Elektronenmikroskopischer Nachweis von mitochondrialer Adenosintriphosphataseaktivität in tierischen Geweben

Histochemie 5, 417--429 (1965)

Insti tut fiir Kreislaufforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch

E L E K T R O N E N M I K R 0 S K O P I S C H E R N A C H W E I S

V 0 N M I T O C H O N D R I A L E R A D E N O S I N T R I P H O S P H A T A S E A K T I V I T A T

I N T I E R I S C H E N G E W E B E N

W. SC•ULZE u n d A. WOLLENBERG~R

Mit 7 Textabbildungen

(Eingega~gen am 8. Juli 1965)

Summary. By means of a modified Wachstein-Meisel method, 40--200 ~ thick frozen sections of cardiac and diaphragmatic musculature, epithelium cells from the mucosa of the small intestine, and certain parts of the renal tubuli of various species were tested for nucleo- side phosphatase activity. After brief fixation with osmium tetroxide fine lead precipitates were found in the mitochondria. These precipitates were observed directly along the membranes of the cristae mitochondriales and the limiting membrane of the mitochondria. The lead phosphate precipitate on the membranes of the mitochondria was only demonstrable, if ATP was present (in cardiac muscle also in the presence of ITP); this specificity was not observed in the tests done on diaphragm. When ADP was used as substrate no reaction took place. In all cases the reaction was dependent on the presence of Mg ++ ions; it was enhanced in the presence of Na + and K + and completely inhibited by Ca ~+.

p-Chloromercuribenzoic acid inhibited the reaction, g-strophanthin had no effect even in the presence of Na + and K +. Not even after addition of dinitrophenol was it possible to demon- strate mitochondrial ATPase in thin liver sections. Isolated mitochondria and mitochondrial fragments from cardiac musculature and liver gave a positive ATPase reaction.

Zusammeufassuug. Mit einer abgei~nderten Wachstein-Meisel-Methodik zur Darstellung yon Nukleosidphosphataseaktivit~t werden in 40--200 ~z dicken Gefrierschnitten yon Herz- und Zwerchfellmuskulatur, yon Mucosaepithelzellen des Diinndarms und yon einigen Teilen der :Nierentubuli verschiedener Spezies nach kurzer Osmiumtetroxyd-Vorfixierung feine Bleiphosphatablagerungen in den Mitochondrien gefunden. Diese Ablagerung liegt direkt an den Einzelleisten der Cristae mitochondriales und der Aul3enmembran der Mitochondrien. Der Bleiphosphatniederschlag an den Membranen der Mitochondrien war in den untersuchten Geweben, mit Ausnahme des Zwerchfells, nut in Anwesenheit yon ATP (ira Herzmuskel auch in Gegenwart yon ITP), nicht aber yon anderen Nukleosidtriphosphaten oder yon ADP als Substrat, zu beobachten. Die Reaktion war in allen F~llen abh~ngig yon Mg ++ und wnrde durch Zusatz yon Na + und K+ gefSrdert und durch Ca ++ vollst~ndig gehemmt.

p-Chlormercuribenzoes~ure hemmt die Reaktion, g-Strophanthin war auch in Gegenwart yon Na + und K + wirkungslos. Es gelang nicht, auch nicht nach Zusatz yon Dinitrophenol, mit der benutzten Methodik mitochondriale ATPase-Aktivit~t in Leberdfinnschnitten nach- zuweisen. Isolierte Mitochondrien und Mitochondrienbruchstiicke aus Herzmuskel und Leber gaben eine positive ATPase-Reaktion.

U b e r die h i s t o c h e m i s c h e D a r s t e l l b a r k e i t v o n m i t o c h o n d r i a l e r Adenos in -

t r i p h o s p h a t a s e - ( A T P a s e - ) A k t i v i t ~ t m i t de r B l e i s a l z m e t h o d e im L i c h t m i k r o s k o p b e s t e h e n k a u m noch Zweife l (NOVIKOFF, HAUSMAN, PODBER, 1958; NOVIKOFF, DRUCKER, SHIN, GOLDFISCHER, 1961; WACHSTEIN, BRADSHAW, ORTIZ, 1962;

WACHSTEIN, MEISEL, •IEDZWIEDZ, 1960; PADYKULA, GAUTHIER, 1963; HORI,

C~ANG, 1963). D a g e g e n w e r d e n i m m e r n o c h B e d e n k e n gegen die A n w e n d u n g dieser M e t h o d i k ffir die e l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h e n N a c h w e i s v e r f a h r e n ges

418 W. SeRULZ~ und A. WOLLENBERGER:

(GOLDFISCItER, ESSNER, NOVIKOFF, 1964). Doch liegen schon einige Arbe i t en fiber die ATPase -Dars t e l lung in Mitochondr ien mi t Hilfe der E lek t ronenmikro- skopie vor. So wurde mi tochondr ia le A T P a s e - A k t i v i t ~ t e lek t ronenmikroskopisch von LAZARUS und BARDEN (1962, 1964) in den aeini~ren Zellen des Pankreas , von OTERO-VILARDEBO, LANE und GODMAN (1962) in Colonmucosazellen, yon ASHWORTR, LUIBEL und ST]~WART (1963) in Je junumepi the lze l len , P lasmazel len der Leber und verschiedenen Abschn i t t en der Nie ren tubu l i und von SCHULZE und WOLLENBERGER (1962, 1963) im Herzgewebe nachgewiesen. Allerdings bes tehen bei den genann ten Auto ren noeh unterschiedl iche Auffassungen fiber I nkuba t i onsmed ium, fiber A r t der Vorbehand lung und besonders auch fiber den Ort der A T P - S p a l t u n g in den Mitochondrien.

I n der vor l iegenden Arbe i t wird an H a n d yon Ergebnissen neuer licht- und elektronenmikroskopis~her Untersuchungen unsere Auffassung fiber die DarsteU- barkeit mitochondrialer A TPase-Aktivitiit an verschiedenen t ier ischen Geweben pr~zisiert und mi t den SehluBfolgerungen anderer Au to ren verglichen. Auf Beobach tungen fiber die gleiehzeit ig dars te l lbare A T P a s e - A k t i v i t ~ t anderer zellul~rer S t ruk tu ren wie Ze l lmembranen und endoplasmat i sehes Re t iku lum wird hier n icht eingegangen, da hierfiber an anderer Stelle ber ich te t werden soll (WOLLENBERGER, SCHULZE, 19C6).

Material und Methodik Adulte Labormiiuse, weifle Wistarratten, Meerschweinchen, Kaninchen und Fr5sche

beiderlei Geschlechts wurden verwendet. Gewebestfickchen aus Diinndarm, :Niere, Leber, Herz, Zwerchfell wurden nach Dekapitierung oder leichter Narkose herausgeschnitten, sofort am Gefriermikrotom mit Kohlens~ureschnee eingefroren und mit tiefgekiihltem Messer in 200, 120 und 60 ~ dicke Schnitte zerlegt. Auch wurden 40 ~z Kryostatschnitte (Dittes-Duspiva- Kryostat) hergestellt. Diese Schnitte wurden nach Vorfixierung ffir 3 rain in 0 ~ ~ C kalter OsmiumtetroxydlSsung nach CAUL~ELD (1957), ffir 10 min in kalter FormalinlSsung nach HOLT und HICKS (1961) oder fiir l0 min in 2%igem Glutar- oder 6%igem Hydroxiadipin- dialdehyd nach SABATI~I, BENSCH und BARR~ETT (1963) sofort sehr griindlich bis zu 30 rain bei 0 ~ C in 0,25 M Saccharose-TrispufferlSsung gewaschen und anschlieflend in den unten beschriebenen Medien inkubiert. Von den gleichen Gewebeproben wurden jeweils 10 ~z dicke Kryostatschnitte unter ~hnlichen Bedingungen mit verkfirzten Vorfixierungszeiten ffir die lichtmikroskopische Bearbeitung verwendet. Aul3erdem wurden isolierte Mitochondrien (HoGEBOOM, 1955) entweder sofort oder nach Inaktivierung durch Hitze oder lange Fixie- rungszeiten mit isolierten aktiven, d. h. chemisch nachweisbare ATPase-Aktivit~t besitzenden Myofibrillen (PERRY, 1960) vermischt und nach entsprechender Vorbehandlung ebenfalls im unten beschriebenen Standard-ATPase-Medium inkubiert. Dieses Medium, das gegeniiber dem Wachstein-Meisel-Medium (1957) einige Veri~nderungen aufwies, hatte folgende Zu- sammensetzung: In 10 ml InkubationslSsung yon pH 7,2--7,4 befanden sich 12,5 mmolares Tris, 30 mmolares Kaliumnatriumtartrat (vgl. MOLBERT, DUSPIVA, V. DEIMLING, 1960), 2,5 mmolares Magnesiumsulfat, 5 mmolares Bleiacetat und 2,5 mmolares ATP-Dinatriumsalz. Das Kaliumtartrat lieB sich durch 30 mmolaros Tiron (Natrium-3,5 Brenzkatechinsulfonat) ersetzen oder erg~nzen (v. DEIMLI~O, 1964).

Abki~rzungen: ADP Adenosindiphosphat; ATP Adenosintriphosphat; ATPase Adenosin- triphosphatase; CTP Cytidintriphosphat; GTP Guanosintriphosphat; ITP Inosintriphosphat; UTP Uridintriphosphat; Tris 2-Amino-2-oxymethylpropan-l,3-diol; DNP 2,4-Dinitrophenol; PCMB p-Chlormercuribenzoesi~ure.

Chemikalien: ATP, ADP - - Firma Boehringer und SShne, Mannheim; CTP, GTP, UTP, ATP - - Sigma Chemical Co., St. Louis.

Dieses Inkubationsmedium wurde in einer Reihe yon Versuchen wiefolgt ver~ndert: 1. Kaliumnatriumtartrat wurde durch Weins~ure ersetzt, und start Na-ATP wurde Tris-

ATP verwendet. Die Schnitte wurden nach der Vorfixierung 30 min in gepufferter Saccharose-

Elektronenmikroskopischer Nachweis mitochondrialer ATPase 419

15sung gewaschen. Flammenphotometrische Messungen der gewaschenen Schnitte zeigten ein fast vSlliges Verschwinden des gewebeeigenen Kaliums und Natriums. Zur Prfifung des Ein- flusses yon Kalium und Natrium auf die ATPase-Aktivit~t wurden diese Ionen in verschiedenen Konzentrationen als Chloride hinzugegeben.

2. Statt Magnesiumsulfat wurde 18 mmolares oder 2 mmolares Calciumchlorid hinzugesetzt.

3. An Stelle yon ATP wurden 2,5 mmolares ITP, GTP, UTP, CTP oder ADP verwendet. AuBerdem wurden 8 mmolares u-, fl-Glycerophosphat, 4 mmolares Dinatriumphenylphosphat oder Natriumpyrophosphat eingesetzt.

4. Ferner wurde die Wirkung von 0,2 mmolarem DNP, 2,5 mmolarem PCMB und yon 1, 0,1 und 0,01 mmolarem g-Strophanthin durch Vorbehandlung und durch Zusetzen dieser Substanzen zur InkubationslSsung getestet.

Die Inkubationszeit betrug in allen F~llen 20--40 min, die Temperatur 37 o C. Nach der Inkubation wurden die Schnitte kurz in Tris-Saccharose gespfilt und ffir die

Elektronenmikroskopie 2 Std in OsO4-LSsung nachfixiert, fiber Alkohol entw~ssert und in Butyl-Methylmethacrylat (4:1) oder Araldit eingebettet. Die Dfinnschnitte wurden mit dem LKB-Ultrotom angefertigt, wobei darauf geachtet wurde, da[~ mSglichst nur Schnitte, die etwa 10 [z vom Gewebsrand entfernt lagen, aufgefangen wurden. Mikroskopiert wurde mit dem Standardelektronenmikroskop (SEM 3) des Werkes ffir Fernsehelektronik, Berlin- SchSneweide, mit 40--50 ~ Objektivblenden bei 60 kV.

Ergebnisse Mitochondriale A TPase-Reaktion in verschiedenen Geweben im Standard-

Inkubationsmedium. Naeh Inkuba t ion im Standard-ATPase-Medium sieht man im Elektronenmikroskop besonders nach kurzer OsO4-Vorfixierung von Geffier- schnit ten in allen untersuchten Geweben mit Ausnahme der Leber Bleiphosphat- ablagerungen in den Mitochondrien. Der Durehmesser der Bleiphosphatkristalle betri~gt etwa 80--100 A und gestat te t eine genaue Beschreibung der Lokalisation in den Mitochondrien. Besonders Mitochondrien aus Warmblfiterherz- und -zwerchfellmuskel, in denen die Bleipr~zipitation in der Regel sehr intensiv und deutlich ausgepri~gt ist, zeigen eine starke Reakt ion der Einzelleisten der Cristae mitochondriales und der doppelkonturier ten Au~enmembran (Abb. 1, 2). Das helle Spat ium ist ohne Bleiniederschlag. Nur bei sehr kr~ftiger Ablagerung, bedingt durch Uberinkubat ion, ist der genaue Lokalisationsort in den Mitochon- drien verdeckt (Abb. 3). Speziesunterschiede hinsichtlich der Intensit i i t der ATPase-Reakt ion in den verschiedenen Geweben wurden nicht beobachtet . I n den untersuehten Amphibienherzen (R. esculenta) sind ebenfalls nur die Cristae mitochondriales gef~rbt (Abb. 4). I m Zwerchfell zeigten sowohl die randst~ndigen groi~en als auch die in HShe der I -Zonen gelegenen kleinen paarigen Mitoehondrien die gleiche Schwiirzungsintensitat. Auch in den Iterzmuskelzellen unterschieden sich die einzelnen Mitoehondrien nicht hinsiehtlich der St~rke der Bleiablagerung. Unter den gleichen Bedingungen liel~ sich in den Mitochondrien der Mueosazellen des Duodenums nur eine verh~ltnism~Big schwache Bleipri~zipitation erzielen, und nieht alle Mitochondrien waren gleichm~l~ig gefi~rbt. Wiederum waren die Mem- branen der Mitochondrien die Tr~ger des Bleiniedersehlags.

Schwieriger gelingt der elektronenmikroskopische Nachweis der ATPase- Aktivi t~t in den Mitochondrien der Nierentubuliabsehnitte. Wir fanden bisher hauptsiichlich in den Mitochondrien aus den distalen Teilen der Tubuli contort i I. Ordnung Bleiablagerungen (Abb. 5). Die in anderen Abschni t ten liegenden

420 W. SCHULZE und A. WOLLENBERGER:

Abb. 1. U l t r ad t innschn i t t durch einen 120 Iz Gefr ierschnit t aus dem Herzmuske l der Maus nach I n k u b a t i o n im ATPase-Medium. Ble iphospha tab lagerungen an den Einzel le is ten der Cristae mitochondriales und den Aui3en- membranen der Mitochondrien. Pos i t ive Reak t ion auch an den Membranen des endoplasmat isehen Ret iku lums .

YergrSl3erung 40000 :1

Mitochondrien waren meist frei yon inkubationsbedingten Bleipr/~zipitationen. Auch die zwischen den fl-Cytomembranen im proximalen Teil der Tubuli contorti gelegenen langgestreckten Mitochondrien wiesen nur in einigen F/~llen eine Reaktion auf. Das Verhalten der einzelnen Membransysteme in der Niere soll sp/~ter gesondert beschrieben werden.


Abb. 2. Querschni t t du tch den I t e rzmuske l der Maus. E in M:itochondrium sti irker vergrS[~ert. Bleikristalle an den Cristae mitochondriales . VergrSBerung 75000:1

In Mitochondrien aus Lebergewebeschnitten war der Nachweis einer ATPase bisher ohne Erfolg. Auch nach Vorbehandlung oder Inkubat ion mit DNP blieb eine sichtbare Reaktion aus. Dagegen fanden sich in Experimenten mit isolierten Mitochondrien aus der Kaninchenleber grSbere Bleiphosphatablagerungen innerhalb der Mitochondrien ohne deutliche Beziehung zu best immten Strukturen (Abb. 7).

Aldehydvor/ixierung. Die Vorfixierung mit den oben aufgefiihrten Aldehyden erschwerte die Darstellung der mitochondrialen ATPase erheblich. Lediglich eine Vorbehandlung mit Formalin in der yon HOLT und HICKS (1961) beschriebenen Art gab in einigen wenigen Fallen in Herz- und Nierenmitochondrien


Abb. 3. Lfingsschni t t durch die Zwerchfe l lmuskula tur der Maus. Infolge 0be r inkuba t ion (40 rain) s ind die Cristae v611ig m i t Bleiniederschl~gen belegt. Aui te rdem deutl iche Ablagerungen an der P l a s m a m e m b r a n des Sarkolemms und der Kapi l laren sowie an den Tr iaden. Vers t reute Bleikristalle an den Myofibrillen sind unspezifische Spuren

der ~ber inkuba t ion . Araldi te inbet tung. Yergr613erung 30000:1

positive Resultate. Nach dieser Vorfixierung waren in Herz und Zwerchfell die Myofibrfllen und dig Strukturen des endoplasmatischen Retikulums in welt st~rkerem Mal3e mit Bleiphosphatniederschl/tgen bedeckt als die Mitochondrien.

Wirlcung von Ca ++, Na + und K +. Wenn an Stelle yon Magnesiumionen Ca ++ hinzugesetzt wurde, blieb zwar die Reaktion der meisten Membrankomponenten in den Zellen erhalten (WoLLV, NBERGER, SCHULZE, 1966), aber in keinem Falle konnte eine mitochondriale ATPase-Aktiviti~t gesehen werden. Na + und K+ in der Inkubationsl6sung f6rderten die Darstellung der Mitochondrien-ATPase. Ohne Na + und K + konnte nicht in allen Experimenten eine positive Reaktion


Abb. 4. Froschherz. Inkuba t ion eines 60 ~ Gefrierschnittes nach 3 m i n OsO4 Vorfixierung. Reakt ion an den Membranen der Mitochondrien. VergrSi~erung 30000:1

[o)bachte t werden. Dabeischeinen Herz- und Skelettmuskelmitochondrien noch leichter als die Mitochondrien der anderen getesteten Gewebe zu reagieren. Na + und K +, in Gegenwart yon Mg ++ einzeln zugesetzt, hat ten nicht die gleiche gfinstige Wirkung wie die gleichzeitige Zugabe der beiden Ionen.

Ein/lufl verschiedener Substrate. Eine Bleiphosphatablagerung in den Mito- chondrien wurde regelm~I~ig nur nach Zugabe yon ATP als Substrat gefunden. Alle anderen im Abschnitt Material und Methodik genannten Substrate erwiesen sich in den meisten Geweben als nicht geeignet. Nur im Iterzmuskel wurde eine allerdings recht schwache Reaktion auch mit I T P und im Zwerchfellmuskel mit ITP, UTP und GTP gesehen (Abb. 6).

E/]elct von 2-4-Dinitrophenol, p-Chlormercuribenzoesgure und g-Strophanthin. Trotz der bekannten stimulierenden Wirkung von DNP auf die ATPase isolierter Mitochondrien (LARDY und WELLMAN, 1953) konnten wir weder nach Vorbehand- lung noch nach Inkubat ion der Gewebeschnitte mit DNP eine Beeinflussung der ATPase-Reaktion feststellen. Wie erwi~hnt, zeigten Lebermitochondrien auch in Gegenwart yon DNP keine Reaktion. MSglicherweise ist die Schs durch die Vorfixierung und das Einfrieren so stark, dab keine zus~tzliche Aktivierung des Ferments mehr erfolgen kann.

424 W . SC~ULZlr u n d A. WOLLENBERGER:

Abb. 5. Schnitt durch die basalen Abschnitte der Tubu|i contorti I. Ord. der Maus. Bleipr~izipitation an den Membranen der Mitochondrien (120 ~z Gefrierschnitte, 3 rain Os04 u u 45000:1

Abb. 6. Zwerchfellmuskel, Maus nach Inkubation mit ITP. Vergr6Berung 20000:1


Ebenso wie HORI und CHA~O (1963) fanden wir eine Hemmung der Mito- chondrien-ATPase im Herzmuskel und in der Niere nach Einwirkung von PCMB. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem yon PADYKULA und GAUTtIIER (1963) beschriebenen Verhalten der Mitochondrien des Zwerchfells.

G-Strophanthin, das in den Plasmamembranen verschiedener Gewebe zu einem Verlust der von Mg ++, Na +, K+ abhiingigen ATPase-Aktivit/~t fiihrt (No- V I K O F F , 1964; W O L L E N -

B~RGER, SCHULZ~, 1966), beeinflul~te die mitochondrial gebundene ATPase-Aktivit~t nicht oder nur unwesentlich.

Versuche mit isolierten Mitochondrien. Die In- kubation isolierter Mito- chondrien im Standard- medium ffihrte zu posi- tiven ATPase-Reaktio- nen. Dabei waren nicht

alle Mitochondrien gleichmi~Big gef~rbt, einige zeigten nur Spuren yon Bleiniederschliigen, andere waren ohne jede Reaktion. Vor allem trugen Bruchstficke und st/~rker zerstSrte Mito- chondrien erheblich mehr Bleiphosphatab- lagerungen als die intakt aussehenden Organellen. Aul~erdem waren die einzelnen Bleikristalle Abb. 7. Dfinnschnitt durch isotierte Mitochondrien aus Lebergewebe nach

Inkubation in Standard-ATPase-Medium. Grobe Bleiablagerungen v o n gr6berer Beschaf- innerhalb der Mitochondrien. Vergr6Berung 30000:1

fenheit als im Gewebe- sehnitt und ]agen oft in grSl~eren Verklumpungen nicht immer direkt an den Cristae mitochondriales (Abb. 7). Naeh Inaktivierung der Mitoehondrien durch Hitze oder lange Fixierung sowie bei Auslassung des Substrats wurde keine Reaktion mehr beobachtet. Auch Vermischung der inaktiven Mitochondrien mit isolierten aktiven Myofibrillen ergab keine durch eventuelle Verlagerung der Bleiphosphatkristalle bedingte Reaktion in den Mitochondrien. Nur die den Myofibrillen anhaftenden Membranreste (endoplasmatisches Retikulum, Sarko- lemm) zeigten in diesen Experimenten ATPase-Aktivit~t.

Diskussion

In den vorliegenden Untersuchungen wurde nach 3minutiger OsO 4- Vor/ixierung eine ATPase-Aktiviti~t in den Mitochondrien an verschiedenen tierischen Geweben

ttistochemie, Bd. 5 29

426 W. SCHULZE und A. WOLLEI~BERGER:

gefunden. Gegen die Vorbehandlung mit Os04 sind starke Bedenken ge~ul~ert worden (EssNEI~, NOVIKOFF, MASEK, 1958; GOLDFISCHER, ESSNEI% NOVIKOFF, 1964). Einmal soll 0s04 s/~mtliche Enzyme zerst6ren und zum anderen die Ein- dringungszeit yon 3 min zu kurz sein, um das Gewebematerial v611ig anzu- fixieren und so Verlagerungen des Reaktionsproduktes zu verhindern. In quanti- tat iven biochemischen Untersuchungen an isolierten, mittels differentieller Zentrifugierung gewonnenen subzellul/~ren Fraktionen konnten wir aber nach Os04-Vorfixierung noeh ATPase-Aktivit/~t in den verschiedenen Fraktionen mit Ausnahme der Myofibrillen linden (ScHuLZE und WOLLENBERGER, 1963). Diese Aktivit/~t diirfte ausreichend fiir eine histoehemische Darstellung sein (SCHULZE, WOLLENBERGEI:t, 1963, 1965; siehe auch I~OVIKOFF, BURI~ETT, GLICKMAN, 1956; NOVIKOFF, HAUSMAN, PODBEE, 1958). Sie war wesentlich h6her als yon ESSNER, NOVIKOFF und MASEK (1958) ffir Lebergewebe nach 7 min Fixierung in 1%iger OsO2-L6sung beschrieben wurde.

Die Eindringung der l%igen isotonisehen OsO2-LSsung in verschiedene tierische Gewebe bei 0 ~ C soll nach DAWD (1964) in 5 min etwa 50 b t betragen. PEASE (1960) besehreibt eine ausreichende Fixierung fiir Nierengewebe mit OsO 4 in 3 min. Es ist deshalb wahrseheinlieh, dab unsere Vorfixierung in OsO a ausreiehend ist, um 60 b~ Gefrierschnitte genfigend zu fixieren. Es gibt auBerdem Hinweise, die ffir eine verbesserte Eindringung yon Fixierungsmitteln und Inkn- bationsl6sung in vorgefrorenes im Gegensatz zu niehtgefrorenem Gewebe sprechen (REALE, 1963; SCHULZE, BUTSCHAK, 1962). Eine Verlagerung des Reaktions- produktes in den vorliegenden Versuehen infolge ungenfigender Fixierung ist deshalb nicht wahrseheinlich. Sogar diekere Gefrierschnitte (120 und 200 bt) und einige l mm-Bl6ekehen zeigten kein yon den 60 und 40 b~ Sehnitten abweiehendes Verhalten hinsiehtlieh der Bleiphosphatablagerungen. In Herz- und Zwerehfell- muskel ist auBerdem auf Grund der stiirkeren Empfindliehkeit der myofibrillgren ATPasen gegenfiber OsO 4 nieht an eine Verlagerung der Reaktionsprodukte aus den Myofibrillen in die Mitoehondrien zu denken. Diese Vermutung wird besonders dureh die an isolierten Mitoehondrien und Myofibrillenfraktionen erhaltenen Ergebnisse bekrgftigt.

Naeh Vor]ixierung mit Aldehyden, insbesondere Formalin und Hydroxyadi- pinaldehyd, wurden in Herz- und Skelettmuskel die gleiehen Ergebnisse erhalten, wie sie sehon yon mehreren anderen Untersnehern beschrieben worden sind (PERSIJN, DAEMS, DE MAN, MEIJER, 1960; DE BEYER, DE MAIV, PERSIJN, 1961; ZEBE und FALK, 1963a, b; Tree und BARRI~ETT, 1962; SOMMER und SeacH, 1962), n/~mlich eine Bleiablagerung in den A-Banden und in kontrahierten Fibrillen in der Nghe der Z-Streifen. Unsere Ergebnisse am Zwerehfellmuskel stimmen gut mit den yon PADYKULA und GAUTHIER (1963) beschriebenen lichtmikroskopischen Resultaten fiberein. Diese Autoren beobachteten ebenfalls eine starke ATPase- Aktivitiit in den grol~en und in den kleinen, mit den I-Bgndern verbundenen Mitochondrien dieses Gewebes.

In allen Mitochondrienbildern fanden wir, ebenso wie OTERo-VILARDEB6, LANE und GODMAN (1962) und ASttWORTIt, LUIBEL und STEWAI~T (1963) naeh Formalinvorfixierung, eine Bleiphosphatablagerung direkt an den Einzelleisten der Cristae mitochondriales und an den Aul~enmembranen der Mitochondrien. Nur nach l~berinkubation war der Ort der Bleiab]agerungen nicht genau zu


identifizieren. Eine F/irbung der Matrix, wie sie yon LAZARUS und BARDEN (1962, 1964) gesehen wurde, kSnnen wir nicht best~tigen.

WACHSTEIN U. Mitarb. (1960, 1962) sahen in liehtmikroskopischen Unter- suehungen in fast allen Zellen der Niere mitochondriale ATPase-Aktivititt. Sie war am sts in den aufsteigenden Abschnitten der Henleschen Schleife und in den distalen Tubuli contorti. Wir beobaehteten elektronenmikroskopisch bisher vor allem in diesen distalen Bereichen des Hauptstiickes Mitochondrien mit Blei- ablagerungen. Mitochondrien in anderen Bereichen waren nach unseren Inku- bationen und Vorbehandlungen entweder ohne Aktivi tat oder nur mit sp/~rlichen Ablagerungen bedeekt.

I m Gegensatz zu den an den Membranen und Pinozytosebl/~schen der Endo- thelzellen und den Membranen des endoplasmatischen Retikulums gefundenen Nukleosidphosphatasen (MARCHESI, BARRNETT, 1963; NOVIKOFF, ESSNER, GOLD- FISCHER and HEUS, 1962; WOLLENBERGER, SCHULZE, 1966; SCHULZE, WOLLEN- BERGER, unverSffentlicht) reagiert das hier dargestellte mitochondriale Ferment ziemlich spezifisch mit ATP als Substrat. Nur in Zwerchfellmitochondrien erwiesen sich ITP, UTP und GTP und im Herzmuskel I T P als brauchbares Substra~ ffir die Darstellung der Nukleosidtriphosphatase-Aktivit/it.

Eine grol~e Bedeutung ffir die Darstellung der mitochondrialen ATPase hat nach unseren Ergebnissen die A n w e s e n h e i t von N a + u n d K +. Nur im Herzgewebe und Zwerchfellmuskel gelang uns in den meisten Fi~llen der Nachweis yon Blei- phosphatablagerungen ohne Natr ium und Kalium. In allen anderen Geweben war die Anwesenheit beider Ionen oder zumindest der Natriumionen Voraus- setzung f/ir eine positive Reaktion.

In der Literatur liegen Berichte vor (SuGAWARA und UTIDA, 1963; AUDITORE und WADE, 1964; PENA-DIAz u. Mitarb. 1964), denen zufolge die ATPase-Aktivititt yon Suspensionen isolierter Mitochondrienpriiparate durch Zusatz yon Na + und K+ erhSht wird. Es erhebt sich hierbei die Frage, ob diese Stimulierung nicht mSglicherweise eine Reaktion von Zellmembranfragmenten darstellt, die als Verunreinigung in die Mitochondrienfraktion hineingerieten. Jedenfalls besagt die hier beobachtete Verbesserung der elektronenmikroskopischen Darstellung der mitochondrialen ATPase-Aktivit/~t durch Na +- und K+-Zusatz keineswegs, dab es sich um eine , , Ionentransport"-ATPase (GLYNN, 1964) handelt, zumal eine der hervorstechendsten Eigenschaften der Transport-ATPase, die Hemmbarkei t durch Herzglykoside fehlt. In diesem Zusammenhang ist es von Interesse, daf~ die an isolierten Mitochondrien oder Mitochondrienfragmenten beobachteten ATP-abhitngigen Bewegungen yon Kationen durch Strophanthin nicht gehemmt werden (HOLLAND und DuNN, 1954; SCHREIBER, ORATZ und I~OTHSCHILD, 1960; VAS~N6TON 1963).

Ein weiteres Charakteristikum der hier naehgewiesenen ATPase ist die schon yon HoRI und CHANG (1963) besehriebene Tatsache, dal~ sich M g ++ als A k t i v a t o r

nicht durch Ca++ ersetzen li~]~t. Dies scheint eine spezifische Eigenschaft der ATPase der Mitochondrien zu sein; denn an anderen Zellstrukturen wie Zell- membranen, endoplasmatisches Retikulum, Kerne, Kernmembranen l~l~t sich histochemisch ATPase-Aktivit~t mehr oder weniger gut auch in Anwesenheit von Ca++ ansta t t Mg++ nachweisen (vgl. auch AZZONE, 1961; KIELLEY, 1961).

Fiir technische Mitarbeit danken wir Fraulein E. BOLICK und Fraulein H. SOMMERFELD.

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X 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70

tiistochemie, Bd. 6 29b

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Elektronenmikroskopischer Nachweis von mitochondrialer Adenosintriphosphataseaktivität in tierischen Geweben