Embed Size (px)
Citation preview
Entwicklung und Charakterisierung
bispezifischer Antikörper-Derivate zur Immuntherapie
CD19-positiver Leukämien und Lymphome
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Christian Kellner
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2008
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. H. Fey
Zweitberichterstatter: PD Dr. B. Stockmeyer
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis Seite
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 Abstract 1
1.2 Zusammenfassung 2
2 EINLEITUNG 3
2.1 Lymphome und Leukämien 3
2.1.1 Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe 4
2.1.1.1 Hodgkin-Lymphome 5
2.1.1.2 Non-Hodgkin-Lymphome 6
2.1.1.3 Chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) 8
2.1.1.4 Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL) 11
2.1.2 Nebenwirkungen konventioneller Therapieansätze 12
2.2 Antikörper-basierte Strategien in der Krebstherapie 14
2.2.1 Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 14
2.2.2 Antikörper als Vehikel 17
2.2.3 Antikörper in der Therapie hämatologischer Neoplasien 19
2.2.4 Limitierungen monoklonaler Antikörper 22
2.3 Bispezifische Antikörper als Immuntherapeutika 23
2.3.1 Bispezifische Antikörper zur Rekrutierung von Effektorzellen 23
2.3.2 Klassische Formate bispezifischer Antikörper 24
2.3.3 Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate 26
2.3.4 Limitierungen rekombinanter bispezifischer Antikörper-Derivate 30
2.4 Zielstrukturen auf Effektorzellen 31
2.4.1 Auswahl der Effektorzellpopulation durch Wahl der Zielstruktur 31
2.4.2 Der Fcγ-Rezeptor III (CD16) auf NK-Zellen und Makrophagen 32
2.5 Zielstrukturen auf Tumorzellen für eine Antikörper-basierte Therapie 33
2.5.1 Allgemeine Anforderungen für Zielantigene auf Tumorzellen 33
2.5.2 Zielstrukturen auf B-lymphoiden Neoplasien 34
2.5.3 CD19 als Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Neoplasien 36
Inhaltsverzeichnis
II
3 PROBLEMSTELLUNG 38
4 ERGEBNISSE 39
4.1 Herstellung und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer
Fab-scFv Fusionsproteine gegen CD19 und CD16 39
4.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für den bstb [Fab19xds19xds16]
und den bsbb [Fab19xds16] 39
4.1.2 Expression und Aufreinigung des bstb [Fab19xds19xds16] und des
bsbb [Fab19xds16] 42
4.1.3 Analyse der Bindungseigenschaften des bstb [Fab19xds19xds16] und
des bsbb [Fab19xds16] 43
4.1.4 Analyse der Bindungsstärken des bstb [Fab19xds19xds16] und des
bsbb [Fab19xds16] 46
4.1.4.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 46
4.1.4.2 Bestimmung der Retentionszeit auf Antigen-positiven Zellen in vitro 47
4.1.5 Bestimmung der Stabilität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] in humanem Serum in vitro 49
4.1.6 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] in vitro 50
4.1.6.1 Analyse der Antigen-spezifischen zellulären-Zytotoxizität des bstb
[Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] 51
4.1.6.2 Vergleichende Analyse des ADCC-Potentials der Antikörper-Derivate
bstb [Fab19xds19xds16], bsbb Fab[19xds16] und bsscFv [19x16] 53
4.1.6.3 Zytotoxische Aktivität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] gegenüber primären Tumorzellen 55
4.2 Herstellung und funktionelle Charakterisierung des bispezifischen
single-chain Fv triple-bodys ds[19x16x19] 57
4.2.1 Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] 57
4.2.2 Bindungsstudien mit dem trispezifischen sctb [33xds16xds19] zur
Analyse der Funktionalität des single-chain Fv triple-body Formats 58
4.2.3 Eukaryotische Expression und Aufreinigung des sctb ds[19x16x19] 60
4.2.4 Analyse der Bindungseigenschaften des sctb ds[19x1619] 61
4.2.5 Vergleich der Bindungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des
bsscFv ds[19x16] 63
Inhaltsverzeichnis
III
4.2.5.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 63
4.2.5.2 Kompetitive Inhibition des parentalen CD19 Antikörpers 64
4.2.5.3 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro 66
4.2.6 Bestimmung der Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in humanem Serum in vitro 67
4.2.7 Bestimmung der Plasmaretention des sctb ds[19x16x19] und des
bsscFv ds[19x16] in Mäusen 68
4.2.8 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 70
4.2.8.1 Nachweis der Antigen-spezifischen Induktion der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] 70
4.2.8.2 Vergleichende Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 72
4.2.8.3 Zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]
gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen 74
5 DISKUSSION 78
6 MATERIAL UND METHODEN 91
6.1 Materialien 91
6.1.1 Chemikalien und Enzyme 91
6.1.2 Allgemeine Puffer und Lösungen 91
6.1.3 Vektoren 91
6.1.4 Oligonukleotide 91
6.1.5 Bakterienstämme 93
6.1.6 Zellkulturmedien 93
6.1.7 Zelllinien 93
6.1.8 Mäuse 94
6.1.9 Antikörper 94
6.2 Methoden 95
6.2.1 Allgemeine Methoden 95
6.2.2 Klonierungen 95
6.2.2.1 Herstellung der Expressionsvektoren für die bispezifischen Fab-scFv
Fusionsproteine 95
Inhaltsverzeichnis
IV
6.2.2.2 Herstellung der Expressionsvektoren für die scFv triple-bodies 97
6.2.3 Expression der rekombinanten Antikörper-Derivate und der GFP- und
RFP- Fusionsproteine in 293T Zellen 98
6.2.4 Aufreinigung monoklonaler Antikörper aus Hybridomen 99
6.2.5 SDS-PAGE und Western-Transfer Experimente 99
6.2.6 Durchflusszytometrische Methoden 99
6.2.6.1 Nachweis der spezifischen und simultanen Bindung 100
6.2.6.2 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) 100
6.2.6.3 Bestimmung der Serumstabilität in vitro 101
6.2.6.4 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro 101
6.2.6.5 Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7 102
6.2.7 Bestimmung der Plasmaretention in Mäusen 102
6.2.8 Isolierung mononukleärer Zellen (MNCs) 102
6.2.9 Zytotoxizitätsexperimente 103
6.2.10 Graphische Auswertung und statistische Analysen 103
7 LITERATUR 105
8 WEITERE INFORMATIONSQUELLEN UND INTERNETSEITEN 121
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 122
10 EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN 124
Inhaltsverzeichnis
V
Verzeichnis der Abbildungen Seite
Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebs- neuerkrankungen in Deutschland 2004 3 Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 16 Abbildung 3: Antikörper als Vehikel 18 Abbildung 4: Struktur eines monoklonalen IgG Antikörpers und klassische For- mate bispezifischer Antikörper 25 Abbildung 5: Formate rekombinanter bispezifischer scFv Antikörper-Derivate 27 Abbildung 6: Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate mit Dimerisie- rungsdomänen 29 Abbildung 7: Stadienspezifische Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Entwicklung 35 Abbildung 8: Konstruktion der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] 40 Abbildung 9: Spezifischer Nachweis der Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] nach Aufreinigung 43 Abbildung 10: Spezifische Bindung der Fab-scFv Fusionsproteine 44 Abbildung 11: Simultane Antigenbindung der bispezifischen Fab-scFv Fusionen 46 Abbildung 12: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den bstb [Fab19xds19xds16] und den [bsbb [Fab19xds16] 47 Abbildung 13: Zelloberflächenretention der Fab-scFv Fusionsproteine 48 Abbildung 14: Stabilität der Fab-scFv Fusionsproteine in humanem Serum 50 Abbildung 15: Antigen-spezifische Induktion der Zielzelllyse durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 52 Abbildung 16: Einfluss des E:T Verhältnisses auf die durch den bstb [Fab19xds19xds16] oder den bsbb [Fab19xds16] vermittelte Lyse 53 Abbildung 17: Dosis-abhängige ADCC durch den bstb [Fab19xds19xds16], den bsbb [Fab19xds16] und den bsscFv ds[19x16] 54
Inhaltsverzeichnis
VI
Abbildung 18: ADCC gegenüber primäre Tumorzellen durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 56 Abbildung 19: Schema des Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] 58 Abbildung 20: Nachweis der spezifischen Bindung des sctb [33xds16xds19] an Antigen-positive Zellen 59 Abbildung 21: Analyse der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19] 60 Abbildung 22: Aufreinigung und Nachweis des sctb ds[19x16x19] 61 Abbildung 23: Spezifische und simultane Bindung des sctb ds[19x16x19] 62 Abbildung 24: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten KD für den sctb ds[19x16x19] und den bsscFvs ds[19x16] 64 Abbildung 25: Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7
durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 65 Abbildung 26: Bestimmung der in vitro Zelloberflächenretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] 66 Abbildung 27: Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in humanem Serum bei 37°C 69 Abbildung 28: Vergleich der Plasmaverweildauer des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in Mäusen 69 Abbildung 29: Antigen-spezifische Induktion der ADCC durch den sctb ds[19x16x19] 71 Abbildung 30: Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] in Abhängigkeit des E:T Verhältnisses 72 Abbildung 31: Dosis-abhängige Vermittlung der Lyse humaner Tumorzellli- nien durch den sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16] 73 Abbildung 32: Vermittlung der ADCC gegen primäre Leukämie- und Lymphom- zellen durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] 75 Abbildung 33: Dosis-abhängige ADCC durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] gegen primäre Tumorzellen 76
Inhaltsverzeichnis
VII
Verzeichnis der Tabellen Seite
Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeiten B-lymphatischer Neo- plasien 5 Tabelle 2: Stadieneinteilung der B-CLL nach Rai und Binet 9
Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL 10 Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe 11
Tabelle 5: Zugelassene Antikörper in der Krebstherapie (Stand: 2007) 21 Tabelle 6: Effektorzellen des Immunsystems, trigger-Moleküle und aktivieren-
de Zytokine 32 Tabelle 7: Bindungseigenschaften und Zytotoxizität der bispezifischen Antikörper-Derivate 55
Tabelle 8: EC50-Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit CD19-positiven Zelllinien 74
Tabelle 9: EC50 Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit primären B-CLL Zellen 77 Tabelle 10: Übersicht über verwendete Oligonukleotide 92
Tabelle 11: Übersicht über die verwendeten Zelllinien 93
Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Antikörper 94
Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
1.1 Abstract
Bispecific antibodies are attractive agents for therapy of cancer and have been gene-
rated against different combinations of tumor antigens and trigger molecules on ef-
fector cells. Redirecting Natural Killer (NK) cells against leukemias and lymphomas is
promising, as demonstrated by a bispecific single-chain fragment variable (bsscFv)
against the tumor antigen CD19 and the trigger molecule CD16 (FcγRIII). However,
monovalent targeting and almost equal equilibrium constants (KD) for binding to
CD19 (KD = 42 nM) and to CD16 (KD = 56 nM) were considered unfavorable for tu-
mor-site specific retention and cytotoxicity.
Therefore, novel bispecific proteins with increased functional affinity for CD19 were
designed. A bispecific bibody was generated by genetically fusing a CD19-directed
fragment antigen binding (Fab) with a single-chain fragment variable (scFv) specific
for CD16. By extension of this molecule with a CD19-directed scFv, a bispecific tribo-
dy was obtained, now being bivalent for CD19 and monovalent for CD16. The tribody
displayed 3-fold greater avidity for CD19 (KD = 8 nM) than the bibody (KD = 23 nM)
and equal affinity for CD16 (KD = 57 nM). Both the tribody and the bibody induced
ADCC against human leukemia-derived cell lines and primary cells from tumor pa-
tients with human mononuclear cells (MNCs) as effectors. The tribody displayed half-
maximum effective concentrations (EC50) of 55 pM, and promoted equal antibody-
dependent cellular cytotoxicity (ADCC) at 6- and 12-fold lower concentrations than
the bibody and the bsscFv, respectively. Based on these findings a novel format was
designed, a scFv triple-body (sctb), consisting of one polypeptide chain with three
scFvs connected in tandem. The two distal scFvs were specific for CD19, and the
central scFv was directed against CD16. The sctb demonstrated 3-fold greater avidity
for CD19 than the bsscFv (KD = 13 nM) and had equal affinity for CD16 (KD = 58 nM).
The sctb induced ADCC against tumor cell lines and primary malignant cells at 10- to
40-fold lower EC50 than the bsscFv and therefore constituted a major improvement.
In summary, converting CD19 and CD16 directed bispecific antibody-derivatives into
bivalent targeting formats resulted in enhanced cytotoxicity. With EC50 in the low pi-
comolar range, both the sctb and the tribody represent attractive candidates for
further evaluation towards clinical studies.
Zusammenfassung
2
1 Zusammenfassung
Bispezifische Antikörper sind attraktive Wirkstoffe für die Krebstherapie und wurden
gegen verschiedene Kombinationen von Tumorantigenen und trigger Molekülen auf
Effektorzellen hergestellt. Die Rekrutierung von Natürlichen Killer (NK) Zellen gegen
Leukämien und Lymphome ist viel versprechend, wie ein bispezifisches single-chain
fragment variable (bsscFv) gegen das Tumorantigen CD19 und das trigger Molekül
CD16 (FcγRIII) zeigte. Jedoch wurden das monovalente Anvisieren der Tumorzellen
und die fast identischen Gleichgewichtskonstanten (KD) für CD19 (KD = 42 nM) und
CD16 (56 nM) als ungünstig für eine Tumor-spezifische Anreicherung und für die Zy-
totoxizität erachtet.
Daher wurden neue bispezifische Proteine mit höherer funktionaler Affinität für CD19
entwickelt. Ein bispezifischer bibody wurde durch Fusion eines fragment antigen bin-
ding (Fab) gegen CD19 mit einem single-chain fragment variable (scFv) gegen CD16
hergestellt. Durch Erweiterung dieses Moleküls um einen CD19-gerichteten scFv
wurde ein bispezifischer tribody erhalten, der nun bivalent für CD19 und monovalent
für CD16 war. Der tribody besaß eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (KD = 8 nM)
als der bibody (KD = 23 nM) und eine gleich hohe Affinität für CD16 (KD = 57 nM). So-
wohl der tribody als auch der bibody induzierten Antikörper-vermittelte zelluläre Zyto-
toxizität (ADCC) gegen Leukämie-abgeleitete Zelllinien und primäre Zellen von Tu-
morpatienten mit mononukleären Zellen (MNCs) als Effektoren. Der tribody wies eine
halbmaximale effektive Konzentration(EC50) von 55 pM auf und vermittelte gleich
starke ADCC in 6- bzw. 12-fach niedrigeren Konzentrationen als der bibody und der
bsscFv. Darauf aufbauend wurde mit dem scFv triple-body (sctb) ein neues Format
entwickelt, welches drei scFvs innerhalb einer Polypeptidkette in tandem verknüpfte.
Die distalen scFvs waren spezifisch für CD19, der zentrale für CD16. Gegenüber
dem bsscFv zeigte der sctb eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (KD = 13 nM) und
eine vergleichbare Affinität für CD16 (KD = 58 nM). Der sctb vermittelte ADCC gegen
humane Tumorzelllinien und primäre maligne Zellen in 10- bis 40-fach niedrigeren
Konzentrationen als der bsscFv und repräsentiert somit eine wichtige Verbesserung.
Zusammenfassend führte die Konvertierung CD19- und CD16-gerichteter bispezifi-
scher Antikörper-Derivate in bivalent-anvisierende Formate zu einer gesteigerten Zy-
totoxizität. Mit EC50-Werten in niedrig-picomolaren Bereichen stellen der sctb als
auch der tribody attraktive Kandidaten für eine Weiterentwicklung in Richtung klini-
scher Studien dar.
Einleitung
3
2 Einleitung
2.1 Lymphome und Leukämien
Krebs ist mit etwa 200 000 Todesfällen pro Jahr die zweithäufigste Todesursache
nach Herz- und Kreislauferkrankungen in Deutschland. Insgesamt erkranken jährlich
230 500 Männer und 206 000 Frauen an Krebs. Mit einem Anteil von jeweils über
25% stellen der Prostatakrebs bei Männern und der Brustkrebs bei Frauen die häu-
figsten Krebsformen dar (Abbildung 1). Hämatologische Neoplasien, die grob in Leu-
kämien und Lymphome untergliedert werden, liegen bei Männern und Frauen mit je-
weils ca. 5% an fünfter Stelle der Krebsneuerkrankungen. Im Jahr 2004 erkrankten
23 670 Erwachsene erstmals an einem Lymphom oder einer Leukämie.
Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland 2004. Leukämien und Lymphome liegen bei Männern und Frauen mit jeweils 5,5% an fünfter Stelle der Häufigkeitsverteilung. Abgewandelt nach: Krebs in Deutschland, Robert Koch Insti-tut, 2008.
Der Anteil an Kindern unter allen Krebserkrankten beträgt weniger als 1%. Mit etwa
1.800 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland tritt Krebs mit einer Inzidenz von 14
pro 100 000 Kinder unter 15 Jahren auf und ist die zweithäufigste Todesursache.
Das Diagnosespektrum bei Kindern unterscheidet sich generell von dem bei Erwach-
senen. So ist die relative Häufigkeit der hämatologischen Neoplasien bei Kindern
deutlich höher, wobei Leukämien mit 34,1% die häufigste und Lymphome mit 11,8%
Einleitung
4
die dritthäufigste Krebserkrankung darstellen (Krebs in Deutschland, Robert Koch
Institut, 2008).
Leukämien und Lymphome entstehen durch eine unkontrollierte Proliferation maligne
entarteter Zellen des blutbildenden Systems. Die Einteilung nach Linienzugehörigkeit
und Differenzierungsstadium der entarteten Zellen folgt der Klassifikation der World
Health Organization (WHO) und bezieht klinische, morphologische und immunophä-
notypische, aber auch molekulargenetische Merkmale der Tumorzellen ein (Harris et
al, 1999; Jaffe et al, 2001). Lymphome entwickeln sich aus maligne entarteten, in der
Regel bereits differenzierten Lymphozyten in den sekundären lymphatischen Orga-
nen wie den Lymphknoten oder der Milz. Lymphome werden nach histologischen
Gesichtspunkten in Hodgkin-Lymphome und Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) unter-
teilt. Die malignen Zellen können sowohl der B-Zell-, oder deutlich seltener, der T-
Zellreihe entstammen. Je nach Verlauf der Erkrankung werden chronische oder
aggressive Formen unterschieden. Im Gegensatz dazu entstehen Leukämien typi-
scherweise im Knochenmark, meist aus nicht, oder nur schwach ausdifferenzierten
Vorläuferzellen der myeloischen oder der lymphatischen Linie. Nach Linienzugehö-
rigkeit und weiterem Verlauf erfolgt eine Einteilung in akute myeloische Leukämie
(AML), chronische myeloische Leukämie (CML), akute lymphoblastische Leukämie
(ALL), oder chronische lymphozytische Leukämie (CLL). Wie Lymphome können
auch die lymphatischen Leukämien immunophänotypisch der B- oder der T-Zellreihe
zugeordnet werden.
2.1.1 Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe
Die Neoplasien der B-Zellreihe leiten sich von B-lymphoiden Zellen unterschiedlicher
Differenzierungsgrade ab, wodurch die hohe Heterogenität unter diesen Erkrankung-
en erklärt wird. Insbesondere die Lymphome können in eine Vielzahl verschiedener
Subtypen eingeteilt werden (Tabelle 1). Die genaue Abgrenzung zwischen Leukä-
mien und Lymphomen verläuft dabei zum Teil fließend. So wird zum Beispiel die CLL
aufgrund ihres Ursprungs als indolentes NHL eingestuft, verläuft aber durch eine
sehr frühzeitige Ausschwemmung der entarteten Zellen ins Blut primär leukämisch.
Eine Unterscheidung aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome von akuten lymphoblasti-
schen Leukämien erfolgt nach dem Ausmaß einer Infiltration des Knochenmarks mit
Einleitung
5
malignen Zellen. Überschreiten diese einen Wert von 25%, so handelt es sich um ei-
ne akute lymphoblastische Leukämie.
Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeit B-lymphatischer Neoplasien
*relative Häufigkeit unter B-Zell Lymphomen bei Erwachsenen in Europa und den USA. GC, Keimzen-trum (germinal center). Abgewandelt nach: Küppers et al., 2005.
2.1.1.1 Hodgkin-Lymphome
Hodgkin-Lymphome stammen in 95% der Fälle von einer entarteten reifen B-Zelle
des Keimzentrums der Lymphknoten ab und sind charakterisiert durch die Bildung
der Hodgkin- oder Reed Sternberg Zellen. Mit einer Inzidenz von 2-3 pro 100 000
Einwohner ist das Hodgkin-Lymphom eine relativ seltene Krankheit bei Erwachsenen
(0,5% aller jährlichen Krebsneuerkrankungen). Bei Kindern beläuft sich die relative
Häufigkeit unter allen Krebsarten auf 4,8% bei einer Inzidenz von 0,7 pro 100 000
(Krebs in Deutschland, Robert Koch Institut, 2008). Hodgkin-Lymphome werden
nach histologischen Merkmalen weiter in das klassische Hodgkin-Lymphom (95% der
Fälle) und das seltenere noduläre Lymphozyten-prädominante Hodgkin-Lymphom
eingeteilt.
Lymphom/Leukämie zellulärer Ursprung Häufigkeit*
[%]
I. Indolente Non-Hodgkin-Lymphome/Leukämien
Chronische lymphozytische Leukämie
naive od. Gedächtnis B-Zelle
7 Lymphoplasmozytisches Lymphom (post) GC B-Zelle 1 Haarzellleukämie Gedächtnis B-Zelle <1 Marginalzonenlymphom Marginalzonen B-Zelle 9 Follikuläres Lymphom Grad 1 und 2 GC B-Zelle 16
II. Aggressive Non-Hodgkin-Lymphome/Leukämien
Prolymphozytenleukämie
Gedächtnis B-Zelle
<1 Plasmozytom (Multiples Myelom) Plasmazelle 10 Mantelzell-Lymphom CD5+ Mantelzonen B-Zelle 5 Follikuläres Lymphom Grad 3 wie Grad 1 und 2 6 Diffus großzelliges B-Zell Lymphom GC oder post-GC B-Zelle 30-40 Burkitt-Lymphom, Burkitt-ähnliches Lymphom GC B-Zelle 2 Akute lymphoblastische Leukämie/Lymphom B-Vorläuferzellen 2-3
III. Hodgkin-Lymphome
Klassisches Hodgkin-Lymphom
GC B-Zelle
8-10 Lymphozyten-prädominantes Hodgkin-Lymphom GC B-Zelle <1
Einleitung
6
Die Ursachen für die Entstehung eines Hodgkin-Lymphoms sind noch unklar. Klini-
sche und biologische Merkmale wie z.B. die Ausschüttung von Entzündungsmediato-
ren wie Interleukinen, Tumor Nekrose Faktor α oder granulocyte-colony stimulating
factor (G-CSF) durch die Reed Sternberg Zellen, sprechen für eine infektiöse Ent-
stehung. Als Risikofaktor für eine Erkrankung gilt eine Infektion mit dem Epstein-Barr
Virus (EBV), die bei etwa 40% der Patienten mit dem klassischen Hodgkin-Lymphom
vorliegt (Khan, 2006). Die Therapie des Hodgkin-Lymphoms erfolgt mit Strahlenthe-
rapie oder, gegebenenfalls, mit ergänzender Poly-Chemotherapie aus Doxorubicin,
Bleomycin, Vinblastin und Dacarbazin (ABVD-Schema). Im Vergleich zu anderen
Neoplasien ist das Hodgkin-Lymphom gut therapierbar, mit relativen 5-Jahres-Über-
lebensraten von 87-97% bei Erwachsenen und 97% bei Kindern (Connors, 2005).
2.1.1.2 Non-Hodgkin-Lymphome
Der Überbegriff Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) umfasst eine Vielzahl verschiedener
Lymphomerkrankungen und repräsentiert eine sehr heterogene Gruppe von unter-
schiedlichen Krankheitsbildern (Tabelle 1; Küppers, 2005; The Non-Hodgkin-Lym-
phoma classification Project, 1997). Im Gegensatz zu Hodgkin-Lymphomen können
NHL einen leukämischen Verlauf annehmen. Mit etwa 85-90% stammt die überwie-
gende Mehrheit der NHL von B-Lymphozyten ab (B-NHL), wohingegen sich nur 10-
15% von T- oder Natürlichen Killer (NK) Zellen ableiten (Küppers, 2005). Bei Er-
wachsenen tritt das NHL mit einer jährlichen Inzidenz von 5-10 pro 100 000 Einwoh-
ner auf und stellt etwa 3% der insgesamt diagnostizierten Krebsarten dar. In den letz-
ten 30 Jahren wurde eine stetige jährliche Zunahme von 5-8% an Fällen beobachtet.
Bei Kindern ist die relative Häufigkeit von 5-6% unter allen Krebsformen höher, wobei
die jährliche Inzidenz 0,8 pro 100 000 beträgt. Die beiden häufigsten Arten des NHL
sind das diffus großzellige B-Zell Lymphom (30-40%) und das follikuläre Lymphom
(22%).
Die verschiedenen Subtypen des B-Zell NHL entsprechen annäherungsweise unter-
schiedlichen Reifungsstadien, woraus Rückschlüsse über die zelluläre Herkunft ge-
zogen werden können. Ein B-Zell NHL kann aus B-1-Zellen (B-CLL), aus ruhenden
CD5-positiven naiven B-Zellen der Mantellzone (Mantelzelllymphom), reifen Ge-
Einleitung
7
dächtniszellen (Prolymphozyten Leukämie) oder B-Zellen des Keimzentrums (Burkitt-
Lymphom), IgM sezernierenden B-Zellen (lymphoplasmozytisches Lymphom), aber
auch aus ausdifferenzierten Plasmazellen (Plasmozytom) entstehen (Küppers,
2005). Je nach klinischem Verlauf kann eine Einteilung in indolente und aggressive
NHL erfolgen (Tabelle 1). Jedoch ist diese Untergliederung nach der Kiel-Klassi-
fikation nicht mehr Bestandteil der WHO-Richtlinien, da der weitere Verlauf nach
Erstdiagnose von verschiedenen Faktoren, wie dem Grad des Fortschreitens der
Krankheit, abhängig sein kann (Lennert und Feller, 1990).
Die Ursachen, die zur Entstehung eines NHL führen, sind in der Regel genetisch be-
dingt und umfassen strukturelle und numerische Aberrationen wie Translokationen,
Deletionen und Trisomien (Küppers, 2005). Häufig betroffen ist der Locus der Im-
munglobulin schweren Kette (IgH) auf Chromosom 14q32. Durch Translokationen
geraten Proto-Onkogene wie myc, Bcl-1 (Mantelzelllymphom), Bcl-2 (Burkitt-Lym-
phom, follikuläres Lymphom) oder Bcl-6 (diffus großzelliges B-Zell-Lymphom) unter
Kontrolle des IgH Promotors. Die Fehlregulation der Expression dieser Proteine führt
zur Inhibition der Apoptose oder zu einer erhöhten Proliferationsrate. Neben geneti-
schen Ursachen können auch virale Infektionen als Auslöser oder Kofaktoren eine
Rolle spielen. Das Auftreten des Burkitt-Lymphoms ist stark mit EBV-Infektionen as-
soziiert. Etwa 95% des endemischen und ca. 30% des sporadischen Burkitt-Lym-
phoms sind EBV positiv (Brady et al, 2007). Auch eine Infektion mit dem human im-
munodeficiency virus (HIV) führt zu einem erhöhten Risiko an einem NHL zu erkran-
ken (Knowles, 2003).
Die Behandlung der NHL erfolgt mit Strahlen-, Chemo-, oder ergänzender Immunthe-
rapie. Das Behandlungsschema wird an den Lymphomtyp angepasst, wobei auch
das Stadium (Ann Arbor-Klassifikation), welches den Grad der Ausbreitung der Er-
krankung im Körper widerspiegelt, das Alter des Patienten und dessen Allgemeinzu-
stand berücksichtigt werden. Bei indolenten NHL mit einer sehr langsamen Pro-
gression der Krankheit kann, falls keine Beschwerden vorliegen, mit einer Behand-
lung in einzelnen Fällen noch abgewartet werden (watch and wait).
Unter den unterschiedlichen Subtypen des NHL variieren die Aussichten auf Heilung
stark. Gut therapierbar sind follikuläre Lymphome (Grad I und II) in frühen Stadien.
Diese sind in der Regel strahlungssensitiv und können mit Radiotherapie und in
manchen Fällen mit zusätzlicher Chemotherapie geheilt werden. In fortgeschrittenen
Einleitung
8
Stadien hingegen ist eine vollständige Heilung selten möglich. Auch gelten das
Plasmozytom, die B-CLL und das Mantelzelllymphom als nahezu unheilbar. Häufig
ist der klinische Verlauf über Jahre durch wiederkehrende Rezidive geprägt, die
durch die minimale Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) entstehen und
selbst nach Komplett-Remissionen auftreten können. Die Therapie ist meist palliativ.
Bei follikulären, und anderen indolent verlaufenden Lymphomen in fortgeschrittenen
Stadien sowie bei aggressiven Lymphomen (z.B. diffus großzelliges B-Zell-
Lymphom) erwies sich Kombinationsbehandlungen mit verschiedenen Zytostatika als
wirkungsvoll. Eingesetzt werden u.a. die Chemotherapeutika Cyclophosphamid, Hy-
droxidaunorubicin, Vincristin (Oncovin®) und Prednisolon (CHOP-Schema). Bei Re-
zidiv-Patienten wird inzwischen routinemäßig eine ergänzende Immuntherapie mit
dem CD20 Antikörper Rituximab (Rituxan, MabThera®) durchgeführt (R-CHOP;
Coiffier, 2007). Zur nachfolgenden Erhaltungstherapie werden Zytokine wie Interfe-
ron α eingesetzt.
Bei NHL Patienten mit schlechter Prognose bietet eine Hochdosis-Chemotherapie
mit anschließender Stammzelltransplantation eine weitere Therapiemöglichkeit. Die
transplantierten Stammzellen können aus dem Patienten (autolog) oder von Fremd-
spendern (allogen) aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut nach Stimula-
tion mit G-CSF gewonnen werden. Als Kandidaten gelten Patienten, die jünger als 60
Jahre sind und die in der Primärtherapie ein unbefriedigendes Ansprechen zeigten
oder einen Rückfall erlitten (Weisdorf et al, 1992). Bei rezidivierten Patienten mit
hochmaligen Lymphomen konnten deutliche Verbesserungen hinsichtlich der Pro-
gression und des ereignisfreien Überlebens erzielt werden (Shipp et al, 1999).
2.1.1.3 Chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL)
Die CLL ist eine indolente Form des NHL mit stark leukämischem Verlauf. Sie ist mit
einer Inzidenz von 3 - 6 Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohner die häufigste Leu-
kämie und betrifft bei einem durchschnittlichen Erkrankungsalter von 65 Jahren
hauptsächlich ältere Menschen. Bei Kindern tritt die CLL gewöhnlich nicht auf. In
97% der Fälle sind die entarteten Zellen B-lymphatischen Ursprungs und stammen
von Gedächtniszellen oder unreifen, naiven B-Zellen ab (B-CLL). Charakteristisch ist
eine Expression von CD5 und B-Zell Differenzierungsantigenen wie CD19, CD20 und
Einleitung
9
CD79a (Oduncu et al, 2004). Der Krankheitsverlauf der B-CLL variiert sehr stark. Zur
Erstellung einer Prognose wird das individuelle Krankheitsstadium eines Patienten
nach den Kriterien der unabhängig entwickelten Klassifikationen nach Rai oder Binet
festgestellt (Tabelle 2; Binet et al, 1981; Tabelle 2; Rai et al, 1975). Beide Systeme
beruhen auf dem Ergebnis, dass in frühen Stadien die Tumormasse, und in späten
Stadien der Grad der Knochenmarkinsuffizienz den weiteren Verlauf der Krankheit
bestimmen. Berücksichtigt werden die Lymphozytenzahl im Blut, die Anzahl betrof-
fener Lymphknotenregionen, mögliche Vergrößerungen der Milz oder der Leber, et-
waige vorliegende Blutarmut (Anämie) oder Verringerung der Thrombozytenzahl
(Thrombopenie). Nach diesen Kriterien werden drei Risikogruppen unterschieden.
Die Niedrigrisikogruppe (Rai 0 und Binet A) weist eine mediane Überlebenszeit von
über zehn, die intermediäre Risikogruppe (Rai I und II, Binet B) von fünf bis sieben
und die Hochrisikogruppe (Rai III und IV) von zwei bis dreieinhalb Jahren auf. Nach
wie vor gilt die B-CLL als unheilbare Krankheit.
Tabelle 2: Stadieneinteilung der B-CLL nach Rai und Binet
Rai Definition Binet Definition
0 Lymphozytose > 15 000/mm3, Knochenmarksinfiltration > 40%
A Hb > 10,0 g/dL, Thrombozytenzahl normal und < 3 vergrößerte Lymph-knotenregionen*
I Lymphozytose und Lymphadenopathie
II Lymphozytose und Hepatomegalie und/oder Splenomegalie
B Hb >10,0 g/dL, Thrombozytenzahl normal und ≥ 3 vergrößerte Lymph-knotenregionen
III Lymphozytose und Anämie (Hb < 11,0 g/dL)
IV Lymphozytose und Thrombozytopenie
< 100 000/mm3 mit oder ohne Anämie,
Lymphadenopathie und Organomega-lie
C Hb > 10,0 g/dL und/oder Thrombo-zytenzahl 100 000 x 109/L unab-hängig von der Zahl vergrößerter Lymphknotenregionen
*Zervikale und axilläre, inguinale Lymphknoten uni- oder bilateral sowie Leber- und Milzvergröße-rungen gelten als je eine Region. Hb, Hämoglobin. Nach: Rai et al, 1975 und Binet et al,1981.
Weitere prognostische Faktoren liefern zytogenetische Analysen (Tabelle 3; Dohner
et al, 2000). Häufigste zytogenetische Anomalie ist die Deletion 13q14, die in ca.
55% der Fälle nachzuweisen ist und mit einer günstigen Prognose assoziiert ist. Das
in diesem Genomabschnitt vermutete tumor suppressor Gen ist bis heute nicht ein-
deutig identifiziert (Kalachikov et al, 1997; Liu et al, 1997). Die Deletion 17p13 führt
zum Verlust des tumor suppressor Gens p53 und ist dagegen mit einer schlechten
Einleitung
10
Prognose assoziiert. Weitere ungünstige prognostische Faktoren sind u.a. eine Ex-
pression von CD38, das Fehlen von Hypermutationen in Genen der variablen
Immunglobulinregionen (IgV) und eine kurze Lymphozytenverdopplungszeit von
unter zwölf Monaten.
Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL*
*Untersuchung beruht auf der Analyse von 343 Patienten. Abgewandelt nach: Dohner et al, 2000.
Patienten im Binet Stadium A sind in der Regel symptomlos und müssen nicht be-
handelt werden (Oduncu et al, 2004). Bei Krankheitsprogression oder einer ent-
sprechenden Prognose werden mit Purinanaloga (Fludarabin) verabreicht. Mit dieser
Behandlung konnten zwar in vielen Fällen Komplettremissionen erzielt werden, ob je-
doch die Überlebensrate erhöht wird ist derzeit noch unklar. In fortgeschrittenen Sta-
dien (Binet B und C) werden standardmäßig die Alkylantien Chlorambucil oder Cyclo-
phosphamid eingesetzt, wobei die Ansprechrate 40–70% beträgt. Komplette Re-
missionen werden allerdings, wie auch mit Polychemotherapie nach verschiedenen
Standardprotokollen, selten erreicht (CLL Trialists´Collaborative Group, 1999). Durch
eine Kombinationsbehandlung mit Fludarabin, Cyclophosphamid und Mitoxantron
konnte eine gute Gesamtansprechrate von 67% bei Patienten im Rezidiv und eine
hohe Quote an kompletten Remissionen (50%) erzielt werden, die auch molekulare
Remissionen umfasste (Bosch et al, 2002). Aufgrund des hohen Risikos wird eine
Hochdosis-Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation nur bei Pati-
enten mit hohem Progressionsrisiko, die jünger als 60 Jahre sind und einen guten
Allgemeinzustand haben, durchgeführt (Dreger et al, 2003; Schetelig et al, 2003). In
solchen Fällen konnten verringerte Rückfallquoten erzielt werden. Ob dies zu einer
höheren Überlebensrate beitragen kann wird derzeit untersucht. Als alternativer
Ansatz werden auch therapeutische Antikörper wie der gegen CD52-gerichtete An-
tikörper Alemtuzumab (Campath®) mit in die Therapieprotokolle integriert und in
Kombination mit Chemotherapeutika verabreicht (Alinari et al, 2007).
Aberration Betroffene Gene Häufigkeit [%] Prognose
Deletion 13q14 D13S25 55 Günstig Deletion 11q22.3-23.1 ? 18 Schlecht
Trisomie 12 ? 16 - Deletion 16q21-23 ? 6 Günstig
Deletion 17p13 p53 7 Schlecht
Einleitung
11
2.1.1.4 Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL)
Akute lymphatische Leukämien (ALL) treten bei Erwachsenen mit einer Inzidenz von
1 pro 100 000 Einwohner eher selten auf, wobei das mittlere Erkrankungsalter zwi-
schen 30 und 40 Jahren liegt. Im Kindesalter ist die ALL dagegen mit einer jährlichen
Inzidenz von etwa 4 Fällen pro 100 000 ungleich häufiger und stellt mit einem Anteil
von 27% an allen Krebsarten die häufigste Krebsform in dieser Bevölkerungsgruppe
dar. Insbesondere sind Kinder im Alter von unter vier Jahren betroffen, bei denen die
ALL mehr als doppelt so häufig auftritt wie in anderen Altersgruppen. Unter den pä-
diatrischen Leukämien ist die ALL mit einem Anteil von 80% die häufigste Form
(Felix und Lange, 1999).
Die Einteilung der ALL erfolgt durch Immunphänotypisierung nach den Richtlinien der
European Group for the Immunological Classification of Leukemia (EGIL; Bene et al,
1995). Bei Erwachsenen sind etwa 75% der diagnostizierten ALL B-lymphatischen
Ursprungs (B-ALL). Im Kindes- und Jugendalter sind ca. 85% der B-Zellreihe zuzu-
ordnen (Lipp et al, 2003). Innerhalb der B-lymphoiden ALL werden weitere Subtypen
je nach Differenzierungsgrad der malignen Zellen unterschieden (Tabelle 4). Der
häufigste Subtyp bei Erwachsenen und Kindern ist mit etwa 60% die common B-ALL,
wohingegen eine reifzellige B-ALL sehr selten ist (6% der B-ALL).
Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe
Antigen pro-B common B prä-B B
TdT + + + - HLA-DR + + + +
CD10 - + +/- +/- CD19 + + + +
cyCD22 + + + + cyCD79a + + + +
cyµ - - + - IgM - - - +
+ positiv bei > 20% der Blasten; +/- positiv bei 10% der Blasten; - positiv bei < 10% der Blasten; cy, zytoplasmatisch; TdT, terminale Desoxyadenylattransferase; HLA, human leukocyte antigen; CD clus-
ter of differentiation. Abgewandelt nach: Lipp et al, 2003.
Bei etwa 60 bis 80% der Patienten ist die B-ALL mit strukturellen oder numerischen
Chromosomenaberrationen assoziiert, die auch von prognostischer Bedeutung sein
können. So ist die reziproke Translokation t(9,22), die zur Bildung des Philadelphia-
Chromosoms und des Fusionsproteins bcr-abl führt und die bei 10-30% der erwach-
senen B-ALL Patienten gefunden wird, mit einer sehr ungünstigen Prognose
Einleitung
12
assoziiert (Lipp et al, 2003). Auch Translokationen, die das mixed-lineage leukemia
(MLL) Gen (11q23) betreffen, stehen mit einer schlechten Prognose in Zusammen-
hang (Thirman et al, 1993). MLL Translokationen werden in 50-80% der pädiatri-
schen ALL gefunden (Felix und Lange, 1999). Unter diesen ist die Translokation
t(4;11), die zum Fusionsonkogen MLL-AF4 führt, am häufigsten.
Zur Behandlung der ALL erfolgt eine Induktionstherapie mit einer Poly-Chemothera-
pie. Eingesetzt werden u.a. Prednison (oder Dexamethason), Vincristin, Anthrazykli-
ne (Daunorubizin) und L-Asparaginase, die zur Intensivierung mit Cyclophosphamid,
Cytarabin oder Mercaptopurin ergänzt werden können (Hoelzer et al, 2002). Zur Kon-
solidierung wird insbesondere zusätzlich Methotrexat eingesetzt. Bei Patienten, die
nicht auf eine Chemotherapie ansprechen oder die eine sehr schlechte Prognose ha-
ben, besteht die Möglichkeit einer Stammzelltransplantation. Diese bietet für diese
Patientengruppe oft die einzige Option auf eine Heilung. An die Konsolidierungsthe-
rapie setzt eine bis zu zweijährige Erhaltungstherapie an, die die Gefahr eines Rezi-
divs vermindern soll. Üblicherweise werden Methotrexat und Mercaptopurin verab-
reicht. Ein Problem bei der ALL stellt der Befall des zentralen Nervensystems (ZNS)
dar. Deshalb wird zusätzlich eine ZNS-Prophylaxe mit intrathekal applizierten Che-
motherapeutika wie z.B. Methotrexat oder eine Schädelbestrahlung durchgeführt,
wodurch die Rückfallquote deutlich verringert werden konnte. Inzwischen werden bei
Kindern relativ hohe Heilungsraten von 80% erzielt (Schrappe et al, 2000), wohinge-
gen bei Erwachsenen nur etwa 40% der Patienten geheilt werden (Gokbuget und
Hoelzer, 2002). In Hoch-Risiko Gruppen z.B. mit Translokation t(9;22) liegt die 5-Jah-
res-Überlebenswahrscheinlichkeit noch immer bei unter 20% (Lipp et al, 2003).
2.1.2 Nebenwirkungen konventioneller Therapieansätze
Chemotherapeutika sind meist Zytostatika, die durch eine Hemmung der DNA Repli-
kation oder der Zellteilung wirken. Anthrazykline, wie Daunorubicin oder Doxorubicin
verhindern durch Interkalation in die DNA die Replikation. Eine ähnliche Wirkungs-
weise besitzen Alkylantien wie Cyclophosphamid, die Alkylgruppen auf die DNA
übertragen. Alkaloide wie Vincristin binden das Protein Tubulin und verhindern da-
durch die Mitose (Mitosespindelgifte). Topoisomerase-II-Inhibitoren wie Etoposid
Einleitung
13
hemmen dieses zur Replikation wichtige Enzym, wodurch DNA Doppelstrangbrüche
entstehen. Antimetabolite wie der Folsäure Antagonist Methotrexat oder Pyrimidin-
oder Purinanaloga (z.B. Fludarabin) verdrängen die natürlichen Metabolite und hem-
men so wichtige Stoffwechselfunktionen wie die Nukleinsäuresynthese.
Da Zytostatika generell auf schnell proliferierende Zellen und nicht selektiv auf Tu-
morzellen wirken, sind immer auch gesunde Gewebe wie Knochenmark, Magen- und
Darmepithelien oder auch Haarfollikel betroffen. Daher ist eine Chemotherapie mit
zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden. Diese umfassen u.a. Übel-
keit, Entzündungen der Mund-, Speiseröhren- und Darmschleimhäute, Menstrua-
tionsstörungen, Keimzellstörungen und Haarausfall. Eine Gefahr ist ein erhöhtes In-
fektionsrisiko durch hervorgerufene Störungen der Hämatopoiese, die zu einem Man-
gel an Granulozyten (Granulozytopenie) oder Lymphozyten (Lymphozytopenie) füh-
ren können. Dies schädigt zusätzlich das körpereigene Immunsystem, welches bei
Leukämie- oder Lymphompatienten ohnehin beeinträchtigt ist. Weiterhin kann auch
die Bildung von Blutplättchen eingeschränkt sein (Trombozytopenie), was zu Stö-
rungen in der Blutgerinnung führen kann und als deren Folge spontane Blutungen
auftreten können. Störungen der Erythrozyten-Bildung können zu einer Blutarmut
(Anämie) führen, die mit Müdigkeit, Konzentrationsschwäche und Kopfschmerzen
verbunden ist. Diese Folgen sind jedoch zeitlich begrenzt, und nach Abschluss der
Chemotherapie regenerieren sich die geschädigten Gewebe. Schwerwiegender sind
mögliche dauerhafte Schädigungen von Organen wie des Herzens, der Leber, der
Niere oder des Nervensystems. Darüber hinaus können als Folge einer Chemo- oder
einer Strahlentherapie Therapie-induzierte Neoplasien auftreten, die durch die muta-
gene Wirkung vieler Chemotherapeutika verursacht werden können. Zudem stellt
häufig die MRD ein Problem bei der Therapie dar. Tumorzellen, die im Verlauf der
Therapie nicht beseitigt wurden, können erneut expandieren und zu einem Rezidiv
führen. Oft haben diese MRD Zellen unter dem Selektionsdruck im Verlauf der Be-
handlung Resistenzmechanismen entwickelt und sprechen auf eine erneute Chemo-
therapie nicht mehr an (Hoelzer et al, 2002).
Bei Transplantationen stellen mögliche Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen
(graft versus host disease; GvHD) ein schwerwiegendes Problem dar. Die Ursache
sind immunologische Reaktionen der T-Zellen des Spenders gegen Körperzellen des
Empfängers, wodurch Gewebeschädigungen entstehen können. Zwar führt ein graft
Einleitung
14
versus malignancy (GvM) Effekt auch zu einer Abwehrreaktion des Transplantates
gegen die Tumorzellen, dennoch bleibt die GvHD ein Hauptproblem und kann in
schweren Fällen tödlich enden. Insgesamt werden durch Verbesserungen der
Chemotherapieprotokolle und der Transplantationsmethoden immer mehr Patienten
geheilt. Aufgrund der erläuterten Nachteile ist es jedoch erforderlich, neue Strategien
zu entwerfen, die eine gezielte antitumorale Therapie erlauben. Ansatzpunkte sind
kleine Wirkstoffmoleküle (small inhibitory molecules), die in den Stoffwechselweg der
Tumorzellen eingreifen (Imatinib mesylat; Nadal und Olavarria, 2004), Tumorvakzi-
nierungen und Antikörper-basierte Strategien.
2.2 Antikörper-basierte Strategien in der Krebstherapie
Bestimmte therapeutische Antikörper vereinen eine gewisse Spezifität für Tumorzel-
len mit einer Fähigkeit, Effektorzellen des körpereigenen Immunsystems aktivieren
oder anti-proliferative bzw. pro-apoptotische Signale in den Tumorzellen auslösen zu
können (Carter, 2006). Auch können Antikörper als Vehikel genutzt werden, um
Zellgifte, wie Zytostatika, proteinogene Toxine oder radioaktive Isotope, gezielt zu
den erkrankten Geweben zu transportieren (Allen, 2002). Durch die Spezifität des
Antikörpers können somit systemische Nebeneffekte der zytotoxischen Substanzen
reduziert werden. Der klinische Erfolg hängt dabei sowohl von den Eigenschaften
des gewählten Zielantigens als auch von Eigenschaften des Antikörpers und des
gewählten Formats ab.
2.2.1 Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper
Monoklonale Antikörper können auf verschiedene Art therapeutisch wirksam sein
(Abbildung 2). Dabei werden direkte und indirekte Wirkmechanismen unterschieden
(Glennie und Johnson, 2000). Direkte Wirkmechanismen beruhen einzig auf der Bin-
dung des Antikörpers an das entsprechende Zielantigen. So können durch Kreuzver-
netzung des Zielantigens auf den Tumorzellen intrazelluläre Signale ausgelöst wer-
den, die den Zellzyklus beeinflussen und anti-proliferativ wirken oder direkt zur Apop-
tose führen (Signalisieren). Dies ist unter anderem ein Wirkmechanismus des Anti-
Einleitung
15
körpers Rituximab (Rituxan, MabThera®), der durch Kreuzvernetzung des Zielan-
tigens CD20 Apoptose in den Zielzellen induziert (Shan et al, 1998). Gleichermaßen
löst auch die Antikörper-vermittelte Kreuzvernetzung anderer Antigene, wie CD22,
CD33 oder human leukocyte antigen class II (HLA II) anti-proliferative Signale in den
Zielzellen aus (Dechant et al, 2003; Meng et al, 2004; Vitale et al, 1999). Des
Weiteren können Antikörper die Bindung verschiedener Liganden, wie z.B. Wachs-
tumsfaktoren oder Zytokine, an entsprechende Rezeptoren verhindern (Blockieren).
So inhibiert der zur Therapie von Brustkrebs eingesetzte Antikörper Trastuzumab
(Herceptin®) durch Bindung an den Rezeptor Her2/neu dessen Interaktion mit dem
epithelialen Wachstumsfaktor (epithelial growth factor, EGF). Als Folge wird die
Vermittlung proliferationsfördernder Signale blockiert und dadurch das Wachstum
des Tumors verlangsamt (Harries und Smith, 2002). Die beiden Antikörper Infliximab
(Remicade®) und Adalimumab (Humira®), die zur Behandlung von Autoimmuner-
krankungen oder zur Immunsuppression eingesetzt werden, wirken blockierend,
indem sie das Zytokin TNFα binden. Dadurch verhindern sie dessen Interaktion mit
seinem Rezeptor und hemmen Entzündungsreaktionen (Bondeson und Maini, 2001;
Navarro-Sarabia et al, 2006).
Indirekte Wirkmechanismen hingegen beruhen auf der Aktivierung bestimmter Effek-
torfunktionen, die schließlich den Tod der Zielzelle auslösen. Effektorfunktionen wer-
den über das fragment crystalizable (Fc) eines Antikörpers vermittelt, daher kommt
der Art des Isotyps eine besondere Bedeutung zu. Zu den indirekten Wirkmechanis-
men zählen die Fixierung von Komplement und das Auslösen der Komplementkaska-
de. Dies führt zur Lyse der Zielzelle durch Komplement-abhängige Zytotoxizität (com-
plement-dependent cytotoxicity, CDC). Die Vermittlung der CDC trägt auch zur thera-
peutischen Wirksamkeit von Rituximab und des ebenso in der Therapie B-lymphoider
Neoplasien eingesetzten CD52-gerichteten Antikörpers Alemtuzumab (Campath®)
bei (Alinari et al, 2007; Cragg und Glennie, 2004; Reff et al, 1994). Insbesondere
sind Antikörper in der Lage, einen antigenspezifischen Angriff zytotoxischer Effektor-
zellen, die selbst keine Antigenspezifität besitzen, zu steuern. Durch Wechselwirkung
zwischen dem Fc Teil des Antikörpers und den Fc-Rezeptoren der Effektorzellen, wie
z.B. NK-Zellen, werden diese zu den erkrankten Zellen rekrutiert und aktiviert. Die
Effektorzellen lösen schließlich durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität
(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) den Tod der Zielzelle durch die
Freisetzung lytischer Granula aus, die sich aus Granzymen und Perforinen zusam-
Einleitung
16
mensetzen. Für IgG Antikörper existieren drei wichtige Fc-Rezeptoren (FcR), die
ADCC vermitteln, der hoch affine FcγRI (CD64), sowie die beiden niedrig affinen
FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16) (Burton und Woof, 1992; Ravetch und Bolland,
2001). Für die Aktivierung der Effektorzellen ist die γ-Kette verantwortlich, die mit den
Fc-Rezeptoren assoziiert ist und die bei der Signalübertragung ins Innere der Effek-
torzelle eine entscheidende Rolle spielt. Die ADCC ist ein wichtiger Wirkmecha-
nismus vieler therapeutischer Antikörper, einschließlich Rituximab, Alemtuzumab,
Trastuzumab oder Cetuximab (Carter, 2001b; Cooley et al, 1999; Crowe et al, 1992;
Hale et al, 1985; Kimura et al, 2007a; Naramura et al, 1993; Reff et al, 1994). Über
den Fc Teil können Antikörper auch phagozytierende Zellen wie Makrophagen rekru-
tieren und auf diese Weise Phagozytose auslösen (Brekke und Sandlie, 2003).
Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper. Therapeutische Antikörper können direkt wirken, indem sie eine Interaktion zwischen einem löslichen oder einem zellgebundenen Ligan-den mit dem Rezeptor auf der Tumorzelle blockieren oder nach Bindung auf Zelloberflächenrezepto-ren der Tumorzelle anti-proliferative oder pro-apoptotische Signale auslösen. Indirekte Mechanismen werden über den Fc-Teil des Antikörpers vermittelt. Über diesen können die Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) ausgelöst oder Immuneffektorzellen rekrutiert werden, welche die Tumorzelle über Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) oder Phagozytose beseitigen können. Abgewan-delt nach: Glennie und Johnson, 2000.
Rituximab bietet ein Beispiel für einen Antikörper, der in vitro sowohl direkt durch
Auslösen der Apoptose, als auch indirekt über CDC oder ADCC wirken kann. Die Be-
Einleitung
17
teiligung der einzelnen Mechanismen in vivo ist noch nicht vollständig geklärt, den in-
direkten Mechanismen werden allerdings eine größere Bedeutung zugeschrieben
(Carter, 2006). Die klinische Bedeutung der CDC ist noch umstritten und wird kontro-
vers diskutiert (Manches et al, 2003; Weng und Levy, 2001). Dahingegen stellt die
Rekrutierung von Immunzellen und die Induktion der ADCC unter Beteiligung von Fc-
Rezeptoren einen klinisch relevanten Mechanismus, sowohl in vitro als auch in vivo,
dar (Cartron et al, 2002; Weng und Levy, 2003). Dies wurde inzwischen auch für an-
dere therapeutische Antikörper, wie Cetuximab (Erbitux®) oder Trastuzumab gezeigt
(Carter, 2001b; Musolino et al, 2008; Zhang et al, 2007).
2.2.2 Antikörper als Vehikel
Antikörper können auch als Vehikel eingesetzt werden um toxische Substanzen zu
den Tumorzellen zu transportieren (Abbildung 3). Am weitesten entwickelt sind Ra-
dioimmunkonjugate, die aus an Antikörper-gekoppelte Radionuklide wie 131Iod (I)
oder 90Yttrium (Y) bestehen. Mit Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin®) und Tositumomab
(Bexxar®) sind zwei gegen CD20 gerichtete Radioimmunkonjugate zur Therapie des
NHL von der U.S. Food and drug administration (FDA) zugelassen, die in der Be-
handlung Chemotherapie-refraktärer Patienten hohe Ansprechraten erzielten (Witzig
et al, 1999). Durch chemische Kopplung wurden Antikörper an verschiedene Zytosta-
tika wie Doxorubicin oder Calicheamycin gekoppelt (Allen, 2002). Bislang ist mit
Gemtuzumab Ozogamicin (Mylotarg®) ein Zytostatika-Immunkonjugat zum klini-
schen Einsatz zugelassen. Antikörper können auch chemisch an Liposomen gekop-
pelt werden, die Zytostatika als Fracht tragen (Immunliposomen). Auf diese Weise
können größere Mengen der Wirkstoffe gezielt zum Tumorgewebe transportiert und
systemische Toxizitäten reduziert werden (Allen, 2002).
Die Entwicklung von Immuntoxinen ermöglichte eine genetische Kopplung proteino-
gener Toxine wie Ricin A oder Pseudomonas Exotoxin A (ETA) an Antikörper (Allen,
2002). Diese Moleküle besitzen eine hohe Effizienz, die Tumorzellen zu beseitigen.
Durch die Verwendung von Antikörperfragmenten, die nur aus den variablen Berei-
chen der schweren und der leichten Kette bestehen (fragment variable, Fv), konnte
ein Großteil der immunogenen Epitope beseitigt werden, die hauptsächlich in den
konstanten Regionen eines Antikörpers lokalisiert sind (Thorpe et al, 2003). Dadurch
Einleitung
18
wurde die Immunogenität der Moleküle entscheidend verringert. Zwar sind derartige
Moleküle derzeit noch nicht zugelassen, zeigten aber in präklinischen Studien viel
versprechende Ergebnisse (Bruell et al, 2005; Peipp et al, 2002; Schwemmlein et al,
2007; Tur et al, 2003). In einer Phase I Studie erzielte ein gegen CD22 gerichtetes
Immuntoxin (BL22) bei Chemotherapie-resistenten Haarzellleukämie-Patienten eine
Ansprechrate von 80%. Die Nebenwirkungen wurden als leicht eingestuft und waren
reversibel und nicht Dosis-limitierend (Kreitman et al, 2005; Kreitman et al, 2001).
Abbildung 3: Antikörper als Vehikel. Antikörper können genutzt werden, toxische Substanzen ge-zielt zum Tumorgewebe zu dirigieren. Toxische Substanzen können Zytostatika, die direkt gekoppelt oder in Form von Immunliposomen transportiert werden können, Radionukleide oder proteinogene To-xine aus Pflanzen, Pilzen sowie aus Bakterien sein. Auf indirektem Weg wirken Immunzytokine. Zyto-kine können Immunreaktionen auslösen oder verstärken. Durch die Fusion eines Zytokins an einen Antikörper kann eine lokale Anreicherung des Moleküls im Tumorgewebe erzielt und eine zielgerichte-te Immunreaktion gegen die malignen Zellen ausgelöst werden. Abgewandelt nach: Carter, 2001.
Auch wurden durch die Fusion von Zytokinen an Antikörper Immunzytokine entwi-
ckelt. Zytokine, wie Interleukin-2, oder andere immunmodulatorische Moleküle kön-
nen antitumorale Immunantworten auslösen oder verstärken. In Form von Immunzy-
tokinen, die gegen Zelloberflächenantigene des Tumors gerichtet sind, kann durch
die resultierende Anreicherung des Zytokins am Tumorgewebe dessen therapeuti-
sche Wirksamkeit unter Minimierung der Nebenwirkungen verstärkt werden
(Schrama et al, 2006). Des Weiteren wurden als Todeseffektordomänen Enzyme
(z.B. Rnasen) oder Todesliganden der tumor necrose factor/nerve growth factor
Einleitung
19
(TNF/NGF)-Superfamilie an Antikörper oder Antikörperfragmente gekoppelt (Bremer
et al, 2004; Newton und Ryback, 2001). Diese Fusionsproteine zeigten viel
versprechende Ergebnisse in vorklinischen Untersuchungen.
2.2.3 Antikörper in der Therapie hämatologischer Neoplasien
Die Entwicklung der Hybridom-Technologie ermöglichte es, monoklonale Antikörper
in größeren Mengen herzustellen und klinisch zu erproben (Kohler und Milstein,
1975). Mit Muromonab-CD3 (OKT3), der gegen Transplantatabstoßung eingesetzt
wird, wurde 1987 der erste Antikörper von der FDA zum klinischen Einsatz zugelas-
sen (Kung et al, 1979; Smith, 1996). Die ersten klinischen Versuche mit Antikörpern
wurden Anfang der 80er Jahre bei der Behandlung von Lymphom-Patienten durch-
geführt (Meeker et al, 1985; Miller et al, 1982; Nadler et al, 1980). Diese Antikörper
waren Anti-Idiotyp-Antikörper und spezifisch für den Idiotyp des dem Lymphom zu-
grunde liegenden entarteten Klons, und boten somit ein Höchstmaß an Spezifität für
die Tumorzellen. Mit diesem Ansatz konnten erste Erfolge verzeichnet werden, und
bei einem Patienten wurde eine komplette Remission erzielt (Miller et al, 1982). Aller-
dings sind Anti-Idiotyp-Antikörper für eine generelle Anwendung nicht geeignet, da
sie individuell für jeden Patienten entwickelt werden müssten. Alternative Zielstruktu-
ren für eine Antikörper-basierte Therapie von Leukämien und Lymphomen sind Diffe-
renzierungsantigene (cluster of differentiation, CD). Diese eignen sich gut als Zielan-
tigene, da ihre Expression auf einen oder wenige Zelltypen beschränkt ist. Dadurch
kann eine Zellpopulation im Organismus gezielt attackiert werden, ohne dass andere
Gewebe geschädigt werden. Somit werden CD Antigene zwar nicht ausschließlich
auf den Tumorzellen exprimiert, ermöglichen aber eine Anwendung, die auf
unterschiedliche Patienten übertragbar ist.
Die ersten klinisch getesteten Antikörper bestanden aus murinen Sequenzen. Ob-
wohl diese therapeutische Effekte zeigten, war ihre Wirkung teilweise eingeschränkt.
Hauptprobleme waren zum einen auftretende Immunreaktionen im Patienten gegen
das Therapeutikum, die zur Bildung neutralisierender Antikörper führten (human anti-
mouse antibody, HAMA). Dies limitierte deren Einsatz und Effizienz. Zum anderen in-
teragierten murine Fc Teile nur schwach mit den humanen Fc-Rezeptoren der Effek-
torzellen. Deshalb waren die vermittelten Effektorfunktionen muriner Antiköper oft
Einleitung
20
nicht effizient genug (Carter, 2001b). Durch Chimärisierung und Humanisierung
konnten diese Limitierungen weitgehend überwunden werden: In einem chimären
Antikörper wurden die murinen konstanten Domänen durch die entsprechenden
humanen ersetzt, während in einem humanisierten Antikörper nur noch die comple-
mentarity determining regions (CDR) der variablen Ketten murinen Ursprungs sind.
Schließlich ist inzwischen auch die Herstellung komplett humaner Antikörper
möglich. Die Phage-Display Technik ermöglichte es Antikörperfragmente der gewün-
schten Spezifität aus humanen Antikörperbanken zu isolieren und durch Kombination
mit den Sequenzen humaner konstanter Antikörper-Domänen zu ganzen Antikörpern
zu fusionieren. Auch ist inzwischen die Erzeugung humaner Antikörper durch
Immunisierung transgener Mäusen, die humane Immunglobulin Gene tragen,
möglich (Green, 1999; Lonberg et al, 1994). Chimäre, humanisierte oder humane
Antikörper sind weniger immunogen als murine Antikörper und besitzen verbesserte
Effektorfunktionen (Carter, 2006).
Bislang sind 21 Antikörper oder Antikörper-abgeleitete Derivate von der FDA zum kli-
nischen Einsatz zugelassen (Stand 2007). Diese werden in verschiedenen Anwen-
dungsgebieten (Onkologie, chronische Entzündungskrankheiten, Transplantationen,
Infektionskrankheiten, kardiovaskuläre Medizin) eingesetzt. Neun dieser Antikörper
werden in der Krebstherapie, und davon über die Hälfte zur Behandlung hämatologi-
scher Neoplasien eingesetzt (Tabelle 5). Am häufigsten wird der Isotyp IgG1 verwen-
det. Dieser besitzt gute Effektorfunktionen und kann sowohl ADCC als auch CDC
vermitteln. Darüber hinaus weisen IgG1 Antikörper eine lange in vivo Plasma-Halb-
wertszeit von über 21 Tagen auf, da sie durch eine Wechselwirkung mit dem neona-
talen Rezeptor (FcRn) rezirkularisieren können (Carter, 2006).
Der monoklonale CD20-gerichtete Antikörper Rituximab wird zur Therapie von B-Zell
NHL Patienten eingesetzt und hat deren Therapieoptionen deutlich verbessert. In er-
sten Studien mit rezidivierten follikulären Lymphom Patienten ergab sich eine An-
sprechrate von 48%, und in 6% der Patienten wurde eine komplette Remission er-
zielt (McLaughlin et al, 1998). Wurde der Antikörper in der Erstlinientherapie (first line
therapy) verabreicht, sprachen über 70% der Patienten an, wobei für fast 40% der
Patienten eine komplette Remission beobachtet wurde. Der Antikörper wurde von
den meisten Patienten gut toleriert, und Nebenwirkungen beschränkten sich haupt-
sächlich auf Fieber und Schüttelfrost, welche als Folgen der Infusion auftraten
Einleitung
21
(Hainsworth, 2002). Darüber hinaus erhöhte die zusätzliche Gabe von Rituximab in
Kombination mit Standardchemotherapeutika nach dem CHOP-Schema (R-CHOP)
die Ansprechraten im Vergleich zur alleinigen Chemotherapie, ohne dabei die Ne-
benwirkungen zu erhöhen. Auf diese Weise konnten für das follikuläre Lymphom und
das diffus grosszellige B-Zell-Lymphom die bislang höchsten Ansprechraten erzielt
werden. Auch bei Patienten mit anderen Formen des NHL wurde Rituximab allein
oder als Ergänzung der Chemotherapie mit unterschiedlichem Erfolg in klinischen
Studien getestet. Bei B-CLL Patienten erwies sich eine Behandlung mit Rituximab
bei Ansprechraten von 12% als nicht erfolgsversprechend. Trotzdem sensibilisierte
Rituximab die leukämischen Zellen für die Chemotherapeutika Fludarabin und Cyclo-
phosphamid (Byrd et al, 2001; Wierda und O'Brien, 2001).
Tabelle 5: Zugelassene Antikörper in der Krebstherapie (Stand: 2007)
Produktname Antikörper Format Antigen Indikation
Zulassung
Monoklonale Antikörper
Rituxan Rituximab Chimärer IgG1 CD20 NHL 1997
Herceptin Trastuzumab Humanisierter IgG1 Her2/neu Brustkrebs 1998
Campath-1H Alemtuzumab Humanisierter IgG1 CD52 CLL 2001
Erbitux Cetuximab Chimärer IgG1 EGFR Darmkrebs Kopf/Halskrebs
2004 2006
Avastin
Bevacizumab
Humanisierter IgG1
VEGF
Darmkrebs NSCLC
2004 2006
Vectibix Panitumumab Humaner IgG2b EGFR Darmkrebs 2006
Immunkonjugate/ Radioimmunkonjugate
Mylotarg Gemtuzumab Ozogamycin
Humanisierter IgG4; Calicheamycin konjugiert
CD33 AML 2000
Zevalin Ibritumomab Tiuxetan
Muriner IgG1; 90Y-konjugiert
CD20 NHL 2002
Bexxar Tositumomab Muriner IgG2a; 131I-konjuguert
CD20 NHL 2003
NHL, Non-Hodgkin Lymphom; CLL, chronische lymphozytische Leukämie; EGFR; epidermal growth
factor receptor; VEGF, vascular endothelial growth factor; NSCLC, nicht-kleinzelliges Bronchialkarzi-nom (non-small cell lung cancer); AML, akute myeloische Leukämie. Abgewandelt nach: Carter, 2006.
Zur Behandlung der B-CLL wird in steigendem Maße der CD52 Antikörper Alemtuzu-
mab routinemäßig eingesetzt. Bei refraktären Patienten betrug die Ansprechrate
33%, jedoch wurden in nur 2% der Patienten komplette Remissionen erzielt (Keating
Einleitung
22
et al, 2002). In der Erstlinientherapie sprachen in ersten Studien bis zu 87% auf die
Behandlung an, und in 19% konnte eine komplette Remission erzielt werden. In
Kombination mit verschiedenen Chemotherapeutika (z.B. Fludarabin) oder dem Anti-
körper Rituximab zeigten sich in verschiedenen Studien additive bis synergistische
Effekte (Faderl et al, 2003; Kennedy et al, 2002a).
Zur Behandlung der B-Zell NHL sind mit Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin®) und Tosi-
tumomab (Bexxar®) auch zwei CD20-gerichtete Radioimmunkonjugate zugelassen.
Diese verzeichneten insbesondere auch bei der Behandlung Rituximab-resistenter
Patienten Erfolge (Gordon et al, 2004; Horning et al, 2005). Gemtuzumab Ozogamy-
cin (Mylotarg®) ist nach wie vor das einzige Zytostatika-Immunkonjugat das zum kli-
nischen Einsatz zugelassen ist. Dieses wird zur Behandlung rezidivierter AML-Pa-
tienten, die älter als 60 Jahre sind, eingesetzt. Obwohl die systemischen Toxizitäten
im Vergleich zu herkömmlichen Chemotherapeutika geringer ausfallen, ist eine Be-
handlung mit Mylotarg dennoch mit zum Teil erheblichen Nebenwirkungen assoziiert
(Bross et al, 2001; Hamann et al, 2002). Als mögliche Ursachen werden u. a. eine
CD33-unabhängige Aufnahme des Immunkonjugats oder die Entstehung freier Cali-
cheamicin Moleküle, die aufgrund einer instabilen Kopplungschemie entstehen und
nun unspezifisch wirken, diskutiert (Jedema et al, 2004; Schwemmlein et al, 2006)
2.2.4 Limitierungen monoklonaler Antikörper
Trotz der beachtlichen therapeutischen Erfolge, die mit Antikörpern erzielt wurden, ist
eine Behandlung mit konventionellen Antikörpern auch mit Nachteilen verbunden.
Insbesondere bei der Verabreichung muriner, chimärer, aber auch bei humanisierten
oder humanen Antikörpern, besteht die Gefahr, dass das Immunsystem des Patien-
ten mit der Bildung neutralisierender Antikörper reagiert, wodurch eine wiederholte
oder dauerhafte Verabreichung erschwert wird (Carter, 2006). Darüber hinaus
schränkt die relativ große Molekülmasse von ca. 150 kDa die Gewebegängigkeit
ganzer Antikörper ein und erschwert ein Eindringen in tiefere Schichten eines soliden
Tumors, wodurch therapeutische Effekte gemindert werden (Jain und Baxter, 1988;
Yokota et al, 1992). Zusätzlich kann die Wirksamkeit eines monoklonalen Antikörpers
durch Wechselwirkungen zwischen dem Fc-Teil des humanen IgG1 Antikörpers mit
Fc-Rezeptoren auf nicht-zytotoxischen Zellen (z.B. FcγRII Blutplättchen), mit nicht-
Einleitung
23
aktivierenden Fc-Rezeptoren (z.B. FcγRIIIb auf Granulozyten) oder inhibitorischen
Fc-Rezeptoren (FcγRIIb auf Monozyten oder Makrophagen) eingeschränkt werden.
Darüber hinaus beeinflussen Polymorphismen in den Fc-Rezeptoren die Affinität der
Bindung der Fc-Regionen, und wirken sich kritisch auf das klinische Ansprechen ei-
nes Patienten aus. So wurde für Rituximab eine Abhängigkeit des klinischen Erfolges
von den beiden bi-allelischen Varianten des FcγRIIIa [158 Valin (V) / Phenylalanin
(F)] gezeigt (Cartron et al, 2002; Weng und Levy, 2003). Schließlich müssen intakte
Antikörper mit einer großen Menge an endogenen Immunglobulinen im Plasma um
die Bindestellen der Fc-Rezeptoren konkurrieren. Dies kann eine effiziente Rekrutie-
rung der Effektorzellen über Fc-Rezeptoren erschweren. Manche der hier darge-
stelltenNachteile konnten durch die Verwendung rekombinanter bispezifischer Anti-
körper-Derivate überwunden werden.
2.3 Bispezifische Antikörper als Immuntherapeutika
Bispezifische Antikörper kombinieren die Antigen-bindenden Domänen zweier Anti-
körper in einem einzigen Molekül, und können gleichzeitig zwei verschiedene Epito-
pe auf dem gleichen oder auf verschiedenen Antigenen binden (Mueller und
Kontermann, 2007). Bispezifische Antikörper eröffneten für die Immuntherapie neue
Möglichkeiten und wurden mit einer Vielzahl an unterschiedlichen Effektorfunktionen
ausgestattet. So wurden bispezifische Antikörper zur Rekrutierung von Effektorzellen
des Immunsystems, aber auch zur Direktion von Effektormolekülen (u.a. Radionukli-
de, Toxine, Enzyme), Transport-Systemen (Nanopartikel, Liposomen) oder Viren
(Adenovirus, Coronavirus) eingesetzt (pretargeting). Damit finden sie Anwendung in
Bereichen der Immuntherapie, Chemotherapie, Radiotherapie und Gentherapie (Cao
und Suresh, 1998; Muller und Kontermann, 2007).
2.3.1 Bispezifische Antikörper zur Rekrutierung von Effektorzellen
Bispezifische Antikörper, die zur Rekrutierung von Effektorzellen des Immunsystems
eingesetzt werden, kombinieren eine Bindestelle für ein Zielantigen auf den erkrank-
ten Zellen mit einer zweiten Bindestelle für ein aktivierendes trigger Molekül auf den
Einleitung
24
Effektorzellen, die dann die Zielzellen über ADCC oder Phagozytose beseitigen
(Fanger et al, 1991). Mit Hilfe von bispezifischen Antikörpern oder Antikörper-Deriva-
ten konnten teilweise verschiedene Limitierungen monoklonaler Antikörper überwun-
den oder deren Anwendungsbereich erweitert werden. Bispezifische Antikörper bie-
ten die Möglichkeit gezielt und selektiv bestimmte Effektorzellpopulationen zu rekru-
tieren. Im Gegensatz zu monoklonalen Antikörpern, die über ihren Fc-Teil die Effek-
torzellen aktivieren, können bispezifische Antikörper auch nicht Fc-Rezeptor tragen-
de Immunzellen, wie z.B. zytotoxische T-Lymphozyten, rekrutieren, die normalerwei-
se nicht mit monoklonalen IgG Antikörpern aktiviert werden können (Peipp und
Valerius, 2002). Im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern benötigen bispezifische
Antikörper eine niedrigere Expression des Zielantigens und weisen ein höheres zyto-
toxisches Potential auf (Peipp und Valerius, 2002; Weiner et al, 1993). Weiterhin wird
die Wirksamkeit bispezifischer Antikörper nicht von Polymorphismen der Fc-Rezepto-
ren beeinträchtigt. Auch können zur Herstellung bispezifischer Antikörper Bindedo-
mänen gewählt werden, die den Fc-Rezeptor außerhalb der IgG Bindetasche binden.
Dies erlaubt es, einer Kompetition mit endogenen Immunglobulinen zu entgehen, mit
denen monoklonale Antikörper konkurrieren müssen (Guyre et al, 1989).
2.3.2 Klassische Formate bispezifischer Antikörper
Die ersten bispezifischen Antikörper entstanden durch eine Fusion zweier Hybridome
mit der Hybrid-Hybridom-Technologie (Quadroma Antikörper), oder wurden durch
eine chemische Kopplung zweier Antikörper bzw. zweier fragment antigen binding
(Fab) Fragmente hergestellt (Abbildung 4; Glennie et al, 1987; Karpovsky et al, 1984;
Milstein und Cuello, 1983; Schrama et al, 2006; Suresh et al, 1986).
Quadroma Antikörper zeigten eine hohe Zytotoxizität in vitro und im Tiermodell
(Brissinck et al, 1991; Renner et al, 1994; Weiner und Hillstrom, 1991). Auch in er-
sten klinischen Studien wurden therapeutische Effekte bei einzelnen Patienten beo-
bachtet (Canevari et al, 1995; Lamers et al, 1997; Segal et al, 1999). Allerdings er-
wiesen sich die murinen Anteile der bispezifischen Antikörper als immunogen. Dies
führte zu Immunreaktionen und der Bildung von HAMA oder human-anti-bispecific
antibodies (HABA), die eine langfristige Behandlung nicht möglich machten
(Hartmann et al, 1997). Ein weiteres Problem stellte der in den Quadroma Antikör-
Einleitung
25
pern enthaltene Fc-Teil dar. Die Kombination einer Fc-Rezeptor-spezifischen Fv Do-
mäne mit einem Fc-Teil in einem bispezifischen Quadroma-Antikörper führte nach In-
teraktion mit verschiedenen Fc-Rezeptoren zu deren Kreuzvernetzung. Dies resul-
tierte in vivo in einer massiven Zytokinfreisetzung und den damit verbundenen Toxizi-
täten (Link et al, 1998; Weiner et al, 1995; Weiner et al, 1993).
Abbildung 4: Struktur eines monoklonalen IgG Antikörpers und klassische Formate bispezifi-scher Antikörper. Durch die Fusion zweier Hybridome werden Quadroma Antikörper hergestellt. Bispezifische (Fab)2 Fragmente können durch chemische Kopplung erzeugt werden. VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette, CH1-3, konstante Immunglobulin schwere Kette 1-3; CL, konstante Immunglobulin leichte Kette; Fab, fragment antigen binding, Fc, fragment crystallizable. Abgewandelt nach: Muller und Kontermann, 2007.
Durch Einsatz chemisch gekoppelter bispezifischer Fab Fragmente konnten diese
Begleittoxizitäten vermindert werden. Diese Moleküle zeigten viel versprechende Er-
gebnisse in klinischen Studien (Borchmann et al, 2002; Curnow, 1997; James et al,
2001; Posey et al, 1999; Valone et al, 1995). Allerdings war die Herstellung derarti-
ger Moleküle aufwendig und teuer, so dass die limitierte Verfügbarkeit der Therapeu-
tika eine Durchführung ausgeweiteter klinischer Studien verhinderte (Hartmann et al,
1997). Somit konnten die ursprünglich hohen Erwartungen bislang nicht eingehalten
werden und nach wie vor ist noch kein bispezifischer Antikörper zur klinischen An-
wendung zugelassen (Muller und Kontermann, 2007). Um diese Limitierungen der
klassischen Formate zu überwinden wird seit längerem intensiv an der Entwicklung
neuer Formate bispezifischer Antikörper und deren Herstellungsmethoden geforscht,
und bislang wurde eine Vielzahl von verschiedenen Formaten beschrieben.
Einleitung
26
2.3.3 Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate
Im einfachsten Fall bestehen rekombinante bispezifische Antikörper aus den variablen
Domänen (fragment variable, Fv) zweier Antiköper. Sie besitzen nicht den Fc-Anteil gan-
zer Antikörper und haben ein relativ kleines Molekulargewicht von 55-60 kDa. Daher sind
sie weniger immunogen als intakte, monoklonale Antikörper, haben eine verbesserte Ge-
webegängigkeit und zeigen ein erhöhtes Tumorpenetrationspotential. Auch sind sie leich-
ter herzustellen als chemisch gekoppelte bispezifische Antikörper oder Fab-Fragmente
(Peipp und Valerius, 2002). Die gebräuchlichsten Formate sind bispezifische tandem
scFvs (bsscFvs) (Gruber et al, 1994; Hayden et al, 1994; Mack et al, 1995), bispezifische
diabodies (Holliger et al, 1993) und bispezifische single-chain diabodies (Abbildung 5;
Brüsselbach et al., 1999).
Tandem bsscFvs sind einkettige Moleküle, die als Leseköpfe zwei single-chain Fv (scFv)
Komponenten besitzen (Bird et al, 1988; Huston et al, 1988). Diese sind genetisch über
einen kurzen, aus zwischen 15 und 20 Aminosäuren bestehenden, flexiblen Polypeptid-
linker fusioniert (Gruber et al, 1994). Diabodies dagegen sind zweikettige Moleküle. Sie
formieren sich, wenn die Sequenz des linkers, der die variablen Domänen eines scFvs
verbindet, auf eine Länge von 8-10 Aminosäuren reduziert wird (Kortt et al, 1997;
Todorovska et al, 2001). Dies macht eine Paarung zwischen den variablen Domänen in-
nerhalb einer Polypeptidkette unmöglich und führt zur Ausbildung von Homodimeren.
Das Format eines diabodys kann auch zur Herstellung von bispezifischen Antikörper-De-
rivaten genutzt werden, indem die Ketten mit der Zusammenstellung VHA-VLB und VHB-
VLA in einer Zelle ko-exprimiert werden. Dies führt zur Bildung von heterodimeren bispe-
zifischen diabodies (Holliger et al, 1993). Die Expression von zwei Ketten innerhalb einer
Zelle resultiert jedoch auch in einer Bildung nicht funktionaler Homodimere. Eine Möglich-
keit, dieses Problem zu umgehen, bieten single-chain diabodies (Brüsselbach et al,
1999), die eine Zwischenstufe aus bsscFvs und diabodies darstellen. In diesem Format
sind die variablen Domänen in der Anordnung VHA-VLB-VHB-VLA auf einer Polypeptidket-
te kombiniert, die sich zu einem monomeren Molekül einer diabody ähnlichen Struktur
falten. Durch Variationen in der Länge der linker können tetravalente, bispezifische tan-
dem diabodys (tandabs) hergestellt werden, die je zwei Leseköpfe für die beiden Antige-
ne tragen (Kipriyanov et al, 1999).
Die Wirksamkeit dieser kleinen bispezifischen Antikörper-Derivate wurde bislang in Zell-
kultur und in Tiermodellen nachgewiesen (Dreier et al, 2003; Grosse-Hovest et al, 2005;
Einleitung
27
Kipriyanov et al, 2002; Schlereth et al, 2006). Zwei tandem bsscFv für eine Anwendung
zur Therapie des NHL bzw. des malignen Melanoms werden derzeit in klinischen Phase I
und II Studien bewertet, in denen sich erste therapeutische Effekte abzeichnen (Bargou
et al, 2007).
Abbildung 5: Formate rekombinanter bispezifischer scFv Antikörper-Derivate. Tandem bispecific
single-chain fragments variable (bsscFv) bestehen aus zwei scFv Fragmenten die linear in einer Poly-peptidkette fusioniert sind. Bispezifische diabodies (Db) sind Heterodimere aus zwei scFv Fragmenten, die sich überkreuz aneinander lagern, insofern der linker zwischen den variablen Do-mänen eine Länge von 8-10 AS unterschreitet. Single-chain diabodies (scDb) sind einkettige Molekü-le, einer diabody-ähnlichen Struktur. Durch eine Verkürzung des zentralen linkers wird eine in-tramolekulare Paarung unmöglich, und es formieren sich zweikettige, bispezifische, tetravalente tandem diabodies (Tandab). VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette. Abgewandelt nach: Little et al, 2000; Muller und Kontermann, 2007.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind Formate, die
Dimerisierungsdomänen ausnutzen. Diese gewährleisten eine effiziente Paarung
zweier unterschiedlicher Polypeptidketten, die jeweils eine Bindespezifität tragen.
Diese Formate werden unter dem Begriff mini-antibodies zusammengefasst (Abbil-
dung 6). Genutzt werden kann die Interaktion der konstanten Domänen der Immun-
globuline. Diese Strategien haben sich allerdings aufgrund des symmetrischen Auf-
baus der Produkte nicht für die Herstellung bispezifischer Heterodimere bewährt, ob-
wohl die Dimerisierung bispezifischer single-chain diabodies durch deren Fusion mit
der CH3-Domäne oder dem ganzen Fc-Teil beschrieben ist (Alt et al, 1999).
Eine elegante Lösung bot die Einführung von knob-into-hole Mutationen an der
CH3/CH3 Kontaktfläche, wodurch sich der Anteil funktionaler Heterodimere
gegenüber inaktiver Homodimere bei der Produktion bispezifischer IgG Antikörper
erhöhen ließ (Atwell et al, 1997; Carter, 2001a; Ridgway et al, 1996). Die knob-into-
hole Strategie konnte auch genutzt werden, um eine effiziente Heterodimerisierung
rekombinanter scFv-Fc oder scFv-CH3 Fusionsproteine zu gewährleisten (Shahied et
al, 2004; Xie et al, 2005). Darüber hinaus wurden bispezifische minibodies durch die
Einleitung
28
Fusion eines scFv Fragments mit der konstanten leichten Immunglobulin-Domäne
(CL), und der Fusion eines weiteren scFv Fragments mit der konstanten schweren
Kette 1 (CH1) konstruiert. Die Assoziation der beiden unterschiedlichen konstanten
Domänen führte zur Formation bispezifischer Heterodimere (Muller et al, 1998b). In
einem weiteren Ansatz wurden Fab-scFv Fusionsproteine hergestellt (Lu et al, 2002;
Schoonjans et al, 2000; Schoonjans et al, 2001; Willems et al, 2003). Hier wurden
scFvs an das C-terminale Ende entweder der leichten Kette (L) oder des fragment
difficult (Fd) eines Fab Fragments fusioniert, woraus sogenannte bispezifischer
bibodys resultierten. Es war auch möglich, in einem Molekül beide Ketten mit einem
scFv zu erweitern. Dies führte zu trivalenten oder, bei unterschiedlichen Spezifitäten,
zu trispezifischen Molekülen (tribodys). Nach dieser Methode wurden in
eukaryotischer Expressionssystemen effizient Heterodimere hergestellt, die bis zu
über 90% des aufgereinigten rekombinanten Proteins darstellten (Schoonjans et al,
2001).
Bispezifische tetravalente Antikörper-Formate, mit jeweils zwei Leseköpfen für beide
Antigene, können durch Fusion eines scFv Fragments an einen intakten IgG Antikörper
oder an ein F(ab)2-Fragment dargestellt werden (Coloma und Morrison, 1997). Auch
wurden hochmolekulare IgG-ähnliche Fusionsproteine aus den CH3 oder Fc Domänen
mit tandem bsscFvs, diabodies oder single-chain diabodys hergestellt (Alt et al, 1999;
Connelly et al, 1998; Lu et al, 2003; Schneider et al, 2005; Zuo et al, 2000).
Neben den konstanten IgG Domänen finden noch weitere heterologe Peptide oder Pro-
teine als Oligomerisierungsdomänen Verwendung (Pluckthun und Pack, 1997). So wur-
den die kurzen Leucin-zipper der beiden Transkriptionsfaktoren fos und jun verwendet,
die unter Bildung heterodimerer Doppelwendeln (coiled-coils) dimerisieren. Diese Hetero-
dimerisierungshelix, die weiter über Disulfidbrücken stabilisiert werden kann, wurde für
die Darstellung bivalenter und bispezifischer Antikörper ausgenutzt (de Kruif und
Logtenberg, 1996; Kostelny et al, 1992; Pack und Pluckthun, 1992). Analog funktionieren
kurze Helix-Schleife-Helix -Motive, die sich unter Ausbildung von vier Helix-Bündeln anei-
nander lagern und somit eine Anwendung für die Darstellung bispezifischer Antikörper-
Derivate mit zwei oder vier Antigenbindungsstellen finden (Muller et al, 1998a; Pack und
Pluckthun, 1992).
Einleitung
29
Abbildung 6: Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate mit Dimerisierungsdomänen. (A) Knob-into-hole Strategie (B) Fusion der scFv Fragmente mit konstanten CH1/CL Domänen (C) Fusion der scFv Fragmente an IgG oder Fc-Fragmente (D) Fusion der scFv Fragmente an homo-oder heterodimerisierende Peptide. VL/VH, variable Immunglobulin leichte/schwere Kette; CH1-3, Immunglobulin konstante schwere Kette 1-3; CL, Immunglobulin konstante leichte Kette; dhlx, homodimerisierende Helix-Schleife-Helix. Abgewandelt nach: Müller und Kontermann, 2007.
Einleitung
30
2.3.4 Limitierungen rekombinanter bispezifischer Antikörper-Derivate
Kritische Parameter, die den therapeutischen Nutzen bispezifischer Antikörper beein-
trächtigen, sind Stabilität, Größe und Affinität bzw. Avidität. Diese limitieren insbeson-
dere die Wirksamkeit kleiner, aus scFv-Komponenten bestehender Moleküle, wie
tandem bsscFvs, diabodies oder single-chain diabodies. So weisen scFv Fragmente,
diabodies oder tandem bsscFvs häufig eine verminderte thermische Stabilität auf
(Kipriyanov et al, 1999; Willuda et al, 1999). Aufgrund des niedrigen Molekularge-
wichts von ca. 50-60 kDa, welches zwar eine gute Gewebegängigkeit ermöglicht,
aber nur knapp über der Nierenausscheidungsgrenze liegt, kommt es zu einer ra-
schen Ausscheidung. Schließlich besitzen bsscFvs keinen Fc-Teil, weshalb ihnen die
Domäne zur Interaktion mit dem neonatalen Rezeptor FcRn fehlt, der die Rezirkulari-
sation von ganzen IgG Antikörpern ermöglicht (Raghavan et al, 1994). Auch führt die
Konvertierung zum scFv-Format häufig zu einem Affinitätsverlust gegenüber dem pa-
rentalen Antikörper (Huston et al, 1988). Monovalenz für das Tumorantigen, niedrige
Affinität und Stabilität sowie eine schnelle Beseitigung aus dem Blutstrom führen zu
einer kurzen lokalen Tumorretentionszeit und beeinträchtigen nachhaltig den thera-
peutischen Nutzen bispezifischer Moleküle (Kontermann, 2005).
Zur Überwindung dieser Probleme wurden einige Verbesserungen vorgenommen.
So wurde durch in vitro Mutagenese eine intramolekulare Disulfidbrücke zwischen
der VH- und der VL-Kette eines scFvs eingeführt (Disulfidstabilisierung; Reiter et al,
1994). Die zusätzliche Disulfidbrücke verhinderte die Auffaltung und Denaturierung
der scFvs und führte zu einer signifikanten Stabilitätssteigerung. Dies wurde auch zur
Stabilisierung eines tandem bsscFv erfolgreich angewandt (Bruenke et al, 2005). Die
Größe kleinerer, Antikörper-abgeleiteter Proteine wurde durch PEGylierung, oder
dem Anfügen weiterer Proteindomänen erhöht (Lee et al, 1999; Muller et al, 2007).
Diese Modifikationen führten zu einer verlängerten Plasmaverweildauer in vivo. Eine
weitere Verbesserung wurde durch in vitro Affinitätsreifung der einzelnen scFv Lese-
köpfe eines bispezifischen Antikörper-Derivates erzielt (Marks et al, 1992; Schier et
al, 1996). Ein Gewinn an Affinität für das Tumorantigen erhöhte das zytotoxische Po-
tential von ganzen monoklonalen Antikörpern und bispezifischen Antikörper-Deriva-
ten in vitro und begünstigte eine Tumor-spezifische Anreicherung in vivo (Adams et
al, 1998a; McCall et al, 2001; Tang et al, 2007). Schließlich wurde eine wichtige Ver-
besserung durch die Entwicklung von Formaten erzielt, die eine Kombination von
Einleitung
31
drei oder mehreren Antigenbindestellen in einem Molekül erlauben (Kipriyanov et al,
1999; Shahied et al, 2004). So verbesserte die Erweiterung eines bispezifischen
miniantibodys um einen zweiten Lesekopf gegen das Tumorzellantigen das
zytotoxische Potential dieses Moleküls.
2.4 Zielstrukturen auf Effektorzellen
Um eine zelluläre Zytotoxizität zu vermitteln, müssen bispezifische Antikörper durch
Bindung an Zelloberflächenstrukturen die Immuneffektorzellen zu den erkrankten Ge-
weben rekrutieren und aktivieren. Durch eine Bindung an Zelloberflächenantigene er-
folgt eine Stimulierung der Effektorzellen, die schließlich lytische Prozesse auslöst.
Als Effektorzellen kommen in erster Linie zytotoxische T-Zellen, NK-Zellen, Monozy-
ten und Makrophagen aber auch Granulozyten in Frage (Tabelle 6). Dabei wird die
Effektorzellpopulation durch die Auswahl des Effektormoleküls festgelegt.
2.4.1 Auswahl der Effektorzellpopulation durch Wahl der Zielstruktur
Zytotoxische T-Zellen gelten als die Zellen mit dem höchsten zytotoxischen Potential
des Immunsystems, können aber mit konventionellen Antikörpern nicht aktiviert wer-
den, da sie keine Fc-Rezeptoren tragen (Muller und Kontermann, 2007). Die meisten
bispezifischen Antikörper, die zur Rekrutierung zytotoxischer T-Zellen entwickelt wur-
den, sind gegen CD3 gerichtet (Tabelle 6). Jedoch wurden inzwischen auch andere
Antigene, wie CD2 oder CD28 als trigger-Moleküle erfolgreich erprobt. Zur effizienten
Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen sind in der Regel zusätzliche Signale nötig, al-
lerdings lösen die Bindungsdomänen mancher Antikörper gegen CD3 oder CD28
auch ohne Co-Stimulation eine potente Aktivierung aus (Cochlovius et al, 2000a;
Cochlovius et al, 2000b; Daniel et al, 1998; Kipriyanov et al, 2002; Loffler et al, 2000;
Tacke et al, 1997). Eine unkontrollierte Stimulation von CD3 oder CD28 kann aller-
dings durch Auslösen eines Zytokinsturms zu massiven Nebenwirkungen führen
(Suntharalingam et al, 2006). Deshalb müssen der die Bindedomäne liefernde, für
das trigger Molekül spezifische parentale Antikörper und das bispezifische Format
sorgsam ausgewählt werden.
Einleitung
32
Tabelle 6: Effektorzellen des Immunsystems, trigger-Moleküle und aktivierende Zytokine
Effektorzellen Zellzahl/µl* trigger-Molekül Aktivierende Zytokine
T-Zellen 600-2000 CD2, CD3, CD28 IL-2
NK-Zellen 120-350 CD16 IL-2
Monozyten/Makrophagen 80-320 CD64 GM-CSF IFN-γ
PMN 2000-7000 CD64# CD89
G-CSF GM-CSF
IFN-γ
* Konzentration im peripheren Blut gesunder Spender; PMN, polymorphkernige Granulozyten; # nach Stimulation. Abgewandelt nach: Peipp und Valerius, 2002.
NK-Zellen, Monozyten/Makrophagen und Granulozyten können effizient über Fc-Re-
zeptoren rekrutiert werden (Tabelle 6). Die aktivierenden Fc-Rezeptoren für IgG
FcγRI (CD64) und FcγRIII (CD16) wurden intensiv als Effektormoleküle auf NK-Zellen
und Monozyten/Makrophagen erforscht. In zahlreichen Kombinationen mit unter-
schiedlichen Tumorzellantigenen konnte ihr hohes Potential als trigger Moleküle un-
ter Beweis gestellt werden (Curnow, 1997; Deo et al, 1997; Renner et al, 1994). Auf-
grund ihrer Häufigkeit im peripheren Blut stellen polymorphkernige Granulozyten (po-
lymorphonuclear, PMN) eine äußerst attraktive Effektorzellpopulation dar. Eine
aktivierende Zielstruktur für bispezifische Antikörper auf diesen Zellen ist der Fc-
Rezeptor für IgA (CD89) (Valerius et al, 1997).
2.4.2 Der Fcγγγγ-Rezeptor III (CD16) auf NK-Zellen und Makrophagen
CD16 ist der niedrig affine Rezeptor für IgG (FcγRIII) und besitzt ein Molekularge-
wicht von 50-80 kDa (Ravetch und Perussia, 1989). CD16 existiert in zwei Isoformen,
als Transmembranprotein (FcγRIIIa) und als Glykosyl-Phosphatidylinositol (GPI)-ver-
ankertes Protein (FcγRIIIb) (Selvaraj et al, 1989; Simmons und Seed, 1988). Beide
Isoformen unterscheiden sich in ihrer Sequenz der extrazellulären Region, die aus
zwei Immunglobulin-ähnlichen Domänen besteht, in nur sechs Aminosäuren
(Ravetch und Perussia, 1989). Die signalisierende Transmembranform (CD16a) wird
konstitutiv auf der Oberfläche von NK-Zellen und Makrophagen exprimiert, und ist in-
trazellulär nicht-kovalent mit der FcεRI γ-Kette oder der TCRζ-Kette assoziiert (Hibbs
Einleitung
33
et al, 1 989; Lanier et al, 1989), die ein Immun-Rezeptor-Tyrosin-Aktivierungs-Motiv
(ITAM) tragen (Deo et al, 1997). Diese Interaktion ist notwendig zum Zelloberflächen-
transport, zur Aktivierung und zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität oder der
Phagozytose. Nach einer Aktivierung über CD16 setzen die NK-Zellen zytoplasma-
tisch gespeicherte lytische Granula frei, was schließlich zur Lyse der Tumorzellen
führt (Daeron, 1997). Die GPI-verankerte Isoform (CD16b) wird auf neutrophilen Gra-
nulozyten exprimiert. Diese bindet zwar den Liganden, ist aber nicht in der Lage ein
Signal weiterzuleiten oder funktionale Effekte wie Zytotoxizität zu vermitteln, da auf-
grund des Fehlens der Transmembran- und der intrazellulären Domäne eine Interak-
tion mit den signalisierenden Ketten nicht stattfinden kann. Zudem wird durch proteo-
lytische Abspaltung von der Oberfläche von Neutrophilen CD16 in starkem Maße als
lösliches Protein ins Blut abgegeben (Koene et al, 1996). Die Funktion der GPI-ver-
ankerten Isoform und des löslichen CD16 ist noch unklar.
CD16 hat sich bislang als geeignetes Effektormolekül zur Aktivierung von NK Zellen
mit bispezifischen Antikörpern erwiesen. Chemisch gekoppelte bispezifische Antikör-
per lieferten in in vitro Studien und in Tiermodellen viel versprechende Ergebnisse
und induzierten eine effiziente NK Zell-vermittelte Lyse der malignen Zellen (Garcia
de Palazzo et al, 1992; Hombach et al, 1993; Kipriyanov et al, 2002). Die bisher mit
CD16-gerichteten bispezifischen Antikörpern durchgeführten klinischen Studien wa-
ren jedoch mit den bereits beschriebenen Format-assoziierten Problemen, wie Immu-
nogenität und Verfügbarkeit des Agens, behaftet, so dass eine intensive klinische Er-
probung nicht durchgeführt wurde (Hartmann et al, 1997; Weiner et al, 1995). Re-
kombinante CD16-gerichtete bispezifische Antikörper-Derivate zeigten bislang in
Tiermodellen ihr zytotoxisches Potential, eine Evaluierung ihres therapeutischen Ef-
fekts in klinischen Phasen steht jedoch noch aus (Muller und Kontermann, 2007).
2.5 Zielstrukturen auf Tumorzellen für eine Antikörper-basierte
Therapie
2.5.1 Allgemeine Anforderungen für Zielantigene auf Tumorzellen
Antikörper-basierte Strategien zur Behandlung maligner Erkrankungen bieten gegen-
über einer herkömmlichen Chemotherapie den Vorteil, dass sie durch eine geeignete
Einleitung
34
Auswahl des Tumorantigens zielgerichtet gegen die malignen Zellen erfolgen kann
(Allen, 2002). Dabei müssen die Eigenschaften des Antigens mit dem Format des
Antikörpers und der verfolgten Strategie abgestimmt werden. So ist z.B. für eine
erfolgversprechende Anwendung von Immuntoxinen eine stark internalisierende Ziel-
struktur notwendig. Diese Eigenschaft ist jedoch von Nachteil, falls über den Antikör-
per Effektorfunktionen vermittelt werden sollen.
Nach Möglichkeit sollte das Zielantigen auf allen malignen Zellen der Tumormasse
vorhanden sein, wobei eine Expression auf mindestens 20-30% als Voraussetzung
für eine erfolgversprechende Therapie gilt (Hoelzer et al, 2002). Von Vorteil ist auch
eine Expression auf den Tumor-Stammzellen oder intermediären Tumorvorläufer-
Zellen, die sich im Expressionsprofil von der Masse der Tumorzellen abheben kann
(Hosen et al, 2007; Taussig et al, 2005). Dagegen sollte das Zielantigen nicht auf an-
deren Geweben präsent sein, da dies zu Nebenwirkungen führen kann. Um eine Re-
konstitution nach der Behandlung zu gewährleisten, sollte das Antigen nicht auf
Stammzellen exprimiert werden. Weiterhin sollte das Antigen nicht als lösliche Form
z.B. durch proteolytische Abspaltung (shedding) ins Blut abgegeben werden, da dies
zu einer Neutralisation der Antikörper führen und die therapeutische Wirkung beein-
flussen könnte.
2.5.2 Zielstrukturen auf B-lymphoiden Neoplasien
Der Einsatz der monoklonalen Antikörper Rituximab und Alemtuzumab in der Thera-
pie des NHL oder der B-CLL zeigt das große Potential Antikörper-basierter Strate-
gien in der Behandlung hämatologischer Neoplasien auf. Dennoch stoßen diese The-
rapeutika in manchen Fällen an ihre Grenzen, und Rezidive bleiben ein großes Pro-
blem. So sprechen nur etwa die Hälfte der Patienten auf eine Therapie mit Rituximab
an, und auch nach einem initialen Ansprechen können erworbene Resistenzmecha-
nismen oder der Verlust der CD20 Expression auf den malignen Zellen eine weitere
erfolgreiche Behandlung mit Rituximab verhindern (Kennedy et al, 2002b). Darüber
hinaus sind pro-B ALL Blasten in der Regel negativ für CD20, folglich kann Rituximab
für diese Patientengruppe nicht angewendet werden (Abbildung 7). Aufgrund einer
weitverbreiteten Expression des Antigens CD52 auf Zellen des hämatopoietischen
Systems (T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, Eosinophilen, NK-Zellen und dendriti-
Einleitung
35
schen Zellen) führt eine Behandlung mit Alemtuzumab häufig zu einer Zytopenie und
schädigt das Immunsystem der Patienten mit den damit verbundenen Komplikatio-
nen (Alinari et al, 2007). Nach gegenwärtiger Meinung könnten auch Patienten, die
für eine Behandlung mit CD20 oder CD52 Antikörpern nicht in Frage kommen eben-
falls von Antikörper-basierten Therapeutika profitieren. Daher werden nach wie vor
neuartige therapeutische Konzepte benötigt (Hoelzer et al, 2002; Kennedy et al,
2002b). Deren Entwicklung schließt sowohl die Erprobung neuer Antikörper-Formate,
als auch die Evaluierung anderer Zelloberflächenmoleküle mit ein (Abbildung 7).
Auf malignen B-Zellen weisen mehrere Zelloberflächenantigene gute Vorausset-
zungen für die Antikörper-basierte Therapie auf, wie beispielsweise CD19, CD20,
CD22, CD25, CD37, CD40, CD74, IgM Idiotyp (Id) oder HLA Klasse II (Rothe und
Schmitz, 1996). Unterschiedliche Antikörper-basierte Strategien gegen diese Antige-
ne wurden in präklinischen und klinischen Studien auf Wirksamkeit erprobt. Nicht al-
le Antigene sind jedoch als Zielantigene zur Vermittlung der ADCC geeignet (Tutt et
al, 1998; Wurflein et al, 1998), und im frühen Entwicklungsstadium der pro-B Zelle
und der malignen Blasten einer pro-B ALL sind nur wenige potentielle Zielantigene
exprimiert (Abbildung 7). Von diesen weist CD19 besonders attraktive Eigenschaften
auf.
Abbildung 7: Stadienspezifische Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Ent-wicklung. In Abhängigkeit des Differenzierungsstadiums werden verschiedene Antigene exprimiert, die sich als Zielstrukturen für die Antikörper-basierte Immuntherapie eignen. cIg = zytoplasmatisch ex-primiertes Immunglobulin; sIg = membranständiges Immunglobulin. Abgewandelt nach: Rothe und Schmitz, 1996.
Einleitung
36
2.5.3 CD19 als Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Neoplasien
Das Zelloberflächenantigen CD19 ist aufgrund seines Expressionsprofils und seiner
Eigenschaften eine gute Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Erkrankungen
(Rothe und Schmitz, 1996). CD19 ist ein glykosyliertes Typ I Transmembranprotein
mit einem Molekulargewicht von 95 kDa und gehört zur Immunglobulin-Superfamilie
(Tedder und Isaacs, 1989). CD19 ist ein wichtiges regulatorisches Protein und spielt
eine Rolle bei der Aktivierung, Proliferation und Differenzierung B-lymphoider Zellen.
Das Protein ist gekennzeichnet durch zwei Immunglobulin-ähnliche Domänen im
extrazellulären Teil, sowie durch eine zytoplasmatische Domäne, die neun hoch
konservierte Tyrosinreste enthält. Diese können phosphoryliert werden und sind an
der Signalübertragung beteiligt (Tedder und Isaacs, 1989). Auf reifen B-Zellen bildet
CD19 zusammen mit den membranständigen Proteinen CD21 (CR2), CD81(TAPA-1)
und Leu13 den B-Zell-Corezeptor-Komplex (Bradbury et al, 1992; Carter et al, 2002;
Fearon und Carter, 1995; Matsumoto et al, 1993). Nach Kreuzvernetzung des B-
Zellrezeptors (B cell receptor, BCR) wird CD19 phosphoryliert und überträgt so
Transmembransignale ins Zellinnere.
Im Gegensatz zu HLA II oder auch CD52, wird CD19 vermutlich ausschließlich auf
Zellen der B-Zellreihe exprimiert. Einzige mögliche Ausnahme bilden follikuläre den-
dritische Zellen, allerdings ist die Expression von CD19 auf diesen Zellen noch um-
stritten (Scheuermann und Racila, 1995). Im Verlauf der B-Zell-Entwicklung wird
CD19 auf fast allen Reifungsstadien exprimiert, von den frühen pro-B Vorläuferzellen
bis zu den reifen B-Zellen, wird aber ab dem Stadium der reifen Plasmazelle herun-
terreguliert (Nadler et al, 1983; Stamenkovic und Seed, 1988). Darüber hinaus wird
CD19 nicht auf gesunden hämatopoietischen Stammzellen exprimiert, unterliegt kei-
ner proteolytischen Abspaltung (shedding, (Press et al, 1989) und geht nicht, wie in
manchen Fällen für CD20 beschrieben, im Verlauf einer Antikörpertherapie verloren
(Davis et al, 1999).
CD19 wird auf der Mehrzahl der B-lymphoiden Neoplasien exprimiert, und ist auf
94% aller reifzelligen B-ALL und auf 95% der Vorläufer B-ALL vorhanden (Gokbuget
und Hoelzer, 2002). Mit eingeschlossen sind auch die CD22- oder CD20-negativen
pro-B ALL, die nicht mit Rituximab behandelt werden können. Auch die Mehrzahl der
Subtypen der B-NHL exprimieren, wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß CD19.
So ist CD19 in der Regel auf den Tumorzellen der B-CLL, des lymphoplasmozy-
Einleitung
37
tischen Lymphoms, der Prolymphozytenleukämie, der Haarzellleukämie, des folliku-
lären Lymphoms, des Mantelzelllymphoms, des Burkitt-Lymphoms und des diffusen
großzelligen B-Zelllymphoms nachzuweisen (Kimura et al, 2007b; Rothe und
Schmitz, 1996). Nicht exprimiert wird CD19 in der Regel auf den entarteten Zellen
des Plasmozytoms und der Hodgkin-Lymphome (Masir et al, 2006). Ob CD19 auch
auf leukämischen Stammzellen (leukemic stem cells, LSCs) exprimiert wird, wird
derzeit noch kontrovers diskutiert (Castor et al, 2005; Cox et al, 2004; Hotfilder et al,
2005). Für einige Fälle der pre-B ALL mit den Translokationen t(9;22) oder t(12;22)
wurde die Expression von CD19 auf LSCs berichtet (Castor et al, 2005).
Bislang wurden verschiedene CD19-gerichtete Antikörper oder Antikörper-Derivate
entwickelt und ihre Wirksamkeit in der Zellkultur, im Mausmodell oder in klinischen
Studien untersucht. Klinische Studien mit monoklonalen Antikörpern, die sich für das
Zielantigen CD20 und CD20-positive Lymphome bewährt hatten, blieben jedoch bis-
lang erfolglos (Hekman et al, 1991; Vlasveld et al, 1995). Um CD19 dennoch als Ziel-
antigen nutzen zu können wurden unterschiedliche Strategien erprobt. Diese beinhal-
ten chimäre CD19 Antikörper, die nach glycoengineering des Fc-Teils verbesserte
Effektorfunktionen in vitro aufwiesen und im Mausmodell erste vielversprechende Er-
gebnisse zeigten (Barbin et al, 2006; Lang et al, 2004; Stieglmaier, 2007). Darüber
hinaus wurden Immuntoxine und Immunzytokine hergestellt und in Zellkultur und im
Mausmodell erfolgreich erprobt (Herrera et al, 2006; Schwemmlein et al, 2007;
Stieglmaier et al, 2007). Verschiedene bispezifische Antikörper zur Rekrutierung zy-
totoxischer T-Zellen, Monozyten/Makrophagen oder NK-Zellen wurden in klassi-
schen, oder in rekombinanten Formaten eines diabodys, tandem bsscFvs, oder tan-
dem diabodys hergestellt und zeigten in präklinischen, und klinischen Studien viel-
versprechende Erfolge (Bruenke et al, 2005; Dreier et al, 2003; Ely et al, 1996;
Kipriyanov et al, 2002; Kipriyanov et al, 1999; Schlereth et al, 2006). Am weitesten
entwickelt ist ein tandem bsscFv gegen CD19 und CD3 (MT103/MEDI-538), der der-
zeit in einer Phase II klinischen Studie mit B-Zell NHL Patienten getestet wird
(Bargou et al, 2007). Dennoch ist nach wie vor kein CD19-spezifisches Antikörper-
basiertes Therapeutikum von der FDA zugelassen.
Problemstellung
38
3 Problemstellung
Das zentrale Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuer rekombinanter bispezifi-
scher Antikörper-Derivate zur Therapie B-lymphoider Neoplasien. Die bispezifischen
Antikörper-Derivate sollten das Tumorantigen CD19 bivalent und das trigger Molekül
CD16 monovalent binden. Arbeitshypothese war, dass im Vergleich zu monovalenter
Bindung das bivalente Anvisieren (bivalent targeting) der Tumorzellen zu einer
höheren NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität führen sollte. Folgende spezifische Ziele
wurden in dieser Arbeit verfolgt:
1. Entwicklung und Charakterisierung zweikettiger Fab-scFv Fusionsproteine
Zur Überprüfung der Hypothese sollte ein bispezifischer tribody durch genetische Fu-
sion eines chimären CD19 Fab Fragments mit einem CD19- und einem CD16- ge-
richteten scFv hergestellt werden. Als Vergleichsmolekül sollte ein bispezifischer,
CD19 monovalenter bibody dienen, der aus den identischen Bindedomänen konstru-
iert werden sollte. Beide rekombinante Proteine sollten exprimiert, affinitätschromato-
graphisch aufgereinigt und funktionell in vitro erprobt werden. Insbesondere sollten
kritische Parameter wie Bindungsstärke und Stabilität untersucht werden. Schließlich
sollte in vergleichenden Studien die Zytotoxizität der Moleküle bestimmt und das
Konzept des bivalenten Anvisierens der Tumorzellen bewertet werden.
2. Entwicklung und Charakterisierung eines single-chain Fv triple-bodys
Basierend auf den Ergebnissen des ersten Teilprojekts sollte ein neues, einkettiges
Format für bispezifische Antikörper entwickelt werden. Zwei CD19-gerichtete scFv
Fragmente sollten mit einem CD16 scFv in linearer Anordnung genetisch zu einem
scFv triple-body verknüpft und Expressions- und Reinigungsstrategien für dieses
Protein entworfen werden. In funktionellen Tests sollte die Arbeitshypothese durch
einen Vergleich in vitro mit dem kürzlich in der Arbeitsgruppe entwickelten CD19 mo-
novalenten tandem bsscFv ds[19x16] erfolgen. Die Parameter funktionale Affinität,
Stabilität und Zytotoxizität gegenüber Tumorzelllinien und primären Zellen von Leu-
kämie- und Lymphompatienten sollten bewertet werden. Schließlich sollte untersucht
werden, ob die Erhöhung des Molekulargewichts die Plasmaverweildauer in vivo ver-
besserte.
Ergebnisse
39
4 Ergebnisse
4.1 Herstellung und Charakterisierung rekombinanter bispezifi-
scher Fab-scFv Fusionsproteine gegen CD19 und CD16
Die Fusion eines oder zweier scFv Fragmente an die C-terminalen Enden der kon-
stanten Regionen eines Fab Fragments erlaubt es, rekombinante bispezifische Mole-
küle mit zwei (bibody) oder drei Leseköpfen (tribody) herzustellen (Schoonjans et al,
2001). Um ein bivalentes Anvisieren der Tumorzellen zu ermöglichen wurden im
Rahmen vorliegender Arbeit der bispezifische tribody (bstb) [Fab19xds19xds16] mit
bivalenter Bindung für CD19 und monovalenter Bindung für CD16 hergestellt. Als
Vergleichsmolekül wurde unter Verwendung identischer Bindedomänen, der CD19
monovalente bispezifische bibody (bsbb) [Fab19xds16] konstruiert. Untersucht wer-
den sollte, ob durch das bivalente Anvisieren der Tumorzellen ein Gewinn an Zytoto-
xizität CD19- und CD16-gerichteter bispezifischer Antikörper-Derivate zu erzielen war
(Abbildung 8).
4.1.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für den bstb [Fab19xds19xds16]
und den bsbb [Fab19xds16]
Zur Konstruktion lagen zu Beginn der Arbeit die kodierenden Sequenzen des chimä-
ren CD19-spezifischen Antikörpers 4G7chim und der disulfidstabilisierten (ds) Vari-
anten der scFvs gegen CD19 und CD16 vor (Barbin et al, 2006; Bruenke et al, 2005).
Die variablen Immunglobulinketten waren aus den Hybridomen 4G7 (anti-CD19)
bzw. 3G8 (anti-CD16) subkloniert worden. In den Sequenzen dieser ds scFv Frag-
mente waren durch gezielte DNA-Mutagenese in den variablen Regionen einzelne
Codons in Cystein-kodierende Tripletts umgewandelt worden. Diese eingefügten
Cystein-Reste ermöglichen die Ausbildung einer intramolekularen, stabilisierenden
Disulfidbrücke. Die genetische Fusion der copy DNA (cDNA) Sequenzen erfolgte im
bicistronischen Expressionsvektor pBud/CE4.1. Dieser erlaubt die Co-Expression
zweier Polypeptidketten, die jeweils unter Kontrolle eines starken eukaryotischen
Promotors stehen (immediate-early cytomegalovirus (CMV) Promotor bzw. Elonga-
tionsfaktor 1α (EF1α) Promotor, Abbildung 8).
Ergebnisse
40
Abbildung 8: Konstruktion der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16]. A: Blockstrukturen des bsbb [Fab19xds16] und des bstb [Fab19xds19xds16]. In beiden Molekülen ist das Fab Fragment spezifisch für CD19. Die scFvs sind an die C-terminalen Enden der humanen konstanten IgG κ leichten oder schweren Kette 1 fusioniert. Durch Wechselwirkung zwischen der L-Kette und dem Fd-Fragment und der Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke formieren sich heterodimere bispezifische Antikörper-Derivate. B: Konstruktion der Expressionsvektoren. CD19L, leichte Kette des chimären CD19 Antikörpers 4G7; CD19 Fd, fragment difficult des chimären CD19 Antikörpers 4G7; scFv, single-chain fragment va-
riable; CMV, Cytomegalovirus immediate early Promotor; E1α: Promotor des EF1α Gens; Igκ, Kodier-
sequenz für den Sekretionsleader der humanen Immunglobulin κ leichten Kette; IgH, Kodiersequenz für den Sekretionsleader der humanen Immunglobulin schweren Kette; VL, VH, cDNA Sequenzen für die variablen Regionen der leichten bzw. schweren Kette der Antikörper gegen CD19 (hellgrau) bzw. CD16 (schwarz); CL, konstante humane Immunglobulin κ leichte Kette; CH1, Region 1 der konstanten humanen γ1 schweren Kette; L1, L2, L3, linker; S, H; cDNA Sequenzen für einen Strep- und einen He-xahistidin-tag; S-S, stabilisierende Disulfidbrücke.
Die Herstellung der Expressionsvektoren verlief in sequentiellen Klonierungsschritten
(siehe Material und Methoden). Die kodierenden Sequenzen wurden durch Polyme-
rase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) unter Einführung der Restrik-
Ergebnisse
41
tionsschnittstellen und gegebenenfalls kodierender linker-Sequenzen aus den Vekto-
ren pBud/4G7chim und pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 amplifiziert
(Daten nicht gezeigt). Die cDNA Sequenzen des humanen Ig κ leaders und der
CD19 Fab L- Kette des Antikörpers 4G7chim wurden in die stromabwärts des CMV
Promotors gelegene multiple Klonierstelle (multiple cloning site, MCS) des Vektors
pBud/CE4.1 ligiert. Anschließend wurde die cDNA des ds scFvs 3G8 über eine kurze
linker Sequenz, die für die Aminosäuren (AS) DVPGGS kodierte, fusioniert (Abbil-
dung 8). Der resultierende Expressionsvektor pBud/CD19L-ds16 kodierte für das L-
scFv Fragment des bsbb [Fab19xds16] und des bstb [Fab19xds19xds16].
Die cDNA des Sekretions-leaders der humanen IgG schweren Kette sowie die cDNA
der VH Kette und der humanen IgG1 CH1 Region einschließlich der ersten fünf AS
der oberen Gelenkregion (EPKSC) des Antikörpers 4G7chim wurden in die MCS
stromabwärts des EF1α Promotors des Vektors pBud/CE4.1 ligiert. Hieraus resultier-
te der Expressionsvektors pBud/19Fd-Stop. Dieser kodierte für das Fd Fragment des
bibodys. Anschließend wurde die cDNA des ds scFv CD19 an das C-terminale Ende
des Fd Fragments über Sequenzen der oberen Gelenkregion und eines flexiblen lin-
kers (EPKSCSGPGGGRS(G4S)2) fusioniert. Dabei entstand der Expressionsvektor
pBud/19Fd-ds19, der für das Fd-scFv Fragment des tribodys kodierte. Durch Um-
setzen der kodierenden Sequenzen des L-scFv Fragments in die Vektoren
pBud/19Fd-ds19 und pBud/19Fd-Stop wurden schließlich die bicistronischen Vek-
toren pBud/Fab19-ds19-ds16 und pBud/Fab19-ds16 erhalten, die nun für beide Ket-
tenuntereinheiten der Moleküle kodierten (Abbildung 8).
Die Sekretion des L-scFv Kette erfolgte über den Sekretions-leader der humanen
IgG κ leichten Kette, die der Fragmente Fd und Fd-scFv über den Sekretions-leader
der humanen IgG schweren Kette. Die freien Cysteine in der oberen Gelenkregion
des Fd- bzw. des Fd-scFv Fragments und in der L-scFv Kette sollten die Ausbildung
einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den beiden Ketten des tribodys und
des bibodys ermöglichen. Die verwendeten Restriktionsschnittstellen wurden so aus-
gewählt, dass sie in der Regel nicht in cDNA Sequenzen muriner variabler Ketten
schneiden. Somit können in diesen Vektoren die cDNA Sequenzen der variablen Do-
mänen des Fab Fragments sowie die der scFvs unabhängig voneinander gegen an-
dere Spezifitäten ausgetauscht werden.
Ergebnisse
42
4.1.2 Expression und Aufreinigung des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16]
Um die Herstellung und Aufreinigung zu erleichtern, wurden stabil transfizierte Pro-
duktionslinien für die Expression des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] hergestellt. Hierzu wurden 293T Zellen mit dem jeweiligen, zuvor line-
arisierten Expressionsvektor transfiziert und unter Selektionsdruck vereinzelt. Der
Zellkulturüberstand wurde durchflusszytometrisch auf Bindung an Antigen-positive
Zellen getestet, wodurch stark exprimierende Einzelklone identifiziert wurden (Daten
nicht gezeigt). Zur Produktion wurden diese in einem kleinen Bioreaktor in Hochdich-
tekultur gehalten. Der Zellkulturüberstand wurde geerntet, und die rekombinanten
Proteine über Ni-Chelat Affinitätschromatographie aus 50-70 ml aufgereinigt. Nach
Hochrechnung lagen die Ausbeuten für beide Moleküle routinemäßig bei zwischen 1
bis 3 mg/l Zellkulturüberstand. Im Vergleich betrugen die Ausbeuten nach transienter
Expression etwa 100 bis 400 µg/l (Daten nicht gezeigt).
Die angereicherten Antikörper-Derivate wurden im Coomassie-gefärbten sodium do-
decylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) Gel analysiert (Abbil-
dung 9). Unter reduzierenden Bedingungen wurden die Polypeptidketten L-scFv, Fd
und Fd-scFv im Gel identifiziert, wobei der spezifische Nachweis dieser
Polypeptidketten mit einem anti-Pentahistidin (Nachweis der Fd bzw. Fd-scFv Frag-
mente; Abbildung 9) und einem anti-humane IgG κ Kette Antikörper (Nachweis des
L-scFv Fragments) im Western Transfer-Experiment erfolgte. Die Mobilitäten der
Fragmente Fd-scFv und L-scFv im Gel entsprachen einer Größe von ca. 50 kDa. Das
Fd Fragment zeigte ein Laufverhalten von etwa 25 kDa. Diese Werte stimmten gut
mit den aus den Sequenzen vorhergesagten Werten von 54 kDa für die Fragmente
Fd-scFv und L-scFv bzw. von 23 kDa für das Fd Fragment überein.
Zum Nachweis der stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen der leichten und der
schweren Kettenuntereinheit wurden die angereicherten Proteine auf ein nicht-redu-
zierendes SDS-PAGE Gel auftragen. Im Western-Transfer Experiment wies der
tribody eine Mobilität entsprechend einer molekularen Masse von etwa 100 kDa, der
bibody eine Mobilität von etwa 80 kDa auf. Die ermittelten Größen standen im
Einklang mit den errechneten molekularen Massen von 108 kDa für den bstb
[Fab19xds19xds16] bzw. 77 kDa für den bsbb [Fab19xds16]. Daraus wurde ge-
schlossen, dass sich die Polypeptidketten zu Dimeren assoziierten, die über eine Di-
Ergebnisse
43
sulfidbrücke kovalent verknüpft waren. Weiterhin bestand die Proteinpräparation des
bibodys hauptsächlich aus L-scFv:Fd Heterodimeren. Funktionslose L-scFv:L-scFv
oder Fd:Fd Homodimere, die eine Größe von 108 bzw. 46 kDa aufgewiesen hätten,
wurden nicht beobachtet. Aufgrund der annähernd gleichen Größen der Fragmente
Fd-scFv und L-scFv konnte für die tribody Präparation keine Aussage getroffen wer-
den, ob eine korrekte Paarung zu L-scFv:Fd-scFv Heterodimeren stattgefunden hat-
te.
Abbildung 9. Spezifischer Nachweis der Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] nach Aufreinigung. Die rekombinanten dimeren Proteine wurden in 293 T Zel-len in Hoch-Dichtekultur exprimiert und aus dem Überstand über Ni-NTA Affinitätschromatographie gereinigt. (A) Nachweis der Polypeptidketten im nicht-reduzierenden SDS PAGE-Gel nach Coomas-sie-Färbung oder im Western-Transfer Experiment mit einem anti-Pentahistidin (anti his) oder einem anti-humane IgG κ leichte Kette Antikörper (anti Igκ). (B) Nachweis der Ausbildung disulfidstabilisierter Dimere im Western-Transfer Experiment nach nicht-reduzierender SDS PAGE. L, leichte Kette des Antikörpers 4G7chim; Fd, fragment difficult des Antikörpers 4G7chim; scFv, single-chain fragment va-
riable.
4.1.3 Analyse der Bindungseigenschaften des bstb [Fab19xds19xds16] und
des bsbb [Fab19xds16]
Im Anschluss an die Aufreinigung der Proteine, wurden die Bindungseigenschaften
des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] in durchflusszytometri-
schen Analysen untersucht (Abbildung 10). Beide Moleküle reagierten sowohl mit
CD19-positiven SEM, als auch mit CD16-transfizierten CHO Zellen (CHO 16-10).
Eine Bindung an CD19- und CD16-negative, T-ALL abgeleitete CEM Zellen und an
untransfizierte CHO Zellen wurde nicht beobachtet. Somit banden die beiden
rekombinanten Fab-scFv Fusionen spezifisch an CD19- und CD16-positive Zellen.
Ergebnisse
44
Abbildung 10: Spezifische Bindung der Fab-scFv Fusionsproteine. Durchflusszytometrische Ana-lysen der Bindung des bstb [Fab19xds19xds16] (A) und des bsbb [Fab19xds16] (B) an CD19-positive SEM (a), CD19- und CD16-negative CEM (b), CD16-transfizierte CHO (c) und untransfizierte CHO Zellen (d). Schwarze Peaks repräsentieren das Signal der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine, weiße Peaks das Signal eines Kontrollproteins.
Für bispezifische Antikörper-Derivate ist es essentiell, dass sowohl das Tumorzellan-
tigen als auch das Effektorzellantigen simultan binden zu können, um eine effiziente
Rekrutierung der Effektorzellen zu den Tumorzellen zu erzielen. Um die Möglichkeit
formal auszuschließen, dass die Protein Präparation hauptsächlich aus zwei unter-
schiedlichen Subpopulationen des Proteins bestand, die jeweils in der Lage waren,
nur eines der beiden Antigene, nicht aber beide gleichzeitig zu binden, wurde die si-
multane Bindefähigkeit der Fab-scFv Fusionen untersucht. Hierzu wurden CD19-po-
sitive SEM Zellen mit dem bstb [Fab19xds19ds16] oder dem bsbb [Fab19xds16] in-
kubiert und anschließend mit dem Fusionsprotein CD16exGFP gefärbt, das aus der
extrazellulären Domäne von CD16 und dem green fluorescent protein (GFP) bestand
(Abbildung 11, Bruenke et al, 2004). Ein Zell-assoziiertes Fluoreszenzsignal war nur
in dem Fall zu erwarten, falls das untersuchte Protein mit CD19 auf der Zelloberflä-
che und gleichzeitig mit dem löslichen CD16exGFP reagiert hatte.
Die Inkubation der Zellen mit entweder dem bstb [Fab19xds19xds16] oder dem bsbb
[Fab19xds16] resultierte bei anschließender Färbung mit CD16exGFP in einem deut-
lichen Fluoreszenzsignal im Durchflusszytometer. Kein Signal dagegen wurde nach
Inkubation der SEM Zellen mit einem analog konstruierten nicht-relevanten Kontroll-
Ergebnisse
45
protein, oder nach Färbung mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domä-
ne von CD64 und GFP (CD64exGFP) erhalten (Daten nicht gezeigt, Bruenke et al,
2005)). Somit enthielten die Proteinpräparationen, zumindest zu einem gewissen An-
teil, Moleküle, die gleichzeitig mit beiden Antigenen reagierten.
Die Spezifität der Bindung wurde in Blockierungsexperimenten sichergestellt. Das
Fluoreszenzsignal wurde durch Vorinkubation mit einem 50-fach molaren Über-
schuss der parentalen Antikörper 4G7 (anti-CD19) oder 3G8 (anti-CD16) auf das
Hintergrundniveau reduziert. Die Zugabe eines nicht relevanten IgG1 Kontrollantikör-
pers (TH69) im gleichen molaren Überschuss hatte dagegen keinen Einfluss. Diese
Daten bestätigten, dass der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16]
spezifisch und simultan mit CD19 und CD16 reagierten.
Abbildung 11: Simultane Antigenbindung der bispezifischen Fab-scFv Fusionen. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder dem bsbb [Fab19xds16] (B) inkubiert und mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD16 und GFP (CD16ex-GFP) gefärbt (a). Schwarze peaks repräsentieren das Signal, das durch Inkubation der Zellen mit dem Fab-scFv Fusionsprotein erhalten wurde, weiße peaks das Signal eines nicht-relevanten Kontrollproteins. Das CD16ex-GFP Signal wurde durch Zugabe eines 50-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper 4G7 (b) und 3G8 (c) blockiert (dunkelgraue peaks), wohingegen ein nicht-relevanter IgG1Antikörper das Fluoreszenzsignal nicht beeinflusste (hellgraue Peak peaks).
Ergebnisse
46
4.1.4 Analyse der Bindungsstärken des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16]
Die Bindungsstärke ist ein wichtiger Parameter bispezifischer Antikörper, die die Zy-
totoxizität in vitro und eine spezifische Anreicherung der Moleküle am Tumor in vivo
beeinflusst. Unter diesen Gesichtspunkten sollte die Affinität bzw. die Avidität der
Fab-scFv Fusionen für beide Antigene untersucht werden. Insbesondere sollte die
Frage geklärt werden, ob die Kombination zweier CD19 Leseköpfe in der Anordnung
eines tribodys zu einem Aviditätsgewinn führte. Die Bindungsstärken des tribodys
und des bibodys wurden mit zwei unabhängigen Meßmethoden verglichen. Zum ei-
nen wurde die Gleichgewichtskonstante der Bindungsreaktion aus einer Sättigungs-
kurve bestimmt. Zum anderen wurde die Verweildauer der Moleküle auf der Ober-
fläche Antigen-positiver Zellen bei physiologischer Temperatur gemessen.
4.1.4.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD)
Die Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD) erfolgte mit einer durchflusszyto-
metrischen Methode (Benedict et al, 1997; Bruenke et al, 2004). CD19-positive SEM
oder CD16-transfizierte CHO Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen der
Antikörper-Derivate inkubiert, die anschließend über den Hexahistidin-tag nachge-
wiesen wurden (Abbildung 12).
Aus den Sättigungskurven wurden die KD-Werte (Konzentrationen, bei denen halb-
maximale Sättigung erreicht wurde) berechnet. Der bsbb [Fab19xds16] wies für
CD19 eine KD von 23,2 ± 2,8 nM auf. Im Gegensatz dazu band der bstb
[Fab19xds19xds16] mit einer statistisch signifikant niedrigeren KD von 8,3 ± 0.6 nM
an CD19 (P = 0,006). Der tribody, der mit zwei Valenzen für CD19 ausgestattet war,
besaß somit eine 2,8-fach höhere Avidität für CD19, als der monovalente bibody.
Diese Verbesserung in der Bindung ließ darauf schließen, dass beide im tribody ent-
haltenen CD19 Leseköpfe funktional waren, und zu der Bindung an CD19 auf intak-
ten Zellen beitrugen. Im Gegensatz dazu war die Affinität für CD16 in beiden Molekü-
len ungefähr gleich hoch. Für den bsbb [Fab19xds16] wurde ein KD -Wert von
56,2 ± 6,9 nM, für den bstb [Fab19xds19xds16] ein KD-Wert von 55,6 ± 4,0 nM ermit-
telt (P = 0,74). Die Anwesenheit eines weiteren scFv Fragments im tribody beein-
Ergebnisse
47
trächtigte demzufolge nicht die Affinität des CD16 scFvs auf der anderen Polypeptid-
kette, z.B. über allosterische Effekte. Beide Moleküle wiesen eine höhere Bindungs-
stärke für CD19 auf als das Vergleichsmolekül bsscFv ds[19x16], für das im weiteren
Verlauf der Arbeit KD-Werte von 42,4 ± 5,7 nM für CD19 und 57,6 ± 8,9 nM für CD16
bestimmt wurden (Abbildung 24).
Abbildung 12: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb Fab 19xds16. CD19-positive SEM oder CD16- transfizierte CHO Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen des bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder des bsbb [Fab19xds16] (B) inkubiert, die mit einem anti-Pentahistidin Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen wurden. Die höchste mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) einer jeden Meßreihe wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Datenpunkte auf diesen Wert normalisiert. Die Gleichgewichtskonstante (KD) wurde mit dem Langmuir-Scatchard Algorithmus bestimmt (Benedict et al., 1997). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus 7 unabhängigen Messungen.
4.1.4.2 Bestimmung der Retentionszeit auf Antigen-positiven Zellen in vitro
In einer unabhängigen Methode zur Messung der Bindungsstärke wurde die Verweil-
dauer des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] auf intakten, Anti-
gen-positiven Zellen in vitro analysiert. Dies basierte auf der Annahme, dass bivalen-
te Moleküle gegenüber monovalenten eine verlangsamte Dissoziation von Antigen-
Ergebnisse
48
positiven Zellen zeigen sollten. Hierzu wurden CD19-positive SEM oder CD16-trans-
fizierte CHO Zellen mit dem tribody oder dem bibody dekoriert. Nachdem ungebun-
dene Moleküle aus dem Überstand entfernt worden waren, wurden die Zellen bei
37°C unter nicht-internalisierenden Bedingungen inkubiert. Zu verschiedenen Zeit-
punkten wurden dissoziierte Moleküle aus dem Überstand entfernt, und die verblie-
benen zellgebundenen Moleküle durchflusszytometrisch über den Hexahistidin-tag
nachgewiesen. Das mittlere Fluoreszenzsignal der zum Zeitpunkt t0 entnommenen
Probe wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte relativ dazu bestimmt.
Abbildung 13: Zelloberflächenretention der Fab-scFv Fusionsproteine. CD19-positive SEM (A) oder CD16-transfizierte CHO Zellen (B) wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Vierecke) oder dem bsbb [Fab19xds16] (graue offene Dreiecke) dekoriert und bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden den Ansätzen Zellen entnommen, und diese auf gebundene Antikörperfragmente durchflusszytometrisch analysiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte auf diesen Punkt normalisiert. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem bstb [Fab19xds19xds16] und dem bsbb [Fab19xds16] sind gekennzeichnet (P < 0,05;*). Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3 unabhängigen Experi-menten.
Unter diesen Bedingungen war der bsbb [Fab19xds16] bereits nach 45 min nicht
mehr auf der Zelloberfläche CD19-positiver Zellen nachweisbar. Zellen hingegen, die
mit dem bstb [Fab19xds19xds16] versetzt worden waren, wiesen zu diesem Zeit-
punkt noch über 50% der ursprünglich zum Zeitpunkt t0 gemessenen mittleren Fluo-
reszenzintensität auf (Abbildung 13). Der bsbb [Fab19xds16] dissoziierte von der
Zelloberfläche einem einphasigem Verlauf folgend und wies eine Retentionshalb-
wertszeit von 9,6 ± 0,3 min auf. Im Gegensatz erfolgte die Dissoziation des bstb
[Fab19xds19xds16] zwei-phasig, mit einer kurzen α-Halbwertszeit von
10,8 ± 1,7 min, und einer langen β-Halbwertszeit (nicht bestimmt). Selbst nach
120 min betrug das relative residuelle Fluoreszenzsignal über 50%. Im Gegensatz
Ergebnisse
49
zeigten beide Moleküle vergleichbare Halbwertszeiten in der Retention auf CD16-po-
sitiven Zellen. Die berechneten Halbwertszeiten betrugen 10,3 ± 0,3 min für den bstb
[Fab19xds19xds16] und 10,2 ± 1,1 min für den bsbb [Fab19xds16] (P = 0,94).
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die Einführung eines weiteren
CD19 Lesekopfes zu einer verlangsamten Dissoziation des Moleküls vom Antigen
führte. Diese Methode wurde allerdings als nicht exakt genug eingestuft, um eine
Dissoziationskonstante zu berechnen. Dennoch bestätigten diese Resultate das Er-
gebnis der Affinitätsmessungen, wonach der tribody gegenüber dem bibody eine hö-
here Avidität für CD19, aber eine gleich hohe Affinität für CD16 besaß.
4.1.5 Bestimmung der Stabilität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] in humanem Serum in vitro
Die therapeutische Wirksamkeit Antikörper-abgeleiteter Proteine wird kritisch durch
deren Stabilität in humanem Serum beeinflusst. Um diese zu bestimmen, wurden der
tribody [Fab19xds19xds16] und der bibody [Fab19xds16] über einen Zeitraum von
vier Wochen in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunk-
ten wurden beide Moleküle auf ihre residuelle Bindung an CD19-positive SEM oder
CD16-transfizierte CHO Zellen durchflusszytometrisch untersucht. Das mittlere Fluo-
reszenzsignal einer frisch angesetzten Probe wurde auf 100% gesetzt, und die resi-
duelle Bindung der einzelnen Proben relativ dazu ermittelt (Abbildung 14).
Aus den Kurven wurden die Halbwertszeiten für eine Bindung an CD19 und CD16
bestimmt. Die Halbwertszeit des CD19 Fab Fragments im bibody betrug
160,3 ± 27,2 h. Im tribody betrug die Halbwertszeit der Bindung an CD19-positive
Zellen 174.6 ± 30,3 h (P = 0,55). Es wurden keine Anstrengungen unternommen, die
Stabilität des ds CD19 scFvs und des CD19 Fab Fragments im tribody getrennt von-
einander zu untersuchen. Für den ds CD16 scFv dagegen wurden statistisch signifi-
kant unterschiedliche Halbwertszeiten von 113,9 ± 8,4 h im tribody und
195,9 ± 29,0 h im bibody gemessen (P = 0,039). Die C-terminale Erweiterung des Fd
Fragments um einen scFv beeinflusste somit die Stabilität des an der L-Kette fu-
sionierten ds CD16 scFvs. Die dieser Beobachtung zugrunde liegenden molekularen
Mechanismen wurden nicht untersucht. Zusammenfassend wurde aus diesen Experi-
menten geschlossen, dass, auch im Vergleich zu anderen rekombinanten Antikörper-
Ergebnisse
50
fragmenten, der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] eine hohe Sta-
bilität in humanem Serum bei 37°C aufwiesen.
Abbildung 14: Stabilität der Fab-scFv Fusionsproteine in humanem Serum. Der bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Vierecke) und der bsbb [Fab19xds16] (graue offene Dreiecke) wurden in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle Bindeaktivität an CD19- (A) und CD16-positive Zellen (B) in Immunfluoreszenzanalysen bestimmt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4-6 unabhängigen Experi-menten.
4.1.6 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] in vitro
Rekombinante, bispezifische tandem bsscFvs und diabodies mit Spezifitäten für
CD19 und CD16 haben sich als potente ADCC-vermittelnde Moleküle erwiesen. Da-
her sollte analysiert werden, ob mit den hier gewählten Formaten eines tribodys oder
bibodys eine ähnlich starke Wirkung erzielt werden konnte. Insbesondere sollten die
Antigenspezifität sowie die Effektorzellabhängigkeit der Zielzelllyse untersucht wer-
den. In vergleichenden Experimenten sollte weiterhin der Einfluss der Avidität für das
Tumorantigen CD19 auf die Zytotoxizität der Moleküle analysiert und das Konzept
des bivalenten Anvisierens der Tumorzellen bewertet werden.
Ergebnisse
51
4.1.6.1 Analyse der Antigen-spezifischen zellulären-Zytotoxizität des bstb
[Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16]
In 51Chrom-Freisetzungsexperimenten sollte untersucht werden, ob der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] mit humanen MNCs als Effektoren
spezifische Lyse der Tumorzellen induzieren konnten. Als Zielzellen wurde die pro-B
ALL abgeleitete Zelllinie SEM mit der Translokation t(4;11) verwendet. Der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] wurden äquimolar in einer Konzen-
tration von 1 nM eingesetzt. Aus unabhängigen, gesunden Spendern isolierte, unsti-
mulierte mononukleäre Zellen (MNCs), die typischerweise 5-10% NK-Zellen enthal-
ten, dienten als Effektorzellen. Effektor- und Zielzellen wurden in einem konstanten
Effektor-zu-Zielzell (E:T)-Verhältnis von 40:1 eingesetzt. In einem Ansatz ohne An-
tikörper wurden Lysen der SEM Zellen gemessen, die unter 15% lagen. Dies gab die
basale Zytotoxizität der Effektorzellen wieder (Abbildung 15).
Im Vergleich zu dem Ansatz ohne Antikörper induzierten sowohl der
bstb[Fab19xds19xds16] (P = 0,005), als auch der bsbb [Fab19xds16] (P = 0,012)
spezifische Lyse der Zielzellen. Die gemessenen Lysen lagen im Mittel für beide Mo-
leküle bei etwa 50%. Zur Kontrolle wurden der bispezifische tribody bstb
[Fab7x7xds16] und der bispezifischer bibody bsbb [Fab7xds16] mitgeführt. Diese wa-
ren spezifisch für das T-ALL assoziierte Antigen CD7, das in der Regel nicht inner-
halb der B-Zellreihe exprimiert wird. Weder der bstb [Fab7x7xds16] noch der bsbb
[Fab7xds16] induzierten eine statistisch signifikante Lyse der CD7-negativen SEM
Zellen (P > 0,05). Die monovalente Bindung an CD16 führte somit nicht zu einer
Aktivierung und einer Zielzell-Antigen-unabhängigen Lyse durch die Effektoren. Die
Antigen-spezifische Induktion der Lyse wurde in ADCC-Blockierungsexperimenten
weiter bestätigt. Durch Zugabe eines 120-fach molaren Überschusses der murinen
parentalen Antikörper gegen CD19 (4G7; P < 0,01) oder gegen CD16 (3G8;
P < 0,05) wurde die vermittelten Lysen statistisch signifikant blockiert. Eine Zugabe
des nicht-relevanten IgG1 Antikörpers TH69 nahm keinen Einfluss (Abbildung 15).
Aus diesen Resultaten wurde gefolgert, dass der bstb [Fab19xds19xds16] und der
bsbb [Fab19xds16] ADCC gegenüber den CD19-positiven Tumorzellen vermittelten.
Eine unspezifische Aktivierung der Effektorzellen war nicht zu beobachten. Die
Blockierungsstudien zeigten, dass die bispezifischen Proteine eine Interaktion mit
Ergebnisse
52
dem Zielzellantigen und dem Effektorzellantigen benötigten, um eine effiziente
zelluläre Zytotoxizität zu induzieren.
Abbildung 15: Antigen-spezifische Induktion der Zielzelllyse durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds19]. Die CD19-positive Zelllinie SEM wurde mit den Antikörper-Derivaten bstb [Fab19xds19xds16] (A) oder bsbb [Fab19xds16] (B) in einer Konzentration von 1nM und MNCs von gesunden Spendern bei einem E:T Verhältnis von 40:1 inkubiert. Beide Moleküle vermittelten signifikant höhere Lyse gegenüber einem Ansatz mit MNCs in Abwesenheit eines Antikörpers (Ak; P < 0,05;*). Die beiden Kontrollen bstb [Fab7x7xds16] und bsbb [Fab7xds16] induzierten keine ADCC (P > 0,05). Durch Zugabe eines 120-fachen molaren Überschusses der pa-rentalen Antikörper 3G8 (anti-CD16) oder 4G7 (anti-CD19) wurde die Lyse blockiert (P < 0,05;#), nicht aber durch Zugabe eines nichtrelevanten IgG1. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
Um nachzuweisen, dass die beobachtete Lyse Effektorzell-vermittelt war, wurde wei-
terhin die zytotoxische Wirkung beider Antikörper-Derivate bei unterschiedlichen E:T-
Verhältnissen getestet. Bei einer konstanten Konzentration von 1 nM waren der bstb
[Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] über einen breiten Bereich an E:T
Verhältnissen wirksam. Ab einem E:T Verhältnis von 5:1 wurde eine statistisch signi-
fikante ADCC gemessen (P < 0,05). In Abwesenheit der Effektorzellen induzierten
beide Moleküle keine Zielzelllyse, die alleinige Bindung an CD19 war nicht zytoto-
xisch. Mit steigenden E:T Verhältnissen stieg auch die Zelllyse saturativ an, wobei
beide Moleküle bei einem Verhältnis von 40:1 einen Sättigungswert erreichten. Die
maximal erzielten Lysen lagen bei ca. 50% für den tribody und bei 40% für den
bibody. In diesem Experiment induzierte der CD19-bivlante tribody bei allen ge-
Ergebnisse
53
testeten E:T Verhältnissen in der Tendenz höhere Lysen als der monovalente bi-
body. Der zur Kontrolle mitgeführte bstb [Fab7x7xds16] löste keine ADCC aus und
blieb auch bei hohen E:T Verhältnissen wirkungslos (P > 0,05). Die auf einer
Basalaktivität der MNCs beruhende Lyse in Abwesenheit eines Antikörpers lag auch
bei hohen E:T Verhältnissen bei unter 10%. Die gefundene Korrelation zwischen
dem E:T Verhältnis und der Zielzelllyse bestätigte, dass die Zytotoxizität dieser
beiden bispezifischen Antikörper-Derivate durch Effektorzellen vermittelt wurde.
Abbildung 16: Einfluss des E:T Verhältnisses auf die durch den bstb [Fab19xds19xds16] oder den bsbb [Fab19xds16] vermittelte Zielzelllyse. Die CD19-positive Zelllinie SEM wurde mit den bispezifischen Antikörper-Derivaten bstb Fab19xds19xds16 (schwarze Balken) oder bsbb [Fab19xds16] (dunkelgraue Balken) in einer Konzentration von 1nM und MNCs von gesunden Spendern bei verschiedenen E:T Verhältnissen inkubiert. Der Nachweis der spezifischen Lyse erfolgte im 51Chrom-Freisetzungsexperiment. Ab einem E:T Verhältnis von 5:1 vermittelten beide Moleküle signifikant höhere Lyse gegenüber einer Kontrolle ohne Antikörper (weiße Balken; P < 0,05;*). Der bstb [Fab7x7xds16] (hellgraue Balken) als Kontrolle löste keine ADCC aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
4.1.6.2 Vergleichende Analyse des ADCC Potentials der Antikörper-Derivate
bstb [Fab19xds19xds16], bsbb [Fab19xds16] und des bsscFv ds[19x16]
Schließlich sollte das zytotoxische Potential der beiden Fab-scFv Fusionen unterei-
nander, aber auch mit dem bsscFv ds[19x16] verglichen werden. Dieser wurde paral-
lel unter identischen Bedingungen in einer stabil transfizierten 293T Produktionslinie
in einem Mini-Bioreaktor hergestellt und über den Hexahistidin-tag mit Ni-NTA Perlen
aufgereinigt. In ADCC Experimenten wurden die Moleküle in 5-fach seriellen Verdün-
nungen bei einem konstanten E:T Verhältnis von 40:1 eingesetzt und Dosis-Wir-
Ergebnisse
54
kungskurven erstellt. Um mögliche Qualitätsschwankungen der Proteinpräparationen
auszugleichen wurden die Experimente mit aufgereinigten Proteinen aus mindestens
drei unterschiedlichen Produktionsrunden durchgeführt. Als Zielzellen wurden SEM
Zellen verwendet. Alle drei CD19-gerichteten bispezifischen Moleküle induzierten
konzentrationsabhängig spezifische Lyse der Tumorzelllinie und waren bereits in nie-
drigen, subnanomolaren Konzentrationen wirksam. In diesen Versuchen lagen die
maximal erzielten Lysen für alle drei Antikörper-Derivate bei etwa 40% über dem Hin-
tergrund der Basallyse der MNCs. Allerdings unterschieden sich diese deutlich in ih-
rer Effizienz. So löste der bstb [Fab19xds19xds16] bereits in niedrigeren Konzentra-
tionen eine vergleichbar hohe Lyse aus, wie der bsbb [Fab19xds16] oder der bsscFv
ds[19x16]. Der bstb [Fab7x7xds16] als Kontrolle blieb dagegen auch in hohen Kon-
zentrationen wirkungslos.
Abbildung 17: Dosis-abhängige ADCC durch den bstb [Fab19xds19xds16], den bsbb [Fab19xds16] und den bsscFv ds[19x16]. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem bstb [Fab19xds19xds16] (graue Vierecke), dem bsbb [Fab19xds16] (schwarze offene Dreiecke) oder dem bsscFv ds [19x16] (graue Kreise) in unterschiedlichen Konzentrationen mit MNCs gesunder Spender inkubiert (E:T = 40:1). Der Nachweis der spezifischen Lyse gegenüber der Basallyse der MNCs erfolgte im 51Chrom-Freisetzungsexperiment (P < 0,05;*). Der bstb [Fab7x7xds16] induzierte keine statistisch signifikante Lyse (P > 0,05). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 7 unabhängigen Experimenten.
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die Konzentrationen ermittelt, welche einen
halbmaximalen zytotoxischen Effekt bewirkten (EC50-Werte; Tabelle 7). Die EC50-
Werte betrugen 55,4 pM für den bstb [Fab19x19xds16], 348.2 pM für den bsbb
[Fab19xds16] und 678,0 pM für den bsscFv ds[19x16]. Folglich stieg das ADCC Po-
Ergebnisse
55
tential mit steigender Affinität/Avidität der Moleküle für CD19, wobei der tribody die
höchste und der bsscFv die niedrigste Zytotoxizität aufwiesen. Der bstb
[Fab19xds19xds16] erzielte in 12-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv
ds[19x16] (P = 0.001), und in 6-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsbb
[Fab19xds16] (P = 0.021) eine halbmaximale zytotoxische Wirkung. Auch der bsbb
[Fab19xds16] hatte eine höherer ADCC-Effizienz als der bsscFv ds[19x16]
(P = 0.049). Die charakteristischen Bindungseigenschaften und die E50-Werte der
ADCC sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert,
dass das bivalente Anvisieren der Tumorzellen zu einem höheren ADCC Potential
führte, wodurch die Arbeitshypothese bestätigt war.
Tabelle 7: Bindungseigenschaften und Zytotoxizität der bispezifischen Antikörper-Derivate
Antikörper-Derivat KD
a [nM] CD19 CD16
t½b [min]
CD19 CD16 EC50
c [pM]
bstb [Fab19xds19xds16] 8,3 55,9 > 120 10,3 55,5
bsbb [Fab19xds16] 23,2 56,2 9,3 10,2 348,2
bsscFv ds[19x16] 42,4 57,6 7,7 14,5 678,0
a bestimmt aus Bindungssättigungskurven b bestimmt aus Zelloberflächenretentionsexperimenten c bestimmt aus ADCC Experimenten mit SEM Zellen als Ziel- und humanen MNCs als Effektorzellen
4.1.6.3 Zytotoxische Aktivität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb
[Fab19xds16] gegenüber primären Tumorzellen
Der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16] vermittelten potente zellulä-
re Zytotoxizität gegenüber der Zelllinie SEM. Da primäre Tumorzellen generell
schwerer zu lysieren sind als etablierte Zelllinien, sollte die Induktion spezifischer Ly-
se mit primären Tumorzellen analysiert werden. Hierzu wurden MNCs aus dem peri-
pheren Blut oder aus dem Knochenmark fünf verschiedener B-CLL Patienten und ei-
nes Patienten mit diffus großzelligem B-Zell-Lymphom aufgereinigt. Bei einer Kon-
zentration von 1nM vermittelten der bstb [Fab19xds19xds16] und der bsbb
[Fab19xds16] zelluläre Zytotoxizität gegenüber den CD19-positiven Tumorzellen aller
sechs Patienten mit MNCs gesunder Spender als Effektoren, wobei das Ausmaß der
Lysen zwischen den einzelnen Proben variierte (Abbildung 18). Mit dem bstb
[Fab19xds19xds16] wurden Lysen zwischen 29% und 57% erzielt. Der bstb
Ergebnisse
56
[Fab7xds7ds16] als Kontrolle blieb wirkungslos. Mit diesen Experimenten wurde ge-
zeigt, dass die Fab-scFv Fusionen auch potente Lyse gegenüber primären
Tumorzellen verschiedener B-CLL oder NHL Patienten induzierten.
Abbildung 18. ADCC gegenüber primären Tumorzellen durch den bstb [Fabxds19xds16] und den bsbb [Fab1xds16]. Der bstb [Fab19xds19xds16] (schwarze Balken) und der bsbb [Fab19xds16] (dunkelgraue Balken) induzieren potente ADCC gegen CD19-positive primäre Zellen, die aus dem Knochenmark (KM) oder dem peripheren Blut (PB) fünf verschiedener B-CLL und eines DLBCL Pa-tienten präpariert worden waren. Die bispezifischen Antikörper wurden bei einer Konzentration von 1nM eingesetzt. Effektorzellen waren MNCs gesunder Spendern (E:T = 40:1). Der Nachweis der spezifischen Lyse erfolgte im 51Cr Freisetzungsexperiment. Die Basallysen der MNCs in Ansätzen ohne Antikörper (weiße Balken) lagen stets bei unter 15%. Der Kontroll-bstb Fab7x7xds16 (hellgraue Balken) löste keine Lyse aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus Triplikatbestim-mungen. B-CLL, chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe; DLBCL, diffuses großzelliges B-Zell Lymphom.
Ergebnisse
57
4.2 Herstellung und funktionelle Charakterisierung des bispezifi-
schen single-chain Fv triple-bodys ds[19x16x19]
Die beiden Fab-scFv Fusionsproteine wiesen gegenüber dem bsscFv ds[19x16] eine
höhere Zytotoxizität auf. Dies war mit einer höheren Affinität bzw. Avidität für das Tu-
morantigen CD19 zu erklären. Zweikettige Moleküle können in manchen Fällen al-
lerdings Nachteile für die Produktion oder die Herstellung mit sich bringen. Daher
wurde im Rahmen dieser Arbeit ein einkettiges Format entworfen, das drei Leseköp-
fe in einer einzigen Polypeptidkette-Kette vereinigt. Hierzu wurde der bispezifische
scFv ds[19x16] um einen zweiten disulfidstabilisierten, CD19-gerichteten scFv erwei-
tert. Dieses Molekül repräsentierte ein neues Format für bispezifische Antikörper-De-
rivate und wurde single-chain Fv triple-body (sctb) benannt. Der sctb ds[19x16x19]
wurde bezüglich seiner Affinität, Stabilität und Zytotoxizität im Vergleich zu dem
bsscFv ds[19x16] charakterisiert.
4.2.1 Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19]
Die Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] erfolgte in se-
quentiellen Klonierungsschritten (Material und Methoden). Die cDNA Sequenzen der
disulfidstabilisierten scFvs 4G7 (anti-CD19) und 3G8 (anti-CD16) wurden aus dem
Vektor pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 (Bruenke et al, 2005) aus-
geschnitten, oder gegebenenfalls, unter Einführung entsprechender Restriktions-
schnittstellen durch PCR amplifiziert. Die Fragmente wurden in die MCS stromab-
wärts des CMV Promotors des Vektors pSecTag2HygroC-Strep ligiert. Als Ergebnis
wurde der Vektor pSecTag2HygroC-Strep-ds19-ds16-ds19 erhalten (Abbildung 19).
Die beiden distalen scFvs waren spezifisch für CD19, und der zentrale scFv für
CD16. Das entwickelte Kassettensystem benutzte Restriktionsenzyme, die nur selten
in variablen Domänen muriner Immunglobuline schneiden, wodurch für weitere An-
wendungen ein unkomplizierter Austausch der einzelnen scFv Leseköpfe gegen
scFvs mit anderer Spezifität ermöglicht wurde. Wie der bsscFv ds[19x16] stand auch
der sctb ds[19x16x19] unter Kontrolle des starken CMV immediate early Promotors.
Das resultierende rekombinante Protein war aus identischen Untereinheiten aufge-
Ergebnisse
58
baut wie der bsscFv ds[19x16], wodurch ein direkter Vergleich dieser beiden Forma-
te möglich wurde.
Abbildung 19: Schema des Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19]. Drei scFv Fragmente sind in linarer Anordnung in tandem auf einer Polypeptidkette fusioniert. Die beiden distalen scFvs sind spezifisch für CD19, der zentrale scFv ist spezifisch für CD16. CMV, Cytomegalovirus immediate
early Promotor; Igκ, Kodiersequenz des Sekretionsleaders der murinen Immunglobulin κ leichten Ket-te; VL,VH, cDNA Sequenenzen für die variablen Regionen der Immunglobulin leichten- bzw. schwe-ren-Kette; L, cDNA Sequenz für einen 20 AS flexiblen Linker (G4S)4; S, M, H cDNA Sequenzen für einen Strep-, einen c-myc- und einen Hexahistidin-tag; S-S, stabilisierende Disulfidbrücke.
4.2.2 Bindungsstudien mit einem trispezifischen sctb [33xds16xds19] zur
Analyse der Funktionalität des single-chain Fv triple-body Formats
Zu diesem Zeitpunkt war unklar, ob in der linearen Anordnung eines sctb drei scFv
Leseköpfe ihre spezifische Bindekapazität behielten. Dieser Nachweis konnte
allerdings mit dem sctb ds[19x16x19] nur indirekt über Affinitätsmessungen erbracht
werden, da zwei der drei Leseköpfe gegen das gleiche Antigen gerichtet waren. Um
einen direkten Nachweis zu erbringen, wurde ein trispezifischer sctb hergestellt.
Hierzu wurde die cDNA Sequenz des N-terminalen ds CD19 scFv im Vektor
pSecTag2HygroCStrep-ds19xds16xds19 gegen einen CD33 gerichteten scFv aus-
getauscht (Schwemmlein et al, 2006). Der resultierende Expressionsvektor
pSecTag2HygroCStrep-33-ds16-ds19 wurde transient in 293T Zellen transfiziert, und
das rekombinante Protein anschließend über Ni-Chelat Chromatographie aus dem
Zellkulturüberstand aufgereinigt (Daten nicht gezeigt). Das aufgereinigte Protein
wurde auf Bindung an Antigen-positive Zellen durchflusszytometrisch analysiert (Ab-
bildung 20). Der sctb [33xds16xds19] band spezifisch an CD33-positive HL-60, an
CD19-positive Nalm-6, sowie an CD16-transfizierte CHO Zellen, reagierte jedoch
nicht mit CEM Zellen, die keines dieser drei Antigene exprimierten. Folglich hatten
alle in diesem sctb enthaltenen einzelnen scFv-Leseköpfe ihre Bindefähigkeit bei-
behalten.
Ergebnisse
59
Abbildung 20: Nachweis der spezifischen Bindung des sctb [33xds16xds19] an Antigen-positi-ve Zellen. CD33-positive HL-60 (A), CD19-positive Nalm-6 (B), CD16-transfizierte CHO (C) und Anti-gen-negative CEM Zellen (D) wurden mit dem sctb [33xds16xds19] (dunkelgraue peaks) oder einem Kontroll-sctb (hellgraue peaks) inkubiert und die spezifische Bindung im Durchflusszytometer analy-siert.
Zum Nachweis der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19] an verschie-
dene Kombinationen dieser drei Antigene, wurden Färbungen mit CD16exGFP und
einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD33 und dem red fluo-
rescent protein (CD33exRFP) durchgeführt (Abbildung 21). Dazu wurden zunächst
CD33-positive HL-60 Zellen, CD19-positive Nalm-6 und CD16-transfizierte CHO Zel-
len mit dem trispezifischen sctb [33xds16xds19] inkubiert. Die simultane Bindung die-
ses sctb an CD16 und CD33 wurde durch Färbung mit dem Fusionsprotein
CD16exGFP auf den CD33-positiven HL-60 Zellen nachgewiesen. Analog erfolgte
der Nachweis der simultanen Bindung des Moleküls an CD19 und CD16 bzw. an
CD19 und CD33 auf CD19-positiven Nalm-6 Zellen durch Färbung mit CD16exGFP
bzw. CD33exRFP. In allen drei Ansätzen wurde ein deutliches Fluoreszenzsignal im
Durchflusszytometer gemessen. Dies zeigte, dass der sctb [33xds16xds19] simultan
mit CD33 und CD16, simultan mit CD19 und CD16 und auch simultan mit CD19 und
CD33 reagierte. Schließlich wurden in einer Doppelfärbung Nalm-6 Zellen mit dem
sctb [33xds16xds19] inkubiert und anschließend mit beiden Fusionsproteinen gleich-
zeitig gefärbt. Im Durchflusszytometer fluoreszierten einzelne Zellen gleichzeitig rot
und grün, somit vermittelte der über CD19 an die Zelle gebundene sctb
[33xds16xds19] eine gleichzeitige Bindung von CD33exRFP und CD16exGFP an
diese Zelle.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass der sctb [33xds16xds19] unab-
hängig mit den Antigenen CD19, CD33 und CD16 reagierte, und mindestens zwei
dieser Antigene von einem Molekül des sctb [33xds16xds19] gleichzeitig gebunden
werden konnten. Somit war gezeigt, dass das Format eines scFv triple-bodys geeig-
net ist, drei scFv Leseköpfe linear miteinander in einer einzigen Polypeptidkette zu
kombinieren.
Ergebnisse
60
Abbildung 21: Analyse der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19]. (A) CD33-positi-ve HL-60 Zellen, CD19-positive Nalm-6 und CD16-transfizierte CHO Zellen wurden mit dem sctb [33xds16xds19] inkubiert. Der Nachweis der Simultanbindung des sctb [33xds16xds19] an CD16 und an CD33 erfolgte mit CD16exGFP auf HL-60 Zellen (a). Mit Nalm-6 Zellen wurde die Simultanbindung an CD19 und CD16 durch Färbung mit CD16exGFP (b) und die Simultanbindung an CD19 und CD33 durch Färbung mit CD33exRFP nachgewiesen (c); dunkelgrauer Peak: sctb [33xds16xds19]; hell-grauer Peak: Kontroll-protein. (B) In einer Doppelfärbung wurden Nalm-6 Zellen mit einem Kontroll-protein (a), oder dem sctb [33xds16xds19] inkubiert (b-d) und anschließend mit CD16ex-GFP (b) und CD33ex-RFP (c) gefärbt. Bei gleichzeitiger Zugabe der Proteine CD16exGFP und CD33exRFP wer-den beide Proteine durch Wechselwirkung mit dem sctb [33xds16xds19] an einzelne Zellen gebun-den, die rot und grün fluoreszieren (d).
4.2.3 Eukaryotische Expression und Aufreinigung des sctb ds[19x16x19]
Der sctb ds[19x16x19] wurde zunächst nach transienter Transfektion in 293T Zellen
hergestellt, und über Ni-NTA Affinitätschromatoghraphie aus dem Zellkulturüberstand
angereichert (Abbildung 4.15). Die Anreicherung des rekombinanten Proteins wurde
in Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gelen und in Western-Transfer Experimenten
geprüft. Der sctb ds[19x16x19] zeigte unter reduzierenden Bedingungen eine elektro-
phoretische Mobilität entsprechend einer Masse von ungefähr 90 kDa, die mit dem
aus seiner AS Sequenz berechneten Molekulargewicht von 88,6 kDa gut überein-
stimmte. Abbruchprodukte oder höherwertige Aggregate wurden nicht beobachtet.
Die Ausbeuten lagen hier routinemäßig bei 300-400 µg/l. Um die Herstellung zu er-
leichtern, wurde eine stabil transfizierte 293T Produktionszelllinie angelegt. Ein stark
exprimierender Einzelklon wurde in einem kleinen Bioreaktor kultiviert, und der sctb
Ergebnisse
61
ds[19x16x19] aus dem Überstand aufgereinigt. Für verschiedene Aufreinigungen be-
trugen die Ausbeuten nach Hochrechnung zwischen 3 und 10 mg/l. Diese lagen in
der gleichen Größenordnung, wie die, die für den bsscFv ds[19x16] unter identischen
Bedingungen erzielt wurden (Daten nicht gezeigt). Zur Expression dieses Proteins
lag zu Beginn der Arbeit bereits eine stabil transfizierte 293T Produktionszelllinie vor
(Jörg Brünke, unpubliziert). Die Produktion der rekombinanten Proteine im Mini-Bio-
reaktor stellte eine massive Verbesserung im Vergleich zu einer Herstellung nach
transienter Expression dar. So wurden sowohl für den sctb ds[19x16x19] als auch für
den bsscFv ds[19x16] eine höhere Ausbeuten, aber auch eine höhere Reinheit er-
zielt. Durch Anschluss eines zweiten Reinigungsschritts über den N-terminalen
Strep-tag mit Streptactin-Sepharose wurde die Reinheit des Proteins weiter
verbessert (Abbildung 22). Die durch den zweiten Aufreinigungsschritt bedingten
Verluste lagen bei ca. 25%.
Abbildung 22: Aufreinigung und Nachweis des sctb ds[19x16x19]. (A) Analyse des Proteins im
Coomassie gefärbten, reduzierendem SDS-PAGE-Gel. Der sctb ds[19x16x19] wurde in transient (a)
oder in stabil transfizierten 293T Zellen unter Kultivierung in einem kleinen Bioreaktor (b) produziert
und über affinitätschromatographische Aufreinigung mit Ni-NTA Agarose angereichert. Die Reinheit
des sctb ds[19x16x19] wurde durch einen zweiten Reinigungsschritt mit Streptactin-Sepharose weiter
verbessert (c). (B) Nachweis des sctb ds[19x16x19] in Western-Transfer Experimenten mit einem anti-
Pentahistidin (a) oder einem anti-Strep-tag II Antikörper (b) nach reduzierender SDS-PAGE. Im
Western-Transfer Experiment mit einem anti-Pentahistidin Antikörper nach SDS-PAGE unter nicht-re-
duzierenden Bedingungen ergaben sich keine Hinweise auf über Disulfidbrücken verbundene
kovalente Aggregate (c).
4.2.4 Analyse der Bindungseigenschaften des sctb ds[19x1619]
Nach erfolgter Aufreinigung wurde die Fähigkeit des sctb ds[19x16x19] an CD19 und
CD16 zu binden in durchflusszytometrischen Analysen mit Antigen-positiven Zellen
Ergebnisse
62
überprüft. Der sctb band spezifisch an CD19-positive SEM und an CD16-transfizierte
CHO Zellen, reagierte jedoch nicht mit CD19- und CD16-negativen CEM und un-
transfizierten CHO Zellen (Abbildung 23).
Abbildung 23: Spezifische und simultane Bindung des sctb ds[19x16x19]. (A) Durchflusszytome-trische Analysen der Bindung des sctb ds[19x16x19] an CD19-positive SEM Zellen (a), CD19-ne-gative CEM Zellen (b), CD16-transfizierte CHO Zellen (c) und untransfizierte CHO Zellen (d). Schwar-ze Peaks repräsentieren das Signal des sctb ds[19x16x19], weiße Peaks das Signal eines Kontroll-proteins. (B) CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds [19x16x19] inkubiert und mit einem Fusionsprotein aus der extrazellulären Domäne von CD16 und GFP (CD16ex-GFP) gefärbt (a). Schwarze peaks repräsentieren das Signal, das mit dem sctb ds[19x16x19], weiße peaks das Signal, das mit einem Kontroll-Protein erhalten wurde. Das CD16ex-GFP-Signal wurde durch Zugabe eines 100-fach molaren Überschusses der Parentalantikörper anti-CD19 4G7 (b) und anti-CD16 3G8 (c) blo-ckiert (dunkelgraue peaks), wohingegen ein nicht-relevanter IgG1 Antikörper keinen Einfluss auf das Fluoreszenzsignal hatte (hellgraue peaks).
Auch für den sctb ds[19x16x19] wurde, wie für die bispezifischen Fab-scFv Fusionen
beschrieben, die simultane Bindekapazität analysiert (siehe Kapitel 4.1.2). Der sctb
ds[19x16x19] reagierte simultan mit CD19 auf intakten SEM Zellen und dem
löslichen Fusionsprotein CD16exGFP (Abbildung 23). Kein Fluoreszenzsignal wurde
in einem Ansatz mit einem nichtrelevanten Kontroll-sctb, oder bei Zugabe des
Fusionsproteins CD64exGFP beobachtet (Daten nicht gezeigt). Weiterhin wurde in
Blockierungsexperimenten die Spezifität des Moleküls sichergestellt. Bei Zugabe ei-
nes 50-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper 4G7 (anti-CD19) oder
3G8 (anti-CD16) wurde das Fluoreszenzsignal auf das Hintergrundniveau reduziert.
Ein IgG1 Isotyp Antikörper in gleicher Konzentration hingegen zeigte keinen Einfluss
Ergebnisse
63
auf das Fluoreszenzsignal. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass der
sctb ds[19x16x19] sowohl mit dem Tumorzellantigen CD19 als auch mit dem Effek-
torzellantigen CD16 spezifisch und simultan reagierte.
4.2.5 Vergleich der Bindungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16]
Ziel dieser Arbeit war, ein einkettiges bispezifisches Molekül mit bivalenter Bindung
für CD19 herzustellen um ein bivalentes Anvisieren der Tumorzellen zu ermöglichen.
Um zu untersuchen, ob durch die Erweiterung des bsscFv ds[19x16] um einem zwei-
ten, gegen CD19-gerichteten scFv ein Aviditätsgewinn erzielt wurde, wurden drei
unabhängige Experimente durchgeführt. Diese beinhalteten eine Bestimmung der
Gleichgewichtskonstanten aus Sättigungskurven, Studien zur kompetitiven Inhibition
des parentalen CD19 Antikörpers 4G7, sowie eine Bestimmung der Zelloberflächen-
retentionszeit. Um einen guten Vergleich zu gewährleisten, wurden beide Moleküle
parallel unter identischen Bedingungen hergestellt und aufgereinigt.
4.2.5.1 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD)
Zur Bestimmung der Gleichgewichtskonstante wurden sättigende Bindungskurven
mit kalibrierter Durchflusszytometrie aufgenommen und aus diesen die KD-Werte ab-
geleitet (Abbildung 24). Die Messung der Affinität der Bindung an CD19 erfolgte mit
CD19-positiven SEM Zellen, die Affinität des CD16 Lesekopfes wurde mit CD16-
transfizierten CHO Zellen bestimmt.
Der sctb ds[19x16x19] hatte eine KD von 13,0 ± 1,2 nM für CD19, der bsscFv
ds[19x16] eine KD von 42,4 ± 5,7 nM (P = 0,005). Demzufolge wies der sctb mit zwei
CD19 Leseköpfen eine 3,3-fach höhere Avidität für CD19 auf als der monovalente
bsscFv. Im Gegensatz dazu besaßen die beiden Moleküle eine vergleichbare Affini-
tät für CD16. Die KD Werte für CD16 wurden zu 58,6 ± 4,0 nM für den sctb und zu
57,6 ± 8,9 nM für den bsscFv bestimmt (P = 0,772). Die Affinität des ds CD16 scFvs
war unabhängig davon, ob nur sein N-Terminus an einen scFv, oder, wie im sctb,
seine beiden Enden an scFvs fusioniert waren. Mögliche herstellungsbedingte
Ergebnisse
64
Schwankungen in der Qualität der Proteine wurden durch Experimente mit ver-
schiedenen Aufreinigungen ausgeglichen. Die Produktion in Hochdichtekultur im
Bioreaktor hatte gegenüber einer Herstellung nach transienter Expression in
Zellkulturschalen keinen Einfluss auf die Affinität oder Avidität, und damit auf die
Qualität der beiden Moleküle nach der Aufreinigung (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 24: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den sctb ds[19x16x19] und den bsscFvs ds[19x16]. Steigende Konzentrationen des aufgereinigten sctb ds [19x16x19] (A) oder des bsscFv ds[19x16] (B) wurden mit CD19-positiven SEM Zellen oder CD16-transfizierten CHO Zellen in-kubiert und mit einem anti-Pentahistidin Antikörper durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die maxi-mal erhaltene mittlere Fluoreszenzintensität (MFl) wurde auf 100% gesetzt und alle weiteren Werte re-lativ zu diesem Wert bestimmt. Die KD-Werte der Bindung an CD19 und CD16 wurden mit Hilfe des Langmuir-Scatchard Algorithmus berechnet (Benedict et al, 1997).
4.2.5.2 Kompetitive Inhibition des parentalen CD19 Antikörpers
Die relative Bindungsstärke eines Antikörperfragments für ein Antigen kann aus sei-
ner konzentrationsabhängigen Fähigkeit, den parentalen Antikörper von diesem Anti-
gen zu verdrängen, bestimmt werden. Daher boten kompetitive Inhibitionsexperimen-
te mit dem monoklonalen Antikörper mAk 4G7 eine unabhängige Methode, die Bin-
dungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] zu vergleichen.
Hierzu wurden CD19-positive SEM Zellen mit dem mAk 4G7 in einer subsaturativen
Konzentration von 0,5 µg/ml inkubiert. Die beiden Antikörper-Derivate wurden als
Ergebnisse
65
Inhibitoren eingesetzt und in steigenden Konzentrationen zugegeben. Die residuelle
Bindung des mAk 4G7 an die Zellen wurde anschließend durchflusszytometrisch
bestimmt. Die relative Inhibition wurde berechnet und gegen die eingesetzte
Konzentration des Inhibitors aufgetragen (Abbildung 25).
Abbildung 25: Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7 durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Der CD19-gerichtete Antikörper 4G7 wurde in Ge-genwart steigender Konzentrationen des sctb ds [19x16x19] (schwarze Vierecke) oder des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) mit CD19-positiven SEM Zellen inkubiert. Der zellgebundene Anti-körper 4G7 wurde mit einem PE-gekoppelten anti-Maus IgG Sekundärantikörper durchflusszyto-metrisch nachgewiesen. Die relative Inhibition wurde mit der Gleichung % Inhibition = [(% MFI ohne Inhibitor - % MFI mit Inhibitor) / (% MFI ohne Inhibitor)] x 100 (MFI, mittlere Fluoreszenz Intensität) er-rechnet. Der sctb ds [19x16x19] blockierte in niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv ds[19x16] die Bindung des 4G7 Antikörpers (P < 0,05; *). Die Datenpunkte repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 5 unabhängigen Experimenten.
Sowohl der bsscFv ds[19x16] als auch der sctb ds[19x16x19] inhibierten konzentra-
tionsabhängig die Bindung des mAk 4G7 an die Zellen. Die Zugabe eines 450-fach
molaren Überschusses des sctb resultierte in einer > 95%igen Reduzierung des
Fluoreszenzsignals gegenüber einem Ansatz mit dem mAk 4G7 in Abwesenheit
eines Inhibitors. Um beide Moleküle zu vergleichen wurde die Konzentration, die in
einer halb-maximalen Inhibition resultierte (IC50), bestimmt. Der IC50-Wert für den
sctb ds[19x16x19] betrug 81,3 ± 1,2 nM, wohingegen für den bsscFv ds[19x16] ein
statistisch signifikant höherer IC50-Wert von 287,5 ± 1,3 nM bestimmt wurde
(P = 0.013). Daher waren 3,5-fach höhere Konzentrationen des bsscFv als des sctb
nötig um eine halb-maximale Inhibition zu erreichen. Dieses Ergebnis stimmt gut mit
den aus den Affinitätsmessungen erhaltenen Ergebnissen überein, in denen für den
sctb ds[19x16x19] eine 3,3-fach höhere Avidität für CD19 bestimmt wurde.
Ergebnisse
66
4.2.5.3 Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro
In weiteren Experimenten wurde die in vitro Retentionszeit der Moleküle auf der Zell-
oberfläche Antigen-positiver Zellen untersucht, in analoger Weise wie für die Fab-
scFv Fusionen bereits beschrieben wurde (Kapitel 4.1.2). Die Messungen wurden mit
CD19-positiven SEM und CD16-transfizierten CHO Zellen durchgeführt (Abbildung
26).
Abbildung 26: Bestimmung der in vitro Zelloberflächenretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]. CD19-positive SEM (A) oder CD16-transfizierte CHO Zellen (B) wurden mit dem sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) oder dem bsscFv ds[19x16] (offene graue Dreiecke) de-koriert und bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Zellproben entnommen, und die auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörper-Fragmente durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt, und alle weiteren Daten-punkte auf diesen Wert normalisiert. Die Daten repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3 unabhängigen Experimenten.
Im Vergleich zum sctb ds[19x16x19] zeigte der CD19-monovalente bsscFv ds[19x16]
eine deutlich kürzere Retentionszeit auf der Zelloberfläche CD19-positiver Zellen,
aber eine etwa gleich lange Verweildauer auf CD16-positiven Zellen (Abbildung 26).
Die Dissoziation beider Moleküle folgte einem einphasigen Verlauf. Die Halb-
wertszeiten der Retention betrugen 7,7 ± 0,5 min für den bsscFv ds[19x16] und 51,5
± 2,9 min für den sctb ds[19x16x19] (P = 0.006). Im Gegensatz konnte kein Unter-
schied in der Zelloberflächenretention auf CD16-transfizierten CHO-Zellen beobach-
tet werden. Die Halbwertszeiten wurden zu 15,5 ± 1,2 min für den sctb ds[19x16x19]
und zu 14,5 ± 1,9 min für den bsscFv ds[19x16] bestimmt (P = 0,848).
Ergebnisse
67
Zusammenfassend wurde in drei unabhängigen Methoden gezeigt, dass die Erweite-
rung des bsscFv ds[19x16] um einen zweiten ds CD19 scFv zu einem Aviditätsge-
winn führte. Die Affinität des ds CD16 scFvs hingegen blieb durch die Fusion unbe-
einflusst. Dies erlaubte eine Bewertung des Einflusses der Avidität für CD19 auf das
zytotoxische Potential der bispezifischen Antikörper-Derivate.
4.2.6 Bestimmung der Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in humanem Serum in vitro
Ein kritischer Parameter, der die Wirksamkeit Antikörper-abgeleiteter Proteine beein-
flusst, ist die Stabilität in humanem Serum. Die Einführung stabilisierender intramole-
kularer Disulfidbrücken in konservierte Gerüstregionen des CD16 scFv 3G8 und des
CD19 scFv 4G7 führte zu einem massiven Stabilitätsgewinn. Auch der bsscFv
ds[19x16] aus diesen stabilisierten Leseköpfen zeigte eine deutlich erhöhte Halb-
wertszeit als der bsscFv [19x16] auf, der aus den nicht-stabilisierten scFvs bestand.
Obwohl für die einzelnen scFv Leseköpfe eine gute Serumstabilität belegt worden
war, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob sie diese Eigenschaft
auch im Format eines sctb beibehalten würden. Als Vergleichsmolekül wurde der
bsscFv ds[19x16] mitgeführt.
Die gereinigten Proteine wurden über einen Zeitraum von vier Wochen in humanem
Serum bei 37°C in vitro inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle
Antigenbindung an CD19-positiven SEM oder CD16-transfizierten CHO Zellen durch-
flusszytometrisch gemessen. Das mittlere Fluoreszenzsignal einer frisch angesetzten
Probe wurde auf 100% gesetzt, und die residuelle Bindung der Moleküle der
einzelnen Proben relativ dazu berechnet (Abbildung 27).
Der sctb ds[19x16x19] zeigte gegenüber dem bsscFv ds[19x16] eine statistisch sig-
nifikant verlängerte residuelle Bindung an CD19. Die Halbwertszeiten betrugen
94,0 ± 3,1 h für den sctb ds[19x16x19] und 70,4 ± 3,1 h für den bsscFv ds[19x16]
(P = 0,002). Im Gegensatz dazu war der ds CD16 scFv im Format des bsscFv sig-
nifikant stabiler als im Format des sctb. Nach 700 h lag die relative residuelle CD16-
Bindekapazität bei über 50%. Die Halbwertszeit im sctb ds[19x16x19] betrug da-
gegen 153,1 ± 4,6 h. Diese war im Vergleich zu anderen Antikörper-Derivaten immer
noch als sehr hoch einzustufen, und gemessen an der Halbwertszeit der CD19 Bin-
Ergebnisse
68
dung dürfte die CD16 Seite nicht limitierend sein. Auch waren sowohl die Halbwerts-
zeiten der Bindung an CD19 und an CD16 deutlich höher als die publizierten Werte
der entsprechenden nicht-stabilisierten scFvs im bsscFv [19x16] (Bruenke et al,
2005). Daraus wurde geschlossen, dass sich im sctb ds[19x16x19] zumindest zu ei-
nem gewissen Anteil die stabilisierenden Disulfidbrücken korrekt ausgebildet hatten.
Abbildung 27: Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bssFv ds[19x16] in humanem Serum bei 37°C. Der sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) und der bsscFv ds[19x16] (offene graue Dreiecke) wurden in vitro in humanem Serum bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die residuelle Bindeaktivität an CD19- (A) und CD16-positive Zellen (B) in Immunfluoreszenzanalysen bestimmt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 wurde auf 100% gesetzt und alle Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM aus 6 unabhängigen Experimenten.
4.2.7 Bestimmung der Plasmaretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv
ds[19x16] in Mäusen
Als ein weiterer, wichtiger Parameter gilt die Plasmaverweildauer therapeutischer
Moleküle in vivo. Durch die erzielte Vergrößerung der molekularen Masse des sctb
ds[19x16x19] auf 89 kDa (gegenüber 59 kD des bsscFv ds[19x16]) war erhofft wor-
den, eine Verlängerung der Verweildauer des Moleküls im Blut in vivo zu erzielen.
Um die Plasmaverweildauer zu bestimmen wurden äquimolare Mengen des bsscFv
ds[19x16] und des sctb ds[19x16x19] separat in die Schwanzvene von NOD-SCID
Mäusen injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurden Blutpro-
ben entnommen und Serum präpariert. In durchflusszytometrischen Analysen mit An-
tigen-positiven Zellen wurden die im Serum enthaltenen Antikörper-Derivate über
den Hexahistidin-tag nachgewiesen. Hierbei wurde die residuelle Bindung auf CD19-
Ergebnisse
69
positiven SEM, als auch auf CD16-transfizierten CHO Zellen überprüft. Das mittlere
Fluoreszenzsignal einer Blutprobe, die zum Zeitpunkt t0 = 1 min entnommen worden
war, wurde auf 100% gesetzt (Abbildung 28).
Abbildung 28: Vergleich der Plasmaverweildauer des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in Mäusen. Die beiden Antikörper-Fragmente wurden in äquimolaren Mengen den NOD-SCID Mäusen i.v. injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden den Mäusen Blutproben entnommen und Serum präpariert. Der relative Gehalt an sctb ds[19x16x19] (schwarze Vierecke) und bsscFv ds[19x16] (graue Dreiecke) im Serum wurde auf CD19-positiven SEM (A) und auf CD16-transfizierten CHO-Zellen (B) durchflusszytometrisch ermittelt. Die mittlere Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt t0 = 1min wurde auf 100% gesetzt und alle Datenpunkte auf diesen Wert normiert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten. Der sctb ds[19x16x19] war statistisch signifikant länger im Serum nachzuweisen als der bsscFv ds[19x16] (P < 0,05, *).
Aus den Messwerten wurden die Plasma-Halbwertszeiten berechnet. Die Plasma-
Halbwertszeit belief sich für den bsscFv ds[19x16] auf ca. 2 h. Die gemessenen Wer-
te betrugen 1,9 ± 0,2 h aus den Messungen mit SEM bzw. 1,9 ± 0,1 h aus den Mes-
sungen mit CD16-transfizierten CHO Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte der sctb
ds[19x16x19] eine statistisch signifikant erhöhte Halbwertszeit von ca. 4 h auf
(3,9 ± 0,6 h und 4,2 ± 0,3 h). Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass die Fu-
sion mit einem weiteren scFv und der damit verbundenen Vergrößerung der ur-
sprünglichen molekularen Masse von 59 kDa auf 89 kDa zu einer Verdopplung der
Plasmahalbwertszeit in vivo führte. Somit besitzt der sctb ds[19x16x19] auch
gewissen pharmakokinetische Vorteile gegenüber dem bsscFv ds[19x16].
Ergebnisse
70
4.2.8 Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den
sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]
Für den bsscFv ds[19x16] war bereits gezeigt worden, dass dieser mit humanen NK-
Zellen Antigen-spezifisch zelluläre Zytotoxizität gegenüber CD19-positiven Leukä-
mie- und Lymphomzellen vermittelte. Im Folgenden sollte das ADCC Potential des
sctb ds[19x16x19] untersucht werden. Insbesondere sollte in vergleichenden Experi-
menten analysiert werden, ob der im sctb ds[19x16x19] erzielte Aviditätsgewinn auch
zu einer erhöhten Zytotoxizität führte, wie dies bereits für die zweikettigen Fab-scFv
Fusionen demonstriert worden war.
4.2.8.1 Nachweis der Antigen-spezifischen Induktion der zellulären-Zytotoxizi-
tät durch den sctb ds[19x16x19]
Zunächst wurden das ADCC-Potential und die Antigen-spezifische Zytotoxizität des
sctb ds[19x16x19] in Blockierungsexperimenten analysiert. Der sctb ds[19x16x19]
wurden in einer Konzentration von 1 nM gegen die CD19-positiven SEM Zellen ein-
gesetzt. MNCs von gesunden Spendern waren die Effektorzellen (Abbildung 29). Zur
Kontrolle wurde der bispezifische sctb ds[7xds16x7] gegen CD7 mitgeführt. Dieses
Protein war analog konstruiert und war unter denselben Bedingungen wie der sctb
ds[19x16x19] exprimiert und aufgereinigt worden (Abbildung 29).
In einer Konzentration von 1 nM vermittelte der sctb ds[19x16x19] starke Lyse der
Tumorzellen, wobei die im Mittel maximal erzielte Lyse ca. 60% betrug. Dagegen
blieben der nicht-relevante bispezifische sctb ds[7xds16x7], wie auch die parentalen,
murinen, monoklonalen Antikörper gegen CD19 (mAk 4G7) und CD16 (mAk 3G8)
wirkungslos. Bei einer Zugabe eines 125-fach molaren Überschusses des mAk 4G7
wurde die Lyse statistisch signifikant blockiert (P = 0,011). Auch der mAk 3G8 inhi-
bierte die ADCC (0,004). Dagegen beeinflusste ein nichtrelevanter IgG1 Antikörper
nicht die durch den sctb ds[19x16x19] vermittelte Zytotoxizität (P = 0,45). Aus diesem
Ergebnis wurde geschlossen, dass die Tumorzelllyse Antigen-spezifisch war. Der
sctb ds[19x16x19] benötigte die Interaktion mit CD19 auf den Tumorzellen und dem
trigger Molekül CD16 auf den Effektorzellen, um ADCC auszulösen
Ergebnisse
71
Abbildung 29: Antigen-spezifische Induktion der ADCC durch den sctb ds[19x16x19]. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds[19x16x19] in einer Konzentration von 1 nM versetzt. Als Effektorzellen wurden MNCs gesunder Spender bei einem E:T Verhältnis von 40:1 eingesetzt, und die spezifische Lyse im 51Chrom-Freisetzungsexperiment analysiert. Der sctb ds[19x16x19] induzierte spezifische ADCC (P < 0,05;*). Der sctb [7xds16x7] und die parentalen monoklonalen Antikörper (mAk) 4G7 (anti-CD19) oder 3G8 (anti-CD16) zur Kontrolle lösten keine ADCC aus (P > 0,05). Durch Zugabe eines 120-fach molaren Überschusses der parentalen Antikörper wurde die sctb-vermittelte Lyse blockiert (P < 0,05;#), nicht aber durch einen nicht-relevanten IgG1 Antikörper. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
Nachdem die Antigen-spezifische Wirkung des sctb ds[19x16x19] nachgewiesen
worden war, wurde die Abhängigkeit der Zielzelllyse vom eingesetzten E:T-Verhältnis
analysiert. Zum Vergleich wurde der bsscFv ds[19x16] mitgeführt. Bei einer konstan-
ten Konzentration von 1 nM wurden die zytotoxischen Aktivitäten beider Moleküle ge-
genüber SEM Zellen bei verschiedenen E:T Verhältnissen analysiert. (Abbildung 30).
Zu beobachten war ein starker Zusammenhang zwischen der spezifischen Lyse und
dem eingesetzten E:T Verhältnis. So vermittelten der sctb ds[19x16x19] und der
bsscFv ds[19x16] zelluläre Zytotoxizität über einen weiten Bereich verschiedener E:T
Verhältnisse von 2,5:1 bis 80:1 (P < 0,05). Die Lyse stieg dabei in saturativer Weise
mit wachsenden E:T Verhältnissen an, wobei in Abwesenheit der MNCs keine Lysen
beobachtet wurden. Bemerkenswerter Weise war die Tendenz zu erkennen, dass
der sctb ds[19x16x19] bei allen getesteten E:T Verhältnissen höhere Lysen auslöste,
als der bsscFv ds[19x16]. Die Zelllyse war Antigen-spezifisch, da der nichtrelevante
sctb [7xds16x7] selbst bei hohen E:T Verhältnissen wirkungslos blieb (P > 0,05). Auf-
grund der Basalaktivität der Effektorzellen wurden auch in Abwesenheit eines Anti-
körpers schwache Lysen gemessen, die allerdings selbst bei hohen E:T Verhältnis-
sen bei unter 15% lagen. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass die Tu-
Ergebnisse
72
morzelllyse durch zelluläre Zytotoxizität ausgelöst wurde, da ein deutlicher Zusam-
menhang zwischen dem Ausmaß der Lyse und dem E:T Verhältnis bestand.
Abbildung 30: Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] in Abhäng-igkeit des E:T Verhältnisses. CD19-positive SEM Zellen wurden mit dem sctb ds[19x16x19] (schwarze Balken) oder dem bsscFv ds[19x16] (dunkelgraue Balken) in einer Konzentration von 1 nM versetzt und mit MNCs gesunder Spender bei unterschiedlichen E:T Verhältnissen inkubiert. In 51Cr-Freisetzungsexperimenten wurde die spezifische Lyse durch die bispezifischen Antikörper-Derivate gegenüber einem Ansatz mit MNCs in Abwesenheit eines Antikörpers ermittelt (weiße Balken; P < 0,05;*). Der Kontroll-sctb [7xds16x7] (hellgraue Balken) löste gegen die CD7-negativen SEM Zellen keine ADCC aus (P > 0,05). Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten.
4.2.8.2 Vergleichende Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxi-
zität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]
Im folgendem sollte untersucht werden, ob die Erweiterung des bsscFv ds[19x16] um
einen zweiten CD19 gerichteten scFv und der damit verbundene Aviditätsgewinn zu
einer Erhöhung der zytotoxischen Eigenschaften führte. Daher wurde das ADCC-Po-
tential beider Moleküle in vergleichenden Zytotoxizitätsexperimenten analysiert. Drei
CD19-positive Tumorzelllinien, die unterschiedliche B-Zell Neoplasien verschiedener
Reifungsstadien verkörperten, wurden als Zielzellen verwendet. SEM Zellen reprä-
sentierten eine Hoch-Risiko proB-ALL mit Translokation t(4;11), BV-173 eine B-Zell
Vorläufer Leukämie mit Translokation t(9;22) vom Mischlinien-Phänotyp (CD19- und
CD33-positiv). Beide Translokationen sind mit einer schlechten Prognose assoziiert.
ARH-77 stellte eine reifzellige, EBV-positive B-lymphoblastoide Zellline dar. Um mög-
liche aufreinigungsbedingte Qualitätsschwankungen der beiden rekombinanten Pro-
Ergebnisse
73
teine auszugleichen wurden die Versuche für jede Zelllinie mit Protein aus min-
destens 3 verschiedenen Produktionen durchgeführt. Sowohl der sctb ds[19x16x19]
als auch der bsscFv ds[19x16] vermittelten konzentrationsabhängig Zytotoxizität
gegenüber allen drei untersuchten Zelllinien (Abbildung 31). In allen drei Fällen war
der sctb ds[19x16x19] effizienter als der bsscFv ds[19x16] und induzierte gleich hohe
Lysen in niedrigeren Konzentrationen. Im Gegensatz dazu blieben die zur Kontrolle
eingesetzten sctb [7xds16x7] und bsscFv [7xds16] auch in hohen Konzentrationen
wirkungslos.
Abbildung 31: Dosis-abhängige Vermittlung der Lyse humaner Tumorzelllinien durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Die Zell-vermittelte zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] (schwarzes Quadrate) und des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) gegenüber den CD19-positiven Zelllinien SEM (A), BV-173 (B) und ARH-77 (C) wurde in 51Cr-Freisetzungs-Experimenten analysiert. MNCs gesunder Spender wurden als Effektoren eingesetzt (E:T = 40:1 ein-gesetzt. Der sctb [7xds16x7] (schwarze Kreise) und der bsscFv [7xds16] (graue offene Kreise) blieben wirkungslos. Statistisch signifikante Lysen (P < 0,05) gegenüber der Basalaktivität der MNCs sind mit einem Stern (*) markiert. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus 4-6 unabhängigen Ex-perimenten. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den induzierten Lysen durch den ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] sind gekennzeichnet (P < 0,05; #).
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die EC50-Werte für den sctb ds[19x16x19]
und den bsscFv ds[19x16] berechnet (Tabelle 8). Die EC50-Werte des sctb
Ergebnisse
74
ds[19x16x19] lagen im picomolaren Bereich und waren statistisch signifikant niedri-
ger als die des bsscFv ds[19x16]. Der sctb ds[19x16x19] lysierte die SEM Zellen mit
einem EC50-Wert von 4,1 pM. Der bsscFv ds[19x16] dagegen benötigte eine 27,7-
fach höhere Konzentration, um eine halbmaximale Lyse zu erzielen
(EC50 = 113,6 pM). Gegen die Zelllinien BV-173 und ARH-77 induzierte der sctb
ds[19x16x19] in 26,3 und 44,0-fach niedriger Konzentration als der bsscFv ds[19x16]
eine halbmaximale Lyse. Dies zeigte, dass der Aviditätsgewinn um den Faktor 3 im
sctb ds[19x16x19] gegenüber dem bsscFv ds[19x16] zu einem deutlich gesteigerten
ADCC-Potential führte. Somit war das Konzept des bivalenten Anvisierens der Tu-
morzellen auf die einkettigen bispezifischen Formate übertragbar.
Tabelle 8: EC50-Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit CD19-positiven Zelllinien
Zelllinie sctb [pM] (95% CI) bsscFv [pM] (95% CI) Unterschied P-Wert*
SEM 4,1 (2,8 - 6,0) 113,6 (24,5 – 526,3) 27,7 x 0,004
BV-173 28,6 (18,0 – 45,3) 753,3 (445,1 – 1 274) 26,3 x 0,001
ARH-77 29,0 (17,7 – 47,6) 1 277 (587,2 – 2 777) 44,0 x 0,006
* statistisch signifikante Unterschiede der log EC50-Werte; CI, Konfidenzintervall (convidence interval).
4.2.8.3 Zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16]
gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen
Primäre Tumorzellen sind im Allgemeinen schwieriger zu lysieren als etablierte Zellli-
nien. Daher sollte auch die Fähigkeit des rekombinanten sctb ds[19x16x19], ADCC
gegenüber primären humanen Tumorzellen aus Patienten zu vermitteln, untersucht
werden. Hierzu wurden Tumorzellen aus dem peripheren Blut (PB), oder aus dem
Knochenmark (KM) von elf unterschiedlichen Patienten aufgereinigt (Abbildung 32).
Neun dieser Patienten waren mit einer B-CLL, einer mit einem Mantelzell-Lymphom
(MCL) und einer mit einer B-ALL diagnostiziert worden. Die CD19-Expression auf
den malignen Zellen wurde durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Die isolierten
malignen Zellen wurden in Zytotoxizitätstests mit MNCs gesunder Spender als Effek-
toren bei einem E:T Verhältnis von 40:1 als Zielzellen eingesetzt.
Ergebnisse
75
Abbildung 32: Vermittlung der ADCC gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16]. Der sctb ds[19x16x19] (schwarze Balken) und der bsscFv ds[19x16] (weiße Balken) induzieren potente ADCC gegenüber primären Zellen, die aus dem peripherem Blut (PB), oder dem Knochenmark (KM) verschiedener Leukämie- oder Lymphompatien-ten isoliert wurden. Die Antikörper-Derivate wurden in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Ef-fektorzellen waren MNCs gesunder Spender (E:T = 40:1). Die Antikörper-vermittelte Lyse wurde in 51Cr-Freisetzungsexperimenten gemessen. Die Basallyse der MNCs (hellgraue Balken) lag bei unter 10%. Der sctb [7xds16x7] (dunkelgraue Balken) löste keine ADCC aus. Die Ergebnisse repräsentieren Mittelwerte ± SEM aus Triplikatbestimmungen. B-CLL, chronische B-lymphatische Leukämie, B-ALL, akute B-lymphatische Leukämie; MCL, Mantelzelllymphom.
Der sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16] lysierten bei einer Konzentration
von 1 nM die primären Tumorzellen (Abbildung 4.23). Auch hier war die Tendenz zu
erkennen, dass der sctb ds[19x16x19] in allen elf Fällen höhere Lysen induzierte, als
der bsscFv. Da der sctb [7xds16x7] keine Zelllyse auslöste, war der gemessene Ef-
fekt CD19-spezifisch. Die Basallyse durch die MNCs in einem Ansatz ohne Antikör-
per lag dabei stets bei unter 10%. Mit den isolierten Zellen der B-CLL Patienten 1-4
wurden Dosis-Wirkungskurven erstellt (Abbildung 33). Für die Probe eines jeden Pa-
tienten wurden MNCs von mindestens drei unabhängigen, gesunden Spendern bei
einem konstanten E:T von 40:1 eingesetzt.
Ergebnisse
76
Abbildung 33: Dosis-abhängige ADCC durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscFv ds[19x16] gegen primäre Tumorzellen. Die Zell-vermittelte zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] (schwarze Quadrate) und des bsscFv ds[19x16] (graue offene Dreiecke) gegenüber primären Zellen 4 verschiedener B-CLL Patienten wurde mit MNCs gesunder Spender bei einem E:T Verhältnis von 40:1 analysiert. Der sctb [7xds16x7] (schwarze offene Kreise) blieb wirkungslos. Die Ergebnisse re-präsentieren Mittelwerte ± SEM aus 3-6 unabhängigen Experimenten. *Statistisch signifikante Unter-schiede in der ADCC gegenüber Basallyse der MNCs; #statistisch signifikante Unterschiede in der ADCC durch den sctb ds[19x16x19] gegenüber dem bsscFv ds[19x16].
Der sctb ds[19x16x19] und der bsscFv ds[19x16x19] vermittelten Dosis-abhängige
Lyse der primären Tumorzellen aller vier Patienten. Der sctb [7xds16xds7] als Kon-
trolle blieb dagegen auch bei hohen Konzentrationen wirkungslos (P > 0,05). Wie in
ADCC Experimenten mit Zelllinien vermittelte der sctb ds[19x16x19] auch hier in we-
sentlich geringeren Konzentrationen gleich hohe Lysen als der bsscFv ds[19x16].
Aus den Dosis-Wirkungskurven wurden die EC50-Werte berechnet. Der sctb
ds[19x16x19] vermittelte gegenüber primären malignen Zellen ADCC mit EC50-Wer-
ten in niedrig-picomolaren Konzentrationen und induzierte halbmaximale Lysen in
11- bis 21-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscFv ds[19x16] (Tabelle 9).
Diese Werte lagen in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Zytotoxi-
zitätsexperimenten mit Tumor-abgeleiteten Zelllinien als Zielzellen.
Ergebnisse
77
Tabelle 9: EC50 Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscFv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit primären B-CLL Zellen
* statistisch signifikante Unterschiede der log EC50-Werte; CI, Konfidenzintervall ( convidence interval).
Das hier neu entwickelte Format eines rekombinanten single-chain Fv triple-bodys
bietet eine einfache Möglichkeit, drei scFv Leseköpfe in einer einzigen Polypeptidket-
te zu kombinieren. Das Prinzip wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals mit dem
Prototyp ds[19x16x19], mit zwei scFv Leseköpfen gegen CD19 und einem scFv Le-
sekopf gegen CD16, etabliert und funktionell bewertet. Die zwei scFv Leseköpfe für
CD19 waren beide funktional und an der Bindung des Moleküls an intakten, CD19-
positiven Zellen beteiligt. Daraus resultierte eine 3-fach höhere Avidität gegenüber
der Affinität des monovalenten Vergleichsmoleküls bsscFv ds[19x16], das aus den
gleichen genetischen Elementen bestand. Durch das bivalente Anvisieren der Tu-
morzellen erzielte der sctb ds[19x16x19] ein 10- bis 40-fach höheres zytotoxisches
Potential als der monovalente bsscFv ds[19x16], und weist darüber hinaus verbes-
serte pharmakokinetische Eigenschaften auf. Somit besitzt dieser sctb ds[19x16x19]
eine hohe biologische Aktivität und stellt gegenüber dem bsscFv ds[19x16] eine deu-
tliche Verbesserung dar.
B-CLL Zellen sctb [pM] (95% CI) bsscFv [pM] (95% CI) Unterschied P-Wert*
1 20,4 (9,2 – 44,9) 416,4 (277,1 – 625,8) 20,4 x 0,028
2 194,5 (31,2 – 350,2) 2117 (964,1 – 4646) 20,3 x 0,009
3 37,2 (18,2 – 77,6) 425,4 (202,4 – 894,4) 11,4 x 0,014
4 13,7 (6,4 – 26,6) 294,3 (154,3 – 561,3) 21,5 x <0,001
Diskussion
78
5 Diskussion
Mit Verbesserungen in den Chemotherapie-Protokollen und Fortschritten in der
Transplantationsmedizin wurden in den letzten Jahren deutliche Erfolge in der The-
rapie hämatologischer Neoplasien erzielt. Starke Nebenwirkungen und auftretende
Rezidive stellen jedoch nach wie vor ein großes Problem dar, und bestimmte Subty-
pen von Leukämien und Lymphomen sind weiterhin nur schwer heilbar. Ein innovati-
ver Ansatz ist der Einbezug von therapeutischen Antikörpern, die einen zielge-
richteten Angriff auf die Tumorzellen ermöglichen. Die monoklonalen Antikörper Ritu-
ximab und Alemtuzumab zeigten bislang beachtliche Erfolge in der Behandlung von
NHL bzw. B-CLL Patienten und verdeutlichen das hohe Potential Antikörper-basierter
Strategien in der Krebstherapie (Adams und Weiner, 2005). Doch auch eine Behand-
lung mit konventionellen monoklonalen Antikörpern ist mit Limitierungen verbunden.
So blieben monoklonale Antikörper gegen das attraktive Zielantigen CD19 bislang
klinisch erfolglos, so dass ein CD19-gerichtetes Antikörper-basiertes Therapeutikum
noch nicht zum klinischen Einsatz zugelassen ist. In der Arbeitsgruppe wurde ein bi-
spezifischer tandem bsscFv ds[19x16] entwickelt, der in vitro eine hohe Zytotoxizität
gegen humane Leukämie- und Lymphomzellen mit NK-Zellen vermittelte (Bruenke et
al, 2005). Da die ADCC einen klinisch relevanten Mechanismus therapeutischer Anti-
körper darstellt, ist auch eine Verbesserung des ADCC Potentials bispezifischer Anti-
körper sinnvoll. Eine Möglichkeit, dieses zu steigern, besteht darin, die funktionale
Affinität für das Tumorantigen zu erhöhen, wie für andere Antigene beschrieben
wurde (Shahied et al, 2004).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rekombinante bispezifische Antikörper-Deriva-
te mit zwei Leseköpfen für CD19 hergestellt, um durch ein bivalentes Anvisieren der
Tumorzellen das ADCC Potential zu steigern. Die Erweiterung eines chimären CD19
Fab Fragments mit je einem CD19 und einem CD16 scFv resultierte im zweikettigen,
bispezifischen tribody [Fab19xds19xds16]. Aus den gleichen Bindedomänen wurde
der für CD19 monovalente, bispezifische bibody [Fab19xds16] hergestellt. Diese bi-
spezifischen Antikörper-Derivate wurden eukaryotisch exprimiert und auf relevante
Eigenschaften wie Affinität/Avidität, Stabilität und Zytotoxizität analysiert. Im direkten
Vergleich zwischen dem bstb [Fab19xds19xds16], bsbb [Fab19xds16] und bsscFv
ds[19x16], ergab sich eine Verbesserung im zytotoxischen Potential mit steigender
Diskussion
79
funktionaler Affinität für CD19. Hierdurch wurde das bivalente Anvisieren der Tumor-
zellen als wirkungsvolles Konzept zur Steigerung der Zytotoxizität bispezifischer Anti-
körper gegen CD19 bestätigt. So wies der bstb [Fab19xds19xds16] eine etwa 5-fach
höhere Avidität als der bsscFv ds[19x16] auf und besaß eine etwa 12-fach höhere
Zytotoxizität. In einem zweiten Ansatz wurden der bsscFv ds[19x16] durch geneti-
sche Fusion mit einem zweiten CD19 scFv erweitert. Dieser single-chain Fv triple-
body ds[19x16x19] stellte einen Prototyp für ein neues Format Antikörper-abgeleite-
ter Proteine dar, das drei scFv Leseköpfe in einer einzigen Polypeptidkette vereinig-
te. Der sctb ds[19x16x19] wurde eukaryotisch exprimiert, aufgereinigt, und auf die Ei-
genschaften Stabilität, Bindungsstärke und Zytotoxizität untersucht. Mit einer 3-fach
höheren Avidität für CD19 wies dieses Molekül eine 10- bis 40-fach höhere Zytotoxi-
zität als der bsscFv ds[19x16] auf. Zusätzlich führte die Vergrößerung der molekula-
ren Masse zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften des Moleküls. Auf-
grund dieser Ergebnisse ist das Format eines single-chain Fv triple-bodys attraktiv
und kann vermutlich auch auf andere Kombinationen verschiedener Tumor- oder Ef-
fektorzellantigene übertragen werden.
Rekombinante bispezifische Antikörper als als attraktive Wirkstoffmoleküle
Die Verwendung bispezifischer Antikörper zur Induktion einer anti-tumoralen Immun-
antwort durch körpereigene Immunzellen stellt ein attraktives Konzept dar. Bispezifi-
sche Antikörper weisen eine höhere Zytotoxizität als monoklonale Antikörper auf und
erlauben es, gezielt bestimmte, einschließlich nicht Fc-Rezeptor tragender Effektor-
zellpopulationen, selektiv anzusteuern. Bei entsprechender Auswahl bindender Do-
mänen gegen trigger Moleküle auf den Effektorzellen können bispezifische Antikör-
per einer Kompetition mit endogenen IgG Molekülen und einer Interaktion mit nicht-
signalisierenden oder inhibitorischen Fc-Rezeptoren entgehen (Peipp und Valerius,
2002). Nach anfänglichen enttäuschenden Ergebnissen in ersten klinischen Studien
wurde das Interesse durch die Entwicklung neuer rekombinanter Formate erneut ge-
weckt (Muller und Kontermann, 2007). Als Bindedomänen finden dabei meist scFv
oder Fab Fragmente Anwendung, die im Vergleich zu ganzen Antikörpern eine redu-
zierte Immunogenität aufweisen. Dennoch ist bislang kein bispezifischer Antikörper
von der FDA zum klinischen Einsatz zugelassen, und weitere Verbesserungen in den
Diskussion
80
Formaten sind notwendig, die den therapeutischen Nutzen dieser Moleküle steigern.
Dieser wird nachhaltig durch die kritischen Parameter Stabilität, Größe und Affinität
bzw. Avidität der Moleküle bestimmt.
Erhöhung der Stabilität bispezifischer Antikörper-Derivate durch Disulfidstabilisierung
Die Stabilität in humanem Serum beeinflusst maßgeblich den therapeutischen Nut-
zen Antikörper-abgeleiteter Therapeutika. Zur effizienten Rekrutierung der Effektor-
zellen müssen bispezifische Antikörper eine genügend hohe Stabilität im Blut aufwei-
sen, die bei scFv Fragmenten oft nicht ausreichend ist. Dies ist eher durch eine De-
naturierung, als durch eine proteolytische Degradation zu erklären. Eine Möglichkeit
eine Denaturierung zu verhindern bietet das Einführen einer intramolekularen Disul-
fidbrücke zwischen der variablen leichten und schweren Kette in einem Fv Fragment
(Brinkmann et al, 1993; Reiter et al, 1994). Dies wurde zur Stabilisierung von scFvs,
Immuntoxinen und insbesondere auch zur Stabilisierung des tandem bsscFvs
[19x16] erfolgreich angewandt, ohne dass die biologischen Eigenschaften wie Spezi-
fität, Affinität und Zytotoxizität beeinflusst wurden (Bruenke et al, 2005). Aufgrund
dieses Ergebnisses wurden auch zur Konstruktion der zweikettigen Fab-scFv Fusio-
nen und des scFv triple-bodys die disulfidstabilisierten scFv Varianten verwendet und
das Konzept erstmals auf diese Formate übertragen. Obwohl das Vorhandensein
freier Cysteine durch entstehende Falschpaarungen und folgender Bildung hochmo-
lekularer und funktionsloser Aggregate zu Komplikationen führen kann, wurden diese
Probleme bei keinem der Moleküle beobachtet. Als Resultat wurden Moleküle mit
sehr hoher Stabilität erhalten, wobei die gemessenen Halbwertszeiten bei 100 h oder
höher lagen. Diese sollten in Hinblick auf die kurze in vivo Plasmaretentionszeit von
einigen wenigen Stunden nicht limitierend sein. Als besonders stabil erwies sich das
CD19 Fab Fragment mit einer Halbwertszeit von 160 h. Die disulfidstabilisierten scFv
Fragmente im tribody, bibody und scFv triple-body waren deutlich stabiler als ihre
nicht stabilisierten Varianten im bsscFv [19x16] (Bruenke et al, 2005), woraus ge-
schlossen wurde, dass sich zumindest in einem Teil der Moleküle die stabilisierende
Disulfidbrücke ausgebildet hatte. Insbesondere die Stabilität des ds CD16 scFvs vari-
ierte stark unter den Formaten. So beeinflusste die gleichzeitige Anwesenheit des
CD19 scFvs die residuelle Bindung des Moleküls an CD16, sowohl im triple-body, als
auch im tribody, wie aus dem Vergleich mit den entsprechenden CD19-monovalen-
ten Molekülen ersichtlich wurde. Gründe könnten eine nicht vollständige Ausbildung
Diskussion
81
der Disulfidbrücken im CD16 scFv in diesen Molekülen sein. Auch könnte eine Dena-
turierung des ds CD19 scFvs, für den eine Halbwertszeit von 70 h im bsscFv
ds[19x16] gemessen wurde, die Bindung des Moleküls an CD16 beeinflussen.
Die molekulare Größe als kritischer Parameter für bispezifische Antikörper-Derivate
Bispezifische Antikörperfragmente wie diabodies, single-chain diabodies oder tan-
dem bsscFvs werden aufgrund ihrer geringen Größe rasch aus dem Blutstrom über
die Nieren eliminiert, und besitzen demnach nur eine kurze Verweildauer im Blut in
vivo, die eine ausreichende Akkumulation der Moleküle im Tumorgewebe verhindert.
Die verlängerte Plasmaretentionszeit in Mäusen für den sctb ds[19x16x19] gegen-
über dem bsscFv ds[19x16] ist als das Ergebnis der Vergrößerung des Moleküls zu
sehen. Vermutlich war die Verdopplung der Halbwertszeit von 2 h auf 4 h das maxi-
male, was durch eine Vergrößerung der molekularen Masse von 60 auf 90 kDa zu
erwarten war. Für den tribody mit einer molekularen Masse von 110 kDa wurde die
Plasmaretentionszeit in vivo nicht bestimmt, liegt aber vermutlich ebenfalls in dem
Bereich von einigen wenigen Stunden. Die gemessenen Werte für den sctb und den
bsscFv liegen in der gleichen Größenordnung, die für andere Antikörperfragmente
vergleichbarer Größe berichtet wurden. Eine Halbwertszeit von 4 h mag dennoch
nicht ausreichend sein, um eine gute tumorspezifische Anreicherung des Therapeuti-
kums in vivo zu erzielen. Somit verbesserte eine Vergrößerung des Moleküls zwar
die pharmakokinetischen Eigenschaften, die aber immer noch nicht als optimal anzu-
sehen sind. Inzwischen wurden weitere Maßnahmen beschrieben, die die Plasmare-
tentionszeit kleiner bispezifischer Antikörper-Derivate verlängern. Eine elegante Lö-
sung liegt darin, die Moleküle so zu modifizieren, dass eine Rezirkularisation über
den FcRn, analog zu intakten IgG Antikörpern, möglich wird. Dies kann durch Fusion
des Antikörper-Derivates mit Proteinen, die an humanes Serum Albumin (HSA) bin-
den, oder mit HSA selbst erzielt werden (Muller et al, 2007). Auf diese Weise wurde
die Plasmaverweildauer bispezifischer Antikörperfragmente verschiedener Formate
drastisch verbessert. Somit könnte durch eine Fusion des sctb ds[19x16x19] an HSA
oder an Domänen dieses Proteins die Plasmaverweildauer des Moleküls in vivo
deutlich verlängert werden.
Diskussion
82
Erhöhung der zellulären Zytotoxizität durch bivalentes Anvisieren der Tumorzellen
Aufgrund einer schnellen Eliminationsrate ist es insbesondere für die kleinen bispezi-
fischen Antikörper-Derivate wichtig, in einer kurzen Zeit eine therapeutische Wirkung
zu erzielen. Hierbei spielt die funktionale Affinität für das Zielantigen eine wichtige
Rolle. Diese beeinflusst sowohl das zytotoxische Potential in vitro als auch die spezi-
fische Anreicherung des Moleküls im Tumorgewebe in vivo (McCall et al, 2001;
Shahied et al, 2004; Tang et al, 2007). Die Bindungsstärke kann dabei sowohl durch
eine Erhöhung der intrinsischen Affinität oder durch Erhöhung der Valenz erfolgen.
Beide Maßnahmen führen zu einer höheren Zytotoxizität, wie für bispezifische Anti-
körper gegen das Zielantigen Her-2/neu auf Brustkrebszellen gezeigt wurde
(Shahied et al, 2004). Bei soliden Tumoren kann eine zu hohe Affinität allerdings
auch kontraproduktiv sein, da diese Moleküle nur in Randbereiche des Tumors ein-
dringen und sich in den hochvaskularisierten Bereichen akkumulieren (Adams et al,
2001; Weinstein et al, 1987).
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei bispezifische Antikörperderivate mit bivalenter
Bindung für das Tumorantigen CD19 entwickelt, die gegenüber den monovalenten
Vergleichsmolekülen eine ca. 3-fach höhere Avidität aufwiesen. Mit gemessenen Avi-
ditäten von 8 bzw. 13 nM erreichten der tribody [Fab19xds19xds16] und der sctb ds
[19x16x19] fast das Niveau des chimären 4G7 Antikörpers, der eine Avidität von et-
wa 5 nM aufwies (Barbin et al, 2006). Die gegenüber den monovalenten Vergleichs-
molekülen erzielten Aviditätsgewinne sind, gemessen an publizierten Ergebnissen,
als gut einzustufen und bewegten sich in vergleichbarer Größenordnung. So wurde
eine 1,7-fach höhere Avidität bei einem CD19 spezifischen bivalenten diabody im
Vergleich zu dem entsprechenden monovalenten scFv gemessen (Le Gall et al,
1999). Durch Konvertierung eines bispezifischen single-chain diabodys gegen CD19
und CD3 in das tetravalente Format eines tandab, mit jeweils zwei Leseköpfen für
beide Antigene, wurde ein Aviditätsgewinn für CD19 um den Faktor 2,2 erzielt
(Kipriyanov et al, 1999).
Bemerkenswerterweise besaß der ds CD16 scFv in allen vier analysierten Molekülen
eine vergleichbare Affinität von etwa 60 nM. Dadurch wurde das Gleichgewicht der
Bindstärken zu Gunsten der Tumorzellen verschoben. Auch eine zu hohe Affinität
für das Effektorzellantigen gegenüber der Affinität für das Tumorantigen kann sich
ungünstig auf das zytotoxische Potential auswirken (Bortoletto et al, 2002). Dies
könnte in vivo dazu führen, dass das Therapeutikum von den Effektorzellen abge-
Diskussion
83
fangen würde, bevor es das erkrankte Gewebe erreicht, wodurch eine Anreicherung
des Moleküls im Tumorgewebe und damit die Tumorzelllyse beeinträchtigt werden
würde.
Dennoch bestand die theoretische Möglichkeit, dass nur einer der beiden CD19-spe-
zifischen scFv Komponenten im sctb ds[19x16x19] an das Antigen band, allerdings
mit einer 3-fach höheren Affinität, als der entsprechende scFv im bsscFv ds[19x16].
Allerdings wurde die Affinität des CD19 scFvs im sctb [33xds16xds19] mit 40 nM be-
stimmt und entsprach damit näherungsweise dem Wert, der auch für diesen scFv im
bsscFv ds[19x16] gemessen wurde (Ingo Schubert, unpubliziert). Dadurch konnte die
Möglichkeit, dass der sctb ds[19x16x19] nur monovalent, aber mit einer 3-fach höhe-
ren Affinität durch einen Format-assoziierten Effekt an CD19 band, formal ausge-
schlossen werden.
Diese Ergebnisse belegen, dass beide CD19 Leseköpfe im sctb ds[19x16x19] und im
tribody [Fab19xds19xds16] an der Bindung an CD19 beteiligt sind. Jedoch bleibt die
Frage, ob ein Aviditätsgewinn um den Faktor 3 das Maximale ist, was zu erzielen ist.
Es ist nicht sicher, ob die Anordnung der CD19 Moleküle auf den Zellen, und die
dreidimensionale Struktur dieser Antikörper-Derivate eine gleichzeitige Bindung der
CD19 Leseköpfe an zwei Moleküle CD19 auf einer Zielzelle zulässt. Daher ist die
bestmögliche mechanistische Erklärung derzeit, dass die zusätzliche zweite Binde-
stelle für CD19 die über die Zeit gemittelte Wahrscheinlichkeit dreifach erhöht, dass
zumindest einer der beiden CD19 Leseköpfe an die Tumorzellen gebunden ist.
In Betracht gezogen werden muss auch die Möglichkeit, dass zwei CD19 Moleküle
aufgrund ihrer molekularen Architektur, oder des sie umgebenden Mikromilieus auf
der Zelloberfläche, nur auf eine bestimmte minimale Distanz zueinander angenähert
werden könnten. Dies könnte letztlich eine simultane Bindung zweier CD19 Moleküle
auf der Zelloberfläche ausschließen. In diesem Fall könnte eine Vergrößerung des
Abstands zwischen den beiden CD19 Leseköpfen eine weitere Aviditätssteigerung
bringen. In vorliegender Arbeit wurden jedoch keine Anstrengungen unternommen
die Länge der linker zu optimieren. Auch ist eine Steigerung der funktionalen Affinität
durch eine Erhöhung der Zahl der Leseköpfe von der ursprünglichen intrinsischen Af-
finität der verwendeten Antigen-bindenden Domänen abhängig. Je höher diese ist,
desto geringer wird auch der Effekt eines Aviditätsgewinnes sein (Tang et al, 2007).
Allerdings waren die Affinitäten des CD19 scFvs im bsscFv und des CD19 Fab Frag-
Diskussion
84
ments im bibody im niedrig-nanomolaren Bereich, und daher erscheint eine weitere
Steigerung der Avidität um mehr als das 3-fache als nicht ausgeschlossen.
Vorliegende Arbeit beruhte auf der Hypothese, dass durch bivalentes Anvisieren der
Leukämie- und Lymphomzellen ein gesteigertes zytotoxisches Potential bispezifi-
scher CD19-gerichteter Antikörper erzielt wird. Diese Hypothese wurde in den ver-
gleichenden Zytotoxizitätsmessungen bestätigt. In diesen ergab sich eine deutliche
Steigerung der Zytotoxizität mit steigender Affinität bzw. Avidität für das Tumoranti-
gen. Der bstb [Fab19xds19xds16] zeigte im Vergleich zum bsbb [Fab19xds16] bei ei-
ner 3-fach höheren Avidität eine 6-fach höhere Zytotoxizität. Gegenüber dem bsscFv
ds[19x16] wies der bstb [Fab19xds19xds16] eine 5-fach höhere Avidität auf, die sich
in einer 12-fach höheren Zytotoxizität manifestierte. Auch beim Vergleich der einketti-
gen Moleküle war eine überproportionale Steigerung im ADCC-Potential zu erken-
nen. Mit einer 3-fach höheren Avidität wies der sctb ds[19x16x19] ein 10- bis 40-fach
höheres zytotoxisches Potential auf als der bsscFv ds[19x16].
Ein direkter Vergleich zwischen dem scFv triple-body und dem tribody wurde bislang
noch nicht durchgeführt. Aus den bisherigen Daten ist keine endgültige Aussage zu
treffen, welches dieser beiden Moleküle das höhere ADCC-Potential besitzt. Anhand
eines indirekten Vergleichs der Zytotoxizitäten gegenüber SEM Zellen, in Relation
zum bsscFv ds[19x16], scheint das einkettige Molekül gewisse Vorteile zu besitzen,
obwohl dieses die niedrigere Avidität für CD19 aufwies. Allerdings könnten sich auch
sterische und Format-assoziierte Faktoren, die zum Beispiel die Ausbildung der im-
munologischen Synapse beeinflussen könnten, auf die Zytotoxizität eines Moleküls
auswirken. Weiterführende Versuche zum Vergleich dieser beiden Moleküle sind in
Planung.
Gegenwärtig wird vermutet, dass die Stärke einer ADCC Reaktion, die von unter-
schiedlichen Kombinationen an Tumor- und Effektormolekülen erzielt wird, die Leich-
tigkeit der Ausbildung und Aufrechterhaltung der immunologischen Synapse zwi-
schen der Tumor- und der Effektorzelle widerspiegelt. Insofern ist zu vermuten, dass
die erhöhten ADCC Effekte aufgrund einer effektiveren Formation der immunologi-
schen Synapsen zu Stande kamen. Eine weitere Erklärung ist, dass das bivalente
Anvisieren der Tumorzellen dazu führt, dass die Moleküle bevorzugt zuerst an die
Tumorzellen und nicht an die Effektorzellen binden. Bei physiologischer Temperatur
war zusätzlich die Verweildauer der Moleküle mit zwei Leseköpfen für CD19 auf der
Zelloberfläche der Tumorzellen deutlich verlängert, wohingegen sie von den Effektor-
Diskussion
85
zellen schnell wieder dissoziierten. Diese Faktoren erhöhen die Wahrscheinlichkeit,
dass die Moleküle von der Zelloberfläche der Tumorzellen aus die Effektorzellen ak-
tivieren können. Insbesondere bei leichter Antigenexpression, niedrigem Effektor-zu-
Zielzell-Verhältnis oder bei geringer Antikörperkonzentration könnten Aviditätseffekte
von besonders wichtiger Bedeutung sein.
Der scFv triple-body als neues Format für trivalente Antikörper-Derivate
Eine lineare Anordnung von drei scFv Fragmenten innerhalb einer einzigen Polypep-
tidkette ist bislang in der Literatur noch nicht beschrieben. Zwar wurden in der Ver-
gangenheit bereits Formate entwickelt, die eine Kombination von drei oder mehreren
Leseköpfen ermöglichten, allerdings waren diese weitgehend zweikettige Moleküle
(Muller und Kontermann, 2007). In diesen Fällen waren oft weitere Aufreinigungs-
schritte zur Trennung von Homo- und Heterodimeren notwendig, die aufwendig und
teuer sind. Zwar wurden Methoden entwickelt, die eine korrekte Paarung zweier un-
terschiedlicher Polypeptidketten durch Einführung von Heterodimerisierungsdomä-
nen begünstigten. Allerdings ist für eine effiziente Produktion eine möglichst äquimo-
lare Expression und Sekretion der beiden Ketten eine Voraussetzung, die nicht im-
mer erreicht werden kann. So wurden auch im Rahmen dieser Arbeit gewisse Vortei-
le in der Produktion der einkettigen Proteine gegenüber den zweikettigen beobachtet.
Ein neuer Aspekt des Formates eines sctb ist, dass ein einkettiges Polypeptid gleich-
starke biologische Effekte erzielen kann. Ein trispezifisches Antikörperderivat aus
drei linear angeordneten Antigen-bindenden Domänen wurde bereits in der Literatur
beschrieben, allerdings besteht dieses aus zwei scFv Fragmenten und einer VH Do-
mäne. Dieses Format ist folglich dem eines scFv triple-bodys verschieden, und ist
vermutlich nicht generalisiert anwendbar, da VH Domänen ohne Paarung mit einer
VL Domäne oft nicht ihre Bindungseigenschaften bewahren.
Nach bisherigen Erkenntnissen sollten bispezifische Antikörper folgende Kriterien er-
füllen: Sie sollten (1) keinen Fc-Teil besitzen, (2) das Effektorzellantigen mit modera-
ter, das Tumorzellantigen mit hoher funktionaler Affinität binden, (3) leicht und in aus-
reichender Menge herzustellen sein und (4) eine mittlere molekulare Größe besitzen.
Das hier neu entwickelte Format eines scFv triple-bodys erfüllt weitgehend diese Kri-
terien, und sollte auch über eine Kombination von CD19 und CD16 hinaus auf ande-
re Kombinationen verschiedener Tumor- und Effektorzellantigene übertragbar sein.
Diskussion
86
So wurden bislang scFv triple-bodies aus unterschiedlichen scFv Leseköpfen
hergestellt. Diese schließen Spezifitäten für die Tumorzellantigene CD7, CD13 (C.
Kellner, unpubliziert), CD33 (H. Singer, unpubliziert), sowie gegen die Effektorzellan-
tigene CD64 und CD89 mit ein (C. Stein, unpubliziert). Eine Evaluierung des
zytotoxischen Potentials dieser Moleküle steht allerdings noch aus.
Zusammenfassend bietet das scFv triple-body Format eine einfache Möglichkeit zur
Herstellung trivalenter Moleküle. Verglichen mit den hier gezeigten Daten für den
bsscFv ds[19x16], aber auch mit den Resultaten, die mit anderen bsscFvs in vorher-
gegangenen Studien in der Arbeitsgruppe erhalten wurden, zeigt sich eindeutig, dass
der sctb eine klare Verbesserung in der biologischen Aktivität gegenüber dem
bsscFv darstellt. Das scFv triple-body Format gestattet auch eine Kombination drei
verschiedener Spezifitäten in einer Polypeptidkette, die in diesem Format unab-
hängig und simultan mit den jeweiligen Antigenen reagieren können, wie durch eine
Kombination der scFvs gegen CD19, CD33 und CD16 gezeigt wurde. Dies bietet
weiterhin die Möglichkeit, entweder zwei verschiedene Antigene auf den Tumorzellen
(duales Anvisieren), oder durch entsprechende Wahl der Antigene, zwei unterschied-
liche Effektorzellpopulationen, wie z.B. NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen zu re-
krutieren. Entsprechende Untersuchungen sind in der Arbeitsgruppe geplant.
NK-Zellen als attraktive Effektorzellpopulation
Den NK-Zellen des angeborenen Immunsystems wird eine tragende Rolle in der Im-
munüberwachung von Tumoren zugeschrieben (Talmadge et al, 1980). Da sich NK-
Zellen in der Regel in einem konstitutiv aktivierten Zustand befinden, benötigen sie
keine zusätzliche Stimulation und stellen aufgrund ihres hohen zytotoxischen Potenti-
als eine sehr attraktive Effektorzellpopulation dar (Segal et al, 1999). Zwar wurde im
Rahmen dieser Arbeit die letztlich wirksame Effektorzellpopulation nicht eindeutig
identifiziert, allerdings ist zu vermuten dass die ADCC-Aktivität der hier vorgestellten
Moleküle in vitro durch NK-Zellen vermittelt wurde, obwohl auch Makrophagen CD16
exprimieren und ADCC ausüben können (van Ojik und Valerius, 2001; Weiner et al,
1995). Allerdings sind Makrophagen, die sich hauptsächlich im Gewebe ansiedeln,
weitgehend nicht in den MNC Fraktionen aus dem peripheren Blut enthalten, die in
den ADCC Reaktionen dieser Arbeit eingesetzt wurden. Die monozytären Vorläufer-
Diskussion
87
zellen im peripheren Blut exprimieren meist keine signifikante Menge an CD16. Da
NK-Zellen etwa 5-10% der MNC Fraktion repräsentieren, lag somit das effektive NK-
zu Zielzell-Verhältnis, bei dem der sctb ds[19x16x19] bereits signifikante Lysen indu-
zierte, bei etwa 0,1 bis 0,3 zu 1. Die beiden Fab-scFv Fusionen lösten ab einem Ver-
hältnis von 0,3 bis 0,5 zu 1 signifikante ADCC aus. Somit sind diese bispezifischen
Antikörper-Derivate selbst dann noch wirksam, wenn kein lokaler Überschuss an Ef-
fektorzellen vorliegt, der in vivo nur selten erzielt werden kann.
NK-Zellen eignen sich insbesondere als Effektorzellpopulation für eine Antikörper-ba-
sierte Therapie in der post-transplantiven Phase. NK-Zellen sind neben den Granulo-
zyten die ersten Immunzellen, die sich nach einer Stammzelltransplantation konstitu-
ieren und eine zytotoxische Aktivität zeigen (Scheid et al, 1995). Das Risiko eines
auftretenden Rezidivs nach einer Stammzelltransplantation könnte durch Beseitigung
der MRD Zellen durch den Einsatz bispezifischer Antikörper in der frühen posttrans-
plantativen Phase verringert werden. So könnten in dieser Situation bispezifische An-
tikörper den graft versus leukemia Effekt verstärken, ohne dabei eine graft versus
host disease auszulösen, insbesondere da in dieser Periode besonders günstige E:T
Verhältnisse erreicht werden können. In vitro konnte für den bsscFv ds[19x16] ge-
zeigt werden, dass dieser potente Lyse gegenüber primären common B-ALL Blasten
mit allogenen, Spender-abgeleiteten NK-Zellen von Patienten nach einer Stammzell-
transplantation induzierte. Somit sind NK-Zellen eine attraktive Effektorzellpopulation
in der posttransplantativen Phase für die Antikörper-basierte Therapie der MRD
(Bruenke et al, 2005).
Der in dieser Arbeit verwendete CD16 scFv 3G8 bindet außerhalb der IgG Bindeta-
sche, und entgeht dadurch einer Kompetition mit dem hohen Immunglobulinspiegel
im Blut (Galatiuc et al, 1995). Jedoch bindet dieser Antikörper sowohl die signalisie-
rende und Zytotoxizität-vermittelnde Isoform FcγRIIIa auf NK-Zellen und Makropha-
gen, als auch die GPI-verankerte Variante FcγRIIIb auf Neutrophilen. Letztere kön-
nen mit bispezifischen CD16 gerichteten Antikörpern nicht zur Tumorzelllyse aktiviert
werden. Dies, und die Tatsache, dass lösliches CD16 durch Proteolyse ins Blut ab-
gespalten wird, könnte die zytotoxische Aktivität in vivo beeinträchtigen (Koene et al,
1996). Allerdings zeigten Untersuchungen, dass die Zytotoxizität solcher bispezifi-
scher Antikörper nicht durch eine Wechselwirkung mit CD16-positiven Neutrophilen
inhibiert wurde (Weiner et al, 1996). Auch legten vorklinische oder klinische
Phase I/II Studien nahe, dass die Zytotoxizität in vivo nicht entscheidend durch eine
Diskussion
88
Kompetition mit CD16b auf Neutrophilen reduziert wird (Hartmann et al, 2001;
Hartmann et al, 1996).
CD19 als Zielstruktur für die Antikörpertherapie maligner B-lymphoider Zellen
Aufgrund seiner Eigenschaften stellt CD19 eines der attraktivsten Zielantigene für ei-
ne Antikörpertherapie B-lymphoider Neoplasien dar und weist im Vergleich zu ande-
ren Zielstrukturen bestimmte Vorteile auf. CD19 wird im Gegensatz zu CD52 aus-
schließlich auf Zellen der B-Zellreihe exprimiert, weshalb bei einer Behandlung mit
Antikörper-basierten Therapeutika gegen CD19 nur B-lymphoide Zellen beseitigt und
gesunde Zellen anderer Gewebe oder anderer Linienzugehörigkeit innerhalb des hä-
matopoietischen Systems verschont bleiben. Im Vergleich zu CD20 wird CD19 schon
ab dem Entwicklungsstadium der pro-B-Zelle exprimiert. Somit bietet CD19 auch die
Möglichkeit, maligne Zellen zu therapieren, die in dem frühen pro-B Zellstadium arre-
tiert sind. Dies ist insbesondere bei vielen pädiatrischen Vorläufer-B ALLs der Fall.
Da CD19 nicht auf hämatopoietischen Stammzellen exprimiert wird, ist eine Regene-
ration der Lymphozyten nach erfolgter Therapie möglich. CD19-basierte Strategien
könnten auch eine Behandlungsoption für NHL Patienten bieten, die initial nicht auf
eine Therapie mit Rituximab ansprechen (ca. 50%), oder die aufgrund erworbener
Resistenz-Mechanismen oder einem Verlust der CD20-Expression auf den malignen
Zellen nicht weiter mit diesem Antikörper therapiert werden können (Coiffier, 2007;
McLaughlin et al, 1998). Folglich wurden verschiedene Antikörper-basierte Strategien mit CD19 als Zielanti-
gen verfolgt, aber eine Zulassung für ein Therapeutikum wurde bislang noch nicht er-
teilt. Die Strategien umfassten Immuntoxine, Zytokinfusionen, monoklonale Antikör-
per mit verbesserten Effektorfunktionen, aber auch bispezifische Antikörper (Barbin
et al, 2006; Kipriyanov et al, 2002; Loffler et al, 2000; Schwemmlein et al, 2007;
Stieglmaier et al, 2007). Bislang wurde die Zytotoxizität CD19-gerichteter Antikörper
in Kombination mit unterschiedlichen Effektorzellpopulationen untersucht. Dabei er-
wiesen sich CD19- im Gegensatz zu HLAII-gerichteten Antikörpern als wirkungslos,
neutrophile Granulozyten zu aktivieren (Elsasser et al, 1996; Wurflein et al, 1998).
Auch waren unmodifizierte chimäre Antikörper nur bedingt in der Lage, NK-Zellen zu
aktivieren und bedurften Modifikationen im Fc-Teil zu einer Erhöhung der Affinität für
Diskussion
89
CD16, die dann allerdings eine hohe Zytotoxizität aufwiesen (Barbin et al, 2006).
Somit scheint die Auswahl der Effektorpopulation und des trigger Moleküls sowie die
Stärke der Interaktion mit diesem für CD19 gerichtete Antikörper kritisch zu sein.
Bispezifische Antikörper wurden in Kombination mit verschiedenen Effektorzellanti-
genen auf ihre Wirksamkeit untersucht. Intensiv wurden insbesondere bispezifische
Antikörper oder Antikörper-Derivate gegen CD19 und CD3 zur Rekrutierung von zy-
totoxischen T-Zellen auf Wirksamkeit geprüft. Diese bispezifischen Antikörper
induzierten ADCC sowohl in vitro (Bohlen et al, 1993a; Bohlen et al, 1993b; Csoka et
al, 1996; Haagen et al, 1994) als auch in Tiermodellen (Bohlen et al, 1997; Daniel et
al, 1998; Demanet et al, 1992). In klinischen Versuchen konnte zwar biologische
Aktivität nachgewiesen werden (De Gast et al, 1995; Haagen, 1995), allerdings
führte die Stimulierung über CD3 in vivo auch zu einer unspezifischen Aktivierung
der T-Zellen und war mit einer Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen und mit
Toxizitäten verbunden (Link et al, 1998). Hierdurch wurde der therapeutische Nutzen
reduziert. Dagegen zeigte ein rekombinanter tandem bsscFv gegen CD19 und CD3
(MT103/MEDI-538) seine Wirksamkeit im Tiermodell auf und wird derzeit in
klinischen Studien Phase I und II Studien getestet (Dreier et al, 2003). Die ersten,
vorläufigen Ergebnisse sind vielversprechend. Dosis-limitierenden Toxizitäten
wurden nicht beobachtet und erste therapeutische Effekte wurden schon in niedrigen
Dosen erzielt (Bargou et al, 2007). Allerdings muss die weitere Entwicklung abgewar-
tet werden, um eindeutige Aussagen treffen zu können.
Auch bispezifische Antikörper-Derivate gegen CD19 und CD16 vermittelten mit NK-
Zellen als Effektoren in vitro und in vivo ADCC (Bruenke et al, 2005). Ein diabody
gegen CD19 und CD16 zeigte in einem xenotransplantierten Mausmodell in Kombi-
nation mit einem diabody gegen CD19 und CD3 eine synergistische anti-tumorale
Wirkung (Kipriyanov et al, 2002). Die hier entwickelten bispezifischen Antikörper-
Derivate vermittelten potente Lyse gegenüber verschiedenen Tumorzelllinien. Unter
diesen waren die Zelllinien SEM mit der Translokation t(4;11) und BV-173, mit der
Translokation t(9;22), die Suptypen von Leukämien repräsentierten, die im
Allgemeinen besonders schlechte Prognosen haben. So war die Zelllinie SEM
resistent gegenüber einem CD19 gerichteten Immuntoxin, und sprach auch schlecht
auf ein CD19 scFv:sTrail Fusionsprotein an, konnte aber mit dem sctb ds[19x16x19]
über NK Zell-vermittelte Zytotoxizität effizient eliminiert werden. Wie auch der bsscFv
ds[19x16] vermittelten der tribody [Fab19xds19xds16] und der bsbb [Fab19xds16]
Diskussion
90
sowie der sctb ds[19x16x19] potente Lyse gegenüber primären Zellen verschiedener
Leukämie und Lymphom Patienten. So sprachen 11/11 auf den sctb ds[19x16x19],
und 6/6 der getesteten primären Zellproben auf den bstb [Fab19xds19xds16] an. Es
wurden keine Anstrengungen unternommen, die malignen Zellen von den gesunden
Zellen zu trennen, und zwischen dem Effekt der rekombinanten Proteine auf beide
Zelltypen zu unterscheiden. Nach gängigen Diagnosekriterien bestanden allerdings
die MNC Fraktionen, die aus dem peripheren Blut oder aus dem Knochenmark der
Patienten aufgereinigt wurden, hauptsächlich aus malignen Zellen. Daher kann
davon ausgegangen werden, dass die gemessenen ADCC Effekte auf einer Lyse der
malignen Zellen beruhten. Drei der Patienten, deren MNC als Zielzellen für den sctb
ds[19x16x19] eingesetzt wurden, besaßen ungünstige Prognosen (Abbildung 32).
Patient 3 hatte eine atypische B-CLL mit p53 Deletion, unmutiertem IgG VH Status,
und zeigte nur ein minimales Ansprechen auf eine Behandlung nach dem R-CHOP
Schema. Patient 10 war mit einem Mantelzelllymphom mit leukämischen Verlauf und
p53 Deletion diagnostiziert worden. Patient 10 hatte eine B-ALL mit Hoch-Risiko
Faktoren, komplexem Karyotyp und Hyperleukozytose (150 000/µl). Dennoch
sprachen auch die malignen Zellen dieser Patienten in vitro auf den sctb
ds[19x16x19] an. Diese Ergebnisse unterstreichen eine hohe Wirksamkeit und
zeigen ein breites Anwendungsspektrum CD19 und CD16 gerichteter bispezifischer
Antikörper in der Therapie verschiedener B-lymphoider Neoplasien auf.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit verschiedene CD19 und CD16 gerichtete
rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate zur Effektor-vermittelten Lyse B-lym-
phoider Tumorzellen in unterschiedlichen Formaten hergestellt und in vergleichenden
in vitro Studien erprobt. Insbesondere zeigte der Prototyp eines single chain Fv triple-
bodys eine sehr hohe biologische Zytotoxizität gegenüber humanen Leukämie- und
Lymphomzellen, und soll aufgrund dieser vielversprechenden Ergebnisse auf seine
Aktivität in vivo im Mausmodell mit xenotransplantierten humanen Leukämie- und
NK-Zellen untersucht werden. Dieses Molekül ist auch für eine klinische Anwendung
von hohem Interesse und eine Weiterentwicklung wird derzeit am Lehrstuhl für Ge-
netik sowie in Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen intensiv weiterbetrieben.
Material und Methoden
91
6 Material und Methoden
6.1 Materialien
6.1.1 Chemikalien und Enzyme
Die verwendeten Chemikalien wie Salze, Puffersubstanzen, Lösungsmittel, Antibioti-
ka etc. wurden von den Firmen Roche (Mannheim), Bio Whittaker (Walkersville), Co-
star (Bodenheim), Dianova (Hamburg), Roth (Karlsruhe), Sigma (Deisenhofen), Invi-
trogen (Karlsruhe), Qiagen (Hilden) bezogen, die Nährsubstanzen für Bakterien von
der Firma Difco (Michigan, USA) und Roth (Karlsruhe). Filter etc. stammen von den
Firmen Schleicher & Schuell (Dassel) und Millipore (Eschborn). Enzyme wurden von
Roche (Mannheim), Stratagene (Heidelberg), Promega (Heidelberg), New England
Biolabs (Frankfurt am Main), MBI (St. Leon-Rot), Qiagen (Hilden) und Peqlab (Er-
langen) bezogen. Zur Herstellung von Lösungen wurde ausschließlich Wasser aus
einer Deionisationsanlage MilliQ (Millipore, Eschborn) mit einem spezifischen Wider-
stand von 18,2 mΩ/cm2 verwendet.
6.1.2 Allgemeine Puffer und Lösungen
Rezepte für Puffer und Lösungen wurden, falls nicht anders vermerkt, bekannten
Protokollsammlungen entnommen (Sambrook et al, 1989).
6.1.3 Vektoren
pSecTag2 (Invitrogen)
pBud4.1CE (Invitrogen)
6.1.4 Oligonukleotide
Die in PCR-Experimenten oder in Sequenzierungsreaktionen verwendeten Oligonu-
kleotide wurden in Auftragssynthese von den Firmen Sigma-Aldrich (Dassel) und
MWG (Ebersberg) hergestellt und bezogen.
Material und Methoden
92
Tabelle 10: Übersicht über verwendete Oligonukleotide*
* P: Modifikation des Oligonukleotids durch Phosphorylierung
Oligonukleotid Sequenz
Bstb-κ-leader-C PAGCTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAG
GTTCCACTGGTGACGGCGCCGGTTCTGGAGGCG
Bstb-κ-leader-NC PGATCCGCCTCCAGAACCGGCGCCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGC
AGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATG
5´bstb 4G7L-KasI AAAADDCGCCGACTACAAAGATATTGTGATGACCCAG
3´bstb 4G7L-BamHI AAAGGATCCGCCTGGCACGTCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC
5´bstb 3G8-BglII AAAAAAAGATCTGACTACAAAGACATTGTGCTGACCCAATCTC
3´bstb 3G8-BglII AAAGAATTCAGATCTCTATTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCAAGAGACAGTGA
CCAGAGTCCCTTGGGC
Bstb H-leader-C PGGCCGCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGT
GTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGCTCC
Bstb H-leader-NC PTCGAGGAGCAGCTGCACCTCACACTGGACACCTTTTAAAATAGCCACAAGAAAA
AGCCAGCTCAGCCCAAACTCCATGC
5´bstb 4G7VH-XhoI AAAACTCGAGCAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACC
3´bstb 4G7VH-PmeI
CTCCGTTTAAACTCCTCCTCCTCCAGATCTGCCGCCGCCGCCTCGCGAAGAGACG
GTGACTGTGAGAGTG
5´bstb CH1-NruI AAAAAATCGCGAAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC
3´bsbb CH1-BglII TTTTTAGATCTTCACTAATGATGGTGATGATGGGTGCGGTCCGCTACAAGATTTG
GGCTCAACTCTCTTGTC
3´bstb CH1-BglII TTTTTAGATCTGCCCCCGCCCGGTCCGCTACAAGATTTGGGCTCAACTCTCTTGT
CC
5´bstb 4G7scFv-
BglII
AAAAGATCTGGAGGAGGAGGATCTGGCGGGGGCGGGTCTGCGGCCCAGCCGGCCA
TGGCGGAC
3`bstb 4G7scFv-Bglll AAAAAGATCTTCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGCCCCCGAGGCCGAGGA
GACGGTG
5´TH69VL-EcoRv AAAAAAAAAGATATCGACTACAAAGACATCCAGATGACACAGACTACATC
3´TH69VL3-HindIII AAAGCTTTGTTCCGCCACCAAACGTGTACGGTAGCTTGCTATACTGCTG
5´TH69VH-XhoI AAAACTCGAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGG
3´TH69VH-NruI TTTTTTTCGCGAGGAAACGGTGACCGTGGTCC
pST2MCSsctb-C PGGCCGCACTGTGCGAAGACTCTCGAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTC
TGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCCGGCGCCACTGAGGCCTACTGGATA
TCCGT
pST2MCSsctb-NC PCTAGACGGATATCCAGTAGGCCTCAGTGGCGCCGGAACCACCACCACCGGAGCC
GCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTCGAGAGTCTGCGCAC
CAGTGC
5´sctb 4G7-XhoI AAACTCGAGGTGGTGGTGGTTCTGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGCTCTGG
AGGCGGAGGCTCTGGCGCCGACTACAAAGATATTGTGATGACC
5´sctb 4G7-AgeI AAACCGGTTCAATGATGATGATGATGATGCTTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTT
TTTGTTCGATATCCGAGGAGACGGTGACTGTGAGAGT
5´sctb 3G8 NotI AGCTGCGGCCGCGGACTACAAAGACATTGTG
3´sctb 3G8 XhoI TTTTTTCTCGAGAGACAGTGACCAGAGTCC
5´sctb TH69-XhoI AACTCGAGGTGGTGGTGGTTCTGGAGGAGGAQGGATCTGGCGGCGGCGGCTCTGG
AGGCGGAQGGCTCTGGCGGCTACAAAGATATCCAGATG
3´sctb TH69-AgeI AAACCGGTTCAATGATGATGATGATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGATCCTCTT
CTGAGATGAGTTTTTGTTCGATATCCGAGGAAACGGTGACCGTGTCC
Material und Methoden
93
6.1.5 Bakterienstämme
E. coli XL1 blue recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac, [F´,
proAB, laclqZ∆M15, tn10 (tetR)]
6.1.6 Zellkulturmedien
Zelllinie: Medium:
293T Dulbecco´s Modified Eagle Medium
(DMEM) mit 4 mM L-Glutamin (Invitrogen)
10% fötales Kälberserum (Invitrogen)
1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen)
CEM, CHO, CHO16-10, HLA-60,
SEM, Nalm-6
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
1640 Medium (Invitrogen)
10% fötales Kälberserum (Invitrogen)
1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen)
BV-173, ARH-77 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
1640 Medium (Invitrogen)
20% fötales Kälberserum (Invitrogen)
1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen)
6.1.7 Zelllinien
Tabelle 11: Übersicht über die verwendeten Zelllinien
Zelllinie Zelltyp Referenz
293T humane Nierenfibroblasten, stabil transfiziert mit SV40 large T Antigen
(Pear et al, 1993)
3G8 CD16 Hybridom (Fleit et al, 1982)
4G7 CD19 Hybridom (Meeker et al, 1984)
ARH-77 EBV-positive, B-lymphoblastoide Zellinie Plasmazellleukä-mie
(Drewinko et al, 1984)
BV-173 humane B-Zell Vorläufer Leukämie (Pegoraro et al, 1983)
Nalm-6 humane prä-B ALL (Hurwitz et al, 1979)
CEM humane T-ALL (Foley et al, 1965)
CHO Chinesische-Hamster-Ovarzellen (Puck et al, 1958)
CHO 16-10 CHO-Zellen, stabil transfiziert mit humanem CD16a (Bruenke et al, 2004)
HL60 humane AML (Stone et al, 1996)
SEM humane pro-B ALL mit Translokation t(4;11) (Greil et al, 1994)
Material und Methoden
94
6.1.8 Mäuse
Stamm:
FOX-CHASE SCID-NOD [NOD/MrkBomTac-Prkdc scid (M&B, Ry Dänemark)]
Die Haltung der Mäuse erfolgte unter sterilen, standardisierten Umweltbedingungen
(22 ± 1 °C, 50 ± 10% relative Luftfeuchtigkeit, 12 h Tag-Nacht Rhythmus), und erhiel-
ten autoklaviertes Einstreu, Futter (ssniff Spezialdiäten, Soest) und Trinkwasser pH
4,0 nach Belieben. Die Experimente wurden unter Berücksichtigung des Deutschen
Tierschutzgesetzes und nach Genehmigung lokaler Regierungsbehörden durchge-
führt.
6.1.9 Antikörper
Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Antikörper
Antikörper Klonalität Referenz
3G8 (mIgG1) monoklonal (Fleit et al, 1982)
4G7 (mIgG1) monoklonal (Meeker et al,
1984)
TH-69 (mIgG1) monoklonal (Baum et al, 1996)
Maus-anti-Pentahistidin polyklonal Qiagen
Kaninchen-anti-human κ leichte Kette; HRP gekoppelt polyklonal DAKO
Ziege (Fab)2-anti-murin IgG, RPE gekoppelt monoklonal DAKO
Maus-anti-Pentahistidin, AF555 gekoppelt polyklonal Qiagen
Maus-anti-human CD19, PE gekoppelt monoklonal BD Biosciences
Ziege-anti-murin IgG Fcγ, HRP gekoppelt polyklonal Dianova
Maus-anti-Strep-tag II, HRP gekoppelt monoklonal IBA
Material und Methoden
95
6.2 Methoden
6.2.1 Allgemeine Methoden
Folgende Standardmethoden wurden aus bekannten Protokollsammlungen
entnommen (Sambrook et al, 1989):
• Herstellung elektrokompetenter E. coli Bakterien
• Transformation von E. coli durch Elektroporation
• Fällungsmethoden für Nukleinsäuren
• Gelelektrophoresen
• Ligationsreaktionen
• Minilysat-Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli nach der Methode der
alkalischen Lyse
• Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
• Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen
• Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
• Sequenzanalyse von Nukleinsäuren
6.2.2 Klonierungen
Alle Klonierungsreaktionen wurden durch geeignete Restriktionsverdaus überprüft
und die Richtigkeit der Endprodukte durch mehrfache Sequenzierung auf einem au-
tomatisierten Applied Biosystems DNA Sequenziergerät (ABI Prism 310 Genetic
Analyzer; Perkin Elmer, Überlingen) sichergestellt.
6.2.2.1 Herstellung der Expressionsvektoren für die bispezifischen Fab-scFv
Fusionsproteine
Zur Konstruktion des L-scFv Fragments des bsbb [Fab19xds16] und des bstb
[Fab19xds19xds16] wurden die kodierenden Sequenzen des Sekretionsleaders der
humanen Immunglobulin κ leichten Kette sowie die für weiteren Klonierungsschritte
notwendigen Restriktionsstellen in den mit HindIII linearisierten Vektor pBudCE4.1 li-
Material und Methoden
96
giert, woraus der Vektor pBud/LL entstand. Anschließend wurde die cDNA der leich-
ten Kette des chimären 4G7 Antikörpers unter Einführung der Restriktionsschnittstel-
len EcoRV und BamHI aus dem Vektor pBud/CD19 4G7chim (Barbin et al, 2006)
durch PCR amplifiziert und über diese Schnittstellen in den Vektor pBud/LL ligiert.
Dadurch entstand der Vektor pBud/19L. Die für den ds scFv 3G8 kodierende cDNA
(G-44→C in VH und G-105→C in VL; nach Kabat et al, 1991) wurde unter Anfügen
linker-kodierender Sequenzen und terminaler BglII Schnittstellen aus dem Vektor
pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 amplifiziert (Bruenke et al, 2005) und
in den BamHI geschnittenen Vektor pBud/19L unter Herstellung des Vektors
pBud/19L-ds16 ligiert.
Zur Konstruktion des Fd Fragments des bsbb [Fab19xds16] wurden die cDNA Se-
quenz des humanen Sekretionsleader der IgG schweren Kette sowie Restriktions-
stellen für folgende Klonierungen über NotI und XhoI in den entsprechend verdauten
Vektor pBudCE4.1 ligiert, woraus der Vektor pBud/HL resultierte. Die cDNA der va-
riablen schweren Kette des Antikörpers 4G7 wurde unter Einführung der Restrik-
tionsschnittstellen XhoI und PmeI aus dem Vektor pBud/CD19 4G7chim amplifiziert
und in den entsprechend verdauten Vektor pBud/HL ligiert. Als Ergebnis wurde der
Vektor pBud/CD19VH erhalten. Anschließend wurde die cDNA der CH1 Domäne ein-
schließlich der Sequenzen der ersten fünf AS der oberen Gelenkregion aus dem
Vektor pBud/CD19 4G7chim amplifiziert und über NruI und BglII in den Vektor
pBud/CD19VH ligiert, unter Herstellung des Vektors pBud/19Fd-Stop. Zur Konstruk-
tion des Fd-scFv Fragments des bstb [Fab19xds19xds16] wurde die cDNA des ds
scFv 4G7 (G-44→C in VH und A-105→C in VL; nach Kabat et al, 1991), unter Ein-
führung linker kodierender Sequenzen und terminaler BglII Schnittstellen aus dem
Vektor pSecTag2HygroC-Step dsCD19 4G7-dsCD16 amplifiziert und als Bglll Kas-
sette in den Vektor pBud/CD19Fd-Stop ligiert. Der resultierende Vektor wurde als
pBud/19Fd-ds19 bezeichnet.
Anschließend wurde die kodierende Sequenz des L-scFv Fragments inklusive Pro-
motor als NdeI/EcoRI Kassette in die Vektoren pBud/19Fd-ds19 und pBud/19Fd-
Stop ligiert. Hieraus resultierten die bicistronischen Vektoren pBud/bstb19-ds19-ds16
und pBud/Fab19-ds16. Zur Herstellung stabil transfizierter Produktionslinien wurde
die Zeozin Resistenzkassette gegen eine Hygromycin B Resistenzkassette ausge-
tauscht. Diese wurde aus dem Vektor pSecTag2-HygroC ausgeschnitten und als
Material und Methoden
97
BsmI/AvrII Kassette in beide Expressionsvektoren unter Herstellung der Vektoren
pBud/Fab19-ds19-ds16 und pBudHC/Fab19-ds16 ligiert.
Zur Herstellung der Expressionsvektoren für die Proteine bsbb [Fab7x7ds16] und
bstb [Fab7x7xds16] wurden die cDNA Sequenzen der variablen Ketten des Antikör-
pers 4G7 gegen die entsprechenden Sequenzen des Antikörpers TH69 ausge-
tauscht. Als Matrize für die Amplifikation der Fragmente über PCR wurde der Vektor
pak400 CD7scFv TH69 verwendet (Peipp et al, 2002). Entsprechende Restriktions-
schnittstellen wurden dabei eingeführt, und die VH Kette als XhoI/NruI, und die VL
Kette als EcoRV/HindIII Kassette in die jeweiligen Vektoren ligiert, woraus die Vekto-
ren pBud/Fab7-19-ds16 und pBud/Fab7-ds16 entstanden. Der ds scFv 4G7 wurde
schließlich über einen SfiI-Klonierschritt durch den scFv TH69 ersetzt, wodurch der
Expressionsvektor pBud/Fab7-7-ds16 entstand.
6.2.2.2 Herstellung der Expressionsvektoren für die scFv triple-bodies
Zur Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] wurde eine mul-
tiple Klonierstelle in den Vektor pSectag2HygroC-Strep über XbaI und NotI Schnitt-
stellen ligiert. Die für den ds CD19 scFv 4G7 kodierende cDNA wurde aus dem Vek-
tor pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-dsCD16 (Bruenke et al, 2005) ausgeschnit-
ten und als SfiI Kassette in den Vektor pSecTag2HygroC-sctb unter Herstellung des
Vektors pSecTag2HygroC-Strep-ds19 ligiert. Zur Herstellung des Vektors
pSecTag2HygroC-Strep-ds19-ds16-ds19 wurden die Sequenzen der scFvs ds CD19
und ds CD16 über PCR aus dem Vektor pSecTag2HygroC-Step dsCD19 4G7-
dsCD16 (Bruenke et al, 2005) amplifiziert und in den Vektor pSecTag2HygroC-
Strep-dsCD19 über NotI/XhoI and XhoI/AgeI Restriktionsschnittstellen ligiert. Der Ex-
pressionsvektor pSecTag2HygroC-33xds16xds19 wurde hergestellt, indem die cDNA
für den scFv CD33 K132 (Schwemmlein et al, 2006) aus dem Vektor pak400-
CD33 K132 über SfiI ausgeschnitten und in den SfiI linearisierten Vektor pSecTag2-
HygroC-ds19-ds16-ds19 ligiert wurde.
Der Expressionsvektor pSecTag2HygroC-Strep 7-ds16-7 wurde konstruiert durch
Austausch der kodierenden Sequenzen beider ds CD19 scFv Fragmente im Vektor
Vektor pSecTag2 Hygroc-ds19-ds16-ds19 gegen die cDNA des scFvs TH69 (Peipp
et al, 2002), die als SfiI bzw. XhoI/AgeI Kassetten ligiert wurden. Zur Herstellung des
Material und Methoden
98
Expressionsvektor für den bsscFv [7xds16] pSecTag2HygroC-Strep 7-ds16 wurde
die cDNA des ds CD19 scFv 4G7 im Vektor pSecTag2HygroC-Strep dsCD19 4G7-
dsCD16 durch die kodierende Sequenz des scFvs TH69 über SfiI Schnittstellen
ersetzt.
6.2.3 Expression der rekombinanten Antikörper-Derivate und der GFP- und
RFP- Fusionsproteine in 293T Zellen
Für die transiente Expression der rekombinanten Proteine wurden 10 µg des Expres-
sionsvektors pro 10 cm Zellkulturschale mit 293T Zellen in einer Konfluenz von 70-
90% mit der Kalziumphosphat-Methode mit 5 mM Chloroquin transfiziert (Sambrook
et al, 1989). Nach 9-12 h wurde das Transfektionsmedium durch frisches Kulturme-
dium ersetzt. Die Überstände wurden täglich für fünf Tage gesammelt und bei 4°C
gegen einen 4000-fachen Überschuss an Puffer mit 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl
und 10mM Imidazol, pH 8.0 dialysiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Proteins
erfolgte über Affinitätschromatographie mit Ni-NTA Agarose Perlen (Qiagen), die
über Nacht bei 4°C eingerührt wurden. Die Perlen wurden durch Zentrifugation an-
konzentriert und auf Säulchen geladen. Die weitere Aufreinigung erfolgte nach Anlei-
tung des Herstellers. Das aufgereinigte Protein wurde anschließend gegen PBS dia-
lysiert. Die Konzentration der aufgereinigten Proteine wurde durch Abschätzung im
Coomassie gefärbten SDS Gel gegen eine Verdünnungsreihe des Proteins BSA ab-
geschätzt.
Zur Herstellung stabil transfizierter Produktionslinien erfolgte die Transfektion mit li-
nearisierten Expressionsvektoren. Derivate des Vektors pSecTag2 wurden hierzu mit
dem Enzym FspI, Derivate des Vektors pBud/CE4.1 mit SspI verdaut. Die Produk-
tion der rekombinanten Moleküle erfolgte im miniPERM Bioreaktor (Greiner Bio-One,
Frickenhausen) mit einer Dialysemembran von 12,5 kDa MWCO nach Angaben des
Herstellers. Die Überstände wurden alle 5 Tage geerntet, und wie oben beschrieben,
über Ni-NTA Perlen aufgereinigt. Die Aufreinigung über den Strep-tag erfolgte mit
Streptactin-Sepharose (IBA GmbH). Diese wurde für über Nacht bei 4°C gerührt. Da-
nach wurde die Sepharose mittels Zentrifugation ankonzentriert und anschließend
auf Säulchen gegeben. Die Aufreinigung folgte den Protokollen des Herstellers.
Material und Methoden
99
6.2.4 Aufreinigung monoklonaler Antikörper aus Hybridomen
Die Hybridom Antikörper 3G8 und 4G7, beide vom IgG1 Isotyp, wurden aus 1-2 l
Zellkulturüberstand nach Standardprotokollen mit Protein A-Agarose-Perlen (Sigma-
Aldrich) unter Hochsalzbedingungen aufgereinigt und anschließend gegen PBS dia-
lysiert (Harlow und Lane, 1988). Die Konzentration wurde durch Abschätzung im
Coomassie gefärbten SDS Gel gegen eine Verdünnungsreihe eines humanen IgG
Antikörpers bestimmt.
6.2.5 SDS-PAGE und Western-Transfer Experimente
SDS-PAGE wurde nach Standardprotokollen unter reduzierenden bzw. nicht-reduzie-
renden Bedingungen durchgeführt (Sambrook et al, 1989). Die Färbung der Gele er-
folgte mit Coomassie Brilliant Blue R250 (Sigma). In Western-Transfer Experimenten
wurden Proteine über einen anti-Pentahistidin (Qiagen) und einem sekundären HRP-
gekoppelten Ziege-anti-Maus IgG Fcγ Antikörper nachgewiesen. Die Detektion über
den Strep-tag erfolgte mit einem HRP-gekoppelten anti-Strep Antikörper (IBA). Das
L-scFv Fragment der Fab-scFv Fusionen wurde mit einem HRP-konjugierten
Kaninchen-anti-humane κ leichte Kette Antikörper (DAKO) nachgewiesen. Sämtliche
Antikörper wurden nach den Protokollen der Hersteller eingesetzt. Die Darstellung
erfolgte auf einem Röntgenfilm nach Entwicklung mit ECL-Reagenz (enhanced che-
moluminescence, Amersham Pharmacia Biotech).
6.2.6 Durchflusszytometrische Methoden
Die durchflusszytometrischen Analysen wurden an einem FACS Calibur Gerät mit
der SoftwareCellQuest (Becton Dickinson) durchgeführt. Für jede Probe wurden
1 x 104 Zellen analysiert. Durch entsprechende scatter gates auf lebende Zellen wur-
den tote Zellen, Zellaggregate und zellulärer Debris ausgeschlossen.
Material und Methoden
100
6.2.6.1 Nachweis der spezifischen und simultanen Bindung
Für jeden Ansatz wurden 3 x 105 Zellen mit 1 ml PBA (PBS, 0,1% BSA, 7mM Natri-
umazid) gewaschen. Zur Untersuchung der spezifischen Bindefähigkeit wurden die
Zellen mit 30 µl einer Verdünnung des Antikörper-Derivats (5 µg/ml) 45 min auf Eis
inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 ml PBA gewaschen und anschließend 30 min mit
einem Maus anti-Pentahistidin Antikörper (Qiagen) inkubiert. Nach einem weiteren
Waschschritt wurde die Zellen 30 min mit einem Ziege-anti-Maus F(ab)2 Antikörper
(Dako) gefärbt. Die Zellen wurden erneut mit 1 ml PBA gewaschen und mit 300 µl
PFA (PBS, 1% Paraformaldehyd) fixiert und anschließend im Durchflusszytometer
vermessen.
Zum Nachweis der simultanen Antigenbindung wurden CD19-positive SEM Zellen
mit 5 µg/ml des jeweiligen Antikörper-Derivates inkubiert. Nach einem Waschschritt
erfolgte die Zugabe der Fusionsproteine CD16exGFP, oder, als Kontrolle,
CD64exGFP, in einer Konzentration von 10 µg/ml bei einem Volumen von 30 µl. Zur
kompetitiven Inhibition der Bindung wurden die Zellen mit einem 50-fachen molaren
Überschuss des parentalen CD19 Antikörpers 4G7 30 min auf Eis vorinkubiert. Zur
Inhibition der Bindung an CD16 Seite wurde das Fusionsprotein CD16ex-GFP mit ei-
nem 50-fach molaren Überschuss des CD16 Antikörpers 3G8 vorinkubiert und an-
schließend mit den Zellen versetzt. Als Kontrolle wurde der nicht relevante IgG1 Anti-
körper TH69 mitgeführt.
6.2.6.2 Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (KD)
Die Gleichgewichtskonstante wurde nach einer publizierten Methode durchflusszyto-
metrisch bestimmt (Benedict et al, 1997; Bruenke et al, 2004). 3 x 105 Zellen wurden
mit steigenden Konzentrationen der jeweiligen Konstrukte 30 min auf Eis inkubiert,
und mit einem Maus anti-Pentahistidin Antikörper nachgewiesen. In jeder Versuchs-
reihe wurden zusätzlich Latex Fluoreszenz-Kalibrierungspartikel (Spherotech, Liber-
tyville, IL) vermessen, um die gemessenen mittleren Fluoreszenzintensitäten in kali-
brierte Einheiten umzuwandeln. Aus Konzentrations-abhängigen Bindungskurven
wurden die KD-Werte berechnet.
Material und Methoden
101
6.2.6.3 Bestimmung der Serumstabilität in vitro
Die Antikörper-Derivate wurden in humanem Serum bei einer Konzentration von
2,5 µg/ml bei 37°C inkubiert. Die residuelle Bindung wurde zu verschiedenen Zeit-
punkten durchflusszytometrisch bestimmt. Hierzu wurden 50 µl Aliquots entnommen
und zusammen mit Antigen-positiven Zellen auf Eis inkubiert, und mit einem Maus-
anti-Pentahistidin Antikörper nachgewiesen. Die mittlere Fluoreszenzintensität einer
frisch angesetzten Probe wurde auf 100% gesetzt, und alle weiteren Werte darauf
normalisiert. Die Halbwertszeit t1/2 wurde aus einer einphasigen exponentiellen
Verfallskurve ermittelt.
6.2.6.4 Bestimmung der Zelloberflächenretention
Die Zelloberflächenretention in vitro wurde bei 37 °C unter Bedingungen, die eine In-
ternalisierung der Antigene verhindern, nach publizierter Methode analysiert (Adams
et al, 1998b). Hierzu wurden 4 x 106 Zellen 1 h auf Eis mit 10 µg/ml des entsprechen-
den Antikörper-Derivates inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit
12 ml kaltem FACS Puffer (0.154 M Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphat,
1% BSA, 0,1% Natriumazid, pH 7.2) gewaschen und durch Zentrifugation pelletiert.
Die Zellen wurden in 4 ml FACS Puffer resuspendiert und im Wasserbad bei 37°C in-
kubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellen erneut gewaschen, um dis-
soziierte Moleküle zu entfernen, und in FACS-Puffer aufgenommen. Aliquots ent-
sprechend 0,5 x 106 Zellen wurden entnommen, 5 min auf Eis abgekühlt und wieder
gewaschen. Die auf der Zelloberfläche noch gebundenen Moleküle wurden mit ei-
nem Alexa Fluor 488 konjugiertem Maus anti-Pentahistidin Antikörper (Qiagen)
durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die Werte wurden auf den Zeitpunkt
t0 = 100 % normalisiert. Die Halbwertszeiten der Zelloberflächenretention wurden aus
einer einphasigen exponentiellen Verfallskurve errechnet.
Material und Methoden
102
6.2.6.5 Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7
SEM Zellen wurden auf Eis mit dem parentalen Hybridom Antikörper 4G7 in einer
subsaturativen Konzentration von 0,5 µg/ml entweder alleine, oder in Gegenwart stei-
gender Konzentrationen des sctb ds[19x16x19] oder des bsscFv ds[19x16] als Inhibi-
toren inkubiert. Die Zellen wurden mit PBA gewaschen, und der zellgebundene Anti-
körper 4G7 mit einem PE-konjugierten Ziege anti-Maus IgG Antikörper (DAKO)
durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die relative Inhibition der Bindung des 4G7
Antikörpers wurde mit folgender Gleichung berechnet: % Inhibition = (% FI ohne Inhi-
bitor - % FI mit Inhibitor) / (% FI ohne Inhibitor) x 100 (FI, Fluoreszenz Intensität). Die
IC50 -Werte wurden aus einer sigmoidalen Dosis-Wirkungskurve ermittelt.
6.2.7 Bestimmung der Plasmaretention in Mäusen
NOD-SCID Mäuse (männlich, 12 Wochen, Gewicht von 20 - 25 g, 4 Mäuse / Gruppe)
erhielten i.v. Injektionen von 0,7 nmol des sctb ds[19x16x19] (entsprechend 60 µg)
oder des bsscFv ds[19x16] (40 µg) in einem Volumen von 200 µl PBS, oder PBS al-
leine als Kontrolle. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Blutproben entnommen (50-
100 µl) und zu Serum mit BD Microtainer SST TM Röhrchen (Becton Dickinson) um-
gewandelt. Der verbliebene reaktive Gehalt an Antikörper-Derivaten im Serum wurde
mit einem Alexa Fluor 488 konjugiertem Maus-anti-Pentahistidin Antikörper (Qiagen)
durchflusszytometrisch mit Antigen-positiven Zellen nachgewiesen. Der Wert zum
Zeitpunkt t0 (1 min) wurde auf 100%. gesetzt und alle weiteren Werte auf diesen Da-
tenpunkt normalisiert. Die Halbwertszeit wurde aus einer einphasigen exponentiellen
Verfallskurve bestimmt.
6.2.8 Isolierung mononukleärer Zellen (MNCs)
Mononukleäre Zellen wurden je nach Bedarf aus 10 bis 40 ml peripheren Blutes ge-
sunder Spender nach veröffentlichten Protokollen angereichert (Elsasser et al, 1996).
Die Reinheit der isolierten MNCs wurde durch Zytospin-Präparationen untersucht
und betrug ca. 95%. Die Viabilität wurde durch Färbung mit Trypanblau überprüft und
Material und Methoden
103
lag routinemäßig bei über 95%. Analog wurde die MNC Fraktion aus dem peripheren
Blut oder dem Knochenmark von Leukämie oder Lymphom Patienten angereichert.
Die CD19-Expression auf den malignen Zellen wurde durchflusszytometrisch mit ei-
nem PE-konjugierten Maus anti-human CD19 Antikörper (BD Biosciences) nachgewie-
sen.
6.2.9 Zytotoxizitätsexperimente
ADCC-Experimente wurden nach der publizierten Methode mit 51Cr (Elsasser et al,
1996) durchgeführt. Zur radioaktiven Markierung wurden zunächst 1,2 x106 Zielzellen
über 2 h mit 100 µCi 51Cr inkubiert. Nach 3 Waschschritten mit Medium wurden die
Zellen auf eine Zellzahl von 1x105 Zellen/ml eingestellt. MNCs als Effektorzellen wur-
den isoliert und auf eine Zellzahl von 4 x 106 Zellen pro ml eingestellt. Zu jedem An-
satz wurden die Antikörper-Derivate, Effektorzellen und Zielzellen pipetiert und mit
RPMI 1640 Medium auf ein Endvolumen von 200 µl eingestellt. Falls nicht ander-
weitig beschrieben, wurden die Versuche bei einem konstanten E: T Verhältnis von
40:1 durchgeführt. Nach 3 h Inkubation wurde die Reaktion durch Zentrifugation
gestoppt, und der Überstand auf freigesetztes 51Cr in counts per minute (cpm)
analysiert. Die spezifische Lyse wurde nach folgender Formel berechnet:
% spezifische Lyse = [(experimentelle cpm-basale cpm) / (maximale cpm – basale
cpm)] x 100. Maximale 51Cr Freisetzung wurde durch Zugabe von Perchlorsäure in
einer Endkonzentration von 3% bestimmt. Zur Ermittlung der basalen 51Cr Freiset-
zung wurden in einem Ansatz Zielzellen in Abwesenheit von Antikörpern oder Effek-
torzellen inkubiert. Die EC50-Werte wurden aus sigmoidalen Dosis-Wirkungskurven
berechnet.
6.2.10 Graphische Auswertung und statistische Analyse
Graphische und statistisch Auswertungen wurden mit der Software GraphPad Prism
(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Falls nicht anders ver-
merkt wurden Daten als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes (standard error
of the mean, SEM) dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit ei-
Material und Methoden
104
nem ungepaarten, oder wenn angemessen, gepaarten Student’s t-test ermittelt. P-
Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant eingestuft.
Alle in dieser Arbeit durchgeführten Versuche mit Mäusen wurden entsprechend dem
deutschen Tierschutzgesetz und mit Erlaubnis der verantwortlichen Behörden der
Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
Alle Experimente mit Patientenzellen wurden durch das Ethik Komitee der Universität
Erlangen-Nürnberg, in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki, gebilligt.
Literatur
105
7 Literatur
Adams, G.P., Schier, R., Marshall, K., Wolf, E.J., McCall, A.M., Marks, J.D. & Weiner, L.M. (1998a) Increased affinity leads to improved selective tumor delivery of single-chain Fv antibodies. Cancer Res, 58, 485-490.
Adams, G.P., Schier, R., McCall, A.M., Crawford, R.S., Wolf, E.J., Weiner, L.M. & Marks, J.D. (1998b) Prolonged in vivo tumour retention of a human diabody targeting the extracellular domain of human HER2/neu. Br J Cancer, 77, 1405-1412.
Adams, G.P., Schier, R., McCall, A.M., Simmons, H.H., Horak, E.M., Alpaugh, R.K., Marks, J.D. & Weiner, L.M. (2001) High affinity restricts the localization and tumor penetration of single-chain fv antibody molecules. Cancer Res, 61, 4750-4755.
Adams, G.P. & Weiner, L.M. (2005) Monoclonal antibody therapy of cancer. Nat Biotechnol, 23, 1147-1157.
Alinari, L., Lapalombella, R., Andritsos, L., Baiocchi, R.A., Lin, T.S. & Byrd, J.C. (2007) Alemtuzumab (Campath-1H) in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Oncogene, 26, 3644-3653.
Allen, T.M. (2002) Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. Nat Rev Cancer, 2, 750-763.
Alt, M., Muller, R. & Kontermann, R.E. (1999) Novel tetravalent and bispecific IgG-like antibody molecules combining single-chain diabodies with the immunoglobulin gamma1 Fc or CH3 region. FEBS Lett, 454, 90-94.
Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A. & Carter, P. (1997) Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J Mol Biol, 270, 26-35.
Barbin, K., Stieglmaier, J., Saul, D., Stieglmaier, K., Stockmeyer, B., Pfeiffer, M., Lang, P. & Fey, G.H. (2006) Influence of variable N-glycosylation on the cytolytic potential of chimeric CD19 antibodies. J Immunother (1997), 29, 122-133.
Bargou, R., Kufer, P., Goebeler, M., Knop, S., Einsele, H., Noppeney , R., Viardot, A., Georg Hess, G., Riethmueller, G., P.A., B., Leo, E., Lutterbuese, R., Reitsma, D., Kaucic, K., linger, M., Schmidt, M., Reinhardt, C. & Zugmaier, G. (2007) Anti-CD19 BiTE Antibody MT103 (MEDI-538) Induces Dose-dependent Objective Complete and Partial Responses in Relapsed Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) Patients. Update from Ongoing Phase I Study MT103-104. In: Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), Vol. 110, p. 2557.
Baum, W., Steininger, H., Bair, H.J., Becker, W., Hansen-Hagge, T.E., Kressel, M., Kremmer, E., Kalden, J.R. & Gramatzki, M. (1996) Therapy with CD7 monoclonal antibody TH-69 is highly effective for xenografted human T-cell ALL. Br J Haematol, 95, 327-338.
Bene, M.C., Castoldi, G., Knapp, W., Ludwig, W.D., Matutes, E., Orfao, A. & van't Veer, M.B. (1995) Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia, 9, 1783-1786.
Benedict, C.A., MacKrell, A.J. & Anderson, W.F. (1997) Determination of the binding affinity of an anti-CD34 single-chain antibody using a novel, flow cytometry based assay. J Immunol Methods, 201, 223-231.
Binet, J.L., Auquier, A., Dighiero, G., Chastang, C., Piguet, H., Goasguen, J., Vaugier, G., Potron, G., Colona, P., Oberling, F., Thomas, M., Tchernia, G., Jacquillat, C., Boivin, P., Lesty, C., Duault, M.T., Monconduit, M., Belabbes, S. & Gremy, F. (1981) A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer, 48, 198-206.
Literatur
106
Bird, R.E., Hardman, K.D., Jacobson, J.W., Johnson, S., Kaufman, B.M., Lee, S.M., Lee, T., Pope, S.H., Riordan, G.S. & Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science, 242, 423-426.
Bohlen, H., Hopff, T., Manzke, O., Engert, A., Kube, D., Wickramanayake, P.D., Diehl, V. & Tesch, H. (1993a) Lysis of malignant B cells from patients with B-chronic lymphocytic leukemia by autologous T cells activated with CD3 x CD19 bispecific antibodies in combination with bivalent CD28 antibodies. Blood, 82, 1803-1812.
Bohlen, H., Manzke, O., Patel, B., Moldenhauer, G., Dorken, B., von Fliedner, V., Diehl, V. & Tesch, H. (1993b) Cytolysis of leukemic B-cells by T-cells activated via two bispecific antibodies. Cancer Res, 53, 4310-4314.
Bohlen, H., Manzke, O., Titzer, S., Lorenzen, J., Kube, D., Engert, A., Abken, H., Wolf, J., Diehl, V. & Tesch, H. (1997) Prevention of Epstein-Barr virus-induced human B-cell lymphoma in severe combined immunodeficient mice treated with CD3xCD19 bispecific antibodies, CD28 monospecific antibodies, and autologous T cells. Cancer Res, 57, 1704-1709.
Bondeson, J. & Maini, R.N. (2001) Tumour necrosis factor as a therapeutic target in rheumatoid arthritis and other chronic inflammatory diseases: the clinical experience with infliximab (REMICADE). Int J Clin Pract, 55, 211-216.
Borchmann, P., Schnell, R., Fuss, I., Manzke, O., Davis, T., Lewis, L.D., Behnke, D., Wickenhauser, C., Schiller, P., Diehl, V. & Engert, A. (2002) Phase 1 trial of the novel bispecific molecule H22xKi-4 in patients with refractory Hodgkin lymphoma. Blood, 100, 3101-3107.
Bortoletto, N., Scotet, E., Myamoto, Y., D'Oro, U. & Lanzavecchia, A. (2002) Optimizing anti-CD3 affinity for effective T cell targeting against tumor cells. Eur J Immunol, 32, 3102-3107.
Bosch, F., Ferrer, A., Lopez-Guillermo, A., Gine, E., Bellosillo, B., Villamor, N., Colomer, D., Cobo, F., Perales, M., Esteve, J., Altes, A., Besalduch, J., Ribera, J.M. & Montserrat, E. (2002) Fludarabine, cyclophosphamide and mitoxantrone in the treatment of resistant or relapsed chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol, 119, 976-984.
Bradbury, L.E., Kansas, G.S., Levy, S., Evans, R.L. & Tedder, T.F. (1992) The CD19/CD21 signal transducing complex of human B lymphocytes includes the target of antiproliferative antibody-1 and Leu-13 molecules. J Immunol, 149, 2841-2850.
Brady, G., MacArthur, G.J. & Farrell, P.J. (2007) Epstein-Barr virus and Burkitt lymphoma. J Clin Pathol, 60, 1397-1402.
Brekke, O.H. & Sandlie, I. (2003) Therapeutic antibodies for human diseases at the dawn of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov, 2, 52-62.
Bremer, E., Kuijlen, J., Samplonius, D., Walczak, H., de Leij, L. & Helfrich, W. (2004) Target cell-restricted and -enhanced apoptosis induction by a scFv:sTRAIL fusion protein with specificity for the pancarcinoma-associated antigen EGP2. Int J Cancer, 109, 281-290.
Brinkmann, U., Gallo, M., Brinkmann, E., Kunwar, S. & Pastan, I. (1993) A recombinant immunotoxin that is active on prostate cancer cells and that is composed of the Fv region of monoclonal antibody PR1 and a truncated form of Pseudomonas exotoxin. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 547-551.
Brissinck, J., Demanet, C., Moser, M., Leo, O. & Thielemans, K. (1991) Treatment of mice bearing BCL1 lymphoma with bispecific antibodies. J Immunol, 147, 4019-4026.
Bross, P.F., Beitz, J., Chen, G., Chen, X.H., Duffy, E., Kieffer, L., Roy, S., Sridhara, R., Rahman, A., Williams, G. & Pazdur, R. (2001) Approval summary: gemtuzumab ozogamicin in relapsed acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res, 7, 1490-1496.
Literatur
107
Bruell, D., Bruns, C.J., Yezhelyev, M., Huhn, M., Muller, J., Ischenko, I., Fischer, R., Finnern, R., Jauch, K.W. & Barth, S. (2005) Recombinant anti-EGFR immunotoxin 425(scFv)-ETA' demonstrates anti-tumor activity against disseminated human pancreatic cancer in nude mice. Int J Mol Med, 15, 305-313.
Bruenke, J., Barbin, K., Kunert, S., Lang, P., Pfeiffer, M., Stieglmaier, K., Niethammer, D., Stockmeyer, B., Peipp, M., Repp, R., Valerius, T. & Fey, G.H. (2005) Effective lysis of lymphoma cells with a stabilised bispecific single-chain Fv antibody against CD19 and FcgammaRIII (CD16). Br J Haematol, 130, 218-228.
Bruenke, J., Fischer, B., Barbin, K., Schreiter, K., Wachter, Y., Mahr, K., Titgemeyer, F., Niederweis, M., Peipp, M., Zunino, S.J., Repp, R., Valerius, T. & Fey, G.H. (2004) A recombinant bispecific single-chain Fv antibody against HLA class II and FcgammaRIII (CD16) triggers effective lysis of lymphoma cells. Br J Haematol, 125, 167-179.
Brüsselbach, S., Korn, T., Völkel, T., R, M. & Kontermann, R.E. (1999) Enzyme recruitment and tumor cell killing in vitro by a secreted bispecific single-chain diabody. Tumor Targeting, 4, 115-123.
Burton, D.R. & Woof, J.M. (1992) Human antibody effector function. Adv Immunol, 51, 1-84.
Byrd, J.C., Murphy, T., Howard, R.S., Lucas, M.S., Goodrich, A., Park, K., Pearson, M., Waselenko, J.K., Ling, G., Grever, M.R., Grillo-Lopez, A.J., Rosenberg, J., Kunkel, L. & Flinn, I.W. (2001) Rituximab using a thrice weekly dosing schedule in B-cell chronic lymphocytic leukemia and small lymphocytic lymphoma demonstrates clinical activity and acceptable toxicity. J Clin Oncol, 19, 2153-2164.
Canevari, S., Mezzanzanica, D., Mazzoni, A., Negri, D.R., Ramakrishna, V., Bolhuis, R.L., Colnaghi, M.I. & Bolis, G. (1995) Bispecific antibody targeted T cell therapy of ovarian cancer: clinical results and future directions. J Hematother, 4, 423-427.
Cao, Y. & Suresh, M.R. (1998) Bispecific antibodies as novel bioconjugates. Bioconjug Chem, 9, 635-644.
Carter, P. (2001a) Bispecific human IgG by design. J Immunol Methods, 248, 7-15.
Carter, P. (2001b) Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nat Rev Cancer, 1, 118-129.
Carter, P.J. (2006) Potent antibody therapeutics by design. Nat Rev Immunol, 6, 343-357.
Carter, R.H., Wang, Y. & Brooks, S. (2002) Role of CD19 signal transduction in B cell biology. Immunol Res, 26, 45-54.
Cartron, G., Dacheux, L., Salles, G., Solal-Celigny, P., Bardos, P., Colombat, P. & Watier, H. (2002) Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood, 99, 754-758.
Castor, A., Nilsson, L., Astrand-Grundstrom, I., Buitenhuis, M., Ramirez, C., Anderson, K., Strombeck, B., Garwicz, S., Bekassy, A.N., Schmiegelow, K., Lausen, B., Hokland, P., Lehmann, S., Juliusson, G., Johansson, B. & Jacobsen, S.E. (2005) Distinct patterns of hematopoietic stem cell involvement in acute lymphoblastic leukemia. Nat Med, 11, 630-637.
CLL Trialists´Collaborative Group (1999) Chemotherapeutic options in chronic lymphocytic leukemia: a meta-analysis of the randomized trials. CLL Trialists' Collaborative Group. J Natl Cancer Inst, 91, 861-868.
Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J., Christ, O., Schuhmacher, J., Strauss, G., Moldenhauer, G. & Little, M. (2000a) Treatment of human B cell lymphoma xenografts with a CD3 x CD19 diabody and T cells. J Immunol, 165, 888-895.
Literatur
108
Cochlovius, B., Kipriyanov, S.M., Stassar, M.J., Schuhmacher, J., Benner, A., Moldenhauer, G. & Little, M. (2000b) Cure of Burkitt's lymphoma in severe combined immunodeficiency mice by T cells, tetravalent CD3 x CD19 tandem diabody, and CD28 costimulation. Cancer Res, 60, 4336-4341.
Coiffier, B. (2007) Rituximab therapy in malignant lymphoma. Oncogene, 26, 3603-3613.
Coloma, M.J. & Morrison, S.L. (1997) Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies. Nat Biotechnol, 15, 159-163.
Connelly, R.J., Hayden, M.S., Scholler, J.K., Tsu, T.T., Dupont, B., Ledbetter, J.A. & Kanner, S.B. (1998) Mitogenic properties of a bispecific single-chain Fv-Ig fusion generated from CD2-specific mAb to distinct epitopes. Int Immunol, 10, 1863-1872.
Connors, J.M. (2005) Evolving approaches to primary treatment of hodgkin lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 239-244.
Cooley, S., Burns, L.J., Repka, T. & Miller, J.S. (1999) Natural killer cell cytotoxicity of breast cancer targets is enhanced by two distinct mechanisms of antibody-dependent cellular cytotoxicity against LFA-3 and HER2/neu. Exp Hematol, 27, 1533-1541.
Cox, C.V., Evely, R.S., Oakhill, A., Pamphilon, D.H., Goulden, N.J. & Blair, A. (2004) Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells. Blood, 104, 2919-2925.
Cragg, M.S. & Glennie, M.J. (2004) Antibody specificity controls in vivo effector mechanisms of anti-CD20 reagents. Blood, 103, 2738-2743.
Crowe, J.S., Hall, V.S., Smith, M.A., Cooper, H.J. & Tite, J.P. (1992) Humanized monoclonal antibody CAMPATH-1H: myeloma cell expression of genomic constructs, nucleotide sequence of cDNA constructs and comparison of effector mechanisms of myeloma and Chinese hamster ovary cell-derived material. Clin Exp Immunol, 87, 105-110.
Csoka, M., Strauss, G., Debatin, K.M. & Moldenhauer, G. (1996) Activation of T cell cytotoxicity against autologous common acute lymphoblastic leukemia (cALL) blasts by CD3xCD19 bispecific antibody. Leukemia, 10, 1765-1772.
Curnow, R.T. (1997) Clinical experience with CD64-directed immunotherapy. An overview. Cancer Immunol Immunother, 45, 210-215.
Daeron, M. (1997) Fc receptor biology. Annu Rev Immunol, 15, 203-234.
Daniel, P.T., Kroidl, A., Kopp, J., Sturm, I., Moldenhauer, G., Dorken, B. & Pezzutto, A. (1998) Immunotherapy of B-cell lymphoma with CD3x19 bispecific antibodies: costimulation via CD28 prevents "veto" apoptosis of antibody-targeted cytotoxic T cells. Blood, 92, 4750-4757.
Davis, T.A., Czerwinski, D.K. & Levy, R. (1999) Therapy of B-cell lymphoma with anti-CD20 antibodies can result in the loss of CD20 antigen expression. Clin Cancer Res, 5, 611-615.
De Gast, G.C., Van Houten, A.A., Haagen, I.A., Klein, S., De Weger, R.A., Van Dijk, A., Phillips, J., Clark, M. & Bast, B.J. (1995) Clinical experience with CD3 x CD19 bispecific antibodies in patients with B cell malignancies. J Hematother, 4, 433-437.
de Kruif, J. & Logtenberg, T. (1996) Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from a semi-synthetic antibody phage display library. J Biol Chem, 271, 7630-7634.
Dechant, M., Bruenke, J. & Valerius, T. (2003) HLA class II antibodies in the treatment of hematologic malignancies. Semin Oncol, 30, 465-475.
Demanet, C., Brissinck, J., Moser, M., Leo, O. & Thielemans, K. (1992) Bispecific antibody therapy of two murine B-cell lymphomas. Int J Cancer Suppl, 7, 67-68.
Literatur
109
Deo, Y.M., Graziano, R.F., Repp, R. & van de Winkel, J.G. (1997) Clinical significance of IgG Fc receptors and Fc gamma R-directed immunotherapies. Immunol Today, 18, 127-135.
Dohner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., Leupolt, E., Krober, A., Bullinger, L., Dohner, K., Bentz, M. & Lichter, P. (2000) Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 343, 1910-1916.
Dreger, P., Brand, R., Hansz, J., Milligan, D., Corradini, P., Finke, J., Deliliers, G.L., Martino, R., Russell, N., Van Biezen, A., Michallet, M. & Niederwieser, D. (2003) Treatment-related mortality and graft-versus-leukemia activity after allogeneic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia using intensity-reduced conditioning. Leukemia, 17, 841-848.
Dreier, T., Baeuerle, P.A., Fichtner, I., Grun, M., Schlereth, B., Lorenczewski, G., Kufer, P., Lutterbuse, R., Riethmuller, G., Gjorstrup, P. & Bargou, R.C. (2003) T cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- bispecific single-chain antibody construct. J Immunol, 170, 4397-4402.
Drewinko, B., Mars, W., Stragand, J.J., Henderson, S.D., Latreille, J., Barlogie, B. & Trujillo, J.M. (1984) ARH-77, an established human IgG-producing myeloma cell line. II. Growth kinetics, clonogenic capacity, chalone production, xenogeneic transplantations, and response to melphalan. Cancer, 54, 1893-1903.
Elsasser, D., Valerius, T., Repp, R., Weiner, G.J., Deo, Y., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Stevenson, G.T., Glennie, M.J. & Gramatzki, M. (1996) HLA class II as potential target antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies in combination with granulocyte colony-stimulating factor. Blood, 87, 3803-3812.
Ely, P., Wallace, P.K., Givan, A.L., Graziano, R.F., Guyre, P.M. & Fanger, M.W. (1996) Bispecific-armed, interferon gamma-primed macrophage-mediated phagocytosis of malignant non-Hodgkin's lymphoma. Blood, 87, 3813-3821.
Faderl, S., Thomas, D.A., O'Brien, S., Garcia-Manero, G., Kantarjian, H.M., Giles, F.J., Koller, C., Ferrajoli, A., Verstovsek, S., Pro, B., Andreeff, M., Beran, M., Cortes, J., Wierda, W., Tran, N. & Keating, M.J. (2003) Experience with alemtuzumab plus rituximab in patients with relapsed and refractory lymphoid malignancies. Blood, 101, 3413-3415.
Fanger, M.W., Segal, D.M. & Romet-Lemonne, J.L. (1991) Bispecific antibodies and targeted cellular cytotoxicity. Immunol Today, 12, 51-54.
Fearon, D.T. & Carter, R.H. (1995) The CD19/CR2/TAPA-1 complex of B lymphocytes: linking natural to acquired immunity. Annu Rev Immunol, 13, 127-149.
Felix, C.A. & Lange, B.J. (1999) Leukemia in infants. Oncologist, 4, 225-240.
Fleit, H.B., Wright, S.D. & Unkeless, J.C. (1982) Human neutrophil Fc gamma receptor distribution and structure. Proc Natl Acad Sci U S A, 79, 3275-3279.
Foley, G.E., Lazarus, H., Farber, S., Uzman, B.G., Boone, B.A. & McCarthy, R.E. (1965) Continuous Culture of Human Lymphoblasts from Peripheral Blood of a Child with Acute Leukemia. Cancer, 18, 522-529.
Galatiuc, C., Gherman, M., Metes, D., Sulica, A., DeLeo, A., Whiteside, T.L. & Herberman, R.B. (1995) Natural killer (NK) activity in human responders and nonresponders to stimulation by anti-CD16 antibodies. Cell Immunol, 163, 167-177.
Garcia de Palazzo, I., Holmes, M., Gercel-Taylor, C. & Weiner, L.M. (1992) Antitumor effects of a bispecific antibody targeting CA19-9 antigen and CD16. Cancer Res, 52, 5713-5719.
Glennie, M.J. & Johnson, P.W. (2000) Clinical trials of antibody therapy. Immunol Today, 21, 403-410.
Literatur
110
Glennie, M.J., McBride, H.M., Worth, A.T. & Stevenson, G.T. (1987) Preparation and performance of bispecific F(ab' gamma)2 antibody containing thioether-linked Fab' gamma fragments. J Immunol, 139, 2367-2375.
Gokbuget, N. & Hoelzer, D. (2002) Recent approaches in acute lymphoblastic leukemia in adults. Rev Clin Exp Hematol, 6, 114-141; discussion 200-112.
Gordon, L.I., Witzig, T., Molina, A., Czuczman, M., Emmanouilides, C., Joyce, R., Vo, K., Theuer, C., Pohlman, B., Bartlett, N., Wiseman, G., Darif, M. & White, C. (2004) Yttrium 90-labeled ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy produces high response rates and durable remissions in patients with previously treated B-cell lymphoma. Clin Lymphoma, 5, 98-101.
Green, L.L. (1999) Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies. J Immunol Methods, 231, 11-23.
Greil, J., Gramatzki, M., Burger, R., Marschalek, R., Peltner, M., Trautmann, U., Hansen-Hagge, T.E., Bartram, C.R., Fey, G.H., Stehr, K. & et al. (1994) The acute lymphoblastic leukaemia cell line SEM with t(4;11) chromosomal rearrangement is biphenotypic and responsive to interleukin-7. Br J Haematol, 86, 275-283.
Grosse-Hovest, L., Wick, W., Minoia, R., Weller, M., Rammensee, H.G., Brem, G. & Jung, G. (2005) Supraagonistic, bispecific single-chain antibody purified from the serum of cloned, transgenic cows induces T-cell-mediated killing of glioblastoma cells in vitro and in vivo. Int J Cancer, 117, 1060-1064.
Gruber, M., Schodin, B.A., Wilson, E.R. & Kranz, D.M. (1994) Efficient tumor cell lysis mediated by a bispecific single chain antibody expressed in Escherichia coli. J Immunol, 152, 5368-5374.
Guyre, P.M., Graziano, R.F., Vance, B.A., Morganelli, P.M. & Fanger, M.W. (1989) Monoclonal antibodies that bind to distinct epitopes on Fc gamma RI are able to trigger receptor function. J Immunol, 143, 1650-1655.
Haagen, I.A. (1995) Performance of CD3xCD19 bispecific monoclonal antibodies in B cell malignancy. Leuk Lymphoma, 19, 381-393.
Haagen, I.A., de Lau, W.B., Bast, B.J., Geerars, A.J., Clark, M.R. & de Gast, B.C. (1994) Unprimed CD4+ and CD8+ T cells can be rapidly activated by a CD3 x CD19 bispecific antibody to proliferate and become cytotoxic. Cancer Immunol Immunother, 39, 391-396.
Hainsworth, J.D. (2002) Rituximab as first-line and maintenance therapy for patients with indolent non-Hodgkin's lymphoma: interim follow-up of a multicenter phase II trial. Semin Oncol, 29, 25-29.
Hale, G., Clark, M. & Waldmann, H. (1985) Therapeutic potential of rat monoclonal antibodies: isotype specificity of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity with human lymphocytes. J Immunol, 134, 3056-3061.
Hamann, P.R., Hinman, L.M., Hollander, I., Beyer, C.F., Lindh, D., Holcomb, R., Hallett, W., Tsou, H.R., Upeslacis, J., Shochat, D., Mountain, A., Flowers, D.A. & Bernstein, I. (2002) Gemtuzumab ozogamicin, a potent and selective anti-CD33 antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Bioconjug Chem, 13, 47-58.
Harlow, E. & Lane, D.P. (eds.) (1988) Antibodies - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press New York.
Harries, M. & Smith, I. (2002) The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin). Endocr Relat Cancer, 9, 75-85.
Literatur
111
Harris, N.L., Jaffe, E.S., Diebold, J., Flandrin, G., Muller-Hermelink, H.K., Vardiman, J., Lister, T.A. & Bloomfield, C.D. (1999) The World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues. Report of the Clinical Advisory Committee meeting, Airlie House, Virginia, November, 1997. Ann Oncol, 10, 1419-1432.
Hartmann, F., Renner, C., Jung, W., da Costa, L., Tembrink, S., Held, G., Sek, A., Konig, J., Bauer, S., Kloft, M. & Pfreundschuh, M. (2001) Anti-CD16/CD30 bispecific antibody treatment for Hodgkin's disease: role of infusion schedule and costimulation with cytokines. Clin Cancer Res, 7, 1873-1881.
Hartmann, F., Renner, C., Jung, W., Deisting, C., Juwana, M., Eichentopf, B., Kloft, M. & Pfreundschuh, M. (1997) Treatment of refractory Hodgkin's disease with an anti-CD16/CD30 bispecific antibody. Blood, 89, 2042-2047.
Hartmann, F., Renner, C., Jung, W., Sahin, U. & Pfreundschuh, M. (1996) Treatment of Hodgkin's disease with bispecific antibodies. Ann Oncol, 7 Suppl 4, 143-146.
Hayden, M.S., Linsley, P.S., Gayle, M.A., Bajorath, J., Brady, W.A., Norris, N.A., Fell, H.P., Ledbetter, J.A. & Gilliland, L.K. (1994) Single-chain mono- and bispecific antibody derivatives with novel biological properties and antitumour activity from a COS cell transient expression system. Ther Immunol, 1, 3-15.
Hekman, A., Honselaar, A., Vuist, W.M., Sein, J.J., Rodenhuis, S., ten Bokkel Huinink, W.W., Somers, R., Rumke, P. & Melief, C.J. (1991) Initial experience with treatment of human B cell lymphoma with anti-CD19 monoclonal antibody. Cancer Immunol Immunother, 32, 364-372.
Herrera, L., Stanciu-Herrera, C., Morgan, C., Ghetie, V. & Vitetta, E.S. (2006) Anti-CD19 immunotoxin enhances the activity of chemotherapy in severe combined immunodeficient mice with human pre-B acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma, 47, 2380-2387.
Hibbs, M.L., Selvaraj, P., Carpen, O., Springer, T.A., Kuster, H., Jouvin, M.H. & Kinet, J.P. (1989) Mechanisms for regulating expression of membrane isoforms of Fc gamma RIII (CD16). Science, 246, 1608-1611.
Hoelzer, D., Gokbuget, N., Ottmann, O., Pui, C.H., Relling, M.V., Appelbaum, F.R., van Dongen, J.J. & Szczepanski, T. (2002) Acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 162-192.
Holliger, P., Prospero, T. & Winter, G. (1993) "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6444-6448.
Hombach, A., Jung, W., Pohl, C., Renner, C., Sahin, U., Schmits, R., Wolf, J., Kapp, U., Diehl, V. & Pfreundschuh, M. (1993) A CD16/CD30 bispecific monoclonal antibody induces lysis of Hodgkin's cells by unstimulated natural killer cells in vitro and in vivo. Int J Cancer, 55, 830-836.
Horning, S.J., Younes, A., Jain, V., Kroll, S., Lucas, J., Podoloff, D. & Goris, M. (2005) Efficacy and safety of tositumomab and iodine-131 tositumomab (Bexxar) in B-cell lymphoma, progressive after rituximab. J Clin Oncol, 23, 712-719.
Hosen, N., Park, C.Y., Tatsumi, N., Oji, Y., Sugiyama, H., Gramatzki, M., Krensky, A.M. & Weissman, I.L. (2007) CD96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 11008-11013.
Hotfilder, M., Rottgers, S., Rosemann, A., Schrauder, A., Schrappe, M., Pieters, R., Jurgens, H., Harbott, J. & Vormoor, J. (2005) Leukemic stem cells in childhood high-risk ALL/t(9;22) and t(4;11) are present in primitive lymphoid-restricted CD34+CD19- cells. Cancer Res, 65, 1442-1449.
Hurwitz, R., Hozier, J., LeBien, T., Minowada, J., Gajl-Peczalska, K., Kubonishi, I. & Kersey, J. (1979) Characterization of a leukemic cell line of the pre-B phenotype. Int J Cancer, 23, 174-180.
Literatur
112
Huston, J.S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotny, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri, R.E., Haber, E., Crea, R. & et al. (1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 85, 5879-5883.
Jaffe, E.S., Harries, M., H., S. & J.W., V. (eds.) (2001) World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press, Lyon.
Jain, R.K. & Baxter, L.T. (1988) Mechanisms of heterogeneous distribution of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors: significance of elevated interstitial pressure. Cancer Res, 48, 7022-7032.
James, N.D., Atherton, P.J., Jones, J., Howie, A.J., Tchekmedyian, S. & Curnow, R.T. (2001) A phase II study of the bispecific antibody MDX-H210 (anti-HER2 x CD64) with GM-CSF in HER2+ advanced prostate cancer. Br J Cancer, 85, 152-156.
Jedema, I., Barge, R.M., van der Velden, V.H., Nijmeijer, B.A., van Dongen, J.J., Willemze, R. & Falkenburg, J.H. (2004) Internalization and cell cycle-dependent killing of leukemic cells by Gemtuzumab Ozogamicin: rationale for efficacy in CD33-negative malignancies with endocytic capacity. Leukemia, 18, 316-325.
Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S. & Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5 th ed, Public Health Service, NIH, Washington D.C.
Kalachikov, S., Migliazza, A., Cayanis, E., Fracchiolla, N.S., Bonaldo, M.F., Lawton, L., Jelenc, P., Ye, X., Qu, X., Chien, M., Hauptschein, R., Gaidano, G., Vitolo, U., Saglio, G., Resegotti, L., Brodjansky, V., Yankovsky, N., Zhang, P., Soares, M.B., Russo, J., Edelman, I.S., Efstratiadis, A., Dalla-Favera, R. & Fischer, S.G. (1997) Cloning and gene mapping of the chromosome 13q14 region deleted in chronic lymphocytic leukemia. Genomics, 42, 369-377.
Karpovsky, B., Titus, J.A., Stephany, D.A. & Segal, D.M. (1984) Production of target-specific effector cells using hetero-cross-linked aggregates containing anti-target cell and anti-Fc gamma receptor antibodies. J Exp Med, 160, 1686-1701.
Keating, M.J., Flinn, I., Jain, V., Binet, J.L., Hillmen, P., Byrd, J., Albitar, M., Brettman, L., Santabarbara, P., Wacker, B. & Rai, K.R. (2002) Therapeutic role of alemtuzumab (Campath-1H) in patients who have failed fludarabine: results of a large international study. Blood, 99, 3554-3561.
Kennedy, B., Rawstron, A., Carter, C., Ryan, M., Speed, K., Lucas, G. & Hillmen, P. (2002a) Campath-1H and fludarabine in combination are highly active in refractory chronic lymphocytic leukemia. Blood, 99, 2245-2247.
Kennedy, G.A., Tey, S.K., Cobcroft, R., Marlton, P., Cull, G., Grimmett, K., Thomson, D. & Gill, D. (2002b) Incidence and nature of CD20-negative relapses following rituximab therapy in aggressive B-cell non-Hodgkin's lymphoma: a retrospective review. Br J Haematol, 119, 412-416.
Khan, G. (2006) Epstein-Barr virus, cytokines, and inflammation: a cocktail for the pathogenesis of Hodgkin's lymphoma? Exp Hematol, 34, 399-406.
Kimura, H., Sakai, K., Arao, T., Shimoyama, T., Tamura, T. & Nishio, K. (2007a) Antibody-dependent cellular cytotoxicity of cetuximab against tumor cells with wild-type or mutant epidermal growth factor receptor. Cancer Sci, 98, 1275-1280.
Kimura, M., Yamaguchi, M., Nakamura, S., Imai, H., Ueno, S., Ogawa, S., Miyazaki, K., Oka, K., Ohno, T., Kita, K., Kobayashi, T. & Shiku, H. (2007b) Clinicopathologic significance of loss of CD19 expression in diffuse large B-cell lymphoma. Int J Hematol, 85, 41-48.
Kipriyanov, S.M., Cochlovius, B., Schafer, H.J., Moldenhauer, G., Bahre, A., Le Gall, F., Knackmuss, S. & Little, M. (2002) Synergistic antitumor effect of bispecific CD19 x CD3 and CD19 x CD16 diabodies in a preclinical model of non-Hodgkin's lymphoma. J Immunol, 169, 137-144.
Literatur
113
Kipriyanov, S.M., Moldenhauer, G., Schuhmacher, J., Cochlovius, B., Von der Lieth, C.W., Matys, E.R. & Little, M. (1999) Bispecific tandem diabody for tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics. J Mol Biol, 293, 41-56.
Knowles, D.M. (2003) Etiology and pathogenesis of AIDS-related non-Hodgkin's lymphoma. Hematol Oncol Clin North Am, 17, 785-820.
Koene, H.R., de Haas, M., Kleijer, M., Roos, D. & von dem Borne, A.E. (1996) NA-phenotype-dependent differences in neutrophil Fc gamma RIIIb expression cause differences in plasma levels of soluble Fc gamma RIII. Br J Haematol, 93, 235-241.
Kohler, G. & Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256, 495-497.
Kontermann, R.E. (2005) Recombinant bispecific antibodies for cancer therapy. Acta Pharmacol Sin, 26, 1-9.
Kortt, A.A., Lah, M., Oddie, G.W., Gruen, C.L., Burns, J.E., Pearce, L.A., Atwell, J.L., McCoy, A.J., Howlett, G.J., Metzger, D.W., Webster, R.G. & Hudson, P.J. (1997) Single-chain Fv fragments of anti-neuraminidase antibody NC10 containing five- and ten-residue linkers form dimers and with zero-residue linker a trimer. Protein Eng, 10, 423-433.
Kostelny, S.A., Cole, M.S. & Tso, J.Y. (1992) Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers. J Immunol, 148, 1547-1553.
Kreitman, R.J., Squires, D.R., Stetler-Stevenson, M., Noel, P., FitzGerald, D.J., Wilson, W.H. & Pastan, I. (2005) Phase I trial of recombinant immunotoxin RFB4(dsFv)-PE38 (BL22) in patients with B-cell malignancies. J Clin Oncol, 23, 6719-6729.
Kreitman, R.J., Wilson, W.H., Bergeron, K., Raggio, M., Stetler-Stevenson, M., FitzGerald, D.J. & Pastan, I. (2001) Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 in chemotherapy-resistant hairy-cell leukemia. N Engl J Med, 345, 241-247.
Kung, P., Goldstein, G., Reinherz, E.L. & Schlossman, S.F. (1979) Monoclonal antibodies defining distinctive human T cell surface antigens. Science, 206, 347-349.
Küppers, R. (2005) Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis. Nat Rev Cancer, 5, 251-262.
Lamers, C.H., Bolhuis, R.L., Warnaar, S.O., Stoter, G. & Gratama, J.W. (1997) Local but no systemic immunomodulation by intraperitoneal treatment of advanced ovarian cancer with autologous T lymphocytes re-targeted by a bi-specific monoclonal antibody. Int J Cancer, 73, 211-219.
Lang, P., Barbin, K., Feuchtinger, T., Greil, J., Peipp, M., Zunino, S.J., Pfeiffer, M., Handgretinger, R., Niethammer, D. & Fey, G.H. (2004) Chimeric CD19 antibody mediates cytotoxic activity against leukemic blasts with effector cells from pediatric patients who received T-cell-depleted allografts. Blood, 103, 3982-3985.
Lanier, L.L., Yu, G. & Phillips, J.H. (1989) Co-association of CD3 zeta with a receptor (CD16) for IgG Fc on human natural killer cells. Nature, 342, 803-805.
Le Gall, F., Kipriyanov, S.M., Moldenhauer, G. & Little, M. (1999) Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding. FEBS Lett, 453, 164-168.
Lee, L.S., Conover, C., Shi, C., Whitlow, M. & Filpula, D. (1999) Prolonged circulating lives of single-chain Fv proteins conjugated with polyethylene glycol: a comparison of conjugation chemistries and compounds. Bioconjug Chem, 10, 973-981.
Lennert, K. & Feller, A.C. (1990) Histopathologie der Non-Hodgkin Lymphome. ed, Springer Verlag, Berlin.
Literatur
114
Link, B.K., Kostelny, S.A., Cole, M.S., Fusselman, W.P., Tso, J.Y. & Weiner, G.J. (1998) Anti-CD3-based bispecific antibody designed for therapy of human B-cell malignancy can induce T-cell activation by antigen-dependent and antigen-independent mechanisms. Int J Cancer, 77, 251-256.
Lipp, T., Schneller, F., Adorf, D., Haferlach, T., Schoch, C. & Schleuning, M. (2003) Akute lymphoblastische Leukämie (ALL) bei Erwachsenen. In: Manual: Leukämien, myelodisplastische und myeloproliferative Syndrome. (ed. by W. Hiddemann & T. Haferlach). Tumorzentrum München und W. Zuckerschwerdt Verlag, München.
Liu, Y., Corcoran, M., Rasool, O., Ivanova, G., Ibbotson, R., Grander, D., Iyengar, A., Baranova, A., Kashuba, V., Merup, M., Wu, X., Gardiner, A., Mullenbach, R., Poltaraus, A., Hultstrom, A.L., Juliusson, G., Chapman, R., Tiller, M., Cotter, F., Gahrton, G., Yankovsky, N., Zabarovsky, E., Einhorn, S. & Oscier, D. (1997) Cloning of two candidate tumor suppressor genes within a 10 kb region on chromosome 13q14, frequently deleted in chronic lymphocytic leukemia. Oncogene, 15, 2463-2473.
Loffler, A., Kufer, P., Lutterbuse, R., Zettl, F., Daniel, P.T., Schwenkenbecher, J.M., Riethmuller, G., Dorken, B. & Bargou, R.C. (2000) A recombinant bispecific single-chain antibody, CD19 x CD3, induces rapid and high lymphoma-directed cytotoxicity by unstimulated T lymphocytes. Blood, 95, 2098-2103.
Lonberg, N., Taylor, L.D., Harding, F.A., Trounstine, M., Higgins, K.M., Schramm, S.R., Kuo, C.C., Mashayekh, R., Wymore, K., McCabe, J.G. & et al. (1994) Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature, 368, 856-859.
Lu, D., Jimenez, X., Zhang, H., Atkins, A., Brennan, L., Balderes, P., Bohlen, P., Witte, L. & Zhu, Z. (2003) Di-diabody: a novel tetravalent bispecific antibody molecule by design. J Immunol Methods, 279, 219-232.
Lu, D., Jimenez, X., Zhang, H., Bohlen, P., Witte, L. & Zhu, Z. (2002) Fab-scFv fusion protein: an efficient approach to production of bispecific antibody fragments. J Immunol Methods, 267, 213-226.
Mack, M., Riethmuller, G. & Kufer, P. (1995) A small bispecific antibody construct expressed as a functional single-chain molecule with high tumor cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 7021-7025.
Manches, O., Lui, G., Chaperot, L., Gressin, R., Molens, J.P., Jacob, M.C., Sotto, J.J., Leroux, D., Bensa, J.C. & Plumas, J. (2003) In vitro mechanisms of action of rituximab on primary non-Hodgkin lymphomas. Blood, 101, 949-954.
Marks, J.D., Griffiths, A.D., Malmqvist, M., Clackson, T.P., Bye, J.M. & Winter, G. (1992) By-passing immunization: building high affinity human antibodies by chain shuffling. Biotechnology (N Y), 10, 779-783.
Masir, N., Marafioti, T., Jones, M., Natkunam, Y., Rudiger, T., Hansmann, M.L. & Mason, D.Y. (2006) Loss of CD19 expression in B-cell neoplasms. Histopathology, 48, 239-246.
Matsumoto, A.K., Martin, D.R., Carter, R.H., Klickstein, L.B., Ahearn, J.M. & Fearon, D.T. (1993) Functional dissection of the CD21/CD19/TAPA-1/Leu-13 complex of B lymphocytes. J Exp Med, 178, 1407-1417.
McCall, A.M., Shahied, L., Amoroso, A.R., Horak, E.M., Simmons, H.H., Nielson, U., Adams, G.P., Schier, R., Marks, J.D. & Weiner, L.M. (2001) Increasing the affinity for tumor antigen enhances bispecific antibody cytotoxicity. J Immunol, 166, 6112-6117.
McLaughlin, P., Grillo-Lopez, A.J., Link, B.K., Levy, R., Czuczman, M.S., Williams, M.E., Heyman, M.R., Bence-Bruckler, I., White, C.A., Cabanillas, F., Jain, V., Ho, A.D., Lister, J., Wey, K., Shen, D. & Dallaire, B.K. (1998) Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program. J Clin Oncol, 16, 2825-2833.
Literatur
115
Meeker, T.C., Lowder, J., Maloney, D.G., Miller, R.A., Thielemans, K., Warnke, R. & Levy, R. (1985) A clinical trial of anti-idiotype therapy for B cell malignancy. Blood, 65, 1349-1363.
Meeker, T.C., Miller, R.A., Link, M.P., Bindl, J., Warnke, R. & Levy, R. (1984) A unique human B lymphocyte antigen defined by a monoclonal antibody. Hybridoma, 3, 305-320.
Meng, R., Smallshaw, J.E., Pop, L.M., Yen, M., Liu, X., Le, L., Ghetie, M.A., Vitetta, E.S. & Ghetie, V. (2004) The evaluation of recombinant, chimeric, tetravalent antihuman CD22 antibodies. Clin Cancer Res, 10, 1274-1281.
Miller, R.A., Maloney, D.G., Warnke, R. & Levy, R. (1982) Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotype antibody. N Engl J Med, 306, 517-522.
Milstein, C. & Cuello, A.C. (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature, 305, 537-540.
Mueller, D. & Kontermann, R. (2007) Bispecific Antibodies. In: Handbook of Therapeutic Antibodies (ed. by S. Duebel).
Muller, D., Karle, A., Meissburger, B., Hofig, I., Stork, R. & Kontermann, R.E. (2007) Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibody molecules by fusion to human serum albumin. J Biol Chem, 282, 12650-12660.
Muller, D. & Kontermann, R. (2007) Bispecific Antibodies. In: Handbook of Therapeutic Antibodies (ed. by S. Duebel).
Muller, K.M., Arndt, K.M. & Pluckthun, A. (1998a) A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity. FEBS Lett, 432, 45-49.
Muller, K.M., Arndt, K.M., Strittmatter, W. & Pluckthun, A. (1998b) The first constant domain (C(H)1 and C(L)) of an antibody used as heterodimerization domain for bispecific miniantibodies. FEBS Lett, 422, 259-264.
Musolino, A., Naldi, N., Bortesi, B., Pezzuolo, D., Capelletti, M., Missale, G., Laccabue, D., Zerbini, A., Camisa, R., Bisagni, G., Neri, T.M. & Ardizzoni, A. (2008) Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol, 26, 1789-1796.
Nadal, E. & Olavarria, E. (2004) Imatinib mesylate (Gleevec/Glivec) a molecular-targeted therapy for chronic myeloid leukaemia and other malignancies. Int J Clin Pract, 58, 511-516.
Nadler, L.M., Anderson, K.C., Marti, G., Bates, M., Park, E., Daley, J.F. & Schlossman, S.F. (1983) B4, a human B lymphocyte-associated antigen expressed on normal, mitogen-activated, and malignant B lymphocytes. J Immunol, 131, 244-250.
Nadler, L.M., Stashenko, P., Hardy, R., Kaplan, W.D., Button, L.N., Kufe, D.W., Antman, K.H. & Schlossman, S.F. (1980) Serotherapy of a patient with a monoclonal antibody directed against a human lymphoma-associated antigen. Cancer Res, 40, 3147-3154.
Naramura, M., Gillies, S.D., Mendelsohn, J., Reisfeld, R.A. & Mueller, B.M. (1993) Therapeutic potential of chimeric and murine anti-(epidermal growth factor receptor) antibodies in a metastasis model for human melanoma. Cancer Immunol Immunother, 37, 343-349.
Navarro-Sarabia, F., Ariza-Ariza, R., Hernandez-Cruz, B. & Villanueva, I. (2006) Adalimumab for treating rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 33, 1075-1081.
Newton, D.L. & Ryback, S.M. (2001) Antibody targeted therapeutics for lymphoma: new focus on the CD22 antigen and RNA. Expert Opin Biol Ther, 1, 995-1003.
Literatur
116
Oduncu, F.S., Eichhorst, B., Nerl, C., Röhnisch, T., Schneller, F., Hallek, M. & Emmerich, B. (2004) Lymphozytische Lymphome. In: Manual: Maligne Lymphome (ed. by B. Emmerich). Tumorzentrum München und W. Zuckerschwerdt Verlag, München.
Pack, P. & Pluckthun, A. (1992) Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli. Biochemistry, 31, 1579-1584.
Pear, W.S., Nolan, G.P., Scott, M.L. & Baltimore, D. (1993) Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 8392-8396.
Pegoraro, L., Matera, L., Ritz, J., Levis, A., Palumbo, A. & Biagini, G. (1983) Establishment of a Ph1-positive human cell line (BV173). J Natl Cancer Inst, 70, 447-453.
Peipp, M., Kupers, H., Saul, D., Schlierf, B., Greil, J., Zunino, S.J., Gramatzki, M. & Fey, G.H. (2002) A recombinant CD7-specific single-chain immunotoxin is a potent inducer of apoptosis in acute leukemic T cells. Cancer Res, 62, 2848-2855.
Peipp, M. & Valerius, T. (2002) Bispecific antibodies targeting cancer cells. Biochem Soc Trans, 30, 507-511.
Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology, 3, 83-105.
Posey, J.A., Raspet, R., Verma, U., Deo, Y.M., Keller, T., Marshall, J.L., Hodgson, J., Mazumder, A. & Hawkins, M.J. (1999) A pilot trial of GM-CSF and MDX-H210 in patients with erbB-2-positive advanced malignancies. J Immunother, 22, 371-379.
Press, O.W., Farr, A.G., Borroz, K.I., Anderson, S.K. & Martin, P.J. (1989) Endocytosis and degradation of monoclonal antibodies targeting human B-cell malignancies. Cancer Res, 49, 4906-4912.
Puck, T.T., Cieciura, S.J. & Robinson, A. (1958) Genetics of somatic mammalian cells. III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J Exp Med, 108, 945-956.
Raghavan, M., Chen, M.Y., Gastinel, L.N. & Bjorkman, P.J. (1994) Investigation of the interaction between the class I MHC-related Fc receptor and its immunoglobulin G ligand. Immunity, 1, 303-315.
Rai, K.R., Sawitsky, A., Cronkite, E.P., Chanana, A.D., Levy, R.N. & Pasternack, B.S. (1975) Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 46, 219-234.
Ravetch, J.V. & Bolland, S. (2001) IgG Fc receptors. Annu Rev Immunol, 19, 275-290.
Ravetch, J.V. & Perussia, B. (1989) Alternative membrane forms of Fc gamma RIII(CD16) on human natural killer cells and neutrophils. Cell type-specific expression of two genes that differ in single nucleotide substitutions. J Exp Med, 170, 481-497.
Reff, M.E., Carner, K., Chambers, K.S., Chinn, P.C., Leonard, J.E., Raab, R., Newman, R.A., Hanna, N. & Anderson, D.R. (1994) Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood, 83, 435-445.
Reiter, Y., Brinkmann, U., Kreitman, R.J., Jung, S.H., Lee, B. & Pastan, I. (1994) Stabilization of the Fv fragments in recombinant immunotoxins by disulfide bonds engineered into conserved framework regions. Biochemistry, 33, 5451-5459.
Renner, C., Jung, W., Sahin, U., Denfeld, R., Pohl, C., Trumper, L., Hartmann, F., Diehl, V., van Lier, R. & Pfreundschuh, M. (1994) Cure of xenografted human tumors by bispecific monoclonal antibodies and human T cells. Science, 264, 833-835.
Ridgway, J.B., Presta, L.G. & Carter, P. (1996) 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization. Protein Eng, 9, 617-621.
Literatur
117
Rothe, G. & Schmitz, G. (1996) Consensus protocol for the flow cytometric immunophenotyping of hematopoietic malignancies. Working Group on Flow Cytometry and Image Analysis. Leukemia, 10, 877-895.
Sambrook , J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Scheid, C., Pettengell, R., Ghielmini, M., Radford, J.A., Morgenstern, G.R., Stern, P.L. & Crowther, D. (1995) Time-course of the recovery of cellular immune function after high-dose chemotherapy and peripheral blood progenitor cell transplantation for high-grade non-Hodgkin's lymphoma. Bone Marrow Transplant, 15, 901-906.
Schetelig, J., Thiede, C., Bornhauser, M., Schwerdtfeger, R., Kiehl, M., Beyer, J., Sayer, H.G., Kroger, N., Hensel, M., Scheffold, C., Held, T.K., Hoffken, K., Ho, A.D., Kienast, J., Neubauer, A., Zander, A.R., Fauser, A.A., Ehninger, G. & Siegert, W. (2003) Evidence of a graft-versus-leukemia effect in chronic lymphocytic leukemia after reduced-intensity conditioning and allogeneic stem-cell transplantation: the Cooperative German Transplant Study Group. J Clin Oncol, 21, 2747-2753.
Scheuermann, R.H. & Racila, E. (1995) CD19 antigen in leukemia and lymphoma diagnosis and immunotherapy. Leuk Lymphoma, 18, 385-397.
Schier, R., Bye, J., Apell, G., McCall, A., Adams, G.P., Malmqvist, M., Weiner, L.M. & Marks, J.D. (1996) Isolation of high-affinity monomeric human anti-c-erbB-2 single chain Fv using affinity-driven selection. J Mol Biol, 255, 28-43.
Schlereth, B., Quadt, C., Dreier, T., Kufer, P., Lorenczewski, G., Prang, N., Brandl, C., Lippold, S., Cobb, K., Brasky, K., Leo, E., Bargou, R., Murthy, K. & Baeuerle, P.A. (2006) T-cell activation and B-cell depletion in chimpanzees treated with a bispecific anti-CD19/anti-CD3 single-chain antibody construct. Cancer Immunol Immunother, 55, 503-514.
Schneider, M.A., Bruhl, H., Wechselberger, A., Cihak, J., Stangassinger, M., Schlondorff, D. & Mack, M. (2005) In vitro and in vivo properties of a dimeric bispecific single-chain antibody IgG-fusion protein for depletion of CCR2+ target cells in mice. Eur J Immunol, 35, 987-995.
Schoonjans, R., Willems, A., Schoonooghe, S., Fiers, W., Grooten, J. & Mertens, N. (2000) Fab chains as an efficient heterodimerization scaffold for the production of recombinant bispecific and trispecific antibody derivatives. J Immunol, 165, 7050-7057.
Schoonjans, R., Willems, A., Schoonooghe, S., Leoen, J., Grooten, J. & Mertens, N. (2001) A new model for intermediate molecular weight recombinant bispecific and trispecific antibodies by efficient heterodimerization of single chain variable domains through fusion to a Fab-chain. Biomol Eng, 17, 193-202.
Schrama, D., Reisfeld, R.A. & Becker, J.C. (2006) Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov, 5, 147-159.
Schrappe, M., Reiter, A., Ludwig, W.D., Harbott, J., Zimmermann, M., Hiddemann, W., Niemeyer, C., Henze, G., Feldges, A., Zintl, F., Kornhuber, B., Ritter, J., Welte, K., Gadner, H. & Riehm, H. (2000) Improved outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use of anthracyclines and cranial radiotherapy: results of trial ALL-BFM 90. German-Austrian-Swiss ALL-BFM Study Group. Blood, 95, 3310-3322.
Schwemmlein, M., Peipp, M., Barbin, K., Saul, D., Stockmeyer, B., Repp, R., Birkmann, J., Oduncu, F., Emmerich, B. & Fey, G.H. (2006) A CD33-specific single-chain immunotoxin mediates potent apoptosis of cultured human myeloid leukaemia cells. Br J Haematol, 133, 141-151.
Schwemmlein, M., Stieglmaier, J., Kellner, C., Peipp, M., Saul, D., Oduncu, F., Emmerich, B., Stockmeyer, B., Lang, P., Beck, J.D. & Fey, G.H. (2007) A CD19-specific single-chain immunotoxin mediates potent apoptosis of B-lineage leukemic cells. Leukemia, 21, 1405-1412.
Literatur
118
Segal, D.M., Weiner, G.J. & Weiner, L.M. (1999) Bispecific antibodies in cancer therapy. Curr Opin Immunol, 11, 558-562.
Selvaraj, P., Carpen, O., Hibbs, M.L. & Springer, T.A. (1989) Natural killer cell and granulocyte Fc gamma receptor III (CD16) differ in membrane anchor and signal transduction. J Immunol, 143, 3283-3288.
Shahied, L.S., Tang, Y., Alpaugh, R.K., Somer, R., Greenspon, D. & Weiner, L.M. (2004) Bispecific minibodies targeting HER2/neu and CD16 exhibit improved tumor lysis when placed in a divalent tumor antigen binding format. J Biol Chem, 279, 53907-53914.
Shan, D., Ledbetter, J.A. & Press, O.W. (1998) Apoptosis of malignant human B cells by ligation of CD20 with monoclonal antibodies. Blood, 91, 1644-1652.
Shipp, M.A., Abeloff, M.D., Antman, K.H., Carroll, G., Hagenbeek, A., Loeffler, M., Montserrat, E., Radford, J.A., Salles, G., Schmitz, N., Symann, M., Armitage, J.O., Coiffier, B. & Philip, T. (1999) International Consensus Conference on high-dose therapy with hematopoietic stem-cell transplantation in aggressive non-Hodgkin's lymphomas: report of the jury. Ann Oncol, 10, 13-19.
Simmons, D. & Seed, B. (1988) The Fc gamma receptor of natural killer cells is a phospholipid-linked membrane protein. Nature, 333, 568-570.
Smith, S.L. (1996) Ten years of Orthoclone OKT3 (muromonab-CD3): a review. J Transpl Coord, 6, 109-119; quiz 120-101.
Stamenkovic, I. & Seed, B. (1988) CD19, the earliest differentiation antigen of the B cell lineage, bears three extracellular immunoglobulin-like domains and an Epstein-Barr virus-related cytoplasmic tail. J Exp Med, 168, 1205-1210.
Stieglmaier, J. (2007) Entwicklung und Charakterisierung unterschiedlicher Antikörper-basierter Therapeutika zur Behandlung CD19-positiver Leukämien. Dissertation am Lehrstuhl für Genetik, Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen-Nürnberg.
Stieglmaier, J., Bremer, E., Kellner, C., Liebig, T.M., Ten Cate, B., Peipp, M., Schulze-Koops, H., Pfeiffer, M., Buhring, H.J., Greil, J., Oduncu, F., Emmerich, B., Fey, G.H. & Helfrich, W. (2007) Selective induction of apoptosis in leukemic B-lymphoid cells by a CD19-specific TRAIL fusion protein. Cancer Immunol Immunother.
Stone, M.J., Sausville, E.A., Fay, J.W., Headlee, D., Collins, R.H., Figg, W.D., Stetler-Stevenson, M., Jain, V., Jaffe, E.S., Solomon, D., Lush, R.M., Senderowicz, A., Ghetie, V., Schindler, J., Uhr, J.W. & Vitetta, E.S. (1996) A phase I study of bolus versus continuous infusion of the anti-CD19 immunotoxin, IgG-HD37-dgA, in patients with B-cell lymphoma. Blood, 88, 1188-1197.
Suntharalingam, G., Perry, M.R., Ward, S., Brett, S.J., Castello-Cortes, A., Brunner, M.D. & Panoskaltsis, N. (2006) Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med, 355, 1018-1028.
Suresh, M.R., Cuello, A.C. & Milstein, C. (1986) Bispecific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas. Methods Enzymol, 121, 210-228.
Tacke, M., Hanke, G., Hanke, T. & Hunig, T. (1997) CD28-mediated induction of proliferation in resting T cells in vitro and in vivo without engagement of the T cell receptor: evidence for functionally distinct forms of CD28. Eur J Immunol, 27, 239-247.
Talmadge, J.E., Meyers, K.M., Prieur, D.J. & Starkey, J.R. (1980) Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature, 284, 622-624.
Tang, Y., Lou, J., Alpaugh, R.K., Robinson, M.K., Marks, J.D. & Weiner, L.M. (2007) Regulation of antibody-dependent cellular cytotoxicity by IgG intrinsic and apparent affinity for target antigen. J Immunol, 179, 2815-2823.
Literatur
119
Taussig, D.C., Pearce, D.J., Simpson, C., Rohatiner, A.Z., Lister, T.A., Kelly, G., Luongo, J.L., Danet-Desnoyers, G.A. & Bonnet, D. (2005) Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers: implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia. Blood, 106, 4086-4092.
Tedder, T.F. & Isaacs, C.M. (1989) Isolation of cDNAs encoding the CD19 antigen of human and mouse B lymphocytes. A new member of the immunoglobulin superfamily. J Immunol, 143, 712-717.
Thirman, M.J., Gill, H.J., Burnett, R.C., Mbangkollo, D., McCabe, N.R., Kobayashi, H., Ziemin-van der Poel, S., Kaneko, Y., Morgan, R., Sandberg, A.A. & et al. (1993) Rearrangement of the MLL gene in acute lymphoblastic and acute myeloid leukemias with 11q23 chromosomal translocations. N Engl J Med, 329, 909-914.
Thorpe, S.J., Turner, C., Heath, A., Feavers, I., Vatn, I., Natvig, J.B. & Thompson, K.M. (2003) Clonal analysis of a human antimouse antibody (HAMA) response. Scand J Immunol, 57, 85-92.
Todorovska, A., Roovers, R.C., Dolezal, O., Kortt, A.A., Hoogenboom, H.R. & Hudson, P.J. (2001) Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting. J Immunol Methods, 248, 47-66.
Tur, M.K., Huhn, M., Thepen, T., Stocker, M., Krohn, R., Vogel, S., Jost, E., Osieka, R., van de Winkel, J.G., Fischer, R., Finnern, R. & Barth, S. (2003) Recombinant CD64-specific single chain immunotoxin exhibits specific cytotoxicity against acute myeloid leukemia cells. Cancer Res, 63, 8414-8419.
Tutt, A.L., French, R.R., Illidge, T.M., Honeychurch, J., McBride, H.M., Penfold, C.A., Fearon, D.T., Parkhouse, R.M., Klaus, G.G. & Glennie, M.J. (1998) Monoclonal antibody therapy of B cell lymphoma: signaling activity on tumor cells appears more important than recruitment of effectors. J Immunol, 161, 3176-3185.
Valerius, T., Stockmeyer, B., van Spriel, A.B., Graziano, R.F., van den Herik-Oudijk, I.E., Repp, R., Deo, Y.M., Lund, J., Kalden, J.R., Gramatzki, M. & van de Winkel, J.G. (1997) FcalphaRI (CD89) as a novel trigger molecule for bispecific antibody therapy. Blood, 90, 4485-4492.
Valone, F.H., Kaufman, P.A., Guyre, P.M., Lewis, L.D., Memoli, V., Deo, Y., Graziano, R., Fisher, J.L., Meyer, L., Mrozek-Orlowski, M. & et al. (1995) Phase Ia/Ib trial of bispecific antibody MDX-210 in patients with advanced breast or ovarian cancer that overexpresses the proto-oncogene HER-2/neu. J Clin Oncol, 13, 2281-2292.
van Ojik, H.H. & Valerius, T. (2001) Preclinical and clinical data with bispecific antibodies recruiting myeloid effector cells for tumor therapy. Crit Rev Oncol Hematol, 38, 47-61.
Vitale, C., Romagnani, C., Falco, M., Ponte, M., Vitale, M., Moretta, A., Bacigalupo, A., Moretta, L. & Mingari, M.C. (1999) Engagement of p75/AIRM1 or CD33 inhibits the proliferation of normal or leukemic myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 15091-15096.
Vlasveld, L.T., Hekman, A., Vyth-Dreese, F.A., Melief, C.J., Sein, J.J., Voordouw, A.C., Dellemijn, T.A. & Rankin, E.M. (1995) Treatment of low-grade non-Hodgkin's lymphoma with continuous infusion of low-dose recombinant interleukin-2 in combination with the B-cell-specific monoclonal antibody CLB-CD19. Cancer Immunol Immunother, 40, 37-47.
Weiner, G.J. & Hillstrom, J.R. (1991) Bispecific anti-idiotype/anti-CD3 antibody therapy of murine B cell lymphoma. J Immunol, 147, 4035-4044.
Weiner, L.M., Alpaugh, R.K., Amoroso, A.R., Adams, G.P., Ring, D.B. & Barth, M.W. (1996) Human neutrophil interactions of a bispecific monoclonal antibody targeting tumor and human Fc gamma RIII. Cancer Immunol Immunother, 42, 141-150.
Weiner, L.M., Clark, J.I., Davey, M., Li, W.S., Garcia de Palazzo, I., Ring, D.B. & Alpaugh, R.K. (1995) Phase I trial of 2B1, a bispecific monoclonal antibody targeting c-erbB-2 and Fc gamma RIII. Cancer Res, 55, 4586-4593.
Literatur
120
Weiner, L.M., Holmes, M., Richeson, A., Godwin, A., Adams, G.P., Hsieh-Ma, S.T., Ring, D.B. & Alpaugh, R.K. (1993) Binding and cytotoxicity characteristics of the bispecific murine monoclonal antibody 2B1. J Immunol, 151, 2877-2886.
Weinstein, J.N., Eger, R.R., Covell, D.G., Black, C.D., Mulshine, J., Carrasquillo, J.A., Larson, S.M. & Keenan, A.M. (1987) The pharmacology of monoclonal antibodies. Ann N Y Acad Sci, 507, 199-210.
Weisdorf, D.J., Andersen, J.W., Glick, J.H. & Oken, M.M. (1992) Survival after relapse of low-grade non-Hodgkin's lymphoma: implications for marrow transplantation. J Clin Oncol, 10, 942-947.
Weng, W.K. & Levy, R. (2001) Expression of complement inhibitors CD46, CD55, and CD59 on tumor cells does not predict clinical outcome after rituximab treatment in follicular non-Hodgkin lymphoma. Blood, 98, 1352-1357.
Weng, W.K. & Levy, R. (2003) Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol, 21, 3940-3947.
Wierda, W.G. & O'Brien, S. (2001) Immunotherapy of chronic lymphocytic leukemia. Expert Rev Anticancer Ther, 1, 73-83.
Willems, A., Leoen, J., Schoonooghe, S., Grooten, J. & Mertens, N. (2003) Optimizing expression and purification from cell culture medium of trispecific recombinant antibody derivatives. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 786, 161-176.
Willuda, J., Honegger, A., Waibel, R., Schubiger, P.A., Stahel, R., Zangemeister-Wittke, U. & Pluckthun, A. (1999) High thermal stability is essential for tumor targeting of antibody fragments: engineering of a humanized anti-epithelial glycoprotein-2 (epithelial cell adhesion molecule) single-chain Fv fragment. Cancer Res, 59, 5758-5767.
Witzig, T.E., White, C.A., Wiseman, G.A., Gordon, L.I., Emmanouilides, C., Raubitschek, A., Janakiraman, N., Gutheil, J., Schilder, R.J., Spies, S., Silverman, D.H., Parker, E. & Grillo-Lopez, A.J. (1999) Phase I/II trial of IDEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatment of relapsed or refractory CD20(+) B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 17, 3793-3803.
Wurflein, D., Dechant, M., Stockmeyer, B., Tutt, A.L., Hu, P., Repp, R., Kalden, J.R., van de Winkel, J.G., Epstein, A.L., Valerius, T., Glennie, M. & Gramatzki, M. (1998) Evaluating antibodies for their capacity to induce cell-mediated lysis of malignant B cells. Cancer Res, 58, 3051-3058.
Xie, Z., Guo, N., Yu, M., Hu, M. & Shen, B. (2005) A new format of bispecific antibody: highly efficient heterodimerization, expression and tumor cell lysis. J Immunol Methods, 296, 95-101.
Yokota, T., Milenic, D.E., Whitlow, M. & Schlom, J. (1992) Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res, 52, 3402-3408.
Zhang, W., Gordon, M., Schultheis, A.M., Yang, D.Y., Nagashima, F., Azuma, M., Chang, H.M., Borucka, E., Lurje, G., Sherrod, A.E., Iqbal, S., Groshen, S. & Lenz, H.J. (2007) FCGR2A and FCGR3A polymorphisms associated with clinical outcome of epidermal growth factor receptor expressing metastatic colorectal cancer patients treated with single-agent cetuximab. J Clin Oncol, 25, 3712-3718.
Zuo, Z., Jimenez, X., Witte, L. & Zhu, Z. (2000) An efficient route to the production of an IgG-like bispecific antibody. Protein Eng, 13, 361-367.
Literatur
121
8 Weitere Informationsquellen und Internetseiten
Broschüren
Krebs in Deutschland 2003 – 2004. Häufigkeiten und Trends.
6. überarbeitete Auflage. Robert Koch-Institut (Hrsg) und die Gesellschaft der epide-
miologischen Krebsregister in Deutschland e. V. (Hrsg). Berlin, 2008
Die blauen Ratgeber: Leukämie bei Erwachsenen
Deutsche Krebshilfe e.V., Ausgabe 6/2005
Internetseiten Kompetenznetz Leukämien http://www.kompetenznetz-leukaemie.de Leukämien im Kindesalter und bei Erwachsenen http://www.krebsinfo.de Kompetenznetz Maligne Lymphome http://www.lymphome.de
Chemotherapie maligner Erkrankungen http:///.krebs-kompass.de/chemotherapie.html
Abkürzungsverzeichnis
122
9 Abkürzungsverzeichnis
µg Mikrogramm
A Adenin
ADCC Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent
cellular cytotoxicity)
ALL akut lymphoblastische Leukämie
AS Aminosäure
BCR B-Zellrezeptor (B-cell receptor)
BSA bovines Serumalbumin
bsbb bispecific bibody
bsscFv bispecific single-chain Fv
bstb bispecific tribody
C Cytosin
CD cluster of differentiation
CDC Komplement-abhängige Zytotoxizität (complement dependent
cytotoxicity)
CDR complemenarity determining region
cDNA copy DNA
CHO Chinese Hamster Ovary
CH konstante Domäne der Immunglobulin schweren Kette
Ci Curie
CL konstante Domäne der Immunglobulin leichten Kette
CLL chronische lymphozytische Leukämie
CMV Cytomegalovirus
cpm counts per minute
DLBCL diffuses großzelliges B-Zell Lymphom (diffuse large B-cell
lymphoma)
DMEM Dulbecco´s modified Eagle Medium
DNA Desoxy-Ribonekleinsäure
EC50 effektive Konzentration
ds disulfidstabilisiert
EF1α Elongationsfaktor 1α
EBV Epstein-Barr Virus
Abkürzungsverzeichnis
123
EGFR epidermal growth factor receptor
E:T Effektor-zu-Zielzell
Fab fragment antigen binding
Fc konstanter Teil eines Antikörpers (fragment crystalizable)
Fv variabler Teil eines Antikörpers (fragment variable)
FcR Fc-Rezeptor
FcRn neonataler Fc-Rezeptor
Fd fragment difficult
FDA US Food and Drug Administration
FI Fluoreszenzintensität
g Gramm
G Guanin; Glycin
GFP green fluorescent protein
GvHD graft versus host disease
GvM graft versus malignancy
h Stunde (hour)
HAMA human anti mouse antibodies
HABA human anti bispecific antibodies
IL Interleukin
Ig Immunglobulin
ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
kb Kilobasen
KD Gleichgewichtskonstante
kDa Kilo-Dalton
kg Kilogramm
KM Knochenmark
LSC leukämische Stammzelle (leukemic stem cell)
M Molar
mAk monoklonaler Antikörper
MCL Mantelzell-Lymphom (mantle-cell lymphoma)
MNCs Mononukleäre Zellen (mononuclear cells)
MRD minimale Restkrankheit (minimal residual disease)
NHL Non-Hodgkin-Lymphom
NK-Zellen Natürliche Killer Zellen
Abkürzungsverzeichnis
124
nM Nanomolar
NOD/SCID non-obese/severe combined immune deficiency
NSLC nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom
PBS phosphate buffered saline
PCR polymerase chain reaction
PE Phycoerythrin
PFA Paraformaldehyd
pM Picomolar
RFP red fluorescent protein
RPMI Roswell Park´s Memorial institute
scFv single-chain fragment variable
sctb single-chain Fv triple-body
SDS sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis
SEM standard error of the mean
t Zeit (time)
T Thymin
TNF Tumor-Nekrose Faktor
VEGF vascular epidermal growth factor
VH variable Region der schweren Kette eines Antikörpers
VL variable Region der leichten Kette eines Antikörpers
ZNS zentrales Nervensystem
Eigene Veröffentlichungen
125
10 Eigene Veröffentlichungen
Kellner, C. & Zunino, S.J. (2004) Nitric oxide is synthesized in acute leukemia cells after exposure to phenolic antioxidants and initially protects against mitochon-drial membrane depolarization. Cancer Lett, 215, 43-52.
Schwemmlein, M., Stieglmaier, J., Kellner, C., Peipp, M., Saul, D., Oduncu, F., Emmerich, B., Stockmeyer, B., Lang, P., Beck, J.D. & Fey, G.H. (2007) A CD19-specific single-chain immunotoxin mediates potent apoptosis of B-lineage leukemic cells. Leukemia, 21, 1405-1412.
Stieglmaier, J., Bremer, E., Kellner, C., Liebig, T.M., ten Cate, B., Peipp, M., Schulze-Koops, H., Pfeiffer, M., Buhring, H.J., Greil, J., Oduncu, F., Emmerich, B., Fey, G.H. & Helfrich, W. (2007) Selective induction of apopto-sis in leukemic B-lymphoid cells by a CD19-specific TRAIL fusion protein. Cancer Immunol Immunother, 57, 233-246.
Schwenkert, M., Birkholz, K., Schwemmlein, M., Kellner, C., Kugler, M., Peipp, M., Nettelbeck, D.M., Schuler-Thurner, B., Schaft, N., Dorrie, J., Ferrone, S., Kampgen, E. & Fey, G.H. (2008) A single chain immunotoxin, targeting the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan, is a potent inducer of apoptosis in cultured human melanoma cells. Melanoma Res, 18, 73-84.
Kellner, C., Bruenke, J., Stieglmaier, J., Schwemmlein, M., Schwenkert, M., Singer, H., Mentz, K., Peipp, M., Lang, P., Oduncu, F., Stockmeyer, B. & Fey, G.H. (2008) A novel CD19-directed recombinant bispecific antibody deri-vative with enhanced immune effector functions for human leukemic cells. J
Immunother; 31:871–884.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Christian Kellner
Geboren am: 19.07.1976
Geburtsort: Nürnberg
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulischer Werdegang
1982-1986: Volksschule Lauf, Hardtstrasse
1986-1995: Christoph-Jacob-Treu Gymnasium Lauf
Sonstiges
1995-1996: Zivildienst beim Arbeiter-Samariter-Bund, Lauf
Studium
1996-2002: Studium der Biologie an der FAU Erlangen-Nürnberg
2002: Diplomarbeit am Lehrstuhl für Genetik der FAU Erlangen-Nürn-
berg
Thema: „Untersuchungen der intrazellulären CD95 Speicher in B-
lymphoiden leukämischen Zelllinien“
Betreuer: Prof. Dr. G. H. Fey und Dr. S. J. Zunino
Berufliche Erfahrung
10/2002-12/20 03: Biologisch-technischer Assistent am Lehrstuhl für Genetik der
FAU Erlangen-Nürnberg
Promotion
seit 01/2004: Dissertation am Lehrstuhl für Genetik der FAU Erlangen-Nürnberg
Thema: „Entwicklung und Charakterisierung bispezifischer Antikör-
per-Derivate zur Immuntherapie CD19-positiver Leukämien und
Lymphome“
Betreuer: Prof. Dr. G. H. Fey
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. G. H. Fey für die Überlassung dieses
interessanten Themas, für die Betreuung meiner Arbeit, für wissenschaftlichen Rat
und für den Gestaltungsspielraum, der es mir ermöglichte, eigene Ideen in diese
Arbeit einfließen zu lassen. Vor allem danke ich ihm für sein mir entgegengebrachtes
Vertrauen in den Zeiten, die nicht sonderlich von Erfolg gekrönt waren.
Herrn PD Dr. B. Stockmeyer danke ich für seine Bereitschaft, das Zweitgutachten
dieser Arbeit zu übernehmen sowie für seine Unterstützung und die erfolgreiche Zu-
sammenarbeit in den vergangenen Jahren.
Bei Herrn Prof. Dr. H. M. Jäck bedanke ich mich für seine Bereitschaft, mich im
Nebenfach Immunologie zu prüfen.
Herrn Prof. Dr. J. H. Brandstätter danke ich für seine Bereitschaft den Prüfungsvor-
sitz zu übernehmen.
Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. B. Stockmeyer, insbesondere
Heike Horner und Barbara Bock, danke ich für Ihre große Hilfe bei der Durchführung
der Zytotoxizitätstests und für die gute Zusammenarbeit.
Dr. M. Peipp und Dr. J. Brünke danke ganz herzlich für ihre Hilfsbereitschaft und für
die zahlreichen guten Ratschläge, durch die so manches Problem in endlosen Tele-
fonaten gelöst werden konnte.
Unseren Kooperationspartnern Herrn PD Dr. F. Oduncu (Klinikum der Universität
München) und Herrn PD Dr. Peter Lang (Universitätsklinik für Kinder- und Jugend-
medizin, Tübingen) danke ich für die erfolgreiche Zusammenarbeit.
Prof. Dr. E. Kämpgen, Dr. J. Dörrie, Dr. N. Schaft und Kathrin Birkholz danke ich für
die gute Zusammenarbeit im Rahmen des SFB 643 „Strategien der zellulären Im-
munintervention“.
Kristin Mentz und Domenica Saul, die mir im Labor so manche Arbeit abgenommen
haben, danke ich ganz besonders für ihre tatkräftige Unterstützung und ihre motivier-
te Mitarbeit, ohne die die Bearbeitung dieses Themas in dieser Form nicht möglich
gewesen wäre.
Michael Schwemmlein danke ich für die schöne gemeinsame Zeit als Nachbar in
Büro und Labor, noch mehr aber für die Freundschaft, die sich in den langen Jahren
entwickelt hat.
Bei allen anderen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe, Karin Barbin, Julia Stieglmaier,
Heiko Singer, Christoph Stein, Markus Kügler, Ingo Schubert, Tanja Liebig, Jörg
Schubert, Kathrin Birkholz, Nina Reiff, Sebastian Bolduan, Nicolas Rohner und vor
allem bei meinem neuen Büronachbarn Michael Schwenkert, bedanke ich mich für
ihre Hilfsbereitschaft und für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre.
Herrn Thomas Lange danke ich für seine Hilfe bei der Lösung vieler Probleme außer-
halb des Labors.
Herrn Stricker und seinen Kollegen, die mit großem Einsatz die Stiftung Kaminkehrer
helfen krebskranken Kindern ins Leben gerufen haben, danke ich für die finanzielle
Unterstützung.
Herzlich bedanken möchte ich mich bei meiner Freundin Julia, die auch in schwieri-
gen Zeiten immer zu mir gehalten hat und die durch ihre liebevolle Art mein Leben
ungemein bereichert. Mein ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinem
Bruder Michael für ihre ausnahmslose Unterstützung in vielen Bereichen meines Le-
bens.
