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.17 -

7.05 (m, 2 H, FCHarom.); 6.91 (t(br), 0.76 H, NH); 6.68 (t(br), 0.24 H, NH); 4.33 (s, 0.43 H,

C(1)CH2); 4.03 (s, 1.57 H, C(1)CH2); 3.69 (s(br), 2 H, GlyCH2); 3.62, 3.55 (je s, zusammen

3 H, OCH3) (darunter befinden sich 0.56 H BocNHCH2CH2); 3.45 (t(br), 3J = 6.2, 1.44 H,

BocNHCH2CH2); 3.14 (dt aa dd(br), 3J = 6.1, 6.14, 1.44 H, BocNHCH2) 3.03 (dt aa q(br),

0.56 H, BocNHCH2); 2.17 (s(br), FCH3); 1.36 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz,

DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 170.16 (C=O); 170.00 (C=O); 169.88 (C=O); 169.68 (C=O);

158.00 (FC(4)); 157.89 (FC(2)); 157.39 (FC(2)); 155.82 (BocC=O); 155.73 (BocC=O);

133.82, 133.72 u. 133.42 (FC(6)); 119.64, 119.48, 119.43, 118.74, 118.61 (FC(5)); 103.15,

102.89, 102.83, 102.63 (FC(3)); 77.94 (C(CH3)3); 77.69 (C(CH3)3); 52.10 (OCH3); 51.64

(OCH3); 49.76, 47.79, 47.35 u. 46.59 (GlyCH2, BocHNCH2CH2); 38.13 (BocHNCH2); 37.80

(BocHNCH2); 32.26 (FCH2); 31.75 (FCH2); 28.10 (BocCH3); 27.88 (BocCH3); 13.44 (FCH3).

Aufgrund der C-F-Kopplungen und dem Auftreten von 2 Rotameren, sind die

Signalintensitäten zu gering, bzw. das Spektrum zu komplex, um alle Signale vollständig zu

analysieren.


266

10.63 2-Amino-N-(2-dimethylamino-ethyl)-acetamid Di-trifluoracetat (205)

NH

O

NNH2

*2TFA

Summenformel: C6H15N3O*2TFA M = 373.25 g/mol

Ansatz:

1.10 g 4.48 mmol [(2-Dimethylamino-ethylcarbamoyl)-methyl]carbamin-

säure-tert-butylester (207)

5 ml TFA

10 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 15. Man erhält das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

1.67 g (4.48 mmol) = 100 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 8.69 (t, 3J = 5.6, 1 H, NH); 8.12 (s, 3 H, H3N

+);

3.72 - 3.40 (m, 4 H, CH2CH2); 3.25 - 3.07 (m, 2 H, GlyCH2); 2.81 (s, 6 H, N(CH3)2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 166.85 (COOH); 158.63 (q, 3J(C,F) = 35.2,

F3CCOOH); 116.10 (q, 1J(C,F) = 293, F3CCOOH); 55.63 (CH2NMe2); 42.50 (N(CH3)2,

GlyCH2); 34.01 (CH2CH2NMe2).


267

10.64 [(2-Dimethylamino-ethylcarbamoyl)-methyl]carbaminsäure-tert-butylester (207)

NH

O

NNH

O

O


Ansatz:

1.50 g 8.56 mmol Boc-Gly-OH (206)

755 mg 8.56 mmol N,N-Dimethylaminoethylamin (143)

1.97 g 10.3 mmol EDC

1.39 g 10.3 mmol HOBt

3.46 g 34.2 mmol TEA

50 ml Chloroform

Durchführung:


scher Reinigung (Silica, EtOAc/MeOH/TEA 7:3:0.1) als farbloses Öl.

Ausbeute:

1.10 g (4.48 mmol) = 52 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH/TEA 7:3:0.1): 0.25. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 6.66 (s(br), 1 H,

NH); 5.32 (s(br), 1 H, NH); 3.77 (d, 3J = 5.8, 2 H, BocNHCH2); 3.35 (m, 2 H, CH2CH2NMe2);

2.44 (t, 3J = 5.8, 2 H, CH2CH2NMe2); 2.23 (s, 6 H, N(CH3)2); 1.42 (s, 9 H, BocCH3). 13C-

NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 169.54 (GlyC=O); 156.03 (BocC=O); 80.14 (C(CH3)3); 57.78

(CH2NMe2); 45.13 (N(CH3)2, GlyCH2); 36.74 (CH2CH2NMe2); 28.41 (BocCH3). FAB-MS:

268.2 (14) [M+Na]+; 246.2 (100) [M+H]+.


268

10.65 H-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(G)-Aem*4TFA (224)

2-Amino-N-[12-(2-aminoethyl)-14-(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl)-6-[2-(6-amino-9H-purin-9-yl)acetyl]-

4,10,13-trioxo-3,6,9,12-tetraazatetradec-1-yl]-1,6-dihydro-N-(2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-

6-oxo-9H-purine-9-acetamid

N

N

O

NH2

N

O

N N

NN

NH2

NH2

O

NH

NNH

NNH

OO

N

OO

N N

NNH

O

NH2

O

*4TFA

Summenformel: C38H53N21O9*4TFA M = 1403.08 g/mol

Ansatz:

491 mg 308 µmol Z-Aeg(CZ)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem (242)

1.0 ml 0.88 mmol TFMSA

0.50 ml 9.6 mmol m-Cresol

0.50 ml 8.5 mmol Thioanisol

3.0 ml TFA

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 16. Nach Aufreinigung durch RP-HPLC und

anschließender Gefriertrocknung erhält man das Produkt als farbloses Pulver.

Ausbeute:

238 mg (170 µmol) = 55 % d.Th.


269

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 140 °C) (Rotamere): δ = 8.56, 8.22, 8.21, 8.02 (je s,

zusammen 2 H, A-C(8)H, A-C(2)H); 7.88 (m(br), 3 H, 3 × Amid-NH); 7.76 (m, 2 H, C-

C(6)H, G-C(8)H); 6.42 (s(br), div. HN+R3); 6.88 (m, 1 H, C-C(5)H); 5.12 (s(br), 2 H,

BaseCH2); 4.89 (m, 2 H, BaseCH2); 4.57 (s(br), 2 H, BaseCH2); 3.78 - 3.10 (m, 30 H, 2 ×

NCH2CH2O, 4 × CH2CH2, 3 × GlyCH2). MALDI-MS: 949.298 (169) [M+2H]+. HR-ESI-

MS: 950.4438 (13) [M+3H]+ (ber.: 950.4570); 949.4411 (51) [M+2H]+ (ber.: 949.4491);

948.4387 (100) [M+H]+ (ber.: 948.4413).

10.66 Boc-Aeg(Alloc)-OMe (225)

Methyl N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}-ethyl)glycinat

NO

O

NH

O

O

OO


Ansatz:

24.0 g 103 mmol Boc-Aeg(H)-OMe (187)

14.4 ml 103 mmol Alloc-Cl

14.3 ml 134 mmol TEA

36 ml DCM

Durchführung:

Zu einer Lösung von 24.0 g (103 mmol) Boc-Aeg(H)-OMe (187) und 14.4 ml (19.8 g,

103 mmol) TEA in 360 ml DCM wird unter Eisbadkühlung eine Lösung von 14.3 ml (16.2 g,

134 mmol) Alloc-Cl getropft. Man lässt 2 h bei RT rühren, entfernt anschließend das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer und nimmt den Rückstand in 500 ml Ethylacetat auf.

Die organische Phase wird mit je 500 ml 1 M KHSO4-, ges. NaHCO3 und NaCl-Lösung

gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Nach dem destillativen Entfernen des Lösungsmittels

erhält man das Produkt als farbloses Öl.


270

Ausbeute:

27.8 g (87.9 mmol) = 85 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, CDCl3) (2 Rotamere): δ = 5.90 (m, 1 H, CH2CH=CH2); 5.25 (m, 3 H,

NH und CH2CH=CH2); 4.60 (m, 2 H, CH2CH=CH); 4.00 (s, 2 H, GlyCH2); 3.75, 3.74 (2 × s,

3 H, OCH3); 3.46 (m, 2 H, BocNHCH2); 3.29 (m, 2 H, BocNHCH2CH2); 1.43 (s, 9 H,

BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3) (2 Rotamere): δ = 170.83 (GlyC=O); 170.56

(GlyC=O); 156.36 (BocC=O); 156.21 (AllocC=O); 156.07 (AllocC=O); 132.61

(CH2CH=CH2); 117.88 (CH2CH=CH2); 117.42 (CH2CH=CH2); 79.34 (C(CH3)3); 66.66

(CH2CH=CH2); 66.43 (CH2CH=CH2); 52.36 (OCH3); 49.94 (GlyCH2); 49.69 (GlyCH2);

49.02 (BocNHCH2CH2); 48.69 (BocNHCH2CH2); 39.19 (BocNHCH2); 28.46 (BocCH3).

FAB-MS: 655.4 (5) [2M+Na]+; 633.4 (3) [2M+H]+; 339.2 (25) [M+Na]+; 217.1 (100)

[M-Boc]+; 317.2 (23) [M+H]+.

10.67 Boc-Aeg(Fmoc)-OMe (226)

Methyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat

NO

O

NH

O

O

OO


Ansatz:

26.5 g 114 mmol Boc-Aeg(H)-OMe (187)

29.4 g 114 mmol Fmoc-Cl


500 ml DCM


271

Durchführung:

Zur Vorlage von 26.5 g (114 mmol) Boc-Aeg(H)-OMe (187) und 39.7 ml (29.5 g, 228 mmol)

DIPEA in 400 ml DCM wird unter Eisbadkühlung eine Lösung von 29.4 g (114 mmol)

Fmoc-Cl in 100 ml DCM getropft. Man lässt 1 h bei Eisbadtemperatur und weitere 3 h bei RT

rühren, wäscht mit 10%iger Zitronensäure-, ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung und entfernt

anschließend das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. Nach Reinigung durch Säulen-

chromatographie (Silica, DCM/MeOH 50:1) erhält man das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

44.0 g (96.9 mmol) = 86 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 50:1): 0.21. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 7.85 (m, 2 H,

FmocCHarom.); 7.62 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.46 - 7.29 (m, 4 H, FmocCHarom.); 6.21 (m(br),

1 H, NH); 4.39 (m, 2 H, FmocCH2); 4.26 (m, 1H, FmocCH); 3.97 (s, 2 H, GlyCH2), 3.65 (s,

3 H, CH3), 3.33 (m, 2 H), 3.09 (m, 2 H) (CH2CH2); 1.39 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR

(50 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 169.25 (COOMe); 154.95 (FmocC=O, BocC=O); 143.32

(FmocCarom.); 140.27 (FmocCarom.); 126.94 (FmocCHarom.); 126.40 (FmocCHarom.); 124.20

(FmocCHarom.); 119.30 (FmocCHarom.); 77.30 (C(CH3)3), 66.56 (FmocCH2); 50.96 (OCH3);

48.47, 47.31, 46.41, 38.26 (FmocCH, GlyCH2, CH2CH2); 27.65 (BocCH3). FAB-MS: 477

(15) [M+Na]+; 455 (5) [M+H]+; 355.1 (67) [M-Boc]+; 178.0 (100).


272

10.68 Z-Aeg(H)-OMe (227)

Methyl N-(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)glycinat

NH

O

O

NH

O

O


Ansatz:

37.1 g 150 mmol Z-OSu

30.4 g 150 mmol H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124)


600 ml Acetonitril

Durchführung:

Zu einer Lösung von 37.1 g (150 mmol) Z-OSu in 60 ml MeCN werden bei -15 °C (NaCl-

Eisbadkühlung) zunächst 30.4 g (150 mmol) H-Aeg(H)-OMe*2HCl (124) und anschließend

41.1 ml (37.9 g, 373 mmol) NMM gegeben. Man lässt 3 h bei -15 °C und weitere 2 h bei RT

rühren und entfernt danach das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. Der Rückstand wird

in 100 ml 1 M KHSO4-Lösung aufgenommen und diese Lösung mit 500 ml Ethylacetat

gewaschen. Nachdem der pH-Wert der wässrigen Phase mit NaHCO3 auf 8 eingestellt wurde,

wird dreimal mit je 500 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit 400 ml

ges. NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und destillativ vom Lösungsmittel

befreit, woraufhin man das Produkt als farbloses Öl erhält.

Ausbeute:

25.0 g (93.9 mmol) = 63 % d.Th.


273

Analysedaten:

1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.38 - 7.13 (m, 5 H, ZCHarom.); 5.32 (s(br), 1 H, ZNH);

5.02 (s, 2 H, ZCH2); 3.64 (s, 3 H, OCH3); 3.32 (s, 2 H, GlyCH2); 3.20 (dt, 2 × 3J = 5.7, 2 H,

ZNHCH2); 2.68 (t, 3J = 5.7, 2 H, ZNHCH2CH2). 13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 172.95

(GlyC=O); 156.55 (ZC=O); 136.63 (ZCarom.); 128.51 (Z-o-CHarom.); 128.07 (2 × s, Z-p-CHarom.,

Z-m-CHarom.); 66.65 (ZCH2); 51.86 (OCH3); 50.23 (GlyCH2); 48.63 (ZNHCH2CH2); 40.63

(ZNHCH2). FAB-MS: 289.0 (11) [M+Na]+; 267.1 (100) [M+H]+.


274

10.69 Boc-Aeg(Alloc)-OH (228)

N-[(Allyloxy)carbonyl-]-N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycin

NOH

O

NH

O

O

OO


Ansatz:

27.8 g 87.9 mmol Boc-Aeg(Alloc)-OMe (225)

180 ml 1 M LiOH

180 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 3. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

25.1 g (83.0 mmol) = 94 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 12.67 (s(br), 1 H, COOH); 6.75 (m(br),

1 H, NH); 6.01 - 5.73 (m, 1 H, CH2CH=CH2); 5.34 - 5.11 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 4.51 (m,

2 H, CH2CH=CH); 3.92, 3.89 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.33 - 3.05 (m, 4 H, CH2CH2);

1.36 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 171.18 (COOH);

171.07 (COOH); 155.59, 155.46, 155.20 (BocC=O, AllocC=O); 133.22 (CH2CH=CH2);

116.70 (CH2CH=CH2); 116.34 (CH2CH=CH2); 77.67 (C(CH3)3); 65.34 (CH2CH=CH2); 65.13

(CH2CH=CH2); 48.97 (GlyCH2); 48.81 (GlyCH2); 47.78 (BocNHCH2CH2); 47.13

(BocNHCH2CH2); 38.36 (BocNHCH2); 38.06 (BocNHCH2); 28.18 (BocCH3). FAB-MS:

325.1 (100) [M+Na]+; 303 (19) [M+H]+; 203.1 (73) [M-Boc]+.


275

10.70 H-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (229)

Methyl N-(2-Aminoethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat Trifluoracetat

NO

O

NH2

OO

*TFA


Ansatz:

44.0 g 96.6 mmol Boc-Aeg(Fmoc)-OMe (226)

100 ml TFA

100 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 15. Man versetzt das Rohprodukt mit Diethylether,

saugt den entstandenen Niederschlag ab und trocknet im Ölpumpenvakuum. Man erhält das


Ausbeute:

41.2 g (87.8 mmol) = 91 % d.Th.

Analysedaten:

FAB-MS: 709.1 (5) [2M+H]+; 377.0 (11) [M+Na]+; 355.1 (100) [M+H]+.


276

10.71 Z-Aeg(Boc)-OMe (230)

Methyl N-(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-[(tert-butoxy)carbonyl]glycinat

NO

O

NH

O

O

OO


Ansatz:

24.9 g 93.8 mmol Z-Aeg(H)-OMe (227)


13.1 ml 93.8 mmol TEA

500 ml DCM

Durchführung:

Man legt 24.9 g (93.8 mmol) Z-Aeg(H)-OMe (227) und 13.1 ml (9.51 g, 93.8 mmol) TEA in

410 ml DCM vor. Nach der Zugabe von 19.7 g (93.8 mmol) Boc2O in 90 ml DCM lässt man

über Nacht nachrühren, wäscht mit 1 M KHSO4-, ges. NaHCO3 und NaCl-Lösung und

trocknet über MgSO4. Nachdem das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt wurde,

erhält man das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

32.9 g (89.9 mmol) = 96 % d.Th.


277

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.34 (s, 5 H, ZCHarom.); 7.18 (m, 1 H,

NH); 5.01 (s, 2 H, ZCH2); 3.93 (s, 0.90 H, GlyCH2); 3.91 (s, 1.10 H, GlyCH2); 3.65 (s,

1.30 H, OCH3); 3.63 (s, 1.70 H, OCH3); 3.29 - 3.07 (m, 4 H, CH2CH2); 1.37 (s, 4.10 H,

BocCH3); 1.32 (s, 4.90 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 170.61 (GlyC=O); 170.64 (GlyC=O); 156.07 (ZC=O); 154.89 (BocC=O); 154.55

(BocC=O); 137.21 (ZCarom.); 137.10 (ZCarom.); 128.34 (Z-o-CHarom.); 127.75 (Z-m-CHarom.);

127.66 (Z-p-CHarom.); 79.31 (C(CH3)3); 79.24 (C(CH3)3); 65.27 (ZCH2); 65.23 (ZCH2); 51.72

(OCH3); 49.28, 48.38, 47.24, 47.14 (2 × GlyCH2, 2 × ZNHCH2CH2); 27.88 (BocCH3); 27.80

(BocCH3). Das Signal für ZNHCH2 wird bei ca. 40 ppm vermutet und ist wahrscheinlich vom

DMSO-Signal überdeckt. FAB-MS: 389.1 (26) [M+Na]+; 367.1 (22) [M+H]+; 267.0 (100)

[M-Boc]+.

10.72 Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (231)

Methyl N-(2-{[N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-[(prop-2-en-1-yloxy)carbonyl]glycyl]amino}-

ethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat

O NH

N

OOOO

NH

NO

OOO

Summenformel:C33H42N4O9 M = 638.72 g/mol

Ansatz:

13.9 g 45.8 mmol Boc-(Alloc)-OH (228)

21.5 g 45.8 mmol H-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (229)

17.4 g 45.8 mmol HBTU


100 ml DMF


278

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 17. Man erhält das Produkt nach Säulenchromatogra-

phie (Silica, EtOAc/MeOH 9:1) als farblosen Schaum.

Ausbeute:

22.4 g (35.0 mmol) = 76 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 9:1): 0.6. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6, Rotamere): δ = 7.92 (t(br),

1 H, NH); 7.90 (d, 3J = 7.2, 1 H, FmocCHarom.); 7.88 (d, 3J = 7.3, 1 H, FmocCHarom.); 7.67 (d, 3J = 7.4, 1 H, FmocCHarom.); 7.57 (d, 3J = 7.4, 1 H, FmocCHarom.); 7.42 (m, 2 H,

FmocCHarom.); 7.33 (m, 2 H, FmocCHarom.); 6.76 (s(br), 0.9 H, NH); 6.42 (s(br), 0.1 H, NH);

5.87 (m, 1 H, CH2CH=CH2); 5.19 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 4.47 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 4.27

(m, 3 H, FmocCH2, FmocCH); 3.97 (m, 2 H, GlyCH2); 3.75 (m, 2 H, GlyCH2) 3.64, 3.61 (je s,

zusammen 3 H, OCH3); 3.29 - 3.05 (m, 8 H, 2 × CH2CH2); 1.37, 1.35 (je s, zusammen 9 H,

BocCH3). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6, Rotamere): δ = 170.15 (COOMe); 170.04

(COOMe); 168.85 (GlyC=O); 168.79 (GlyC=O); 155.56, 155.50, 155.32, 155.23 (FmocC=O,

AllocC=O); 143.69 (FmocCarom.); 140.72 (FmocCarom.); 133.24 (CH2CH=CH2); 127.64



(CH2CH=CH2); 116.18 (CH2CH=CH2); 77.59 (C(CH3)3); 67.28 (FmocCH2); 66.95

(FmocCH2); 65.33 (CH2CH=CH2); 65.04 (CH2CH=CH2); 51.86 (OCH3); 51.76 (OCH3);

49.30, 48.67, 48.64, 48.13, 48.09, 47.45, 47.16, 46.55, 46.52 (FmocCH, 2 × GlyCH2,

CH2CH2N(Alloc), CH2CH2N(Fmoc)); 37.44, 36.89 (CH2CH2N(Alloc), CH2CH2N(Fmoc));

28.15 (BocCH3); 27.88 (BocCH3). 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6, 100 °C) (2 Rotamere,

da die Fmoc-Gruppe den Koaleszenzpunkt noch nicht ganz erreicht hat): δ = 7.87 (m,

2 H, FmocCHarom.); 7.61 (d, 3J = 7.4, 2 H, FmocCHarom.); 7.5 (m(br), 1 H, NH); 7.45 - 7.29 (m,

4 H, FmocCHarom.); 6.35 (t(br), 1 H, NH); 5.90 (ddt, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 3J = 5.2, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.27 (ddt aa dq, 3Jtrans = 17, 2J = 1.6, 4J = 1.6, 2 H, CH2CH=CHcisHtrans);

5.15 (ddt aa dq, 3Jcis = 11, 2J = 1.6, 4J = 1.6, 2 H, CH2CH=CHcisHtrans); 4.51 (dt, 3J = 5.2, 4J = 1.6, 2 H, CH2CH=CH2); 4.39 (m, 2 H, FmocCH2); 4.26 (m, 1 H, FmocCH2); 3.97 (s, 2 H,

N(Alloc)CH2CO); 3.82 (s, 1.6 H, N(Fmoc)CH2CO); 3.74 (s, 0.4 H, N(Fmoc)CH2CO); 3.65,

3.64 (je s, zusammen 3 H, OCH3); 3.36 - 3.08 (m, 8 H, 2 × CH2CH2); 1.39 (s, 9 H, BocCH3).


279

13C-NMR (62.9 MHz, DMSO-d6, 100 °C) (2 Rotamere, da die Fmoc-Gruppe den

Koaleszenzpunkt noch nicht ganz erreicht hat): δ = 169.39 (COOMe); 168.32 (GlyC=O);

155.03, 155.01 (2 × C=O); 143.34 (FmocCarom.); 140.31 (FmocCarom.); 132.79 (CH2CH=CH2);

127.01 (FmocCHarom.); 126.47 (FmocCHarom.); 124.26 (FmocCHarom.); 119.38 (FmocCHarom.);

116.08 (CH2CH=CH2); 77.24 (C(CH3)3); 66.64 (CH2CH=CH2); 64.79 (FmocCH2); 51.07

(OMe); 50.02 (CH2); 49.32 (CH2); 48.58 (CH2); 48.62 (CH2); 47.65 (CH2); 47.08 (CH2);

46.40 (FmocCH); 38.18 (CH2); 36.90 (CH2); 36.91 (CH2); 27.71 (BocCH3). FAB-MS: 678.3

(47) [M+K]+; 661.3 (97) [M+Na]+; 539.3 (33) [M-Boc]+; 178.1 (100).


280

10.73 Z-Aeg(Boc)-OH (232)

N-(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-[(tert-butoxy)carbonyl]glycin

NOH

O

NH

O

O

OO


Ansatz:

32.9 g 89.9 mmol Z-Aeg(H)-OMe (230)

180 ml 1 M LiOH

180 ml THF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 3. Nachdem der pH-Wert auf 2-3 eingestellt ist, fällt das

Produkt als farbloser Feststoff aus. Man saugt ab, wäscht mit Wasser und Diethylether und

trocknet im Vakuum.

Ausbeute:

29.4 g (83.4 mmol) = 93 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 12.61 (s(br), 1 H, COOH); 7.34 (m, 5 H,

ZCHarom.); 7.17 (m(br), 1 H, ZNH); 5.01 (s, 2 H, ZCH2); 3.86 (s, 1 H, GlyCH2); 3.82 (s, 1 H,

GlyCH2); 3.35 - 3.11 (m, 4 H, CH2CH2); 1.37 (s, 4 H, BocCH3); 1.34 (s, 5 H, BocCH3). 13C-NMR (50 MHz, (DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 171.61 (GlyC=O); 171.46 (GlyC=O);

156.16 (ZC=O); 156.09 (ZC=O); 154.93 (BocC=O); 154.78 (BocC=O); 137.24 (ZCarom.);

137.13 (ZCarom.); 128.36 (Z-o-CHarom.); 127.75 (Z-m-CHarom.); 127.65 (Z-p-CHarom.); 79.09

(C(CH3)3); 79.07; (C(CH3)3); 65.28 (ZCH2); 65.22 (ZCH2); 49.30 (GlyCH2); 48.44 (GlyCH2);

47.26 (ZNHCH2CH2); 47.16 (ZNHCH2CH2); 27.93 (BocCH3); 27.87 (BocCH3). Das Signal

für ZNHCH2 ist wahrscheinlich vom DMSO-Signal überdeckt. FAB-MS: 375.1 (15)

[M+Na]+; 353.1 (24) [M+H]+; 297.1 (25) [M-tBu]+; 253.1 (81) [M-Boc]+; 91.0 (100).


281

10.74 H-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (233)

Methyl N-[2-({N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-(2-aminoethyl)-glycyl}amino)ethyl]-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]-

carbonyl}glycinat Trifluoracetat

NH2

N

OOO

NH

NO

OOO

*TFA


Ansatz:

22.4 g 35.0 mmol Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (231)

40 ml TFA

40 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt nach AAV 15. Man erhält das Rohprodukt als leicht gelbliches Öl,

das ohne weitere Reinigung im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt wird.

Ausbeute:

22.8 g (34.9 mmol) = 99 % d.Th.

Analysedaten:

FAB-MS: 561.2 (17) [M+Na]+; 539.2 (100) [M+H]+.


282

10.75 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (234)

Methyl N-[2-({[({N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-(2-{[N-(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-{[((tert-butoxy)-

carbonyl]glycyl}amino)ethyl]glycyl}amino)ethyl]-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinate

NH

N

OOO

NH

NO

OOO

O

NNH

O

OOO


Ansatz:

12.3 g 34.9 mmol Z-Aeg(Boc)-OH (232)

22.8 g 34.9 mmol H-Aeg(Fmoc)-OMe*TFA (233)



70 ml DMF

Durchführung:



Ausbeute:

19.0 g (21.7 mmol) = 62 % d.Th.


283

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 9:1): 0.28. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6, 100 °C): δ = 7.85 (d, 3J = 7.0, 2 H, FmocCHarom.); 7.61 (d, 3J = 7.5, 2 H FmocCHarom.) darunter (s(br), 1 H, NH);

7.57 (s(br), 1 H, NH); 7.44 - 7.28 (m, 9 H, 4 × FmocCHarom., 5 × ZCHarom.); 6.81 (t(br), 1 H,

NH); 5.90 (ddt, 3J = 5.2, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.28 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jtrans = 17, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.15 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jcis = 11, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.04 (s, 2 H; ZCH2); 4.52 (dt, 3J = 5.2, 4J = 1.6, 2 H,

CH2CH=CH2); 4.39 (m, 2 H, FmocCH2); 4.26 (t(br), 3J = 6.2, 1 H, FmocCH); 3.97 (s, 2 H,

GlyCH2); 3.84 (s, 2 H, GlyCH2); 3.74 (s, 2 H, GlyCH2); 3.64 (s, 3 H, OCH3); 3.35 - 3.15 (m,

12 H, 3 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (62.9 MHz, DMSO-d6, 100 °C):

169.37 (COOMe); 168.65 (GlyC=O); 168.38 (GlyC=O); 155.51, 155.04, 155.00, 154.48

(ZC=O, BocC=O, AllocC=O, FmocC=O); 143.34 (FmocCarom.); 140.32 (FmocCarom.); 136.78

(ZCarom.); 132.75 (CH2C=CH2); 127.66 (FmocCHarom.); 127.01 (Z-o-CHarom.); 126.90 (Z-m-

CHarom.); 126.47 (Z-p-CHarom.); 124.26 (FmocCHarom.); 119.38 (FmocCHarom.); 116.16

(CH2CH=CH2); 78.59 (C(CH3)3); 66.63 (CH2CH=CH2); 64.84 (FmocCH2); 51.07 (OCH3);

46.40 (FmocCH). 27.50 (BocCH3). Die Signale der übrigen CH2-Gruppen befinden sich im

Bereich 51.13 - 37.74 ppm, können jedoch z.T. unter den gegebenen Messbedingungen

(76 mM Probe, 1024 Scans) nicht sinnvoll von der Basislinie unterschieden werden. FAB-

MS: 895.3 (35) [M+Na]+; 873.3 (15) [M+H]+; 795.3 (3) [M-Boc+Na]+; 773.3 (36) [M-Boc]+;

91.0 (100).


284

10.76 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OH (235)

N-[2-({[{N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-(2-{[N-(2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-{[(tert-butoxy)carbonyl]-

glycyl}amino)ethyl]glycyl}amino)ethyl]-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycin

OO

N

O

OHNH

OO

N

O

NH

O

N

O O

NH

O

O


Ansatz:

19.0 g 21.7 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (234)


43.4 ml 1 M LiOH

43.4 ml THF

Durchführung:

19.0 g (21.7 mmol) Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OMe (234) (21.7 mmol) werden

43.4 ml in THF vorgelegt und auf 0 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 43.4 ml 1 M LiOH-

Lösung wird 1 h bei 0 °C und 1 h bei RT gerührt. Die während dieser Zeit erfolgte Fmoc-

Abpaltung wird rückgängig gemacht, indem man bei 0 °C 7.31 g (28.2 mmol, 1.3 eq.) Fmoc-

Cl zugibt und eine weitere Stunde bei dieser Temperatur rührt. Danach stellt man durch

Zugabe von 1 M KHSO4-Lösung auf pH 3 ein und extrahiert dreimal mit je 150 ml

Ethylacetat. Die vereinten organischen Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung gewaschen,

über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird

säulenchromatographisch gereinigt (Silica, EtOAc/MeOH 9:1 → 1:1). Man erhält das Produkt

als farblosen Schaum.

Ausbeute:

12.9 g (15.0 mmol) = 69 % d.Th.


285

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 1:1): 0.46. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) (Rotamere): δ = 12.74

(s(br), 1 H, COOH); 8.00 (s(br), 2 H, 2 × NH); 7.89 (d(br), 3J = 7.4, 2 H, FmocCHarom.); 7.67

(d, 3J = 7.3, 1 H, FmocCHarom.); 7.62 (d, 3J = 7.5, 1 H, FmocCHarom.); 7.45 - 7.23 (m, 10 H,

FmocCHarom., ZCHarom, NH); 6.01 - 5.76 (m, 1 H, CH2CH=CH2); 5.20 (m, 2 H,

CH2CH=CH2); 5.00 (s, 2 H, ZCH2); 4.50 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 4.27 (m, 3 H, FmocCH2,

FmocCH); 4.04 - 3.68 (m, 6 H, 3 × GlyCH2); 3.39 - 3.13 (m, 12 H, 3 × CH2CH2); 1.36, 1.31

(je s, zusammen 9 H, BocCH3). Erhöhte Temperaturen führen zu einer schnellen Fmoc-

Abspaltung, wahrscheinlich durch die Bildung eines cyclischen Anhydrids mit der Carboxyl-

funktion. Daher ist eine Charakterisierung oberhalb des Koaleszenzpunkts nicht möglich.

FAB-MS: 881.2 (45) [M+Na]+; 859.2 (13) [M+H]+; 759.2 (28) [M-Boc]+; 91.0 (100).

HR-ESI-MS: 861.3916 (14) [M+3H]+ (ber.: 861.4034); 860.3888 (48) [M+2H]+ (ber.:

860.3956); 859.3856 (100) [M+H]+ (ber.: 859.3878).


286

10.77 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-Aem (236)

N-[15-[(Allyloxy)carbonyl]-9-[(tert-butoxy)carbonyl]-3-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}-20-(morpholin-

4-yl)-5,11,17-trioxo-3,6,9,12,15,18-hexaazaicos-1-yl]carbaminsäure-phenylmethylester

NH

N

OOO

N

O

NH

OO

N

O

NH

O

N

O O

NH

O

O


Ansatz:

12.8 g 14.9 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OH (235)

1.96 ml 14.9 mmol 4-(2-Aminoethyl)morpholin (143)

2.56 g 22.3 mmol HOSu

3.38 g 16.4 mmol DCC

60 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 18. Anschließend chromatographiert man den Rück-

stand (Silica, EtOAc/MeOH 2:1) und erhält das Produkt in Form eines farblosen Schaums.

Ausbeute:

12.1 g (12.5 mmol) = 84 % d.Th.


287

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 2:1): 0.32. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6, 100 °C): δ = 7.85 (d, 3J = 7.4, 2 H, FmocCHarom.); 7.72 (t(br), 1 H, NH); 7.64 (d, 3J = 7.3, 2 H, FmocCHarom.);

darunter (1 H, NH); 7.48 - 7.26 (m, 10 H, 4 × FmocCHarom., 5 × ZCHarom., NH); 6.81 (t(br),

1 H, NH); 5.90 (ddt, 3J = 5.2, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.27 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jtrans = 17, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.15 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jcis = 11, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.04 (s, 2 H, ZCH2); 4.52 (dt(br), 2 H, CH2CH=CH2); 4.30

(m, 3 H, FmocCH2, FmocCH); 3.88 (s, 2 H, GlyCH2); 3.85 (s, 2 H, GlyCH2); 3.74 (s, 2 H,

GlyCH2); 3.54 (m, 4 H, 2 × NCH2CH2O); 3.37 - 3.11 (m, 14 H, 3.5 × CH2CH2); 2.38 (m, 6 H,

2 × NCH2CH2O, 0.5 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). Erhöhte Temperaturen führen zu

einer schnellen Fmoc-Abspaltung, die die Charakterisierung durch 13C-NMR-Spektroskopie

verhindert. FAB-MS: 971.1 (36) [M+H]+; 871.5 (5) [M-Boc]+; 154.1 (100). MALDI-MS:

971.917 (68) [M+H]+; 871.771 (248) [M-Boc]+. HR-ESI-MS: 973.4910 (17) [M+3H]+ (ber.:

973.5034); 972.4885 (58) [M+2H]+ (ber.: 972.4956); 971.4853 (100) [M+H]+ (ber.:

971.4878).


288

10.78 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-Aem (237)

N-[9-[(Allyloxy)carbonyl]-3-[(tert-butoxy)carbonyl]-20-(morpholin-4-yl)-5,11,17-trioxo-3,6,9,12,15,18-

hexaazaeicos-1-yl]carbaminsäure-phenylmethylester

NH

N

O

NH

O

NH

OO

N

O

NH

O

N

O O

NH

O

O


Ansatz:

11.1 g 11.4 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-Aem (236)

17.8 ml 171 mmol Diethylamin

75 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 19. Der Rückstand wird chromatographiert (Silica,

EtOAc/MeOH 1:1 → 0:1) und man erhält das Produkt in Form eines farblosen Schaums.

Ausbeute:

6.82 g (9.05 mmol) = 79 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 1:1): 0.15. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 7.73 (t(br), 1 H,

NH); 7.66 (t(br), 1 H, NH); 7.54 (m(br), 1 H, NH); 7.34 (m, 5 H, ZCHarom.); 6.88 (t(br), 1 H,

NH); 5.89 (ddt, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 3J = 5.2, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.28 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jtrans = 17, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.16 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jcis = 11, 4J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.04 (s, 2 H, ZCH2); 4.52 (dt, 4J = 1.6, 3J = 5.2, 2 H,

CH2CH=CH2); 3.86 (s, 2 H, GlyCH2); 3.73 (s, 2 H, GlyCH2); 3.74 (s, 2 H, GlyCH2); 3.57 (m,

4 H, 2 × NCH2CH2O); 3.38 - 3.14 (m, 14 H, 3.5 × CH2CH2); 3.10 (s, 2 H, GlyCH2); 2.40 (m,

6 H, 2 × NCH2CH2O, 0.5 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). FAB-MS: 771.3 (21) [M+Na]+;

749.4 (59) [M+H]+; 649.3 (13) [M-Boc]+; 91 (100). HR-ESI-MS: 751.4239 (10) [M+3H]+

(ber.: 751.4354); 750.4212 (40) [M+2H]+ (ber.: 750.4276); 749.4178 (100) [M+H]+ (ber.:

749.4197).


289

10.79 Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-Aem (238)

9-[(Allyloxy)carbonyl]-N-{15-[2-(1,6-dihydro-6-oxo-2-{[(phenylmethoxy)carbonyl]amino}-9H-purin-9-

yl)acetyl]-3-[(tert-butoxy)carbonyl]-20-(morpholin-4-yl)-5,11,17-trioxo-3,6,9,12,15,18-hexaazaicos-1-yl}-

carbaminsäure-phenylmethylester

O

N N

NNH

O

NH

O

O

NH

N

O

N

O

NH

OO

N

O

NH

O

NNH

O

OOO


Ansatz:

6.78 g 9.05 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-Aem (237)

3.88 g 11.3 mmol GZ-AcOH (199)

4.39 g 11.3 mmol Brop


35 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 20. Die Reaktionsmischung wird mit Chloroform

verdünnt, mit ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Man

entfernt die Lösungsmittel am Rotationsverdampfer, chromatographiert den verbliebenen

Rückstand (Silica, EtOAc/MeOH 1:1 → 0:1) und erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

8.15 g (7.78 mmol) = 86 % d.Th.


290

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 1:1): 0.10. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 7.78 (s, 1 H,

G-C(8)H); 7.73 (t(br), 1 H, NH); 7.66 (t(br), 1 H, NH); 7.54 (m(br), 1 H, NH); 7.40 - 7.27 (m,

10 H, 10 × ZCHarom.); 6.77 (t(br), 1 H, NH); 5.89 (ddt, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 3J = 5.2, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.28 (s, 2 H, G-ZCH2); 5.27 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jtrans = 17, 4J = 1.6,

1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.15 (ddt aa dq, 2J = 1.6, 3Jcis = 11, 4J = 1.6, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.04 (s, 2 H, ZCH2); 4.98 (s(br), 2 H, G-N(9)CH2); 4.51 (dt, 4J = 1.6, 3J = 5.2, 2 H, CH2CH=CH2); 4.06, 3.95 (je s(br), zusammen 2 H, GlyCH2); 3.87 (s(br), 2 H,

GlyCH2); 3.74 (s, 2 H, GlyCH2); 3.55 (m, 4 H, 2 × NCH2CH2O); 3.35 - 3.14 (m, 14 H,

3.5 × CH2CH2); 2.41 (m, 6 H, 2 × NCH2CH2O, 0.5 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3).

FAB-MS: 1096 (42) [M+Na]+; 1074.6 (31) [M+H]+; 154.0 (100). HR-ESI-MS: 1077.5062

(5) [M+4H]+ (ber.: 1077.5243); 1076.5035 (20) [M+3H]+ (ber.: 1076.5165); 1075.5010 (57)

[M+2H]+ (ber.: 1075.5087); 1074.4983 (100) [M+H]+ (ber.: 1074.5008).

10.80 Z-Aeg(Boc)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-Aem (239)

N-{6,9-Dihydro-9-[15-[(tert-butoxy)carbonyl]-3-(2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-2,7,13,19-

tetraoxo-21-phenyl-20-oxa-3,6,9,12,15,18-hexaazaheneicos-1-yl]-6-oxo-1H-purin-2-yl}carbaminsäure-phenyl-

methylester

O

N N

NNH

O

NH

O

O

NH

N

O

N

O

NH

NH

O

NH

O

NNH

O

OOO


Ansatz:

8.98 g 8.58 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-Aem (238)

991 mg 858 µmol Pd[P(Ph)3]4

26.7 ml Diethylamin

60 ml DCM


291

Durchführung:

Man legt 8.98 g (8.58 mmol) Z-Aeg(Boc)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-Aem (237) und 26.7 ml (18.7

g, 256 mmol, 30 eq.) Diethylamin in 60 ml DCM vor und kühlt auf 0 °C ab. Danach werden

991 mg (0.858 mmol) Pd[P(Ph)3]4 hinzugegeben und die Reaktionsmischung wird 1 h bei RT

gerührt. Anschließend werden die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt und der

Rückstand durch Säulenchromatographie gereinigt (Silica, EtOAc/MeOH 1:1 → 0:1). Man

erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

5.21 g (5.27 mmol) = 61 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (MeOH): 0.19. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) (Rotamere): δ = 8.17 (s(br), 1 H, NH);

7.86 (s(br), 2 H, 2 × NH); 7.79, 7.78 (je s, zusammen 1 H, G-C(8)H); 7.42 - 7.28 (m, 10 H,

10 × ZCHarom.); 7.24 (t(br), 1 H, NH); 5.233, 5.226 (je s, zusammen 2 H, G-ZCH2); 5.00 (s,

2 H, ZCH2); 5.05, 4.93 (je s, zusammen 2 H, G-N(9)CH2); 4.15, 3.92 (je s, zusammen 2 H,

GlyCH2); 3.75, 3.70 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.56 - 3.06 (m, 20 H, GlyCH2,

3.5 × CH2CH2, 2 × NCH2CH2O); 2.35 (m, 6 H, 2 × NCH2CH2O, 0.5 × CH2CH2); 1.36, 1.31

(je s, zusammen 9 H, BocCH3). Bei 110 °C führen Signalverbreiterungen zu einer schlechten

Interpretierbarkeit des Spektrums. MALDI-MS: 1013.249 (210) [M+Na]+; 991.208 (120)

[M+H]+.


292

10.81 Z-Aeg(Boc)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem (240)

N-(6,9-Dihydro-9-{15-[(tert-butoxy)carbonyl]-3-(2-{[2-(morpholin-1-yl)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-2,7,13,19-

tetraoxo-21-phenyl-9-[2-(6-{[(phenylmethoxy)carbonyl]amino}-9H-purin-9-yl)acetyl]-20-oxa-3,6,9,12,15,18-

hexaazaheneicos-1-yl}-6-oxo-1H-purin-2-yl)carbaminsäure-phenylmethylester

O

N N

NN

NH

O

O

O

N N

NNH

O

NH

O

O

NH

N

O

N

O

NH

N

O

NH

O

NNH

O

OOO


Ansatz:

6.78 g 5.26 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-Aem (239)

2.15 g 6.58 mmol AZ-AcOH (190)

4.39 g 11.3 mmol Brop


20 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 20. Die Reaktionsmischung wird am Trockeneis-Rota-

tionsverdampfer eingeengt und der verbleibende Rückstand durch Säulenchromatographie

gereinigt (Silica, MeOH). Man erhält das Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

4.62 g (3.56 mmol) = 67 % d.Th.


293

Analysedaten:

Rf (MeOH): 0.14. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere): δ = 8.57, 8.23,

8.14, 7.96 (je m, zusammen 2 H, A-C(8)H, A-C(2)H); 7.92 - 7.17 (m, 17 H, 15 × ZCHarom.,

G-C(8)H, NH); 6.79 (t(br), 1 H, NH); 6.66 (s(br), 1 H, NH); 6.09 (s(br), 1 H, NH); 5.25 (s,

2 H, ZCH2); 5.16 (s(br), 2 H, N(9)CH2); 5.03 (s, 2 H, ZCH2); 4.87 (s(br), 2 H, N(9)CH2); 4.52

(s, 2 H, ZCH2); 4.23 (s(br), 4 H, 2 × GlyCH2); 3.81, 3.76 (je s(br), zusammen 2 H, GlyCH2);

3.57 - 3.18 (m, 18 H, 2 × NCH2CH2O, 3.5 × CH2CH2); 2.41 (m, 6 H, 2 × NCH2CH2O,

0.5 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). MALDI-MS: 1322.861 (127) [M+Na]+; 1300.814

(171) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 1302.5703 (8) [M+4H]+ (ber.: 1302.5894); 1301.5671 (26)

[M+3H]+ (ber.: 1301.5816); 1300.5652 (75) [M+2H]+ (ber.: 1300.5737); 1299.5621 (100)

[M+H]+ (ber.: 1299.5659).


294

10.82 Z-Aeg(H)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem*2TFA (241)

N-(6,9-Dihydro-9-{3-(2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-2,7,13,19-tetraoxo-21-phenyl-9-[2-(6-

{[(phenylmethoxy)carbonyl]amino}-9H-purin-9-yl)acetyl]-20-oxa-3,6,9,12,15,18-hexaazaheneicos-1-yl}-6-oxo-

1H-purin-2-yl)carbaminsäure-phenylmethylester

O

N N

NN

NH

O

O

O

N N

NNH

O

NH

O

O

NH

N

O

N

O

NH

N

O

NH

O

NH

NH

O

O

*2TFA

Summenformel: C56H66N18O13*2TFA M = 1427.30 g/mol

Ansatz:

1.38 g 1.06 mmol Z-Aeg(Boc)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem (240)


5 ml TFA

5 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 15 in der Gegenwart von Triethylsilan. Man nimmt

das Rohprodukt in 10 ml Ethylacetat auf, versetzt mit Diethylether, saugt den entstandenen

Feststoff ab und wäscht mit Diethylether. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

1.44 g (1.01 mmol) = 95 % d.Th.

Analysedaten:

Das Produkt zersetzt sich bei 110 °C, sodass keine HT-NMR-Charakterisierung möglich ist.

MALDI-MS: 1223.223 (355) [M+Na]+; 1200.790 (877) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 1202.5178

(6) [M+4H]+ (ber.: 1202.5369); 1201.5152 (24) [M+3H]+ (ber.: 1201.5291); 1200.5123 (68)

[M+2H]+ (ber.: 1200.5213); 1199.5062 (100) [M+H]+ (ber.: 1199.5135).


295

10.83 Z-Aeg(CZ)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem*TFA (242)

N-(6,9-Dihydro-9-{3-(2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]amino}-2-oxoethyl)-2,7,13,19-tetraoxo-15-[2-(2-oxo-4-

{[(phenylmethoxy)carbonyl]amino}pyrimidin-1(2H)-yl)acetyl]-21-phenyl-9-[2-(6-{[(phenylmethoxy)-

carbonyl]amino}-9H-purin-9-yl)acetyl]-20-oxa-3,6,9,12,15,18-hexaazaheneicos-1-yl}-6-oxo-1H-purin-2-yl)

carbaminsäure-phenylmethylester

N

N

O

NH

N

O

N N

NN

NH

O

O

NH

O

NH

NNH

NNH

OOO

ON

OO

N N

NNH

O

NH

O

O

O

O

O

*TFA


Ansatz:

1.00 g 701 µmol Z-Aeg(H)-Aeg(AZ)-Aeg(GZ)-Aem (241)

266 mg 876 µmol CZ-AcOH (192)

340 mg 876 µmol Brop

440 µl 3.15 mmol TEA

5 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 20. Anschließend wird die Reaktionsmischung am

Trockeneis-Rotationsverdampfer eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit

iso-Propanol versetzt und 5 min im Ultraschallbad behandelt. Man saugt den entstandenen

Niederschlag ab und wäscht mit iso-Propanol und Diethylether. Das Rohprodukt (1.08 g) wird

durch präparative RP-HPLC gereinigt. Nach Gefriertrocknung erhält man das Produkt in

Form eines farblosen Pulvers.

Ausbeute:

531 mg (332 µmol) = 47 % d.Th.


296

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere): δ = 8.56, 8.22, 8.21, 8.02 (je s,

zusammen 2 H, A-C(8)H, A-C(2)H); 7.76 (m, 2 H, C-C(6)H, G-C(8)H); 7.92 - 7.17 (m, 20 H,

ZCHarom.); 6.88 (m, 1 H, C-C(5)H); 5.27 (s, 2 H, ZCH2); 5.24 (s, 2 H, ZCH2); 5.20 (s, 2 H,

ZCH2); 5.19 (s, 2 H, ZCH2); 5.05 (s(br), 2 H, BaseCH2); 5.01 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.70

(s(br), 2 H, BaseCH2); 3.78 - 3.10 (m, 30 H, 2 × NCH2CH2O, 4 × CH2CH2, 3 × GlyCH2).

Zwischen 8.10 - 7.60 und bei 6.42 erkennt man sehr breite Singuletts, welche den diversen

NH-Spezies entsprechen und schwer zu integrieren sind. MALDI-MS: 1508.376 (34)

[M+Na]+; 1486.173 (156) [M+3H]+. HR-ESI-MS: 1487.5917 (12) [M+4H]+ (ber.:

1487.6119); 1486.5889 (37) [M+3H]+ (ber.: 1486.6041); 1485.5863 (87) [M+2H]+ (ber.:

1485.5962); 1484.5843 (100) [M+H]+ (ber.: 1484.5884).

10.84 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OH*3TFA (248)

N-[(2-Amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-N-[2-({N-[2-({N-[(4-amino-2-oxopyrimidin-1(2H)-

yl)acetyl]-N-[2-({N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methylglycyl}amino)ethyl]glycyl}amino)ethyl]-N-[(2,4-

difluor-5-methylphenyl)acetyl]glycyl}amino)ethyl]glycin

N N

NNH

O

NH2

NH

N

O

NH

NNH

NOH

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

*3TFA

Summenformel: C41H56F2N16O10*3TFA M = 1313.06 g/mol

Ansatz:

305 mg 214 µmol Me2-Aeg(Me)-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn (262)

1.0 ml 0.88 mmol TFMSA

0.50 ml 9.6 mmol m-Cresol

0.50 ml 8.5 mmol Thioanisol

3.0 ml TFA


297

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 16. Man erhält das Produkt in Form eines farblosen

Pulvers.

Ausbeute:

157 mg (120 µmol) = 56 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 140 °C): δ = 7.63 (d, 3J = 7.4, 1 H, C-C(6)H); 7.57 (s, 1 H,

G-C(8)H); darunter (s(br), 3 H, 3 × Amid-NH); 7.16 (t, 3J = 8.7, 1 H, FCHarom.); 6.89 (t, 3J = 9.8, 1 H, FCHarom.); 6.21 (s(br), div. HN+R3, COOH); 5.96 (d, 3J = 7.4, 1 H, C-C(5)H);

4.88 (s, 2 H, CH2); 4.65 (s, 2 H, CH2); 4.15 (s, 2 H, CH2); 4.04 (s, 2 H, CH2); 4.02 (s, 2 H,

CH2); 3.65 (s, 2 H, CH2); 3.58 - 3.17 (m, 16 H, 3.5 × CH2CH2, CH2); 2.85 (s, 6 H, N(CH3)2);

darunter (m, 2 H, 0.5 × CH2CH2); 2.37 (s, 3 H, CH3); 2.17 (s, 3 H, CH3). 19F-NMR

(235 MHz, DMSO-d6) (Rotamere): -78.80 (s, 9 F, F3CCOOH); -118.45 (m, 1 F, F(4)); -

120.99 (m, 1 F, F(2)). MALDI-MS: 972.564 (485) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 973.4433 (13)

[M+3H]+ (ber.: 973.4568); 972.4411 (48) [M+2H]+ (ber.: 972.4490); 971.4381 (100) [M+H]+

(ber.: 971.4411).


298

10.85 Me2-Aeg(Me)-OH*2HCl (249)

N-[2-(Dimethylamino)ethyl]-N-methylglycin Dihydrochlorid

OH

O

NN

*2HCl


Ansatz:

2.50 g 21.2 mmol Aeg (85)

3.99 ml 106 mmol Ameisensäure

5.68 ml 73.3 mmol Formalin-Lösung

Durchführung:

Man legt 2.50 g (21.2 mmol) Aeg (85) vor und gibt unter Eisbadkühlung zunächst 3.99 ml

(4.87 g, 106 mmol) Ameisensäure und anschließend 5.68 ml (6.19 g, 73.3 mmol) Formalin-

Lösung hinzu. Die Reaktionsmischung wird 12 h bei Rückflusstemperatur gerührt und danach

mit 11.6 ml konzentrierter Salzsäure versetzt. Anschließend entfernt man destillativ die

flüchtigen Komponenten und kristallisiert den verbleibenden Rückstand aus 20 ml Methanol

um. Man erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

2.02 g (8.67 mmol) = 41 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 4.20 (s, 2 H, GlyCH2); 3.77 (m, 4 H, CH2CH2); 3.11 (s, 3 H,

NCH3); 3.04 (s, 6 H, N(CH3)2). 13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 168.26 (COOH); 57.31

(GlyCH2); 51.29 (CH2); 50.82 (CH2); 43.57 (NCH3); 42.17 (N(CH3)2). FAB-MS: 321.2 (10)

[2M+H]+; 161.1 (100) [M+H]+.


299

10.86 Me2-Aeg(Me)-OH (249)

N-[2-(Dimethylamino)ethyl]-N-methylglycin

OH

O

NN


Ansatz:

2.50 g 21.2 mmol Aeg (85)

5.68 ml 73.3 mmol Formalin-Lösung

2.00 g Pd/C (10 %)

300 ml Wasser

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 4. Danach kristallisiert man das Rohprodukt aus 20 ml

Methanol um und erhält das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

2.54 g (15.7 mmol) = 75 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.85


300

10.87 H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253)

Benzyl N-(2-Aminoethyl)glycinat Ditosylat

NH

O

O

NH2

*2pTsOH

Summenformel: C11H16N2O2*2pTsOH M = 552.66 g/mol

Ansatz:

7.56 g 64.0 mmol AEG (85)

29.4 g 154 mmol p-Toluolsulfonsäure

60 ml Benzylalkohol

500 ml Toluol

Durchführung:

Zu einer Suspension aus 7.56 g (64.0 mmol) AEG (85) in 500 ml Toluol werden 29.4 g

(154 mmol) p-Toluolsulfonsäure und 60 ml Benzylalkohol gegeben. Man erhitzt die Reakti-

onsmischung am Wasserabscheider für 6 h auf 140 °C und engt anschließend auf ca. 150 ml

ein. Nach Zugabe von 500 ml Diethylether lässt man über Nacht bei -20 °C stehen. Man saugt

den entstandenen Feststoff ab, wäscht dreimal mit Diethylether, trocknet im Ölpumpen-

vakuum und erhält so das Produkt als farblosen Feststoff.

Ausbeute:

32.2 g (54.7 mmol) = 86 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, D2O): δ = 7.71 (m, 4 H, pTsOHCHarom.); 7.39 (s, 5 H, BnCHarom.); 7.29

(m, 4 H, pTsOHCHarom.); 5.20 (s, 2 H, BnCH2); 4.06 (s, 2 H, GlyCH2); 3.52 (m, 4 H,

CH2CH2); 2.32 (s, 6 H, pTsOHCH3). 13C-NMR (50 MHz, D2O): δ = 166.61 (C=O); 142.32,

139.64 (2 × pTsOHCarom.); 134.43 (BnCarom.); 129.45, 128.93, 128.85, 128.49, 125.40

(3 × BnCHarom., 2 × pTsOHCHarom.); 68.52 (BnCH2); 47.71, 44.18 (H3N+CH2CH2, GlyCH2);

35.43 (H3N+CH2); 20.54 (pTsOHCH3). FAB-MS: 231 (8) [M+Na]+; 209.1 (100) [M+H]+;

119.1 (20) [M-Bn]+.


301

10.88 Boc-Aeg(H)-OBn (254)

Benzyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycinat

NH

O

O

NH

O

O


Ansatz:

6.00 g 10.2 mmol H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253)



250 ml DCM

Durchführung:

Man legt 6.00 g (10.2 mmol) H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253) in 250 ml DCM vor und kühlt

im Eisbad auf 0 °C ab. Nach der Zugabe von 2.84 ml (2.06 g, 20.4 mmol) TEA wird über

einen Zeitraum von 15 min eine Lösung von 2.22 g (10.2 mmol) Boc2O in 50 ml DCM hinzu

getropft. Man lässt über Nacht nachrühren, wäscht mit je 200 ml Wasser und ges. NaCl-

Lösung, trocknet über MgSO4 und entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. Nach

der Chromatographie des Rückstandes (Silica, EtOAc) erhält man das Produkt als farbloses

Öl.

Ausbeute:

1.52 g (4.94 mmol) = 48 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc): 0.26. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 7.37 (m, 5 H, BnCHarom.); 6.72

(m(br), 1 H, NH); 5.11 (s, 2 H, BnCH2); 3.37 (s, 2 H, GlyCH2); 2.97, 2.54 (je m, zusammen

4 H, CH2CH2); 1.36 (s, 9 H, BocCH3). FAB-MS: 331.2 (9) [M+Na]+; 309.2 (100) [M+H]+;

253.1 (60) [M-tBu]+.


302

10.89 Boc-Aeg(Fmoc)-OBn (255)

Benzyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat

NO

O

NH

O

OOO


Ansatz:

1.49 g 4.83 mmol Boc-Aeg(H)-OBn (254)



70 ml DCM

Durchführung:

Man legt 1.49 g (4.83 mmol) Boc-Aeg(H)-OBn (254) in 50 ml DCM vor und kühlt im Eisbad

auf 0 °C ab. Nach der Zugabe von 1.66 ml (1.23 g, 9.66 mmol) DIPEA wird über einen

Zeitraum von 20 min eine Lösung von 1.25 g (4.83 mmol) Fmoc-Cl in 20 ml DCM

hinzugetropft. Anschließend lässt man über Nacht bei RT rühren. Am darauf folgenden Tag

wäscht man mit 1 M KHSO4-, ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung, trocknet über MgSO4 und

entfernt das Lösungsmittel destillativ am Rotationsverdampfer. Nach der Chromatographie

des Rückstandes (Silica, DCM/MeOH 50:1) erhält man das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

2.20 g (4.14 mmol) = 86 % d.Th.

Analysedaten:

siehe 10.90


303

10.90 Boc-Aeg(Fmoc)-OBn (255)

Benzyl N-(2-{[(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat

NO

O

NH

O

OOO


Ansatz:

12.0 g 20.4 mmol H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253)




250 ml DCM

Durchführung:

Man legt 12.0 g (20.4 mmol) H-Aeg(H)-OBn*2pTsOH (253) in 420 ml DCM vor und kühlt

im Eisbad auf 0 °C ab. Nach der Zugabe von 7.11 ml (5.28 g, 40.8 mmol) DIPEA wird über

einen Zeitraum von 20 min eine Lösung von 4.45 g (20.4 mmol) Boc2O in 120 ml DCM

hinzu getropft. Man lässt 1 h bei 0 °C und 4 h bei RT nachrühren und kühlt erneut auf 0 °C

ab. Anschließend werden 3.55 ml (2.63 g, 20.4 mmol) DIPEA und 5.28 g (20.4 mmol) Fmoc-

Cl hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei RT gerührt. Man wäscht mit je

250 ml 1 M KHSO4-, ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung, trocknet über MgSO4 und entfernt das

Lösungsmittel destillativ am Rotationsverdampfer. Nach der Chromatographie des Rückstan-

des (Silica, DCM/MeOH 50:1) erhält man das Produkt als farbloses Öl.

Ausbeute:

7.89 g (14.9 mmol) = 73 % d.Th.


304

Analysedaten:

Rf (DCM/MeOH 50:1): 0.41. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.90 (d, 3J = 7.2, 1 H, FmocCHarom.); 7.86 (d, 3J = 7.2, 1 H, FmocCHarom.); 7.67 (d, 3J = 7.2, 1 H,

FmocCHarom.); 7.57 (d, 3J = 7.2, 1 H, FmocCHarom.); 7.33 (m, 9 H, 4 × FmocCHarom.,

5 × BnCHarom.); 6.71 (s(br), 1 H, NH); 5.15 (s, 1 H, BnCH2); 5.10 (s, 1 H, BnCH2); 4.12 (m,

5 H, FmocCH, FmocCH2, GlyCH2); 3.26, 3.06 (je m, zusammen 4 H, CH2CH2); 1.35 (s, 9 H,

BocCH3). FAB-MS: 553.3 (16) [M+Na]+; 531.3 (6) [M+H]+; 431.2 (57) [M-Boc]+; 178.1

(100).

10.91 H-Aeg(Fmoc)-OBn (256)

Benzyl N-(2-Aminoethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinate Trifluoracetat

NO

O

NH2

OO

*TFA


Ansatz:

63.6 g 120 mmol Boc-Aeg(Fmoc)-OBn (255)

50 ml HSiEt3

100 ml TFA

100 ml DCM

Durchführung:


saugt den entstandenen Feststoff ab und wäscht mit Diethylether. Nach Trocknen im


Ausbeute:

56.5 g (104 mmol) = 86 % d.Th.


305

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere): δ = 7.87 (m, 5 H, 2 × FmocCHarom.,

3 × H3N+); 7.61 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.35 (m, 9 H, 4 × FmocCHarom., 5 × BnCHarom.); 5.16

(s, 0.78 H, BnCH2); 5.12 (s, 1.22 H, BnCH2); 4.20 (m, 5 H, FmocCH, FmocCH2, GlyCH2);

3.49, 2.90 (je m, zusammen 4 H, CH2H2). 13C-NMR (50 MHz, DMSO-d6) (2 Rotamere):

δ = 169.65 (COOBn); 169.62 (COOBn); 155.68 (FmocC=O); 155.48 (FmocC=O); 143.72

(FmocCarom.); 143.62; (FmocCarom.); 140.72 (FmocCarom.); 135.68 (BnCarom.); 135.60

(BnCarom.); 128.43 (BnCHarom.); 128.16 (BnCHarom.); 127.92 (BnCHarom.); 127.74


(FmocCHarom.); 124.87 (FmocCHarom.); 120.19 (FmocCHarom.); 120.12 (FmocCHarom.); 67.62,

67.29, 66.23, 66.15 (FmocCH2, BnCH2); 49.41, 48.73, 46.40, 45.84, 37.47, 37.13 (FmocCH,

GlyCH2, CH2CH2). Das Signal für eine Methylengruppe von CH2CH2 wird bei ca. 40 ppm

vermutet und ist wahrscheinlich vom DMSO-Signal überdeckt. FAB-MS: 453.2 (10)

[M+Na]+; 431.2 (100) [M+H]+.

10.92 Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (257)

Benzyl N-(2-{[N-(2-{(tert-Butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-N-[(prop-2-en-1-yloxy)carbonyl]glycyl]amino}ethyl)-

N-{[(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl}glycinat

OOO

NH

NNH

NO

OOOO

O


Ansatz:

13.7 g 45.3 mmol Boc-Aeg(Alloc)-OH (228)

24.7 g 45.3 mmol H-Aeg(Fmoc)-OBn*TFA (256)



90 ml DMF


306

Durchführung:


phie (Silica, CH/EtOAc 1:2 → 1:5) als farblosen Schaum.

Ausbeute:

23.7 g (32.7 mmol) = 73 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc): 0.37. 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6, 100 °C): δ = 7.85 (d, 3J = 7.3, 2 H,

FmocCHarom.); 7.61 (d, 3J = 7.5, 2 H, FmocCHarom.); 7.56 (t(br), 1 H, NH); 7.43 - 7.27 (m, 9 H,

4 × FmocCHarom., 5 × BnCHarom.); 6.35 (t(br), 1 H, NH); 5.89 (ddt, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 3J = 5.2, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.26 (ddt aa dq, 4J = 1.6, 3Jcis = 17, 2J = 1.6, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.14 (ddt aa dq, 4J = 1.6, 3Jtrans = 11, 2J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans);

5.14 (s, 2 H, BnCH2); 4.52 (dt, 4J = 1.6, 3J = 5.2, 2 H, CH2CH=CH2); 4.36 (d, 3J = 6.3, 2 H,

FmocCH2); 4.23 (t(br), 3J = 6.3, 1 H, FmocCH); 4.06 (s, 2 H, GlyCH2); 3.82 (s, 2 H, GlyCH2);

3.42 - 3.06 (m, 8 H, 2 × CH2CH2); 1.38 (s, 9 H, BocCH3). 13C-NMR (63 MHz, DMSO-d6,

100 °C): δ = 168.86 (GlyC=O); 168.33 (GlyC=O); 155.03 (FmocC=O, AllocC=O); 143.32

(FmocCarom.); 140.29 (FmocCarom.); 135.30 (BnCarom.); 132.78 (CH2CH=CH2); 127.78

(FmocCHarom.); 127.42 (FmocCHarom.); 127.17 (Bn-o-CHarom.); 127.02 (Bn-m-CHarom.); 126.48

(Bn-p-CHarom.); 124.30 (FmocCHarom.); 119.38 (FmocCHarom.); 116.08 (CH2CH=CH2); 77.24

(C(CH3)3); 66.71, 65.57, 64.79 (CH2CH=CH2, BnCH2, FmocCH2); 50.03, 48.89, 47.66, 46.40,

38.19 (FmocCH, 2 × GlyCH2, 2 × CH2CH2); 27.72 (BocCH3). Die Signale der übrigen CH2-

Gruppen befinden sich im Bereich 50.84 bis 35.43 ppm, können jedoch unter den gegebenen

Messbedingungen (93 mM Probe, 734 Scans) nicht sinnvoll von der Basislinie unterschieden

werden. FAB-MS: 737 (100) [M+Na]+; 715.4 (13) [M+H]+; 615.3 (78) [M-Boc]+.


307

10.93 H-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn*TFA (258)

Benzyl N-[2-({N-(2-Aminoethyl)-N-[(prop-2-en-1-yloxy)-carbonyl]glycyl}amino)ethyl]-N-{[(9H-fluoren-9-yl)-

methoxy]carbonyl}glycinat Trifluoracetat

OO

NH2

NNH

NO

OOOO

*TFA


Ansatz:

12.8 g 17.9 mmol Boc-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (257)

15 ml HSiEt3

30 ml TFA

30 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 15. Nach Trocknen im Ölpumpenvakuum erhält man

das Produkt als leicht gelbliches, hochviskoses Öl.

Ausbeute:

13.0 g (17.9 mmol) = 100 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 100 °C) (Rotamere): δ = 7.85 (m, 3 H, 2 × FmocCHarom.,

NH); 7.60 (m, 2 H, FmocCHarom.); 7.35 (m, 9 H, 4 × FmocCHarom., 5 × BnCHarom.); 5.88 (m,

2 H, CH2CH=CHcisHtrans, NH); 5.22 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 5.14 (s, 2 H, BnCH2); 4.54 (m,

2 H, CH2CH=CH2); 4.37 (m, 2 H, FmocCH2); 4.24 (m, 1 H, FmocCH); 4.06, 3.96 (je s,

zusammen 2 H, GlyCH2); 3.91, 3.90 (je s, zusammen 2 H, GlyCH2); 3.55 (t(br), 3J = 6.1, 2 H),

3.30 (m, 4 H), 3.05 (t(br), 3J = 6.1, 2 H) (2 × CH2CH2). FAB-MS: 637.3 (20) [M+Na]+; 615.3

(90) [M+H]+; 154 (100). HR-ESI-MS: 617.2866 (7) [M+3H]+ (ber.: 617.2975); 616.2837

(36) [M+2H]+ (ber.: 616.2897); 615.2803 (100) [M+H]+ (ber.: 615.2819).


308

10.94 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (259)

Benzyl N-{2-[(N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-{2-[(N-{[(4-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]-

acetyl}-N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)-N-{[(9H-fluoren-9-

yl)methoxy)carbonyl}glycinat

N

O

NH

OO

NNH

NO

OOOOO

N

NH

O

O

N

O

NH

O

O


Ansatz:

9.01 g 17.9 mmol Boc-Aeg(CZ)-OH (195)

13.0 g 17.9 mmol H-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn*TFA (258)



36 ml DMF

Durchführung:



Ausbeute:

12.8 g (11.6 mmol) = 65 % d.Th.


309

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 9:1): 0.15. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 7.78 (m, 4 H,

C-C(6)H, FmocCHarom., NH); 7.60 (d, 3J = 7.4, 2 H, FmocCHarom.); 7.40 (tr(br), 3J = 5.1, 1 H,

NH); 7.42 - 7.25 (m, 14 H, 5 × ZCHarom., 5 × BnCHarom., 4 × FmocCHarom.); 6.92 (d, 3J = 7.3,

1 H, C-C(5)H); 6.37 (s(br), 1 H, NH); 5.89 (ddt, 3J = 5.2, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.27 (ddt aa dq, 4J = 1.6, 3Jcis = 17, 2J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans);

5.14 (ddt aa dq, 4J = 1.6, 3Jtrans = 11, 2J = 1.6, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.21 (s, 2 H,

OCH2Ph); 5.14 (s, 2 H, OCH2Ph); 4.70 (s, 2 H, C-N(1)CH2); 4.51 (dt, 4J = 1.6, 3J = 5.2, 2 H,

CH2CH=CH2); 4.36 (d, 3J = 6.0, 2 H, FmocCH2); 4.22 (t(br), 3J = 6.0, 1 H, FmocCH); 4.06 (s,

2 H, GlyCH2); 3.98 (s(br), 2 H, GlyCH2); 3.84 (s, 2 H, GlyCH2); 3.46 - 3.16 (m, 12 H,

3 × CH2CH2); 1.40 (s, 9 H, BocCH3). FAB-MS: 1122.6 (40) [M+Na]+; 91.1 (100).

10.95 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-OBn (260)

Benzyl N-({[2-[(N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-(2-{[(N-(4-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-

yl)acetyl]-N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycinat

N

O

NH

OO

NNH

NH

O

OOO

N

NH

O

O

N

O

NH

O

O


Ansatz:

7.40 g 6.72 mmol Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(Fmoc)-OBn (259)

10.4 ml 101 mmol Diethylamin

45 ml DCM

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 19. Anschließend versetzt man mit 50 ml Ethylacetat

und 200 ml Diethylether und rührt für 10 min. Der entstandene farblose Feststoff wird


310

abgesaugt, mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält das Produkt

in Form eines farblosen Feststoffs.

Ausbeute:

5.06 g (5.77 mmol) = 86 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 7.82 (d, 3J = 7.3, 2 H, C-C(6)H); darunter

(m(br), 1 H, NH); 7.52 (t(br), 1 H, NH); 7.40 (m, 10 H, 5 × ZCHarom., 5 × BnCHarom.); 6.93 (d, 3J = 7.3, 1 H, C-C(5)H); 6.39 (s(br), 1 H, NH); 5.90 (ddt, 3J = 5.2, 3Jtrans = 17, 3Jcis = 11, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.33 - 5.12 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 5.21 (s, 2 H, OCH2Ph); 5.15 (s, 2 H,

OCH2Ph); 4.71 (s, 2 H, C-N(1)CH2); 4.52 (dt, 4J = 1.6, 3J = 5.2, 2 H, CH2CH=CH2); 3.98 (s,

2 H, GlyCH2); 3.86 (s, 2 H, GlyCH2); 3.51 - 3.15 (m, 10 H, 2.5 × CH2CH2); 3.41 (s, 2 H,

GlyCH2); 2.68 (t, 3J = 6.3, 2 H, 0.5 × CH2CH2); 1.41 (s, 9 H, BocCH3). MALDI-MS: 878.940

(128) [M+H]+. HR-ESI-MS: 880.4082 (13) [M+3H]+ (ber.: 880.4205); 879.4054 (48)

[M+2H]+ (ber.: 879.4126); 878.4023 (100) [M+H]+ (ber.: 878.4048).

10.96 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-OBn (261)

Benzyl N-[(Allyloxy)carbonyl]-N-[(2-{[(benzyloxy)-carbonyl]amino}-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-

N-(2-{[N-({2-[(N-{[4-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]acetyl}-N-(2-{[(tert-butoxy)-

carbonyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycinate

N N

NNH

O

NH

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

OO

O

OO

O

O



311

Ansatz:

4.84 g 5.51 mmol Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(H)-OBn (260)

2.12 g 6.17 mmol GZ-AcOH (199)

2.39 g 876 µmol Brop


30 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 20. Die Reaktionsmischung wird mit 300 ml Ethylace-

tat verdünnt, mit je 250 ml 1 M KHSO4- ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung. gewaschen und

über MgSO4 getrocknet. Man entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer, chromato-

graphiert den Rückstand (Silica, EtOAc/MeOH 4:1) und erhält das Produkt als farblosen

Schaum.

Ausbeute:

4.80 g (3.99 mmol) = 72 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 4:1): 0.08. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere):

δ = 10.76 (s(br), 2 H, 2 × ZNH); 7.80 (m, 4 H, C-C(6)H, G-C(8)H, 2 × NH); 7.37 (m, 15 H,

10 × ZCHarom., 5 × BnCHarom.); 6.93 (m, 1 H, C-C(5)H); 6.39 (s(br), 1 H, NH); 5.88 (m, 1 H,

CH2CH=CHcisHtrans); 5.31 - 5.03 (m, 6 H, CH2CH=CH2, OCH2Ph, G-N(9)CH2); 5.27 (s, 2 H,

OCH2Ph); 5.21 (s, 2 H, OCH2Ph); 4.71 (s, 2 H, C-N(1)CH2); 4.50 (m, 2 H, CH2CH=CH2);

4.24 (s, 2 H, GlyCH2); 3.98 (s, 2 H, GlyCH2); 3.89 (s, 2 H, GlyCH2); 3.55 - 3.19 (m, 12 H,

3 × CH2CH2); 1.40 (s, 9 H, BocCH3). FAB-MS: 1203.5 (8) [M+H]+; 91.1 (100).


312

10.97 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-OBn (262)

Benzyl N-[(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-N-(2-{[N-(2-[(N-{[4-

{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]acetyl}-N-{2-{[(tert-butoxy)carbony]amino}ethyl)-

glycyl]amino}ethyl)glycyl]amino}ethyl)glycinate

N N

NNH

O

NH

NH

N

O

NH

NH

NH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

OO

O

O

O


Ansatz:

5.17 g 4.30 mmol Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-OBn (261)

991 mg 858 µmol Pd[P(Ph)3]4

15.4 g 98.8 mmol N,N’-Dimethylbarbitursäure (267)

200 ml THFabs.

Durchführung:

Zu einer Lösung von 5.17 g (4.30 mmol) Boc-Aeg(CZ)-Aeg(Alloc)-Aeg(GZ)-OBn (261) in

200 ml THFabs. werden nacheinander 15.4 g (98.8 mmol) N,N’-Dimethylbarbitursäure (267)

und 991 mg (858 µmol) Pd[P(Ph)3]4 gegeben. Man lässt 2 h bei RT rühren, entfernt das

Lösungsmittel destillativ am Rotationsverdampfer und chromatographiert den Rückstand

(Silica, EtOAc/MeOH 2:1 → 1:1). Das Produkt wird als farbloser Schaum erhalten.

Ausbeute:

4.21 g (3.76 mmol) = 88 % d.Th.


313

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH): 0.28. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere): δ = 7.77

(m, 4 H, C-C(6)H, G-C(8)H, 2 × NH); 7.33 (15 H, 10 × ZCHarom., 5 × BnCHarom.); 6.91 (m,

1 H, C-C(5)H); 6.39 (s(br), 1 H, NH); 5.88 (m, 1 H, CH2CH=CHcisHtrans); 5.31 - 5.03 (m, 6 H,

CH2CH=CH2, OCH2Ph, G-N(9)CH2); 5.27 (s, 2 H, OCH2Ph); 5.21 (s, 2 H, OCH2Ph); 4.71 (s,

2 H, C-N(1)CH2); 4.50 (m, 2 H, CH2CH=CH2); 4.24 (s, 2 H, GlyCH2); 3.98 (s, 2 H, GlyCH2);

3.89 (s, 2 H, GlyCH2); 3.55 - 3.19 (m, 12 H, 3 × CH2CH2); 1.40 (s, 9 H, BocCH3). MALDI-

MS: 1143.260 (317) [M+Na]+; 1120.603 (1053) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 1122.4695 (5)

[M+4H]+ (ber.: 1122.4883); 1121.46703 (22) [M+3H]+ (ber.: 1121.4804); 1120.4646 (61)

[M+2H]+ (ber.: 1120.4726); 1119.4620 (100) [M+H]+ (ber.: 1119.4648).

10.98 Boc-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn (263)

Benzyl N-[(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-N-[2-({[(N-{2-[(N-{[4-

{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]acetyl}-N-(2-{[(tert-butoxy)carbonyl]amino}ethyl)-

glycyl]amino}ethyl]-N-[(2,4-difluor-5-methylphenyl)acetyl]glycyl}amino)ethyl]glycinat

N N

NNH

O

NH

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

OO

O

F

F

O

O

O


Ansatz:

1.50 g 1.34 mmol Boc-Aeg(CZ)-Aeg(H)-Aeg(GZ)-OBn (262)

300 mg 1.61 mmol F-AcOH (70)

625 mg 1.61 mmol Brop


20 ml DMF


314

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 20. Die Reaktionsmischung wird mit 200 ml

Ethylacetet verdünnt, mit je 200 ml 1 M KHSO4- ges. NaHCO3- und NaCl-Lösung gewaschen

und über MgSO4 getrocknet. Man entfernt das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer,

chromatographiert den verbliebenen Rückstand (Silica, EtOAc/MeOH 2:1) und erhält das

Produkt als farblosen Schaum.

Ausbeute:

1.29 g (1.01 mmol) = 75 % d.Th.

Analysedaten:

Rf (EtOAc/MeOH 2:1): 0.24. 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere):

δ = 7.97 - 7.72 (m, 5 H), 7.47 - 7.10 (m, 15 H), 6.92 - 6.81 (m, 2 H) (C-C(6)H, C-C(5)H,

G-C(8)H, F-C(6)H, F-C(3)H, 10 × ZCHarom., 5 × BnCHarom., 2 × NH); 6.42 (s(br), 1 H, NH);

5.25, 5.20, 5.17, 5.03, 4.92 (je s, teilweise br, zusammen 6 H, 3 × OCH2Ph); 4.73 (m, 2 H,

BaseCH2); 4.10 (m, 4 H, 2 × BaseCH2); 3.65 - 2.76 (m, 18 H, 3 × GlyCH2, 3 × CH2CH2); 1.98

(s(br), 3 H, FCH3); 1.39 (m, 9 H, BocCH3). 19F-NMR (235 MHz, DMSO-d6) (Rotamere):

δ = -119.63, -120.14 (je m, zusammen 2 F, F(2), F(4)). FAB-MS: 1309.3 (100) [M+Na]+.


315

10.99 H-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn*TFA (264)

Benzyl N-[2-({N-(2-{[N-(2-Aminoethyl)-N-{[4-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]-ace-

tyl}glycyl]amino}ethyl)-N-[(2,4-difluor-5-methylphenyl)acetyl]glycyl}amino)ethyl]-N-[(2-{[(benzyloxy)-

carbonyl]amino}-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]glycinat

N N

NNH

O

NH

NH2

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

OO

O

F

F

O

*TFA

Summenformel: C57H60F2N14O13*TFA M = 1301.22 g/mol

Ansatz:

1.43 g 1.11 mmol Boc-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn (263)


5 ml TFA

5 ml DCM

Durchführung:


saugt den entstandenen Feststoff ab und wäscht mit Diethylether. Nach Trocknen im


Ausbeute:

1.27 g (975 µmol) = 88 % d.Th.


316

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C) (Rotamere): δ = 8.08 (s(br), 1 H, NH); 7.95 - 7.68

(m, 4 H), 7.40 - 7.34 (m, 15 H), 7.11 (s(br), 1 H); 6.93 - 6.82 (m, 2 H) (C-C(6)H, C-C(5)H,

G-C(8)H, F-C(6)H, F-C(3)H, 10 × ZCHarom., 5 × BnCHarom., NH); 6.42 (s(br), 1 H, NH); 5.27,

5.21, 5.18, 5.02 (je s, teilweise br, zusammen 6 H, 3 × OCH2Ph); 4.80 - 4.60 (m, 2 H,

BaseCH2); 4.26 (s(br), 2 H), 4.08 (m(br), 4 H); 3.64 - 3.09 (m(br), 14 H) (2 × BaseCH2,

3 × GlyCH2, 3 × CH2CH2); 1.98 (s(br), 3 H, FCH3). 19F-NMR (235 MHz, DMSO-d6)

(Rotamere): δ = -77.01 (s, 3 F, F3CCOOH); -119.40, -120.12 (je m, zusammen 2 F, F(2),

F(4)). MALDI-MS: 1188.331 (70) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 1190.4525 (8) [M+4H]+ (ber.:

1190.4745); 1189.4532 (24) [M+3H]+ (ber.: 1189.4667); 1188.4504 (67) [M+2H]+ (ber.:

1188.4589); 1187.4474 (100) [M+H]+ (ber.: 1187.4510).

10.100 Me2-Aeg(Me)-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn*2TFA (265)

Benzyl N-[(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-N-{2-[(N-{2-[(N-{[4-

{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-oxopyrimidin-1(2H)-yl]acetyl}-N-[2-({N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-

glycyl}amino)ethyl]glycyl)-N-[(2,4-difluor-5-methylphenyl)acetyl]glycyl)amino]ethyl}glycinat

N N

NNH

O

NH

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH

O

O

O

F

F

OO

NN

O

O

*2TFA



317

Ansatz:

600 mg 461 µmol H-Aeg(CZ)-Aeg(F)-Aeg(GZ)-OBn*TFA (264)

359 mg 1.54 mmol Me2-Aeg(Me)-OH*2HCl (249)

266 mg 2.31 mmol HOSu

348 mg 1.69 mmol DCC


10 ml DMF

Durchführung:

Die Durchführung erfolgt gemäß AAV 18. Nach Reinigung durch präparative RP-HPLC und

anschließender Gefriertrocknung erhält man die Zielverbindung als farbloses Pulver.

Ausbeute:

305 mg (214 mmol) = 46 % d.Th.

Analysedaten: 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6, 110 °C): δ = 8.62 (s(br), div. N+R3); 8.08 (s(br), 1 H, NH);

7.76 (m, 5 H, C-C(6)H, FCHarom., G-C(8)H, 2 × NH); 7.41 - 7.34 (m, 15 H, 10 × ZCHarom.,

5 × BnCHarom.); 7.12 (t(br), 1 H, NH); 6.89 (m, 2 H, C-C(5)H, FCHarom.); 5.27 (s, 2 H,

OCH2Ph); 5.21 (s, 2 H, OCH2Ph); 5.18 (s(br), 2 H, OCH2Ph); 5.02 (s(br), 2 H, BaseCH2);

4.69 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.24 (s(br), 2 H, BaseCH2); 4.02 (s(br), 4 H, 2 × GlyCH2);

3.63 - 3.20 (m(br), 18 H, 2 × GlyCH2, 3.5 × CH2CH2); darunter das Signal für Wasserreste

aus dem LM; 2.90 (t, 3J = 6.0, 2 H, 0.5 × CH2CH2); 2.84 (s, 6 H, N(CH3)3); 2.40 (s, 3 H,

NCH3); 2.12 (s(br), 3 H, FCH3). 19F-NMR (235 MHz, DMSO-d6) (Rotamere): δ = -77.83

(s, 6 F, F3CCOOH); -119.39, -120.09 (je m, zusammen 2 F, F(2), F(4)). MALDI-MS:

1330.842 (577) [M+2H]+. HR-ESI-MS: 1332.5663 (8) [M+4H]+ (ber.: 1332.5851);

1331.5630 (24) [M+3H]+ (ber.: 1331.5773); 1330.5610 (73) [M+2H]+ (ber.: 1330.5695);

1329.5583 (100) [M+H]+ (ber.: 1329.5616).


318

10.101 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(G)-Aem*6TFA (268)

N

N

O

NH2

N

O

NH

O

NH

NNH

NNH

OOO

N N

NNH

O

NH2

OO

NN

F

F N

N

O

NH2

N

O

N N

NN

NH2

O

NH

NNH

NNH

OO

N

OO

N N

NNH

O

NH2

O

*6TFA


Ansatz:

6.57 mg 5.00 µmol Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OH*3TFA (248)

7.02 mg 5.00 µmol H-Aeg(C)-Aeg(A)-Aeg(G)-Aem*4TFA (224)

0.5 ml 0.8 M 1-Methylimidazol-Puffer pH 7.5

0.5 ml 0.4 M EDC*HCl

Durchführung:

Die beiden PNA-Trimere 224 (7.02 mg, 5.00 µmol) und 248 (6.57 mg, 5.00 µmol) werden in

0.5 ml 1-Methylimidazol-Puffer (0.8 M, pH 7.5) gelöst, mit dem gleichen Volumen einer

0.4 M wässrigen Lösung von EDC*HCl versetzt und dann 4 d bei RT geschüttelt. Nach

Reinigung durch präparative RP-HPLC und anschließender Gefriertrocknung erhält man die

Zielverbindung als farbloses Pulver.

Ausbeute:

7.11 mg (2.75 mmol) = 55 % d.Th.

Analysedaten:

MALDI-MS: 1903.197 (95) [M+3H]+. HR-ESI-MS: 1904.8704 (5) [M+5H]+ (ber.:

1904.8954); 1903.8673 (15) [M+4H]+ (ber.: 1903.8875); 1902.8653 (41) [M+3H]+ (ber.:

1902.8797); 1901.8629 (95) [M+2H]+ (ber.: 1901.8719); 1900.8602 (100) [M+H]+ (ber.:

1900.8641).


319

10.102 Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OMe*3TFA (291)

Methyl N-[(2-Amino-6-oxo-1,6-dihydro-9H-purin-9-yl)acetyl]-N-[2-({N-[2-({N-[(4-amino-2-oxopyrimidin-

1(2H)-yl)acetyl]-N-[2-({N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methylglycyl}amino)ethyl]glycyl}amino)ethyl]-N-[(2,4-

difluor-5-methylphenyl)acetyl]glycyl}amino)ethyl]glycinat

N N

NNH

O

NH2

NH

N

O

NH

NNH

NO

OOO

N

N

O

NH2

O

F

F

OO

NN

*3TFA


Ansatz:

2.00 mg 1.52 µmol Me2-Aeg(Me)-Aeg(C)-Aeg(F)-Aeg(G)-OH*3TFA (248)

0.64 mg 1.7 µmol HATU

2.65 µl 15.2 µmol DIPEA

100 µl 2.53 mmol MeOH

304 µl DMFabs.

Durchführung:

2.00 mg (1.52 µmol) PNA-Trimer 248 werden mit einer Lösung von 0.64 mg (1.1 eq.) HATU

und 2.65 µl (1.96 mg, 10 eq.) DIPEA in 304 µl DMFabs. versetzt. Man lässt 15 min bei RT

schütteln, gibt 100 µl (2.53 mmol) Methanol hinzu und lässt die Reaktionsmischung über

Nacht bei RT stehen. Anschließend werden die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt

(Speedvac) und der Rückstand mittels präparativer RP-HPLC gereinigt. Nach Gefriertrock-

nung erhält man die Zielverbindung als farbloses Pulver.

Ausbeute:

0.31 mg (0.23 µmol) = 15 % d.Th.

Analysedaten:

MALDI-MS: 987.495 (317) [M+2H]+.

Experimenteller Teil 11 Ligation und Replikation

320

11 Ligations- und Replikationsexperimente

Die Ligationsexperimente wurden in Reagiergefäßen (500 µl, Polypropylen) der Fa. Sarstedt

durchgeführt, die in einem Thermocycler der Fa. MJ Research (MiniCycler™ PTC-150)

temperiert wurden. Die Reaktionslösungen wurden jeweils aus einer 10 mM Stammlösung der

beiden Trimere 224 und 248 und dem gleichen Volumen einer frisch hergestellten Lösung

von EDC, Katalysator und Salz im entsprechenden Puffer angesetzt. Anschließend wurde die

Lösung gleichmäßig auf die entsprechende Anzahl Reagiergefäße aufgeteilt, die gegebenfalls

gefriergetrocknete hexa-PNA 268 enthielten. Aus diesen Ansätzen wurden in zeitlichen

Abständen je 0.5 µl entnommen und um den Faktor 100 mit einer Lösung von 5 % Acetonitril

und 0.1 % TFA in Wasser verdünnt. Die erhaltenen Proben wurden direkt mittels HPLC

analysiert oder zunächst bei RT gelagert. Die Lagerung hatte auch nach mehreren Tagen

keinen Einfluss auf die Probenzusammensetzung.

Anhang 12 Nomenklatur

I

Anhang

12 Zur Nomenklatur der hier beschriebenen Verbindungen

Die strikte Anwendung der IUPAC-Regeln führt bei vielen der größeren hier beschriebenen

Verbindungen zu sehr unübersichtlichen Namensgebilden, die damit wenig aussagekräftig

sind. Aus diesem Grund wurde hier eine Nomenklatur benutzt, die sich an die Schreibweise

von Peptidsequenzen anlehnt. Dabei bildet Aeg den Grundkörper, an dessen N-Terminus

(links) oder C-Terminus (rechts) sich weitere Aeg-Einheiten, Schutzgruppen oder Endmodifi-

zierungen befinden. Substituenten, die an das interne sekundäre Amin binden, werden wie die

Schutzgruppe einer Seitenkette notiert. PNA-Oligomere werden als poly-PNAs (z.B.

tri-PNAs) bezeichnet; handelt es sich bei den Substituenten am sekundären Amin nicht um

Nukleobasen, sondern um Schutzgruppen, wird von poly-Aegs (z.B. di-AEGs) gesprochen.

Nukleobasen und Isostere die an N1 (Pyrimidine), N9 (Purine) oder C1 mit einem Essigsäure-

Linker versehen sind, werden als Nukleobasen- bzw. Isosteren-essigsäuren bezeichnet; sind

die exocyclischen Aminofunktionen geschützt, werden sie geschützte Nukleobasen-

essigsäuren genannt. Ist die Carboxylfunktion der Essigsäure verestert, wird von

Nukleobasen-estern gesprochen.

Anhang 13 Abkürzungsverzeichnis

I

13 Abkürzungsverzeichnis

A bzw. a Adenin

aa analysiert als

abs. absolutiert

Ac Acetyl

Aeg bzw. AEG N-(2-Aminoethyl)glycin

Aem 2-Morpholinoethylamin

Alloc Allyloxycarbonyl

aq. wässrig

arom. aromatisch

B Nukleobase

Bhoc Benzhydryoxycarbonyl

ber. berechnet

Bn Benzyl

Boc tert-Butyloxycarbonyl

Brop Bromotris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat

C bzw. c Cytosin

CDI 1,1’-Carbonyldiimidazol

CH Cyclohexan

CHCA α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

CMC N-Cyclohexyl-N′-(ß-[N-methylmorpholino]ethyl)carbodiimid Tosylat

d Dublett

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecen

DC Dünnschichtchromatographie

DCC N,N’-Dicyclohexylcarbodiimid

DCM Dichlormethan

DEA Diethylamin

DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure

DIPEA N,N-Diisopropylethylamin

DMAP 4-Dimethylaminopyridin

DMF N,N-Dimethylformamid


II

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

d.Th. der Theorie

ED Ethylendiamin

EI Elektronenstoß-Ionisation

eq. Äquivalent

ESI Elektrospray-Ionisation

Et Ethyl

EDC 1-Ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydrochlorid

EtOAc Essigsäureethylester

F 2,4-Difluortoluol

FAB fast atom bombardement

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

G bzw. g Guanin

ges. gesättigt

Gly Glycin

HATU 1-[Bis(dimethylamino)methylen]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium-

hexafluorphosphat-3-oxid (N-HATU)

HBTU 1-[Bis(dimethylamino)methylen]-1H-benzotriazolium-hexafluorphosphat-

3-oxid (N-HBTU)

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)ethansulfonsäure

HMBA 4-Hydroxymethylbenzoesäure

HOAt 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol

HOBt 1-Hydroxybenzotriazol

HOSu N-Hydroxysuccinimid

HPLC high performance liquid chromatographie

HR high resolution

Hz Hertz

konz. konzentriert

LP linear positive

Lsg. Lösung

m Multiplett

M molar


III

MALDI matrix-assisted laser desorption ionization

Me Methyl

MeOH Methanol

MeCN Acetonitril

MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

MHz Megahertz

min Minuten

Mmt 4-Monomethoxytrityl

MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure

MS Massenspektrometrie

MSNT 1-(2-Mesitylensulfonyl)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol

NDMBA N,N’-Dimethylbarbitursäure

NMM N-Methylmorpholin

NMP N-Methyl-2-pyrrolidon

NMR Kernresonanzspektroskopie (nucleic magnetic resonance)

NP normal phase

PEG Polyethylenglykol

PG protective group

Ph Phenyl

PNA Peptide Nucleic Acid / Polyamide Nucleic Acid

ppm parts per million

pTsOH p-Toluolsulfonsäure

q Quartett

R2 Bestimmtheitsmaß

RMS root mean square

RNA Ribonukleinsäure

RP reversed phase

RT Raumtemperatur

s Singulett / Sekunden

SC Säulenchromatographie

SD Standardabweichung (standard deviation)

SP solid phase

SPPS solid phase peptide synthesis


IV

T Thymin

t Triplett / Thymin

tBu tert-Butyl

TEA Triethylamin

tert. tertiär

TFA Trifluoressigsäure

THAP 2,4,6-Trihydroxyacetophenon

THF Tetrahydrofuran

TFMSA Trifluormethansulfonsäure

TOF time of flight

TOTU O-[(Ethoxycarbonyl)cyanomethylenamino]-N,N,N′,N′-tetramethyluronium-

tetrafluorborat

UV Ultraviolett

VIS visible

Z Benzyloxycarbonyl

Anhang 14 HR-ESI-MS-Spektren

V

14 HR-ESI-MS-Spektren von PNA 224, F-PNA 248 und F-PNA 268

Abbildung 160. HR-ESI-MS-Spektren von PNA 224 (links), F-PNA 248 (Mitte) und PNA 268 (rechts).

Anhang 15 SimFit-Dateien

VI

15 SimFit-Dateien

15.1 SimFit-Eingabedateien

15.1.1 A-Modell

* MOPS-Puffer pH 7.6, 10 °C, 0.1 M Imidazol, 0.2 M NaI, Abbildung 139, Tabelle 11 define (1, t, p, 12) scale (3, 1.00000E+0) define (2, a, e, 11) scale (3, 1.00000E+0) select (t, a) read (NaI.txt) choose (exp1, exp2) reaction (A + B --> T) constant (1, 1E-4,1, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+10) reaction (A --> X) constant (2, 1E-6,2, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+10) reaction (B --> Y) constant (3, 1E-6,2, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+10) constant (show) reaction (compile) reaction (show) int (show) assign (obs, a = A + X) assign (obs, t = T) assign (spec, A = a) assign (spec, B = # 5e-3) assign (spec, T = t) assign (spec, X = # 0) assign (spec, Y = # 0) assign (show) time (h) conc (mM) win (0, 35, 5, 0.01, 0, 6, 1, 0.01) dim (2) integ (stiff, .0000001, 4, .050000000745058, 100, 50) simplex (plot) opar (1e+25) newton (plot) plot (spec, file) make


VII

15.1.2 B-Modell

* MOPS-Puffer pH 7.6, 10 °C, 0.1 M Imidazol, 0.2 M NaI, Abbildung 139, Tabelle 11 define (1, t, p, 12) scale (3, 1.00000E+0) define (2, a, e, 11) scale (3, 1.00000E+0) select (t, a) read (NaI.txt) choose (exp1, exp2) reaction ( A + B --> T) constant (1, 1E-4,1, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+1) reaction ( A --> X) constant (2, 1E-6,2, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+1) reaction ( B --> Y) constant (3, 1E-6,2, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+1) reaction (A + B + 0.5 T --> 1.5 T) constant (4, 1E-2,3, 1.00000E+0, 1.00000E-10, 1.00000E+1) constant (show) reaction (compile) reaction (show) int (show) assign (obs, a = A + X) assign (obs, t = T) assign (spec, A = a) assign (spec, B = # 5e-3) assign (spec, T = t) assign (spec, X = # 0) assign (spec, Y = # 0) assign (show) time (h) conc (mM) win (0, 35, 5, 0.01, 0, 6, 1, 0.01) dim (3) integ (stiff, .0000001, 4, .05, 100, 10) simplex (plot) opar (1e+25) newton (plot) plot (spec, file) make


VIII

15.2 Konzentrations-Zeit-Daten

15.2.1 Ligation in 1-Methylimidazol-Puffer

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.4 M 1-Methylimida-zol-Puffer pH 7.5, 25 µl Ansatzgröße (vgl. Abbildung 133 und Tabelle 6).

T = 0 °C

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 4.25 0.000065 0.004935 0.000065 3 1 8.01 0.000166 0.004834 0.000166 4 1 22.72 0.000503 0.004497 0.000503 5 1 30.69 0.000537 0.004463 0.000537 6 1 47.77 0.000719 0.004281 0.000719 7 1 54.93 0.000786 0.004214 0.000786 8 1 71.18 0.000937 0.004063 0.000937 9 1 94.73 0.001168 0.003832 0.001168 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.001000 2 2 4.25 0.000085 0.004915 0.001085 3 2 8.01 0.000182 0.004818 0.001182 4 2 22.72 0.000447 0.004553 0.001447 5 2 30.69 0.000550 0.004450 0.001550 6 2 47.77 0.000771 0.004229 0.001771 7 2 54.93 0.000797 0.004203 0.001797 8 2 71.18 0.000964 0.004036 0.001964 9 2 94.73 0.001182 0.003818 0.002182 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.002000 2 3 4.25 0.000121 0.004879 0.002121 3 3 8.01 0.000189 0.004811 0.002189 4 3 22.72 0.000470 0.004530 0.002470 5 3 30.69 0.000515 0.004485 0.002515 6 3 47.77 0.000741 0.004259 0.002741 7 3 54.93 0.000823 0.004177 0.002823 8 3 71.18 0.000955 0.004045 0.002955 9 3 94.73 0.001029 0.003971 0.003029 end


IX

T = 10 °C, 1 d

numb. exp. time[h] t-t0 t a 1 1 0.00 0.000000 0.0000001 0.00500 2 1 4.15 0.000201 0.000201 0.00480 3 1 8.06 0.000402 0.000402 0.00460 4 1 22.77 0.000940 0.000940 0.00406 1 2 0.00 0.000000 0.001000 0.00500 2 2 4.15 0.000259 0.001259 0.00474 3 2 8.06 0.000437 0.001437 0.00456 4 2 22.77 0.001007 0.002007 0.00399 1 3 0.00 0.000000 0.002000 0.00500 2 3 4.15 0.000262 0.002262 0.00474 3 3 8.06 0.000459 0.002459 0.00454 4 3 22.77 0.001049 0.003049 0.00395 end

T = 10 °C, 2 d (vgl. 6.1)

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 4.15 0.000201 0.004799 0.000201 3 1 8.06 0.000402 0.004598 0.000402 4 1 22.77 0.000940 0.004060 0.000940 5 1 47.77 0.001731 0.003269 0.001731 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.001000 2 2 4.15 0.000259 0.004741 0.001259 3 2 8.06 0.000437 0.004563 0.001437 4 2 22.77 0.001007 0.003993 0.002007 5 2 47.77 0.001792 0.003208 0.002792 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.002000 2 3 4.15 0.000262 0.004738 0.002262 3 3 8.06 0.000459 0.004541 0.002459 4 3 22.77 0.001049 0.003951 0.003049 5 3 47.77 0.001816 0.003184 0.003816 end

T = 20 °C

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 2.99 0.000270 0.004730 0.000270 3 1 5.87 0.000515 0.004485 0.000515 4 1 9.02 0.000761 0.004239 0.000761 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.001000 2 2 2.99 0.000314 0.004686 0.001314 3 2 5.87 0.000537 0.004463 0.001537 4 2 9.02 0.000792 0.004208 0.001792 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.001500 2 3 2.99 0.000349 0.004651 0.001849 3 3 5.87 0.000634 0.004366 0.002134 4 3 9.02 0.000914 0.004086 0.002414 end


X

T = 30 °C

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.00500 0.0000001 2 1 2.99 0.000709 0.00429 0.000709 3 1 5.87 0.001243 0.00376 0.001243 4 1 9.02 0.001795 0.00320 0.001795 1 2 0.00 0.000000 0.00500 0.000800 2 2 2.99 0.000811 0.00419 0.001611 3 2 5.87 0.001387 0.00361 0.002187 4 2 9.02 0.002009 0.00299 0.002809 1 3 0.00 0.000000 0.00500 0.002750 2 3 2.99 0.000938 0.00406 0.003688 3 3 5.87 0.001552 0.00345 0.004302 4 3 9.02 0.002134 0.00287 0.004884 end

15.2.2 Ligation in Imidazol-Puffer

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.4 M Imidazol-Puffer pH 7.5, 25 µl Ansatzgröße (vgl. Abbildung 136 und Tabelle 7).

T = 0 °C



XI

T = 10 °C, 1 d

numb. exp. time[h] a t-t0 t 1 1 0.00 0.00500 0.00000 0.0000001 2 1 2.33 0.00496 0.00004 0.00004 3 1 6.63 0.00480 0.00020 0.00020 4 1 20.52 0.00443 0.00057 0.00057 5 1 29.80 0.00428 0.00072 0.00072 1 2 0.00 0.00500 0.00000 0.00150 2 2 2.33 0.00476 0.00024 0.00174 3 2 6.63 0.00455 0.00045 0.00195 4 2 20.52 0.00414 0.00086 0.00236 5 2 29.80 0.00397 0.00103 0.00253 1 3 0.00 0.00500 0.00000 0.00250 2 3 2.33 0.00478 0.00022 0.00272 3 3 6.63 0.00460 0.00040 0.00290 4 3 20.52 0.00413 0.00087 0.00337 5 3 29.80 0.00391 0.00109 0.00359 end

T = 10 °C, 2 d (vgl. 6.1)

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 2.33 0.000041 0.004959 0.000041 3 1 6.63 0.000198 0.004802 0.000198 4 1 20.52 0.000569 0.004431 0.000569 5 1 29.80 0.000723 0.004277 0.000723 6 1 44.65 0.000922 0.004078 0.000922 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.001500 2 2 2.33 0.000237 0.004763 0.001737 3 2 6.63 0.000454 0.004546 0.001954 4 2 20.52 0.000856 0.004144 0.002356 5 2 29.80 0.001032 0.003968 0.002532 6 2 44.65 0.001176 0.003824 0.002676 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.002500 2 3 2.33 0.000223 0.004777 0.002723 3 3 6.63 0.000401 0.004599 0.002901 4 3 20.52 0.000871 0.004129 0.003371 5 3 29.80 0.001085 0.003915 0.003585 6 3 44.65 0.001281 0.003719 0.003781 end

T = RT

numb. exp. time[h] a t-t0 t 1 1 0.00 0.00500 0.00000 0.0000001 2 1 6.58 0.00477 0.00023 0.00023 3 1 20.47 0.00465 0.00035 0.00035 4 1 29.92 0.00462 0.00038 0.00038 end


XII

15.2.3 Ligation in HEPES- und MOPS-Puffer

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M Puffer (MOPS pH 7.2 oder HEPES pH 7.5), 0.2 M NaCl, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 137 und Tabelle 8).

HEPES

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.00500 0.0000001 2 1 0.57 0.000024 0.00498 0.000024 3 1 2.87 0.000073 0.00493 0.000073 4 1 5.18 0.000050 0.00495 0.000050 5 1 8.10 0.000125 0.00487 0.000125 6 1 23.32 0.000296 0.00470 0.000296 7 1 31.82 0.000382 0.00462 0.000382 1 2 0.00 0.000000 0.00500 0.000500 2 2 0.57 0.000067 0.00493 0.000567 3 2 2.87 0.000100 0.00490 0.000600 4 2 5.18 0.000070 0.00493 0.000570 5 2 8.10 0.000146 0.00485 0.000646 6 2 23.32 0.000342 0.00466 0.000842 7 2 31.82 0.000365 0.00463 0.000865 1 3 0.00 0.000000 0.00500 0.0000001 2 3 0.57 0.000213 0.00479 0.000213 3 3 1.45 0.000347 0.00465 0.000347 4 3 2.87 0.000607 0.00439 0.000607 5 3 8.10 0.000785 0.00421 0.000785 6 3 23.32 0.001015 0.00398 0.001015 7 3 31.82 0.001046 0.00395 0.001046 end

MOPS



XIII

HEPES/0.1 M Imidazol


MOPS/0.1 M Imidazol

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 2.18 0.000040 0.004960 0.000040 3 1 4.13 0.000077 0.004923 0.000077 4 1 6.13 0.000152 0.004848 0.000152 5 1 8.47 0.000199 0.004801 0.000199 6 1 23.22 0.000765 0.004235 0.000765 7 1 31.28 0.000954 0.004046 0.000954 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 1.13 0.000003 0.004997 0.000503 3 2 2.18 0.000081 0.004919 0.000581 4 2 4.13 0.000177 0.004823 0.000677 5 2 6.13 0.000241 0.004759 0.000741 6 2 8.47 0.000384 0.004616 0.000884 7 2 23.22 0.000928 0.004072 0.001428 8 2 31.28 0.001052 0.003948 0.001552 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 1.13 0.000020 0.004980 0.000020 3 3 2.18 0.000062 0.004938 0.000062 4 3 4.13 0.000180 0.004820 0.000180 5 3 6.13 0.000304 0.004696 0.000304 6 3 8.47 0.000319 0.004681 0.000319 7 3 23.22 0.000687 0.004313 0.000687 8 3 31.28 0.000787 0.004213 0.000787 end


XIV

MOPS/0.1 M 1- Methylimidazol


15.2.4 Ligation in Gegenwart von Pyridin oder HOAt

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.2, 0.2 M NaCl, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 138 und Tabelle 10).

0.1 M Pyridin



XV

0.1 M HOAt



XVI

15.2.5 Ligation in Anwesenheit verschiedener Salze

5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.1 M Imidazol, 6 µl Ansatzgröße, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 139 und Tabelle 11).

kein zusätzliches Salz

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 1.02 0.000034 0.004966 0.000034 3 1 2.15 0.000034 0.004966 0.000034 4 1 4.17 0.000091 0.004909 0.000091 5 1 7.70 0.000177 0.004823 0.000177 6 1 21.07 0.000494 0.004506 0.000494 7 1 28.82 0.000701 0.004299 0.000701 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 1.02 -0.00001 0.005011 0.000489 3 2 2.15 0.000067 0.004933 0.000567 4 2 4.17 0.000166 0.004834 0.000666 5 2 7.70 0.000289 0.004711 0.000789 6 2 21.07 0.000718 0.004282 0.001218 7 2 28.82 0.000901 0.004099 0.001401 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 1.02 0.000042 0.004958 0.000042 3 3 2.15 0.000115 0.004885 0.000115 4 3 4.17 0.000127 0.004873 0.000127 5 3 7.70 0.000293 0.004707 0.000293 6 3 21.07 0.000405 0.004595 0.000405 7 3 28.82 0.000456 0.004544 0.000456 end

0.2 M NaCl

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 1.07 -0.000006 0.005006 -0.000006 3 1 2.21 0.000021 0.004979 0.000021 4 1 4.22 0.000089 0.004911 0.000089 5 1 7.71 0.000221 0.004779 0.000221 6 1 21.19 0.000573 0.004427 0.000573 7 1 28.87 0.000686 0.004314 0.000686 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 1.07 0.000040 0.004960 0.000540 3 2 2.21 0.000086 0.004914 0.000586 4 2 4.22 0.000221 0.004779 0.000721 5 2 7.71 0.000393 0.004607 0.000893 6 2 21.19 0.000731 0.004269 0.001231 7 2 28.87 0.000936 0.004064 0.001436 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 1.07 0.000016 0.004984 0.000016 3 3 2.21 0.000034 0.004966 0.000034 4 3 4.22 0.000098 0.004902 0.000098 5 3 7.71 0.000241 0.004759 0.000241 6 3 21.19 0.000514 0.004486 0.000514 7 3 28.87 0.000566 0.004434 0.000566 end


XVII

0.2 M Na2SO4

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 0.94 -0.000003 0.005003 -0.000003 3 1 1.92 -0.000019 0.005019 -0.000019 4 1 3.97 0.000046 0.004954 0.000046 5 1 6.64 0.000101 0.004899 0.000101 6 1 21.89 0.000388 0.004612 0.000388 7 1 29.92 0.000536 0.004464 0.000536 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 0.94 0.000107 0.004893 0.000607 3 2 1.92 0.000083 0.004917 0.000583 4 2 3.97 0.000154 0.004846 0.000654 5 2 6.64 0.000190 0.004810 0.000690 6 2 21.89 0.000600 0.004400 0.001100 7 2 29.92 0.000778 0.004222 0.001278 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 0.94 0.000005 0.004995 0.000005 3 3 1.92 0.000046 0.004954 0.000046 4 3 3.97 0.000071 0.004929 0.000071 5 3 6.64 0.000091 0.004909 0.000091 6 3 21.89 0.000245 0.004755 0.000245 7 3 29.92 0.000268 0.004732 0.000268 end

0.2 M NaI

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 0.97 0.000018 0.004982 0.000018 3 1 1.96 -0.000010 0.005010 -0.000010 4 1 4.01 0.000084 0.004916 0.000084 5 1 6.67 0.000172 0.004828 0.000172 6 1 21.89 0.000677 0.004323 0.000677 7 1 29.92 0.000905 0.004095 0.000905 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 0.97 0.000034 0.004966 0.000534 3 2 1.96 0.000074 0.004926 0.000574 4 2 4.01 0.000210 0.004790 0.000710 5 2 6.67 0.000326 0.004674 0.000826 6 2 21.89 0.000948 0.004052 0.001448 7 2 29.92 0.001159 0.003841 0.001659 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 0.97 0.000021 0.004979 0.000021 3 3 1.96 0.000067 0.004933 0.000067 4 3 4.01 0.000152 0.004848 0.000152 5 3 6.67 0.000335 0.004665 0.000335 6 3 21.89 0.000465 0.004535 0.000465 end


XVIII

15.2.6 Ligation in Gegenwart von 0.4 M EDC

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.4 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.1 M Imidazol, 6 µl Ansatzgröße, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 140 und Tabelle 12).


15.2.7 Ligation bei pH 6.6

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 6.6, 0.1 M Imidazol, 6 µl Ansatzgröße, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 141 und Tabelle 13).



XIX

15.2.8 Ligation in Gegenwart von PEG

0.2 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.6, 0.2 M NaCl, 0.1 M Imidazol, 20 % PEG, 6 µl Ansatz-größe, exp.1-2: T = 10 °C, exp.3: T = RT (vgl. Abbildung 142 und Tabelle 14).

PEG400

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 1.15 -0.000024 0.005024 -0.000024 3 1 2.12 0.000007 0.004993 0.000007 4 1 4.17 0.000026 0.004974 0.000026 5 1 7.98 0.000091 0.004909 0.000091 6 1 21.65 0.000292 0.004708 0.000292 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000700 2 2 1.15 0.000020 0.004980 0.000720 3 2 2.12 0.000052 0.004948 0.000752 4 2 4.17 0.000142 0.004858 0.000842 5 2 7.98 0.000294 0.004706 0.000994 6 2 21.65 0.000666 0.004334 0.001366 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 1.15 -0.000016 0.005016 -0.000016 3 3 2.12 0.000006 0.004994 0.000006 4 3 4.17 0.000070 0.004930 0.000070 5 3 7.98 0.000112 0.004888 0.000112 6 3 21.65 0.000257 0.004743 0.000257 end

PEG3350

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 1.03 -0.000023 0.005023 -0.000023 3 1 2.02 0.000023 0.004977 0.000023 4 1 4.07 0.000128 0.004872 0.000128 5 1 7.88 0.000340 0.004660 0.000340 6 1 21.53 0.001081 0.003919 0.001081 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 1.03 -0.000006 0.005006 0.000494 3 2 2.02 0.000076 0.004924 0.000576 4 2 4.07 0.000283 0.004717 0.000783 5 2 7.88 0.000572 0.004428 0.001072 6 2 21.53 0.001403 0.003597 0.001903 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 3 1.03 0.000010 0.004990 0.000010 3 3 2.02 0.000089 0.004911 0.000089 4 3 4.07 0.000249 0.004751 0.000249 5 3 7.88 0.000402 0.004598 0.000402 6 3 21.53 0.000889 0.004111 0.000889

end


XX

15.2.9 Ligation bei unterschiedlichen Imidazol-Konzentrationen

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.4 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 7.2, 0.2 M NaI, 6 µl Ansatzgröße, T = 10 °C (vgl. Abbildung 143 und Tabelle 16).

01. M Imidazol

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 0.87 0.000092 0.004908 0.000092 3 1 1.50 0.000106 0.004894 0.000106 4 1 3.17 0.000288 0.004712 0.000288 5 1 5.67 0.000515 0.004485 0.000515 6 1 9.12 0.000829 0.004171 0.000829 7 1 23.63 0.001792 0.003208 0.001792 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 0.87 0.000070 0.004930 0.000570 3 2 1.50 0.000139 0.004861 0.000639 4 2 3.17 0.000361 0.004639 0.000861 5 2 5.67 0.000683 0.004317 0.001183 6 2 9.12 0.001012 0.003988 0.001512 7 2 23.63 0.002050 0.002950 0.002550 end

0.2 M Imidazol

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 0.75 0.000083 0.004917 0.000083 3 1 1.38 0.000055 0.004945 0.000055 4 1 3.05 0.000202 0.004798 0.000202 5 1 5.55 0.000383 0.004617 0.000383 6 1 9.00 0.000484 0.004516 0.000484 7 1 23.52 0.001119 0.003881 0.001119 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 2 0.75 0.000075 0.004925 0.000575 3 2 3.05 0.000258 0.004742 0.000758 4 2 5.55 0.000518 0.004482 0.001018 5 2 9.00 0.000734 0.004266 0.001234 6 2 23.52 0.001301 0.003699 0.001801 end


XXI

15.2.10 Ligation bei vier unterschiedlichen intialen Hexamerkonzentrationen

Reaktionsbedingungen: 5 mM PNA-Trimere 224 und 248, 0.4 M EDC, 0.2 M MOPS-Puffer pH 6.6, 0.1 M Imidazol, 10 °C, 6 µl Ansatzgröße (vgl. Abbildung 144 und Tabelle 17).

numb. exp. time[h] t-t0 a t 1 1 0.00 0.000000 0.005000 0.0000001 2 1 1.09 0.000185 0.004815 0.000185 3 1 2.16 0.000378 0.004622 0.000378 4 1 3.52 0.000730 0.004270 0.000730 5 1 5.16 0.001171 0.003829 0.001171 6 1 7.05 0.001647 0.003353 0.001647 7 1 23.47 0.003277 0.001723 0.003277 1 2 0.00 0.000000 0.005000 0.000250 2 2 1.09 0.000246 0.004754 0.000496 3 2 2.16 0.000537 0.004463 0.000787 4 2 3.52 0.000895 0.004105 0.001145 5 2 5.16 0.001421 0.003579 0.001671 6 2 7.05 0.001851 0.003149 0.002101 7 2 23.47 0.003310 0.001690 0.003560 1 3 0.00 0.000000 0.005000 0.000500 2 3 1.09 0.000255 0.004745 0.000755 3 3 2.16 0.000593 0.004407 0.001093 4 3 3.52 0.000965 0.004035 0.001465 5 3 5.16 0.001450 0.003550 0.001950 6 3 7.05 0.001820 0.003180 0.002320 7 3 23.47 0.003498 0.001502 0.003998 1 4 0.00 0.000000 0.005000 0.001000 2 4 1.09 0.000277 0.004723 0.001277 3 4 2.16 0.000614 0.004386 0.001614 4 4 3.52 0.001033 0.003967 0.002033 5 4 5.16 0.001603 0.003397 0.002603 6 4 7.05 0.001951 0.003049 0.002951 7 4 23.47 0.003441 0.001559 0.004441 end

Anhang 16 Danksagung

XXII

16 Danksagung

Ich bedanke mich bei Herrn Prof. Dr. Günter von Kiedrowski dafür, dass ich in einem sehr

interessanten Bereich forschen konnte und die wissenschaftliche Freiheit bei der Durch-

führung selbstverständlich war. Ferner möchte ich mich für seinen wissenschaftlichen Rat,

seine Unterstützung und das mir entgegengebrachte Vertrauen bedanken.

Herrn Prof. Dr. Martin Feigel danke ich für die freundliche Übernahme des Korreferates.

Bei Herrn Dr. Wolf Matthias Pankau möchte ich mich für seine wertvolle wissenschaftliche

und moralische Unterstützung bedanken. Dr. Arne Dieckmann danke ich für die freundschaft-

liche Atmosphäre in „unserer Box“ und die ständige Diskussionsbereitschaft zu wissenschaft-

lichen und anderen interessanten Themen.

Hans-Jochen Hauswald (RUBiospek) danke ich für die angenehme Zusammenarbeit bei der

Aufnahme der Hochtemperatur-NMR-Spektren. Dr. Benjamin Fraenzel (AG Dr. Dirk Wol-

ters) sei für die Aufnahme der HR-ESI-Spektren gedankt.

Den Vertiefern Alexandra Aniol, Michel Beißwenger, Christian Dietz, Mei Kappels, Daniel

Krah und Kirill Sliozberg danke ich für ihren jeweiligen Anteil an der vorliegenden Arbeit.

Der gesamten Arbeitsgruppe von Kiedrowski danke ich für das positive Arbeitsklima und die

stete Bereitschaft zur Diskussion. Besonders danke ich:

Florian Kaschuba für die Unterstützung mit IT-Knowhow;

Carsten Lodwig für die technische Hilfe bei NP-HPLC-Trennungen;

Dr. Sven Mönninghoff für das Interesse an dieser Arbeit und den interessanten Aus-

tausch zu Fragen der Peptidchemie;

Jana Pyka für die angenehme „Box-Nachbarschaft“;

Tim Wilmsen für die vetrauensvolle Zusammenarbeit im Labor;

Michael Wüstefeld für seine wichtige technische Unterstützung und sein Interesse am

Fortgang meiner Arbeit.

Ganz persönlicher Dank gebührt meiner Frau Nadine und meinen Eltern Sigrid und Fred

Plöger für ihre vielfältige Unterstützung.

Anhang 17 Lebenslauf

XXIII

17 Lebenslauf

Persönliches 13.06.1982 geboren in Remscheid, verheiratet Schule 08/1988 - 07/1992 Gemeinschafts-Grundschule Bergerhof, Radevormwald 08/1992 - 06/2001 Theodor-Heuss-Gymnasium, Radevormwald 06/2001 Abschluss: Abitur (Note 1.4) Studium 10/2001 Beginn des Chemie-Studiums, Ruhr-Universität Bochum 06/2004 Abschluss: Bachelor of Science (Note 1.8)

Bachelor-Arbeit in Organischer Chemie: Beiträge zur Synthese neuartiger mehrfachfunktionalisierter Tris-Thioether-Liganden für Goldcluster vom Au55-Typ

09/2006 Abschluss: Master of Science (Note 1.1)

Master-Arbeit in Organischer Chemie: Synthese von tripodalen Tris-Thioether-Liganden auf Peptidbasis

11/2006 - 12/2011 Promotion am Lehrstuhl für Organische Chemie I Tag der mündlichen Prüfung: 02.12.2011

Studienbegleitende Tätigkeiten 06/2004 - 10/2006 studentische Hilfskraft, Lehrstuhl für Organische Chemie I,

Ruhr-Universität Bochum 11/2006 bis heute wissenschaftlicher Mitarbeiter, Lehrstuhl für Organische Chemie I,

Ruhr-Universität Bochum

Anhang 18 Literaturverzeichnis

XXIV

18 Literaturverzeichnis

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