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Prospektive Pilotstudie zur Prüfung eines Antikörper-beschichteten Nanodetektors für die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus dem Blut von Nierenzellkarzinom-Patienten - PowerPoint PPT Presentation
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Einleitung
Der Nanodetektor basiert auf einem 16 cm langen Edelstahldraht (Durchmesser 0,5 mm), welcher an einem Ende über einen 2,5 cm langen Bereich mit Gold und einem Hydrogel beschichtet wurde. Diese Oberfläche ermöglicht eine kovalente Bindung von Antikörpern, die gegen das humane Oberflächenantigen EpCAM (Epithelial Cell Adhesions Molecule) gerichtet sind. Die prospektive Pilotstudie wurde zur Überprüfung der Funktionalität des medizinischen Drahtes (FSMW) in vitro durchgeführt (Abb.1).
Prospektive Pilotstudie zur Prüfung eines Antikörper-beschichteten Nanodetektors für die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus dem Blut von
Nierenzellkarzinom-Patienten
Gerit Theil1, M. Raschid Hoda1, Kersten Fischer1, Klaus Lücke2, Paolo Fornara1 1 Klinik und Poliklinik für Urologie und Nierentransplantationszentrum, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg,
2 Gilupi Inc., Potsdam
Abb. 1: Aufbau des Antikörper-beschichteten Nanodetektors
a) b)
c) d)
e)
Abb. 5: Färbung: Overlay von anti-pan-CK-FITC-, anti-CD45-APC-, Hoechst-Kernfärbung. Beispiel für CTC aus RCC-Patientenblut am FSMW. a) RCC-Patient 7, b) RCC-Patient 1
Methode
Im ersten Teil der Studie wurde die EpCAM-Expression an Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen (RCC) unterschiedlicher Tumorentität und unterschiedlichen Malignitätsgrades immunzytometrisch untersucht (Abb. 2 und 3). Die folgenden Spiking-Experimente dienten der Evaluierung des FSMW. Dazu wurden 15 mL EDTA-Blut von gesunden Probanden mit Primärkulturzellen von Nierenzellkarzinomen angereichert (12 - 660 RCC-Zellen/mL) und der Nanodetektor im hämodynamischen Modell (Fließgeschwindigkeit 2,65 cm/s, 30 min) angewendet (Abb. 4, Tab. 1). Abschließend wurde Blut von 13 RCC-Patienten mit gesicherter Diagnose in unterschiedlichen Tumorstadien eingesetzt. Das Blut von 2 gesunden Probanden und eines Patienten mit benigner Nierenerkrankung diente als Kontrolle (Abb. 5, Tab. 2). Die Charakterisierung der isolierten RCC-Zellen bzw. der CTC erfolgte mit anti-pan-CK-FITC und die Kernlokalisation mit Hoechst 33258. EpCAM-positive Leukozyten wurden mit der CD45-APC-Kontrollfärbung identifiziert.
Ergebnisse – EpCAM-Expression der Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen - immunzytochemische Untersuchung
Primärkulturzellen von RCC-n(n = Nummer der Zelllinie)
Zellzahl/mL Blut
Anzahl pan-CK positiver Zellen am FSMW
RCC-45 (hellzellig pT3b) 660 832
RCC-149 (sarkomatoid) 660 0
RCC-53 (hellzellig pT1a) 30 186
RCC-53 (hellzellig pT1a) 15 82
RCC-84 (hellzellig pT1b) 12 2
RCC-63 (hellzellig pT1b) 12 6
RCC-182 (hellzellig pT1b) 12 2
Abb. 2: PFA-fixierte Primärkultur; immunzytochemischer Nachweis von EpCAM mit anti-EpCAM-FITC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258 a) hellzellige RCC-45-Zellen (pT3b, G2) , b) hellzellige RCC-28 (pT1a, G1)
b)a)
Tab. 2: Zusammenfassung- FSMW ex-vivo CTC-Isolierung
Abb. 4: a) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (hellzellig, pT3b, G2), Färbung mit pan CK-FITC und anti-CD45-APC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258 b) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (Rasterelektronenmikroskopie)
Abb. 3: EpCAM-Expression der Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen
Ergebnisse – Spiking-Experimente (hämodynamischen Modell)
a) b)
Tab. 1: Zusammenfassung- Spiking-Experimente
Ergebnisse – Ex-vivo-Isolierung von CTC aus Patientenblut (hämodynamisches Modell)
Histologie Tumorentität CTC Histologie Tumorentität CTC Histologie CTC
lokal begrenzte Nierentumore metastasierte Nierentumore Kontrollgruppe
pT1aG1 hellzellig 2 pT1aG1 papillär 0 Benigne Erkr. 1pT1aG2 hellzellig 0 pT1G2 hellzellig 5 Gesund 1pT1aG3 papillär 10 pT3aG3 hellzellig 2 Gesund 0pT1bG1 papillär 5 hellzellig 3pT1bG2 papillär 0 pT3aG2 hellzellig 3
pT3aG2 hellzellig 3pT3bG2-3 hellzellig 7pT3aG2 chromophil 8
a) b)
SchlussfolgerungDie untersuchten Tumorentitäten weisen eine unterschiedlich starke EpCAM-Expression auf, die beim hellzelligen Nierenzellkarzinom tendenziell höher ist. Es konnte gezeigt werden, daß eine ex-vivo CTC-Isolierung beim RCC mit Hilfe des FSMW möglich ist. Weiterführende Untersuchungen an Tumorgewebeproben und Patientenblut sollen die erhoben Befund untermauern.
0
5
10
15
20
25
30
35
hellzellig papillär sarkomatoid
Nierentumorentität
EpC
AM
-Exp
ress
ion
[%]