Acta histochem. Bd. 60, S. 121-131 (1977)

Abteilung Klinische Morphologie und Abteilung Biochemie I der Universitat Ulm, BRD

Elektrophoretische Trennung und Eigenschaften von Isoenzymen der sauren Phosphatase aus dem Gehirn der Ratte

Electrophoretic separation and properties of acid phosphatase isoenzymes from rat brain

Von Ew A STACH, HEINRICH OCKENFELS und CHRISTOPH PILGRIM

Mit 2 Abbildungen und Tafel I

Eingegangen am 29. Marz 1977

Zusammenfassung

Nach Agargel-Elektrophorese des 20000 X g.Uberstandes aus Rattenhirn-Homogenat war mit Azofarbstoffmethoden eine einzelne Bande mit saurer Phosphataseaktivitat darstellbar. Durch Be­handlung des Homogenats mit Triton X-100 kam eine zweite Aktivitatsbande zum Vorschein. In Gegenwart von Zink-Ionen war ein drittes Isoenzym nachweisbar. Eine vierte Bande, die ausschlieE­lich bei Anwendung von Bleimethoden erscheint, ist als Artefakt anzusehen, da ihr Auftreten nicht an die Anwesenheit eines Substrates gebunden war. Die Substratspezifitat der Isoenzyme sowie die BeeinfluEbarkeit ihrer Aktivitat wurden untersucht. Durch gezielte Wahl von Substraten und Effek­toren konnten Bedingungen definiert werden, die eine selektive Erfassung der einzelnen Isoenzyme ermoglichen.

Summary

Following agar gel electrophoresis of the 20000 X g supernatant of rat brain homogenate a single band with acid phosphatase activity could be visualized by means of azo dye techniques. By adding Triton X-100 to the homogenate, a second band with enzymatic activity was demonstrable. A third isoenzyme could be identified in the presence of zinc ions. A fourth band visible only when employing lead methods has to be considered an artefact as its appearance does not depend on the presence of a substrate. The substrate specificity of the isoenzymes and the possibilities of influencing their ac­tivity were examined. By specific choice of substrates and effectors, conditions could be defined rendering possible a selective identification of the individual isoenzymes.

Einleitung

Dber das Vorkommen saurer Phosphatase in Rattenhirn-Homogenaten wurde be­reits von BEAUFAY et al. (1957) berichtet. Auch histochemische Darstellungen dieses Enzyms in Nervenzellen und Gliazellen sind haufig beschrieben (NOVIKOFF 1967, DAVIDOFF und GALABOV 1974, Lit.). Zudem ist bekannt, daB es im Nervengewebe multiple Formen del' sauren Phosphatase gibt (MOORE und ANGELETTI 1961, ANDER­SON 1965). Untersuchungen zur selektiven histochemischen Darstellung einzelner Iso­enzyme im Nervengewebe wurden jedoch bisher nur von RATH und FELICETTI (1975)

122 E. STACH, H. OCKENFELS und CH. PILGRIM

publiziert. Parallel zu dieser Studie wurde auch von uns in der vorliegenden Arbeit der Versuch unternommen, im Hinblick auf die Moglichkeiten eines histochemischen Nachweises die Isoenzyme der sauren Phosphatase aus Rattenhirn auf Grund ihres unterschiedlichen Verhaltens gegeniiber verschiedenen Substraten und Effektoren zu charakterisieren.

Zu diesem Zweck muBte eine leistungsfiihige elektrophoretische Trennmethode herangezogen werden, da dieses Verfahren im Gegensatz zur chromatographischen Trennung die Darstellung der enzymatisch aktiven Banden mittels histochemischer Nachweism~thoden erlaubt. Friihere Versuche, Isoenzyme der sauren Phosphatase mit Hilfe der Elektrophorese darzustellen (ANDERSON et al. 1962, GERHARDT et al. 1963, BARRON et al. 1964, TIMPERLEY et al. 1971), fiihrten zu differenten Ergebnissen beziiglich der Anzahl der Aktivitatsbanden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Agargel-Elektrophorese angewandt. Fiir die Wahl eines elektrophoretischen Ver­fahrens war weiterhin die Tatsache maBgebend, daB es sich bei Isoenzymen der sauren Phosphatase um Glykoproteine handeln kann, die sich in dem Gehalt an Neuraminsaure und damit in der Ladung unterscheiden (OSTROWSKI et al. 1970, CHU et al. 1975).

Material und Methoden

Die Versuchstiere waren 'jl und d" Ratten vom Inzuchtstamm Lewis; zum Vergleich der Iso· enzymmuster wurden Sprague Dawley-Ratten herangezogen. Das Korpergewicht betrug 130 bis 150 g.

Haltungsbedingungen: Raumtemperatur 21 ± 1°C, relative Feuchte 55 ± 10 %, Belichtung im

12 h-Rhythmus; Fiitterung: Altromin R 10 und Wasser ad libitum.

Vorbereitung der Organproben

Die Tiere wurden durch Dekapitation immer zum gleichen Zeitpunkt (10.30 h) getotet. Bei den Perfusionsversuchen wurde unter Athernarkose 0,25 M Saccharose-Losung in die linke Herzkammer

gespritzt und zum Abflul3 die V. cava inferior durchtrennt. Das Gehirn wurde als Ganzes entnommen

und in eiskalte 0,25 M Saccharose-Losung (lgJ2 ml) gebracht; bei Leber und Nieren betrug das Go­wicht-Volumen-VerhiUtnis 1 g/8 ml. Die Homogenisierung der Organe erfolgte mit dem Ultra-Turrax bei 20000 UJmin fUr 4 X 10 sec im Eisbad. Nach Zugabe von Triton X-100 (Endkonzentration 1 %) blieb das Homogenat 1 h bei 0 °C stehen und wurde anschliel3end 1 h bei 20000 X gunter Beibehaltung

der Kiihlung zentrifugiert.

Elektrophoretische Trennung

Die Trennung erfolgte auf 1 %igen Agargelen (DIFCO, Detroit) unter Verwendung von 0,025 ]}I Tris-HCI (pH = 6,7) als Laufpuffer mit dem Elektrophoresegerat der Firma APE LAB (Bagneux).

Es wurden jeweils 1O,u1 des 20000 X g-Uberstandes in eine Kerbe auf die Gelplatten (76 X 26 mm; 3,5 ml Agargel) gebracht. Als Elektrodenpuffer diente eine 0,05 M Tris-HCI-Losung (pH = 6,7).

Feldstarke: 1,3 VJcm; Trenndauer bei Raumtemperatur: 1,5 h.

1m Rahmen der Entwicklung dieser Standardmethode wurden folgende Puffer auf ihre Anwend· barkeit gepriift: Acetat (pH = 5,0; 1,6 VJcm), Citrat (pH = 6,2; 1,3 VJcm), Veronal-Natriumphos­

phat(pH = 8,2; 2,1 VJcm). Die Konzentration betrug jeweils 0,025 MolJI bei dem Lauf- und 0,05 MolJI

bei dem Elektrodenpuffer. Aul3erdem wurden Trennungen auf 0,8%igen Agarose-Gelen mit Veronal­Natriumphosphat-Puffer (pH = 8,2; 2,1 VJcm) versucht (LAX 1972).

Elektrophoretische Trennung 123

Histochemische N ach weismethoden

Kupplungsmethode nach BURSTONE (1962), modifiziert fur die Anwendung auf Agargelen: Zur Her­

stellung des Diazoniumsalzes (BLANK und HOPF 1972) wurden 0,5 g Echt-Bordeaux-B-Base (Bayer, Leverkusen) mit 6,0 ml Wasser und 0,25 ml Remol ASN verruhrt. Dazu gab man 0,65 ml 32%ige

Salzsaure und 160 mg Natriumnitrit, gelost in 1,0 ml Wasser. Nach 30 min Ruhren unter Eiskuhlung

wurde die Reaktion durch ZufUgen von 0,3 g Natriumacetat in 2,9 ml Wasser und von 0,2 ml50%iger Essigsaure unterbrochen. 0,28 ml dieser Diazoniumsalz-Losung, 50 ml 0,2 M Acetatpuffer (pH = 5,0)

und 16 mg Naphthol-AS-BI-phosphat (Sigma, St. Louis) ergaben die Inkubationslosung. Inkuba­tionsdauer bei 37 °0: 20 bis 40 min.

Kupplungsmethode nach GassNER (1958), modifiziert fur die Anwendung auf Agargelen: Die Dia­

zotierung der EQhtrot-ITR-Base (Bayer, Leverkusen) wurde nach der oben fUr die Echt-Bordeaux­B-Base angegebenen Vorschrift durchgefUhrt. Als Substrat diente 1X-Naphthylphosphat in einer

Konzentration von 16 mg/50 ml 0,2 M Acetatpuffer (pH = 5,0). Hierzu wurden 0,56 ml der Dia­zoniumsalz-Losung gegeben. Inkubationsdauer bei 37 °0: 1 h.

Bleimethode nach GOMOR! (1952) mit fJ-Glycerophosphat als Substrat in der von ALLEN et al. (1963) modifizierten Form. Bleimethode mit p-Nitrophenylphosphat: Ais Substrat wurde p-Nitrophenylphos­

phat (6 mM) verwendet; die Inkubationszeit betrug 2 h. Die ubrigen Bedingungen entsprachen der

Vorschrift von ALLEN et al. (1963).

Abgrenzung der Substratspezifitat

Zur Prufung ihrer Verwendbarkeit als Substrate wurden folgende physiologische Phosphatver­bindungen an Stelle von fJ-Glycerophosphat der Inkubationslosung nach ALLEN et al. (1963) zuge­

setzt: 1,0 mM, 0,1 mM und 0,05 mM Oytidin-5'-monophosphat bzw. Glucose-6-phosphat; lO,O mM, 1,0 mM, 0,1 mM und 0,05 mM Adenosin-5'-diphosphat, Inosin-5'-diphosphat, Thiaminpyrophosphat

bzw. Adenosin-5'-triphosphat. Die Inkubation der Gelplatten erfolgte uber Nacht.

EinfluB von Effektoren

Zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren und Aktivatoren wurden folgende Substanzen der Inkubationslosung zugegeben: 100,0 mM, lO,O mM und 1,0 mM ZnOI2, MgOl2 bzw.

MnOI2; 10,OmM, 1,0mMund 0,1 mMNaF,Natriumtartrat, Kupfer(II)-acetat bzw_EDTA; 0,10mM, 0,01 mM und 0,005 mM Na2Mo04. Die Wirkung von Formaldehyd und Glutaraldehyd wurde ge­pruft, indem man die Gele nach der Elektrophorese mit den in Tris-HOI-Puffer (0,025 M; pH = 6,7)

gel osten A1dehyden (2,5%ig) bei + 4 °0 vorbehandelte (15, :30 und 60 min). Danach spiilte man die Gelplatten zur Entfernung der Aldehyde 10 min mit Leitungswasser.

Zum Nachweis der sauren Phosphatase diente die Bleimethode mit p-Nitrophenylphosphat als

Substrat. Nur im Falle von Na2Mo04 und EDTA muLlte aus technischen Grunden auf eine Kupp­lungsmethode (BURSTONE 1962) zuruckgegriffen werden.

Biochemische Bestimmungsmethoden

Die Aktivitat der sauren Phosphatase im 20000 X g-Uberstand wurde mit der Methode von

WALTER und SCHUTT (1970) bestimmt; in Abanderung zur Originalvorschrift betrugen das Probe­volumen 0,1 ml und die Inkubationszeit 10 min. Die Proteinbestimmung erfolgte nach LOWRY et at (1951).

Ergebnisse

Entwicklung der elektrophoretischen Trennmethode

Die Elektrophorese auf Agarosegel unter Verwendung von Veronal-Natriumphos­ph at-Puffer (pH = 8,2) ergab, daB nach 1 h Laufzeit das gesamte Enzym auf der Auf trag stelle zuruckgeblieben, nach 2,5 h diffusionsartig in beiden Richtungen ge-

124 E. STACH, H. OCKENFELS und CH. PILGRIM

wandert ist, ohne diskrete Banden zu bilden. Auf Agargelen hingegen konnten unter Beibehaltung des Puffers 2 Aktivitatsbanden dargestellt werden; die Trennung war jedoch nicht optimal. Der Austausch des Veronal-Natriumphosphat-Puffers (pH =

8,2) gegen Acetatpuffer (pH = 5,0) oder Citratpuffer (pH = 6,2) brachte keine Ver­besserung. Dagegen erwies sich Tris-HCI-Puffer (pH = 6,7) als gut geeignet und wurde daher zur elektrophoretischen Trennung auf Agargelen verwendet.

Isoenzymmuster der sauren Phosphatase

Nach der Agargel-Elektrophorese des 20000 X g-Uberstandes aus Hirngewebe lie13 sich nur eine Bande mit saurer Phosphataseaktivi1Jat nachweisen, sofern keine Be­handlung mit Triton X-100 vorausgegangen war. Wurde dagegen das Homogenat mit dem Tensid vorbehandelt, so trat eine zweite Aktivitatsbande auf, die eine ge­ringere Laufgeschwindigkeitaufwies; beide Banden wanderten zur Kathode (Tafel I, Abb. 1). Die spezifische Aktivitat des gesamten Enzyms im Uberstand stieg infolge der Behandlung mit Triton X-100 um 56 % an.

Zusatzlich zu den hier verwendeten Tieren yom Stamm Lewis wurden noch Hirn­homogenate von Sprague Dawley-Ratten untersucht. Bei beiden Stammen waren die Elektropherogramme identisch. Zwischen weiblichen und mannlichen Tieren lie13 sich ebenfalls kein Unterschied im Isoenzymmuster der sauren Phosphatase feststellen.

Um zu priifen, ob das oben beschriebene Isoenzymmuster spezifisch fUr das Ge­hirn ist, wurde es mit denjenigen aus Leber und Niere verglichen: Zuerst wurde auch hier eine Trennung ohne Behandlung der Homogenate mit Triton X-100 vorgenom­men. In beiden Organen lie13en sich jeweils 3 Banden nachweisen. Eine der Banden aus Nierengewebe wanderte zur Kathode und 2 zur Anode. Sowohl das kathodische als auch das naher der Auf trag stelle befindliche anodische Isoenzym wurden auch in der Leber gefunden. Die zweite anodische Bande fehlte in der Leber, dagegen war hier ein zweites kathodisches Isoenzym vorhanden, das sich zwischen dem obenge­nannten und der Auf trag stelle befand. Nach einer Behandlung der Homogenate mit Triton X-100 kam in der Niere eine zusatzliche Bande zum Vorschein. Der gleiche Effekt konnte nach Behandlung von Hirngewebe mit diesem Detergens beobachtet werden; auch die Lage der Bande auf dem Elektropherogramm war in beiden Fallen gleich. 1m Uberstand des Leberhomogenates dagegen trat dieses Isoenzym nicht auf.

Darstellbarkeit der Isoenzyme in Abhangigkeit von der histochemi­schen Nachweismethode

Bei den bisherigen Versuchen kam ausschlie13lich die von uns modifizierte Kupp­lungsmethode nach BURSTONE (1962) zur Anwendung. Zum Vergleich wurde das Kupplungsverfahren nach GassNER (1958) erprobt. Die Zymogramme waren in beiden Fallen gleich.

Die Ergebnisse der Azofarbstoffverfahren wurden mit denjenigen der Bleimethoden verglichen: Bei der von ALLEN et al. (1963) modifizierten Nachweismethode nach GOMORI mit tJ-Glycerophosphat als Substrat trat eine neue Bande auf, die mit den Kupplungsmethoden nicht darstellbar ist und im Gegensatz zu den beiden schon

Eloktrophoretische Trenn ung 125

I. , III

II. , I I

III. ,

Abb. 1. Darstellbarkeit von)soenzymen dor sauren Phosphatase aus dem Gehirn der Ratte unter Verwendtmg physiologischerSubstrate. Cytidin·5' -monophosphat bzw. Glucose-6-phosphat: I.l,OmM; II. 0,1 mM; III. 0,05 mM; Behandlung des Homogenats mit Triton X-JOO. Elektrophorese auf 1 %igem Agargel, Tris-HC1-Puffer (pH = 6,7). Bleimethode.

bekannten Banden zur Anode wandert. Auch mit der von uns verbesserten Blei­methode unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat kommt die anodische Bande zum Vorschein (Tafel I, Abb. 2). Diese wird im folgenden als Bande 1 bezeichnet, die beiden kathodischen Banden werden entsprechend mit den Nummern 2 und 3 versehen.

Substratspezifitat der Isoenzyme

Es wurde gepriift, inwieweit natiirlich vorkommende Phosphatverbindungen durch die von uns untersuchten Isoenzyme gespalten werden. Cytidin-5' -monophos­ph at (CMP) und Glucose-6-phosphat (G-6-P) erwiesen sich als gut geeignete Sub­strate. In beiden Fallen waren bei einer Konzentration von 1 mMol/1 aIle 3 Banden sehr intensiv gefarbt (Abb. 1). In einer 0,1 mM Lasung konnten nur die Banden 1 und 2, bei einer Konzentration von 0,05 mMol/1 nur noch die Bande 1 nachgewiesen werden.

Von den Nucleosiddiphosphaten wurden Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und Ino­sin-5'-diphosphat (IDP) verwendet. Bei einer Konzentration von 10 mMol/l war mit beiden Substraten keine saure Phosphataseaktivitat nachzuweisen. Nach der Inkuba­tion in 1 mM, 0,1 mM und 0,05 mM ADP-Lasung konnte nur die Bande 1 dargestellt werden. Bei den entsprechenden IDP-Konzentrationen kam ebenfalls nur die Bande 1 zum Vorschein, wobei aber hahere Substratkonzentrationen jetzt einen hemmenden EinfluB auf die Darstellung dieser Bande ausiibten. Mit Thiaminpyrophosphat (TPP) konnte bei allen angewandten Konzentrationen nur die Bande 1 dargestellt werden. Auch bei Anwendung von 1 mM, 0,1 mM und 0,05 mM Adenosin-5'-triphosphat (ATP) kam nur die Bande 1 zum Vorschein. Bei einer Konzentration von 10 mMol/1 war keine Bande mehr vorhanden.

126 E. STACH, H. OCKENFELS und CH. PILGRIM

I·I~ ~J II·~I . _I III. ,---t • _I _II 1

a

I. • Illl

II. • 1111

III. I III c

I.

II. I I ~ I

III. I III b

I 1 ~------------------~

IL [

----------------~

I

"'ol ----------------~

d Abb. 2. EinfluLl von Effektoren auf die Aktivitiit von Isoenzymcn der sauren Phosphatase aus dem Gehirn der Ratte.

a Natriumfluorid: 1. 10,0 mM, b Kupfer(II).aeetat: I. 10,0 mM, e Zinkehlorid: I. 100,0 mM, d Glutaraldehyd(2,5%ig): I. 15 min,

IJ. 1,0 mM, II. 1,0 mM, II. 10,0 mM, II. 30 min,

III. 0,1 mM; III. 0,1 mM; III. 1,0 mM; III. 60 min.

Behandlung des Homogenats mit Triton X·100. Elektrophorese auf I %igem Agargel, Tris·HCI·Puf· fer (pH = 6,7). Bleimethode mit p-Nitrophenylphosphat.

EinfluB verschiedener Inhibitoren und Aktivatoren

Fluorid-Ionen bewirkten in einer Konzentration von 10 mMoljl eine totale Hem­mung der sauren Phosphataseaktivitat. Mit einer 1 roM NaF-Losung konnte nur die Bande 1 partieIl dargesteIlt werden (Abb.2a). Erst bei einer Konzentration von 0,1 mMoljl waren nach der Inkubation aIle 3 Banden vorhanden.

Elektrophoretischo Trennung 127

Die Anwesenheit von Tartrat-Ionen in der Inkubationslosung hatte keinen EinfluB auf die Bande 1; dagegen hemmten diese Ionen bei Konzentrationen von 10 mMoljl und 1 mMoljl vollstiindig die Aktivitiit der Isoenzyme 2 und 3. Erst in einer 0,1 mM Natriumtartrat-Losung waren aIle 3 Banden nachweisbar.

Molybdat-Ionen hemmten die saure Phosphataseaktivitiit schr stark. Schon bei einer Konzentration von 0,1 mMoljl konnte keine Enzymaktivitiit nachgewiesen werden. In einer 0,01 mMNatriummolybdat-Losung erschienen die Banden 2 und 3 wieder, waren aber immer noch teilweise inhibiert. (Der EinfluB auf die Bande 1 konnte nicht untersucht werden - vgl. oben.)

Nach der Inkubation in 10 mM Kupfer(II)-acetat-Losung lieB sich keine der 3 Ban­den darstellen. Bei einer Konzentration von I mMol/1 war die Bande 2 teilweise ge­hemmt, die beiden anderen dagegen in normaler Intensitiit dargestellt (Abb. 2b). Erst 0,1 mM Kupfer(II)-acetat tibte keinen inhibitorischen EinfluB mehr aus.

Die Untersuchung des Einflusses von Zink-Ionen lieferte eine vollig neue Informa­tion (Abb. 2c): Nach der Inkubation in einer 100 mM ZnCl2-Losung trat eine vierte Bande auf. Sie befand sich zwischen dcr Auftragstelle und der Bande 2. Von den Banden 2 und 3 waren nur gcringe Spuren vorhanden, auch die Bande 1 war zum Teil reduziert. Bei einer Konzentration von 10 mMoljl traten aIle 4 Banden auf, wo­bei die Bande 1 weiterhin teilweise inhibiert war. In einer I mM ZnCl2-Losung hatten die Zink-Ionen keinen hemmenden EinfluB mehr auf das Auftreten der Banden 1, 2 und 3; das durch Zink-Ionen aktivierbare Isoenzym war hingegen nicht mehr nach­weisbar.

Magnesium- und Mangan(II)-Ionen tibten keinen EinfluB auf die Isoenzyme der sauren Phosphatase aus. Auch EDTA hatte keine Wirkung auf die Darstellbarkeit der Isoenzyme.

SchlieBIich wurden die Fixantien Formaldehyd und Glutaraldehyd auf ihre Hemm­wirkung gegentiber den Isoenzymen der sauren Phosphatase untersucht. Schon eine 2:5%ige Formaldehydlosung verursachte nach 15mintitigcr Einwirkung eine voll­stiindige Hemmung aller Isoenzyme. Der EinfluB des Glutaraldehyds wies demgegen­tiber einige Besonderheiten auf (Abb. 4d). Bei Verwendung ciner 2,5 %igen Losung war nach 15 min eine teilweise Hemmung der Bande 2 festzustellen; nach 30 min war diese Bande nicht mehr vorhanden, dagegen blieb die Bande 3 weiterhin unver­iindert. Nach 1 h war keine saure Phosphataseaktivitiit mehr nachweisbar. Die Bandel fehlte sowohl auf den mit Aldehyden behandelten Platten als auch auf den unbehan­del ten Kontrollplatten. Hierbei diirfte es sich um einen Auswascheffekt handeln, da die Gele unter flieBendem Wasser gespiilt wurdcn.

Kon troll versuche

Inkubation ohne Substrat. Bei den Kupplungsmethoden waren nach der Inkuba­tion ohne Substrat keine Banden auf den Gelplatten vorhanden. Bei den Bleimethoden dagegen trat die Bande lauch ohne Substrat auf; die Banden 2 und 3 stellten sich nicht dar.

128 E. STACH, H. OCRENFELS und CH. PILGRIM

AusschlufJ der alkalischen Phosphatase. Bei pH = 9,5 war auf den Elektrophero­grammen keine Phosphataseaktivitat mit der Methode nach ALLEN und HYNCIK (1963) nachweisbar.

Entfernung des Blutes durch Perfusion. Eine Elektrophorese der von perfundierten Ratten stammenden Proben ergab das fUr Hirngewebe charakteristische Bild mit den Banden 1, 2 und 3. Damit wurde gezeigt, daB unsere Untersuchungsergebnisse nicht durch die im Serum bzw. in den korpuskularen Elementen des Blutes enthal­tenen Phosphatasen beeinfluBt werden.

Hitzeinaktivierung. Nach der Warmebehandlung des 20000 X g-Dberstandes (30 min, 50. °0) waren die Isoenzyme 2 und 3 vollstandig inaktiviert; die Bande 1 blieb dagegen unbeeinfluBt.

Diskussion Bei der Ausarbeitung einer Methode zur elektrophoretischen Trennung wurde zunachst Agarose­

Gel unter Bedingungen getestet, die sich in unserem Laboratorium zur Darstellung von Isoenzymen

der Lactat.Dehydrogenase bewahrt hatten (LAX 1972). Fur dio hior untorsuchten Isoenzymo der

sauren Phosphatase aus Hirngowebe war dieses Verfahren jodoch nicht geeignet. Erst die Anwendung von Agar, das im Gegensatz zur Agarose noch ionisierbare Sulfatgruppen enthalt, machte eine Tren·

nung miiglich. Offenbar ist hierbei die Gegenwart von anionischen Resten entscheidend. Diese Vermutung wurde durch den Befund bestatigt, daB bei Anwendung von Mischgelen aus

Agarose und einem Kationenaustauscher (Cellulose 45040) ebenfalls eine Trennung der Isoenzyme er· reicht werden konnte. Diese Tatsache zeigt deutlich, daB fur die Trennung der hier untersuchten

Isoenzyme auf Agargelen auch Effekte wie Ionenaustausch oder Elektroosmose verantwortlich sind. Die Behandlung des Rattenhirnhomogenats mit Triton X-lOO bewirkte einen Anstieg der spezifi­

schen Aktivitat der sauren Phosphatase im Uberstand. Ahnliche Beobachtungen sind auch von an· deren Autoren beschrieben (TSUBOI und HUDSON 1955; KAYE und NADLER 1974).

Durch Zugabe dieses Tensides zu einem Leberhomogenat gelang BARRA (1961) die Darstellung eines zusiitzlichen Isoenzyms. Zur Erkliirung der Wirkungsweise von Triton X-lOO werden mehrere

Hypothesen diskutiert (ALLEN und GOCRERMAN 1964; VAN ETTEN 1976). In unseren Versuchen wurde gezeigt, daB durch die Behandlung mit Triton X-lOO auch aus Hirngewebeder Ratte ein zu­

siitzliches Isoenzym gewonnen werden kann. Von den Azofarbstoffmethoden ist bekannt, daB die Diazoniumsalze oft einen inhibitorischen

EinfluB auf die darzustellenden Enzyme ausuben (BARRA 1961, SCHNEIDER 1977). Die Anwendung von Bleimethoden zum histochemischen Nachweis von Enzymen in Gewebeschnitten kann zu Arte­

fakten fiihren, die durch unspezifische Anlagerung von Bleisalzen an verschiedenen Strukturen zu­stande kommen (PEARSE 1968). Ein Vergleich der mit Kupplungs- und Bleimethoden gewonnenen

Ergebnisse lieB nach ALLEN und GOCRERlIIAN (1964) keinerlei Unterschiede auf dem Elektrophero­gramm erkennen. Dagegen konnten wir feststellen, da!3 bei Anwendung der Bleimethoden eine neue, zusatzliche Bande auftritt. Die Bande erscheint auch dann, wenn koin Substrat in der Inkubations­

Iii sung vorhandon ist. Fur das Zustandokommen dieser nur bei Bleimothoden auftretenden Bande durfto oine unspezifische Adsorption von Bleisalzen an eine Substanz verantwortlich sein, die wah· rend der Elektrophorese an diese Stelle gewandert ist. Solche Artefakte entstehen also nicht nur

in Gewebeschnitten, sondern auch in zellfreien Systemen nach einer elektrophoretischen Trennung. Daruber hinaus laBt sich das Auftreten dieser Bande mit Nucleosidpolyphosphaten beeinflussen,

wodurch das Vorliegen eines Isoenzyms vorgetauscht werden kann. So bewirken ATP, ADP und IDP in einer Konzentration von 10 mMol!1 ein viilliges Verschwinden dieser Bande. Bei IDP-Konzen­

tratimlen von 1 mMol!1 und 0,1 mMol!1 erscheint sie stark reduziert. Auch konzentriertere Liisungen (10 mM) mancher Inhibitoren der sauren Phosphatase verhindern das Erscheinen der artifiziellen Bande vollstandig (Fluorid- und Kupfer(II)-Ionen) oder teilweise (Zink-Ionen). Auf Grund der beobachteten Hemmbarkeit eines Artefaktes kiinnen Kontrollversuche

E1ektrophoretische Trennung 129

z. B. mit F1uorid-Ionen - bei der histochemischen Darstellung saurer Phosphatase in Gewebe­schnitten zu falschen Schliissen fUhren.

Aus dem Hirngewebe der Ratte konnten bisher 3 und gelegentlich auch 4 Fraktionen mit saurer Phosphataseaktivitat isoliert werden (MOORE und ANGELETTI 1961, ANDERSON et al. 1962, FELI­CETTI und RATH 1975). In unseren Versuchen mit Rattenhirn lieJ3 sich zunachst nur ein Isoenzym nachweisen. Nach einer Behandlung des Homogenates mit Triton X-I00 trat ein zweites und nach Zugabe von Zink·lonen zur Inkubationslosung ein drittes Isoenzym auf. Die 3 Banden waren scharf begrenzt und gut voneinander getrennt; sie wanderten aIle zur Kathode. Die Zymogramme sind bei 2 verschiedenen Rattenstammen sowie bei weiblichen und mannlichen Tieren identisch. Dagegen unterscheidet sich das unter unseren Bedingungen dargestellte Isoenzymmuster der sauren Phos­phatase aus Rattenhirn von denjenigen aus Niere und Leber und ist somit organspezifisch.

Die in dieser-Arbeit untersuchten Isoenzyme sind nur im sauren pH-Bereich (pH = 5,0) nachweis­bar. Die Banden konnen also nicht durch alkalische Phosphatasen, wie z. B. unspezifische a1kalische Phosphatase oder 5' -Nucleotidase, hervorgerufen worden sein. Weiterhin konnen Diphosphatasen, wie z. B. Thiaminpyrophosphatase, ausgeschlossen werden, da die Diphosphate ADP, IDP und TPP keine Substrate fUr die untersuchten Isoenzyme darstellen. Gegen das Vorliegen einer ATPase spricht die Tatsache, daJ3 die ATP-Hydrolyse nicht katalysiert wird.

Von den natiirlich vorkommenden Phosphatverbindungen wurden die Monophosphate CMP und G-6-P durch die untersuchten Isoenzyme gespalten. Hierbei wies das langsamer wandernde Isoenzym eine hohere Affinitat zu den Substraten auf. Bei geeigneter Substratkonzentration wird somit dieses Isoenzym einzeln dargestellt.

Von den Inhibitoren der sauren Phosphatase fUhren einige zu einer unspezifischen Hemmung aller Isoenzyme. Dazu gehoren Fluorid-, Tartrat- und Molybdat-Ionen sowie Formaldehyd. Die hemmende Wirkung dieser Substanzen auf die saure Phosphataseaktivitat ist bekannt (VAN ETTEN et al. 1974, CHU et al. 1975, BORGERS und THONE 1976, GOSSRAU 1977). Entscheidend sind die­jenigen Effektoren der sauren Phosphatase, die eine Differenzierung zwischen den Isoenzymen er­moglichen. Zu dieser Gruppe gehoren Kupfer(II)-Ionen. Nach Inkubation in einer 1 mM-Losung war das langsamer wandernde Isoenzym teilweise inhibiert, dagegen blieb die zweite Bande unbe­einfluJ3t. Auch nach ANDERSON et al. (1962) wird die saure Phosphatase aus dem Gehirn der Ratte durch Kupfer-Ionen gehemmt. Interessant ist weiterhin der Einflul3 von 2,5%igem Glutaraldehyd. Nach 30 min Einwirkung war das langsamer wandernde Isoenzym vollstandig inhibiert, das zweite blieb dagegen unverandert. Die Untersuchungen iiber den Einflu13 von Zink-Ionen auf die Aktivitat der Isoenzyme fiihrten zu einem wichtigen Befund: Eine 100 mM ZnCl2·Losung bewirkte eine starke Hemmung der beiden Isoenzyme, dafiir stellte sich aber eine neue Aktivitatsbande dar. Es handelt sich also urn ein durch Zink-Ionen aktivierbares Isoenzym der sauren Phosphatase; ahnliche Beob­achtungen wurden kiirzlich von FELiCETTI und RATH (1975) beschrieben. Das unterschiedliche Ver­halten von Isoenzymen dor sauren Phosphatase kann als Grundlage fUr eine selektive Darstellung dieser Isoenzyme in Gewebeschnitten dienen.

Literatur

ALLEN, J. M., and GOCKERMAN, J., Electrophoretio separation of multiple forms of particle asso­ciated acid phosphatase. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 616-633 (1964).

- and HYNCIK, G., Localization of alkaline phosphatases in gel matrices following electrophoresis. J. Histochem. Cytochem. 11, 169-175 (1963).

ALLEN,S. L., MISCH, M. S., and MORRISON, B. M., Variations of the electrophoretic ally separated acid phosphatases of Tetrahymcna. J. Histochem. Cytochem. 11,706-719 (1963).

ANDERSON, P. J., The effect of autolysis on the distribution of acid phosphatase in rat brain. J. Neuro­chern. 12,919-925 (1965).

- SONG, S. K., and CHRISTOFF, N., The cytochemistry of acid phosphatase in neural tissue: separa­tion, validation and localization. IV. International congress of neuropathology, Vol. I, p. 75-79. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1962.

9 Acta histochem. Bd. 60

130 E. STACH, H. OCKENFELS und CH. PILGRIM

BARKA, T., Studies of acid phosphatase. I. Electrophoretic separation of acid phosphatases of rat liver on polyacrylamide gels. J. Histochem. Cytochem. 9, 542-547 (1961).

BARRON, K. D., BERNSOHN, J., and HESS, A. R., Zymograms of neural acid phosphatases. Implica­tions for slide histochemistry. J. Histochem. Cytochem. 12, 42-44 (1964).

BEAUFAY, H., BERLEUR, A.-M., and DOYEN, A., The occurrence of lysosome-like particles in rat brain tissue. Biochem. J. 66, 32P (1957).

BLANK, M., und HOPF, H., Beeinflussungen histochemisch und biochemisch nachweisbarer saurer Phosphataseaktivitaten. In: Nervensystem und biologische Information (Sonderforschungs­bereich 33), S. 35-49. Gottingen 1972.

BORGERS, M., and THONE, F., Further characterization of phosphatase activities using non-specific substrates. Histochem. J. 8, 301-317 (1976).

BURSTONE, M_. S., Enzyme Histochemistry. Academic Press, New York and London 1962. CHU, T. M., BHARGAVA, A., BARNARD, E. A., OSTROWSKI, W., VARKARAKIS, M. J., MERRIN, C., and

MURPHY, G. P., Tumor antigen and acid phosphatase isoenzyme in prostatic cancer. Cancer Chemother. Rep. 59, 97-103 (1975).

DAVIDOFF, M. S., und GALABOV, G. P., Lysosomen und Iysosomale Enzyme im Zentralnervensystem der Ratte. Progr. Histochem. Cytochem. 6, 1-64 (1974).

FELICETTI, D., und RATH, F. W., Zum Vorkommen und zur Isolierung einer durch Zink stark akti­vierbaren sauren Phosphatase im GroJ3hirn der Ratte. Acta histochem. 53, 281-290 (1975).

GERHARDT, W., CLAUSEN, J., CHRISTENSEN, E., and RnsHEDE, J., Changes of LDH-isoenzymes, esterases, acid phosphatases and proteins in malignant and benign human brain tumors. Acta NeuroI. Scand. 39, 85-111 (1963).

GOMORI, G., Microscopic Histochemistry. University of Chicago Press, Chicago 1952. GaSSNER, W., Histochemischer Nachweis hydrolytischer Enzyme mit Hilfe der Azofarbstoffmethode.

Histochemie 1, 48-96 (1958). GOSSRAU, R., Spezifitatsprobleme bei histochemischen Enzymnachweisen. Acta histochem. SuppI.

18,75-84 (1977).

KAYE, C. I., and NADLER, H. L., Acid phosphatase isoenzymes in human skin fibroblasts (37768)_ Proc. Soc. Exp. BioI. Med. 145, 157-160 (1974).

LAX, E. R., Lactate and malate dehydrogenases in HeLa cells. (p. 84) Ph. D. Thesis, London Univ.

1972.

LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L., and RANDALL, R. J., Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. BioI. Chern. 193, 265-275 (1951).

MOORE, B. W., and ANGELETTI, P. U., Chromatographic heterogeneity of some enzymes in normal tissues and tumors. Ann. N. Y. Acad. Sci. 94, 659-667 (1961).

NOVIKOFF, A. B., Lysosomes in nerve cells. In: The neuron (Hrsg. H. HYDEN), S. 319-377. Elsevier,

Amsterdam 1967.

OSTROWSKI, W., WASYL, Z., WEBER, M., GUMINSKA, M., and LUCHTER, E., The role of neuraminic acid in the heterogeneity of acid phosphomonoesterase from the human prostate gland. Biochim. Biophys. Acta 221, 297-306 (1970).

PEARSE, A. G. E., Histochemistry. Theoretical and Applied. Vol. I, 3rd Ed., p. 552-555. Churchill

Ltd., London 1968.

RATH, F. W., und FELICETTI, D., Zur histochemischen Darstellung einer durch Zinkazetat stark aktivierten sauren Phosphatase in Friihstadien N-Athyl-N-Nitrosoharnstoff-induzierter Tumoren des RattengroJ3hirns. NeuropatoI. Pol. 13, 507-509 (1975).

SCHNEIDER, F., Theoretische Grundlagen und praktische Bedeutung der Enzymhemmung. Acta

histochem. SuppI. 18, 65-74 (1977).

TIMPERLEY, W_ R., BARSON, A_ J., and DAVIES, S., Isoenzyme patterns of non-specific esterase and acid phosphatase in the developing brain and a variety of normal tissues. BioI. Neonate 19, 459-464 (1971).

Acta histochem. Bd. 60 Tafel I

+

1 1 2 3

+

2

Stach, Ockenfe lf< und Pilgrim

Elektrophoretische Trennung 131

TSUBOI, K. K., and HUDSON, P. B., Acid phosphatase. V. The nature of inactivation and stabiliza­tion of purified human red cell phosphomonoesterase. Arch. Biochem. Biophys. 55, 206-218 (1955).

VAN ETTEN, R. L., Personliche Mitteilung, 1976. - WAYMACK, P. P., and REHKOP, D. M., Transition metal ion inhibition of enzyme-catalyzed phos­

phate ester displacement reactions. J_ Am. Chern. Soc. 96, 6782-6785 (1974). WALTER, K., und SCHUTT, CH., Saure und alkalische Phosphatase im Serum (Zwei-Punkt-Methode).

In: Methoden der enzymatischen Analyse (Hrsg. H. U. Bergmeyer), S. 818-822. Verlag Chemie, WeinheimfBergstr. 1970.

Anschrift der Verfasser: p. A. Dr. EWA STACH, Abteilung Klinische Morphologie, Universitat Ulm, Oberer Eselsberg, D - 7900 Ulm.

Tafelerklarung

Tafel I

Abb. 1. Darstellung der sauren Phosphataseaktivitat aus dem Gehirn der Ratte (Kupplungsmethode). Behandlung des Homogenats mit Triton X-JOO. Elektrophorese auf 1 %igem Agargel, Tris-HCI­Puffer (pH = 6,7). Modifizierte Kupplungsmethode nach BURSTONE (Substrat: Naphthol-AS-BI­phosphat). A Auftragstelle.

Abb.2. Darstellung der sauren Phosphataseaktivitat aus dem Gehirn der Ratte (Bleimethode). Be­handlung des Homogenats mit Triton X-100. Elektrophorese auf 1 %igem Agargel, Tris-HCI-Puffer (pH = 6,7). Bleimethode (Substrat: p-Nitrophenylphosphat). A Auftragstelle.

t*