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AmpliVue C. difficile Assay Page 1 of 13

FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE

Contents INTENDED USE .......................................................................................................................................................................... 2

SUMMARY AND EXPLANATION ................................................................................................................................................ 2

PRINCIPLE OF THE PROCEDURE ................................................................................................................................................ 2

MATERIALS PROVIDED ............................................................................................................................................................. 3

OPTIONAL MATERIALS.............................................................................................................................................................. 3

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED ............................................................................................................................ 3

WARNINGS AND PRECAUTIONS ............................................................................................................................................... 3

STORAGE AND HANDLING OF KIT REAGENTS .......................................................................................................................... 4

SPECIMEN COLLECTION, STORAGE AND HANDLING ................................................................................................................ 4

ASSAY PROCEDURE ................................................................................................................................................................... 4

Heat Lysis .......................................................................................................................................................................... 4

Amplification ..................................................................................................................................................................... 4

Detection ........................................................................................................................................................................... 5

Warning ............................................................................................................................................................................. 5

INTERPRETATION OF RESULTS ................................................................................................................................................. 6

QUALITY CONTROL ................................................................................................................................................................... 6

LIMITATIONS ............................................................................................................................................................................ 6

CLINICAL PERFORMANCE ......................................................................................................................................................... 7

ANALYTICAL PERFORMANCE .................................................................................................................................................... 7

Limit of Detection .............................................................................................................................................................. 7

Analytical Reactivity (Inclusivity) ....................................................................................................................................... 7

Reproducibility Study ........................................................................................................................................................ 8

Analytical Specificity – Cross-reactivity and Microbial Interference ................................................................................. 9

Analytical Specificity – Interfering Substances ................................................................................................................ 11

For the qualitative detection and identification of toxigenic Clostridium difficile nucleic acids extracted from stool samples


Carryover – Cross Contamination ................................................................................................................................... 11

ASSISTANCE ............................................................................................................................................................................ 11

REFERENCES ........................................................................................................................................................................... 11

GLOSSARY ............................................................................................................................................................................... 13

INTENDED USE

The AmpliVue C. difficile Assay is an in vitro diagnostic test for the direct, qualitative detection of the Clostridium difficile Toxin A gene (tcdA) in unformed stool specimens of patients suspected of having Clostridium difficile-associated disease (CDAD). The AmpliVue C. difficile Assay is intended for use as an aid in diagnosis of CDAD. The assay utilizes helicase-dependent amplification (HDA) for the amplification of a highly conserved fragment of the Toxin A gene sequence and a self-contained disposable amplification detection device that allows for visual evaluation of assay results.

SUMMARY AND EXPLANATION C. difficile is a major cause of antibiotic-associated diarrhea and colitis, accounting for up to 25% of all cases.1 It is thought that the exposure to antibiotics disrupts the flora of the intestine, allowing an opportunistic colonization by C. difficile (which is present in the gut flora of up to 3% of healthy adults). The virulence of C. difficile is believed to be mediated by the production of two toxins (Toxin A and Toxin B). Both toxin genes (tcdA and tcdB, respectively) are located within a 19.6 Kb pathogenicity locus (PaLoc), along with 3 other gene products. Recently, the incidence and severity of C. difficile-associated disease corresponding to short-term hospital stays has been on the rise.1,2

PRINCIPLE OF THE PROCEDURE The AmpliVue C. difficile Assay combines simple sample processing, an isothermal amplification technology named helicase-dependent amplification (HDA), and a self-contained disposable amplicon detection device for the detection of C. difficile directly from CDAD-suspected stool specimens.3,4 The assay targets a conserved fragment of the C. difficile DNA,

which is intact in all known A+B+ and A–B+ toxinotypes of C. difficile. A swab is used to transfer a small amount of specimen into a dilution tube. The diluted sample is then transferred into a sample lysis buffer tube, and the cells are lysed by simple heat treatment. After heat treatment, an aliquot of the lysed sample is added to a reaction tube containing lyophilized mix of HDA reagents including primers specific for the amplification of a fragment from the conserved region of the C. difficile DNA. The assay also includes a process control to monitor sample processing and to confirm the integrity of the assay reagents and chamber detection as well as to assess for HDA-inhibitors that may be present within the diarrheal sample. Competitive amplification of the process control DNA also takes place unless amplification inhibitory substances are present or the sample processing fails. The HDA reaction is asymmetric so that an excess of single stranded DNA is formed from a biotinylated primer present within the reaction mix. The capture probes for each amplicon bind to the corresponding biotinylated single-stranded DNA forming dual labeled amplicons. After completion of the HDA reaction, the Reaction Tube is transferred to a Detection Chamber for rapid detection with the test result displayed as test and/or control lines in the window of the Detection Chamber. The dual-labeled probe-amplicon hybrid is then detected by the lateral flow strip within the Detection Chamber. The bottom line captures the test amplicon and the top line captures the control amplicon. The biotin label binds the streptavidin-conjugated color particles for visualization and the test result is shown as colored lines visible to the naked eye. The self-contained Detection Chamber is comprised of two individual components: an Amplicon Cartridge that holds the running buffer and a single 0.2 mL thin wall Reaction Tube containing the amplified product; and the detection chamber which houses the Amplicon Cartridge and a vertical-flow DNA detection strip embedded into the Detection Chamber. The DNA detection strip is coated with different anti-hapten antibodies that serve as the C. difficile test (T) line and the control (C) line in the assay. A razor blade and a plastic pin located at the bottom of the detection chamber opens the HDA reaction tube and the running buffer bulb when the handle of the detection chamber is closed. The mixture flows through a fiberglass paper connected to the DNA detection strip that contains a fiberglass pad pre-loaded with streptavidin-conjugated color particles for color visualization. Detection of C. difficile DNA is reported whenever the T2 (Test line 2) is visible through the detection window of the Detection Chamber. The presence of the C line is not required for positive


results. No detection of C. difficile DNA is reported when only the C line is displayed. The assay is regarded as invalid when neither line is displayed.

MATERIALS PROVIDED Cat. #M201 16 Tests per Kit

Component Quantity Storage

Detection Chambers 16/kit 2°C to 30°C

Dilution Buffer 16 tubes/kit 1.8 mL 2°C to 8°C

Lysis Buffer 16 tubes/kit 1 mL 2°C to 8°C

Reaction Tubes 16 tubes/kit 2°C to 8°C

Amplicon Cartridge 16/kit 2°C to 30°C

Flocked Swabs Part 16 swabs/kit 2°C to 30°C

OPTIONAL MATERIALS External controls for toxigenic C. difficile (e.g. Quidel Molecular C. difficile Control Set #M108, which contains positive

and negative controls, serves as an external processing and extraction control)

Thermometer

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Sterile DNAse-free filter-blocked or positive displacement micropipettor tips

Micropipettor

Stopwatch or timer

Scissors or a blade

Heat block capable of 95°C 2°C temperature

Heat block with heated lid capable of 64°C 2°C temperature

WARNINGS AND PRECAUTIONS For in vitro diagnostic use.

Performance characteristics of this test have been established with the specimen types listed in the Intended Use Section only. The performance of this assay with other specimen types or samples has not been evaluated.

Treat all specimen/samples as potentially infectious. Follow universal precautions when handling samples, this kit and its contents.

Proper sample collection, storage and transport are essential for correct results.

Store assay reagents as indicated on their individual labels.

Reagents are not interchangeable between lots.

Never pool reagents from different tubes even if they are from the same lot.

Do not use the reagents after their expiration date.

Do not interchange caps among reagents as contamination may occur and compromise test results.

Only open the tubes when adding aliquots into tubes or removing aliquots from tubes. Keep the tubes closed at any other time to avoid contamination.

To avoid contamination of the environment with C. difficile amplicons, do not open the reaction tubes post-amplification.

Avoid microbial and deoxyribonuclease (DNAse) contamination of reagents when removing aliquots from tubes. The use of sterile DNAse-free disposable filter-blocked or positive displacement Pipettor tips is recommended.

Use a new Pipettor tip for each specimen or reagents.

Performing the assay outside of the recommended time ranges can produce invalid results. Assays not completed within specified time ranges should be repeated.

Additional controls may be tested according to guidelines or requirements of Local, State, Provincial and/or Federal regulations or accrediting organizations.


In cases where open-tube PCR tests are conducted in the same general area by the laboratory, separated or segregated working areas should be used for specimen preparation and amplification/detection activities. Supplies and equipment should be dedicated to each area and should not be moved from one area to another. Gloves must always be worn and must be changed before going from one area to another. Gloves must be changed before manipulating the reagents.

Do not pipette by mouth.

Do not smoke, drink or eat in areas where specimens or kit reagents are being handled.

For accurate results, pipette carefully using only calibrated equipment.

Maintenance and decontamination of workspace and equipment should follow and be performed according to established laboratory protocols and schedules.

Use micropipettes with an aerosol barrier or positive displacement tips for all procedures.

Testing should be performed in an area with adequate ventilation.

Dispose of containers and unused contents in accordance with Federal, State and Local regulatory requirements.

Wear suitable protective clothing, gloves, and eye/face protection when handling the contents of this kit.

Wash hands thoroughly after handling.

For additional information on hazard symbols, safety, handling and disposal of the components within this kit, please refer to the Safety Data Sheet (SDS) located at quidel.com.

STORAGE AND HANDLING OF KIT REAGENTS Store assay reagents and Detection Chambers as indicated on their individual labels.

SPECIMEN COLLECTION, STORAGE AND HANDLING Specimen Type: unformed stool samples indicative of CDAD. Using a sterile container:

1. Transfer the liquid or soft stool into the sterile container, taking care not to transfer toilet paper, urine, water or soap.

2. Label the container according to hospital standard operating procedures. 3. Transport the labeled specimen to the laboratory. If specimens can be processed within 3 to 4 hours after

collection, transport at room temperature is adequate. Specimens delayed to the laboratory should be promptly cooled and kept between 2°C to 8°C during transport.

Storage: Specimens may be stored between 2°C to 8°C or –20°C for up to 7 days prior to testing.

ASSAY PROCEDURE Heat Lysis

1. 25 minutes prior to the heat lysis step, warm the heating block to 95°C. 2. Vortex liquid stool specimen for 15 seconds to ensure complete mixing. 3. Collect sample by using the sterile swab provided. Dip the swab into the liquid or unformed stool sample being

aware to not oversample – the swab head should only be lightly coated with stool. 4. Place swab in a patient identified Dilution Buffer tube (Blue Cap) and release the specimen by swirling the tip

rapidly for 5 to 10 seconds to remove stool; remove swab and discard as appropriate for your laboratory. Vortex approximately 10 seconds to mix. Note: Samples in Dilution Buffer are stable up to 24 hours at room temperature.

5. Transfer 50 μL of the diluted stool specimen to a labeled Lysis Buffer tube and vortex for 10 seconds. Note: Samples in Lysis Buffer are stable up to 24 hours at room temperature prior to heating.

6. Heat the Lysis Buffer tube at 95°C ± 2°C for 10 minutes ± 2 minutes and then vortex for 10 seconds. Note: Begin 10 minute lysis procedure after placing tubes in block and waiting until block returns to 95°C. Note: Samples in Lysis Buffer are stable up to 24 hours at room temperature after heating. Note: Unused Dilution Buffers and Lysis Buffers must be stored at 2°C to 8°C.

Amplification 1. 15 minutes prior to the amplification step, warm a heating block with a heated lid to 64°C.


2. Transfer 50 µL of lysed sample to a labeled Reaction Tube and rehydrate lyophilized reagents by pipetting up and

down 3 to 5 times to mix. Close the lid tightly and proceed to the next step.

3. Incubate the Reaction Tube at 64°C ± 2°C for 60 minutes ± 2 minutes in a heating block with a heated lid.

Note: To avoid laboratory contamination, once the tube has been closed, and the amplification reaction started,

DO NOT open the Reaction Tube.

Note: Unused Reaction Tubes must be stored at 2°C to 8°C.

Detection 1. Tear open a new Detection Chamber package. Label the Detection Chamber appropriately. Make sure a buffer bulb is attached in the Amplicon Cartridge. 2. Place the Reaction Tube into the Amplicon Cartridge (Figure 1, step 1). Be sure to place the HINGE of the

Reaction Tube cap into the largest slot adjacent to the buffer bulb. 3. Close the Amplicon Cartridge (Figure 1, step 2) ensuring that it snaps shut. If the cartridge does not snap shut, reposition the tube within the cartridge. 4. Insert the closed Amplicon Cartridge into the Detection Chamber (Figure 1, step 3). Make sure the arrow faces the detection strip (Reaction Tube should face the razor blade and the plastic bulb

containing the running buffer should face the pin). Identify the Detection Chamber on the top and/or side of the outer casing.

5. Keep the device upright and press the handle of the outer casing to close the device (Figure 1, step 4). The handle will lock into place when closed completely (Figure 1, step 5).

6. Read results at 10 minutes. Results are stable up to 30 minutes after the Detection Chamber has been snapped shut.

7. Discard the used Detection Chambers in sealed bags and as appropriate for your laboratory.

Warning 1. DO NOT open the AmpliVue Detection Chamber after use. Opening the Detection Chamber after use may result

in amplicon contamination of the test area. 2. Remove the required number of Reaction Tubes from the protective pouch, remove the excess air and reseal the

bag.

Figure 1


INTERPRETATION OF RESULTS Any pink to red colored visible line should be recorded as positive (+) and no line should be recorded as (–); for

example, “T+” = Visible T line and “T–" = No T line (See diagram below).

The T2 line detects toxigenic C. difficile DNA.

The C line detects the process control DNA in the absence of the target toxigenic C. difficle DNA. In the presence of the target toxigenic C. difficile DNA, the C line detects amplified products from both the toxigenic C. difficile DNA and the process control DNA. The control line intensity may vary with each test. Any pink to red colored visible line in the control signifies a valid test.

The interpretation of the assay results is done according to the following criteria:

Test line (T) Reading Control line (C) Reading Interpretation of result

T2+ C+ Toxigenic C. difficile DNA detected (Positive)

T2+ C– Toxigenic C. difficile DNA detected (Positive)

T2– C+ No toxigenic C. difficile DNA detected (Negative)

T2– C– Invalid: failure due to inhibitory specimen, reagent failure, or device failure. Repeat test with original stool specimen.

Note 1: The T1 line is for triplex assays. The T1 line is not used on this assay. Note 2: The absence of a C line (control) in conjunction with a positive test line (T2) means that target material was successfully amplified. This occurs because of the over abundance of amplicons that generates competition with the test targets.

QUALITY CONTROL The AmpliVue C. difficile Assay incorporates several controls to monitor assay performance. 1. The process control is used to monitor sample processing, to detect HDA inhibitory specimens and to confirm the

integrity of assay reagents and chamber detection. The process control is included in the lysis buffer tube. 2. External positive controls may be treated as a patient specimen. Dip the provided swab into the external positive

control ensuring liquid covers the tip. Identify the Dilution Buffer tube as the positive control and proceed with processing as described above in the Assay Procedure. The external positive control is intended to monitor substantial Reagent and Detection Chamber failure.

3. External negative controls may be treated as a patient specimen. Dip the provided swab into the external negative control ensuring liquid covers the tip. Identify the Dilution Buffer tube as the negative control and proceed with processing as described above in the Assay Procedure. The external negative control is used to detect reagent or environmental contamination (or carry-over) by C. difficile DNA or amplicon.

It is recommended that the reactivity of each new lot and each new shipment of the AmpliVue C. difficile Assay be verified on receipt and before use. External control tests should be performed thereafter in accordance with appropriate Federal, State and Local guidelines. The AmpliVue C. difficile Assay should not be used in patient testing if the external controls do not produce the correct results.

LIMITATIONS A negative C. difficile result should not be used as the sole basis for diagnosis, treatment, or patient management

decisions.

Positive for Negative for Invalid Toxigenic Toxigenic C. difficile C. difficile

C line

T2 line

T1 line


Although there is no need for reagent preparation, the main laboratory technique required is pipetting; good laboratory technique is essential for the proper performance of this assay. Due to the high analytical sensitivity of this test, extreme care should be taken to preserve the purity of all reagents, especially in cases where multiple aliquots are taken from a tube.

Mutations or polymorphisms in primer or probe binding regions may affect detection of new or unknown C. difficile variants and may result in a false negative result with the AmpliVue C. difficile Assay.

A positive test result does not necessarily indicate the presence of viable organisms.

This test detects but does not differentiate hypervirulent strains from other toxigenic C. difficile genotypes.

This test does not indicate the susceptibility of detected C. difficile strains to various antimicrobial agents.

Negative test results may occur from improper specimen collection, handling or storage, presence of inhibitors, technical error, sample mix-up or because the number or organisms in the specimen is below the analytical sensitivity of the test. Careful compliance with the instructions given in this insert is necessary to avoid erroneous results. Use of this assay should be limited to personnel trained on the procedure.

The AmpliVue C. difficile Assay procedure must be carried out in an environment that does not exceed 30°C.

CLINICAL PERFORMANCE The performance of the AmpliVue C. difficile Assay was evaluated at four geographically diverse locations within the United States between January 2012 and October 2012. Eight hundred and forty (840) samples were tested by both the AmpliVue C. difficile Assay and the Tissue Culture Cytotoxicity Assay. One specimen (0.1%) was indeterminate in the cytotoxin assay due to toxicity in the antitoxin well. Four (4) specimens (0.5%) were invalid in the AmpliVue C. difficile Assay when initially tested. Three (3) of these specimens yielded valid results (all were negative) when retested according to the AmpliVue C. difficile Assay’s instructions for use. One (1) specimen remained invalid upon repeat testing. The data below is based on the initial result for the eight hundred and thirty-five (835) specimens. The Quidel AmpliVue C. difficile Assay achieved a sensitivity and specificity of 93.6% and 94.1%, respectively, in this study.

Tissue Culture Cytotoxin 95% CI

POS NEG Total Sensitivity 93.6% 87.3% 96.9%

AmpliVue C. difficile POS 102 43* 145 Specificity 94.1% 92.1% 95.6%

NEG 7** 683 690 Total 109 726 835

* Of these forty three (43) discordant specimens (AmpliVue Positive/Tissue Culture Cytotoxin Negative) reported, thirty-seven (37) were positive for C. difficile by a FDA-cleared molecular device, and six (6) were negative.

** Of these seven (7) discordant specimens (AmpliVue Negative/Tissue Culture Cytotoxin positive) reported, two (2) were positive for C. difficile by a FDA-cleared molecular device, and five (5) were negative.

ANALYTICAL PERFORMANCE Limit of Detection The analytical sensitivity (limit of detection or LOD) of the AmpliVue C. difficile Assay was determined using quantified (CFU/mL) cultures of two (2) C. difficile strains (ATCC 43255 {toxinotype 0} and CCUG 8864 {toxinotype X}) serially diluted in a negative fecal matrix. Analytical sensitivity (LOD) is defined as the lowest concentration at which 95% of all replicates tested positive.

Strain Toxinotype LOD (CFU/ Assay)

ATCC 43255 0 4.2

CCUG 8864 X 0.7

The final assay LOD is defined as the higher of the two strain concentrations where 95% positivity was observed. The final assay LOD is 4.2 CFU/assay.

Analytical Reactivity (Inclusivity) The reactivity of the AmpliVue C. difficile Assay was evaluated against an additional twenty-four (24) strains of Clostridium difficile representing multiple toxinotypes. The testing was performed near the level of detection for the assay (2 to 3x LOD). The testing was performed using three (3) separate production lots of the AmpliVue C. difficile Assay. All twenty-


four (24) strains were detected by the AmpliVue C. difficile Assay in this study and the highest observed LOD was 15.67 CFU/assay.

Strain Toxinotype CFU/Assay AmpliVue C. difficile

(Detected/Total)

ATCC 43255 0 4.2 19/20

CCUG 8864 X 0.7 19/20

ATCC BAA-1870 IIIb 8.15 3 / 3

CCUG 37770 IV 2.84 3 / 3

ATCC BAA-1875 V 10.92 3 / 3

ATCC 43598 VIII 2.13 3 / 3

ATCC 37774 XXIII 1.52 3 / 3

CCUG 9004 Unknown 1.63 3 / 3

ATCC BAA-1874 0 5.75 3 / 3

ATCC 43600 0 3.92 3 / 3

ATCC BAA-1871 0 3.61 3 / 3

ATCC BAA-1803 IIIc 0.7 3 / 3

ATCC BAA-1872 0 7.97 3 / 3

ATCC 700792 0 1.65 3 / 3

ATCC 43599 0 1.55 3 / 3

CCUG 60276 Unknown 15.67 3 / 3

CCUG 60275 Unknown 1.99 3 / 3

CCUG 37778 Unknown 9.29 3 / 3

CCUG 37777 Unknown 7.97 3 / 3

CCUG 37776 Unknown 1.08 3 / 3

CCUG 37773 Unknown 1.29 3 / 3

ATCC 17857 0 0.72 3 / 3

ATCC 43594 0 0.54 3 / 3

ATCC 43596 0 1.27 3 / 3

Reproducibility Study In order to confirm the reproducibility of the AmpliVue C. difficile Assay a blinded and randomized study panel containing Clostridium difficile negative and positive samples was tested at three (3) test sites (two (2) clinical sites). Each site tested a reproducibility panel and Assay Controls for 5 days in triplicate. Testing was done by two operators at each site. Each operator ran the panel once a day using one lot of AmpliVue C. difficile Assay. A total of five hundred and forty (540) specimens were tested (including controls). The AmpliVue C. difficile Assay generated reproducible results in this study.

Reproducibility of the Quidel AmpliVue C. difficile Assay

Category

Site #1 Site #2 Site #3 Overall Percent

Agreement

95% Confidence

Interval

#Expected results/#

tested

% Agreement

#Expected results/# tested

% Agreement

#Expected results/#

tested

% Agreement

C. difficile High* Negative

25/30 83% 23/30 77% 24/30 80% 72/90 80% 71% to

87%

C. difficile Low Positive

30/30 100% 29/29 100% 30/30 100% 89/89* 100% 95% to 100%

C. difficile Moderate Positive

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95% to 100%


Reproducibility of the Quidel AmpliVue C. difficile Assay

Category

Site #1 Site #2 Site #3 Overall Percent

Agreement

95% Confidence

Interval

#Expected results/#

tested

% Agreement

#Expected results/# tested

% Agreement

#Expected results/#

tested

% Agreement

Negative 30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95% to 100%

C. difficile Positive Control

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95% to 100%

Assay Negative Control

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95% to 100%

Lot# CLIN-005

*Note: One (1) sample was invalid. A “high negative/low positive” sample is a sample with a concentration

below the clinical cut-off such that results of repeated tests of this sample are negative approximately 20% to 80% of the time.5

Analytical Specificity – Cross-reactivity and Microbial Interference The analytical specificity of the AmpliVue C. difficile Assay was evaluated by testing a panel consisting of sixty-six (66) bacterial, viral and yeast microorganisms and human DNA representing common enteric pathogens, flora or nucleic acid commonly present in the intestine. Microorganisms or nucleic acid was mixed with pooled negative matrix and tested directly or in the presence of 2 to 3x LOD level of C. difficile for cross-reactivity and microbial interference, respectively. The table below summarizes the data from these studies. There was no evidence of cross reactivity or interference with any of the panel members and the AmpliVue C. difficile Assay.

Organisms ID Identification

Concentration tested

(CFU/mL or PFU/mL)

C. difficile Results

Cross-reactivity

Microbial Interference

(Strain 1)


(Strain 2)

Abiotrophia defective * CCUG 27280 4.30E+08 Negative Positive Positive

Acinetobacter baumannii ZM 081597 5.27E+08 Negative Positive Positive

Aeromonas hydrophila ATCC 7966 2.09E+10 Negative Positive Positive

Alcaligenes faecalis subspecies faecalis ATCC 15554 4.65E+09 Negative Positive Positive

Bacillus cereus ATCC 13472 1.00E+07 Negative Positive Positive

Bacteroides fragilis CCUG 4856 1.77E+08 Negative Positive Positive

Campylobacter coli* CCUG 36995 5.30E+08 Negative Positive Positive

Campylobacter jejuni sub sp .jejuni ATCC 33292 1.72E+07 Negative Positive Positive

Candida albicans ATCC 10231 3.00E+07 Negative Positive Positive

Citrobacter freundii ATCC 8090 2.38E+09 Negative Positive Positive

Clostridium bifermentans ATCC 638 2.05E+07 Negative Positive Positive

Clostridium botulinum In silico analysis No in silico cross reactivity observed

Clostridium butyricum CCUG 47601 1.75E+07 Negative Positive Positive

Clostridium difficile (non-toxigenic) ATCC 43601 4.58E+06 Negative Positive Positive

Clostridium difficile (non-toxigenic) ATCC 43593 1.13E+06 Negative Positive Positive

Clostridium haemolyticum* ATCC 9650 3.43E+09 Negative Positive Positive Clostridium novyi CCUG 57219 6.50E+06 Negative Positive Positive

Clostridium orbiscindens ATCC 49531 5.30E+06 Negative Positive Positive

Clostridium perfringens (Strain: Type A) ZM 0801585 3.37E+07 Negative Positive Positive

Clostridium scindens ATCC 35704 1.62E+07 Negative Positive Positive

Clostridium septicum ATCC 12464 6.60E+09 Negative Positive Positive

Clostridium sordellii ATCC 9714 1.94E+06 Negative Positive Positive

Clostridium sordellii Z077 2.07E+08 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 6329 9.85+E07 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 9284 6.50E+07 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 33098 2.00E+07 Negative Positive Positive


Organisms ID Identification

Concentration tested

(CFU/mL or PFU/mL)

C. difficile Results

Cross-reactivity


(Strain 1)


(Strain 2)

Clostridium sordellii CCUG 36938 5.55E+07 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 43123 2.50E+07 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 47545 1.36E+07 Negative Positive Positive Clostridium sordellii CCUG 59819 7.00E+06 Negative Positive Positive Clostridium sporogenes ATCC 11437 3.55E+07 Negative Positive Positive

Edwardsiella tarda ATCC 15947 2.03E+09 Negative Positive Positive

Enterobacter aerogenes ATCC 13048 1.31E+10 Negative Positive Positive

Enterobacter cloacae ATCC 13047 5.95E+08 Negative Positive Positive

Enterococcus faecalis vanB ATCC 51299 3.45E+09 Negative Positive Positive

Escherichia coli ATCC 23511 1.92E+09 Negative Positive Positive

Escherichia coli O157:H7 ZM 0801622 2.20E+09 Negative Positive Positive

Helicobacter pylori ZM 0801486 3.57E+06 Negative Positive Positive

Klebsielia oxytoca ATCC 33496 1.63E+09 Negative Positive Positive

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 6.82E+07 Negative Positive Positive

Listeria monocytogenes(Serotype 1/2b) ZM 0801534 1.18E+10 Negative Positive Positive

Peptostreptococcus anaerobius ATCC 27337 5.80E+08 Negative Positive Positive

Plesiomonas shigelloides ATCC 14029 1.40E+08 Negative Positive Positive

Porphyromonas asaccharolytica CCUG 7834 1.30E+07 Negative Positive Positive

Prevotella melaninogenica ATCC 25845 5.10E+08 Negative Positive Positive

Proteus mirabilis ATCC 25933 1.06E+09 Negative Positive Positive

Providencia alcalifaciens ATCC 9886 9.60E+08 Negative Positive Positive

Pseudomonas aeruginosa ATCC 35554 2.60E+10 Negative Positive Positive

Salmonella cholerasuis (typhimurium) ATCC 14028 3.55E+10 Negative Positive Positive

Salmonella enterica subspecies Arizonae (formerly Choleraesuis arizonae)

ATCC 13314 4.22E+09 Negative Positive Positive

Salmonella enteric subspecies enterica (formally Salmonella choleraesuis)


Serratia liquefaciens ATCC 27592 3.79E+10 Negative Positive Positive

Serratia marcescens ZM 0801723 6.10E+08 Positive

Shigella boydii ATCC 9207 8.16E+08 Negative Positive Positive

Shigella dysenteriae ATCC 49557 1.26E+10 Negative Positive Positive

Shigella sonnei ATCC 29930 3.36E+08 Negative Positive Positive

Staphylococcus aureus ATCC 43300 6.00E+07 Negative Positive Positive

Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 4.00E+08 Negative Positive Positive

Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus)


Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 9.50E+06 Negative Positive Positive

Adenovirus 1 VR-1* DHI 62207 5.67E+05 Negative Positive Positive

Rotavirus (Strain: WA)* ZM NATROTA-ST 2.32E+08 Negative Positive Positive

Norovirus GII ZM NATNOVII-ST 3.92E+08 Negative Positive Positive

Enterovirus 71 DHI 80406 4.82E+05 Negative Positive Positive

Echovirus 6 DHI 121506 1.05E+09 Negative Positive Positive

Coxsackievirus B4 DHI 92206 2.43E+07 Negative Positive Positive

Cytomegalovirus Towne VR-977 DHI 201006 1.48E+06 Negative Positive Positive

Human Genomic DNA Promega G3041 184 µg/mL Negative Positive Positive * Purified nucleic acid was used in the testing of these organisms. Cell counts were approximated based on nucleic acid concentration

and genome size.


Analytical Specificity – Interfering Substances The performance of AmpliVue C. difficile Assay was evaluated with potentially interfering substances that may be present in stool specimens. The potentially interfering substances were evaluated using two C. difficile strains (ATCC 43255 {toxinotype 0} and CCUG 8864 {toxinotype X}) at a concentration of 2 to 3x LOD. There was no evidence of interference caused by the substances tested.

Substance Name Concentration

Tested C difficile

Result Substance Name

Concentration Tested

C difficile Result

Nystatin 10,000 USP

U/mL Positive

Esomeprazole magnesium hydrate

0.5 mg/mL Positive

Hydrocortisone (aka cortisone)

1% w/v Positive Barium sulfate 5 mg/mL Positive

Phenylephrine hydrochlorine

2% w/v Positive Witch hazel 100% Positive

Calcium carbonate 0.2 mg/mL Positive Petroleum jelly 100% Positive

Aluminum hydroxide 0.1 mg/mL Positive Vancomycin HCl 12.5 mg/mL Positive

Magnesium hydroxide 0.1 mg/mL Positive Methicillin 12.5 mg/mL Positive

5-aminosalicylic acid/Mesalazine

2 mg/mL Positive Sennosides 0.1 mg/mL Positive

Mineral oil 2% v/v Positive triclosan 0.1% v/v Positive

Nonoxynol-9 7% Positive Naproxen sodium 14 mg/mL Positive

Loperamide hydrochloride 1 mg/mL Positive Benzalkonium chloride 0.12% Positive

Bismuth subsalicylate 0.87 mg/mL Positive Ethanol 10% Positive

Blood 5% v/v Positive Glucose 1 mg/mL Positive

Mucus (Mucin) 3 mg/mL Positive Human IgA 1.6 mg/mL Positive

Miconazole nitrate 2% Positive Human serum albumin 10 mg/mL Positive

Zinc oxide 13% w/v Positive Palmitic acid 1.3 mg/mL Positive

Aluminum hydroxide / Magnesium carbonate

0.1 mg/mL Positive Stearic acid 26 mg/mL Positive

Cimetidine 0.5 mg/mL Positive Human hemoglobin 3.2 mg/mL Positive

Carryover – Cross Contamination Four (4) runs of twenty-four (24) samples consisting of twelve (12) negative and twelve (12) high C. difficile positive samples were tested in an alternating pattern by a total of two (2) operators on two (2) assay lots (operators were blinded to the expected results). All positive samples were reported as positive (T2+/C+) and all negative samples were reported as negative (T2–/C+). No carry over contamination was seen when performing the Quidel AmpliVue C. difficile Assay according to product instructions for use.

ASSISTANCE To place an order or for technical support, please contact a Quidel Representative at 800.874.1517 (in the U.S.) or 858.552.1100 (outside the U.S.), Monday through Friday, from 8:00 a.m. to 5:00 p.m., Eastern Time. Orders may also be placed by fax at 740.592.9820. For e-mail support contact [email protected] or [email protected]. For services outside the U.S., please contact your local distributor. Additional information about Quidel, our products, and our distributors can be found on our website quidel.com.

REFERENCES 1. Sloan LM, Duresko BJ, Gustafson DR, and Rosenblatt JE. Comparison of Real-Time PCR for Detection of the tcdC Gene

with Four Toxin Immunoassays and Culture in Diagnosis of Clostridium difficile Infection_J. Clin. Micro. 2008: 46(6):1996–2001.

2. Archibal LK, Banerjee SN, and Jarvis WR. Secular trends in hospital-acquired Clostridium difficile disease in the United States. J. Infect. Dis. 2004: 189:1585–1588.

mailto:[email protected]


http://www.quidel.com/


3. An L, Tang W, Ranalli TA, Kim HJ, Wytiaz J and Kong H. Characterization of a Thermostable UvrD Helicase and its

participation in Helicase Dependent Amplification. J. Biol. Chem. 2005: 280: 28952-28958. 4. Vincent M, Xu Y, and Kong H. Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification. EMBO 2004: Rep.5: 795-800. 5. Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff - Establishing the Performance Characteristics of

In Vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile, November 29, 2010.

M201 – AmpliVue C. difficile Assay kit

MDSS GmBH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany

Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH 45701 USA quidel.com

PIM201002EN01 (02/17)


GLOSSARY

AmpliVue C. difficile Seite 1 von 17

ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK

Contents EINSATZBEREICH ...................................................................................................................................................................... 2

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG ............................................................................................................................. 2

FUNKTIONSPRINZIP .................................................................................................................................................................. 2

MITGELIEFERTE MATERIALIEN ................................................................................................................................................. 3

OPTIONALE MATERIALIEN ........................................................................................................................................................ 3

ERFORDERLICHE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN ............................................................................................ 3

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN .................................................................................................................... 3

AUFBEWAHRUNG UND HANDHABUNG DER KIT-REAGENZIEN ................................................................................................ 4

ENTNAHME, AUFBEWAHRUNG UND HANDHABUNG DER PROBEN ........................................................................................ 4

ASSAYVERFAHREN .................................................................................................................................................................... 5

Wärme-Lyse ......................................................................................................................................................................... 5

Amplifikation ........................................................................................................................................................................ 5

Nachweis .............................................................................................................................................................................. 5

Warnhinweis ........................................................................................................................................................................ 5

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE .............................................................................................................................................. 6

QUALITÄTSKONTROLLE ............................................................................................................................................................ 7

EINSCHRÄNKUNGEN ................................................................................................................................................................. 7

KLINISCHE LEISTUNG ................................................................................................................................................................ 8

ANALYTISCHE LEISTUNG ........................................................................................................................................................... 9

Nachweisgrenze ................................................................................................................................................................... 9

Analytische Reaktivität (Inklusivität) .................................................................................................................................... 9

Reproduzierbarkeitsstudie ................................................................................................................................................. 10

Analytische Spezifität – Kreuzreaktivität und mikrobielle Störung .................................................................................... 11

Analytische Spezifität – Störsubstanzen ............................................................................................................................ 15

Carryover – Kreuzkontamination ....................................................................................................................................... 15

Für den qualitativen Nachweis und die Identifizierung von aus Stuhlproben extrahierten toxigenen Clostridium difficile Nukleinsäuren


KUNDENDIENST UND TECHNISCHER SUPPORT ...................................................................................................................... 15

GEISTIGES EIGENTUM ............................................................................................................................................................ 16

LITERATURVERWEISE ............................................................................................................................................................. 16

GLOSSAR ................................................................................................................................................................................. 16

EINSATZBEREICH Der AmpliVue® C. difficile Assay ist ein In-vitro-Diagnostik-Test für den direkten, qualitativen Nachweis von Clostridium difficile Toxin A Gen (tcdA) in wässrigen Stuhlproben von Patienten, bei denen Verdacht auf eine Clostridium-difficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht. Der AmpliVue C. difficile Assay ist zur Unterstützung bei der Diagnose der CDAD bestimmt. Der Assay setzt Helicase-abhängige Amplifikation (HDA) für die Amplifikation eines hochkonservierten Fragments der Toxin-A-Gen-Sequenz und ein eigenständiges Amplifikat-Nachweisgerät (Einmalgebrauch) für die visuelle Beurteilung von Assay-Ergebnissen ein.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG C. difficile ist eine der Hauptursachen (25 % aller Fälle) für antibiotika-assoziierte Diarrhö und Colitis.

1 Es wird vermutet,

dass die Verwendung von Antibiotika die Flora des Darms stört und eine opportunistische Kolonisierung durch C. difficile (in der Darmflora von bis zu 3 % gesunder Erwachsener vorhanden) ermöglicht. Es wird angenommen, dass die Virulenz von C. difficile durch die Produktion von zwei Toxinen (Toxin A und Toxin B) gesteuert wird. Beide Toxingene (tcdA bzw. tcdB) befinden sich zusammen mit drei weiteren Genprodukten innerhalb eines 19,6 kb großen Pathogenitätslokus (PaLoc). Die Häufigkeit und die Schwere von C. difficile-assoziierten Erkrankungen mit entsprechenden Kurzaufenthalten im Krankenhaus steigen an.

1,2

FUNKTIONSPRINZIP Der AmpliVue C. difficile-Assay kombiniert einfache Probenverarbeitung, eine Biohelix® isotherme Amplifikationstechnologie mit der Bezeichnung Helicase-abhängige Amplifikation (HDA) und ein eigenständiges Amplifikat-Nachweisgerät (Einmalgebrauch) für den Nachweis von C. difficile direkt von CDAD-verdächtigen Stuhlproben.3,4 Der Assay zielt ein konserviertes Fragment der C. difficile-DNA an, das in allen bekannten A+B+ und A-B+ Toxinotypen von C. difficile intakt ist. Ein Tupfer wird verwendet, um eine kleine Menge des Präparats in ein Verdünnungsröhrchen zu übertragen. Die verdünnte Probe wird dann in ein Proben-Lysepufferröhrchen übertragen, und die Zellen werden durch einfache Wärmebehandlung lysiert. Nach der Wärmebehandlung wird ein Aliquot der lysierten Probe zu einem Reagenzröhrchen mit einem lyophilisiertem Mix aus HDA-Reagenzien hinzugefügt, einschließlich Primer, die für die Amplifikation des Fragments aus der konservierten Region der C. difficile-DNA spezifisch sind. Außerdem enthält der Assay eine Prozesskontrolle zur Überwachung der Probenverarbeitung und Bestätigung der Integrität der Assay-Reagenzien und des Kassettennachweises sowie für die Beurteilung von HDA-Inhibitoren, die möglicherweise in der Diarrhö-Stuhlprobe vorhanden sind. Ebenso findet kompetitive Amplifikation der Prozesskontrolle-DNA statt, es sei denn es sind amplifikationsinhibierende Substanzen vorhanden oder die Probenverarbeitung schlägt fehl. Die HDA-Reaktion ist asymmetrisch, so dass ein Überschuss an einzelsträngiger DNA von einem biotinylierten Primer gebildet wird, der innerhalb des Reaktionsmix vorhanden ist. Die Fangsonden für jedes Amplifikat binden sich an die entsprechende biotinylierte einzelsträngige DNA und bilden doppelt markierte Amplifikate. Nach Abschluss der HDA-Reaktion wird das Reagenzröhrchen für den schnellen Nachweis zu einer Kassette übertragen, und das Testergebnis wird als Test- und/oder Kontrolllinien im Fenster der Kassette angezeigt. Der doppelt markierte Sonden-Amplikat-Komplex wird dann auf dem Lateral-Flow-Strip (LFS) in der Kassette nachgewiesen. Die untere Linie erfasst das Testamplifikat, und die obere Linie erfasst das Kontrollamplifikat. Die Biotin-Markierung bindet sich zur Visualisierung mit den mit Streptavidin konjugierten Farbpartikeln, und das Testergebnis wird als Farblinien anzeigt, die mit dem bloßen Auge zu sehen sind.


Die eigenständige Kassette besteht aus zwei einzelnen Komponenten: einer Amplifikat-Kassette, die den Elektrophoresepuffer und ein einzelnes dünnwandiges Reagenzröhrchen (0,2 ml) mit dem amplifizierten Produkt enthält, und die Nachweiskammer, in der sich die Amplifikat-Kassette und ein Vertical-Flow-DNA-Nachweisstreifen befindet, der in die Kassette eingebettet ist. Der DNA-Nachweisstreifen ist mit verschiedenen Anti-Hapten-Antikörpern beschichtet, die als C. difficile-Testlinie (T) und Kontrolllinie (C) im Assay dienen. Eine Rasierklinge und ein Plastikstift unten an der Nachweiskammer dienen zum Öffnen des HDA-Reagenzröhrchens und des Pufferkolbens, wenn der Griff der Nachweiskammer geschlossen ist. Das Gemisch fließt durch ein Glasfaser-Papier, das mit dem DNA-Nachweisstreifen verbunden ist. Dieser enthält ein Glasfaser-Pad, das zur farblichen Visualisierung mit streptavidin-konjugierten Farbpartikeln vorgefüllt ist. Der Nachweis von C. difficile-DNA wird gemeldet, wenn die Linie T2 (Testlinie 2) durch das Nachweisfenster der Kassette zu sehen ist. Das Vorhandensein von Linie C ist für ein positives Ergebnis nicht erforderlich. Kein Nachweis von C. difficile-DNA wird gemeldet, wenn nur die C-Linie zu sehen ist. Der Assay wird als ungültig erachtet, wenn keine Linie zu sehen ist.

MITGELIEFERTE MATERIALIEN SKU-Nr. M201 16 Tests je Kit

Komponente Menge/Anzahl Aufbewahrung

Nachweiskassetten, Artikel-Nr. 1185001 16/Kit 2 °C bis 30 °C

Verdünnungspuffer, Artikel-Nr. M5015 16 Röhrchen/Kit 1,8 ml 2 °C bis 8 °C

Lysepuffer, Artikel-Nr. M5016 16 Röhrchen/Kit 1 ml 2 °C bis 8 °C

Reagenzröhrchen, Artikel-Nr. M5017 16 Röhrchen/Kit 2 °C bis 8 °C

Amplifikat-Kassette, Artikel-Nr. 1215400 16/Kit 2 °C bis 30 °C

Beflockte Tupfer, Artikel-Nr. M5013 16 Tupfer/Kit 2 °C bis 30 °C

OPTIONALE MATERIALIEN Externe Kontrollen für toxigenes C. difficile (z. B. Quidel Molecular C. difficile Kontrollset, Artikel-Nr. M108, das

positive und negative Kontrollen enthält und als externe Prozess- und Extraktionskontrolle dient) Thermometer

ERFORDERLICHE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN Mikro-Pipettierer mit sterilen DNAse-freien Filterspitzen oder Spitzen mit positiver Verdrängung Mikro-Pipettierer Stoppuhr oder Zeitgeber Schere oder Klinge Für Temperaturen bis zu 95 °C ± 2 °C fähiger Wärmeblock Für Temperaturen bis 64 °C ± 2 °C fähiger Wärmeblock mit erwärmten Deckel

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Zur In-vitro-Diagnostik. Die Leistungsmerkmale dieses Tests wurden nur anhand der im Abschnitt Bestimmungsgemäßer Gebrauch

aufgeführten Präparattypen bestimmt. Die Leistung dieses Assays mit anderen Präparattypen oder Proben wurde nicht untersucht.

Alle Präparate/Proben sind als potenziell infektiös zu behandeln. Bei der Arbeit mit Proben, diesem Kit und dessen Inhalt sind universelle Vorsichtsmaßnahmen zu befolgen.

Korrekte Ergebnisse setzen eine ordnungsgemäße Gewinnung und Lagerung und einen sachgemäßen Transport der Proben voraus.

Die Assay-Reagenzien sind entsprechend den Angaben auf ihren jeweiligen Etiketten aufzubewahren. Die Reagenzien sind nicht zwischen den Chargen austauschbar. Niemals Reagenzien aus verschiedenen Röhrchen zusammenfassen, selbst wenn sie von derselben Charge stammen.


Die Reagenzien nach ihrem Verfalldatum nicht verwenden. Die Kappen der Reagenzien nicht vertauschen, da dies zu Kontamination führen und die Testergebnisse

beeinträchtigen kann. Die Röhrchen nur öffnen, wenn Aliquote in die Röhrchen hinzugefügt oder Aliquote aus den Röhrchen entnommen

werden. Andernfalls die Röhrchen geschlossen halten, um Kontamination zu vermeiden. Um eine Kontaminierung der Umgebung mit C. difficile-Amplifikaten zu vermeiden, die Reagenzröhrchen nach der

Amplifikation nicht öffnen. Bei der Entnahme von Aliquoten aus den Röhrchen mikrobielle und Desoxyribonuklease- (DNAse) Kontamination der

Reagenzien vermeiden. Die Verwendung von Pipettierern mit sterilen DNAse-freien Filterspitzen oder Spitzen mit positiver Verdrängung wird empfohlen.

Für jedes Präparat oder Reagenz eine neue Pipettiererspitze verwenden. Die Durchführung des Assays außerhalb der empfohlenen Zeiträume kann zu ungültigen Ergebnissen führen. Assays,

die nicht innerhalb der angegebenen Zeiträume abgeschlossen werden, sollten wiederholt werden. Weitere Kontrollen können gemäß den Richtlinien oder Bestimmungen örtlicher und/oder staatlicher

Aufsichtsbehörden oder Akkreditierungsorganisationen durchgeführt werden. In Fällen, in denen das Labor in demselben allgemeinen Bereich PCR-Tests mit offenen Röhrchen durchführt, sind

getrennte Arbeitsbereiche für die Präparatvorbereitungs- und die Amplifikations-/Nachweisaktivitäten zu verwenden. Die Materialien und Gerätschaften sollten für die jeweiligen Bereiche zweckbestimmt sein und nicht zwischen den Bereichen gewechselt werden. Bei allen Arbeiten immer Handschuhe tragen und diese beim Verlassen des einen und Betreten des anderen Bereichs wechseln. Vor dem Handhaben von Reagenzien müssen die Handschuhe gewechselt werden.

Vor der Durchführung des Tests gründlich die Hände waschen. Nicht mit dem Mund pipettieren. In Bereichen, in denen Präparate oder Kit-Reagenzien gehandhabt werden, nicht rauchen, essen oder trinken. Ungebrauchte Reagenzien und Abfall gemäß den örtlichen und staatlichen Bestimmungen entsorgen. Bei der Verwendung dieses Kits geeignete Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille und Mundschutz tragen. Um genaue Ergebnisse beim Pipettieren zu erhalten, sorgfältig vorgehen und nur kalibrierte Geräte verwenden. Alle Oberflächen mit einer 10%igen Bleichelösung und anschließend mit molekularbiologisch gereinigtem Wasser

reinigen und desinfizieren. Bei allen Arbeitsschritten Mikro-Pipettierer mit einer Aerosolbarriere oder Spitzen mit positiver Verdrängung

verwenden. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDB) auf quidel.com, um weitere Informationen zu Gefahrensymbolen,

Sicherheit, Handhabung und Entsorgung der Komponenten in diesem Kit zu erhalten.

AUFBEWAHRUNG UND HANDHABUNG DER KIT-REAGENZIEN Die Assay-Reagenzien und Nachweiskassetten sind entsprechend den Angaben auf ihren jeweiligen Etiketten aufzubewahren.

ENTNAHME, AUFBEWAHRUNG UND HANDHABUNG DER PROBEN Probentyp: wässrige CDAD-verdächtige Stuhlproben. Verwendung eines sterilen Behälters:

1. Die flüssige oder weiche Stuhlprobe in den sterilen Behälter übertragen; darauf achten, dass kein Toilettenpapier, Urin, Wasser und keine Seife übertragen wird.

2. Den Behälter gemäß standardmäßigen Betriebsverfahren des Krankenhauses beschriften. 3. Die beschriftete Probe zum Labor transportieren; die Proben während des Transports bei Temperaturen von 2 °C

bis 8 °C halten. Wenn die Proben innerhalb von 3 bis 4 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden können, reicht der Transport bei Raumtemperatur aus. Proben, die verspätet im Labor ankommen, müssen sofort gekühlt und während des Transportes bei einer Temperatur von 2°C bis 8°C gehalten werden.

Aufbewahrung: Proben können bei 2 °C bis 8 °C oder bis zu 7 Tage lang bei –20 °C aufbewahrt werden.


ASSAYVERFAHREN Wärme-Lyse

1. Den Wärmeblock 25 Minuten vor dem Wärme-Lyse-Schritt auf 95 °C aufwärmen. 2. Die flüssige Stuhlprobe 15 Sekunden lang vortexen, um vollständiges Mischen sicherzustellen. 3. Probe mit dem mitgelieferten sterilen Tupfer entnehmen. Den Tupfer in die flüssige oder wässrige Stuhlprobe

eintauchen; nicht zu viel Stuhl entnehmen; die Tupferspitze sollte nur leicht mit Stuhl beschichtet sein. 4. Tupfer in ein mit den Daten des Patienten gekennzeichnetes Verdünnungspufferröhrchen (blaue Kappe)

einführen und das Präparat durch schnelles Drehen der Spitze 5 bis 10 Sekunden lang lösen; Tupfer entfernen und gemäß Laborvorschriften entsorgen. Ca. 10 Sekunden zum Mischen vortexen. Hinweis: Proben im Verdünnungspuffer sind bei Raumtemperatur bis zu 24 Stunden stabil.

5. 50 μL der verdünnten Stuhlprobe in ein beschriftetes Lysepufferröhrchen übertragen und 10 Sekunden lang vortexen. Hinweis: Proben im Lysepuffer sind bei Raumtemperatur vor dem Erwärmen bis zu 24 Stunden stabil.

6. Das Lysepufferröhrchen 10 Minuten ± 2 Minuten auf 95 °C ± 2 °C erwärmen und anschließend 10 Sekunden lang vortexen. Hinweis: Das 10-minütige Lyseverfahren starten, nachdem die Röhrchen in den Block gestellt wurden, und warten, bis der Block auf 95 °C zurückkehrt. Hinweis: Proben im Lysepuffer sind bei Raumtemperatur nach dem Erwärmen bis zu 24 Stunden stabil. Hinweis: Nicht verwendete Verdünnungs- und Lysepuffer müssen bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden.

Amplifikation 1. 15 Minuten vor dem Amplifikationsschritt einen Wärmeblock mit erwärmtem Deckel auf 64 °C erwärmen. 2. 50 µl der lysierten Probe in ein beschriftetes Reagenzröhrchen übertragen und zum Mischen die lyophilisierten

Reagenzien durch 3- bis 5-malige Auf- und Abpipettierung rehydrieren. Den Deckel gut verschließen und mit dem nächsten Schritt fortfahren.

3. Das Reagenzröhrchen 60 ± 2 Minuten lang bei 64 °C ± 2 °C in einem Wärmeblock mit erwärmtem Deckel inkubieren. Hinweis: Um Laborkontamination zu vermeiden, nachdem das Röhrchen verschlossen und die Amplifikation gestartet wurde, darf das Reaktionsröhrchen NICHT geöffnet werden. Hinweis: Nicht gebrauchte Reagenzröhrchen müssen bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden.

Nachweis 1. Eine neue Nachweiskassettenpackung aufreißen. Die Kassette entsprechend beschriften. Sicherstellen, dass ein

Pufferkolben in der Amplifikat-Kassette angebracht ist. 2. Das Reagenzröhrchen in die Amplifikat-Kassette einführen (Abb. 1, Schritt 1). Darauf achten, das GELENK der

Kappe des Reagenzröhrchens in den größten Schlitz neben dem Pufferkolben einzuführen. 3. Die Amplifikat-Kassette schließen (Abb. 1, Schritt 2); sicherstellen, dass sie einrastet. Wenn die Kassette nicht

einrastet, das Röhrchen in der Kassette umpositionieren. 4. Die geschlossene Amplifikat-Kassette in die Nachweiskassette einführen (Abb. 1, Schritt 3). Darauf achten, dass

der Pfeil zum Nachweisstreifen zeigt (Reagenzröhrchen sollte in Richtung Rasierklinge zeigen, und der Kunststoffkolben mit dem Elektrophoresepuffer sollte in Richtung Stift zeigen). Die Kassette oben und/oder an der Seite des Außengehäuses kennzeichnen.

5. Das Gerät aufrecht belassen und auf den Griff des Außengehäuses drücken, um das Gerät zu schließen (Abb. 1, Schritt 4). Der Griff rastet ein, wenn er komplett geschlossen ist (Abb. 1, Schritt 5).

6. Ergebnisse nach 10 Minuten ablesen. Die Ergebnisse sind bis zu 30 Minuten nach Zuklappen der Kassette stabil. 7. Die gebrauchten Nachweiskammern in verschlossenen Beuteln gemäß Laborvorschriften entsorgen.

Warnhinweis 1. Die AmpliVue-Nachweiskassette nach der Verwendung NICHT öffnen. Ein Öffnen der Kassette nach der

Verwendung kann zur Amplifikat-Kontamination des Testbereichs führen.

2. Die erforderliche Anzahl Reagenzröhrchen aus der Schutzhülle nehmen; überschüssige Luft heraus drücken und

den Beutel wieder verschließen.


Abbildung 1

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Alle sichtbaren rosafarbenen bis roten Linien sollten als positiv (+) und keine Linie sollte als negativ (-) aufgezeichnet

werden; Beispiel: „T+“ = Sichtbare T-Linie und „T–“ = Keine T-Linie (siehe Abbildung unten). Die T2-Linie weist toxigene C. difficile DNA nach. Die C-Linie weist die Prozesskontrolle-DNA in Abwesenheit der toxigenen C. difficile-Ziel-DNA nach. Bei

Vorhandensein der toxigenen C. difficile-Ziel-DNA weist die C-Linie amplifizierte Produkte sowohl von der toxigenen C. difficile-DNA als auch der Prozess-Kontrolle-DNA nach. Die Intensität der Kontrolllinie kann sich von Test zu Test unterscheiden. Alle sichtbaren rosafarbenen bis roten Linien in der Kontrolle weisen auf einen gültigen Test hin.

Positiv auf Toxigen

C. difficile

Negativ auf Toxigen

C. difficile

Ungültig

Die Auswertung der Assay-Ergebnisse erfolgt nach den folgenden Kriterien:

C-Linie

T2-Linie

T1-Linie


Testlinie (T) Messauswertung

Kontrolllinie (C) Messauswertung

Auswertung der Ergebnisse

T2+ C+ Toxigene C. difficile DNA nachgewiesen (positiv)

T2+ C– Toxigene C. difficile DNA nachgewiesen (positiv)

T2– C+ Keine toxigene C. difficile DNA nachgewiesen (negativ)

T2– C– Ungültig: Fehler aufgrund von hemmender Probe, Reagenzfehler oder Gerätefehler. Test mit ursprünglicher Stuhlprobe wiederholen.

Hinweis 1: Die T1-Linie ist für Triplex-Assays bestimmt. Die T1-Linie wird in diesem Assay nicht verwendet. Hinweis 2: Die Abwesenheit einer C-Linie (Kontrolle) in Verbindung mit einer positiven Testlinie (T2) bedeutet, dass das Zielmaterial erfolgreich amplifiziert wurde. Dies tritt wegen der Überzahl an Amplifikaten auf, die einen Konkurrenzkampf mit den Testzielen auslöst.

QUALITÄTSKONTROLLE Der AmpliVue C. difficile-Assay enthält mehrere Kontrollen zur Überwachung der Leistung des Assays. 1. Die Prozesskontrolle wird verwendet, um die Probenverarbeitung zu überwachen, die HDA-hemmenden Proben

nachzuweisen und die Integrität der Assay-Reagenzien und des Kassettennachweises zu bestätigen. Die Prozesskontrolle ist im Lysepufferröhrchen enthalten.

2. Externe positive Kontrollen können als Patientenprobe behandelt werden. Den mitgelieferten Tupfer in die externe positive Kontrolle einführen; darauf achten, dass die Spitze mit Flüssigkeit bedeckt ist. Das Verdünnungspufferröhrchen als positive Kontrolle kennzeichnen und mit der Verarbeitung gemäß der Beschreibung oben im Assayverfahren fortfahren. Die externe positive Kontrolle ist dafür bestimmt, bedeutende Reagenzien- und Kassettenfehler zu überwachen.

3. Externe negative Kontrollen können als Patientenprobe behandelt werden. Den mitgelieferten Tupfer in die externe negative Kontrolle einführen; darauf achten, dass die Spitze mit Flüssigkeit bedeckt ist. Das Verdünnungspufferröhrchen als negative Kontrolle kennzeichnen und mit der Verarbeitung gemäß der Beschreibung oben im Assayverfahren fortfahren. Die externe negative Kontrolle wird verwendet, um eine Kontamination der Reagenzien oder Umgebung (oder Carry-over) durch C. difficile DNA oder Amplifikat nachzuweisen.

Es wird empfohlen, die Reaktivität jeder neuen Charge und jeder neuen Lieferung des AmpliVue C. difficile Assays bei Entgegennahme und vor der Verwendung zu bestätigen. Anschließend sollten externe Kontrolltests gemäß örtlicher und/oder staatlicher Richtlinien durchgeführt werden. Der AmpliVue C. difficile Assay sollte nicht für Patiententests eingesetzt werden, wenn die externen Kontrollen nicht die richtigen Ergebnisse erzielen.

EINSCHRÄNKUNGEN Ein negatives C. difficile-Ergebnis sollte nicht als alleinige Grundlage für Diagnose-, Behandlungs- oder Patienten-

Management-Entscheidungen eingesetzt werden. Zwar ist keine Reagenzvorbereitung erforderlich, doch die Hauptlabortechnik ist die Pipettierung und eine gute

Labortechnik ist für die korrekte Leistung dieses Assays unerlässlich. Aufgrund der hohen analytischen Sensitivität dieses Tests ist sorgfältig darauf zu achten, die Reinheit aller Reagenzien zu bewahren, insbesondere in Fällen, in denen einem Röhrchen mehrere Aliquote entnommen werden.

Mutationen oder Polymorphismen in primer- oder sondenbindenden Regionen können den Nachweis neuer oder unbekannter C. difficile-Variationen beeinträchtigen und zu einem falschnegativen Ergebnis mit dem AmpliVue C. difficile-Assay führen.

Ein positives Testergebnis weist nicht unbedingt auf das Vorhandensein lebender Organismen hin. Dieser Test weist hypervirulente Stämme nach, unterscheidet sie jedoch nicht von anderen toxigenen C. difficile

Genotypen. Dieser Test weist nicht auf die Empfindlichkeit nachgewiesener C. difficile-Stämme für verschiedene antimikrobielle

Wirkstoffe hin.

Negative Testergebnisse können auf falsche Probenahme, falsche Handhabung oder Aufbewahrung, Vorhandensein von Inhibitoren, technische Fehler, Probenverwechslung oder darauf zurückzuführen sein, dass die Anzahl oder Organismen in der Probe unterhalb der analytischen Sensitivität des Tests liegt. Die sorgfältige Beachtung der Anweisungen in dieser Packungsbeilage ist unabdingbar, um fehlerhafte Ergebnisse zu vermeiden. Die Verwendung dieses Assays sollte auf Personal beschränkt werden, das in dem Verfahren geschult wurde.


Das AmpliVue C. difficile Assay-Verfahren muss in einer Umgebung durchgeführt werden, die 30 °C nicht überschreitet.

KLINISCHE LEISTUNG Die Leistung des AmpliVue C. difficile Assays wurde zwischen Januar 2012 und Oktober 2012 an vier geografisch verteilten Standorten in den USA beurteilt. Achthundertvierzig (840) Proben wurden sowohl vom AmpliVue C. difficile Assay als auch dem Gewebekultur-Zytotoxizitätsassay getestet. Eine Probe (0,1 %) war im Zytotoxin-Assay aufgrund von Toxizität in der Antitoxin-Vertiefung unklar. Vier (4) Proben (0,5 %) waren bei den ersten Tests im AmpliVue C. difficile Assay ungültig. Drei (3) dieser Proben ergaben bei Wiederholungstests gemäß der Gebrauchsanweisung für den AmpliVue C. difficile Assay gültige Ergebnisse (alle waren negativ). Eine (1) Probe war auch bei dem Wiederholungstest ungültig. Die folgenden Daten basieren auf dem ersten Ergebnis für die achthundertfünfunddreißig (835) Proben. Der Quidel AmpliVue C. difficile Assay erzielte in dieser Studie eine Sensitivität und Spezifität von 93,6 % bzw. 94,1 %.


Gewebekultur-Zytotoxin 95 % KI

POS NEG Gesamt Empfindlichkeit 93,6% 87,3% 96,9%

AmpliVue C. difficile

POS 102 43* 145 Spezifität 94,1% 92,1% 95,6%

NEG 7** 683 690

Gesamt 109 726 835 * Von diesen dreiundvierzig (43) diskordanten Proben (AmpliVue positiv / Gewebekultur-Zytotoxin negativ) wurden mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument siebenunddreißig (37) Proben positiv und sechs (6) Proben negativ auf C. difficile getestet. ** Von diesen sieben (7) gemeldeten diskordanten Proben (AmpliVue negativ / Gewebekultur-Zytotoxin positiv) wurden mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument zwei (2) Proben positiv und fünf (5) Proben negativ auf C. difficile getestet.

ANALYTISCHE LEISTUNG Nachweisgrenze Die analytische Sensitivität (Nachweisgrenze bzw. LoD) des Quidel AmpliVue C. difficile-Assays wurde anhand von quantifizierten (CFU/ml) Kulturen von zwei (2) C. difficile-Stämmen (ATCC 43255 {Toxinotyp 0} und CCUG 8864 {Toxinotyp X}) ermittelt, die in einer negativen Fäkalmatrix verdünnt wurden. Analytische Empfindlichkeit (LoD) wird als die niedrigste Konzentration definiert, bei der 95 % aller Replikate positiv testeten.

Stamm Toxinotyp LoD (CFU/Assay)

ATCC 43255 0 4,2

CCUG 8864 X 0,7

Die endgültige LoD des Assays wird definiert als die höhere der zwei Stammkonzentrationen, wobei 95 % Positivität beobachtet wurde. Die endgültige LoD des Assays ist 4,2 CFU/Assay.

Analytische Reaktivität (Inklusivität) Die Reaktivität des Quidel AmpliVue C. difficile-Assays wurde anhand von vierundzwanzig (24) Stämmen von Clostridium difficile beurteilt, die mehrere Toxinotypen repräsentierten. Die Tests wurden nahe der Nachweisgrenze für das Assay (2 bis 3x LoD) durchgeführt. Die Texts wurden mithilfe drei (3) separater Produktionschargen des AmpliVue C. difficile-Assays durchgeführt. Alle vierundzwanzig (24) Stämme wurden in dieser Studie vom Quidel AmpliVue C. difficile Assay nachgewiesen, und die höchste beobachtete LoD war 15,67 CFU/Assay.

Stamm Toxinotyp CFU/Assay AmpliVue C. difficile

(Nachgewiesen/gesamt)

ATCC 43255 0 4,2 19/20

CCUG 8864 X 0,7 19/20

ATCC BAA-1870 IIIb 8,15 3/3

CCUG 37770 IV 2,84 3/3

ATCC BAA-1875 V 10,92 3/3

ATCC 43598 VIII 2,13 3/3

ATCC 37774 XXIII 1,52 3/3

CCUG 9004 Unbekannt 1,63 3/3

ATCC BAA-1874 0 5,75 3/3

ATCC 43600 0 3,92 3/3

ATCC BAA-1871 0 3,61 3/3

ATCC BAA-1803 IIIc 0,7 3/3

ATCC BAA-1872 0 7,97 3/3


Stamm Toxinotyp CFU/Assay AmpliVue C. difficile

(Nachgewiesen/gesamt)

ATCC 700792 0 1,65 3/3

ATCC 43599 0 1,55 3/3







ATCC 17857 0 0,72 3/3

ATCC 43594 0 0,54 3/3

ATCC 43596 0 1,27 3/3

Reproduzierbarkeitsstudie Um die Reproduzierbarkeit des Quidel AmpliVue C. difficile Assays zu bestätigen, wurde ein verblindetes und randomisiertes Studienpanel mit Clostridium difficile-negativen und -positiven Proben an drei (3) Teststandorten (an zwei (2) klinischen Einrichtungen) getestet. Jeder Standort testete ein Reproduzierbarkeitspanel und Assay-Kontrollen an fünf (5) Tagen in dreifacher Ausfertigung. Die Tests wurden von jeweils zwei Bedienern an jedem Standort durchgeführt. Jeder Bediener führte einmal täglich einen Paneldurchlauf mithilfe von einer Charge AmpliVue C. difficile Assay durch. Insgesamt wurden fünfhundertvierzig (540) Proben getestet (einschließlich Kontrollen). Der Quidel AmpliVue C. difficile Assay generierte Reproduzierbarkeitsergebnisse in dieser Studie.


Reproduzierbarkeit des Quidel AmpliVue C. difficile

Kategorie

Standort 1 Standort 2 Standort 3

Prozent, gesamt Übereinstimmung

95 % Konfidenz-

intervall An

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C. difficile hoch* negativ

25/30 83% 23/30 77% 24/30 80% 72/90 80% 71-87%

C. difficile niedrig positiv

30/30 100% 29/29 100% 30/30 100% 89/89* 100% 95-100%

C. difficile moderat positiv

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Negativ 30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

C. difficile-positive Kontrolle

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Assay-negative Kontrolle

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Chargennr. CLIN-005

*Hinweis: Eine (1) Probe war ungültig. Eine „Hoch-negativ-/Niedrig-positiv”-Probe ist eine Probe, deren Konzentration so weit unter dem klinischen Cut-Off-Wert liegt, dass die Ergebnisse wiederholter Tests dieser Probe ungefähr 20% bis 80% der Zeit negativ sind.5

Analytische Spezifität – Kreuzreaktivität und mikrobielle Störung Die analytische Spezifität des Quidel AmpliVue C. difficile Assays wurde durch Testen eines Panels beurteilt, das aus sechsundsechzig (66) bakteriellen, viralen und Hefe-Mikroorganismen und menschlicher DNA bestand, die häufig im Darm anzutreffende enterische Pathogene, Flora oder Nukleinsäure repräsentieren. Die Mikroorganismen oder die Nukleinsäure wurde mit gepoolter negativer Matrix gemischt und direkt oder in Gegenwart von C. difficile (2 bis 3x LoD) auf Kreuzreaktivität bzw. mikrobielle Störung getestet. Die Tabelle unten fasst die Daten dieser Studien zusammen. Es gab keine Anzeichen von Kreuzreaktivität bei Panel-Elementen oder dem Quidel AmpliVue C. difficile Assay.


Organismus-ID Identifizierung

Getestete Konzentration (CFU/ml oder

PFU/ml)

C. difficile Ergebnisse

Kreuzreaktivität

Mikrobielle Störung

(Stamm 1)


(Stamm 2)

Abiotrophia defectiva*

CCUG 27280 4,30E+08 Negativo Positivo Positivo

Acinetobacter baumannii

ZM 081597 5,27E+08 Negativo Positivo Positivo

Aeromonas hydrophila

ATCC 7966 2,09E+10 Negativo Positivo Positivo

Alcaligenes faecalis, sottospecie faecalis


Bacillus cereus ATCC 13472 1,00E+07 Negativo Positivo Positivo

Bacteroides fragilis CCUG 4856 1,77E+08 Negativo Positivo Positivo

Campylobacter coli* CCUG 36995 5,30E+08 Negativo Positivo Positivo

Campylobacter jejuni sub sp .jejuni


Candida albicans ATCC 10231 3,00E+07 Negativo Positivo Positivo

Citrobacter freundii ATCC 8090 2,38E+09 Negativo Positivo Positivo

Clostridium bifermentans


Clostridium botulinum

Analisi in silico Nessuna reattività crociata in silico rilevata

Clostridium butyricum CCUG 47601 1,75E+07 Negativo Positivo Positivo

Clostridium difficile (non tossicogenico)




Clostridium haemolyticum*


Clostridium novyi CCUG 57219 6,50E+06 Negativo Positivo Positivo

Clostridium orbiscindens


Clostridium perfringens (ceppo: tipo A)


Clostridium scindens ATCC 35704 1,62E+07 Negativo Positivo Positivo

Clostridium septicum ATCC 12464 6,60E+09 Negativo Positivo Positivo

Clostridium sordellii ATCC 9714 1,94E+06 Negativo Positivo Positivo

Clostridium sordellii Z077 2,07E+08 Negativo Positivo Positivo

Clostridium sordellii CCUG 6329 9,85+E07 Negativo Positivo Positivo

Clostridium sordellii CCUG 9284 6,50E+07 Negativo Positivo Positivo








PFU/ml)


Kreuzreaktivität


(Stamm 1)


(Stamm 2)


Clostridium sporogenes


Edwardsiella tarda ATCC 15947 2,03E+09 Negativo Positivo Positivo

Enterobacter aerogenes


Enterobacter cloacae ATCC 13047 5,95E+08 Negativo Positivo Positivo

Enterococcus faecalis vanB


Escherichia coli ATCC 23511 1,92E+09 Negativo Positivo Positivo

Escherichia coli O157:H7


Helicobacter pylori ZM 0801486 3,57E+06 Negativo Positivo Positivo

Klebsielia oxytoca ATCC 33496 1,63E+09 Negativo Positivo Positivo

Lactobacillus acidophilus


Listeria monocytogenes (sierotipo 1/2b)


Peptostreptococcus anaerobius


Plesiomonas shigelloides


Porphyromonas asaccharolytica


Prevotella melaninogenica


Proteus mirabilis ATCC 25933 1,06E+09 Negativo Positivo Positivo

Providencia alcalifaciens


Pseudomonas aeruginosa


Salmonella cholerasuis (typhimurium)


Salmonella enterica, sottospecie Arizonae (precedentemente Choleraesuis arizonae)


Salmonella enterica, sottospecie enterica (precedentemente Salmonella choleraesuis)





PFU/ml)


Kreuzreaktivität


(Stamm 1)


(Stamm 2)

Serratia liquefaciens ATCC 7001 3,79E+10 Negativo Positivo Positivo

Serratia marcescens ZM 0801723 6,10E+08 Positivo

Shigella boydii ATCC 9207 8,16E+08 Negativo Positivo Positivo

Shigella dysenteriae ATCC 49557 1,26E+10 Negativo Positivo Positivo

Shigella sonnei ATCC 29930 3,36E+08 Negativo Positivo Positivo

Staphylococcus aureus


Staphylococcus epidermidis


Streptococcus agalactiae (streptococco del Gruppo B)


Vibrio parahaemolyticus


Adenovirus 1 VR-1* DHI 62207 5,67E+05 Negativo Positivo Positivo

Rotavirus (ceppo: WA)*

ZM NATROTA-ST 2,32E+08 Negativo Positivo Positivo

Norovirus GII ZM NATNOVII-ST 3,92E+08 Negativo Positivo Positivo

Enterovirus 71 DHI 80406 4,82E+05 Negativo Positivo Positivo

Ecovirus 6 DHI 121506 1,05E+09 Negativo Positivo Positivo

Coxsackievirus B4 DHI 92206 2,43E+07 Negativo Positivo Positivo

Citomegalovirus Towne VR-977

DHI 201006 1,48E+06 Negativo Positivo Positivo

DNA genomico umano

Promega G3041 184 µg/ml Negativo Positivo Positivo

*Per testare tali organismi è stato usato acido nucleico purificato. Il numero delle cellule è stato approssimato in base alla concentrazione dell'acido nucleico e delle dimensioni del genoma.


Analytische Spezifität – Störsubstanzen Die Leistung des Quidel AmpliVue C. difficile-Assays wurde anhand von potenziellen Störsubstanzen beurteilt, die in Stuhlproben vorhanden sein können. Die potenziellen Störsubstanzen wurden anhand von zwei C. difficile-Stämmen (ATCC 43255 {Toxinotyp 0} und CCUG 8864 {Toxinotyp X}) bei einer Konzentration von 2 bis 3x LoD beurteilt. Es gab keine Hinweise darauf, dass die getesteten Substanzen Störungen verursachten.

Bezeichnung der Substanz

Getestete Konzentration

C. difficile Ergebnis

Bezeichnung der Substanz

Getestete Konzentration

C.difficileErgebnis

Nistatina 10.000 USP U/mL

Positivo Esomeprazolo magnesio idrato

0,5 mg/ml Positivo

Idrocortisone (ossia cortisone)

1% w/v Positivo Solfato di bario 5 mg/mL Positivo

Cloridrato di fenilefrina

2% w/v Positivo Hamamelis 100% Positivo

Carbonato di calcio 0,2 mg/mL Positivo Vaselina 100% Positivo

Idrossido di alluminio 0,1 mg/mL Positivo Cloridrato di vancomicina

12,5 mg/mL Positivo

Idrossido di magnesio 0,1 mg/mL Positivo Meticillina 12,5 mg/mL Positivo

Acido 5-amminosalicilico/ mesalazina

2 mg/mL Positivo Sennosidi 0,1 mg/mL Positivo

Olio minerale 2% v/v Positivo Triclosan 0,1% v/v Positivo

Nonossinolo-9 7% Positivo Naprossene sodico 14 mg/mL Positivo

Cloridrato di loperamide

1 mg/mL Positivo Cloruro di benzalconio 0,12% Positivo

Subsalicilato di bismuto

0,87 mg/mL Positivo Etanolo 10% Positivo

Sangue 5% v/v Positivo Glucosio 1 mg/mL Positivo

Muco (mucina) 3 mg/mL Positivo IgA umana 1,6 mg/mL Positivo

Nitrato di miconazolo 2% Positivo Albumina sierica umana

10 mg/mL Positivo

Ossido di zinco 13% w/v Positivo Acido palmitico 1,3 mg/mL Positivo

Idrossido di alluminio / carbonato di magnesio

0,1 mg/mL Positivo Acido stereatico 26 mg/mL Positivo

Cimetidina 0,5 mg/ml Positivo Emoglobina umana 3,2 mg/mL Positivo

Carryover – Kreuzkontamination Vier (4) Durchläufe mit vierundzwanzig (24) Proben bestehend aus zwölf (12) negativen und zwölf (12) C. difficile-hoch-positiven Proben wurden in einem abwechselnden Muster von insgesamt zwei (2) Bedienern an zwei (2) Assay-Chargen durchgeführt (Bediener waren gegenüber den erwarteten Ergebnissen verblindet). Alle positiven Proben wurden als positiv (T2+/C+) und alle negativen Proben wurden als negativ (T2–/C+) gemeldet. Bei der Durchführung des Quidel AmpliVue

C. difficile Assays gemäß der Gebrauchsanweisung für das Produkt wurde keine Carryover-Kontamination

beobachtet.

KUNDENDIENST UND TECHNISCHER SUPPORT Um eine Bestellung aufzugeben oder technischen Support anzufordern, wenden Sie sich bitte an einen Quidel-Repräsentanten unter der Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder (858) 552-1100 (außerhalb der USA), Montag bis Freitag zwischen 8 und 17 Uhr (Ostküstenzeit). Bestellungen können auch per Fax aufgegeben werden: (740) 592-9820. Für E-Mail-Support wenden Sie sich bitte an [email protected] oder



[email protected]. Für Dienstleistungen außerhalb der USA wenden Sie sich bitte an Ihren Distributor vor Ort. Weitere Informationen über Quidel, unsere Produkte und unsere Distributoren sind auf unserer Website quidel.com zu finden.

GEISTIGES EIGENTUM Biohelix ist eine eingetragene Marke von BioHelix Corporation. BioHelix besitzt geistiges Eigentum im Zusammenhang mit HDA-Technologie. AmpliVue ist eine eingetragene Marke von Quidel Corporation.

LITERATURVERWEISE 1. Sloan LM, Duresko BJ, Gustafson DR, and Rosenblatt JE. Comparison of Real-Time PCR for Detection of the tcdC Gene

with Four Toxin Immunoassays and Culture in Diagnosis of Clostridium difficile Infection_J. Clin. Micro. 2008: 46(6):1996–2001.


3. An L, Tang W, Ranalli TA, Kim HJ, Wytiaz J and Kong H. Characterization of a Thermostable UvrD Helicase and its participation in Helicase Dependent Amplification. J. Biol. Chem. 2005: 280: 28952-28958.

4. Vincent M, Xu Y, and Kong H. Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification. EMBO 2004: Rep.5: 795-800. 5. Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff – Establishing the Performance Characteristics of

In vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile, November 29, 2010.

M201 – AmpliVue C. difficile Assay-Kit

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH 45701 USA quidel.com PIM201001DE00 (01/16)

GLOSSAR




AmpliVue C. difficile Pagini 1 di 16

PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO

Contents USO PREVISTO ......................................................................................................................................................................... 2

RIASSUNTO E SPIEGAZIONE ...................................................................................................................................................... 2

PRINCIPIO DELLA PROCEDURA ................................................................................................................................................. 2

MATERIALI FORNITI .................................................................................................................................................................. 3

MATERIALI FACOLTATIVI .......................................................................................................................................................... 3

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI ................................................................................................................................ 3

AVVERTENZE E PRECAUZIONI ................................................................................................................................................... 4

CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI REAGENTI DEL KIT .................................................................................................. 4

PRELIEVO, CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI ............................................................................................. 5

PROCEDURA DEL DOSAGGIO .................................................................................................................................................... 5

Lisi a calore ........................................................................................................................................................................ 5

Amplificazione ................................................................................................................................................................... 5

Rilevamento ...................................................................................................................................................................... 6

Avvertenza ........................................................................................................................................................................ 6

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI ............................................................................................................................................ 6

CONTROLLO DI QUALITÀ .......................................................................................................................................................... 7

LIMITAZIONI ............................................................................................................................................................................. 8

PRESTAZIONI CLINICHE ............................................................................................................................................................. 8

PRESTAZIONI ANALITICHE ........................................................................................................................................................ 9

Limite di rilevamento ........................................................................................................................................................ 9

Reattività analitica (Inclusività) ......................................................................................................................................... 9

Studio sulla riproducibilità .............................................................................................................................................. 10

Specificità analitica – Reattività crociata e interferenza microbica ................................................................................ 11

Specificità analitica – Sostanze interferenti .................................................................................................................... 14

Carry-over – Contaminazione crociata ............................................................................................................................ 14

Per il rilevamento quantitativo e l'identificazione degli acidi nucleici tossigenici del Clostridium difficile estratti da campioni fecali


SERVIZIO CLIENTI E ASSISTENZA TECNICA .............................................................................................................................. 14

PROPRIETÀ INTELLETTUALE.................................................................................................................................................... 15

BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................................................................... 15

GLOSSARIO ............................................................................................................................................................................. 16

USO PREVISTO Il dosaggio AmpliVue® C. difficile è un test diagnostico in vitro per il rilevamento diretto e qualitativo del gene della tossina A del Clostridium difficile (tcdA) in campioni fecali non ancora ancora formati di pazienti nei quali si sospetta una patologia associata al Clostridium difficile (CDAD). Il dosaggio AmpliVue C. difficile è previsto come ausilio nella diagnosi di CDAD. Il dosaggio utilizza l'amplificazione dipendente da elicasi (HDA) per amplificare un frammento altamente conservato della sequenza genetica della tossina A, nonché un dispositivo di rilevamento dell'amplificazione autonomo e monouso che consente la valutazione visiva dei risultati del dosaggio.

RIASSUNTO E SPIEGAZIONE Il C. difficile è un'importante causa di diarrea e colite associate ad antibiotici: fino al 25% di tutti i casi può essere ricondotto a tale batterio1. Si ritiene che l’esposizione ad antibiotici alteri la flora intestinale, permettendo una colonizzazione opportunistica da parte del C. difficile (fino al 3% degli adulti sani presenta tale batterio nella flora dell’apparato digerente). Si ritiene che la virulenza del C. difficile sia mediata dalla produzione di due tossine: la tossina A e la tossina B. I geni di entrambe le tossine (rispettivamente tcdA e tcdB) si trovano all'interno di un locus di patogenicità (PaLoc) di 19,6 Kb insieme ad altri 3 geni. Recentemente, l'incidenza e la gravità delle patologie associate al C. difficile e causa di brevi ricoveri ospedalieri sono aumentate1,2.

PRINCIPIO DELLA PROCEDURA Il dosaggio AmpliVue C. difficile combina una semplice elaborazione dei campioni, una tecnologia di amplificazione isotermica Biohelix® denominata amplificazione dipendente da elicasi (HDA) e un dispositivo di rilevamento degli ampliconi autonomo e monouso, progettato per rilevare il C. difficile direttamente da campioni fecali di soggetti in cui si sospetta una CDAD3,4. Il dosaggio mira a un frammento conservato del DNA del C. difficile, che è intatto in tutti i tossinotipi conosciuti A+B+ e A-B+ del C. difficile. Viene usato un tampone per trasferire una piccola quantità di campione in una provetta per diluizione. Il campione diluito viene poi trasferito in una provetta con tampone di lisi e le cellule vengono lisate mediante un semplice trattamento termico. Dopo il trattamento termico, un'aliquota del campione lisato viene aggiunta a una provetta di reazione contenente una miscela liofilizzata di reagenti HDA, inclusi primer specifici per l'amplificazione di un frammento derivante dalla regione conservata del DNA del C. difficile. Il dosaggio include anche un controllo di processo per monitorare l'elaborazione del campione e verificare l'integrità dei reagenti del dosaggio e il rilevamento della cassetta, nonché per valutare gli inibitori dell'HDA che potrebbero essere presenti all'interno del campione diarroico. L'amplificazione competitiva del DNA del controllo di processo avviene anche se nel campione non sono presenti sostanze che inibiscono l'amplificazione e anche se l'elaborazione del campione non riesce. La reazione HDA è asimmetrica, in modo che da un primer biotinilato presente all'interno della miscela di reazione si formi un eccesso di DNA a singolo filamento. Le sonde di cattura di ciascun amplicone si legano al corrispondente DNA a singolo filamento biotinilato, formando ampliconi a doppia marcatura.


Una volta completata la reazione HDA, la provetta di reazione viene trasferita in una cassetta per il rapido rilevamento; il risultato del test viene visualizzato come linee di test e/o linee di controllo nella finestra della cassetta. L'ibrido a doppia marcatura sonda-amplicone viene poi rilevato dalla striscia di flusso laterale interna alla cassetta. La linea di fondo cattura l'amplicone di test, mentre la linea in alto cattura l'amplicone di controllo. La marcatura della biotina si lega alle particelle di colore coniugate con streptavidina per la visualizzazione e il risultato del test viene visualizzato sotto forma di linee colorate visibili a occhio nudo. La cassetta autonoma è formata da due componenti: una cartuccia amplicone (che contiene il tampone di esecuzione e una provetta di reazione a parete sottile da 0,2 mL contenente il prodotto amplificato) e la camera di rilevamento, che contiene la cartuccia amplicone e una striscia di rilevamento del DNA a flusso verticale integrata nella cassetta. La striscia di rilevamento del DNA è ricoperta di vari anticorpi anti-aptene, che fungono da linea di test (T) del C. difficile e da linea di controllo (C) nel dosaggio. Una lametta a rasoio e un perno di plastica posizionati sul fondo della camera di rilevamento fanno aprire la provetta di reazione HDA e il bulbo del tampone di esecuzione quando l'impugnatura della camera di rilevamento viene messa in posizione di chiusura. La miscela fluisce attraverso un foglio di vetroresina, collegato alla striscia di rilevamento del DNA, che contiene un tampone in vetroresina pre-caricato con particelle colorate coniugate con streptavidina per la visualizzazione a colori. Viene segnalato il rilevamento di DNA del C. difficile quando la linea T2 (linea di test 2) è visibile attraverso la finestra di rilevamento della cassetta. La presenza della linea C non è necessaria per i risultati positivi. Non viene segnalato alcun rilevamento di DNA del C. difficile quando è visibile solo la linea C. Il dosaggio è considerato non valido quando non è visibile alcuna linea.

MATERIALI FORNITI Codice di inventario M201 16 test per kit

Componente Quantità Conservazione

Cassette di rilevamento, Parte 1185001 16/kit Da 2 °C a 30 °C

Tampone di diluizione, Parte M5015 16 provette/kit; 1,8 mL Da 2 °C a 8 °C

Tampone di lisi, Parte M5016 16 provette/kit; 1 mL Da 2 °C a 8 °C

Provette di reazione, Parte M5017 16 provette/kit Da 2 °C a 8 °C

Cartuccia amplicone, Parte 1215400 16/kit Da 2 °C a 30 °C

Tamponi floccati, Parte M5013 16 tamponi/kit Da 2 °C a 30 °C

MATERIALI FACOLTATIVI Controlli esterni per il C. difficile tossigenico (ad es. set di controllo Quidel Molecular C. difficile codice

M108, che contiene controlli positivi e negativi e serve come controllo esterno per l'elaborazione e l'estrazione)

Termometro

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Punte sterili per micropipettatore, bloccate da filtro privo di DNA-se oppure a erogazione positiva Micropipettatore Cronometro o timer Forbici o lametta Blocco di calore che raggiunge temperature di 95 °C ± 2 °C Blocco di calore con coperchio riscaldato, che raggiunge temperature di 64 °C ± 2 °C


AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro. Le caratteristiche di rendimento di questo test sono state stabilite solo con i tipi di campioni elencati nella

sezione Uso Previsto. Il rendimento di questo dosaggio con altri tipi di campioni non è stato valutato. Considerare tutti i campioni come potenzialmente infettivi. Rispettare le precauzioni universali nel

maneggiare i campioni, questo kit e il suo contenuto. Raccolta, conservazione e trasporto adeguati dei campioni sono elementi essenziali per ottenere

risultati corretti. Conservare i reagenti del dosaggio come indicato sulle rispettive etichette. I reagenti di lotti diversi non sono intercambiabili. Non mescolare mai reagenti provenienti da provette diverse, anche se appartengono allo stesso lotto. Non usare i reagenti dopo la loro data di scadenza. Non scambiare i tappi dei reagenti, poiché si potrebbe verificare una contaminazione e i risultati del test

potrebbero essere compromessi. Aprire le provette solo quando si aggiungono le aliquote a esse o quando si rimuovono le aliquote da esse.

Tenere sempre chiuse le provette per evitare la contaminazione. Per evitare di contaminare l'ambiente con ampliconi di C. difficile, non aprire le provette di reazione dopo

l'amplificazione. Evitare la contaminazione microbica e da deossiribonucleasi (DNAse) dei reagenti quando si rimuovono

aliquote dalle provette. Si consiglia l'uso di punte sterili monouso per micropipettatore, bloccate da filtro privo di DNA-se oppure a erogazione positiva.

Usare un nuovo pipettatore per ciascun campione o reagente. Eseguire il dosaggio al di fuori degli intervalli di tempo consigliati può produrre risultati non validi. I dosaggi

non completati entro gli intervalli di tempo specificati devono essere ripetuti. I controlli aggiuntivi devono essere testati sulla base delle linee-guida o dei requisiti delle normative locali,

regionali o statali o delle organizzazioni accreditanti. Nei casi in cui vengono condotti test PCR a provetta aperta nella stessa area generale del laboratorio, è

necessario utilizzare spazi di lavoro separati o chiusi per le attività di preparazione dei campioni e quelle di amplificazione/rilevamento. Ciascuna area deve avere le proprie forniture e apparecchiature, che non devono essere spostate da un'area all'altra. È necessario indossare sempre dei guanti, che devono essere cambiati prima di andare da un'area all'altra. I guanti devono essere cambiati prima di manipolare i reagenti.

Lavare accuratamente le mani dopo aver eseguito il test. Non pipettare usando la bocca. Non fumare, bere o mangiare nelle aree in cui vengono maneggiati campioni o reagenti dei kit. Smaltire i reagenti inutilizzati conformemente alle normative locali, regionali e statali. Indossare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione degli occhi e del viso adeguati quando si

usa questo kit. Per ottenere risultati accurati, pipettare con cura utilizzando solo apparecchiature calibrate. Pulire a fondo e disinfettare tutte le superfici con una soluzione di candeggina al 10% seguita da acqua

ultrapura per applicazioni in biologia molecolare. Utilizzare micropipette con barriera aerosol o punte a erogazione positiva in tutte le procedure. Per ulteriori informazioni su simboli di pericolo, sicurezza, manipolazione e smaltimento dei componenti di questo kit,

consultare la scheda di sicurezza (SDS) reperibile su quidel.com.

CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI REAGENTI DEL KIT Conservare i reagenti del dosaggio e le cassette di rilevamento come indicato sulle rispettive etichette.


PRELIEVO, CONSERVAZIONE E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI Tipo di campione: campioni fecali non ancora formati che indicano la presenza di CDAD. Utilizzando un contenitore sterile: 1. trasferire le feci liquide o molli nel contenitore sterile, facendo attenzione a non trasferire carta igienica,

urina, acqua o sapone; 2. etichettare il contenitore conformemente alle procedure operative standard dell'ospedale; 3. trasportare in laboratorio il campione etichettato, mantenendolo a temperature tra 2 °C e 8 °C durante

il trasporto. Se i campioni verranno elaborati entro 3 o 4 ore, è ammissibile il trasporto a temperatura ambiente. I campioni che vengono inviati più tardi al laboratorio devono essere prontamente raffreddati e conservati a una temperatura di 2 °C a 8 °C durante il trasporto.

Conservazione: I campioni possono essere conservati a temperature di 2 °C a 8 °C, oppure a –20 °C per un massimo di 7 giorni prima dei test. PROCEDURA DEL DOSAGGIO Lisi a calore 1. 25 minuti prima della fase di lisi a calore, riscaldare il blocco di calore portandolo a 95 °C. 2. Vorticare il campione di feci liquide per 15 secondi per garantire una miscelatura completa. 3. Raccogliere il campione usando il tampone sterile fornito. Immergere il tampone nel campione fecale

liquido o non formato, facendo attenzione a non prelevare una quantità eccessiva di campione (la testa del tampone deve essere solo leggermente coperta di feci).

4. Posizionare il tampone in una provetta di tampone per diluizione identificata per il paziente (tappo blu) e rilasciare il campione facendo ruotare rapidamente la punta per 5-10 secondi in modo da rimuovere le feci; rimuovere il tampone e smaltirlo conformemente a quanto stabilito dal proprio laboratorio. Vorticare per circa 10 secondi per miscelare. Nota: I campioni in tampone per diluizione sono stabili fino a 24 ore a temperatura ambiente.

5. Trasferire 50 μL del campione fecale diluito in una provetta di tampone per lisi etichettata, quindi vorticare per 10 secondi. Nota: I campioni in tampone per lisi sono stabili fino a 24 ore a temperatura ambiente prima del riscaldamento.

6. Riscaldare la provetta di tampone per lisi a 95 °C ± 2 °C per 10 minuti ± 2 minuti quindi vorticare per 10 secondi. Nota: iniziare la procedura della lisi di 10 minuti dopo aver posizionato le provette nel blocco e aver atteso che il blocco tornasse a 95 °C. Nota: I campioni in tampone per lisi sono stabili fino a 24 ore a temperatura ambiente dopo il riscaldamento. Nota: I tamponi per diluizione e i tamponi per lisi non utilizzati devono essere conservati a 2 °C a 8 °C.

Amplificazione 1. 15 minuti prima della fase di amplificazione, scaldare un blocco di calore con coperchio riscaldato

portandolo a 64 °C. 2. Trasferire 50 µL di campione lisato in una provetta di reazione etichettata e reidratare i reagenti liofilizzati

pipettando su e giù 3-5 volte per miscelare. Chiudere saldamente il coperchio e passare alla fase successiva.

3. Incubare la provetta di reazione a 64 °C ± 2 °C per 60 minuti in un blocco di calore con coperchio riscaldato. Nota: per evitare la contaminazione del laboratorio, una volta chiusa la provetta e avviata la reazione di amplificazione, NON aprire la provetta di reazione. Nota: Le provette di reazione non utilizzate devono essere conservate a 2 °C a 8 °C.


Rilevamento 1. Aprire una nuova confezione di cassette di rilevamento. Etichettare la cassetta correttamente. 2. Assicurarsi che nella cartuccia amplicone sia presente un bulbo del tampone. 3. Posizionare la provetta di reazione nella cartuccia amplicone (Fig. 1, passaggio 1). Accertarsi di posizionare

la cerniera del tappo della provetta di reazione nella fessura più grande vicino al bulbo del tampone. 4. Chiudere la cartuccia amplicone (Fig. 1, passaggio 2) accertandosi che si fissi in posizione con uno scatto. 5. Se ciò non accade, riposizionare la provetta all'interno della cartuccia. 6. Inserire la cartuccia amplicone chiusa nella cassetta di rilevamento (Fig. 1, passaggio 3). 7. Accertarsi che la freccia sia rivolta verso la striscia di rilevamento (la provetta di reazione deve essere

rivolta verso la lametta a rasoio e il bulbo in plastica che contiene il tampone di esecuzione deve essere rivolto verso il perno). Identificare la cassetta nella parte superiore e/o laterale dell'involucro esterno.

8. Tenere il dispositivo in posizione verticale e premere l'impugnatura dell'involucro esterno per chiudere il dispositivo (Fig. 1, passaggio 4). L'impugnatura si bloccherà in posizione quando sarà completamente chiusa (Fig. 1, passaggio 5).

9. Leggere i risultati dopo 10 minuti. I risultati sono stabili fino a 30 minuti dopo che la cassetta è stata chiusa a scatto.

10. Smaltire le camere di rilevamento utilizzate in sacchi sigillati e conformemente a quanto stabilito dal proprio laboratorio.

Avvertenza 1. NON aprire la cassetta di rilevamento AmpliVue dopo l'uso. Aprendo la cassetta dopo l'uso si potrebbe

causare una contaminazione dell'area del test da parte degli ampliconi. 2. Rimuovere il numero necessario di provette di reazione dalla busta protettiva, eliminare l'aria in eccesso e

sigillare nuovamente il sacchetto.

Figura 1

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Le linee visibili di colore dal rosa al rosso devono essere registrate come esito positivo (+) e l'assenza di

linee deve essere registrata come (–). Per esempio, “T+” = linea T visibile, “T–” = nessuna linea T (vedere la tabella qui sotto).


La linea T2 rileva il DNA del C. difficile tossigenico. La linea C rileva il DNA del controllo di processo in assenza di DNA del C. difficile tossigenico target. In

presenza di DNA del C. difficile tossigenico target, la linea C rileva i prodotti amplificati derivanti sia dal DNA del C. difficile tossigenico che dal DNA del controllo di processo. L'intensità della linea di controllo può variare da test a test. Qualsiasi linea di colore dal rosa a rosso visibile nel controllo significa che il test è valido.

Positivo per C. difficile

tossigenico

Negativo per C. difficile

tossigenico

Non valido

L'interpretazione dei risultati del dosaggio avviene sulla base dei seguenti criteri:

Lettura della linea del test (T)

Lettura della linea di controllo (C)

Interpretazione del risultato

T2+ C+ Rilevato DNA di C. difficile tossigenico (positivo)

T2+ C– Rilevato DNA di C. difficile tossigenico (positivo)

T2– C+ Nessun DNA di C. difficile tossigenico rilevato (negativo)

T2– C–

Non valido: test non riuscito a causa di campione inibitorio, insuccesso del reagente o guasto al dispositivo. Ripetere il test con il campione fecale originario.

Nota 1: la linea T1 è per i dosaggi triplici. La linea T1 non è in uso per questo dosaggio. Nota 2: L'assenza di una linea C (controllo) unitamente a una linea di test positiva (T2) significa che il materiale target è stato amplificato con successo. Ciò accade per via della sovrabbondanza di ampliconi che generano competizione con i target di test.

CONTROLLO DI QUALITÀ Il dosaggio AmpliVue C. difficile incorpora numerosi controlli per monitorare le prestazioni del dosaggio. 1. Il controllo di processo viene utilizzato per monitorare l'elaborazione dei campioni, per rilevare campioni

inibitori della HDA e per verificare l'integrità dei reagenti del dosaggio e il rilevamento della cassetta. Il controllo di processo è incluso nella provetta di tampone per lisi.

2. I controlli positivi esterni possono essere trattati come campioni del paziente. Immergere il tampone fornito nel controllo positivo esterno, facendo in modo che il liquido copra la punta. Identificare la provetta di tampone per diluizione come controllo positivo e procedere come descritto sopra nella Procedura del dosaggio. Il controllo positivo esterno è pensato per monitorare i problemi sostanziali dei reagenti e della cassetta.

3. I controlli negativi esterni possono essere trattati come campioni del paziente. Immergere il tampone fornito nel controllo negativo esterno, facendo in modo che il liquido copra la punta. Identificare la provetta di tampone per diluizione come controllo negativo e procedere come descritto sopra nella Procedura del dosaggio. Il controllo negativo esterno viene usato per rilevare la contaminazione dei reagenti o ambientale (o carry-over) dovuta al DNA del C. difficile o all'amplicone.

Linea C

Linea T2

Linea T1


Si raccomanda di verificare la reattività di ciascun nuovo lotto e di ciascuna nuova spedizione del dosaggio AmpliVue C. difficile al momento della ricezione e prima dell'uso. Successivamente, è necessario eseguire test di controllo esterni conformi alle linee guida nazionali e locali appropriate. Se i controlli esterni non producono i risultati corretti, il dosaggio AmpliVue C. difficile non deve essere usato per test sui pazienti.

LIMITAZIONI Un risultato negativo circa il C. difficile non deve essere utilizzato come sola base per la diagnosi, il

trattamento o decisioni di gestione del paziente. Anche se non c'è bisogno di preparazione dei reagenti, la principale tecnica di laboratorio utilizzata è la

pipettatura; una buona tecnica di laboratorio è essenziale per ottenere prestazioni ottimali da questo dosaggio. Per via dell'elevata sensibilità analitica di questo test, è necessario fare particolare attenzione a preservare la purezza di tutti i reagenti, specialmente nei casi in cui da una provetta vengono estratte aliquote multiple.

Mutazioni o polimorfismi nel primer o nelle regioni di legame della sonda possono influire sul rilevamento di varianti nuove o sconosciute di C. difficile e possono portare a risultati falsi negativi quando si usa il dosaggio AmpliVue C. difficile.

Un risultato positivo del test non indica necessariamente la presenza di organismi vitali. Questo test rileva ma non differenzia i ceppi ipervirulenti di altri genotipi di C. difficile tossigenico. Questo test non indica la suscettibilità dei ceppi rilevati di C. difficile ai vari agenti antimicrobici. Risultati negativi del test possono derivare da raccolta, manipolazione o conservazione improprie dei

campioni, presenza di inibitori, errori tecnici, campioni mescolati tra loro, o dal fatto che il numero di organismi nel campione è al di sotto della sensibilità analitica del test. L'attento rispetto delle istruzioni fornite in questo documento consentono di evitare i risultati erronei. Questo dosaggio deve essere usato solo da personale con adeguata formazione sulla procedura.

La procedura del dosaggio AmpliVue C. difficile deve essere eseguita in un ambiente la cui temperatura non superi i 30 °C.

PRESTAZIONI CLINICHE Le prestazioni del dosaggio AmpliVue C. difficile sono state valutate in quattro diverse località geografiche negli Stati Uniti tra gennaio e ottobre 2012. Ottocentoquaranta (840) campioni sono stati testati sia con il dosaggio AmpliVue C. difficile che con il dosaggio Citotossicità su coltura tissutale. Un campione (0,1%) è risultato indeterminato nel dosaggio per la citotossicità, a causa di una tossicità nel pozzetto antitossina. Il test iniziale ha evidenziato quattro (4) campioni (0,5%) non validi nel dosaggio AmpliVue C. difficile. Tre (3) di tali campioni hanno generato risultati validi (tutti negativi) dopo essere stati nuovamente testati conformemente alle istruzioni per l'uso del dosaggio AmpliVue C. difficile. Un (1) campione è rimasto non valido dopo test ripetuti. I dati qui sotto sono basati sul risultato iniziale degli ottocentotrentacinque (835) campioni. In questo studio, il dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile ha ottenuto una sensibilità e una specificità rispettivamente del 93,6% e del 94,1%.

Coltura tissutale citotossica 95% CI

POS. NEG. Totale Sensibilità 93,6% 87,3% 96,9%

AmpliVue C. difficile

POS. 102 43* 145 Specificità 94,1% 92,1% 95,6%

NEG. 7** 683 690

Totale 109 726 835 * Fra questi quarantatré (43) campioni discordanti (positivi con AmpliVue / negativi con la coltura tissutale citotossica), trentasette (37) sono risultati positivi per il C. difficile attraverso un dispositivo molecolare approvato dalla FDA e sei (6) sono risultati negativi. ** Di tali sette (7) campioni discordanti (negativi con AmpliVue / positivi con la coltura tissutale citotossica), due (2) sono risultati positivi per il C. difficile attraverso un dispositivo molecolare approvato dalla FDA e cinque (5) sono risultati negativi.


PRESTAZIONI ANALITICHE Limite di rilevamento La sensibilità analitica (limite di rilevamento o LoD) del dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile è stata stabilita usando colture quantificate (CFU/mL) di due ceppi di C. difficile (ATCC 43255 {tossinotipo 0} e CCUG 8864 {tossinotipo X}), diluiti serialmente in una matrice fecale negativa. La sensibilità analitica (LoD) è definita come la concentrazione più bassa in corrispondenza della quale il 95% di tutti i duplicati risulta positivo al test.

Ceppo Tossinotipo LoD

(CFU/dosaggio)

ATCC 43255 0 4,2

CCUG 8864 X 0,7

Il LoD finale del dosaggio è definito come la concentrazione maggiore fra i due ceppi dove è stata osservata una positività del 95%. Il LoD finale del dosaggio è 4,2 CFU/dosaggio.

Reattività analitica (Inclusività) La reattività del dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile è stata valutata in relazione a ventiquattro (24) ceppi aggiuntivi di C. difficile, che rappresentavano vari tossinotipi. Il test è stato eseguito vicino al livello di rilevamento del dosaggio (da 2 a 3x LoD). Il test è stato eseguito usando tre (3) lotti di produzione separati del dosaggio AmpliVue C. difficile. In questo studio, tutti i ventiquattro (24) ceppi sono stati rilevati dal dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile e il più alto LoD osservato è stato pari a 15,67 CFU/dosaggio.

Ceppo Tossinotipo CFU/dosaggio AmpliVue C. difficile

(rilevato/totale)

ATCC 43255 0 4,2 19/20

CCUG 8864 X 0,7 19/20


CCUG 37770 IV 2,84 3/3

ATCC BAA-1875 V 10,92 3/3

ATCC 43598 VIII 2,13 3/3

ATCC 37774 XXIII 1,52 3/3

CCUG 9004 Sconosciuto 1,63 3/3

ATCC BAA-1874 0 5,75 3/3

ATCC 43600 0 3,92 3/3

ATCC BAA-1871 0 3,61 3/3


ATCC BAA-1872 0 7,97 3/3

ATCC 700792 0 1,65 3/3

ATCC 43599 0 1,55 3/3







Ceppo Tossinotipo CFU/dosaggio AmpliVue C. difficile

(rilevato/totale)


ATCC 17857 0 0,72 3/3

ATCC 43594 0 0,54 3/3

ATCC 43596 0 1,27 3/3

Studio sulla riproducibilità Per confermare la riproducibilità del dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile, un panel di studio in cieco e randomizzato contenente campioni positivi e negativi di Clostridium difficile è stato testato in tre (3) siti (due (2) studi clinici). Ciascun sito ha testato un panel di riproducibilità e controlli di dosaggio per cinque (5) giorni, con test triplice. In ciascun sito, i test sono stati eseguiti da due operatori. Ciascun operatore ha testato il panel una volta al giorno usando un unico lotto del dosaggio AmpliVue C. difficile. È stato testato un totale di cinquecentoquaranta (540) campioni (compresi i controlli). In questo studio, il dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile ha generato risultati riproducibili.

Riproducibilità del dosaggio Quidel AmpliVue C. Difficile

Categoria

Sito n. 1 Sito n. 2 Sito n. 3

Percentuale complessiva concordanza

Intervallo di confidenza

95%

n. r

isu

lta

ti

att

esi/

n. t

esta

ti

% c

on

ord

an

za

n. r

isu

lta

ti

att

esi/

n. T

esta

ti

% c

on

cord

an

za

n. r

isu

lta

ti

att

esi/

n. t

esta

ti

% c

on

cord

an

za

C. difficile alto* negativo

25/30 83% 23/30 77% 24/30 80% 72/90 80% 71-87%

C. difficile basso positivo

30/30 100% 29/29 100% 30/30 100% 89/89* 100% 95-100%

C. difficile moderatamente positivo

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Negativo 30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Controllo positivo C. difficile

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Controllo negativo dosaggio

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%


N. di lotto CLIN-005

*NOTA: un (1) campione è risultato non valido. Un campione “alto negativo/basso positivo” è un campione con una concentrazione inferiore al cut-off clinico tale che i risultati di più test di questo campione sono negativi per circa il 20% - 80% delle volte.5

Specificità analitica – Reattività crociata e interferenza microbica La specificità analitica del dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile è stata valutata testando un panel composto da sessantasei (66) batteri, virus e lieviti e DNA umano che rappresentavano patogeni enterici comuni, flora o acidi nucleici comunemente presenti nell'intestino. I microorganismi o gli acidi nucleici sono stati mescolati con una matrice negativa mista e testati direttamente o in presenza di un livello LoD da 2 a 3x di C. difficile, rispettivamente per valutare la reattività crociata e l'interferenza microbica. La tabella qui sotto riepiloga i dati estratti da questi studi. Non è stato rilevato alcun segno di reattività o interferenza in alcun componente del panel e nel dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile.

ID organismo Identificazione

Concentrazione testata

(CFU/mL o PFU/mL)

C. difficile Risultati

Reattività crociata

Interferenza microbica (ceppo 1)


Abiotrophia defectiva* CCUG 27280 4,30E+08 Negativo Positivo Positivo



Aeromonas hydrophila ATCC 7966 2,09E+10 Negativo Positivo Positivo












Clostridium botulinum Analisi in silico Nessuna reattività crociata in silico

rilevata
















(CFU/mL o PFU/mL)
















Clostridium sporogenes ATCC 11437 3,55E+07 Negativo Positivo Positivo































Salmonella enterica, ATCC 13314 4,22E+09 Negativo Positivo Positivo




(CFU/mL o PFU/mL)





sottospecie Arizonae (precedentemente Choleraesuis arizonae)








Staphylococcus aureus ATCC 43300 6,00E+07 Negativo Positivo Positivo
















DNA genomico umano Promega G3041 184 µg/ml Negativo Positivo Positivo *Per testare tali organismi è stato usato acido nucleico purificato. Il numero delle cellule è stato approssimato in base alla concentrazione dell'acido nucleico e delle dimensioni del genoma.


Specificità analitica – Sostanze interferenti Le prestazioni del dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile sono state valutate con sostanze potenzialmente interferenti che potrebbero essere presenti nei campioni fecali. Le sostanze potenzialmente interferenti sono state valutate usando due ceppi di C. difficile (ATCC 43255 {tossinotipo 0} e CCUG 8864 {tossinotipo X}) a una concentrazione da 2 a 3x LoD. Non è stato rilevato alcun segno di interferenza da parte delle sostanze testate.

Nome della sostanza Concentrazione

testata

Risultato del C.

difficile Nome della sostanza


Risultato del C.

difficile

Nistatina 10.000 USP

U/mL Positivo

Esomeprazolo magnesio idrato

0,5 mg/ml Positivo



Cloridrato di fenilefrina 2% w/v Positivo Hamamelis 100% Positivo



12,5 mg/mL Positivo






Cloridrato di loperamide 1 mg/mL Positivo Cloruro di benzalconio 0,12% Positivo

Subsalicilato di bismuto 0,87 mg/mL Positivo Etanolo 10% Positivo




10 mg/mL Positivo





Carry-over – Contaminazione crociata Quattro (4) cicli di ventiquattro (24) campioni, formati da dodici (12) campioni negativi e dodici (12) campioni alti positivi di C. difficile, sono stati testati con schema alternato da un totale di due (2) operatori su due (2) lotti di dosaggio (gli operatori non conoscevano i risultati attesi). Tutti i campioni positivi sono stati refertati come positivi (T2+/C+) e tutti i campioni negativi sono stati refertati come negativi (T2–/C+). Eseguendo il dosaggio Quidel AmpliVue C. difficile conformemente alle istruzioni per l'uso del prodotto, non è stata rilevata alcuna contaminazione da carry-over.

SERVIZIO CLIENTI E ASSISTENZA TECNICA Per ordini o assistenza tecnica, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 874-1517 (gratuito negli Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100 (al di fuori degli Stati Uniti), dal lunedì al venerdì, dalle 8:00 alle 17:00, ora della costa orientale. Gli ordini possono essere effettuati anche via fax al numero +1 (740) 592-9820. Per avere assistenza via e-mail, scrivere a [email protected] oppure a



[email protected]. Per servizi al di fuori degli Stati Uniti, contattare il distributore di zona. Maggiori informazioni su Quidel, i nostri prodotti e i nostri distributori sono disponibili sul sito web quidel.com.

PROPRIETÀ INTELLETTUALE Biohelix è un marchio depositato di BioHelix Corporation. BioHelix è titolare delle proprietà intellettuali relative alla tecnologia HDA. AmpliVue è un marchio depositato di Quidel Corporation.

BIBLIOGRAFIA 1. Sloan LM, Duresko BJ, Gustafson DR, and Rosenblatt JE. Comparison of Real-Time PCR for Detection of the

tcdC Gene with Four Toxin Immunoassays and Culture in Diagnosis of Clostridium difficile Infection_J. Clin. Micro. 2008: 46(6):1996–2001.



4. Vincent M, Xu Y, and Kong H. Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification. EMBO 2004: Rep.5: 795-800.

5. Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff – Establishing the Performance Characteristics of In vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile, November 29, 2010.

M201 – Kit per dosaggio AmpliVue C. difficile

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH 45701 USA quidel.com PIM201001IT00 (01/16)




GLOSSARIO

AmpliVue C. difficile Page 1 de 16

POUR UNE UTILISATION EN DIAGNOSTIC IN VITRO

Contents UTILISATION PRÉVUE ............................................................................................................................................................... 2

RÉSUMÉ ET EXPLICATION ......................................................................................................................................................... 2

PRINCIPE DE LA PROCÉDURE .................................................................................................................................................... 2

MATERIALI FORNITI .................................................................................................................................................................. 3

MATÉRIEL REQUIS NON FOURNI .............................................................................................................................................. 3

MISES EN GARDE ...................................................................................................................................................................... 4

STOCKAGE ET MANIPULATION DES KITS DE RÉACTIFS ............................................................................................................. 4

PRÉLÈVEMENT, STOCKAGE, ET MANIPULATION DES ÉCHANTILLONS ..................................................................................... 5

PROCÉDURE DE TEST ................................................................................................................................................................ 5

Lyse.................................................................................................................................................................................... 5

Amplification ..................................................................................................................................................................... 5

Détection ........................................................................................................................................................................... 6

Avertissement ................................................................................................................................................................... 6

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS ........................................................................................................................................... 7

CONTRÔLE QUALITÉ ................................................................................................................................................................. 7

LIMITES ..................................................................................................................................................................................... 8

PERFORMANCE CLINIQUE ........................................................................................................................................................ 8

PERFORMANCES ANALYTIQUES ............................................................................................................................................... 9

Limite de détection ........................................................................................................................................................... 9

Réactivité analytique (inclusion) ....................................................................................................................................... 9

Étude de reproductibilité ................................................................................................................................................ 10

Spécificité analytique - Réactivité croisée et interférence microbienne ........................................................................ 11

Spécificité analytique – Substances interférentes .......................................................................................................... 14

Propagation - Contamination croisée ............................................................................................................................. 14

ASSISTANCE CLIENT ET TECHNIQUE ....................................................................................................................................... 14

Pour la détection qualitative et l'identification des acides nucléiques de Clostridium difficile toxinogène extraits à partir d'échantillons de selles


PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE .................................................................................................................................................. 15

RÉFÉRENCES ........................................................................................................................................................................... 15

UTILISATION PRÉVUE Le test C. difficile AmpliVue® est un test de diagnostic in vitro pour la détection directe et qualitative du gène de la toxine A de Clostridium difficile (tcdA) à partir d'échantillons de selles non-formées de patients chez qui l'on soupçonne une maladie associée au Clostridium difficile (DACD). Le test C. difficile AmpliVue est destiné à être utilisé comme une aide au diagnostic de DACD. Le test utilise une amplification hélicase-dépendante (HDA) pour l'amplification d'un fragment hautement conservé de la séquence du gène de la toxine A et un dispositif de détection dans une cassette unitaire jetable qui permet une évaluation visuelle des résultats du test.

RÉSUMÉ ET EXPLICATION C. difficile est une cause majeure de diarrhées et de colites associées à la prise d’antibiotiques, représentant jusqu'à 25 % de tous les cas.1 On pense que l'exposition aux antibiotiques perturbe la flore intestinale, ce qui favorise une colonisation opportuniste par la bactérie C. difficile (qui est présente dans la flore intestinale chez 3 % des adultes en bonne santé). La virulence de la bactérie C. difficile est causée par la production de deux toxines (A et B). Les gènes codant pour ces 2 toxines (respectivement tcdA et tcdB) se situent dans un locus de pathogénicité (PaLoc) de 19.6 Kb, ainsi que 3 autres produits géniques. Récemment, l'incidence et la gravité de la maladie associée à la bactérie C. difficile ayant entraîné de brefs séjours à l'hôpital ont augmenté.1,2

PRINCIPE DE LA PROCÉDURE Le test C. difficile AmpliVue combine un traitement d'échantillon simple, une technologie d'amplification isotherme Biohelix® appelée amplification hélicase-dépendante (HDA) et un dispositif de détection dans une cassette unitaire jetable pour la détection de C. difficile directement à partir d'échantillons de selles pour lesquels on soupçonne une DACD.3,4 Le test cible un fragment conservé de l'ADN C. difficile, qui est intact dans tous les toxinotypes A+B+ et A-B+ connus de la bactérie C. difficile.

Un écouvillon est utilisé pour transférer une petite quantité d'échantillon dans un tube de dilution. L'échantillon dilué est ensuite transféré dans un tube contenant une solution de tampon de lyse et les cellules sont lysées par traitement thermique simple. Après ce traitement thermique, un aliquot de l'échantillon lysé est ajouté dans un tube réactionnel contenant un mélange lyophilisé de réactifs HDA comprenant des amorces spécifiques pour l'amplification d'un fragment de la région conservée de l’ADN C. difficile. Le test comprend également un contrôle de processus visant à contrôler le bon déroulement des étapes de traitement des échantillons et de détection dans la cassette, à confirmer l'intégrité des réactifs du test et à évaluer l'activité des inhibiteurs HDA qui peuvent être présents dans l'échantillon diarrhéique. Une amplification concurrente de l'ADN contrôle de processus a lieu, à moins que des substances inhibitrices soient présentes ou que la préparation de l'échantillon ait échoué. La réaction HDA est asymétrique de telle sorte qu’un excès d'ADN simple brin se forme à partir d'une amorce biotinylée présente dans le mélange réactionnel. Les sondes de capture de chaque amplicon se lient à l’ADN simple brin biotinylé formant des amplicons doubles brins marqués.

À la fin de la réaction HDA, le tube réactionnel est transféré dans une cassette pour une détection rapide. Le résultat du test s'affiche sous forme de lignes de test et/ou contrôles dans la fenêtre de la cassette. L’hybride amplicon double brin/sonde nucléotidique marquée migre par flux latéral dans la cassette pour être ensuite capturé sur la bande d'hybridation. La ligne du bas capture l'amplicon de test alors que la ligne du haut capture


l'amplicon contrôle. Le marqueur biotine lie les particules de couleurs conjuguées à la streptavidine pour visualisation. Le résultat du test est affiché sous forme de lignes de couleur visibles à l'œil nu.

La cassette unitaire est constituée de deux composants individuels: une cartouche amplicon qui contient le tampon de migration et un tube à réaction à paroi fine de 0,2 ml unique contenant le produit amplifié ; et la chambre de détection qui accueille la cartouche amplicon et une bande de détection d'ADN à flux vertical incorporée dans la cassette. La bande de détection ADN est hybridée avec différents anticorps anti-haptènes qui servent de ligne de test (T) C. difficile et de ligne contrôle (C) dans le test. Une lame de rasoir et une pointe en plastique situées en bas de la chambre de détection ouvrent le tube réactionnel HDA et l'ampoule de solution de tampon de migration lorsque la poignée de la chambre de détection est fermée. Le mélange s'écoule à travers un papier en fibre de verre relié à la bande de détection ADN qui contient un tampon de fibres de verre pré-chargé avec des billes de couleur marquées d’un conjugué de streptavidine pour une visualisation colorée. La détection de l'ADN C. difficile est signalée chaque fois que la ligne T2 (ligne de test 2) est visible à travers la fenêtre de détection de la cassette. La présence de la ligne C n'est pas nécessaire pour des résultats positifs. Aucune détection de l'ADN C. difficile toxinogène n'est signalée lorsque seule la ligne C est affichée. Le test est considéré comme non valide si aucune ligne n’est affichée.

MATERIALI FORNITI SKU n°M201 16 tests par kit

Composant Quantité Stockage

Cassettes de detection, Réf. 1185001 16/kit 2 °C à 30 °C.

Tampon de dilution, Réf. M5015 16 tubes/kit; 1,8 mL 2 °C à 8 °C.

Tampon de lyse, Réf. M5016 16 tubes/kit; 1 mL 2 °C à 8 °C.

Tubes réactionnels, Réf. M5017 16 tubes/kit 2 °C à 8 °C.

Cartouches amplicon, Réf. 1215400 16/kit 2 °C à 30 °C.

Écouvillons floqués, Réf. M5013 16 écouvillons/kit 2 °C à 30 °C.

MATÉRIEL FACULTATIF Contrôles externes pour C. difficile toxinogène (par exemple le kit contrôle C. difficile Quidel Molecular

n°M108, qui contient des contrôles positifs et négatifs, sert de contrôle de traitement et d'extraction externe)

Thermomètre

MATÉRIEL REQUIS NON FOURNI Pointes volumétriques ou à filtre stériles pour pipette sans DNAse Pipette Chronomètre ou minuteur Ciseaux ou lame Bloc chauffant pouvant atteindre une température de 95 °C ± 2 °C Bloc chauffant avec couvercle chauffé pouvant atteindre une température de 64 °C ± 2 °C


MISES EN GARDE Pour une utilisation en Diagnostic In Vitro. Les caractéristiques de performance de ce test ont été établies avec les types d'échantillons indiqués dans

la section Utilisation Prévue uniquement. La mise en œuvre de ce test avec d'autres types d'échantillons ou de spécimens n'a pas été évaluée.

Traiter tous les spécimens/échantillons comme étant potentiellement infectés. Suivre les précautions universelles lors de la manipulation des échantillons, de ce kit et de son contenu.

Un prélèvement, un stockage et un transport adéquats des échantillons sont indispensables pour obtenir des résultats corrects.

Stocker les réactifs du test comme indiqué sur leurs étiquettes individuelles. Les réactifs ne sont pas interchangeables entre les lots. Ne jamais mettre en commun des réactifs provenant de différents tubes, même s’ils sont du même lot. Ne pas utiliser les réactifs après leur date d'expiration. Ne pas intervertir les bouchons entre réactifs car une contamination peut se produire et compromettre les

résultats des tests. Ouvrir les tubes seulement au moment de l'ajout des aliquots dans les tubes ou lors du prélèvement des

aliquots à partir des dits tubes. Toujours garder les tubes fermés pour éviter toute contamination. Pour éviter toute contamination de l'environnement par les amplicons C. difficile, ne pas ouvrir les tubes

réactionnels post-amplification. Éviter toute contamination microbienne et désoxyribonucléase (DNAse) des réactifs lors du prélèvement

des aliquots à partir des tubes. L'utilisation de pointes à filtre stériles ou volumétriques pour pipette exempts de DNAse est recommandée.

Utiliser un embout de pipette pour chaque échantillon ou réactif. La réalisation du test dans des délais différents de ceux recommandés peut induire des résultats

incorrects. Les tests non achevés dans les délais spécifiés doivent être répétés. Des témoins supplémentaires peuvent être testés conformément aux directives ou aux exigences

précisées dans les réglementations locales, nationales, provinciales et/ou fédérales, voire des organismes d'accréditation.

Lorsque des tests PCR à tube ouvert sont réalisés dans la même zone par le laboratoire, des zones de travail séparées ou distinctes doivent être utilisées pour les activités de préparation et d'amplification / détection des échantillons. Les fournitures et le matériel doivent être dédiés à chaque zone et ne doivent pas être déplacés d’une zone vers une autre. Des gants doivent toujours être portés et changés avant de passer d’une zone à une autre. Il est important de changer de gants avant de manipuler les réactifs.

Se laver les mains après avoir mis en œuvre le test. Ne pas pipeter avec la bouche. Ne pas fumer, boire ou manger dans les zones où des échantillons ou des réactifs sont manipulés. Jeter les réactifs non utilisés et les déchets en accord avec les règlements du comté, fédéraux, provinciaux,

étatiques et locaux. Porter des vêtements de protection, des gants, des protections oculaire et faciale lors de l'utilisation de ce

kit. Pour des résultats précis, pipeter soigneusement en utilisant uniquement un équipement calibré. Nettoyer et désinfecter toutes les surfaces avec une solution à 10 % de javel puis avec de l'eau de

qualité moléculaire. Utiliser des micropipettes avec une barrière aérosol ou des embouts volumétriques pour toutes

les procédures. Pour en savoir plus sur les symboles de danger, la sécurité, la manipulation et l’élimination des composants de ce kit,

veuillez vous référer à la Fiche de données de sécurité (FDS) que vous trouverez sur quidel.com.

STOCKAGE ET MANIPULATION DES KITS DE RÉACTIFS


Entreposer les réactifs du test et les cassettes de détection comme indiqué sur chaque étiquette individuelle.

PRÉLÈVEMENT, STOCKAGE, ET MANIPULATION DES ÉCHANTILLONS Type d'échantillon: échantillons de selles non formées indicatives d'une DACD. Utilisation d'un récipient stérile: 1. Transférer les selles liquides ou molles dans le récipient stérile, en prenant soin de ne pas transférer de

papier de toilette, d'urine, d'eau ou de savon. 2. Étiqueter le récipient conformément aux procédures de service standard en milieu hospitalier. 3. Transporter l’échantillon étiqueté au laboratoire, en maintenant les échantillons entre 2 °C et 8 °C durant

le transport. Si les échantillons peuvent être traités dans un délai de 3 à 4 heures après le prélèvement, un transport à température ambiante est adéquat. Les échantillons que l’on doit transporter au laboratoire doivent être rapidement refroidis et maintenus entre 2 °C et 8 °C pendant toute la durée du transport.

Stockage: Les échantillons peuvent être conservés entre 2 °C et 8 °C ou à –20 °C pendant un maximum de 7 jours avant le test.

PROCÉDURE DE TEST Lyse 1. 25 minutes avant l'étape de chauffe du tube de lyse, préchauffer le bloc de chauffage à 95 °C. 2. Vortexer l’échantillon de selles liquides pendant 15 secondes pour assurer un mélange complet. 3. Prélever un échantillon à l'aide de l'écouvillon stérile fourni. Plonger l'écouvillon dans l'échantillon de

selles liquides ou non formées en prenant soin de ne pas trop prélever de matière - la tête de l'écouvillon doit seulement être légèrement enduite avec les selles.

4. Placer un écouvillon dans un tube à solution tampon de dilution identifié pour le patient (capuchon bleu) et libérer l’échantillon en agitant ledit écouvillon rapidement pendant 5 à 10 secondes pour détacher les selles; retirer et jeter l’écouvillon en accord avec les pratiques en vigueur dans le laboratoire. Vortexer pendant 10 secondes environ pour mélanger. Remarque: Les échantillons en tampon de dilution sont stables jusqu'à 24 heures à température ambiante.

5. Transférer 50 µL de l'échantillon de selles dilué dans un tube de solution tampon de lyse étiqueté, puis vortexer pendant 10 secondes. Remarque: Les échantillons dans le tampon de lyse sont stables jusqu'à 24 heures à température ambiante avant l’étape de chauffage.

6. Chauffer le tube de tampon de lyse à 95 °C ± 2 °C pendant 10 minutes ± 2 minutes, puis le vortexer pendant 10 secondes. Remarque: Veiller à ce que la température du bloc soit stabilisée à 95 °C avant de disposer les tubes. Décompter 10 minutes après la mise en place des tubes dans le thermo-bloc. Remarque: Les échantillons en tampon de lyse sont stables jusqu'à 24 heures à température ambiante après l’étape de chauffage. Remarque: Les tampons de dilution et les tampons de lyse non utilisés doivent être conservés entre 2 °C et 8 °C.

Amplification 1. 15 minutes avant l'étape d'amplification, préchauffer un thermo-bloc avec couvercle chauffé à 64 °C. 2. Transférer 50 µL d'échantillon de lyse dans un tube de réaction étiqueté et réhydrater les réactifs

lyophilisés en pipetant entre 3 et 5 fois l’échantillon pour assurer un mélange optimal. Bien fermer le couvercle et passer à l'étape suivante.


3. Incuber le tube de réaction à 64 °C ± 2 °C pendant 60 minutes ± 2 minutes dans un bloc chauffant équipé d’un couvercle chauffé. Remarque: pour éviter toute contamination du laboratoire, une fois que le tube a été fermé et que la réaction d'amplification a commencé, NE PAS ouvrir le tube de réaction. Remarque: Les tubes de réaction non utilisés doivent être conservés entre 2 °C et 8 °C.

Détection 1. Ouvrir un sachet contenant une cassette de détection neuve. Étiqueter la cassette de manière appropriée. 2. Vérifier la présence et l’intégrité de l'ampoule de solution tampon dans la cartouche amplicon. 3. Placer le tube réactionnel dans la cartouche amplicon (Fig. 1, étape 1). Veiller à placer le CAPUCHON du

tube réactionnel dans la plus grande rainure située à côté de l'ampoule de solution tampon. 4. Fermer la cartouche amplicon (Fig. 1, étape 2) en veillant à ce qu'elle s'enclenche. Si la cartouche ne

s’enclenche pas, repositionner le tube à l’intérieur de la cartouche. 5. Insérer la cartouche amplicon fermée dans la cassette de détection (Fig. 1, étape 3). Veiller à ce que la

flèche soit face à la bande de détection (le tube réactionnel doit faire face à la lame de rasoir et l'ampoule en plastique contenant la solution tampon de migration doit faire face à la pointe). Identifier la cassette sur le dessus et/ou sur le côté de l'enveloppe extérieure.

6. Maintenir le dispositif en position verticale et appuyer sur la poignée de l'enveloppe extérieure pour fermer le dispositif (Fig. 1, étape 4). La poignée se verrouille en position lorsqu’elle est complètement fermée (Fig. 1, étape 5).

7. Lire les résultats après 10 minutes. Les résultats sont stables durant 30 minutes à partir de la fermeture de la cassette.

8. Jeter les chambres de détection utilisées dans des sacs étanches et conformément aux bonnes pratiques du laboratoire.

Avertissement 1. NE PAS ouvrir la cassette de détection AmpliVue après utilisation. L’ouverture de la cassette après son

utilisation peut entraîner la contamination par l’amplicon de la zone de test. 2. Retirer le nombre requis de tubes réactionnels de la pochette de protection, éliminer l'excès d'air et

refermer le sac. Figure 1


INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Toute ligne visible de couleur rose à rouge doit être consignée comme positive (+) et l’absence de ligne

doit être consignée comme négative (–), par exemple, « T+ » = ligne T visible et « T– » = pas de ligne T (voir le schéma ci-dessous).

La ligne T2 détecte l'ADN C. difficile toxinogène. La ligne C détecte l'ADN contrôle de processus en l'absence d'ADN C. difficile cible toxinogène. En présence

d'ADN C. difficile cible toxinogène, la ligne C détecte les produits amplifiés provenant de l'ADN C. difficile toxinogène et de l'ADN contrôle de processus. L'intensité de la ligne contrôle peut varier avec chaque test. Toute ligne visible de couleur rose à rouge dans le contrôle signifie un test valide.

Positif pour C. difficile

toxinogène

Négatif pour C. difficile

toxinogène

Non valide

L'interprétation des résultats du test se fait selon les critères suivants:

Lecture de la ligne de test (T)

Lecture de la ligne contrôle (C)

Interprétation des résultats

T2+ C+ ADN C. difficile toxinogène détecté (positif)

T2+ C– ADN C. difficile toxinogène détecté (positif)

T2– C+ ADN C. difficile toxinogène non détecté (négatif)

T2– C–

Non valide: problème dû à une inhibition de l’échantillon, à un défaut du réactif ou à une défaillance du dispositif. Répéter le test avec l'échantillon de selles d'origine.

Remarque 1: La ligne T1 correspond aux tests triplex. La ligne T1 n'est pas utilisée dans ce test. Remarque 2: L'absence d'une ligne C (témoin) en conjonction avec une ligne de test positif (T2) signifie que la matière cible a été amplifiée avec succès. Cela se produit en raison de la surabondance d’amplicons qui génèrent une concurrence avec les cibles de test.

CONTRÔLE QUALITÉ Le test C. difficile AmpliVue contient plusieurs contrôles visant à vérifier ses performances. 1. Le contrôle de processus est utilisé pour contrôler le bon déroulement des étapes de traitement des

échantillons et de détection dans la cassette, pour confirmer l'intégrité des réactifs du test et pour évaluer l'activité des inhibiteurs HDA. Le contrôle de processus est inclus dans le tube de solution tampon de lyse.

2. Des contrôles positifs externes peuvent être traités comme un échantillon de patient. Plonger l'écouvillon fourni dans le témoin positif externe en veillant à ce que le liquide recouvre bien la pointe. Identifier le tube de solution tampon de dilution comme contrôle positif et procéder au traitement comme décrit dans la procédure de test ci-dessus. Le contrôle positif externe est destiné à surveiller les défaillances substantielles des réactifs et de la cassette.

3. Des contrôles négatifs externes peuvent être traités comme un échantillon de patient. Plonger l'écouvillon fourni dans le témoin négatif externe en veillant à ce que le liquide recouvre bien la pointe. Identifier le tube de solution tampon de dilution comme témoin négatif et procéder au traitement comme décrit dans la procédure de test ci-dessus. Le contrôle négatif externe est utilisé pour détecter une contamination du réactif ou de l'environnement (ou une contamination croisée) par ADN C. difficile ou amplicon.

Ligne C

Ligne T2

Ligne T1


Il est recommandé de vérifier chaque nouveau lot et de chaque nouvelle expédition du test C. difficile AmpliVue dès réception et avant toute utilisation. Des tests de contrôle externes doivent être effectués ultérieurement, conformément aux lignes directrices fédérales, étatiques et locales appropriées. Le test C. difficile AmpliVue ne doit pas être utilisé pour des échantillons de patients si les contrôles externes ne donnent pas les résultats corrects attendus.

LIMITES Un résultat C. difficile négatif ne doit pas être utilisé comme seule base de diagnostic, traitement ou

décisions de traitement du patient. Bien qu'il n'y ait pas besoin de préparation des réactifs, la principale technique de laboratoire requise est

le pipetage ; une bonne technique de laboratoire est essentielle pour la bonne exécution de ce test. En raison de la sensibilité analytique élevée de ce test, un soin extrême est requis pour préserver la pureté de tous les réactifs, en particulier lorsque plusieurs aliquots sont prélevés à partir d'un tube.

Des mutations ou des polymorphismes dans les régions d'amorce ou de liaison de sonde peuvent affecter la détection de variantes nouvelles ou inconnues de la bactérie C. difficile et peuvent conduire à des faux négatifs le test C. difficile AmpliVue.

Un résultat de test positif n'indique pas nécessairement la présence d'organismes viables. Ce test détecte mais ne différencie pas les souches hypervirulentes des autres génotypes toxinogènes de

C. difficile. Ce test n'indique pas la résistance/sensibilité de souches C. difficile détectées pour différents agents

antimicrobiens. Des résultats de test négatifs peuvent se produire en cas de prélèvement, de manipulation ou de stockage

incorrects, de présence d'inhibiteurs, d’erreurs techniques, de mélange d’échantillons ou parce que le nombre de micro-organismes dans l'échantillon est inférieur à la sensibilité analytique du test. Une stricte conformité aux instructions mentionnées dans cette notice est requise pour éviter tout résultat erroné. L'utilisation de ce test doit être limitée au personnel dûment formé à la procédure.

La procédure de test C. difficile AmpliVue doit être menée dans un environnement dont la température ne dépasse pas 30 °C.

PERFORMANCE CLINIQUE La performance du test C. difficile AmpliVue a été évaluée à quatre endroits géographiquement distincts aux États-Unis entre janvier et octobre 2012. Huit cent quarante (840) échantillons ont été testés à la fois via le test C. difficile AmpliVue et le test de cytotoxicité de culture de tissus. Un échantillon (0,1 %) était indéterminé dans le test de cytotoxicité en raison de la présence d’une toxine dans un puits antitoxine. Quatre (4) échantillons (0,5 %) n'étaient initialement pas valides dans le test C. difficile AmpliVue. Trois (3) de ces échantillons ont donné des résultats valides (tous étaient négatifs) lors d’un nouveau test conformément aux instructions d’utilisation du test C. difficile AmpliVue. Un (1) échantillon est resté non-valide lors des tests répétés. Les valeurs ci-dessous sont basées sur le résultat initial de huit cent trente-cinq (835) échantillons. Le test C. difficile AmpliVue de Quidel a atteint une sensibilité et une spécificité de respectivement 93,6 % et 94,1 % au cours de cette étude.

Tests de cytotoxicité sur culture de tissus 95 % IC

POS NÉG Total Sensibilité 93,6% 87,3% 96,9%

AmpliVue C. Difficile

POS 102 43* 145 Spécificité 94,1% 92,1% 95,6%

NÉG 7** 683 690

Total 109 726 835 * Sur ces quarante trois (43) échantillons discordants (AmpliVue positif / Tests de cytotoxicité sur culture de tissu négative) signalés, trente-sept (37) étaient positifs pour C. difficile par un test de diagnostic moléculaire approuvé par la FDA, et six (6) étaient négatifs. ** Sur ces sept (7) échantillons discordants (AmpliVue négatif / Tests de cytotoxicité sur culture de tissu positive) signalés, deux (2) étaient positifs pour C. difficile par un test de diagnostic moléculaire approuvé par la FDA, et cinq (5) étaient négatifs.


PERFORMANCES ANALYTIQUES Limite de détection La sensibilité analytique (limite de détection ou LoD) du test C. difficile AmpliVue de Quidel a été déterminée à l'aide de cultures quantifiées (UFC / ml) de deux (2) souches de la bactérie C. difficile (ATCC 43255 {toxinotype 0} et CCUG 8864 {toxinotype X}) diluées en série dans une matrice fécale négative. La sensibilité analytique (limite de détection ou LoD) est définie comme étant la concentration la plus faible à laquelle 95 % de toutes les répétitions ont été testées positives.

Souche Toxinotype LoD (UFC/test)

ATCC 43255 0 4,2

CCUG 8864 X 0,7

La limite de détection finale du test est définie comme la plus élevée des deux concentrations de souches où une positivité de 95 % a été observée. La limite de détection finale du test est 4,2 UFC / test.

Réactivité analytique (inclusion) La réactivité du test C. difficile AmpliVue de Quidel a été évaluée sur vingt-quatre (24) souches supplémentaires de la bactérie Clostridium difficile représentant plusieurs toxinotypes. Le test a été mis en œuvre à proximité du niveau de détection pour le dosage (2 à 3x LoD). Il a été mis en œuvre au moyen de trois (3) lots de production distincts du test C. difficile AmpliVue. L’ensemble des vingt-quatre (24) souches a été détecté par le test C. difficile AmpliVue de Quidel dans le cadre de cette étude et la limite de détection la plus élevée observée était 15,67 UFC / test.

Souche Toxinotype UFC/test C. difficile AmpliVue

(détecté/total)

ATCC 43255 0 4,2 19/20

CCUG 8864 X 0,7 19/20


CCUG 37770 IV 2,84 3/3

ATCC BAA-1875 V 10,92 3/3

ATCC 43598 VIII 2,13 3/3

ATCC 37774 XXIII 1,52 3/3

CCUG 9004 Inconnu 1,63 3/3

ATCC BAA-1874 0 5,75 3/3

ATCC 43600 0 3,92 3/3

ATCC BAA-1871 0 3,61 3/3


ATCC BAA-1872 0 7,97 3/3

ATCC 700792 0 1,65 3/3

ATCC 43599 0 1,55 3/3

CCUG 60276 Inconnu 15,67 3/3






Souche Toxinotype UFC/test C. difficile AmpliVue

(détecté/total)


ATCC 17857 0 0,72 3/3

ATCC 43594 0 0,54 3/3

ATCC 43596 0 1,27 3/3

Étude de reproductibilité Afin de confirmer la reproductibilité du test C. difficile AmpliVue de Quidel, un panel d'étude randomisé et en aveugle contenant des échantillons négatifs et positifs à Clostridium difficile a été testé sur trois (3) sites de test (deux (2) sites cliniques). Chaque site a testé à trois reprises un panel de reproductibilité et des témoins de test durant cinq (5) jours. Les tests ont été effectués par deux techniciens sur chaque site. Chaque technicien s’est occupé quotidiennement d’un groupe du panel en utilisant un lot de tests C. difficile AmpliVue. Au total, cinq cent quarante (540) échantillons ont été testés (y compris les témoins). Le test C. difficile AmpliVue de Quidel a généré des résultats reproductibles dans cette étude.

Reproductibilité du test AmpliVue C. difficile de Quidel

Catégorie

Site n°1 Site n°2 Site n°3

Pourcentage global d’accord

Intervalle de

confiance de 95 % N

om

bre

de

résu

lta

ts

att

end

us

/ n

om

bre

d

e te

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Acc

ord

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%

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end

us

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om

bre

d

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Acc

ord

en

%

C. difficile négatif haut*

25/30 83% 23/30 77% 24/30 80% 72/90 80% 71-87%

C. difficile positif bas

30/30 100% 29/29 100% 30/30 100% 89/89* 100% 95-100%

C. difficile positif modéré

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Négatif 30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

C. difficile témoin

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

Témoin de test négatif

30/30 100% 30/30 100% 30/30 100% 90/90 100% 95-100%

N° de lot CLIN-005

*REMARQUE: Un (1) échantillon n'était pas valide. Un échantillon « négatif haut / positif bas » est un échantillon dont la concentration est inférieure au seuil clinique. Les tests répétés de cet échantillon sont alors négatifs entre approximativement 20 et 80 % du temps.5


Spécificité analytique - Réactivité croisée et interférence microbienne La spécificité analytique du test C. difficile AmpliVue de Quidel a été évaluée en testant un panel ou groupe composé de soixante six (66) micro-organismes bactériens, viraux ainsi que d’une souche de levure et de l'ADN humain représentant des pathogènes entériques communs, la flore ou l'acide nucléique habituellement présent dans l'intestin. Des micro-organismes ou de l'acide nucléique ont été mélangés avec une matrice négative groupée et testés directement ou en présence de C. difficile à 2 ou 3 fois la limite de détection pour respectivement la réactivité croisée et l'interférence microbienne. Le tableau ci-dessous récapitule les données de ces études. Il n’y a aucune réactivité croisée démontrée, ni aucune interférence entre les éléments du panel et le test C. difficile AmpliVue de Quidel.

ID des organismes Identification

Concentration testée

(UFC/mL ou PFU/mL)

C. difficile Résultats

Réactivité croisée

D’interférence microbienne (Souche 1)


Abiotrophia defectiva*




Aeromonas hydrophila













Clostridium botulinum

Analisi in silico Nessuna reattività crociata in silico rilevata

















(UFC/mL ou PFU/mL)















Clostridium sporogenes

































(UFC/mL ou PFU/mL)







Salmonella enterica, sottospecie Arizonae (precedentemente Choleraesuis arizonae)









Staphylococcus aureus

















DNA genomico umano

Promega G3041 184 µg/ml Negativo Positivo Positivo

*Per testare tali organismi è stato usato acido nucleico purificato. Il numero delle cellule è stato approssimato in base alla concentrazione dell'acido nucleico e delle dimensioni del genoma.


Spécificité analytique – Substances interférentes La performance du test C. difficile AmpliVue de Quidel a été évaluée avec des substances potentiellement interférentes qui peuvent être présentes dans les échantillons de selles. Les substances potentiellement interférentes ont été évaluées en utilisant deux souches de la bactérie C. difficile (ATCC 43255 {toxinotype 0} et CCUG 8864 {toxinotype X}) à une concentration de 2 à 3x la limite de détection (ou LoD). Aucune interférence induite par les substances testées n’a été démontrée.

Nom de la substance Concentration testée

Résultat C. difficile

Nom de la substance Concentration testée

Résultat C. difficile

Nistatina 10.000 USP U/mL

Positivo Esomeprazolo magnesio idrato

0,5 mg/ml Positivo



Cloridrato di fenilefrina

2% w/v Positivo Hamamelis 100% Positivo



12,5 mg/mL Positivo






Cloridrato di loperamide

1 mg/mL Positivo Cloruro di benzalconio 0,12% Positivo

Subsalicilato di bismuto

0,87 mg/mL Positivo Etanolo 10% Positivo




10 mg/mL Positivo





Propagation - Contamination croisée Quatre (4) cycles de vingt-quatre (24) échantillons constitués de douze (12) échantillons négatifs et de douze (12) échantillons hautement positifs C. difficile ont été testés selon un schéma alterné par un total de deux (2) techniciens sur deux (2) lots de tests (les techniciens opérateurs ignoraient les résultats attendus). Tous les échantillons positifs ont été signalés positifs (T2+ / C+) et tous les échantillons négatifs ont été déclarés négatifs (T2 / C+). Aucune contamination par propagation n’a été observée lors de la mise en œuvre du test C. difficile AmpliVue de Quidel conformément aux instructions d'utilisation du produit.

ASSISTANCE CLIENT ET TECHNIQUE Pour passer une commande ou pour obtenir une assistance technique, veuillez contacter un représentant Quidel au (800) 874-1517 (appel gratuit aux États-Unis) ou (858) 552-1100 (en dehors des États-Unis), du lundi


au vendredi, entre 8h00 et 17h00 (heure de l'Est) Les commandes peuvent être passées par fax au (740) 592-9820. Pour toute assistance par courriel, veuillez contacter [email protected] ou [email protected]. Pour tout service à l'extérieur des États-Unis, veuillez contacter votre distributeur local.

Des informations supplémentaires sur Quidel, nos produits et nos distributeurs sont consultables sur notre site Web à l’adresse quidel.com.

PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE Biohelix est une marque déposée de BioHelix Corporation. BioHelix dispose de la propriété intellectuelle englobant la Technologie HDA. AmpliVue est une marque déposée de Quidel Corporation.

RÉFÉRENCES 1. Sloan LM, Duresko BJ, Gustafson DR, and Rosenblatt JE. Comparison of Real-Time PCR for Detection of the

tcdC Gene with Four Toxin Immunoassays and Culture in Diagnosis of Clostridium difficile Infection_J. Clin. Micro. 2008: 46(6):1996–2001.



4. Vincent M, Xu Y, and Kong H. Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification. EMBO 2004: Rep.5: 795-800.

5. Draft Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff – Establishing the Performance Characteristics of In vitro Diagnostic Devices for the Detection of Clostridium difficile, November 29, 2010.

M201 – Kit de test C. difficile AmpliVue

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Quidel Corporation 2005 East State Street, Suite 100 Athens, OH 45701 USA quidel.com PIM201001FR00 (01/16)





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