Einsatz in optischen Sensoren Absorptionsbanden im nahen … · 2020. 3. 26. · den MitdoktorandenCaspar Demuth, Alphons Fakler und Mathias Nagele sowie Dr WStahel vomSeminarfür

Research Collection

Doctoral Thesis

Bestimmung von Elektrolyten im Blutplasma mit chemischenSensoren und die Verarbeitung der Rohdaten und Farbstoffe mitAbsorptionsbanden im nahen Infrarot-Spektralbereich für denEinsatz in optischen Sensoren

Author(s): Citterio, Daniel

Publication Date: 1998

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Diss ETH Nr 12503

Bestimmung von Elektrolyten in Blutplasma mit chemischen

Sensoren und die Verarbeitung der Rohdaten

und

Farbstoffe mit Absorptionsbanden im nahen Infrarot-

Spektralbereich für den Einsatz in optischen Sensoren

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN

der

EIDGENOSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH

vorgelegt von

Daniel Citteno

Dipl Chem ETH

geboren am 17 Dezember 1967

von Zürich (ZH)

Angenommen auf Antrag von

Prof Dr G Folkers, Reierent

PD Dr U E Spichiger, Korreferentin

Prof Dr U P Wild, Korreferent

Zürich 1998

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Für meine lieben Eltern

und

meine Freunde

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Prot Dr G Folkers danke ich für die Möglichkeit, die Promotionsarbeit

in seiner Gruppe durchfuhren zu dürfen Besonders danke ich PD Dr

U E Spichiger, die es verstand, meine Arbeit durch zahlreiche anregende

Diskussionen zu leiten Auch danke ich ihr für den unermüdlichen Einsatz

zur Sicherstellung der finanziellen Unterstützung Ich danke Prof Dr U

Wild lur die Übernahme des Korreferats

Grosser Dank gebührt Prof Dr DJ Vonderschmitt, Dr P Pei und

seinem Team vom Institut für klinische Chemie am Universitatsspital

Zürich sowie Remo Wild für die Unterstützung wahrend des klinischen

Teils dieser Arbeit

Der Optik-Gruppe am Paul-Schener-Institut Zürich, besonders Dr R E

Kunz, Dr H P Zappe und Bernd Maisenholder bin ich zu grossem Dank

für die Ratschlage in physikalischen Belangen und Messungen verpflichtet

Prof Dr G Patonay (Atlanta), Prof Dr O S Wolfbeis (Regensburg)

und Dr Gerhard Mohr (Graz) danke ich für die zur Verfugung gestellten

Farbstoffproben

Den Laborkollegen Dr Stefan Räsonyi und Dr Luzi Jenny bin ich für

ihre Unterstützung oder Durchfuhrung der Synthese- und Strukturaufkla-

rungsarbeiten äusserst dankbar Für die statistische Beratung danke ich

den Mitdoktoranden Caspar Demuth, Alphons Fakler und Mathias Nagele

sowie Dr W Stahel vom Seminar für Statistik der ETH Für die sorgfal¬

tige Durchsicht des vorliegenden Texts danke ich Caspar Demuth und

Thomas Roth, der mich auch bei Computerproblemen tatkraftig unter¬

stutzte

Zum Schluss mochte ich allen heutigen und ehemaligen Gruppenmitghe-

dern für das offene und kameradschaftliche Klima in unserer Forschungs¬

gruppe danken, das das Arbeiten auch in schwierigen Phasen zu einer

grossen Freude machte

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Die folgenden Publikationen wurden wahrend dieser Arbeit verfasst

D Freiner, R E Kunz, D Citteno, U E Spichiger, M T Gale Integrated

optical sensors based on refractometry of wn selective membranes, Sens

Actuators B, 29, 277-285 (1995)

U E Spichiger, D Citteno, M Bott Analyte-selective membranes and

optical evaluatwn techniques Characterizatwn of response behavwur by

ATR measurements, Proc SPIE, 2508, 179-189 (1995)

D Citteno, S Räsonyi, U E Spichiger Development of new dyes for use

in integrated optical sensors, Fresenius J Anal Chem, 354, 836-840

(1996)

R Wild, D Citteno, J Spichiger, U E Spichiger Continuous momtonng

of ethanol for bioprocess control by a chemical sensor, Journal of

Biotechnology, 50, 37-46 (1996)

D Citteno, L Jenny, S Räsonyi, U E Spichiger Dyes for use in

integrated optical sensors, Sens Actuators B, 39, 202-206 (1997)

G J Mohr, D Citteno, U E Spichiger Synthesis of novel chromogenic

hgandsfor optical sensing of ethanol, eingereicht zur Publikation (1997)

D Citteno, M Nagele, W Stahel, P Pei, D J Vonderschmitt, U E

Spichiger Determination of the mass concentratwn of water, wmc

strength and single-ion activity coefficients in blood plasma of individual

specimens, in Vorbereitung (1997)

L Jenny, D Citteno, U E Spichiger Reduced dicyanovinyl dyes, in

Vorbereitung (1998)

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INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1. ZUSAMMENFASSUNG 13

2. SUMMARY 15

3. EINFUHRUNG 17

4. CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN

ANALYTIK 23

5. GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER

SENSOREN 27

5 1 Ionenselektive Elektroden 27

5 2 Ionenselektive Optoden 32

6. KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN

SENSOREN 39

6 1 Einfuhrung in die Problemstellung 39

6 2 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 40

6 3 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in Plasma 43

6 4 Abschätzung der Etnzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Plasma 45

6 4 1 Das erweiterte Debye-Huckel-Modell 46

6 4 2 Stokes-Robinson-Hydratationstheone 48

6 4 3 Das Pitzer-Modell 49

6 4 4 Vergleich von Aküvitatskoeffizienten im physiologischenBereich 52

6 5 Aktivitäten versus Konzentrationen 54

6 6 Umrechnung von Ionenaktivitaten in Ionenkonzentrationen 57

6 6 1 Individuelle und mittlere Massenkonzentration von Wasser 62

6 6 2 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke 64

6 6 3 Individuelle und mittlere molale Einzehonen-

Aktivitatskoeffizienten 66

6 6 4 Komplexierung von zweiwertigen Kationen 70

10 INHALTSVERZEICHNIS

6 6 5 Transformation von aktiven Molahtaten in freie

(molare) Ionenkonzentrationen 73

6 7 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 82

6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch Vergleichvon Ionenaktivitaten und Ionenkonzentrationen 84

6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer

ISE-Messkette 95

6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99

6 10 1 Einfluss des pH-Wertes auf die Messung mit optischenSensoren 99

6 10 2 Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration

in Vollblut 103

6 11 Schlussfolgerungen 105

OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON

NIR-FARBSTOFFEN 109

7 1 Einfuhrung in die Problemstellung 109

7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen 111

7 3 Chromoionophore für Optodenmembranen 114

7 4 NIR absorbierende Farbstoffe 119

7 4 1 Allgemeines 119

7 4 2 Polymethin-Farbstoffe 120

7 5 Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore 124

7 5 1 Ausgangslage 124

7 5 2 Stabilität der Farbstoffe 127

7 5 3 Geeignete Membranmedien 129

754 pH-empfindliche Optoden basierend auf Nafion-Membranen 130

7 5 5 Optoden basierend auf PVC-Membranen 136

7 5 6 Schlussfolgerungen 138

INHALTSVERZEICHNIS 11

7 6 Merocyanine als Chromoionophore 140


7 6 2 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVCMembranen 143

7 6 3 Ca +-selektive Optode für den Einsatz im NIR Spektralbereich 151


7 7 Reduzierte Dicyanovinyl Farbstoffe 158


7 7 2 pH empfindliche Optoden basierend aufweichgemachten PVC-Membranen 165

77 3 Ca'-selektive Optode für den Einsatz im NIR-Spektralbereich 177

7 7 4 Schlussfolgerungen 181

7 8 Das miniaturisierte Mach Zehnder-Interferometer 182

8. AUSBLICK 187

9. EXPERIMENTELLER TEIL 189

9 1 Klinische Untersuchungen 189

9 1 1 Probanden 189

9 1 2 Probenahme 189

9 1 3 Verwendete Gerate und Methoden 190

9 1 4 Kahbrationsmethoden 192

9 1 5 Qualitätskontrolle 192

9 2 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193

9 2 1 Optodenmembranen basierend auf PVC und OH-PVC 193

9 2 2 Optodenmembranen aus Nafion 194

9 3 Messlosungen und Kahbratoren 195

9 4 Messgerate 196

9 5 Computersoftware und -hardware 196

9 6 Verwendete Abkürzungen 197

12 INHALTSVERZEICHNIS

10. LITERATUR 201

Anhang 1 219

Anhang 2 225

Lebenslauf 235

13

1. Zusammenfassung

Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Rahmenbedingungen für

den Einsatz von chemischen Sensoren für die Bestimmung von Elektro¬

lyten (Na+, K+, Ca1+, Mg1+) in Blutproben Die Resultate von direkten

Messungen in unverdünnten Specimen wurden mit denjenigen von in¬

direkten Messungen in verdünnten Proben verglichen Das Probanden¬

kollektiv (n=82) setzte sich aus "Gesunden", sowie aus Hamodialysepati-

enten und Patienten der Intensivstation für innere Medizin zusammen Das

Ziel der Studie war es, den Einfluss von Variationen der Massenkonzen¬

tration von Wasser, der Ionenstarke, der Einzehonen-Aktivitatskoeffizi-

enten und dem Komplexierungsgrad auf die Interpretation von Rohdaten

zu untersuchen Diese Parameter sind verantwortlich für Differenzen zwi¬

schen den Resultaten aus indirekter und direkter Messung mit chemischen

Sensoren Die IFCC (International Federation of Clinical Chemistry)

empfiehlt einen Algorithmus, um Ergebnisse aus direkten ISE-Messungen

(lonenselektive Elektroden) rechnerisch in Gesamtkonzentrationen, äqui¬

valent zu Messwerten aus der indirekten Bestimmung, umzuwandeln Die

Fehler, die durch die Anwendung dieses Algorithmus entstehen, wurden

untersucht und diskutiert Für Na+- und K+-ISE-Messungen traten bei

17% und bei Ca2+- und Mg1+-Analysen bei 37% der untersuchten Pati¬

entenproben Abweichungen vom "wahren" Wert von mehr als 0 5% auf

Die Fehler rührten hauptsächlich von den interindividuellen Variationen

der Massenkonzentration von Wasser her, die im IFCC-Algorithmus nicht

berücksichtigt werden Die Datentransformation basierend auf diesem Al¬

gorithmus ist nicht nur gefahrlich in Bezug auf Fehlinterpretationen,

sondern kann auch zum Verlust von wertvollen Informationen aus dem

Sensor-Rohsignal fuhren Zusätzliche Information, die Rückschlüsse auf

die nicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser erlaubt,

konnte aus dem Vergleich von direkter und indirekter Elektrolytmessung

insbesondere von Natriumionen gewonnen werden

14 ZUSAMMENFASSUNG

Im zweiten Ted der Arbeit ging es darum, pH-Indikatoren, die sich

für den Einsatz als Chromoionophore in monolithisch-integrierten opti¬

schen Sensorsystemen eignen, zu entwickeln Das Ziel war es, die hohe

Effizienz der Messplattform im roten und im nahen infraroten (NIR)

Spektralbereich sowie billig verfugbare Laserdioden als Lichtquellen nut

zen zu können Dies bedingte die optische Empfindlichkeit der Chromo¬

ionophore im NIR-Bereich Die kationischen Cyanin- und Streptocyanin-

Farbstotfe zeigten Probleme in der Kombination mit den zur Verfügung

stehenden neutralen, hpophilen Ionophoren in apolaren Membranmedien

pH-empfindliche NIR-Optoden mit dem polaren lonentauscherpolymer

Nafion als Membranmatrix wurden realisiert Neutrale oder zwittenoni-

sche Merocyanine mit Absorptionsmaxima im Bereich von 800 nm führ¬

ten zu pH-empfindlichen NIR-Optoden auf der Basis von weichgemachten

PVC-Membranen In Kombination mit dem Ionophor ETH 1001 war es

möglich, eine Ca2+-selektive Optode herzustellen, die bei pH 4 8 einen dy¬

namischen Messbereich von 10 'bis 10s

mol L' Ca2+ zeigte

Reduzierte Dicyanovinyl-Farbstoffe (ETHT 5003-5009), eine Klasse neu¬

artiger, neutraler Indikatoren, wurden isoliert und in weichgemachten

PVC-Membransystemen charakterisiert Diese Chromoionophore zeich¬

neten sich in der Optodenmembran durch eine ausserordentlich hohe

chemische Stabilität gegenüber stark sauren oder stark alkalischen Medien

sowie durch gute Loslichkeit aus Im deprotonierten, anionischen Zustand

wurden breite Absorptionsbanden (emax 7000-12000 L mol' cm"1) beob¬

achtet, deren Maxima in Abhängigkeit von Substituenten zwischen 600

und 760 nm lagen und die bis in den NIR-Bereich reichten Chemische

Modifikationen zur Erhöhung der Aciditat der Indikatoren wurden vorge¬

nommen Die pKa-Werte in der Membranphase lagen alle oberhalb von

7 0 und waren teilweise hoher als 14 0, was eine genaue Bestimmung ver-

unmoghchte Eine Ca2+-selektive Optode, die bei pH 2 7 einen dynami¬

schen Messbereich von 10"' bis 10"6 mol L"1 Ca2+ zeigte, wurde realisiert

15

2. Summary

The hrst part ol the present work describes the conditions met

when using chemical sensors to determine electrolytes in blood samples

The results trom direct measurements in the undduted specimen were

compared to the results from indirect measurements in diluted samples

Electrolytes were analyzed in blood plasma samples from 82 volunteers

The volunteers included "healthy" individuals as well as hospitahzed

patients who were either from the intensive care unit or undergoing

haemodialysis The aim of the study was to investigate the influence of

vanations in the mass concentration of water, lonic strength, single-ion

activity coefficients and degree of complexation on the Interpretation of

raw data These parameters may explain the differences between the re¬

sults obtained from indirect and direct measurements The IFCC (Inter¬

national Federation of Chnical Chemistry) recommends an algonthm in

order to transform the results from direct ISE (ton-selective electrodes)

methods into total substance concentrations, corresponding to results from

indirect ISE methods Errors resulting from the application of the algo¬

nthm were examined and discussed It was found that, when this algo¬

nthm was applied to the results of direct ISE-analysis, deviations from the

"true" values of more than 0 5% occurred in 17% of the samples in which

Na+- and K+-ions were determined and in 37% of those tested for Ca2+-

and Mg,+-ions These errors were mainly due to individual differences in

the mass concentration of water, which are not taken into consideration in

the IFCC-algonthm It was concluded that the transformation procedure

based on this algonthm is not only dangerous with regard to possible mis-

mterpretations, but may also lead to the loss of important Information in¬

cluded in the "raw" sensor Signal Additional Information could be gained

by companng direct and indirect electrolyte measurements, which

allowed to estimate the mass concentration of water not directly accessible

by other methods This method worked best with sodium 10ns

16 SUMMARY

The aim of the second part of this work was to develop pH

indicators suitable lor use as chromoionophores in monolithically

integrated optical sensing Systems In order to be able to use the high

efticiency of the measunng plattorm and low-cost diode lasers as light

sources, the indicators had to be optically sensitive in the near-intrared

(NIR) spectral ränge In a tirst step, known polymethine dyes were

studied With cyanine and streptocyanine dyes, there were problems com

bintng cationic chromoionophores with neutral hpophilic lonophores in

apolar membrane media pH sensitive NIR-optodes, based on the polar

lon-exchanger polymer Nafion where therelore developed The

application of electncally neutral or zwittenonic merocyamnes allowed

pH sensitive NIR-optodes to be produced in plasticized poly(vinyl

chlonde) membranes (PVC) In combination with the Ca"+-selective

lonophore ETH 1001, a Ca+ selective NIR-optode with a dynamic

measunng ränge from 10'to 10

^

mol L' Ca,+ at pH 4 8 was developed

Reduced dicyanovinyl dyes (ETHT 5003 5009), a new cluss of neutral

indicators were isolated and analyzed in plasticized PVC membranes

These chromoionophores were extremely stable in both strongly acidic

and strongly basic media as well as easily soluble In the deprotonated,

anionic State, broad absorption bands (emax 7000 12000 L mol'cm ') with

maxima in the ränge between 600 and 760 nm and reaching into the NIR

spectral ränge were observed The spectral properties were dependent on

the side-chain residues The indicators were chemically modified to in

crease their acidity The pKa values in the membrane phase were higher

than 7 0 in all cases and higher then 14 0 for some dyes, making it lm-

possible to determine an exact value A Ca'+-selective NIR-optode with a

dynamic measunng ränge between 10'and 10

6mol L

' Ca,+ at pH 2 7

was developed

17

3. Einführung

Ein Sensor ist ein abgegrenztes, miniaturisiertes Messsystem, das

eine physikalische oder chemische Eigenschaft des zu vermessenden

Mediums kontinuierlich in elektrische oder andere von einem Datenver¬

arbeitungssystem auswertbare Informationen, z B Lichtsignale, umwan¬

delt [1 2] Ein chemischer Sensor im speziellen ist ein Analyseinstrument,

das in der Lage ist, Informationen über die chemischen Eigenschaften des

den Sensor umgebenden Mediums zu liefern Die chemischen Parameter

werden dabei in einer Probe selektiv, reversibel und kontinuierlich

erfasst Reversibilität äussert sich in diesem Fall dann, dass Konzentra¬

tionsanderungen des Analyten nach oben und nach unten gemessen werden

können und dass die Fähigkeit zur Signalerfassung nicht verloren geht

Unter diese Definition fallen auch die Biosensoren, die sich dadurch

abgrenzen, dass die Signalerkennung durch Enzyme oder Rezeptoren

erfolgt Im Idealfall erfordert der Einsatz eines chemischen Sensors keine

Probenvorbereitung und das erhaltene Messresultat hangt einzig von der

zu bestimmenden Grosse ab Diese Tatsache macht den chemischen Sensor

zum geeigneten Instrument für eine grosse Vielfalt von Anwendungen

Vereinzelt werden auch analytische Werkzeuge, die einen chemischen

Parameter zwar selektiv, aber irreversibel und daher nicht kontinuierlich

erfassen können, den chemischen Sensoren zugerechnet In diese Klasse

fallen zum Beispiel die meist irreversibel arbeitenden "Immunosensoren",

die eigentlich keine echten Sensoren sind, da die Regenerierung der Anti-

korper in der Regel nur durch Waschvorgange erreicht werden kann

Streng genommen sind diese vielmehr als sogenannte "Probes" zu be¬

zeichnen Auch Teststreifen zum Einweggebrauch oder Testrohrchen

werden oft unberechtigterweise zu den chemischen Sensoren gezahlt

Nicht immer ist es möglich, eine klare Grenze zwischen chemischen und

physikalischen Sensoren zu ziehen Grundsätzlich kann der chemische

18 EINFUHRUNG

Sensor auch als Erweiterung eines physikalischen Sensors betrachtet

werden Schliesslich muss ein chemisches Signal in ein elektronisch mess¬

bares Signal umgewandelt werden, um eine chemische Grosse quantitativ

erfassen zu können Die Messung des generierten elektronischen Signals

erfolgt dann in der Regel mittels eines physikalischen Sensors Dieser, als

Signaltransduktion bezeichnete Vorgang, kann auf vielfaltige Art und

Weise erfolgen Die am häufigsten angewandten Methoden sind die

elektrische, die optische und die mechanische Transduktion über

Beobachtung von Massenanderungen Bei der optischen Transduktion

wird das chemische Signal in einem ersten Schritt in ein optisches Signal

umgewandelt Je nach Auslegung des Signalwandlers wird dann das

optische Signal in einem zweiten Schritt als Absorption, Emission,

optische Dispersion oder Reflexion gemessen, um nur einige Beispiele zu

nennen

Die Einfachheit der Handhabung chemischer Sensorsysteme, die relativ

geringe Grosse und die Unabhängigkeit von Reagenzien ermöglichen eine

rasche, mobile Analyse direkt vor Ort [3] Fernüberwachung gestattet den

Einsatz in gefährdeten Bereichen oder eine kontinuierliche Überwachung

auch über grossere Distanzen Auch in Fallen, in denen eine sehr rasche

Entscheidung notwendig sein kann, wie zum Beispiel in der klinisch-medi-

zinischen Analytik, kommen häufig chemische Sensoren zum Einsatz Die

klinische Chemie ist einer der Bereiche, in dem die chemische Sensor¬

technik schon am tiefsten verwurzelt ist und am häufigsten eingesetzt wird

[4] Sei es, dass chemische Sensorelemente als Bestandteile automatisierter

Laborsysteme dienen (Messung von Blutelektrolyten) oder dass sie für die

direkte Überwachung von Notfallpatienten auf der Intensivstation von

Krankenhausern verwendet werden (Elektrolyte, pO,, pC02, pH)

Der Einsatz chemischer Sensoren in der Mess- und Regeltechnik nimmt an

Bedeutung zu [5, 6] Die Prozesskontrolle und -Steuerung durch die

Kopplung eines Sensors an Dosierpumpen, Forderanlagen und Heizvor¬

richtungen in der industriellen Produktion ist zum Forschungsgegenstand

EINFUHRUNG 19

auf dem Gebiet der Sensonk geworden [7] Chemische Sensoren können

auch als Bestandteile von Warngeraten zum Einsatz kommen In diesem

Fall steht nicht eine genaue Erfassung einer Analytkonzentration im

Vordergrund sondern die Überwachung eines Grenzwertes Wird dieser

überschritten, so muss ein Alarm ausgelost werden In die gleiche

Richtung geht auch die Verwendung von chemischen Sensoren für ein

vorgangiges Screening bei sehr hoher Anzahl anfallender Proben in einem

analytischen Laboratorium In diesem Fall werden nur diejenigen Proben

der detaillierten Laboranalyse zugeführt, deren Konzentration zuvor bei

einer Messung mit einem Sensor einen kritischen Schwellenwert

überschritten hat Dadurch wird ein grosser Anteil von garantiert

negativen (true negative) Proben aussortiert Dies kann zu einer

erheblichen Arbeitsentlastung eines Labors fuhren und dadurch

garantieren, dass wirklich problematische Proben rascher erkannt werden

und deshalb notwendige Gegenmassnahmen früher getroffen werden

können

Für die Evaluation der Qualltat eines chemischen Sensors sind gewisse

Kenngrossen entscheidend Als wichtigste sind hier die Selektivität, die

Sensitivitat, die Ansprechgeschwindigkeit und die Lebensdauer zu nennen

Auf jeden Fall muss ein Sensor immer auf die bevorstehende Applikation

hin ausgewählt und nötigenfalls angepasst werden Wahrend in gewissen

Fallen beispielsweise eine hohe Lebensdauer wichtiger als eine hohe An

Sprechgeschwindigkeit ist, kann es sich für eine andere Anwendung

gerade umgekehrt verhalten Den Allzweck-Sensor für jede beliebige

Anwendung wird es nicht geben, denn dies wäre kein optimierter Sensor

Obwohl auf dem Gebiet der chemischen Sensoren schon seit Jahrzehnten

intensiv gearbeitet wird, bleibt dieser Themenkreis für die wissen¬

schaftliche Forschung von grossem Interesse Die Forschung auf dem

Gebiet der chemischen Sensoren lasst sich heute vereinfacht in zwei

Sektoren einteilen Zum einen sind immer noch grosse Anstrengungen

20 EINFUHRUNG

notwendig und auch im Gange, um neue, selektive Erkennungskompo¬

nenten für weitere Analyte zu entwickeln Zum anderen wird versucht,

den im Laborsystem unter genau definierten Bedingungen bereits funktio¬

nierenden Sensor durch Anpassung an neue Messtechniken und an reale

Gegebenheiten zur Marktreife zu bringen Dass kommerzialisierte che¬

mische Sensorsysteme auf dem Markt durchaus gute Chancen haben, kann

aus den Zahlen in den Tabellen 3 la und 3 lb entnommen werden, die auf

Daten aus dem Jahr 1994 beruhen Über einen Zeitraum von 10 Jahren

wird für die chemischen Sensoren ohne Einbezug der Biosensoren weit

weit eine Marktsteigerung um einen Faktor 2 bis 3 prognostiziert Für die

Biosensoren wird sogar eine Zunahme um einen Faktor 3 bis 4 voraus

gesagt

Tabelle 3 1 (a) Gegenwartiger und projektierter Weltmarkt für che¬

mische Sensoren (ohne Biosensoren) und (b) für Biosensoren (in Milli¬

onen US-Dollar) [8]

3 la

Marktsegment 1994 1999a 2004" Zuwachsb(%)

Biomedizin 200 310 520 8-12

Umwelt-/Arbeitsplatzuberwachung 250 420 760 10-14

Industrieproduktion 50 70 100 6-8

Total 500 800 1380 9-11

EINFUHRUNG 21

3 lb

Marktsegment 1994 1999J 2004a Zuwachsb(%)

Medi/in / Klinik 220 440 950 14 16

Industrieproduktion 75 120 250 10 12

Militär / Verteidigung 65 95 150 7-9

Umweltuberwachung 25 40 75 10-12

Landwirtschaft / Vetennarwesen 10 15 35 10-15

Andere 5 10 20 9-12

Total 400 720 1480 10-15

a

Projektiert im Jahr 1994 in US$, beinhaltet sowohl Verkauf, wie auch

Vertrage in Forschung und Entwicklungb

Durchschnittliche, jährliche Wachstumsrate

Leider muss man aber feststellen, dass der Forschungssektor, der steh mit

der messtechnischen Weiterentwicklung chemischer Sensoren befasst oft

unterschätzt und dadurch vernachlässigt wird Anders hesse sich die doch

recht beachtliche Diskrepanz zwischen der grossen Anzahl Veröffent¬

lichungen auf dem Gebiet der Liganden- und Sensorentwicklung und der

kleinen Anzahl der auf den Markt gebrachten chemischen Sensoren nicht

erklaren Gerade bei den optischen Sensoren gibt es bis heute nur sehr

wenige Gerate, die bereits im Handel erhaltlich sind, obwohl standig neue

Publikationen zu diesem Thema abgedruckt werden Um den optischen

Sensoren zu einem Durchbruch zu verhelfen, sollte vermehrt die Nutzung

der modernen, physikalischen, optischen Messtechnik in die Sensor¬

entwicklung einbezogen werden Dazu ist interdisziplinäre Zusammen¬

arbeit notwendig Nur so lasst sich verhindern, dass die Entwicklung der

optischen Sensoren immer hinter der neuesten Technologie zurückbleibt

22 EINFUHRUNG

Diese Dissertationsarbeit wurde zu einem grossen Teil im Rahmen des

nationalen Forschungsprogramms "OPTIQUE" (Projekt Nr 512)

durchgeführt [9] Einerseits ging es darum, schon vorhandene Prinzipien

auf dem Gebiet der chemischen Sensoren für die Anwendung in klinischen

Blutproben zu untersuchen und im zweiten Ted dann schliesslich an die

neuesten Entwicklungen im Bereich der optischen Messtechnik anzu-

passen, um dadurch einen Beitrag zu einer möglichen Kommer¬

zialisierung zu liefern Diese Arbeit ist also eher dem zweiten der oben

genannten Forschungsschwerpunkte zuzuordnen

23

4. Chemische Sensoren in der medizinischen Analytik

Der klinisch-medizinische Bereich gehört zu den ersten Anwen¬

dungsgebieten der chemischen Sensonk Bereits im Jahre 1970 wurden

lonenselektive Elektroden für die Elektrolytbestimmung in physiolo¬

gischen Proben eingesetzt [10] Heute sind sie aus den Labors nicht mehr

wegzudenken Immunologische und enzymatische Testverfahren, obwohl

keine Sensoren im engeren Sinne, sind sehr stark verbreitet und kommen

zur Hauptsache bei der Bestimmung biologischer Substrate zum Einsatz

Im Bereich der optischen Sensoren allerdings, sind bis heute nur in Aus¬

nahmefallen kommerziell erhältliche Gerate im klinischen Labor im Ein¬

satz Dies erstaunt um so mehr, als Farbreaktionen, oft gekoppelt mit en-

zymatischer Umsetzung eines Analyten, zu den meistverwendeten Bestim¬

mungsmethoden für klinische Analyte gehören und dadurch die optische

Spektroskopie eine bekannte Methode in der klinischen Chemie darstellt

Eine Erklärung mag mitunter der allgemeine Ruckstand der optischen

Sensoren gegenüber den elektrochemischen Sensoren im Hinblick auf die

Kommerzialisierung sein

Besonders in grossen Spitalern werden heute sehr hohe Anforderungen an

die medizinische Analytik gestellt Dies kann man beispielsweise aus

Zahlen entnehmen, welche im Jahresbericht 1996 des Umversitatsspital

Zürich veröffentlicht wurden [11] Die grosse Zahl der Laborauftrage

verlangt weitgehend automatisierte und sehr rasche Methoden In Tabelle

4 1 wird eine Übersicht über die zehn häufigsten, im Jahre 1996 im

Umversitatsspital Zürich geleisteten Analysen gegeben

Chemische Sensoren sind in der Regel nicht dazu gedacht und geeignet,

das klinische Grosslabor mit automatisierten Analysesystemen zu

ersetzten, jedoch aber sinnvoll zu erganzen Zum Teil sind chemische

Sensoren auch als Bestandteile von Laborautomaten im Einsatz Die in

24 CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK

Tabelle 4 1 genannten Beispiele von Referenzen zeigen auf, dass für die

Hälfte der am häufigsten verlangten Analyseparameter chemische

Sensoren bereits heute zur Verfugung stehen und eingesetzt werden oder

in der Entwicklung schon fortgeschritten sind Gerade für Notfall-

stationen, periphere Spitalabteilungen oder Arztpraxen konnte also der

rasch zur Verfugung stehende und einfach handhabbare Sensor eine wün¬

schenswerte Alternative zum klinischen Zentrallabor darstellen Auch im

Hinblick auf die kontinuierliche Zustandsuberwachung von Patienten in

kritischen Situationen [12] bis hin zur m-vivo Überwachung eines Ana-

lyten bietet der Sensor Möglichkeiten, welche die Laboranalytik nicht aul¬

weist Dies mögen bestimmt mit Grunde sein, weshalb in Tabelle 3 1 der

medizinische Bereich stets an erster Stelle bei den projektierten Umsätzen

auf dem Weltmarkt steht

Der Einsatz von chemischen Sensoren im medizinischen Bereich bietet

sich aber nicht nur für stationäre Standorte wie Spitaler und Arztpraxen

an Die Tatsache, dass für viele der in Tabelle 4 1 aufgeführten Analyte

die notfallmassige Analyse sehr häufig angefordert wird (für Kreatinin in

39% aller Falle, für Kalium in 46%, für Harnstoff in 52%) weist darauf

hin, dass mobile Analysegerate für den Notfall- und Katastropheneinsatz

(z B in Ambulanzfahrzeugen) auf dem Markt gute Chancen haben

CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK 25

Tabelle 4 1 Die zehn am häufigsten verlangten Analyseparameter im

klinisch-chemischen Labor des Umversitatsspital Zürich [11] und die an¬

gewandte Methode

Analyt Anzahl

Analysen

(1996)

Methode Sensor"

Kreatinin 124000 Komplexbildung

Optische Detektion

[13, 14]

Kalium 120000 ISE

Flammenphotometne

[15]

C-reaktives Protein 99500 Nephelometrie

Natrium 88800 ISE

Flammenphotometne

[15, 16]

Glucose 79100 Enzymatisch

Optische Detektion

[17]

Alanin-Aminotransferase 78600 Enzymatisch

Aspartat-Aminotransferase 75800 Enzymatisch

Optische Detektion

Prothrombinzeit 65900 Optische Detektion

Alkalische Phosphatase 64500 Enzymatisch

Optische Detektion

Harnstoff 61200 Enzymatisch

Optische Detektion

[18, 19]

a

Ausgewählte Beispiele von Referenzen zu Entwicklungen oder Anwen¬

dungen von chemischen Sensoren auf dem entsprechenden Gebiet

26 CHEMISCHE SENSOREN IN DER MEDIZINISCHEN ANALYTIK

Es stellt sich die Frage, weshalb gerade chemische Sensoren basierend auf

optischer Transduktion für den medizinischen Einsatz entwickelt werden

sollen, obwohl sich die elektrochemischen Analoga schon längere Zeit

bewahrt haben [20, 21] Ein wichtiger Grund ist mit Sicherheit der grosse

technische Fortschritt und das hohe Entwicklungspotential im Bereich dei

optischen Messtechnik Dies fuhrt zu einer Auswahl an hoch¬

empfindlichen, miniaturisierbaren Messplattformen, die den Bedurfnissen

angepasst werden können Ein weiterer Vorzug der optischen Sensoren

hegt in der Vielfalt der möglichen Messtechniken [22] Je nach Aufbau des

Sensorsystems kann die Signaldetektion im Absorptions-, im Fluoreszenz¬

oder im Dispersionsmodus erfolgen (vgl Abschnitte 5 2, 7 2 und 7 8) In

der Regel stehen mehrere der genannten Möglichkeiten simultan zur

Verfugung Neben dem hohen Potential zur Miniaturisierung und zur

kostengünstigen Serienproduktion ist im klinischen Sektor aber auch die

Störanfälligkeit des gemessenen Signals von zentraler Bedeutung Wird

der Sensor im Umfeld elektrischer Gerate oder für den mobilen Einsatz

verwendet, muss für elektrochemische Sensorsysteme gegen die allgegen¬

wärtigen elektrischen Felder abgeschirmt werden, im Gegensatz zu

optischen Systemen Bei invasiven m-vivo Messungen muss zusatzlich die

Sicherheit des Patienten bedacht werden. Auch in diesem Bereich sind

optische Systeme den elektrochemischen vorzuziehen, da kein direkter

elektrischer Kontakt zwischen dem Patienten und dem Messgerat besteht

27

5. Grundlagen der Funktionsweise chemischer Sensoren

Weil in dieser Arbeit hauptsachlich auf dem Gebiet der Elektrolyt-

Analyse gearbeitet wurde, sind in den folgenden zwei Unterkapiteln die

Grundlagen zum Verständnis der Funktionsweise von lonenselektiven

Sensoren zusammengestellt Dabei werden die beiden wichtigsten Kate¬

gorien von Sensoren für die Ionenanalytik behandelt die potentiome-

tnschen Sensoren - lonenselektive Elektroden (ISE) - und die optischen

Sensoren - lonenselektive Optoden In beiden Fallen wird für detail¬

liertere Ausführungen auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen und

lediglich auf die für das Verständnis der vorliegenden Arbeit zentralen

Sachverhalte eingegangen

5.1. Ionenselektive Elektroden

Im Falle der lonenselektiven Elektroden (ISE) erfolgt die Trans¬

duktion der chemischen Erkennung über ein Potential Eine lonenselektive

Membranelektroden-Messkette besteht aus zwei galvanischen Halbzellen,

die über ein hochohmiges Voltmeter miteinander verbunden sind Die

eine Halbzelle setzt sich aus der lonenselektiven Membran, dem Innen-

ableitelektrolyten und der Innenableitung zusammen, wahrend die zweite

Halbzelle aus einer Referenzelektrode (z B einer Kalomelelektrode)

besteht Ein schematischer Aufbau ist in Abbildung 5 1 gegeben

28 GRUNDLAGEN DER FUNKTIONSWEISE CHEMISCHER SENSOREN

Referenz

Ag/AgCIInnenableitung

Innenableit-

elektrolyt

lonenselektive

Membran

Kalomel

(Hg/Hg2CI2)

KCl gesattigt

DiaphragmaBrucken-

elektrolyt

Kapillare

Abb. 5.1: Schematische Darstellung einer potentiometrischen Messzelle

Im Idealfall besteht in einer derartigen Messkette eine direkte Ab¬

hängigkeit zwischen der Aktivität des zu messenden Ions und dem

Potential. Das Potential, auch als elektromotorische Kraft (EMK) bezeich¬

net, setzt sich aus der Summe der an allen Phasengrenzen und Kontakt¬

stellen auftretenden Potentialdifferenzen E, zusammen:

Hg Hg2Cl2 KCl i Brücken- .. Pr obe¬

res.); elektrolyt;| lösung

Membran Innenableit-

elektrolytAgCl Ag

y

E2 £, Es E<

I

Referenzelektrode ISE

5 1 lonenselektive Elektroden 29

Die experimentellen Bedingungen werden derart gewählt, dass über die

Messkette kein Strom fliesst (hohe Widerstände) In diesem Fall hegt ein

elektrochemisches Gleichgewicht vor, und die gemessene EMK entspricht

der Gleichgewichtszellspannung

EMK = £,+£, + £,+ E, + EM + E4 + £, (5 1)

mit EMK Gesamtpotential [V]

£,, £„ £, Messgutunabhangige Potentiale in der Referenz

elektrode [V]

Ej Messgutabhangiges Flussigkeitspotential (liquid

junction potential) [V]

EM Messgutabhangiges Membranpotential [V]

£4, £, Messgutunabhangige Potentiale in der Innenableitung

[V]

Alle messgutunabhangigen und demzufolge für ein gegebenes System

konstanten Potentialbeitrage E, bis E, werden durch den Ausdruck £°

zusammengefasst Gleichung 5 1 reduziert sich damit zu

EMK = £° + E, + EM (5 2)

Wird vom Beitrag des Flussigkeitspotentials E, abgesehen, entspricht die

gemessene EMK dem Membranpotential EM und ist somit für das

lonenselektive Verhalten der Membran charakteristisch

Die Abhängigkeit des Messsignals von der Aktivität des Messions wird

durch die Nernstsche Gleichung beschrieben


EMK = E° +s loga, (5 3)

mit £° Standardpotential der Messkette [V]

s Nernstsche Steigung der Elektrodenfunktion [V]

a, Aktivität des Messions in der Probelosung [1]

Als weitere messgutabhangige Grosse bleibt noch das Flussigkeitspotential

£j, das im Messsignal nach Gleichung 5 3 mitenthalten ist Es stellt sich

auf Grund der verschiedenen Mobilitäten von Kationen und Anionen in

der als Bruckenelektrolyt gewählten Losung ein Die Ionen der konzen¬

trierten Elektrolytlosung in der Brücke diffundieren in die Messlosung

und verursachen dadurch ein Diffusionspotential Die Brücke hat die

Funktion, das Messgut in Kontakt mit der Referenzelektrode (Kalomel) zu

bringen Der Betrag von Es lasst sich durch Wahl eines aquitransferenten

Elektrolyten (gleiche Mobilität von Anionen und Kationen) hoher

Konzentration als Brücke minimieren Wegen der standigen Diffusion ins

Messgut muss aber die Kontamination der Probelosung beachtet werden

Aus diesem Grund hat sich für klinische Anwendungen eine 1 mol L"1

Kahumchlond-Losung als Kompromisslosung bewahrt

Eine Möglichkeit zur Berechnung des Flussigkeitspotentials bei bekannter

Probenzusammensetzung gibt die Gleichung von Henderson, die einen

linearen Verlauf der Aktivitatsprofile in der Diffusionsgrenzschicht

postuliert

5 1 lonenselektive Elektroden 31

X?, u \a - a \ Hz, u a

1 1 \ 1 1 I n-r 1 1

__J ül_ lnJJJ

r 2 l *\ F

v2

Xz h [a -aj

r

IZj "j ß

£t=-^:

iT^ln-^^ (54)

mit c, Ladung des Ions I

h, Absolute Beweglichkeit des Ions I [cm2 s'J

'

mol]

R Universelle Gaskonstante (R= 8 314 J K'mol ')

T Absolute Temperatur [K]

F Faraday-Konstante (F= 96487 C mol ')

^ Summe über alle Ionen der Probelosung und des

i

Bruckenelektrolyten

a, Aktivität des Ions I in der Probelosung

a, Aktivität des Ions I im Bruckenelektrolyten

Für die praktische Auswertung sollte die gemessene EMK um den Wert

des Flussigkeitspotentials (EMK - £,) korrigiert werden (vgl Kapitel 6 9)

oder bei der Kalibration der Elektrode mitberucksichtigt werden (vgl

Kapitel 6 7)

Auf detaillierte Ausfuhrungen wird an dieser Stelle verzichtet Es sei aber

auf wichtige Literatur zum Thema der Membranmodelle und Selek¬

tivitäten für lonenselektive Elektroden verwiesen [23-29]


5.2. Ionenselektive Optoden

Wie in Kapitel 3 erwähnt, erfolgt im Falle der optischen Sensoren

eine Transduktion des chemischen Signals in eine optisch erfassbare

Messgrosse Die wahrend dieser Arbeit untersuchten optischen Sensoren

beruhen alle auf einem aktiven Massentransport des zu untersuchenden

Analyten aus der wassngen Probelosung in eine lipophile, organische

Schicht (Membran), die aus einem weichgemachten Polymer als Matrix

besteht Bei diesem Vorgang stellt sich ein thermodynamisches Gleich¬

gewicht zwischen der Probelosung und der gesamten, homogenen Sensor¬

schicht ein Derartige Membranschichten werden als Bulkoptoden be¬

zeichnet und stehen im Gegensatz zu oberflächenaktiven Systemen Das

Ausmass des Massentransportes wird durch die in die Membran einge¬

brachten Erkennungskomponenten und Hilfsstoffe bestimmt In vielen

Fallen erfolgt die Extraktion des Analyten in die organische Phase durch

Komplexbildung mit einem Liganden L oder durch eine selektive,

reversible chemische Reaktion (in der Regel für neutrale Analyte) Eine

ausführliche Übersicht über die zugrundeliegenden Phasentransfergleich-

gewichte, über verschiedene Realisierungsmoglichkeiten derartiger

Systeme und die Herleitung der zugehörigen Gleichungen findet sich bei

Bakker et al [30, 31] An dieser Stelle werden lediglich die Grundlagen

zum Verständnis eines kationenselektiven Optodensystems diskutiert Eine

schematische Darstellung einer kationenselektiven Membran findet man in

Abbildung 5 2 Der zugesetzte Chromoionophor C, ein hpophihsierter

pH-Indikator, ist für die Transduktion des chemischen Signals in eine

optisch messbare Grosse verantwortlich Die Änderung der optischen

Eigenschaften des Membransystems kommt durch den Austausch von

Protonen H+ gegen Analytkationen I+ und der damit verbundenen Proto-

merung resp Deprotomerung des Indikators zustande Zur Aufrecht¬

erhaltung der Elektroneutrahtat ist in manchen Fallen der Zusatz von

membranloshchen, hpophden ionischen Komponenten R+ oder R"

5 2 lonenselektive Optoden 33

notwendig Als anionischer Zusatz wird in der Regel ein hpophiles Borat¬

salz und als kationischer Zusatz ein hpophiles Ammoniumsalz eingesetzt

(a) (b)

hf

IL+ L

CH C

Abb 5 2 Schematische Darstellungen einer kationenselektiven Bulk-

optode (a) mit neutralem Liganden L und neutralem Chromoionophor C,

(b) mit neutralem Liganden L und (m deprotoniertem) Zustand

geladenem Chromoionophor C,

I+ Analyt Kation, R hpophder,

anionischer Zusatz

Für den einfachsten Fall eines Kationenaustauschsystems ohne Zusatz eines

selektiven Liganden lasst sich das folgende Gleichgewicht zwischen der

Probelosung und der Optodenmembran formulieren

F+(aq) + v CH+(mem) -« Iv+(mem) + v C(mem) + v H+(aq) (5 5)

V bezeichnet die Ladungszahl des Kations Die Austauschkonstante lautet

für diesen Fall

K = Kexch chrom :*H. (*.)" = (5 6)


Aktivitäten beziehen sich auf Spezies in der Wasserphase Die eckigen

Klammern bezeichnen Konzentrationen in der organischen Membranphase

unter der Annahme, dass die Aktivitatskoeffizienten konstant bleiben Die

Konstante KH, bezeichnet das Austauschgleichgewicht zwischen Protonen

und Analyt-Kationen und ist durch die Verteilung der beiden Ionen

zwischen der wassngen und der organischen Phase bestimmt K^ be

zeichnet die Aciditatskonstante des Chromoionophors in der Membran¬

phase Die Beziehung 5 6 lasst sich zur experimentellen Bestimmung von

Aciditaten der Chromoionophore in der Membranphase ausnutzen [32]

Wird ein kationenselektiver Liganden L in die Optodenmembran

eingebracht, verändert sich Gleichung 5 5 zu

r+(aq)+pL(mem)+vCH+(mem) -« ILp+(mem)+vC(mem)+vH+(aq)

(5 7)

Der Index p gibt die Stochiometne des Komplexes zwischen dem Mession

Iv+ und dem Liganden L an

In Analogie zu Gleichung 5 6 formuliert man die Austauschkonstante

m _(v)"f [clVK'1êxi.h

ör+ [OT].(5 8)

[L]P

welche auch geschrieben werden kann als

tfexcPh=*H1 ßir (*.)" (5 9)

mit der Bruttostabihtatskonstante ßlL des Komplexes ILp+ in der

Membranphase Aus dem optischen Messsignal kann auf das Konzen-

trationsverhaltnis zwischen protomertem und gesamten Chromoionophor


in der Membran, den Protonierungsgrad 1-a geschlossen werden Dieser

wird mit der gewünschten Messgrosse der Analytaktivitat av+

in Ver¬

bindung gebracht (siehe Gleichung 5 14) Als zusätzliche Parameter

stehen die aus der Membranherstellung bekannten Grossen wie die Kon¬

zentration an Ligand LT und an Chromoionophor CT mit ihren Massen-

bilanzen sowie an anionischem Additiv RT mit der Elektroneutrahtatsbe-

dingung zur Verfugung

LT=[L]10lj,=[L] + p [IL;+] (5 10)

CT=[C]toldl=[C] + [CH + ] (5 11)

Rt=[R"L=[CH+] + MILVp1 <512)

Der Protonierungsgrad 1-a lasst sich nun direkt aus dem Messsignal be¬

stimmen, wie hier am Beispiel der Extinktionsmessung gezeigt wird Das

gleiche Prinzip lasst sich aber beispielsweise auch auf die Fluoreszenz¬

emissionsmessung [33 34] oder Brechungsindexmessung [35] anwenden

,-„JSl A~A^(513,

C A — A^T -^prot "deprot

mit A Extinktion der Membranschicht bei einem beliebigen

Gleichgewichtszustand

Aprol, Adtpro, Extinktion der Membranschicht bei vollständig

protomertem bzw deprotoniertem Chromoinophor


Aus Kombination von Gleichungen 5 8 und 5 10-5 13 erhalt man für die

Aktivität des Analyten

v,(vl f-«_y —»t-o-ic,—. (514,*- ll-°J

v(LT-£{RT-(.-a)CT})'

Auf ahnliche Weise erhalt man für eine Optode mit einem negativ ge¬

ladenen Chromoionophor C (Abb 5 2b), die ohne den Zusatz eines

anionischen Additivs R auskommt, die untenstehende Beziehung

„.=ivL { ' )' —?£i (515)

1 «£i ld-«)cTJ,(LT_£aCT)'

Aus Gleichungen 5 14 und 5 15 geht klar hervor, dass eine auf Ionen-

austausch basierende Optode nicht allein auf die Metalhonenaktivitat a„t,

sondern vielmehr auf das Verhältnis der Aktivitäten des Mess- und

Referenzions (in diesem Fall der Protonen) anspricht Für den Einsatz der

Optode bedeutet das, dass die Referenzionenaktivitat, d.h der pH-Wert,

entweder simultan miterfasst oder durch Pufferung der Probelosung

konstant gehalten werden muss Es lasst sich berechnen [30], dass pH-

Anderungen von 0 01 Einheiten bei der Erfassung von zweiwertigen

Kationen das Analysenresultat bereits um 4 5 % verfalschen Steigt der

pH-Wert der Probe um 0 01 Einheiten an, sinkt die Messionenaktivitat

eines zweiwertigen Kations vermeintlich um 4 5 % Für einwertige

Kationen ist der Fehlerbeitrag halb so gross Auf die Konsequenzen dieser

Tatsache in Bezug auf klinische Messungen wird in Kapitel 6 10

eingegangen


In Gleichungen 5 14 und 5 15 wird der Einfluss von in der Probelosung

auftretenden Stononen nicht berücksichtigt In Analogie zu den poten-

tiometnschen Sensoren lasst sich ein optischer Selektivitatskoeffizient Ar,°pt

definieren An dieser Stelle soll aber nur auf die Arbeiten von Bakker und

Simon [31] sowie von Lerchi et al [36] verwiesen werden, die eine detail¬

lierte Einfuhrung liefern

38

39

6. Klinische Ionenanalytik mit chemischen Sensoren

6.1. Einfuhrung in die Problemstellung

Um die maximale Leistung eines chemischen Sensorsystems nutzen

zu können, ist es von Vorteil, den Sensor auf die zu analysierende Probe

anzupassen und zu optimieren Dazu ist die Kenntnis möglichst vieler

Rahmenbedingungen eine wichtige Voraussetzung Ferner ist die Ver¬

arbeitung des Rohsignals in eine klinisch sinnvolle und interpretierbare

Grosse notwendig, um das System für den Anwender attraktiv zu machen

Schliesslich sollte in einem vollständigen Analysensystem auch die für die

Kalibration und Datenauswertung benotigte Software integriert sein

Das Ziel im klinischen Ted der vorliegenden Arbeit war es, im Hinblick

auf die oben aufgeführten Gesichtspunkte Möglichkeiten, Bedingungen

und Grenzen für den Direkteinsatz von potentiometnschen und optischen

Sensoren in der unverdünnten Probe - in der Regel Vollblut, Plasma oder

Serum - zu untersuchen Es stellte sich unter anderem die Frage,

inwiefern die heute gangige Praxis der Verarbeitung des Rohsignals eines

Sensors Unsicherheiten [37] birgt und wie sich diese eliminieren lassen

Besonders wurde das Problem des Vergleichs von Aktivitäts- und Gesamt-

konzentrationsmessungen durch eine Datenvahdierung mit realen Proben

aus dem Spitalbetrieb genauer beleuchtet Im Zentrum stand in diesem

Zusammenhang die Massenkonzentration von Wasser Diese Grosse be¬

rücksichtigt, dass Vollblut, Plasma oder Serum nicht allein aus einem

wassngen Anteil bestehen

Gleichzeitig ging es darum abzuklären, welche Faktoren beim Einsatz

chemischer Sensoren mögliche Fehlerquellen für verfälschte Resultate

darstellen und in welcher Grossenordnung die daraus resultierenden

Fehler liegen Von Interesse waren vor allem Parameter, die aufgrund

40 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN

der angewandten Messtechnik eine direkte Auswirkung auf das Rohsignal

des chemischen Sensors ausüben Dazu zahlen das Flussigkeitspotential bei

der Verwendung von ISE und der pH-Wert beim Einsatz lonenselektiver

Austauschoptoden

Mit der zur Verfügung stehenden Infrastruktur eines grossen Routine-

spitallabors erfolgte die simultane Messung des pH-Wertes, der Protein-,

Lipid-, Harnstoff- und Glucosekonzentration sowie der Elektrolyt¬

konzentrationen in Plasmaproben Durch lonenselektive Messungen der

freien Elektrolytkonzentrationen konnten Rückschlüsse auf die Ionen-

aktivitaten gemacht werden Die gesammelten Daten wurden aufgrund

von bekannten mathematischen Modellen ausgewertet und auf die be¬

trachteten Sensorsysteme angewendet Die analysierten Proben stammten

von gesunden Testpersonen und von Spitalpatienten mit zwei ver

schiedenen Krankheitsdiagnosen (Patienten mit Nierenversagen und Herz-

Kreislaufbeschwerden) Die beiden Gruppen wurden ausgewählt, weil für

diese Patienten aus medizinischer Sicht die lonenanalytik und damit der

Einsatz chemischer Sensoren besonders relevant ist

6.2. Menschliches Blut als Probenmatrix: Fraktionierung

In menschlichem Vollblut beanspruchen die Blutzellen etwa 44

Prozent des gesamten Volumens Die übrigen 56 Prozent machen das

Blutplasma aus Dann tragt die wassnge Phase ungefähr 93 % zum

Gesamtvolumen bei Etwa 5 3 % nehmen die Proteine ein, 0 62 % Lipide

und 0 9 % Trockensubstanz wie geloste Salze und Zucker [38] In Ab¬

hängigkeit von den physikochemischen Eigenschaften eines Analyten hegt

dieser zwischen der Protein-/Lipidphase und der wassngen Phase verteilt

vor Die angewandte analytische Methode bestimmt, welche Fraktion

quantifiziert wird Da chemische Sensoren am häufigsten für Elektrolyt-

6 2 Menschliches Blut als Probenmatrix Fraktionierung 41

messungen eingesetzt werden, wird dies am Beispiel der Ionenanalytik

erläutert. Im folgenden sollen vier Fraktionen näher beleuchtet werden

[39, 40]:

1. Die totale (molare) Substanzkonzentration c*obe des Ions j und des

Individuums i im gesamten Probevolumen yProbc> ausgedrückt in

mol • Lp'r„(,,,', bestimmt durch indirekte Potentiometrie (d.h. in der

verdünnten Probe) mit ISEs oder mit herkömmlichen, photometrischen

Methoden.

2. Die (molare) Substanzkonzentration c^'' oder die Molalität matJ'fdes freien Elektrolyten in der Wasserphase F,aq, ausgedrückt in

mol • L"H'i0 (Molarität), beziehungsweise in mol • kgô (Molalität). Diese

Fraktion wird typischerweise durch direkte Potentiometrie mit ISEs in

der unverdünnten Probe erfasst. Die Voraussetzung ist, dass eine adäquate

Kalibrationsmethode zur Verfügung steht. Probleme, welche bei der

Kalibration auftreten können, weiden in Abschnitt 6.7 behandelt.

3. Die aktive Molalität2 des freien Elektrolyten in der Wasserphase

m,aj', ausgedrückt in molkgH'i0. Dies ist die physikalische Grösse,

welche von einer ionenselektiven Elektrode oder Optode direkt erfasst

wird. Die Beziehung zwischen der aktiven Molalität fh^' und der

Molalität mld'J,t wird beschrieben durch einen Proportionalitätsfaktor, den

molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten y für ein Ion j und ein

Individuum i. In Analogie dazu definiert man die aktive Konzentration

1 Um Verwechslungen vorzubeugen werden innerhalb des Kapitels 6 die physikalischen Einheiten mit

Indices versehen, welche das Bezugssystem angeben (z.B Probe Gesamte, physiologische Probe wie

Serum, Plasma oder Vollblut, H:0 wassriger Anteil des physiologischen Untersuchungsgutes oder

wassnge Losung)2Diese Grosse ist nahe verwandt mit der dimensionslosen relativen, molalen Aktivität des Elektrolyten

a,! Der Zusammenhang zwischen den beiden Grossen ist gegeben durch. aM =m,*l1l/m" (mit

m" = 1 mol kgH'())


des freien Elektrolyten in der Wasserphase C*q', ausgedruckt in

mol L^q und den molaren Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten \M

4 Die (molare) Substanzkonzentration des freien Elektrolyten t]ProbLl

im gesamten Probevolumen VProbc, ausgedruckt in mol Lp'robL Diese

Fraktion ist in der klinischen Analytik routinemassig nicht dnekt

zuganglich Ihre Bestimmung erfordert die Kenntnis der Massen¬

konzentration von Wasser p,Hl°, die den Massenanteil von Wasser im

gesamten Probevolumen in kgH^0 Lp'robe beschreibt Für Elektrolyte mit

einem sehr kleinen Anteil an komplex gebundenen Ionen, entspricht diese

Fraktion aber naherungsweise der totalen (molaren) Substanz¬

konzentration c,Probe, die mit klinischer Routineanalytik zuganglich ist

Die Diskriminierung zwischen den verschiedenen Fraktionen ist für die

klinische Dateninterpretation von hoher Wichtigkeit Sie gibt Anlass zu

Kontroversen und Fehldiagnosen (Pseudohyponatraemie scheinbar er¬

niedrigte Natriumionenkonzentration), seit Waugh 1969 seinen ersten

Artikel über die Verdrängung von Wasser durch Proteine und Lipide in

Humanserum und -plasma veröffentlichte [41] Für diagnostische Zwecke

wurde die Unterscheidung zwischen den zwei Fraktionen freie (molare)

Ionenkonzentration in der Wasserphase c,a(jf und der totalen (molaren)

Ionenkonzentration im gesamten Probevolumen c,Probe zur Routine Die

biologische Aktivität von Elektrolyten wie Natrium, Kalium, Calcium

oder Magnesium aber auch von Anionen wird am besten durch die aktive

Molalitat m^' beschrieben Dennoch konnte sich bis heute die Grosse der

aktiven Molalität in den klinischen Laboratorien wegen der Gefahr von

Verwechslungen mit anderen Grossen nicht durchsetzten

6 3 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in Plasma 43

6.3. Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser in

Plasma

Der Gehalt an Wasser in einer Plasma- oder Serumprobe wird als

Massenkonzentration von Wasser p'

bezeichnet und normalerweise in

der Einheit kgH;0 LP'rohL angegeben p'

leitet sich aus dem Produkt

der Dichte von reinem Wasser p*H"° und dem Volumenverhaltnis des

wassngen Anteils der Probe Vj"1 gegenüber dem Gesamtvolumen yProbe

ab

H,0 *H,0 v, ,s ,N

Für die klinische Analytik mit chemischen Sensoren ist diese Grosse

relevant, da mit Sensoren die aktive Molalität m^ einer Substanz in der

Wasserphase erfasst wird Die Massenkonzentration von Wasser ist

routinemassig keine direkt zugangliche Messgrosse Sie muss über Um¬

wege bestimmt werden Eine Übersicht über verschiedene Verfahren

findet man in [42] Eine klassische und sehr direkte Methode ist die

gravimetrische Bestimmung des Wasseranteils durch Verdampfung bei

100 °C wahrend mindestens 24 Stunden Wegen der langen Analysedauer

ist dieses Verfahren für die klinische Laboranwendung nicht geeignet Ein

wesentlich rascheres, aber immer noch relativ aufwendiges Verfahren ist

die gravimetrische Wasserbestimmung durch Verdampfung bei Mikro¬

wellenbestrahlung Diese Methode wurde als mögliche Referenzmethode

vorgeschlagen [43] Ein anderes Vorgehen basiert auf der Messung der

Osmolalitat über Gefrierpunktserniedrigung bei Verdünnung der Probe

mit einer definierten Menge an Wasser [42]. Experimentelle

Unsicherheiten in der Osmolalitatsmessung und beim Verdünnen der

Probe reduzieren aber die Zuverlässigkeit der Resultate


Eine gut etablierte und relativ rasche Methode ist die Abschätzung aus

experimentellen Bestimmungen von Protein- und Lipidkonzentrattonen

Zwar stellten Faye und Payne bei einer Methodenevaluation fest, dass die

Massenkonzentration von Wasser dabei systematisch leicht untei schätzt

wurde, da nach der Zugabe einer bekannten Wassermenge nur eine

Wiederfindungsrate von 99 01 % ermittelt wurde [42] Auf der anderen

Seite wies diese Methode mit nur 0 2 % die geringste analytische Un

Sicherheit innerhalb einer Messserie auf Da es für die vorliegende Arbeit

wichtig war, klinische Variationen der Massenkonzentration von Wasser

aufzuzeigen, wurde diese Methode wegen der hohen analytischen

Präzision ausgewählt Das Verfahren basiert auf dem Effekt, dass

Proteine und Lipide einen Teil des Plasmavolumens einnehmen und somit

Wasser verdrangen Über die bekannte Dichte von Proteinen und Lipiden

lasst sich das verdrängte Volumen abschätzen und somit auf die

Massenkonzentration von Wasser zuruckschhessen Neben Proteinen und

Lipiden finden sich in Plasma noch weitere Komponenten (Salze,

organische Substanzen), die in dieser Approximation lediglich mit einem

konstanten Term berücksichtigt werden

P,H°[kgH0 lpLJ = ph,°( -.Protein Lipid ^

0 991--* Protein Lipid

(6 2)

mit

p*' [kg L_l 1 Dichte von Wasser

p*Prolcin,p L,pkl[kg L"1] Mittlere Dichte der Plasma-Proteinfraktion

resp Lipidfraktion

p,Prolun, p,L'p,d[kg Lp'robel Gemessene Massenkonzentration von Proteinen

resp Lipiden

Der konstante Term, 0 991 LHi0 Lp'robe , repräsentiert die Menge an

Wasser in IL Probe, reduziert um das Volumen von Trockensubstanzen

6 4 Abschätzung dei Em/elionen-Akttvitatskoettizienten in Plasma 45

6.4. Abschätzung der Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten in

Plasma

Der physikalisch-chemische Zusammenhang zwischen einer Kon-

zentrationsgrosse und einer Aktivitatsgrosse, ist durch den Aktivitats-

koettizienten yu beziehungsweise \,gegeben Gleichungen 6 3 und 6 4

zeigen diese Beziehung auf

><]<=Yn m/V (6 3)

Diese Koeffizienten lassen sich experimentell, beispielsweise über eine

Messung der Dampfdruckermerdrigung, ermitteln Im Falle von

Elektrolyten aber sind die Einzehonen Aktivitatskoeffizienten y+l tund v+l

für Kationen, respektive y, xund v, x

für Anionen, experimentell nicht

direkt zuganglich [44] Mittels verschiedener Naherungsverfahren, die auf

thermodynamischen Gesetzen beruhen, lassen sich aber die mittleren

Aktivitatskoeffizienten y± und k auf der Basis von experimentell

gemessenen Parametern abschätzen Für die anschliessende Aufspaltung in

die Einzelionen-Aktivitatskoeffizienten sind aber nicht-thermodynamische

Annahmen notig Für Losungen eines einzelnen Elektrolyten existieien

verschiedene, einfache Konventionen Einige davon sind durch Morf [24]

zusammengefasst worden Die Behandlung von Losungen mit mehreren

Elektrolyten ist komplexer als diejenige für reine Elektrolyte Oft wird

angenommen, dass die Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in gemischten

Elektrolytlosungen die gleichen Werte annehmen wie in reinen Elektro¬

lytlosungen der gleichen Ionenstarke wie die Mischlosung [45] Dabei

werden also Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Ionen gleicher

Ladung vernachlässigt Um möglichst zuverlässige Abschatzungen für die

Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Blut, Plasma oder Serum zu

46 KLINISCHE IONENANALY TIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN

erhalten, verwendet man mit Vorteil eine Methode, welche die

Besonderheiten von gemischten Elektrolytlosungen berücksichtigt

6 4 1 Das erweiterte Debye Huckel-Modell

Die von Debye und Huckel abgeleitete Näherung für die Ab¬

schätzung von mittleren Aktivitatskoeffizienten basiert hauptsachlich auf

interionischen Wechselwirkungen unter der Annahme punktförmiger La¬

dungen Das Modell wurde erweitert, um die individuelle Ionengrosse zu

berücksichtigen und schliesslich mit einem empirischen Term, der

abhangig von der Ionenstarke ist, ergänzt [46, 47]

I a Jimolli

logy±=r + ~-'

'V +C/m°'jl (6 5)l + BmaV7"

_|77U Jjmolir

log v+ =

' + 'V - + C/molar (6 6)

l + B,aV/molar

mit

z+, z Ladung des Kations bzw Anions

Am, At / Losungsmittelspezifische Parameter (für Wasser bei 37 °C

Bm, Bu gilt Am= 0 5193 kg"2mol"2 und At = 0 5211 L^mol""1

resp Bm = 0 3301 10 '"m1 kg"2 mol"2

und Bt = 0 331210'"

m"2morl/2)

/ Ionenstarke auf molaler [mol kg"1] bzw molarer [molL-1]

Basis (siehe Gleichung 6 7a / b)

a Ionengrossenparameter [10"'° m] (siehe [48])

C Elektrolytspezifischer Parameter (siehe [48])

6 4 Abschätzung der Etnzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 47

Die Ionenstarke / für ein Ion j wird berechnet nach Gleichung 6 7

rmolar' V^ Probt 1 2 /(- -, \

/ =- 2,ci :i (67a)

zi

I i cProbU z27 =; 1»V ?j =r 1—-hTö— (67b>

zj

zj P

Aus den mittleren Aktivitatskoeffizienten erhalt man die Einzehonen-

Aktivitatskoeffizienten nach der Debye-Huckel-Konvention wie in

Gleichung 6 8 dargestellt (im weiteren Verlauf werden nur noch die

molalen Koeffizienten y betrachtet)

logy+ =|z+/z_|logy+(6 8)

logy_ =|?_/?+|logy±

Das Debye-Huckel-Modell ist wegen seiner Einfachheit das am häufigsten

angewandte Verfahren zur Ermittlung von Einzehonen-Aktivitats-

koeffizienten Aus diesem Grund ist es auch schon in Form von Software

Prozeduren in kommerzielle Blutelektrolytanalysatoren integriert In der

Literatur gibt es jedoch keine Hinweise auf die Frage, wieweit das

vereinfachte Debye-Huckel-Modell auf gemischte Elektrolytlosungen

anwendbar ist Die nach Debye-Huckel berechneten Koeffizienten für

Vollblut, Plasma oder Serum entsprechen demzufolge den Koeffizienten,

die durch unabhängige Behandlung der einzelnen Elektrolyte nach

Gleichungen 6 5 und 6 8 erhalten werden


6 4 2 Stokes-Robinson-Hydratationstheone

Stokes und Robinson ergänzten die Debye-Huckel-Theone durch

einen zusätzlichen Term, der die Hydratation miteinbezieht [49 50] Durch

H>dratation wird ein Teil des Wassers in der Hydratationssphare der

Ionen gebunden und steht somit nicht mehr als frei bewegliches

Losungsmittel zur Verfugung, was sich auf die Einzehonen-Aktivitats-

koeffizienten auswirkt Unter Berücksichtigung einer Konvention tur die

Abschätzung von Einzehonen-Akttvitatskoeffizienten nach Bates, Staples

und Robinson [51], erhalt man eine Gleichung, die für gemischte

Elektrolytlosungen anwendbar ist [52]

-ln(10)ÂmV7mol il

lny+ =

+ "

=— + h+mM,l + BmaV/moi"

f

-In -oois]^-i)m;41

(6 9a)

-ln(\0)z2Am4r*J, _

lny =.

+ h__rfiMhl + BmaV/molal

f $6 9b)

In 1-0 018^^ -$n aq I

mit

h+,h Hydratationszahl (Anzahl Mole Wassermolekule, die durch

Hydratation an ein Mol Kationen resp Anionen gebunden

sind, zB /if= 3 5)

Na

m Osmolahtat [molkg']

MHi0 Relative Molmasse von Wasser (0 018 kg mol ')

6 4 Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 49

In dieser Approximationsmethode wird über alle in der Losung

vorhandenen Ionen j summiert Durch Einbezug der Osmolalitat werden

Einflüsse elektrisch neutraler osmotisch aktiver Komponenten (z B

Glucose Harnstoff) mitbeiucksichttgt

6 4 3 Das Pitzer Modell

Pitzer entwickelte ein Approximationsmodell für gemischte

Elektrolytlosungen, das nicht nur Wechselwirkungen zwischen

verschiedenen Kationen und Anionen miteinbezieht, sondern auch die

gegenseitige Beeinflussung von Ionen gleicher Ladung untereinander mit-

beruckstchtigt [53] Dennoch ist das Verfahren relativ leicht anzuwenden

und lasst sich auf Computerprogramme implementieren Ein Nachteil

dieser sehr zuverlässigen und thermodynamisch fundierten

Approximation hegt dann, dass nicht alle Parameter für physiologisch

relevante Ionen bekannt sind Da diese Methode zuerst im Bereich der

Geologie Anwendung fand, gibt es vor allem bei den organischen Anionen

wie beispielsweise dem Acetat Ion Lucken in den tabelherten Parameter-

satzen


Für ein Salz MX in verdünnter wassriger Lösung gilt (c: cation; a: anum)

[53]:

ln/M =2MfY +25>a[BMa + (X m?)C Ma ] + 2X '«t 6Mta l

+II»V"a[>7MB;j+7MCu+4'Mu]

-^XI'^vK.a']^-

.1 .1'

l"7x =?xfY +2S/»t[Bxc +(I'^)CXL] + 2lmJ0>l a

+XX»W^b:+?xCj, +vpx.1l]

^c (.'

wobei

X«? = XWc?c =XWaka|

und

/ j molal ^>.

,.

V/, ^hil + bVr^,+ bV/molal b V /

R -

Rl0),

2P|y|XDMX -PMX

+

.2 , molal

aV1(l + ccVr^je

-aV/

C-MX ~

BMX -

^\?MZx|

(2ß(;x)

a2(/molal)

1-l + |l + aV7iZ + -a2/molal |e

-aV/m

(6.10a)

(6.10b)

(6.11)

(6.12)

(6.13)

(6.14)

6 4 Abschätzung der Einzelionen Aktivitatskoeffizienten in Plasma 51

mit

A0 Debye-Huckel-Parameter (für Wasser bei 37 °C

ist A^ 0 3995 kg"' mol "2)

b, a Justierbare, universelle Parameter (b = 1 2

kg"2 mol "\ a = 2 0 kg"2 mol ,n)

ß\ix> ßvix' ^mx Spezifische Parameter für das Salz MX, die

Wechselwirkungen über kurze Distanzen

repräsentieren Angepasst an eine Temperatur

von 37 °C nach [53]

0^, 0Xl und Mischparameter für Kation-Kation resp Anion-

4/Mtl,vr'Mla, Anion Wechselwirkungen (nicht temperatur-

•Px.-V korrigiert) [53]

Es ist zu beachten, dass die Mischparameter 0 und ¥ nur einen sehr

kleinen Beitrag leisten und deshalb oft vernachlässigt werden dürfen Den

grossten Beitrag zur Mischung liefern die Parameter ß<0), ß"' und C, die

von reinen Elektrolyten stammen


6 4 4 Vergleich von Aktivitatskoeffizienten im physiologischen Bereich

Im Bezug auf die Praxis ist es bei der Kalibiation von chemischen

Sensoren für physiologische Anwendungen wichtig, die molalen Einzel-

lonen-Aktivitatskoeftiztenten zuverlässig abschätzen zu können, solange

mit Kalibratoren, die auf wassrigen Losungen basieren, gearbeitet wird

(vgl Kapitel 6 7) Aus diesem Grund sollte dasjenige Verfahren eingesetzt

werden, welches die zuverlässigsten Resultate garantiert Wie aus Ab¬

bildung 6 1 hervorgeht, lassen sich im physiologischen Konzentrations¬

bereich keine grundlegenden Unterschiede im Verlauf der Einzehonen-

Aktivitatskoettizienten, berechnet nach der Debye-Huckel-Methode, dem

Pitzer-Formahsmus und der Stokes-Robinson-Hydratationstheone, für die

betrachteten Kationen feststellen Die Absolutwerte der Koeffizienten

weichen jedoch voneinander ab

Für die einwettigen Kationen wie Na+ und K+ werden mit der einfachen

Debye-Huckel-Approximation last identische Werte wie mit der auf¬

wendigeren Pitzer-Approximation erhalten Vernachlässigt man hingegen

für zweiwertige Kationen wie Ca2+ und Mg2+ Mischterme, wie dies bei der

Methode nach Debye und Huckel zutrifft, findet man grossere Ab¬

weichungen von den nach Pitzer erhaltenen Werten Im Rahmen dieser

Arbeit wurde demzufolge tur alle Abschatzungen im Zusammenhang mit

klinischen Messungen der rechnerisch aufwendigere Pitzer-Formalismus

angewendet Chlorid wurde in sämtlichen Fallen als Gegenanion

angenommen, da es den höchsten Anteil der Anionen im Plasma ausmacht

Das Bicarbonat-Anion konnte aus experimentellen Gründen nicht

bestimmt und daher nicht berücksichtigt werden

6 4 Abschätzung der Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten in Plasma 53

0.77

0.76 H

J 0.75

0.74

0.73

<

<

140 145 150 155 1601 165 170

mNaW(mmolkg 0 )

0.35 -i++

0.34-

0.32-

0.31 H

++

++++

Ä50.33-°°O^

++++++

°°°°°-o^

+++++

°Oo<o°o0oo

°Oo

140 145 150 155 1601 165 170

mNa+/ (mmol kgHa0 )

Abb. 6.1: Molale Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten für Na+ (a) und Ca:+

(b) in Abhängigkeit der Na+-Molalitäten in einer wassrigen Lösung mit

physiologischem Hintergrund, abgeschätzt nach den Gleichungen von

Debye-Hückel (Gl. 6.5 / 6.8) (O), Stokes-Robinson (Gl. 6.9a) () und

Pitzer (Gl. 6.10a) (+). (Bedingungen: T=37 °C; wR+= 4.7 mmol • kg~'i0,

mCa

!+= 1.2 mmolkgH)0, »i ,+= 0.6

MgmmolkgHi0; Chlorid als

Gegenion in allen Fällen).


6.5. Aktivitäten versus Konzentrationen

Mit dem Einzug der chemischen Sensoren - bis heute in erster Linie

der lonenselektiven Elektroden - in die klinischen Laboratorien wurde die

Erfassung einer neuen physikalisch-chemischen Grosse, dei aktiven

Molalität des Analyten, ermöglicht (vgl Kapitel 6 2) Gleichzeitig stellte

dieser Schritt die Routineanwender aber vor eine Reihe von neuen Fragen

und Problemen Besonders wichtig ist die Beziehung zwischen der aktiven

Molalitat m*q' eines Analyten und der totalen (molaren) Substanz¬

konzentration cPj0be, die mit den herkömmlichen Methoden erhalten wird

Auch ist eine korrekte Kalibration des chemischen Sensors nicht immer

einfach Es ist also nicht erstaunlich, dass sich eine ganze Reihe von

Publikationen mit diesen Themenkreisen befasst [54 57] Aus historischen

Gründen betreffen die meisten Veröffentlichungen die Bestimmung von

Natrium- und Kahumionen mit ISE in Plasma oder Serumproben Die

Mehrzahl der genannten Arbeiten befasst sich mit der Kontroverse

zwischen Aktivitäts- und Konzentrationsmessung und den daraus

resultierenden Folgen für den Vergleich zwischen Messresultaten von ver¬

schiedenen Geraten Es soll darauf hingewiesen werden, dass hier in

erster Linie der analytisch-technische Aspekt dieser Kontroverse be¬

trachtet wird und nicht der klinisch-medizinische

In den meisten Spitalern stehen heute vollautomatische Analysatoren mit

einem sehr hohen Probendurchsatz für die Messung der wichtigsten

klinischen Analyte in Blut, Serum oder Plasma im Einsatz Für die

Bestimmung der Konzentration an Elektrolyten wird in diesen Geraten

meist das Verfahren der indirekten Potentiometrie mit lonenselektiven

Elektroden eingesetzt In diesem Fall wird die Probe stark verdünnt, was

eine drastische Verschiebung der Komplexierungsgleichgewichte zur

Folge hat Aus diesem Grund wird mit der indirekten Potentiometrie

immer die Gesamtkonzentration c*rs°he an Ionen erfasst Gleichzeitig

6 5 Aktivitäten versus Konzentrationen 55

befinden sich aber vor allem an peripheren Standorten und

Notfallstationen auch Gerate im Einsatz, welche mit ISE die aktive

Molalität m ,'j' der freien Elektrolyte im wassrigen Anteil der

unverdünnten Probe messen Auch im Falle des Einsatzes von optischen

Sensoren in unverdünnten Proben werden die aktiven Molahtaten der

Elektrolyte gemessen In den meisten Fallen wird aber das Resultat der

Analyse in derselben Einheit von mmol LP'robLangegeben Die von

verschiedenen Geraten erhaltenen Messwerte können somit beachtliche

Differenzen autzeigen Um dieses Problem zu losen, hat eine Experten¬

kommission der "International Federation of Clinical Chemistry" (IFCC)

empfohlen, eine Methode zur Standardisierung von ISE Methoden durch

Verwendung von frischen Humanseren auszuarbeiten [58] Darauf

veröffentlichte eine Arbeitsgruppe der IFCC, welche sich mit lonen¬

selektiven Elektroden befasst, einen Entwurf mit dem Titel

"Recommendations for Nomenclature, Definitions, and Conventions

Relativ to the Use of lon-Selective Electrodes for Blood-Electrolyte

Analysis" [59] Dieses Dokument befasst sich mit der Bestimmung von

Elektrolytkonzentrationen in unverdünntem Plasma, welches durch

Abtrennung der Blutzellen von antikoaguhertem Blut erhalten wurde Es

beinhaltet Empfehlungen, wie die Messresultate dargestellt und wie sie in

Zusammenhang mit den Ergebnissen von Referenzmethoden gebracht

werden sollen Komplikationen rühren von der Tatsache her, dass lonen¬

selektive Elektroden in der unverdünnten Probe eine Fraktion des

Analyten erfassen, welche sich von der Gesamtkonzentration

unterscheidet Diese einzigartige Möglichkeit liefert zwar wertvolles

Wissen über die biologische Aktivität von Ionen, fuhrt aber dazu, dass die

erhaltenen Resultate nicht konsistent mit den Gesamtkonzentrationen sind,

welche durch indirekte Potentiometrie, Flammenphotometne, Atomab-

sorptionsspektrometne oder kombinierte, komplexometrische und photo¬

metrische Verfahren erhalten werden In einem Versuch, Resultate aus

direkten ISE-Messungen in Einklang mit Messwerten aus der indirekten


Potentiometrie in der verdünnten Probe oder anderen Methoden zu

bringen, schlagt das IFCC-Dokument vor, einen Algorithmus

anzuwenden, um die Ergebnisse aus der direkten Potentiometrie

umzurechnen Die Absicht ist es, die Resultate von verschiedenen Mess¬

methoden in derselben Einheit (mmol LP'rohl_) anzugeben Es besteht

jedoch die Gefahr, dass diese Prozedur zu einer übermässig vereinfachten

Interpretation von individuellen Messwerten fuhrt Dies insbesondere

dann, wenn der Anteil an Wasser in der Probe stark vom Normwert

abweicht Ferner muss beachtet werden, dass sich der Algorithmus nur

gerade auf die einwertigen Kationen Natrium und Kalium anwenden lasst

Heute ist es aber auch möglich, mit direkter Potentiometrie die zwei

wertigen Ionen Calcium und Magnesium zu erlassen In diesem Fall ist ein

Vergleich mit herkömmlichen Methoden mit der Bestimmung der

Gesamtkonzentration ohnehin nicht mehr mit einem einfachen Algo¬

rithmus möglich Diese Ionen liegen zu einem hohen Grad als Komplexe

gebunden vor Zusatzlich ist der Komplexierungsgrad stark von weiteren

Parametern abhangig, wie zum Beispiel vom pH Wert und der

Ionenstarke

6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 57

6.6. Umrechnung von Ionenaktivitäten in Ionenkonzentrationen

Wie in Abschnitt 6.5 erläutert, ist die Grösse der aktiven Molalität

m"^'1 aus historischen Gründen bis heute kein allgemein akzeptierter und

verbreiteter Parameter in der klinischen Chemie. Da aber mit einem

chemischen Sensor gerade diese Grösse erfasst wird, ist eine an¬

schliessende, mathematische Datenumrechnung unvermeidbar. Der von

der IFCC vorgeschlagene Formalismus (Gleichungen 6.20 und 6.21) wird

im folgenden Abschnitt hergeleitet:

Die totale (molare) Substanzkonzentration c^r}°hc des Ions j in einer Probe

des Probanden i kann in die folgenden drei Fraktionen eingeteilt werden:

Die freie Substanzkonzentration in der Wasserphase caiJ', der komplex

gebundene Anteil c,dj\ sowie der Anteil in der nichtwässrigen Phase

non.aq

M

Probe_ ,

aq

Ci.J~

C'i I +<rc+<r [C'HH-Wrot,] (6.i5)

Wenn ein Elektrolyt nur in der wassrigen Phase vorliegt, kann Gleichung

6.15 zu Gleichung 6.16 vereinfacht werden:

Diese Vereinfachung ist für Elektrolyte in den meisten Fällen zulässig. In

einem ersten Schritt sollen nur die frei vorliegenden Ionen in der

wassrigen Phase c^'1 betrachtet werden:

cProbe,!

= c.aq.t (61?)

werden:hergeleitetBeziehung

folgendedie6.16GleichungvonausgehendWeiseanalogeaufkann

soll,werdenermitteltKationengebundenenkomplexxSpeziesneutrale

oderAnionenanderEinbezugunterero

cSubstanzkonzentrationtotale

diee'ro

c

ProbederinSubstanzkonzentrationfreienderStelleanWenn

Probe,

C

rioucueiinioiizeiiuauunProbe.f

,

Probevolumen.gesamten

imIonsdesc1pJrobe,tSubstanzkonzentration(molaren)freienderundwird,

erfasstProbeunverdünntenderinSensorchemischeneinemmitsiewie

Wasserphase,derinIonseinesfh^'fMolalitätaktivenderzwischenhang

Zusammen¬denfürModelleinfachstedasrepräsentiertGleichungDiese

(620)=_LL_p«20Probe,.

man:erhältso6.18,Gleichungmit6.19GleichungmanKombiniert

7..j(6.19)aq.l=_^_

mäqA

verknüpft:gezeigt,6.19Gleichunginwie

yEinzelionen-Aktivitätskoeffizientenmolalendenüberfh^yMolalität

aktivendermitm*qAMolalitätdieisterwähnt,zuvorbereitsWie

(6-18)=<jJP,H2°c,Pjrobe''

wird.eingesetztc^'1Ionenkonzentration(molaren)freien

derStelleanLp'robe•kgHi0p,H2°WasservonMassenkonzentrationdie

undm*q'Molalitätdiewennman,erhältAusdruckgleichwertigenEinen

SENSORENCHEMISCHENMITIONENANALYTIKKLINISCHE58


_. aq.l -H,0

"»i.j -P."

.Probe

i+i^x-<r

r..j(6.21)

mit KjX: Assoziationskonstante für den Komplex jx

Da in den meisten Fällen die einzelnen Assoziationskonstanten sowie die

aktiven Molalitäten m^'der Komplexbildner x nicht bekannt sind, wird

in Gleichung 6.21 der Ausdruck \ + ^Kf n -\

jx i,x

V x=l )

durch Gf, jersetzt:

.Probe i

_ ju.I „H,0"*..j Pi

y..j-a..i(6.22)

a,j entspricht dem Anteil nicht gebundener Kationen j.

Da die einwertigen Kationen Na+ und K+ nur zu einem verhältnismässig

kleinen und nahezu konstanten Anteil komplex gebunden vorliegen [60],

kann für diese beiden Ionen entweder das einfachere Modell nach

Gleichung 6.20 zur Ermittlung der totalen Substanzkonzentration c*obe

angewendet werden oder besser ein konstanter Wert a} in Gleichung 6.22

eingesetzt werden. Für die zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+ ist der

Anteil an komplexierten Ionen im Verhältnis zur gesamten Konzentration

aber erheblich, so dass nur mit dem Modell nach Gleichung 6.22

gearbeitet werden kann.

Das Problem wird dadurch erschwert, dass das Ausmass der Kom-

plexierung sehr stark von der Ionenstärke und vom pH-Wert der Probe

abhängt, da Protonierungsgleichgewichte miteinbezogen sind. Bei nicht

anaerober Probenbehandlung wird der pH-Wert sehr rasch verändert und


entspricht nicht mehr den in vivo angetroffenen Bedingungen. Aus diesem

Grund werden in den eingesetzten Geräten (ISE-Analyzer) in vielen

Fällen empirische pH-Korrekturen für die Erfassung der freien Konzen¬

trationen cfj'1 an stark komplexierten Ionen wie Calcium oder

Magnesium vorgenommen.

Mit den beiden Gleichungen 6.20 oder 6.22 liesse sich nun eine korrekte

Transformation des Ausgangssignals des Sensors, der aktiven Molalität

waq'', in die klinisch akzeptierte Grösse der freien (molaren) Ionen¬

konzentration cProbe,f oder der totalen (molaren) Ionenkonzentration

cPro!» durchführen. Dazu müssten allerdings die Werte sämtlicher

beeinflussenden Grössen für die individuelle Probe bekannt sein oder

experimentell bestimmt werden'. Vor allem aus Gründen der Analyse¬

dauer ist dies aber nicht möglich.H O

Demzufolge werden in der Laborroutine die Grössen p2

, y und a,s

ersetzt durch konstante Werte pHl°, ft und DTj (siehe Tab. 6.1, 6.3; Abb.

6.5), die in der Regel den Mittelwerten von normalen Proben (d.h.

gesunden Probanden) entsprechen. Dies führt zu Gleichungen 6.23 und

6.24:

Probe.. =î_,H20 (g ^h

. aq.l „HiO

)be

'il__

mH

W„Probe =_ij

y

(624)

wobei die Ausdrücke c-ipjrobc't und ^1pJrobc als Schätzung für die freie,

respektive die totale Substanzkonzentration stehen. Diese unterscheiden

'Im Anhang 2 sind sämtliche experimentell bestimmten Grossen und die daraus rechnerisch abgeleiteten

Grossen lur alle untersuchten Individuen wiedergegeben


sich vom wahren individuellen Wert cProbe und cProbef, wobei die relative

Abweichung ej;' respektive e^ beträgt:

Ec.t = (£Probe,. _ cProhe.. ) , ^Probe.t (625)

e;3 = (£*<*«• -cProbc)/cProbe (6.26)

Im folgenden werden die Faktoren p,H2°, y, und atJ ,die eine

Datenumrechnung beeinflussen, zunächst einzeln und dann gesamthaft

betrachtet. Dazu werden experimentell gesammelte Daten (vgl. Anhang 2)

für reale Plasmaproben von verschiedenen freiwilligen Probanden

verwendet. Die relativen Abweichungen von den entsprechenden Mittel¬

werten für gesunde Probanden werden für die Massenkonzentration von

Wasser £?, die molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten £7' sowie die

Ot

Komplexierung von Kationen e,J zunächst getrennt analysiert, bevor die

Gesamtabweichung e'j' oder ef bestimmt wird.

Aus der Sicht des Analytikers sind primär die mittleren relativen Ab¬

weichungen von Interesse, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ

ausfallen. Die in den folgenden Tabellen präsentierten Daten für die

mittleren relativen Abweichungen vom Mittelwert gesunder Probanden

sind daher immer aus den Absolutbeträgen der individuellen Werte le,l

berechnet. Aus medizinisch-diagnostischer Perspektive ist zusätzlich eine

Trennung der Abweichungen in positive und in negative Richtung

bedeutsam. Dieses Thema wird am Ende von Abschnitt 6.6.5 kurz

angeschnitten.


6.6.1. Individuelle und mittlere Massenkonzentration von Wasser

Für vier verschiedene Probandengruppen wurde die Massenkon¬

zentration von Wasser p2 nach Gleichung 6.2 aus Daten der Protein-

und Lipidbestimmung ermittelt. Tabelle 6.1 gibt eine Übersicht über die

erhaltenen Mittelwerte pHl° sowie die 95%-Vertrauensintervalle

(sts,95% /Vn; s: Standardabweichung; ts95%: Studentfaktor; n: Anzahl der

Proben) für die betrachteten Patientengruppen. Die niedrigsten Messwerte

wurden in Proben von Patienten mit Nierenbeschwerden nach erfolgter

Hämodialyse gefunden. Die Höchstwerte traten bei Patienten auf, welche

wegen verschiedener Herzbeschwerden auf der Intensivstation für innere

Medizin behandelt wurden. In Abbildung 6.2 ist dieser Sachverhalt

graphisch dargestellt. Die Massenkonzentration von Wasser unterscheidet

sich bei den Patienten nach der Hämodialyse sowie bei den Patienten mit

Herzbeschwerden eindeutig von den Werten, welche für gesunde

Probanden erhalten werden.

Tabelle 6.1: Experimentell bestimmte, mittlere Massenkonzentration von

Wasser pHl° (Gl. 6.2) in Humanplasmen von gesunden Probanden und

von Patienten mit verschiedenem medizinischen Status.

pHj-° Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt

Nj-i l Dialyse Dialyse versagen

H,0'

LProbe I

(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)

Mittelwert 0.932 0.934 0.928 0.936 0.932

0.931 0.932 0.925 0.934 0.93195%-Intervall

0.933 0.936 0.931 0.938 0.933

6 6 Umrechnung von Ioncnakttvttaten in Ionenkonzentrationen 63

.0 940-

i 0 935 -

0 930

0 925-

VD ND HV

Abb 6 2 Experimentell ermittelte Massenkonzentration von Wasser p

gegliedert nach Probandengruppen (G Gesunde, VD / ND Vor / nach

Hämodialyse, HV Herzversagen) Dargestellt sind Mittelwert (horizon¬

tale Linie), Gesamtbereich der Datenverteilung (vertikaler Balken), 95%-

Vertrauenstntervall (graues Rechteck)

Es sollte beachtet werden, dass die Variationen in der Massen¬

konzentration von Wasser im Einzelfall auf eine Ermittlung der molaren

Ionenkonzentration ausgehend vom Messsignal eines chemischen Sensors

einen nicht unwesentlichen Einfluss haben können (vgl Tabelle 6 4) So

ist im Falle der Massenkonzentration von Wasser p der Betrag der

relativen Abweichung der Individualwerte vom Mittelwert für gesunde

Probanden ef in 20 der untei suchten 82 Falle grosser als 0 5 Prozent1

= (pf PH0)/P,H0 (6 27)

1Du Grenzwert von 0 Wr wurde willkürlich gewählt da in diesem Fall der Fehierbtiüag zum

Analystnresultat durch rechnerische Korrekturen die Haltte des in der klinischen Chemie allgemeintolerierten Gesamttehiers von 1% ausmacht Für weitere Bemerkungen zu diesem Thema sei hier auf den

Abschnitt 6 6 5 und insbesondere auf Tabelle 6 6 verwiesen


Dies bedeutet für die Bestimmung der molaren Ionenkonzentration t>1ProbL

durch Umrechnung nach Gleichung 6 24 einen Fehlerbeitrag zum

Analysenresultat von mehr als 0 5 Prozent bei 20 der untersuchten

Individuen, wenn für die Massenkonzentration von Wasser der Mittelwert

p"H'° (in diesem Fall tur gesunde Probanden) an Stelle der

Individualwerte p,'

eingesetzt wird

6 6 2 Individuelle und mittlere molale Ionenstarke

Die molale Ionenstarke /,mola' gehört zwar nicht zu den direkten

Einflussfaktoren für die Datentransformation, sie bestimmt jedoch in

erster Linie die Grosse der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten

und wird daher in die Betrachtungen miteinbezogen In Tabelle 6 2 findet

man eine Zusammenstellung der Mittelwerte 7mohl sowie der 95%-Ver-

trauensintervalle von molalen Ionenstarken in menschlichem Plasma,

ermittelt aus experimentellen Daten nach Gleichung 6 7b Diese Werte

wurden mitunter als Grundlage für die Abschätzung der molalen Einzel-

lonen-Aktivitatskoeffizienten verwendet In Abbildung 6 3 sind die

Resultate graphisch dargestellt Die tieferen Werte für Patienten mit Herz¬

beschwerden lassen sich auf geringere freie Natriumionenkonzentrationen

cp".obet zurückfuhren, welche innerhalb dieser Probandengruppe oft

beobachtet wurden Da das Natnumion den höchsten Anteil der Kationen

im menschlichen Blut darstellt, ist die freie Natriumionenkonzentration

der dominierende Faktor für die Ionenstarke Allgemein wird diese

Tatsache beispielsweise in klinischen Elektrolytanalysatoren, basierend auf

ISE, für die Abschätzung der Ionenstarke ausgenutzt

6.6. limrcchnuna von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 65

Tabelle 6.2: Experimentell bestimmte, mittlere molale Ionenstärke 7mola'

in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Patienten mit ver¬

schiedenem medizinischem Status.

t molal Gesunde Vor Nach Herz¬ Gesamt

[mmolkgH'i0] Dialyse Dialyse versagen

(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)

Mittelwert 160.9 158.4 159.0 154.1 158.8

95%-Intervall160.4

161.4

157.0

159.8

158.0

160.0

151.3

156.9

158.0

159.6

164

°.160 -

"öEE

156-

152-

148-

VD ND HV

Abb. 6.3: Molale Ionenstärke /lmol'd gegliedert nach Probandengrttppen;

(Darstellung analog zu Abb. 6.2).


Aus Tabelle 6 2 und Abbildung 6 3 lasst sich entnehmen, dass die Ionen¬

starke sich in allen pathologischen Fallen von derjenigen für gesunde

Probanden unterscheidet Dies wirkt sich direkt auf die Einzehonen-

Aktivitatskoeffizienten aus, da diese hauptsächlich von der Ionenstarke

abhangen Da die Aktivitatskoeffizienten mit steigender Ionenstarke

abnehmen, wird für erstere ein verglichen mit /,mohl umgekehrtes

Verteilungsmuster erwartet, was in Abschnitt 6 6 3 auch bestätigt

gefunden wird

6 6 3 Individuelle und mittlere molale Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten

In der Tabelle 6 3 sowie in der Abbildung 6 4 sind die Mittelwerte

yi sowie die 95%-Vertrauensintervalle der molalen Einzehonen-Aktivi-

tatskoeffizienten, abgeschätzt aus experimentellen Daten nach der Methode

von Pitzer (vgl Gleichungen 6 10 bis 6 14), für die verschiedenen

Gruppen von Probanden zusammengefasst Sämtliche Daten beziehen sich

auf die physiologische Temperatur 37 °C Über alle Probanden gesamthaft

betrachtet zeigen im Falle von Na+, K+ und Cl die Koeffizienten relative

95%-Vertrauensintervalle unterhalb von 0 06 Prozent Für die zwei¬

wertigen Ionen Ca2+ und Mg,+ liegen die Werte unterhalb von 0 14

Prozent Die grossten Streuungen findet man in der Gruppe der Patienten

mit Herzerkrankungen Wie schon im Falle der Ionenstarke lassen sich

auch diese Variationen hauptsächlich auf die grosseren Schwankungen der

freien Natriumionenkonzentration zurückfuhren Auch bei den Aktivitats¬

koeffizienten findet man signifikante Unterschiede zwischen Probanden

aus den pathologischen Gruppen und gesunden Probanden Es muss jedoch

beachtet werden, dass diese Unterschiede zwar statistisch signifikant, als

relative Differenzen betrachtet aber gering sind

6 6 Umrechnung von lonenaktivitäten in Ionenkonzentrationen 67

Tabelle 6 3 Experimentell bestimmte, mittlere Einzehonen-Aktivitats-

koetfizienten y] in Humanplasmen von gesunden Probanden und von Pati¬

enten mit verschiedenem medizinischem Status

Probanden¬ Ion

gruppe

Gesunde Mittelwert

(n=36)95%-Intervall

Vor Mittelwert

Dialyse95%-Intervall

(n=18)

Nach Mittelwert

Dialyse95%-Intervall

(n=13)

Herz¬ Mittelwert

versagen95%-Intervall

(n=15)

Gesamt Mittelwert

(n=82)95%-Intervall

Na+ K+ Cl Ca1+ Mg2-

0.7430 0.7263 0.7446 0.3417 0.3507

0 7428 0 7261 0 7444 0 3414 0 3505

0 7432 0 7265 0 7448 0 3420 0 3509

0 7440 0 7276 0 7455 0 3430 0 3520

0 7434 0 7269 0 7450 0 3422 0 3512

0 7446 0 7283 0 7460 0 3438 0 3528

0 7438 0 7273 0 7452 0 3428 0 3518

0 7434 0 7268 0 7448 0 3422 0 3513

0 7442 0 7278 0 7456 0 3434 0 3523

0 7458 0 7297 0 7474 0 3455 0 3542

0 7446 0 7283 0 7463 0 3439 0 3527

0 7470 0 7311 07485 03471 03557

0 7438 0 7274 0 7454 0 3429 0 3518

0 7441 0 7270 0 7451 0 3424 0 3514

0 7435 0 7278 0 7457 0 3434 0 3522


0.750n

0.748-

Na+ 0.734-

0.732-

0.730-

0.728-

0.726-

1

0.358-

0.356-

0.354-

0.352-

0.350-

1

K+

-0.746-^-

—i—

0.744-r-— h -i

0.742-

1

0.350-

0.348-

II 1 1

G VD ND

„2+

Ca

HVi i 1 1

G VD ND

Mg2+

HV

-0.346-

0.344-

| i

0.342-

0.340-

1— —1 1— —1

i— =i i— —1

1

C7"T3 VD

I

N1

D HV c7"T

VDi i

ND HV

er

0.750-

0.748- w i

Ä.

0.746^

1- —j

0.744-

E 3

r~^ 1 1

G VD ND HV

Abb. 6.4: Molale Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten von Na+, K+, Ca2+,

Mg2+ und Cl in Humanplasma, abgeschätzt aus experimentellen Daten

nach dem Pitzer-Modell, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung

analog zu Abb. 6.2).


In Analogie zu Abschnitt 6 6 1 kann auch an dieser Stelle der Fehler¬

beitrag der Variationen in den molalen Einzehonen-Aktivitatskoef-

fizienten auf das Analysenresultat des Sensors im Falle einer Konzentra¬

tionsbestimmung nach IFCC abgeschätzt werden Die Resultate sind in

Tabelle 6 4 zusammengefasst Betrachtet für die Einzehonen-Aktivitats¬

koeffizienten findet man relative Abweichungen vom Mittelwert von

gesunden Probanden |e,''| über 0 5 Prozent bei Na+ und Cl für 5

Individuen, bei 7 Individuen für K+ und bei 23 Individuen für Ca2+ und

Mg2+ nach Gleichung 6 28

£*' =(7l-7n)/Yl) (6 28)

Bei einer Umrechnung von gemessenen aktiven Molahtaten m*q in

molare Substanzkonzentrationen ^|pjobe nach Gleichung 6 24 unter Ver¬

wendung von Mittelwerten der Aktivitatskoeffizienten y} werden in den

oben aufgezahlten Fallen Beitrage von mehr als 0 5 Prozent zum gesamten

Fehler der Analyse geliefert Besonders häufig treten grossere Ab¬

weichungen vom Mittelwert bei Patienten mit Nierenbeschwerden vor der

Hämodialyse, sowie bei herzkranken Patienten auf der Intensivstation auf

In beiden Fallen sind Störungen im Elektrolythaushalt des Korpers Be¬

standteil des Krankheitsbildes Da gerade für diese Patientengruppen die

Erfassung von freien Elektrolytkonzentrationen besonders relevant ist und

sich der Einsatz von peripheren Sensorgeraten hier anbietet, sollte diese

Tatsache keineswegs unbeachtet gelassen werden


6.6.4 Komplexierung von zweiwertigen Kationen

In Abbildung 6.5 ist der in der Probe frei vorliegende Anteil a,

der Ionen Ca2* und Mg2+ in Abhängigkeit der Probandengruppe dar¬

gestellt. Die Werte wurden experimentell aus den Differenzen der gemes¬

senen totalen Substanzkonzentratione

und der freien Ionenkonzen¬

tration im wassrigen Probenanteil c1p,"t'e't bestimmt und sind nicht pH-

korrigiert1. Eine rechnerische Bestimmung von c-1p'obe wäre für beide

Ionen nur dann sinnvoll, wenn der Komplexierungsgrad in allen Fällen

gleich gross wäre und dadurch wie in Gleichung 6.24 als Konstante

behandelt werden könnte. Aus Abbildung 6.5 geht jedoch hervor, dass

diese Grösse erheblichen Schwankungen unterworfen ist. Dies insbe¬

sondere dann, wenn die Probe nicht anaerob behandelt wird und es

dadurch zu Veränderungen des pH-Wertes kommt.

52-Ca2+ 76-

72-

68-

0-64-

z 60-

? 56-a

52-

48-

44-

1

Mg2+

1—

It« Mg

—1^48- h- H .

. P —|o

a 44-

40-

M M

Cl

5 V]

D ND HV C3i

V!

D ND HV

Abb. 6.5: Experimentell bestimmte, freie Anteile an Ca2+ und Mg2+ in

Prozent der entsprechenden totalen Substanzkonzentration in Humanplas¬

ma, gegliedert nach Probandengruppen; (Darstellung wie in Abb. 6.2).

1

ISE-EIektrolyt-Analyzcr bieten in der Regel die Möglichkeit zur Korrektur der pH-abhängigen Messwerte

der freien Ionenkonzentrationen von Ca:* und Mg:+ auf einen physiologischen pH-Wert von 7.40 [61, 62].


Betrachtet man die relativen Abweichungen e" des Anteils frei

vorliegender Ionen vom Mittelwert für gesunde Probanden nach

Gleichung 6 29, so wird für das Ca2+-Ion und für das Mg'+-Ion bei 75 der

82 untersuchten Individuen ein Wert von 0 5 Prozent überschritten Die

mittleren, relativen Abweichungen für die einzelnen Probandengruppen

sind in Tabelle 6 4 aufgeführt

e^' =(w,-a1J)/a1J (6 29)

Dies bedeutet, dass der Fehlerbeitrag zum Analysenresultat infolge der

Datenumrechnung nach Gleichung 6 24 alleine von der variablen Ionen-

komplexierung für fast alle untersuchten Proben mehr als 0 5 Prozent

betragt

Die Resultate der vorangehenden Untersuchungen zu den einzelnen beein¬

flussenden Parametern p,H'°, y, und al} sind in Tabelle 6 4 zusammen¬

gestellt Die Übersicht beinhaltet alle durch die Datenumrechnung

verursachten, relativen Fehlerbeitrage |e, | in Abhängigkeit der einzelnen

relevanten Grossen


Tabelle 6.4: Mittlere relative Fehlerbeiträge |e|, die auftreten, wenn

Mittelwerte gesunder Probanden (Gl. 6.23 / 6.24) anstelle von

individuellen Daten (Gl. 6.20 / 6.22) zur Datenumrechnung eingesetzt

werden. Die Resultate sind aufgelistet nach den einzelnen, beeinflussenden

Parametern. Alle Angaben in Prozent des Messwertes.

Parameter Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt

Dialyse Dialyse versagen

(n=36) (n=18) (n=13) (n=I5) (n=82)

AHl0 Mittel 0.24 0.34 0.59 0.40 0.35

95%0.19

0.30

0.20

0.48

0.39

0.79

0.20

0.60

0.29

0.41

'Na*Mittel 0.05 0.15 0.11 0.38 0.14

95%0.03

0.07

0.08

0.22

0.06

0.16

0.23

0.53

0.10

0.18

V Mittel 0.07 0.19 0.14 0.47 0.18

95%0.05

0.09

0.10

0.28

0.08

0.20

0.39

0.65

0.13

0.23

rcr Mittel 0.05 0.13 0.09 0.38 0.14

95%0.03

0.07

0.07

0.19

0.04

0.14

0.23

0.53

0.10

0.18

y^ Mittel 0.16 0.45 0.34 1.12 0.43

95%0.11

0.21

0.24

0.66

0.18

0.49

0.69

1.55

0.31

0.55


Tabelle 6.4' Fortsetzung

Parameter Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt


(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)

'Mir

Mittel 0.15 0.41 0.31 1.02 0.39

95%0.10

0.20

0.22

0.60

0.16

0.46

0.62

1.42

0.28

0.50

ac- Mittel 2.28 5.65 6.86 4.29 4.11

95%1.67

2.89

4.15

7.15

2.71

11.00

2.63

5.95

3.26

4.96

°v- Mittel 3.01 3.52 26.99 4.53 7.20

95%2.20

3.81

1.47

5.56

17.89

36.09

2.29

6.77

4.82

9.58

6.6.5 Transformation von aktiven Molalitäten in freie (molare) Ionen¬

konzentrationen

Bis jetzt wurden die relativen Beiträge der Massenkonzentration

von Wasser, der molalen Einzelionen-Aktivitätskoeffizienten und der

Komplexierung (im Falle der zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+) zum

resultierenden Umrechnungsfehler getrennt analysiert. An dieser Stelle

sollen nun die umrechnungsinduzierten Abweichungen ef,f gesamthaft

nach Gleichung 6.25 betrachtet werden. Die Resultate sind in Tabelle 6.5

und in Abbildung 6.6 dargestellt.

Es ist zu beachten, dass auch für die Ionen Ca2+ und Mg2+ lediglich die

Umrechnung von aktiven Molalitäten m^'1 zu freien Ionenkon-


zentrationen cPr"bel berücksichtigt wird Eine allfalhge Ermittlung der

totalen Substanzkonzentration c1Probc wird nicht diskutiert, da wegen der

starken Schwankungen im Komplexierungsgrad eine Umrechnung eines

mit einem Sensor erhaltenen Messwertes nach Gleichung 6 24 nicht

sinnvoll ist und m der Regel auch nicht durchgeführt wird Die dabei

resultierenden Fehlerwerte waren um ein Mehrfaches grosser als

diejenigen, welche durch die Ermittlung der freien Ionenkonzentration

£,pJrobe' nach Gleichung 6 23 erhalten werden


Tabelle 6 5 Mittlere relative Fehlerbeitrage Ec,die auftreten, wenn

Mittelwerte gesunder Probanden (Gl 6 23) anstelle von individuellen

Daten (Gl 6 20) zur Umrechnung von aktiven Molalitaten in freie,

molare Ionenkonzentrationen eingesetzt werden Die Resultate sind

getrennt für die einzelnen Ionen aufgelistet Alle Angaben in Prozent des

Messwertes

Ionj Gesunde Vor Nach Herz- Gesamt


(n=36) (n=18) (n=13) (n=15) (n=82)

Na+ Mittel 0 24 031 061 0 27 0 32

0 19 021 0 40 0 15 0 2795%

0 30 0 42 0 83 0 38 0 38

K+ Mittel 0 24 0 32 0 62 0 29 0 33

0 19 0 23 0 40 0 17 0 2795%

0 30 0 42 0 84 0 42 0 39

Cl Mittel 0 24 0 32 0 60 0 26 0 32

0 19 0 20 0 39 0 15 0 2695%

0 30 0 43 081 0 38 0 37

Ca,+ Mittel 0 27 0 43 0 78 0 79 0 48

0 20 0 28 0 56 0 43 0 3995%

0 34 0 59 100 1 15 0 58

Mg,+ Mittel 0 27 0 40 0 75 0 69 0 45

0 20 0 25 0 53 0 37 0 3695%

0 34 0 54 0 98 102 0 54


^

1.0

0.8-

0.6-

0.4

0.2

0.0

Na

G VD ND HV

2.0-

1.6-

1 ?-

Ca2+

0.8-

0.4-

0.0-

1:

_

r"""^—r

1.0-

0.8-

;o.6-

r0.4-

0.2-

0.0-

Cl"

l j

tz I

1.0-

0.8-

0.6-

0.4-

0.2-

0.0-

K+

i ZDI I

I ^

1.6-

1.2-

Mg2+

0.8-

l—0.4-

i

o.o-

—*—

I —IVD ND HV

G VD ND HV

Abb. 6.6: Durch Datenumrechnung nach Gleichung 6.23 verursachte

relative Abweichungen Ef'

für die Ionen Na+, K+, Ca2+, Mg2+ und Cl in

Prozent: (Darstellung analog zu Abb. 6.2).


Die in Tabelle 6 5 zusammengefassten Resultate belegen, dass die freie,

molare Substanzkonzentration cProbe' nicht in allen Fallen mit genügender

Sicherheit aus gemessenen aktiven Molalitäten m*q ermittelt werden

kann Das Risiko, neben dem analytischen Fehler der Messmethode einen

zusätzlichen Beitrag zum Gesamtfehler der Analyse durch mathematische

Datentransformation einzufuhren, ist nicht vernachlassigbar In der

Gruppe von Probanden nach erfolgter Behandlung durch Hämodialyse ist

das Fehlernsiko am grossten Vor allem bei den einwertigen Ionen

unterscheidet sich diese Gruppe von Patienten klar von den übrigen

Probandengruppen Bei den zweiwertigen Ionen, wo allgemein grossere

Differenzen auftreten, heben sich die Gruppen der Patienten nach der

Hämodialyse und die Patienten mit Herzbeschwerden von den übrigen

Probanden ab

Zu Beginn von Kapitel 6 6 wurde erwähnt, dass es aus der Sicht des

Mediziners für die diagnostische Interpretation der Daten entscheidend

sein kann, in welche Richtung die Abweichungen durch rechnerische

Datentransformation aultreten Abbildung 6 7 zeigt die Histogramme mit

dem Verteilungsmuster der Gesamtabweichungen ef' für die einzelnen

Ionen

78 KLINISCHE IONEN ANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN

40 - Na+

4820 -

o -

21

9

9

11

2

7

_8_15

3420 -

G VD ND HV Tot.'

60

40

N 20

0 H

20

Ca

23

13

"TänrTi" 13

62

20

i 1 i r

G VD ND HV Tot

40

20

20

Cl

48

21

9 117

159 2 _8_

34

I I

40 -

20

0 -

20

G VD ND HV Tot.

40 -

Mc2+

5920 -

o -

22

12 13 12

14L6J 0

323

20 -

G VD ND HV Tot.

Eu >0

£l] <0

G VD ND HV Tot.

Abb. 6.7: Häufigkeit N der relativen Abweichungen ef'j (Gleichung 6.25)

in positiver respektive negativer Richtung, dargestellt für die untersuchten

Ionen.


Wie aus Abbildung 6 7 hervorgeht treten die beobachteten relativen Ab¬

weichungen e'' vermehrt mit positivem Vorzeichen auf Dies bedeutet,

dass die nach Gleichung 6 23 aus Mittelwerten abgeschätzten freien Ionen¬

konzentrationen e>Pro1*'' für die Mehrzahl der untersuchten Individuen

grosser als die wahren Werte c,p[obct, berechnet mit den individuellen

Daten ausfallen Hauptverantwortlich für diese Beobachtung ist eine

gegenüber dem Mittelwert im allgemeinen leicht erniedrigte Massen

konzentration von Wasser p,H,°, wie dies sehr deutlich bei Patienten nach

der Behandlung durch Hämodialyse zum Ausdruck kommt Für den Arzt

besteht somit die Gefahr einer Fehldiagnose, verursacht durch

vermeintlich erhöhte Laborwerte für die Elektrolyte

Das Ausmass der in Tabelle 6 5 angegebenen Abweichungen lasst sich am

besten beurteilen, wenn sie mit den idealerweise diagnostisch zulassigen

Fehlern verglichen werden Diese werden oft unabhängig vom Analyten

auf 1 % festgesetzt Daneben existieren aber auch Richtlinien, die sich an

der intraindividuellen biologischen Variation der einzelnen Analyte

orientieren Gemäss den Richtlinien des CAP (College of American

Pathologists) [63 64], berechnet sich der total zulassige analytische Fehler

cva für die Bestimmung einer klinisch relevanten Grosse nach Gleichung

6 30

mit cva Totaler, zulassiger, analytischer Fehler

cvb mtrd Biologische, intraindividuelle Variation [65]


Tabelle 6 6 Totaler, zulassiger analytischer Fehler, berechnet nach den

Richtlinien des CAP

Analyt Total zulassiger analytischer Fehler

cvd [%]

Na+ 0 3

K+ 2 2

Ca"+ 0 85a

Mg2+ 1 la

Cl 0 7

aWerte für die totale Ionenkonzentration cvbmlri für freie Ionenkonzen¬

tration nicht verfugbar

Beim Vergleich der Daten in Tabelle 6 5 und 6 6 muss man feststellen,

dass für das Na+-Ion alleine der Beitrag der Datenumrechnung zum

analytischen Fehler den Wert des totalen, idealerweise zulassigen Fehlers

bereits überschreitet oder annähernd erreicht Die Zahlen in Tabelle 6 5

enthalten aber noch keine Fehlerbeitrage, verursacht durch die Mess¬

methode an sich Besser sieht die Situation im Falle des K+-Ions aus Hier

vermag der durch den Umrechnungsalgonthmus nach Gleichung 6 23

verursachte Fehlerbeitrag den total zulassigen analytischen Fehler nicht zu

erreichen Für die beiden zweiwertigen Kationen Ca2+ und Mg2+, sowie

das Amon Cl, werden die total zulassigen analytischen Fehler nicht

überschritten, für manche Probandengruppen (nach der Hämodialyse,

Herzversagen) jedoch nahezu erreicht Es ist zu beachten, dass es sich bei

den Zahlen in Tabelle 6 6 um Idealwerte handelt, die aber in der heutigen

Laborpraxis in der Regel nicht erreicht werden (vgl Abschnitt 9 1 5)

Eine Reduktion der analytischen Fehler drangt sich auf Um so mehr


müssen zusätzliche Fehlerbeitrage, die nicht durch die Messmethode

selbst, sondern durch rechnerische Datentransformation verursacht

werden ausgeschlossen werden

Die erhaltenen Resultate belegen am Beispiel von lediglich zwei

pathologischen Probandengruppen, bei welchen der Elektrolythaushalt

eine entscheidende Rolle spielt, dass durch die Umrechnung von

gemessenen aktiven Molalitäten in freie oder totale Ionenkonzentrationen

ein relativ hohes Fehlemsko eingegangen wird In dieser Studie wurden

keine Proben von Patienten, die unter starker Hypo Hydratation leiden,

mituntersucht Auch für solche Falle werden aber grossere Abweichungen

auf Grund der Variationen in der Massenkonzentration von Wasser

erwartet Wegen des experimentell wesentlich höheren Aufwandes ist eine

Datentransformation unter Berücksichtigung individueller Aktivitats¬

koeffizienten und Massenkonzentrationen von Wasser auch keine

allgemeine Losung für dieses Problem Zusatzlich muss bei der

experimentellen Bestimmung der Massenkonzentration von Wasser

bedacht werden, dass die zuvor beschriebene Methode selbst

Unsicherheiten mit sich bringt Klinisch betrachtet, ist das Resultat einer

aktiven Molahtatsbestimmung ohnehin wertvoller als die Konzentrations¬

messung

82 KLINISCHE 1QNENANALYTIK MIT CHEMISCHEN SENSOREN

6.7. Kalibration chemischer Sensoren für physiologische

Proben

Da die korrekte Kalibration eines Sensorsystems entscheidend fut

die Qualität des Analysenresultates ist, sollen an dieser Stelle einige

grundsatzliche Hinweise zu diesem Thema im Hinblick auf die

Anwendung in klinischen Proben gegeben werden Die hier getroffenen

Überlegungen sind in der Regel für alle Typen von chemischen Sensoren

gültig Ein Spezialfall für die Kalibration von potentiometnschen

Sensoren wird in Kapitel 6 9 diskutiert Prinzipiell stehen für die Kali¬

bration eines chemischen Sensors für den Direkteinsatz (d h ohne Ver¬

dünnung) in der klinischen Probe zwei verschiedene Möglichkeiten zur

Wahl Dabei stosst man auf die Frage ob der Sensor für die Messung der

(molaren) Substanzkonzentration oder der aktiven Molalitat kalibriert

werden soll

Der Sensor kann einerseits mit wassrigen Losungen bekannter Zusammen¬

setzung kalibriert werden oder aber es werden Losungen verwendet, die

mit Proteinen versetzt sind und somit den physiologischen Proben am

nächsten kommen In beiden Fallen kann die Kalibration mit oder ohne

Hintergrund von potentiell interferierenden Komponenten durchgeführt

werden Im Extremfall gelangen sogar physiologische Proben mit

bekanntem Gehalt des zu kalibrierenden Analyten zum Einsatz Diese

müssen zuvor mit einer unabhängigen Referenzmethode analysiert worden

sein Je nach Zielgrosse bietet die eine oder die andere Methode gewisse

Vorteile In einfachen wassrigen Losungen bekannter Zusammensetzung

lassen sich beispielsweise für Elektrolyte relativ leicht und zuverlässig die

Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten nach der Methode von Pitzer

abschätzen Somit wird die Kalibration des Sensors auf der Basis der

aktiven Molalitaten ermöglicht Dies bedeutet, dass aus dem Messsignal

direkt das Resultat in Form der aktiven Molalität erhalten wird Alle

resultierenden Fehler sind somit durch die Messmethode selbst (z B

6 7 Kalibration chemischer Sensoren für physiologische Proben 83

Selektivitatsprobleme), sowie duich geringe Unsicherheiten in der

Abschätzung der Aktivitatskoeffizienten gegeben Probleme ergeben sich

lediglich in den Fallen, in denen eine Abschätzung der Aktivitats¬

koeffizienten nicht zuverlässig möglich (fehlende Parameter) oder

problematisch (z B neutrale Analyte) ist Wird die Kalibration mit

wassrigen Losungen durchgeführt, die einen konstanten physiologischen

Elektrolythintergrund haben, können auch Selektivitatsprobleme, sowie

das Flussigkeitspotential (vgl Kap 5 1 und 6 9) weitgehend eliminiert

werden Allerdings wird dadurch die mathematische Abschätzung der

Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten erschwert und es muss sichergestellt

sein, dass ein zuverlässiger, plausibler Berechnungsformalismus (z B

nach Pitzer) zur Verfugung steht

Wie in Abschnitt 6 6 ausführlich dargestellt, ist aber in der klinischen

Chemie die Grosse der freien oder der totalen (molaren) Ionen¬

konzentration gebräuchlich Diese wird einerseits durch die im

voranstehenden Kapitel beschriebene Umrechnung erhalten, oder aber

durch die Kalibration des Sensors auf der Basis von Konzentrationen

unter möglichst probennahen Bedingungen Dazu verwendet man protein-

haltige Losungen oder physiologische Proben Beide Verfahren verbergen

die gleichen potentiellen Fehlerquellen In beiden Fallen wird davon

ausgegangen, dass die Aktivitatskoeffizienten für den Analyten in der

Probe und im Kahbrator identisch sind respektive in der Probe

unverändert bleiben Die gleiche Annahme gilt für die Massen

konzentration von Wasser Abweichungen von diesen Annahmen haben

Fehler im Analysenresultat wie in Kapitel 6 6 gezeigt zur Folge


6.8. Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser durch

Vergleich von lonenaktivitäten und Ionenkonzentrationen

Gleichungen 6 20 und 6 22 zeigen, dass das Verhältnis der totalen

Ionenkonzentration cProbe und der aktiven Molalität m1^' von der

Massenkonzentration von Wasser p, abhangig ist Dies gestattet es

theoretisch, die nicht direkt messbare Massenkonzentration von Wasser

aus den routinemassig zugänglichen Werten für die totale Ionen

konzentration und die aktive Molalitat abzuschätzen Dieses Verfahren

wird beispielsweise in einem kommerziell erhältlichen Analyzer der

Firma NOVA Biomedical1 zur Aufdeckung von Anomalien im

Wassergehalt der Probe eingesetzt [66] Dazu werden die Messwerte für

das Na+-Ion, erhalten mit ISE in der unverdünnten Probe (proportional zu

maq f

j), mit denjenigen, erhalten durch die indirekte Potentiometrie

(entspricht c" ) verglichen

An dieser Stelle soll nun untersucht werden, inwiefern dieses Verfahren

für die in dieser Arbeit untersuchten Proben anwendbar ist und ob sich

die Methode auch auf andere Kationen übertragen lasst Dazu wurde ein

einfaches lineares Regressionsmodell aufgestellt

A = ßc.

V'"'J J

c/in

( Probt ^Cl J

vacl t

m,

+ CONST + E, (6 31)

mit ß(/„, Regressionskoeffizient für den Quotienten aus cProbe

und m")'E, Zufällige Abweichungen vom Modell

Die Regression wurde mit allen 82 Datensätzen durchgeführt Die

Resultate sind in Tabelle 6 7 zusammengefasst Im postulierten Modell

wird der Quotient aus c,Probc und m*q[ als fehlerfreie erklärende Variable

NOVA NUCLEUS(NOVA BIOMEDICAL GmbH Rüdermark Germany)

6 8 Abschätzung der Massenkonzentration von Wasser 85

betrachtet Der Ausdruck E, repräsentiert die Residuen, das heisst den

nicht durch die erklärende Variable und die Konstante erfassten Beitrag

zum Modell

Als experimentelle Parameter wurden für die statistische Analyse

einerseits die mit indirekter Potentiometrie oder Photometrie bestimmte

totale (molare) Ionenkonzentration und andererseits der aus der direkten

Potentiometrie (unverdünnte Probe) stammende Messwert, der direkt

proportional zur aktiven Molalität ist, eingesetzt In Abbildung 6 8 sind

die der Regression zugrundeliegenden individuellen Quotienten von c1Probeund int'q' gegenüber der Massenkonzentration von Wasser graphisch

dargestellt


10.94-

Jj?0.93-

0.92-1

Na

—I ' 1 ' 1

0.92 0.94 0.96

0.94-K+

.."

•

. D * "~^^^

0.93- •^^ "

T

1 ' l '

0.90 1.00

Probe ./w aq,f.(c /m )/(kgH0L Probe)

10.94-

CT)0.93-

0.92-

Ca

-i 1 1 1 1 1 r

2.00 2.20 2.40

Probe .*, aq,f

0.94-

0.93-

0.92 4

Mg2+

-i 1 1 , 1 1

1.60 2.00 2.40

(c /m )/(kgH0L Probe)

Abb. 6.8: Zugrundeliegende experimentelle Datenpunkte (o), Regressions¬

gerade (ausgezogene Linie) und 95%-Vertrauensband (unterbrochene

Linie) für das lineare Regressionsmodell (Methode der kleinsten Fehler¬

quadrate) nach Gleichung 6.31.

Alleine die Betrachtung von Abbildung 6.8 zeigt, dass sich die

experimentell bestimmten Daten nicht vollständig durch einen einfachen,


linearen Zusammenhang beschreiben lassen Bei der Regression nach

Gleichung 6 31 wurden bewusst keine Ausreisser aus der Datenanalyse

ausgeschlossen, denn es sollte die Gültigkeit der Modellbeziehung für alle

betrachteten Individuen abgeklärt werden Aus diesem Grund sind auch

offensichtliche Extremwerte, denen möglicherweise mit den beobachteten

Parametern nicht erfassbare medizinische Faktoren zugrunde liegen, im

Regressionsmodel] mitberucksichtigt Dementsprechend fallt auch das

Resultat der Regressionsanalyse (Methode der kleinsten Fehlerquadrate)

aus, wie aus Abbildung 6 8 und Tabelle 6 7 entnommen werden kann Die

Messwerte tur das hier betrachtete Gesamtkollektiv von Probanden lassen

sich durch das nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate gefundene

lineare Modell nicht korrekt beschreiben Die Daten verlangen nach einer

anderen Regressionsmethode Einzelne Individuen üben eine sehr starke

Hebelwirkung auf die Regressionsgerade aus, was besonders deutlich für

das K+-Ion zutrifft Für die Betrachtung der Extrema als Ausreisser,

verursacht durch messtechnische oder experimentelle Fehler, lagen

innerhalb der erfassten klinischen Grossen keine Indizien vor Deshalb

wurden die entsprechenden Daten nicht aus dem Datensatz ausgeschlossen


Tabelle 6 7 Resultate aus der einfachen linearen Regressionsanalyse

(Methode der kleinsten Fehlerquadrate) nach Gleichung 6 31 (R"

Bestimmtheitsmass)

Ionj ß/ CONST R1

95%-Vertrauensbereich 95%-Vertrauensbereich

[xlO1]

Na+ 191 58 ± 81 06 0 750 ± 0 077 0218

K+ 30 11 ± 3165 0 904 ± 0 030 0 043

Ca,+ -16 25+ 7 70 0 966 ±0 016 0 182

Mg,+ 1071+ 436 0 950 ± 0 007 0 232

Für alle Ionen j wurde ein kleines Bestimmtheitsmass R1 gefunden, was

auch aus Abbildung 6 8 gut ersichtlich ist Für Kalium kann überhaupt

nicht mehr von einer Korrelation im Sinne des aufgestellten Modells

gesprochen werden Insbesondere ist auch das relative 95%-Vertrauens-

mtervall der Steigung für dieses Ion sehr gross und die Steigung deshalb

nicht mehr signifikant von Null verschieden Dafür verantwortlich sind

die auftretenden Extremwerte, wie aus Abbildung 6 8 sehr gut ersichtlich

ist Im Falle eines Ausschlusses der 4 Extrema (Quotient > 1 0 oder < 0 9)

verbessert sich das Bestimmtheitsmass auf einen Wert von 0 185 und ist

somit mit demjenigen von Ca,+ vergleichbar Ferner findet man eine

Steigung der Regressionsgerade, die nahezu derjenigen von Na+

entspricht Wie bereits erwähnt, fehlt für diese Ausreisserehmination aber

eine plausible Begründung Für die übrigen Elektrolyte Na+, Ca^+ und

Mg2+ sind keine grossen Unterschiede im Bestimmtheitsmass zu

beobachten Dieses Resultat überrascht insofern, als das Verhältnis von

cProbe un(j âqi

ûT ^ zweiwertigen Ionen stark vom


Komplexierungsgrad abhangt, der grossen Schwankungen unterliegt (vgl

Abb 6 5) Die negative Steigung für Ca2+ und Mg2+ lasst sich damit

begründen, dass die aktive Molalitat m*q' mit zunehmendem

Proteingehalt einer Probe durch Komplexierung verringert wird

Gleichzeitig fuhrt aber eine erhöhte Proteinkonzentration nach Gleichung

6 2 zu einem verminderten Wasseranted in der Probe

Aufgrund der erhaltenen Resultate wurde versucht, ein gegen

Extremwerte robusteres Regressionsmodell anzuwenden [67 68] Dabei

werden die Extrema mit einem geringeren Gewichtungsfaktor

berücksichtigt Die zugehörigen Daten sind in Tabelle 6 8

zusammengestellt

Tabelle 6 8 Resultate aus der robusten Regressionsanalyse (Methode nach

Huber [68]) nach Gleichung 6 31

Ionj ß./M CONST

95%-Vertrauensbereich 95%-Vertrauensbeieich

[xlO1]

Na+ 322 35 + 91 96 0 625 + 0 088

K+ 26 28 ± 49 48 0 907 + 0 047

Ca1+ -16 23 ± 9 37 0 966 ± 0 020

Mg2+ -14 57 ± 4 92 0 955 ± 0 008

Die Ähnlichkeit der Daten in Tabellen 6 7 und 6 8 belegt, dass mit dem

robusteren Regressionsverfahren mit Ausnahme tur das Natnumion

(geringere Unsicherheit in der Steigung der Regressionsgeraden) keine


signifikanten Verbesserungen gegenüber der Methode der kleinsten

Fehlerquadrate erzielt werden können

In einem weiteren Schritt wurde untersucht, ob das Modell verbessert

werden konnte, indem zusätzliche Parameter in die Betrachtung mit

einbezogen wurden Insbesondere war es interessant abzuklären ob das

Alter und das Geschlecht des Patienten sowie der medizinische Status

einen Einfluss auf das Resultat ausüben Dazu wurde das Modell folgen

dermassen erweitert

p,HU=CONST + ß(/,

( Pr obc \' J

mdL] t

+ ßSEX SEX + ßJAHR JAHR

(o M)V ij J

+ßzi Zl + ßZ2 Z2 + ßZ3 Z3 + E,

mit ßk Regressionskoeffizienten

SEX Indikatorvanable für das Geschlecht (l=mannlich,

2=weibhch)

JAHR Jahrgang des Probanden

Zn Indikatorvanable für den medizinischen Zustand

ZI l=Patienten vor der Dialyse 0=ubnge

Z2 l=Patienten nach der Dialyse 0=ubnge

Z3 l=Patienten mit Herzbeschwerden 0=ubnge

Die Variablen SEX und JAHR wurden mitberucksichtigt, da sich ihre

Häufigkeitsverteilungen innerhalb der verschiedenen Probandengruppen

stark unterschieden Da die Specimen nicht anaerob abgenommen und

gelagert werden konnten, traten Schwankungen im pH-Wert auf, die

keinen Zusammenhang mit dem medizinischen Status des Probanden

zeigten Daher wurde für die Betrachtung der zweiwertigen Ionen Ca2+

und Mg2+ mit einem pH-abhangigen, hohen Anteil an komplexierten

6 8 Abschätzung der Massenkonzentiation von Wasser 91

Kationen im Modell 6 32 als zusatzliche Variable der pH-Wert

berücksichtigt Anhand des Modells sollten Antworten auf die folgenden

Fragen gefunden werden

1 Welche Variablen haben einen signifikanten Einfluss auf das

Modell'

2 Lasst sich das Giundmodell nach Gleichung 6 31 durch

Berücksichtigung zusätzlicher Paiametei wesentlich verbessern7

Die Auswahl der signifikanten Koeffizienten erfolgte durch das Verfahren

dei Ruckwartsehmination Dabei wurden schrittweise die Variablen,

deien Koeffizienten den höchsten P-Wert (dient als Mass für die

statistische Unsicherheit) aufwiesen, aus dem Modell eliminiert Dieser

Votgang wurde solange wiederholt, bis sich das Bestimmtheitsmass R1

\on einem Schritt zum nächsten signifikant verschlechterte Die

statistische Analyse wurde wiederum mit dem gesamten Datensatz

(inklusive Extremwerte) durchgeführt Die entsprechenden Resultate

findet man in Tabellen 6 9 (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) und

6 10 (lobuste Regiession)

Sign

ifik

anz

statistische

für

95%-Wahrscheinhchkeitsbereichs

des

ausserhalb

liegt

ßkh

d05,

0>

P-Wert

a

331

0007

0±

945

016

±2

42

396

1±

04

234

4±

42

-8

Mg2+

420

0065

0±

902

019'

±9

67

809

2±

66

256

2±

87

-2

19

±2

291

41

9±

65

-17

Ca2+

342

0026

0±

907

015

±2

72

327

2±

73

-3

02a

2±

79

199a

26

±19

26

K+

467

0068

0±

770

094

1±

114

13

±2

49

-2

82

1+

07

261

71

±16

170

Na+

[xlO1]

[xlOj

[xlO

1][x

lO1]

[xlO1]

B95%-V

B95%-V

B95%-V

B95%-V

B95%-V

R1

CONST

ßpH

ßz,

ßz:

ßz,

ß„„,

Ionj

Vertrauensbereich)

BV

Bestimmtheitsmass,

(R2

32

6Gleichung

nach

Fehl

erqu

adra

te)

kleinsten

der

(Methode

Regr

essi

onsa

naly

seder

aus

Resultate

96

Tabelle

Signifikanz.

statistische

für

95%-Wahrscheinlichkeitsbereichs

des

ausserhalb

lieg

tßk

d.h.

0.05,

>P-Wert

a

±0.009

0.951

2.09

±2.94

1.99a

±1.84

5.27

±-12.85

Mg2+

0.070

±0.927

10.10"

+4.45

2.15

±2.62

2.75

±-3.54

2.33

±2.70

10.15

±-14.26

Ca2+

±0.078

0.911

±2.48

3.51

2.79

±-4.83

2.21a

±1.49

81.85a

±21.43

K+

0.099

±0.779

±2.15

4.07

2.34

±-2.96

1.95a

±1.69

103.60

±160.75

Na+

[xlO']

[xlO1]

[xlO1]

[xlO

1][xlO1]

95%-V.B.

95%-V.B.

95%-V.B.

95%-V.B.

95%-V.B.

CONST

ßpH

ßz,

ßZ2

ßz,

Vüm

Ionj

Vertrauensbereich).

(V.B

.:

6.32

Gleichung

nach

[68]

)Huber

nach

(Methode

Regression

sana

lyse

robusten

der

aus

Resultate

6.10:

Tabelle


Die Variablen SEX und JAHR trugen nicht signifikant zum Modell bei

und wurden in allen Fallen eliminiert Gegenüber dem einfachen Modell

nach Gleichung 6 31 erhalt man ein höheres Bestimmtheitsmass (Methode

der kleinsten Fehlerquadrate) Man stellt fest, dass die Parameter, die den

medizinischen Zustand des Probanden festlegen, ausser im Falle des Mg,+-

Ions bei Patienten nach der Hämodialyse, nicht eliminiert werden konnten

Dies weist darauf hin, dass der Zusammenhang zwischen dem Quotienten

aus ClProbe und fh*q' und der Massenkonzentration von Wasser in der

Regel vom Gesundheitszustand des Probanden abhangig ist, auch wenn

sich die Koeffizienten ßzl, ßZ2 und ßz1 nicht in allen Fallen signifikant von

Null unterscheiden Für die Ca*-Ionen wird das Modell für einzelne

Individuen zusätzlich durch den pH-Wert der Probe beeinflusst, allerdings

ist der Koeffizient ßpH gesamthaft betrachtet nicht signifikant von Null

verschieden

Auch beim erweiterten Modell lassen sich keine signifikanten Unter¬

schiede zwischen den Resultaten aus der Regressionsmethode der kleinsten

Fehlerquadrate und der robusten Regression feststellen Dies deutet darauf

hin, dass sich die zugrundeliegenden Daten auch nach der reduzierten

Gewichtung der Extremwerte nur teilweise durch einen linearen Zusam¬

menhang erklaren lassen

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich die einfache Quotienten-

Methode nach Gleichung 6 31 zur Abschätzung der Massenkonzentration

von Wasser aus dem Verhältnis von experimentellen Werten der totalen

Ionenkonzentration zur aktiven Molalität für Na*-Ionen in der Praxis nur

bedingt eignet Mit Ausnahme von K* unterscheiden sich die Resultate der

übrigen Elektrolyte aber nur unwesentlich von denjenigen für Na* Aus

diesem Grund kann man festhalten, dass sich das Modell, wie es für Na*

bereits angewendet wird, grundsatzlich auch auf andere Ionen übertragen

lasst Das höchste Bestimmtheitsmass wurde für die Ionen Na* und Mg2*

gefunden

6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 95

Für den zur Verfugung stehenden Datensatz konnte keines der ange¬

wandten linearen Regressionsmodelle den Zusammenhang zwischen der

Zielvanable p,H,° und der erklärenden Variable (Quotient von c,Probe und

m*q') mit einem Bestimmtheitsmass über 0 5 erklaren Extremwerte üben

eine grosse Hebelwirkung auf das Modell aus, die auch mit robusteren

Regressionsmethoden nicht verhindert werden kann Das Auftreten dieser

Extrema durch biologische Einflüsse kann nicht ausgeschlossen werden

Aus diesem Grund ist es nicht zulassig, die betroffenen Daten aus dem

Regressionsmodell auszuschhessen Mit dem erweiterten Modell nach

Gleichung 6 32 kann ein grosserer Anteil der Zusammenhange

beschrieben werden Aus praktischen Gründen kann aber nur mit dem

einfachen Modell nach Gleichung 6 31 gearbeitet werden Die zusatzlich

benotigten Parameter für das erweiterte Modell sind in der Praxis

üblicherweise nicht verfugbar

6.9. Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials

einer ISE-Messkette

In Kapitel 5 1 wurde eine kurze Einfuhrung in die Funktionsweise

der lonenselektiven Elektroden gegeben Dabei wurde darauf hinge¬

wiesen, dass neben dem Membranpotential EM, welches das lonenselektive

Verhalten und somit die interessierende Grosse repräsentiert, das Flussig-

keitspotential E, ebenfalls von der Probenzusammensetzung abhangt E, ist

abhangig von der Wahl des Bruckenelektrolyten der Referenzelektrode

Mit Hilfe der Gleichung von Henderson (Gl 5 4) wurde das Flussig-

keitspotential aus gemessenen freien Ionenkonzentrationen von Natrium,

Kalium, Calcium und Magnesium für die individuellen Plasmaproben bei

der Verwendung eines 1 mol L'Kahumchlond Bruckenelektrolyten

abgeschätzt Für Anionen wurde das Chlorid in den experimentell

bestimmten Mengen berücksichtigt, wahrend Bicarbonat und weitere


anorganische und organische Anionen naherungsv-eise durch Acetat

ersetzt wurden, da bei der Verwendung von Chlorid als alleinigem

Gegenanion zu hohe Potentialwerte erhalten werden Die Wahl fiel auf

das Acetat, weil es eine nahezu identische Beweglichkeit zum Bicarbonat

aufweist In Abbildung 6 9 findet man das Flussigkeitspotential

aufgetragen in Abhängigkeit der Probandengruppe Es unterscheidet sich

für alle pathologischen Falle signifikant von den Werten für gesunde

Probanden

-0 60 -

__^

-0 65-|

,

__^

> I I 1

£ -0 70- —I— I 1 | 1

^ -0 75 -

, ,

—'— '

L=^ _L_

-0 80- |

"0 85 4 , , 11

1

G VD ND HV

Abb 6 9 Nach der Formel von Henderson (Gl 5 4) experimentell abge¬

schätztes Flussigkeitspotential bei der Verwendung einer 1 mol L'KC1-

Losung als Bruckenelektrolyt, gegliedert nach Probandengruppen, T =

37 °C, (Darstellung analog zu Abb 6 2)v , ,.

Es ist sehr wichtig zu beachten, dass Variationen im Flussigkeitspotential

sowohl die Bestimmung von m]q' als auch von cProbet mit lonen-° i j i j

selektiven Elektroden gleichermassen beeinflussen Im Gegensatz zu der

im Abschnitt 6 6 diskutierten Problematik handelt es sich hier nicht um

einen Einflussfaktor, der von einer mathematischen Datentransformation

herrührt, sondern um ein physikalisches Phänomen

6 9 Probenbedingte Variationen des Flussigkeitspotentials einer ISE Messkette 97

Die Potentialbeitrage Ei wirken sich auf das Resultat einer potentio-

metnschen Elektrolytbestimmung aus, sofern der Messwert nicht

rechnerisch korrigiert wird, oder bei der Kalibration mitberucksichtigt

wird Wird mit einem Kalibrator gearbeitet, dessen Elektrolytzusammen¬

setzung den mittleren Aktivitäten (z B Mittelwert für gesunde

Probanden) einer physiologischen Probe entspricht, lasst sich der Einfluss

des Flussigkeitspotentials auf das Analysenresultat reduzieren Alternativ

kann die mit dem Sensor gemessene EMK auch um einen fixen Betrag

korrigiert werden, der beispielsweise dem Mittelwert des Flussigkeits¬

potentials in Proben gesunder Probanden entspricht Dennoch treten in

beiden Fallen flussigkeitspotentialbedingte Fehler e£) auf, die aus Ab¬

weichungen der Individualwerte einer Probe Eu vom Mittelwert Fjresultieren

e'J =10l s *(6 33)

s Steigung der Elektrodenfunktion [V]

Tabelle 6 11 gibt eine Übersicht über die zu erwartenden Fehlerbeitrage

nach erfolgter Korrektur der Messwerte um einen konstanten Betiag


Tabelle 6 11 Mittlere Flussigkeitspotentiale F, für die einzelnen Proban¬

dengruppen Mittlere, relative Fehlerbeitrage E/j,verursacht durch Va¬

riationen des Flussigkeitspotentials bei der Analyse einwertiger (z=l) und

zweiwertiger (z=2) Ionen unter Annahme theoretischer Elektrodenstei-

gungen, T=37 °C, Bruckenelektrolyt 1 mol L'KCl

Probanden¬ z, |e£|| K'lgruppe [mV] z=l

[%]

z=2

[%]

Gesunde Mittelwert -0 77 0 10 0 20

(n=36)95%-Intervall

-0 78

-0 76

0 08

0 12

0 16

0 24

Vor Mittelwert -0 68 0 33 0 67

Dialyse

(n=18)95%-Intervall

-0 71

-0 65

0 23

0 43

0 46

0 88

Nach Mittelwert -0 70 0 26 0 52

Dialyse

(n=13)95%-Intervall

-0 71

-0 69

021

031

0 41

0 63

Herzversagen Mittelwert -0 71 0 26 0 53

(n=14)95%-Intervall

-0 75

-0 67

0 15

0 37

031

0 75

Gesamt Mittelwert -0 73 0 20 041

(n=82)95%-Intervall

-0 74

-0 72

0 16

0 24

0 34

0 48

6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoren 99

Die Daten der letzten beiden Kolonnen in Tabelle 6 11 zeigen, dass sich

Fehlerbeitrage, die von der Variation des Flussigkeitspotentials her¬

rühren, zwar durch eine Korrektur minimieren, nicht aber vollständig

eliminieren lassen Eine Berücksichtigung der Individualwerte kommt aus

Gründen des experimentellen Aufwandes in der Regel nicht in Frage Im

allgemeinen kann festgehalten werden, dass im Falle der Elektrolyt¬

analytik mit lonenselektiven, potentiometnschen Sensoren beim Einsatz

von konventionellen Referenzelektroden das Flussigkeitspotential eine ge

nauigkeitslimitierende Grosse darstellt Dies trifft bei Direktmessungen zu

und wirkt sich auf die Bestimmung von m*ql und von côbefgleichermassen aus Im Falle vom Einsatz der ISE in stark verdünnten,

gepufferten Specimen sind hingegen kaum Auswirkungen auf die

Resultate von Gesamtkonzentrationsbestimmungen ClProbe zu erwarten

6.10. Direktmessungen mit optischen Sensoren

6 10 1 Einfluss des pH-Wertes auf die Messung mit optischen Sensoren

Der pH-Wert der Probe beeinflusst den mit optischen Sensoren

erhaltenen Messwert im Falle einer Elektrolytmessung in mehrfacher

Hinsicht Zum einen bestimmt der pH-Wert den Anteil an frei oder

komplex gebunden vorliegenden Ionen, da die bestimmenden Kom¬

plexierungsgleichgewichte allesamt pH-abhangig sind Diese Tatsache gilt

natürlich auch für die Elektrolytanalytik mit potentiometnschen Sensoren

und fallt besonders dann ins Gewicht, wenn keine anaerobe Proben¬

entnahme und Behandlung erfolgt In Analogie zu den ISE konnten daher

gegebenenfalls die gleichen empirischen Faktoren für die rechnerische

Korrektur des Analysenresultates auf einen physiologischen pH-Wert von

7 4 angewendet werden [61, 62]


Eine zweite Art der pH-Abhängigkeit ist spezifisch für den in dieser

Arbeit angewandten Typ von Optoden, wie er in Kapitel 5 2 eingeführt

wurde Da die kationenselektiven Austauschoptoden gemäss Gleichungen

5 14 und 5 15 stets auf das Verhältnis der Messionenaktivitat und der

Protonenaktivitat in der Probe ansprechen, ist für eine exakte

Bestimmung der Messionenaktivitat die genaue Kenntnis des pH-Wertes

erforderlich Diese Voraussetzung ist dann erfüllt, wenn der pH-Wert der

Probe entweder konstant und bekannt ist, durch Putferung konstant

gehalten wird, oder simultan mitgemessen wird Soll allerdings mit der

Optode die aktive Molalität des Analyten in der unverdünnten Probe

erfasst werden (Direktmessung), wäre eine Pufferung ohne nennenswerte

Verdünnung höchstens durch Zusatz einer geringen Menge einer hoch¬

konzentrierten Pufferlosung realisierbar Ferner konnte gezeigt werden

(vgl Abb 6 10), dass die Annahme eines konstanten pH-Wertes im Falle

von realen Plasmaproben, entnommen unter normalen Laborbedingungen,

verworfen werden muss Das Ausmass der Variationen des pH-Wertes

von 4 verschiedenen Probandengruppen ist in Abbildung 6 10 dargestellt

6 10 Direktmessungen mit optischen Sensoien 101

7.9-

7.8-_^

—I—|

7-7- I 1

X~ I ^, ,

a76-p=^ rz

7.5-

7 4-

1 I I I I

G VD ND HV

Abb 6 10 Gemessene pH Weite in Plasma gegliedeit nach Piobanden-

gruppen Bemeikung Keine anaciobe Piobeiibehandlung (.Daistellung

analog zu Abb 6 2)

Daiaus lassen sich nun mit Gleichungen 5 14 und 6 ^4 die pll mdu/ieiten

Messtehlei e1'" auf die Messung dci aktnen Molalität in1]1 des \nal\ten

abschätzen, die untei Annahme eines konstanten pH-Weites in det Ptobe

eihdlten winden

e^"=[.Ti;|,(pn)-rti;;l(pn1)]/ih;;,(pH1) & u)

hui den konslanten pH Weit winde dei Mitlclwcit hu gesunde

Piobanden eingesetzt Die Resultate sind in \bbildung b 1 I

zusaiiimeiigciasst

102 KLINISCHE IONENANALYTIK MIT CHFMISCHFN SENSOREN

^

100-

80-

60-

40-

20-

a)

300-

200-

100-

(b)

XCl

d

.±1

I I E —1 H 3

C7"T3 VD N D HV

1 i

G VD NDi i

HV

Abb 6 11 Durch pH-Variationen verursachte mittlere relative Messfehler

einer lonenselektiven Austauschoptode bei Annahme eines konstanten pH-

Wertes in der Ptobe tut einwertige Kationen (a) und für zweiwertige

Kationen (b)

Abbildung 6 11 belegt, dass beim Einsatz einer kationenselektnen Optode

für die Erfassung der aktiven Kationenmolahtat keinesfalls von einem

konstanten pH Wert in physiologischen Proben ausgegangen werden darf

Dabei wurden im Falle der zweiwertigen Ionen wie Ca2* und Mg1*

Messfehler bis zum Vierfachen des Messresultates erhalten

Als Losung für den Direkteinsatz von Optoden in der klinischen Probe

bleibt die simultane Miterfassung des pH-Wertes mit anschliessender

rechnerischer Korrektur der gemessenen aktiven Molalitat Dazu können

herkömmliche pH-Elektroden oder auch optische pH-Sensoren [69 73]

eingesetzt werden Wie bei Bakker [30] festgehalten, müssen jedoch sehr

hohe Anforderungen an die Genauigkeit der pH-Messung gestellt weiden

Um bei der Bestimmung der aktiven Molalitat eine Fehlergrenze von 1 %

nicht zu überschreiten, durfte die pH-Messung eine Unsicherheit von

höchstens 0 004 pH-Einheiten (für einwertige Ionen) aufweisen, was mit

heutigen Methoden kaum zu erreichen ist

6 10 Dnektmessungen mit optischen Sensoren 103

Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass Direktmessungen in

klinischen Proben mit Optoden basierend auf Ionenaustausch nicht die

geforderten Erwartungen erfüllen können Nur die Stabilisierung des pH-

Wertes der Probe in einem sehr engen Bereich wurde die optische Dnekt-

messung mit zufriedenstellender Sicherheit ermöglichen

6 10 2 Vorversuche zur Messung der freien Ionenkonzentration in

Vollblut

Ungeachtet der ungelösten Probleme der pH-Messung, wurde in

einigen Vorexperimenten untersucht, wie sich eine lonenselektive

Optodenmembran in Vollblut mit Heparin als Antikoagulans verhalt Als

Beispiel wurde ein calciumselektiver Sensor gewählt Dazu wurde die

ATR-Messtechnik mit einem planaren Reflexionselement in einer Durch-

flussmesszelle angewendet (siehe Kap 9 2 1) Von besonderem Interesse

war bei diesen Experimenten die Signalregeneration nach dem Kontakt

mit der Vollblutprobe Abbildung 6 12 zeigt, dass mit dem zur Verfugung

stehenden Messaufbau keine zufriedenstellende Regeneration des Mess¬

signals nach dem Blutkontakt erreicht werden konnte Dies musste

zumindest teilweise auf die verwendete Messzelle zurückgeführt werden,

die sich nicht für den Durchfluss viskoser Proben eignete und die keine

vollständige Spulung nach dem Blutkontakt gewährleistete Auch gelang es

nicht, wahrend der Messung im Vollblut stabile optische Signale zu

erhalten Vielmehr wurde über mehrere Messungen eine Zunahme der

Absorption für die Blutprobe beobachtet, obwohl sich der pH-Wert nicht

veränderte


1 14-

1 12-1

?c 1 10-1m

£l 08Hc

o

2 1 06c

UJ 1 04

1 084 1 081

K2K2

1 02 H

1 00

1 022

K3

1 106

K2

•*Blut

^J

1 015 1 017

0 20 40 60 80

Zeit / min

Abb 6 12 Ansprechverhalten eines optischen ATR-Ca+

Sensors der

Membranzusammensetzung M l' (ETH 1001, ETH 5350, NaTFPB, DOS /

PVC) in wassrigen Kahbrationslosungen (K2, K3, vgl Abschnitt 9 3)

sowie in Vollblut

fs wurden keine weiteren Experimente aul diesem Gebiet durchgeführt

Die Vorversuche haben gezeigt, dass im Vergleich zur Arbeit mit

verdünnten Proben [li] insbesondere in messtechnischen Belangen

grossere Anpassungen an bestehenden Systemen notwendig sind, die über

den Rahmen dieser Arbeit hinausgegangen waren

Mcmbr in/us immtnsct/ungcn siehe Anh tng I


6.11 .Schlussfolgerungen

Am Beispiel eines ausgewählten Kollektivs von 82 Probanden,

klassifiziert nach medizinischen Gesichtspunkten, wurde untersucht durch

welche Faktoren das Resultat einer klinischen Elektrolytanalyse mit einem

chemischen Sensor in der unverdünnten Probe beeinflusst wird Im

Vordergrund stand zum einen die Frage, welche Parameter mögliche

Fehlerquellen tur verfälschte Resultate darstellen und in welcher

Grossenordnung die daraus resultierenden Fehler liegen Zum anderen

wurde eine kritische Betrachtung der heute üblichen Praxis zur

Verarbeitung eines Sensor Rohsignals in eine klinisch interpretierbare

Grosse vorgenommen

Bedingt durch die physikalischen Gegebenheiten der Methode treten beim

Einsatz von lonenselektiven Elektroden in biologischen Proben

Unsicherheiten in der Messung auf, die vom Flussigkeitspotential Es

herrühren Diese sind aus messtechnischen Gründen nicht für jede

einzelne Probe erfassbar und die verursachten Unsicherheiten lassen sich

daher auch nicht vollständig rechnerisch kompensieren Eine teilweise

Korrektur ist möglich und sinnvoll und w.id heute bereits in direkt

messenden ISE Systemen angewendet

Bei der Verwendung von lonenselektiven Optoden ist man hingegen mit

einem anderen Problem, bedingt durch die Methode, konfrontiert Die

mit einer Optode gemessenen aktiven Molalitaten sind sehr stark vom pH-

Wert der Probe abhangig Die Annahme eines biologisch regulierten und

daher konstanten pH-Wertes muss verworfen werden Insbesondere bei

nicht anaerober Probenbehandlung, wie sie im Spital den Normalfall

darstellt, treten pH-Schwankungen auf, die eine rechnerische Kom¬

pensation mit einem konstanten Wert verunmoglichen Als Ausweg bleibt

die simultane Erfassung des pH-Wertes in jeder einzelnen Probe

Allerdings ist mit der heute verfugbaren Messtechnik eine pH-Messung


mit der erforderlichen Präzision von ± 0 004 pH-Einheiten nicht ohne

weiteres realisierbar, so dass eine nicht kompensierbare Unsicherheit der

Methode verbleibt Ferner besteht die Möglichkeit, durch Pufferung der

Probe den pH-Wert konstant zu halten Um aber der Forderung der un¬

verdünnten Probe nachzukommen, durfte dazu nur ein vernachlassigbar

kleines Volumen einer hochkonzentrierten Pufferlosung zugesetzt werden

Ein positiver Nebeneffekt wäre dabei die Stabilisierung der Ionenstarke,

so dass sich die relativ geringen klinischen Variationen nicht mehr in Än¬

derungen der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten äussern

wurden

In ersten Experimenten wurde versucht, Ca2+-Ionen mit einer Optode

direkt in Vollblut zu messen Probleme mit dem Transport der viskosen

Blutprobe in den engen Kanälen der ATR-Durchflussmesszelle führten

dazu, dass sich das optische Signal nach Blutkontakt nicht mehr ohne

weiteres regenerieren hess Für weitere Experimente auf diesem Gebiet

ist es daher wichtig, mit einem optimierten Messaufbau zu arbeiten Auch

ist eine Verkleinerung des Systems zur Reduktion der benotigten Blut¬

menge erforderlich

Ein lonenselektiver Sensor kann mit gemischten, wassrigen Elektrolyt¬

losungen auf der Basis von aktiven Molalitaten m*q kalibriert werden

Dazu ist die Kenntnis der molalen Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten X,

notwendig, die mit der Methode von Pitzer auch in gemischten Elektrolyt¬

losungen mit genügender Zuverlässigkeit abgeschätzt werden können

Dies fuhrt unter Berücksichtigung der zuvor genannten Parameter (Flus¬

sigkeitspotential, pH-Wert) zu Messwerten, die die biologisch relevante

aktive Molalität m'q' des Ions im wassrigen Anteil der unverdünnten

Probe korrekt wiedergeben

Der zusatzliche Schritt der rechnerischen Umwandlung der aktiven

Molalität in eine freie (molare) Ionenkonzentration clpJrobef oder gar die

totale (molare) Ionenkonzentration cProbe birgt aber unnötige Risiken,


wenn diese auf der Basis von gemittelten Umrechnungsfaktoren geschieht

Im Rahmen dieser Untersuchungen musste festgestellt werden, dass 17 %

(einwertige Ionen), respektive 37 % (zweiwertige Ionen) aller Mess¬

resultate durch den Umrechnungsvorgang in freie Ionenkonzentrationen

um mehr als 0 5 % verfälscht werden In dieser Zahl sind die analytischen

Fehler verursacht durch die Messmethode selbst (z B Änderungen des

Flussigkeitspotentials beim Einsatz von ISE) noch nicht enthalten

Probleme treten bei allen Patienten auf, die eine starke Abweichung der

Massenkonzentration von Wasser gegenüber normalen Personen zeigen,

verursacht durch erhöhte oder reduzierte Protein und Fettwerte im Blut

Innerhalb des untersuchten Patientenkollektivs sind besonders Patienten

nach erfolgter Hämodialyse oder Patienten mit Herzbeschwerden

betroffen Gerade in diesen Fallen wurde die wertvolle Information des

Sensor-Messwertes aufgrund der Interpretation einer molaren Ionen¬

konzentration, basierend auf falschen Annahmen, durch eine Daten¬

umrechnung verloren gehen oder ausgemittelt werden Eine teilweise

Transformation des Messwertes zu einer freien Molalität des Ions m^q'unter Verwendung mittlerer molaler Einzehonen-Aktivitatskoeffizienten

wäre für einwertige Ionen vertretbar, wenn auch vom klinischen

Standpunkt aus betrachtet nicht sinnvoll Die y zeigen verhältnismässig

kleine Variationen und werden vermutlich durch biologische Kontroll¬

mechanismen stark ausgeglichen Für die zweiwertigen Ionen Ca2+ und

Mg1+ ist diese Voraussetzung aber nicht erfüllt

Stehen in einem Labor zur Erfassung von Elektrolyten sowohl direkt¬

messende (unverdünnte Probe), wie auch indirekt arbeitende (verdünnte

Probe) chemische Sensorsysteme oder andere auf Gesamtkonzentrations-

messung basierende Analysatoren zur Verfugung, bietet sich die

Möglichkeit, durch Vergleiche der unabhängigen Messresultate über ein

lineares Regressionsmodell Rückschlüsse auf die Massenkonzentration von

Wasser anzustellen Dieses Verfahren lasst sich grundsätzlich auf die

Kationen Na\ K+, Ca2+ und Mg1+ anwenden Es vermag aber den


Zusammenhang zwischen der Massenkonzentration von Wasser und dem

Quotienten aus c,Probt' und m^' für die im Rahmen dieser Arbeit

untersuchten 82 Individuen in allen Fallen nur mit einem beschrankten

Bestimmtheitsmass unterhalb von 0 5 zu beschreiben

Berücksichtigt man die gesammelten Tatsachen, gelangt man zum Schluss,

dass Resultate aus Messungen mit chemischen Sensoren in unverdünnten

biologischen Proben unabhängig von anderen Methoden, beruhend auf

Gesamtkonzentrationsmessungen, behandelt und interpretiert werden

sollen, um den maximalen Grad an Information aus einer Analyse zu

erhalten Dazu ist es aber notwendig in den klinischen Laboratorien eine

unvertraute physikalische Grosse mit neuen Referenzintervallen einzu¬

fuhren Man kann darüber diskutieren, welcher Faktor das grossere

Risiko darstellt die Umrechnung der Messwerte im Versuch, Resultate

aus verschiedenen Messmethoden anzugleichen oder die Einfuhrung einer

neuen physikalischen Grosse, der aktiven Molalität m^ mit einem neuen,

zugehörigen Referenzintervall Sicher ist, dass mit der zunehmenden

Verbreitung von chemischen Sensoren in klinischen Routinelaboratonen

diese Diskussion weitergeführt werden muss Auf alle Falle sollte darauf

geachtet werden, dass die Anwender von Geraten, welche auf chemischen

Sensoren beruhen, über dieses Problem informiert werden und

demzufolge genügend sensibilisiert sind Der Nutzer muss sich der

Unterschiede zwischen den Messresultaten erhalten mit verschiedenen

Methoden bewusst sein Nur dann lasst sich sicherstellen, dass es nicht zu

medizinischen Fehlentscheidungen auf Grund falscher Annahmen kommt,

wie zum Beispiel im Fall der Pseudohyponatraemie

109

7. Optische Sensoren auf der Basis von NIR-Farbstoffen

7.1. Einführung in die Problemstellung

In den vergangenen fahren wurden in der Gruppe von Prof Simon

an der ETH Zürich die Grundlagen für verschiedene optische Sensoren,

basierend auf weichgemachten PVC-Flussigmembranen, entwickelt [74

78] In der Gruppe von PD LI Spichiger [79] wurde damit begonnen, mit

miniaturisierten optischen Systemen zu arbeiten Auch wurde die ATR-

Messtechnik für die optische Sensonk genutzt und Optoden für den

Einsatz in verdünnten biologischen Proben charakterisiert [35, 80, 81]

Erfahrungen mit ATR-Messungen auf planaren optischen Reflexions¬

elementen ermöglichten den Übergang zur Monomoden-Messtechnik für

die Vermessung von Optodenmembranen

Neue Messtechniken wie zum Beispiel die integrierte Optik ermöglichen

heute die Miniaturisierung von Optoden und erweitern dadurch das An¬

wendungsgebiet von optischen Sensoren Insbesondere wurden ver¬

schiedene Realisierungsmoglichkeiten für total integrierte optische Sen¬

soren (TIOS), bei welchen sowohl die Lichtquelle wie auch der Detektor

aus einem Material gefertigt sind, präsentiert [82, 83] Diese Module

eliminieren die Notwendigkeit externer Komponenten sowie deren

aufwendige Justierung und gestatten es, kleine, leichte und stabile Mess¬

plattformen zu fertigen Sie bieten sich für die Realisierung eines

Sensorarrays auf einem einzigen Chip mit einem hohen Potential zur

Serienproduktion an Als Materialien werden zum Beispiel III-V Halb¬

leiter verwendet Ein besonders leistungsfähiges Material ist die ternare

Verbindung AlxGa, xAs, deren Emissionswellenlange im Bereich von 750

bis 870 nm liegt und über die Zusammensetzung abgestimmt werden kann

[84] Aus diesem Grund wird für integrierte, optische Messtechniken der

nahe Infrarot Spektralbereich (NIR, Wellenlange A > 780 nm) als

Wellenlangenbereich bevorzugt Als weitere Vorteile des langwelligen

110 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR FARBSTOFFEN

Arbeitsbereiches sind die hohe Einkopplungseffizienz des Lichtes in den

Wellenleiter und die geringere spektrale Interferenz durch nicht

spezifische Absorptionen verursacht durch die Probe selbst zu nennen

[85]

Das Ziel der Arbeit war es, eine Anpassung der bisherigen optischen

Sensoren an die Anforderungen moderner Messtechnik vorzunehmen

Dazu war in erster Linie der Ersatz der bis anhin verwendeten Chromo¬

ionophore durch Indikatoren, die ihre maximale Absorption im NIR-

Bereich aufweisen, zu bewerkstelligen Parallel dazu ging es darum, in

interdisziplinarer Zusammenarbeit erste Versuche zum Einsatz von

Optodenmembranen auf einem integrierten Mach-Zehnder-Interferometer

als neuartige Messplattform zu demonstrieren

In einem ersten Schritt wurde eine Reihe von bekannten NIR-absor-

bierenden Farbstoffen untersucht Von Interesse waren ausgewählte

Beispiele von Polymethin Farbstoffen, insbesondere die Cyanine und die

Merocyamne Im Zentrum stand die Frage nach deren Eignung als

Chromoionophore in Optodenmembranen von der Art, wie sie im

Abschnitt 5 2 beschrieben wurden Dazu wurden die Farbstoffe in

Membranen mit verschiedenen chemischen und physikalischen Eigen¬

schaften und Zusammensetzungen charakterisiert Im weiteren erfolgte

dann in Optodenmembransystemen die Charakterisierung einer neuartigen

Verbindung Diese Art von Chromophor wurde zunächst im Rahmen der

Synthese einer bekannten Substanz isoliert und dann aufgrund seiner

speziellen optischen Eigenschaften genauer untersucht Dabei wurde

festgestellt, dass sich der Indikator nicht den Polymethin-Farbstoffen

zuordnen lasst

7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen

7.2. Optische Eigenschaften von Molekülen

Die optischen Eigenschaften von Molekülen und Ionen beruhen auf

ihrer Fähigkeit, elektromagnetische Strahlung innerhalb eines bestimmten

Wellenlangenbereiches absorbieren zu können Je nach Wellenlange (resp

Energie) der absorbierten Strahlung spricht man von nahem Ultraviolett

oder Ultraviolett (UV, 10 - 380 nm), vom sichtbaren Bereich (VIS, 380 -

780 nm) und von nahem Infrarot (NIR) oder Infrarot (IR, 780 - 500000

nm) [86] Der Mechanismus der Lichtabsorption ist in den ersten beiden

Fallen (UV und VIS) derselbe Wird die Resonanzbedingung für A£ nach

Gleichung 7 l erfüllt, so kommt es zur Absorption von elektro¬

magnetischer Strahlung der Frequenz v, respektive der Wellenlange A,

was zu wellenlangenabhangigen, elektronischen Spektren fuhrt Im Falle

des IR reicht jedoch die Energie in der Regel nicht aus, um Elektronen

anzuregen In diesem Fall fuhrt die Absorption der Strahlung zur

Anregung molekularer Vibrationen

AE = hv = — (7 1)A

mit A£ Energiedifferenz zwischen 2 Energieniveaus [J]

h Planck-Konstante [J s]

v Frequenz [s ']

c Lichtgeschwindigkeit [ms1]

A Wellenlange [m]

Ein Molekül im angeregten Zustand kann auf verschiedenen Wegen

wieder in den Grundzustand zurückkehren Grundsatzlich lasst sich die

strahlungsfreie Relaxation von der Relaxation unter Emission von elektro¬

magnetischer Strahlung unterscheiden Im letzteren Fall spricht man von

Fluoreszenz oder von Phosphoreszenz


Eine weitere bedeutsame optische Grosse im Rahmen der Sensonk ist der

Brechungsindex Der Brechungsindex und die Absorption von Licht in

einem bestimmten Medium sind gemäss den von Kramers und Kronig

hergeleiteten Relationen voneinander abhangig [87 88] Dann wird die

Dispersion (Brechungsindex) als Realteil und die Absorption als

Imaginarted der komplexen Suszeptibditat bezeichnet Mathematisch

können die beiden Grossen durch eine Founer-Transformation im

Hilbert-Raum ineinander überfuhrt werden [89] Dies gestattet unter

bestimmten Voraussetzungen die theoretische Abschätzung von Disper

sionsspektren aus gemessenen UV / VIS-Spektren

Für das Verständnis der chromophoren Systeme ist der Zusammenhang

zwischen der Struktur und den zugehörigen elektronischen Spektren von

Interesse An dieser Stelle sollen deshalb einige historisch besonders

wichtige Resultate zur theoretischen Behandlung von elektronischen

Spektren zusammengetragen werden

Nach Gleichung 7 1 lasst sich die Wellenlange der Absorption elektro

magnetischer Strahlung aus der Energiedifferenz der vom Übergang

betroffenen Zustande bestimmen Um also elektronische Spektren eines

Moleküls ausgehend von seiner chemischen Struktur verstehen zu können,

ist die Kenntnis der Energien der Grundzustande sowie elektronisch

angeregter Zustande notwendig Die elektronische Anregungsenergie

sowie die Ubergangswahrscheinlichkeit zwischen den Zustanden

beeinflussen die Lage und die Intensität der Absorptionsbanden

Molekulare Vibrationen im angeregten Zustand sind für die Form der

Banden bestimmend

Die ersten Versuche zur Interpretation von Absorptionsspektren stutzten

sich auf die Tatsache, dass für konjugierte Systeme langwellige

Absorptionsbanden beobachtet werden Daraus wurde geschlossen, dass

nur Elektronen, die in konjugierten Bindungen involviert sind, berück¬

sichtigt werden müssen Von der theoretischen Seite her betrachtet, war es

7 2 Optische Eigenschaften von Molekülen 113

die "valence bond" (VB) Theorie, die erstmals Zusammenhange zwischen

Absorptionsverhalten und Molekulstruktur von konjugierten Systemen zu

erklaren vermochte [90] Die VB-Theone verlor ihre Bedeutung mit dem

Aufkommen der Molekulorbitaltheone (MO) Als Spezialfall sei hier das

von Kuhn im Jahr 1948 entwickelte Modell des Elektronengases (free

electron model, FE-MO) erwähnt [91] Im einfachsten Fall werden dabei

die MO's durch Betrachtung von Elektronen in einem eindimensionalen

Kasten erhalten Die Lichtabsorption kommt durch die Anregung eines

Elektrons aus dem höchsten besetzten MO (HOMO) in das niedrigste,

unbesetzte MO (LUMO), die sog Grenzorbitale zustande Diese

Anregung ist verantwortlich für den Übergang niedrigster Energie, in der

Regel 7t—>7t* oder n—>tc* (n nichtbindendes Orbital) Damit hessen sich

auch für komplexere Moleküle erfolgreiche Abschatzungen vornehmen

Das FE-MO Modell wurde spater durch die auch heute noch

weitverbreitete Methode der Linearkombination von Atomorbitalen

(linear combination of atomic orbitals, LCAO-MO) und die daraus

abgeleitete Huckel Methode (HMO) für 7t-Elektronensysteme abgelost, die

sich beide leichter als Computerprozeduren implementieren hessen Auch

in diesen Methoden wird der Elektronenubergang mit geringster Energie¬

differenz zwischen Grenzorbitalen postuliert Der schwerwiegendste

Nachteil der HMO-Methode ist allerdings die totale Vernachlässigung von

Elektron-Elektron Wechselwirkungen Ferner wird nicht berücksichtigt,

dass für die Absorption von elektromagnetischer Strahlung nicht nur die

Lage der Energieniveaus des Grundzustandes eines Moleküls von

Bedeutung ist, sondern dass auch elektronisch angeregte Zustande eine

wichtige Rolle spielen Ferner wird die Energie eines Molekulorbitals

nicht nur durch eine einzige Elektronenkonfiguration, wie im HMO und

im FE-MO-Modell angenommen, bestimmt Wechselwirkungen zwischen

verschiedenen Elektronenkonfigurationen sind entscheidend Dieser

Gedanke bildete den Grundstein für die Entwicklung der sog Pariser-


Parr-Pople (PPP) Methode [92-94] Wechselwirkungen zwischen

Elektronen und zwischen verschiedenen Elektronenkonfigurationen

(configuration interaction, Cl) werden mitberucksichtigt Weil die

Wellenfunktionen verschiedener angeregter Zustande kombiniert werden

können, wird jeder elektronische Übergang durch mehrere elektronische

Anregungen zwischen besetzten und unbesetzten Orbitalen interpretiert

Mit dieser Methode lassen sich recht zuverlässige Voraussagen über die

Lage von Absorptionsbanden machen

7.3. Chromoionophore für Optodenmembranen

Wie in Kapitel 5 2 dargestellt, erfolgt die Signalumwandlung von

der molekularen Erkennung in eine optisch erfassbare Messgrosse bei den

hier betrachteten optischen Sensoren mit Hilfe des Chromoionophors Zu

diesem Zweck eignet sich grundsatzlich jede Verbindung, die unter

Änderung ihrer optischen Eigenschaften in der Lage ist, eine selektive

und reversible Wechselwirkung (Komplexierung, Reaktion) mit einem

Analyten einzugehen In Austausch- oder Koextraktionssystemen steht der

Chromoionophor C in Verbindung mit einem zweiten Ionophor L (siehe

auch Abb 5 2), der in der Regel selbst keinen Beitrag zum optischen

Messsignal liefert In allen im folgenden betrachteten Fallen wird für den

Chromoionophor ein H+-selektiver Ligand (pH-Indikator) verwendet, der

durch Protonierung oder Deprotonierung seine optischen Eigenschaften

verändert Das Wasserstoff-Ion unterscheidet sich chemisch sehr stark von

Metalhonen, so dass in der Regel keine Selektivitatsprobleme anzutreffen

sind In Austauschsystemen erfolgt ein Austausch von Protonen gegen

Kationen aus der Probe unter Beibehaltung der Elektroneutrahtat der

7 3 Chromoionophore für Optodenmembranen 115

Membran Nur der Chromoionophor ändert bei diesem Vorgang seine

optischen Eigenschaften

Im folgenden sollen die Anforderungen an einen Chromoionophor für

Optoden basierend auf Ionenaustausch oder Ionenkoextraktion etwas

detaillierter beleuchtet werden Der ideale Chromoionophor sollte für die

oben genannten Anwendungen möglichst viele der unten aufgelisteten

Bedingungen erfüllen

- pH-gekoppelte optische Eigenschaften

- Hohe Selektivität für Protonen gegenüber anderen Metallkationen

- An die Stabihtatskonstante des Ionophor-Analyt-Komplexes und die

Probe angepasste Basizitat, um die Reversibilität zu gewahrleisten

- An das verwendete Messsystem angepasster Wellenlangenbereich, in

dem die optischen Eigenschaften messbar sind

- Photochemische Stabilität im Hinblick auf eine lange Lebensdauer der

Sensormembran

- Hohe Lipophihe um eine gute Loslichkeit in der organischen

Membranphase zu garantieren und somit ein Auswaschen in die

wassnge Probephase zu verhindern oder

- Möglichkeit zur Immobilisierung (kovalent, ionisch) an die

Membranmatiix

- Genugende Mobilität in der Membranphase, um die Ansprechzeiten des

Sensors kurz zu halten

Die hier aufgelisteten Anforderungen sind unabhängig von dem gewählten

Messmodus für den optischen Sensor Im folgenden wurden aber im

Rahmen dieser Arbeit alle Farbstoffe im Absorptionsmodus

charakterisiert Auf Fluoreszenzfarbstoffe wird deshalb nicht weiter

eingegangen


Als besonders kritisch für die Eignung als Chromoionophor erweist sich

die Basizitat des Indikators Wie aus Gleichung 5 9 ersichtlich ist, geht die

Aciditatskonstante Ä"a des Chromoionophors in der Membranphase in die

Austauschkonstante Kex'h ein Zusammen mit dem pH-Wert der

Probelosung wird somit der dynamische Ansprechbereich des Sensors

festgelegt In Abbildung 7 1 ist als Beispiel der Einfluss der Basizitat des

Chromoionophors auf den Messbereich einer Ca+-selektiven Optode im

physiologischen pH-Bereich, berechnet nach Gleichungen 5 9 und 5 14,

dargestellt

08

0.6-

0.4-

0.2

-12 -10 -8 -6 -4

'09 (aCa**)

0

Abb 7 1 Berechnete Ansprechkurven einer Ca2+-Optode mit lonophor

ETH 1001 [78] bei der Verwendung von Chromoionophoren mit unter¬

schiedlicher Basizitat in einer Probelosung mit pH 7 60 (+) ETH 5294

(pK=12 0), (O) ETH 5350 (pK=13 4) und (D) ETH 2430 (pK=13 7)

[32] Der Ausdruck 1-a beschreibt den Protonierungsgrad des

Chromoionophors (siehe Gl 5 13)

7 3 Chtomoionophore für Optodenmembranen 117

Die Wahl des Indikators erlaubt demzufolge eine flexible Anpassung des

Messbereichs an die zu untersuchende Probe, solange die Auswahl

zwischen Chromoionophoren verschiedener Basizitat besteht Als Alter¬

native besteht die Möglichkeit den pH Wert durch Pufferung anzupassen

Allerdings werden dem pH-Bereich durch die Eigenschaften des Analyten

oft enge Grenzen gesetzt (z B Ausfallung des Analytkations mit

Hydroxidionen) Schliesslich lasst sich die Austauschkonstante Kex*h noch

durch die Wahl eines Liganden mit unterschiedlicher Brutto¬

stabihtatskonstante ßlL verandern Aus Gründen der Selektivität ist dies

allerdings nur sehr selten realisierbar, da in der Regel nicht verschiedene

Liganden mit optimierter Selektivität für den Analyten zur Verfugung

stehen Die Basizitat des Chromoionophors ist also auf jeden Fall sehr

wichtig

Mit bekannten Aciditatskonstanten für die Chromoionophore K^ und den

Austauschkonstanten KeJh für ein bekanntes Optodensystem, lassen sich

nach Gleichung 5 9 die Austauschkonstanten für Chromoionophore mit

beliebiger Basizitat abschätzen Daraus wiederum, erhalt man nach

Gleichung 5 14 die theoretischen Ansprechfunktionen der Optoden Das

erlaubt es, den in Abbildung 7 2 dargestellten pH-Bereich zu ermitteln, in

dem die Kationen Na+, K+ und Ca1+ in physiologischen Konzentrationen

erfasst werden können Der Messbereich wurde so angegeben, dass die

mittlere physiologische freie Ionenkonzentration des jeweiligen Ions (in

der unverdünnten Probe) innerhalb des linearen Ansprechbereichs des

optischen Sensors liegt und mit maximaler Empfindlichkeit erfasst werden

kann Als Grundlage für die Berechnung dienten die Kenngrossen von

bekannten Kationentauscher-Optoden für die betrachteten Ionen, die in

der Gruppe von Prof W Simon entwickelt worden waren [31, 78, 95]

118 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BASIS VON NIR-FARBSTOFFEN

9-i

8-

7-

«D6-

.O

3-

2-

1-

4 6 8 10 12 14

pKg (Chromoionophor)

Abb. 7.2: Möglicher Messbereich (pH) in Abhängigkeit des pKa-Wertes

des Chromoionophors für die Erfassung von Ca2+ (lonophor: ETH 1001),

Na+ (lonophor: ETH 4120) und K+ (lonophor: Valinomycin) in physio¬

logischen Konzentrationen (freie Ionenkonzentrationen) mit einer Optode.

Im speziellen markiert der horizontale Balken den physiologischen pH-

Wert von 7.4, der für Direktmessungen relevant ist.

Bis heute werden als Chromoionophore für Optoden basierend auf Ab¬

sorptionsmessungen in vielen Fällen Derivate des basischen Benzo-

phenoxazin-Farbstoffs Nilblau eingesetzt (vgl. Abb. 7.4). Diese wurden in

der Gruppe von Prof. Simon entwickelt [32]. Die einzelnen Chromo¬

ionophore unterscheiden sich lediglich sowohl im Aufbau als auch in der

Länge ihrer Seitenketten am Imin-Stickstoff. Aus diesem Grund liegen

auch die Absorptionsmaxima in einem relativ engen spektralen Bereich

von 600 bis 650 nm für die protonierten Spezies und 500 bis 550 nm für

7 4 NIR-absorbierende Farbstoffe 119

die deprotonierten Spezies (gemessen in Methanol) [32] Die Seitenkette

beeinflusst das Absorptionsverhalten nur marginal, da sie in den meisten

Fallen keine chromophoren Gruppen enthalt, die in Resonanz¬

wechselwirkung mit dem n-Elektronensystem des Farbstoffgrundgerustes

stehen Hingegen übt die Seitenkette einen Einfluss auf die Lipophihe und

die Basizitat des Farbstoffes aus Die pKa-Werte für die Nilblaudenvate

liegen in DOS-weichgemachten PVC-Membranen zwischen 9 0 und 14 0

Der grosse Basizitatsbereich der Indikatoren gestattet eine flexible

Anpassung des Sensorarbeitsbereichs an die Probe

Für die Entwicklung von neuartigen Chromoionophoren wäre es aus

diesem Grund ein grosser Vorteil, wenn ausgehend von einem Grund

gerust, das den Chromophoren enthalt, in Analogie zu den Nilblau-

denvaten durch flexible Variation von Seitenketten die Basizitat resp

Aciditat der Verbindung kontrolliert werden konnte

7.4. NIR-absorbierende Farbstoffe

7 4 1 Allgemeines

In einer ersten Phase wurde nach Farbstoffen gesucht, die ihr

Absorptionsverhalten im NIR-Spektralbereich in Abhängigkeit des pH-

Wertes der Umgebung verandern Zunächst wurden bekannte Verbin¬

dungen mit einem Absorptionsmaximum im NIR-Bereich erfasst Dazu

standen verschiedene Standard-Literaturwerke zu den Themen Farbstoffe,

Indikatoren und Laserfarbstoffe zur Verfugung [96 101] Da die Ab-

sorpüonsmaxima dieser Verbindungen ausserhalb des für das menschliche

Auge sichtbaren Bereichs liegen, begann sich die Forschung erst in

jüngerer Zeit mit den NIR-Farbstoffen zu beschäftigen Für die

Anwendung in der klassischen Farbstoffchemie (Textdfarbung, Indi¬

katoren, Farbreagenzien etc) waren diese Substanzen nicht interessant


Erst mit dem Aufkommen der modernen Farbphotographie, der Laser¬

technik, der optischen Speichermedien sowie der Farblaserdrucker und

kopierer begann das Interesse an dieser Klasse von Farbstoffen zu steigen

[102 105] Noch spater begann man sich aus der Sicht der analytischen

Chemie mit NIR-Chromophoren zu beschäftigen, wie die folgenden

Literaturstellen zeigen [106-112] Aus diesem Grund ist es nicht

erstaunlich, dass es bis heute keine kommerziell erhältlichen NIR-pH-

Indikatoren gibt, obwohl die Forschung auf diesem Gebiet, stimuliert

durch Entwicklungen auf dem Gebiet der Sensoitechnologte, einen

Aufschwung erlebt hat

7 4 2 Polymetfnn-Farbstoffe

Die wohl bekanntesten im NIR-Bereich absorbierenden Farbstoffe

gehören der Klasse der Polymethine an Sie zeichnen sich durch eine

zusammenhangende Kette von Methingruppen (-CH=), d h durch ein

System von konjugierten Doppelbindungen aus Im Gegensatz zu den

Polyenen, endet im Falle der Polymethine die Kette konjugierter Doppel¬

bindungen mit einem Elektronendonor und einem Elektronenakzeptor, die

beide die notwendigen Energiequanten zur elektronischen Anregung des

Moleküls beeinflussen Ferner weisen die Polymethine im Kontrast zu den

Polyenen gleiche Bindungslangen über alle konjugierten Bindungen auf

Die Polymethin-Farbstoffe lassen sich in folgende Untergruppen

aufgliedern (vgl Tabelle 7 1) [99, 113]


Tabelle 7 1 Untergruppen von Polymethin-Farbstoffen und deren

allgemeine Darstellung

Gruppe Allgemeine Formel

Cyanin

Hemicyanin

Streptocyanin

Oxonol

Merocyanin

Ein Polymethin-Farbstoff mit N 7t-Zentren (N ist immer ungeradzahlig)

entlang der konjugierten Kette enthalt somit N-2 Methinzentren und N+l

7t-Elektronen Die ungeradzahlige Anzahl an Zentren im 7t-System hat zur

Folge, dass das höchste besetzte Molekulorbital ein nichtbindendes Orbital

(n-Orbital) ist Dadurch weist das HOMO für einen Polymethin-Farbstoff

eine höhere Energie auf, als in einem Chromophor von ahnlicher Grosse,

aber mit geradzahliger Anzahl konjugierter Zentren Die Folge davon ist


eine geringere Energiedifferenz zwischen HOMO und LUMO (n—>n*)

und damit eine langwelligere Absorptionsbande Die scharfe Form der

Absorptionsbanden lasst sich durch die geringe Änderung der

Bindungslange bei der Anregung erklaren [114] Die Absorptions-

wellenlange nimmt mit zunehmender Anzahl an C-C-Doppelbindungen zu

Für symmetrische Polymethine kann als Faustregel von einer batho

chromen Verschiebung von 100 nm pro zusätzliche Doppelbindung

ausgegangen werden, weshalb man von der sogenannten "Vinylen-

Verschiebung" spricht Durch Substitution von Methingruppen innerhalb

der Kette konjugierter Doppelbindungen oder durch das Einfuhren von

externen Substituenten an den Methingruppen lassen sich spektrale

Verschiebungen der intensivsten Absorptionsbande realisieren, wie durch

Storungsrechnung gezeigt werden konnte [115] Die Auswirkungen auf die

Absorptionsspektren sind in Abbildung 7 3 dargestellt [113]

1 2 3

X — CH — CH — CH — — CH — X

Subst von CH durch Heteroatom

Element höherer Elektroneg bath hyps bath

Element geringerer Elektroneg hyps bath hyps

Externe Seitenkette

Akzeptor bath hyps bath

Donor hyps bath hyps

Abb 7 3 Einfluss von Substituenten auf die spektralen Eigenschaften von

Polymethin-Farbstoffen


Es ist zu beachten, dass auch die bisher als Chromoionophore verwen¬

deten Nilblauderivate formal den Polymethin-Farbstoffen zugerechnet

werden können, da sie einen Polymethin-Subchromophor enthalten, wie in

Abbildung 7 4 dargestellt ist

Abb 7 4 Polymethin-Sub¬

chromophor innerhalb des

Nilblaumolekuls 11 (N) jt-

Zentren, 12 (N+l) n-

Elektronen, 9 (N-2)

"Methinzentren"

In der Tat können beinahe alle wahrend dieser Arbeit verwendeten NIR-

Farbstoffe formal der Klasse der Polymethine zugeordnet werden Die

Ausnahme bilden die in Kapitel 7 7 beschriebenen reduzierten

Dicyanovinyl-Farbstoffe, die einer eigenen, neuen Farbstoffklasse

angehören

Neben der Anzahl an konjugierten Doppelbindungen, sind es die Eigen

schatten der Donor- und Akzeptorgruppen, die das Absorptionsverhalten

der Polymethine bestimmen In der Regel können aus Gründen der

Stabilität sowie der zunehmenden Tendenz zur cis-trans Isomensierung

oder zur Aggregatbddung, die konjugierten Ketten nicht beliebig

verlängert werden, um die Lage der Absorptionsbanden in den NIR-

Bereich zu verschieben Als Alternativen bleiben die interne und externe

Substitution der Methinzentren (vgl Abb 7 3) und die Verstärkung des

Donor-Effektes von elektronenspendenden Gruppen und des Akzeptor-

Effektes von elektronenziehenden Gruppen Als zwei ausgewählte

Beispiele für besonders effiziente, elektrisch neutrale Elektronen-

Akzeptoren seien hier die mehrfach Cyano-substituierten Systeme


(Abb 7 5 A) genannt (vgl auch Kapitel 7 6) Auf der Seite der

Elektronen-Donoren wird das Dihydropenmidin-System (Abb 7 5 B) als

ein Beispiel aufgeführt (vgl Kapitel 7 6)

A

Abb 7 5 Zwei Beispiele für

(B)

7.5. Cyanine und Streptocyanine als Chromoionophore

7 5 1 Ausgangslage

In Abbildung 7 6 findet man die Konstitutionen von 3 ver¬

schiedenen, typischen Cyanin Farbstoffen, die alle in der Literatur bereits

beschrieben sind Die Verbindungen IR-125 (A) und HITC+ (B) sind als

Farbstoffe für den Einsatz in Farbstofflasern auf dem Markt, wahrend die

Verbindung pHCOOH+ (C) von Patonay und Mitarbeitern beschrieben

wurde [116] Im weiteren findet man die Molekulstrukturen von zwei

ebenfalls bekannten Streptocyamn-Farbstoffen Es handelt sich um den

Farbstoff PDC+ (D) [117, 118] sowie den Croconium-Farbstoff (E) [119

120] Die vollständigen Namen der Verbindungen findet man in Kapitel

96

B

effiziente Akzeptor- (A) und Donorsysteme


S03Na S03

Abb. 7.6: Untersuchte Cyanin-Farbstoffe: A IR-125; B HITC+ und C

pHCOOH+ sowie Streptocyanin-Verbindungen D PDC+ und E

Croconium-Farbstoff.


Mit Ausnahme der Verbindungen A und E handelt es sich in allen Fällen

um kationische Farbstoffe, die als Salze mit einem zusätzlichen Anion

vorliegen. IR-125 (A) und der Croconium-Farbstoff (E) dagegen, liegen

als Zwitterion gesamthaft elektrisch neutral vor. Diese Tatsache ist von

Bedeutung, da die Löslichkeit der Substanzen in apolaren Medien dadurch

beeinflusst wird. Tabelle 7.2 gibt eine Zusammenstellung der optischen

Eigenschaften der Farbstoffe A-E in Lösung.

Tabelle 7.2: Optische Eigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption

Ä.max, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient £max) von Cyanin- und

Streptocyanin-Farbstoffen in Lösung1.

Farbstoff IR-125 HITC+ pHCOOH+ PDC+ Croconium

(A) (B) (C) (D) (E)

A.max 787a 743a 802" 786a 820a

[nm]

emax 192000a 247000a 143000" 102000a n.b.1-

[L mol' cm ']

a

Lösungsmittel: Ethanol

h

Lösungsmittel: Methanol

'

nicht bestimmt; ungenügende Stabilität

Es stellte sich die Frage, inwiefern diese Farbstoffe als pH-Indikatoren

eingesetzt werden können und wo ihre pKa-Werte liegen. Herz charak¬

terisierte eine Reihe von symmetrischen Cyanin-Farbstoffen mittels

spektrophotometrischer pH-Titrationen in Wasser und untersuchte die

1Die Angaben beliehen sich auf die intensivste Absorptionsbande unabhängig davon, in welchem

Protonierungszusland der Indikator vorliegt


Einflüsse von Methinkettenlange und Substituenten auf die Aciditat der

Indikatoren [121] Mazzucato, Scheibe und andere Autoren stellten fest,

dass die pH-Abhängigkeit der Absorptionsspektren von Verbindungen wie

A, B und D durch einen Unterbiuch der Resonanz über das konjugierte

7t-System entlang der Methinkette verursacht wird Dieser Unterbruch

wird verursacht durch Protonierung eines Stickstoffzentrums oder eines

Methinzentrums [122 127], was zu einem Verlust der langwelligen

Absorptionsbande fuhrt In Analogie kann auch ein nukleophiler Angriff

des OH -Ions im stark alkalischen Milieu zu einem Unterbruch des

konjugierten 71-Systems fuhren, wie beispielsweise in [128] postuliert wird

Die Farbstoffe C und E weisen zusatzliche acide, respektive basische

Gruppen auf, die den pKa der Indikatoren bestimmen und die spektralen

Eigenschaften über das konjugierte n-System des Farbstoffs beeinflussen

Grummt et al zweifelten diese Erklärung für den Indikator C allerdings

an, mit der Begründung, dass der beobachtete Effekt auf die

Absorptionsspektren zu stark sei, um alleine vom protolytischen Einfluss

auf die endstandigen Carboxylatgruppen herzurühren [129]

7 5 2 Stabilität der Farbstoffe

Eine wichtige Voraussetzung für die Eignung eines Farbstoffs als

Chromoionophor ist seine Stabilität Rasches Ausbleichen durch Lichtein

Strahlung oder hohe chemische Empfindlichkeit gegenüber einer che¬

mischen Spezies schranken den Nutzen der Verbindung stark ein Zur

Abklärung wurde die Reversibilität von Protonierung und Depro¬

tonierung der Indikatoren sowie die Signalstabditat in alkoholischer

Losung und in verschiedenen Membranzusammensetzungen spektros¬

kopisch untersucht Dabei musste festgestellt werden, dass lediglich die

Verbindung PDC+ (D) die gestellten Anforderungen zu erfüllen ver¬

mochte In diesem Fall konnten in methanohschen Pufferlosungen über

einen weiten pH-Bereich (mit Ausnahme des stark alkalischen Bereiches)


stabile, optische Signale beobachtet werden Für den Indikator pHCOOH+

(C) wurden im neutralen und alkalischen Bereich stabile Signale

beobachtet, bei tieferen pH-Werten (< pH 4 0) jedoch, erfolgte eine rasche

Abnahme der Absorptionsbande im NIR-Spektralbereich Eine chemische

Reaktion des Farbstoffes mit Komponenten der methanolischen Puffer¬

lösungen im sauren Bereich konnte nicht ausgeschlossen werden Eine

saurekatalysierte Veresterung der Carbonsaurereste schien möglich In

wassrigen Pufferlösungen wurden keine vergleichbaren Signalverluste im

sauren Bereich festgestellt Die chemische Stabilität des Indikators war

also sehr stark von der chemischen Umgebung abhangig Allgemein kann

festgehalten werden, dass das Vorhandensein von reaktiven funktionellen

Gruppen im Farbstoffmolekul die Gefahr der unerwünschten chemischen

Umwandlung durch Reaktion mit Puffer- oder Membrankomponenten

erhöht Für die übrigen Farbstoffe dieser Gruppe wurden jeweils Signal¬

verluste oder nur ungenügende Reversibilität bei wiederholter

Protonierung oder Deprotonierung beobachtet Ein Grund für das

beobachtete Verhalten der Indikatoren A und B konnte die bekannte

Abnahme der Stabilität mit Zunahme der Lange der Methinketten sein,

wie sie von Gnffiths beschrieben wurde [105] Der Croconium-Farbstoff

(E) zeigte bei Kontakt mit Lauge in ethanolischer Losung oder in einer

weichgemachten PVC-Membran einen irreversiblen Verlust der NIR-

Absorption bei gleichzeitigem Auftreten eines neuen Absorptionspeaks im

sichtbaren Bereich

Aufgrund der gemachten Beobachtungen zur Stabilität, sowie zusätzlichen

Problemen wie geringer Loslichkeit, wurde entschieden, die

Verbindungen A, B und E im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter zu

charakterisieren


7 5 3 Geeignete Membranmedien

Aufgrund ihres kationischen Charakters hessen sich die Indikatoren

A, B, C und D nicht muhelos in weichgemachten PVC-Membranen losen

Daher wurden andere Polymere, die bisher nicht für den in Kapitel 5 2

beschriebenen Typ von optischen Sensoren verwendet wurden, in die

Untersuchungen miteinbezogen Es war offensichtlich, dass für die

geladenen Farbstotfmolekule Membranmedien mit relativ hoher Polarität

notwendig sein wurden, um eine genugende Loslichkeit zu erhalten Bei

der Verwendung von weichgemachten PVC-Membranen lasst sich die

Polarität der resultierenden Sensorschicht durch die Wahl des Weich¬

machers beeinflussen [130] Für eine Erhöhung der Polarität der

Polymermatrix selbst wurde schon in anderen Arbeiten partiell

hydroxyhertes PVC (OH-PVC) eingesetzt [131] Dadurch blieben die

meisten Eigenschaften des Poly(vinylchlond)-Systems unter gleichzeitiger

Erhöhung der Membranpolantat erhalten Zusatzlich bleibt die

Möglichkeit der Wahl verschiedener Weichmacher In seltenen Fallen

wurde auch die Verwendung von Amino-PVC (PVC-NH,) als Matrix für

Flussigmembranen beschrieben Aufgrund der freien Aminogruppe kann

diese Matrix je nach pH-Wert als neutrales oder kationisches Polymer

betrachtet werden Es zeigt in Abhängigkeit des Weichmachers in einem

pH-Bereich zwischen 4 und 11 eine lineare potentiometnsche Ansprech¬

funktion gegenüber Protonen [132] Noch einen Schritt weiter geht die

Veiwendung von Polymeren, die über den gesamten interessierenden pH-

Bereich elektrisch geladen vorliegen Dazu zahlt beispielsweise auch das

in Ionentauschermembranen eingesetzte Polymer mit dem Handelsnamen

Nafion Es handelt sich dabei um ein perfluorosulfoniertes Polymer Die

chemische Struktur ist in Abbildung 7 7 wiedergegeben Der Gehalt an

Sulfonsaureresten, der die Anzahl ionischer Ladungen im Polymer

festlegt, wurde mittels Titration zu 0 9 mmol SOj / g Polymer bestimmt

[133] Ein Nachteil dieses Materials ist die geringe Loslichkeit in den


meisten Losungsmitteln Daher werden in der Regel im Handel

gebrauchsfertige Membranen oder mit speziellen Verfahren hergestellte

Losungen angeboten, die jedoch den Anwendungsrahmen sehr

einschranken

Abb 7 7 Chemische Struktur des

perfluorosulfonierten Polymers

Nafion [133]

-[(CF2CF2)mCFCF2]n

f2CFCF3

O

I

CF2CF2S03H

7 5 4 pH-empfindliche Optoden basierend auf Nafion-Membranen

Die Verwendung des Ionentauscher-Polymers Nafion kombiniert

ein sehr polares Membranmedium mit immobilisierten anionischen

Zentren Dadurch kann zum einen die Loslichkeit kationischer Farbstoffe

durch Bildung von Ionenpaaren verbessert werden Zum anderen steht ein

Kationentauscher in der Membranphase zur Verfugung, der es gestattet,

Optoden beruhend auf dem Ionenaustauschpnnzip zu realisieren Es

wurde dadurch möglich, optische Sensormembranen basierend auf

kationischen pH-Indikatoren, die reproduzierbar und reversibel auf pH-

Anderungen der Probelosung ansprechen, zu realisieren Patonay und

Mitarbeiter beschreiben einen pH-Sensor aus Nafion mit pHCOOH+ (C)

als immobilisiertem pH-Indikator [69] In dieser Arbeit wurde das gleiche

Prinzip neben pHCOOH+ auf den Farbstoff PDC+ (D) angewendet und in

ein optisches Durchflusssystem implementiert [133] Dies gestattete die

Untersuchung des Ansprechverhaltens und der Stabilität des Systems bei


kontinuierlichem Betneb Auch konnten die Signalverluste durch Aus¬

waschen der Indikatoren erfasst werden Für beide untersuchten Farb¬

stoffe traten keinerlei Loshchkeitsprobleme in der polaren Nafion-Umge-

bung auf Die resultierenden Membranen waren auch nach dem Ver¬

dunsten des Losungsmittels vollständig transparent Abbildung 7 8 zeigt

die Absorptionsspektren, die mit einem Sensor mit PDC+ (D) als

Chromoionophor in Nafion aufgenommen wurden

Abb 7 8 Absorptionsspektren einer Nafion-Optode der Zusammen¬

setzung M21 (Durchflusssystem) mit Chromoionophor PDC+ in Ab¬

hängigkeit des pH-Wertes der Probelosung (Acetat- und Phosphatpuffer)

1Membranzusammensetzungen siehe Anhang 1


Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess kann schematisch folgender-

massen dargestellt werden

PDC+

(mem) + I+

(mem) + 2 R - SOJ(mem) + H+

(aq)

*

W

PDCH2+(mem) + 2R-SO^mem)-!-I+

(aq)

(7 2)

Die Ansprechgeschwindigkeit für eine 95% Signalanderung (t,,4) betrug

bei kontinuierlichem Probewechsel in der Durchflusszelle (27 ± 3) s für

eine vollständige Deprotonierung (n=6, 95%, Wechsel von 0 01 mol L'

HCl zu 0 14 mol L'

Phosphatpuffer pH 7 0) und (104 ± 11) s für eine

vollständige Protonierung (n=6, 95%, Wechsel zu 0 01 mol L'

HCl) Die

beobachtete Hysterese in der Ansprechgeschwindigkeit wurde erwartet

und lasst sich durch die hohe Pufferkapazitat des verwendeten Phosphat¬

puffers im Vergleich zur verdünnten Saure begründen Für die

eingesetzte Sensormembran wurden mit dem Indikator PDC+ nur geringe

Signalverluste durch Auswaschen des Chromoionophors aus der

Membranphase in die wassrige Probe beobachtet Dies äusserte sich in

einer hohen Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit bei wiederholtem

Wechsel vom protonierten in den deprotonierten Zustand des Indikators,

wie in Abbildung 7 9 dargestellt ist


20-,

E15'c

oCON

11 0-

g

c

X

LU05

00^

U

o

Puffer pH 7 0 Tag 1

n

U 0 01 mol L

u uHCl

u u

50 100

Zeit / min

Tag 2

n

150

Abb 7 9 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Nafion-Optode der Zusam

mensetzung M2 mit PDC+ als Chromoionophor (vgl Abb 7 8), aufge¬

nommen bei 780 nm an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, verwendete

Pufferlösung 0 14 mol L'

Phosphatpuffer

Im Falle des Einsatzes von pHCOOH+ als Indikator wurden wesentlich

weniger stabile Signale beobachtet Die Signalverluste waren beim Spulen

mit verdünnter Saure (0 Ol mol L'HCl) am stärksten In Abbildung 7 10

sind die Ansprechfunktionen für zwei verschiedene Nafion-Optoden

dargestellt, wie sie mit den Indikatoren pHCOOH+ (C) und PDC+ (D)

realisiert wurden Es wurde eine pH-unabhängige Auftragung der

Resultate gewählt Daraus hessen sich die scheinbaren pKa-Werte (pH-

Wert für 50 % Protonierungsgrad) der Chromoionophore im Nafion-

Membransystem bestimmen


=^r A—a —a

^^-o o o ^g?

1 1 1 1 1 1 1

0 2 4 6 8 10 12 14

log (aNa+ / aH+)

Abb 7 10 Kalibrationskurven von Nafion-Optoden mit Chromoionophor

D (O, M2) und C (A, M3) Experimentelle Messdaten (0,A) sowie

angepasste sigmoidale Kahbrationsfunktion (—)

Für den Streptocyanin-Indikator PDC+ fand man einen scheinbaren pKa-

Wert von 4 5 und für den Cyanin-Indikator pHCOOH+ einen pKa-Wert

von 13 0 im verwendeten Sensorsystem für einen NaMonenhintergrund

von log a =-1 5

Für die mathematische Beschreibung der Kahbrationsfunktion

(ausgezogene Linie in Abb 7 10) wurde eine allgemeine sigmoidale

Funktion der Form y = 1 /(l + e") an die Messdaten angepasst

Da es sich bei Nafion um einen Kationentauscher handelt, muss der

Einfluss von Alkalnonen auf das optische Signal beachtet werden Die

ermittelte scheinbare Aciditatskonstante ist daher möglicherweise vom

Na+-Gehalt abhangig In der Literatur findet man die folgende Reihe der

I .u

08-

aCOi_

O)

«0.6

c

o 04io

02

OO


Assoziationskonstanten für Nafion mit Alkaliionen und Protonen in

wassriger Umgebung K+>Na+>H+>Li+ [134] Dies bedeutet, dass die in

physiologischen Proben vorliegenden Alkaliionen Kalium und Natrium

starker an Nafion gebunden werden als Protonen Falls diese Tatsache das

Protonierungsgleichgewicht des Indikators beeinflussen wurde, wäre der

praktische Nutzen des Sensors sehr beschrankt Patonay et al führten

Untersuchungen von K+-, Na+- und Li+-Interferenzen auf das Verhalten

des Indikators pHCOOH+ in Nafion durch [69] Dabei wurde keine

signifikante Verfälschung der pH-Bestimmung festgestellt, solange der

Indikator im Absorptionsmodus vermessen wurde Fluoreszenzmessungen

hingegen, zeigten eine Querempfindlichkeit gegenüber Lithiumionen

Eigene Experimente belegten, dass bei der Verwendung von PDC+ als

Chromoionophor in Nafion-Schichten sehr geringe, reversible spektrale

Änderungen des NIR-Signals, verursacht durch Kahumionen in sauren

Losungen (0 01 mol L'KCl in 0 01 mol L

'

HCl), zu beobachten waren,

die vom Verlauf her einer Deprotonierung des Indikators entsprachen

Der Farbstoff selbst zeigte aber in ethanohscher Losung keine

Empfindlichkeit gegenüber den Natrium und Kahumionen Damit konnte

eine direkte Wechselwirkung zwischen Chromoionophor und Alkaliionen

ausgeschlossen werden Die leichte Signalzunahme im NIR-Bereich kann

daher durch eine erleichterte Deprotonierung des Indikators infolge

bevorzugter Aufnahme von Kahumionen in die Nation-Struktur erklart

werden Für Natriumionen war der gleiche Effekt in noch geringerem

Ausmass zu beobachten Eine wesentliche Störung der pH Messung durch

Alkaliionen, vorliegend in geringen Konzentrationen (< 0 01 mol L '), ist

also nicht zu erwarten

Im weiteren Verlauf der Arbeiten stellte man fest, dass aufgrund des

ionischen Charakters und der damit verbundenen hohen Polarität des

Membranmediums sich keine der bekannten Ionophore für die

Realisierung einer lonenselektiven Optode mit Nafion kombinieren lassen


Diese Aussage trifft auf alle Liganden zu, die im Hinblick auf die

Loslichkeit in apolarer, hoch-lipophiler Umgebung optimiert wurden

Zusätzlich muss bedacht werden, dass der hohe Uberschuss an negativ

geladenen Zentren in Nafion jeglichen Einfluss eines Ionophoren unter¬

drucken wurde und somit zwangsläufig zu einfachen Kationentauscher-

Optoden ohne spezifisches Selektivitatsverhalten fuhren musste

7 5 5 Optoden basierend auf PVC-Membranen

Auf der Basis der vorangehenden Resultate stand fest, dass mit

Vorteil nicht-ionische Polymere verwendet werden, um optische Sensoren

im NIR-Spektralbereich mit Einbezug der bekannten lonenselektiven

Liganden realisieren zu können Aus diesem Grund wurde untersucht, ob

die beiden zuvor in Nafion charakterisierten Indikatoren pHCOOH+ und

PDC+ sich gegebenenfalls auch in weichgemachten PVC- oder Hydroxy

PVC-Membranen (OH-PVC) in Kombination mit einem lonophor ein¬

bringen lassen In Tabelle 7 3 findet man eine Zusammenstellung über

qualitative Eigenschaften wie die Loslichkeit, die pH-Empfindlichkeit und

die allgemeine Stabilität der resultierenden Membransysteme

durchzufuhren

Messungen

lonenselektive

mögl

ich,

nicht

war

Es

werden

untersucht

Anderungen

pH-

gegenüber

Verhalten

das

nur

konnte

enthielten,

Liganden

lonenselektiven

einen

Membranen

die

Obwohl

c

o-NPOE

Membranen

allen

in

Weichmacher

b

1Anhang

siehe

Membranzusammensetzung

die

Für

a

unlöslich

OH-PVC

pHCOOH+

M7

Membran

transparente

unempfindlich

gut

OH-PVC

PDC+

M6

Sign

alve

rlus

terasche

feststellbar

gering

PVC

pHCOOH+

M5

Sign

alve

rlus

terasche

Membranen

transparente

repr

oduz

ierb

ar

nicht

gut

PVC

PDC+

M4

matr

ix''

typ1

Membranquahtat

pH-E

mpfi

ndli

chke

it"

Loshchkeit

Membran¬

Farbstoff

Membran¬

Nafion-Membranen

nicht

in

Chromoionophore

als

Streptocyamn-Farbstoffen

und

Cyanin-

mit

Optodenmembranen

von

Eige

nsch

afte

nQualitative

37

Tabelle


Die Daten für Membran M6 zeigen, dass der Farbstoff PDC+ gut löslich

in der o-NPOE weichgemachten OH-PVC Matrix war Allerdings konnte

keine pH Abhängigkeit der aufgezeichneten Spektren beobachtet werden

Im Gegensatz zu Membran M4 mit unsubstituiertem PVC als Matrix,

wurden mit M6 auch nach längerem Probendurchfluss optische Signale

mit konstanter Intensität registriert Dies deutet darauf hin, dass die

Polantat des Membranmediums für die Herstellung einer stabilen Sensor¬

membran ausreichend ist und das rasche Auswaschen des Chromo¬

ionophors in die Probelosung verhindert werden kann Die fehlende pH-

Empfindlichkeit - eine Protonierung des Indikators in der Membranphase

war nicht möglich - wurde einer Reduktion des scheinbaren pKa-Wertes

(4 5 in Nafion) gegenüber der wesentlich polareren Umgebung der

Nafion-Membran zugeschrieben Offensichtlich kann die resultierende

zweifach positive Ladung des protonierten Farbstoffes PDCH1+ in der

hpophileren Membran nicht genügend stabilisiert werden Der Indikator

pHCOOH+ (Membran M7) schien in OH-PVC nahezu unlöslich zu sein

7 5 6 Schlussfolgerungen

Innerhalb der Auswahl der untersuchten Vertreter von Indikatoren

aus der Gruppe der Cyanine und Streptocyanine konnte kein Farbstoff

gefunden werden, der alle gestellten Anforderungen an einen Chromo¬

ionophor, wie in Kapitel 7 3 zusammengestellt, erfüllen konnte Einfache,

pH-empfindliche optische Sensormembranen, die im Bereich des nahen

Infrarot eingesetzt werden können, wurden unter Verwendung des

polaren Ionentauscher-Polymers Nafion verwirklicht Das Einbringen von

neutralen, lonenselektiven Liganden in diese Membranumgebung war

jedoch nicht möglich, da diese alle für apolare, hpophile Medien optimiert

wurden und sich daher in Nafion-Schichten ungenügend losen hessen

Umgekehrt konnten die meisten Farbstoffe ihrerseits wegen Loshchkeits-

problemen nicht in weniger polaren Medien eingesetzt werden Mit


abnehmender Polarität der Membranphase wurde gleichzeitig eine

Verminderung der Basizitat der Chromoionophore beobachtet, bis

schliesslich sehr tiefe scheinbare pKa-Werte gemessen wurden oder eine

Protonierung verunmoglicht wurde Eine Erhöhung der Basizitat der

Indikatoren wurde nicht in Erwägung gezogen, da damit die potentiell

auftretenden Loshchkeitsprobleme im Zusammenhang mit kationischen

Farbstoffen nicht eliminiert worden waren Zumindest wäre eine

gleichzeitige Lipophdisierung der Farbstoffe unumgänglich gewesen

Elektrisch geladene Cyanin- oder Streptocyanin-Farbstoffe lassen sich nur

in Kombination mit polaren oder geladenen Membranmedien einsetzen

und sind daher nicht ohne weiteres mit hpophden Ionophoren

kombinierbar Für das weitere Vorgehen wurde beschlossen, elektrisch

neutrale NIR-Farbstoffe vom Typ der Merocyanine oder zwitterionische

Verbindungen in Analogie zum Croconium-Farbstoff (E) in den Mittel¬

punkt der Untersuchungen zu stellen


7.6. Merocyanine als Chromoionophore

7 6 1 Ausgangslage

Merocyanine sind ungeladene Polymethin-Farbstoffe Es wurde

erwartet, dass dadurch Probleme mit der Loslichkeit der Indikatoren in

apolarer Membranumgebung, wie sie bei den kationischen Vertretern der

Gruppe der Cyanine und der Streptocyanine beobachtet wurden, ver¬

ringert werden können In Abbildung 7 11 sind die Strukturen der

charakterisierten Verbindungen dargestellt Die drei untersuchten

Beispiele sind der von der Quadratsaure abgeleitete Squann-Farbstoff (F)

[105 135], der in einer zwitterionischen Form als gesamthaft elektrisch

neutrale Verbindung vorliegt, der Dicyanovinyl-Farbstoff (G) [136 137]

und der asymmetrische Tnmethinium-Farbstoff (H) [129 138] Die

vollständigen Namen der Verbindungen sind in Kapitel 9 6 aufgeführt

Verantwortlich für die langwelligen Absorptionsbanden der Farbstoffe F

und G sind die in Abbildung 7 5 präsentierten besonders effizienten

Donor- und Akzeptorsysteme

Wie erwartet, traten aufgrund der elektrischen Neutralität keine schwer¬

wiegenden Loshchkeitsprobleme in apolaren Membranmedien auf

Dennoch muss beachtet werden, dass es sich bei den untersuchten Verbin¬

dungen nicht um lipophihsierte Substanzen handelte, die gezielt für den

Einsatz in lipophiler Umgebung optimiert wurden Aus diesem Grund

zeigte der Tnmethinium-Indikator (H) sowohl in DOS- wie auch in o-

NPOE-weichgemachten Membranen eine begrenzte Loslichkeit, die die

Anwendung von Ultraschall zur Homogenisierung der Membranlosung

erforderlich machte In Tabelle 7 4 sind die optischen Parameter der drei

Indikatoren in Losung und in weichgemachten PVC-Membranen zusam¬

mengefasst


Abb 7 11 Untersuchte Merocyanin Farbstoffe F Squann-Farbstoff, G

Dicyanovinyl-Farbstoff, H Trimethinium Farbstoff

Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient e des Squann-Farb-

stoffes im Vergleich zu den beiden anderen Merocyaninen lasst sich damit

begründen, dass die Struktur derjenigen eines symmetrischen,

kationischen Cyanin-Farbstoffes sehr nahe verwandt ist Symmetrische

Cyanin-Farbstoffe zeigen allgemein die höchsten Extinktionskoeffizienten

innerhalb der Gruppe der Polymethin Farbstoffe


Tabelle 7.4: Optische Eigenschaften (Wellenlänge maximaler Absorption

A.max, molarer dekadischer Extinktionskoeffizient emax) von Merocyanin-

Farbstoffen in verschiedener Umgebung1.

Farbstoff Squarin Dicyanovinyl Trimethinium

(F) (G) (H)

A,max Lösung 815a 763b

[nm]

Membran- DOS 819 755

Weichmacher

o-NPOE 821 768

Propylen- 821 768

carbonat

emax Lösung 136700a 28900"

[L mol"' cnT1]

a

Lösungsmittel: Ethanol

b

Lösungsmittel: Methylenchlorid (ungenügend löslich in Ethanol)

839a

850

n. g.

848

57100a

1Die Angaben beziehen sich auf die intensivste Absorptionsbande unabhängig davon, in welchem

Protonierungszustand der Indikator vorliegt


7 6 2 pH-empfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC-

Membranen

Ein Vorteil des weichgemachten PVC-Systems ist die Tatsache, dass

die Polarität der Membranphase zum grossten Ted durch den ver¬

wendeten Weichmacher, der als Membranlosungsmittel dient, bestimmt

wird Aus diesem Grund ist es möglich, die Losungsmittelumgebung der

Membranbestandtede zu variieren, ohne aber die Polymer-Matrix (PVC)

wechseln zu müssen Diese Tatsache wurde ausgenutzt, um die Selektivität

von lonenselektiven Elektroden [130] und die Lebensdauer von Mem¬

branen allgemein zu verlangern Im Spezialfall der optischen Sensoren

können die optischen Eigenschaften sowie die scheinbaren Aciditats-

konstanten der Chromoionophore in der Membranphase durch Wechsel

des Weichmachers modifiziert werden [139] Im weiteren beeinflusst die

Loslichkeit des Farbstoffes im Weichmacher zusammen mit seiner Lipo-

philie die Lebensdauer der Sensormembran [81]

Für diese Untersuchungen wurden lediglich drei Beispiele aus der grossen

Anzahl von Weichmachern [130] evaluiert Die Auswahl wurde so

getroffen, dass ein möglichst breiter Polantatsbereich, ausgedruckt durch

die Dielektrizitätskonstante e, abgedeckt werden konnte Die optischen

Eigenschaften der Merocyamn-Farbstoffe F, G und H in PVC-

Membranen mit den drei ausgewählten Weichmachern sind aus Tabelle

7 4 zu entnehmen Für den Squann-Farbstoff (F) und den Tnmethimum-

Chromophor (H) wird kein solvatochromer Effekt beobachtet Der

Dicyanovinyl-Indikator (G) hingegen, zeigt eine bathochrome Ver¬

schiebung von 13 nm beim Wechsel von DOS zum polareren

Weichmacher o-NPOE oder Propylencarbonat Diese sogenannte positive

Solvatochromie lasst auf eine Erhöhung des Dipolmoments im angeregten

Zustand des Farbstoffs gegenüber dem Grundzustand schliessen, die zu

einer Absenkung des Energieniveaus des angeregten Zustands fuhrt [140]

Beim Squann- und beim Tnmethinium-Farbstoff tritt demzufolge keine


wesentliche Änderung des Dipolmoments bei der elektronischen

Anregung auf Dieser Sachverhalt konnte durch PPP-Rechnungen

bestätigt werden

Abbildung 7 12 zeigt ein typisches Beispiel von Absorptionsspektren in

Abhängigkeit des pH-Wertes der Probelosung für eine Optode im NIR-

Bereich Dieser Sensor wurde mit dem Squann-Farbstoff (F) in einer

DOS-weichgemachten PVC-Membran realisiert Die Membran enthielt

zusatzlich das hpohile Boratsalz KTFPB (vgl Abschnitt 9 6) zur Auf¬

rechterhaltung der Elektroneutrahtat der Membranphase In Abbildung

7 13 ist das Resultat des analogen Experimentes mit dem Dicyanovinyl-

Farbstoff (G) dargestellt Die entsprechenden Spektren in PVC-

Membranen mit dem Weichmacher o-NPOE unterscheiden sich nicht

wesentlich von den in Abbildungen 7 12 und 7 13 dargestellten Resultaten

Für die Ermittlung der scheinbaren Aciditatskonstante pKa der

Indikatoren in den Optodenmembranen wurden die Signale im

Absorptionsmaximum ausgewertet Das Spektrum des Chromoionophors

F zeigt im Gegensatz zum Dicyanovinyl-Farbstoff (G) und dem im

Kapitel 7 5 4 gezeigten Indikator PDC* (D) in Bezug auf die Protolyse

ein unterschiedliches Verhalten, das aufgrund der Struktur des Farbstoffs

erklart werden kann Im Falle des Streptocyanin-Farbstoffes PDC+ fuhrt

eine vollständige Protonierung (PDCH+) zum Verlust der NIR-

Absorption und es tritt eine neuen Bande um 300 nm hypsochrom

verschoben auf (Abb 7 8) Beim Dicyanovinyl-Chromoionophor stellt

man gar eine Verschiebung der Bande in den UV-Spektralbereich fest

Für den Squann-Farbstoff hingegen, ist die beobachtete hypsochrome

Wellenlangenanderung wesentlich geringer Im PDC+-Ion wird das

konjugierte rc-System durch eine Protonierung (PDCH2+) vollständig

unterbrochen Bei Squann muss von einer Protonierung der vinylogen

Carbonsaure im Quadratsaurekern des Moleküls ausgegangen werden

Dadurch wird das Resonanzsystem jedoch nicht unterbrochen, sondern

durch einen veränderten externen Substituenten von aussen beeinflusst


Die Protonierung reduziert in diesem Fall den Elektronenuberschuss am

Substituenten und kann daher formal als Einfuhrung eines Akzeptors

betrachtet werden, was in dieser Position zu einer hypsochromen

Verschiebung der Absorptionsbande fuhren muss (siehe Abb 7 3) Das

Ausmass ist aber erwartungsgemass geringer, als bei einem vollständigen

Unterbruch des konjugierten Jt-Systems Die beobachtete hypsochrome

Verschiebung betragt in diesem Beispiel noch 110 nm und eine neue

Absorptionsbande tritt bei 700 nm Wellenlange auf

Abb 7 12 pH-abhangige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬

mensetzung M8 mit Squann-Farbstoff (F) als Chromoionophor in einer

DOS-weichgemachten PVC-Membran


Der zugrundeliegende Ionenaustauschprozess folgt den Gleichungen 5.5

und 5.6 und kann schematisch folgendermassen dargestellt werden:

C(mem) +1+ (mem) + R" (mem) + H+ (aq)

^ CH+

(mem) + R"(mem) + r(aq)

(7.3)

Der Zusatz des lipophilen anionischen Additivs R~ ist zur Gewährung der

Elektroneutralität der Membranphase notwendig. Die Ansprechfunktion

des Sensors lässt sich durch Gleichung 5.6 beschreiben und ist in

Abbildung 7.15 dargestellt.

040~| Dicyanovinyl-Farbstoff (G)KTFPB _—-PH 5.0

400 500 600 700 800 900

Wellenlänge / nm

Abb. 7.13: pH-abhängige Absorptionsspektren einer Optode der Zusam¬

mensetzung M9 mit Dicyanovinyl-Farbstoff (G) als Chromoionophor in

einer DOS-weichgemachten PVC-Membran.


Der zugrundeliegende lonenaustauschprozess kann in Analogie zum

Squann-Farbstoff (vgl Abb 7 12) beschrieben werden Die theoretische

Ansprechfunktion, ermittelt nach Gleichung 5 6 ist in Abbildung 7 15

dargestellt

Die Untersuchung der Reversibilität und des Ansprechverhaltens für den

Chromoionophor F in DOS-weichgemachten PVC-Membranen zeigte,

dass mit dem Squann-Farbstoff reproduzierbare Absorptionsanderungen

und stabile optische Signale erhalten werden (Abbildung 7 14) Arbeitete

man allerdings in stark alkalischer oder stark saurer Probelosung (0 01

mol L'NaOH resp 0 01 mol L

'

HCl) traten Signalverluste auf, die als

Hydrolyse des Indikators interpretiert wurden

pH 3 2^pH 3 7

Squann-Farbstoff (F)KTFPB

DOS/PVC

1

10

I

20

I I

30 40

Zeit / min

i

50

1

60

i

70

Abb 7 14 Ansprechverhalten eines pH-Sensors der Zusammensetzung

M8 mit Squann (F) als Chromoionophor gegenüber Citrat-Puffer-

losungen bei kontinuierlichem Probenwechsel in einem Durchflusssystem


Mit dem Dicyanovinyl-Farbstoff (G) in der Membran wurde ebenfalls

hohe Signalstabilitat und Reproduzierbarkeit beobachtet, solange der

Sensor nicht im alkalischen Milieu eingesetzt wurde In diesem Fall verlor

die NIR-Absorptionsbande irreversibel an Intensität, wahrend im sicht¬

baren Bereich (bei 600 nm) eine neue Bande zu beobachten war

Besonders rasch verlief dieser Vorgang in der Gegenwart lipophder

Kationen wie MTDDAC1 (vgl Kapitel 9 6) in der Membranphase Der

Amonentauscher wirkt unter diesen Bedingungen als Phasentransfer-

katalysator, der Hydroxid-Ionen in die Membran zu extrahieren vermag

und somit eine basenkatalysierte Hydrolyse unterstutzt

Der Gebrauch von Propylencarbonat als polarer Weichmacher führte zu

Stabilitatsproblemen in der Membranzusammensetzung Der Weich¬

macher schwitzte rasch aus der PVC-Membran aus, und die Polymer¬

schicht verlor ihre Flexibilität und Transparenz Es musste zusatzlich

angenommen werden, dass der Weichmacher bei Kontakt des Sensors mit

wassriger Probelosung aus der Membranphase ausgewaschen wird

Reproduzierbare Messungen konnten mit diesem Material nicht

vorgenommen werden

Beruhend auf den bekannten Modellen von Bakker [32] konnten nach

Gleichung 5 6 die Aciditatskonstanten der Chromoionophore in der

Membranphase abgeschätzt werden Die pH-unabhängige Auftragung der

Ansprechkurven für die verschiedenen Sensormembranen findet man in

Abbildung 7 15 Die zugehörigen Daten der experimentell ermittelten

pKa-Werte in der Sensormembran sind in Tabelle 7 5 wiedergegeben

Daraus kann entnommen werden, dass der Weichmacher o-NPOE mit

einer höheren Polarität (höhere Dielektrizitätskonstante e) als DOS zu

einer verstärkten Basizitat der Indikatoren fuhrt Diese erwartete

Beobachtung lasst sich durch die höhere Stabilisierung der protonierten,

elektrisch geladenen Moleküle über Dipol-Dipol Wechselwirkungen in der

polareren Umgebung erklaren Das Ausmass der Stabilisierung hangt im

einzelnen aber von den Eigenschaften des Indikators ab Für den Squann-


Indikator wurde ein kleineres Inkrement des pKa-Wertes beobachtet

(ApKa = 1 7), wahrend im Falle des Dicyanovinyl-Farbstoffes eine

Basizitatserhohung von 2 5 pKa-Einheiten festgestellt wurde Es kann

davon ausgegangen werden, dass die Squann-Verbindung in der Membran

in zwitterionischer Form auftritt Eine Erhöhung der Polantat der

Umgebung fuhrt zu einem geringeren, zusätzlichen Stabihtatsgewinn im

Vergleich zum Dicyanovinyl-Farbstoff, da der Squann-Chromoionophor

bereits in der nicht protonierten neutralen Form elektrische Ladungen

tragt, im Gegensatz zur ungeladen vorliegenden Dicyanovinyl-

Verbindung

Tabelle 7 5 Aciditatskonstanten pKa für Merocyanine in PVC-Sensor-

membranen mit unterschiedlichen Weichmachern Die Dielektrizitäts¬

konstante e diente der Quantifizierung der Polarität des Weichmachers

rarnsion Weichmacher DOS o-NPOE Propylen-

carbonat

£[130 141] 3 9 ±0 1 23 9±0 3 70 5±5 0

(Membran) (Membran) (Membran)

Squann (F) pKa 2 7±0 1 4 4±0 1a

(M8) (MIO) (M12)

Dicyanovinyl (G) pKa 4 0±0 1 6 5±0 1 a

(M9) (Mll) (M13)

Tnmethinium (H) pKa 11 5±0 0 n g n g

(M14)

a

Die ungenügende Membranstabihtat (siehe Text) erlaubte keine

Bestimmung


1 On

08H

T3

c

<y

o 04

o

Q.

02-

00-"T~

0

__, , r

4 8

log [aK> / aH*]

i

12

Abb 7 15 Ansprechkurven für Farbstoffe F (•, log Klxlh=-2 4, M8), G

(A, log Ktxü=-3 7. M9) und H (, log KtxJ=-l 1 3, M14) in DOS-weich¬

gemachten PVC-Membranen sowie F (O, log KtxUl=-2 6, MIO) und G (A,

log KlXL,,=-4 7, Mll) in Membranen mit ^-NPOE Die ausgezogenen

Linien stellen die angepasste theoretische Ansprechfunktion, ermittelt

nach Gleichung 5 14 dai

Nachdem nun mit drei verschiedenen Vertretern aus der Gruppe der

Merocyanine erfolgreiche Messungen in weichgemachten PVC-

Membranen durchgeführt worden waren, stellte sich die wichtige Frage,

ob sich die untersuchten Verbindungen als Chromoionophore in

Kombination mit einem lonenselektiven Liganden zu einem optischen

Sensor für Kationen oder Anionen kombinieren lassen Im Kontrast zu

den kationischen Cyanin- und Streptocyamn-Farbstoffen war in diesem

Fall nicht die Loslichkeit der Komponenten in lipophder Umgebung das

ausschlaggebende Kriterium Für die Verbindungen F und G bestand


zudem eine relativ einfache Möglichkeit zur Lipophdisierung durch

Einführung langkettiger Alkylreste wahrend der Synthese Wichtiger w ar

in diesem Zusammenhang die Frage nach der Basizitat des Chromo

lonophors im Verhältnis zur Komplexstabditatskonstante die zusammen

mit dem pH Wert der Probelosung den Ansprechbereich des Sensors

bestimmt (vgl Kapitel 7 3)

Der Vergleich dei Daten aus Tabelle 7 5 mit Abbildung 7 2 zeigt dass

einzig dei Trimethimum Chromoionophor (H) eine Basizitat autweist die

für eine Kombination mit den ttaditionellen kuttonenselekmen ETH

Liganden [142| genügend hoch ist Ionensclekme Messungen im

physiologischen pH-Beieich mit dem Indikator F als Chromoionophor

sind ausgeschlossen Auch wenn sieh dei pK, Weit des Dic\ano\m\l

Indikatois (G) durch die Wahl eines polaieren Weichmachers zu

basischeren Weiten \etschieben lasst ieicht diese VeisiJuebung nicht aus

um einen kationenselektiven Sensot tut Analysen im philologischen pH

Bereich in dei unverdünnten Piobe mit einem bekannten lonophoi zu

realisieren Anwendungen iintei Bedingungen bei welchen im staik

sauren pH Bei eich in vei dünnten Losungen odei in Kombination mit

einem Liganden mit veihaltnismassig kleiner Komplexierungskonstante

geuibeitet wird, sind jedoch denkbar

7 6 3 Ca +-selektive Optode tur den binsatz im NIR Spektrulbereieh

Der Trimethimum Farbstott (H) wurde erfolgreich in DOS weich

gemachten PVC Membranen als Chromoionophor tur Ca+

Messungen in

Kombination mit dem Liganden FTH 1001 eingesetzt Die Abbildung 7 16

zeigt die Absorptionsspektren des optischen Sensors mit dem lonophoi

ETH 1001 und dem Chromoionophor Trimethimum (H) in Kontakt mit

Ca2+-Losungen


300 400 500 600 700 800 900

Wellenlange / nm

Abb 7 16 Absorptionsspektren einer Ca1+-selektiven Optode der Zusam¬

mensetzung Ml5, die mit verschiedenen Ca,+haltigen, bei pH 4 8 ge¬

pufferten Losungen äquilibriert wurde

Der zugrundeliegende lonenaustauschvorgang wird durch Abbildung 5 2a

sowie durch Gleichung 5 7 repräsentiert

Die fünf deutlichen isosbestischen Punkte belegen, dass wahrend diesem

Experiment kein Verlust an Chromoionophor auftrat In Abbildung 7 17

ist die zugehörige, nach Gleichung 5 14 berechnete Kalibrationskurve

dargestellt

05-

04-

c

o

| 03-

x

LU

02-

0 1


1.0-|

0.8-

73ro

D)

g,06c

^_

0

o 04

o

Q.

02

0.0 -l

Tnmethinium (H)ETH 1001

NaTFPB

DOS/PVC

Natnumacetatpuffer pH 4.8

-4

log aCa2

r

0

Abb 7 17 Kalibrationskurve für eine Ca+-selektive Optode der Zusam¬

mensetzung M15 in Kontakt mit verschiedenen Ca+-haltigen, bei pH 4 8

gepufferten Losungen Die ausgezogene Kurve wurde nach Gleichung

5 14 mit log K^ = -5 3 berechnet

Das Ansprechverhalten bei vollständiger Protonierung und Deproto¬

nierung war reversibel und führte zu stabilen, reproduzierbaren optischen

Signalen, wie sie in Abbildung 7 18 dargestellt sind In gepufferten, Ca2+-

haltigen Probelosungen wurden gegenüber metalhonenfreien Losungen

(Abb 7 18) deutlich längere Ansprechzeiten beobachtet, wie der Wechsel

zwischen 10'und 10~4 mol L

'

Ca2+-Losung in Abbildung 7 19 zeigt

Dieses Verhalten kann mit den unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten

für Protonen und für Ca2+-Ionen sowie mit der verschiedenen

Austauschkinetik von Ionen am lonophor und Protonen am Chromo¬

ionophor erklart werden und wird für alle Ionenaustausch-Optoden


beobachtet [80] Man geht davon aus, dass die Diffusion der verschiedenen

Spezies in der Membranphase limitierend ist und die Geschwindigkeit

bestimmt

0 806 0 807 0 805 0 802

08-

W = 45 S W = 45 s »95% = 45 S

07-

?c

0 01 mol L"1 HCl

(850o CD 1

Extinktion o

o

*.

Ol

i

i

,

0 01 mo L 1KC)HI

03- W = 96 SJ W = 81 s I t95% = 78 s ^v02-

0 250 0 248 0 250

I I I I I I

0 5 10 15 20 25 3(

Zeit/ min

Abb 7 18 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬

setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) gegenüber voll-

standiger Protonierung und Deprotonierung bei kontinuierlichem Probe

Wechsel Messlosungen 0 01 mol L'HCl und 0 01 mol L

'KOH Die

angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem Proben¬

wechsel gemessen

Bei den hier angegebenen Ansprechzeiten t,,^ ist es wichtig zu beachten,

dass diese für einen kontinuierlichen Probenwechsel gültig sind Bei

Anwendung eines Batch-Verfahrens mit vollständiger Entleerung der

Messzelle zwischen einzelnen Messungen werden wesentlich kürzere An-


Sprechzeiten beobachtet, da keine Mischeffekte in der Messzelle oder

innerhalb des Probenflusses (carry over) eintreten So reduzierte sich

unter diesen Bedingungen die Ansprechzeit für einen Konzentrations¬

sprung von 104

zu 10'mol L

'

Ca,+-Losung in Acetatpuffer von rund 2

min auf lediglich 12 s und tur die Konzentrationsabnahme von 10'auf

104mol L

' Ca1+ Losung von 4 5 min auf 20 s Das wiederholte

vollständige Entleeren und sehr rasche Füllen der relativ grossen Mess

zelle führte aber zu weniger reproduzierbaren optischen Signalen und

teilweise zu mechanischer Beschädigung der Sensormembran

O 100-

0 101 0 101

n r\ r\W = 281 S, »95% = 275 S

10-4 mol L1

CaCL, in Puffer

0 101

S 0 095 -

CO,

c

o

|= 0 090-

,2 t95% = 128s t95%=112s| tQW„=125s

0 085-

u

0 101

r

0 086 0 086 0 086

103

mol L1

CaCI2 in Puffer

—i 1 r~

10 20 30

Zeit / min

Abb 7 19 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen

setzung M15 mit Chromoionophor Trimethimum (H) und lonophor ETH

1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel Die angegebenen Extinktions

werte wurden unmittelbar vor dem Probenwechsel gemessen


Die Lebensdauer des Sensors wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht in

ausführlichen Langzeitstudien untersucht Es zeigte sich aber, dass die

Membranen auch nach zweiwöchiger Lagerung in Acetatpuffer unter

Ausschluss von Licht einsatzfahig blieben Bei der Spulung des Sensors

mit destilliertem Wasser (1 5 mL / min) wahrend 15 Stunden, wurde bei

einer Wellenlange von 850 nm ein Signalverlust von 5% festgestellt

Um die Lebensdauer von Optoden zu erhohen, wurde abgeklärt, wieweit

die Viskosität einer PVC-Flussigmembran erhöht werden kann, ohne

damit die Ansprechzeiten drastisch zu verandern [80 143] Dadurch konnte

das Auswaschen von Membrankomponenten bei gleichzeitigem, mecha¬

nischem Stabditatsgewinn vermindert werden Reduzierte man das Ver¬

hältnis von Weichmacher zu PVC m einer Optodenmembran von 2 1 auf

1 1, wurde die Ansprechzeit um lediglich einen Faktor von 2-3 ver¬

längert Erst wenn man das ursprüngliche Mengenverhältnis auf 1 2 um¬

kehrte, beobachtete man eine Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit um

mehr als einen Faktor 20 Anderen Autoren ist es gelungen, die Lebens¬

dauer durch Immobilisierung von Chromoionophoren und anionischen

Ladungszentren zu erhohen [144], wobei auch dieses Vorgehen in der

Regel zu einer Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit fuhrt

Mit dem Trimethinium-Farbstoff (H) als Chromoionophor wurde ein

optischer Sensor realisiert, mit dem sich im NIR-Spektralbereich bei 850

nm Wellenlange Bestimmungen von Kationen durchfuhren lassen In

dieser Arbeit wurde eine Ca2+-selektive Optode als Beispiel demonstriert

Für eine Erfassung der freien Ionenkonzentration von Ca2+ in klinischen

Blutproben, die das Arbeiten bei einem physiologischen pH von 7 4

voraussetzt, ist die Basizitat des Chromoionophors allerdings zu gering

Dennoch kann man festhalten, dass der Indikator eine ausreichende

Basizitat aufweist, um NIR-aktive Optoden mit weiteren selektiven

Liganden für Kationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, zu

realisieren. Diese Annahme lasst sich damit begründen, dass der


Trimethimum-Farbstoft in der Membran einen pKa-Wert aufweist, der

demjenigen der bis anhin eingesetzten Chromoionophore vom Nilblau-

Typ sehr ähnlich ist


Drei Farbstoffe aus der Untergruppe der elektrisch neutralen

Merocyanine wurden im Hinblick auf ihre Eignung als NIR aktive

Chromoionophore für Optodenmembranen untersucht Die Tri¬

methimum-Verbindung vermochte den meisten der in Kapitel 7 3 zusam¬

mengetragenen Anforderungen zu genügen und hess sich zusammen mit

einem Liganden für Ca+-selektive Messungen im NIR-Bereich einsetzen

Die Squarin- und die Dicyanovinyl-Verbindungen konnten die Be¬

dingungen an die Basizitat nicht erfüllen und hessen sich daher nicht mit

einem Ionophoren zu einer lonenselektiven Optode für physiologische

Proben kombinieren Der Einsatz als NIR pH-Indikator ist zwar möglich,

vor allem aber beim Squann-Derivat wegen des tiefen pKa-Wertes kaum

von praktischem Interesse Ein Versuch der Modifikation der Molekul-

struktur zur Erhöhung der Basizitat und der Lipophdie stand nicht zur

Diskussion Dies vor allem deshalb, weil die bestehenden Grundstrukturen

gegenüber alkalischer Probelosung nur ungenügende Stabilität aufwiesen

Obwohl nicht alle Voraussetzungen erfüllt waren, wurde eine Optode mit

dem Dicyanovinyl-Chromoionophor als Versuchsmembran für Messungen

auf einem integrierten optischen Chip eingesetzt, da die Wellenlange der

Lichtabsorption sich ideal mit der Emissionswellenlange der zur

Verfugung stehenden Lichtquelle deckte und die Sensormembran zu sehr

reproduzierbaren Signalen führte (vgl Kapitel 7 8)


7.7. Reduzierte Dicyanovinyl-Farbstoffe

7 7 1 Ausgangslage

Im Zusammenhang mit der Synthese des Dicyanovinyl-Farbstoffs

(G) wurde als Nebenprodukt ein weiteres Farbstoffmolekul mitisoliert,

das wegen seiner pH-abhangigen Farbeigenschaften eingehend untersucht

wurde Alle bis anhin diskutierten Beispiele von NIR-Chromoionophoren,

inklusive dem Dicyanovinyl-Indikator, gehorten formal der Klasse der

Polymethin Farbstoffe an Die neu isolierte Verbindung hess sich aber

nicht einer der bisher bekannten Farbstoffklassen zuordnen Es handelte

sich um einen elektrisch neutralen, vom Dicyanovinyl-Indikator (G) abge¬

leiteten, reduzierten Farbstoff Formal betrachtet erfolgte eine Addition

von H2 an die C-N-Doppelbindung des Eduktes Es wird vermutet, dass

Bespalov et al bereits im Jahre 1991 im Rahmen der Synthese des

Dicyanovinyl-Indikators auf Farbstoffe von diesem Typ gestossen sind, sie

aber nicht als solche erkannt haben [137] Die Autoren beobachteten in den

Massenspektren der vermeintlichen Dicyanovinyl-Verbindungen Signale

für das Molekuhon, die um zwei Masseneinheiten zu hoch ausfielen, ohne

eine Erklärung dafür zu finden Dabei handelte es sich möglicherweise

um die reduzierte Form des Dicyanovinyl-Farbstoffes, die sich um zwei

Masseneinheiten vom Vorlaufer unterscheidet

Abbildung 7 20 gibt die Strukturen der Reihe von reduzierten Dicyano-

vtnyl-Farbstoffen wieder Zum Thema der Synthese, Strukturaufklarung

und -bestatigung sei an dieser Stelle auf die Arbeit von Jenny et al ver¬

wiesen [145] Ausgehend von der Grundstruktur, dem sekundären Amin

ETHT 5003 (R=H), hessen sich die Farbstoffe ETHT 5004, 5005, 5006,

5007, 5008 und 5009 relativ einfach synthetisieren Dadurch erhielt man

die Möglichkeit, wichtige Charakteristika wie optische Eigenschaften und

Basizitat der Chromoionophore mit einfachen synthetischen Mitteln durch

7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 159

Änderung des Substituenten R am sekundären Amin-Stickstoff zwischen

den beiden Ringsystemen zu variieren

Farbstoff

ETHT 5003

ETHT 5004

ETHT 5006

ETHT 5007

ETHT 5008

Abb 7 20 Konstitutionsformeln der Chromoionophore ETHT 5003,

5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009

1 Postulierte Struktur (konnte wahrend dieser Arbeit nicht definitiv bestätigt werden)

R

H

\ /

P(C6H5)3

O O


Farbstoff

ETHT 5009

R

ETHT 5005

Abb. 7.20 (Fortsetzung): Konstitutionsformeln der Chromoionophore

ETHT 5003, 5004, 5005, 5006, 5007, 5008 und 5009.

Im elektrisch neutralen, d.h. im protonierten Zustand wurde für diesen

Verbindungstyp keine Absorptionsbande im NIR-Bereich beobachtet,

während im anionischen, deprotonierten Zustand breite Banden auftraten,

die sich bis in den NIR-Bereich hinein erstreckten. Im Vergleich zu den

Cyanin- und Streptocyanin-Farbstoffen wiesen die Absorptionsbanden

wesentlich geringere Extinktionskoeffizienten auf. Es wurde postuliert,

dass das Proton am Kohlenstoff (C-2) innerhalb des 5-gliedrigen Rings

des Indansystems, benachbart zum Amin-Stickstoff, bei der De¬

protonierung abgegeben wird. Diese Vermutung wurde im Verlauf der

Arbeit durch mehrere Indizien unterstützt (vgl. Tab. 7.6 und Abb. 7.21

Spektrum von ETHT 5005). Bei den reduzierten Dicyanovinyl-

7 7 Reduzierte Dicyanovtnyl-Farbstoffe 161

Verbindungen handelt es sich demzufolge um sogenannte C-Sauren In

Tabelle 7 6 sind die optischen Eigenschaften der Indikatoren in metha¬

nolischer Losung zusammengestellt Die zugehörigen Absorptionsspektren

finden sich in Abbildung 7 21

lETH 5003

0 0i r

400 600 800

Wellenlange / nm

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1 H

0.0

ETH 5004

1 1

400 600 800

Wellenlange/ nm

0.3-

I 0.2-

x

tu0.1 -

o.o-

ETH 5005

i 1 r^

400 600 800

Wellenlange / nm

"

lETHT 50060 06-

r\0 04- \/ \0.02- \l \

n nn-

\i i r

400 600 800

Wellenlange / nm

Abb. 7.21: UV / VIS-Spektren der Chromoionophore in Methanol (varia¬

ble Konzentrationen). Ausgezogene Kurven: deprotonierte, anionische

Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form; ETHT 5005 ist nicht

deprotomerbar.


ETH 5007

1 T

400 600 800

Wellenlänge / nm

c

oV-

c

X

111

0.8-t

0.6

0.4-

0.2-

0.0Jr

ETH 5009

T"

400 600 800

Wellenlänge/ nm

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2-1

0.1

0.01 n~

400 600 800

Wellenlänge / nm

Abb. 7.21 (Fortsetzung): UV / VIS-Spektren der Chromoionophore in

Methanol (variable Konzentrationen). Ausgezogene Kurven: depro¬

tonierte, anionische Form; durchbrochene Kurven: protonierte Form.

werden

bestimmt

nicht

koeffizienten

Extinktions¬

dekadischen

molaren

die

konnten

bestätigen,

zu

Verbindung

der

Struktur

die

war,

gelungen

nicht

es

Da

a

9000

637

7000

7000

bestimmt"

nicht

deprotomerbar

nicht

depr

oton

ierb

arnicht

594

3000

576

3000

752

bestimmt"

nicht

12000

12000

759

717

3000

8000

8000

8000

cm"'

]'

mol

[L

e[nm]

A,max

']cm

'mol

[L

e

Form

Unprotomerte

Form

Protonierte

500

5009

ETHT

525

5008

ETHT

513

5007

ETHT

604

5006

ETHT

609

5005

ETHT

597

5004

ETHT

588

5003

ETHT

^max

Chromoionophor

Losung

scher

methanoh

in

5009

-5003

ETHT

Chromoionophore

der

emax)

koeffizient

Extinktions¬

dekadischer

molarer

Amax

,Absorption

maximaler

(Wellenlange

Eige

nsch

afte

nOp

tische

67

Tabelle


Wie zuvor erwähnt, lassen sich die neutralen Chromoionophore vom Typ

ETHT 5003 - 5009 zunächst keiner bis anhin bekannten Klasse von

Farbstoffen zuordnen Betrachtet man aber den deprotonierten, an

ionischen Zustand des Indikators, kann eine analoge Struktur wie für die

von Figala et al beschriebenen, im langwelligen Spektralbereich absor

bierenden Ybde des Cyclopentadiens postuliert werden [146] Dies

bedeutet, dass die Absorptionseigenschaften hauptsächlich durch das an

ionische Indansystem bestimmt werden Für das Ringsystem lasst sich im

anionischen Zustand ein N-Zentren (N=9) und N+l 7t-Elektronensystem

postulieren (siehe Abb 7 22), wobei das freie Elektronenpaar in Position

2 die Rolle des Donors übernimmt Eine 7t-Resonanzwechselwirkung über

das Indansystem hinaus erscheint für die Erklärung des beobachteten

optischen Verhaltens der Verbindungen nicht zwingend [146] Inter¬

aktionen mit Substituenten R in Position 2 über o Orbitale müssen jedoch

angenommen werden

Abb 7 22 Primares Chromo-

phorsystem für die Verbindungen

ETHT 5003 5009 im deproto¬

nierten, anionischen Zustand

NC

Die Akzeptor- oder Donoreigenschaften des Substituenten R (Abb 7 20)

üben einen starken Einfluss auf die Lage der langwelligen Absorptions¬

bande aus So wird im Falle von elektronenziehenden Substituenten R

(ETHT 5007, 5008 und 5009) eine gegenüber den Chromoionophoren

ETHT 5003, 5004 und 5006 hypsochrome Verschiebung des

Absorptionssignals für den deprotonierten, anionischen Zustand

beobachtet

7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 165

7 7 2 pH-empfindliche Optoden basierend auf weichgemachten PVC-

Membranen

Bei Experimenten mit dem Chromoionophor ETHT 5003 in alkoho¬

lischen Losungen wurde festgestellt, dass der Indikator eine sehr hohe

Basizitat aufweist und sich nur unter extremen Bedingungen (konz NaOH

in Methanol) deprotomeren und damit in eine NIR-aktive Form über¬

fuhren lasst Nach Zufügen des lipophilen Tetrabutylammonium-

hydroxids, wurde eine Deprotonierung schon nach Zugabe geringerer

Menge an Base erreicht

In PVC-Membranen, die nur den Chromoionophor ETHT 5003 enthielten,

konnte selbst in stark alkalischen Proben (pH 14) keine Deprotonierung in

Folge eines Ionenaustausches mit Kationen aus der Probelosung

beobachtet werden Der Ersatz des Weichmachers DOS durch das

polarere «-NPOE vermochte diese Tatsache nicht zu verandern Fugte

man hingegen hpophile kationische Zentren in Form des Anionen-

tauschersalzes MTDDAC1 dem Membrancocktail hinzu (100 mol% in

Bezug zum Chromoionophor), konnte der Chromoionophor reversibel

deprotoniert und protomert werden Dabei trat im anionischen Zustand

ein breiter Absorptionspeak mit einem Absorptionsmaximum bei 734 nm

auf, dessen langwellige Schulter bis zu Wellenlangen oberhalb von 800

nm reichte Weitere Experimente bestätigten die Vermutung, dass sich der

Chromoionophor ETHT 5003 nui in der Gegenwart von frei

vorliegenden, lipophilen Kationen (R+) in der Membranphase de¬

protomeren lasst Offensichtlich ist das hpophile Kation als Gegenion für

die Stabilisierung des resultierenden Anions des Chromoionophors (C ) in

der Membranphase notwendig In Abbildung 7 23 findet man die

Spektren, wie sie mit einem Sensor mit ETHT 5003 als Chromoionophor

gegenüber Pufferlosungen mit variablem pH gemessen wurden


0.35-

0.30-

ETHT 5003

MTDDACI

DOS / PVC *^

pH 14.0

/^"pH 13.0

/-^S-^"pH 12.0

"""^--""pH 11.5

^y^^pH 11.0

0.25- y^y^ZpH 10.5

q V-" pH 10.0

I 0.20-X

LU

^^m^-PH 9-5

^\___pH 8.9

0.15- 3^5^Tph 8.0

><^l8f^pH 7-5

0.10- X^^L^PH 7.0

^^^^SpH 66

^g^J^pH 6.1

500 600 700 800

Wellenlänge / nm

Abb. 7.23: Titration von ETHT 5003 mit Universalpuffer (pH 6.0 - 12.0;

H,BO, / KH2P04 / KCl / KOH) und KOH (pH 13.0 - 14.0) in einer Sensor¬

membran der Zusammensetzung Ml6.

Aufgrund des hohen Anteils (100 mol%) von lipophilen Kationen R+ wird

von einer Koextraktion von Protonen und Anionen aus der Membran¬

phase ausgegangen. Das zugrundeliegende Koextraktionsgleichgewicht

lässt sich wie folgt formulieren:

CH(mem) + R+X"(mem)

"» C"(mem) + R+

(mem) + H+

(aq) + X"(aq)

(7.4)

7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl Farbstoffe 167

Dies äussert sich dann, dass die Eigenschaften des im Puffer vorliegenden

Anions einen nicht vernachlassigbaren Einfluss auf den Protonierungsgrad

des Indikators ausüben Lipophile Anionen lassen sich wesentlich leichter

in die apolare Membranphase extrahieren als hydrophile Anionen und

fuhren bei konstantem pH Wert der Probe zu einem höheren Proto

merungsgrad des Indikators in der Membran Für die Titrationsexperi¬

mente wurde ein Universalpuffer gewählt, der einen weiten pH-Bereich

abdeckte Dadurch konnte ein abrupter Wechsel des Puffersystems und

damit des Pufler-Amons bei einem bestimmten pH-Wert vermieden

werden Zusätzlich wurde ein konstanter, relativ hoher Ionenhintergrund

(0 1 mol L'KCl) eingestellt

0 40

0 35

0 30

0 25

0 20

0 15

0 10

0 05

ETH 5003 / MTDDACI / DOS / PVC

0 324 0 324 0 324 0 324 0 323 0 323

n n0 01 mol L

1

KOH

0 01 mol L HCl

u U

0 083 0 081 0 083 0 084 0 085 0 085

T 1 1 1 1 1 1

0 10 20 30 40 50 60

Zeit / min

Abb 7 24 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬

setzung M16 mit Chromoionophor ETHT 5003 bei kontinuierlichem

Losungswechsel Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar

vor dem Probenwechsel gemessen


Abbildung 7 24 zeigt dass mit dem Sensor eine sehr gute Kurzzeitrepro

duzierbarkeit beim Probewechsel zwischen 0 01 mol L1 KOH und

0 01 mol L'HCl erreicht wurde Auch gegenüber konzentnerterer Base

(1 mol L'

KOH) wurden stabile und reproduzierbare Signale beobachtet,

was im Gegensatz zu den Dicyanovinyl Farbstoffen auf eine hohe

Stabilität der Verbindung im stark alkalischen Milieu und eine gute

Loslichkeit in apolarer Membranumgebung schliessen lasst Auch

nachdem der Sensor mehrere Tage in Universalpuffer (pH 7) gelagert

worden war, konnten Signale von identischer Intensität gemessen werden

Die Stabilität des Chromoionophors im betrachteten System war sehr gut

Für die Ansprechzeiten dieses Membrantyps fand man im kontinuierlichen

Durchflussbetrieb Werte von (133 ± 5) s für die vollständige Depro¬

tonierung (n=6, 95%) und (90 ± 5) s für die vollständige Protonierung

(n=5, 95%) Die Reduktion der Ansprechgeschwindigkeit gegenüber einer

Sensormembran mit dem Tnmethinium-Farbstoff (siehe Abb 7 18) steht

in Übereinstimmung mit der Tatsache, dass die C Sauren kleinere Ge

schwindigkeitskonstanten für Protomerungs und Deprotomerungs

reaktionen aufweisen, als beispielsweise Moleküle, die an einem Sauer¬

stoff oder Stickstoff-Zentrum protomert, respektive deprotoniert wer

den Dies wird mit der für C-Sauren im Verlauf der Reaktion

notwendigen Umhybridisierung am Kohlenstoff-Atom begründet

Durch eine Alkylierung des Amin-Stickstoffs von ETHT 5003 gelangte

man zum Chromoionophor ETHT 5004 Die Absicht war es zu

verifizieren, ob ETHT 5003 am C-Atom in Position 2 des Indansystems, in

a-Stellung zum Amin-Stickstoff, deprotoniert wird Mit der alkylierten

Verbindung wurde in PVC-Sensormembranen in der Gegenwart von

MTDDA+ als hpophiles Kation ein sehr ahnliches Verhalten beobachtet

wie für ETHT 5003 Der einzige Unterschied bestand dann, dass der

alkylierte Chromoionophor eine gegenüber dem Vorlaufer leicht erhöhte

Basizitat aufwies, was sich über den induktiven Effekt des Alkyl-


Substituenten erklaren lasst Im weiteren waren keine Unterschiede

gegenüber ETHT 5003 zu vermerken Dadurch wurde das Postulat einer

Deprotonierung in Position 2 erhärtet

Am Beispiel dieses Chromoionophors wurde der Einfluss der Konzen¬

tration an lipophilen Kationen MTDDA+ in der Membranphase auf das

Ansprechverhalten untersucht Dazu wurden PVC-Membranen mit 10, 50,

100, 150 und 200 mol% an MTDDAC1 im Verhältnis zum Farbstoff

ETHT 5004 eingesetzt Die Resultate sind in Abbildung 7 25 zusammen¬

gestellt Es wurde das Verhältnis der Intensitäten zwischen den Signalen

für den deprotonierten Chromoionophor C (774 nm) und den

protonierten Chromoionophor CH (592 nm) gegen den pH-Wert der

Pufferlosung aufgetragen

40-,

35-

30-

25-

;20-

M 5-

1 0-

05-

00-

Zusatz von MTDDACI

in Bezug zur Kqnzentration von ETH

10 mol%m DOS

X 50 mol% in DOS

T 100mol%in

+ 150mol%in

200 mol% in

6 8 10

pH der Pufferlosungen

12 14

Abb 7 25 Einfluss der Konzentration von lipophilen kationischen Zen¬

tren in PVC-Membranen mit dem Chromoionophor ETHr 5004, Mem¬

branzusammensetzungen Ml7-21


Aus Abbildung 7 25 ist ersichtlich, dass ein grosserer Anteil an lipophilen

Kationen R+ in der Membran zu einem erniedrigten scheinbaren pKa-Wert

des Chromoionophors fuhrt Wie bereits erwähnt, wird angenommen,

dass 100 mol% (im Verhältnis zum Farbstoff) des Zusatzes zur Stabi¬

lisierung der resultierenden negativen Ladung des deprotonierten Indi¬

kators notwendig sind Man stellt fest, dass eine Zunahme der Kon¬

zentration von R+ über 100 mol% hinaus, die gleichzeitig einer Erhöhung

der Ionenstarke in der Membranphase entspricht, zu einer steileren Stei¬

gung der Ansprechfunktion fuhrt Erst bei einer Konzentration an

MTDDA+ von 200 mol% kann ein Abflachen der Kurve, das bedeutet eine

vollständige Deprotonierung bei erhöhtem pH-Wert (pH>13) beobachtet

werden Die höhere Ionenstarke in der Membranphase hat eine Abnahme

des Debye Radius zur Folge Dies bedeutet wiederum, dass der ionische

Zustand stabilisiert und demzufolge die Deprotonierung des Indikators

erleichtert wird Für die praktische Anwendung des Chromoionophors ist

es sinnvoll, den Anteil an kationischen, als Anionentauscher agierenden

Zentren so gering wie möglich zu halten, um nicht einen unselektiven

Ionenaustausch zu provozieren Daher wurden für alle Applikationen

Optodenmembranen mit 100 mol% an MTDDAC1 eingesetzt Dadurch

konnte verhindert werden, dass nach der Deprotonierung des

Chromoionophors ein Uberschuss an freien Ionentauscherzentren

vorliegt

Die Verbindung ETHT 5005 zeigte keine pH-abhangigen spektralen Ver¬

änderungen, was auf das Fehlen eines Protons in a-Stellung zum Amin-

Stickstoff zurückgeführt wurde Der Indikator diente daher als wichtiger

Hinweis für die Deprotonierung am zuvor postulierten Kohlenstoff-

Zentrum Ferner wurden nützliche Informationen für die Struktur-

aufklarung der Reihe von Farbstoffen gewonnen [145]

Im weiteren wurde versucht, durch Einfuhrung einer Seitenkette mit

einem positiv geladenen Phosphin-Zentrum als Substituent am Amin-

7 7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 171

Stickstoff einen lipophilen kationischen Chromoionophor (ETHT 5006) zu

erhalten Damit sollte erreicht werden, dass im Gegensatz zu ETHT 5003

und 5004 kein Zusatz von lipophilen kationischen Komponenten zum

Chromoionophor in der Membranphase notwendig ist, um diesen zu

deprotonieien, sondern eine intramolekulare Stabilisierung der resul

tierenden negativen Ladung in Form eines Betains erfolgt Es gelang

jedoch nicht, die Struktur der Verbindung ETHT 5006 schlussig zu

ermitteln und zu bestätigen Dennoch wurde der Indikator in Optoden

membranen eingesetzt Die entsprechenden Spektren mit ETHT 5006 als

Chromoionophor ohne weitere Zusätze sind in Abbildung 7 26

wiedergegeben

pH 11 5

0 12-^""""^ pH 11 0

^2__pH 10 5

0 11- —pH 10 0

uon ^^H|{ pH 9 5

c 0 10- »feä^5—pH 8 9

LU ^LvGL-pH 8 5

0 09- >^Lph 80

yyf PH 7 5

0 08- ETHT 5006^V\\,,-<G#^lpH7 0

DOS / PVC N^Jfy^Z-vH <o §

•^^—pHO 1

500 600 700 800 900 1000

Wellenlange / nm

Abb 7 26 Titration von ETHT 5006 mit Universalpuffer (pH 6 0 - 11 5,

HjBO, / KH2P04 / KCl / KOH) in einer Sensormembran der Zusammen¬

setzung M22


Mit dem Chromoionophor ETHT 5006 ist eine Deprotonierung in der

apolaren Membranphase ohne den Zusatz von MTDDA+ möglich

geworden Gegenüber einer Sensormembran mit den Chromoionophoren

ETHT 5003 oder 5004 benotigt man eine Membrankomponente weniger

Dadurch gewinnt man den Vorteil, dass keine kationischen Zentren aus

der Membranphase ausgewaschen werden können und die Signalstabilitat

zusatzlich erhöht wird

Für die drei experimentell untersuchten Chromoionophore ETHT 5003,

5004 und 5006 ergab sich in allen Fallen das Problem der sehr hohen

Basizitat der korrespondierenden Base Erst der Zusatz der lipophilen

Kationen MTDDA+ oder die intramolekulare Stabilisierung in der Form

eines Betains ermöglichte es, die Chromoionophore in den Sensor¬

membranen reversibel zu deprotomeren Die somit erhaltenen pH

sensitiven Optoden zeichneten sich allerdings durch eine hervorragende

Signalstabilitat und durch eine hohe Sensttivitat im physiologischen pH-

Bereich aus

Um einen kationenselektiven optischen Sensor zu realisieren, ist es aber

nicht sinnvoll, ein hpophiles, kationisches Additiv in der Membranphase

mit einem kationenselektiven Liganden zu kombinieren, da dadurch die

Extraktion von Analyt-Kationen behindert wurde Es war zu erwarten,

dass eine Substitution mit einem Elektronenakzeptor am Amin-Stickstoff

zu einer erhöhten Aciditat des Protons am Kohlenstoff-Zentrum C-2

fuhren sollte Dies gab den Anlass zur Synthese der drei Chromo

lonophore ETHT 5007, 5008 und 5009

Die Indikatoren ETHT 5007 und 5008 zeigten gegenüber der Stammver¬

bindung ETHT 5003 eine deutlich reduzierte Basizitat Dies äusserte sich

dann, dass sich beide Chromoionophore in einer Membran ohne den

Zusatz von lipophilen, ladungsstabilisierenden Kationen MTDDA+ in die

anionische, deprotonierte Form überfuhren hessen Dazu war es aber

notwendig, mit konzentrierter Lauge (1 mol L'

KOH) zu arbeiten Unter


gemassigteren Bedingungen war eine Deprotonierung nicht möglich

Kombinierte man hingegen die Farbstoffe mit dem Amonentauschersalz

MTDDACl, wurde die scheinbare Aciditat in der Membranphase derart

erhöht, dass der Indikator bereits bei pH-Werten unterhalb von pH 7 0

vollständig in der deprotonierten Form vorlag

Die Einfuhrung eines Sulfonsubstituenten, wie dies im Chromoionophor

ETHT 5009 realisiert wurde, vermochte die Aciditat des Indikators in

einem Ausmass zu erhohen, dass es möglich war, in weichgemachten

PVC-Membranen ohne weitere Zusätze zu arbeiten Fugte man das

Amonentauschersalz MTDDACl zu, wurde es sogar unmöglich, die

korrespondierende Base C mit 0 01 mol L'HCl zu protomeren, weil

dadurch die deprotonierte, anionische Form stark stabilisiert wurde In

Abbildung 7 27 sind die Spektren für einen pH-sensitiven Sensor

basierend auf ETHT 5009 dargestellt Wie daraus zu entnehmen ist, wurde

durch den Sulfonsubstituenten nicht nur die Basizitat des Indikators stark

beeinflusst, sondern es trat auch eine hypsochrome Verschiebung des Ab¬

sorptionsmaximums von etwa 100 nm gegenüber der Ausgangsverbindung

ETHT 5003 auf Da die Absorptionsbanden der reduzierten Dicyanovinyl-

Verbindungen aber sehr breit sind, konnte auch mit ETHT 5009 noch bei

Wellenlangen oberhalb von 700 nm gearbeitet werden


500 600 700 800 900

Wellenlänge / nm

Abb. 7.27: Titration von ETHT 5009 mit Universalpuffer (pH 6.0 - 8.5;

H,BO, / KH2P04 / KCl / KOH) in einer Sensormembran der Zusammen¬

setzung M23.

Die Untersuchung des Ansprechverhaltens zeigte, dass mit diesem Sensor¬

typ eine sehr gute Kurzzeitreproduzierbarkeit erreicht werden konnte

(vgl. Abbildung 7.28). Die beobachteten Signale waren sehr stabil.

7.7 Reduzierte Dtcyanovinyl-Farbstoffe 175

0.12

Ec

m 0î-

£.

|o.£

X

LU

.10-

08-

0.06-

0.04-^

ETH 5009/DOS/PVC

0.113 0.113 0.113 0.113 0.113

-*!

y^J

m /—i

0.01 mol L1

KOH

-1

0.01 mol L HCl

u u u L0.047 0.047 0.047 0.047 0.047

—T"

20

l

40

Zeit / min

i

60

~l

80

Abb. 7.28: Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Optode der Zusammen¬

setzung M23 mit Chromoionophor ETHT 5009 bei kontinuierlichem Lö¬

sungswechsel. Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor

dem Probenwechsel gemessen.

Mit ETHT 5009 konnte ein Sensor realisiert werden, der ohne den Zusatz

von lipophilen kationischen Zentren R+ seine maximale pH-Empfind¬

lichkeit im physiologischen pH-Bereich aufweist. Die breite Absorptions¬

bande gestattet eine flexible Wahl der Messwellenlänge bis an die Grenze

des NIR-Spektralbereichs. Der relativ geringe Extinktionskoeffizient

könnte sich zudem als Vorteil erweisen, wenn eine Sensormembran auf

einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer eingesetzt wird

(vgl. Kapitel 7.8.).

176 OPTISCHE SENSOREN AUF DER BAS IS VON NIR FARBSTOFFEN

Für den Chromoionophor ETHT 5009 konnte die Basizitat in der

Membranphase nach dem Verfahren von Bakker et al P2] experimentell

ermittelt werden Der pKa-Wert in einer DOS-weichgemachten PVC-

Membran ohne Zusatz von lipophilen Kationen betrug 7 5 ± 0 2 Für die

übrigen Indikatoren der Reihe war es aufgrund der sehr geringen Aciditat

nicht möglich, einen pKj-Wert in der Membranphase zu bestimmen Es ist

auch in Kombination mit dem lipophilen, kationischen Zusatz nicht

gelungen, die Verbindungen in der Membran vollständig in ihre

deprotonierte Form zu überfuhren Ihre relative Basizitat innerhalb der

Reihe konnte aber durch direkte Gegenüberstellung der Titrationskurven

bei Verwendung identischer Pufferlosungen bestimmt werden Dazu

wurde in den Titrationskurven die Steigung als Funktion des pH Wertes

der Pufferlosungen analysiert Auf diese Art war es möglich, einen

Wendepunkt und damit einen Schatzwert für den scheinbaren pK, zu

bestimmen, obwohl der Endpunkt der Titrationskurve in der Regel nicht

erreicht wurde Die zugehörigen Werte sind in Tabelle 7 7

zusammengestellt

Der scheinbare pKa-Wert darf nicht mit dem eigentlichen pKa-Wert in der

Membranphase verwechselt und direkt verglichen werden Im Gegensatz

zum letzteren ist er nur für die Membran einer bestimmten Zusammen¬

setzung in Kontakt mit dem verwendeten Universalpuffer gültig, wahrend

sich beispielsweise der zuvor ermittelte Wert für ETHT 5009 auch auf

Sensoren mit unterschiedlichen Liganden in beliebiger Probelosung

anwenden lasst


Tabelle 7 7 Gegenüberstellung von relativen, scheinbaren Aciditaten der

Chromoionophore ETHT 5003 - 5009 (ohne 5005) in DOS-weich¬

gemachten Optodenmembranen mit 100 mol% MTDDACl (in Bezug zum

Chromoionophor)

Chromoionophor scheinbarer pKa Beobachtungs-

(Membran- Wellenlange

Zusammensetzung) [nm]

Membran

ETHT5003 (Ml6) 88 734 R+ / DOS / PVC

ETHT5004(M17) 95 774 R+ / DOS / PVC

ETHT 5006 (M22) 85 760 DOS/PVC

ETHT 5007 (M24) 48 700 R+ / DOS / PVC

ETHT 5008 (M25) <6 0 700 R+ / DOS / PVC

ETHT 5009 (M23) <2 0 700 R+ / DOS / PVC

Es muss beachtet werden, dass die angegebenen Werte für die Aciditat nur

für Membranen gelten, in denen der Chromoionophor durch ein kat-

lonisches Additiv oder eine intramolekulare ionische Wechselwirkung in

seiner anionischen Form stabilisiert wird

7 7 3 Ca2+-selektive Optode für den Einsatz im NIR-Spektralbereich

Der Chromoionophor ETHT 5009 eignete sich aufgrund seiner

Aciditatskonstante in Kombination mit dem Ca2+-Ionophor ETH 1001 für

die Erfassung der Ca2+-Konzentration in Losungen bei tiefen (pH < 3) pH-

Werten Eine Bestimmung der totalen Konzentration von Ca,+ in

verdünnter, gepufferter physiologischer Probe war somit möglich Die

übrigen Chromoionophore der Serie wiesen zu hohe Aciditatskonstanten

auf, um in Kombination mit einem lonenselektiven Liganden eingesetzt


werden zu können Abbildung 7 29 zeigt die Absorptionsspektren einer

Optode, die mit verschiedenen Ca2+-haltigen, bei pH 2 7 gepufferten

Losungen äquilibriert wurde Im Gegensatz zur Ca2+-selektiven Optode

mit dem Tnmethinium-Farbstoff (vgl Abb 7 16) ist für diesen Sensor

kein Zusatz eines anionischen Additivs notwendig Das für diesen Fall

gültige Optodenmodell entspricht der Abbildung 5 2b In diesem Modell

steht der deprotonierte Chromoionophor C zur Kompensation der

Ladung der extrahierten Kationen Ca2+ zur Verfugung

400 500 600 700 800 900

Wellenlänge/ nm

Abb 7 29 Absorptionsspektren einer Optode der Zusammensetzung M26,

die mit verschiedenen Ca2+-haltigen, bei pH 2 7 gepufferten Losungen

äquilibriert wurde.


Die deutlichen isosbestischen Punkte weisen auf eine Messung ohne den

Verlust von Chromoionophor hin Nach einer Standzeit von 3 Tagen,

wahrend denen der Sensor in 0 01 mol L'HCl aufbewahrt worden war,

konnten dieselben absoluten Signalintensitaten wiedergefunden werden In

Abbildung 7 30 ist die zu den Spektren zugehörige, berechnete

Kalibrationskurve dargestellt

1 On

08-

DCOi_

a>w

c

a>

c

o

o\—

06-

04-

02-

-4

log aCaa

ETH 5009

ETH 1001

DOS/PVC

Ameisensaure-

puffer pH 2 7

i

0

Abb 7 30 Kalibrationskurve für eine Ca2+-selektive Optode der Zusam

mensetzung M26 in Kontakt mit verschiedenen Ca'+-haltigen, bei pH 2 7

gepufferten Losungen Die ausgezogenen Kurve wurde nach GleichungrCaL

5 15 mit log Krrh2 = 1 9 berechnet

Das experimentelle Verhalten steht in guter Übereinstimmung mit der

Theorie Nur in sehr verdünnten Losungen kann eine schwache

Interferenz durch K+-Ionen aus der Pufferlosung beobachtet werden


0 095

0 090

0 085-1

8 0 080 HCD-

o 0 075

~ 0 070

LU

0 065-

0 060-

ETH 5009/ETH 1001 /DOS/PVC

10~3 mol L~1 CaCI2 in Puffer

0 086 0 085 0 084

0 064 0 064

10-4 mol L1

CaCI2 in Puffer

0 20 40

Zeit / min

60

0 064

80

Abb 7 31 Kurzzeitreproduzierbarkeit einer Ca'+ selektiven Optode der

Zusammensetzung M26 mit Chromoionophor ETHT 5009 und lonophor

ETH 1001 bei kontinuierlichem Losungswechsel (pH der Pufferlosung

2 7) Die angegebenen Extinktionswerte wurden unmittelbar vor dem

Probenwechsel gemessen

Abbildung 7 31 zeigt die Ansprechgeschwindigkeit und die Kurzzeitre¬

produzierbarkeit, wie sie mit der Ca2+-selektiven Optode im kontinuier¬

lichen Durchflussbetneb gemessen wurde Im Vergleich zum Ca,+-Sensor

mit dem Trimethimum Chromoionophor stellt man eine deutliche Reduk¬

tion der Ansprechgeschwindigkeit fest Diese lasst sich wiederum mit der

langsameren Protonierungs-Kinetik von C-Sauren (ETHT 5009) im

Vergleich zu einer Verbindung, die am Stickstoff-Zentrum protoniert

oder deprotoniert wird (Tnmethinium-Indikator) begründen

7 7 Reduzieite Dtcyanovinyl-Farbstoffe 181


Mit dem Chromoionophor ETHT 5003 und den substituierten

Derivaten ETHT 5004 - 5009 wurde eine Spezies von Farbstoftmolekulen

gefunden, die sich vom Aufbau des Chromophors her nicht den bisher

bekannten Gruppen zuordnen lasst und eine neue Klasse von Farbstoffen

repräsentiert Obwohl es im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich war, das

spektroskopische Verhalten der Verbindungen vollständig zu erklaren,

wurden die Farbstoffe aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften als

Chromoionophore in Optodenmembranen eingesetzt und charakterisiert

Die Indikatoren zeichnen sich durch eine äusserst hohe Stabilität sowohl

gegenüber saurer, wie auch gegenüber basischer Losung aus Eine

Deprotonierung am Kohlenstoff-Zentrum C-2 des Indansystems fuhrt zu

einer breiten, langwelligen Absorptionsbande, die in Abhängigkeit des

Substituenten am Amin-Stickstoff bis in den NIR-Spektralbereich reicht

Die Aciditat der Chromoionophore wird zu einem hohen Ausmass durch

die chemische Umgebung des Farbstoffes bestimmt In weichgemachten

PVC-Membranen lassen sich die Indikatoren ETHT 5003 und 5004 nur in

der Gegenwart des lipophilen kationischen Salzes MTDDACl depro-

tomeren Der Chromoionophor ETHT 5006 vermag die resultierende

negative Ladung der korrespondierenden Base als Betain intramolekular

zu stabilisieren Eine Substitution am Amin-Stickstoff mit elektronen¬

ziehenden Substituenten fuhrt zu einer gesteigerten Aciditat der Chromo¬

ionophore (ETHT 5007, 5008 und 5009) Gleichzeitig wird aber eine

starke hypsochrome Verschiebung der Absorptionsbande der deproto¬

nierten Spezies beobachtet

Ein bis anhin nicht erwähnter Vorzug der Chromoionophore vom Typ

ETHT 5003 hegt in der chemischen Funktionalitat der Verbindung Wie

für die Synthese der Derivate ETHT 5004 - 5009 angewendet, lasst sich

die sekundäre Aminogruppe der Grundstruktur ETHT 5003 für kovalente


Bindungen nutzen, ohne dass die Grundstruktur des Chromophors dabei

verändert wird Dies bietet beispielsweise Möglichkeiten zur kovalenten

Immobilisierung des Indikators an Polymere [147]

7.8. Das miniaturisierte Mach-Zehnder-Interferometer

In Abschnitt 7 1 wurde darauf verwiesen, dass sich chemische

Sensormembranen mit einer maximalen optischen Empfindlichkeit im

NIR-Spektralbereich für die Verwendung auf optischen Chips, gefertigt

aus III-V Halbleitermatenahen eignen Nachdem nun eine Reihe von

Chromoionophoren mit maximaler Lichtabsorption im langwelligen

Spektralbereich in Optodenmembranen charakterisiert worden waren

wurde in einigen Experimenten untersucht, wie sich eine NIR-aktive

Sensorschicht auf einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer

[148] als Messplattform verhalt Abbildung 7 32 zeigt den schematischen

Aufbau des optischen Messsystems

Phasenmodulator

Laser

Sensorfeld

Detektor

Abb 7 32 Schematische Darstellung eines monolithisch-integrierten,

chemischen Sensors in Form eines miniaturisierten Mach-Zehnder-Inter-

ferometers Reproduziert mit Genehmigung nach [149]

7 8 Das miniaturisierte Mach-Zehnder Interferometer 183

Das vom Laser emittierte Licht wird auf die zwei Teilarme des Mach-

Zehnder-Interferometers aufgeteilt Im Sensorfeld des Messarms werden

Änderungen im Brechungsindex des benachbarten Mediums, in diesem

Fall der Sensormembran, durch Änderungen der Phasengeschwindigkeit

der optischen Mode registriert Die Interferenz mit dem Licht im

Referenzarm wird am Detektor in ein elektrisches Signal umgewandelt

[149] Dieser Messaufbau ermöglichte es, Brechungsindexdifferenzen in

Flüssigkeiten mit einer Auflosung von An=l 3 x 10s

zu erfassen

Ändert sich aufgrund einer chemisch selektiven Wechselwirkung das Ab¬

sorptionsspektrum einer Optodenmembran, fuhrt dies gleichzeitig zu

einer Änderung des Dispersionsspektrums Somit können Änderungen des

Brechungsindex in der Optodenmembran direkt mit Variationen in der

Aktivität eines Analyten in der Probelosung in Verbindung gebracht

werden, wie auch experimentell von Freiner et al gezeigt wurde [35] Die

Anwendung der Kramers-Kronig-Transformation auf gemessene Absorp¬

tionsspektren erlaubte die Abschätzung der Wellenlange maximaler

Empfindlichkeit für die Erfassung von Brechungsindexanderungen in

Optodenmembranen [150]

Mit einer pH-sensitiven Membran der Zusammensetzung M9 mit dem

Dicyanovinyl-Indikator als Chromoionophor, wurden erste Messungen

auf einem miniaturisierten Mach-Zehnder-Interferometer (Lange 2 mm)

mit einem externen Detektor vorgenommen Die Sensorschicht wurde

durch Tropfbeschichtung mit einer Micropipette auf den Chip

aufgetragen Als Lichtquelle diente eine externe Laserdiode mit einer

Emissionswellenlange von 830 nm Bei dieser Wellenlange wurden für die

eingesetzte Membran die intensivsten Änderungen im Brechungsindex

erwartet Dies ging aus berechneten Dispersionsspektren (Abb 7 33)

hervor, die aus den gemessenen Absorptionsspektren (Abb 7 13) mittels

eines Computerprogramms [151], basierend auf den Kramers-Kronig-

Relationen erhalten wurden. Es ist zu beachten, dass mit dieser Berech-


nungsmethode nur die erwarteten Änderungen An im Brechungsindex

beschrieben werden und nicht die Absolutwerte.

400 500 600 700 800 900

Wellenlänge / nm

Abb. 7.33: Nach Kramers-Kronig berechnete pH-abhängige Dispersions¬

spektren (Änderungen des Brechungsindex) einer Optode der Zusammen¬

setzung M9 (vgl. Abb. 7.13) mit dem Dicyanovinyl-Farbstoff als Chro¬

moionophor in einer DOS-weichgemachten PVC-Membran.

Im Verlauf der Experimente stiess man auf ein grundsätzliches Problem.

Der hohe molare dekadische Extinktionskoeffizient des Chromoionophors

führte in Kombination mit der relativ hohen Konzentration in der

Optodenmembran zu starken Intensitätsverlusten im Lichtwellenleiter.

Diese lagen im Bereich von 50 bis 100 dB cm"' und waren damit zu stark,

um auf dem Detektor eine genügende Intensität zu registrieren. Idealer¬

weise sollte die Dämpfung der Lichtintensität einen Wert von 20 dB cm"'

7 8 Das miniaturisierte Mach Zehnder Interterometer 185

nicht überschreiten, was für einen Wellenleiter aus Titandioxid mit einer

Kerndicke von 70 nm einer Extinktion von 15 cm'

entspricht [152] Eine

Reduktion der Verluste wäre nur dann möglich, wenn die Konzentration

des Farbstoffes verringert wurde, was zu Lasten der Sensitivitat fallen

wurde Bei zukunftigen retraktometnschen Sensoren konnte der Sensi-

tivitatsverlust durch ein höheres Auflösungsvermögen kompensiert

werden Eine weitere Möglichkeit besteht dann, Chromoionophore mit

niedrigeren Extinktionskoeffizienten einzusetzen ohne dass die Konzen¬

tration erniedrigt werden muss Von diesem Standpunkt aus betrachtet

wurden sich die reduzierten Dicyanovinyl-Farbstoffe ETHT 5003 - 5009

anbieten Gegenüber einer Verringerung der Konzentration des Farbstoffs

haben die Chromoionophore ETHT 5003 5009 den Vorteil, dass die

chemische Empfindlichkeit des Sensors unverändert bleibt, die optische

Dichte der Membranschichten aber gleichzeitig reduziert wird

Aut weitere Messungen musste im Rahmen dieser Arbeit verzichtet

werden, da sich das interferometrische Messsystem selbst noch im Aufbau

befand Vor allem war es noch nicht möglich, mit einer integrierten

Lichtquelle und einem integrierten Detektor zu arbeiten Dadurch war das

Auflösungsvermögen für die erwarteten kleinen Brechungsindexanderun-

gen der Sensormembranen bei reduzierter Farbstoffmenge noch nicht

genügend

186

187

8. Ausblick

Unsicherheiten beim Einsatz von chemischen Sensoren für klinische

Messungen treten vor allem dann auf wenn die Analysenbefunde direkt

mit Resultaten aus konventionellen Gesamtkonzentrationsbestimmungen

verglichen werden Viele der beschriebenen Probleme konnten eliminiert

werden, indem auf einen direkten Methodenvergleich verzichtet wurde,

was aber die Einfuhrung einer neuen physikalischen Grosse mit einem

neuen Referenzintervall und die Bereitstellung der zugehörigen Referenz-

matenahen erfordern wurde Ob sich auf dem Gebiet der klinischen

Elektrolytanalytik die biologisch wichtige Grosse der aktiven Molalität

durchsetzten wird, ist abzuwarten Sicher ist, dass bis heute kein bewusstes

Umdenken stattgefunden hat und weiterhin Resultate aus direkten und

indirekten Elektrolytmessungen unkritisch einander gegenübergestellt

werden Auch in Expertenkreisen herrscht noch keine Einigkeit So

wurden die Empfehlungen der IFCC [59] wahrend mehreren Jahren

immer wieder abgeändert und angepasst Die IFCC verfasste bereits im

Jahre 1986 einen Entwurf für den internen Gebrauch, der sich mit diesem

Themenkreis befasste [58]

Im Rahmen der Weiterentwicklung der optischen Messtechnik werden

sich neue Möglichkeiten ergeben Mikrooptische Systeme basierend auf

optischen Wellenleitern aus Polymermatenalien wie zum Beispiel Poly-

carbonat sind inzwischen entwickelt worden [153] Diese sind sehr kosten¬

günstig in der Herstellung und eignen sich für die Serienproduktion in

grossen Stuckzahlen Eine weitergehende Integration aller Komponenten

auf einem Chip wird die Grosse und die Kosten der Sensorsysteme

zusätzlich reduzieren Der niedrige Preis durfte es gestatten, in Zukunft

auch an die Konstruktion von Wegwerfmodulen (disposable chips) zu

denken Die Entwicklung einer Disk ("Chemical Disk", CD) mit einer

188 AUSBLICK

Reihe von optischen chemischen Sensoren in Form eines integrierten

Sensorarrays, die von einem Gerat analog zu einem Compact-Disk Spieler

gelesen werden kann wird für die Zukunft vorgeschlagen [154]

Vermehrt werden neue, kostengünstige Laserdioden als Lichtquellen

verfugbar Die Emissionswellenlange dieser Dioden ruckt immer weiter

in den sichtbaren Wellenlangenbereich voi Dennoch wird die Nachfrage

nach NIR-Indikatoren bestehen bleiben, da ihre maximale optische Emp¬

findlichkeit ausserhalb des Absorptionsbereichs von interferierenden

Komponenten in biologischen Proben hegt

Die Forschung auf dem Gebiet der optischen chemischen Sensoren wird

sich mit der Problematik der pH- und der Ionenstarkeabhangigkeit

befassen müssen Zwar weisen Optoden basierend auf dem Ionen¬

austausch- und Koextraktionspnnzip eine Vielzahl von Vorteilen auf

Dazu zahlen besonders die grosse Auswahl an Liganden und die

Flexibilität bei der Wahl der Chromoionophore und der dadurch

ermöglichten Anpassung des dynamischen Messbereiches Für den Einsatz

für klinische Direktmessungen sind sie aber nur dann geeignet, wenn

adäquate Methoden zur optischen pH-Erfassung zur Verfugung stehen

Anstrengungen zur Entwicklung von direkten optischen Systemen, die

nicht auf Ionenaustausch oder Koextraktion beruhen, sind im Gang Diese

Art von Sensoren bedingt allerdings die Verwendung von selektiven,

weitgehend pH-unempfindlichen Chromoionophoren [155] für jeden

Analyten [156-163] Ferner kann in diesem Fall nicht mehr mit einem auf

Ionenaustausch basierenden Membransystem (wassnge Probephase und

organische Membranphase) gearbeitet werden, was spezielle Anforde¬

rungen an die Selektivität der Chromoionophore stellt

189

9. Experimenteller Teil

9.1. Klinische Untersuchungen

9 1 1 Probanden

Proben wuiden von 36 freiwilligen Probanden der ETH Zürich,

sowie des Untversitatsspitals Zürich, welche sich als gesund bezeichneten,

unter den folgenden Bedingungen entnommen Die Spender fanden sich

morgens um 8 Uhr mit nüchternem Magen und ohne den Konsum von

Alkohol wahrend der vorangehenden 12 Stunden ein Weiter wurde Blut

von 18 Patienten mit Nierenbeschwerden unmittelbar vor der Behandlung

durch Hämodialyse und von 15 Patienten nach dei Behandlung durch

Hämodialyse entnommen Schliesslich standen Pioben von 15 Patienten

aus der Intensivstation für innere Medizin, welche an verschiedenen Herz¬

problemen litten oder sich einer Herzoperation zu unterziehen hatten

(Herzinfarkt, instabile Angina Pectoris, Einsatz eines aortokoronaren

Bypasses und perkutane, transluminale koronare Angioplastik) zur

Verfugung Von den insgesamt 82 Blutspendern waren 52 männlich und

30 weiblich Die Altersverteilung variierte je nach Probandengruppe und

lag zwischen 21 und 50 Jahren bei den Gesunden, 28 und 76 Jahren bei

den Hamodialysepatienten und zwischen 42 und 80 Jahren bei den

Patienten mit Herzbeschwerden

9 1 2 Probenahme

Alle Proben wurden in hepannisierten (Li-Hepannat, 143 USP

Einheiten) 10ml Vacutainer-Rohrchen (Becton-Dickmson, Rutherford NJ,

USA) gesammelt, wahrend die Probanden sassen oder lagen An¬

schliessend erfolgte eine Markierung mit Strichcoden, um

190 EXPERIMENTELLER TEIL

Verwechslungen auszuschhessen Die Entnahmerohrchen wurden rotiert,

um eine vollständige Durchmischung mit dem Heparmat zu gewährleisten

Plasma wurde entweder unmittelbar nach oder vor der Analyse der Probe

auf dem Laborautomaten (siehe Abschnitt 9 13) ungefähr eine Stunde

nach der Zentnfugation abgetrennt Anaerobe Probenhandhabung war aus

technischen Gründen nicht möglich Die Plasmaproben wurden bis zur

weiteren Analyse bei 4 °C gelagert Nach der Beendung aller Analysen

wurden die Proben mit flussigem Stickstoff schockgefroren und unterhalb

von -20 °C aufbewahrt

9 1 3 Verwendete Gerate und Methoden

Die im folgenden aufgeführten Analysen wurden auf einem

Hitachi 747 Analyzer (Boehnnger Mannheim Diagnostics Ine, Houston,

TX, USA) ausgeführt Totale Ionenkonzentrationen von Natrium, Kalium,

Calcium, Magnesium und Chlorid, Gesamtprotein, Cholesterin, Glucose,

Hainstoff und Triglyceride Die Phosphohpide wurden auf einem COBAS

FARA Gerat (Hoffmann LaRoche Diagnostica, Basel) bestimmt Die

freien Ionenkonzentrationen von Natrium und Kalium bestimmte man mit

einem AVL 985-S Elektrolytanalyzer (AVL List GmbH, Graz,

Osterreich) wahrend die freien Ionenkonzentrationen von Calcium und

Magnesium, sowie der pH-Wert mit einem AVL-988 Analyzer erfasst

wurden Die angewandten analytischen Methoden sind in Tabelle 9 1

zusammengefasst Alle Tests wurden gemäss den Vorschriften der

jeweiligen Geratehersteller durchgeführt

9 1 Klinische Untersuchungen 191

Tabelle 9 1 Klinische Analysemethoden Alle Tests wurden bei 37 °C

nach den Anweisungen des Gerateherstellers durchgeführt

Analyt Methode

Natrium Gesamtkonz

Natrium freie lonenkonz

Kalium Gesamtkonz

Kalium freie lonenkonz

Calcium Gesamtkonz

Calcium freie lonenkonz

Magnesium Gesamtkonz

Magnesium freie lonenkonz

Chlorid

Cholesterin

Gesamtproteine

Glucose

Harnstoff

Triglyceride

Phosphohpide

pH

Indirekte Potentiometrie (ISE)

Direkte Potentiometrie (ISE)

Indirekte Potentiometrie (ISE)


Photometnsch (546 nm)

o-Kresolphthaleinkomplex


Photometrisch (505 nm)

Xylidylblaukomplex


Indirekte Potentiometne (ISE)

Enzymatisch, photometrisch (505 nm)

Cholestennoxidase-PAP-Methode

Photometnsch (546 nm)

Biuret-Methode

Enzymatisch, photometnsch (505 nm)

Peridochrom® (Boehnnger Mannheim)

Glukoseoxidase-PAP-Methode

Enzymatisch, kinetischer UV-Test (340 nm)

Urease-GLDH


GPO-PAP


Phosphohpase D, Chohnoxidase, Peroxidase



9 1 4 Kahbrationsmethoden

Der Hitachi 747 Analyzer wurde durch eine Einpunktkahbration

mit einem biologischen (Serum) Standard kalibriert (Calibrator for Auto

mated Systems Nr 759350, Boehnnger Mannheim GmbH, Mannheim

Deutschland) Das COBAS FARA Gerat zut Phosphohpidbestimmung

wurde ebenfalls durch eine Einpunktkahbration mit einem Standardserum

kalibriert (Wako Chemicals GmbH, Neuss Deutschland) Im Falle der

AVL Elektrolytgerate erfolgte die Kalibration an mindestens 2 Punkten

durch wassnge Standardlosungen (AVL Standard A, B, C und D)

9 1 5 Qualitätskontrolle

Die Präzision und die Richtigkeit der Analysen am klinischen

Laboratorium des Universitatsspitals Zürich wird routinemassig mittels

Kontrollseren Precinorm0 U und Precipath0 U (Boehnnger Mannheim

GmbH, Mannheim, Deutschland), mittels sekundären, zertifizierten Refe-

renzmatenahen für lonenselektive Elektroden (Pferdeserum) (Chemicals

Inspection & Testing Institute, Tokyo, Japan, Lot No W 90-1) sowie

durch Vergleiche mit anderen Labors überwacht Die erhaltenen Mess¬

werte für Quahtatskontrollproben, welche regelmassig analysiert wurden,

lagen alle innerhalb ihrer vorgegebenen Toleranzintervalle Für den

AVL-988 Analyzer wurden zusatzlich wassnge Standardlosungen für die

Richtigkeitskontrolle verwendet Zur Sicherung der Präzision wurde ein

Poolplasma, hergestellt durch Mischung von frischen Humanplasmen, ab

gefüllt in Portionen zu wenigen Millilitern und gelagert unterhalb -20 °C

eingesetzt Für die Analyse wurde jeweils eine Probe aufgetaut, zen

tnfugiert und insgesamt 5 bis 15 mal (in Abhängigkeit des Analyten)

wahrend der gesamten experimentellen Phase vor und nach einer Serie

von unbekannten Proben analysiert Die analytische Variation des Hitachi

9 2 Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmembranen 193

747 Analyzers wurde durch Auswertung der Resultate der Poolplasmen

über die gesamte experimentelle Phase abgeschätzt Sie lag unterhalb von

einem Prozent (95% Vertrauensintervall) für Natrium, Kalium, Chlorid,

Gesamtprotein und Cholesterin und mit Ausnahme von Harnstoff (3 9%,

95% Vertrauensintervall) unterhalb von zwei Prozent für alle anderen

Analyte Für die AVL Elektrolytanalyzer erhielt man Variationen

unterhalb einem Prozent für Natrium und für Kalium wahrend sie für

Calcium und Magnesium zwei Prozent betrugen

9.2. Zusammensetzung und Herstellung von Optodenmem¬

branen

9 2 1 Optodenmembranen basierend auf PVC und OH-PVC

Als Membranbestandteile verwendete man Liganden, Weichmacher

und Zusätze der Qualitatsstufe Selectophore0 der Firma Fluka AG (CH

9470 Buchs) Die eingesetzten Farbstoffe stammten aus der eigenen

Synthese oder wurden als Proben zur Verfugung gestellt Die Ver¬

bindungen IR-125 (Eastman Kodak, Rochester NY, USA) und HITCI

(Aldrich, CH 9470 Buchs) wurden bei den genannten Herstellern bezogen

Sämtliche Membrankomponenten wurden in ein Glaschen mit Gewinde-

verschluss eingewogen Die detaillierte Zusammensetzung findet man im

Anhang 1 Der Weichmacher und die Polymermatrix wurden immer im

Gewichtsverhaltnis 2 1 eingesetzt Das Gesamtgewicht aller Membranbe-

standtede (mit Ausnahme des Losungsmittels) betrug 167 mg Falls nicht

anders vermerkt, wurde jeweils 1 ml frisch destilliertes THF zugesetzt

und bis zur vollständigen Losung auf einem Schuttler gemischt Von der

resultierenden Losung wurden ca 0 4 ml mit einer Glasspritze auf¬

gezogen und mit Hilfe eines Spin on Gerätes [164] auf eine rotierende


Tragerscheibe aus Herasd® Quarzglas (Moller AG, CH-8050 Zürich)

aufgespritzt Durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit oder der Vis¬

kosität des Membrancocktads, war es möglich, die Membrandicke zu

beeinflussen [80] In der Regel wurde mit Membranen von 2-3 pm Dicke

gearbeitet Die Herstellung der Sensormembranen erfolgte in einer

Laminarfluss-Zelle vom Typ Biocyt Modell 95 (Flufrance, Wissous,

Frankreich), welche eine weitgehend staubfreie Umgebung gewährleistete

Jeweils 2 Membranen auf 2 Tragerscheiben wurden in einer Durchfluss-

messzelle [81] zu einem Sensor kombiniert

Fui Messungen im ATR-Modus wurde ein Saphir-Reflexionselement von

1 mm Dicke und 52 mm Lange mit der Optodenmembran beschichtet und

in eine spezielle Durchflussmesszelle eingesetzt [165] Beide Typen von

Durchflussmesszellen waren für Messungen in kommerziellen UV/VIS-

Spektrophotometern (Kap 9 4) adaptiert

9 2 2 Optodenmembranen aus Nafion

400 pl einer 0 001 mol L~' Losung des zu untersuchenden

Farbstoffes (siehe Anhang 1) in Methanol wurden mit 600 pl einer ge¬

brauchsfertigen 5% Nafion Losung in niedrigen aliphatischen Alkoholen

und Wasser (Aldnch, CH-9470 Buchs) gemischt Von dem resultierenden

Membrancocktail wurden dann 200 pl mit Hilfe einer Spritzennadel

gleichmassig über eine Quarz-Tragerplatte verteilt Diese wurden gegen

Licht und Staub geschützt abgedeckt, und man liess das Losungsmittel

über Nacht verdampfen Obwohl diese Membranschichten nicht die

gleiche Homogenitat wie mit dem Spin-on-Verfahren hergestellte Mem¬

branen aufwiesen, waren sie für optische Absorptionsmessungen geeignet

9 3 Messlosungen und Kalibratoren 195

9.3. Messlösungen und Kalibratoren

Für die Herstellung von Pufferlosungen und Kalibratoren verwen¬

dete man Metallsalze von höchstmöglicher Reinheit der Firmen Fluka AG

(CH-9470 Buchs), sowie Merck (D-6100 Darmstadt, Deutschland) Alle

Losungen wurden mit zweifach destilliertem Wasser mit einer Leitfähig¬

keit unter 1 uS / cm angesetzt, das mit einer Destdlationsanlage vom Typ

Buchi Fontavapor 285 (Buchi Laboratoriums-Technik, CH-9230 Flawd)

aufbereitet wurde Die Zusammensetzung der wassrigen, sowie der

methanohschen Pufferlösungen wurde in den meisten Fallen aus dem

Werk von Pernn und Dempsey [166] entnommen

Für die Ca2+-Bestimmung in Vollblut wurden wassnge Kalibratoren mit

physiologischem lonenhintergrund eingesetzt Die Konzentrationen orien¬

tierten sich an den mittleren physiologischen Molalitäten, wie sie in Hu¬

manplasmen angetroffen wurden (Na+ 150 mmol kg"', K+ 4 3 mmol kg ',

Mg2+ 0 51 mmol kg ') Alle Ionen wurden in Form der Chlondsalze

eingebracht Zur Stabilisierung des pH-Wertes wurde die Losung mit

10 mmol kg'HEPES auf pH 7 40 gepuffert Es wurden die folgenden

Ca2+-Konzentrationen eingestellt Kl 0 54 mmol kg"', K2 1 18 mmol kg'

und K3 2 68 mmol kg"1 Die Vollblutproben wurden auf analoge Weise

entnommen, wie im Abschnitt 9 1 2 beschrieben Es wurde ausschliesslich

das eigene Blut verwendet

Die Universalpuffer (Kapitel 7 7) wurden aus einer Stammlosung ange¬

setzt (HßO,, KH,P04 und KCl je 1 mol L"') und der gewünschte pH-Wert

mit 1 mol L'KOH eingestellt Anschliessend verdünnte man auf eine

Konzentration von 0 1 mol L"1


9.4. Messgerate

Alle Einwaagen wurden auf Präzisionswaagen der Firma Mettler-

Toledo (Mettler-Toledo AG, CH-8606 Greifensee) durchgeführt Für die

Einwaage von Optodenmembrancocktails wurde ein Gerat mit einer

Genauigkeit von ±0 01 mg (AT261 Delta Range") eingesetzt Für die pH-

Einstellung der Pufferlosungen verwendete man ein Orion Modell 920 A

pH-Meter mit einer Glaselektrode vom Typ 8103 Ross° (ATI Orion,

Boston MA, USA) Für die Aufzeichnung der Absorptionsspektren

benutzte man ein UV/VIS-Zweistrahl-Spektrophotometer vom Typ

Uvikon942 (Kontron Instruments, CH-8010 Zürich) oder Hitachi U3210

(Hitachi Ltd, Tokyo, Japan) mit den adaptierten Durchflussmesszellen

Die Forderung der Probelosungen im Schlauchsystem der Durchfluss-

messzelle erfolgte mit einer Penstaltikpumpe des Typs Perpex Jubile

(Guldener, CH 8047 Zürich) in der Regel mit einer Geschwindigkeit von

1 5 ml min'

9.5. Computersoftware und -hardware

Die Verarbeitung der aufgezeichneten spektralen Daten erfolgte mit

den Softwarepaketen Igor Pro 3 03 (WaveMetncs Ine,Lake Oswego,

Oregon, USA) oder teilweise auch Microsoft Excel 5 0 (Microsoft Corp ,

Seattle, USA) Für die statistische Datenauswertung verwendete man

Systat 5 2 1 (Systat, Ine,Evanston IL, USA) In allen Fallen wurden

Personal Computer vom Typ Apple Macintosh (Apple Computer Ine,

Cupertino CA, USA) eingesetzt PPP-Berechnungen wurden mit dem

Programm QCPE (Quantum chemistry program exchange) Nr 641 [167]

auf einer Silicon Graphics Indigo 2xz Workstation (Silicon Graphics Ine,

Mountain View CA, USA) durchgeführt


9.6. Verwendete Abkürzungen

Abkürzung Bedeutung

ATR Abgeschwächte Totalreflexion (attenuated total reflection)

C Chromoionophor, Farbstoff

Cl Configuration Interactwn

Crocontum- 2-[4-(Diethylamino)-2-hydroxyphenyl]-5-[4-(l,l-diethyl-

Indikator ammonium)-2-hydroxy-2,5-cyclohexadienyhden]-3,4-

dioxo-1 -cyclopenten-1 -olat

Dicyanovinyl- l,3-Bis(dicyanomethylen)-2-[4'-(A,A'-diethylamino)-

Indikator phenyhmino]indan

DOS Bis(2-ethylhexyl)sebacat, Membranweichmacher

EMK Elektromotorische Kraft

ETH 1001 [(-MR^-Â'-Bis-tlHethoxycarbonyDundecylJ-AgV'-

4,5-tetramethyl-3,6-dioxaoctandiamid, Calciumionophor

ETH 5350 MAf-(Diethyl)-5-[(2-octyldecyl)imino]-5//-benzo[a]-

phenoxazin-9-amin

ETHT 5003 2-[3-Dicyanomethylen-2-(4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]-

phenylamino)indan-1 -yliden]malononitnl

ETHT 5004 2-{2-[{4-[Bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl }-(4-tert-butyl-

phenyl)amino]-3-dicyanomethylenindan-1 -yliden}malono-

nitnl

ETHT 5005 Spiro[{ l,3-bis-dicyanomethylemndan}-2,2'-{ l'-(4-[bis-

(2-ethylhexyl)amino]phenyl)pipendin} ]

ETHT5006 [4-((l,3-Bis-dicyanomethylenindan-2-yl)-{4-[bis-(2-ethyl-

hexyl)amino]phenyl}amino)butyl]tnphenylphosphonium-

lodid


ETHT 5007 V-Adamantan-l-yl-A7'-(l,3-bis-dicyanomethylenindan-2

yl)-A/'-{4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl)malonamid

ETHT 5008 N-Adamantan-1 -y\-N-( 1,3-bis-dicyanomethylenindan-2-

yl)-Ar-{4-[bis-(2-ethylhexyl)amino]phenyl}-A-methyl-

malonamid

ETHT 5009 V-(l,3-Bis-dicyanomethylemndan-2-yl)-A'-{4-[bis-(2-

ethylhexyl)amino]phenyl}-2,4,6-trnsopropylbenzolsulfon-

amid

GLDH Glucosedehydrogenase

GPO Glycerophosphatoxidase

HITCI 1,1 ',3,3,3',3'-Hexamethyl-2,2'-indotncarbocyaniniodid

IFCC International Federation ofClinital Chemistrv

IR-125 Anhydro-1,1 -dimethyl-2-[7-[ 1,1 -dimethyl-3-(4-sulfo-

butyl)-2(l//)-benz[elindohnyhden]-l,3,5-heptatnenyl]-3-

(4-sulfobutyl)-l//-benz[e]indohumhydroxid Natriumsalz

ISE lonenselektive Elektrode

KTFPB Kahum-tetrakis[3,5-bis(trifluorornethyl)phenyl]borat, R

L lonophor, Ligand

MTDDACl Methyltridodecylammomumchlorid, R+

NaTFPB Natnum-tetrakis[3,5-bis(tnfluoromethyl)phenyl]borat, R

NIR Nahes Infrarot

OH-PVC Hydroxy-poly(vinylchlond)

«-NPOE 2-Nitrophenyloctylether, Membranweichmacher

PAP p-Aminophenazon

PDCC104 [l,5-Bis(p-dimethylaminophenyl)-2,4-

pentadienyljcarbeniumperchlorat


pHCOOHBr 5-Carboxy-2-(2- {3-[2-(5-carboxy- 1-ethyl-1,3-dihydro-

3,3-dimethylmdol-2-yliden)ethyliden]-2-chloro-1 -cyclo-

hexen-1 -yl} vinyl)-1 -ethyl-3,3-dimethyl-3//-indohum-

bromtd

PPP Panser-Parr-Pople

Propylen- 4-Methyl-l,3-dioxolan-2-on, Membranweichmacher

carbonat

PVC Poly(vinylchlond)

QCPE Quantum chemistry program exchange

R+ Lipophiler kationischer Zusatz (in der Regel MTDDACl)

R Lipophiler anionischer Zusatz (in der Regel KTFPB oder

NaTFPB)

Squann- 2- [2,2-Diethyl-1,2-dihydro-6//-penmidinium-6-yliden]-4-

Indikator [2,2-diethyl-2,3-dihydro-1 //-penmidin-6-yl]-3-oxo-1-

cyclobuten-1-olat

THF Tetrahydrofuran

Trimethimum- [6-(2-(9-Acndinyl)vinyl)-7,8,9,10-tetrahydro-5-oxa-

Indikator cyclohepta[b]naphthahn-3-yl]diethylamin

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2)2

9(siehe

Nafion

2)

29

(siehe

Nafion

PVC

DOS

2)2

9(s

iehe

pHCOOH+

2)2

9(s

iehe

PDC+

50

117

38

NaTFPB

1001

ETH

5350

ETH

M3

M2

Ml

Polymer

Weichmacher

']kg

[mmol

Additiv

kg

[mmol

']kg

[mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

69

Abschnitt

siehe

Abkürzungen

Für

Membran

der

Gesamtmasse

die

auf

sich

beziehen

Konzentrationsangaben

Alle

Optodenmembranen

der

Zusammensetzung

1Anhang

oz>X>

PVC

OH-PVC

OH-PVC

PVC

PVC

Polymer

25

DOS

KTFPB

26

o-NPOE

NaTFPB

26

o-NPOE

NaTFPB

50

o-NPOE

NaTFPB

42

o-NPOE

NaTFPBkg

"']

[mmol

Weichmacher

Additiv

20

Squarin

31

10

5234

ETH

pHCOOH+

31

10

5234

ETH

PDC+

117

38

1001

ETH

pHCOOH+

58

19

1001

ETH

PDC+

M8

M7

M6

M5

M4

kg"

[mmol

kg"1

][mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

25

PVC

Propylencarbonat

KTFPB

25

PVC

Propylencarbonat

KTFPB

25

PVC

o-NPOE

KTFPB

25

PVC

o-NPOE

KTFPB

25

PVC

DOS

KTFPB

kg"1

][mmol

Polymer

Weichmacher

Additiv

Dicyanovinyl

M13

20

Squarin

M12

20

Dicyanovinyl

Mll

20

Squarin

MIO

20

Dicyanovinyl

M9

kg"'

][mmol

kg"'

][mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

10

PVC

DOS

MTDDAC1

2

PVC

DOS

MTDDAC1

o20

£PVC

DOS

MTDDAC1

20

PVC

DOS

NaTFPB

16

PVC

DOS

KTFPB

kg"1

][mmol

Polymer

Weichmacher

Additiv

20

5004

ETHT

Ml8

20

5004

ETHT

M17

20

ETHT5003

M16

45

17

1001

ETH

Trimethinium

5Ml

15

Trimethinium

M14

kg"']

[mmol

kg"'

][mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

PVC

DOS

PVC

DOS

PVC

PVC

PVC

40

DOS

MTDDAC1

30

DOS

MTDDAC1

20

DOS

MTDDAC1

']kg

[mmol

Polymer

Weichmacher

Additiv

20

5009

ETHT

M23

13

5006

ETHT

M22

20

5004

ETHT

M21

20

5004

ETHT

M20

20

5004

ETHT

M19

kg"']

[mmol

kg"'

][mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

PVC

DOS

20

PVC

DOS

MTDDAC1

20

PVC

DOS

MTDDAC1

kg"1

][mmol

Polymer

Weichmacher

Additiv

1001

ETH

ETHT5009

M26

20

5008

ETHT

M25

20

5007

ETHT

M24

kg"'

][mmol

kg"'

][mmol

Ligand

Chromoionophor

Membran-Typ

225

Anhang 2

Tabelle 1 Gemessene Rohdaten für Blutplasma von 82 Probanden, Status G = gesunde

Probanden VD = Patienten vor der Hämodialyse, ND = Patienten nach der Hämodialyse,

HV = Patienten mit Heizbeschwerden auf der Intensivstation für innere Medizin, Jhg

Jahrgang des Piobanden, t* b°Totale Ionenkonzentration gemessen mit Hitachi 747

Analyzer in mmol L,', llx, c,'4' Aktive Molalitat gemessen auf AVL-Elektrolytanalyzer in

mmol kg,,' „und gerateintern transformiert zur freien Ionenkonzentration, ausgedruckt

in mmol L,'r ht,Hkt Hamatoknt-Wert, Osmol Osmolalitat

Nr Status Sex Jhg c\h c [' c\b c^K c'[^[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']

1 G m 65 140 0 147 1 3 8 40 105

2 G 1 59 140 0 146 9 44 4 6 107

3 G m 69 140 0 147 7 4 1 4 3 104

4 G m 60 142 0 148 2 3 5 3 7 107

5 G m 67 141 0 148 7 3 7 3 8 107

6 G m 67 142 0 148 1 44 46 104

7 G m 63 144 0 149 7 4 1 4 2 105

8 G f 65 142 0 148 3 39 4 1 108

9 G 1 62 141 0 148 6 37 3 9 107

10 G m 62 142 0 149 1 3 8 40 105

11 G f 61 1390 145 1 39 4 1 107

12 G m 66 141 0 149 3 37 3 9 106

13 G f 68 140 0 147 2 3 9 4 2 105

14 G m 67 142 0 149 8 3 8 40 106

15 G f 66 140 0 148 0 4 3 45 105

16 G m 66 141 0 148 3 3 8 4 0 107

17 G m 65 143 0 150 3 4 1 4 3 105

18 G m 65 141 0 148 7 37 3 9 104

19 G m 63 145 0 151 5 4 2 4 4 110

20 G m 65 140 0 147 5 4 3 45 103

21 G m 62 140 0 146 6 43 45 102

22 G m 69 141 0 148 2 4 1 43 107

23 G m 67 142 0 149 1 3 2 3 9 103

24 G m 67 1410 149 5 39 40 104

25 G f 57 140 0 148 3 4 1 43 107

26 G f 63 141 0 149 8 42 45 106

27 G f 43 141 0 148 2 3 8 40 103

28 G f 71 141 0 146 1 44 46 102

29 G f 70 142 0 146 8 44 46 108

30 G f 72 140 0 145 9 4 1 4 3 104

31 G f 71 143 0 148 6 4 3 4 5 109

32 G f 70 140 0 146 7 43 4 5 108

226 ANHANG 2

Tabelle 1 Fortsetzung

Nr Status Sex Jhg c\^ < ;_' c"^ < ^ c'uh[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']

33 G f 68 139 0 144 8 44 4 6 106

34 G f 71 140 0 147 1 37 3 9 105

35 G m 72 142 0 147 5 40 4 1 108

36 G f 70 141 0 147 2 3 8 39 108

37 VD m 36 133 8 139 4 5 7 59 99

38 VD m 26 135 9 143 0 63 66 103

39 VD m 41 138 6 146 5 48 5 1 104

40 VD m 32 138 7 146 2 47 49 103

41 VD f 34 139 2 147 4 5 6 60 106

42 VD f 49 134 0 140 8 54 5 8 93

43 VD m 31 135 9 144 7 6 1 66 98

44 VD m 22 135 8 144 1 57 6 1 97

45 VD f 43 134 2 140 6 6 1 64 98

46 VD f 58 137 2 142 5 70 7 3 100

47 VD m 17 136 9 143 7 44 47 98

48 VD m 50 140 6 147 6 48 5 1 104

49 VD f 59 140 6 146 4 45 4 7 103

50 VD m 64 140 5 148 0 50 5 3 104

51 VD m 67 139 8 146 9 46 48 96

52 VD m 47 135 2 142 0 6 9 7 3 102

53 VD f 58 138 2 145 5 5 9 62 102

54 VD m 65 141 4 148 8 5 0 5 2 108

55 ND m 41 140 3 148 9 4 1 4 4 101

56 ND m 26 138 0 144 7 3 9 4 1 100

57 ND m 32 140 0 149 1 37 40 100

58 ND m 36 1394 145 6 32 3 5 102

59 ND m 31 140 0 148 0 3 6 3 8 102

60 ND m 22 138 2 146 7 49 5 2 101

61 ND t 49 138 2 146 1 3 9 4 1 99

62 ND f 34 139 5 146 6 43 45 102

63 ND f 43 136 4 142 1 47 49 100

64 ND m 67 139 8 149 8 3 6 3 9 101

65 ND m 47 138 7 148 8 4 1 44 101

66 ND m 64 139 6 148 0 43 48 104

67 ND f 58 138 8 149 1 4 1 43 100

68 HV m 51 131 0 135 5 44 46 102

69 HV f 26 137 0 143 1 4 1 43 101

70 HV m 24 139 0 145 7 4 1 43 103

71 HV m 13 132 0 135 9 42 44 96

72 HV f 28 142 0 150 1 42 44 105

73 HV m 16 135 0 141 3 4 8 5 1 100

74 HV t 26 129 0 136 1 43 46 93

75 HV m 28 134 0 147 8 34 4 1 98

76 HV m 28 133 0 145 3 3 8 46 94

77 HV m 38 137 0 144 6 4 3 4 1 105

78 HV m 25 140 0 147 8 45 48 111

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228 ANHANG 2


Nr Status Sex Jhg (fth <" <p'h <

" ,' h

[mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L '] [mmol L ']

36 G 2 29 1 17 0 68 0 47 73 45

37 VD 2 12 1 00 0 53 0 35 58 3 9

38 VD 2 43 1 11 061 0 42 66 3 5

39 VD 2 56 1 19 081 0 52 77 5 5

40 VD 2 13 0 98 0 42 0 27 70 4 5

41 VD 2 16 0 99 0 90 0 59 69 4 8

42 VD 2 38 1 07 0 72 0 48 70 7 5

43 VD 2 62 1 21 0 76 0 50 77 5 2

44 VD 2 49 1 21 0 89 0 57 71 62

45 VD 2 34 1 06 0 75 0 47 74 3 3

46 VD 2 26 1 05 1 00 0 68 66 7 6

47 VD 1 97 091 0 63 041 71 44

48 VD 2 74 1 31 0 87 0 53 75 5 7

49 VD 2 19 1 00 0 96 0 62 67 54

50 VD 2 88 1 34 0 77 0 43 69 4 3

51 VD 2 53 1 08 0 89 0 54 72 43

52 VD 2 64 1 25 0 54 0 33 69 5 1

53 VD 2 55 1 21 091 0 59 71 64

54 VD 2 02 0 92 081 0 53 64 4 8

55 ND 2 94 1 32 0 39 0 19 86 60

56 ND 2 74 1 27 0 36 0 18 68 3 6

57 ND 2 62 1 19 0 30 0 13 81 5 1

58 ND 2 62 1 20 0 50 0 30 73 4 8

59 ND 2 78 1 27 061 0 33 83 56

60 ND 2 68 1 31 0 48 0 26 76 69

61 ND 2 69 1 04 0 34 0 17 79 86

62 ND 2 58 1 22 0 45 0 24 75 5 3

63 ND 2 36 1 13 0 60 0 38 71 3 2

64 ND 2 87 1 23 0 62 0 34 84 49

65 ND 2 90 1 34 0 48 0 23 79 60

66 ND 2 89 1 38 0 36 0 15 74 45

67 ND 2 75 1 36 0 53 0 29 77 70

68 HV 1 91 1 03 1 Ol 0 79 66 23

69 HV 2 26 1 12 0 88 0 56 71 59

70 HV 2 12 1 00 0 89 0 59 72 37

71 HV 201 1 04 0 59 0 40 58 36

72 HV 2 09 1 08 0 87 0 57 69 47

73 HV 2 12 1 15 0 89 0 64 66 33

74 HV 2 29 1 07 0 79 0 49 73 46

75 HV 2 12 1 03 081 0 54 71 46

76 HV 2 18 1 03 0 72 0 46 66 65

77 HV 2 15 1 10 0 76 0 53 68 5 2

78 HV 2 19 1 10 0 77 0 48 66 50

79 HV 2 12 1 05 0 80 051 72 56

80 HV 2 03 1 08 0 63 0 43 64 4 1

81 HV 2 09 1 04 1 07 0 73 65 44

82 HV 2 09 1 03 0 79 0 53 70 39

Tabelle 1 229

Tabtlle 1 Fottset/ung

Nr Statusr

tph '

( u

it pH Hkr Osmol

[mmol t ] [mmol L '] [mmol L ] [mmol L ] [mmol kg ']

1 G 1 63 2 6 4 2 4 3 761 0 46 285i G 0 55 2 8 4 5 2 8 7 55 0 42 272

3 G 2 17 2 8 45 46 7 73 0 50 277

4 G 1 00 2 3 3 8 8 8 7 53 0 46 289

5 G 1 12 2 3 5 2 45 7 62 0 48 284

6 G 0 52 2 4 40 5 1 7 63 0 47 280

7 G 0 62 2 4 49 4 3 7 55 0 49 289

8 G 0 54 20 3 7 5 1 7 46 0 42 277

9 G 0 99 3 1 40 3 7 7 53 0 43 276

10 G 1 18 2 4 54 4 3 7 52 0 45 280

11 G 1 05 2 2 6 1 2 6 7 59 0 37 275

12 G 071 2 0 4 9 4 8 7 57 0 42 281

13 G 1 09 2 8 3 8 4 1 7 59 0 38 274

14 G 0 79 2 1 44 5 5 7 66 0 46 288

15 G 1 06 2 8 40 3 2 7 57 0 46 287

16 G 1 01 2 1 4 4 46 7 70 0 45 282

17 G 1 05 2 2 4 1 5 9 7 55 291

18 G 1 14 2 5 5 1 4 1 7 56 0 46 287

19 G 0 59 24 40 4 8 7 66 041 286

20 G 1 39 2 5 5 0 3 8 7 55 0 48 287

21 G 0 49 1 7 40 5 4 7 59 041 283

22 G 0 45 2 0 3 7 59 7 59 0 46 289

23 G 0 97 2 1 39 5 3 7 78 0 45 288

24 G 0 75 2 1 37 3 5 7 57 0 48 287

25 G 1 22 2 6 3 9 4 3 7 75 0 44 282

26 G 0 42 2 2 3 2 5 1 7 75 0 42 291

27 G 1 52 3 2 4 3 3 0 7 55 0 42 287

28 G 1 85 4 2 7 7 3 7 7 54 0 48 285

29 G 0 60 3 1 4 5 3 8 7 53 0 40 284

30 G 1 02 3 8 47 3 5 7 52 0 42 277

31 G 0 82 2 9 44 3 7 7 49 0 40 278

32 G 1 85 3 7 3 9 4 3 7 54 0 44 278

33 G 0 80 3 3 49 5 3 7 52 041 278

34 G 0 98 24 4 7 3 8 7 53 0 40 281

35 G 0 83 2 3 48 5 9 7 55 0 46 285

36 G 071 3 1 45 3 5 7 55 0 42 288

37 VD 1 39 3 3 5 2 129 781 0 36 290

38 VD 1 17 2 3 8 7 199 7 70 0 35 304

39 VD 1 73 3 5 4 1 21 8 7 67 0 38 310

40 VD 3 14 29 65 24 0 7 68 0 28 309

41 VD 1 67 3 0 5 6 26 6 7 66 0 38 317

42 VD 2 82 45 63 22 3 7 65 0 36 306

43 VD 1 77 29 5 1 29 7 7 55 031 318

44 VD 4 93 3 7 5 5 22 1 7 55 0 36 312

45 VD 1 18 2 5 4 2 21 5 7 64 041 301

46 VD 1 72 49 5 2 25 4 7 65 0 35 311

230 ANHANG 2


Nr Status p k

S TrüvLU dec

Ph v|ti hrmk

Pr Ik

'.GIlK «.

Pl tlL

ti Humi II pH Hkr Osmol

[mmol L '] [mmol L"1] [mmol L" '] [mmol L"' ] [mmol kg ']

47 VD 0 78 29 95 17 9 7 73 0 34 307

48 VD 2 50 3 7 4 8 21 6 7 62 0 35 316

49 VD 2 25 3 3 66 160 7 67 0 35 307

50 VD 1 64 2 7 49 27 9 771 0 39 319

51 VD 2 57 29 45 23 3 7 75 0 33 311

52 VD 2 16 3 1 63 30 8 7 64 0 37 317

53 VD 2 25 45 47 25 3 7 67 0 33 317

54 VD 1 22 3 4 3 3 169 7 80 0 29 306

55 ND 0 88 3 6 6 1 67 7 77 299

56 ND 0 79 2 3 5 0 7 6 7 86 292

57 ND 2 76 3 4 5 4 11 6 7 55 304

58 ND 1 55 40 60 4 8 7 86 294

59 ND 1 67 3 2 74 11 5 7 85 300

60 ND 3 95 3 9 7 9 9 8 7 56 298

61 ND 2 56 5 2 8 7 7 1 771 299

62 ND 1 75 3 6 70 10 8 7 62 300

63 ND 1 11 2 6 5 0 11 5 771 296

64 ND 1 87 3 1 62 87 7 92 301

65 ND 1 66 3 5 7 1 120 7 62 303

66 ND 1 44 2 8 5 7 11 2 7 78 303

67 ND 1 30 4 8 7 1 5 5 7 62 303

68 HV 1 96 2 1 3 0 32 1 7 35 0 37 289

69 HV 1 79 3 4 4 6 5 2 7 67 0 37 284

70 HV 1 03 23 70 8 1 7 74 0 47 289

71 HV 1 48 2 4 6 9 12 3 7 59 0 34 282

72 HV 3 72 3 8 11 5 10 4 7 48 0 36 307

73 HV 1 76 2 6 6 2 10 0 7 64 0 36 292

74 HV 1 81 29 5 5 5 5 7 58 0 43 268

75 HV 1 90 3 5 7 9 122 7 63 0 42 286

76 HV 2 33 3 6 11 3 109 7 58 0 42 290

77 HV 2 28 34 6 1 92 7 53 0 44 289

78 HV 1 18 3 1 7 8 94 7 55 0 44 292

79 HV 2 78 3 5 48 8 1 7 55 041 288

80 HV 1 04 23 37 9 3 8 7 49 0 34 292

81 HV 1 61 29 66 43 7 66 0 44 276

82 HV 1 96 3 1 57 48 7 63 0 38 274

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34253428

34163405

34203413

34173414

34133416

34203413

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34213395

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34113426

34193436

34113417

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35393509

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35313555

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35153517

35063496

35103503

35073504

35043507

35113504

35083511

35113486

35063494

35093512

35023516

35093525

35023507

35093492

35033513

35103513

35143512

232 ANHANG 2


Nr Status~

T"" 7"""~ ~ ~ ~

[kg L '] [mmol L '] [mmol kg '](6 2) (6 7a) (6 7b) (6 10a) (6 10a) (6 10a) (6 10a)

45 VD 0 933 144 9 155 3 0 7452 0 7291 0 3448 0 3536

46 VD 0 934 149 4 159 9 0 7433 0 7268 0 3420 03510

47 VD 0 934 145 3 155 5 0 7453 0 7290 0 3450 0 3539

48 VD 0 929 150 9 162 5 0 7423 0 7255 0 3405 0 3495

49 VD 0 935 150 0 160 4 0 7432 0 7265 0 3419 0 3509

50 VD 0 936 150 8 161 2 0 7428 0 7261 03412 0 3502

51 VD 0 932 149 2 160 1 0 7433 0 7267 0 3421 03511

52 VD 0 934 146 8 157 2 0 7444 0 7282 0 3436 0 3525

53 VD 0 931 149 5 160 6 0 7430 0 7264 0 3415 0 3505

54 VD 0 939 150 8 160 6 0 7431 0 7265 0 3420 0 3510

55 ND 0 922 148 9 161 5 0 7428 0 7261 0 3415 0 3505

56 ND 0 938 146 3 156 0 0 7450 0 7287 0 3445 0 3534

57 ND 0 925 147 7 159 7 0 7436 0 7270 0 3426 0 3516

58 ND 0931 147 1 158 1 0 7441 0 7277 0 3433 0 3522

59 ND 0 924 148 4 160 5 0 7432 0 7265 0 3420 03510

60 ND 0 926 147 8 159 6 0 7435 0 7270 0 3424 03514

61 ND 0 923 145 8 157 9 0 7443 0 7279 0 3438 0 3527

62 ND 0 930 148 2 159 4 0 7436 0 7271 0 3426 03516

63 ND 0 935 145 7 155 8 0 7451 0 7288 0 3445 0 3534

64 ND 0 924 148 2 160 4 0 7432 0 7265 0 3419 0 3509

65 ND 0 926 147 5 159 2 0 7437 0 7272 0 3427 03517

66 ND 0 932 148 5 159 4 0 7436 0 7271 0 3425 03515

67 ND 0 927 147 8 159 5 0 7435 0 7270 0 3424 03513

68 HV 0 938 140 9 150 1 0 7473 07316 0 3475 03561

69 HV 0 932 146 1 156 7 0 7446 0 7283 0 3439 0 3527

70 HV 0 934 147 8 158 3 0 7441 0 7276 0 3431 0 3521

71 HV 0 944 140 5 148 9 0 7480 0 7324 0 3487 0 3573

72 HV 0 932 151 2 162 1 0 7425 0 7257 0 3410 0 3500

73 HV 0 938 145 2 154 8 0 7454 0 7293 0 3448 0 3536

74 HV 0 932 138 0 148 1 0 7483 0 7327 0 3490 0 3576

75 HV 0 933 142 1 152 3 0 7465 0 7305 0 3465 0 3552

76 HV 0 935 141 3 151 1 0 7471 07312 0 3473 0 3560

77 HV 0 935 146 2 156 4 0 7448 0 7285 0 3441 0 3529

78 HV 0 937 149 2 159 2 0 7437 0 7271 0 3426 0 3516

79 HV 0 931 148 5 159 5 0 7436 0 7270 0 3425 03515

80 HV 0 940 135 5 144 2 0 7500 0 7347 03515 0 3599

81 HV 0 938 146 4 156 1 0 7449 0 7286 0 3441 0 3529

82 HV 0 934 143 9 154 0 0 7458 0 7297 0 3455 0 3543

Tabelle 2 233


Nr Status Y, at a

M E(|['%] [%] [mV]

(6 10a) (5 4)

1 G 0 7450 48 3 59 7 -0 77

2 G 0 7451 50 0 68 0 -0 79

3 G 0 7449 45 5 61 0 -0 74

4 G 0 7448 49 3 65 8 -0 79

5 G 0 7450 47 9 62 3 -0 79

6 G 0 7442 46 1 61 6 -0 72

7 G 0 7434 48 5 62 2 -0 73

8 G 0 7447 50 0 63 4 -0 80

9 G 0 7446 48 7 64 9 -0 80

10 G 0 7442 48 1 65 4 -0 76

11 G 0 7460 49 5 64 0 -0 80

12 G 0 7448 47 8 65 8 -0 78

13 G 0 7452 48 5 64 7 -0 76

14 G 0 7442 49 1 64 8 -0 77

15 G 0 7450 48 5 63 4 -0 76

16 G 0 7448 48 7 66 2 -0 79

17 G 0 7436 48 3 65 8 -0 74

18 G 0 7447 47 4 62 3 -0 75

19 G 0 7431 48 5 65 1 -0 81

20 G 0 7449 47 1 63 2 -0 72

21 G 0 7448 47 3 64 9 -0 71

22 G 0 7447 48 9 64 9 -0 79

23 G 0 7444 47 0 63 8 -0 73

24 G 0 7447 46 2 62 7 -0 74

25 G 0 7447 50 4 65 0 -0 80

26 G 0 7444 49 6 65 8 -0 77

27 G 0 7445 49 6 65 8 -0 73

28 G 0 7445 48 7 66 1 -0 70

29 G 0 7442 50 9 69 2 -0 79

30 G 0 7449 49 1 68 9 -0 75

31 G 0 7437 50 7 67 6 -0 81

32 G 0 7447 50 2 68 8 -0 81

33 G 0 7454 50 7 69 3 -0 78

34 G 0 7451 49 3 66 7 -0 77

35 G 0 7445 50 9 69 6 -0 80

36 G 0 7448 51 1 69 1 -0 81

37 VD 0 7478 47 2 66 0 -0 65

38 VD 0 7462 45 7 68 9 -0 70

39 VD 0 7450 46 5 64 2 -0 74

40 VD 0 7455 46 0 64 3 -0 71

41 VD 0 7447 45 8 65 6 -0 75

42 VD 0 7470 45 0 66 7 -0 57

43 VD 0 7455 46 2 65 8 -0 64

44 VD 0 7458 48 6 64 0 -0 63

45 VD 0 7466 45 3 62 7 -0 64

234 ANHANG 2


Nr Status y,a V, «,M. E„

[%] [%] [mV]

(6 10a) (5 4)

46 VD 0 7449 46 5 68 0 -0 64

47 VD 0 7465 46 2 65 1 -0 64

48 VD 0 7441 47 8 60 9 -0 74

49 VD 0 7448 45 7 64 6 -0 71

50 VD 0 7445 46 5 55 8 -0 73

51 VD 0 7449 42 7 60 7 -0 60

52 VD 0 7458 47 3 61 1 -0 68

53 VD 0 7447 47 5 64 8 -0 69

54 VD 0 7445 45 5 65 4 -0 77

55 ND 0 7443 44 9 48 7 -0 70

56 ND 0 7464 46 4 50 0 -0 68

57 ND 0 7448 45 4 43 3 -0 68

58 ND 0 7457 45 8 60 0 -0 72

59 ND 0 7448 45 7 54 1 -0 73

60 ND 0 7450 48 9 54 2 -0 70

61 ND 0 7455 38 7 50 0 -0 66

62 ND 0 7450 47 3 53 3 -0 71

63 ND 0 7465 47 9 63 3 -0 67

64 ND 0 7448 42 9 54 8 -0 70

65 ND 0 7453 46 2 47 9 -0 70

66 ND 0 7451 47 8 41 7 -0 75

67 ND 0 7452 49 5 54 7 -0 69

68 HV 0 7492 53 9 78 2 -0 76

69 HV 0 7464 49 6 63 6 -0 71

70 HV 0 7456 46 9 65 7 -0 73

71 HV 0 7494 51 7 67 8 -0 64

72 HV 0 7441 51 7 65 5 -0 75

73 HV 0 7472 54 0 71 9 -0 70

74 HV 0 7499 46 7 62 0 -0 62

75 HV 0 7481 48 6 66 7 -0 69

76 HV 0 7486 47 2 63 9 -0 61

77 HV 0 7464 51 2 69 7 -0 78

78 HV 0 7452 50 2 62 3 -0 85

79 HV 0 7452 49 5 63 8 -0 68

80 HV 07516 53 2 68 3 -0 68

81 HV 0 7467 49 8 68 2 -0 78

82 HV 0 7474 49 3 67 1

235

Curriculum Vitae

von

Daniel Citterio

1967 Geboren am 17 12 67 als Sohn von Viktor und Christa

Otteno-Labitzke in Zürich, Burger von Zürich

1974-1979 Primarschule in Zürich

1980-1986 Literargymnasium Ramibuhl in Zürich, Matura

Typus B

1986-1987 Certificate of Proficiency in Enghsh an der McGdl

University Montreal (Kanada)

1987 Militärdienst (Februar-November)

1987-1992 Studium an der Eidgenossischen Technischen Hoch

schule (ETH) Zürich, Abt IV (Chemie)

1991 Ausbildung zum Strahlenschutzsachverstandigen am

Paul-Scherrer-Institut (PSI) Wurenlingen

1992 Diplom der ETH Zürich, Diplomarbeit in der

Arbeitsgruppe von Prof Dr Wilhelm Simon

1992-1993 Anstellung bei der ANAWA AG in Wangen (ZH),

Pharmakokinetische Studien (GC / HPLC)

kommerzieller Pharmaka

1993-1997 Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Gerd

Folkers unter der Leitung von PD Dr Ursula E

Spichiger am Zentrum für Chemische Sensoren, ETH

Zürich

1996 Stipendiat der Masuda Foundation in der Arbeitsgruppe

von Prof Dr Yoshio Umezawa (August-November),

School of Science, University of Tokyo (Japan)

236 LEBENSLAUF

1994-1997 Praktikumsassistent in analytisch-chemischen Praktika

an der ETH Zürich sowie der Ingenieurschule

Wadenswd (ISW)

1998- Postdoktorat in der Arbeitsgruppe von Prof Dr Koji

Suzuki, Keio University, Yokohama (Japan)

Documents

Einsatz in optischen Sensoren Absorptionsbanden im nahen … · 2020. 3. 26. · den MitdoktorandenCaspar Demuth, Alphons Fakler und Mathias Nagele sowie Dr WStahel vomSeminarfür