386 H. S ~ L g ~ N : Enz3rmatisehe Bestimmung yon Polyens~uren im Serum gSinisshe Wochenschrif~

such bet unseren Beobaehtungen nich~ der Fall war. Unsere Un~ersuchungen sprechen daf/ir, dab die Be- reigschaft der Depot-Organe (in erster Linie des Skelets) zur Bleispeieherung bet j ugendliehen ?¢ienschen geringer isg als bet Mten. ~ SeMieBlich wurde die Wirktmg eines saluretisehen Mittels (01magran) bei einem Pa- tien$en mi t leichter Bleivergiftung geprfift. Eine St-eigerang der renalen Bleiausseheidung t r a t dabei nicht ein.

ZusammenJassung. Mit Hilfe des 1958 yon einem der Verlf. besehriebenen ,,l~[osa$il-Tests", der eine klinische Beurteilung der im Organismus vorhandenen Bleiablagerungen erm6glieht, wurden einige Frage- s~elhmgen geprfift, welche die Rolle des Depot-Bleis under normaten wie such nnter pathologischen ]3e- dingungen betreffen. Die Resultate dieser Unter- suebungen zeigen, dag das Depot-BM, bisher wegen

mangelnder k]mischer Nachweismethoden ka.um u the r erforscht and beaehte$, weder unter physiologisehen noeh unter klinischen Aspekten als vSllig uninter- essan$ und bedeutungslos gelten kann. Weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet mfissen daher er- wfinscht sein.

Literatm'. ~ BAADER, E. W. : Oewerbekrankheiten. Miin- chert u. Berlin: Urban & Sehwarzenberg 1954. - - e ZT5 ~R, N.: In T~NN~AUSE~, Lehrbuch des Stoffwechsels und der Stoffwechselkrankheiten. Stuttgart: Georg Thieme 1957. - - a T~I~EKSr, L.: Gewerbliche Vergiftungen. Berlin-GSt~ingen- Heidelberg: Springer 1955. - - a h { o ~ s e ~ , S.: Klinik und Therapie der Vergiftungen. Stuttgart: Georg Thieme 1952. - - a T~ceGm% H. : Die Klinik der entschgdigungspfliehtigen Be- rufskrankhei~en. Berlin: Springer 1941. - - ~ UNS~.LD, D. W.: Klin. Wschr. 19~8, 328. - - ~ LAN~]~, J., E. P~CKA]aDT u. E. W~Nm: Arzgl. Wsehr. 14, 105 (1959). - - s T~SINeF~, J., and J. S~BOV£: Brit. J. industr. Med. 16, 148 (1959). - -

GAIT, V. A. : Zit. naeh s.

Enzymatisehe Bestimmung yon Polyens~iuren im Serum Von

H. Sff~s~AN~ Aus der lViedizhfischen Klinik und Poliklinik der Universit~ Nfinster (Direktor: Prof. Dr. W. H. ItAI~SS)

Mehrfaeh unges/~ttigte Fettsguren (Polyensi~uren), die die Gruppierung

- -CH= C H - - C ~ - - C I I = C H - -

in eis,eis-Konfiguration besitzen, werden yon einem pflanzlichen Enzym, der Lipoxydase (Ubersichtenl-a), unter Bitdung yon konjugiert-unges/ittigten Dien- t Iydroperoxyden 5-s,

- -CH= CH--CH =CtI--CH(OOH)--,

oxydiert. Die Bildung yon konjugier~-unges/~ttigten ])iengruppen bewirkt, dub im Ultraviolet~en, bet etwa 235 m~t, ein starkes Absorpt ionsmaximum auftri t t . Einfach ungesgttigte Fet tsauren oder such Polyen- sauren, die die o b e n angegebene Gruppierung nicht enthalten, liefern naeh Einwirkung yon Lipoxydase keine spektrophotometrisch nachweisbaren Reakt.ions- prodnkte.

Die Lipoxydase kann a ls ein spezifisehes Reagens auf eis-isomere Polyensgnren vom T)xous der Linol-, Linolen- oder Arachidonsaure betraehtet werden. Anders als bet der dutch Alkali und W/irme kataly- sierten Isomerisierung entstehen bet der dutch die Lipoxydase eingeleiteten Isomerisierung der hTher ungesatt igten Fet tsauren (mit mehr als zwei isolierten Doppelbindungen) keine konjugierten Triene, Tetraene usw., sondern ebenfalls mLr konjugie~e Diene. In einem Substratgemiseh gesta t te t die Lipoxydase da tum keine spektrophotometrische Identifizierung yon einzelnen Polyens/~uren, da mi t jeder der reagie- r eMen Xomponenten nut der Absorptionsgipfel bet etwa 235 m/~ beobachtet wird. In Verbindung mi t der spektrophotometrisehen Messung der Reaktionspro- dukte bietet die Anwendung der Lipoxydase jedoeh die Aussieht, eine Gruppe yon ungesatt igten Fet t - si~uren, die physiologiseh nnd kliniseh besonders interessieren, in sehr Meinen 5{engen and auf ein~ache Weise quan~itativ erfassen zu k6nnen.

Die Anwendbarkeit der Lipoxydase ffir analytische Zwecke wurde erst in jfingster Zeit, yon X~AcG~ ~, untersucht.

Danaeh effolgt die enzymatisehe Bestimmung yon Potyen- sguren im Blutplasma, in Pflanzensamen und in Mikroorga- nismen direkg, olme voraufgehende Fettextraktion. D~s zu untersuehende ]}Iaterial wird zur Verseifung der Fettsguren- ester bet Raumtemperatur un4 in Stiekstoffatmosph~re mit alkoholiseher NMflauge behandelt. Nach der Verseifung wird Boratpuffer, p~ = 9, and eine der KMitaugenmenge ~qui- valente Menge Salzsiiure zugegeben. Aliquote Volumina der verseifgen und gepufferten LSsung werden mit inaktivier~er Lipoxydase (Leerwert) bzw. mit aktiver Lipoxydase (Mel3. weft) 30 rain bet Raumtemperatur inkubierg. Da bet diesem Vorgehen die Absorption des Leerwertes (yon Plasma) auger- orden~lieh hoeh is~, wird die spektrophotometrisehe ~Iessung nieht beim Absorptionsmaximum (hier 234 m~), sondern bet 245 m# vorgenommen.

Bisher sind keine Ergebnisse bekannt, die bet der Anwendung der enzymatisehen Methode zur Bestim- mung des Polyens£urengehaltes in biologisehem Material (auger in pflanzlichen 01en 9) erhalten werden.

Zur enzymatisehen Best immung des Polyensguren- gehaltes im Blutserum haben wit die Methode yon MAcG~E 9 in einigen Einzelheiten ge/indert. Dariiber and fiber den enzymatiseh bestimm~en Po lyens /~en - gehalt yon normalen mensehliehen Seren wird naeh- stehend beriehtet.

Methode L6sungen. 1. Alkohol-~ther. Drei Volumeni~ile Xthyl-

alkohol (99 % ig, fiber Caleiumoxyd redestilliert) -t- 1 Vohmen- teil Xthylgther (p.a., tiber Calcinmehlorid redestflliert).

2. Kalilauge (2,5-n.). 14 g KOH mit 3tVasser ad 100 ml. 3. Boratpu/]erA (0,2-m., pt~ 9,0). 12,4g Borsgure und

5 g Kaliumhydroxyd werden unter Erwgrmen in etwa 800 ml Wasser gelSst. Die LSsung wird auf p~ 9,0 eingestellt (Glas- elekgrode) und dana mi~; ~¥asser auf 1000 ml aufgef4itlt.

d. Boratpu//er B (0,5-m., ptt 8,4). 31 g Borsgure trod 6 g Kaliumhydroxyd werden unter Erw~rmen in etwa 800 ml Wasser gelSst. Die LSsung wfl'd dureh Zugabe yon l-n. KOH auf t~ 8,4 eingestellt und mi~ ~¥asser auf t000 ml aufgefiillt. (Dieser Puffer wird den unten angegebenen Verseiftmgsan- sgtzen zugesetzt; seine Verwendung ertibrigt die gesonderte Neutralisation der zur Verseifung angewende~en Xatilauge).

5. Lipoxydase. 20 mg Lipoxydase (Nutritional Biochemi- cals Corporation, Cleveland, USA.) werden in 50ml Borat- puffer A ge15st. Nine H~lfte der EnzymlSsung wird in kleine l~eagensglgser abgeffillt; die undere tIgllte wird zur Inakti- vierung der Lipoxydase 8 min lang im koehenden Wasserbad erhi~zt. Die ak~ive and die ina.l~ive Enzymlbsung werden im Tiefkiihlfach des Kfihlschrankes aufgehoben. Die in geffo-

Jg. 89, He~t, 7 H. S~LLMANN: Enzymatische Bestimmung yon Polyensauren im Serum 887 1. April 1961

renem Zus~ande atffbewahrte LipoxydaselSsung bMbt min- destens einen t~ion~g lang geniigend wirksum.

Aus]i~;hrung. 1,0 mt St rum wird in 15 ml Alkohol- Ather, der sieh in einem 25 mt fassenden t~[eBkSlbehen befindet, eingetropf~. ])as KSlbehen wird in ein heiges Wasserbad gebraeht and darin his zum Anf- koehen des Gemisehes gehalten. Naeh dem Abkiihlen auf Zimmertemperatur wird mi t Alkohol-Ather bis zur Marke aufgeffillt, gr/iMlieh gemiseht and filtriert.

2,0 ml Fi l t rat werden in ein 25 ml fassendes Meg- kSlbehen pipett iert and mig 0,25 ml Kalilauge ver. setzt. Zur Verseifung der Fetts/~urenester werden die mit Sehliffstop~en versehenen KSlbehen 3 Std lang in einen Brutsehrank (37 °) gestellt. Die ver- seifte L6sung wird naeh dem AbkfiMen auf t~aum- tempera tur mi t 10 ml Boratpuffer B versetzt and mit Wasser bis zur ~ a r k e aufgefiillt.

Die enzymatisehe Re~ktion finder bei einer Tempera~ur yon et~wa 1 ° start. Dazu wird ein mit Eis gekiihltes Wasserbad verwende$. Prakgisch ist ein kleiner reehteekiger Glaskasten (e~wa 20 X 15 X 15 era), in den Wasser und eine reiehliehe Menge Eis gegebea wird. Eht in den Glaskasten passendes ~e~allgestell en~h~lt LSeher zur Anf.n~hme yon egwa 30 t{eagensglgsern (16 × 160 ram).

Zwei geagensgl/~ser werden mit je ~,0 ml der ver- seiften und gepufferten L6sung beschickt and in das Bad mig Eiswasser gegeben. Die aktive und die in- al(tivierte LipoxydasetSsung werden dutch I-Iand- w/~rme aufgetaut und bis zur Verwendung ebenfMls in das Eiswasser gebracht. Nach etwa 15 rain werden zu der Versuehsl6sung im ersten l~eagensglas 0,2 ml inaktivierte Lipoxydase ( = Leerwert), zu der Ver- suchsl6sung im zweiten l~ea.gensglas 0,2 ml aktive Lipoxydase (--MeBwert) pipettiert. Unmit telbar nach der Enzymzugabe wird gemiseht. Die L6sungen bleiben weitere 45 min in dem Eiswasser stehen. Vor der Messung h/ilt man sie wenigsgens 10 rain bei t~aumtemperatur, um ein Beschlagen der Cure , ten zu vermeiden.

Die spektrophotometrische Messung erfolgt gegen den Leerwert bei einer WMlenl~nge yon 236 m# in. optiseh ausgemessenen (,,gepaarten") and sorgf/~ltig gereinigten Quarzcuve~ten yon 10 into Sehiehtdieke.

Dutch lV[uttiplikation der Ext inkt ion mi~ I4,26 erh/~lt man die Anzahl Millimole Polyensguren pro Liter Serum.

Von Seren mit sehr hohem Polyens/~urengehalt (stark lip/~misehe Seren) wird ein Alkohol-~ther- ext rakt yon geringerer Konzentra~ion bereite$, oder es werden kleinere Volumina yon dem oben angege- benen Alkohol-~therextrakt verwendet. I m letzten Falle ist das Volumen vor dem Zusatz yon Kalilauge mit Alkohol-~ther anf 2 ml zu erggnzen.

Erl~iuterungen zur Methode Zur Eichung wurden abgewogene Mengen reiner

Linolsgure* in Alkohol-~ther gel5st. Abgemessene Volumina yon dieser L6sung ~_rden mit BoratpufferA in bes t immtem Verh/~ltnis verdfinnt. Der Gehalt dieser Linols/~urelSsungen an Alkohol-~ther wurde ebenso grog gehalten ~5e der der L6sungen in den Versuchen mit Serumextrakten. :Die gepufferten Linols/iurelSsungen warden unter den oben angege- benen Versnehsbedingungen enzymatiseh oxydiert, and danaeh wurde die Ext inkt ion bei 236 m/z unter

* Der ~h'ma Deutsche Ho[[mann-Za Roche A G., Grenzaeh (Baden), danken wir ftir die zur Verfiigung gestellte Linolsgure.

Verwendung des zugehSrigen Leerwertes gemessen. Tabelle 1 enth~lt die Ergebnisse yon 7 Versuehen.

I m Mittel wurde ein molarer Extinktionskoeffizient e236 (d. i. die Extinkt ion bei 236 m/z and bei einer Sehiehtdieke yon 10 m m des aus 1 Mol Linolsgure = 280,4 g entstandenen Oxydationsproduktes bei einem L6sungsvolumen yon 1 Liter) ~ron 23000 erhalten. Daraus ergibt sieh ein spezifiseher Extinktions- koeffizient (pro 1 g oxydierter Linols~ure/Liter) yon 82.

In der Literatur werden ffir die nach Einwirkung yon Lipoxydase auf Potyens/~uren erhaItenen motaren Extinktionskoeffizienten sowohl h6here s als aueh niedrigere ~° Wer~e angegeben, gegenfiber den yon uns erhaltenen Werten. Zur Erkl~rung dieser Unter- sehiede ist besonders darauf hinzuweisen, dab die molaren Extink- tionskoeffizienten in den hier mitgeteilten Ver- suchen naeh vollst/~ndi- ger Oxydation der vor- gelegten Substratmenge gemessen wurden, wo- gegen in anderen Unter- sueh tmgen, in denen aueh der Q-Verbraueh best immt wurde, die enzymatisehe Reaktion vor ihrem AbsehluB unterbroehen und der molare Extiaktionskoef- fizient dutch Extra- polation der gemessenen Extinkt ion auf den Verbrauch yon 1 Mot 0~/ 3/[ol Substrat erreehnet wurde.

Tabelle 1. Molarer Extinktions- koeHizient yon enzymatisch oxy-

dierter Linolsiiure Die Reak~ionsl6sung (4 ml

VersuchslSsung -~ 0,2 ml Lip- oxydase) enthM~ pro 1 ml die Reaktionsl0rodukte yon der in der 2. S10al~e angegebenen Linol- Si~uremenge (in/xg). Der mol~re Extinktionskoeffizien~ e236 er- gibt sieh aus der gemessenen Extinktion E (in Cuvetten yon 10 mm Liehtweglange) and der Linols~tu'emenge (#g/ml) naeh:

E . 280,4. 1000 Linols~uremen

Linols~ure /~3~ ~g/ml

I 3,87 0,319 7,74 0,627

I I 4,40 0,369 8,80 0,715

I I t 3,34 0,273 6,68 0,546

IV 7,22 0,586

23 200 22750 23 500 22 800 22950 22950 22 800 22 990 ± 200

Nit einem Prfi.parat yon Linolens/~ure erhielten wit naeh enzymatiseher Oxydation molare Extinktions- koeffizienten yon rand 20000. Diese niedrigeren Werte - - gegentiber den mi~ Linols/ture erhaltenen W e r t e n - k6nnen darauf bernhen, dab das verwendete Linolens/~urepr/tparat teilweise autoxydiert war. ~[AC- G ~ 9 fiihr~ Befunde an, naeh denen Linol-, Linolen- and Araehidonsaure naeh Oxydation mit Lipoxydase den gleiehen molaren Extinktionskoeffizien~en ergeben.

Der Berechnung legen wit den mi t Linolsgnre unter den angegebenen Versuehsbedingungen er- haltenen molaren Extinktionskoeffizienten Y-on 23 000 zngrunde and dr/ieken den Gehalt des Strums an Polyensguren in Miltimolen pro Liter S t rum aus. Man erhglt die AnzaM Millimole (mlV[ole) an Potyen- s/~uren pro Liter Serum dureh Multiplizieren des bei 236 mu abgelesenen (oder aus der Durehl/~ssigkeit be- reehneten) Extinktionskoeffizienten E m i t dem Faktor

1.10O0 -- 23000" 0,00305 -- 14,26.

(Die Zahl 0,00305 im Nenner bedeutet die Serum- menge in mill ml der unter den Standardbedingungen der Methode in die Cuvetten eingeffillten L6sung).

Die gegenfiber den Angaben yon M~cGE]~ 9 getrof- fenen methodischen ~nderungen beziehen sieh haupt- si~chlich auf die Verwendung yon Alkohol-~therex- t rakten (anstelle yon unbehandeltem Serum), auf die

Xlinische 388 H. S~LLMANN: Enzymatisehe Bestimmung yon Polyensguren im Serum Wochensehrift

Verseihmg (mit wgBriger s tar t alkoholiseher Kalitauge und in Lug- s tar t in N2-Atmosphgre), auf die Durch- ffihrung der enzymatisehen Oxydation bei tieferer und konstanterer Tempera tur (start bei l~aumtempe- ratur) and atff die ~{essung bei 236 m/~ (start bei 245 m/~).

:Bei Verwendung yon Alkohol-~_therextrakten des Serums ist die Leerwertabsorption klein, nnd die Messmagen tassen sich ohne Sehwierigkeit behm Ab- sorpt ionsmaximum der ReaktionslSsung ausf/ihren. (Die Messmlgen erfolgten mi t den Spektratphoto- metern M 4 oder PMQ I I yon Zeiss bei einer effektiven Bandbreite yon etwa 0,45 m#). Alkohol- ~ therex t rak te gestat ten ferner die Verwendung yon

~8

0,7

o,6

o,5

20o 250 m~ 300

Abb. 1. Absorptionskurven yon (1) Serumextrakt, (2) Linol~gure und (3) Linolens~ure nach Einwirkmng yon Lipox:/dase,

(Beckman-Spektralphotometer DK 2)

wgBriger KMitauge zur Verseifung. AuBerdem ist es wfinsehenswert, zusammen mit dem Polyensguren- gehatt jeweils aueh den Gehalt des Serums an Lipoiden fiberhaupt zu bestimmen, um Auskunft darfiber zu er- halten, in welchem MaBe die Polyensguren an ~nde- rungen des LipoidgehMtes im Serum yon Gesunden und Kranken teilnehmen. }¥ir best immen dazu den Gehalt des Serums an verester ten Fet tsguren (als I Iydroxamate) und verwenden daffir aliquote Teile yon demselben Alkohol-Atherextrakt, der aueh ffir die Best immung des PolyensgurengehMtes dient.

Bei keinem Arbeitsschritt wurde Luft ausgesehtos- sen. Da die Polyensauren besonders leieht wghrend d e r Verseifung dureh den Luftsauerstoff oxydiert werden k6nnten - - was zu Bestimmungsfehlern fiihren wfirde --- wurde in Parallelversuchen die Verseifung mit Luft und mit reinem Stiekstoff im Gasraum vor- genommen. Es wnrden keine sieheren Untersehiede zwisehen den in den ParMlelversuchen erhMtenen Er- gebnissen beobaehtet, so d~B weiterhin auf den Aus- sehluB yon Luftsauerstoff verzichtet w~'de. Eine Ver- sei~ungsdauer yon 3 Std bei 370 and mi t der angege- bench Menge Kalilauge ist ffir Serumextrakt aus-

reiehend: zwei-, vier- oder seehsstiindige Verseifungen lieferten die gleichen Ergebnisse. Bei l~aumtempera- t a r bleibt der Verseifungsansatz 5 Std im Dunke]n stehen. Die versefften trod gepufferten LSsungen kSn- hen bis zum n~ehsten Tag aufgehoben werden, ohne dug ein Schwund yon Polyens~uren zu beobachten ist.

Die ifir die enzymatisehe t{eaktion.verwendeten L6sungen enthalten knapp 6% Alkohol und 2% Ather. Da die Wirkung der Lipoxydase dutch Alkohol and andere organisehe LSsungs- miteel gehemmt wird, ist es nieht angezeigt, wesentlieh grSBere ~Iengen Alkohoi-Atherextrak~ zu verwenden.

Aus anderen Untersuehungen s, 11 ist bekannt, dab der molare Extinktionskoeffizient yon enzymatisch oxydieIger Linolsgure mit steigender Inkubations- tempera tur abnimmt. Das gleiche war in unseren Versuehen mit SerumextrM~ten, die mi t dem Enzym bei 1 °, 240 und 370 inkubiert wurden, zu beobachten (Tabel]e 2). Dieser EinfluB der Inkubat ionstemperatnr

Tabelle 2. Ein/lu~ der Inlcubationstemperatur au/ die Extinktion Die Serumextrakte wurden nach Verseifung and 1)ufferung

wghrend 45 rain bei den angegebenen Temperaturen mit Lip- oxydase inkubiert. Ein gleiehargiger Inkubationsversueh mit Linolsgure. Messung der Extinktion bei 236 m,u. I~elatige Werte in Klammern.

Yersuch mit

Serum I. Serum II Serum III Serum IV Serum V Linolsgure

Extinktion nach Inkubation bei

10

0,291 (100) 0,388 (100) 0,658 (100) 0,520 (~00) 0,620 (1O0) 0,586 (t00)

240

0,261 (89,6) 0,356 (91,9) 0,613 (93,1) 0,470 (90,5) 0,548 (88,4) 0,559 (95,2)

37 o

o,212 (81,1) 0,324 (83,5) 0,523 (79,5) 0,397 (76,4) 0,431 (69,5) 0,512 (87,3)

auf das MeBergebnis legt nahe, die enzymatische Reaktion bei mSglichst tiefer und konstanter Tem- peratur ablaufen zu lassen. Auch bei 1 ° werden die Polyens~uren yon der Lipoxydase schnetl oxydiert; mit, der verwendeten Enzymmenge ist die Oxydation - - gemessen durch die Extinkt ion - - nach etwa 30 rain Inkubat ion b e i 10 abgeschlossen. Erh6ht man yon vorneherein oder wahrend der Inkubationszeit die zugesetzte Enzymmenge, so hat das keinen EinfluB auf das Meltergebnis. Mit einem Lipoxydaseprgparat unbekannter Aktivi tgt wird man auf diese Weise die erforderliche Enzymmenge prtifen.

Unter den Bedingungen unserer Versuehe ]iegt das Absorpt ionsmaximum der enzymatischen Oxydations- produkte bei 236 m/~. In dem Bereieh zwischen 234 and 237 m/~ bestehen rmr geringe Untersehiede in der Absorptionsh6he. Die in Abb. 1 wiedergegebenen Kurven zeigen, dug die naeh enzymatiseher Oxy- dation des Polyensgurenkomplexes yon Serumextrakt sowie yon reiner Linol- und Linolens~ure avcftretenden AbsorptionsgipfeI in dem gleiehen Wellenlgngenbe- r e i c h - bei 236/237 m / t - liegen, und dab in allen F£11en nur ein Gipfel zu beobaehten ist. Die ver- sehiedenen Polyensguren, die als Substrate der Lip- oxydase wirken kSnnen, werden offenbar also einheit- lieh unter Bildung yon konjugiert-ungesgttigten Dien- sguren mit den gleiehen Absorptionseigensehaften oxydiert .

Abb. 2 zeigt, dab die naeh enzymatiseher Oxy- dation gemessene Extinktion proportional mit der verwendeten ~ienge Serumextrakt ansteigt.

Naeh der I n k u b a t i o n bei I ° kSrmen die Versuchsl6sun- gen 1 - -2 Std bei ~ a u m t e m p e r a t u r stehenbIeiben, ohne dab

ag. 89, ]left 7 I-I. SiY~n~x~: Enzymatische Bestimmung yon Polyensiiuren im Serum 389 l . April 196t

wghrend dieser Zeit eine Anderung der Extinktion megbar ist. Nach 20 Std ist eine Extinktionsabnahme yon etwa 8% zu beobachten.

U m die I~eproduzierbarkeit der Ergebnisse, die mit der angegebenen Methode erhalten werden, zu prfifen, wurden je 2,0 ml einer LSsung yon Lein61 ( I8 ,8mg Lein61 in 100ml Alkohol-Xther) an ver- sehiedenen Tagen dem gleiehen Arbeitsgang nnter- woden wie die Serumextrakte. Bezogen anf 1000 g LeinS1 wurden geflmden: 25,3, 25,6, 25,6, 25,0 und 25,2 N[ole Polyensgtrcen. Die grSgte Differenz zwischen den Einzelergebnissen betr~gt 2,4% und die dureh- sehnittliche Abweiehung veto Ivlittelwert ( = 25,3~o!e) der fiinf Analysen :[:0,2%. (Aus dem in 1Vfolen aus- gedrfickten Mittelwert und unter Zugrundelegung des ~olekulargewichtes yon Linolensgure ergibt sich ffir die untersuehte Lein61probe ein Gehalt an Polyen- sguren yon 71%. Das entspricht einem Lein61 mi t einem verhgltnismiBig hohen Polyensiurengehalt) .

Bei den Polyensgurenbestimmungen im Se~-am ist auch die IApoidextraktion mi t Alkohol-~ther als Fehlerquelle in Betraeht zu ziehen. In Doppelver- suchen mi~ Serum betrggt jedoch die Abweichung des Mittelwertes yon den Einzelergebnissen selten mehr als 4- 2 % (imDurehschnitt allerVersuehe weniger als 4-1% ). Eher Ms anf die Extrakt ion oder die Ver- seffung kSnnen seMeehte l~bereinstimmungen a~d Unregelmggigkeiten im Verlauf der enzymatischen l~eaktion zurfiekgefiihrg werden. Solehe St6rungen, die nut ganz ausnahmsweise zu beobacht.en sind, lassen sich als meistens wghrend der Inkubationszeit auftretend naehweisen (und als ~'ehler aussehalten), wenn man die Analysen mi t denselben bereits ver- sefften mad gepufferten Versuehsansgtzen wiederholt.

E~yebnisse mit normalen Seren

1Viii der enzymatischen Methode wurde der Polyen- sgurengehMt im Blutserum yon 22 klinisch gesunden Versuehspersonen best immt. Die Blutproben wux'den vormit tags abgenommen. Ein Teil der Versuchs- personen hat te seit 12--14 Std, der a, ndere Tell seit 4 - -5 Std niehts mehr gegessen. In allen Seren wurde auch der Gehalt an verester ten ~e t t s iu ren best immt. Tabelle 3 enthglt die Ergebnisse. Die Zahlen in der letzten Spalte der Tabelle drficken den Anteil der Polyensguren an den verester ten Fettsguren in Pro- zenten aus. (Die im Serum vorhandenen ldeinen Men- gen yon freien Fettsguren bleiben bier auBer Betraeht.)

I )er GehMt der untersuchten Seren an enzymatisch bes t immbaren Polyensguren schwankt zwisehen 2,85 und 6,75 mMolen in 1 Liter Serum, wobei Werte unter 3 mlVIolen nut einmal und Werte fiber 6 mMolen nur zweimal auftreten. Obgleich der Anteil der Polyen- sguren an den verester ten l~etbsguren zwischen fund 34% und 46% streut, so ist t rotz dieser Streubreite doch zu erkennen, dab Seren mit relativ niedrigem Gehalt an veresterten Fettsguren durehschnittlieh einen niedrigeren Gehalt an Polyensguren haben als Seren mit relativ hohem Gehalt an veresterten l?ett- sguren: 10 Serumproben mi t weniger als 11,1 mMolen (-= Mittelwert yon allen Serumproben) veres te~en Fettsguren enthatten durehsehnittlieh 3,Smt~Iole Polyensguren; die arideren 12 Serumproben mit mehr als l l , l m M o l e n veresterten Fe t t s im 'en enthalten durehsehnittlieh 4,9 rm~Iole Polyens£uren.

Klin. Wschr., 39. J-ahrg.

Der Wirkungsbereich der Lipoxydase erstreekt sich mSglicherweise nicht auf alle Polyensguren, die im K6rper vorkommen. Es ist daher zu fragen, ob es nennenswerte Mengen Polyensguren im mensehliehen Serum gibt, die mi t der enzymatisehen 5Iethode nicht erfaBt we rden . SCttRA9~ u. Mitarb. le erhielten naeh Isomerisierung mit Alkali fiir die Summe yon Linol-, Linolen- und Araehidonsgure als Durchsehnittswert 3,7 mlVfole/Liter Serum; enzymatisch fhiden wir dureh- schnittlieh 4,4 mMole Polyensguren. ~'fir einen wei- teren Vergleieh wghlen ~dr ZaMenangaben aus einer yon I-IAvss und I ~ x c ~ v is aufgestellten l~rbersichts- tabelle. Der yon verschiedenen Untersuehern mit nieht-enzymatisehen 5Iethoden gefundene, in Tabelle 4

E 0A-

0,5

oA

0A

L r o o,5 1,0 $~m~

Abb. 2. Propor~ionalit i t zwischen ~enge an Polyens~£uren und Extinkt ion. Yersuch mit 0,5, 1,0 und 2,0 ml eines ~erseiften und gepufierten Seram- extraktes. Messung der Extinktion (E) nach Einwirlmng yon Lipoxydase

bei 236 m/~

Tabelle 3. Gehal$ normaler Blutseren yon Menschen an enzy- matisch bestimmbaren PolyensSuren

Werte in Millimolen pro 1 Liter Serum. Per Gehalt der Seren an verestert~n ~ettsiuren wurde zum ¥ergleich mit- bestimmt. In der letzten Spalte ist der Anteil der Polyen- sguren an den veresfergen Fettsiuren in Prozenten wieder- gegeben. ~ -~ weibliche, d~ = mMmliche Versuchspersonen. s----- Standardabweiehung.

m}fole]Liter Serum Ge~

Nr. sehlecht Alter

Jahre

1 9 18 ? 20

20

25 s ? 26 9 ~ 27

10 9 30 11 ~ 36 12 ~ 38 13 3 14 14 ~ 18 15 ~ 19 16 c~ 21 17 ~ 22 18 c? 23 19 ~ 26 20 c~ 34 21 ~ 53 22 ~ 57 ~ittelwerte (~: s) . .

,,Normalbereich" (= Mi~elwer~ 4- 28)

veresterte Fettsauren

8,55 11,4 11,5 11,6 10,1 9,6 9,7

13,3 11,0 9,1

14,6 11,2 11,2 12,3 lO,4 7,8

11,45 9,6

10,3 13,0 13,5 13,8 11,14

(:L 1,41)

8,3--14,0

Polyensgu~en

3,2 4,4 5,2 4,7 3,8 4,2 4,0 4,5 4,85 3,4 6,75 4,3 3,95 4,65 3,75 2,85 5,2 3,8 4,2 4,75 6,2 4,8 4,43

(±0,88)

2,7---6,2

Anteil in Prozen?G

37,4 38,6 45,2 40,5 37,6 43,7 41,2 33,8 44,1 37,4 46,2 38,4 35,3 37,8 36,0 36,6 45,4 39,6 40,8 36,5 46,0 34,8 39,7

(~: 3,34)

33,0--46,4

80

Klinisohe ~90 I-I. OvE~x~2: Die Kolloideisen-Clearance bei Eisenmangelkrankheiten Woohenschrift

summariseh aufgeftihrte Antefl der Polyensguren an den Gesamtfegtsguren (deren Menge mi t groBer An- n/~herung der ~ e n g e an verester ten Fegts/~uren im Serum gIeichgesegzt werden kann) schwankt zwischen 26,9 und 42,0%. Zum Teil ~, ~ wurden in diesen

Tabelle 4. Antei~ dermit nicht.enzymatischen Methoden geJun- denen Polyens~iurenmengen an den Ge~amt-~e~tsgurenmengen

des Serums Anteil der Potyens~wren [ Anteil der Polyens~;uren

in Prozent Zitat [ in Prozent Zitat der Gesamt-Fetts~turen tier Gesamt-Fetts~uren

42,0 14 I 36,3 17

@

26,9 15 [ 37,1 18 29,5 16 29,6 19

Untersuehungen yon den Polyens/~uren nu t die Dien-, Trien- und Tetraens/~uren best immt, im fibrigen aueh die Pentaen- mud Hexaens/~uren. Der yon nns ffir den Anteil der Polyens/~m'en an den verester ten Fetts/~uren normaler Seren erhaltene Mittelwert betrKgt 39,7%. Naeh dieser Gegeniiberstellung ist nieht anzunehmen, dab der auf Serum angewendeten enzymatisehen Me- rhode nennenswerte ~engen Polyens~uren entgehen, die mi t anderen, bisher ftir die Polyens/~urenbestim- mungen herangezogenen 3/Iethoden erfaBt werden.

Zusammen.Jassung. Der Gehalt des Serums an Polyens~uren lgBt sieh enzymatisch (mit Lipoxydase) auf einfache Weise bestimmen.

Eine yon MAcGEE 9 angegebene enzymatlsche Methode zur Best immtmg yon Polyens/im'en wird in ihrer Anwendbarkeit auf Serum gepr/ift. Einzelhei~en der Methode werden ge/~ndert.

Die mi t der besehriebenen enzymatischen Methode bei der Untersuchung yon normalen menschlichen Seren erhaltenen Ergebnisse werden mitgeteil~.

l~iteratur. ~ S ~ a ~ - , H.: Fermentforsch. 17, 610 (1945). - - 2 BE~GS~R6~, S., and R.T. H o ~ x ~ : Advanc. Enzymol. 8, 425 (1948). - - 3 FRAm~E, W.: Ergebn. Enzym- forsch. 12, 89 (1951). - - 4 HOL~A~¢, R. T., and S. BE~GS~6~: The enzymes, edit. g. B. S v ~ s ~ and X. 3~YR~XeK, vo1. II/1. New York 1951. - - s BE~¢Sa~5~, S.: Ark. Kemi, 3/fineral. Geol. A ~1, Nr 15 (1945). - - s tIOL~r.A~, R.T. , and G.O. :Bu~: Arch. Bioehem. 7, 47 (1945). - - ~ t Io~A~, R.T.: Arch. Biochem. 10, 519 (I946). - - s Iton~a~N-, R.T.: Arch. Biochem. 15, 403 (1947). - - s MAcGEE, J.: Analyt. Chem. 81, 298 (1959). - - 10 S~DD~Q~, A.M., and A.L. TA~]~: J. Amer. Oil Chem. Soc. 84, 529 (1957). Zi$. nach s. - - n Bv,~asT~5~:, S., and R. T. t { o ~ : Nature (Lend.) 161, 55 (1948). - - ~ SeJ~ADE, W., R. B~EG~ u. C. OTT: Klin. Wschr. 84, 1242 (1956). - - ~s HAVSS, W. H., u. G. ]F~CKAU: Fette u. Scifen 61, 1059 (1959). - - ~a W~ESE, H. F., and A. F. H~ws~: J. biol. Chem. 202, 417 (1953). - - ~ SOm~DE, W., R. BIEGLE~ U. E. B6~mE: Kiim Wschr. 86, 314 (1958). - - ~s ICLa-~r~o~D, E.G., and W. O. L~vD~E~: Arch. Bioehem. ~7, 517 (1955). - - ~ I~cY~v, G., u. W. H. tIAvss: Xrztl. Forsch. 8, 187 (1959). - - ~s EvAns, D., ~ . W~o~ox, N.L. OLEKSYSHYN and R.W. RIEMEIgSCHNEIDER: J. biol. Chem. ~81, 255 (1956). --t~ PIK~a~, N. A., and J. N~JHO~: Biochem. J. ~0, 52 (1958).

Die Kolloideisen-Clearance bei Eisenmangelkrankheiten Von

g. 0VE~K~MP

Aus der/~Iedizinisehen Klinik der St~dt. Krankenanstalten 8olingen (0be~a~zt: Prof. Dr. med. H. WENDT)

Einfiihrung. Als Clearance wird dasjenige Plasma- volumen bezeichnet, das in tier Zeiteinheit yon einer Substanz gereinigt wird. Die originalen, der Bestim- mung der renalen Ausseheidung dienenden Clearance- Methoden erfordern eine kombinierte Analyse der Plasmaspiegelkurve und der gleichzei~igen Ausschei- dungst/itigkeit der Nieren, gemessen an Urinvolumen und Urinkonzentration.

Bei bes t immten Stoffen 1/~Bt sieh die PlasmareinL gung allein ans dem zeitliehen Abfalt ihrer Serum- konzentrat ion ermitteln. Die Anwendung dieses Clear. anee-Verfahrens setzt voraus, dab sieh die benutzte Testsubstanz ,,kinetisch nicht-reakt iv" verb/fit a, d.h. dab sic naeh intravenSser Applikation gleichm~Big exponentiell aus der Blutbahn eliminiert wird. Kol- Ioidale Ferri-SaeeharaCe entsprechen dieser Bedingung und k6nnen deshalb, wie wir kiirzlieh gezeigt haben, als Clearancesubsbanz verwendet werden 1°.

Die aus dem Abfall der Serumspiegelk~rve errech- neten Clearancewerte geben zun~ehst keinen Auf- schluB dariiber, wohin eine Testsubstanz abgestrSmt is*. Sic bedeuten als Solche lediglich eine ,,totale Clearance", mi t tier s~mtliehe an der Plasmareinigung betefligten ehemisehen und exkregorisehen Funktionen des Organismus erfaBt werden. IngravenSs injiziertes Fe-Saccharag wandert jedoch, wie aus histologisehen und histochemischen Untersuehungen bekannt ist, praktisch quant i ta t iv in das R E S ab mad wird hier deponiel* I, z,xs. Die *otale Clearance des Kolloideisens kann somit seiner retieuloendothelialen Clearance gleiehgesegzg werden.

Erkrankungen und Alterationen des RES wirken sieh in der }Veise auf die Plasmareinigung yon i.e. injiziertem Kolloideisen aus, dab die Clearance bei entzfindlichen Erkrankungen und bei Hyperplasien des retieuloendothelialen Systems stark vergr6gert, bei quanti tat iver Verriugerung des Gewebes (dureh Milzexstirpation) dagegen erheblich verldeinert wlrd n. Die Kolloideisen-Ctearanee bietet damit gleiehzeitig die M6gliehkeit, den Funktionszustand des RE S - - h i n . siehtlich seiner resorptiven E i g e n s c h a f t e n - zu kon- trollieren.

Ffir die Kolloideisenelimination aus der Blutbahn wurden bisher teils normale6, ~Iu.a., tells verkfirzte Abwanderungszeiten~, ~ angegeben. Es war deshalb yon Interesse, das Verhalten des RES bei Eisenmangel. krankheiten mi t Hilfe der Kolloideisen-Clearanee zu /iberpriifen.

Methodik a) Durchfiihrung des Clearance-Versuches. Die Er-

mitt lung der Kolloideisen-Clearance (und adgquater GrSBen) ist dadurch mSglieh, dab das ohne Bindung an ein Tr~gerprotein im Plasma zirkulierende komplex- gebundene Fe nach einem exponentiellen Zei~gesetz aus der Blutbahn in das RES abwandert . Diese exponen- tielle, geometriseh fortschreitende Elimination kann experimentell nnr wghrend der Zeitspanne ermittel t werden, w/ihrend der der Eisenabstrom in das RES nngestSrt vor sieh geht. Das ist der Fall zwischen der 15. und 45. rain nach der Fe-Injekt ion 1°, w~hrend die ,,echte" Elimination des Kolloideisens in den ersten 15 rain. p. i. dureh Vermisehung mi t seinem gesamten