Epstein-Barr-VirusTestsysteme zum Nachweis von

EBV-Infektionen

Hochspezifi sche, rekombinante Antigene

Vielfältige Automatisierungslösungen für ELISA, Blot und IIFT

Hohe Aussagekraft durch Multiplex-Tests und Aviditätsuntersuchung

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Epstein-Barr-Virus

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) gehört zur Gruppe der human-pathogenen Herpesviren. Es wird auch als Humanes Her-pesvirus-4 bezeichnet und zählt zu den doppelsträngigenDNA-Viren. Der Mensch ist der einzige Wirt für das EBV. DieInfektion erfolgt zunächst über Epithelzellen, später werdendann B-Lymphocyten befallen, in denen das Virus lebens-lang persistiert.

Der Hauptübertragungsweg der Viren ist die Tröpfchen-oder Kontaktinfektion durch Speichel. In aller Regel erfolgtdie Ansteckung bereits im Kindesalter. Für gewöhnlich tre-ten bei den Kindern keine Symptome auf. Tritt die Infektionerst bei Jugendlichen oder Erwachsenen auf, kommt es da-gegen in 30 - 60 % der Fälle zum Ausbruch einer infektiösen Mono nukleose, auch Pfeiffersches Drüsenfi eber genannt(siehe Infokasten). Durch die weite Verbreitung des EBV istdie Durchseuchungsrate in der Bevölkerung sehr hoch. Abdem 20. Lebensjahr sind etwa 90 % infi ziert, nach dem 50. Lebensjahr sogar 99 %.

Wie alle Herpesviren ist das EBV in der Lage, wiederkeh-rende Infektionen hervorzurufen. Bei Immungesundenverlaufen diese Reaktivierungen für gewöhnlich klinisch un-auffällig.

Wenn jedoch eine Immunsuppression vorliegt, z. B. bei einerHIV-Infektion oder nach einer Organtransplanta tion, kann essowohl unmittelbar nach der Erstinfektion als auch bei einerReaktivierung zu Komplikationen kommen. Das Virus ver-mehrt sich dann unkontrolliert, wodurch es zu Lymphkno-tenkrebs oder zur Entstehung von Posttransplantations-Lym-phoproliferativen Erkrankungen (PTLD) kommen kann. EineEBV-Infektion steht jedoch auch bei Immungesunden mitder Pathogenese verschiedener Tumor erkrankungen im Zu-sammenhang. Das Burkitt-Lymphom, das vor allem in Afrikaauftritt und das Nasopharynx-Kar zinom, das im südostasi-atischen Raum endemisch ist, sind mit einer EBV-Infektionassoziiert (siehe auch Seite 8).

Diagnostik

Eine EBV-Infektion zeigt meist relativ unspezifi scheSymptome, die sich mit denen anderer Erkrankungen über-schneiden. Differentialdiagnostisch sollte die EBV-Infektionvon folgenden Krankheiten abgegrenzt werden: Cytomega-lie, Toxoplasmose, Streptokokken-Infektion, Ringelrötelnund HIV-Infektion.

Primäres Ziel der Routinediagnostik ist die Unterscheidungzwischen den einzelnen Stadien einer EBV-Infektion, wieErstinfektion oder zurückliegende Infektion. Zur Bestätigungeiner EBV-Infektion wird in den meisten Fällen ein serologi-scher Nachweis von Antikörpern durchgeführt. Eine Virus-last-Bestimmung durch PCR ist bei immunsupprimiertenPatienten und bei chronisch-aktiven EBV-Infektionen sinn-voll. EUROIMMUN bietet ein breites Produkt spektrum ver-schiedener Testsysteme für eine umfassende serologischeEBV-Diagnostik. Für alle Testverfahren stehen verschiedeneAutomatisierungslösungen zur Verfügung.

Infektiöse Mononukleose Die infektiöse Mononukleose (Pfeiffersches Drüsen-fi eber) beginnt in aller Regel mit Grippe-ähnlichen Symptomen wie Fieber, Gliederschmerzen, starkerMüdigkeit und schmerzhaften, dick geschwollenenLymphknoten, vor allem am Hals. Die Infektion gehtaußerdem mit einer auffälligen Erhöhung der Lympho-cytenzahl im Blut einher. Im Blutbild lassen sich zahl-reiche lymphomono cytoide Zellen nachweisen. Beietwa 50 % der Patienten tritt zudem eine Milzvergröße-rung auf. Normalerweise verläuft die Infektion selbst-limitierend und dauert selten länger als drei Wochen.Postinfektiös sind jedoch länger anhaltende Erschöp-fungszustände möglich, was auch als chronisches Mü-digkeitssyndrom bezeichnet wird. Die Krankheit trittbesonders ausgeprägt bei Jugendlichen und jungenErwachsenen auf.

Hüllmembran mit Glykoprotein-Spikes

Capsid

EBV

INFO

3

EBV-Antikörper

Die serologischen Tests messen Antikörper, die sich gegen verschiedene Antigene des EBV richten. Zielantigene sind primär:

Im Verlauf einer EBV-Infektion treten die Antikörper zeitlichversetzt auf. In der Frühphase der Erkrankung sind IgM- undIgG-Antikörper gegen CA nachweisbar. Ein positiver Anti-EBV-CA (IgM)-Nachweis ist der klassische Marker einer aku-ten Infektion. IgG-Antikörper gegen EA treten etwas späterin der akuten Phase auf und fallen nach 3-6 Monaten auf nicht mehr detektierbare Konzentrationen ab.

Der CA-IgG-Antikörperspiegel persistiert dagegen lebens-lang. Etwa sechs bis acht Wochen nach einer Infektionkommt es zur Ausbildung von Antikörpern gegen EBNA. IhrAuftreten zeigt also eine bereits abgelaufene Infektion an.

Interpretationsschema Antikörper-Profi l

Antikörperprofi lDiagnose Infektionsstadium

EA (IgG) CA (IgM) CA (IgG) EBNA-1 (IgG)

– – – – Keine Infektion

– – + + Zurückliegende Infektion

+ / – + + – Akute Infektion (frühe Phase)

+ / – + + +Unklare serologische Konstellation,weiterführende Diagnostik erforderlich

Titer der verschiedenen Antikörper im zeitlichen Verlauf

Virales Capsidantigen (CA): Strukturprotein des Virus-capsids

Early Antigen (EA): Frühes Protein der Virusreplikation

Epstein-Barr-Nukleäres Antigen (EBNA): Immortali-sierungsprotein, wird erst spät dem Immunsystem desWirtes präsentiert. Die Antikörper-Bildung erfolgt des-halb erst nach der Infektion.

0 2 4A

nti

kö

rpert

iter

CA (IgG)

EBNA-1 (IgG)

EA (IgG)

CA (IgM)

6 12

Infektion

Krankheitsverlauf (Wochen) (Monate)

Symptome

Antikörper gegenVerfügbare Testsysteme

IIFT ELISA EUROLINE Westernblot

EBV-Capsid-Antigen (EBV-CA) EBV-CA, Aviditätstest EBV-CA p19 EBV-CA p22 EBV-CA gp125 EBV-Early-Antigen (EBV-EA) EBV-Nukleäres Antigen (EBNA)

Überblick Testsysteme

EUROIMMUN bietet eine Reihe von Testsystemen zum Anti-EBV-Nachweis an. An Testmethoden stehen ELISA, IIFTund Blot-Techniken zur Auswahl. Je nach Laborsituation kann das passende System gewählt werden.

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Indirekter Immunfl uoreszenztest (IIFT)

Der Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene EBV-Antigene kann mit der bewährten Methode der indirekten Immun-fl uoreszenz durchgeführt werden, die in der Literatur vielfach als Goldstandard beschrieben wird. Mit Hilfe der EUROIMMUN BIOCHIPs können parallel Antikörper gegen EBV-CA, EBV-EA und EBNA detektiert werden. Serologisch unklare Konstellatio-nen können durch einen modifi zierten IIFT zur Bestimmung der Antikörper-Avidität geklärt werden.

BIOCHIP-Sequenz EBVPatientenseren verschiedener internationaler Referenz-zentren (INSTAND / Deutschland, NEQAS / Großbritannien und Labquality / Finnland) wurden mit der EUROIMMUN BIOCHIP-Sequenz EBV untersucht. Anhand des vorgegebe-nen Erwartungswerts wurden folgende Sensitivitäten undSpezifi täten ermittelt:

Substrat n Spezifi tät Sensitivität

EBV-CA (IgG) 61 100 % 100 %

EBV-CA (IgM) 84 100 % 100 %

EBV-EA (IgG) 48 100 % 100 %

EBNA 80 95 % 100 %

Substrat Referenz Spezifi tät Sensitivität

gp125 und /oder p19 (IgG)

Anti-EBV-CA-IgG-IIFT(n = 320)

98 % 100 %

gp125 und /oder p19 (IgM)

Anti-EBV-CA-IgM-IIFT(n = 322)

98 % 99 %

Bestellnummer

BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-1 X

EUROPLUS BIOCHIP®-Sequenz EBV FI 2799 -####-21 X

Anti-EBV-CA-IIFT (IgA, IgG, IgM) FI 2791 -#### A, G oder M

Anti-EBNA-IIFT FI 2793 -#### G

Anti-EBV-EA-IIFT (IgA, IgG) FI 2795 -#### A oder G

Auch für serologisch schwierige Konstellationen geeignet durch Aviditäts-Messung

Optional auch zum Nachweis von IgA-Antikörpern er-hältlich, zum Screening bei Verdacht auf Nasopharynx-Karzinom

Vereinfachte Auswertung unspezifi scher EBV-CA-IgG- Reaktionen durch Einsatz von EBV-Capsid-Antigenengp125 und p19

Kombination aus exprimierenden Zellen und defi nierten Einzelantigenen auf einem Objektträger

Patient 1: EBV-CA (IgG) EBV-CA (IgG): Harnstoff-behandelt EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG) EBNA (IgG)

Patient 2: EBV-CA (IgG) EBV-CA (IgG): Harnstoff-behandelt EBV-CA (IgM) EBV-EA (IgG) EBNA (IgG)

EUROPLUS BIOCHIP-Sequenz EBVFür eine hochdifferenzierte EBV-Diagnostik kann die BIOCHIP-Sequenz EBV mit den monospezifi schen Anti-gensubstraten gp125 und p19 erweitert werden. Die In-terpretation unspezifi scher EBV-CA-IgG-Reaktionen im IIFT kann so wesentlich vereinfacht werden. Bei unkla-ren EBV-CA-IgM-Reaktionen ermöglicht der EUROPLUS-BIOCHIP zudem eine zuverlässige Differenzierung zwischenspezifi schen und unspezifi schen Reaktionen.

Obere Reihe: frische Infektion, untere Reihe: abgelaufene Infektion

6 VCA gp125 7 VCA p19 8 Antigen-freier BIOCHIP (IgG)

9 VCA gp125 10 VCA p19 11 Antigen-freier BIOCHIP (IgM)

BE

ST

ELL

UN

G1 2 3 4 5

5432 1

8

7

6

8

7

6

11

10

9

11

10

9

EBV CA (IgG) EEBV CA (IgG) EEBV CA (I G) EEBV CA (I G) EBV CA (IgG) +HarnstoBV CA (IgG) +HarnstoV CA (I G) H tV CA (I G) H t f EBV CA (IgM)ff EBV CA (IgM)f EBV CA (I M)f EBV CA (I M)f EBV EA (IgG)EBV EA (IgG)EBV EA (I G)EBV EA (I G) EBNA (IgG)EBNA (IgG)EBNA (I G)EBNA (I G)

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ELISA

Die EUROIMMUN Anti-EBV-ELISA sind hochsensitive Tests zum Nachweis von EBV-Antikörpern verschiedener Immun-globulinklassen (IgA, IgG, IgM). Die Untersuchung der zeitlich versetzt auftretenden Antikörper ermöglicht eine unkompli-zierte Bestimmung des Infektionsstadiums. Durch die automatisierte Abarbeitung sind die ELISA zur Untersuchung größe-rer Patientenkollektive geeignet.

Stufendiagnostik bei Immungesunden

Sensitivität und Spezifi tät

Die Untersuchung klinisch und serologisch vorcharakte-risierter Proben verschiedenen Ursprungs (INSTAND /Deutschland, NEQAS / Großbritannien, Labquality / Finn-land) mit den ELISA-Systemen ergaben eine hohe Sensi-tivität bei gleichzeitig sehr guter Spezifi tät (grenzwertige Seren ausgenommen).

Antigen n Spezifi tät Sensitivität

EBV-CA (IgG) 111 100 % 100 %

EBV-CA (IgM) 160 99 % 100 %

EBV-EA-D (IgG) 26 100 % 100 %

EBNA-1 (IgG) 109 100 % 100 %

ELISA-Produkte Bestellnummer

Anti-EBV-CA-ELISA (IgA, IgG) EI 2791-9601 A / G

Anti-EBV-CA-ELISA (IgG) (Aviditätsbestimmung) EI 2791-9601-1 G

Anti-EBV-CA-ELISA (IgM) EI 2791-9601 M

Anti-EBV-EA-D-ELISA (IgA, IgG, IgM) EI 2795-9601 A / G / M

Anti-EBNA-1-ELISA (IgG) EI 2793-9601 G BE

ST

ELL

UN

G

1Es gibt Patienten, die keine

EBV-CA-IgM-Antikörper bilden.

In diesem Fall kann mit den

Routinetests nicht zuverläs-

sig zwischen einer akuten und

einer abgelaufenen Reaktion

unterschieden werden. Hier

kann zusätzlich ein Aviditätstest

durchgeführt werden, um eine

akute von einer abgelaufenen

Infektion zu unterscheiden.

EBV-CA IgG / IgM EBNA IgG

ein Test positiv 1

EBNA IgG

negativ positivIgG und IgM

negativ

Patientenprobe

*vgl. Tabelle S. 3

Seronegativ Interpretation * Zurückliegende

Infektion

6

EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG / IgM)Einfache Testdurchführung, vollautomatische Abarbei-tung möglich

Native, affi nitätschromatographisch aufgereinigte Anti-gene und rekombinante EBV-Antigene für höchste Sen-sitivität und Spezifi tät

Wahrscheinlichkeit einer akuten EBV-Infektion wird in derEUROLineScan Software berechnet

Inklusive Spätphasenmarker p22; hilfreich bei serolo-gisch unklaren Befunden wie sekundärem Verlust vonAnti-EBNA-1

Anti-EBV-Westernblot (IgG / IgM)

Spezifi scher Test zum Nachweis von Antikörpern gegen EBVVollantigenextrakt mit allen relevanten AntigenenOptimale Trennung der Antigenbanden

Klinische Daten

60 klinisch und serologisch vorcharakterisierte Seren wurden im Rahmen eines INSTANDRingversuchs mit dem EUROIMMUN EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG, IgM) untersucht. Die mit dem EUROLINE erzielten Ergebnisse zum Infektionsstatus stimmten in allen Fällen mit demVorgaben des Ringversuchsinstituts überein.

BLOT-Produkte Bestellnummer

EUROLINE EBV-Profi l 2 (IgG, IgM) DN 2790 -####-2 G / M

Anti-EBV-Westernblot (IgG, IgM) DY 2790 -#### G / M

BESTELLUNG

Immunblot

Als Nachweisverfahren zur Diagnostik einer EBV-Erkrankung stehen neben den Methoden IIFT und ELISA auch Immunblotszur Verfügung (EUROLINE und Westernblot). Beide Blotverfahren bieten eine Multiparameteranalyse verschiedener Anti-körper. Für die automatische Blot-Abarbeitung steht mit dem EUROBlotOne ein System zur Verfügung, das von der Proben-verdünnung bis zur Bilderfassung sämtliche Arbeitsschritte vollautomatisch durchführt.

Frische

Infektion

Abgelaufene

Infektion

Anti-VCA (IgM) - + -

Anti-VCA (IgG) - + +

Anti-EBNA-1 (IgG) - - +

Anti-p22 (IgG) - - +

Anti-EA-D (IgG) - - -

n = 60

Ergebnisse EUROLINE IgG und IgM

Primärinfektion zurückliegendeInfektion negativ

Status der EBV-

Infektion nach

INSTAND

Primärinfektion 5 0 0

zurückliegendeInfektion 0 43 0

negativ 0 0 12

Kontrollbande

VCA p22

IgAIgGIgM

VCA p33

EA p43, VCA p42

EA p45

EBNA-1 p79

VCA p40, 41

VCA p125

EA p93

VCA p65

p27

Kontrolle

IgGIgM

EA-D

p22

VCA gp125

VCA p19

EBNA-1

EUROLINE Westernblot

Konjugat-kontrolle

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Avidität

Über die Avidität der IgG-Antikörper kann abgeschätzt wer-den, in welcher Phase sich eine EBV-Infektion befi ndet. Die Stärke einer einzelnen Bindung zwischen Antikörper undAntigen wird als Affi nität bezeichnet. Unter Avidität versteht man die Summe aller Affi nitäten eines Antikörpers. Zu Be-ginn einer Infektion ist die Bindungskraft schwach, weil dasImmunsystem noch keine genau passenden Antikörper bil-den kann. Mit fortschreitender Dauer der Infektion werdendie Antikörper dann immer exakter dem entsprechendenAntigen angepasst.

IgG-Antikörper während einer akuten Infektion weiseneine niedrige Avidität auf

IgG-Antikörper nach einer durchgemachten Infektionweisen eine hohe Avidität auf

Zur Feststellung der Bindungsfähigkeit werden IgG-Testsmit bzw. ohne bindungshemmende Substanzen wie z. B.hochmolarer Harnstoff durchgeführt. Im Gegensatz zuhoch-aviden Antikörpern sind niedrig-avide Antikörper nachZugabe von Harnstoff nicht in der Lage, stabile Bindungeneinzugehen. Durch die Aviditätstestung lassen sich serolo-gisch schwierige Konstellationen klären wie z. B. das Auftre-ten persistierender Anti-EBV-CA-IgM-Antikörper oder dasFehlen spezifi scher Anti-EBV-CA-IgM-Antikörper bei akuten Infektionen.

Aviditätsmessung ELISA

Zur serologischen Diagnose einer akuten EBV-Infektion kannder EBV-CA-ELISA genutzt werden. Dazu werden zwei Pa-tientenproben parallel angesetzt (konventionell bzw. mitHarnstoff-Behandlung). Niedrig-avide Antikörper liegen vor,wenn die im ELISA gemessene Extinktion durch die Harn-stoff-Behandlung wesentlich verringert wird. Zur Objektivie-rung und Quantifi zierung wird aus den Messwerten mit und ohne Harnstoff-Behandlung der relative Aviditäts index (RAI)berechnet.

Eine Aviditätsbestimmung ist auch bei den indirekten Im-munfl uoreszenztests möglich.

Tests zur Aviditätsmessung Bestellnummer

BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-1 X

EUROPLUS® BIOCHIP-Sequenz EBV FI 2799 -####-21 X

EBV-CA-ELISA (IgG) EI 2791-9601-1 G

BESTELLUNG

Tag der Blutentnahme

0 50 100 150 200

Rela

tiver

Avid

itäts

ind

ex (

%)

0

20

40

60

80

100

2568

Hinweis auf niedrig-avide Antikörper

Hinweis auf hoch-avide Antikörper

Grenzwertbereich

Bei Inkubation mit Harnstoff-Lösung lösen sich niedrig avide Anti-körper von ihrem Antigen (a), während bei hoch-aviden Antikörperndie Bindung stabil bleibt (b).

Relativer Aviditätsindex der IgG-Antikörper im Verlauf einer akutenEBV-Infektion

niedrig-avidesIgG

+ Harnstoff

Bindung zerstört Virus Antigen

a

hoch-avidesIgG

+ Harnstoff

Bindungstabil

b

Extinktion der Probe mit Harnstoffbehandlung x 100

Extinktion der Probe ohne Harnstoffbehandlung= RAI (%)

Nasopharynx-Karzinom

Das Nasopharynx-Karzinom (NPC) ist ein monoklonaler Tu-mor des Nasen-Rachen-Raums, der mit einer EBV-Infektionassoziiert ist. Das NPC tritt vor allem in Südostasien, Nordaf-rika, Alaska und Grönland auf. Im südlichen China ist dasNPC unter den bösartigen Tumoren die dritthäufi gste Tu-morart. In Europa und Nordamerika ist die Erkrankung sel-ten. Die Inzidenz liegt hier im Bereich von 0,5 bis 1 auf 100.000 Personen. Bei der Entstehung des NPC sind nebender Infektion mit dem EBV noch andere Faktoren am Tumor-wachstum beteiligt. Als Kofaktoren werden genetischeGründe angenommen, aber auch Umweltfaktoren wie spezi-fi sche Ernährungsgewohnheiten scheinen eine Rolle zu spielen. In der Diskussion stehen seit einiger Zeit auchverschiedene Virusstämme des EBV.

Für die frühzeitige Identifi zierung des Nasopharynx-Karzi-noms spielt neben dem Direktnachweis durch Polymera-se-Kettenreaktion (PCR) die Serologie eine große Rolle. DasNasopharynx-Karzinom stimuliert die Bildung von IgA-Antikörpern gegen Capsid-Antigene und Early Anti gene des Epstein-Barr-Virus.

Prävalenz von IgA-Antikörpern

In einer Studie wurden 96 chinesische Patienten mit kli-nisch charakterisiertem NPC und ein Kontrollkollektiv aus 80gesunden chinesischen Blutspendern untersucht. Die Prä-valenz der IgA-Antikörper gegen EBV-CA und EBV-EAwurde mithilfe von ELISA-Testsystemen bzw. durch indi-rekte Immunfl uoreszenztests ermittelt. Bei Einhaltung des empfohl enen Cut-off konnten Antikörper der Klasse IgAgegen EBV-CA in 98 % (IIFT) bzw. 95 % (ELISA) der NPC-Patientenseren nachgewiesen werden. Die ermittelte Präva-lenz von Anti-EBV-EA (IgA) lag im Patientenkollektiv bei 85 % (IIFT) bzw. 56 % (ELISA).

Tests für die Diagnose des NPC Bestellnummer

Anti-EBV-CA-ELISA (IgA) EI 2791-9601 A

Anti-EBV-EA-ELISA (IgA) EI 2795-9601 A

BIOCHIP-Mosaik EBV-CA/EBV-EA (IgA) FI 2791-####-2 A

BESTELLUNG

EI_2791_I_DE_A03, 07/ 2018

IIFT-Titer Anti-EBV-CA-IIFT (IgA) Anti-EBV-EA-IIFT (IgA)

Cut-off Sensitivität Spezifi tät Sensitivität Spezifi tät

1:10* 98 % 85 % 85 % 97 %

1:100 95 % 91% 66 % 99 %

1:1000 69 % 99 % 28% 100 %

1:10000 22 % 100 % 7 % 100 %

Ratio Anti-EBV-CA-ELISA (IgA) Anti-EBV-EA-ELISA (IgA)

Cut-off Sensitivität Spezifi tät Sensitivität Spezifi tät

Ratio 0,8* 95 % 85 % 56 % 99 %

Ratio 1,1 85 % 92% 47 % 99 %

Ratio 1,6 77 % 95 % 40% 99 %

Ratio 2,1 70 % 100 % 38 % 100 %

*Empfohlener Cut-off

Für den serologischen Nachweis von EBV-IgA-Antikörpernbietet EUROIMMUN sowohl ELISA- als auch indirekte Im-munfl uoreszenz-Testsysteme an.

Immunfl uoreszenz-Aufnahme Anti-EBV-CA-positiv (links) und

Anti- EBV-EA-positiv (rechts)

Nasopharynx

Nasenhöhle

EUROIMMUN AG · Seekamp 31 · 23560 Lübeck · Tel 0 451/ 58 55-0 · Fax 58 55-591 · info@euroimmun.de · www.euroimmun.de