Embed Size (px)
DESCRIPTION
pODC Konstrukte (hergestellt durch PCR) -596 bp -264 bp -49 bp +306 bp. Ctrl. HPL. 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. 70. 25. §. Ctrl. **. §. **. + PGE 2. 20. + cAMP. 15. 10. 5. 0. Ctrl. HPL. Ctrl. DFU. NS-398. anti-PGE 2 Ak. Ctrl. + PGE 2. + cAMP. 12000. 40. 3500. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Einleitung
Aktivierung der Ornithindecarboxylase (ODC) durch Cyclooxygenase (COX)-2 in H.-pylori(Hp)-stimulierten Makrophagen (MØ): Ein Mechanismus für die Dysregulation
der angeborenen Immunantwort
• Folgende Aspekte sind im Zusammenhang mit der Immun-antwort auf H.-pylori-Infektion bekannt:
– Die Ornithindecarboxylase ist hochreguliert in M [Gobert et al. J Immunol
168:4692-4700, 2002; Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161-40173, 2004], die
daraufhin Polyamine (Spermin u.a.) produzieren.
– Spermin dysreguliert die dem Wirt angeborene Immunantwort durch:» Hemmung der antimikrobiellen NO-Produktion
[Bussiere et al. J Biol Chem 280:2409-2412, 2005]. » Induktion von Apoptose [Gobert et al. J. Immunol. 168:4692-4700, 2002;
Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161-40173, 2004].
– Aktivierung von COX-2 reguliert die Th1-Immunantwort durch die Generation
von PGE2 & dem „Second messenger”, zyklisches AMP (cAMP) [Meyer et al. J
Immunol 171:3913-3917, 2003].
• PGE2 oder cAMP hemmen die IFN-γ- & IL-12-Freisetzung & Lymphozytenproliferation als
Antwort auf H. pylori.• Hemmung von COX-2 hat den gegenteiligen Effekt.
• cAMP agiert über Aktivierung des ODC-Promoters.
Hypothesen & Ziele
• Werden M mit H. pylori stimuliert, ist über die Aktivierung des ODC-Promoters ODC stark induzierbar.
• Vergleichbar mit dem Effekt auf Zytokine kann die COX-2-Induktion & resultierendes PGE2 die ODC-Expression &-Aktivität alterieren.
• cAMP, der „down stream 2nd messenger“ & durch PGE2 aktiviert, kann die Induktion von ODC vermitteln.
Zu bestimmen, ob:
• ODC auf dem Level der Promoteraktivierung, der Transkription, reguliert wird;
• COX-2 exprimiert & PGE2 sowie „2nd messenger“ cAMP vor dem Höhepunkt der ODC-Induktion produziert werden;
• PGE2 &/oder cAMP direkt ODC aktivieren oder sie die Hp-stimulierte ODC- Aktivierung erhöhen können;
• die ODC-Aktivierung COX-2 erfordert.
A. Scholz1,3, F.I. Bussiere1,4, M. Asim 1,4, R. Chaturvedi1,4, Y. Cheng1,4, H.X. Xu1,4, M. Schneemilch1,3, F. Meyer3, K.T. Wilson1,2,4. 1Division of Gastroenterology, Department of Medicine, 2Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine; 3Otto von Guericke University, Magdeburg, Germany;
4Veterans Affairs Maryland Health Care System, Baltimore, MD.
P O S T E R of DISTINCTION – “Digestive Disease Week, May 15-18, 2005 (Chicago, U.S.A.)
Design & Methoden
RAW 264.7 M- Zelllinie (106/ml)
ODCCOX-2
RT-PCR/ „Real-
time“- PCR
PGE2 ELISA
Überstände
ODC-ProteinWestern Blot
Zellextrakte
mRNA
Stimulation mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien oder „French-press“-Lysaten & rekombinanter Urease (0 – 24 h); -/+ PGE2, cAMP, DFU, NS-398, anti-PGE2 Ak
ODC-Promoter Assays Luciferase-Reporter
Nucleäre Extrakte
ODC-AktivitätRadiochem.
Assay
cAMP-LevelELISA
ODC-Promoter Bindung
EMSA
Design & Methoden - Transfektionsstudien
ODC-Luc-264bp
pODC Konstrukte (hergestellt durch PCR)-596 bp-264 bp-49 bp+306 bp
ODC-Luc
ODC Luciferase Reporter Assay
M - HP + HP
Ctrl + PGE2, cAMP
Ctrl + PGE2, cAMP
- HP + HP
Der –264 bp-ODC-Promoter ist für die Transkription erforderlich
Luc-596
Luc-264
Luc-49
Luc+306
*
*
RLU x 103/g Protein
Identifizierung der für H. pylori verantwortlichen ODC-Promoterregion.RAW 264.7 Zellen wurden mit einem H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für 6 h inkubiert. ODC-Promoterkonstrukte wurden mittels PCR eines pODC-Musters hergestellt, das von J. Cleveland (St. Jude Children’s Research Hospital) bereitgestellt wurde. *p < 0,05 vs. nichtstimulierte Kontrolle
Parallele Induktion von ODC-Promoter- aktivität, -mRNA-Expression & -Enzym-
aktivität
Zeitverläufe der Aktivierung von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression & ODC- Aktivität als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI: 100) für o.g. Zeit versetzt. A: ODC-Promoter-Assays wurden mittels des –264 bp-Promoterkonstruktes vollzogen. B: Für die ODC-mRNA-Expression wurde die „Real-time“-PCR verwendet. C: Beim ODC-Assay wurde die Summe des vonL-[14C]Ornithin freigesetzten 14CO2 gemessen. *p < 0.05 vs. nichtstimulierte Kontrolle
Zeitverläufe der ODC-mRNA- & -Proteinexpression
Time (h)
OD
C P
rom
ote
r A
ctiv
ity
(Fo
ld In
crea
se)
0 2 4 6 12 h
ODC
ODC
-actin
0 2 4 6 12 h
A
B
C
D
E
OD
C m
RN
A E
xpre
ssio
n
(Fo
ld In
crea
se)
O
DC
Act
ivit
y(n
mo
l CO
2/h
/mg
pro
tein
)
OD
C P
rom
ote
r A
ctiv
ity
(RL
U x
10
3 /g
pro
tein
)
F
ODC Promoter Construct
Figure 1
Time (h)
OD
C P
rom
ote
r A
ctiv
ity
(Fo
ld In
crea
se)
0 2 4 6 12 h
ODC
A
B
C
D
E
OD
C m
RN
A E
xpre
ssio
n
(Fo
ld In
crea
se)
O
DC
Act
ivit
y(n
mo
l CO
2/h
/mg
pro
tein
)
Figure 1
-actin
B
Zeitverläufe der Aktivierung von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression & ODC-Aktivität als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für o.g. Zeit stimuliert. A: RT-PCR-Analyse der ODC-mRNA-Expression.B: Western-Blot-Analyse der ODC-Proteinexpression. Die Korrelation der Höhepunkte der mRNA- & Proteinexpression bei 6 h mit den Promoter- & Enzymaktivitätsassay-Daten der vorherigen Abbildung sind unbedingt zu beachten.
Zeitverläufe der COX-2-Expression, PGE2-Freisetzung & cAMP-Produktion gleichen
der Induktion von ODC
0 2 4 6 12
-actin
COX-2
hA
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 2 4 6
HPL
HP **
** **
*
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 2 4 6
* *
PG
E2
(pg
/ml)
cAM
P (
pm
ol/
mg
Pro
tein
)
Zeit (h)
B
C
Zeitverläufe der COX-2-mRNA-Expression, PGE2-Freisetzung & cAMP-
Erzeugung als Antwort auf H. pylori.RAW 264.7 Zellen wurden mit H. pylori SS1 für o.g. Zeiten stimuliert. A: RT-PCR- Analyse der COX-2-mRNA-Expression. B: PGE2-Freisetzung im Medium; Daten für
Stimulation mit intakten H. pylori (HP) & „French-press“-Lysaten (HPL) jeweils MOI 100. C: Detektion von cAMP in M-Lysaten. For B & C: *p<0,05; **p<0,01 vs. nichtstimulierte Zellen.
PGE2 & cAMP potenzieren die durch H. pylori stimulierte ODC-
Promoteraktivität
Effekt der Zugabe von PGE2
& cAMP auf die Induktion des ODC-Promoters durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysaten (HPL; MOI: 100) für 6 h behandelt, -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 µM)
oder zellpermeablem cAMP- Analogon, 8-bromo-cAMP (0.1 µM). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle, §p < 0,05 vs. HPL-stimulierte Zellen -/+ PGE2
oder cAMP.
OD
C-P
rom
ote
rakt
ivit
ät (
RL
U x
103 /
mg
Pro
tein
)
PGE2 & cAMP potenzieren H.-pylori-stimulierte ODC-mRNA-Expression
OD
C-m
RN
A-E
xpre
ssio
n(A
nst
ieg
als
Vie
lfac
hes
)
Effekt der Zugabe von PGE2 oder cAMP auf die Induktion der ODC-mRNA-Expression („Real-time“-PCR) durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien (HP; MOI: 100), -Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50 g/ml) für 6 h behandelt -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 µM) oder zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). Hier Daten eines repräsentativen Experiments gezeigt.
PGE2 & cAMP potenzieren H.-pylori-stimulierte ODC-Enzymaktivität
Effekt der Zugabe von PGE2
oder cAMP auf die Induktion der ODC-Enzymaktivität durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori [SS1]-Lysaten (HPL; MOI: 100) für 6 h stimuliert -/+ exogener Zugabe von PGE2
(0,1 M) oder zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle, §p < 0,01 vs. HPL-stimulierte Zellen -/+ PGE2 oder cAMP.
O
DC
-Act
ivit
ät(p
mo
l CO
2/h
/mg
Pro
tein
)
H.-pylori-stimulierte ODC-Aktivität wird durch COX-2 & PGE2 vermittelt
O
DC
-Act
ivit
ät(p
mo
l CO
2/h
/mg
pro
tein
)
Effekt der Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 auf H.-pylori-stimulierte ODC-Aktivität. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien (HP; MOI: 100), H.-pylori-“French-press“-Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50 µg/ml) stimuliert ohne (Ctrl, gelbe Balken) & mit COX-2-Inhibitoren wie z.B. DFU (10 µM), NS-398 (1 µM) oder neutralisierendem anti-PGE2-Ak 2B5 (135 mg/ml). **p < 0,01 vs. nichtstimulierte Kontrolle; §p < 0,05 vs. stimulierte Zellen -/+ Inhibitor.
H.-pylori-induzierte Bindung von nukleären Proteinen an ODC-Promoter wird nicht durch
cAMP verstärkt
Effekt der Zugabe von cAMP auf H.-pylori-stimulierteBindung von nukleären Proteinen an den ODC- Promoter. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]- Lysaten (HPL; MOI: 100) für 2 h versetzt -/+ exogener Zugabe von zellpermeablem cAMP-Analogon, 8-bromo-cAMP (0,1 µM). Nukleäre Proteine wurden extrahiert & inkubiert mit 32P--ATP-markiertem 133 bp-ODC- Promoterfragment (nt –264 bis –131 bp), was wir als bindend an H.-pylori-stimulierte nukleäre Proteine identifizierten.
ZUSAMMENFASSUNG der Ergebnisse- Regulation der H.-pylori-stimulierten
ODC in Makrophagen
• H. pylori induzierte gleiches zeitabhängiges Anstiegsverhalten der ODC-Promoteraktivität, -mRNA-Expression, -Proteinexpression & funktioneller Enzymaktivität mit „Peak“ bei 6 h.
• COX-2-Expression, PGE2-Freisetzung & Erzeugung von cAMP zeigten signifikante Anstiege 4 h nach Stimulation.
• Zugabe von PGE2 oder cAMP erhöhten die H.-pylori-induzierte ODC- Promoteraktivität, -mRNA-Expression & -Enzymaktivität.
• Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 reduzierten signifikant die ODC-Aktivität.
• cAMP beeinflusste nicht die Bindung nukleärer Extrakte von H.-pylori-stimulierten M an den ODC-Promoter.
• Nukleäre Extrakte von H.-pylori-stimulierten Zellen banden auch nicht an eine Vergleichsprobe, die die „cAMP response element” Bindungs (CREB)-Seite enthielt (Daten nicht gezeigt).
Schlussfolgerungen
• PGE2 & cAMP sind allein nicht in der Lage ODC signifikant zu erhöhen, sie potenzieren jedoch die Induktion von ODC durch H. pylori.
• Die Induktion von ODC wird teilweise durch COX-2 & PGE2
vermittelt.
• Die Potenzierung der ODC-Promoteraktivität durch cAMP lässt sich eher durch erhöhte Bindungs-affinität von Transkriptionsfaktoren als von CREB-Proteinen begründen.
M
0
5
10
15
20
25
Ctrl HPL
+ cAMP
+ PGE2
Ctrl ****
§
§
0 10 20 30 40 50 60 70
HPL
Ctrl
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Ctrl HPL
+ cAMP
+ PGE2
Ctrl
**
****
§§§§
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Ctrl HP HPL Urease
+ cAMP+ PGE2Ctrl
A
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Ctrl HP HPL Urease
anti-PGE2 AkNS-398DFUCtrl
** ** **
§
§
§
§
§
§
§§
§
A C
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8 10 12
**
**
**§§
OD
C A
ctiv
ity(n
mol
CO
2/h/
mg
prot
ein)
B
OD
C m
RN
A E
xpre
ssio
n
(Fol
d In
crea
se)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12
*
** **
OD
C P
rom
oter
Act
ivity
(Fol
d In
crea
se)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 2 4 6 8 10 12
**
*
Time (h) Time (h) Time (h)
OD
C-P
rom
oter
aktiv
ität
(Ans
tieg
als
Vie
lfach
es)
OD
C-m
RN
A-E
xpre
ssio
n(A
nstie
g al
s V
ielfa
ches
)
OD
C-E
nzym
aktiv
ität
(pm
ol C
O2/
h/m
g P
rote
in)
Zeit (h) Zeit (h) Zeit (h)
