Entwicklung und Charakterisierung von ... - uni-freiburg.de

Entwicklung und Charakterisierung von

LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikeln

zum siRNA-Transport

INAUGURALDISSERTATION

zur Erlangung der Doktorwürde

der Fakultät für Chemie und Pharmazie

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

vorgelegt von

Carl Martin Gotthardt

aus Kassel

2017

Die vorliegende Dissertationsschrift wurde von April 2013 bis Juni

2017 unter der Anleitung von Frau Prof. Dr. Regine Süss am

Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie des

Instituts für Pharmazeutische Wissenschaften der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg im Breisgau angefertigt.

Dekan: Prof. Dr. Manfred Jung

Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber

Referentin: Prof. Dr. Regine Süss

Korreferent: Prof. Dr. Rolf Schubert

Drittprüfer: Prof. Dr. Norbert Klugbauer

Tag der mündlichen Prüfung: 22.09.2017

Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 26.10.2017

Danksagung

Zuallererst möchte ich mich bei meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Regine Süss und

meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Rolf Schubert für die herzliche Aufnahme in den

Arbeitskreis und die Möglichkeit hier zu promovieren bedanken. Bei Frau Prof. Dr.

Regine Süss bedanke ich mich für das spannende Thema, das mir

entgegengebrachte Vertrauen, die fortwährende Unterstützung sowie die vielen

Anregungen.

Bei Herrn Prof. Schubert bedanke ich mich neben der Übernahme des Korreferats

und der Co-Betreuung für die tollen Weihnachtsfeiern und die schönen Sommerfeste

im „schubertschen“ Garten. An dieser Stelle danke ich auch Frau Schubert für ihre

Gastfreundschaft.

Herrn Prof. Dr. Norbert Klugbauer danke ich für die schnelle und unkomplizierte

Übernahme des Drittprüferamtes.

Meinen Kooperationspartnern der Université de Strasbourg Prof. Dr. Burkhard

Bechinger, Justine Wolf und Christopher (Chris) Aisenbrey danke ich sehr für die

gute und unkomplizierte Zusammenarbeit, die gemeinsamen Diskussionen sowie die

Bereitstellung zahlreicher Peptide mit und ohne Fluoreszenzmarkierung.

Die Kooperation ist eingebettet in die International Research Training Group (IRTG)

Soft Matter Science (SoMaS). Ich möchte an dieser Stelle allen danken, die dieses

trinationale Graduierten Kolleg ins Leben gerufen und unterstützt haben. Ich danke

Herrn Prof. Dr. Günther Reiter für die Leitung und Herrn Prof. Dr. Jörg Baschnagel

für die Co-Leitung des IRTGs. Bei Birgitta Zovko, Melisa Mustafovic, Dr. Jana Husse,

Assiyeah Joers, Pauline Boutin und Alexander (Alex) Link bedanke ich mich sehr

herzlich für die tolle Organisation der „IRTG-Events“. Die Summer Schools in

Mittelwihr waren die schönsten Tage meiner Doktorandenzeit!

Zusätzlich möchte ich mich bei Birgitta Zovko und Dr. Jana Husse für das

entgegengebrachte Verständnis für die Probleme mit Kindern zu promovieren und

die Unterstützung diese abzumildern bedanken.

An dieser Stelle möchte ich auch den Entdeckern des Ibuprofens, einer Gruppe um

Stewart Adams, sowie der Firma Reckitt Benckiser Deutschland GmbH für die

Vermarktung einer Kinderdosierung mit Orangengeschmack danken. Dies hat uns in

mancher Nacht ein paar Stunden Schlaf bewahrt.

Außerdem danke ich dem ganzen Team der Uni Kita Murmelgarten, insbesondere

Malou Beckmann, Jennifer Beck, Anna Tsirtsos, Mila Dzhuranova, Sandrina

Böhringer und Celina Lebtig für die gute und qualifizierte Betreuung meiner Tochter.

Der Leiterin Frau Papst möchte ich für die gute Führung der Kita auch in schwierigen

Zeiten danken. In diesem Zuge danke ich auch unseren Babysitterinnen Michelle

Schwarz und Mila Dzhuranova, ohne die ich an vielen Veranstaltungen nicht hätte

teilnehmen können.

Dem IRTG SoMaS danke ich zusätzlich für die finanzielle Unterstützung dieser

Arbeit, sowie der Lipoid GmbH für die kostenlose Belieferung mit Phospholipiden.

Ganz besonders danke ich Frau Birgit Erhard und Frau Dr. Monika Köll-Weber für

ihren unermüdlichen Einsatz das Labor in einem entropiearmen Zustand zu halten.

Bei Frau Birgit Erhard bedanke ich mich außerdem für die gute Einführung in die

Zellkultur sowie die Blutentnahmen. Für eine weitere Blutentnahme für diese Arbeit

bedanke ich mich bei dem Team der Praxis „Hausärzte am Bertoldsbrunnen“. Bei

meiner Vorgängerin Dr. Doris Zimmer bedanke ich mich für die Einführung in die

Welt der siRNA.

Ein weiterer besonderer Dank gilt Sabine Barnert für die Anfertigung der Cryo-TEM-

Bilder, die Hilfe bei der Interpretation der Aufnahmen und ihr Dasein als „Guter Geist“

der Arbeitsgruppe.

Bei Nicole Specht möchte ich mich für die Durchführung von Bartlett-Assays

bedanken. Vielen Dank an Irmgard (Ima) Ohlhoff, Eva Dengler und Katrin Kiefer für

zahlreiche Bestellungen. Ein herzliches Dankeschön gilt zudem Nuria Beltrán-

Sanchez für ihr freundliches Wesen, ihre aufmunternden Worte und ihren

unermüdlichen Einsatz im „Papierkrieg“.

Herrn Dr. Martin Holzer danke ich sowohl für die wissenschaftlichen als auch für die

privaten Diskussionen und die Unterstützung mit Babysachen.

Außerdem danke ich Dr. Martin Holzer und Dr. Ali Al Raghban für ihren Einsatz bei

der Organisation und Durchführung der Studentenpraktika, wodurch wir Doktoranden

entlastet worden sind.

Bei Dr. Louma Kalie und Dr. Ali Al Raghban bedanke ich mich zusätzlich für die

Vorbildfunktion, mit Kind promovieren zu können, und für die leckeren

fremdländischen Speisen zu verschiedenen Feierlichkeiten

Ein weiterer herzlicher Dank gilt Frau Dr. Aenne Geyer und Frau Dr. Marie Follo

(Universitätsklinikum Freiburg, Lighthouse Core Facility, Zentrum für Translationale

Zellforschung) für die Unterstützung bei der Erstellung und Auswertung der

konfokalen fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen.

Bei meinem Freund Miró Jungklaus sowie den „Medizinern vom Spielplatz“ bedanke

ich mich für die Diskussion der Hämolyse-Ergebnisse.

Ich bedanke mich bei „meinen“ ehemaligen Studenten Christina Maucher, Isabelle

Fix, Valentin Schoop, Mona Bühler, Carmen Bohlinger, Valerie Stopper, Sonja Fros,

Luise Hilfert und Fatimah Imam für ihre engagierte Mitarbeit und Weiterführung des

Projektes im Rahmen unterschiedlicher Praktika / Arbeiten.

Bei unserer gemeinsamen Laufgruppe Kathrin Züfle, Dr. Constantin Hozsa, Kiran

Telukunta, Stephan Flemming und Nan Liu bedanke ich mich für die gemeinsamen

Runden um den Schlossberg.

Herrn Dr. Constantin Hozsa danke ich außerdem für die fachlichen und nicht

fachlichen Gespräche und für das Korrekturlesen meiner Abstracts.

Bei Nan Liu bedanke ich mich für die Fortführung des Laufens im kleinen Rahmen an

der Dreisam. Des Weiteren danke ich Dir für die gemeinsame Zeit im Büro, im Labor

und abseits von der Arbeit. Es ist schön einen Freund wie dich gefunden zu haben!

Bei Dr. Aenne Geyer, Dr. Monika Köll-Weber, Maximilian (Max) Wittmann, und

Michael Walter bedanke ich mich für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Ich danke allen weiteren ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Arbeitsgruppe für

die gemeinsame Zeit: Gesche Först, Ines Müller, Manuel Weis, Felicitas Lewrick,

Judith Jakoby, Marcus Wüller, Michael Keller, Daniel Molnar, Christoph Grapentin,

Shila Gurung, Manuel Weinheimer, Stefan Braun, Hannah Deibel, Melanie Kolter,

Daniel Eckhardt, Stefan Bleher, Wolfgang Krämer, Maria Hoernke, Anja Stulz, Carina

Zorzin, Heiko Heerklotz, Anja Stulz, Marie Markones, Lisa Dietel, Johannes Schnur

und Friederike Hartwig.

Ich danke allen von euch, die bei meinem Umzug mitgeholfen haben (in Erinnerung

an die legendäre „Kisten-Kette“) und vor allem Stefan (Stebbo) Müller, der sehr viel

mitorganisiert hat.

Mein größter Dank gilt meiner Familie! Meinen Eltern, Geschwistern und meiner

Frau, die mich auf diesem langen Weg immer unterstützt haben. Meiner Frau danke

ich außerdem dafür, dass sie sich so oft alleine um unsere Kinder gekümmert hat.

Vielen Dank für eure großartige Unterstützung und Liebe <3

Für meine Familie

„Orbis sine liberis nullum futurum habet“, Baron Silvian

Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht

Posterpräsentationen

Martin Gotthardt, Burkhard Bechinger, Regine Süss

siRNA delivery by means of LAH4-L1 peptide

Tag der Forschung, Fakultät für Chemie und Pharmazie, Freiburg, Juli 2014

Martin Gotthardt, Burkhard Bechinger, Regine Süss

Modification and characterization of siRNA-LAH4-L1-peptide-particles

CRS Meeting 2015 German Chapter, Muttenz, Schweiz, Februar 2015

Martin Gotthardt, Valentin Schoop, Burkhard Bechinger, Regine Süss

Uptake and gene knockdown studies of LAH4-L1-peptide-protamine-siRNA-particles

Tag der Forschung, Fakultät für Chemie und Pharmazie, Freiburg, Juli 2015


Development and storage investigations of LAH4-L1-peptide-protamine-siRNA-

particles

5th SoMaS School, Annual Summer School, Mittelwihr, France, Juli 2015


Long term storage and serum tolerance investigations of LAH4-L1-peptide-

protamine-siRNA-particles (PPR-particles)


Martin Gotthardt, Valentin Schoop, Justine Wolf, Christopher Aisenbrey, Burkhard

Bechinger, Regine Süss

Investigation on siRNA release mechanism of LAH4-L1-peptide-protamine-siRNA-

particles (PPR-particles) and the trail of active targeting


Vorträge


Development, characterization and first in vitro tests of peptide-protamine-based-

siRNA-particles (PPR-particles)

12th Pharmacy-Workshop, Oberjoch (Allgäu), März 2015


Entwicklung eines “cell-penetrating-peptide” basierten Drug Delivery Systems für

eine Modell-siRNA

Förderverein für Arzneimittelforschung (FAF), Jahrestreffen, Freiburg, März 2016


Development of a cell-penetrating-peptide-based drug delivery system for siRNA

IRTG SoMaS Spring Workshop, Freiburg, Mai 2016

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................... 1

1.1 Gentherapie ...................................................................... 1

1.2 RNA-Interferenz ................................................................ 1

1.2.1 Small interfering RNA (siRNA) ........................................... 2

1.2.2 Mechanismus der RNAi ..................................................... 2

1.2.3 Hürden für die zelluläre siRNA-Aufnahme .......................... 3

1.3 Trägersysteme für siRNA ................................................ 4

1.3.1 Das LAH4-L1-Peptid .......................................................... 6

1.3.2 Protamin ............................................................................ 10

1.3.3 Lipid-basierter siRNA-Transport ......................................... 10

1.3.3.1 Liposom-Protamin-Hyaluronsäure Nanopartikel (LPH-NP)................ 10

1.3.3.2 Oberflächenmodifikation mittels postinsertions-Technik .................... 11

1.4 Verwendete Zelllinien ...................................................... 12

1.4.1 RH-30 Zellen ...................................................................... 12

1.4.2 HeLa Zellen ....................................................................... 13

1.5 Reportergene.................................................................... 13

1.5.1 Luciferase .......................................................................... 13

1.5.2 GFP (green fluorescent protein) ......................................... 14

1.6 Integrin-Rezeptor Targeting ............................................ 15

1.7 Ziel dieser Arbeit .............................................................. 17

II Inhaltsverzeichnis

2 Material und Geräte ............................................... 18

2.1 Materialien ........................................................................ 18

2.1.1 Nukleinsäuren und Peptide ................................................ 18

2.1.2 Chemikalien und Reagenzien ............................................ 19

2.1.3 Zelllinien ............................................................................. 24

2.1.4 Verbrauchsmaterial ............................................................ 24

2.2 Geräte ............................................................................... 26

3 Methoden ............................................................... 29

3.1 RNase-freies Arbeiten ...................................................... 29

3.2 Herstellung von siRNA-Trägersystemen ........................ 29

3.2.1 Herstellung der benötigten Stammlösungen....................... 29

3.2.2 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln .............. 29

3.2.3 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-

siRNA-Partikeln .................................................................. 30

3.2.4 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-

Partikeln (PPR-Partikel) ..................................................... 30

3.2.5 Lyophilisierung von PPR-Partikeln ..................................... 30

3.2.6 Lagerung von PPR-Partikeln .............................................. 31

3.2.7 Modifizierte PPR-Partikel ................................................... 31

3.2.7.1 RGD-modifizierte PPR-Partikel .......................................................... 31

3.2.7.2 RGD-Lipid-modifizierte PPR-Partikel ................................................. 32

3.2.7.2.1 Liposomenherstellung........................................................................ 32

3.2.7.2.2 Lipid-modifizierte PPR-Partikel .......................................................... 32

3.2.7.2.3 RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel ...................................... 33

Inhaltsverzeichnis III

3.3 Analytik von siRNA-Trägersystemen und Liposomen .. 34

3.3.1 Photonenkorrelationsspektroskopie ................................... 34

3.3.2 Zetapotential ...................................................................... 34

3.3.3 Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie ........................ 34

3.3.4 Bartlett-Assay..................................................................... 35

3.3.5 Komplexierung von siRNA in PPR-Partikeln ...................... 36

3.3.6 Bestimmung der Serumstabilität von PPR-Partikeln........... 36

3.3.7 Bestimmung der Assoziationseffizienz (AE) ....................... 37

3.3.8 Fluorimetrie ........................................................................ 37

3.4 Zellversuche ..................................................................... 38

3.4.1 Kultivierung der Zellen ....................................................... 38

3.4.2 Durchflusszytometrie.......................................................... 38

3.4.2.1 Bestimmung der zellulären Assoziation und Aufnahme ..................... 38

3.4.2.2 Bestimmung des Gen-Knockdowns ................................................... 40

3.4.2.3 Bestimmung der zellulären Assoziation und Aufnahme sowie

des Gen-Knockdowns unter Anwesenheit von Bafilomycin A1 .......... 41

3.4.3 Untersuchungen zur Freisetzung aus dem Träger-

system mittels Molecular Beacons ..................................... 42

3.4.3.1 Aufnahme von Kalibrierfunktionen ..................................................... 43

3.4.3.2 Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Assoziation und Auf-

nahme sowie der endosomalen Freisetzung von PPR-Partikeln ....... 44

3.4.4 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie .................................... 45

3.4.5 Resazurin-Assay ................................................................ 46

3.4.5.1 Etablierung des Resazurin-Assays .................................................... 47

3.4.5.2 Bestimmung der Zellviabilität ............................................................. 47

3.4.6 Hämolyse-Assay ................................................................ 48

3.4.6.1 Herstellung der benötigten Lösungen ................................................ 48

3.4.6.2 Lyse-Assay ........................................................................................ 49

3.5 Statistik ............................................................................. 50

IV Inhaltsverzeichnis

4 Ergebnisse und Diskussion ................................. 51

4.1 Vergleich von LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln mit

LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-Partikeln in

unterschiedlichen Puffersystemen ................................. 51

4.2 Entwicklung von PPR-Partikeln ...................................... 53

4.2.1 Formierung von Protamin-siRNA-Komplexen ..................... 53

4.2.2 Bildung von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikeln

(PPR-Partikel) .................................................................... 55

4.2.3 Testung von PPR-Partikeln auf ihre Gen-Knockdown-

Effizienz ............................................................................. 56

4.3 Lagerung von PPR-Partikeln ........................................... 57

4.3.1 Untersuchung der kurzfristigen Lagerstabilität ................... 57

4.3.1.1 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei Raumtemperatur............... 58

4.3.1.2 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei -20 °C ± 5 °C .................... 59

4.3.1.3 Größenentwicklung der lyophilisierten PPR-Partikel ......................... 60

4.3.1.4 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei 5 °C ± 3 °C ....................... 62

4.3.1.5 Testung der Gen-Knockdown-Effizienz von gelagerten PPR-

Partikeln ............................................................................................. 62

4.3.2 Untersuchungen zur langfristigen Lagerstabilität ................ 65

4.3.2.1 Entwicklung der Partikelgröße im Verlauf eines Jahres ..................... 65

4.3.2.2 Gen-Knockdown-Effizienz im Verlauf eines Jahres ........................... 66

4.4 Charakterisierung von PPR-Partikeln ............................. 67

4.4.1 Komplexbildung ................................................................. 67

4.4.2 Assoziationseffizienz (AE) .................................................. 68

4.4.3 Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie ...................... 69

Inhaltsverzeichnis V

4.4.4 Gen-Knockdown-Effizienz von PPR-Partikeln im

Vergleich zu Kontrollen ...................................................... 70

4.4.4.1 Negativkontrollen ............................................................................... 70

4.4.4.2 Positivkontrolle .................................................................................. 72

4.4.5 Dosis-Wirkungskurve ......................................................... 73

4.4.6 Untersuchungen zur Zellviabilität ....................................... 75

4.4.6.1 Etablierung des Resazurin-Assays .................................................... 75

4.4.6.2 Bestimmung der Zellviabilität ............................................................. 77

4.4.7 Versuche unter hohen Serumkonzentrationen ................... 78

4.4.7.1 Stabilität der siRNA gegen Fetales Kälberserum ............................... 78

4.4.7.2 Serumabhängigkeit des Gen-Knockdowns ........................................ 80

4.4.8 Hämolyse ........................................................................... 81

4.5 Intrazellulärer Verbleib von PPR-Partikeln ..................... 84

4.5.1 Zelluläre Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln .... 84

4.5.1.1 Durchflusszytometrische Bestimmung der zellulären

Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln .................................. 84

4.5.1.2 Konfokal mikroskopische Bestimmung der zellulären

Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln .................................. 86

4.5.2 Versuche zur endosomalen Freisetzung ............................ 88

4.5.2.1 Hämolyse-Versuche zur endosomalen Freisetzung .......................... 88

4.5.2.2 Gen-Knockdown-Versuche mit Bafilomycin A1 ................................. 89

4.5.3 Untersuchungen zur Freisetzung ins Zytosol mittels

Molecular Beacons ............................................................ 90

4.5.3.1 Kalibrierung ....................................................................................... 91

4.5.3.2 Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf der Aufnahme und

Freisetzung ........................................................................................ 93

VI Inhaltsverzeichnis

4.5.4 Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-

Peptiden ............................................................................. 96

4.5.4.1 Untersuchungen zum Einfluss der fluoreszenzmarkierten

LAH4-L1-Peptide auf die zelluläre Assoziation und Aufnahme

von PPR-Partikeln ............................................................................. 97

4.5.4.2 Knockdown-Effizienz der fluoreszenzmarkierten

LAH4-L1-Peptide ............................................................................... 102

4.5.4.3 Konfokale Mikroskopie mit fluoreszenzmarkierten

LAH4-L1-Peptiden ............................................................................. 105

4.5.5 Durchflusszytometrischer siRNA-Freisetzungsversuch

unter Ausnutzung eines FRET-Effektes zwischen

AF 488 und ROX ................................................................ 108

4.6 Spezifität und aktives Targeting ..................................... 110

4.6.1 Überprüfung der Spezifität von PPR-Partikeln ................... 110

4.6.2 RGD-modifizierte PPR-Partikel .......................................... 111

4.6.3 Lipid-modifizierte PPR-Partikel ........................................... 115

4.6.3.1 Herstellung und Analytik der Liposomen ........................................... 115

4.6.3.2 Herstellung und Analytik der L-PPR-Partikel ..................................... 116

4.6.3.3 Zelluläre Assoziation und Aufnahme von L-PPR-Partikeln ................ 119

4.6.3.4 RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel ...................................... 121

5 Zusammenfassung und Ausblick ........................ 125

6 Abkürzungsverzeichnis ........................................ 130

7 Literaturverzeichnis .............................................. 134

Inhaltsverzeichnis VII

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Gentherapie

In der Medizin wird das Einfügen von Nukleinsäuren wie DNA und RNA in Zellen

oder Gewebe als Gentherapie bezeichnet. Ziel ist die Genregulation: Um defekte

Gene zu ersetzen, können DNA oder mRNA (messenger RNA) in Zielzellen

eingeschleust werden (Naldini 2015; Antony et al. 2015). Zur Herunterregulation von

Genen (Gen-Knockdown) können siRNAs (small interfering RNAs), shRNAs (short

hairpin RNAs) sowie miRNAs (microRNAs) verwendet werden (Kim & Rossi 2007;

Kim et al. 2009; Grimm 2009; Wang et al. 2011). Im Fokus dieser Arbeit steht die

Herunterregulation von Genen mittels siRNA durch RNA-Interferenz (RNAi).

1.2 RNA-Interferenz

Die RNAi (RNA-Interferenz) ist ein hochkonservierter Mechanismus eukaryotischer

Zellen zur Herunterregulierung von Genen auf dem Level der mRNA und ist erstmals

1998 von Fire et al. beschrieben worden: Das Einbringen einer 742 Nukleotide

langen, doppelsträngigen RNA (dsRNA) in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

hat zur selektiven und effizienten Herunterregulation einer komplementären mRNA

und somit zur entsprechenden Genregulation geführt (Fire et al. 1998). Für diese

Entdeckung haben Andrew Z. Fire und Craig C. Mello 2006 den Nobelpreis für

Medizin erhalten.

Entwicklungsbiologisch wird die RNAi zur Stilllegung von Genen genutzt. Dies ist

insbesondere für den Übergang von einem Entwicklungsstadium in das nächste

relevant (Lee et al. 1993; Reinhart et al. 2000; Grishok et al. 2001; Pasquinelli &

Ruvkun 2002). Außerdem ist die RNAi ein Bestandteil der Immunantwort, durch die

z.B. eingeschleuste virale RNA abgebaut werden soll (Dykxhoorn & Lieberman

2005).

Der spezifische Gen-Knockdown durch RNAi stellt sowohl für die Erforschung von

Genfunktionen als auch für die Behandlung von bisher nicht oder nur schlecht

therapierbaren Erkrankungen ein großes Potential dar. Im Prinzip kann jede

beliebige mRNA, deren Sequenz bekannt ist, mittels RNAi herunterreguliert werden.

2 Einleitung

1.2.1 Small interfering RNA (siRNA)

Im Jahre 2001 ist zum ersten Mal gezeigt worden, dass dsRNA mit einer Länge von

21 bis 22 Nukleotiden in Säugetierzelllinien RNAi auslösen kann (Elbashir et al.

2001). Die als small interfering RNA (siRNA) bezeichnete RNA ist doppelsträngig und

hat eine Länge von 21 bis 25 Nukleotiden. An den 3`-Enden der beiden Stränge

befinden sich Überhänge von zwei bis drei Nukleotiden. Diese sind sowohl für die

Stabilität der siRNA als auch für die Induktion der RNAi von Bedeutung (Dykxhoorn &

Lieberman 2005; Kim & Rossi 2007).

1.2.2 Mechanismus der RNAi

Abbildung 1-1: Mechanismus der RNA-Interferenz

Schematische Darstellung der RNA-Interferenz (Kanasty et al. 2013)

In Abbildung 1-1 ist der Ablauf der RNAi schematisch gezeigt: Mit einer längeren

dsRNA startet der Prozess der RNAi. Aus der dsRNA wird durch die Endonuklease

Dicer eine 21 bis 23 Nukleotide lange siRNA mit symmetrischen Überhängen an den

3´-Enden synthetisiert, sie wird als siRNA bezeichnet (vgl. 1.2.1). Die siRNA wird in

Einleitung 3

den RNA-induced-silencing-complex (RISC) aufgenommen. Durch die Endonuklease

Argonaut-2, die Bestandteil des RISC ist, wird die siRNA in passenger (sense) und

guide (antisense) Strang gespalten. Der sense Strang wird abgebaut, wohingegen

der antisense Strang im RISC verbleibt. Hieran wird eine mRNA mit komplementärer

Sequenz gebunden und abgebaut. Die Schritte der mRNA-Erkennung, -Bindung und

des mRNA-Abbaus werden wiederholt. Hieraus resultiert ein überstöchiometrischer

Abbau der mRNA. Dementsprechend wird die Translation und somit die

Proteinbiosynthese reduziert (Tuschl et al. 1999; Grishok et al. 2001; Kim et al. 2005;

Kanasty et al. 2013).

Auch wenn die siRNA-induzierte RNAi als sehr spezifisch gilt, kann exogen

zugeführte siRNA unerwünschte Effekte hervorrufen: Zum einen kann siRNA an Toll-

like Rezeptoren binden und dadurch eine Immunantwort hervorrufen. Zum anderen

können durch Sequenzhomologie andere mRNAs ebenfalls abgebaut werden. Dies

wird als off-target Effekt bezeichnet (Hornung et al. 2005; Dykxhoorn & Lieberman

2005; Rao et al. 2009; Wang et al. 2011).

1.2.3 Hürden für die zelluläre siRNA-Aufnahme

Damit synthetische siRNA die RNAi induzieren kann, muss sie zunächst zellulär

aufgenommen werden. Hierfür sind mehrere Hürden zu überwinden:

Durch das relativ hohe Molekulargewicht von ca. 13 kDa sowie die starke negative

Ladung ist freie siRNA nicht membranpermeabel (Akhtar & Benter 2007). Für

manche Zelllinien ist jedoch eine geringfügige, Caveolae-vermittelte Aufnahme von

siRNA beschrieben (Detzer et al. 2008). Weitere Probleme in der Anwendbarkeit von

siRNA sind der rapide enzymatische Abbau durch RNasen sowie die schnelle renale

Elimination (van de Water et al. 2006; Urakami & Oku 2007). Folglich werden

Transportsysteme für siRNA verwendet, die die siRNA vor enzymatischen Abbau

schützen und über 10 nm groß sind, um nicht über die Niere ausgeschieden zu

werden (Huang & Liu 2011).

Die meisten Trägersysteme befinden sich nach der zellulären Aufnahme zunächst in

endosomalen Kompartimenten. Damit die siRNA ihre Wirkung entfalten kann, muss

zum einen eine Freisetzung aus dem Endosom (endosomal escape) und zum

anderen eine Freisetzung aus dem Trägersystem stattfinden. Hierfür ist eine

4 Einleitung

reversible Bindung zwischen siRNA und Transportsystem notwendig (Urakami & Oku

2007; Huang & Liu 2011).

1.3 Trägersysteme für siRNA

In der Gentherapie kann zwischen viralen und nicht-viralen Systemen unterschieden

werden. Virale Systeme zeichnen sich durch ihre hohe Transfektionseffizienz aus.

Sie können z.B. DNA in Zielzellen einbringen, die siRNA oder Vorstufen dieser

codieren. Allerdings stehen der hohen Transfektionseffizienz Sicherheitsbedenken

gegenüber: Immunogenität und unerwartete Veränderungen in der Genexpression

durch eine Integration der viralen DNA in das Genom der Zielzellen behindern die

klinische Anwendung (Sui et al. 2002; Ong et al. 2005; Urakami & Oku 2007; Akhtar

& Benter 2007).

Im Rahmen dieser Arbeit wird ein nicht-virales Transportsystem für siRNA entwickelt.

Die Hauptkomponenten sind in Tabelle 1-1 aufgeführt. Nicht-virale Transportsysteme

gelten im Vergleich zu viralen Systemen als relativ sicher und leicht zu

synthetisieren. Eine geringere Transfektionseffizienz sowie eine höhere Zytotoxizität

sind die Hauptnachteile nicht-viraler Transportsysteme (Yin et al. 2014).

Einleitung 5

Tabelle 1-1: Übersicht über die Hauptkomponenten bzw. Strukturelemente von

siRNA-Transfektionssystemen und deren Verwendung

Komponente /

Strukturmerkmal Verwendung

siRNA

Herunterregulation der Proteinbiosynthese; Einsatz einer

anti-eGFP-siRNA, um eGFP herunter zu regulieren (Kapitel

1.2.1 und 1.2.2; Elbashir et al. 2001)

Protamin

Kondensation von siRNA in eine nanopartikuläre Form

(Kapitel 1.3.2; Li & Huang 2006a; Kundu et al. 2012; Ki et

al. 2014; Powell et al. 2017)

Hyaluronsäure Verbesserung der Kondensation von siRNA mit

Polykationen (Kapitel 1.3.3.1; Chono et al. 2008)

LAH4-L1

Kondensation von Nukleinsäuren in eine nanopartikuläre

Form und Einschleusung in Zellen (Kapitel 1.3.1; Prongidi-

Fix et al. 2007; Langlet-Bertin et al. 2010)

PEG

(Polyethylenglykol)

Eine PEGylierung führt zur sterischen Stabilisierung und

Maskierung von Nanopartikeln gegenüber Teilen des

Immunsystems, wodurch die Blutzirkulationszeit verlängert

wird. Moleküle am Ende der PEG-Kette können zur

gezielten Ansteuerung bestimmter Zellen genutzt werden

(Kapitel 1.3.3.1 und 1.3.3.2; Allen et al. 1991; Maruyama et

al. 1992; Torchilin 2005)

RGD

(Arg-Gly-Asp)

Tripeptidsequenz zur gezielten Ansteuerung von Integrin-

Rezeptoren (Kapitel 1.6; Ruoslahti 1996; Hynes 2002)

6 Einleitung

1.3.1 Das LAH4-L1-Peptid

Das LAH4-L1-Peptid ist ein 26 Aminosäuren langes, amphiphiles, kationisches

Peptid aus der LAH4-Peptid-Familie. Die Peptide aus der LAH4-Familie besitzen zum

einen antimikrobielle Eigenschaften, zum anderen sind sie in der Lage,

Nukleinsäuren wie DNA und siRNA zu binden und in Zellen einzuschleusen (Vogt &

Bechinger 1999; Kichler et al. 2003; Kichler et al. 2006; Mason et al. 2006; Mason et

al. 2007; Kichler et al. 2007; Prongidi-Fix et al. 2007; Langlet-Bertin et al. 2010;

Bechinger et al. 2011).

Die Primärstruktur von LAH4-L1 (KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA) führt zu einer

amphipathischen Helix (Abb. 1-2), wenn das Peptid an Nukleinsäuren oder

Membranen assoziiert vorliegt (Kichler et al. 2006; Mason et al. 2007; Prongidi-Fix et

al. 2007; Kichler et al. 2013). Die vier Lysin-Reste (K) liegen bei einem

physiologischen pH-Wert von 7,4 protoniert vor. Sie sind für die elektrostatische

Wechselwirkung mit den Nukleinsäuren über deren negativ geladenen

Phosphatreste verantwortlich. Da zwei Lysin-Reste am Anfang und zwei am Ende

des Peptids sind, kann LAH4-L1 entfernte Molekülbereiche der Nukleinsäuren

zusammenführen oder zwei Nukleinsäuremoleküle miteinander verknüpfen. Dies

führt zur Kondensation der Nukleinsäuren (Prongidi-Fix et al. 2007; Bechinger et al.

2011).

Neben den vier Lysin-Resten besteht LAH4-L1 vor allem aus Leucin (L) und Alanin

(A). Diese beiden Aminosäuren bilden den hydrophoben Teil von LAH4-L1, der für

Membraninteraktionen relevant ist. Für den Transport und die intrazelluläre

Freisetzung von Nukleinsäuren sind vier Histidin-Reste (H) essentiell (Mason et al.

2007; Prongidi-Fix et al. 2007). Die pKa-Werte der Imidazol-Gruppen betragen 5,4;

5,8; 5,9 und 6,0 (Bechinger 1996; Kichler et al. 2007). Somit liegen sie bei

physiologischen pH überwiegend unprotoniert vor.

Einleitung 7

Abbildung 1-2: Dreidimensionales Modell von LAH4-L1

Im dreidimensionalen Modell sind die Positionen der Histidin-Reste angezeigt. LAH4-L1 liegt

in dieser α-Helix Konformation vor, wenn es an Nukleinsäuren oder Membranen gebunden

ist (Kichler et al. 2013).

LAH4/DNA-Komplexe werden von Zellen durch Endozytose aufgenommen. Im

Verlauf der endosomalen Reifung sinkt der pH-Wert in den endosomalen

Kompartimenten und die Imidazol-Gruppen der LAH4-Peptide werden protoniert.

Hierdurch sind weniger LAH4-Peptide notwendig, um die negative Ladung der

Nukleinsäure zu kompensieren, und es kommt zur Freisetzung von LAH4-Peptid aus

dem Transfektionskomplex. Diese freien LAH4-Peptide können dann mit der

Endosomenmembran interagieren, was zur endosomalen Freisetzung der

Nukleinsäure führt (endosomal escape; Abb. 1-3; Prongidi-Fix et al. 2007).

8 Einleitung

Abbildung 1-3: Transfektionsmechanismus von LAH4/DNA-Komplexen

Nach der Endozytose von LAH4/DNA-Komplexen kommt es zur endosomalen Reifung. Der

pH-Wert im Endosom sinkt, LAH4-Peptide werden aus dem Transfektionskomplex

freigesetzt und interagieren mit der Endosomenmembran. Dies führt zur Freisetzung aus

dem Endosom (modifiziert nach Prongidi-Fix et al. 2007).

Ein zweiter Mechanismus der endosomalen Freisetzung wird durch den puffernden

Effekt der Histidin-Reste bedingt und wird als proton sponge effect bezeichnet (Abb.

1-4): Während der endosomalen Reifung werden Protonen in das Endosom

gepumpt. Diese werden durch die Imidazol-Gruppen abgepuffert. Es werden weitere

Protonen in das Endosom gepumpt, um den pH-Wert abzusenken. Dies ist auf Grund

der Ladung mit dem Einstrom von Chlorid-Ionen verbunden. Hierdurch wird ein

osmotischer Wassereinstrom ausgelöst. Dies führt zum Quellen und letztendlich zum

Platzen der Endosomen (Chou et al. 2011).

Endozytose von LAH4/DNA-Komplexen

Azidifizierung des Endosoms

Freisetzung von LAH4 aus dem Transfektionskomplex

und Interaktion mit der Endosomenmembran

Endosomale Freisetzung

Einleitung 9

Abbildung 1-4: Schematische Darstellung des proton sponge effect

Während der endosomalen Reifung werden Protonen in das Endosom gepumpt.

Nanopartikel puffern diese Protonen ab. Zusätzlich gelangen Chlorid-Ionen und Wasser ins

Endosom. Dies führt zum Quellen und Aufplatzen des Endosoms, wodurch die Nanopartikel

freigesetzt werden (modifiziert nach Chou et al. 2011).

Diese beiden Mechanismen für die endosomale Freisetzung sind mit LAH4/DNA-

Komplexen untersucht worden. Für LAH4-L1 wird der gleiche Wirkungsmechanismus

angenommen (Langlet-Bertin et al. 2010).

Im Rahmen dieser Arbeit wird LAH4-L1 verwendet, um siRNA in eine nanopartikuläre

Form zu kondensieren und möglichst effizient in Zellen einzuschleusen.

Nanopartikel

ATPasen

10 Einleitung

1.3.2 Protamin

Protamin ist ein Stoffgemisch aus stark basischen Peptiden, die zu mehr als zwei

Dritteln aus L-Arginin bestehen. Protamin wird vorwiegend aus dem Sperma

bestimmter Lachsarten isoliert. Es wird u.a. als pharmazeutischer Hilfsstoff zur

Retardierung des Wirkungseintrittes von Insulin im NPH-Insulin (neutrales Protamin

Hagedorn-Insulin) genutzt (von http://flexikon.doccheck.com/de/Protamin, zuletzt

aufgerufen am 19.07.2017).

In der Literatur ist umfangreich beschrieben, dass siRNA mit Protamin in

nanopartikuläre Form kondensiert werden kann. Diese Protamin-siRNA-Partikel

können im Folgenden mit weiteren Substanzen modifiziert werden (Li & Huang

2006a; Kundu et al. 2012; Ki et al. 2014; Powell et al. 2017).

Im Rahmen dieser Arbeit wird das wasserlösliche Protaminsulfat verwendet, um

siRNA zu Protamin-siRNA-Partikeln zu kondensieren. Diese Protamin-siRNA-Partikel

werden anschließend mit dem LAH4-L1-Peptid modifiziert.

1.3.3 Lipid-basierter siRNA-Transport

Der Lipid-basierte siRNA-Transport ist von den nicht-viralen Transportmechanismen

der Gentherapie am umfangreichsten untersucht. Hierfür stehen Liposomen,

Lipoplexe und andere nanopartikuläre Systeme mit einem siRNA-Kern sowie einer

Lipidhülle zur Verfügung. Auch das kommerziell erhältliche Transfektionsreagenz

Lipofectamine® ist Lipid-basiert. Die eingesetzten Lipide sind hauptsächlich

kationisch, jedoch sind auch Untersuchungen mit anionischen und neutralen Lipiden

beschrieben (Li & Huang 2006a; Hirsch et al. 2009; Striepe 2010; Akbarzadeh et al.

2013; Zimmer 2013; Zhang et al. 2014).

1.3.3.1 Liposom-Protamin-Hyaluronsäure Nanopartikel (LPH-NP)

Liposom-Protamin-Hyaluronsäure Nanopartikel (LPH-NP) stellen eine erfolgreiche

Variante des Lipid-basierten siRNA-Transportes dar. Sie sind aus einem Kern aus

siRNA, Hyaluronsäure und Protamin sowie einer Lipidmembran aufgebaut (Abb. 1-5).

Die Lipidmembran ist PEGyliert und trägt zusätzliche Liganden, um Zielzellen

spezifisch anzusteuern (Chono et al. 2008).

Einleitung 11

Abbildung 1-5: Schematische Darstellung von LPH-NP

Hyaluronsäure, siRNA und ein Polykation, z.B. Protamin, bilden einen Kern, der von einer

Lipidmembran umgeben ist. Die Lipidmembran kann PEGyliert sein und zusätzliche

Liganden tragen (modifiziert nach Zhao et al. 2016).

Im Rahmen dieser Arbeit wird untersucht, ob mit dem LAH4-L1-Peptid ebenfalls

stabile siRNA-Partikel gebildet werden können, die in Analogie zu den LPH-NP mit

Lipiden modifizierbar sind. Dafür werden die negativ geladenen Phospholipide 1,2-

Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphat (DOPA), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin

(DOPS) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (DOPG) verwendet.

1.3.3.2 Oberflächenmodifikation mittels postinsertions-Technik

Mit Hilfe der postinsertions-Technik (PIT) ist es möglich, PEGylierte Phospholipide in

präformulierte Liposomen einzulagern. Über reaktive Gruppen am Ende der PEG-

Kette können Liganden gekoppelt werden (Uster et al. 1996; Ishida et al. 1999).

Hieraus ergibt sich ein typischer, dreigeteilter Aufbau dieser Moleküle: Zwei lipophile

Fettsäuren dienen als Membrananker, ein Spacer aus einer hydrophilen PEG-Kette

sorgt für die PEGylierung der Liposomen und an eine reaktive Gruppe können

Liganden für eine zielgerichtete Aufnahme in bestimmte Zellen gebunden werden.

Substanzen mit diesem Aufbau werden auch als Ankermoleküle bezeichnet (Abb. 1-

6).

Hyaluronsäure

siRNA

Polykation

DSPE-PEG-Ligand

DSPE-PEG

Lipidmembran

12 Einleitung

Abbildung 1-6: DSPE-PEG2000-Mal

Das Ankermolekül DSPE-PEG2000-Mal ist dreigeteilt aufgebaut: DSPE ist lipophil und somit

für die Verankerung in der Membran verantwortlich, PEG ist hydrophil und dient als Spacer,

Maleinimid (Mal) ist eine reaktive Gruppe, die mit SH-Gruppen reagieren kann (von

https://avantilipids.com/product/880126/, zuletzt aufgerufen am 02.06.2017).

Nach der Kopplung des Liganden an das Ankermolekül wird dieses bei der PIT für

eine Stunde bei 60 °C in die äußere Lipidschicht der Liposomen eingelagert. Ein

möglicher Effekt der hohen Temperatur auf den Liganden und dessen

Bindungsaffinität müssen hierbei bedacht werden (Ishida et al. 1999). Bei den LPH-

NP von Chono et al. (2008) erfolgt die PIT für 10 Minuten bei 50 °C (Chono et al.

2008). Für eine effiziente Einlagerung soll die Temperatur oberhalb der

Phasenübergangstemperatur liegen (Ishida et al. 1999).

Im Rahmen dieser Arbeit wird ein DSPE-PEG2000-Mal-Anker verwendet (Abb. 1-6).

Maleinimid (Mal) ist die reaktive Gruppe, über die eine kovalente Bindung von SH-

Gruppen möglich ist. An das Maleinimid wird ein cyclisches RGD-Peptid gekoppelt,

das durch die Aminosäure Cystein eine SH-Gruppe besitzt (Abb. 1-8 in Kapitel 1.6).

1.4 Verwendete Zelllinien

Im Zuge dieser Arbeit werden in vitro Versuche an den beiden humanen Zelllinien

RH-30 und HeLa durchgeführt. Hierbei werden je nach Versuch stabil eGFP-

transfizierte oder nicht transfizierte Zellen verwendet. Die stabile Transfektion ist

durch Frau Dr. Stefanie Striepe im Rahmen ihrer Doktorarbeit erfolgt (Striepe 2010).

1.4.1 RH-30 Zellen

Die Überprüfung der Gen-Knockdown-Effizienz der in dieser Arbeit verwendeten

siRNA-Trägersysteme erfolgt in erster Linie an der alveolären

Rhabdomyosarkomzelllinie RH-30. Diese Zelllinie stammt aus

Einleitung 13

Knochenmarksmetastasen eines 17-jährigen Jungen. Die RH-30 Zellen zeigen eine

Expression des Integrin-Rezeptors (Striepe 2010).

1.4.2 HeLa Zellen

Die Zelllinie HeLa ist die erste humane etablierte Zelllinie. Sie entstammt aus

Epithelzellen eines Zervixkarzinoms einer 30-jährigen Frau. Da HeLa Zellen keine

Expression des Integrin-Rezeptors zeigen, dienen sie in dieser Arbeit als

Kontrollzelllinie (Chatterjee & Chatterjee 2001; Striepe 2010; Cai et al. 2011; Arosio &

Casagrande 2016).

1.5 Reportergene

Die Effizienz der RNAi wird bei der Entwicklung effizienter Trägersysteme oft

zunächst nicht über eine Quantifizierung der mRNA bestimmt, sondern mit

sogenannten Reportergenen. Hierfür werden insbesondere Gene verwendet, die das

Enzym Luciferase oder das grün fluoreszierende Protein (green fluorescent protein,

GFP) codieren (Langlet-Bertin et al. 2010; Zhang et al. 2013; Asai et al. 2014; Nuhn

et al. 2014; Rengaswamy et al. 2016).

Wichtig für den Einsatz von Reportergenen ist ein direkt proportionaler

Zusammenhang zwischen der Genexpression, dem mRNA Level, der Proteinmenge

sowie dem zu detektierenden Signal. Dieses Signal sollte möglichst einfach zu

bestimmen sein (Alam & Cook 1990; Albano et al. 1998; Soboleski et al. 2005).

1.5.1 Luciferase

Das Enzym Luciferase wird häufig zur Bestimmung der Gen-Knockdown-Effizienz

eingesetzt. Eine kommerziell erhältliche Variante ist die Firefly Luciferase. Sie

katalysiert die Umwandlung von Luciferin in Oxyluciferin und Licht, das mit einem

Luminometer fast ohne Hintergrundrauschen leicht quantifiziert werden kann.

Luciferase-Assays zeigen eine 10- bis 1000-fach bessere Sensitivität als Tests mit

anderen Reportergenen (Alam & Cook 1990).

Luciferase hat jedoch auch einige Nachteile: Es kann nur die mittlere Gen-

Knockdown-Effizenz der Zellpopulation bestimmt werden. Wie die

14 Einleitung

Expressionsverteilung jedoch innerhalb der Zellpopulation ist oder wie stark einzelne

Zellen das Gen exprimieren, kann nicht erfasst werden. Außerdem kann der zeitliche

Verlauf der Genexpression nicht in Echtzeit verfolgt werden (Soboleski et al. 2005).

Abbildung 1-7: Mechanismus der Luciferase-Reaktion

Schematische Darstellung der durch Luciferase katalysierten Umsetzung von Luciferin in

Oxyluciferin und Licht (modifiziert nach Promega, http://www.promegaconnections.com/dual-

luciferase-or-dual-glo-luciferase-assay-system-which-one-should-i-choose-for-my-reporter-

assays/, zuletzt aufgerufen am 29.05.2017)

1.5.2 GFP (green fluorescent protein)

GFP ist ein grün fluoreszierendes Protein, das erstmals 1962 von Osamu Shimomura

beschrieben worden ist. Es ist aus der Qualle Aequorea victoria isoliert worden

(Shimomura et al. 1962). Das Protein ist von mehreren Arbeitsgruppen mutiert

worden, mit dem Erfolg, die Anregungswellenlänge sowie das Emissionsspektrum zu

verbessern (Heim et al. 1995; Cormack et al. 1996; Lybarger et al. 1996). Die in

dieser Arbeit verwendete Variante heißt enhanced green fluorescent protein (eGFP).

Sie wird mit λ = 488 nm angeregt und emittiert Fluoreszenzlicht bei 510 nm. Für die

„Entdeckung und Weiterentwicklung des grün fluoreszierenden Proteins“ haben

Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien 2008 den Nobelpreis für Chemie

erhalten (http://www.sueddeutsche.de/wissen/nobelpreis-fuer-chemie-eine-gruen-

leuchtende-revolution-1.541271, zuletzt aufgerufen am 19.06.2017).

GFP kann in Echtzeit nichtinvasiv in lebenden Zellen und Geweben mittels Durch-

flusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden (Albano et al. 1998).

Im Rahmen dieser Arbeit wird die eGFP-Expression von stabil eGFP-transfizierten

Zellen fluoreszenzmikroskopisch beobachtet und durchflusszytometrisch quantifiziert.

Hierüber wird der Gen-Knockdown der entwickelten siRNA-Trägersysteme ermittelt

(siehe Kapitel 3.4.2.2).

Einleitung 15

1.6 Integrin-Rezeptor Targeting

Integrin-Rezeptoren vermitteln als Transmembranproteine Signale zwischen

extrazellulären Liganden und dem Zytoskelett sowie Signaltransduktionswegen. Sie

sind die wichtigsten Adhäsions-Rezeptoren. Hierbei sind sie sowohl für die Adhäsion

an extrazelluläre Matrixproteine als auch für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich.

Außerdem sind sie u.a. an der Leukozytenfunktion, Entzündungsprozessen, der

Hämostase und der Angiogenese sowie der Zellproliferation und Apoptose beteiligt

(Ruoslahti 1996; Hynes 2002).

Integrin-Rezeptoren bestehen aus α/β Heterodimeren. Es sind 18 Alpha- und 8 Beta-

Untereinheiten beschrieben, die zu 24 verschiedenen Integrin-Rezeptoren

zusammengelagert werden können. Eine Untergruppe der Integrin-Rezeptoren lässt

sich gezielt durch die Tripeptidsequenz RGD (Arginin-Glycin-Asparat) ansteuern

(Ruoslahti 1996; Hynes 2002). Diese Drug Targeting-Option ist für verschieden Drug

Delivery-Systeme beschrieben (Temming et al. 2005). Am Lehrstuhl konnte gezeigt

werden, dass RH-30 Zellen mit cyclischen RGD-Peptiden gezielt angesteuert werden

können (Striepe 2010; Zimmer 2013). Dies wird im Rahmen dieser Arbeit ausgenutzt:

zum einen mit einem negativ geladenen und zum anderen mit einem an ein Lipid-

PEG-Molekül gebundenen cyclischen RGD-Peptid (Abb. 1-8).

Durch eine gezielte Ansteuerung von Integrin-Rezeptoren soll eine vermehrte

Aufnahme des Trägersystems in Zielzellen gegenüber Kontrollzellen erreicht werden.

Bei einem unspezifischen Trägersystem geht ein Großteil der siRNA in anderen

Zellen verloren. Um dies auszugleichen, müssen höhere Dosen eingesetzt werden.

Dies führt zu höheren Kosten und einem gesteigerten Risiko für unerwünschte

Effekte. Durch die gezielte Aufnahme in eine Zelllinie sollen Kosten optimiert und das

Auftreten von off-target Effekten reduziert werden (Dykxhoorn & Lieberman 2005;

Rao et al. 2009; Wang et al. 2011).

16 Einleitung

Abbildung 1-8: Cyclische RGD-Peptide

Das Peptid cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu) (links) trägt bei einem physiologischen pH von 7,4

eine positive Ladung am Arginin und zwei negative Ladungen durch die Carboxylgruppen

der Aminosäuren Aspartat und Glutamat. Hieraus ergibt sich eine einfache negative

Gesamtladung (gezeichnet von Niels Thieme).

Das Peptid cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys) (rechts) kann über die SH-Gruppe des Cysteins

mit der Mal-Gruppe des DSPE-PEG2000-Mal Ankers reagieren und dadurch kovalent

gebunden werden (gezeichnet von Niels Thieme).

Einleitung 17

1.7 Ziel dieser Arbeit

Die durch siRNA ausgelöste RNA-Interferenz bietet großes Potential, bislang nicht

therapierbare Erkrankungen zu behandeln. Da siRNA durch ihre Ladung und Größe

nur schwer in Zellen aufgenommen werden kann, einem raschen enzymatischen

Abbau durch Nukleasen unterliegt und in vivo schnell renal eliminiert wird, ist ein

Trägersystem notwendig.

Ziel dieser Arbeit war es, ein LAH4-L1 basiertes Transportsystem für siRNA zu

entwickeln. Dieses Transportsystem hat im Wesentlichen die Aufgaben, die siRNA

vor einem enzymatischen Abbau zu schützen, die rasche renale Elimination zu

verhindern und eine Aufnahme in die Zelle sowie eine Freisetzung ins Zytosol der

Zelle zu ermöglichen. Hierbei sollte das Trägersystem nicht toxisch sein.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikel (PPR-

Partikel) entwickelt und charakterisiert. Die Charakterisierung umfasste insbesondere

Größenbestimmungen, die Überprüfung und Optimierung der Gen-Knockdown-

Effizienz in stabil eGFP-transfizierten Zellen sowie die Bestimmung der Zytotoxizität.

Es wurden unterschiedliche Lagerungsbedingungen untersucht und die

Langzeitstabilität von PPR-Partikeln unter der besten Lagerungsbedingung bestimmt.

Der zeitliche Verlauf der zellulären Assoziation und Aufnahme der PPR-Partikel

sowie die endosomale Freisetzung der siRNA wurden erforscht.

Um ein zellspezifisches Targeting zu untersuchen, wurden die PPR-Partikel mit

RGD-Peptiden modifiziert. Hierfür wurden Zellen mit (RH-30) und ohne (HeLa)

Integrin-Rezeptoren verwendet. Es wurden zwei Strategien verfolgt, um eine aktive

Ansteuerung der RH-30 Zellen zu erzielen: Zum einen mit einem negativ geladenen

RGD-Peptid, das elektrostatisch an die PPR-Partikel assoziiert werden sollte. Zum

anderen wurde eine Lipid-Modifikation der PPR-Partikel in Analogie zu Liposom-

Protamin-Hyaluronsäure-Nanopartikeln (LPH-NP) untersucht, in die anschließend

RGD-Anker-Konjugate eingelagert wurden.

18 Material und Geräte


2.1 Materialien

2.1.1 Nukleinsäuren und Peptide

Tabelle 2-1: Nukleinsäuren

Bezeichnung Nukleinsäuresequenz (5´ - 3´)

Mr [g ∙ mol-1]

Hersteller / Bezugsquelle

AllStars Neg. siRNA

- -

Qiagen, Hilden AllStars Neg. siRNA AF 488

- -

GAPDH-Molecular Beacon

CGACGGAGTCCTTCCACGATACCACGTCG

8 824 Eurofins

Genomics, Ebersberg

5´-ROX-3´-BHQ2-GAPDH-

Molecular Beacon

[ROX]CGACGGAGTCCTTCCACGATACCACGTCG[BHQ2]

10 076

Silencer Select eGFP siRNA

Sense: CAAGCUGACCCUGAAGUUCtt Antisense: GAACUUCAGGGUCAGCUUGtt

13 300 Life

Technologies, Darmstadt

Tabelle 2-2: Peptide

Bezeichnung Aminosäure-sequenz

Mr [g ∙ mol-1]

Qualität / Reinheitsgrad


LAH4-L1 KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA-NH2

2 778,55

HPLC gereinigt

AG Bechinger, Université de Strasbourg

Protaminsulfat - 5 100 Grade X Sigma Aldrich,

Steinheim

RGD-Cys cyclo (Arg-Gly-

Asp-D-Phe-Cys) 578,65

≥ 99 % Peptides

International, Louisville, USA RGD-Glu

cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu)

604,63

Material und Geräte 19

2.1.2 Chemikalien und Reagenzien

Tabelle 2-3: Lipide und Membranbestandteile

Bezeichnung Abkürzung Mr [g ∙ mol-1]


1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphat (Natriumsalz)

DOPA 722,95 Avanti Polar Lipids,

Alabama, USA

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin

DOPE 743,55 Lipoid GmbH, Ludwigshafen

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin

(Natriumsalz) DOPS 810,03

Lipoid GmbH, Ludwigshafen

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)

(Natriumsalz) DOPG 797,03

Lipoid GmbH, Ludwigshafen

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-

[maleinimido-poly(ethylenglycol)-2000]

DSPE-PEG2000-Mal

2 000 Nanocs, Boston, USA

Cholesterol Chol 386,7 Sigma Aldrich,

Steinheim


Tabelle 2-4: Sonstige Chemikalien

Substanz Abkürzung, Synonym oder Summenformel

Mr [g ∙ mol-1]



Ammoniumhepta-molybdat-

Tetrahydrat (NH4)6Mo7O24 1 235,86 ≥ 99 %

Merck, Darmstadt

Agarose - - - Serva

Electrophoresis, Heidelberg

BD CellFixTM - - - Becton

Dickinson, Heidelberg

BD FACS Clean Solution

FACS Clean - - Becton


BD FACS Flow Sheath Fluid

FACS Flow - - Becton


BD FACS Rinse Solution

FACS Rinse - - Becton


Borsäure - 61,83 ≥ 99,8 % Roth, Karlsruhe

Chloroform CHCl3 119,4 > 99 % Roth, Karlsruhe

4',6-Diamidin-2-phenylindol-

dihydrochlorid DAPI 350,3

Molecular Probes, Leiden,

Niederlande

Dimethylsulfoxid DMSO 78,13 Zellkultur getestet

Sigma-Aldrich, Steinheim

di-Natrium-hydrogenphosphat

Na2HPO4 141,96 ≥ 99 % Roth, Karlsruhe

DNA Gel Loading Dye (6X)

- - - ThermoFisher,

Scientific, Darmstadt

Ethanol EtOH 46,01 ≥ 99,8 % Sigma-Aldrich,

Steinheim

Ethidiumbromid-Lösung

Ethidiumbromid 394,33 0,07 % AppliChem, Darmstadt



Mr [g ∙ mol-1]



Ethylendiamin-tetraessigsäure,

Natriumsalz EDTA 372,24 ≥ 99 %

Merck, Darmstadt

Fetales Kälberserum

FCS - - PAN-Biotech,

Aidenbach

Fiske Subbarow Reducer

- - - Fluka, Buchs,

Schweiz

Geneticin G418 692,70 - Roth, Karlsruhe

Hyaluronsäure, Streptococcus equi

HA - - Sigma-Aldrich,

Steinheim

2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-

piperazinyl)-ethansulfonsäure

HEPES 238,31 ≥ 99,5 % Roth, Karlsruhe

ImmersolTM W2010

- - - Zeiss, Jena

Kaliumdihydrogen-phosphat

KH2PO4 136,09 ≥ 99 % Roth, Karlsruhe

Lipofectamine® RNAiMAX

- - - Life


LysoTracker® Deep Red

- - - Life


LysoTracker® Red DND-99

LysoTracker® Red

- - Life


Natriumchlorid NaCl 58,44 > 99,9 % Roth, Karlsruhe

Natriumhydroxid NaOH 58,44 ≥ 99 % Roth, Karlsruhe

Natriumlaurylsulfat SDS 288,38 ≥ 99 % Sigma-Aldrich,

Steinheim

Paraformaldehyd PFA - > 95 % Sigma-Aldrich,

Steinheim



Mr [g ∙ mol-1]



ProLong® Diamond Antifade

Mountant

Mounting Medium

- - Life


Quant-iTTM RiboGreen RNA

Assay Kit

RiboGreen Assay

- - Life


Resazurin Natriumsalz

Resazurin 229,18 für Zellkultur Sigma-Aldrich,

Steinheim

Saccharose - 342,30 ≥ 99,7 % Roth, Karlsruhe

Salzsäure HCl 36,46 30 % Merck,

Darmstadt

Schwefelsäure H2SO4 98,08 p.a. Roth, Karlsruhe

TrackItTM 100 bp DNA Ladder

- - - Life


Triethylamin TEA 101,9 HPLC grade Roth, Karlsruhe

Trometamol TRIS 121,14 ≥ 99,9 % Sigma-Aldrich,

Steinheim

Triton X-100, 4-(1,1,3,3-

Tetramethylbutyl-)-phenylpolyethylen

glykol

Triton X-100 576,6 für Molekular-

biologie Fluka, Buchs,

Schweiz

Trypanblau 0,4 % - - - Sigma-Aldrich,

Steinheim

Trypsin 0,05 % / EDTA 0,02 %

- - - Biochrom,

Berlin

VLE RPMI 1640 - - - Biochrom,

Berlin

Wasserstoffper-oxidlösung 30 %

(m/m) H2O2 34,02 ACS

Sigma-Aldrich, Steinheim

Wasserstoffper-oxidlösung 30 %

(m/m) H2O2 34,02 30 % Roth, Karlsruhe


Tabelle 2-5: Verwendete Puffer und deren Zusammensetzung

Bezeichnung Zusammensetzung

HS-Puffer pH 7,4 (HEPES-Saccharose-Puffer)

10 mM HEPES + 280 mM Saccharose

+ NaOH bzw. HCl pH 7,4

TBE-Puffer pH 7,4 (TRIS-Borat-EDTA-Puffer)

89 mM TRIS + 89 mM Borsäure + 2 mM Na2-EDTA

+ NaOH bzw. HCl pH 7,4

TE-Puffer (20-fach)

200 mM TRIS + 20 mM Na2-EDTA

+ NaOH bzw. HCl pH 7.5

Transfektionsmedium 25 mM NaCl

+ 250 mM Saccharose pH 7,4

PBS (phosphate buffered saline) mit Ca2+/Mg2+

137 mM NaCl + 2,68 mM KCl

+ 7,81 mM Na2HPO4 + 1,47 mM KH2PO4

+ 1 mM CaCl2 + 0,5 mM MgCl2 x H20

pH 7,4

PBS (phosphate buffered saline) ohne Ca2+/Mg2+

137 mM NaCl + 2,68 mM KCl

+ 7,81 mM Na2HPO4 + 1,47 mM KH2PO4

pH 7,4


2.1.3 Zelllinien

Tabelle 2-6: verwendete Zelllinie

Zelltyp Kulturmedium Herkunft Bezugsquelle

HeLa VLE RPMI 1640

+10 % FCS Humanes

Zervixkarzinom DSMZ, Braunschweig

HeLa stabil eGFP-transfiziert

VLE RPMI 1640 +10 % FCS

+ 400 µg/mL G418

Humanes Zervixkarzinom

Stabile Transfektion der Zelllinie HeLa

(Striepe 2010)

RH-30 VLE RPMI 1640

+10 % FCS Humanes

ARMS DSMZ, Braunschweig

RH-30 stabil eGFP-transfiziert

VLE RPMI 1640 +10 % FCS

+ 600 µg/mL G418

Humanes ARMS

Stabile Transfektion der Zelllinie RH-30

(Striepe 2010)

2.1.4 Verbrauchsmaterial

Tabelle 2-7: Diverse Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung

Artikelbezeichnung / Typ


Combitips

2,5; 5; 10; 25 mL Eppendorf, Hamburg

Einmalküvetten für PCS

PMMA 1,5 mL halbmikro

Brand, Wertheim

Einmalpipetten 2; 5; 10; 25 mL Greiner, Frickenhausen

Einmalspritzen

Injekt Luer-Solo (1; 5; 10; 20 mL)

Braun, Melsungen

Eppendorf Reaktionsgefäße

PP 1,5 mL Eppendorf, Hamburg

FACS Röhrchen - Becton Dickinson,

Heidelberg

Falcon Röhrchen

PP (15; 50 mL) Steril

Becton Dickinson, Heidelberg

HPLC Vials 1,5 mL, klar VWR International GmbH,

Darmstadt

Kanülen 1”, 20” / steril Braun,

Melsungen


Bezeichnung



Sterilfilter 0,2 µm Acrodisc®, geringe

Proteinbindung Pall, Dreieich

Sterilfilter 0,2 µm Rotilab® Roth, Karlsruhe

Verschlussfolie Parafilm PM-966 Pechiney Plastic,

Chicago, USA

µ-Slide 8 Well-Platten - ibidi GmbH, Martinsried

Multiwell-Platten 6, 24, 48, 96 well Becton Dickinson,

Heidelberg

Multiwell-Platten 96 well, schwarz,

steril Greiner, Frickenhausen

Pasteurpipetten - Braun,

Melsungen

Petrischalen 100 x 20 mm Greiner, Frickenhausen

Reaktionsgefäße RNase-frei Biozym Scientific, Hess. Oldendorf

Pipettenspitzen - Eppendorf, Hamburg

Safeseal Tips premium RNase-frei Biozym Scientific, Hess. Oldendorf


2.2 Geräte

Tabelle 2-8: Geräte für die Analytik

Bezeichnung



Durchflusszytometer und Software

FACS CaliburTM mit CellQuestTM Pro


Durchflusszytometer und Software

FACS Fortessa mit FACS Diva


Fluoreszenzmikroskop mit Quecksilberdampflampe,

Vorschaltgerät

Axiovert 40 CFL HBO 50 Mbq ac-z

Zeiss, Jena

Fluoreszenzplattenleser Tristar LB 941 mit

Microwin 2000 Software

Berthold Technologies, Bad Wildbad

Fluoreszenzspektrometer LS 55 mit FL Winlab

Software PerkinElmer, Waltham, MA,

USA

Geldokumentationssystem Quantum ST5 VILBER LOURMAT,

Eberhardzell

Konfokalmikroskop LSM 880 LSM 710

Zeiss, Jena

Plattenlesegerät Spectra Count Packard Instrument, Meriden,

CT, USA

Photonenkorrelations- Spektroskop (PCS)

BI-90 PALS BIC-Brookhaven

Instruments, Wien, Österreich

Zetapotential-Messgerät Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments,

Malvern, UK

Zetapotential-Messküvetten

DTS 1070 Malvern Instruments,

Malvern, UK


Tabelle 2-9: Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie

Gerät Typenbezeichnung Hersteller

Cryo-Kammer Cryo-Box 340719 Carl-Zeiss, Oberkochen

Cryo-Probenhalter Model 626-DH Gatan, Warrendale, USA

Kupfer-Grids mit Kohlefilm bedampft

Quantifoil S7/2 Cu 400 mesh, holey

carbon films

Quantifoil Micro Tools, Jena

TEM-Kamera Proscan HSC 2 Oxford Instruments, Abingdon, UK

TEM-Hochvakuumpumpe TMH 071 P Pfeiffer Vakuum, Aßlar

TEM-Software iTEM 5.0 (Build 1054) Soft Imaging System, Münster

Transmissionselektronen-mikroskop (TEM)

Leo 912 Ω-mega Leo, Oberkochen

Tabelle 2-10: Sonstige Geräte

Bezeichnung



Analysenwaage BP 301 S Sartorius, Göttingen

Autoklav Tuttnauer Systec 3850 EL

Systec, Wettenberg

Feinwaage BP 2100 S AT261 Delta Range

Sartorius, Göttingen; Mettler Toledo, Gießen

Inkubatoren APT Line CB, Hera cell 150

Binder, Tuttlingen; Heraeus Instruments, Fellbach

Kolbenhubpipetten für wässrige Zubereitungen

Pipetten verschiedener

Volumina

Eppendorf, Hamburg

Laborwaage LP 3200 D Sartorius, Göttingen

Millipore-Anlage Milli-Q Academix, BioPak®

Ultrafiltrationsmodul

Millipore GmbH, Schwalbach

Neubauer-Zählkammer - Multimed, Kirchheim

pH-Meter CG 843 P Schott, Mainz


Bezeichnung



Pipetten Pipetman, Gilson Laborshop Neolab®, Freiburg

Pumpe Peristaltic Pump P-1 Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Schüttelwasserbad MB 14 Memmert, Büchenbach

Sicherheitswerkbänke Herasafe HSP 18, Herasafe KSP 18

Heraeus Instruments, Fellbach

Tischlyophilisator Alpha 2-4 Christ Martin Christ, Gefriertrocknungsanlagen,

Osterode

Trockenschrank TK/L 4250 Ehret, Emmendingen

Ultraschallbad Bandelin Sonorex RK 100

Bandelin, Berlin

Ultraschallspitze Sonoplus HD 3100 Bandelin, Berlin

Ultrazentrifuge und Rotor Optima XE-90, Rotor

Typ 50.4 Ti Beckman-Coulter, München

Vortex Mixer VM-300 Neolab Migge, Heidelberg

Wasserbad WB7 Memmert, Schwabach

Zentrifugen Centrifuge 5804 R, Universal 16

Eppendorf, Hamburg; Hettich, Tuttlingen

Methoden 29

3 Methoden

3.1 RNase-freies Arbeiten

Alle Arbeiten werden unter RNase-freien Bedingungen durchgeführt. Hierfür werden

nach Möglichkeit RNase-freie Ausgangsmaterialien verwendet. Hitzestabile Geräte

werden im Trockenschrank für mindestens vier Stunden bei 200 °C aufbewahrt, um

RNasen zu zersetzen. Plastikgefäße werden für drei Stunden in 30 %-iges H2O2 ein-

gelegt und anschließend mit RNase-freiem Wasser abgewaschen. Die Wasserauf-

bereitung erfolgt durch eine Millipore-Reinstwasseranlage, der ein BioPak® Ultra-

filtrationsmodul nachgeschaltet ist, das alle drei Monate erneuert wird. Der Labor-

bereich für die RNase-freien Arbeiten wird vor der Versuchsdurchführung mit

99 %igem Ethanol gereinigt.

3.2 Herstellung von siRNA-Trägersystemen

3.2.1 Herstellung der benötigten Stammlösungen

Die verwendeten siRNAs, Hyaluronsäure (HA), das LAH4-L1-Peptid sowie die RGD-

Peptide werden zu 1 µg/µL und Protamin zu 0,4 µg/µL in autoklaviertem RNase-

freien Wasser gelöst. Die Lösungen werden aliquotiert. Die Hyaluronsäure-Lösung

wird im Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C und die anderen Lösungen im Tiefkühler bei

-20 °C ± 5 °C gelagert.

3.2.2 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln

Zur Herstellung von LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln wird siRNA mit LAH4-L1-Peptid

im Massenverhältnis von 1 : 10 (siRNA zu LAH4-L1-Peptid) für 20 Minuten bei

Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) inkubiert (Langlet-Bertin et al. 2010).

Die entstandenen LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikel werden für Gen-Knockdown Ver-

suche (3.4.2.1) mit dem jeweiligen Puffer auf eine siRNA-Konzentration von 60 nM

verdünnt.

30 Methoden

3.2.3 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-

Partikeln

Zur Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-Partikeln wird im ersten

Schritt siRNA mit Hyaluronsäure im Massenverhältnis von 1 : 1 für 10 Minuten im

Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C inkubiert (Zimmer 2013).

Im zweiten Schritt wird das LAH4-L1-Peptid zu den Hyaluronsäure-siRNA-Partikeln

im Massenverhältnis von 1 : 10 (siRNA zu LAH4-L1-Peptid) hinzupipettiert und für 20

Minuten bei Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) inkubiert.

Die entstandenen LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-Partikel werden für Gen-

Knockdown Versuche (3.4.2.1) mit dem jeweiligen Puffer auf eine siRNA-Konzentra-

tion von 60 nM verdünnt.

3.2.4 Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikeln

(PPR-Partikel)

Zur Herstellung von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikeln (PPR-Partikel) wird

im ersten Schritt das Massenverhältnis von siRNA zu Protamin optimiert. Hierfür

werden siRNA-Protamin-Massenverhältnisse von 0,5 bis 2,3 (siRNA / Protamin) in

0,1-er Schritten untersucht. 20 µL der siRNA-Stammlösung (1 µg/µL) werden mit ent-

sprechenden Volumina der Protamin-Stammlösung (0,4 µg/µL) für 10 Minuten bei

Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) inkubiert. Die entstandenen Protamin-siRNA-Partikel

werden auf Größe (3.3.1) und Oberflächenladung (3.3.2) hin untersucht.

Im zweiten Schritt werden die Protamin-siRNA-Kerne in Massenverhältnissen von

1,5; 2,5 und 3,5 (LAH4-L1-Peptid zu siRNA) mit LAH4-L1-Peptid für 20 Minuten bei

Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) inkubiert. Die entstandenen PPR-Partikel werden

ebenfalls auf Größe (3.3.1) und Oberflächenladung (3.3.2) untersucht. Außerdem

werden die PPR-Partikel mit HS-Puffer für Zellversuche (3.4) verdünnt.

3.2.5 Lyophilisierung von PPR-Partikeln

Die für die Lyophilisierung benötigten Lyophilisations-Vials werden bei 200 °C mind.

4 Stunden lang im Trockenschrank ausgeglüht. Die Gummistopfen werden für 30 min

Methoden 31

in 3 %ige H2O2-Lösung eingelegt. Anschließend werden die Gummistopfen mit

RNase-freiem Wasser gespült und autoklaviert.

PPR-Partikel werden wie in 3.2.4 beschrieben hergestellt und unter aseptischen Be-

dingungen in Lyophilisations-Vials gefüllt. Die Vials werden mit den Gummistopfen so

vorverschlossen, dass eine kleine Öffnung für den Lyophilisationsprozess bleibt. Die

Proben werden im Tischlyophilisator Alpha 2-4 Christ (Martin Christ, Gefrier-

trocknungsanlagen, Osterode) nach dem lehrstuhlinternen Standardprotokoll

lyophilisiert: Nach einer dreistündigen Einfrierphase bei -50 °C und Normaldruck

schließt sich die 42 Stunden dauernde Haupttrocknung bei -30 °C und 0,05 mbar an.

Es folgt die Nachtrocknung für 6 Stunden bei 30 °C und 0,05 mbar. Anschließend

wird der Lyophilisator auf 5 °C heruntergekühlt und belüftet, sodass die lyophilisierten

PPR-Partikel entnommen werden können. Die Lyophilisate werden im Kühlschrank

bei 5 °C ± 3 °C gelagert.

3.2.6 Lagerung von PPR-Partikeln

PPR-Partikel werden bis zu 52 Wochen lang bei Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C), im

Kühlschrank (5 °C ± 3 °C) und im Tiefkühler (-20 °C ± 5 °C) gelagert.

3.2.7 Modifizierte PPR-Partikel

Um ein aktives Targeting an Integrin-Rezeptor-exprimierenden Zelllinien zu

erreichen, werden zwei Modifizierungswege untersucht.

3.2.7.1 RGD-modifizierte PPR-Partikel

PPR-Partikel werden mit 100, 200, 500, 1 000, 2 000 und 3 000 µL einer 1 µg/µL

RGD-Peptid-Lösung (cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu), Peptides International, Louis-

ville, USA) für 10 min bei Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) inkubiert. Die gebildeten

Partikel werden anschließend auf Größe (3.3.1) und Oberflächenpotential (3.3.2)

sowie im Gen-Knockdown-Modell (3.4.2.1) getestet.

32 Methoden

3.2.7.2 RGD-Lipid-modifizierte PPR-Partikel

3.2.7.2.1 Liposomenherstellung

Für die Herstellung von Liposomen werden 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphat

(DOPA), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin (DOPE), 1,2-Dioleoyl-sn-

glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-

glycerol) (DOPG) und Cholesterol (Chol) in Chloroform gelöst. Es werden 16 µmol

Lipidaliquots von DOPA, DOPS und DOPG jeweils alleine als auch in 1 : 1 Mischung

(mol/mol) mit DOPE bzw. Chol hergestellt. Das Chloroform wird mittels Evapo-

rationszentrifuge entfernt, sodass sich ein Lipidfilm am Boden des Eppendorf Reak-

tionsgefäßes bildet. Die Aliquots werden im Tiefkühler bei -20 °C ± 5 °C gelagert.

Zur Liposomenherstellung wird ein Lipidfilm im Exsikkator aufgetaut und in 400 µL

HS-Puffer 30 min lang hydratisiert, dass sich eine Dispersion mit einer Gesamt-

lipidkonzentration von 40 mM bildet. Die Dispersion wird gevortext und anschließend

5-mal 30 s lang im Pulsmodus (50 % Leistung) und einmal 30 s lang im kontinu-

ierlichen Modus (100 % Leistung) mit der Ultraschallspitze Sonoplus HD 3100

(Bandelin, Berlin) beschallt. Zwischen den einzelnen Zyklen wird die Probe für eine

Minute gekühlt, um eine Überhitzung zu verhindern. Auf diese Weise werden small

unilamellar vesicles (SUV) hergestellt.

3.2.7.2.2 Lipid-modifizierte PPR-Partikel

PPR-Partikel werden in 0,4 µmol-Schritten mit 0 bis 2,4 µmol Lipid versetzt. Es wer-

den die in Kapitel 3.2.7.2.1 beschriebenen Liposomen verwendet. Die erhaltenen

Lipid-modifizierten PPR-Partikel (L-PPR-Partikel) werden auf Größe (3.3.1) und

Oberflächenpotential (3.3.2) getestet.

Lipid-modifizierte PPR-Partikel mit den Lipidzusammensetzungen PG, PG/Chol (1/1

mol/mol) und PG/DOPE (1/1 mol/mol) mit 1,2 µmol, 1,6 µmol und 2,0 µmol Lipid

werden in zellulären Assoziations- und Aufnahmeversuchen (3.4.2.1) untersucht.

Methoden 33

3.2.7.2.3 RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel

Für die Präparation RGD-Anker-Lipid-modifizierter PPR-Partikel werden als

Membrananker DSPE-PEG2000-Mal und als RGD-Peptid cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-

Cys) verwendet. Der Membrananker wird in Chloroform gelöst, zu 0,25 µmol in

Reaktionsgefäße aliquotiert und das Chloroform mittels Evaporationszentrifuge

entfernt. Das RGD-Peptid wird zu 1 µg/µL in RNase-freiem Wasser gelöst und im

äquimolaren Verhältnis zum getrockneten Membrananker pipettiert. Durch

abwechselndes 15-sekündiges Vortexen und Eintauchen in ein Ultraschallbad wird

der Membrananker in der Peptid-Lösung dispergiert. Anschließend wird das

Reaktionsgemisch für 20 h bei 20 °C und 1 000 rpm im Thermomixer inkubiert. Die

RGD-Membrananker werden bei -20 °C ± 5 °C im Tiefkühler gelagert.

Um RGD-Membrananker an / in L-PPR-Partikel an- bzw. einzulagern, werden

0,24 µmol RGD-Membrananker zu den L-PPR-Partikeln pipettiert. Dies entspricht

15 % (molar) des Lipidanteils. Die Mischung wird für eine Stunde bei 60 °C und

700 rpm im Thermomixer inkubiert. Die erhaltenen RGD-Lipid-modifizierten PPR-

Partikel (RGD-L-PPR-Partikel) werden auf Größe (3.3.1) und Oberflächenpotential

(3.3.2) sowie im Gen-Knockdown-Modell (3.4.2.1) getestet.

34 Methoden

3.3 Analytik von siRNA-Trägersystemen und Liposomen

3.3.1 Photonenkorrelationsspektroskopie

Der hydrodynamische Durchmesser und die Größenverteilung (Polydispersitäts-

index / PDI) der in dieser Arbeit untersuchten nanopartikulären Systeme werden

mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) bestimmt.

Lipidhaltige Proben werden vor der Messung verdünnt: 40 bis 120 µL der

Zubereitung werden auf 1 mL mit HS-Puffer aufgefüllt. Lipidfreie Proben werden

unverändert vermessen. Die Proben werden in Halbmikroküvetten (1,5 mL, PMMA)

überführt und vor Messbeginn für 2 min im Probenraum des BI-90 Pals® der Firma

Brookhaven Instruments bei 25 °C temperiert. Die sich anschließende Messung

besteht aus 8 Einzelmessungen. Der intensitätsgewichtete effective diameter wird als

Maß für den hydrodynamischen Durchmesser bestimmt.

3.3.2 Zetapotential

Zur Bestimmung des Oberflächenpotentials der untersuchten nanopartikulären

Systeme wird das Zetapotential mittels Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments,

Malvern, UK) bestimmt. Die Proben werden hierfür mit sterilfiltriertem Puffer auf 1 mL

aufgefüllt. Mit Hilfe einer 1 mL Spritze wird die verdünnte Probe luftblasenfrei in eine

Zetaküvette überführt. Die Probe wird in der Messkammer für 2 Minuten bei 25 °C

temperiert. Im Anschluss startet die Messung automatisch. Das Zetapotential jeder

Probe wird dreifach bestimmt, wobei eine Bestimmung aus jeweils 10 bis 100

Einzelmessungen besteht.

3.3.3 Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie

Die Proben für die Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM) sind einen

Tag vor der Vermessung gemäß 3.2.4 hergestellt und bei 5 °C ± 3 °C im Kühlschrank

gelagert worden.

Von der Probe werden ca. 3 µL auf ein mit Kohle bedampftes Kupfergrid überführt

(Quantifoil® S7/2 Cu 400 mesh, holey carbon films, Quantifoil Micro Tools GmbH,

Jena). Überschüssige Probe wird mit einem Filterpapier abgesaugt. Sofort danach

wird das Grid in flüssiges Ethan (Kryogen, 90 K) eingeschossen und dadurch

Methoden 35

schockgefroren. Die Probe wird anschließend mit einem Probenstab unter Stickstoff-

atmosphäre in das Transmissionselektronenmikroskop (Leo 912 Omega, Zeiss,

Oberkochen) eingebracht und die Probe bei 6 300- bis 12 500-facher Vergrößerung

abgebildet.

Die Probenvorbereitungen sowie alle Cryo-Transmissionselektronenmikroskopischen

Aufnahmen sind von Frau Sabine Barnert (Lehrstuhl für Pharmazeutische

Technologie und Biopharmazie, Universität Freiburg) durchgeführt worden.

3.3.4 Bartlett-Assay

Um den Lipidgehalt einer Liposomendispersion zu ermitteln, wird eine Phosphat-

bestimmung nach Bartlett durchgeführt. Hierbei wird organisch gebundener Phos-

phor durch Veraschung und Oxidation in anorganisches Phosphat umgesetzt und

durch eine Komplexreaktion kolorimetrisch quantifiziert (Bartlett 1959).

Es ist essentiell, phosphatfreie Ausgangsmaterialien zu verwenden. Daher werden

phosphatfrei gespülte Gläser verwendet und alle Lösungen werden mit phosphat-

freiem, hochgereinigten Wasser hergestellt. Parallel zu jeder Analyse wird eine

Kalibriergerade mit 50, 100, 150, 200, 250 und 300 mg einer 1,00 mM KH2PO4-Lö-

sung als Phosphatstandard eingewogen. Der Phosphatgehalt der Proben soll so ein-

gestellt sein, dass er im kalibrierten Bereich liegt. Zusätzlich wird ein leeres Röhrchen

als Blindwert mitgeführt.

Die Proben, Kalibratoren und die Blindprobe werden mit 0,5 mL einer 10 N Schwefel-

säure-Lösung versetzt und bei 160 °C für drei Stunden im Trockenschrank verascht.

Es folgt eine Zugabe von 200 µL einer 30 %igen H2O2-Lösung. Nach gründlichem

Vortexen werden die Röhrchen für weitere 1,5 h im Trockenschrank auf 160 °C

erhitzt. Dieser Schritt wird so lange wiederholt, bis die Proben vollständig klar sind.

Danach werden 4,5 mL einer 0,22 %igen Ammoniummolybdat-Lösung sowie 200 µL

einer 14,8 %igen Fiske-Subbarow-Reducer-Lösung in die Gläser gegeben und die

Proben für 10 min in einem Heizblock bei 96 °C erwärmt. Nach dem Abkühlen

werden die nun blau gefärbten Proben bei λ = 830 nm in einem UV/Vis

Spektralphotometer vermessen, nachdem der Nullabgleich mit der Blindlösung

durchgeführt worden ist. Die Kalibrierfunktion wird durch Auftragen der Absorption

gegen die Stoffmenge an Phosphat bestimmt. Die Stoffmengenkonzentration der

36 Methoden

Proben kann dann mittels Kalibrierfunktion berechnet werden. Um die

Gesamtlipidmenge zu erhalten, müssen ggf. phosphatfreie Membrankomponenten

wie Cholesterol rechnerisch berücksichtigt werden.

3.3.5 Komplexierung von siRNA in PPR-Partikeln

Um zu überprüfen, ob die siRNA von Protamin und dem LAH4-L1-Peptid komplexiert

wird, wird ein Agarosegelelektrophorese-Versuch durchgeführt. Das Laufverhalten

von freier siRNA und PPR-Partikeln wird jeweils mit und ohne Zusatz von 3 %iger

SDS-Lösung in einem 1,5 %igen Agarose-Gel untersucht.

Zur Gelherstellung werden 1,5 g Agarose in 100 mL TBE-Puffer unter Erwärmen ge-

löst. Die Lösung wird mit 5 Tropfen Ethidiumbromid-Lösung (0,07 %ig) versetzt und

abkühlen gelassen. Im noch flüssigen Zustand wird die Lösung in die Laufkammer

gegossen. Nach dem Aushärten des Gels wird die Kammer mit TBE-Puffer gefüllt.

Pro Tasche werden 30 µL Probe (inkl. 5 µL 6x Loading Dye) aufgetragen, dies ent-

spricht 0,4 µg siRNA. Zur Orientierung wird eine Tasche mit Größenstandard

(100 bp) mitgeführt. Die Gelelektrophorese läuft bei 100 V für ca. 30 min. Im An-

schluss wird das Gel vorsichtig aus der Laufkammer entnommen und die Nuklein-

säuren unter UV-Licht im Geldokumentationssystem Quantum ST5 detektiert (Vilber

Lourmat, Eberhardzell).

3.3.6 Bestimmung der Serumstabilität von PPR-Partikeln

Für den siRNA-Transport ist es essentiell, dass das Transportsystem die kom-

plexierte siRNA vor enzymatischer Degradation durch RNasen schützt. Dies wird

überprüft, indem freie siRNA als Kontrolle und PPR-Partikel mit 50 % (v/v) fetalem

Kälberserum (fetal calf serum, FCS) bei 37 °C inkubiert werden. Nach 0, 30 und

60 min sowie 8, 12, 24, 36 und 48 h werden jeweils 20 µL Probe gezogen, dies ent-

spricht zu Beginn des Versuches 0,4 µg siRNA. Jede Probe wird mit 5 µL einer

3 %igen SDS-Lösung versetzt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C ge-

lagert. Nachdem alle Proben gezogen worden sind, werden sie aufgetaut und jeweils

5 µL 6x Loading Dye hinzupipettiert. Die Proben sowie ein Größenstandard (100 bp)

werden dann (analog zu 3.3.5) über ein Ethidiumbromid-haltiges, 1,5 %iges Agarose-

Gel für ca. 30 min bei 100 V aufgetrennt. Im Anschluss wird das Gel vorsichtig aus

Methoden 37

der Laufkammer entnommen und die Nukleinsäuren unter UV-Licht im Geldoku-

mentationssystem Quantum ST5 detektiert (Vilber Lourmat, Eberhardzell).

3.3.7 Bestimmung der Assoziationseffizienz (AE)

Um zu bestimmen wie viel siRNA in PPR-Partikeln assoziiert ist, werden drei

voneinander unabhängige Chargen PPR-Partikel hergestellt und mit HS-Puffer zu

20 µg siRNA/mL verdünnt. Mit freier siRNA wird als Kontrolle auf gleiche Weise

verfahren. Die Proben werden in RNase-freie Zentrifugationsröhrchen überführt und

für 2 Stunden bei 153 000 x g in der Ultrazentrifuge Optima LE-80 (Beckman-Coulter,

München) zentrifugiert. Pro Probe werden jeweils 3-mal 10 µL des Überstandes in

eine schwarze 96-well-Platte überführt und die siRNA-Konzentration mit Hilfe des

Quant-iTTM RiboGreen® RNA Assay Kits gemäß der Herstelleranweisungen

bestimmt: Die Proben werden mit TE-Puffer verdünnt und mit dem RiboGreen®-

Reagenz (1 : 200 verdünnt) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz

wird am Plattenlesegerät Tristar LB 941 bei λexc = 460 nm und λem = 520 nm

vermessen. Der gemittelte Blindwert wird von allen Messwerten abgezogen. Die

Fluoreszenzintensität der freien siRNA Probe wird 100 % gesetzt und die Messwerte

der PPR-Partikel dann darauf bezogen.

3.3.8 Fluorimetrie

Um zu überprüfen, ob zwei Fluoreszenzmarker innerhalb zweifach fluoreszenzmar-

kierter PPR-Partikel ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ausbilden, werden

PPR-Partikel wie in 3.2.4 beschrieben hergestellt. Die Proben werden mit 250 µL HS-

Puffer verdünnt und in Halbmikroküvetten überführt. In einem Fluoreszenz-

spektrometer (LS 55, Perkin Elmer) werden die Proben bei λexc = 488 nm angeregt

und Emissionsspektren bei 500 bis 750 nm aufgenommen. Die Messungen finden

bei Raumtemperatur und Spaltbreiten von 2,5 nm statt. Vor jeder Probe wird Wasser

als Blindwert vermessen und vom Emissionsspektrum der Probe subtrahiert.

38 Methoden

3.4 Zellversuche

3.4.1 Kultivierung der Zellen

HeLa und RH-30 Zellen wachsen adhärent auf Böden von 100 mm² Petrischalen und

werden bei 37 °C sowie einer Atmosphäre von 85-90 % relativer Luftfeuchtigkeit und

5 % CO2 kultiviert. Alle drei bis vier Tage werden die Zellen vom Boden der

Petrischale abgelöst. Hierfür wird das alte, verbrauchte Medium abgesaugt, die

Zellen mit ca. 6 mL auf 37 °C temperierten PBS w/o Ca2+ / Mg2+ gewaschen und mit

1 mL Trypsin/EDTA (0,05 % / 0,02 % Massenprozent) versetzt. Das Trypsin wirkt für

fünf bis sechs Minuten im Inkubator auf die Zellen ein, wodurch sich diese vom

Plattenboden ablösen. Die Inkubation wird anschließend mit 4 - 5 mL frischem und

ebenfalls auf 37 °C temperierten Medium (VLE RPMI mit 10 % FCS) abgestoppt.

Durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren werden die Zellen vereinzelt. Ein Teil der

Zellsuspension wird auf eine neue Petrischale mit 13 - 14 mL Medium gegeben

(zuzüglich Geneticin (G418) für stabil eGFP-transfizierte Zelllinien gemäß Tabelle 2-

5), sodass diese nach drei bis vier Tagen wieder zu 80 - 90 % bewachsen ist.

Die Konzentration der geernteten Zellen wird in einer Neubauer-Zählkammer

bestimmt. Die Zellen werden anschließend für Versuche genutzt.

3.4.2 Durchflusszytometrie

3.4.2.1 Bestimmung der zellulären Assoziation und Aufnahme

Um die zelluläre Assoziation und Aufnahme der Trägersysteme an bzw. in die Zellen

zu bestimmen, werden Alexa Fluor® 488-markierte siRNA, 5´-ROX-3´BHQ2-mar-

kierte Molecular Beacons (MB) sowie ROX- oder Quasar® 670-markierte LAH4-L1-

Peptide verwendet.

Einen Tag vor Versuchsbeginn werden 90 000 RH-30 bzw. HeLa Zellen pro Well auf

einer 24-Well-Platte ausgesät. Für jede Probe werden drei Wells angesetzt, als

Kontrolle dienen drei Wells mit unbehandelten Zellen. Am Versuchstag wird eine

Stunde vor der Inkubation das Medium der Zellen erneuert. Hierbei erhalten die

Kontrollzellen 500 µL und die Versuchszellen 400 µL frisches, auf 37 °C temperiertes

VLE RPMI Medium mit 10 % FCS.

Methoden 39

Die Proben werden mit HS-Puffer auf 100 µL / Well mit einer siRNA-Konzentration

von 60 nM verdünnt. Die Zellen werden mit den Proben je nach Versuch für

30 Minuten bis 3 Stunden inkubiert. Nach der Inkubationszeit werden die Zellen für

die Durchflusszytometrie aufgearbeitet:

Der Überstand wird in 5 mL-FACS Röhrchen überführt. Die Zellen werden je Well mit

1 mL 5 °C ± 3 °C kaltem PBS w/o Ca2+ / Mg2+ gewaschen, der Puffer wird ebenfalls

in die FACS Röhrchen überführt. Je Well werden 200 µL Trypsin/EDTA (0,05 % /

0,02 % Massenprozent) zugegeben und die Zellen fünf bis sechs Minuten lang im

Inkubator vom Plattenboden abgelöst. Anschließend wird die Inkubation mit 800 µL

5 °C ± 3 °C kaltem Medium abgestoppt und die Zellen nach mehrfachem Auf- und

Abpipettieren in die FACS Röhrchen überführt. Die Röhrchen werden für 4 min bei

1 200 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, während das

Zellpellet mit 1 mL kaltem (5 °C ± 3 °C) PBS w/o Ca2+ / Mg2+ gewaschen wird. Es

wird ein zweites Mal unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert und der Überstand

abermals verworfen. Die Zellen werden in 200 µL PBS w Ca2+ / Mg2+ aufgenommen

und am Durchflusszytometer vermessen.

Einfach gefärbte Proben werden am FACS CaliburTM, doppelt gefärbte Proben am

FACS FortessaTM untersucht. Es werden die Einstellungen für die jeweilige Zelllinie

geladen und an die Kontrollzellen angepasst. Die Fluoreszenzintensität wird im

jeweiligen Fluoreszenzkanal vermessen und als RFI (relative fluorescence intensity)

ausgedrückt. Über die Verschiebung im Histogramm des Fluoreszenzkanals wird

bestimmt, an bzw. in wie viel Prozent der Zellen der Fluoreszenzfarbstoff assoziiert /

aufgenommen worden ist.

Bei doppelt gefärbten Proben sind die Fluorophore so gewählt, dass eine Kompen-

sation in den jeweils anderen Fluoreszenzkanal nicht notwendig ist. Dies wird zu

Beginn der Messung nochmals überprüft.

40 Methoden

A B

Abbildung 3-1:

Histogramme als Ergebnisse der durchflusszytometrischen Fluoreszenzmessung

A: unbehandelte RH-30 Kontrollzellen, B: RH-30 Zellen 3 Stunden nach Inkubation mit PPR-

Partikeln mit einer Alexa Fluor® 488-markierten siRNA, gemessen am FACS CaliburTM

3.4.2.2 Bestimmung des Gen-Knockdowns

Die Bestimmung des Gen-Knockdowns dient zur Funktionstestung der siRNA-

Formulierung. In dieser Arbeit wird die Fluoreszenz des eGFP (enhanced green

fluorescent protein) in stabil eGFP-transfizierten Zellen gemessen. Die Fluores-

zenzintensität ist proportional zur vorhandenen Menge an eGFP (Soboleski et al.

2005). Wird durch eine Behandlung mit anti-eGFP-siRNA die Neusynthese von

eGFP herunterreguliert, so ist dies durchflusszytometrisch als Fluoreszenzminderung

quantifizierbar.

Einen Tag vor Versuchsbeginn werden 30 000 stabil eGFP-transfizierte RH-30 bzw.

HeLa Zellen pro Well auf eine 24-Well-Platte gegeben (inklusive Selektions-

antibiotikum G418). Für jede Probe werden drei Wells angesetzt, als Kontrolle dienen

drei Wells mit nicht zu inkubierenden Zellen. Am Versuchstag wird eine Stunde vor

der Inkubation das Medium der Zellen erneuert, hierbei erhalten die Kontrollzellen

500 µL und die Versuchszellen 400 µL frisches, auf 37 °C temperiertes VLE RPMI

Medium mit 10 % FCS (ohne G418).

Die Proben werden mit HS-Puffer auf 100 µL / Well mit einer siRNA-Konzentration

von 60 nM verdünnt. Die Zellen werden mit den Proben für 3 Stunden inkubiert. Nach

dieser Inkubationszeit erfolgt ein weiterer Mediumwechsel mit 1 mL frischem, auf

37 °C temperiertem VLE RPMI Medium mit 10 % FCS und G418 je Well. Nach wei-

Methoden 41

teren 72 Stunden Inkubation werden die Zellen wie in 3.4.2.1 beschrieben für die

Durchflusszytometrie aufgearbeitet und anschließend vermessen.

Am FACS CaliburTM bzw. FACS FortessaTM werden die Einstellungen für stabil

eGFP-transfizierte RH-30 oder HeLa Zellen geladen und an die Kontrollzellen ange-

passt. Die eGFP-Fluoreszenz wird gemessen, der geometrische Mittelwert der

Fluoreszenzintensität der Kontrollzellen wird 100 % gesetzt und die Fluoreszenzin-

tensitäten der behandelten Zellen darauf bezogen.

3.4.2.3 Bestimmung der zellulären Assoziation und Aufnahme

sowie des Gen-Knockdowns unter Anwesenheit von

Bafilomycin A1

Analog zu 3.4.2.1 und 3.4.2.2 werden Versuche mit dem Protonenpumpeninhibitor

Bafilomycin A1 (Yoshimori et al. 1991) durchgeführt. Hierfür wird Bafilomycin A1 in

VLE RPMI Medium mit 10 % FCS zu 200 nM gelöst. Der Mediumwechsel eine

Stunde vor der eigentlichen Inkubation wird mit dem Bafilomycin-haltigen Zellmedium

durchgeführt, alle weiteren Schritte finden wie in 3.4.2.1 oder 3.4.2.2 beschrieben

statt.

A B

Abbildung 3-2:

Histogramme als Ergebnis der durchflusszytometrischen Fluoreszenzmessung

A: stabil eGFP-transfizierte RH-30 Kontrollzellen, B: stabil eGFP-transfizierte RH-30 Zellen

72 Stunden nach Behandlung mit PPR-Partikeln, gemessen am FACS CaliburTM

42 Methoden

3.4.3 Untersuchungen zur Freisetzung aus dem Trägersystem

mittels Molecular Beacons

Molecular Beacons (MB) sind kurzkettige DNA-Sequenzen mit einer Haarnadel-

struktur. An den Enden der MB befinden sich ein Fluorophor sowie ein zugehöriger

Quencher, sodass MB in Lösung nicht fluoreszieren. Werden MB an komplementäre

Nukleinsäuresequenzen gebunden, wird die Haarnadelstruktur geöffnet und

Fluorophor und Quencher werden getrennt, sodass Fluoreszenzlicht detektiert

werden kann (Tyagi & Kramer 1996).

In dieser Arbeit werden MB mit 29 Nukleotiden verwendet, die komplementär zur

mRNA von Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) sind. GAPDH ist

ein Enzym der Glycolyse und wird somit ubiquitär in humanen Zellen exprimiert. Am

5`-Ende befindet sich der Fluoreszenzfarbstoff Carboxy-X-Rhodamin (ROX), am 3`-

Ende Black Hole Quencher®-2 (BHQ2) zur Fluoreszenzlöschung (Eurofins

Genomics, Ebersberg). Zur Kontrolle wird ein nicht fluoreszenzmarkierter MB mit

derselben Sequenz verwendet.

MB weisen ähnliche physiko-chemische Eigenschaften wie siRNAs auf. Sie werden

daher stellvertretend für siRNAs eingesetzt, um die Freisetzung aus dem Träger-

system zu bestimmen. Mit fluoreszenzmarkierter siRNA wird mittels Durchfluss-

zytometrie die zelluläre Assoziation und Aufnahme bestimmt. Eine Aussage über die

Lokalisierung innerhalb der Zelle ist jedoch nicht möglich. MB hingegen liegen nach

der Aufnahme in Zellen zuerst in der nicht fluoreszierenden Haarnadelkonformation

vor. Erst wenn sie ins Zytosol freigesetzt werden, binden MB an GAPDH mRNA,

wodurch Fluorophor und Quencher getrennt werden und Fluoreszenzlicht emittiert

wird (Zhou et al. 2013; Yu et al. 2014).

Mit Hilfe der MB und Alexa Fluor® 488-markierter siRNA soll der zeitliche Verlauf der

zellulären Assoziation und Aufnahme sowie die Freisetzung aus PPR-Partikeln

bestimmt werden (Zhou et al. 2013).

Methoden 43

3.4.3.1 Aufnahme von Kalibrierfunktionen

Es werden analog zu 3.2.4 PPR-Partikel hergestellt. Hierfür werden MB zu 1 µg/µL in

RNase-freiem Wasser gelöst. Anstelle der 20 µL siRNA (1 µg/µL) werden die in

Tabelle 3-1 und 3-2 angegebenen Mischungen verwendet.

Im Folgenden wird wie in 3.4.2.1 beschrieben vorgegangen. RH-30 Zellen werden

mit den in Tabelle 3-1 und 3-2 angegebenen Präparationen für 3 Stunden inkubiert

und am FACS FortessaTM durchflusszytometrisch vermessen. Es werden der geo-

metrische Mittelwert (GeoMean), der arithmetische Mittelwert (Mean) sowie der

Median der RFI gegen das eingesetzte Volumen an Alexa Fluor® 488-markierter

siRNA bzw. ROX-/BHQ2-markierter MB aufgetragen und auf Linearität überprüft. Die

beste lineare Korrelation wird im Folgenden als Kalibrierfunktion verwendet.

Tabelle 3-1: Mischungsverhältnisse für die Kalibrierung mit Alexa Fluor® (AF)

488-markierter siRNA zur Bestimmung der zellulären Assoziation

und Aufnahme

Präparation Volumen AF 488-

markierter siRNA [µL]

Volumen nicht markierter

MB [µL]

1 0 20

2 2 18

3 6 14

4 10 10

5 15 5

6 20 0

44 Methoden

3.4.3.2 Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Assoziation und

Aufnahme sowie der endosomalen Freisetzung von PPR-

Partikeln

PPR-Partikel werden wie in 3.2.4 beschrieben hergestellt. Statt der 20 µL siRNA wird

eine 1 : 1 Mischung aus Alexa Fluor® 488-markierter siRNA und ROX-/BHQ2-mar-

kierter MB verwendet. RH-30 Zellen werden in Analogie zu 3.4.2.1 für 30 Minuten

sowie für 1, 2, 3 Stunden mit PPR-Partikeln inkubiert und anschließend am FACS

FortessaTM durchflusszytometrisch vermessen. Außerdem werden Zellen für 3 Stun-

den mit PPR-Partikeln inkubiert. Hieran schließt sich ein Mediumwechsel wie in

3.4.2.2 beschrieben. Nach insgesamt 6, 8, 12 und 24 Stunden werden diese Zellen

durchflusszytometrisch untersucht.

Der arithmetische Mittelwert (Mean) der RFI wird über die entsprechende Kalibrier-

funktion in µg MB bzw. siRNA umgerechnet. Dieser Wert wird gegen die Zeit

aufgetragen.

Tabelle 3-2: Mischungsverhältnisse für die Kalibrierung mit ROX-/BHQ2-

markierten MB zur Bestimmung der endosomalen Freisetzung

Präparation Volumen ROX-/BHQ2-

markierter MB [µL]

Volumen nicht markierter

MB [µL]

1 0 20

2 2 18

3 6 14

4 10 10

5 15 5

6 20 0

Methoden 45

3.4.4 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie

Für die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen werden spezielle µ-Slide 8 Well-

Platten (ibidi GmbH, Martinsried) verwendet. Pro Well werden 40 000 RH-30 Zellen

in 300 µL Zellmedium ausgesät. Nach einem Tag wird ein Mediumwechsel mit

200 µL frischem Zellmedium durchgeführt. Hierbei wird je nach Versuchsanordnung

Zellmedium mit oder ohne 50 nM LysoTracker® Red oder Deep Red (Life Techno-

logies, Darmstadt) und 200 nM Bafilomycin A1 verwendet. Nach einer Stunde

werden die Zellen für bestimmte Zeiträume mit PPR-Partikeln im Inkubator bei 37 °C

sowie einer Atmosphäre von 85-90 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2

inkubiert. Anschließend wird das Medium verworfen und die Zellen zweimal mit PBS

ohne Ca2+/Mg2+ gewaschen. Zur Fixierung der Zellen werden sie für 15 min bei

Raumtemperatur (RT) mit 200 µL einer 4 %igen Paraformaldehyd-Lösung inkubiert.

Der Überstand wird erneut verworfen und die Zellen 2-mal mit demineralisiertem

Wasser gewaschen. Es folgt die Färbung der Nukleinsäuren mittels DAPI (200 nM)

für 20 min bei RT. Der Überstand wird abermals verworfen und die Zellen erneut

zweimal mit demineralisiertem Wasser gewaschen. Damit die Fluoreszenzintensität

bis zur Mikroskopie nicht ausbleicht, werden die Zellen mit Mounting Medium

(ProLong® Diamond Antifade Mountant, Life Technologies, Darmstadt) beschichtet

und in Aluminiumfolie gewickelt im Kühlschrank aufbewahrt.

Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen sind unter der Mithilfe von Frau Dr.

Marie Follo (Universitätsklinikum Freiburg, Lighthouse Core Facility, Zentrum für

Translationale Zellforschung) und Frau Dr. Aenne Geyer (Kinder- und Jugendmedzin,

Universitätsklinikum Freiburg) aufgenommen worden. Hierfür sind die beiden

konfokalen Mikroskope LSM 880 und LSM 710 der Firma Zeiss (Jena) mit der jeweils

zugehörigen Software „Zen Black“ und „Zen 2011“ verwendet worden. Die

Auswertung der Aufnahmen ist mit der Software „Zen lite 2012“ erfolgt.

46 Methoden

3.4.5 Resazurin-Assay

Resazurin ist ein zellmembranpermeabler Redox-Indikator, der zur Bestimmung der

Zellviabilität und Zellanzahl herangezogen werden kann. Resazurin wird zu

0,15 mg/mL in PBS w/o Ca2+ / Mg2+ gelöst. Die blaue Lösung wird durch einen Steril-

filter (0,2 µm) in ein steriles Falcon Röhrchen filtriert. Anschließend wird die Lösung

lichtgeschützt gelagert, für den häufigen Gebrauch bei 5 °C ± 3 °C im Kühlschrank

und zur Langzeitlagerung im Tiefkühler bei -20 °C ± 5 °C.

Resazurin kann direkt auf Zellen gegeben werden. Lebende Zellen mit aktivem

Metabolismus reduzieren Resazurin NADH-abhängig zum fluoreszierenden

Resorufin (Abbildung 3-3). Die gebildete Resorufin-Menge ist proportional zur Anzahl

lebender Zellen und wird mittels Plattenlesegerät Tristar LB 941 quantifiziert. Hierbei

wird Resorufin bei λexc = 460 nm angeregt und das emittierte Fluoreszenzsignal bei

λem = 590 nm gemessen (Riss et al. 2013).

Abbildung 3-3:

NADH-abhängige Reduktion von Resazurin zu Resorufin (nach Riss et al. 2013)

Methoden 47

3.4.5.1 Etablierung des Resazurin-Assays

Um den Resazurin-Assay am Lehrstuhl zu etablieren, werden 0 bis 20 000 Zellen in

5 000-er Schritten in Triplikaten in 100 µL Zellmedium in schwarze 96-well-Platten

gegeben. Es werden 20 µL Resazurin-Lösung (0,15 mg/mL) pro Well hinzupipettiert

und die Zellen für 1 bis 3 Stunden bei 37 °C im Inkubator inkubiert. Anschließend

werden die Platten im Plattenlesegerät (Tristar LB 941, Berthold Technologies, Bad

Wildbad) bei λexc = 460 nm und λem = 590 nm vermessen. Die Messwerte werden in

RFU (relative fluorescence units) angegeben und der gemittelte Blindwert von allen

anderen Messwerten abgezogen. Es wird bestimmt, ob ein linearer Zusammenhang

zwischen Zellzahl und Fluoreszenzintensität besteht.

3.4.5.2 Bestimmung der Zellviabilität

Zur Bestimmung der Zellviabilität werden je nach Versuchsdauer 5 000 bis 14 000

Zellen pro Well einer schwarzen 96-well-Platte in 100 µL Zellmedium einen Tag vor

der eigentlichen Versuchsdurchführung gegeben. Der Versuch wird pro Probe in

Triplikaten durchgeführt. Außerdem werden drei Wells ohne Zellen als Blindwert

sowie drei Wells mit unbehandelten Zellen als 100 %-Wert mitgeführt.

Am Versuchstag erfolgt eine Stunde vor der Inkubation ein Mediumwechsel mit

frischem, auf 37 °C temperiertem Zellmedium, 50 µL für die Kontrollzellen und 40 µL

für die zu inkubierenden Zellen. Die Proben werden so verdünnt, dass die Ziel-

konzentration durch Zugabe von 10 µL Probe erreicht wird. Die Zellen werden für

3 Stunden mit den Proben inkubiert. Anschließend erfolgt ein weiterer

Mediumwechsel mit 100 µL frischem, auf 37 °C temperiertem Zellmedium. Nach

weiteren 0, 48 oder 72 Stunden werden 20 µL Resazurin-Lösung (0,15 mg/mL) pro

Well pipettiert. Nach 1 bis 3 Stunden im Inkubator bei 37 °C werden die Platten im

Plattenlesegerät (Tristar LB 941, Berthold Technologies, Bad Wildbad) bei

λexc = 460 nm und λem = 590 nm vermessen. Die Messwerte werden in RFU

angegeben und der gemittelte Blindwert von allen Messwerten abgezogen. Die

gemittelte Fluoreszenzintensität der unbehandelten Kontrollzellen wird 100 % gesetzt

und die anderen Messwerte darauf bezogen.

48 Methoden

3.4.6 Hämolyse-Assay

Mittels Hämolyse-Versuchen bei unterschiedlichen pH-Werten soll getestet werden,

ob PPR-Partikel bei einem physiologischen pH-Wert hämolytisch aktiv sind und ob

sie aus endosomalen Kompartimenten freigesetzt werden können (Evans et al.

2013).

3.4.6.1 Herstellung der benötigten Lösungen

Zur Herstellung von Phosphatpuffern mit in Tabelle 3-3 genannten pH-Werten

werden 9,08 g KH2PO4 ad 1000,0 mL (Stammlösung A) sowie 11,88 g Na2HPO4 ad

1000,0 mL (Stammlösung B) in RNase-freiem Wasser gelöst und in den in Tabelle 3-

3 beschriebenen Verhältnissen gemischt. Die Puffer werden mit Natriumchlorid iso-

tonisiert und autoklaviert. PBS w/o Ca2+ / Mg2+ wird als isotoner Phosphatpuffer mit

einem pH-Wert von 7,4 verwendet.

Eine 20 %ige Triton-X-100-Lösung wird als Positivkontrolle verwendet. Sie wird durch

Verdünnen von 20 mL Triton-X-100 ad 100 mL RNase-freies Wasser hergestellt. Als

Negativkontrolle wird HS-Puffer verwendet.

Das für den Hämolyse-Versuch benötigte Blut wird aus der Vene eines gesunden

freiwilligen Erwachsenen entnommen. Die Blutentnahme ist von Frau Birgit Erhard

(Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Freiburg)

oder dem Team der Arztpraxis „Hausärzte am Bertoldsbrunnen“ durchgeführt

worden. Die Gerinnung des Blutes wird durch K2EDTA verhindert. Um das

Blutplasma zu entfernen, wird das Blut für 5 min bei 500 x g zentrifugiert. Hämatokrit

und Plasma werden markiert und das Plasma aspiriert. Das Volumen wird durch

isotone Natriumchloridlösung (Isotone Natriumchloridlösung 0,9 % Braun

Injektionslösung, B Braun, Melsungen) ersetzt. Das Blut wird durchmischt. Dieses

Vorgehen wird 2-mal wiederholt.

In vier 50 mL Falcon Röhrchen werden jeweils 49 mL Phosphatpuffer (pH 5,6; 6,2;

6,8 und 7,4) vorgelegt und mit einem Milliliter des aufgereinigten Blutes versetzt.

Methoden 49

3.4.6.2 Lyse-Assay

Es werden pro pH-Wert jeweils in Triplikaten 40 µL PPR-Partikel, LAH4-L1-Peptid,

Triton-Lösung, HS-Puffer und der jeweilige Phosphatpuffer in eine U-Boden-96-Well-

Platte pipettiert. PPR-Partikel und das LAH4-L1-Peptid sind im Vorfeld so verdünnt

worden, dass die eingesetzte siRNA-Konzentration 1 mg pro kg Körpergewicht bzw.

der gleichen LAH4-L1-Peptid-Konzentration entspricht. In jedes Well werden 160 µL

des verdünnten Blutes pipettiert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C

werden die Platten für 5 min bei 500 x g zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile zu

pelletieren. Es werden jeweils 100 µL des Überstandes in eine durchsichtige 96-Well-

Platte mit flachem Boden überführt. An einem Plattenlesegerät (Spectra Count,

Packard Instrument, Meriden, CT, USA) wird die Absorption bei 450 nm bestimmt.

Die Messwerte für den jeweiligen Phosphatpuffer dienen als Blindwerte. Ihr Mittelwert

wird von allen anderen Messwerten subtrahiert. Der Mittelwert der Positivkontrolle

(Triton-X-100) wird 100 % gesetzt und die anderen Messwerte darauf bezogen.

Für PPR-Partikel, LAH4-L1-Peptid, Triton-Lösung, HS-Puffer und PBS w/o Ca2+ /

Mg2+ werden bei pH 7,4 zusätzlich Hämolyse-Werte für 2 und 3 Stunden

Inkubationsdauer bestimmt.

Tabelle 3-3: Mischungsverhältnisse der Stammlösungen

pH-Wert Volumen Stammlösung A [mL] Volumen Stammlösung B [mL]

5,6 95,1 4,9

6,2 81,6 18,4

6,8 50,8 49,2

50 Methoden

3.5 Statistik

Die statistischen Auswertungen werden mit der Software OriginPro 2015

durchgeführt.

Zur Signifikanzbestimmung wird der Mittelwert-Vergleichstest nach Tukey verwendet.

Die hierfür erforderliche Varianzhomogenität wird nach Levene bestimmt. Sofern

keine Varianzhomogenität vorliegt, werden die 95 %-Konfidenzintervalle der Mittel-

werte verglichen. Ein P-Wert von P < 0,05 bzw. das Fehlen der Überschneidung der

95 %-Konfidenzintervalle wird als signifikant (*) angesehen.

Über den Boltzmann-Fit nach Gleichung 3-1 wird die Dosis-Wirkungs-Beziehung in

Kapitel 4.4.5 gefittet. Die mittlere inhibitorische Konzentration (IC50-Wert) wird dann

über die Funktion „FitSigmoidalFindXfromY1“ für 50 % eGFP-Expression berechnet.

Gleichung 3-1

A1 initialer Wert

A2 finaler Wert

x0 zentraler Wert, Wendepunkt der Kurve

dx Steigungsfaktor

x Konzentration [nM]

Ergebnisse und Diskussion 51

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Vergleich von LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln mit LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-Partikeln in unterschiedlichen Puffersystemen

Es soll untersucht werden, welches der drei Puffersysteme Serum-freies Medium

(VLE RPMI), Transfektionsmedium (25 mM NaCl, 250 mM Saccharose, pH 7,4) oder

HS-Puffer (10 mM HEPES, 280 mM Saccharose, pH 7,4) am geeignetsten für die

Partikelherstellung ist. Hierbei wird zudem geprüft, ob der Zusatz von Hyaluronsäure

einen Vorteil für die Effizienz im Gen-Knockdown-Modell darstellt.

LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikel und LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-siRNA-Partikel

werden gemäß 3.2.2 bzw. 3.2.3 jeweils in Serum-freiem Medium,

Transfektionsmedium und HS-Puffer hergestellt und auf eine siRNA-Konzentration

von 60 nM verdünnt.

Die Proben werden gemäß 3.4.2.2 auf ihre Knockdown-Effizienz in stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-1 dargestellt.

Abbildung 4-1: Vergleich der Puffersysteme

eGFP-Expression von stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen nach der Transfektion mit

LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikeln (ohne HA, blau) bzw. LAH4-L1-Peptid-Hyaluronsäure-

siRNA-Partikeln (mit HA, rot) in Serum-freiem Medium, Transfektionsmedium und HS-Puffer;

MW ± SD, n = 5; ns = nicht signifikant, * = signifikant mit α = 5 %

Kontrolle Serum-freies Medium

Transfektions-medium

HS-Puffer 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

ohne HA

mit HA

*

*

ns


Im Gegensatz zu anderen in der Literatur beschriebenen siRNA-

Transfektionssystemen (Chono et al. 2008; Langlet-Bertin et al. 2010; Liu et al. 2011)

zeigt Hyaluronsäure in diesem Versuch keinen verbesserten Gen-Knockdown, daher

wird im Folgenden auf Hyaluronsäure verzichtet.

Von den getesteten Puffersystemen ist das Transfektionsmedium sowohl dem

Serum-freien Medium als auch dem HS-Puffer im Gen-Knockdown signifikant

unterlegen. Partikel, die in Serum-freiem Medium bzw. HS-Puffer hergestellt worden

sind, unterscheiden sich in ihrer Reduktion der eGFP-Expression nicht signifikant. Da

das Oberflächenpotential der Partikel in Serum-freiem Medium nicht bestimmt

werden kann, werden die Partikel im Folgenden nur noch in HS-Puffer hergestellt.

Für das siRNA-Transfektionssystem ist in Anlehnung an die USP Monographie

„Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions“ (USP 2016) eine

durchschnittliche Partikelgröße von unter 500 nm angestrebt.

Da LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikel mit einem mittleren hydrodynamischen

Durchmesser von über 1600 nm (n = 3, nicht graphisch dargestellt) nicht im

angestrebten Größenbereich liegen, werden weitere siRNA-Formulierungen

präpariert und untersucht.


4.2 Entwicklung von PPR-Partikeln

4.2.1 Formierung von Protamin-siRNA-Komplexen

In der Literatur ist umfangreich beschrieben, dass siRNA mit Protamin Komplexe

bildet, die im angestrebten Größenbereich von durchschnittlich unter 500 nm liegen

(Li & Huang 2006b; Kundu et al. 2012; Ki et al. 2014; Powell et al. 2017). Wie in 3.2.4

beschrieben, werden siRNA und Protamin in unterschiedlichen Massenverhältnissen

miteinander gemischt und die gebildeten Komplexe auf Größe (3.3.1) und

Oberflächenladung (3.3.2) hin untersucht. Dies ist von Herrn Valentin Schoop im

Rahmen eines Wahlpflichtpraktikums durchgeführt worden. Die Ergebnisse sind in

Abb. 4-2 graphisch dargestellt. Bis zu einem Massenverhältnis von siRNA zu

Protamin von 1,3 werden positiv geladene Partikel gebildet, die eine Größe von unter

300 nm aufweisen. Bei Massenverhältnissen von 1,4 bis 1,8 (siRNA zu Protamin) tritt

Aggregation auf (rot markierter Bereich). In diesem Bereich ist das Zetapotential zu

niedrig, um die Partikel elektrostatisch zu stabilisieren. Ab einem Massenverhältnis

von 1,9 entstehen negativ geladene Partikel mit mittleren Größen von unter 200 nm.

Bei Massenverhältnissen von 1,9 bis 2,1 (siRNA zu Protamin) unterscheiden sich die

gebildeten Protamin-siRNA-Partikel hinsichtlich ihrer Größe und Oberflächenladung

nicht signifikant. Für die weiteren Versuche wird das Massenverhältnis von 2,0

(siRNA zu Protamin) verwendet.


Abbildung 4-2: Zetapotential und Größe von Protamin-siRNA-Partikeln in

Abhängigkeit ihrer Massenverhältnisse

Massenverhältnisse (siRNA zu Protamin) bis 1,3 positive Partikel mit einer mittleren Größe

von unter 300 nm; Massenverhältnisse von 1,4 bis 1,8 (siRNA zu Protamin) Aggregation (rot

umrandet); Massenverhältnisse > 1,9 (siRNA zu Protamin) Protamin-siRNA-Partikel mit

negativen Zetapotential und mittlerer Größe < 200 nm. MW ± SD, n = 1 - 3; ns = nicht

signifikant mit α = 5 %

ns


4.2.2 Bildung von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikeln (PPR-

Partikel)

Im zweiten Schritt werden die Protamin-siRNA-Partikel (m/m siRNA zu Protamin 2,0),

wie in 3.2.4 beschrieben, mit unterschiedlichen Mengen an LAH4-L1-Peptid inkubiert

und die gebildeten LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikel (PPR-Partikel)

bezüglich Größe (3.3.1) und Oberflächenpotential (3.3.2) charakterisiert. Dies ist von

Herrn Valentin Schoop im Rahmen eines Wahlpflichtpraktikums durchgeführt

worden. In Abb. 4-3 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt.

Abbildung 4-3: Zetapotential und Größe von LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-

Partikeln (PPR-Partikeln) in Abhängigkeit des LAH4-L1-Anteils

Mit steigendem LAH4-L1-Anteil wird das Zetapotential positiver (MW ± SD, n = 3), im rot

markierten Bereich tritt Aggregation auf.


Das Zetapotential der gebildeten PPR-Partikel ändert sich durch Zugabe des positiv

geladenen LAH4-L1-Peptides vom Negativen ins Positive. Hierbei besteht erneut ein

Bereich, in dem das Oberflächenpotential zu gering für eine elektrostatische

Stabilisierung der Partikel ist und Aggregation auftritt (m/m = 0,5 LAH4-L1 zu siRNA,

rot markiert). Bei geringeren Anteilen an LAH4-L1 liegen negativ geladene Partikel

vor, bei höheren Anteilen von LAH4-L1 positiv geladene Partikel. Die Größe der

positiv geladenen PPR-Partikel sinkt mit steigendem Anteil an LAH4-L1 von ca.

400 nm auf ungefähr 200 nm. Die positiv geladenen PPR-Partikel liegen somit im

angestrebten Größenbereich von durchschnittlich unter 500 nm. Sie werden wie in

3.4.2.2 beschrieben im Gen-Knockdown-Modell getestet.

4.2.3 Testung von PPR-Partikeln auf ihre Gen-Knockdown-Effizienz

Die positiv geladenen LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikel (PPR-Partikel)

werden mit HS-Puffer so verdünnt, dass stabil eGFP-transfizierte RH-30 Zellen mit

60 nM siRNA gemäß 3.4.2.2 inkubiert werden. Die Herunterregulation von eGFP wird

durchflusszytometrisch am FACS CaliburTM bestimmt. Abbildung 4-4 zeigt das

Messergebnis. Alle drei Formulierungen führen zu einer signifikanten

Fluoreszenzminderung von über 60 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen.

Je mehr LAH4-L1-Peptid eingesetzt wird, desto größer ist die Fluoreszenzminderung.

PPR-Partikel mit einem Massenverhältnis von 3,5 (LAH4-L1 zu siRNA) zeigen die

signifikant höchste Gen-Knockdown-Effizienz. In Abb. 4-3 ist bereits dargestellt

worden, dass diese Partikel zudem den kleinsten hydrodynamischen Durchmesser

der drei positiv geladenen Formulierungen aufweisen. Aus diesen Gründen werden

PPR-Partikel mit dem Massenverhältnis von 3,5 LAH4-L1-Peptid zu siRNA

(komplexiert mit Protamin) im Folgenden verwendet.


Abbildung 4-4: LAH4-L1-Abhängigkeit des Gen-Knockdowns von PPR-Partikeln

eGFP-Expression von stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen nach Transfektion mit PPR-

Partikeln mit unterschiedlichen Massenanteilen an LAH4-L1-Peptid; MW ± SD, n = 3;

* = signifikant mit α = 5 %

4.3 Lagerung von PPR-Partikeln

4.3.1 Untersuchung der kurzfristigen Lagerstabilität

Um zu überprüfen, ob LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikel (PPR-Partikel)

gelagert werden können, werden drei Chargen hergestellt. Jede Charge wird

dreigeteilt: Ein Teil wird eingefroren und bei -20 °C ± 5 °C im Tiefkühler gelagert. Ein

zweiter Teil wird, wie in 3.2.5 beschrieben, lyophilisiert und anschließend im

Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C aufbewahrt. Der letzte Teil wird unverändert bei

5 °C ± 3 °C im Kühlschrank gelagert. Zwei weitere Chargen PPR-Partikel werden bei

Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C) gelagert. Nach bestimmten Zeitpunkten wird jeweils

eine Probe rekonstituiert bzw. für 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert und die

Partikelgröße sowie die Gen-Knockdown-Effizienz gemäß 3.3.1 und 3.4.2.2

bestimmt.

Kontrolle 1,5 2,5 3,5 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

Massenverhältnis LAH4-L1-Peptid zu siRNA (komplexiert mit Protamin)


4.3.1.1 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei Raumtemperatur

Die hydrodynamischen Durchmesser von zwei bei Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C)

gelagerten PPR-Partikel-Chargen werden für 6 bzw. 4 Wochen beobachtet. Charge 1

weist hierbei für 4 Wochen und Charge 2 für 3 Wochen eine mittlere Größe von unter

500 nm auf. Dies entspricht dem angestrebten Größenbereich.

Nach 6 bzw. 4 Wochen ist bei beiden Chargen eine Zunahme der mittleren

Partikelgröße auf über 500 nm (Charge 1: 1100 nm, Charge 2: 1000 nm) erkennbar.

Somit sind PPR-Partikel bei Raumtemperatur nur drei Wochen lang größenstabil.

Abbildung 4-5: Entwicklung des hydrodynamischen Durchmessers von PPR-

Partikeln während der Lagerung bei Raumtemperatur

Zwei Chargen PPR-Partikel werden 6 bzw. 4 Wochen lang bei Raumtemperatur gelagert.

Charge 1 zeigt für 4 Wochen eine stabile Partikelgröße, Charge 2 für 3 Wochen.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 1 2 3 4 5 6 7

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lagerungszeit bei Raumtemperatur [Wochen]

Charge 1

Charge 2


4.3.1.2 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei -20 °C ± 5 °C

Die mittleren hydrodynamischen Durchmesser von zwei der drei im TK gelagerten

Chargen sind während der sechswöchigen Lagerungszeit konstant. Jedoch ist bei

Charge 1 bereits nach einer zweiwöchigen Lagerung eine Zunahme der mittleren

Partikelgröße auf über 500 nm und somit über den Grenzwert feststellbar. Die

Größenstabilität von PPR-Partikeln ist somit im Tiefkühler nur für eine Woche

gewährleistet.


Partikeln während der Lagerung im Tiefkühler bei -20 °C ± 5 °C

Drei Chargen PPR-Partikel werden 6 Wochen lang im Tiefkühler bei -20 °C ± 5 °C gelagert.

Die Chargen 2 und 3 zeigen 6 Wochen lang eine stabile Partikelgröße, während die mittlere

Partikelgröße von Charge 1 nur eine Woche lang < 500 nm ist.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 1 2 3 4 5 6 7

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lagerungszeit bei -20 °C ± 5° C [Wochen]

Charge 1

Charge 2

Charge 3


4.3.1.3 Größenentwicklung der lyophilisierten PPR-Partikel

PPR-Partikel werden lyophilisiert (3.2.5) und anschließend im Kühlschrank bei

5 °C ± 3 °C gelagert. Die Lyophilisate werden mit RNase-freiem Wasser

rekonstituiert und nach 30 Minuten vermessen.

Nur zwei Messwerte liegen im angestrebten Größenbereich von unter 500 nm: Von

Charge 1 nach einer Woche mit 310 nm sowie ebenfalls von Charge 1 nach 4

Wochen mit 330 nm. Alle anderen Messwerte liegen oberhalb von 500 nm (Abb. 4-7).


Partikeln während der Lagerung als Lyophilisat bei 5 °C ± 3 °C

Drei Chargen PPR-Partikel werden 6 Wochen lang als Lyophilisate bei 5 °C ± 3 °C gelagert.

Nach bestimmten Lagerungszeiten werden die Lyophilisate rekonstituiert und die

hydrodynamischen Durchmesser der PPR-Partikel bestimmt.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 1 2 3 4 5 6 7

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lagerungszeit als Lyophilisate [Wochen]

Charge 1

Charge 2

Charge 3


Wird die Entwicklung der Größe jedoch im Verlauf eines Tages beobachtet, so ist zu

erkennen, dass der hydrodynamische Durchmesser der PPR-Partikel mit der Zeit

abnimmt und Werte von unter 200 nm annimmt. Dies ist in Abb. 4-8 beispielhaft für

Charge 3 gezeigt. Somit können PPR-Partikel lyophilisiert und rekonstituiert werden.


Partikeln über die Zeit nach der Rekonstitution der Lyophilisate

PPR-Partikel aus den rekonstituierten Lyophilisaten zeigen im zeitlichen Verlauf eine

Abnahme des hydrodynamischen Durchmessers auf ca. 200 nm. Dies ist für Charge 3

beispielhaft dargestellt.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 5 10 15 20 25 30

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Zeit nach der Rekonstitution der Lyophilisate [Stunden]

1 Woche

2 Wochen

4 Wochen

6 Wochen


4.3.1.4 Größenentwicklung der PPR-Partikel bei 5 °C ± 3 °C

Die hydrodynamischen Durchmesser der drei im Kühlschrank gelagerten Chargen

PPR-Partikel schwanken innerhalb von 6 Wochen im Bereich von 190 nm und

250 nm. Somit ist die Partikelgröße der bei 5 °C ± 3 °C gelagerten Partikel

kontinuierlich im angestrebten Größenbereich von im Mittel unter 500 nm.


Partikeln während der Lagerung im Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C

Drei Chargen PPR-Partikel werden unverändert bei 5 °C ± 3 °C gelagert. Die mittleren

hydrodynamischen Durchmesser sind während der Lagerungszeit konstant zwischen 190 nm

und 250 nm.

4.3.1.5 Testung der Gen-Knockdown-Effizienz von gelagerten

PPR-Partikeln

Parallel zur Größenbestimmung werden die gelagerten PPR-Partikel im Gen-

Knockdown-Modell nach 3.4.2.2 in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen getestet.

Wie in Abb. 4-10 dargestellt ist, erzielen bei 5 °C ± 3 °C (blau), bei -20 °C ± 5 °C

(orange) und als Lyophilisate bei 5 °C ± 3 °C (gelb) gelagerte PPR-Partikel über die

gesamte sechswöchige Lagerungszeit einen signifikanten Gen-Knockdown

gegenüber unbehandelten Kontrollzellen (schwarz). Zudem unterscheiden sich die

Ergebnisse zwischen diesen Lagerungsbedingungen untereinander und gegenüber

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3 4 5 6 7

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lagerungszeit bei 5 °C ± 3 °C [Wochen]

Charge 1

Charge 2

Charge 2


nicht gelagerten PPR-Partikeln (ndH, nach der Herstellung, grün) nicht signifikant

voneinander. Bei Raumtemperatur (RT, rot) gelagerte PPR-Partikel senken nach

zweiwöchiger Lagerung die eGFP-Expression wie nicht gelagerte PPR-Partikel auf

22,8 % (bezogen auf unbehandelte Kontrollzellen) im Vergleich zu einer eGFP-

Expression von 23,5 % ± 1,1 % nach der Herstellung. Nach fünfwöchiger Lagerung

bei RT sinkt die Fähigkeit, eGFP herunter zu regulieren, jedoch signifikant ab: Die

eGFP-Expression wird lediglich auf 40,8 % reduziert und ist somit signifikant höher

als nach der Herstellung.

Abbildung 4-10: Lagerungsabhängigkeit des Gen-Knockdowns

PPR-Partikel werden unter verschiedenen Bedingungen gelagert: bei 5 °C ± 3 °C (blau), bei

-20 °C ± 5 °C (orange), als Lyophilisat bei 5 °C ± 3 °C (gelb) und bei Raumtemperatur (RT,

rot). Die eGFP-Gen-Knockdown-Effizienz der gelagerten PPR-Partikel wird in stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen getestet. MW ± SD, n = 1 - 3; ns = nicht signifikant, * = signifikant

mit α = 5 %; Kontrolle schwarz, Testung nach der Herstellung (ndH) grün

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die Lagerung bei 5 °C ± 3 °C am

besten geeignet ist. Unter diesen Bedingungen sind alle drei Chargen größenstabil

(190 nm bis 250 nm, Abb. 4-9) während des gesamten sechswöchigen

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

Lagerungszeit [Wochen]

1 2 3 7 8 15

K

Kontrolle ndH 5 °C ± 3 °C

-20 °C ± 5 °C

Lyo-philisate

RT

0 1 2 4 5 6

ns

*


Lagerungszeitraums und die Fähigkeit, die eGFP-Expression herunter zu regulieren,

unterscheidet sich nicht signifikant zu nicht gelagerten Partikeln (Abb. 4-10).

Bei -20 °C ± 5 °C gelagerte PPR-Partikel unterscheiden sich im Gen-Knockdown-

Modell zwar ebenfalls nicht signifikant von frisch hergestellten PPR-Partikeln (Abb. 4-

10), jedoch ist die Partikelgröße unter dieser Lagerungsbedingung nur eine Woche

stabil (Abb. 4-6). Nach 2 Wochen treten mittlere Partikelgrößen von über 500 nm auf.

Die gelagerten lyophilisierten PPR-Partikel führen gleichfalls zu nicht signifikant

unterschiedlichen eGFP-Expressionen gegenüber frisch zubereiteten PPR-Partikeln

(Abb. 4-10). Jedoch ist die mittlere Partikelgröße direkt nach der Rekonstitution mit

300 nm bis 1100 nm zum einen sehr variabel und zum anderen liegen 10 von 12

Werten oberhalb der angestrebten durchschnittlichen Partikelgröße von unter 500 nm

(Abb. 4-7). Im Verlauf eines Tages sinken die mittleren hydrodynamischen

Durchmesser der PPR-Partikel zwar auf 130 -180 nm (Abb. 4-8) und erfüllen somit

die Größenvorgabe, jedoch werden in dieser Arbeit PPR-Partikel im unveränderten

Zustand bei 5 °C ± 3 °C gelagert, weil das Lyophilisieren einen energie-, zeit- und

somit kostenaufwändigen Prozess darstellt, der weder erforderlich ist, noch einen

Zusatznutzen aufweist.

Untersuchungen bei Raumtemperatur können in Anlehnung an die ICH Guideline

„Q1A Stability Testing of new Drug Substances and Products“

(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/

09/WC500002651.pdf, zuletzt aufgerufen am 24.04.2017) als beschleunigte

Haltbarkeitstests für bei 5 °C ± 3 °C gelagerte Arzneistoffe und Arzneimittel

angesehen werden. Die bei Raumtemperatur gelagerten PPR-Partikel sind drei

Wochen lang größenstabil (140 - 220 nm). Danach tritt Partikelwachstum ein, das zu

über 1000 nm großen Agglomeraten führt (Abb. 4-5). Im Gen-Knockdown-Modell

unterscheidet sich nur der Wert nach 2 Wochen nicht signifikant von ungelagerten

Proben (Reduktion der eGFP-Expression auf 22,8 % vs. 23,5 % ± 1,1 %). Nach

5 Wochen Lagerung ist die eGFP-Expression der transfizierten Zellen signifikant

höher als nach 2 Wochen: 40,8 % vs. 22,8 %. Somit liegen für bei Raumtemperatur

gelagerte PPR-Partikel lediglich 2 Wochen Daten vor, die die Stabilität der Partikel

für diesen Zeitraum belegen.

PPR-Partikel werden im Folgenden im Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C gelagert.


4.3.2 Untersuchungen zur langfristigen Lagerstabilität

Nachdem in Kapitel 4.3.1 gezeigt werden konnte, dass für PPR-Partikel (LAH4-L1-

Peptid-Protamin-siRNA-Partikel) eine Lagerung im Kühlschrank bei 5 °C ± 3 °C am

geeignetsten ist, werden PPR-Partikel unter dieser Bedingung ein Jahr lang gelagert.

In dieser Zeit wird die Größe (3.3.1) und die Gen-Knockdown-Effizienz (3.4.2.2)

regelmäßig überprüft.

4.3.2.1 Entwicklung der Partikelgröße im Verlauf eines Jahres

Die Entwicklung der mittleren Partikelgröße von zwei bei 5 °C ± 3 °C gelagerten

Chargen PPR-Partikel ist in Abb. 4-11 gezeigt. Die hydrodynamischen Durchmesser

schwanken von 200 nm bis 300 nm innerhalb von 52 Wochen. Somit ist die

Partikelgröße während der gesamten Lagerungszeit im angestrebten Größenbereich

von unter 500 nm.

Abbildung 4-11: Entwicklung der hydrodynamischen Durchmesser von PPR-

Partikeln in Abhängigkeit von der Lagerungszeit bei

5 °C ± 3 °C

Zwei Chargen PPR-Partikel werden 52 Wochen lang bei 5 °C ± 3 °C gelagert und

regelmäßig auf ihre mittlere Teilchengröße hin untersucht. Die Werte schwanken zwischen

200 nm und 300 nm.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 10 20 30 40 50

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lagerungszeit bei 5 °C ± 3 °C [Wochen]

Charge 1 Charge 2


4.3.2.2 Gen-Knockdown-Effizienz im Verlauf eines Jahres

Abbildung 4-12: Gen-Knockdown von PPR-Partikeln in Abhängigkeit von der

Lagerungszeit

PPR-Partikel werden bei 5 °C ± 3 °C (blau) gelagert. Die eGFP-Gen-Knockdown-Effizienz

wird in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen bestimmt. MW ± SD, n = 2 - 3; ns = nicht

signifikant; Kontrolle schwarz, Testung nach der Herstellung grün; 1 der 6-Wochen-Wert ist

aus 4.3.1.5 übernommen.

PPR-Partikel, die ein Jahr lang bei 5 °C ± 3 °C gelagert werden, unterscheiden sich

nicht signifikant in ihrem Vermögen, die eGFP-Expression in stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen herunter zu regulieren. Die Unterschiede zu frisch

hergestellten PPR-Partikeln sind ebenfalls nicht signifikant (21,7 % ± 2,2 % nach der

Herstellung gegenüber 22,9 % ± 2,9 % bis 24,1 % ± 0,9 % nach der Lagerung).

PPR-Partikel weisen während der einjährigen Lagerung bei 5 °C ± 3 °C einen

stabilen hydrodynamischen Durchmesser von 200 bis 300 nm auf und können die

eGFP-Expression in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen konstant auf 20 bis

25 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen reduzieren. Somit sind PPR-

Partikel ein Jahr lagerstabil.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

Lagerungszeit bei 5 °C ± 3 °C

0 6 Wochen1 6 Monate 9 Monate 12 Monate

ns


4.4 Charakterisierung von PPR-Partikeln

4.4.1 Komplexbildung

Um die Komplexierung der siRNA mit Protamin und dem LAH4-L1-Peptid während

der PPR-Partikel-Bildung nachzuweisen, wird ein Electrophoretic Mobility Shift Assay

durchgeführt (3.3.5). PPR-Partikel mit (4) und ohne (5) Zusatz einer 3 %igen SDS-

Lösung werden auf ein 1,5 %iges Agarosegel aufgetragen. Zum Vergleich wird das

Laufverhalten von freier siRNA, ebenfalls mit (2) und ohne (1) 3 %ige SDS-Lösung,

mit untersucht. Die elektrophoretische Auftrennung ist in Abb. 4-13 dargestellt. In 3

ist ein DNA-Größenstandard aufgetragen. Freie Nukleinsäuren werden mit

Ethidiumbromid angefärbt, während komplexierte siRNA nicht detektiert wird.

Freie siRNA (2) und PPR-Partikel (4) weisen mit SDS-Lösung jeweils das gleiche

Laufverhalten auf. Zudem verfügen beide Banden über eine in etwa gleich große

Intensität. Dies lässt den Rückschluss zu, dass die siRNA durch die Zugabe der

SDS-Lösung zu den PPR-Partikeln quantitativ dekomplexiert wird. PPR-Partikel ohne

SDS-Zusatz (5) weisen nur eine schwache Bande auf, die auf Höhe der siRNA

verläuft. Hieraus wird geschlossen, dass die siRNA nahezu vollständig in PPR-

Partikeln gebunden vorliegt.

Abbildung 4-13: Gelelektrophoretische Auftrennung von PPR-Partikeln

Freie siRNA (1), freie siRNA mit SDS (2), ein DNA-Größenstandard (3), PPR-Partikel mit

SDS (4) sowie PPR-Partikel ohne SDS (5) werden gelelektrophoretisch aufgetrennt und freie

Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid angefärbt. In PPR-Partikeln liegt siRNA nahezu

quantitativ komplexiert vor.

1 5

3

3 4 2


4.4.2 Assoziationseffizienz (AE)

Um den Grad der Komplexierung der siRNA in PPR-Partikeln zu bestimmen, wird die

Assoziationseffizienz (AE) mit Hilfe des Quant-iTTM RiboGreen® RNA Assay Kits

bestimmt (3.3.7). Von drei voneinander unabhängigen Chargen PPR-Partikel wird die

ungebundene siRNA durch das RiboGreen®-Reagenz quantifiziert. Das Ergebnis ist

in Abb. 4-14 dargestellt. In allen drei Chargen liegt die siRNA zu über 99 %

komplexiert vor. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen der Komplexbildung

(4.4.1) und von Langlet-Bertin et al. (2010) publizierten Daten, bei denen siRNA

durch das LAH4-L1-F-Peptid, das sich in der Aminosäuresequenz von LAH4-L1

lediglich in vier Positionen unterscheidet, vollständig komplexiert wird.

Der hohe Komplexierungsgrad spricht für die Effizienz von PPR-Partikeln zum

Transport von siRNA.

Abbildung 4-14: Quantifizierung der in PPR-Partikeln assoziierten siRNA

Die Assoziationseffizienz (AE) von siRNA in PPR-Partikeln wird an drei voneinander

unabhängigen Chargen PPR-Partikel mittels Quant-iTTM RiboGreen® RNA Assay bestimmt.

AE > 99 %.

0

20

40

60

80

100

1 2 3

Asso

zia

tio

nseff

izie

nz [

%]

Charge


4.4.3 Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie

Um einen Eindruck vom Aussehen und der Gestalt der PPR-Partikel zu bekommen,

werden Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopische Aufnahmen der PPR-Partikel

aufgenommen. Die Probenaufarbeitung sowie die Aufnahme der Bilder sind durch

Frau Sabine Barnert (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie,

Universität Freiburg) erfolgt.

Die beiden repräsentativen PPR-Partikel in Abb. 4-15 weisen eine tendenziell

längliche bis rechteckige Form auf. Hierbei entspricht die eine Kantenlänge ungefähr

dem doppelten der anderen. Die Partikelgröße liegt mit 200 bis 300 nm im selben

Bereich wie die mittels PCS gemessenen hydrodynamischen Durchmesser während

der Lagerung bei 5 °C ± 3 °C (4.3.1.4 und 4.3.2.1).

Abbildung 4-15: Cryo-TEM Aufnahmen von PPR-Partikeln

Zwei repräsentative PPR-Partikel sind dargestellt, die Messbalken entsprechen 500 nm. Die

Partikel liegen im Größenbereich von 200 bis 300 nm.


4.4.4 Gen-Knockdown-Effizienz von PPR-Partikeln im Vergleich zu

Kontrollen

4.4.4.1 Negativkontrollen

Um zu zeigen, dass der Gen-Knockdown durch die komplette Formulierung

hervorgerufen wird, werden Knockdown-Experimente nach 3.4.2.2 in stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen durchgeführt. PPR-Partikel (blau) werden hierbei mit

Protamin-siRNA-Partikeln (PR, grün), LAH4-L1 (rot) und freier anti-eGFP-siRNA

(orange) verglichen. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-16 gezeigt. Nur PPR-Partikel sind

in der Lage, die eGFP-Expression signifikant auf 23,2 % ± 2,2 % zu reduzieren. Die

Unterschiede in der eGFP-Expression von unbehandelten Kontrollen, Protamin-

siRNA-Partikeln, LAH4-L1-Peptid und freier anti-eGFP-siRNA sind nicht signifikant.

Abbildung 4-16: PPR-Partikeln im Vergleich zu Negativkontrollen

Die Effektivität eGFP in stabil eGFP-transfizierten RH-30-Zellen herunter zu regulieren, wird

zwischen PPR-Partikeln (blau), Protamin-siRNA-Partikeln (PR, grün), dem LAH4-L1-Peptid

(rot) und freier anti-eGFP-siRNA (orange) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen

(schwarz) gezeigt: Nur PPR-Partikel erreichen eine signifikante Fluoreszenzreduktion.

MW ± SD, n = 3, ns = nicht signifikant, * = signifikant mit α = 5 %

Kontrolle PPR PR LAH4-L1 siRNA 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

ns

*


Beim Vergleich der Gen-Knockdown-Effizienz der PPR-Partikel (23,2 % ± 2,2 %

eGFP-Expression) aus diesem Teil mit der Gen-Knockdown-Effizienz der LAH4-L1-

Peptid-siRNA-Partikel aus Kapitel 4.1 (18,9 % ± 2,8 % eGFP-Expression), ist

ersichtlich, dass Protamin für die Knockdown-Effizienz nicht notwendig ist. Die Werte

für die eGFP-Expression unterscheiden sich nicht signifikant (mit α = 5 %). Im

Gegensatz zu PPR-Partikeln liegen LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikel mit

Partikeldurchmessern von über 1600 nm (n = 3) jedoch nicht im angestrebten

Größenbereich von unter 500 nm. Daher werden im weiteren Verlauf dieser Arbeit

PPR-Partikel als siRNA-Trägersystem verwendet.

Um die Spezifität der anti-eGFP-siRNA zu zeigen, werden zudem Versuche mit einer

unspezifischen siRNA (scr-siRNA) durchgeführt. Es werden analog zu 3.2.4 PPR-

Partikel hergestellt, einmal mit anti-eGFP-siRNA und einmal mit scr-siRNA. Beide

Varianten werden nach 3.4.2.2 in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen getestet.

Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Abb. 4-17. Während PPR-Partikel mit anti-

eGFP-siRNA (blau) die eGFP-Expression gegenüber unbehandelten Kontrollzellen

(schwarz) signifikant senken, zeigen die Zellen, die mit scr-siRNA-PPR-Partikeln

inkubiert worden sind (grau), keine signifikanten Unterschiede in der eGFP-

Expression zu den unbehandelten Kontrollzellen. Dieses Ergebnis bestätigt das oben

aufgeführte Resultat, dass die einzelnen Komponenten des siRNA-Trägersystems

nicht zu einem Rückgang der eGFP-Expression führen und eine spezifische siRNA

notwendig ist.


Abbildung 4-17: PPR-Partikel mit anti-eGFP- oder scr-siRNA

Vergleich der Spezifität von anti-eGFP-siRNA und scr-siRNA (jeweils in PPR-Partikeln

formuliert): anti-eGFP-siRNA (blau) signifikanter Rückgang der eGFP-Expression, scr-siRNA

(grau) kein signifikanter Unterschied zu unbehandelten Kontrollzellen (schwarz); MW ± SD,

n = 2 - 3, ns = nicht signifikant, * = signifikant mit α = 5 %

4.4.4.2 Positivkontrolle

Um die Effizienz von PPR-Partikeln einschätzen zu können, wird ihr Vermögen eGFP

herunter zu regulieren gemäß 3.4.2.2 in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen im

Vergleich zum kommerziell erhältlichen Lipofectamine® RNAiMAX (Life

Technologies, Darmstadt) getestet. Es wird jeweils eine siRNA-Konzentration von

60 nM eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-18 gezeigt: PPR-Partikel (blau)

reduzieren die eGFP-Expression auf 23,4 % ± 1,0 % und Lipofectamine® RNAiMAX

(lila) auf 22,9 % ± 1,2 %. Die Unterschiede in der eGFP-Expression der beiden

siRNA-Formulierungen sind nicht signifikant. PPR-Partikel können also den gleichen

Gen-Knockdown hervorrufen wie das kommerziell erhältliche Lipofectamine®

RNAiMAX.

Kontrolle anti-eGFP-siRNA scr-siRNA 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

*

ns


Abbildung 4-18: PPR-Partikel im Vergleich zu Lipofectamine® RNAiMAX

Der eGFP-Gen-Knockdown in stabil eGFP-transfizierten RH-30-Zellen wird zwischen PPR-

Partikeln (blau) und Lipofectamine® RNAiMAX (lila) im Vergleich zu unbehandelten

Kontrollzellen (schwarz) gezeigt. MW ± SD, n = 3, ns = nicht signifikant, * = signifikant mit

α = 5 %

4.4.5 Dosis-Wirkungskurve

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung von PPR-Partikeln zur eGFP-Expression soll

untersucht werden. Hierfür werden PPR-Partikel mit HS-Puffer auf unterschiedliche

siRNA-Konzentrationen verdünnt und nach 3.4.2.2 in stabil eGFP-transfizierten RH-

30 Zellen geprüft. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Abb. 4-19. Die Dosis-

Wirkungskurve zeigt einen sigmoidalen Verlauf. Ab einer siRNA-Konzentration von

2,5 nM rufen PPR-Partikel einen signifikanten Rückgang der eGFP-Expression in

stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen hervor. Die mittlere inhibitorische

Konzentration (IC50) liegt bei 5,4 nM siRNA (berechnet nach Kapitel 3.5) und die

maximale Wirkung mit einem Rückgang der eGFP-Expression auf 19,7 % ± 0,5 %

wird ab siRNA-Konzentrationen von 30 nM erreicht. In der Literatur wird die

Halbwertszeit von eGFP mit über 24 Stunden bzw. ungefähr 26 Stunden angegeben

(Corish & Tyler-Smith 1999; Wahlers et al. 2001; Snapp 2009). Werden 26 Stunden

als Halbwertszeit für eGFP angenommen, so kann die eGFP-Expression nach

72 Stunden bei vollständiger Inhibition der Neusynthese maximal auf ca. 15 % des

Ausgangswertes abfallen. Mit einer eGFP-Expression um 20 % liegt die Knockdown-

Kontrolle PPR Lipofectamine® 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

ns


Effizienz der PPR-Partikel im Größenordnungsbereich dieser maximal möglichen

Hemmung der Neusynthese.

Zhou et al. (2013) haben für zwei Lipid-siRNA-Formulierungen IC50-Werte

angegeben. Die eine Lipidmischung besteht aus DOTAP/Span 80/TPGS im molaren

Verhältnis von 50:49:1 und wird SPANosomes (SPs) genannt. Die andere ist aus

DOTAP/DOPE/TPGS zusammengesetzt (50:49:1) und heißt cationic liposomes

(CLs). Die IC50-Werte zur Hemmung von Luciferase werden für CLs mit 20,1 nM

siRNA und für SPs mit 5,5 nM siRNA angegeben. PPR-Partikel verfügen mit einem

IC50-Wert von 5,4 nM siRNA über eine ähnlich effiziente Hemmung der

Proteinneusynthese wie die SPANosomes. Beide Formulierungen sind effizienter als

cationic liposomes.

Abbildung 4-19: Dosis-Wirkungs-Beziehung von PPR-Partikeln

Die eGFP-Expression in stabil eGFP-transfizierten RH-30-Zellen ist gegen die siRNA-

Konzentration aufgetragen. PPR-Partikel führen ab einer siRNA-Konzentration von 2,5 nM

zu einem signifikanten Rückgang der eGFP-Expression. Der IC50-Wert beträgt 5,4 nM siRNA

und ab 30 nM siRNA stellt sich ein Maximum des Rückgangs der eGFP-Expression ein.

(MW ± SD, n = 3). Die schwarze Linie stellt den Boltzmann-Fit nach Kapitel 3.5 dar.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,01 0,1 1 10 100

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

siRNA-Konzentration [nM]


4.4.6 Untersuchungen zur Zellviabilität

Nachdem gezeigt werden konnte, dass PPR-Partikel in der Lage sind, die eGFP-

Expression in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen effizient herunter zu regulieren,

soll überprüft werden, inwieweit PPR-Partikel die Zellviabilität beeinflussen. Dies wird

sowohl an RH-30 Zellen als auch an HeLa Zellen untersucht. Zunächst ist der

Resazurin-Assay hierfür am Lehrstuhl etabliert worden.

4.4.6.1 Etablierung des Resazurin-Assays

Zur Etablierung des Resazurin-Assays wird wie in 3.4.5.1 beschrieben vorgegangen.

Für HeLa Zellen genügt eine einstündige Inkubation mit Resazurin, um ausreichend

hohe Fluoreszenzsignale zu erhalten, die mit einem Korrelationskoeffizienten von

0,99 zudem einen linearen Zusammenhang zur vorgegebenen Zellzahl aufweisen

(Abb. 4-20). Für RH-30 Zellen ist eine dreistündige Inkubation mit Resazurin

erforderlich, um genügend große Fluoreszenzintensitäten zu detektieren (Abb. 4-21).

Hier besteht ebenfalls ein linearer Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität

und Zellzahl mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,99. In der Literatur werden

Inkubationszeiten von 1 bis 4 Stunden vorgegeben (Riss et al. 2013). Mit einer

Stunde für HeLa und drei Stunden für RH-30 Zellen liegen beide Werte im

vorgegebenen Bereich.

Beim Vergleich der beiden Zelllinien ist auffällig, dass die Fluoreszenzintensitäten für

HeLa Zellen nach einer einstündigen Inkubation mit Resazurin mehr als 10-mal so

hoch sind wie die nach einer dreistündigen Inkubation der RH-30 Zellen. Da die

Umsetzung von Resazurin zum fluoreszierenden Resorufin NADH-abhängig verläuft,

lässt der große Unterschied in der Fluoreszenzintensität den Schluss zu, dass HeLa

Zellen mehr NADH bilden als RH-30 Zellen.


Abbildung 4-20: Fluoreszenzintensitäten von HeLa Zellen nach einer Stunde

Repräsentative Kalibrierung von HeLa Zellen nach einstündiger Inkubation mit Resazurin

(MW ± SD, n = 3).

Abbildung 4-21: Fluoreszenzintensitäten von RH-30 Zellen nach drei Stunden

Repräsentative Kalibrierung von RH-30 Zellen nach dreistündiger Inkubation mit Resazurin

(MW ± SD, n = 3).

y = 0,79x - 279,67 R² = 0,99

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 5000 10000 15000 20000 25000

rela

tiv

e f

luo

rescen

ce u

nit

s (

RF

U)

Zellen

y = 0,06x - 75,00 R² = 0,99

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 5000 10000 15000 20000 25000

rela

tiv

e f

luo

rescen

ce u

nit

s (

RF

U)

Zellen


4.4.6.2 Bestimmung der Zellviabilität

Nach der Inkubation der Zellen mit den PPR-Partikeln wird die Zellviabilität von HeLa

und RH-30 Zellen wie in 3.4.5.2 beschrieben nach 0, 48 und 72 Stunden bestimmt.

Es werden siRNA-Konzentrationen von 30 und 60 nM untersucht. Abbildung 4-22

zeigt die Resultate für RH-30 Zellen und Abbildung 4-23 für HeLa Zellen. Eine

Zellviabilität von über 70 % wird in Anlehnung an die DIN-ISO 10993-5 als nicht

toxisch angesehen. PPR-Partikel führen folglich weder in RH-30 noch in HeLa Zellen

zu einer akuten Toxizität, da die Zellviabilitäten direkt nach der Inkubation mit den

PPR-Partikeln um die 90 % liegen. Nach 48 bzw. 72 Stunden sinken die Werte für

die Zellviabilität von RH-30 Zellen nach einer Behandlung mit 60 nM siRNA (blau)

unterhalb des Grenzwertes. Bei einem Einsatz von 30 nM (rot) siRNA nimmt die

Zellviabilität der RH-30 Zellen zwar mit der Zeit ab, bleibt jedoch über dem Grenzwert

von 70 %. Für RH-30 Zellen wird daher eine Konzentration von 30 nM siRNA in Form

von PPR-Partikeln als nicht toxisch angesehen.

Abbildung 4-22: Zellviabilität von RH-30 Zellen

RH-30 Zellen werden nach bestimmten Zeitpunkten nach dreistündiger Inkubation mit PPR-

Partikeln (siRNA-Konzentration: 60 nM blau, 30 nM rot) auf ihre Zellviabilität getestet

(MW ± SD, n = 3). Eine Zellviabilität von über 70 % wird als nicht toxisch angesehen.

Kontrolle 0 Stunden 48 Stunden 72 Stunden 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Zellv

iab

ilit

ät

[%]

60 nM

30 nM


Abbildung 4-23: Zellviabilität von HeLa Zellen

HeLa Zellen werden nach bestimmten Zeitpunkten nach dreistündiger Inkubation mit PPR-

Partikeln (siRNA-Konzentration: 60 nM blau, 30 nM rot) auf ihre Zellviabilität getestet

(MW ± SD, n = 3). Eine Zellviabilität von über 70 % wird als nicht toxisch angesehen.

HeLa Zellen weisen 48 und 72 Stunden nach der Inkubation mit PPR-Partikeln immer

noch Zellviabilitäten von um die 90 % auf. Die Werte für 60 nM siRNA liegen leicht

unterhalb der Werte für 30 nM siRNA, die Unterschiede sind jedoch nicht signifikant.

Da die Zellviabilität der HeLa Zellen zu allen drei gemessenen Zeitpunkten sowie bei

beiden eingesetzten siRNA-Konzentrationen mit um die 90 % deutlich oberhalb des

Grenzwertes von 70 % liegt, werden die hier untersuchten PPR-Partikel für HeLa

Zellen als ungiftig angesehen.

4.4.7 Versuche unter hohen Serumkonzentrationen

4.4.7.1 Stabilität der siRNA gegen fetales Kälberserum

Ein effizientes siRNA-Trägersystem sollte nicht nur in der Lage sein, siRNA in Zellen

zu transportieren, sondern auch die siRNA vor dem Abbau durch ubiquitär

vorhandene RNasen zu schützen. Die in vivo Halbwertszeit von siRNA wird mit ca.

einer Stunde angegeben (Dykxhoorn & Lieberman 2005). Diese Zeit soll durch das

Trägersystem verlängert werden. Um dies zu testen, wird wie in 3.3.6 beschrieben

vorgegangen. PPR-Partikel und freie siRNA werden jeweils mit 50 % (v/v) fetalem

Kälberserum (FCS) inkubiert und die noch intakte Menge an siRNA wird nach

Kontrolle 0 Stunden 48 Stunden 72 Stunden 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110Z

ell

via

bil

ität

[%]

60 nM

30 nM


bestimmten Zeitpunkten ermittelt. Die Resultate sind in Abb. 4-24 dargestellt. Freie

siRNA (A) ist bis zu einer Inkubationsdauer von einer Stunde durch eine

Ethidiumbromid-Färbung nachweisbar. Nach 8 Stunden ist freie siRNA komplett

abgebaut. In PPR-Partikeln hingegen ist die siRNA noch nach 12 Stunden eindeutig

erkennbar. Dies spricht für einen deutlichen Schutz der siRNA vor einem

enzymatischen Abbau. In der Literatur sind Lipid-Protamin-siRNA-Formulierungen

beschrieben, die die siRNA sogar über 48 Stunden vor einem enzymatischen Abbau

schützen (Liu et al. 2011; Rengaswamy et al. 2016). Im Vergleich dazu liegt siRNA in

PPR-Partikeln weniger geschützt vor. Daraus wird wahrscheinlich eine kürzere

Plasmahalbwertszeit für PPR-Partikel gegenüber Lipid-Protamin-siRNA-

Formulierungen resultieren. PPR-Partikel müssten tendenziell in kürzeren

Zeitintervallen appliziert werden. Im Vergleich zu freier siRNA ist siRNA in PPR-

Partikeln jedoch deutlich vor abbauenden Serumproteinen geschützt.

A

B

Abbildung 4-24: Serumstabilität von siRNA

Freie siRNA (A) und siRNA in PPR-Partikeln (B) wird mit 50 % (v/v) FCS inkubiert und die

nicht abgebaute Menge an siRNA mittels Ethdiumbromid-Färbung nach

gelelektrophoretischer Auftrennung detektiert: Freie siRNA ist nach einer Stunde noch

schwach nachweisbar, nach 8 Stunden nicht mehr. Die in PPR-Partikeln formulierte siRNA

ist über 12 Stunden detektierbar.


4.4.7.2 Serumabhängigkeit des Gen-Knockdowns

Für eine mögliche in vivo Anwendung sollte das siRNA-Transportsystem nicht nur in

der Lage sein, die siRNA vor abbauenden Enzymen zu schützen. Das Trägersystem

sollte zudem die siRNA unter hohen Serumkonzentrationen effizient in Zellen

einschleusen, um einen Gen-Knockdown hervorzurufen. In der Literatur werden

siRNA-Transportsysteme zum Teil unter serumfreien Bedingungen getestet (Duan et

al. 2012a; Zhou et al. 2013). Bei einem Wechsel zu 10 % FCS fällt beispielsweise die

Knockdown-Effizienz der von Duan et al. (2012a) genutzten siRNA-Formulierung um

über 50 % ab. Um zu testen, inwieweit die Gen-Knockdown-Effizienz der PPR-

Partikel von der FCS-Konzentration abhängt, werden stabil eGFP-transfizierte RH-30

Zellen analog zu 3.4.2.2 bei FCS-Konzentrationen von 0 %, 10 %, 30 % und 50 %

mit PPR-Partikeln (60 nM siRNA) inkubiert. Abbildung 4-25 zeigt die Ergebnisse.

Abbildung 4-25: Serumabhängigkeit des Gen-Knockdowns

Die eGFP-Expression in stabil eGFP-transfizierten RH-30-Zellen wird in Abhängigkeit von

der FCS-Konzentration dargestellt. Die Unterschiede in der eGFP-Expression unterscheiden

sich bei den verschiedenen FCS-Konzentrationen nicht signifikant voneinander. MW ± SD,

n = 3, ns = nicht signifikant mit α = 5 %

Kontrolle 0 % 10 % 30 % 50 % 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

FCS-Konzentration

ns


Die eGFP-Expression der behandelten Zellen liegt unabhängig von der FCS-Kon-

zentration konstant bei 25 %. Die Unterschiede sind nicht signifikant. PPR-Partikel

sind folglich in der Lage einen effizienten Gen-Knockdown unabhängig von der FCS-

Konzentration hervorzurufen. Ein ähnlicher Effekt ist von Liu (2016) für die Trans-

duktionseffizienz von HeLa Zellen durch Viruspartikel berichtet, die mit dem LAH4-

L1-Peptid modifiziert worden sind. Dabei wird LAH4-L1 als ausschlaggebend für die

hohe Transduktionseffizienz unter hohen Serumkonzentrationen angesehen. Einen

ähnlichen Effekt beschreibt Mason et al. (2007): Die Aufnahme von LAH4-L1-DNA-

Komplexen in MRC-5 V2 Zellen ist von der eingesetzten Serumkonzentration weit-

gehend unbeeinflusst, während die Aufnahme von LAH4-DNA-Komplexen mit

steigender Serumkonzentration dramatisch einbricht. In HepG2 hingegen werden

sowohl LAH4- als auch LAH4-L1-DNA-Komplexe bei erhöhten Serum-

konzentrationen schlechter aufgenommen. Es wird eine Abhängigkeit sowohl von der

Serumkonzentration als auch der verwendeten Zelllinie gefolgert (Mason et al. 2007).

In stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen ist die Gen-Knockdown-Effizienz von PPR-

Partikeln unabhängig von der Serumkonzentration.

4.4.8 Hämolyse

Die Guidance for Industry Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of

Pharmaceutical Excipients (FDA, 2005) sieht unter anderem vor, dass neue

Hilfsstoffe, die für Injectabilia genutzt werden sollen, auf ihr hämolytisches Potential

in in vitro Versuchen getestet werden sollen. Dies wird nach 3.4.6 sowohl für PPR-

Partikel als auch für das LAH4-L1-Peptid alleine im Vergleich zur Positivkontrolle

Triton-X-100 durchgeführt. Als Negativkontrolle wird HS-Puffer verwendet. Die

prozentuale Hämolyse, bezogen auf die Positivkontrolle, wird nach 1, 2 und 3

Stunden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-26 gezeigt. PPR-Partikel sind im

Vorfeld so verdünnt worden, dass die eingesetzte siRNA-Konzentration 1 mg/kg

Körpergewicht entspricht. Dies ist eine in der Literatur gängige Dosis (Zhang et al.

2013; Chen et al. 2015; Rengaswamy et al. 2016).


Abbildung 4-26: Zeitabhängige Hämolyse

Die hämolytische Aktivität von PPR-Partikeln und dem LAH4-L1-Peptid ist im zeitlichen

Verlauf dargestellt. Triton Positivkontrolle 100 %; HS-Puffer Negativkontrolle; MW ± SD,

n = 3

Sowohl PPR-Partikel als auch das LAH4-L1-Peptid alleine rufen nach einer Stunde

eine geringe Hämolyse von ca. 7 % hervor. Werden die Normwerte für Erythrozyten

und Hämoglobin (Tabelle 4-1, nach http://flexikon.doccheck.com/de/Normalwerte,

zuletzt aufgerufen am 03.04.2017) im Vergleich zur Indikation einer Transfusion

eines Erythrozytenkonzentrates ab einem Hämoglobinwert von unter 6 - 10 mg/dL

(Müller et al. 2015) betrachtet, so sollte die geringe Hämolyse nach einer Stunde für

Personen, deren Werte vor der Behandlung im Normbereich liegen, unproblematisch

sein. Im zeitlichen Verlauf der hämolytischen Reaktion ist festzustellen, dass nach

2 Stunden ca. 20 % sowie nach 3 Stunden etwa 30 % des vorhandenen

Hämoglobins durch PPR-Partikel freigesetzt worden sind. Für das LAH4-L1-Peptid

alleine liegen die Werte bei 30 %, respektive 37 %. Dieser zeitliche Anstieg der

Hämolyse könnte problematisch sein. Carreno-Gomez & Duncan (1997) haben das

hämolytische Verhalten von unterschiedlichen Chitosan Salzen untersucht. In in vitro

Versuchen haben sie gezeigt, dass zeitabhängig Hämolyse eintritt. Nach 24 Stunden

hat eine komplette Auflösung der Erythrozyten stattgefunden. In Kaninchen hat eine

niedrige Dosis von 4,5 mg/kg Körpergewicht über 11 Tage keine pathologische

Veränderung ergeben. In der Hochdosisgruppe mit 50 mg/kg Körpergewicht

hingegen sind nach drei Tagen 50 % der Versuchstiere verstorben. In der Summe

wertet Baldrick (2010) in einem Review, dass Chitosan nicht parenteral angewendet

PPR LAH4-L1 Triton HS-Puffer 0

20

40

60

80

100

Häm

oly

se [

%]

1 h

2 h

3 h


werden soll. Für das „Mutter-Peptid“ LAH4 sind ebenfalls Untersuchungen zum

hämolytischen Verhalten beschrieben: In einem Konzentrationsbereich von 10-6 bis

10-3 M werden zwischen 5 und 20 % des Hämoglobins nach vierstündiger Inkubation

bei 37 °C freigesetzt. Dies wird als vernachlässigbar eingeschätzt (Vogt & Bechinger

1999).

Die 30 %ige Hämolyse nach dreistündiger Inkubation der Erythrozyten mit den PPR-

Partikeln sollte für die Sauerstoffversorgung eines ansonsten Gesunden

unproblematisch sein. Möglicherweise treten erste Anpassungsreaktionen des

Körpers wie eine erhöhte Herz- und Atemfrequenz auf. Jedoch ist das bei der

Hämolyse freiwerdende Hämoglobin toxisch und kann zu akuten Nierenschäden

führen. Normalerweise bindet Haptoglobin freies Hämoglobin. Der Hämoglobin-

Haptoglobin-Komplex wird dann im retikuloendothelialen System der Milz und der

Leber abgebaut. Durch die Hämolyse von 1 – 2 % der Erythrozyten im Körper wird

bereits das gesamte Haptoglobin verbraucht. Daher besteht bei einer stärkeren

hämolytischen Reaktion die Gefahr von akuten Nierenschäden

(http://flexikon.doccheck.com/de/Haptoglobin, zuletzt aufgerufen am 21.04.2017).

Um die Sicherheit einer intravenösen Anwendung von PPR-Partikel abschließend

beurteilen zu können, müssten in vivo Versuche durchgeführt werden.

Tabelle 4-1: Normwerte für Erythrozyten und Hämoglobin beim Menschen

Normwerte Frauen Männer

Erythrozytenzahl [mio/µL] 4,1 – 5,4 4,5 – 6,0

Hämoglobin [g/dL] 11,5 – 16,4 13,5 – 18,0

nach http://flexikon.doccheck.com/de/Normalwerte, zuletzt aufgerufen am 03.04.2017


4.5 Intrazellulärer Verbleib von PPR-Partikeln

4.5.1 Zelluläre Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln

Damit siRNA ihre Wirkung entfalten kann, muss das siRNA-Trägersystem zunächst

an Zellen binden und aufgenommen werden. Dies wird in durchflusszytometrischen

und konfokal mikroskopischen Versuchen zur zellulären Assoziation und Aufnahme

untersucht.

4.5.1.1 Durchflusszytometrische Bestimmung der zellulären

Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln

Wie in 3.4.2.1 beschrieben, werden PPR-Partikel mit einer Alexa Fluor® (AF) 488-

markierten siRNA nach 3.2.4 hergestellt und mit RH-30 Zellen (60 nM siRNA)

inkubiert. Zusätzlich wird der Versuch analog zu 3.4.2.1 bei 4 °C durchgeführt.

Hierfür werden die entsprechenden Platten eine halbe Stunde nach dem

Mediumwechsel, 30 Minuten vor der Inkubation auf Eis gestellt, mit Aluminiumfolie

abgedeckt und in einem Kühlschrank aufbewahrt.

Abb. 4-27 zeigt die Ergebnisse des Versuches: Nach 3 Stunden fluoreszieren über

95 % der RH-30 Zellen, die bei 37 °C inkubiert worden sind. Von den bei 4 °C

inkubierten RH-30 Zellen fluoreszieren um die 60 % (Abb. 4-27 A). Dies spricht für

eine passive Assoziation der mit einem Zetapotential von ca. 20 mV (Kapitel 4.2.2)

positiv geladenen PPR-Partikel an die negativ geladene Glykokalix der Zellmembran.

Der geometrische Mittelwert der relativen Fluoreszenzintensität gibt an, wie viel

AF 488-markierte siRNA an bzw. in der Zelle ist. Bei 37 °C ist deutlich mehr AF 488-

markierte siRNA assoziiert bzw. aufgenommen worden als bei 4 °C. Die relative

Fluoreszenzintensität der bei 4 °C inkubierten Zellen unterscheidet sich kaum von

den Messwerten der Kontrollzellen (Abb. 4-27 B). Dies lässt darauf schließen, dass

PPR-Partikel passiv an die Zelloberfläche binden, die darauffolgende Aufnahme aber

aktiv abläuft. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass PPR-Partikel bei

37 °C sehr gut von RH-30 Zellen aufgenommen werden, was in einer Transfektion

fast aller untersuchten Zellen resultiert.


Abbildung 4-27: Zelluläre Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln

A: Fluoreszierende RH-30 Zellen bei 37 °C und 4 °C (MW ± SD, n = 3)

B: Geometrischer Mittelwert der relativen Fluoreszenzintensität der fluoreszierenden Zellen

in Abhängigkeit von der Temperatur. (MW ± SD, n = 3)

Kontrolle 37 °C

AF 488 siRNA 37 °C

Kontrolle 4 °C

AF 488 siRNA 4 °C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110fl

uo

reszie

ren

de Z

ellen

[%

]

Kontrolle 37 °C

AF 488 siRNA 37 °C

Kontrolle 4 °C

AF 488 siRNA 4 °C

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

B

A


4.5.1.2 Konfokal mikroskopische Bestimmung der zellulären

Assoziation und Aufnahme von PPR-Partikeln

Um mehr über den Aufnahmeweg sowie über die intrazelluläre Lokalisation der PPR-

Partikel zu erfahren, sind konfokal mikroskopische Aufnahmen nach Kapitel 3.4.4

angefertigt worden. Für die Auswertung sind Stapelaufnahmen auf Zellkernebene

erstellt worden.

Abb. 4-28 zeigt repräsentative Bilder der zeitabhängigen Aufnahme von PPR-

Partikeln in RH-30 Zellen. Nach 30 minütiger Inkubation ist bereits eine geringfügige

Aufnahme von AF 488-markierter siRNA zu erkennen (4-28 B, gelber Pfeil). Das

gelbe Signal weist darauf hin, dass die Aufnahme der PPR-Partikel zunächst über

endosomale Kompartimente verläuft. In Abb. 4-28 C ist dies im unteren Bildabschnitt

sehr gut zu erkennen. Hier sind die Zellen nach einstündiger Inkubation abgebildet.

Zu diesem Zeitpunkt ist ein kleiner Anteil der AF 488-markierten siRNA noch in

endosomalen Kompartimenten (gelber Pfeil). Der größere Anteil der AF 488-

markierten siRNA liegt jedoch punktförmig im Zytosol vor (weiße Pfeile). Dies spricht

dafür, dass die siRNA noch partikulär vorliegt, da sie ansonsten im Zytosol verteilt

sein sollte. Nach 2 Stunden Inkubation ist in einer zunehmenden Zahl an Zellen

AF 488-markierte siRNA zu erkennen (weiße Pfeile), die partikulär im Zytosol vorliegt

(Abb. 4-28 D). In weiteren Versuchen wird die Freisetzung der siRNA aus

endosomalen Kompartimenten und dem Transfektionssystem untersucht.


Abbildung 4-28: Konfokal mikroskopische Aufnahmen von RH-30 Zellen

Repräsentative Aufnahmen von RH-30 Zellen, die mit PPR-Partikeln für 30 Minuten (B),

1 Stunde (C) und 2 Stunden (D) inkubiert worden sind. Unbehandelte Kontrollzellen (A) sind

zum Vergleich abgebildet. Die Zellkerne sind mit DAPI blau angefärbt, endosomale

Kompartimente mit LysoTracker® Red rot und AF 488-markierte siRNA grün. Die

Zellmembran wird mittels Durchlicht (grau) gezeigt. Die weißen Pfeile deuten auf ins Zytosol

aufgenommene AF 488-markierte siRNA, die gelben Pfeile auf AF 488-markierte siRNA, die

sich in endosomalen Kompartimenten befindet.

A B

C D


4.5.2 Versuche zur endosomalen Freisetzung

4.5.2.1 Hämolyse-Versuche zur endosomalen Freisetzung

Nachdem aus den konfokal mikroskopischen Aufnahmen in 4.5.1.2 geschlossen

werden kann, dass die Aufnahme von PPR-Partikeln in RH-30 Zellen über

endosomale Kompartimente verläuft, werden Hämolyse-Versuche bei sauren pH-

Werten nach 3.4.6 durchgeführt. Sie stellen einen Surrogat für die Bestimmung der

endosomalen Freisetzung dar. PPR-Partikel und das LAH4-L1-Peptid sind wie in

4.4.8 in Konzentrationen, die 1 mg siRNA / kg Körpergewicht entsprechen, eingesetzt

worden.

Abbildung 4-29: pH-abhängige Hämolyse

PPR-Partikel und das LAH4-L1-Peptid zeigen eine pH-abhängige Hämolyse, wobei das

LAH4-L1-Peptid bei niedrigeren pH-Werten stärker hämolytisch aktiv ist. Triton-X-100

Positivkontrolle (100 %-Wert); HS-Puffer Negativkontrolle; MW ± SD, n = 3

In Abb. 4-29 ist sowohl für PPR-Partikel als auch für das LAH4-L1-Peptid eine pH-

abhängige Freisetzung von Hämoglobin zu sehen. Beim physiologischen pH-Wert

von 7,4 lysieren PPR-Partikel ca. 10 % der Erythrozyten. Sinkt der pH-Wert wie

während der endosomalen Reifung auf ca. 5,6, so steigt der lysierte Anteil der

Erythrozyten auf etwa 37 % an. Für das LAH4-L1-Peptid alleine liegen die Werte für

die Hämolyse bei 15 % bei pH 7,4 und 41 % bei pH 5,6. Diese Ergebnisse werden

durch Literaturwerte bestätigt: Für das LAH4-L1-Peptid ist berichtet worden, dass es

PPR LAH4-L1 Triton HS-Puffer 0

20

40

60

80

100

Häm

oly

se [

%]

pH 7,4

pH 6,8

pH 6,2

pH 5,6


bei pH 5,5 Bakterien lysiert. Dieser Effekt ist pH-abhängig und findet bei neutralem

pH nicht statt (Mason et al. 2006). Für das „Mutter-Peptid“ LAH4 ist beschrieben,

dass eine Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase aus HepG2 Zellen bei sauren pH-

Werten signifikant höher ist als bei neutralem pH. Wie beim Vergleich von PPR-

Partikeln zu freiem LAH4-L1-Peptid ist die Permeabilisierung durch das alleinige

LAH4-Peptid höher als durch DNA-LAH4-Komplexe (Kichler et al. 2007). Dies

bestätigt die in 4.4.1 gezeigte Komplexbildung: Ein Teil des LAH4-L1-Peptides ist an

die siRNA gebunden und kann dadurch nicht mit der Erythrozytenmembran

wechselwirken.

Der Anstieg der Hämolyse mit sinkendem pH-Wert spricht für die endosomale

Freisetzung der PPR-Partikel, wie sie in den konfokal mikroskopischen Aufnahmen

(4.5.1.2) zu erkennen ist.

4.5.2.2 Gen-Knockdown-Versuche mit Bafilomycin A1

Nachdem in 4.5.2.1 gezeigt worden ist, dass das LAH4-L1-Peptid pH-abhängig

Erythrozyten lysiert, soll überprüft werden, inwieweit die Azidifizierung der

endosomalen Kompartimente für die Gen-Knockdown-Effizienz notwendig ist. Hierfür

werden Gen-Knockdown-Experimente nach 3.4.2.3 in Anwesenheit des

Protonenpumpeninhibitors Bafilomycin A1 (Yoshimori et al. 1991) durchgeführt. Das

Ergebnis ist in Abb. 4-30 gezeigt.

Während PPR-Partikel bei Abwesenheit von Bafilomycin A1 die eGFP-Expression

sehr stark auf 23,3 % ± 0,1 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen

reduzieren, führt die Anwesenheit von 200 nM Bafilomycin A1 zu einer signifikant

höheren eGFP-Expression von 62,4 % ± 1,3 %. Dies ist in Übereinstimmung mit

Ergebnissen von Langlet-Bertin et al. (2010) und der pH-abhängigen Hämolyse. Für

das „Mutter-Peptid“ LAH4 ist der gleiche Effekt bei der Transfektion mit DNA

beschrieben (Kichler et al. 2003). Durch die Absenkung des pH-Wertes während der

endosomalen Reifung werden die Histidin-Reste des LAH4-L1-Peptides protoniert.

Für LAH4 konnte gezeigt werden, dass bei einem pH-Wert von 5,5 im Vergleich zu

pH 7,5 halb so viele Peptide an DNA gebunden sind. Durch die Protonierung der

Imidazol-Gruppen werden weniger Peptide benötigt, um die negative Ladung der

siRNA zu komplexieren. Daher kommt es zu einer Freisetzung von Peptiden aus den


Transfektionskomplexen (Progidi-Fix et al. 2007). Die freigesetzten Peptide können

dann mit der Membran des Endosoms interagieren. Dies führt zur Öffnung oder

Auflösung der Endosomenmembran und zur Freisetzung der PPR-Partikel

(Bechinger 2005; Bechinger & Lohner 2006; Progidi-Fix et al. 2007). Wird die

Azidifizierung der Endosomen mittels Bafilomycin A1 inhibiert, so wird die

Freisetzung der PPR-Partikel aus den Endosomen entsprechend reduziert, was sich

in einem signifikant niedrigeren Gen-Knockdown äußert (Abb. 4-30). Die

Azidifizierung der Endosomen ist folglich für die Freisetzung und Wirkung der PPR-

Partikel notwendig.

Abbildung 4-30: Gen-Knockdown in Abhängigkeit von Bafilomycin A1

Unter der Anwesenheit von 200 nM Bafilomycin A1 (grün) ist die eGFP-Expression

signifikant höher als ohne Bafilomycin A1 (blau). MW ± SD, n = 3, * = signifikant mit α = 5 %

4.5.3 Untersuchungen zur Freisetzung ins Zytosol mittels

Molecular Beacons

Mit Hilfe von Molecular Beacons (MB) soll, wie in 3.4.3 beschrieben, die Freisetzung

der siRNA ins Zytosol untersucht werden. Zuerst liegen MB in einer nicht

fluoreszierenden Haarnadelkonfirmation vor. Sobald sie ins Zytosol gelangen, binden

sie an eine komplementäre mRNA, wodurch Quencher und Fluorophor getrennt

werden und Fluoreszenzlicht emittiert wird (Tyagi & Kramer 1996).

Kontrolle ohne Bafilomycin mit Bafilomycin 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%] *


4.5.3.1 Kalibrierung

Um die assoziierte bzw. freigesetzte Menge an AF 488-markierter siRNA und ROX-

/BHQ2-markierten MB quantifizieren zu können, werden zunächst Kalibrierfunktionen

nach 3.4.3.1 aufgenommen und auf Linearität überprüft.

Tabelle 4-2 zeigt die ermittelten Korrelationskoeffizienten der Kalibrierfunktionen. Für

beide Fluoreszenzfarbstoffe ist die beste Linearität bei der Verwendung des

arithmetischen Mittelwertes (Mean) gegeben. In Abb. 4-31 sind die

Kalibrierfunktionen beispielhaft anhand der zweiten Versuchsdurchführung gezeigt.

Tabelle 4-2: Korrelationskoeffizienten der Kalibrierfunktionen

R² für AF 488 R² für MB

GeoMean Mean Median GeoMean Mean Median

Kalibrierung 1 0,98 0,99 0,99 0,97 1,00 0,99

Kalibrierung 2 0,97 0,99 0,98 0,83 0,99 0,77

Kalibrierung 3 0,98 0,99 0,99 0,71 0,98 0,62


Abbildung 4-31: Kalibrierfunktionen für Alexa Fluor® 488-markierte siRNA und

ROX-/BHQ2-markierte Molecular Beacons

Es sind repräsentative Kalibrierfunktionen dargestellt. Der geometrische Mittelwert

(GeoMean), der arithmetische Mittelwert (Mean) sowie der Median der relativen

Fluoreszenzintensität (RFI) ist gegen die eingesetzte Konzentration an AF 488-markierter

siRNA (oben) bzw. ROX-/BHQ2-markierter MB (unten) aufgetragen.

R² = 0,97

R² = 0,99

R² = 0,98

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 10 20 30 40 50

rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

AF 488-markierte siRNA [nM]

AF 488 GeoMean

AF 488 Mean

AF 488 Median

Linear (AF 488GeoMean)

Linear (AF 488Mean)

Linear (AF 488Median)

R² = 0,83

R² = 0,99

R² = 0,77

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 10 20 30 40 50

rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

ROX-/BHQ2-markierte MB [nM]

MB GeoMean

MB Mean

MB Median

Linear (MB GeoMean)

Linear (MB Mean)

Linear (MB Median)


4.5.3.2 Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf der Aufnahme und

Freisetzung

Nachdem der arithmetische Mittelwert (Mean) der relativen Fluoreszenzintensität als

Kalibrierparameter festgelegt worden ist (Kapitel 4.5.3.1), wird der zeitliche Verlauf

der Aufnahme von PPR-Partikeln sowie die Freisetzung der MB aus den PPR-

Partikeln nach Kapitel 3.4.3.2 bestimmt. Dies ist in Abb. 4-32 dargestellt.

Die AF 488-markierte siRNA soll die zellulär assoziierte und aufgenommene Menge

repräsentieren und die MB den freigesetzten Anteil. Bei der Betrachtung der

Kurvenverläufe ist auffällig, dass die Kurve der ROX-/BHQ2-markierten MB zwischen

2 und 12 Stunden deutlich oberhalb der Kurve für AF 488-markierte siRNA verläuft.

Eigentlich wäre davon auszugehen, dass die beiden Kurvenverläufe lediglich zeitlich

verschoben sind, da nur das freigesetzt werden kann, was vorher auch

aufgenommen worden ist (Zhou et al. 2013).

Zusätzlich ist bei dem Kurvenverlauf für die AF 488-markierte siRNA zu erkennen,

dass die Werte für die aufgenommene Menge zwischen 6 und 12 Stunden erneut

ansteigen. Dies entspricht ebenfalls nicht der Erwartung, da zu diesem Zeitpunkt

durch den Waschschritt nach 3 Stunden keine freien PPR-Partikel mehr im Medium

enthalten sein sollten.

Der Kurvenverlauf für die ROX-/BHQ2-markierten MB gleicht einer Bateman-

Funktion und entspricht damit der Erwartung. Nach 30 Minuten ist noch keine

Freisetzung ins Zytosol messbar. Dann steigen die Messwerte bis zum Zeitpunkt

3 Stunden an. Hier erfolgt der Mediumwechsel, sodass ab 3 Stunden die Messwerte

wieder absinken.


Abbildung 4-32: Zeitlicher Verlauf der Aufnahme von Alexa Fluor® 488-

markierter siRNA und der Freisetzung von ROX-/BHQ2-

markierter MB

Zur Umrechnung der Messwerte in die zelluläre Konzentration wird der Mittelwert der drei

aufgenommenen Kalibrierfunktionen (Kapitel 4.5.3.1) verwendet. (MW ± SD, n = 3)

Der Kurvenverlauf für die AF 488-markierte siRNA entspricht nicht den Erwartungen.

Dies liegt wahrscheinlich an Interaktionen der Fluoreszenzfarbstoffe. Die Energie des

angeregten Alexa Fluor® 488 Farbstoffs kann im Zuge eines Förster-

Resonanzenergietransfers (FRET) auf ROX übertragen werden. Von ROX wird die

Energie dann weiter auf den Quencher BHQ2 übertragen, sodass kein

Fluoreszenzlicht emittiert wird.

Bei einem Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) wird Energie strahlungsfrei von

einem Donor-Molekül auf ein Akzeptor-Molekül übertragen (Förster 1948). Hierfür

müssen drei Voraussetzungen erfüllt sein (Förster 1948, Stryer 1978, Lakowicz 2010,

Broussard et al. 2013):

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

zellu

läre

Ko

nzen

tratr

ati

on

[n

M]

Zeit [h]

AF 488 siRNA

ROX/BHQ2 MB


I Das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls muss mit dem

Anregungsspektrum des Akzeptor-Moleküls überlappen.

II Donor und Akzeptor dürfen maximal 10 nm voneinander entfernt sein.

III Die beiden Moleküle müssen eine parallele Dipolausrichtung aufweisen.

Das Emissionsspektrum von AF 488 reicht von ca. 475 nm bis etwa 635 nm. Das

Anregungsspektrum von ROX beginnt im UV-Bereich und endet bei 620 nm. Somit

ist die erste Voraussetzung – die Überschneidung der Emissions- und

Anregungsspektren – erfüllt. In einem ca. 250 nm großen Partikel ist ein maximaler

Abstand der beiden Moleküle von 10 nm sowie eine parallele Dipolausrichtung

vorstellbar. Die Hypothese, dass AF 488 und ROX ein FRET-Paar bilden, wird durch

eine Messung am Fluorimeter nach 3.3.8 bekräftigt. Das Ergebnis ist in Abb. 4-33

dargestellt.

Abbildung 4-33: Emissionsspektren von PPR-Partikeln mit MB

Die Emissionsspektren von PPR-Partikeln mit AF 488-markierter siRNA mit MB, die

entweder nicht markiert oder mit ROX-BHQ2-markiert sind, werden vergleichend dargestellt.

Während bei unmarkierten MB ein deutliches AF 488 Signal zu detektieren ist, weist das

Spektrum mit den ROX-/BHQ2-markierten MB nur ein geringes Maximum bei einer ähnlichen

Wellenlänge auf (ca. 507 nm mit ROX-/BHQ2-Markierung zu etwa 514 nm ohne zweiten

Fluoreszenzfarbstoff).

0

50

100

150

200

250

300

490 540 590 640 690 740 790

rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

Wellenlänge [nm]

AF 488 siRNA mitunmarkierten MBAF 488 siRNA mitROX-/BHQ2-MB


AF 488-markierte siRNA zusammen mit unmarkierten MB zeigt nach einer Anregung

bei 488 nm ein AF-Spektrum mit deutlich erkennbarem Maximum bei 514 nm mit

einer RFI von ca. 270. Im Vergleich dazu zeigt die gleiche Menge AF 488-markierte

siRNA zusammen mit ROX-/BHQ2-markierten MB eine stark geminderte relative

Fluoreszenzintensität von nur noch 34. Das Maximum ist hierbei im

Wellenlängenbereich nach links zu ca. 507 nm verschoben. Dies spricht für einen

strahlungslosen Energietransfer von AF 488 auf ROX. Von ROX wird die Energie

wiederum strahlungsfrei auf den Quencher BHQ2 übertragen, sodass keine ROX-

Fluoreszenz messbar ist.

Somit lässt sich durch den Versuchsaufbau (AF 488-markierte siRNA und ROX-

/BHQ2-markierte MB) zwar die zeitliche Freisetzung der MB ins Zytosol bestimmen,

jedoch nicht die zeitliche Assoziation und Aufnahme der PPR-Partikel. Assoziierte

PPR-Partikel emittieren weniger Fluoreszenzlicht als während der Kalibrierung, da

die Energie vom angeregten AF 488-Molekül auf ROX übertragen wird. Erst wenn

eine räumliche Trennung zwischen AF 488 und ROX durch die Dekomplexierung der

PPR-Partikel auftritt, emittiert AF 488 die gleiche Energie wie während der

Kalibrierung. Ein Lösungsansatz für dieses Problem wäre eine Kalibrierung mit

doppelt fluoreszenzmarkierten PPR-Partikeln. Zusätzlich sollte für jeden Zeitpunkt

eine einzelne Kalibrierung erstellt werden.

4.5.4 Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-

Peptiden

Um mehr über den intrazellulären Verbleib des LAH4-L1-Peptides zu erfahren und

die Hypothese des FRET-Effektes zwischen AF 488 und ROX weiter zu untersuchen,

werden zwei fluoreszenzmarkierte LAH4-L1-Peptide eingesetzt. Hierbei wird zum

einen wie bei den MB ROX verwendet und zum anderen Quasar® 670. Die Synthese

und Aufreinigung der beiden fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-Peptide sind von Herrn

Christopher Aisenbrey (Institut de Chimie, Université de Stasbourg/CNRS,

Frankreich) durchgeführt worden. Zuerst ist untersucht worden, ob die

Fluoreszenzmarkierungen einen Einfluss auf die zelluläre Aufnahme und die

Knockdown-Effizienz der PPR-Partikel haben.


4.5.4.1 Untersuchungen zum Einfluss der fluoreszenzmarkierten

LAH4-L1-Peptide auf die zelluläre Assoziation und

Aufnahme von PPR-Partikeln

Um den Einfluss der Fluoreszenzmarkierungen auf die zelluläre Assoziation und

Aufnahme zu untersuchen, werden Mischungen von markierten und nicht markierten

Peptiden mit 0 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 % fluoreszenzmarkiertem LAH4-L1-

Peptid hergestellt. Diese Peptid-Mischungen werden zur Herstellung der PPR-

Partikel nach 3.2.4 mit einer AF 488-markierten siRNA verwendet. Die Messung der

zellulären Assoziation und Aufnahme wird wie in 3.4.2.1 beschrieben durchgeführt.

Die Ergebnisse für das ROX-markierte LAH4-L1-Peptid sind in Abb. 4-34 gezeigt, die

für das Quasar® 670-markierte LAH4-L1-Peptid in Abb. 4-36.

Nach einer Stunde ist für das ROX-markierte LAH4-L1-Peptid (Abb. 4-34 A) zu

erkennen, dass weniger Zellen AF 488-positiv sind, je größer der ROX-LAH4-L1-

Peptidanteil in der Formulierung ist. Auch der Anteil der rot fluoreszierenden Zellen

sinkt mit steigendem ROX-LAH4-L1-Peptidgehalt. Dies spricht dafür, dass die ROX-

Markierung die zelluläre Assoziation und Aufnahme verlangsamt.

Die Kurve der ROX positiven Zellen verläuft deutlich oberhalb der AF 488 positiven

Zellen. Theoretisch ist davon auszugehen, dass jede Zelle, die doppelt gefärbte

PPR-Partikel aufnimmt, in beiden Farben fluoresziert. Nach 2 und 3 Stunden (Abb. 4-

34 B und C) nähern sich die beiden Kurven aneinander an. Bei 25 % ROX-LAH4-L1-

Peptid sind nach dreistündiger Inkubation gleichviele Zellen grün wie rot

fluoreszierend. Dies ist ein weiterer Hinweis auf die FRET-Theorie zwischen AF 488

und ROX innerhalb der PPR-Partikel (vgl. 4.5.3.2). Solange die AF 488-markierte

siRNA mit dem ROX-markierten LAH4-L1-Peptid komplexiert vorliegt, ist das AF 488-

Signal abgeschwächt. Wird die siRNA über die Zeit dekomplexiert, so erhöht sich der

Abstand von AF 488 zu ROX und das AF 488 Signal steigt an, sodass sich die Werte

für die AF 488-positive Zellen denen der ROX-positiven annähern.


Abbildung 4-34: Aufnahme AF 488- und ROX-markierter PPR-Partikel

Die zelluläre Assoziation und Aufnahme von AF 488 (siRNA)- und ROX (LAH4-L1)-

markierten PPR-Partikeln in RH-30 Zellen wird in Abhängigkeit des ROX-LAH4-L1-Anteils

sowie der Zeit (A 1 h, B 2 h, C 3 h) dargestellt. Repräsentatives Ergebnis der

Dreifachbestimmung. AF 488 grüne Rauten, ROX rote Quadrate.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]

Anteil ROX-markiertes LAH4-L1-Peptid [%]

AF 488

ROX

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]


0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]


A

B

C


Um zu überprüfen, ob AF 488 und ROX ein FRET-Paar bilden, werden

Fluoreszenzmessungen nach Kapitel 3.3.8 durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abb. 4-

35 gezeigt: AF 488-markierte siRNA komplexiert mit einem nicht markierten LAH4-

L1-Peptid zeigt ein AF 488-Spektrum. Wird die AF 488 siRNA stattdessen mit einem

ROX-markierten LAH4-L1-Peptid (50 % des LAH4-L1 markiert) komplexiert, sinkt das

AF 488 Signal von einer relativen Fluoreszenzintensität von ca. 360 auf etwa 80

deutlich ab. Außerdem tritt ein zweites Maximum bei 600 nm auf, dem

Emissionsmaximum von ROX. Eine Messung von nicht markierter siRNA,

komplexiert mit ROX-markierten LAH4-L1, zeigt kein Emissionsmaximum.

Abbildung 4-35: Emissionsspektren von AF 488- und / oder ROX-markierten

PPR-Partikeln

Alle drei Proben werden bei 488 nm angeregt. Das Emissionsspektrum der PPR-Partikel mit

AF 488-markierter siRNA entspricht dem von AF 488 (grün). Doppelt fluoreszenzmarkierte

PPR-Partikel zeigen eine reduzierte relative Fluoreszenzintensität im Bereich des AF 488

Signals (um 510 nm) und ein zweites Maximum bei 600 nm, dem Emissionsmaximum von

ROX (dunkelrot). PPR-Partikel, die nur ROX-markiert sind, zeigen keine Fluoreszenz

(hellrot).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

490 540 590 640 690 740

rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

Wellenlänge [nm]

AF 488 siRNA mit unmarkierten LAH4-L1 AF 488 siRNA mit ROX-LAH4-L1

unmarkierte siRNA mit ROX-LAH4-L1


Die Fluoreszenzmessungen bestätigen die Hypothese, dass AF 488 und ROX ein

FRET-Paar bilden. Bei 488 nm wird AF 488 angeregt. Ist kein weiterer

Fluoreszenzfarbstoff vorhanden, wird ein AF 488-Spektrum emittiert. Ist jedoch ROX

als zweiter Fluoreszenzfarbstoff in unmittelbarer Nähe zu AF 488, wird die Energie

strahlungsfrei auf ROX übertragen, sodass eine Fluoreszenz im Bereich des

Emissionsmaximums von ROX um 600 nm gemessen werden kann. Diese Emission

bei 600 nm ist bei einer alleinigen Anregung von ROX mit λ = 488 nm nicht

feststellbar.

Beim Quasar® 670-markierten LAH4-L1-Peptid sind ebenfalls weniger Zellen grün-

fluoreszierend als dunkelrot-fluoreszierend (Abb. 4-36). Wie beim ROX-markierten

LAH4-L1-Peptid nähern sich die Kurvenverläufe der AF 488-positiven Zellen denen

der Quasar® 670-positiven Zellen mit der Zeit an. Im Gegensatz zu den ROX-

markierten PPR-Partikeln bleibt der Wert für die grün-fluoreszierenden Zellen mit

steigenden Mengen an Quasar® 670 konstant. Der Anteil dunkelrot-fluoreszierender

Zellen steigt mit zunehmendem Quasar® 670 Gehalt an und erreicht nach 3 Stunden

über 99 % (Abb. 4-36 C).

Auch für die Farbstoffkombination AF 488 - Quasar® 670 soll überprüft werden, ob

ein FRET-Effekt vorliegt. Dafür werden wie in 3.3.8 beschrieben

Fluoreszenzmessungen durchgeführt. Die Fluoreszenzspektren sind in Abb. 4-37

abgebildet. Durch den Zusatz von Quasar® 670 (50 % des LAH4-L1 markiert) wird

die relative Fluoreszenzintensität von AF 488 zwar deutlich gesenkt, aber es ist kein

zweites Maximum detektierbar. Während AF 488 und ROX ein FRET-Paar ausbilden,

scheint Quasar® 670 auf AF 488 als Quencher zu wirken.


Abbildung 4-36: Aufnahme AF 488- und Quasar® 670-markierter PPR-Partikel

Die zelluläre Assoziation und Aufnahme von AF 488 (siRNA)- und Quasar® 670 (LAH4-L1)-

markierten PPR-Partikeln in RH-30 Zellen wird in Abhängigkeit des Quasar® 670-LAH4-L1-

Anteils sowie der Zeit (A 1 h, B 2 h, C 3 h) dargestellt. Repräsentatives Ergebnis der

Dreifachbestimmung. AF 488 grüne Rauten, Quasar® 670 blaue Quadrate.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]

Anteil Quasar® 670-markiertes LAH4-L1-Peptid [%]

AF 488

Quasar 670

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]


0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]


A

B

C


Abbildung 4-37: Emissionsspektren von AF 488- und / oder Quasar® 670-

markierten PPR-Partikeln

Alle drei Proben werden bei 488 nm angeregt. Das Emissionsspektrum der PPR-Partikel mit

AF 488-markierter siRNA entspricht dem von AF 488 (grün). Doppelt fluoreszenzmarkierte

PPR-Partikel zeigen eine reduzierte relative Fluoreszenzintensität im Bereich des AF 488

Signals (um 510 nm, dunkelblau). PPR-Partikel, die nur Quasar® 670-markiert sind, zeigen

keine Fluoreszenz (hellblau).

4.5.4.2 Knockdown-Effizienz der fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-

Peptide

Die Knockdown-Effizienz der fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-Peptide wird in stabil

eGFP-transfizierten RH-30 Zellen nach 3.4.2.2 untersucht. Hierfür werden

Mischungen von markierten und nicht markierten Peptiden mit 0 %, 25 %, 50 %,

75 % und 100 % fluoreszenzmarkiertem LAH4-L1-Peptid hergestellt. Diese Peptid-

Mischungen werden zur Herstellung der PPR-Partikel nach 3.2.4 verwendet.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

490 540 590 640 690 740rela

tiv

e F

luo

reszen

zin

ten

sit

ät

(RF

I)

Wellenlänge [nm]

AF 488 siRNA mit unmarkierten LAH4-L1 AF 488 siRNA mit Quasar 670-LAH4-L1

unmarkierte siRNA mit Quasar 670-LAH4-L1


Die Ergebnisse der Knockdown-Versuche sind in Abb. 4-38 für die ROX-Markierung

und in Abb. 4-39 für die Quasar® 670-Markierung gezeigt. Bis zu 75 % des

eingesetzten LAH4-L1-Peptides kann eine ROX-Markierung tragen, ohne dass sich

die eGFP-Expression signifikant vom nicht markierten LAH4-L1-Peptid unterscheidet.

Für Quasar® 670 liegt der Anteil nur bei 50 %. Wird ein höherer Anteil an

Quasar® 670-markierten LAH4-L1-Peptid verwendet, sinkt der Gen-Knockdown

gegenüber dem unmarkierten Peptid deutlich an. Für weitere Versuche wird der

markierte Peptidanteil daher auf 50 % begrenzt.

Abbildung 4-38: Abhängigkeit des Gen-Knockdowns von der ROX-Markierung

des LAH4-L1-Peptides


der ROX-Markierung des LAH4-L1-Peptides dargestellt. Die Unterschiede in der eGFP-

Expression zwischen unmarkierten LAH4-L1-Peptid und 100 % ROX-markierten LAH4-L1-

Peptid sind signifikant. Bis zu einem ROX-Gehalt von 75 % unterscheiden sich die eGFP-

Expressionen zum nicht markierten LAH4-L1-Peptid nicht signifikant voneinander. MW ± SD,

n = 3, ns = nicht signifikant, * = signifikant mit α = 5 %

Kontrolle 0 % 25 % 50 % 75 % 100 % 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

Anteil an ROX-markiertem LAH4-L1-Peptid

ns

*


Abbildung 4-39: Abhängigkeit des Gen-Knockdowns von der Quasar® 670-

Markierung des LAH4-L1-Peptides


der Quasar® 670-Markierung des LAH4-L1-Peptides dargestellt. Die Unterschiede in der

eGFP-Expression zwischen unmarkiertem LAH4-L1-Peptid, 25 % und 50 % Quasar® 670-

markiertem LAH4-L1-Peptid sind nicht signifikant. Bei 75 % und 100 % Quasar® 670-

markiertem LAH4-L1-Peptid sind deutlich höhere Werte für die eGFP-Expression messbar.

MW ± SD, n = 4, ns = nicht signifikant mit α = 5 %

Kontrolle 0 % 25 % 50 % 75 % 100 % 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

Anteil an Quasar® 670-markiertem LAH4-L1-Peptid

ns


4.5.4.3 Konfokale Mikroskopie mit fluoreszenzmarkierten LAH4-L1-

Peptiden

Um weitere Informationen über die zelluläre Aufnahme der PPR-Partikel sowie die

Trennung von LAH4-L1-Peptid und siRNA zu gewinnen, werden konfokal

mikroskopische Aufnahmen nach Kapitel 3.4.4 angefertigt. Für die Auswertung

werden Stapelaufnahmen auf Zellkernebene erstellt. Die Versuche werden sowohl

mit dem Quasar® 670- (Abb.4-40) als auch mit dem ROX-markierten (Abb. 4-41)

LAH4-L1-Peptid durchgeführt. Hierbei tragen jeweils 50 % des eingesetzten LAH4-

L1-Peptides einen Fluoreszenzfarbstoff. Außerdem werden die Versuche mit bzw.

ohne Bafilomycin A1 durchgeführt, um die pH-Abhängigkeit der endosomalen

Freisetzung aus Kapitel 4.5.2 zu bestätigen.

In Abb. 4-40 und 4-41 sind jeweils repräsentative Bilder der Zeit- und Bafilomycin A1-

abhängigen Aufnahme von PPR-Partikeln in RH-30 Zellen gezeigt: Nach einer

Stunde sind unabhängig vom Bafilomycin A1-Zusatz PPR-Partikel aufgenommen

worden (jeweils B und E). Sie befinden sich in endosomalen Kompartimenten. Dies

wird in Abb. 4-40 durch die Überlagerung von grün (AF 488-markierte siRNA),

magenta (Quasar® 670-markiertes LAH4-L1-Peptid) und rot (LysoTracker® Red)

weiß dargestellt (weiße Pfeile). In Abb. 4-41 besteht die Überlagerung aus grün

(AF 488-markierte siRNA), rot (ROX-markiertes LAH4-L1-Peptid) und magenta

(LysoTracker® Deep Red) und erscheint weiß bis gelb (weiße Pfeile).

Nach zwei Stunden ist ohne Bafilomycin A1 eine Freisetzung von siRNA (grüne

Pfeile jeweils in C) erkennbar. Werden die Zellen jedoch zusätzlich mit dem

Protonenpumpeninhibitor Bafilomycin A1 inkubiert, verbleibt die siRNA mit dem

LAH4-L1-Peptid in den endosomalen Kompartimenten (weiße Pfeile jeweils in F).

Damit bestätigen die konfokal mikroskopischen Aufnahmen, dass die Freisetzung der

siRNA von der Azidifizierung der endosomalen Kompartimente abhängt (siehe auch

Kapitel 4.5.2).

Bei der Verwendung des Quasar® 670-markierten LAH4-L1-Peptides erscheint die

Freisetzung der siRNA nach 2 Stunden ohne Bafilomycin A1 schwächer als beim

ROX-markierten LAH4-L1-Peptid (jeweils C). Neben der Möglichkeit einer

schlechteren Komplexierung der siRNA durch das Quasar® 670-markierten LAH4-L1-


Peptides kann eine schlechtere Freisetzung der siRNA ein Grund für die schlechtere

Knockdown-Effizienz des Quasar® 670-markierten LAH4-L1-Peptides in Kapitel

4.5.4.2 sein.

Abbildung 4-40: Konfokal mikroskopische Aufnahmen von RH-30 Zellen mit

dem Quasar® 670-markierten LAH4-L1-Peptid

Repräsentative Aufnahmen von RH-30 Zellen, die mit PPR-Partikeln für eine Stunde (B und

E) und zwei Stunden (C und F) inkubiert worden sind. Unbehandelte Kontrollzellen (A und D)

sind zum Vergleich abgebildet. Die Zellkerne sind mit DAPI blau angefärbt, endosomale

Kompartimente mit LysoTracker® Red rot, das Quasar® 670-markierte LAH4-L1-Peptid

magenta und AF 488-markierte siRNA grün. Die Zellmembran wird mittels Durchlicht grau

dargestellt. A, B und C zeigen die Aufnahme der PPR-Partikel ohne Bafilomycin A1; D, E

und F mit Bafilomycin A1. Die weißen Pfeile deuten auf aufgenommene PPR-Partikel in

endosomalen Kompartimenten, die grünen Pfeile auf AF 488-markierte siRNA, die sich frei

im Zytosol befindet. In A, B, C und D betragen die Messbalken 5 µm, in E und F 10 µm.

A B

D

C

E F


Abbildung 4-41: Konfokal mikroskopische Aufnahmen von RH-30 Zellen mit

dem ROX-markierten LAH4-L1-Peptid

Repräsentative Aufnahmen von RH-30 Zellen, die mit PPR-Partikeln für eine Stunde (B und

E) und zwei Stunden (C und F) inkubiert worden sind. Unbehandelte Kontrollzellen (A und D)

sind zum Vergleich abgebildet. Die Zellkerne sind mit DAPI blau angefärbt, endosomale

Kompartimente mit LysoTracker® Deep Red magenta, das ROX-markierte LAH4-L1-Peptid

rot und AF 488-markierte siRNA grün. Die Zellmembran wird mittels Durchlicht grau

dargestellt. A, B und C zeigen die Aufnahme der PPR-Partikel ohne Bafilomycin A1; D, E

und F mit Bafilomycin A1. Die weißen Pfeile deuten auf aufgenommene PPR-Partikel in

endosomalen Kompartimenten, die grünen Pfeile auf AF 488-markierte siRNA, die sich frei

im Zytosol befindet. Die Messbalken betragen 10 µm.

A C B

E D F


4.5.5 Durchflusszytometrischer siRNA-Freisetzungsversuch unter

Ausnutzung eines FRET-Effektes zwischen AF 488 und ROX

Wie in 4.5.4.1 gezeigt worden ist, bilden AF 488 und ROX in PPR-Partikeln ein

FRET-Paar. In der Literatur ist sowohl für DNA- als auch für siRNA-Trägersysteme

beschrieben, dass der FRET-Effekt zur Untersuchung der Nukleinsäurefreisetzung

aus dem Trägersystem verwendet werden kann (Matsumoto et al. 2009; Schneider et

al. 2010; Alabi et al. 2012; Werfel et al. 2016; Bujold et al. 2016). Daher soll das

FRET-Paar AF 488 - ROX in diesem Versuch benutzt werden, um die Freisetzung

der AF 488-markierten siRNA aus den PPR-Partikeln in Abhängigkeit von der

Azidifizierung der endosomalen Kompartimente sowie der Zeit zu bestimmen. Hierfür

wird analog zu 3.4.2.3 und 3.4.2.1 vorgegangen: PPR-Partikel mit AF 488-markierter

siRNA und ROX-LAH4-L1 (100 % markiert) werden wie in 3.2.4. beschrieben

hergestellt und mit RH-30 Zellen mit und ohne 200 nM Bafilomycin A1 inkubiert.

Nach 1, 2 und 3 Stunden wird der Anteil der fluoreszierenden Zellen

durchflusszytometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-42 dargestellt.

Die zelluläre Assoziation und Aufnahme wird in diesem Fall über die ROX-

Fluoreszenz des LAH4-L1-Peptides bestimmt. Sie steigt mit der Zeit und ist

unabhängig vom Bafilomycin A1-Zusatz. Dies ist durch den überlagerten

Kurvenverlauf der ROX-markierten Zellen mit Bafilomycin A1 (rote Rauten) und ohne

Bafilomycin A1 (rote Quadrate) zu erkennen. Die Kurve der AF 488-markierten Zellen

bei Anwesenheit von Bafilomycin A1 (grüne Punkte) verläuft parallel zu den Kurven

der ROX-markierten Zellen, jedoch deutlich niedriger. Dies liegt an dem FRET-Effekt

zwischen AF 488 und ROX. Durch die fehlende Azifizierung der endosomalen

Kompartimente durch das Bafilomycin A1 bleiben PPR-Partikel in diesen, wie mit den

konfokal mikroskopischen Bildern in 4.5.4.3 gezeigt, eingeschlossen. Es kommt zu

keiner räumlichen Trennung zwischen AF 488 und ROX (vergleiche Kapitel 4.5.2.2),

wodurch das AF 488 Signal deutlich abgeschwächt ist. Die Kurve der AF 488-

markierten Zellen bei Abwesenheit von Bafilomycin A1 startet nach einstündiger

Inkubation leicht oberhalb der Kurve für die AF 488-positiven Zellen mit Bafilomycin

A1. Im zeitlichen Verlauf zeigt sie eine deutliche Steigung, sodass nach 3 Stunden

fast genauso viele Zellen rot wie grün fluoreszieren. Durch die Absenkung des pH-

Wertes in den endosomalen Kompartimenten wird das LAH4-L1-Peptid protoniert. Es


kommt, wie in 4.5.2.2 beschrieben, zu einer Freisetzung von LAH4-L1 aus dem

Transfektionssystem (Progidi-Fix et al. 2007). Das freie LAH4-L1-Peptid führt über

Wechselwirkungen mit der endosomalen Membran zur endosomalen Freisetzung

(Bechinger 2005; Bechinger & Lohner 2006; Progidi-Fix et al. 2007). Dies resultiert in

der räumlichen Trennung von AF 488 und ROX, sodass beide Fluoreszenzen im

Durchflusszytometer gemessen werden können.

Abbildung 4-42: Freisetzungsuntersuchung mittels FRET-System und

Bafilomycin A1

Die Freisetzung der AF 488-markierten siRNA aus den PPR-Partikeln mit ROX-markierten

LAH4-L1-Peptid wird über die Zeit mit und ohne Bafilomycin A1 untersucht. Mit der Zeit steigt

der Anteil der rot fluoreszierenden Zellen an. Hierbei verlaufen die beiden Kurven der Proben

mit und ohne Bafilomycin A1 aufeinander (rote Rauten mit Bafilomycin A1, rote Quadrate

ohne Bafilomycin A1). Mit Bafilomycin A1 sind weniger Zellen AF 488 positiv (grüne Punkte)

als ohne Bafilomycin A1 (grüne Dreiecke). Der Abstand der beiden Kurven steigt mit der Zeit.

Die Kurve der AF 488-markierten Zellen ohne Bafilomycin A1 nähert sich über die Zeit der

Kurve der ROX-markierten Zellen an.

0

20

40

60

80

0 1 2 3 4

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]

Zeit [Stunden]

ROX-markierte Zellenmit Bafilomycin A1

ROX-markierte Zellenohne Bafilomycin A1

AF 488-markierte Zellenmit Bafilomycin A1

AF 488-markierte Zellenohne Bafilomycin A1


4.6 Spezifität und aktives Targeting

Es wird untersucht, ob PPR-Partikel die eGFP-Expression wie in RH-30 auch in

HeLa Zellen herunterregulieren können. Im Folgenden werden dann Versuche

unternommen, um eine Spezifität durch die gezielte Ansteuerung von Integrin-

Rezeptoren, die auf RH-30 nicht aber auf HeLa Zellen exprimiert werden, durch

RGD-Peptide zu erreichen (Chatterjee & Chatterjee 2001; Striepe 2010; Cai et al.

2011; Arosio & Casagrande 2016; Choi et al. 2017). Dies hat das Ziel, dass

möglichst wenig siRNA in andere als die gewünschten Zellen gelangt.

4.6.1 Überprüfung der Spezifität von PPR-Partikeln

Die Knockdown-Effizienz von PPR-Partikeln wird in stabil eGFP-transfizierten HeLa

Zellen im Vergleich zu stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen untersucht. Hierfür

wird wie in 3.4.2.2. beschrieben vorgegangen. Die Ergebnisse sind in Abb. 4-43

dargestellt.

Abbildung 4-43: Vergleich der eGFP-Expression von HeLa und RH-30 Zellen

HeLa und RH-30 Zellen werden mit PPR-Partikeln behandelt und die eGFP-Expression

bestimmt. PPR-Partikel rufen sowohl in RH-30 als auch in HeLa Zellen eine signifikante

Reduktion der eGFP-Expression im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen hervor. Die

eGFP-Expression der HeLa Zellen ist signifikant höher als die in RH-30 Zellen. MW ± SD,

n = 3, * = signifikant mit α = 5 %

Kontrolle HeLa RH-30 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

*

*

*


PPR-Partikel führen sowohl in HeLa als auch in RH-30 Zellen zu einem signifikanten

Rückgang der eGFP-Expression. Somit sind PPR-Partikel nicht spezifisch für RH-30

Zellen, können aber in dieser Zelllinie die eGFP-Expression signifikant stärker

herunterregulieren als in HeLa Zellen. Über Modifizierungen sollen PPR-Partikel in

RH-30 Zellen weiterhin einen sehr hohen Gen-Knockdown hervorrufen, aber in HeLa

Zellen möglichst keinen.

4.6.2 RGD-modifizierte PPR-Partikel

PPR-Partikel werden, wie in 3.2.7.1. beschrieben, mit einem negativ geladenen

RGD-Peptid inkubiert. Die Proben werden anschließend gemäß 3.3.1 auf ihre Größe

und gemäß 3.3.2 auf ihr Zetapotential hin untersucht. Außerdem werden sie im Gen-

Knockdown-Modell nach 3.4.2.2. getestet. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen

4-44 (Größe und Zetapotential) und 4-45 (Gen-Knockdown) gezeigt.

Abbildung 4-44: Größe und Zetapotential von RGD-modifizierten PPR-Partikeln

Der hydrodynamische Durchmesser sowie das Zetapotential sind gegen die Menge an

zugesetztem RGD-Peptid aufgetragen. Je mehr negativ geladenes RGD-Peptid

hinzugegeben wird, desto niedriger wird das Zetapotential (rote Kreise). Die Größe der

Partikel steigt tendenziell mit der Zugabe an RGD-Peptid (blaue Rauten) an.

Jeder Kreis und jede Raute entsprechen einer unabhängigen Versuchsdurchführung.

0

5

10

15

20

25

30

0

100

200

300

400

500

600

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Zeta

po

ten

tial

[mV

]

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

RGD-Peptid [µg]

hydrodynamischer Durchmesser Zetapotential


Das Zetapotential der Komplexe sinkt von Werten um 20 mV bei PPR-Partikeln mit

dem Zusatz an negativ geladenem RGD-Peptid auf Werte um 2 mV bei der größten

zugesetzten RGD-Menge von 3 mg. Dabei verläuft die Abnahme des Zetapotentials

tendenziell exponentiell. Wird diese Entwicklung mit den Zetapotential-Kurven aus

4.2.1 und 4.2.2 verglichen, so ist der unterschiedliche Verlauf auffällig. Während bei

der Bildung der Protamin-siRNA-Partikel (4.2.1) und der PPR-Partikel (4.2.2) das

Zetapotential einen sigmoidalen Kurvenverlauf zeigt, der auf die Partikelbildung

schließen lässt, verläuft das Zetapotential in diesem Fall eher exponentiell abfallend.

Dies entspricht dem Kurvenverlauf, der eintritt, wenn zu einer Suspension Salz

hinzugefügt wird (Müller 1996). Somit kann keine RGD-PPR-Partikelbildung

geschlussfolgert werden.

Abbildung 4-45: Gen-Knockdown mittels RGD-modifizierter PPR-Partikel

Die eGFP-Expression von stabil eGFP-transfizierten RH-30 (blau) und HeLa Zellen (rot) wird

gegen die Menge an zugesetztem RGD-Peptid aufgetragen. In RH-30 Zellen bleibt die

eGFP-Expression mit ca. 20 % bis 2 mg RGD-Peptid konstant. Bei einem Zusatz von 3 mg

ist ein leichter Anstieg der eGFP-Expression zu erkennen. In HeLa Zellen steigt die eGFP-

Expression von etwa 30 % mit Zusatz des RGD-Peptides auf ca. 40 % an. MW ± SD, n = 2

Kontrolle 0 100 200 500 1000 2000 3000 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

RGD-Peptid [µg]

RH-30 HeLa


Der Versuch, den Gen-Knockdown in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen zu

erhalten und gleichzeitig die eGFP-Expression in stabil eGFP-transfizierten HeLa

Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen nicht zu beeinflussen, kann nicht

bestätigt werden. Während bis zu einer Zugabe von 2 mg RGD-Peptid die eGFP-

Expression in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen konstant bei um die 20 % liegt,

steigt sie in stabil eGFP-transfizierten HeLa Zellen lediglich von ca. 30 % auf etwa

40 % an. Bei einem Zusatz von 3 mg RGD-Peptid ist auch in den stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen ein Anstieg der eGFP-Expression auf ca. 28 % zu

erkennen.

In der Literatur werden insbesondere Polymere mit relativen Molmassen (Mr) von 0,6

bis 170 kDa als Transfektionssysteme für siRNA verwendet (Tabelle 4-3). Das hier

eingesetzte RGD-Peptid hat eine Mr von 0,6 kDa und liegt damit am unteren Ende

der eingesetzten Polymermassen. Zudem hat es nur eine negative Ladung. Die

primäre Triebkraft für die Komplexbildung ist die Entropie. Negativ geladene Gruppen

(z.B. die Phosphate der Nukleinsäuren oder die Carboxyl-Gruppe des eingesetzten

RGD-Peptides) bilden ionische Wechselwirkungen mit positiv geladenen Gruppen

(z.B. protonierte Amine) aus. Dadurch werden Gegenionen und Hydratationswasser

freigesetzt. Dies resultiert in einem Anstieg der Entropie. Dieser Effekt ist umso

stärker ausgeprägt, je länger das Polymer ist (Wagner et al. 2013). Fernandes et al.

(2012) beschreiben, dass Chitosan mit 2 kDa (Mr) nicht in der Lage ist, siRNA zu

binden. Es sind Mr von 25 bzw. 50 kDa notwendig (Fernandes et al. 2012). Ein

ähnlicher Effekt ist für Polyethylenimin (PEI) beschrieben: Erst ab einer Mr von

≥ 10 kDa wird komplexierte siRNA in Zellen aufgenommen (Wagner et al. 2013).

Liu et al. (2007) betrachten nicht nur die Mr, sondern untersuchen zusätzlich den

Deacetylierungsgrad von Chitosan, was der Ladungsdichte des Polymers entspricht:

Eine hohe Mr sowie eine große Ladungsdichte (hoher Deacetylierungsgrad) haben

zu den stabilsten Partikeln geführt, die zudem im Gen-Knockdown-Modell am

effizientesten gewesen sind (Liu et al. 2007).

Unter Berücksichtigung der in der Literatur genannten Ergebnisse für die

Abhängigkeit der Komplexbildung basierend auf ionischen Wechselwirkungen liegt

die Vermutung nahe, dass das eingesetzte RGD-Peptid mit einer Mr von 0,6 kDa zu

klein und mit nur einer negativen Ladung eine zu geringe Ladungsdichte besitzt, als

dass es elektrostatisch an die PPR-Partikel binden kann. Dies legen auch die


Zetapotential-Messungen nahe: Das Zetapotential sinkt exponentiell mit steigendem

RGD-Peptid-Zusatz und nähert sich asymptotisch 0 bis 2 mV an (Abb. 4-44). Es

kommt nicht wie bei der Bildung der Protamin-siRNA-Partikel (4.2.1) oder der PPR-

Partikel (4.2.2) zu einer Ladungsumkehr.

Die Hypothese, dass das RGD-Peptid eine zu geringe Masse und Ladungsdichte

besitzt, wird durch die Arbeit von Liu et al. (2014) untermauert: Ein Peptid bestehend

aus 16 Glutamat- und 6 Glycin-Einheiten sowie der Sequenz RGDK (Mr ~ 2,8 kDa)

bindet elektrostatisch an PAMAM-Nukleinsäure-Komplexe. Hierdurch wird eine

gezielte Ansteuerung von Integrin-Rezeptoren erreicht (Liu et al. 2014).

Tabelle 4-3: Polymere zur siRNA-Transfektion

Polymer Literatur

Polylysin und

Derivate

Inoue et al. 2008;

Watanabe et al. 2009

Buyens et al. 2010; Guo et al.

2012, Qi et al. 2012;

Zheng et al. 2013

Polyspermin Duan et al. 2012a; Duan et al.2012b

Polyglutamatderivat Wang et al. 2016

Chitosan Liu et al. 2007; Fernandes et al. 2012; Ki et al. 2014

Polyamidoamine

(PAMAM) und

Derivate

Zhou et al. 2006 Marquez-Miranda et al. 2016;

Nussbaumer et al. 2016;

Roberts et al. 2017

Polyethylenimin

(PEI)

Wagner et al. 2013; Islam et al. 2014;

Roberts et al. 2017


4.6.3 Lipid-modifizierte PPR-Partikel

4.6.3.1 Herstellung und Analytik der Liposomen

Wie in 3.2.7.2.1 beschrieben, werden Liposomen aus 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-

phosphat (DOPA), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin (DOPE), 1,2-

Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (DOPS), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-

rac-(1-glycerol) (DOPG) und Cholesterol (Chol) mittels Ultraschallbehandlung

hergestellt. Die gebildeten small unilamellar vesicles (SUV) werden nach 3.3.1 auf

Größe und Polydispersität, nach 3.3.2 auf ihr Zetapotential und nach 3.3.4 auf ihren

Lipidgehalt hin untersucht. Die Herstellung sowie die Analytik der Liposomen sind

von Frau Luise Hilfert (Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und

Biopharmazie, Universität Freiburg) im Rahmen eines Wahlpflichtpraktiums

durchgeführt worden.

Die Tabelle 4-4 zeigt die Ergebnisse der Liposomen-Analytik. Alle Formulierungen

weisen Größen von unter 100 nm auf. Die Liposomen der reinen Lipide DOPA,

DOPG und DOPS sind kleiner als die jeweilige Mischung mit DOPE oder Chol. Eine

Ausnahme stellt DOPA/DOPE dar, hier sind die gebildeten Liposomen genauso groß

wie reine DOPA-Liposomen. Alle Liposomen-Formulierungen zeigen ein deutlich

negatives Zetapotential. Der Polydispersitätsindex der Liposomen schwankt

zwischen 0,19 und 0,28. Dies spricht für polydisperse Größenverteilungen.


Tabelle 4-4: Charakterisierung der Liposomen

Lipid bzw. -mischung

(mol/mol)

Hydrodynamischer

Durchmesser [nm]

Polydispersitäts

-index

Zetapotential

[mV]

DOPA 55 ± 0,7 0,225 ± 0,014 -83 ± 19,3

DOPG 44 ± 2,3 0,229 ± 0,015 -53 ± 2,5

DOPS 50 ± 1,7 0,235 ± 0,008 -75 ± 7,6

DOPA/DOPE (1/1) 54 ± 2,1 0,231 ± 0,005 -64 ± 6,6

DOPG/DOPE (1/1) 57 ± 6,4 0,206 ± 0,049 -75 ± 26,1

DOPS/DOPE (1/1) 67 ± 4,6 0,282 ± 0,007 -85 ± 3,7

DOPA/Chol (1/1) 91 ± 1,9 0,259 ± 0,004 -89 ± 5,7

DOPG/Chol (1/1) 62 ± 1,9 0,194 ± 0,016 -55 ± 5,7

DOPS/Chol (1/1) 71 ± 0,6 0,222 ± 0,018 -76 ± 13,1

Es sind jeweils die Mittelwerte ± Standardabweichung einer Dreifachbestimmung aufgeführt.

4.6.3.2 Herstellung und Analytik der L-PPR-Partikel

Wie in 3.2.7.2.2 beschrieben, werden PPR-Partikel in 0,4 µmol-Schritten mit 0 bis

2,4 µmol Lipid versetzt. Es werden die in 4.6.3.1 charakterisierten Liposomen

verwendet. Die erhaltenen Lipid-modifizierten PPR-Partikel (L-PPR-Partikel) werden

nach 3.3.1 auf Größe sowie nach 3.3.2 auf ihr Zetapotential getestet. In Abb. 4-47

sind die Ergebnisse für die Lipidmischungen mit PG gezeigt. Im Folgenden liegt der

Fokus auf diesen Lipidmischungen, da bei POPS oftmals Instabilitäten in Form von

Verfärbungen aufgetreten sind. Außerdem ist bei PA/DOPE-modifizierten PPR-

Partikeln im Gegensatz zu PG/DOPE-modifizierten PPR-Partikeln (Abb. 4-46 B)


bereits ab einem Lipidzusatz von 0,4 µmol ein zweiter Peak bei den Zetapotential-

Messungen aufgetreten, der auf überschüssige, nicht assoziierte Liposomen

hindeutet (Abb. 4-46 A).

Abbildung 4-46: Zetapotential-Messung von PA/DOPE- und PG/DOPE-

modifizierten PPR-Partikeln

Bereits ab einem Lipidzusatz von 0,4 µmol PA/DOPE zu PPR-Partikeln tritt ein zweiter

Zetapotential-Peak bei -70 mV auf (A), der auf nicht assoziierte Liposomen hindeutet. Bei

PG/DOPE-modifizierten PPR-Partikeln (ebenfalls 0,4 µmol Lipid) tritt kein zweiter

Zetapotential-Peak auf (B). Es sind repräsentative Messungen gezeigt.

A

B


Abbildung 4-47: Größe und Zetapotential von Lipid-modifizierten PPR-Partikeln

Der hydrodynamische Durchmesser sowie das Zetapotential sind gegen den Lipidzusatz

aufgetragen. Je mehr negativ geladene Liposomen hinzugegeben werden, desto größer wird

das negative Zetapotential (Dreiecke). Die Größe der Partikel steigt mit der ersten Zugabe

an Lipid sprunghaft an und bleibt dann konstant (Rauten). Zur übersichtlicheren Darstellung

sind die Werte für PG (grün) um 0,05 µmol Lipidzusatz nach links und die für PG/Chol (rot)

entsprechend nach rechts verschoben. PG/DOPE blau; MW ± SD, n = 3

Die Größe der PPR-Partikel steigt mit dem ersten Lipidzusatz sprunghaft von unter

200 nm auf bis zu 290 nm an. Mit weiterem Lipidzusatz bleibt die Größe der L-PPR-

Partikel konstant. Bei der Lipidzusammensetzung PG/Chol ist die große Streuung der

Messwerte auffällig.

Während PPR-Partikel, wie in den Kapiteln 4.2.2 und 4.6.2 gezeigt, ein positiv

geladenes Oberflächenpotential besitzen, kommt es durch den Zusatz der negativ

geladenen Liposomen zu einer Ladungsumkehr. Der Betrag des Zetapotentials der

L-PPR-Partikel steigt mit weiterem Lipidzusatz an.

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

-100

0

100

200

300

400

500

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Zeta

po

ten

tial

[mV

]

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

Lipidzusatz [µmol]

PG/DOPE Größe PG Größe PG/Chol Größe

PG/DOPE Zetapotential PG Zetapotential PG/Chol Zetapotential


4.6.3.3 Zelluläre Assoziation und Aufnahme von L-PPR-Partikeln

Lipid-modifizierte PPR-Partikel mit den Lipidzusammensetzungen PG, PG/Chol (1/1

mol/mol) und PG/DOPE (1/1 mol/mol) werden gemäß 3.2.4 mit einer AF 488-

markierten siRNA und gemäß 3.2.7.2.2 mit 1,2 µmol, 1,6 µmol und 2,0 µmol Lipid

hergestellt. Die Formulierungen werden nach 3.4.2.1 in zellulären Assoziations- und

Aufnahmeversuchen in RH-30 Zellen untersucht. Das Ergebnis ist in Abb. 4-48

gezeigt.

Abbildung 4-48: Zelluläre Assoziation und Aufnahme von L-PPR-Partikeln

Es sind die AF 488-positiven RH-30 Zellen in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung

und des Lipidzusatzes aufgetragen. Unbehandelte Kontrollzellen (schwarz), wie auch Zellen,

die mit PG- (blau) und PG/Chol- (grün) modifizierten PPR-Partikeln inkubiert worden sind,

zeigen keine Fluoreszenz. PG/DOPE-modifizierte PPR-Partikel führen zu wenigen

fluoreszierenden Zellen. Je höher der Lipidzusatz ist, desto weniger Zellen fluoreszieren.

MW ± SD, n = 2

In diesem Experiment wird die AF 488-markierte siRNA weder durch PG- noch durch

PG/Chol-modifizierte PPR-Partikel zellulär assoziiert oder aufgenommen. Bei

PG/DOPE-modifizierten PPR-Partikeln sinkt der Anteil der fluoreszierenden Zellen

mit steigendem Lipidzusatz. Um im nächsten Versuchsschritt ein aktives Targeting

nachzuweisen, muss eine passive Aufnahme der L-PPR-Partikel ausgeschlossen

werden. Da wie bei PA/DOPE-modifizierten PPR-Partikeln (Abb. 4-46 A) bei

PG/DOPE-modifizierten PPR-Partikeln ab einem Lipidzusatz von 2,0 µmol ein

1,2 1,6 2,0 0

1

2

3

flu

ore

szie

ren

de Z

ellen

[%

]

Lipidzusatz [µmol]

Kontrolle

PG-modifizierte-PPR

PG/DOPE-modifizierte-PPR

PG/Chol-modifizierte-PPR


zweiter Peak bei den Zetapotential-Messungen auftritt (Abb. 4-49 B), wird im

Folgenden mit einem Lipidzusatz von 1,6 µmol weitergearbeitet. Hier beträgt die

passive zelluläre Assoziation und Aufnahme weniger als 1 %.

Abbildung 4-49: Zetapotential-Messung von PG/DOPE-modifizierten PPR-

Partikeln

Ab einem Lipidzusatz von 2,0 µmol PG/DOPE zu PPR-Partikeln tritt ein zweiter

Zetapotential-Peak bei -80 mV auf, der auf nicht assoziierte Liposomen hindeutet (B). Bei

einem Lipidzusatz von 1,6 µmol PG/DOPE zu PPR-Partikeln tritt kein zweiter Zetapotential-

Peak auf (A). Es sind repräsentative Messungen gezeigt.

A

B


4.6.3.4 RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel

RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel (RGD-L-PPR-Partikel) werden nach

3.2.7.2.3 hergestellt und nach 3.3.1 auf ihre Größe sowie nach 3.3.2 auf ihr

Zetapotential getestet. Außerdem wird ihre Gen-Knockdown-Effizienz (3.4.2.1) in

stabil eGFP-transfizierten HeLa und RH-30 Zellen untersucht. Die Ergebnisse sind in

Abb. 4-50 (Größe und Zetapotential) und 4-51 (Gen-Knockdown) dargestellt.

Abbildung 4-50: Größe und Zetapotential von RGD-Anker-Lipid-modifizierten

PPR-Partikeln

Die hydrodynamischen Durchmesser (blaue Rauten) sowie die Zetapotentiale (rote Punkte)

sind in Abhängigkeit von der Lipidmischung der RGD-Anker-Lipid-modifizierten PPR-Partikel

dargestellt. PPR-Partikel verfügen über ein positives Zetapotential und weisen hier einen

hydrodynamischen Durchmesser von unter 200 nm auf. Die RGD-Anker-Lipid-modifizierten

PPR-Partikel haben negative Zetapotentiale. Ihre Größe schwankt mit Ausnahme von

PG/DOPE-PPR (etwa 140 nm) um 90 nm. MW ± SD, n = 2

PPR PG- PPR

PG/DOPE- PPR

PG/Chol- PPR

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Zeta

po

ten

tial

[mV

]

hyd

rod

yn

am

isch

er

Du

rch

messer

[nm

]

hydrodynamischer Durchmesser Zetapotential


Abbildung 4-51: Gen-Knockdown von RGD-Anker-Lipid-modifizierten PPR-

Partikeln

Die eGFP-Expression von stabil eGFP-transfizierten RH-30 (blau) und HeLa Zellen (rot) wird

in Abhängigkeit von der Lipidmischung der RGD-L-PPR-Partikel aufgetragen. Während PPR-

Partikel die eGFP-Expression deutlich herunterregulieren, zeigen die RGD-L-PPR-Partikel

keine Reduktion der eGFP-Expression. MW ± SD, n = 2

Während PPR-Partikel, wie bereits in den Kapiteln 4.2.2 und 4.6.2 gezeigt, ein

positives Zetapotential besitzen, verfügen RGD-L-PPR-Partikel wie auch L-PPR-

Partikel aus Abschnitt 4.6.3.2 über ein negatives Zetapotential. Werden die

Messwerte für das Zetapotential von L-PPR-Partikeln (-27 bis -49 mV) mit RGD-L-

PPR-Partikeln (-11 bis -33 mV) verglichen, so ist der Betrag des Zetapotentials der

RGD-L-PPR-Partikel niedriger. Dies lässt sich durch die PEG-Kette der

Ankermoleküle erklären, die eine Ladungsabschirmung hervorrufen (Mayenfels 2012;

Aldrian et al. 2017).

Die RGD-L-PPR-Partikel sind mit der Ausnahme von PG/DOPE-PPR-Partikel kleiner

als PPR-Partikel. Diese Größenentwicklung ist sowohl für DNA- als auch für siRNA-

Protamin-Lipid-Formulierungen beschrieben (Caracciolo et al. 2011; Zimmer 2013;

Geyer 2017). Es wird eine Umstrukturierung mit Bildung von kleineren Strukturen

vermutet.

Kontrolle PPR PG-PPR PG/DOPE-PPR PG/Chol-PPR 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120eG

FP

-Exp

ressio

n [

%]

RH-30 HeLa


In den Gen-Knockdown-Experimenten können RGD-L-PPR-Partikel die eGFP-

Expression nicht herunterregulieren (Abb. 4-51). Die Ursache hierfür ist unklar. Bei

Zimmer (2013) sind RGD-Ankermoleküle erfolgreich mittels PIT bei 60 °C in siRNA-

Protamin-Lipid-Kerne eingelagert worden. Die Temperatur sollte folglich keinen

negativen Effekt auf die siRNA haben. Außerdem ist eine Temperatur oberhalb der

Phasenübergangstemperatur der Lipide für eine effiziente Einlagerung von DSPE-

PEG-Anker-Konjugaten notwendig (Ishida et al. 1999). Da die

Phasenübergangstemperatur von PG -18 °C und von DOPE -16 °C beträgt, ist diese

Voraussetzung für die beiden Lipide erfüllt (https://avantilipids.com/wp-

content/uploads/2015/11/Phase_Transition_Temps_for_Glycerophospholipids_Table

.pdf).

Es ist beschrieben, dass Nukleinsäuren über die negativ geladenen Phosphat-

gruppen elektrostatisch an die protonierten Aminogruppen der Lysin-Reste der

LAH4-L1-Peptide gebunden werden (Progidi-Fix et al. 2007). Wird das LAH4-L1-

Peptid zu POPC/POPS-Liposomen gegeben (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-

phosphocholin / 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin), so interagiert ein

LAH4-L1-Peptid mit seinen vier positiven Ladungen mit vier negativ geladenen

POPS-Molekülen. Bei einer Inkubation mit reinen POPC-Liposomen bindet ein LAH4-

L1-Peptid sechs POPC-Moleküle. Die Bindungskonstante von LAH4-L1 zu POPC ist

dabei ca. 100-fach schwächer als die zu POPS. Hieraus wird ein unterschiedlicher

Bindungsmechanismus geschlossen (Voievoda et al. 2015).

Werden PPR-Partikel mit negativ geladenen Liposomen inkubiert, um L-PPR-Partikel

zu erhalten, ist eine Konkurrenzsituation der siRNA und der negativ geladenen Lipide

um die positiv geladenen Lysin-Reste denkbar. Dies könnte zu einer Verdrängung

der siRNA von den LAH4-L1-Peptiden führen. Dadurch wäre eine schlechtere

zelluläre Verfügbarkeit der siRNA möglich, was in einer schlechteren Gen-

Knockdown-Effizienz resultieren würde. Mit dieser Hypothese ist auch die mit

steigendem Lipidzusatz sinkende zelluläre Assoziation und Aufnahme der AF 488-

markierten siRNA in Kapitel 4.6.3.3 (L-PPR-Partikel) erklärbar.

Um die Hypothese der Verdrängung der siRNA zu überprüfen, könnte die

Assoziationseffizienz mittels Quant-iTTM RiboGreen® RNA Assay (Kapitel 3.3.7)

überprüft werden. Zudem könnten Versuche mit neutralen Liposomen (z.B. POPC)


durchgeführt werden. Die niedrigere Bindungskonstante von POPC im Vergleich zu

POPS zu LAH4-L1 legt die Vermutung nahe, dass POPC und LAH4-L1 über

hydrophobe Wechselwirkungen miteinander interagieren (Voievoda et al. 2015). Hier

sollte folglich keine elektrostatische Verdrängung der siRNA möglich sein.

Zusammenfassung und Ausblick 125

5 Zusammenfassung und Ausblick

Es war Ziel dieser Arbeit, ein LAH4-L1-Peptid basiertes Trägersystem für siRNA zu

entwickeln. Hierfür wurden zuerst verschiedene Puffersysteme getestet. HS-Puffer

war für die Partikelanalytik am geeignetsten und wurde im Folgenden verwendet.

Parallel wurde untersucht, ob der Zusatz von Hyaluronsäure einen Vorteil für die

Gen-Knockdown-Effizienz darstellt. Hyaluronsäure hatte keinen positiven Einfluss auf

die Gen-Knockdown-Effizienz und wurde daher nicht weiter verwendet.

Nachdem LAH4-L1-Peptid-siRNA-Partikel zwar eine sehr gute Gen-Knockdown-

Effizienz in stabil eGFP-transfizierten RH-30 Zellen gezeigt hatten (ca. 80 %

Reduktion), aber mit einem mittleren hydrodynamischen Durchmesser von über

1600 nm nicht im angestrebten Größenbereich von unter 500 nm lagen, wurden

LAH4-L1-Peptid-Protamin-siRNA-Partikel (PPR-Partikel) entwickelt. Hierfür wurde im

ersten Schritt das Massenverhältnis von siRNA zu Protamin an Hand von Größen-

und Zetapotential-Messungen optimiert. Bei dem Massenverhältnis 2,0 (siRNA zu

Protamin) entstanden Protamin-siRNA-Partikel mit einer mittleren Größe von 135 nm

und einem negativen Zetapotential von -25 mV. Im zweiten Schritt wurde das

Massenverhältnis von LAH4-L1 zu siRNA (komplexiert mit Protamin) optimiert.

Hierbei wurde das Massenverhältnis von 3,5 (LAH4-L1 zu siRNA (komplexiert mit

Protamin)) festgelegt, da bei diesem Verhältnis Partikel mit einer mittleren Größe von

rund 230 nm und einem positiven Zetapotential (ca. 22 mV) gebildet wurden, die im

Gen-Knockdown-Modell die eGFP-Expression um etwa 80 % reduziert hatten.

Die Lagerfähigkeit der PPR-Partikel wurde bis zu sechs Wochen lang bei

Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C), im Tiefkühler (-20 °C ± 5 °C), im Kühlschrank

(5 °C ± 3 °C) und als Lyophilisate im Kühlschrank (5 °C ± 3 °C) untersucht. Hierbei

hatte sich die Lagerung im unveränderten Zustand im Kühlschrank als am

geeignetsten erwiesen. Daher wurden PPR-Partikel unter dieser

Lagerungsbedingung 52 Wochen lang gelagert. Die mittlere Größe der PPR-Partikel

schwankte im Lagerungszeitraum zwischen 200 und 300 nm und lag somit immer im

angestrebten Größenbereich von unter 500 nm. Die Gen-Knockdown-Effizienz

unterschied sich vor und nach der Lagerung nicht signifikant. Daher wird für PPR-


Partikel eine Lagerstabilität von einem Jahr im unveränderten Zustand im

Kühlschrank (5 °C ± 3 °C) angegeben.

Die Gen-Knockdown-Effizienz der PPR-Partikel wurde sowohl gegen das

kommerziell erhältliche Transfektionsreagenz Lipofectamine® RNAiMAX als auch

gegen die Negativkontrollen Protamin-siRNA-Partikel, freie anti-eGFP-siRNA, LAH4-

L1 und PPR-Partikel mit einer unspezifischen siRNA (scr-siRNA) getestet. Die

Negativkontrollen veränderten die eGFP-Expression gegenüber unbehandelten

Kontrollzellen nicht signifikant. Dahingegen reduzierten sowohl Lipofectamine®

RNAiMAX (22,9 % ± 1,2 %) als auch PPR-Partikel (23,4 % ± 1,0 %) die eGFP-

Expression deutlich. Der Unterschied zwischen diesen beiden Formulierungen war

nicht signifikant. Damit wurde gezeigt, dass PPR-Partikel einen genauso guten Gen-

Knockdown hervorrufen konnten wie das kommerziell erhältliche

Transfektionsreagenz Lipofectamine® RNAiMAX.

Während der Charakterisierung der PPR-Partikel wurde die Komplexbildung

gelelektrophoretisch nachgewiesen. Hierbei wurde eine annähernd komplette

Komplexierung der siRNA festgestellt. Im weiteren Verlauf erfolgte die Bestimmung

der Assoziationseffizienz über die Quantifizierung der freien siRNA mittels

Quant-iTTM RiboGreen® RNA Assay Kit: Über 99 % der siRNA waren in PPR-

Partikeln assoziiert.

Außerdem wurde eine Dosis-Wirkungskurve der PPR-Partikel aufgenommen.

Hieraus wurde über einen Boltzmann-Fit ein IC50-Wert von 5,4 nM siRNA berechnet.

In der Literatur war kein besserer Wert gefunden worden, sodass geschlussfolgert

wird, dass PPR-Partikel eine sehr gute Gen-Knockdown-Effizienz in stabil eGFP-

transfizierten RH-30 Zellen hervorrufen. Um zu überprüfen, ob dies mit einer

Beeinträchtigung der Zellviabilität einhergeht, wurde der Resazurin-Assay am

Lehrstuhl etabliert und angewendet. Für RH-30 Zellen war eine dreistündige

Inkubation mit Resazurin erforderlich. Es wurde gezeigt, dass die Zellviabilität mit der

Zeit abnahm: bei einer siRNA-Konzentration von 60 nM nach 72 Stunden auf 60 %

und bei 30 nM auf 75 %. Solange die Zellviabilität nicht unter 70 % absinkt, wird die

Formulierung als atoxisch angesehen. Bei einem Einsatz von 30 nM siRNA wirkten

PPR-Partikel demnach auf RH-30 Zellen nicht toxisch.


Parallel wurde die Zellviabilität von HeLa Zellen untersucht. Hier war eine einstündige

Inkubation mit Resazurin ausreichend und nach 72 Stunden lag die Zellviabilität

sowohl für 30 nM als auch für 60 nM siRNA bei über 85 %. PPR-Partikel wirkten

demnach auf HeLa Zellen ebenfalls nicht toxisch.

Für eine potentielle in vivo Anwendung wurde zum einen untersucht, ob die siRNA in

PPR-Partikeln gegenüber abbauenden Serumproteinen geschützt wird. Hierfür

wurden PPR-Partikel und freie siRNA mit 50 % fetalem Kälberserum bei 37 °C

inkubiert. Nach unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und die

noch vorhandene siRNA gelelektrophoretisch mittels Ethidiumbromid-Färbung

nachgewiesen. Während freie siRNA nur eine Stunde lang nachweisbar war, war bei

PPR-Partikeln noch nach 12 Stunden siRNA detektierbar.

Zum anderen wurde getestet, ob die Gen-Knockdown-Effizienz von der Serum-

konzentration abhängt. Hierbei wurden bis zu 50 % fetales Kälberserum eingesetzt.

Die Gen-Knockdown-Effizienz lag unabhängig von der Serumkonzentration um 75 %.

Somit war sowohl ein Schutz der siRNA innerhalb der PPR-Partikel gegenüber ab-

bauenden Enzymen als auch eine gute Gen-Knockdown-Effizienz bei 50 % fetalem

Kälberserum gewährleistet.

Kritisch gegenüber einer möglichen in vivo Anwendung stehen die Ergebnisse der

Hämolyse-Versuche. Hier wurden Erythrozyten mit PPR-Partikeln inkubiert, um eine

Freisetzung des Hämoglobins zu bestimmen. Im Verlauf von 3 Stunden wurden ca.

30 % des Hämoglobins freigesetzt. Dies kann zu Nierenschäden führen.

Außerdem stehen die positive Ladung der PPR-Partikel sowie das Fehlen eines

Stealth-Effektes einer in vivo Anwendung entgegen. PPR-Partikel würden

voraussichtlich schnell durch das Retikuloendotheliale System aufgenommen werden

und dadurch nicht an ihren Wirkort gelangen.

Ein weiteres Thema dieser Arbeit war die Untersuchung des intrazellulären Verbleibs

der PPR-Partikel. Hierfür wurde die zelluläre Assoziation und Aufnahme

durchflusszytometrisch und konfokal mikroskopisch untersucht. Dabei wurde

festgestellt, dass PPR-Partikel zeitabhängig an RH-30 Zellen assoziieren und

aufgenommen werden. Aus dem Vergleich von Versuchen bei 4 °C und 37 °C wurde

geschlussfolgert, dass die Assoziation passiv verläuft, die anschließende Aufnahme

aber Energie benötigt. Die konfokal mikroskopischen Aufnahmen hatten angedeutet,


dass die Aufnahme über endosomale Kompartimente verlief. Daraufhin wurden

Versuche zur endosomalen Freisetzung durchgeführt: PPR-Partikel wurden mit

Erythrozyten bei unterschiedlichen sauren pH-Werten inkubiert, um die endosomale

Reifung nachzuahmen. Das freigesetzte Hämoglobin ist ein Surrogat für die

Freisetzung der PPR-Partikel aus den endosomalen Kompartimenten. Mit sinkendem

pH-Wert wurde mehr Hämoglobin freigesetzt. Dies spricht für einen endosomal

escape der PPR-Partikel bzw. der siRNA.

Außerdem wurde die Gen-Knockdown-Effizienz der PPR-Partikel bei Anwesenheit

des Protonenpumpeninhibitors Bafilomycin A1 untersucht. Bafilomycin A1

unterbindet die endosomale Reifung, wodurch der endosomal escape verhindert

wird. Dies spiegelte sich in einer signifikant reduzierten Gen-Knockdown-Effizienz

wider: Die eGFP-Expression wurde bei Anwesenheit von Bafilomycin A1 nur auf rund

62 % statt etwa 23 % ohne Bafilomycin A1 reduziert.

Im Folgenden wurden die intrazellulären Prozesse mit doppelt fluoreszenzmarkierten

PPR-Partikeln untersucht. Es wurden AF 488-markierte siRNA, 5´-ROX-3´BHQ2-

markierte MB sowie ROX- oder Quasar® 670-markierte LAH4-L1-Peptide eingesetzt.

Dabei wurde festgestellt, dass AF 488 und ROX ein FRET-Paar bilden und

Quasar® 670 das Signal von AF 488 reduziert.

Über das FRET-Paar AF 488-markierte siRNA und ROX-markiertes LAH4-L1-Peptid

wurde gezeigt, dass das ROX-Signal die zelluläre Assoziation und Aufnahme

widerspiegelt und das AF 488-Signal für die Freisetzung der siRNA aus den PPR-

Partikeln steht. Mit Hilfe dieses Systems und Bafilomycin A1 konnte erneut gezeigt

werden, dass für die Freisetzung der siRNA aus den PPR-Partikeln die endosomale

Azidifizierung notwendig ist.

Im letzten Abschnitt dieser Arbeit sollte eine Spezifität der PPR-Partikel für RH-30

Zellen im Vergleich zu HeLa Zellen erreicht werden. Hierfür wurden zwei Ansätze

verfolgt. Zum einen wurden die positiv geladenen PPR-Partikel mit einem negativ

geladenen RGD-Peptid inkubiert, um über eine elektrostatische Assoziation eine

aktive Ansteuerung des Integrin-Rezeptors zu erreichen. In Gen-Knockdown-

Versuchen konnte jedoch kein aktives Targeting nachgewiesen werden. Die

Ladungsdichte des RGD-Peptides war für eine „RGD-PPR-Partikelbildung“

wahrscheinlich zu gering. Liu et al. (2014) konnten mit einem größeren und stärker


geladenen RGD-Peptid ein elektrostatisches Targeting erreichen. Dieser Ansatz

kann für PPR-Partikel in zukünftigen Experimenten untersucht werden.

Der zweite verfolgte Ansatz erfolgte in Analogie zu Liposom-Protamin-Hyaluronsäure

Nanopartikel (LPH-NP; Chono et al. 2008): PPR-Partikel wurden mit Lipiden und

RGD-Anker-Konjugaten modifiziert. Diese Formulierungen riefen jedoch keinen Gen-

Knockdown hervor. Es wird angenommen, dass es zu einer Konkurrenzreaktion der

negativ geladenen Phospholipide sowie der Nukleinsäuren um die positiven

Ladungen der LAH4-L1-Peptide kam und dadurch Nukleinsäuren verdrängt wurden.

In zukünftigen Experimenten könnten daher neutrale Lipide eingesetzt werden, um

eine Konkurrenzsituation um Ladungen zu vermeiden.

PPR-Partikel erfüllen viele Anforderungen an ein ideales siRNA-Transportsystem:

Sie wiesen eine definierte Größe zwischen 200 und 300 nm auf, konnten ohne

Wirkungsverlust ein Jahr lang gelagert werden, schützten die siRNA vor einem

schnellen enzymatischen Abbau und waren abhängig von der Zelllinie und

Konzentration nicht toxisch. Ihre Gen-Knockdown-Effizienz war nicht signifikant

unterschiedlich zum kommerziell erhältlichen Lipofectamine® RNAiMAX und da sie

ausschließlich aus Peptiden und Nukleinsäuren bestehen, wird ihre Bioabbaubarkeit

angenommen. Somit verfügen PPR-Partikel über ein sehr großes Potential in der

Zellbiologie.

Gegen eine in vivo Anwendung von PPR-Partikeln sprechen die Ergebnisse der

Hämolyse-Versuche. Außerdem sollte die positive Ladung z.B. über PEGylierte

LAH4-L1-Peptide abgeschirmt werden. Die Verträglichkeit der PPR-Partikel könnte in

Tierversuchen untersucht werden.

Da die Versuche, einen zielgerichteten Effekt nur in RH-30 Zellen zu erzielen, nicht

erfolgreich waren, sollten hier, wie bereits erwähnt, andere Varianten ausprobiert

werden. Neben den bereits genannten könnten LAH4-L1-Peptide mit integrierter

RGD-Sequenz in PPR-Partikel eingebaut werden, um so eine gezielte Ansteuerung

der Integrin-Rezeptoren zu erreichen.

130 Abkürzungsverzeichnis


A Alanin

AE Assoziationseffizienz

AF Alexa Fluor®

BHQ2 Black Hole Quencher®-2

bp Basenpaar

°C / K Grad Celsius / Kelvin

Chol Cholesterol

CLs cationic liposomes

Cryo-TEM Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie

dL / mL / µL Deziliter / Milliliter / Mikroliter

DLS dynamic light scattering / dynamische Lichtstreuung

DOPA 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphat

DOPE 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin

DOPG 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol)

DOPS 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin

DSPE-PEG2000-Mal 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-

[maleinimido-poly(ethylenglycol)-2000]

dsRNA doppelsträngige RNA

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

(e)GFP (enhanced) Green Fluorescent Protein /

(verbessertes) grün fluoreszierendes Protein

FCS fetal calf serum / fetales Kälberserum

FL-1 Fluoreszenzkanal 1

FRET Förster-Resonanzenergietransfer

x g x-fache Erdbeschleunigung

G418 Geneticin

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

H Histidin

h / min / s Stunde(n) / Minute(n) / Sekunde(n)

HA Hyaluronsäure

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

Abkürzungsverzeichnis 131

HPLC High performance liquid chromatography /

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

K Lysin

kDa Kilodalton

KS Kühlschrank (5 °C ± 3 °C)

IC50 mittlere inhibitorische Konzentration

L Leucin

λ / λexc / λem Wellenlänge / Anregungswellenlänge /

Emissionswellenlänge

LPH-NP Liposom-Protamin-Hyaluronsäure Nanopartikel

L-PPR-Partikel Lipid-modifizierten PPR-Partikel

M / mM / µM / nM molar [mol ∙ L-1] / millimolar [mmol ∙ L-1] / mikromolar

[µmol · L-1] / nanomolar [nmol ∙ L-1]

m/m Massenverhältnis

MB Molecular Beacons

mbar Millibar

mg / µg Milligramm / Mikrogramm

mol/mol Molverhältnis

mol / mmol / µmol / nmol Mol / Millimol / Mikromol / Nanomol

µm / nm Mikrometer / Nanometer

Mr relative Molmasse

mRNA messenger RNA

miRNA microRNA

MW Mittelwert (arithmetischer)

n Anzahl der unabhängigen Wiederholungen eines

Experiments

ndH nach der Herstellung, nicht gelagert

ns nicht signifikant (mit α = 5 %)

PBS phosphate buffered saline / isotoner Phosphatpuffer

PCS photon correlation spectroscopy /

Photonenkorrelationsspektroskopie

PDI Polydispersitätsindex

PEG Polyethylenglykol

PFA Paraformaldehyd


Ph.Eur. Europäisches Arzneibuch

PIT postinsertions-Technik

PMMA Polymethylmethacrylat

POPC 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin

POPS 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin

PP Polypropylen

PPR-Partikel LAH4-L1-Peptid-Protamin-basierte siRNA-Partikel

PR Protamin-siRNA

RFI relative fluorescence intensity /

relative Fluoreszenzintensität

RFU relative fluorescence units / relative Fluoreszenzeinheiten

RGD Arginin-Glycin-Aspartat

RGD-L-PPR-Partikel RGD-Anker-Lipid-modifizierte PPR-Partikel

RISC RNA-induced-silencing-complex

RNAi RNA-Interferenz

ROX Carboxy-X-Rhodamin

RT Raumtemperatur (24 °C ± 2 °C)

rpm revolutions per minute / Umdrehungen pro Minute

SD Standardabweichung

SDS Sodium dodecyl sulfate / Natriumlaurylsulfat

scr-siRNA scrambled / unspezifische siRNA

shRNA short hairpin RNA

siRNA small interfering RNA

SPs SPANosomes

SUV small unilamellar vesicle

T Temperatur

t Zeit

TBE-Puffer Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer

TEA Triethylamin

TK Tiefkühler (-20 °C ± 5 °C)

TPGS Tocopherolpolyethylenglycolsuccinat

TRIS Tris(hydroxymethyl-)aminomethan, Trometamol

USP United States Pharmacopeia / amerikanisches Arzneibuch

Abkürzungsverzeichnis 133

UV ultraviolett

V Volt

Vis visible / sichtbar

v/v Volumenverhältnis

w with / mit

w/o without / ohne

134 Literaturverzeichnis


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