ETABLIERUNG DER MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON … · Bei der Entwicklung von Dosierungsschemata gewinnen Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Korrelationen zunehmend an Bedeutung. Hierbei

Tierärztliche Hochschule Hannover

ETABLIERUNG DER MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON ANTIINFEKTIVA-KONZENTRATIONEN

IN DER LUNGE VON SCHWEINEN UND VERGLEICH MIT ANDEREN UNTERSUCHUNGSMODELLEN

INAUGURAL-DISSERATIONzur Erlangung des Grades einerDoktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -(Dr. med. vet.)

vorgelegt vonAnn-Sophie Croneberger

aus Mainz

Hannover 2009

Tierärztliche Hochschule Hannover

ETABLIERUNG DER MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON ANTIINFEKTIVA-KONZENTRATIONEN

IN DER LUNGE VON SCHWEINEN UND VERGLEICH MIT ANDEREN UNTERSUCHUNGSMODELLEN

INAUGURAL-DISSERATIONzur Erlangung des Grades einerDoktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -(Dr. med. vet.)

vorgelegt vonAnn-Sophie Croneberger

aus Mainz

Hannover 2009

Wissenschastliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. M. Kietzmann Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Kietzmann2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. M. Wendt

Tag der mündlichen Prüfung: 27. April 2009

× Meinen Großeltern ×

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Literaturübersicht 2.1 Untersuchungsmodelle zur Bestimmung von Antiinfektiva- Konzentrationen in Zielgeweben

2.1.1 Notwendigkeit der direkten Bestimmung von Antiinfektiva- Konzentrationen in Zielgeweben2.1.2 Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben 2.1.3 Hautblasenversuch 2.1.4 Gewebekäfige 2.1.5 Bronchoalveoläre Lavage 2.1.6 Entnahme von Sekret des Bronchialepithels mittels Blättchenmethode2.1.7 Bildgebende Verfahren 2.1.8 Mikrodialyse

2.2 Das Schwein als Modelltier2.2.1 Auswahl des Modelltiers 2.2.2 Anatomische Grundlagen 2.2.3 Gewebepenetration von Antiinfektiva – Anreicherung in der Lunge2.2.4 Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen im Respirationstrakt2.2.5 Bakterielle Erkrankungen des Respirationstraktes

2.3 Cefpirom als Modellsubstanz 2.3.1 Struktur und Klassifizierung2.3.2 Pharmakodynamische Eigenschaften2.3.3 Pharmakokinetische Eigenschaften 2.3.4 Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Parameter2.3.5 Resistenzen2.3.6 Präparat

3 Material und Methoden 3.1 Zielsetzung und Beschreibung der In-vivo-Versuche 3.1.1 Versuch 1: Vorversuch - Etablierung der Mikrodialyse 3.1.2 Versuch 2: Hauptversuch - Vergleich der Mikrodialyse mit anderen Untersuchungsmodellen 3.1.3 Versuch 3: Zusatzversuch – Anwendung der Mikrodialyse in wachen Tieren

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Inhaltsverzeichnis

3.2 In-vitro-Vorversuche und allgemeine Versuchsinformationen 3.2.1 Bedingungen der Versuchsdurchführung3.2.2 Mikrodialysezubehör3.2.3 Bestimmung der relativen Wiederfindung3.2.4 Pflege und Aufbewahrung der Mikrodialysekatheter3.2.5 Testsubstanz3.2.6 Versuchstiere und ihre Haltung

3.3 Durchführung Versuch 1 3.3.1 Versuchsablauf 3.3.2 Narkose 3.3.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialyskatheters in die Lunge 3.3.4 Applikation von Cefrom® 3.3.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut 3.3.6 Einschläfern der Versuchstiere

3.4 Durchführung Versuch 2 3.4.1 Versuchsablauf 3.4.2 Narkose 3.4.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters 3.4.4 Applikation von Cefrom® 3.4.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat, Blut, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe 3.4.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben 3.4.7 Einschläfern der Versuchstiere

3.5 Durchführung Versuch 3 3.5.1 Versuchsablauf 3.5.2 Narkose, Aufwachphase und post-anästhetische Überwachung 3.5.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters 3.5.4 Applikation von Cefrom® 3.5.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut 3.5.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben 3.5.7 Einschläfern der Versuchstiere

3.6 Aufarbeitung und Analyse der Proben 3.6.1 Analytische Methode 3.6.2 Mikrodialysat-Proben und Proben der Stammlösungen aus den Wiederfindungsversuchen und Lungen-Mikrodialysat-Proben 3.6.3 Blutplasma-Proben

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Inhaltsverzeichnis

3.6.4 Proben von Sekret des Bronchialepithels 3.6.5 Lungenhomogenat-Proben

3.7 Berechnungen und statistische Auswertung 3.7.1 Relative Wiederfindung der Mikrodialysekatheter 3.7.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe3.7.3 Statistische Testverfahren 3.7.4 Pharmakokinetische Auswertung

4 Ergebnisse 4.1 Versuch 1 4.1.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 1 bis 4 4.1.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von narkotisierten Schweinen 4.1.3 Pharmakokinetische Parameter

4.2 Versuch 2 4.2.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 5 bis 12 4.2.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungen- gewebe von narkotisierten Schweinen 4.2.3 Pharmakokinetische Parameter 4.2.4 Pathologische Untersuchung

4.3 Versuch 3 4.3.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 13 bis 20 4.3.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von wachen Schweinen 4.3.3 Pharmakokinetische Parameter 4.3.4 Pathologische Untersuchung

4.4 Vergleichende Betrachtung der Versuche 1, 2 und 3 4.4.1 Auswirkung der Operation und Katheter-Implantation auf die Tiere 4.4.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge4.4.3 Auswertung der statistischen Testverfahren 4.4.4 Pharmakokinetische Parameter

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5 Diskussion5.1 Auswahl des Mikrodialysezubehörs und Bestimmung der relativen Wiederfindung5.2 Auswirkungen der Thorakotomie und der Katheterimplantation5.3 Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von Menschen und Schweinen5.4 Analyse der Lungen-Mikrodialysat-Proben und Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssig- keit der Lunge der Versuche 1, 2 und 35.5 Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, in Blutplasma, Sekret des Bronchial- epithels und Lungengewebe5.6 Einsatz der Mikrodialyse für Pharmakokinetik-Pharma- kodynamik-Korrelationen5.7 Schlussfolgerungen

6 Zusammenfassung / Summary6.1 Zusammenfassung6.2 Summary

7 Anhang7.1 Nicht im Text aufgeführte Tabellen 7.2 Ergebnisse der pathologischen Untersuchungen einzelnen Tiere

8 Verzeichnisse8.1 Literaturverzeichnis 8.2 Abkürzungsverzeichnis8.3 Abbildungsverzeichnis8.4 Tabellenverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

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Einleitung

1Einleitung

3

Einleitung

Einleitung

Bakterielle Infektionen des Respirationstrakts zählen zu den bei lebensmittelliefernden Tieren

am häufigsten diagnostizierten Erkrankungen. Die Behandlung dieser Erkrankungen erfolgt

durch die Verabreichung von Antiinfektiva. Durch intensiven, nicht immer gezielten Einsatz von

Antiinfektiva entwickeln bakterielle Erreger zunehmend wirksame Resistenzmechanismen ge-

genüber antibakteriellen Substanzen. Um die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen zu

verhindern, sollte die antibakterielle Therapie neben der klinischen Heilung auch eine vollständi-

ge bakteriologische Heilung zum Ziel haben. Dies kann nur erreicht werden, wenn Antiinfektiva

gezielt und in adäquater Dosierung eingesetzt werden.

Bei der Entwicklung von Dosierungsschemata gewinnen Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-

Korrelationen zunehmend an Bedeutung. Hierbei werden pharmakokinetische Parameter häufig

basierend auf im Blutplasma gemessenen Wirkstoffkonzentrationen berechnet. Bakterielle Infek-

tionen sind jedoch bis auf wenige Ausnahmen in anderen Kompartimenten als dem vaskulären

Kompartiment lokalisiert. Da sich die meisten Substanzen nicht gleichmäßig im Organismus ver-

teilen, können Konzentrationen im Blutplasma und Zielgewebe stark voneinander abweichen.

Die Messung von Wirkstoffkonzentrationen direkt im Zielgewebe kann jedoch für anatomisch

schwer zugängliche Organe, wie z. B. die Lunge, schwierig sein. Weiterhin ist bei der Bestim-

mung von Zielgewebskonzentrationen wichtig, in welchen Kompartimenten eines Gewebes die

Wirkstoffkonzentrationen gemessen werden. Denn innerhalb eines Gewebes befinden sich bak-

terielle Erreger in für sie spezifischen Kompartimenten. Beispielsweise sind zahlreiche Erreger in

der extrazellulären Flüssigkeit lokalisiert. Auch kann prinzipiell nur die nicht-proteingebundene

Fraktion eines Wirkstoffs antimikrobielle Aktivität entfalten. In vielen Fällen ist somit für den

Erfolg einer antibakteriellen Therapie die nicht-proteingebundene Fraktion eines Wirkstoffs in

der extrazellulären Flüssigkeit des jeweiligen Zielgewebes entscheidend.

Die in der Veterinärmedizin etablierten Untersuchungsmodelle zur Messung von Wirkstoffkon-

zentrationen in Zielgeweben sind unzureichend, da sie weder eine separate Konzentrationsbe-

stimmung in der extrazellulären Flüssigkeit noch die direkte Bestimmung des nicht-proteinge-

bundenen, pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils erlauben.

Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines Untersuchungsmodells, der Mikrodialyse, zur Bestim-

mung der nicht-proteingebundenen Fraktion eines Beta-Laktam-Antibiotikums in der extrazel-

lulären Flüssigkeit der Lunge von narkotisierten Schweinen und der Vergleich von Konzentra-

tionen dieses Beta-Laktam-Antibiotikums in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Sekret

des Bronchialepithels, Lungengewebe und Blutplasma. Des Weiteren wird die Mikrodialyse zu

Konzentrationsbestimmungen in der Lunge von wachen Schweinen angewendet.

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Literaturübersicht

2Literaturübersicht

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Literaturübersicht

2.1 Untersuchungsmodelle zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben

2.1.1 Notwendigkeit der direkten Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben

Meist ist das Ziel einer antibakteriellen Therapie neben der klinischen Heilung auch eine voll-

ständige Eradikation der Bakterien (bakteriologische Heilung) zu erreichen. Nur so kann die

Entstehung und Verbreitung von Resistenzen gegenüber antibakteriellen Substanzen und ein

Wiederaufflammen der Erkrankung verhindert werden. Ohne eine vollständige bakteriologische

Heilung dominieren diejenigen Erreger den Rekolonisationsprozess, welche gegenüber der ein-

gesetzten antibakteriellen Substanz weniger empfindlich sind. Als Folge davon kann eine resis-

tente Population entstehen. Sowohl eine Minimierung der Entstehung von Resistenzen, als auch

eine Steigerung der klinischen Effektivität kann vor allem durch adäquate, auf wissenschaftlicher

Basis ausgearbeitete Dosierungsschemata von Antiinfektiva erreicht werden (TOUTAIN et al.

2002; TOUTAIN 2003).

Bei der Entwicklung von veterinärmedizinischen Antiinfektiva werden im Rahmen präklini-

scher Studien Dosierungsschemata erstellt, welche in klinischen Studien (Feldstudien) verifiziert

werden (MCKELLAR et al. 2004; TOUTAIN u. LEES 2004). Lange Zeit basierte die präkli-

nische Dosisfindung auf Dosistitrations- und Dosisbestätigungsstudien. Hierbei wird die zu un-

tersuchende Substanz infizierten Tieren der jeweiligen Zieltierspezies in mehreren Dosierungen

verabreicht und die klinischen Ergebnisse werden mittels statistischer Testverfahren miteinander

verglichen. Diese Art der Dosisfindung birgt eine Reihe von Nachteilen. Zum einen muss eine

große Anzahl von Tieren verwendet werden, was sowohl aus ethischer als auch ökonomischer

Sicht unerwünscht ist. Zum anderen kann nicht immer eine valide Aussage darüber getroffen

werden, ob eine bakteriologische Heilung stattgefunden hat, da der Erfolg der Therapie alleine

an den klinischen Ergebnissen gemessen wird (TOUTAIN 2003; TOUTAIN u. LEES 2004).

Das Pollyanna-Phänomen besagt, dass Antibiotika mit guter klinischer Effektivität eine geringe

antibakterielle Aktivität aufweisen können. Umgekehrt können antibakteriell exzellent wirksa-

me Substanzen oder Dosierungsschemata klinisch nicht zum erwarteten Ergebnis führen. Eine

vollständige klinische Heilung garantiert also keineswegs eine gutes bakteriologisches Ergebnis

(MCKELLAR et al. 2004). Somit zeigt sich, dass es allein durch Dosistitrationsstudien, Dosis-

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Literaturübersicht

bestätigungsstudien und Feldstudien nicht immer möglich ist, optimale Dosierungsschemata be-

züglich der bakteriologischen Heilung zu entwickeln. Aus diesem Grund gewinnen Pharmako-

kinetik-Pharmakodynamik (PK-PD)-Korrelationen immer mehr an Bedeutung (TOUTAIN et

al. 2002; EMEA GUIDELINE 627 2003; MCKELLAR et al. 2004).

PK-PD-Korrelationen basieren auf dem Grundsatz, dass das Ergebnis jeder antimikrobiellen

Therapie von 2 Faktoren abhängig ist, zum einen von der Exposition des Erregers gegenüber der

Substanz am Ort des infektiösen Geschehens (Pharmakokinetik), zum anderen von der Emp-

findlichkeit des Erregers gegenüber dieser Substanz (Pharmakodynamik). Die Kombination von

PK- und PD-Parametern wird als PK-PD-Korrelation bezeichnet (TOUTAIN 2003). Durch

PK-Studien im Zieltier werden Konzentrations-Zeitprofile erstellt und pharmakokinetische Pa-

rameter wie die maximale Konzentration (Cmax

), die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Kon-

zentration (Tmax

) und die Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (Area Under the Curve

[AUC]) berechnet. Pharmakodynamische Parameter dienen als Indikator für die Wirksamkeit ei-

ner Substanz. Als pharmakodynamischer Parameter für Antiinfektiva wird in in vitro durchgeführ-

ten PD-Studien insbesondere die minimale Hemmkonzentration (MHK) bestimmt (TOUTAIN

u. LEES 2004). Die wichtigsten und meist verwendeten PK-PD-Parameter zur Vorhersage eines

klinischen und bakteriologischen Ergebnisses sind das Verhältnis der Fläche unter der Konzen-

trations-Zeitkurve zur minimalen Hemmkonzentration (AUC/MHK, angewendet bei Chino-

lonen), das Verhältnis der maximalen Konzentration zur minimalen Hemmkonzentration (Cmax

/

MHK, angewendet bei Aminoglykosiden) und die Zeitspanne in welcher die Konzentration der

antibakteriellen Substanz die minimale Hemmkonzentration übersteigt (T>MHK, angewendet

bei Makroliden und Beta-Laktam-Antibiotika) (TOUTAIN 2003).

In der Entwicklung von Antiinfektiva basieren pharmakokinetische Untersuchungen häufig auf

Messungen von Konzentrationen im Blutplasma, da Blutproben vergleichsweise einfach zu ent-

nehmen sind (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005). Das infektiöse Geschehen ist jedoch bis auf

wenige Ausnahmen (z. B. Bakteriämie mit intravaskulärer Infektion) in den peripheren Gewe-

ben lokalisiert. Genauer befinden sich die meisten Bakterien in der extrazellulären Flüssigkeit

(EZF) der Gewebe. Deshalb ist meist die EZF Zielraum der antibakteriellen Therapie (JOUK-

HADAR et al. 2001; LIU u. DERENDORF 2003; BRUNNER et al. 2005). Bei der Ableitung

von Zielgewebskonzentrationen von im Blutplasma gemessenen Konzentrationen werden einige

Gegebenheiten nicht ausreichend berücksichtigt. Erstens wird davon ausgegangen, dass eine

gleichmäßige Verteilung einer Substanz zwischen Blut und Zielgewebe stattfindet. Tatsächlich

aber können Blutplasma- und Gewebekonzentrationen stark voneinander abweichen (MOU-

TON et al. 2008). Denn zum einen kann nur derjenige Anteil einer Substanz, welcher nicht

an Plasmaproteine gebunden ist (nicht-proteingebundene Fraktion), die systemische Zirkulation

verlassen und sich im Zielgewebe anreichern (PLOCK u. KLOFT 2005). Zum anderen kann bei

einigen klinischen Gegebenheiten die Penetration von Antiinfektiva in das Zielgewebe verändert

sein. Hierbei wird angenommen, dass der transendotheliale Membrantransfer in das Interstitium

peripherer Gewebe durch unspezifische Mechanismen und Schranken (wie beispielsweise Barri-

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Literaturübersicht

eren durch fibröse Kapseln oder perifokale Ödeme bei chronischen oder akuten Entzündungs-

prozessen) oder durch Veränderungen des Blutflusses, der kapillären Dichte und Permeabilität,

des pH-Werts im Entzündungsareal oder durch Änderungen des transkapillären osmotischen

Druckgradienten verändert sein kann (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; THALLINGER u.

JOUKHADAR 2005). Zweitens werden Arzneimittelwirkungen durch Wechselwirkungen mit

verschiedenen Strukturen in den Zielgeweben wie Enzymen, Arzneimitteltransportsystemen

oder Rezeptorproteinen beeinflusst, welche im Blutplasma nicht zu finden sind (BRUNNER

u. LANGER 2006). Daraus folgt, dass die minimale Hemmkonzentration, welche notwendig ist,

um die Zielerreger zu eliminieren, im Blutplasma durchaus erreicht werden kann, obwohl sie im

Zielgewebe nicht erreicht wird (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; MOUTON et al. 2008).

Werden also mit Hilfe pharmakokinetischer Parameter, die basierend auf Blutplasma-Konzen-

trationen berechnet wurden, Dosierungsschemata erstellt, kann durch Anwendung dieser Dosier-

ungsschemata oft keine vollständige Abtötung der Bakterien erreicht werden.

Somit ist es zur Vermeidung von Resistenzbildungen und zur Steigerung der klinischen Effekti-

vität von essentieller Bedeutung, Konzentrationen von Antiinfektiva direkt am Ort des infektiö-

sen Geschehens, das heißt in den meisten Fällen in der EZF peripherer Gewebe, zu messen.

Im Folgenden wird eine Auswahl an Methoden zur Konzentrationsbestimmung von Antiinfekti-

va in Zielgeweben beschrieben.

2.1.2 Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben

Antiinfektiva-Konzentrationen werden in Gesamtgewebeproben wie folgt bestimmt: beim

Mensch werden Gewebeproben mittels Biopsie entnommen; beim Tier werden die Proben meist

direkt post mortem gewonnen. Anschließend homogenisiert man die Proben mit einer Gewebe-

zerkleinerungsmaschine und bestimmt die Konzentration des Arzneimittels im Homogenat mit

analytischen Methoden (NIX 1998).

Die Vorteile der Methode sind die einfache technische Durchführung und die prinzipielle Mög-

lichkeit der Gewinnung von Homogenatproben aus jedem Gewebe.

Es gibt jedoch eine Reihe von Nachteilen. Da die Entnahme von Gewebeproben invasiv ist, gibt

es sowohl beim Tier als auch beim Mensch eine ethische Limitierung (BRUNNER et al. 2005).

Beim Mensch ist schon die Anzahl an Biopsieentnahmen in leicht zugänglichen Geweben (z. B.

Haut) begrenzt. Eine Biopsienentnahme in schwer zugänglichen Geweben (z. B. Leber oder

Niere) ist überhaupt nur aus einer klinischen Indikation heraus rechtfertigbar. Beim Tier müssen

pro Probenentnahmezeitpunkt mindestens 1, meist aber mehrere Tiere getötet werden. Daher

ist die Anzahl der Probenentnahmezeitpunkte aus Tierschutzaspekten limitiert (HANSEN et

al. 1999). Aus der begrenzten Anzahl von Probenentnahmen ergibt sich folgender Nachteil: da

aus ethischen Aspekten nicht mehrerer Proben zu verschiedenen Zeitpunkten von einem Indi-

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Literaturübersicht

viduum entnommen werden sollten, ist die Erstellung eines Konzentrations-Zeitverlaufs mittels

Daten von einem Tier nicht möglich. Aus diesem Grund werden Gewebeproben zu unterschied-

lichen Zeitpunkten von verschiedenen Individuen entnommen, was allerdings zur Entstehung

interindividueller Variabilitäten führt (MOUTON et al. 2008). Gewebeproben setzen sich aus

verschiedenen Bestandteilen, wie Blut, EZF, einer Vielfalt an Zellen und je nach Geweben auch

intraluminalen Komponenten zusammen (NIX 1998). Da der Anteil von Blut im Homogenat

nicht quantifizierbar ist, besteht besonders in gut durchbluteten Geweben (z. B. Lunge) die Ge-

fahr der Verfälschung der gemessenen Konzentrationen. Eine ähnliche Problematik ergibt sich

aus der Kontamination des Homogenats einiger Gewebe mit intraluminalen Komponenten. Im

Homogenat von Organen wie Leber und Niere sind auch Gallenflüssigkeit beziehungsweise

Urin enthalten. Da beispielsweise Beta-Laktam-Antibiotika hohe Konzentrationen in diesen

Flüssigkeiten erreichen können, werden deshalb auch höhere Konzentrationen im Homogenat

gemessen (WISE 1986). Des Weiteren geht man bei der Interpretation von im Gesamtgewebe

gemessenen Konzentrationen fälschlicherweise davon aus, dass die zu untersuchende Substanz

gleichmäßig zwischen den Gewebekomponenten verteilt ist. Dies ist in der Realität jedoch nicht

der Fall. Verschiedene Substanzklassen von Antiinfektiva reichern sich in den einzelnen Kompar-

timenten unterschiedlich an. Während Beta-Laktam-Antibiotika beispielsweise fast ausschließlich

in der EZF angereichert sind, akkumulieren Makrolide und Chinolone auch intrazellulär. Da die

meisten Infektionen im extrazellulären Kompartiment lokalisiert sind, ist die dort vorherrschen-

de Konzentration des Antiinfektivums entscheidend. Deshalb werden bei der Konzentrationsbe-

stimmung von auf den Extrazellulärraum beschränkten Substanzen im Gewebehomogenat die

zur Eradikation der Bakterien entscheidenden Konzentrationen durch Verdünnung mit intrazel-

lulären Komponenten unterschätzt. Konzentrationen von intrazellulär angereicherten Substanzen

werden jedoch überschätzt (NIX 1998). Weiterhin ist bei dieser Methode keine Differenzierung

zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion des Arzneimittels möglich.

Dies ist ein entscheidender Nachteil, denn nur die nicht-proteingebundene Fraktion kann anti-

mikrobielle Aktivität entfalten (MÜLLER et al. 2004).

2.1.3 Hautblasenversuch

Im Hautblasenversuch werden Arzneimittelkonzentrationen in der Flüssigkeit einer artifiziell

erzeugten Hautblase gemessen. Diese Hautblase entsteht durch Trennung von Epidermis und

Dermis entlang der Lamina lucida. Es gibt 2 Möglichkeiten diese Trennung herbeizuführen: zum

einen mechanisch, durch Erzeugung von Unterdruck, zum anderen chemisch unter Verwendung

von Kantharidin. Kantharidin ist ein Terpenoid, welches in verschiedenen Käferarten vorkommt.

Es wird in Form von Pflastern auf die Haut aufgeklebt. Durch starke Reizung der Haut entsteht

dann eine subepidermal lokalisierte Blase. In dem erzeugten Hohlraum, der den Interstitialraum

repräsentieren soll, sammelt sich Flüssigkeit an. Diese wird aspiriert und die Konzentration des zu

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Literaturübersicht

untersuchenden Arzneimittels wird bestimmt (BRUNNER et al. 1998; HOCHT et al. 2006).

Die Entnahme von Hautblasenflüssigkeit ist eine häufig angewendete Methode in der Human-

medizin. Es existiert eine Fülle von Daten zur Penetration von zahlreichen Antibiotika in kan-

tharidin- und unterdruckinduzierter Hautblasenflüssigkeit (MÜLLER et al. 2004).

Die Vorteile der Methode sind zum einen die einfache technische Durchführung, zum an-

deren ist die Methode wenig invasiv und verursacht geringe Kosten (BRUNNER u. LAN-

GER 2006).

Aus der Methodik entstehen jedoch folgende Nachteile: einerseits ist die Arzneimittelkonzent-

ration in der Hautblasenflüssigkeit abhängig von der Lokalisation und Größe der Blase, der Dif-

fusionskapazität über die Blasenbasis und dem Oberflächen-Volumenverhältnis; es besteht also

eine hohe Variabilität und Ergebnisse sind somit kaum reproduzierbar (LIU u. DERENDORF

2003; MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Andererseits sind die Hautblasen

sehr unangenehm, deshalb können Messungen nur über kurze Zeiträume durchgeführt werden.

Eine kontinuierliche Probenentnahme von einem Individuum über einen längeren Zeitraum

ist daher nicht möglich (HOCHT et al. 2006). Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass so-

wohl bei chemisch als auch bei mechanisch induzierten Hautblasen eine starke Manipulation

stattfindet. Das Risiko einer Entzündung ist groß; daher gleicht die Hautblasenflüssigkeit mehr

einem inflammatorischen Exsudat als dass sie der EZF gleicht (LIU u. DERENDORF 2003;

BRUNNER u. LANGER 2006). Zudem ist die Hautblasenflüssigkeit lediglich repräsentativ für

die EZF der Haut (MÜLLER et al. 2004). Weiterhin ist keine Differenzierung zwischen prote-

ingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion des Arzneimittels möglich, da sich in der

Hautblasenflüssigkeit auch Proteine anreichern können (HOCHT et al. 2006).

2.1.4 Gewebekäfige

Ein Gewebekäfig ist ein teilperforierter Hohlkörper, welcher in subkutanes Gewebe eingesetzt wird.

Nach der Implantation wird der Käfig von stark vaskularisiertem Granulationsgewebe umgeben, be-

ziehungsweise partiell gefüllt. In dem verbleibenden Hohlraum sammelt sich eine Flüssigkeit an, die der

EZF ähnelt. Nach Entnahme dieser Flüssigkeit kann die Konzentration des zu untersuchenden Arznei-

mittels bestimmt werden. Gewebekäfige können bezüglich Zusammensetzung, Größe und Form stark

variieren. Häufig verwendete Formen und Materialien sind Methakrylatschläuche, Silikonschläuche,

Stahlzylinder und Polypropylenkugeln (SIDHU et al. 2003).

Gewebekäfige wurden erstmals von GUYTON (1963) verwendet, um die Physiologie und Zu-

sammensetzung der EZF zu untersuchen. Bisher wurden zahlreiche Studien mit vielen Wirk-

stoffen in verschiedenen Spezies durchgeführt (SIDHU et al. 2003). Beispielsweise wurden Kon-

zentrationen der Antiinfektiva Cefradin und Cefalothin (Mensch), Oxytetracylin und Ceftiofur

(Kalb) und Ampicillin (Kaninchen) in Gewebekäfigflüssigkeit bestimmt (CARBON et al. 1978;

BENGTSSON et al. 1986; HALSTEAD et al. 1992).

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Literaturübersicht

Die Methode bietet einige Vorteile: eine einfache technische Durchführung, geringe Invasivität,

gute Toleranz und somit auch die Möglichkeit mehrerer Probenentnahmen über längere Zeit-

räume von einem Individuum, und die Entnahme einer Flüssigkeit, die auf Grund ihres geringen

Proteingehalts der EZF ähnlich ist (ADAM et al. 1978).

Ein entscheidender Nachteil der Methode ist die hohe Variabilität, bedingt durch die variierende

Zusammensetzung der Gewebekäfigflüssigkeit. Die Zusammensetzung der Flüssigkeit wird zum

einen durch Größe und Form des Käfigs sowie Größe und Anzahl der Perforationen beeinflusst,

da die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels in der Flüssigkeit von der Diffusions-

fläche und vom Volumen des Käfigs abhängig ist (BENGTSSON u. GREKO 2002). Zum an-

deren nimmt die Penetration des Arzneimittels in die Gewebekäfigflüssigkeit mit dem Alter der

Käfige (Länge der Zeitspanne nach Implantation) ab, da das entstehende Granulationsgewebe in

und um den Käfig einen großen Einfluss auf die Arzneimittelpenetration und –elimination hat.

Das Granulationsgewebe ist durch Fibrin verbunden. Je nach Dicke der Fibrinschicht ändert sich

das Flüssigkeitsvolumen und somit auch die Arzneimittelkonzentration (BENGTSSON et al.

1986; BENGTSSON u. GREKO 2002; SIDHU et al. 2003). Die Eliminationsrate des zu unter-

suchenden Arzneimittels aus dem Gewebekäfig wird zusätzlich durch die Anzahl und Häufigkeit

der Probenentnahmen beeinflusst. Somit können Schwankungen nicht nur zwischen Käfigen

unterschiedlicher Größe und Bauart auftreten, sondern auch zwischen identisch gefertigten Kä-

figen (BENGTSSON u. GREKO 2002). Jeder Käfig ist daher einzigartig und spezifische Kon-

zentrations-Zeitprofile können schwer reproduziert werden (GREKO et al. 2003).

2.1.5 Bronchoalveoläre Lavage

Mittels bronchoalveolärer Lavage (BAL) wird Sekret des Bronchialepithels (Epithelial Lining

Fluid [ELF]) gewonnen (REINHOLD et al. 2005). Die ELF besteht neben epithelialem Sekret

aus Mucus und verschiedenen Zellen (CRUCIANI et al. 1996). Bei der BAL wird zunächst ein

flexibles fiberoptisches Endoskop mit Spülkanal unter Sichtkontrolle durch die Trachea in die

Bronchien vorgeschoben. Nun wird eine bekannte Menge an Flüssigkeit, meist isotone Natri-

umchloridlösung, über den Spülkanal eingegeben. Dabei wird die Gesamtmenge an einzugeben-

der Flüssigkeit auf mehrere Aliquots verteilt. Die Anzahl und das Volumen der Aliquots können

je nach Spezies und Indikation variieren. Als Standardverfahren beim Mensch ist die Verwen-

dung von 5 Aliquots à 20 bis 50 Milliliter beschrieben (BAYAT et al. 1998). Beim Fohlen kann

beispielsweise ein Installationsvolumen von 200 Milliliter verteilt auf 2 Aliquots à 100 Milliliter

verwendet werden (HÖHENSTEIGER 2005). Ein Teil des installierten Flüssigkeitsvolumens,

meist zwischen 50 und 70 Prozent, kann nun durch sofortige Aspiration zurückgewonnen wer-

den. Das gewonnene Aspirat setzt sich aus der eingegebenen Flüssigkeit, Mucus, epithelialem

Sekret und verschiedenen Zellarten, wie alveolären Makrophagen, Lymphozyten, Granulozyten

und epithelialen Zellen, zusammen. Das Aspirat wird zur Trennung der zellulären und azellulären

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Literaturübersicht

Bestandteile zentrifugiert und die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels kann nun

im separierten Überstand bestimmt werden (REBUCK u. BRAUDE 1984; EISENBERG et al.

1993)

Die BAL ist sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als diagnostische Routi-

netechnik in der Pneumologie etabliert (BAYAT et al. 1998; REINHOLD et al. 2005). Seit

Beginn der achtziger Jahre wird die BAL auch zur Konzentrationsbestimmung von Arzneimit-

teln verwendet (REBUCK u. BRAUDE 1984). Beispielsweise wurden Konzentrationen von

Beta-Laktam-Antibiotika (z. B. Amoxicillin, Cefpodoxim), Makroliden (z. B. Azithromycin,

Clarithromycin) und Fluorochinolonen (z. B. Ciprofloxacin, Enrofloxacin) in bronchoalveolä-

rer Lavageflüssigkeit von Menschen und Konzentrationen von Tulathromycin in bronchoalve-

olärer Lavageflüssigkeit von Fohlen bestimmt (NIX 1998; HÖHENSTEIGER 2005).

Der Vorteil der Methode ist ihre geringe Invasivität (REINHOLD et al. 2005).

Bezüglich der Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln zeigen sich jedoch erhebliche

Nachteile. Wie bereits beschrieben, kann das installierte Flüssigkeitsvolumen nur partiell wieder-

gewonnen werden. Hierbei kann die Menge der aspirierten Flüssigkeit stark variieren (REBUCK

u. BRAUDE 1984; BAYAT et al. 1998). Auch die Zusammensetzung des Aspirats ist variabel.

Erhöht man beispielsweise das Spülvolumen, so sinkt die Rückgewinnungsrate des Gesamtvo-

lumens, der Anteil an zellulären Bestandteilen nimmt jedoch zu (REINHOLD et al. 2005). Ein

weiterer Nachteil der Methode ist, dass sich die installierte Flüssigkeit nicht in einem bestimmten

Gebiet ansammelt, sondern sich während des Lavageprozesses frei über den verfügbaren Raum

verteilt. Somit kann die entnommene ELF keiner speziellen anatomischen Struktur zugeordnet

werden. Sie kann beispielsweise sowohl aus den größeren Bronchien als auch aus den Bronchuli

stammen (EISENBERG et al. 1993). Die ELF ist im gewonnenen Aspirat hochgradig durch Spül-

flüssigkeit verdünnt. Oftmals liegt eine mehr als hundertfache Verdünnung vor (EISENBERG et

al. 1993; NIX 1998). Die größte Schwierigkeit bei der Bestimmung von Arzneimittelkonzentra-

tionen mittels BAL ist die Bestimmung des Verdünnungsfaktors (REBUCK u. BRAUDE 1984;

EISENBERG et al. 1993; BAYAT et al. 1998). Die Kenntnis des Verdünnungsfaktors ist jedoch

unbedingt notwendig, um Arzneimittelkonzentrationen verlässlich bestimmen zu können (EI-

SENBERG et al. 1993). Eine Möglichkeit zur Bestimmung des Verdünnungsfaktors ist die Zuga-

be einer Referenzsubstanz (Verdünnungsmarker) zur Spülflüssigkeit in einer bekannten Konzen-

tration. Die Konzentration dieser Substanz im Aspirat wird bestimmt und der Verdünnungsfaktor

kann ermittelt werden. Eine derartige Referenzsubstanz darf keinesfalls die Fähigkeit besitzen in

das Blut oder Lungeninterstitium zu diffundieren. Ein Beispiel für eine solche Referenzsubstanz

ist Methylenblau. Jedoch kann sich auch bei der Verwendung von Methylenblau zur Bestimmung

des Verdünnungsfaktors eine mögliche Fehlerquelle ergeben. Methylenblau diffundiert zwar we-

der in das Blut noch in das Lungeninterstitium, möglicherweise aber die Spülflüssigkeit, der es

zugesetzt ist, was zu einer Änderung der Konzentration von Methylenblau im Aspirat führt (RE-

BUCK u. BRAUDE 1984). Eine andere Möglichkeit der Bestimmung des Verdünnungsfaktors

ist die intravenöse Gabe einer Substanz von der man annimmt, dass sie sich gleichmäßig zwischen

13

Literaturübersicht

Blut und ELF verteilt. Hierzu wird häufig Harnstoff (Urea) verwendet. Nach Bestimmung der

Harnstoff-Konzentration im Blutplasma und im Aspirat können das ELF-Volumen sowie die

Arzneimittelkonzentration in der ELF dann wie folgt bestimmt werden:

Eine Fehlerquelle hierbei ist die Verdünnung des Harnstoffs mit Spülflüssigkeit während des

Lavageprozesses und eine damit einhergehende vermehrte Diffusion von Harnstoff aus den Ge-

fäßen in das Aspirat auf Grund des Konzentrationsgradienten. Die Harnstoff-Konzentration im

Aspirat wäre dann höher als die tatsächliche Harnstoffkonzentration in der ELF. Somit würde das

Volumen der ELF überschätzt und die Konzentration des zu untersuchenden Arzneimittels in der

ELF unterschätzt (NIX 1998). An den genannten Beispielen zeigt sich, dass eine exakte Bestim-

mung des Verdünnungsfaktors nahezu unmöglich ist. Die hohe Verdünnung der ELF im Aspirat

durch Spülflüssigkeit führt weiterhin dazu, dass die zu messenden Arzneimittelkonzentrationen

häufig unterhalb der analytischen Detektionsgrenze liegen; es wird also eine sehr sensitive analy-

tische Methode benötigt (EISENBERG et al. 1993; NIX 1998). Eine zusätzliche Schwierigkeit

bei der Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln mittels BAL ist, dass die Genauigkeit der

Messung durch Influx von Flüssigkeit aus dem Lungeninterstitium beeinflusst werden kann, da

während des Lavageprozesses ein signifikanter Flüssigkeitsaustausch zwischen Lungeninterstitium

und den luftführenden Wegen möglich ist (EISENBERG et al. 1993; BAYAT et al. 1998). Bei der

Konzentrationsbestimmung intrazellulär akkumulierender Antiinfektiva mittels BAL wird von

einigen Autoren die Freisetzung von Konzentrationen aus den alveolären Makrophagen als wei-

tere mögliche Fehlerquelle beschrieben (ZEITLINGER et al. 2005). Ein anderer Nachteil der

BAL ist die begrenzte Anzahl von Probenentnahmen von einem Individuum. Die Limitierung

der Probenentnahmen ergibt sich zum einen aus der Technik, mit welcher bei häufigem Einsatz

die Epithelien der Atemwege geschädigt werden, zum anderen verändert sich durch jeden Lava-

geprozess die Zusammensetzung der ELF. Es kann also kein vollständiges Konzentrations-Zeit-

profil mit Daten von einem Individuum erstellt werden (EISENBERG et al. 1993; REINHOLD

et al. 2005). Weiterhin ist bei dieser Methode keine Differenzierung zwischen proteingebundener

und nicht-proteingebundener Fraktion eines Arzneimittels möglich (EISENBERG et al. 1993).

VolumenELF

= Urea - KonzentrationAspirat

× Volumen

Aspirat

Urea - KonzentrationBlutplasma

ArzneimittelkonzentrationELF

= ArzneimittelkonzentrationBAL

× Volumen

BAL

VolumenELF

14

Literaturübersicht

2.1.6 Entnahme von Sekret des Bronchialepithels mittels Blättchenmethode

Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von ELF ist die Verwendung von Filterpapierblätt-

chen. Hierbei wird zunächst ein Endotrachealtubus durch die Trachea in die Bronchien einge-

führt. Zur Vermeidung von Verunreinigungen der Proben, z. B. mit Sekret oder Nahrungsresten

aus dem Mund-Rachenraum, wird dann ein kleiner Baumwolltupfer mit einer endoskopischen

Biopsiezange bis zum distalen Ende des Tubus vorgeschoben und wieder entnommen. Nun wird

ein vorgewogenes Filterpapierblättchen mittels Biopsiezange durch den Tubus in die Bronchien

eingeführt bis ein Widerstand auftritt. Das Blättchen verbleibt kurze Zeit auf dem Bronchial-

epithel und wird dann entnommen. Nach erneutem Wiegen und Subtraktion des Gewichtes des

Blättchens vor der Probenentnahme kann nach entsprechender Probenaufarbeitung eine Kon-

zentrationsbestimmung in der auf dem Blättchen befindlichen ELF durchgeführt werden.

Mittels Blättchenmethode wurden beispielsweise Konzentration der antibakteriellen Substanz

Ceftiofur in der ELF von Kälbern bestimmt (HALSTEAD et al. 1992).

Der Vorteil dieser Methode gegenüber der BAL ist, dass alle Schwierigkeiten der BAL, welche

ihren Ursprung in der Verdünnung der ELF mit Spülflüssigkeit haben, nicht auftreten (HAL-

STEAD et al. 1992).

Andere Nachteile der BAL wie die begrenzte Anzahl von Probenentnahmen von einem Indi-

viduum, die Freisetzung von Konzentrationen aus alveolären Makrophagen und die nicht vor-

handene Möglichkeit der Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteinge-

bundener Arzneimittelkonzentration lassen sich auch auf die Blättchenmethode übertragen. Eine

weitere Einschränkung der Methode entsteht dadurch, dass es sich bei der entnommenen Probe

nicht zwangsläufig um frisch sekretierte Flüssigkeit handelt, sondern dass diese sich über längere

Zeit auf dem Bronchialepithel angesammelt haben kann. Eine exakte Korrelation zwischen Kon-

zentration und Zeit ist somit nicht möglich (CRUCIANI et al. 1996).

2.1.7 Bildgebende Verfahren

Folgende bildgebende Verfahren können zur Bestimmung von Arzneimittelkonzentrationen in Ge-

weben eingesetzt werden: Planare Gamma-Szintigraphie (PGS), Single-Photon-Emissions-Com-

putertomographie (Single Photon Emission Computed Tomographie [SPECT]), Positronen-Emis-

sions-Tomographie (PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS). Diese lassen sich bezüglich

der Darstellung in zwei- oder dreidimensionale Bildgebung unterteilen (MÜLLER et al. 2004):

• zweidimensional: PGS

• dreidimensional: SPECT, PET, MRS

Die bildgebenden Verfahren wurden ursprünglich für den Einsatz in der Diagnostik und für

Untersuchungen zu Gewebemetabolismus und Blutfluss entwickelt. Seit neuerer Zeit werden

15

Literaturübersicht

sie auch in Untersuchungen zur Verteilung von Arzneimitteln in verschiedenen Geweben in der

humanmedizinischen Forschung eingesetzt (MÜLLER et al. 2004).

PGS und SPECT

PGS und SPECT basieren auf dem Prinzip der Szintigraphie. Das zu untersuchende Arzneimittel

wird hierzu mit einem gamma-emittierenden Radionuklid (z. B. 99mTechnetium) markiert und

intravenös appliziert. Die Photonen, welche beim Zerfall der gamma-emittierenden Radionuk-

lide entstehen, werden mit Gamma-Kameras detektiert mit dem Unterschied einer zweidimen-

sionalen Bildgebung bei PGS und einer dreidimensionalen Bildgebung bei SPECT. Die Markie-

rungsdichte kann so in verschiedenen Geweben untersucht werden.

Bisher wurden mit diesen Methoden hauptsächlich Untersuchungen zur Verteilung von Inhala-

tiva in der Lunge durchgeführt. Beispielsweise wurden Tobramycin-Konzentration mittels PGS

und Ciprofloxacin-Konzentrationen mittels SPECT bestimmt. PGS war das erste verfügbare

bildgebende Verfahren (LANGER u. MÜLLER 2004; MÜLLER et al. 2004).

Der Nachteil von PGS im Vergleich zu SPECT ist, dass durch die zweidimensionale Darstellung

Fehler und Artefakte durch Überlagerung entstehen können, da sich überlagernde Gewebe nicht

unterscheiden lassen (LANGER u. MÜLLER 2004). Im Vergleich zu PET weisen PGS und

SPECT einige Nachteile auf: die Bestimmung der lokalen Radioaktivität ist schwieriger und so-

wohl die Sensivität als auch das räumliche Auflösungsvermögen sind geringer. Vorteilhaft im Ver-

gleich zu PET ist, dass die eingesetzten Radionuklide langlebiger sind und somit kein Zyklotron

vor Ort vorhanden sein muss; PGS und SPECT sind also vergleichsweise weniger aufwendig und

kostengünstiger. Die Anwendung bei Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln

ist jedoch begrenzt, da die Markierung von Molekülen mit verfügbaren PGS- und SPECT-Ra-

dionukliden schwierig ist und grundsätzlich nur bestimmte Moleküle radioaktiv markierbar sind

(LANGER u. MÜLLER 2004).

PET

PET basiert ebenfalls auf dem Prinzip der Szintigraphie. Dabei wird eine mit positronen-emit-

tierenden Radionukliden markierte Substanz intravenös appliziert. Im Körper verbinden sich die

in unterschiedliche Richtungen emittierten Positronen mit Elektronen (Annihilierung), wobei je

Elektronen-Positronen-Paar 2 kolineare Photonen entstehen. Diese Photonen werden nun mit

einem PET-Gerät aufgezeichnet. Das PET-Gerät besteht aus mehreren Detektoren in Ringan-

ordnung, welche Szintillationskristalle enthalten. Diese werden um das zu untersuchende Gewebe

platziert und die Photonen werden simultan von Detektorpaaren aufgezeichnet, welche sich in

einem Winkel von 180 Grad zueinander befinden. Die resultierenden dreidimensionalen PET-Bil-

der enthalten Informationen über die Gewebeverteilung der positronen-emittierenden Moleküle

(LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Die meist verwendeten Marker-

Radioisotope sind 15Sauerstoff (15O), 13Stickstoff (13N), 11Kohlenstoff (11C) und 18Fluor (18F). 15O und 13N können für Konzentrationsmessungen in Geweben nicht eingesetzt werden, da sie eine sehr

16

Literaturübersicht

kurze Halbwertszeit besitzen. 18F ist das am besten geeignete Radioisotop, da es eine relativ lange

Halbwertszeit (110 Minuten) hat und dadurch eine Bildgebung bis zu 10 Stunden nach Applikation

möglich ist. Wenige Arzneimittel enthalten jedoch Fluor in ihrer Struktur, deshalb werden die meis-

ten Studien unter Verwendung von 11C durchgeführt, obwohl die Halbwertszeit kürzer (circa 20

Minuten) und somit nicht ideal ist (LANGER u. MÜLLER 2004). Bezüglich pharmakokinetischer

Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln gibt es 2 verschiedene Möglichkeiten

PET einzusetzen. Zum einen ist eine direkte Bestimmung der Gewebeverteilung von 11C oder 18F

markierten Arzneimitteln möglich. Zum anderen gibt es einen indirekten Ansatz, wobei die Inter-

aktion eines Arzneimittelmoleküls mit einer Zielstruktur im Körper wie z. B. Rezeptoren oder En-

zymen untersucht wird. Dazu wird ein validierter PET-Radioaktivmarker verwendet, welcher sich

von der zu untersuchenden Substanz unterscheidet. Mit diesem ist die Quantifikation von Parame-

tern möglich, die im Zusammenhang mit der Zielstruktur stehen (z. B. die Bindungsstellendichte).

Die zu untersuchende Substanz (unmarkiert) wird nun in verschiedenen Dosierungen verabreicht

und die Anzahl der besetzten Bindungsstellen kann bestimmt werden.

Von den verschiedenen antibakteriellen Substanzklassen eignen sich Fluorochinolone besonders

gut für pharmakokinetische Untersuchungen mittels PET, da diese einen hohen Grad an radio-

aktiver Aktivität besitzen und Fluor in ihrer Struktur enthalten (LANGER u. MÜLLER 2004).

Beispielsweise wurden Studien zur Gewebepharmakokinetik von Ciprofloxacin durchgeführt

(BRUNNER u. LANGER 2006). Untersuchungen zur Gewebeverteilung von anderen antibi-

otischen Substanzklassen mittels PET wurden beispielsweise in Studien mit 11C-Erythromycin

und antibiotischen Inhalativa in der Lunge von Menschen durchgeführt (LANGER u. MÜL-

LER 2004).

Die Vorteile von PET im Vergleich zu anderen bildgebenden Verfahren sind eine sehr gute räum-

liche Auflösung und eine hohe Sensivität.

Nachteilig ist jedoch der Einsatz von Radionukliden mit kurzer Halbwertzeit und die damit

verbundene Notwendigkeit eines Zyklotrons vor Ort. Dadurch ist die Anwendung von PET

auf spezielle Zentren beschränkt, welche diese Voraussetzung erfüllen (LANGER u. MÜLLER

2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Zudem ist die Methode nicht invasiv, jedoch ist eine

Exposition gegenüber radioaktiven Substanzen gegeben. Weiterhin ermöglicht PET kontinuier-

liche Messungen, wobei aber die Dauer von der Halbwertszeit des verwendeten Radionuklids

abhängig ist (BRUNNER u. LANGER 2006). Ein anderer Nachteil der Methode besteht darin,

dass das aufgezeichnete Signal nicht zwangsläufig die intakte Arzneimittelfraktion darstellt, da

auch Metaboliten erfasst werden. Damit ist ein Teil der erfassten Substanzmenge nicht notwen-

digerweise biologisch aktiv (REINHOLD et al. 2005). Eine weitere Einschränkung ergibt sich

aus der begrenzten Auswahl an verfügbaren Markern, sowie daraus, dass sich nicht alle Arznei-

mittelmoleküle, darunter auch zahlreiche Antiinfektiva, für eine radioaktive Markierung eignen

(MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Weiterhin ist bei dieser Methode keine

Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Fraktion eines Arz-

neimittels möglich (BRUNNER u. LANGER 2006).

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Literaturübersicht

MRS

MRS basiert auf dem physikalischen Prinzip der Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Reso-

nance [NMR]). Dabei nutzt man den Eigendrehimpuls von Protonen und Neutronen und das

magnetische Feld von Atomkernen. Einige Atomkerne (1Wasserstoff [1H], 13Kohlenstoff [13C], 19Fluor [19F], 31Phosphor [31P]) werden durch Anlegen eines starken magnetischen Gegenfelds

(Feld 1) in Richtung dieses Feldes ausgerichtet. Durch das Ausrichten beginnt der Kern mit

einer Präzessionsbewegung, welche auftritt, wenn der Atomkern aus seiner Ruhelage gebracht

wird. Wird das Feld 1 entfernt, fällt der Atomkern in seine Ruhelage zurück. Um den Atomkern

dauerhaft anzuregen, wird ein zweites hochfrequentes Wechselfeld (Feld 2) im rechten Winkel

zu Feld 1 angelegt. Der Kern beginnt zu präzedieren bis sich ein Gleichgewichtszustand einstellt.

Für die Präzessionsbewegung existiert eine Resonanzfrequenz. Sie ist abhängig vom Aufbau des

Atomkerns. Durch die Wahl der Stärke von Feld 1 und die Wahl der Frequenz von Feld 2 kann

genau bestimmt werden, welche Kerne in Resonanz geraten sollen. Nach Abschalten von Feld 2

wird der Gleichgewichtszustand des Kerns unter Emission eines Radiosignals, welches der Re-

sonanzfrequenz entspricht, wiederhergestellt. Dies ist die hauptsächliche Informationsquelle, die

durch MRS genutzt wird. Die Amplitude dieses Signals ist proportional zur Anzahl der Kerne

mit einer entsprechenden Resonanzfrequenz, die im zu untersuchenden Objekt vorhanden sind.

Abhängig von der chemischen Umgebung des Kerns in einem Molekül unterscheidet sich das

emittierte Resonanzsignal, was für die chemische Identifikation entscheidend ist. Mittels MRS

können chemische Einheiten wie z. B. Arzneimittelmoleküle in einem spezifischen Gewebe ge-

messen werden (LANGER u. MÜLLER 2004).

MRS eignet sich besonders für Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Arzneimitteln, wel-

che Fluor in ihrer Struktur enthalten, da 19F eines der am besten geeigneten Isotope ist (MÜL-

LER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Beispielsweise wurden Studien zur Gewebe-

verteilung von Flerofloxacin in Leber und Muskel von Kälbern durchgeführt (MÜLLER et al.

2004).

MRS bietet im Gegensatz zu anderen bildgebenden Verfahren einen wichtigen Vorteil: es ist

eine Unterscheidung von verschiedenen chemischen Strukturen wie beispielsweise Metaboliten

möglich. Des Weiteren ist die Methode nicht invasiv und ermöglicht serielle Messungen in kur-

zen Abständen (LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Ein zusätzlicher

Vorteil ist die Möglichkeit der Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-protein-

gebundener Arzneimittelfraktion (BRUNNER u. LANGER 2006).

Einen Nachteil von MRS im Vergleich zu PET stellt die 107- bis 109-fach geringere Sensivität

dar. Aus diesem Grund sind nur Bestimmungen von hohen Arzneimittelkonzentrationen möglich

(LANGER u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006). Weiterhin ist die Anwendung

der Methode auf Studien mit Arzneimitteln beschränkt, bei denen eine ausreichende magneti-

sche Antwort induziert werden kann (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER u. LANGER 2006).

18

Literaturübersicht

Bei den hier aufgeführten bildgebenden Methoden stehen folgende Vorteile im Vordergrund: sie

sind nicht invasiv und es sind kontinuierliche Messungen in allen Geweben möglich (LANGER

u. MÜLLER 2004; BRUNNER u. LANGER 2006).

Nachteilig ist jedoch, dass innerhalb eines Gewebes keine Aussage bezüglich Konzentrationen

in einzelnen Kompartimenten wie der EZF getroffen werden kann (MÜLLER et al. 2004). Des

Weiteren liegen diesen Verfahren jeweils eine komplexe Technik und ein anspruchsvoller Ver-

suchsaufbau (z. B. Umgang mit radioaktiven Substanzen bei PGS, SPECT und PET) zu Grunde,

weshalb sie auf spezielle Zentren beschränkt sind (BRUNNER u. LANGER 2006). Zusätzliche

Nachteile entstehen durch den enormen Kosten- und Arbeitsaufwand (LIU u. DERENDORF

2003). Weiterhin nachteilig ist, dass pharmakokinetische Studien nicht mit beliebigen Substanzen

durchgeführt werden können, denn es können nur Arzneimittel untersucht werden, die radio-

aktiv markierbar sind (PGS, SPET und PET) beziehungsweise bei denen die Induktion einer

ausreichenden magnetischen Antwort möglich ist (MRS) (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER

u. LANGER 2006).

2.1.8 Mikrodialyse

Prinzip

Die Mikrodialyse ist eine semiinvasive Technik, welche die passive Funktion eines kapillären

Blutgefäßes nachahmt (UNGERSTEDT 1991; DE LA PENA et al. 2000). Sie basiert auf dem

Dialyseprinzip. Der Begriff Dialyse ist vom griechischen Wort „dialysis“ abgeleitet und bedeutet

„Trennung“ (CHAURASIA 1999). Der Dialyse liegt zu Grunde, dass bei der Trennung von 2

Kompartimenten durch eine semipermeable Membran eine Diffusion von Molekülen in Rich-

tung der niedrigsten Konzentration erfolgt (KEHR 1993; ELMQUIST u. SAWCHUK 1997).

Die Hauptelemente des Mikrodialysesystems (siehe Abbildung 1) sind: eine Mikrodialysepumpe,

ein Mikrodialysekatheter mit einer semipermeablen Membran am distalen Ende (durchlässig für

Wasser und niedermolekulare Substanzen) und ein Probensammelgefäß (auch als Microvial be-

zeichnet) (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005).

Zunächst wird der Mikrodialysekatheter in ein bestimmtes Gewebe oder eine bestimmte Matrix

(z. B. Zerebrospinalflüssigkeit) eingesetzt. Dann wird der Katheter durch einen Eingangsschlauch

mit einer Flüssigkeit (Perfusat), welche sich isoosmotisch zu der die Membran umgebenden

Flüssigkeit verhält, in einer bestimmten konstanten Geschwindigkeit (meist zwischen 0,5 und

5 Mikroliter pro Minute) perfundiert (PLOCK u. KLOFT 2005). Das Perfusat ist eine wässrige

Lösung, welche der die Membran umgebenden Flüssigkeit bezüglich pH-Wert und ionischer

Zusammensetzung möglichst ähnlich sein sollte, um unerwünschte Änderungen in der Zusam-

mensetzung der umgebenden Flüssigkeit durch Drainage oder Einbringen von Molekülen zu

vermeiden (DE LANGE et al. 2000). Je nach Orientierung des Konzentrationsgradienten kön-

19

Literaturübersicht

nen nun endogene (z. B. Hormone, Neurotransmitter) oder exogene Stoffe (z. B. Arzneimittel-

moleküle) in das Perfusat, beziehungsweise der Perfusionsflüssigkeit zugesetzte Substanzen aus

dem Perfusat diffundieren. Das System kann sowohl zum Sammeln als auch zur Abgabe von Sub-

stanzen (auch als Retrodialyse bezeichnet) genutzt werden (CHAURASIA et al. 2007). In den

in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wird die Mikrodialyse zum Sammeln von exogenen

Substanzen eingesetzt. Das Perfusat, welches nach Passage der Membran die zu untersuchende

Substanz enthält und nun als Dialysat bezeichnet wird, wird über einen Ausgangsschlauch in ei-

nem Probensammelgefäß gesammelt und in bestimmten Zeitintervallen entnommen. Die Kon-

zentration der zu untersuchenden Substanz im Dialysat kann nun bestimmt werden (PLOCK u.

KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006). Die Konzentration im Dialysat reflektiert die

Konzentration in der die semipermeable Membran umgebenden Flüssigkeit (bei Implantation

des Katheters in ein Gewebe ist dies die EZF) (DE LA PENA et al. 2000; DE LANGE et al.

2000). Abbildung 2 zeigt den Dialyseprozess an der Membran.

Abb. 1: Aufbau eines Mikrodialysesystems (mod. nach CMA MICRODIALYSIS)

1 Mikrodialysekatheter2 Mikrodialysepumpe3 Probensammelgefäß4 Membran des Mikrodialysekatheters

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Literaturübersicht

Abb. 2: Dialyseprozess and der Membran (mod. nach ZEITLINGER et al. 2005)

Historie

Der Begriff „Mikrodialyse“ stammt aus den späten fünfziger Jahren und wurde zur Beschreibung

einer Methode verwendet, mit welcher polare Steroide simultan aus dem Blutplasma dialysiert

und extrahiert werden konnten. Diejenige Methode, für die wir heute den Begriff „Mikro-

dialyse“ verwenden, wurde Mitte der siebziger Jahre von Professor Ungerstedt entwickelt (UN-

GERSTEDT 1991; PLOCK u. KLOFT 2005). Das Konzept der Mikrodialyse, das heißt die

Implantation eines von einer Dialysemembran umgebenen „Kompartiments“, welches sich im

Gleichgewicht mit dem extrazellulären Umfeld befindet, in ein Gewebe geht jedoch schon zurück

bis in die frühen sechziger Jahre (UNGERSTEDT 1991; CHAURASIA et al. 2007). GADDUM

(1961) setzte eine Push-Pull-Technik ein, bei welcher eine Flüssigkeit durch eine Sonde direkt

in zerebrales Gewebe gepumpt wurde (Push) und simultan mit einer zweiten angrenzenden

Sonde entnommen werden konnte (Pull). BITO et al. (1966) implantierten mit Natriumchlorid

und Dextran gefüllte Dialysesäcke in subkutanes Nackengewebe und zerebrales Gewebe von

Hunden. Diese wurden einige Wochen später wieder entfernt und der Gehalt an Aminosäuren

in der luminalen Flüssigkeit bestimmt. DELGADO et al. (1972) entwickelten eine Push-Pull-

Dialytrode, bestehend aus 2 Stahlsonden mit einer kleinen permeablen Tasche mit der Funktion

einer Dialysememebran an der Spitze zur Anwendung im Gehirn von Affen. UNGERSTEDT

und PYCOCK (1974) berichten schließlich über die Implantation von Hohlfasersonden, welche

die Funktion von Blutgefäßen nachahmen sollten, in zerebrales Gewebe zur Konzentrationsbe-

1 Mikrodialysekatheter2 Perfusat3 Mikrodialysat4 Dialyseprozess an der Membran5 Extrazelluläre Flüssigkeit6 Zu untersuchende Substanz7 Zellen8 Blutkapillare

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Literaturübersicht

stimmung von Neurotransmittern. Diese Hohlfasersonden wurden bald zu Nadelkathetern mit

einer Hohlfasermembran an der Spitze weiterentwickelt (UNGERSTEDT 1991). Man setzte

die Mikrodialyse zunächst experimentell zur Konzentrationsbestimmung endogener Substanzen

in der ZNS-Forschung ein (STAHLE 1992). Eine weitere Anwendung fand die Mikrodialyse

in pharmakokinetischen Studien (Messung von Konzentrationen von exogenen Substanzen) in

verschiedenen Geweben von Nagern (CHAURASIA et al. 2007). 1987 wurde die Mikrodialy-

se erstmals im Mensch zur Bestimmung interstitieller Glukosekonzentrationen im subkutanen

Fettgewebe eingesetzt (MÜLLER 2000). Es folgten Messungen von endogenen Metaboliten

und Transmitterkonzentrationen im menschlichen Gehirn. Erste pharmakokinetische Untersu-

chungen zu Konzentrationen von exogenen Substanzen wurden zu Beginn der neunziger Jahre

publiziert (CHAURASIA et al. 2007). Die erste Publikation zur Messung peripherer Gewebe-

konzentrationen von Antiinfektiva erschien 1995 (BRUNNER et al. 2005). Die Mikrodialyse

hat sich zu einer Standardtechnik in der ZNS-Forschung entwickelt (DAVIES 1999). Sie kann

inzwischen auch in fast allen anderen Geweben des Körpers eingesetzt werden (CHAURASIA

et al. 2007). Die Mikrodialyse findet Anwendung in pharmakokinetischen Untersuchungen in

Mensch und Tier zu einer Vielzahl von Substanzen in unterschiedlichen Geweben, wie z. B. Le-

ber, Muskel, Augen, Knochen und Lunge (CHAURASIA 1999; MÜLLER 2000). Inzwischen

sind U. S. Food and Drug Administration (FDA) und European Union Conformite-genehmigte

Katheter für den Einsatz im Mensch erhältlich und es wurden bisher mehr als 10.000 Publikati-

onen zum Thema Mikrodialyse veröffentlicht. 1600 davon beschäftigen sich mit dem Einsatz der

Mikrodialyse im Menschen (CHAURASIA et al. 2007).

Mikrodialysekatheter

Je nach Anwendung, das heißt in welchem Gewebe oder Matrix ein Mikrodialyseversuch durch-

geführt und welche Substanzen untersucht werden sollen, können Katheter verschiedener Form

und verschiedenen Aufbaus verwendet werden (DE LANGE et al. 2000).

Es gibt eine Reihe von unterschiedlichen Katheterformen, unter anderem linear, u-förmig und

konzentrisch aufgebaute Katheter (siehe Abbildung 3) (CHAURASIA et al. 2007).

1 Linear2 U-förmig3 Konzentrisch

Abb. 3: Katheterformen (mod. nach CHAURASIA 1999)

22

Literaturübersicht

Die ersten, von UNGERSTEDT und PYCOCK (1974) entwickelten Katheter hatten ein linea-

res Design und der Dialyseprozess erfolgte über eine Hohlfasermembran. Lineare Sonden haben

den Nachteil, dass das zu untersuchende Gewebe zweimal durchstochen werden muss, wohinge-

gen bei der u-förmigen und konzentrischen Katheterform Ein- und Ausgangsschlauch parallel

angeordnet sind und so nur ein Eingangspunkt in das Gewebe benötigt wird (CHAURASIA

1999). Am häufigsten werden Katheter konzentrischen Aufbaus verwendet. Diese bestehen aus

einer Membran am distalen Ende des Katheters und einem doppellumigen Schaft, der sich in ei-

nen Eingangs- und Ausgangsschlauch aufzweigt. Der Eingangsschlauch ist mit der Mikrodialyse-

pumpe verbunden, der Ausgangsschlauch mit dem Probensammelgefäß. Der Schaft des Katheters

kann je nach Anwendung aus starrem oder flexiblem Material gefertigt sein. Bei Mikrodialyseex-

perimenten im Gehirn werden vorrangig Katheter mit einem starren Schaft verwendet, wohin-

gegen flexibel geformte Katheter ihre Anwendung bei Mikrodialysestudien in Weichteilgeweben

finden (DE LANGE et al. 2000; JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; PLOCK u. KLOFT 2005).

Abbildung 4 zeigt einen flexibel geformten Katheter zur Anwendung in der Leber.

Abb. 4: Konzentrisch aufgebauter flexibler Katheter zur Anwendung in der Leber (mod. nach CMA MICRODIALYSIS 2006)

1 Membran2 Doppellumiger Schaft3 Ausgangsschlauch

4 Eingangsschlauch5 Probensammelgefäß6 Luerlockanschluss

Um Schäden an der Membran zu vermeiden, setzt man die Katheter meist mit Hilfe von Füh-

rungskanülen in das zu untersuchende Gewebe ein (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005). Je

nach Anwendung variiert die Mikrodialysemembran in Länge (üblicherweise zwischen 1 und 30

Millimeter), Durchmesser (üblicherweise zwischen 300 und 600 Mikrometer) und Material, aus

dem sie gefertigt wird. Die Auswahl des Membranmaterials ist für ein Mikrodialyseexperiment

von großer Bedeutung, da die zu untersuchende Substanz und das Membranmaterial nicht mit-

einander agieren dürfen. Häufig verwendete Membranmaterialien sind Cellulose, Polykarbonat,

Polyethersulfon und Cuprophan. Jeder Mikrodialysekatheter hat eine bestimmte Molekularge-

wichtsdurchlässigkeit (Cut-off), die durch die Größe der Poren in der Membran bestimmt wird.

Der Cut-off der Mikrodialysekatheter liegt meist zwischen 6 und 100 Kilodalton, weshalb sie für

große Moleküle, wie z. B. Proteine undurchlässig sind (SARRE et al. 1993).

23

Literaturübersicht

Wiederfindung

In einem Mikrodialyseversuch zu Konzentrationsbestimmung von exogenen Substanzen diffun-

diert die zu untersuchende Substanz durch die Membran aus dem den Katheter umgebenden

Medium (bei Untersuchungen in Geweben ist dies die EZF) auf Grund eines Konzentrations-

gradienten in das im Katheter befindliche Perfusat. Das Perfusat wird durch die Mikrodialyse-

pumpe in einer konstanten kontinuierlichen Fließgeschwindigkeit (bestimmt durch die Flussra-

te) durch den Katheter gepumpt. Dieser Fluss verhindert, dass sich ein Gleichgewicht zwischen

der Konzentration der Substanz im Dialysat (CD) und der Konzentration der Substanz in der

EZF (CEZF

) einstellen kann. Somit ist die gemessene Konzentration im Dialysat nur eine Fraktion

der nicht-proteingebundenen Konzentration in der EZF. Das Verhältnis von CD zu C

EZF wird als

relative Wiederfindung (rW) bezeichnet und üblicherweise in Prozent angegeben. Die relative

Wiederfindung lässt sich durch folgende Gleichung beschreiben (CHAURASIA 1999; CHAU-

RASIA et al. 2007):

Von der relativen Wiederfindung ist der Begriff der absoluten Wiederfindung (aW) abzugrenzen,

welcher die Menge der zu untersuchenden Substanz, die pro Zeiteinheit im Dialysat vorgefun-

den wird, beschreibt. Die absolute Wiederfindung kann mit Hilfe folgender Gleichung dargestellt

werden (BENEVISTE u. HÜTTEMEIER 1990; KOVAR et al. 1997):

Die relative Wiederfindung wird von den folgenden Faktoren beeinflusst:

• Diffusion über die Membran: ihrerseits direkt abhängig von

- Temperatur - Beschaffenheit der Membran (Cut-off, Membranmaterial, Oberfläche der Membran) - Größe der zu untersuchenden Substanz• Zusammensetzung Perfusat

• Flussrate

• Beschaffenheit der Matrix

aW = × 100

[aW] = Masse / Volumen

CD

rW

rW = × 100

[rW] = %

CD

CEZF

24

Literaturübersicht

Die Diffusion über die Membran ist direkt proportional zur Temperatur. Bei steigender Tem-

peratur erhöht sich die Diffusionsrate der zu untersuchenden Substanz über die Membran in das

Perfusat und somit auch die relative Wiederfindung. In-vitro-Versuche sollten deshalb immer bei

einer konstanten Temperatur (Körpertemperatur) durchgeführt werden (DE LANGE et al. 2000;

PLOCK u. KLOFT 2005). Voraussetzung für die Diffusion einer Substanz über die Membran

ist, dass ihr Molekulargewicht kleiner als der Cut-off der Membran ist. Eine akzeptable relative

Wiederfindung wird erreicht, wenn das Molekulargewicht der Substanz ein Viertel des Cut-offs

beträgt (PLOCK u. KLOFT 2005). Durch eine Verlängerung der Membran und somit auch

einer Vergrößerung der Membranoberfläche erhöht sich die relative Wiederfindung. Bei kurzen

Membranen ist der Anstieg der relativen Wiederfindung linear zur Verlängerung der Membran.

Bei sehr langen Membranen jedoch erhöht sich die Wiederfindung kaum, da sich der Konzen-

trationsunterschied zwischen EZF und Dialysat durch die steigende Membranlänge verkleinert

(DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005). Der Diffusionskoeffizient verhält sich um-

gekehrt proportional zur Größe der Substanz. Dies bedeutet, dass die relative Wiederfindung mit

steigendem Molekulargewicht abnimmt. Substanzen mit einem Molekulargewicht größer als 1

Kilodalton sind daher für herkömmliche Mikrodialyseexperimente eher ungeeignet (CHAU-

RASIA 1999).

Auch die Zusammensetzung des Perfusats kann die relative Wiederfindung beeinflussen. Das

Perfusat sollte der EZF möglichst ähnlich sein, denn Unterschiede der osmotischen Eigenschaf-

ten lösen eine Flüssigkeitsbewegung aus, die die Diffusion über die Membran behindern oder

verstärken kann (DE LANGE et al. 2000).

Mit sinkender Flussrate erhöht sich die relative Wiederfindung und umgekehrt. Bei einer nied-

rigen Flussrate nähern sich die Konzentrationen in der EZF und im Dialysat einem Gleichge-

wichtszustand an. Je weiter die Flussrate gegen 0 geht, desto mehr nähert sich die relative Wieder-

findung 100 Prozent an. Mit steigender Flussrate nimmt die Wiederfindung exponentiell ab. Bei

Flussraten höher als 10 Mikroliter pro Minute findet auf Grund des Flüssigkeitsdrucks ein Verlust

von Perfusat über die Membran statt. Dadurch wird die Diffusion über die Membran in das Ka-

theterlumen behindert. Das Herabsetzen der Flussrate wird durch die dabei abnehmenden Pro-

benvolumina und die Quantifikationsgrenze der verwendeten analytischen Methode limitiert.

Ein weiterer Einflussfaktor bezüglich der relativen Wiederfindung ist die Beschaffenheit der

Matrix beziehungsweise des Gewebes, in der oder dem sich der Katheter befindet. Damit die zu

untersuchende Substanz über die Membran in den Katheter diffundieren kann, muss sie zunächst

durch das Gewebe diffundieren. Dies ist abhängig vom Grad der intrazellulären Anreicherung,

der metabolischen Umsatzrate, vom aktiven Transport über Membranen und der Vaskularisation

des Gewebes. Generell gilt, dass durch diese Eigenschaften von Geweben die relative Wiederfin-

dung im Vergleich zu In-vitro-Experimenten reduziert wird (CHAURASIA 1999; DE LANGE

et al 2000; PLOCK u. KLOFT 2005).

Bei quantitativen Untersuchungen, wie Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Arzneimit-

teln in Geweben mittels Mikrodialyse, ist die Kenntnis der relativen Wiederfindung zur Bestim-

25

Literaturübersicht

mung von CEZF

von essentieller Bedeutung. Bei Kenntnis der relativen Wiederfindung berechnet

sich CEZF

wie folgt (KOVAR et al. 1997; CHAURASIA et al. 2007):

Die relative Wiederfindung kann mit Hilfe der folgenden Kalibrierungsmethoden bestimmt werden:

• Bestimmung der relativen Wiederfindung in vitro: - Dialyse

- Retrodialyse

• Bestimmung der relativen Wiederfindung in vivo: - Extrapolation zur Flussrate 0

- No-net-flux

- Dynamischer No-net-flux

- Retrodialyse mit oder ohne Verwendung einer

Eichsubstanz

Bei der Bestimmung der relativen Wiederfindung kann zunächst zwischen in vitro oder in vivo

durchgeführten Kalibrierungsmethoden unterschieden werden (KOVAR et al. 1997). Bei der

In-vitro-Dialysemethode wird der Mikrodialysekatheter kontinuierlich bei einer konstanten

Flussrate perfundiert, während er in eine Lösung eingetaucht ist, welche die zu untersuchende

Substanz in bekannter Konzentration enthält. Das Dialysat wird gesammelt und zu festgelegten

Zeitpunkten entnommen (meist alle 10 bis 20 Minuten). Die relative Wiederfindung berechnet

sich dann wie folgt:

wobei CL die Konzentration der Substanz in der Lösung darstellt. Auch die später beschriebene

Retrodialysemethode kann in vitro durchgeführt werden (BENVENISTE u. HÜTTEMEIER

1990; SARRE et al. 1993; KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005).

Die im Folgenden beschriebenen Kalibrierungsmethoden werden in vivo durchgeführt. Die Ex-

trapolation-zur-Flußrate-0-Methode wurde von JACOBSON et al. (1985) eingeführt. Hier-

bei wird die Konzentration im Dialysat bei verschiedenen Flussraten bestimmt. Die jeweilige

Flussrate wird mit der gemessenen Konzentration durch die folgende Exponentialfunktion in

Verbindung gesetzt:

CEZF

= × 100C

D

rW

rW = × 100,C

D

CL

26

Literaturübersicht

wobei K0 den Massentransportfaktor, A die Membranoberfläche und F die Flussrate darstellt.

CEZF

und K0 x A können durch nicht-lineare Regression mit Hilfe pharmakokinetischer Soft-

wareprogramme bei verschiedenen Flussraten ermittelt werden. Die graphische Darstellung der

gemessenen Konzentrationen gegen die Flussraten ergibt eine von K0 x A abhängige Steigung.

Der Ordinatenschnittpunkt ist CEZF

bei einer Flussrate von 0 und entspräche einer relativen Wie-

derfindung von 100 Prozent. Die zur jeweiligen Flussrate korrespondierende relative Wiederfin-

dung erhält man durch folgende Umformung der oben genannten Gleichung:

Die Nachteile dieser Methode sind zum einen lange Sammelperioden bei niedrigen Flussraten

und die daraus resultierenden niedrigen Probenvolumina. Zum anderen wird hier eine Extra-

polation zum 0-Fluss durchgeführt; die relative Wiederfindung wird somit nur geschätzt ohne

dass die Bestimmung des exakten Wertes möglich ist (KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT

2005).

Die No-net-flux-Methode wurde von LONNROTH et al. (1987) entwickelt. Bei dieser Me-

thode wird die zu untersuchende Substanz dem Perfusat in verschiedenen bekannten Konzent-

rationen zugegeben und die Konzentration im Dialysat wird bestimmt. Wenn die Konzentration

im Perfusat (CP) kleiner als C

EZF ist, ist der Diffusionsprozess in Richtung Perfusat gerichtet und

CD > C

P. Wenn C

P > C

EZF ist, dann ist C

D < C

P. Wenn C

D und C

P gleich sind, dann ist auch C

EZF

gleich CP, der Nettofluss ist also gleich 0. Der jeweilige Substanzverlust oder –gewinn (C

D - C

P)

wird gegen CP aufgetragen. Der Schnittpunkt mit der Abszisse ergibt C

EZF und die relative Wie-

derfindung wird durch die Steigung der Regressionsgeraden bestimmt. Diese Methode ist sehr

zeitintensiv (KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005).

Die Methode des dynamischen No-net-flux wurde von OLSON und JUSTICE (1993) ein-

geführt und der Unterschied zur No-net-flux-Methode besteht darin, dass mindestens 3 Grup-

pen mit je 3 bis 4 Individuen mit einer Konzentration pro Gruppe perfundiert werden. Die

Daten werden dann zur Auswertung zusammengefasst. Die Methode des dynamischen No-net-

flux ist weniger zeitintensiv als die No-net-flux-Methode, jedoch entsteht durch das Zusammen-

fassen von Daten verschiedener Katheter eine zusätzliche Variabilität (PLOCK u. KLOFT 2005;

CHAURASIA et al. 2007).

Die Retrodialysemethode wird auch als Delivery-Methode bezeichnet (STAHLE et al. 1991).

Sie basiert auf der Annahme, dass der Diffusionsprozess über die Membran in beide Richtungen

gleich ist. Bei dieser Methode wird das Verfahren der Mikrodialyse umgekehrt, das heißt die zu

untersuchende Substanz wird dem Perfusat in bekannter Konzentration zugegeben. Die relative

rW = = 1- e .-K

O×

AFC

D

CEZF

CD = C

EZF - C

EZF × e ,

-KO×

AF

27

Literaturübersicht

Wiederfindung wird über die Menge an Substanz, welche aus dem Perfusat in die EZF diffun-

diert, mit Hilfe der folgenden Gleichung bestimmt:

Korrekte Ergebnisse können jedoch nur erzielt werden, wenn keine Konzentrationen der Sub-

stanz in der EZF vorliegen; die Retrodialyse muss also vor Beginn des eigentlichen Mikrodialy-

seversuchs durchgeführt werden. Eine Variation dieser Methode, die Retrodialyse unter Verwen-

dung einer Eichsubstanz, wurde von LARSSON (1991) entwickelt. Hierbei wird dem Perfusat

statt der zu untersuchenden Substanz eine Eichsubstanz in bekannter Konzentration zugegeben.

Im Dialysat wird dann sowohl die Konzentration der zu untersuchenden Substanz als auch die

der Eichsubstanz bestimmt. Die relative Wiederfindung errechnet sich aus der Menge an Eichsub-

stanz, welche aus dem Perfusat in die EZF diffundiert. Dabei ist wichtig, dass die Eichsubstanz der

zu untersuchenden Substanz in Diffusions-, Transport-, und Metabolismuseigenschaften möglichst

ähnlich ist (KOVAR et al. 1997; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al. 2007).

Da gezeigt wurde, dass Schwankungen der relativen Wiederfindung zwischen einzelnen Kathetern

zwischen 10 und 20 Prozent liegen können, empfiehlt es sich die relative Wiederfindung jedes im

lebenden Individuum verwendeten Katheters zu bestimmen (BRUNNER u. LANGER 2006).

Analytik

Da die relative Wiederfindung umgekehrt proportional zur Flussrate ist, ist es vorteilhaft niedrige

Flussraten zu verwenden, um eine möglichst hohe relative Wiederfindung zu erzielen (DAVIES

1999). Niedrige Flussraten resultieren jedoch in niedrigen Probenvolumina (PLOCK u. KLOFT

2005). Zur Analyse der in einem Mikrodialyseversuch gewonnenen Proben, werden sehr sensi-

tive analytische Methoden benötigt, da die Probenvolumina meist im Mikroliterbereich und die

Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen meist im nanomolaren Bereich liegen (DE

LANGE et al. 2000; BRUNNER u. LANGER 2006; CHAURASIA 2007). Die am häufigsten

verwendete analytische Trennungsmethode ist die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (High

Performance Liquid Chromatographie [HPLC]) (CHAURASIA 2007). Als Detektionsmethode

zur Analyse von niedrigen Konzentrationen und Probenvolumina eignet sich die Tandem-Mas-

senspektrometrie (MS/MS) (DAVIES et al. 2000). Da durch den Cut-off der Mikrodialysemem-

bran große Moleküle wie Proteine vom Dialysat ausgeschlossen werden, ist zum einen keine

aufwendige Aufarbeitung der Proben vor der Analyse notwendig und zum anderen besteht bei

der Probenaufbewahrung nicht die Gefahr des Abbaus der zu untersuchenden Substanz durch

Enzyme (BRUNNER u. LANGER 2006).

rW = 100 - × 100 C

D

CP

( ).

28

Literaturübersicht

Gewebetrauma

Die Mikrodialyse gilt als semiinvasive Technik (BRUNNER u. LANGER 2006). Bedingt durch

den geringen Durchmesser der Membran werden nur geringgradige Reaktionen im Zielgewebe

hervorgerufen. Jedoch kann, je nach anatomischer Lokalisation des Zielgewebes, der chirurgi-

sche Eingriff, der notwendig ist, um den Katheter einzusetzen, mehr oder weniger invasiv sein.

Beispielsweise sind Haut oder Skelettmuskel sehr viel einfacher zugänglich als innere Organe

(DAVIES 1999; HANSEN et al. 1999; DE LANGE et al. 2000). Die Implantation des Mikrodi-

alysekatheters im Zielgewebe löst meist lediglich eine gringgradige inflammatorische Reaktion

aus (PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al. 2007). In Untersuchungen bezüglich der

Reaktion von Geweben auf den Einsatz von Mikrodialysekathetern wurde in Haut-, Muskel-

und Lebergewebe eine akute inflammatorische Reaktion mit initialer Infiltration von Neutro-

philen gefolgt von Makrophagen beobachtet (DAVIES 1999). AULT et al. (1994) beschreiben die

Infiltration von Lymphozyten 6 Stunden nach Implantation von Kathetern in die Haut. Diese

haben jedoch keinen Einfluss auf die Funktion des Katheters (PLOCK u. KLOFT 2005). In

histologischen Untersuchungen der Haut wurden weder Ödeme noch Zusammenhangstren-

nungen beobachtet (AULT et al. 1994). MATHY et al. (2003) fanden 8 Tage nach Einsatz eines

Katheters in die Haut von Ratten fibrotische Veränderungen des Gewebes in direkter Umgebung

der Membran. In anderen histologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Katheter bei

einer Implantationszeit von bis zu 24 Stunden keine Fremdkörperreaktion hervorruft (CHAU-

RASIA et al. 2007). Da das durch Einsatz des Katheters verursachte initiale Gewebetrauma, auch

wenn es gering ist, die Ergebnisse des Mikrodialyseversuchs theoretisch beeinflussen könnte, wird

empfohlen, den Katheter direkt nach der Implantation für eine gewisse Zeitspanne vor der Be-

handlung zu perfundieren. Die Länge dieser Zeitspanne ist abhängig von dem zu untersuchenden

Gewebe sowie der verwendeten Substanz. Allgemein wird eine halbe Stunde zur Beseitigung des

initialen Traumas im Gewebe als ausreichend angesehen. Dieser Wert basiert auf der Bestimmung

von Gewebetrauma-Markern wie Thromboxan B2, Adenosintriphosphat, Adenosin, K+, Glukose,

Laktat und Laktat-Pyruvat-Verhältnis. Hierbei wurde gezeigt, dass diese Parameter nach Imp-

lantation des Katheters ansteigen und nach einer halben Stunde wieder Normalwerte erreichen

beziehungsweise nicht mehr nachweisbar sind (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; CHAURA-

SIA et al. 2007). Generell kann die Mikrodialyse in wachen, sich frei bewegenden Individuen

durchgeführt werden, da die Integrität von Geweben erhalten wird (HANSEN et al. 1999).

Einsatz in der Antiinfektiva-Forschung

Die Mikrodialyse wurde bereits zu pharmakokinetischen Untersuchungen einer Vielzahl von

verschiedenen Substanzklassen wie z. B. Aminoglykosiden, Beta-Laktam-Antibiotika, Chinolo-

nen, oder Makroliden in einer Reihe von Geweben wie z. B. Hirn-, Lungen- oder Muskelge-

webe eingesetzt. Mikrodialyseversuche werden heute sowohl im Menschen als auch in Versuchs-

tieren durchgeführt, sind jedoch bisher meist auf die humanmedizinische Forschung beschränkt

(BRUNNER et al. 2005). Die Mikrodialysetechnik stellt eine geeignete Methode zur Erstel-

29

Literaturübersicht

Tab. 1: Mikrodialyseversuche in verschiedenen Geweben und Spezies

Gewebe Spezies antibakterielle Substanz

Subkutanes Fett

Mensch Gentamicin;Cefodizim, Cefpirom, Phenoxymethylpenicillin, Piperacillin;Ciprofloxacin, Fleroxacin, Gemifloxacin, Moxifloxacin; Dirithromycin; Telithromycin

Muskel Ratte Cefaclor, Cefixim, Cefminox, Cefpodoxim, Cestriaxon, Imipenem, Piperacillin, Tazobactam;Gatifloxacin, Ofloxacin, Pazufloxacin

Mensch Gentamicin;Cefixim, Cefodizim, Cefpirom, Cefpodoxim, Imipenem, Phenoxymethylpenicillin;Ciprofloxacin, Fleroxacin, Gemifloxacin, Levofloxacin, Moxifloxacin;Dirithromycin; Telithromycin; Metronidazol; Fosfomycin

Knochen Schwein Gentamicin

Lunge Ratte Gentamicin, Tobramycin;Cefaclor, Cefminox, Cefpodoxim, Imipenem; Gatifloxacin, Levofloxacin

Mensch Cefpirom, Meropenem, Piperacillin, Tazobactam; Levofloxacin

Leber Ratte Cefminox

Galle Ratte Meropenem; Levofloxacin; Metronidazol

Gehirn Ratte Cefazolin, Cestazidim, Cestriaxon;Norfloxacin; Rifampicin

Maus Sparfloxacin

Mensch Fosfomycin; Rifampicin

Auge Kaninchen Cefazolin, Cefalexin, Cefalothin

Katze Gentamicin

Mittelohr Chinchilla Cefdinir; Clarithromycin; Cethromycin

(ELMQUIST u. SAWCHUK 1997; DAVIES 1999; DE LA PENA et al. 2000; JOUKHADAR u. MÜLLER 2005; PLOCK u. KLOFT 2005; CHEUNG et al. 2006; DAYHOT et al. 2006; HOCHT et al. 2006; MARCHAND et al. 2008; TASSO et al. 2008)

lung von Konzentrations-Zeitprofilen antibakterieller Substanzen in Zielgeweben dar, da sie die

Bestimmung der nicht-proteingebundenen Fraktion einer Substanz direkt am Wirkort erlaubt

(THALLINGER u. JOUKHADAR 2005).

Tabelle 1 bietet einen Überblick über den Einsatz der Mikrodialyse in pharmakokinetischen

Untersuchungen von verschiedenen antibakteriellen Substanzen in verschiedenen Geweben und

Spezies.

30

Literaturübersicht

Vorteile

Die Mikrodialyse kann zu pharmakokinetischen Untersuchungen einer Vielzahl von verschie-

denen Substanzen in fast jedem Gewebe beziehungsweise jeder biologischen Flüssigkeit sowohl

bei Tieren als auch bei Menschen eingesetzt werden (DAVIES 1999; DE LA PENA et al. 2000;

MÜLLER 2000). Die Implantation eines Mikrodialysekatheters in ein Gewebe ist ein minimal-

invasiver Prozess, der bedingt durch den kleinen Durchmesser der Membran nur geringgradige

Reaktionen im Gewebe hervorruft (DAVIES 1999; CHAURASIA et al. 2007). Im Gegensatz zur

Konzentrationsbestimmung von Substanzen im Blut wird bei der Mikrodialysetechnik keine bi-

ologische Flüssigkeit entnommen und die Anzahl der Probenentnahmen pro Tier ist somit nicht

beschränkt. Daher sind Probenentnahmen in kurzen Zeitintervallen über mehrere Stunden oder

Tage von einem Individuum möglich. Die Erstellung vollständiger Konzentrations-Zeitprofile

mit Daten von einem Individuum bedingt zum einen eine erhebliche Reduktion der Tierzah-

len und zum anderen eine hohe Reproduzierbarkeit beziehungsweise eine geringe Variabilität.

Bei Einsatz mehrerer Mikrodialysekatheter in unterschiedlichen Geweben eines Individuums

können sogar simultane Konzentrationsbestimmungen in verschiedenen Geweben durchgeführt

werden (SARRE et al. 1993; DAVIES et al. 1999; CHAURASIA et al. 2007). Ein erheblicher

Vorteil der Mikrodialyse ist, dass mit dieser Methode die Bestimmung der nicht-proteingebun-

denen, das heißt der pharmakologisch aktiven Fraktion einer Substanz in der EZF von Gewe-

ben möglich ist. Konzentrationsbestimmungen von Antiinfektiva können also direkt am Ort des

infektiösen Geschehens durchgeführt werden, denn die meisten Bakterien befinden sich in der

EZF (DAVIES 1999; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al. 2007). Der Ausschluss von

Proteinen aus dem Dialysat hat weitere Vorteile. Einerseits können die Proben ohne zeit- und

arbeitsintensive Aufarbeitung direkt analysiert werden und andererseits besteht bei der Proben-

aufbewahrung nicht die Gefahr des Abbaus der zu untersuchenden Substanz durch Enzyme

(DAVIES et al. 1999; CHAURASIA et al. 2007). Weiterhin vorteilhaft sind die vergleichsweise

geringen Kosten und die einfache technische Durchführbarkeit der Mikrodialyse (BRUNNER

u. LANGER 2006). Im Rahmen von Zulassungsverfahren humanmedizinischer Arzneimittel

gewinnt die Mikrodialyse bereits zunehmend an Bedeutung. Zwar werden bis jetzt noch keine

pharmakokinetischen Studien unter Einsatz der Mikrodialysetechnik explizit von den Behörden

gefordert, jedoch empfiehlt beispielsweise die FDA die Messung von Zielgewebskonzentrationen

mittels Mikrodialyse (BRUNNER et al. 2005; CHAURASIA et al. 2007).

Nachteile

Die Implantation des Mikrodialysekatheters an sich ruft nur geringgradige Reaktionen in den

zu untersuchenden Geweben hervor. Je nach Gewebe kann jedoch der chirurgische Eingriff,

welcher nötig ist, um zum Zielgewebe zu gelangen, mehr oder weniger invasiv sein. Beispiels-

weise sind zur Durchführung von Mikrodialyseversuchen in Geweben innerer Organe fortge-

schrittene chirurgische Kenntnisse notwendig und die Auswirkungen auf das Individuum nicht

unerheblich (DAVIES 1999; CHAURASIA et al. 2007). Weiterhin kann die Mikrodialyse nicht

31

Literaturübersicht

Tab. 2: Charakteristika der genannten Methoden zur Konzentrationsbestimmung in Zielgeweben

Gewebe-homogenat

Hautblasen-versuch

Gewebe-käfig BAL Blättchen-

methodeBildgebende

Verfahren MD

Matrix Gesamt-gewebe

Hautblasen-flüssigkeit

Gewebe-flüssigkeit ELF ELF Gesamt-

gewebe EZF

Beschränkungauf bestimmte

Gewebenein ja ja ja ja nein nein

direkte Messungnicht-protein-

gebundene Fraktionnein nein ja nein nein

nein (PGS,SPECT, PET)

ja (MRS)ja

Invasivität invasiv semi-invasiv

semi-invasiv

semi-invasiv

semi-invasiv

nicht-invasiv

semi-invasiv

häufige Probenent-nahmen bei einem

Individuum möglichnein nein ja nein nein ja ja

Variabilität hoch hoch hoch hoch hoch gering gering

Kosten gering gering gering gering gering hoch gering

BAL = Bronchoalveoläre LavageELF = Sekret des BronchialepithelsEZF = Extrazelluläre FlüssigkeitMD = Mikrodialyse

MRS = MagnetresonanzspektroskopiePET = Postitronen-Emissions-TomographiePGS = Planare Gamma-SzintigraphieSPECT = Single-Photon-Emissions-Computertomographie

zu Konzentrationsbestimmung jeder Art von Substanz angewendet werden. Hydrophile Substan-

zen mit niedrigem Molekulargewicht sind besonders gut geeignet. Weniger eignen sich lipophile,

hochgradig proteingebundene Substanzen mit hohem Molekulargewicht (PLOCK u. KLOFT

2005). Auch die Kalibrierung des Katheters zur Bestimmung der relativen Wiederfindung ist

recht zeitintensiv. Des Weiteren besteht ein hoher Anspruch an die analytische Methode, da die

Volumina der in einem Mikrodialyseversuch gewonnenen Proben gering und die zu bestimmen-

den Konzentrationen relativ niedrig sind (BRUNNER u. LANGER 2006).

In Tabelle 2 sind verschiedene Eigenschaften der genannten Methoden zur Konzentrationsbe-

stimmung in Zielgeweben zusammenfassend aufgeführt.

32

Literaturübersicht

2.2 Das Schwein als Modelltier

2.2.1 Auswahl des Modelltiers

Sowohl in der veterinär- als auch humanmedizinischen Forschung werden Schweine häufig zur

Untersuchung vielfältiger Fragestellungen als Modelltiere eingesetzt. Bei Schweinen zählen bak-

terielle Infektionen des Respirationstraktes zu den am häufigsten diagnostizierten Erkrankungen,

wobei die Behandlung durch die Verabreichung von Antiinfektiva erfolgt (WALLMANN et al.

2004). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit das Schwein als Modelltier zur Etablierung

der Mikrodialyse zwecks direkter Konzentrationsbestimmung von Antiinfektiva in der Lunge

gewählt.

2.2.2 Anatomische Grundlagen

Brustkorb und Atemmuskulatur

Der Brustkorb wird von den Brustwirbeln, den Rippen und dem Brustbein gebildet, wobei bei

Schweinen 7 sternale und 7 bis 8 asternale Rippen vorhanden sind. Muskeln, Faszien und die

Haut vervollständigen die thorakale Körperwand. Innerhalb des Thorax trennt das Zwerchfell

die Brusthöhle vom intrathorakalen Teil der Bauchhöhle ab. Durch Bewegung der Rippen, des

Zwerchfells und der Atemmuskulatur ändert sich die Größe des Brustkorbs ständig (NICKEL

et al. 1992). In den Abbildungen 5 und 6 sind die den Brustkorb seitlich begrenzenden Muskeln

aufgeführt.

Zur Atemmuskulatur zählen die Mm. serrati dorsales, der M. rectus thoracis, die Mm. intercostales, die

Mm. levatores costarum, der M. transversus thoracis, sowie das Zwerchfell. Als Atemmuskeln werden

alle Muskeln bezeichnet, die an einer aktiven Erweiterung oder Verengung des Brustraumes be-

teiligt sind. Die Lunge folgt diesen Bewegungen völlig passiv. Bei einer Erweiterung des Brust-

raumes wird die Lunge durch den äußeren Luftdruck gedehnt (Inspiration) und bei einer Veren-

gung wird die Atemluft durch Retraktion der elastischen Fasern der Lunge aus den Luftwegen

gepresst (Expiration) (SEIFERLE u. FREWEIN 1992).

33

Literaturübersicht

1 M. trapezius (Pars thoracica)2 M. latissimus dorsi3 M. serratus dorsalis caudalis4 M. obliquus externus abdominis5 M. pectoralis profundus

1 M. serratus dorsalis cranialis2 M. serratus dorsalis caudalis3 M. longissimus thoracis4 M. iliocostalis thosacis5 M. serratus ventralis thoracis6 M. scalenus dorsalis7 M. obliquus externus abdominis8 Mm. intercostales externi 9 M. rectus thoracis10 M. rectus abdominis

Abb. 6: Tiefe Muskelschichten des seitlichen Thorax des Schweins (mod. nach PROPESKO 1989)

Abb. 5: Oberflächliche und mittlere Muskelschichten des seitlichen Thorax des Schweins (mod. nach PROPESKO 1989)

34

Literaturübersicht

Makroskopischer Aufbau der Schweinelunge

Die gesamte Lunge setzt sich aus der rechten und linken Lunge zusammen, welche in der Brust-

höhle in den beiden durch das Mediastinum getrennten Brustfellsäcken liegen. Die Brustfellsäcke

heften sich als Rippenfell (Pleura costalis) der Innenseite der Rippen an. Die Lunge wird vom

Lungenfell (Pleura pulmonalis) bekleidet. Die Farbe der Lunge ist von ihrem Blutgehalt abhängig.

Intra vitam ist sie bei Schweinen rosa bis rotbläulich gefärbt, bei toten ausgebluteten Tieren er-

scheint sie blassrosa. Das relative Gewicht der Lunge beträgt im Durchschnitt 1 bis 1,5 Prozent

des Körpergewichts. Ihre Größe ist vom Luftgehalt abhängig. Bei der Inspiration ist die Lunge

wesentlich größer als bei der Expiration, wobei sie in beiden Funktionsstadien die Pleurahöhle

bis auf kapilläre Restspalten vollständig ausfüllt. Sowohl die rechte als auch die linke Lunge wer-

den durch Fissurae interlobares in verschiedene Lappen unterteilt. Die linke Lunge des Schweins

besteht aus einem Lobus cranialis mit den Partes cranialis und caudalis und einem Lobus caudalis. Die

rechte Lunge setzt sich aus einem Lobus cranialis, Lobus medius, Lobus caudalis und Lobus accessorius

zusammen (siehe Abbildung 7). Die Aufzweigung des Bronchialbaums entspricht der Gliederung

der Lungenlappen. Aus der Bifurkation der Trachea gehen die beiden Hauptbronchien hervor.

Diese teilen sich nach ihrem Eintritt in die beiden Lungen in die Lappenbronchien auf. Aus den

Lappenbronchien zweigen sich die Segmentbronchien ab; diese teilen sich zunächst subsegmental

und dann weiter in Bronchuli (diese besitzen im Gegensatz zu den Bronchien keine knorpeligen

Anteile) auf. Aus mehreren Teilungen der Bronchuli gehen die Bronchuli respriratorii hervor, diese

führen schließlich in die mit Alveolen besetzten Alveolengänge und deren endständige Teilungs-

gebilde, die Alveolensäckchen (WAIBL 1999).

Abb. 7: Rechte Lunge des Schweins (mod. nach PROPESKO 1989)

1 Lobus cranialis2 Lobus medius3 Lobus caudalis

35

Literaturübersicht

Mikroskopischer Aufbau der Schweinelunge

Die oberste Schicht des Lungeninterstitiums ist die Lamina propria serosae. Die Fasern dieser elasti-

schen Eigenschicht der Lungenkapsel dringen in das Organ ein und bilden als inter- und intralo-

buläres sowie als peribronchiales und perivaskuläres Bindegewebe das Interstitium der Lunge, wel-

ches dem Lungengewebe eine große Dehnungs- und Retraktionsfähigkeit beim Atmemvorgang

verleiht. Beim Schwein bedingt das interlobuläre Bindegewebe makroskopisch eine deutliche

Läppchenzeichnung. Die Innenseite der Bronchien wird von einem mehrreihigem hochprisma-

tischen Epithel ausgekleidet, welches von Becherzellen durchsetzt ist und Zilien trägt. Die Lamina

propria mucosae enthält gemischte Drüsen und Lymphozytenansammlungen. Das Epithel verliert

peripher seine Mehrreihigkeit, so dass die Bronchuli respiratorii nur noch von einem einschichtigen

Epithel ohne Becherzellen und Zilien ausgekleidet werden. Auch verschwinden in der Lamina

propria mucosae allmählich die Drüsen, die ab den Bronchuli vollständig fehlen. Die Alveolen werden

von einem lückenlos geschlossenen Alveolarepithel ausgekleidet, welches auf einer Basalmembran

aufliegt. Ihr folgt die Basalmembran der Kapillaren. In lumenwärts gerichteten Nischen der Alve-

olen befinden sich sogenannte Nischenzellen, die einen Phospholipidfilm (Surfactant) abgeben.

Auf dem Alveolarepithel befinden sich häufig Alveolarmakrophagen, die nach Aufnahme von

Fremdstoffen und Verlagerung in die großen Bronchien ausgehustet werden (WAIBL 1999).

2.2.3 Gewebepenetration von Antiinfektiva – Anreicherung in der LungeJe nach Applikationsroute gelangen Antiinfektiva zunächst entweder direkt (intravenöse Injek-

tion) oder durch Resorption (andere Applikationsarten) ins Blutplasma. Die Substanz zirkuliert

dann mit dem Blutstrom im Organismus. Vom vaskulären Kompartiment ausgehend gelangt sie

in verschiedene extravaskuläre Kompartimente, wobei sich die meisten Substanzen nicht gleich-

mäßig im Organismus verteilen, sondern unterschiedliche Konzentrationen in verschiedenen

Geweben erreichen und sich innerhalb der Gewebe auch unterschiedlich in den einzelnen Kom-

partimenten anreichern. In welchem Gewebe beziehungsweise in welchen Kompartimenten sich

eine Substanz in welcher Konzentration anreichert, ist von den folgenden Faktoren abhängig:

• Physikalisch-chemische Eigenschaften der Substanz

(z. B. Molekülgröße und Lipophilie)

• Eigenschaften der begrenzenden biologischen Membranen

• Proteinbindung der Substanz

• Volumen, Oberfläche und Vaskularisation des Organs

• Gewebespezifische Barrieren

• Entzündliche Veränderungen des Gewebes

36

Literaturübersicht

Der Austritt aus dem vaskulären Kompartiment und Eintritt in extravaskuläre Kompartimente

ist zunächst von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz und von den

Eigenschaften der begrenzenden biologischen Membranen abhängig. Die Fähigkeit

von Substanzen biologische Membranen zu überwinden ist daher von großer Bedeutung.

Membranen bestehen aus einer Lipiddoppelschicht mit eingelagerten Proteinen und werden

meist durch Poren unterbrochen. Prinzipiell gibt es 3 verschiedene Mechanismen der Mem-

branpermeation:

1. Diffusion durch die Lipiddoppelschicht der Membran (nur für lipophile Sub-

stanzen möglich) oder durch Poren, angetrieben durch einen Konzentrations-

gradienten. Die Diffusion ist der Haupttransportmechanismus für die meisten

Arzneimittel.

2. Filtration durch Poren, angetrieben durch hydrostatischen Druck oder un-

terschiedlich hohe Osmolarität auf beiden Seiten der Membran, wobei im

Gegensatz zur Diffusion (nur Bewegung von Teilchen) Teilchen und Lösungs-

mittel die Membran passieren

3. Carrier-vermittelter Transport, ein sättigbarer Prozess, welcher eine hohe

strukturelle Spezifität aufweist. Dieser Transportweg kann nur genutzt wer-

den, wenn ein Arzneimittel große strukturelle Ähnlichkeit mit einer körper-

eigenen Substanz aufweist. Da dies selten vorkommt, spielt der aktive Trans-

port für Arzneimittel eine untergeordnete Rolle.

Um aus dem vaskulären Kompartiment auszutreten, müssen die Substanzen zunächst das Kapil-

larendothel passieren und dann je nach Gewebe weitere Barrieren überwinden (FICHTL 2001).

Bei den Kapillaren der meisten Gewebe ist das Endothel durch Poren unterbrochen, welche

für Substanzen mit einem Molekulargewicht bis 1000 Dalton durchlässig sind. Das Molekular-

gewicht von Antiinfektiva liegt häufig unter 1000 Dalton (BARZA u. CHUCHURAL 1985;

BERGOGNE-BEREZIN 1995).

Eine weitere Determinante für den Eintritt einer Substanz in extravaskuläre Kompartimente

ist der Grad der Proteinbindung. Im Blutplasma ist eine für die jeweilige Substanz spezifische

Fraktion an Plasmaproteine gebunden. Zwischen der nicht-proteingebundenen und der pro-

teingebundenen Fraktion besteht ein Gleichgewicht. Der an Plasmaproteine gebundene Anteil

stellt ein Depot dar, da die Protein-Arzneimittelkomplexe auf Grund ihrer Größe die Kapillaren

nicht verlassen können. Nur die nicht-proteingebundene Fraktion der Substanz kann in das ex-

travaskuläre Kompartiment gelangen. Auch im Gewebe ist ein gewisser Anteil der Substanzen an

Gewebeproteine oder Membranphospholipide gebunden (BARZA u. CHUCHURAL 1985;

FICHTEL 2001).

37

Literaturübersicht

Die Verteilung von Arzneimitteln aus dem Blut in Gewebe ist weiterhin abhängig von Volumen,

Oberfläche und Vaskularisation des jeweiligen Organs. Die Lunge ist ein sehr gut durchblute-

tes Organ (spezifischen Durchblutung von 14 Milligramm je Gramm Gewebe und Minute). Die al-

veoläre Oberfläche ist zwischen 30 und 100 Quadratmeter groß (BERGOGNE-BEREZIN 1995).

Des Weiteren gibt es innerhalb einiger Gewebe zusätzlich gewebespezifische Barrieren. Ge-

webespezifische Barrieren innerhalb der Lunge sind die Kapillar-Alveolar-Barriere und die

Blut-Bronchial-Barriere. Die Kapillar-Alveolar-Barriere besteht aus Kapillarendothel und Al-

veolarepithel. Das Endothel der Kapillaren enthält Poren, wogegen die Epithelzellen der Al-

veolarmembran durch Tight-Junctions verbunden sind. Die Blut-Bronchial-Barriere setzt sich

aus Kapillarendothel, Bronchialepithel, intrabronchialem Mucus und zellulären Abbauprodukten

zusammen. Je nach dem welcher Anteil größer ist, kann die Passage von Arzneimitteln behindert

sein (BALDWIN et al. 1992).

Ein weiterer Einflussfaktor bezüglich der Penetration von Arzneimitteln in Gewebe ist die Aus-

wirkung entzündlicher Prozesse. Durch ein entzündliches Geschehen können einerseits anta-

nomische Barrieren beschädigt werden, was eine erhöhte Membranpermeabilität zur Folge hat.

Andererseits kann die Penetration aber auch durch Fibrosen oder Ödeme behindert sein. Phar-

makokinetische Berechnungen basierend auf Konzentrationen eines Antiinfektivums in Zielge-

weben gesunder Individuen werden jedoch dadurch gerechtfertigt, dass bei jeder Infektion ein

entzündetes Gebiet durch gesunde Areale begrenzt wird. Zur Bekämpfung der Infektion sind

deshalb nicht nur die Konzentrationen eines Antiinfektivums im entzündeten Gebiet entschei-

dend, sondern auch die Konzentrationen im umgebenden gesunden Gewebe, denn nur diese

können eine Ausbreitung der Bakterien verhindern (BALDWIN et al. 1992; BERGOGNE-BE-

REZIN 1995).

Innerhalb der Lunge reichern sich Substanzen auf Grund ihrer Eigenschaften unterschiedlich in

verschiedenen Kompartimenten an. Lipophile Substanzen befinden sich sowohl in der EZF als

auch intrazellulär, wogegen hydrophile Substanzen fast ausschließlich auf die EZF beschränkt

sind (BARZA u. CHUCHURAL 1985; NIX 1998). Im Folgenden werden die wichtigsten

Charakteristika einiger antibakterieller Substanzklassen bezüglich der Penetration in die Lunge

kurz zusammengefasst. Zu den Beta-Laktam-Antibiotika zählen fast ausschließlich hydrophile

Substanzen. Die relativ gute Permeabilität des Kapillarendothels erlaubt die Diffusion in die EZF,

wo sie sich überwiegend anreichern. Auf Grund ihrer geringen Lipidlöslichkeit können Beta-

Laktam-Antibiotika durch Tight-Junctions verbundene Membranen, wie Zellmembranen oder

das Alveolarepithel schlecht passieren. Aminoglykoside weisen bezüglich der Penetration in den

Respirationstrakt ähnliche Eigenschaften wie Beta-Laktam-Antibiotika auf. Wegen ihrer niedri-

gen Proteinbindung erreichen Chinolone in der Regel hohe Gewebekonzentrationen. Innerhalb

der Substanzklasse gibt es große Unterschiede bezüglich der Lipidlöslichkeit (während Ciproflo-

xacin beispielsweise hydrophil ist, weist Sparfloxacin eine hohe Lipidlöslichkeit auf). Makrolide

sind hochgradig lipophile Substanzen, die hohe intrazelluläre Konzentrationen erreichen können

(CRUCIANI et al. 1996).

38

Literaturübersicht

2.2.4 Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen im Respirationstrakt

Folgende, der in Kapitel 2.1 aufgeführten, Untersuchungsmodelle können prinzipiell zur Kon-

zentrationsbestimmung von Antiinfektiva im Respirationstrakt eingesetzt werden: „Konzentra-

tionsbestimmung in Gewebeproben“, „BAL“, „Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode“,

„Bildgebende Verfahren“ und „Mikrodialyse“. In dieser Arbeit soll neben der Mikrodialyse die

Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben und die Entnahme von ELF mittels Blättchenme-

thode näher betrachtet und verglichen werden. Die BAL und die bildgebenden Verfahren werden

nicht weiter untersucht, da die BAL auf Grund des schwierig zu bestimmenden Verdünnungs-

faktors für Messungen von Arzneimittelkonzentrationen nicht besonders geeignet ist und die

bildgebenden Verfahren nur in speziellen Zentren, in denen die entsprechenden Geräte verfügbar

sind, angewendet werden können.

Konzentrationsbestimmung in Gewebeproben der Lunge

Vor- und Nachteile der Konzentrationsbestimmung in Gesamtgewebeproben wurden bereits in

Kapitel 2.1.2 ausführlich dargestellt. Ein gravierender Nachteil ist, dass Konzentrationsbestimmun-

gen im Gewebehomogenat unter der Annahme einer gleichmäßigen Verteilung des Arzneimittels

zwischen den einzelnen Kompartimenten innerhalb eines Gewebes durchgeführt werden. Dies ist

jedoch nicht der Fall. Verschiedene Substanzklassen von Antiinfektiva reichern sich je nach ihren Ei-

genschaften in verschiedenen Kompartimenten unterschiedlich an. Beta-Laktam-Antibiotika und

Aminoglykoside reichern sich überwiegend in der EZF an, wogegen Makrolide und Chinolone

auch intrazellulär akkumulieren und dort sogar höhere Konzentrationen als in der EZF erreichen

können. Da zur Bekämpfung der meisten bakteriellen Erreger die Konzentrationen in der EZF

entscheidend sind, sind im Gewebehomogenat gemessene Konzentrationen von Beta-Laktam-

Antibiotika und Aminoglykosiden auf Grund der Verdünnung mit intrazellulären Komponenten

zu niedrig. Im Gewebehomogenat gemessene Konzentrationen von Makroliden und Chinolonen

dagegen sind zu hoch (NIX 1998). Für viele antibakterielle Substanzen existieren Daten bezüglich

ihrer Konzentrationen im Gesamt-Lungengewebe. In der Regel ist das Gewebe-Plasma-Verhältnis

bei Beta-Laktam-Antibiotika und Aminoglykosiden kleiner als 1 und bei Makroliden und Chino-

lonen größer als 1 (CRUZIANI et al. 1996). Beispielsweise in im Mensch durchgeführten Studien

betrug das Gewebe-Plasma-Verhältnis für Amoxicillin 0,8, für Erythromycin 2,1 und für Ciproflo-

xacin 6 nach intravenöser Applikation (BERGOGNE-BEREZIN 1995).

Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode

Die Methodik der Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode, sowie Vor- und Nachteile der

Methode wurden in Kapitel 2.1.6 beschrieben. Konzentrationen von Beta-Laktam-Antibiotika

und Aminoglykosiden in der ELF unterschreiten Plasmakonzentrationen in der Regel deutlich,

da Vertreter dieser Substanzklassen das Alveolarepithel und Zellmembranen auf Grund ihrer ge-

ringen Lipidlöslichkeit schlecht passieren können. Entzündungen können eine Steigerung der

Permeabilität des Alveolarepithels zur Folge haben und Konzentrationen von Beta-Laktam-An-

39

Literaturübersicht

tibiotika und Aminoglykosiden können dadurch in der ELF erhöht sein. Makrolide und Chi-

nolone erreichen hohe Konzentrationen in der ELF, wobei ein erheblicher Anteil intrazellulär

lokalisiert sein kann (CRUZIANI et al. 1996).

HALSTEAD et al. (1992) verglichen Konzentrationen des Beta-Laktam-Antibiotikums Ceftiofur

in der ELF und im Blutplasma von 4 Kälbern. Den Tieren wurde Ceftiofur zunächst intramusku-

lär viermal im Abstand von 24 Stunden in einer Dosierung von 2,2 Milligramm pro Kilogramm

Körpergewicht verabreicht (Phase I). Nach einer Wash-out-Periode von 4 Wochen wurden die

Kälber erneut mit Ceftiofur viermal im Abstand von 24 Stunden in einer Dosierung von 4,4

Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht behandelt (Phase II). Blutproben wurden in Phase

I und II der Studie jeweils 0, 30 Minuten, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 und 12 Stunden nach der

ersten und vierten Applikation entnommen. ELF-Proben wurden in Phase I und II der Studie

jeweils stündlich zwischen 0 und 12 Stunden nach der ersten und vierten Applikation entnom-

men. Nach einmaliger Dosierung in Phase I der Studie (Dosis: 2,2 Milligramm pro Kilogramm

Körpergewicht) wurde jeweils eine mittlere Cmax

von 8,78 und 4,02 Mikrogramm pro Milliliter

für Plasma und ELF gemessen mit einer zugehörigen mittleren Tmax

1,82 und 3,25 Stunden nach

Behandlung. Das Verhältnis mittlere AUCELF

zu AUCPlasma

betrug 0,69. Nach viermaliger Dosie-

rung in Phase I wurde jeweils eine mittlere Cmax

von 13,13 und 3,14 Mikrogramm pro Milliliter

für Plasma und ELF gemessen, mit einer zugehörigen mittleren Tmax

1,72 und 3,35 Stunden

nach Behandlung. Das Verhältnis mittlere AUCELF

zu AUCPlasma

betrug 0,42. Nach einmaliger

Dosierung in Phase II der Studie (Dosis: 4,4 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht) wurde

jeweils eine mittlere Cmax

von 17,25 und 8,59 Mikrogramm pro Milliliter für Plasma und ELF

gemessen mit einer zugehörigen mittleren Tmax

2,48 und 2,46 Stunden nach Behandlung. Das

Verhältnis mittlere AUCELF

zu AUCPlasma

betrug 0,54. Nach viermaliger Dosierung in Phase II

wurde jeweils eine mittlere Cmax

von 24,08 und 5,59 Mikrogramm pro Milliliter für Plasma und

ELF gemessen mit einer zugehörigen mittleren Tmax

2,31 und 2,79 Stunden nach Behandlung.

Das Verhältnis mittlere AUCELF

zu AUCPlasma

betrug 0,31. Konzentrationen von Ceftiofur waren

signifikant niedriger in der ELF im Vergleich zu Plasma.

Mikrodialyse in der Lunge

Die Mikrodialyse wurde ausführlich in Kapitel 2.1.8 besprochen. Die wichtigsten Vorzüge ge-

genüber anderen Methoden sind die Möglichkeit der Erstellung vollständiger Konzentrations-

Zeitprofile mit Daten von einem Individuum und die Messung der nicht-proteingebundenen

Arzneimittelkonzentration direkt am Ort des infektiösen Geschehens (PLOCK u. KLOFT 2005;

ZEITLINGER et al. 2005). Auf Grund der geschützten anatomischen Lage der Lunge innerhalb

des Thorax ist ein invasiver chirurgischer Eingriff notwendig, bevor der Mikrodialysekatheter

im Lungengewebe platziert werden kann. Da, wie in einigen Tierversuchen gezeigt wurde, die

Implantation des Katheters durch die Brustwand mittels Trokar fast immer zur Entstehung eines

Pneumothorax führt, ist eine Thorakotomie Voraussetzung für die Durchführung eines erfolgrei-

chen Mikrodialyseversuchs in der Lunge.

40

Literaturübersicht

Nach korrekter Implantation des Mikrodialysekatheters im Lungengewebe wurden in bisher durch-

geführten Studien keine durch den Katheter verursachten Nebenwirkungen oder Komplikationen

beschrieben (ZEITLINGER et al. 2005). Die Mikrodialyse kann in der Lunge zum einen zur

Messung von Arzneimittel-Konzentrationen in der EZF des Lungeninterstitiums und zum anderen

zur Bestimmung von Konzentrationen in der ELF der Bronchien angewendet werden. Konzent-

rationsmessungen in der ELF sollen in dieser Arbeit nicht weiter verfolgt werden, da zur Konzen-

trationsbestimmung in der ELF bereits mehrere Methoden (z.B. Blättchenmethode, BAL) in der

Veterinärmedizin etabliert sind. Zwecks vollständiger Darstellung werden bisher durchgeführte

Mikrodialyseversuche, mit welchen Konzentrationen in der ELF gemessen wurden, an dieser

Stelle jedoch genannt. EISENBERG et al. (1993) bestimmten Konzentrationen von Aminogly-

kosiden in der ELF von Ratten, TYVOLD et al. (2007) untersuchten in einer Studie in Bronchi-

en von Schweinen ob sich die Mikrodialyse zur kontinuierlichen Untersuchung der ELF eignet

und AOKI et al. (2008) bestimmten Konzentrationen von Ulifloxacin in der ELF von Ratten.

Während bei herkömmlichen Methoden zur Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln in

der Lunge, wie Entnahme von Gewebeproben, BAL oder Blättchenmethode, die gemessenen

Konzentrationen einzelnen Kompartimenten wie dem intravaskulären, dem extrazellulären und

dem intrazellulären Raum nicht zugeordnet werden können, ermöglicht die Mikrodialyse im

Lungeninterstitium die ausschließliche Messung der nicht-proteingebundenen Arzneimittelfrak-

tion in der EZF (ZEITLINGER et al. 2005). Folgende Studien, in denen Konzentration von

Antiinfektiva im Lungeninterstitium von Ratten und Menschen mittels Mikrodialyse bestimmt

wurden, sind bisher veröffentlicht:

Studien in der Ratte:

• Anwendung der Mikrodialyse in Studien zur Gewebeverteilung von Arznei-

mitteln: Untersuchungen zur Freien-Liganden-Hypothese und Gewebebin-

dung von Beta-Laktam-Antibiotika (DEGUCHI et al. 1992).

• Penetration von Cefaclor in die extrazelluläre Flüssigkeit der Lunge von Rat-

ten (DE LA PENA et al. 2001).

• Messungen der interstitiellen Gewebekonzentration von Cefpodoxim (LIU et

al. 2002).

• Mikrodialysestudie zur Verteilung von Imipenem in der extrazellulären Flüs-

sigkeit der Lunge von nicht-infizierten Ratten (MARCHAND et al. 2005).

• Mikrodialysestudie zur Verteilung von Imipenem in der extrazellulären Flüs-

sigkeit der Lunge von Acinetobacter baumannii infizierten Ratten (DAHYOT et

al. 2006).

• Eine Mikrodialysestudie in der Lunge von Ratten nach intravenöser Infusion

von Levofloxacin (MARCHAND et al. 2008).

• Untersuchungen zur Penetration von Gatifloxacin in die Lunge von Ratten

mittels Mikro dialyse (TASSO et al. 2008).

41

Literaturübersicht

Studien im Mensch:

• Anwendung der Mikrodialyse zur Messung der Penetration von Antibiotika

in die menschliche Lunge (HERKNER et al. 2002).

• Messung der Penetration von Piperazillin und Tazobactam in menschliches

pneumonisches Lungengewebe mittels Mikrodialyse (TOMASELLI et al. 2003).

• Messung der Penetration von Meropenem in menschliches pneumonisches

Lungengewebe mittels Mikrodialyse (TOMASELLI et al. 2004).

• Messungen der Penetration von Levofloxacin in das Lungengewebe nach

einer Operation am Herz (HUTSCHALA et al. 2005).

• Untersuchungen zu Konzentrationen von Levofloxacin in Interstitialraum-

flüssigkeit von Weichteilgeweben als Vorhersage der Pharmakokinetik von

Levofloxacin in der Lunge (ZEITLINGER et al. 2007).

• Untersuchungen zur Auswirkung perioperativer Atelektase auf die Penetration

von Antibiotika in das Lungengewebe (HUTSCHALA et al. 2008).

Im Hinblick auf die in dieser Arbeit verwendete Modellsubstanz (siehe Kapitel 2.3) wird die von

HERKNER et al. (2002) durchgeführte Studie zur Konzentrationsbestimmung von Cefpirom in

der menschlichen Lunge mittels Mikrodialyse näher beschrieben. Je ein flexibler Mikrodialyseka-

theter (Membranmaterial Polyethersulfon, Membrangröße 0,6 mal 50 Millimeter) wurde in das

Lungengewebe von 5 männlichen Patienten während einer Thoraxoperation zur Entfernung von

Lungentumoren implantiert. Als Perfusat wurde entgaste Ringerlösung verwendet. Die Flussrate

wurde auf 1,5 (3 Patienten) und 4,0 Mikroliter pro Minute (2 Patienten) eingestellt. Nach Verschluss

des Thorax und Baseline-Probenentnahmen über einen Zeitraum von 30 Minuten wurde den wa-

chen, spontan atmenden Patienten je 2 Gramm Cefpirom über eine Zeitspanne von 5 Minuten in-

travenös verabreicht. Lungen-Mikrodialysat wurde in 20-minütigen Intervallen bis 4 Stunden nach

der Behandlung entnommen. Zu denselben Zeitpunkten wurden zusätzlich Blutproben gezogen.

Die Proben wurden mittels mizellarer elektrokinetischer Chromatographie analysiert. Die in vitro

bestimmte relative Wiederfindung betrug 78 Prozent bei einer Flussrate von 1,5 Mikroliter pro

Minute und 43 Prozent bei einer Flussrate von 4,0 Mikroliter pro Minute. Nicht-proteingebunde-

ne Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Lunge stiegen bis 40 Minuten nach der Behandlung

rapide an und nahmen dann etwas langsamer ab als totale Cefpirom-Konzentrationen im Blutplas-

ma, so dass 200 Minuten nach Behandlung die nicht-proteingebundene Konzentration in der EZF

der Lunge etwa der proteingebundenen und nicht-proteingebundenen Konzentration im Plasma

entsprach. Die mittlere Cmax

betrug für Plasma 175 Mikrogramm pro Milliliter und für die EZF

der Lunge 74 Mikrogramm pro Milliliter mit einer zugehörigen mittleren Tmax

von 5 Minuten für

Plasma und 49 Minuten für die EZF. Für Plasma wurde eine mittlere AUC von 261 Stunden mal

Mikrogramm pro Milliliter errechnet, für die EZF der Lunge 174 Stunden mal Mikrogramm pro

Milliliter. Das Verhältnis AUCEZF

(nicht-proteingebundene Fraktion von Cefpirom) zu AUCPlasma

(proteingebundene und nicht-proteingebundene Fraktion von Cefpirom) betrug 0,67.

42

Literaturübersicht

2.2.5 Bakterielle Erkrankungen des Respirationstraktes

Bei lebensmittelliefernden Tieren zählen, neben gastrointestinalen Erkrankungen und Mastiti-

den, Respirationserkrankungen zu den am häufigsten diagnostizierten bakteriellen Infektionen

(WALLMANN et al. 2004). Bei Schweinen hat die Häufigkeit von Respirationserkrankungen

durch die Intensivierung der Fleischproduktion stark zugenommen. Respirationserkrankungen

wirken sich sowohl auf den allgemeinen Gesundheitszustand als auch auf die Entwicklung der

Tiere negativ aus. Meist handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen mit ursprünglich in-

fektiöser Ätiologie, welches sich durch Haltungsfaktoren klinisch manifestiert. Häufig entstehen

Sekundärinfektionen, wenn auf einen Erreger (z. B. Viren) weitere Erreger (z. B. Bordetellen) fol-

gen. Die Auswirkungen der Sekundärinfektion sind meist schwerwiegender als die der Primär-

infektion. Die Übertragung von Atemwegserkrankungen kann direkt durch orale Aufnahme von

Nasensekret oder aerogen durch keimhaltige Tröpfchen erfolgen. Im Folgenden sollen die wich-

tigsten bakteriellen Erreger infektiöser Lungenerkrankungen beim Schwein genannt werden.

• Actinobacillus pleuropneumoniae Der Erreger kann in 12 Serotypen mit unterschiedlicher Pathogenität un-

terteilt werden. Die Verbreitung von Actinobacillus pleuropneumoniae zwischen

verschiedenen Beständen erfolgt durch Zukauf stumm infizierter Tiere. Es

lassen sich 4 Verlaufsformen der Infektion unterscheiden: eine perakute und

eine akute Form mit beetartigen dunkelroten Entzündungs herden im Lun-

gengewebe und Fibrinauflagerungen auf der Pleura, wobei bei der perakuten

Form zusätzlich serös-blutige Flüssigkeitsansammlungen in der Brusthöhle

auftreten, eine subakute Form und eine chronische Form.

• Haemophilus parasuis Bezüglich Haemophilus parasuis werden 15 pathogene und apathogene Sero-

typen unterschieden. Pathogenität und Häufigkeit betreffend, haben unbe-

kapselte Stämme, insbesondere die Serotypen 4 und 5 die größte epizootio-

logische Bedeutung. Haemophilus parasuis ist der Erreger der Glässerschen

Krankheit, wird aber auch sehr häufig aus pneumotisch veränderten Lungen

isoliert. Empfängliche Tiere erkranken schon bei Kontakt mit geringen

Keimzahlen, die meisten Schweine sind jedoch unter normalen Haltungs-

bedingungen immun. Am häufigsten erkranken Läuferschweine. Besonders

gefährdet sind Nachkommen primärer spezifisch-pathogen-freier Schweine,

wenn sie aus geschlossenen Beständen in die konventionelle Schweinehaltung

verbracht werden.

43

Literaturübersicht

• Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae ist der primäre Erreger der enzootischen Pneu-

monie. Der Erreger wird durch Zukauf subklinisch infizierter Tiere verbrei-

tet. Die enzootische Pneumonie kann, von subklinisch bis akut, sehr unter-

schiedlich verlaufen. Bei der akuten Form wird der Krankheitsverlauf meist

durch Sekundärerreger kompliziert. Typische pathologische Veränderungen

sind anfänglich graurote, später braunrote entzündliche Veränderungen in den

kranioventralen Lungenbezirken.

• Bordetella bronchiseptica Bordetella bronchiseptica tritt häufig als Sekundärerreger (z. B. bei enzootischer

Pneumonie) auf. Des Weiteren verursacht der Erreger primär eine keuchhus-

tenähnliche Erkrankung bei Saugferkeln. Pathologische Veränderungen der

Lunge sind Hämorrhagien und interlobuläre Ödeme. Später tritt eine starke

Bindegewebsbildung auf und fissurartige Einschnürungen bleiben im Lun-

gengewebe zurück.

• Pasteurella multocida Pasteurella multocida ist ein primärer Erreger der progressiven Rhinitis atro-

phicans, tritt jedoch auch häufig als Sekundärerreger auf (z. B. bei der Au-

jeszkyschen Krankheit). Der Erreger kann in 6 Serotypen unterteilt werden.

Pasteurella multocida A wird häufig aus procinen Lungen isoliert. Die Übertra-

gung des Erregers erfolgt typischerweise von der Muttersau auf Ferkel in der

ersten Lebenswoche. Klinische Symptome der pneumonischen Verlaufsform

einer Pasteurella-multocida-Infektion sind starke Hustenanfälle und Auswurf von

Mucus.

• Streptococcus suis Für Streptococcus suis sind 35 Serotypen bekannt. Am häufigsten kommt Typ II

vor, Typ I wird seltener nachgewiesen und ist vor allem für Saugferkel patho-

gen. Die Einschleppung des Erregers in Schweinebestände erfolgt überwie-

gend über latent infizierte Schweine, aber auch Menschen, Mäuse und Flie-

gen kommen als Überträger in Betracht. Eine dichte Stallbelegung begünstigt

die Ausbreitung. Streptococcus suis ist an verschiedenen Krankheitsverläufen

wie Meningitis, Arthritis und Perikarditis beteiligt. Häufig wird der Erreger

auch in Zusammenhang mit Bronchopneumonien aus der Lunge isoliert.

(DEE 1999, ZIMMERMANN u. PLONAIT 2004).

44

Literaturübersicht

Die Behandlung der durch diese Erreger hervorgerufenen Krankheiten erfolgt, neben einer Op-

timierung der Haltungsbedingungen, vor allem durch die Verabreichung von Antiinfektiva.

Bezüglich des Einsatzes von Antiinfektiva beim Schwein als lebensmittellieferndem Tier stehen

für den Verbraucher 2 Themen im Vordergrund: Rückstände im Fleisch und die Gefahr der Ent-

stehung und Verbreitung von Resistenzen gegenüber antibakteriellen Substanzen (FRIENDSHIP

2007). Um die Entstehung von resistenten Keimen zu verhindern und gleichzeitig Rückstände

im Fleisch möglichst niedrig zu halten, muss bei der Dosierung von Antiinfektiva bei lebensmit-

telliefernden Tieren das Prinzip gelten „so viel wie nötig, aber so wenig wie möglich“.

45

Literaturübersicht

2.3 Cefpirom als Modellsubstanz

2.3.1 Struktur und Klassifizierung

Cefpirom wird der Wirkstoffklasse der Cephalosporine, eine von 4 Wirkstoffklassen der Beta-

Laktam-Antibiotika, zugeordnet. Beta-Laktam-Antibiotika besitzen als chemisch-biologisches

Merkmal einen Beta-Laktam-Ring, der das antibakteriell aktive Zentrum darstellt. Die Un-

terteilung der Beta-Laktam-Antibiotika in 4 Wirkstoffklassen erfolgt auf Grund der restlichen

Molekülkomponenten. Cephalosporine leiten sich vom Cephalosporin C ab, einem Produkt der

Pilzart Cephalosporium acremonium. Alle als Arzneimittel zugelassenen Cephalosporine sind semi-

synthetische Entwicklungen auf der Basis der 7-Amino-Cephalosporansäure (siehe Abbildung 8),

welche durch hydrolytische Abspaltung von Cephalosporin C gewonnen wird.

Die Struktur der Cephalosporine kann hauptsächlich an Position 3 (R2) und 7 (R1) verändert

werden. Während Substitutionen an Position 3 sich auf die metabolische Stabilität und die phar-

makokinetischen Eigenschaften auswirken, verändern Substitutionen an Position 7 die Beta-

Laktamase-Stabilität und die antibakteriellen Eigenschaften (STAHLMANN u. LODE 2001;

PRESCOTT 2007). Die Wirkstoffklasse der Cephalosporine kann auf verschiedene Arten weiter

unterteilt werden. Cephalosporine werden nach der historischen Entwicklung der verschiedenen

Moleküle seit 1975 4 Generationen zugeordnet.

Abb. 8: Struktur der 7-Amino-Cephalosporansäure

COOH

O

NHCR₁

R₂ON

S

46

Literaturübersicht

• 1. Generation: Die Substanzen zeigen antibakterielle Aktivität primär

gegenüber gram-positiven Keimen. Die Applikation erfolgt hauptsächlich

parenteral, in seltenen Fällen auch oral.

• 2. Generation: Die Substanzen sind gegenüber gram-positiven und gram-

negativen Keimen antibakteriell wirksam. Sie können über alle Applikations-

routen verabreicht werden.

• 3. Generation: Die Substanzen zeigen verringerte antibakterielle Aktivität

gegenüber gram-positiven Keimen, aber vermehrte Wirksamkeit gegenüber

gram-negativen Keimen. Die Applikation erfolgt hauptsächlich parenteral, in

seltenen Fällen auch oral.

• 4. Generation: Die Substanzen sind gegenüber gram-positiven und gram-

negativen Keimen vermehrt wirksam. Die Applikation erfolgt parenteral.

Da die Einteilung der Cephalosporine in Generationen die unterschiedlichen Eigenschaften der

Moleküle unzureichend beschreibt, werden die Cephalosporine auf Grund ihrer antimikrobiel-

len Aktivität und der Applikationsroute weiter in 7 Gruppen unterteilt.

• Gruppe 1 (1. Generation): Die Applikation erfolgt parenteral. Die Sub-

stanzen sind stabil gegenüber Beta-Laktamasen von Staphylokokken, aber

sensitiv gegenüber enterobakteriellen Beta-Laktamasen. Sie werden als mit-

telgradig antibakteriell aktiv eingestuft. Der Gruppe 1 werden beispielsweise

Cefalothin, Cefapirin und Cefazolin zugeordnet.

• Gruppe 2 (1. Generation): Die Applikation erfolgt oral. Die Substanzen

sind stabil gegenüber Beta-Laktamasen von Staphylokokken und moderat re-

sistent gegenüber einigen enterobakteriellen Beta-Laktamasen. Sie werden als

mittelgradig antibakteriell aktiv eingestuft. Der Gruppe 2 werden beispiels-

weise Cefadroxil, Cefadrin und Cefalexin zugeordnet.

• Gruppe 3 (2. Generation): Die Applikation erfolgt parenteral und oral.

Die Substanzen sind stabil gegenüber einer Vielzahl von Beta-Laktamasen. Sie

werden als hochgradig antibakteriell aktiv eingestuft. Der Gruppe 3 werden

beispielsweise Cefaclor, Cefotetan und Cefuroxim zugeordnet.


stanzen sind stabil gegenüber einer Vielzahl von Beta-Laktamasen. Sie werden

als hochgradig antibakteriell aktiv eingestuft. Der Gruppe 4 werden beispiels-

weise Cefotaxim, Ceftriaxon und Ceftiofur zugeordnet.

• Gruppe 5 (3. Generation): Die Applikation erfolgt oral. Die Substanzen

sind stabil gegenüber einer Vielzahl von Beta-Laktamasen. Sie werden als

47

Literaturübersicht

hochgradig antibakteriell aktiv eingestuft. Der Gruppe 5 werden beispielswei-

se Cefetamet, Cefixim und Cefpodoxim zugeordnet.


stanzen sind stabil gegenüber einer Vielzahl von Beta-Laktamasen. Sie zeigen

Wirksamkeit gegenüber Pseudomonas aeruginosa. Der Gruppe 6 werden bei-

spielsweise Cefoperazon, Cesulodin und Ceftazidim zugeordnet.

• Gruppe 7 (4. Generation): Die Applikation erfolgt parenteral. Die Substan-

zen sind stabil gegenüber Beta-Laktamasen von Staphylokokken, Enterobak-

terien und Pseudomonaden. Sie werden als hochgradig antibakteriell aktiv

eingestuft. Der Gruppe 7 werden beispielsweise Cefepim, Cefquinom und

Cefpirom zugeordnet.

Cefpirom (siehe Abbildung 9) ist ein in der Humanmedizin eingesetztes Cephalosporin der

4. Generation der Gruppe 7, welches intravenös oder intramuskulär appliziert werden kann

(PRESCOTT 2007). Das Molekulargewicht von Cefpirom beträgt 514,57 Dalton.

2.3.2 Pharmakodynamische Eigenschasten

Wie alle Beta-Laktam-Antibiotika wirken Cephalosporine bakterizid. Sie hemmen die Zell-

wandsynthese, indem sie die Peptidoglykansynthetasen der bakteriellen Zellwand angreifen. Die-

se spezifischen Rezeptoren der Beta-Laktam-Antibiotika werden auch als Penicillin-bindende

Proteine (PBPs) bezeichnet. Um die PBPs zu erreichen, müssen die antibakteriellen Substanzen

zuerst die bakterielle Zellwand und den periplasmatischen Raum passieren. Die Tötung der

Bakterien ist zeitabhängig. Die maximale antibakterielle Wirkung wird bei einer Konzentration

erreicht, die drei- bis viermal höher als der MHK ist; höhere Konzentrationen bringen keinen

zusätzlichen Nutzen (STAHLMANN u. LODE 2001). Generell vorteilhafte Eigenschaften der

Cephalosporine sind ihre hohe Aktivität gegenüber PBPs und die Fähigkeit bakterielle Zell-

wände gut zu durchdringen. Alle Cephalosporine sind wirksam gegenüber beta-hämolysieren-

den Streptokokken und beta-laktamase-produzierenden Staphylokokken. Methicillin-resisten-

te Staphylokokken sind jedoch unempfindlich. Im Gegensatz zu Cephalosporinen vorheriger

Abb. 9: Struktur von Cefpirom (chemische Formel: C₂₂H₂₂N₆O₅S₂)

N

S

CONHC

H₂N CH₂NOCH₃ O

N

S

CO₂

N

48

Literaturübersicht

Generationen wirkt Cefpirom als Cephalosporin der 4. Generation der Gruppe 7 auch gegen

Enterobacteriaceae und gram-negativen Bakterien wie Haemophilus und Pasteurella. Weiterhin ist es

neben den anderen Vertretern seiner Gruppe und der Gruppe 6 gegenüber Pseudomonas aerugi-

nosa effektiv. Cephalosporine zeigen grundsätzlich keine Wirkung bei zellwandlosen Bakterien,

da sie Erreger durch eine Hemmung der Zellwandsynthese töten. Weiterhin unwirksam sind

sie bei obligat intrazellulär wachsenden Bakterien und vorwiegend intrazellulär parasitierenden

Bakterien, da sie Zellmembranen auf Grund ihrer geringen Lipophilie nicht passieren können.

Auch bei langsam wachsenden Bakterien zeigen sie keine Wirkung (STAHLMANN u. LODE

2001; PRESCOTT 2007). In Tabelle 3 ist die antibakterielle Aktivität von Cefpirom gegenüber

einigen Erregern aufgelistet (PRESCOTT 2007).

2.3.3 Pharmakokinetische Eigenschasten

Das scheinbare Verteilungsvolumen von Beta-Laktam-Antibiotika beträgt circa 0,2 Liter pro

Kilogramm. Das scheinbare Verteilungsvolumen, ein Proportionalitätsfaktor zwischen der im

Organismus vorhandenen Menge eines Arzneimittels und seiner Plasmakonzentration, ist bei

Beta-Laktam-Antibiotika klein, da sich die nicht-proteingebundene Fraktion der Wirkstoffe auf

Grund ihrer hydrophilen Eigenschaften fast ausschließlich im vaskulären Kompartiment und

im Extrazellulärraum verteilt. Wegen der geringen Lipophilie können Beta-Laktam-Antibiotika

biologische Membranen kaum passieren und intrazelluläre Konzentrationen sind daher vernach-

lässigbar. Die antibakterielle Aktivität von Beta-Laktam-Antibiotika kann durch den in Ent-

zündungsherden leicht sauren pH-Wert begünstigt werden (FICHTL 2001; STAHLMANN u.

LODE 2001). Generell ist die Plasmaproteinbindung von Beta-Laktam-Antibiotika labil und

leicht reversibel (STAHLMANN u. LODE 2001). Die Plasmaproteinbindung von Cefpirom be-

trägt beim Mensch etwa 10 Prozent (SANOFI-AVENTIS GmbH 2006). Die Eliminationshalb-

wertzeit von Cefpirom aus dem Blutplasma von Menschen beträgt 2 Stunden. Beta-Laktam-An-

tibiotika werden zum größten Teil unverändert ausgeschieden. Die Ausscheidung von Cefpirom

erfolgt primär renal, wobei beim Menschen 80 bis 90 Prozent der verabreichten Dosis im Urin

wiedergefunden werden (STAHLMANN u. LODE 2001; SANOFI-AVENTIS GmbH 2006).

Tab. 3: Antibakterielle Aktivität von Cefpirom

ErregerStaphylo-

coccus aureus

Strepto-coccus

agalactiaeEnterococ-cus faecalis

Escherischia coli

Proteus mirabilis

Pseuno-monas

aeruginosaAcineto-

bacter spp.

MHK₉₀(µg/ml) 0,5 0,06 4,0 0,12 0,06 8,0 4,0

MHK₉₀ = Niedrigste Konzentration, die die Vermehrung von mindestens 90% der getesteten Stämme hemmt

49

Literaturübersicht

2.3.4 Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Parameter

Die Kombination von PK-PD-Parametern zur Entwicklung adäquater Dosierungsschemata wird

als PK-PD-Korrelation bezeichnet. PK-PD-Korrelationen liegt das Prinzip zu Grunde, dass das

Ergebnis der antibakteriellen Therapie hauptsächlich von 2 Faktoren beeinflusst wird, nämlich

einerseits von der Exposition des Erregers gegenüber der antibakteriellen Substanz am Ort des

infektiösen Geschehens (pharmakokinetischer Faktor) und andererseits von der Sensivität des

Erregers gegenüber dieser Substanz (pharmakodynamischer Faktor).

Der pharmakodynamische Faktor ist in der Regel ein in vitro bestimmter Parameter, meist der

MHK. Pharmakokinetische Parameter werden idealerweise basierend auf am Ort des infektiösen

Geschehens gemessenen Konzentrationen der antibakteriellen Substanz berechnet. Dabei han-

delt es sich entweder um einen punktuell gemessenen Wert (z. B. Cmax

) oder einen integrierten

Wert (z. B. AUC). Ziel der Kombination der PK- und PD-Parameter ist die Entwicklung von

Dosierungsschemata, mit welchen sowohl eine klinische als auch eine vollständige bakteriologi-

sche Heilung erzielt werden kann. Für zeitabhängige Antibiotika wie Beta-Laktam-Antibiotika

ist der nützlichste PK-PD-Parameter T>MHK (TOUTAIN 2003).

2.3.5 Resistenzen

Einen Erreger bezeichnet man als resistent, wenn er gegenüber einer antibakteriellen Substanz

unempfindlich ist. Hauptsächlich werden 3 Resistenzmechanismen unterschieden:

• Natürliche Resistenz: alle Stämme einer Spezies sind gegenüber einer

bestimmten antibakteriellen Substanz unempfindlich (z. B. zellwandlose

Bakterien gegenüber Cephalosporinen).

• Mutations-bedingte Resistenz: entweder primäre Resistenz eines Teils der

Stämme ohne Kontakt zur antibakteriellen Substanz oder durch Mutation

beziehungsweise Adaptation erworbene Resistenz unter dem Selektions-

druck einer Therapie.

• Plasmid-/ Transponson-bedingte Resistenz: Bestimmte Bruchstücke von

Plasmiden, sogenannte Transponsons, können von einem Plasmid auf ein

anderes Plasmid oder auf das Chromosom überspringen; durch den Gen-

austausch sind rasche Veränderungen der genetischen Formation möglich

(STAHLMANN u. LODE 2001).

Die häufigsten Resistenzmechanismen gegenüber Cephalosporinen sind die Produktion von

Beta-Laktamasen, Modifikation der PBPs und herabgesetzte Permeabilität der Zellwand. Beta-

50

Literaturübersicht

Laktamasen sind Enzyme, welche die Beta-Laktam-Bindung hydrolytisch spalten und das Antibi-

otikum somit inaktivieren. Die Beta-Laktamase-Produktion kann chromosomal- oder Transpon-

son-vermittelt erfolgen. Transponson-vermittelte Beta-Laktamasen können auch neuere, gegen

bekannte Beta-Laktamasen stabile Wirkstoffe inaktivieren. Cefpirom ist stabil gegenüber einer

Vielzahl von Beta-Laktamasen, unter anderem auch gegenüber Beta-Laktamasen von Staphylo-

kokken, Enterobakterien und Pseudomonaden. Eine hohe Beta-Laktamase-Stabilität kann jedoch

zu einer Zunahme der anderen Resistenzmechanismen (Modifikation der PBPs und herabge-

setzte Permeabilität der Zellwand) führen. Durch chromosomal vermittelte, strukturelle Verän-

derungen der PBPs kann die Affinität von antibakteriellen Substanzen zu diesen Zielenzymen

beeinträchtigt werden. Des Weiteren kann deren Permeabilität durch strukturelle Veränderungen

der Zellwand herabgesetzt werden (STAHLMANN u. LODE 2001; PRESCOTT 2007). Durch

intensiven, nicht immer gezielten Einsatz von Antiinfektiva in der Human- und Veterinärmedizin

entwickeln bakterielle Erreger zunehmend wirksame Mechanismen gegenüber antibakteriellen

Substanzen (WALLMANN et al. 2004).

2.3.6 Präparat

Cefpirom wird unter dem Präparatenamen Cefrom®, einem Produkt der Sanofi-Aventis GmbH,

vertrieben. In dieser Arbeit werden Cefrom® 2,0 g – Trockenstechampullen verwendet. Das Prä-

parat ist zur intravenösen Injektion oder Kurzinfusion bestimmt. Vor der intravenösen Injektion

wird der Inhalt einer Tockenstechampulle (Wirkstoffgehalt 2 Gramm Cefpirom) in 20 Milliliter

Wasser für Injektionszwecke gelöst und anschließend langsam über 3 bis 5 Minuten appliziert

(SANOFI-AVENTIS GmbH 2006).

51

Material und Methoden

3Material und Methoden

52


3.1 Zielsetzung und Beschreibung der In-vivo-Versuche

3.1.1 Versuch 1: Vorversuch - Etablierung der Mikrodialyse

Ziel des Versuchs 1 war die Etablierung der Mikrodialyse zur Konzentrationsbestimmung von

Cefpirom in der EZF der Lunge und Vergleich von nicht-proteingebundenen Cefpirom-Kon-

zentrationen in der EZF mit Gesamt-Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma von narkotisier-

ten Schweinen. Nach Eröffnung des Thorax wurde je 1 Mikrodialysekatheter in das Lungenpa-

renchym von 4 narkotisierten Schweinen implantiert. Nach einer Baseline-Sammelperiode und

intravenöser Applikation von Cefrom® wurden zu festgelegten Zeitpunkten Lungen-Mikrodia-

lysat- und Blutproben entnommen. Die letzte Probenentnahme erfolgte jeweils 8 Stunden nach

Behandlung mit Cefrom®.

3.1.2 Versuch 2: Hauptversuch - Vergleich der Mikrodialyse mit anderen Unter- suchungsmodellen

Ziel des Versuchs 2 war der Vergleich von nicht-proteingebundenen Cefpirom-Konzentrationen

in der EZF mit Gesamt-Cefpirom-Konzentrationen in der ELF, im Blutplasma und Lungenho-

mogenat von narkotisierten Schweinen. Nach Eröffnung des Thorax wurde je 1 Mikrodialyseka-

theter in das Lungenparenchym von 8 narkotisierten Schweinen implantiert. Nach einer Baseli-

ne-Sammelperiode, Verschluss des Thorax und intravenöser Applikation von Cefrom® wurden zu

festgelegten Zeitpunkten Lungen-Mikrodialysat-, Blut- und ELF-Proben (mittels Blättchenme-

thode) entnommen. Die letzte Probenentnahme erfolgte jeweils 8 Stunden nach Behandlung mit

Cefrom®. Nach Einschläfern der Tiere (8 Stunden nach Behandlung) wurde eine pathologisch-

makroskopische Untersuchung der Lunge durchgeführt und es wurden Gewebeproben zwecks

pathologisch-histologischer Untersuchung entnommen. Anschließend wurde die gesamte restli-

che Lunge homogenisiert.

53


3.1.3 Versuch 3: Zusatzversuch - Anwendung der Mikrodialyse in wachen Tieren

Ziel des Versuchs 3 war der Vergleich von nicht-proteingebundenen Cefpirom-Konzentratio-

nen in der EZF mit totalen Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma von nicht-narkotisierten

Schweinen und die Untersuchung der Auswirkung der Katheterimplantation auf das Lungen-

gewebe. Nach Eröffnung des Thorax wurde je 1 Mikrodialysekatheter in das Lungenparenchym

von 8 narkotisierten Schweinen implantiert. Nach einer Baseline-Sammelperiode, Verschluss des

Thorax, intravenöser Applikation von Cefrom®, erfolgte die Ausleitung der Narkose und Lun-

gen-Mikrodialysat- und Blutproben wurden zu festgelegten Zeitpunkten von wachen Schwei-

nen entnommen. Die letzte Probenentnahme erfolgte jeweils 8 Stunden nach Behandlung mit

Cefrom®. 4 der 8 Schweine wurden 8 Stunden nach Behandlung eingeschläfert und eine patho-

logisch-makroskopische Untersuchung der Lunge mit Entnahme von Gewebeproben zwecks

pathologisch-histologischer Untersuchung wurde durchgeführt. Bei den restlichen 4 Schwei-

nen wurde der Mikrodialysekatheter 8 Stunden nach Behandlung mit Cefrom® entfernt. Je 1

Schwein wurde 2, 3, 4 und 5 Tage nach Behandlung mit Cefrom® eingeschläfert und es wurde

eine pathologisch-makroskopische Untersuchung der Lunge durchgeführt und es wurden Ge-

webeproben zwecks pathologisch-histologischer Untersuchung entnommen.

54


3.2 In-vitro-Vorversuche und allgemeine Versuchs- informationen

3.2.1 Bedingungen der Versuchsdurchführung

Die Versuche wurden in einer Gute Laborpraxis (Good Laboratory Praxis [GLP])-Prüfeinrich-

tung nach den Standardarbeitsanweisungen (Standard Operating Procedures [SOPs]) der Intervet

Innovation GmbH (Schwabenheim) entsprechend des GLP-Qualitätsstandards durchgeführt.

3.2.2 Mikrodialysezubehör

Das Mikrodialysesystem bestand aus dem Mikrodialysekatheter (siehe Abbildung 11), der Mikro-

dialysepumpe (siehe Abbildung 10), Perfusor-Spritzen und Probensammelgefäßen. Für die Ent-

nahme von Mikrodialysat im wachen Tier (Versuch 3) wurde der Eingangsschlauch mit zusätz-

lichem Schlauchmaterial und Adaptern verlängert. Der verwendeten Mikrodialysepumpe lag ein

duales System zu Grunde. Die Förderung erfolgte puls-frei und es konnten Flussraten zwischen

0,1 und 20 Mikroliter pro Minute eingestellt werden. Da keine seriell produzierten Katheter zu

Anwendung in der Lunge kommerziell erhältlich sind, wurden die Mikrodialysekatheter CMA

61 verwendet, welche ursprünglich zur Anwendung in der Leber des Menschen entwickelt

wurden. Hierbei handelt es sich um konzentrisch aufgebaute Katheter mit einer flexiblen Mem-

bran am distalen Ende. Der Eingangsschlauch (Länge 400 Millimeter, Außendurchmesser 1 Mil-

limeter) ist mit einem äußeren Schaft (Länge 280 Millimeter, Außendurchmesser 1,5 Millimeter)

verbunden, der Ausgangschlauch mit dem inneren Schaft (Länge 310 Millimeter, Außendurch-

messer 0,9 Millimeter). Eingangs- und Ausgangsschlauch, innerer und äußerer Schaft bestehen

aus Polyurethan. Die flexible Membran (Länge 30 Millimeter, Außendurchmesser 0,6 Millime-

ter) ist aus Polyarylethersulfon gefertigt und der Cut-off beträgt 20.000 Dalton. Die Implantation

der Membran in das Lungengewebe erfolgte mit Hilfe einer Split-Kanüle, welche zusammen mit

dem Mikrodialysekatheter geliefert wurde. Ebenfalls zusammen mit dem Katheter wurde eine

Fixierhilfe zur Befestigung des Katheters an der Haut geliefert.

55


Zur Durchführung der Mikrodialyse verwendete Geräte und Materialien

Mikrodialysepumpe Syringe Pump CMA 402® (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Mikrodialysekatheter Hepatic Microdialysis Catheter CMA 61® (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Probensammelgefäße Microvials (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Perfusor-Spritzen 1 ml Luerlockspritze, Skalenlänge 58 mm (Roeser Medical GmbH & Co. KG, Mülheim)

Spritzenadapter CMA Syringe Adapter (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Schlauchadapter Tubing Adapter (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Schlauch- Tubing ConnectorVerbindungsstück (CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Schlauch FEP Tubing 1 m

(CMA/Microdialyis GmbH, Solna, Schweden)

Abb. 10: Syringe Pump CMA 402® Abb. 11: Hepatic Microdialysis Catheter CMA 61® (CMA MICRODIALYSIS)

56


3.2.3 Bestimmung der relativen Wiederfindung

Die relative Wiederfindung wurde vor Einsatz des Katheters im Tier für jeden Katheter einzeln

in vitro bestimmt. Für jedes Tier wurde ein neuer Mikrodialysekatheter verwendet, somit wurden

In-vitro-Wiederfindungsversuche mit insgesamt 20 Kathetern durchgeführt. Im Folgenden wird

der Ablauf der Wiederfindungs-Bestimmung beschrieben:

Der Eingangsschlauch des Mikrodialysekatheters wurde mit einer Perfusor-Spritze, gefüllt mit

entgaster Ringerlösung (Perfusat), verbunden und die Spritze wurde in der Mikrodialysepumpe

eingespannt. Um das System von Luft zu befreien, wurde der Mikrodialysekatheter für circa 15

Minuten bei einer Flussrate von 15 Mikroliter pro Minute durchspült, wobei die gesamte Län-

ge der Membran des Mikrodialysekatheters in mittels Ultraschallbad entgaster Ringerlösung in

einem Becherglas eingetaucht war. Danach wurde die Membran in ein Becherglas, gefüllt mit

entgaster Ringerlösung mit einem bekannten Gehalt an Cefpirom (Stammlösung), verbracht

und der Katheter wurde für 1 Stunde mit entgaster Ringerlösung mit einer Flussrate von 1,5

Mikroliter pro Minute perfundiert. Das Perfusat, welches nach Passage der Membran als Mikro-

dialysat bezeichnet wird, gelangte über den Ausgangsschlauch in ein Probensammelgefäß. Mi-

krodialysat-Proben wurden alle 20 Minuten entnommen, indem das mit Mikrodialysat gefüllte

Probensammelgefäß gegen ein leeres Probensammelgefäß ausgetauscht wurde. Das jeweils ent-

nommene Probenvolumen betrug 30 Mikroliter. Insgesamt wurde die relative Wiederfindung für

jeden Katheter für 3 verschiedene Konzentrationen, beginnend mit der niedrigsten und endend

mit der höchsten Konzentration, zu je 3 verschiedenen Zeitpunkten (20, 40 und 60 Minuten)

bestimmt. Bevor die Membran in die Stammlösung mit der nächst höheren Konzentration an

Cefpirom verbracht wurde, wurde sie jeweils zunächst in entgaste Ringerlösung eingetaucht und

der Katheter wurde bei einer Flussrate von 15 Mikroliter pro Minute für 10 Minuten durch-

spült. Die Stammlösungen wurden während des gesamten In-vitro-Versuchs mittels Wasserbad auf

eine Temperatur von 37 Grad Celsius erhitzt und mit einem Magnetrührer ständig umgerührt.

Die relative Wiederfindung der Katheter Nr. 1 bis 3 fand vor Beginn der In-vivo-Versuche statt

und der Gehalt an Cefpirom in den Stammlösungen betrug 0,01, 0,04 und 0,19 Mikrogramm

pro Milliliter. Nach Vorlage der ersten Ergebnisse aus den In-vivo-Versuchen wurde der Gehalt

an Cefpirom in den Stammlösungen angepasst und betrug 0,19, 0,8 und 4 Mikrogramm pro

Milliliter für die Katheter Nr. 4 bis 20. Die Stammlösungen wurden folgendermaßen hergestellt:

Zunächst wurden 10 Milligramm Cefpirom eingewogen und mit Wasser für Injektionszwecke

in einem Messkolben gelöst, so dass der Gehalt an Cefpirom 1 Milligramm pro Milliliter Wasser

für Injektionszwecke betrug (Ausgangslösung). Für die Herstellung der Stammlösungen für die

Katheter Nr. 1 bis 3 wurden von der Ausgangslösung 1250 Mikroliter entnommen und mit ent-

gaster Ringerlösung verdünnt, so dass der Gehalt an Cefpirom 125 Mikrogramm pro Milliliter

Ringerlösung betrug. Um eine Konzentration von 0,01, 0,04 oder 0,19 Mikrogramm Cefpirom

pro Milliliter Stammlösung zu erhalten, wurden entweder 20, 80 oder 380 Mikroliter der Lösung

entnommen und mit entgaster Ringerlösung entsprechend verdünnt. Für die Herstellung der

57


Stammlösungen für die Katheter Nr. 4 bis 20 wurden von der Ausgangslösung 2500 Mikroliter

entnommen und mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt, so dass der Gehalt an Cefpirom 250

Mikrogramm pro Milliliter Ringerlösung betrug. Um eine Konzentration von 0,19, 0,8 oder

4 Mikrogramm Cefpirom pro Milliliter Stammlösung zu erhalten, wurden entweder 190, 800

oder 4000 Mikroliter der Lösung entnommen und mit entgaster Ringerlösung entsprechend

verdünnt. Der Ablauf der Bestimmung der relativen Wiederfindung eines Katheters wird im fol-

genden Fließschema zusammenfassend dargestellt.

Der Gehalt an Cefpirom wurde in den Mikrodialysat-Proben und in zuvor entnommenen Pro-

ben der einzelnen Stammlösungen (Entnahme von zweimal 30 Mikroliter jeder Lösung und

Überführung von 30 Mikroliter in je ein Mikro-HPLC-Vial) mittels automatisierter Festphasen-

extraktion (online Solid Phase Extraction [SPE]) gekoppelt mit HPLC-MS/MS bestimmt. Die

Probenaufarbeitung und Analyse wird in Kapitel 3.6.1 und 3.6.2 beschrieben, die Berechung

der relativen Wiederfindung aus den gemessenen Konzentrationen im Mikrodialysat und in den

Stammlösungen in Kapitel 3.7.1.

Eintauchen der Membran in Stammlösung 3 (0,19 bzw. 4 µg Cefpirom/ml Ringerlösung)Entnahme von Mikrodialysat nach 20, 40 und 60 min

Spülen des Katheters in Ringerlösung bei einer Fluss-rate von 15 µl/min für 10 min

Spülen des Katheters in Ringerlösung bei einer Flussrate von 15 µl/min für 10 min

Eintauchen der Membran in Stammlösung 2 (0,04 bzw. 0,8 µg Cefpirom/ml Ringerlösung)Entnahme von Mikrodialysat nach 20, 40 und 60 min

Eintauchen Membran in Stammlösung 1 (0,01 bzw. 0,19 µg Cefpirom/ml Ringerlösung)Entnahme von Mikrodialysat nach 20, 40 und 60 min

Spülen des Katheters in Ringerlösung bei einer Flussrate von 15 µl/min für 15 min

58


Im weiteren Verlauf des Material- und Methoden-Parts werden am Ende der einzelnen Kapitel

jeweils diejenigen Geräte, Materialien, Reagenzien, Chemikalien, Lösungsmittel und Lösungen

detailliert aufgelistet, welche in vorhergehenden Abschnitten noch nicht genannt wurden.

Verwendete Reagenzien

Cefpirom Cefrom® 2.0 g – Trockenstechampullen (Sanofi-Aventis GmbH, Wien, Österreich)

Wasser für Aqua ad injectabile Injektionszwecke (Delta Select GmbH, Pfullingen)

Ringerlösung Ringer-Lösung (B. Braun Melsungen AG, Melsungen)

3.2.4 Pflege und Aufbewahrung der Mikrodialysekatheter

Die Mikrodialysekatheter CMA 61 wurden steril verpackt geliefert. Kurz vor Durchführung

der In-vitro-Versuche zur Bestimmung der relativen Wiederfindung wurden die Katheter aus

der sterilen Verpackung entnommen. Jeweils nach Abschluss eines In-vitro-Wiederfindungsver-

suchs wurde jeder Katheter für circa 15 Minuten mit destilliertem Wasser bei einer Flussrate

von 15 Mikroliter pro Minute durchspült, wobei die Membran sich in einem Becherglas mit

destilliertem Wasser befand. Nach Beendigung des Spülvorgangs wurde der Eingangsschlauch

mit einer zuvor steril verpackten Luerlock-Verschlusskappe verschlossen. Die Öffnung des Be-

cherglases wurde um den Katheter herum mit Paraffinfilm verschlossen. Der Katheter wurde

in dieser Weise, das heißt mit der in destilliertem Wasser eingetauchten Membran und mit dem

mit destilliertem Wasser gefüllten Schlauchsystem, bis zum Einsatz in die Lunge der Schweine

bei circa 4 Grad Celsius im Kühlschrank aufbewahrt. Die Zeitspanne der Aufbewahrung im

Kühlschrank, das heißt die Zeit zwischen Durchführung der In-vitro-Wiederfindungsversuche

und der In-vivo-Versuche im Schwein, betrug maximal 26 Tage. In dieser Zeit wurde jeder Ka-

theter mindestens einmal wöchentlich für circa 15 Minuten mit destilliertem Wasser bei einer

Flussrate von 15 Mikroliter pro Minute durchspült und das destillierte Wasser im Becherglas

wurde gegen frisches Wasser ausgetauscht. Kurz vor Einsatz der Katheter in die Lunge wurden

die Katheter aus dem Kühlschrank entnommen und jeweils für circa 10 Minuten mit entgaster

Ringerlösung bei einer Flussrate von 15 Mikroliter pro Minute durchspült, wobei die Membran

zuerst in Ethanol (70 Prozent) und anschließend in entgaste Ringerlösung eingetaucht wurde.

59


3.2.5 Testsubstanz

Die Schweine wurden in den Versuchen 1 bis 3 mit Cefrom® 2,0 g – Trockenstechampullen der

Sanofi-Aventis GmbH behandelt. Eine Ampulle enthielt 2,382 Gramm Cefpriomsulfat als aktiven

Inhaltsstoff, dies entsprach 2 Gramm Cefpirom. Die CAS-Nummer des aktiven Inhaltsstoffs laute-

te 98753-19-6 und die Farbe des Trockenpulvers war weiß. Die Cefrom® 2,0 g – Trockestecham-

pullen wurden vor Licht geschützt bei einer Temperatur unter 25 Grad Celsius aufbewahrt.

3.2.6 Versuchstiere und ihre Haltung

Da es sich bei den Versuchen 1 bis 3 nach dem Tierschutzgesetz um ein Tierversuchsvorhaben

handelte, wurde am 19. Dezember 2007 beim Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz ein

Antrag auf Genehmigung zur Durchführung eines Tierversuchsvorhabens gestellt und die Ge-

nehmigung wurde am 15. Februar 2008 erteilt (Aktenzeichen 23 177-07/G07-4-001).

In Versuchen wurden insgesamt 20 Hybrid-Schweine (Deutsche Landrasse x Large White) ver-

wendet. Versuch 1 wurde mit 4 Schweinen und die Versuche 2 und 3 wurden jeweils mit 8

Schweinen durchgeführt, wobei in jedem Versuch je zur Hälfte weibliche und kastrierte männli-

che Tiere verwendet wurden. Die Tiere stammten aus einem registrierten Schweinezuchtbetrieb

und wogen bei Ankunft in den Ställen der Intervet Innovation GmbH (Schwabenheim) zwi-

schen 32,0 und 33,5 Kilogramm (Versuch 1), 34,5 und 40,5 Kilogramm (Versuch 2) und 28,5

und 36,5 Kilogramm (Versuch 3). Die Tiere wurden mittels Schlagstempel-Nummer individuell

gekennzeichnet und jedem Tier wurde eine fortlaufende Nummer zugewiesen. Die Schweine

wurden auf Spaltenboden in Einzelbuchten mit Sicht- und Körperkontakt (durch Gitterstäbe)

gehalten. Temperatur und Luftfeuchte wurden mit einem Termohygrograph aufgezeichnet. Die

mittlere Temperatur betrug 18 bis 21 Grad Celsius (Versuch 1), 20 bis 25 Grad Celsius (Versuch

2), 20 bis 22 Grad Celsius (Versuch 3) und es wurde eine mittlere Luftfeuchte von 75 bis 90

Prozent (Versuch 1), 45 bis 82 Prozent (Versuch 2), 24 bis 89 Prozent (Versuch 3) aufgezeichnet.

Die Schweine wurden mit kommerziell erhältlichen Pellets (Universal Mast Press®, Raiffeisen

Waren-Zentrale) zweimal täglich entsprechend ihres Alters und Körpergewichts gefüttert. Wasser

wurde ad libitum bereitgestellt. Die Akklimatisationsphase zwischen Ankunft der Tiere und Ver-

suchsbeginn betrug für jeden Versuch etwa 1 Woche. Appetit und allgemeines Befinden der Tiere

wurden über den gesamten Zeitraum einmal täglich kontrolliert. Vor Versuchsbeginn wurden die

Tiere jeweils klinisch untersucht und nur gesunde Tiere wurden in das Versuchsvorhaben einge-

schlossen.

60


3.3 Durchführung Versuch 1

3.3.1 Versuchsablauf

Ablauf des gesamten Versuchs

Ablauf eines Versuchstages

1 Schwein pro Versuchstag: OP, Behandlung, ProbenentnahmeEinschläfern 8 h nach Behandlung

Akklimatisationsphasecirca 1 Woche

Einstallung derTiere Nr. 1 bis 4

Leerwertentnahme Mikrodialysat, Blut

Spülen Katheter

Eröffnung Thorax

Einsatz Katheterin Lunge

Wiegen prä-anästhetischeUntersuchung OP-Vorbereitung Narkose-

einleitungSedation

Einschläfern8 h nach

Behandlung

Entnahme Mikrodialysat (alle 20 min bis 8 h nach Behandlung) Entnahme Blut (20 min, 1, 2, 4, 6, 8 h

nach Behandlung) unter NarkoseBehandlung

61


3.3.2 Narkose

Vor der prä-anästhetischen Sedation und Einleitung der Narkose wurde eine prä-anästhetische

Untersuchung durchgeführt. Diese umfasste die Auskultation von Herz und Lunge, die Beur-

teilung der Pulsqualität und eine visuelle Untersuchung der Schleimhäute. Das Applikations-

volumen der verwendeten Narkotika wurde basierend auf dem am Morgen vor der Narkose

bestimmten Tiergewicht berechnet. Dann wurden die Tiere zunächst durch intramuskuläre Ap-

plikation (Glutealmuskulatur) von Azaperon (1,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht)

und Midazolam (0,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht) sediert. Nach Legen eines

venösen Zugangs in eine Ohrvene wurde die Narkose durch intravenöse Gabe von Propofol (2,5

Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht) und Fentanyl (0,01 Milligramm pro Kilogramm

Körpergewicht) eingeleitet. Zur Muskelrelaxation wurde Pancuroniumbromid (0,1 Milligramm

pro Kilogramm Körpergewicht) in eine andere Ohrvene appliziert. Die Schweine wurden wäh-

rend der gesamten Dauer der Narkose durch einen Endotrachealtubus mit einem Beatmungs-

gerät künstlich beatmet. Die Narkose wurde bis nach Beendigung der letzten Probenentnahme

(8 Stunden nach Behandlung mit Cefrom®) durch kontinuierliche intravenöse Applikation von

Propofol (9,0 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Stunde) und Fentanyl (0,006 Mil-

ligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Stunde) unter Verwendung separater Spritzenpum-

pen aufrechterhalten. Während der Narkose wurden Herzfrequenz und Herzrhythmus mittels

Elektrokardiogramm, die Sauerstoffsättigung mittels Pulsoximeter, der Blutdruck mittels Blut-

druckmessgerät und der Gehalt an Kohlenstoffdioxid in der Ausatemluft mittels Kapnometer

überwacht. Zusätzlich wurden die Schleimhäute (Farbe, Feuchtigkeit und kapilläre Rückfüllzeit)

und die Körpertemperatur in regelmäßigen Abständen untersucht. Abbildung 12 zeigt den Auf-

bau der Narkoseapparatur.

Abb. 12: Aufbau der Narkoseapparatur

62


Verwendete Medikamente

Azaperon Stresnil® (Janssen Animal Health, Neuss) Midazolam Midazolam-ratiopharm® (Ratiopharm GmbH, Ulm) Propofol Propofol-Lipuro® (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Fentanyl Fentanyl 0,5 mg - Rotexmedica® (Rotexmedica GmbH Arzneimittel- werk, Trittau) Pancuroniumbromid Pancuronium-ratiopharm® (Ratiopharm GmbH, Ulm)

Verwendete Geräte und Materialien

Venenkatheter Braunüle® 1,3 x 33 mm (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Spritzenpumpen Injectomat S® (Fresenius, Bad Homburg) Perfusor-Spritzen Perfusor-Spritzen® 20 ml (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Endotrachealtubus Rüschlit Supersafety Clear® (Rüsch, Kernen) Beatmungsgerät Life-Base Medumat variable® (Weinmann, Hamburg) EKG Dinamap Plus® (GE Healthcare, München) Pulsoximeter Oximax N-65® (Nellcor, Boulder, U.S.A.) Blutdruckmessgerät Memoprint® (S+B medVet GmbH, Babenhausen) Kapnometer Microstream Microcap® (Oridion, Jerusalem, Israel) Thermometer Sure Temp mit Rektalsonde Modell 678® (Welch Allyn GmbH, Jungingen)

63


3.3.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialyskatheters in die Lunge

Vor Beginn der Thorakotomie wurden die Schweine zunächst in linker Seitenlage fixiert. Die

Brusthöhle wurde im 5. Interkostalraum etwa auf Höhe des Schultergelenks in einer Länge von

circa 8 Zentimeter eröffnet. Nach Durchtrennung der Haut und Muskelschichten (M. latissimus

dorsi, M.serratus dorsalis cranialis, M. serratus ventralis thoracis, Mm. intercostales externi und interni) er-

folgte die Inzision der Pleura costalis. Am dorsalen Wundwinkel wurde ein Trokar (Durchmesser 5

Millimeter) durch die Haut geführt. Der, wie in Kapitel 3.2.4 beschrieben, zuvor gespülte Mik-

rodialysekatheter wurde durch diesen Trokar geschoben, der dann wieder aus der Haut entfernt

wurde (siehe Abbildung 14). Nun wurde die gesamte Länge der Membran und circa 2 Zentime-

ter des Mikrodialyse-Schafts mit Hilfe einer Split-Kanüle, unter Sichtkontrolle, in das luftgefüllte

Lungengewebe im kranialen Teil des Lobus caudalis dexter etwa auf Höhe des dorsalen Endes der

Fissura interlobaris (siehe Abbildung 13 und 15) eingesetzt. Anschließend wurde die Splitkanüle

entfernt. Der Schaft des Katheters wurde kurz vor seiner Aufzweigung in Ein- und Ausgangs-

schlauch mit der Fixierhilfe an der Haut befestigt. Der Eingangsschlauch des Mikrodialysekathe-

ters wurde mit einer Perfusor-Spritze, gefüllt mit entgaster Ringerlösung (Perfusat), verbunden

und die Spritze wurde in der Mikrodialysepumpe eingespannt. Um die in der Literatur emp-

fohlenen Zeitspanne zur Beseitigung des initialen Gewebetraumas zu gewährleisten, folgte eine

Baseline-Sammelperiode von 1 Stunde bei einer Flussrate von 1,5 Mikroliter pro Minute. Um

den Sitz des Katheters im Lungengewebe während der Sammelperiode kontrollieren zu können,

wurde bei 3 Tieren (Tiere Nr. 2, 3, 4) die Thorakotomie-Wunde lediglich mit Natriumchlorid-

befeuchteten Tupfern abgedeckt. Bei Tier Nr. 1 wurde der Thorax nach Einsatz des Katheters in

die Lunge durch separate Nähte des Muskelgewebes und der Haut verschlossen.

Abb. 13: Lokalisation Einsatz Katheter in der Lunge (mod. nach PROPESKO 1989)

64


Abb. 14: Entfernung des perkutanen Trokars

Abb. 15: Mikrodialysekatheter in der Lunge

65


3.3.4 Applikation von Cefrom®

Cefrom® wurde in einer Dosierung von 26 Milligramm Cefpirom pro Kilogramm Körperge-

wicht intravenös appliziert. Kurz vor der Behandlung wurde der Inhalt einer Trockenstecham-

pulle (2 Gramm Cefpirom) mit 20 Milliliter Wasser für Injektionszwecke gelöst. Für jedes Tier

wurde eine neue Trockenstechampulle verwendet. Das Applikationsvolumen wurde durch Mul-

tiplikation des am Morgen der Behandlung bestimmten Körpergewichts mit der Dosis (26 Mil-

ligramm Cefpirom pro Kilogramm Körpergewicht) und Division durch die nominale Cefpi-

rom-Konzentration (2 Gramm Cefpirom je 20 Milliliter Wasser für Injektionszwecke) berechnet.

Das berechnete Applikationsvolumen wurde aus der Ampulle entnommen und mittels Spritzen-

pumpe über einen Zeitraum von 5 Minuten durch einen Venenkatheter in eine Ohrvene appli-

ziert, in die zuvor keine Narkotika appliziert wurden. Es wurden 20-Milliliter-Perfusor-Spritzen

verwendet und das Applikationsvolumen wurde auf 0,1 Milliliter gerundet. Die Behandlung der

narkotisierten Tiere wurde 10 Minuten vor Beendigung der Baseline-Sammelperiode begonnen

und endete 5 Minuten vor Beendigung der Baseline-Sammelperiode (5 Minuten vor Entnahme

des letzten Leerwertes), da das Mikrodialysat circa 5 Minuten benötigte um von der Membran

zum Probensammelgefäß zu gelangen. In Tabelle 4 sind die Applikationsvolumina der einzelnen

Tiere aufgelistet.


Venenkatheter Braunüle® 1,3 x 33 mm (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Spritzenpumpe Injectomat 2000® (Fresenius, Bad Homburg)

Tab. 4: Applikationsvolumina Versuch 1

Tiernummer Geschlecht Körpergewicht (kg)

Dosierung(mg/kg KG)

Applikationsvolumenberechnet (ml)

Applikationsvolumenappliziert (ml)

1 männlichkastriert 39,5 26 10,27 10,3


3 weiblich 41,0 26 10,70 10,7

4 weiblich 37,5 26 9,75 9,8

KG = Körpergewicht

66


3.3.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut

Lungen-Mikrodialysat

Die Flussrate wurde während des gesamten Zeitraums der Probenentnahme auf 1,5 Mikroliter

pro Minute eingestellt. Während der Baseline-Sammelperiode wurden dreimal im Abstand von

20 Minuten (nach 20, 40 und 60 Minuten) Mikrodialysat-Leerwerte mit einem Probenvolumen

von 30 Mikroliter entnommen. Nach intravenöser Applikation von Cefrom® wurden Mikrodi-

alysat-Proben 20 Minuten nach Behandlung und dann alle 20 Minuten bis 8 Stunden nach der

Behandlung von narkotisierten Schweinen entnommen. Das Probenvolumen einer Probe betrug

demnach 30 Mikroliter. Die Probenentnahme erfolgte durch Ersatz des gefüllten Probensam-

melgefäßes durch ein neues leeres Probensammelgefäß. Direkt nach der Entnahme wurde jedes

Probensammelgefäß in einem individuell gekennzeichneten Mikroröhrchen verschlossen und

innerhalb 1 Stunde in eine Gefriertruhe verbracht. Die Proben wurden bis zur Analyse bei minus

70 bis minus 80 Grad Celsius gelagert.

Blut

Nach intravenöser Applikation von Cefrom® wurden Blutproben (circa 5 Milliliter pro Pro-

benentnahmezeitpunkt) in Kalium-EDTA-Monovetten durch Venenpunktion einer Jugularvene

von narkotisierten Schweinen zu den folgenden Zeitpunkten entnommen: vor der Behandlung,

sowie 20 Minuten, 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Behandlung. Die Blutproben wurden bis zu

ihrer Verarbeitung in Eiswasser gelagert. Innerhalb 1 Stunde nach Entnahme wurden die Proben

bei 0 Grad Celsius und 2000 RZB für circa 15 Minuten zentrifugiert. 3 Aliquote (A, B, C) Blut-

plasma mit einem Volumen von circa je 0,6 Milliliter wurden von jeder Probe in separate indi-

viduell gekennzeichnete Mikroröhrchen abpipettiert und direkt in eine Gefriertruhe verbracht.

Die Proben wurden bis zur Analyse bei minus 70 bis minus 80 Grad Celsius gelagert.


Mikroröhrchen Mikroröhrchen® 2ml (Sarstedt, Nümbrecht)Kanülen Kanüle 1,2 x 75 mm (Erhardt, Geislingen)Monovetten S-Monovette K-EDTA®, 9 ml (Sarstedt, Nümbrecht)Zentrifuge Rotixa RP®

(Hettich, Tuttlingen)

67


3.3.6 Einschläfern der Versuchstiere

Nach den letzten Probenentnahmen (8 Stunden nach Behandlung mit Cefrom®) wurden die

in tiefer Narkose befindlichen Tiere durch intravenöse Applikation von T61 in einer Dosierung

von 5 Milliliter pro 50 Kilogramm Körpergewicht eingeschläfert und der Mikrodialysekatheter

wurde aus der Lunge entfernt.

Verwendetes Medikament

Tetracainhydrochlorid (5 mg/ml) T61®Mebezoniumiodid (50 mg/ml) (Intervet, Unterschleißheim)Embutramid (200 mg/ml)

68



3.4.1 Versuchsablauf

Ablauf des gesamten Versuchs

Ablauf eines Versuchstages


1 Schwein pro Versuchstag: OP, Behandlung, ProbenentnahmeEinschläfern 8 h nach Behandlung

pathologische Untersuchung



Eröffnung Thorax

Spülen Katheter

Leerwertentnahme Mikrodialysat, ELF, Blut

Wiegen Narkose-einleitung

Sedation OP-Vorbereitung prä-anästhetischeUntersuchung

pathologisch-makroskopische Untersuchung der Lunge + Entnahme histologischer Proben Homogenisierung des Lungengewebes

Entnahme Mikrodialysat (alle 20 min bis 8 h nach Behandlung) und ELF + Blut (20 min,

1, 2, 4, 6, 8 h nach Behandlung) unter Narkose


Behandlung

Verschlussdes Thorax

Behand-lung

69


3.4.2 Narkose

Die prä-anästhetische Untersuchung und Sedation, die Narkoseeinleitung und die Aufrechter-

haltung der Narkose, sowie die Überwachung der Tiere während der Narkose wurde in Versuch

2 analog zu Versuch 1 durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.2).

3.4.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters

Die Eröffnung der Brusthöhle und Implantation des Katheters in das Lungengewebe wurde

ebenfalls analog zu Versuch 1 durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.3). Allerdings wurde der Thorax

nach Einsatz des Katheters in die Lunge bei allen Tieren (Tiere Nr. 5 bis 12) durch separate Näh-

te des Muskelgewebes und der Haut verschlossen. Der Verschluss des Thorax erfolgte parallel zu

den Leerwert-Entnahmen und der Behandlung.


Die Applikation von Cefrom® erfolgte analog zu Versuch 1, wie in Kapitel 3.3.4 beschrieben.

In Tabelle 5 sind die Applikationsvolumina der einzelnen Tiere aufgelistet.



Dosierung(mg/kg KG)





7 weiblich 41,0 26 10,66 10,7


9 weiblich 40,0 26 10,40 10,4

10 weiblich 44,0 26 11,44 11,4


12 weiblich 46,0 26 11,96 12,0

KG = Körpergewicht

70


3.4.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat, Blut, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe

Lungen-Mikrodialysat und Blut

Die Entnahme von Lungen-Mikrodialysat und Blut erfolgte analog zu Versuch 1 (siehe Kapitel 3.3.5).

ELF

Nach intravenöser Applikation von Cefrom® wurden ELF-Proben zu den folgenden Zeitpunk-

ten mittels Blättchenmethode von narkotisierten Schweinen entnommen: vor der Behandlung,

sowie 20 Minuten, 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Behandlung. Vor der Entnahme der ELF

wurden Filterpapierblättchen auf eine Größe von circa 1 mal 2,5 Zentimeter zurechtgeschnitten.

Je 2 Blättchen wurden in einem individuell gekennzeichneten Plastikbehälter verschlossen und

die Behälter wurden inklusive der Blättchen gewogen. Die Entnahme der ELF wurde wie folgt

durchgeführt:

Der Endotrachealtubus, durch welchen die Schweine künstlich beatmet wurden, besaß am kra-

nialen Ende 2 Öffnungen. Eine Öffnung war mit dem Beatmungsgerät verbunden, durch die

andere Öffnung wurde ELF entnommen. Vor der Entnahme wurde der Endotrachealtubus in

die Bronchien vorgeschoben bis ein Widerstand auftrat. Um den Tubus zu reinigen wurde ein

Baumwolltupfer in der Klemme einer endoskopischen Fasszange befestigt (siehe Abbildung 16)

und die Fasszange wurde bis zum distalen Ende des Tubus vorgeschoben und wieder herausgezo-

gen. Danach wurde ein vorgewogenes Filterpapierblättchen aus einem Plastikbehälter entnom-

men und in der Klemme der Fasszange befestigt und die Fasszange wurde durch den Tubus in

die Bronchien vorgeschoben bis ein Widerstand auftrat. Das Blättchen verblieb circa 1 Minute

lang auf der Bronchialschleimhaut. Dann wurde die Fasszange mit dem Blättchen aus dem Tier

entfernt und das Blättchen wurde wieder in seinem Plastikbehälter verschlossen. Dieser Vorgang

wurde pro Probenentnahmezeitpunkt viermal durchgeführt um 4 mit ELF getränkte Filterpa-

pierblättchen pro Probenentnahmezeitpunkt zu erhalten (2 Behälter [A und B] mit je 2 Blätt-

chen). Die Plastikbehälter wurden innerhalb 1 Stunde nach der Entnahme in eine Gefriertruhe

verbracht. Die Proben wurden bis zur Analyse bei minus 70 bis minus 80 Grad Celsius gelagert.

Vor der Analyse wurde die Menge an ELF aus 2 Blättchen pro Behälter durch Wiegen jedes Be-

hälters und Subtraktion des vor der Entnahme protokollierten Gewichts bestimmt.

Lungengewebe

Nach Einschläfern der Tiere durch Blutentzug, Entnahme der Lunge, pathologisch-makrosko-

pischer Untersuchung und Probenentnahmen zwecks histologischer Untersuchungen wurden

die Trachea, die großen Bronchien und benachbarte Gewebe entfernt und das gesamte restliche

Lungengewebe wurde unter Zugabe von etwas Trockeneis in einem Mixer homogenisiert. 4

Aliquots (A, B, C, D) von je 20 Gramm wurden pro homogenisierter Lunge entnommen und in

71


individuell gekennzeichneten Plastikbehältern verschlossen. Die Plastikbehälter wurden inner-

halb 1 Stunde nach der Entnahme in eine Gefriertruhe verbracht. Die Proben wurden bis zur

Analyse bei minus 70 bis minus 80 Grad Celsius gelagert.


Filterpapier Rundfilter® (Schleicher & Schuell, Dassel)

Plastikbehälter Reagenz- und Zentrifugenröhrchen®, (Filterpapierblättchen) 11,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht)

Endoskopische Fasszange Endo-Technik® (W. Griesaud GmbH, Solingen)

Mixer Robot Coupe Typ R4® (Firma Robot Coupe, Saarbrücken)

Plastikbehälter Becher mit Schraubdeckel® 100 ml (Lungenhomogenat) (Sarstedt, Nümbrecht)

Abb. 16: Endoskopische Fasszange und Tupfer zur Reinigung des Tubus

72


3.4.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben

Pathologisch-makroskopische Untersuchung

Nach Einschläfern der Tiere wurde der Brustkorb eröffnet und die Brusthöhle und die Lunge

begutachtet, sowie der Sitz des Katheters im Lungengewebe überprüft. Dann wurde der Kathe-

ter am Schaft durchtrennt und die Lunge wurde vorsichtig aus dem Brustkorb gelöst, wobei die

Membran und ein Teil des Schafts des Katheters sich immer noch im Lungengewebe befanden.

Nun wurden die pulmonale Pleura und das Lungengewebe makroskopisch untersucht, wobei der

Einstichkanal und das die Membran direkt umgebende Gewebe intensiv begutachtet wurden.

Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben

Im Verlauf der pathologisch-makroskopischen Untersuchung wurden von der Einstichstelle

des Katheters und gegebenenfalls von anderen auffälligen Arealen der Lunge Gewebeproben

entnommen. Diese wurden sofort in mit Formalin gefüllten Plastikbehältern verschlossen. Die

Proben wurden nach mindestens 24-stündiger Fixierung mit einem Mikrotom-Messer zurecht-

geschnitten und in Gewebekapseln verbracht, welche in Formalin gelagert wurden. Im Veterinär-

Pathologischen Institut der Justus-Liebig-Universität Giessen wurden mit Hämatoxylin-Eosin

gefärbte histologische Schnitte angefertigt. Die histologischen Schnitte konnten nun mikrosko-

pisch untersucht werden.

Verwendete Geräte, Materialien und Reagenzien

Mikroskop Olympus CH 2® (Olympus, Hamburg)Plastikbehälter Becher mit Schraubdeckel® 120 ml (VWR-International GmbH, Darmstadt) Gewebekapseln Biopsie-Einbettkasetten® (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe)Formalin Formalin 10% v/v®

(Fisher Scientific, Schwerte)


Nach den letzten Probenentnahmen von Mikrodialysat, Blut und ELF (8 Stunden nach Behand-

lung mit Cefrom®) wurden die in tiefer Narkose befindlichen Tiere schmerzfrei durch Blutent-

zug getötet.

73



3.5.1 VersuchsablaufAblauf des gesamten Versuchs

Ablauf eines Versuchstages bei Einschläfern 8 h nach Behandlung


1 Schwein pro Versuchstag: OP, Behandlung, Probenentnahme

Einschläfern pathologische Un-tersuchung 8 h nach Behandlung

(n=4) oder 2 (n=1), 3 (n=1), 4 (n=1), 5 (n=1) d nach Behandlung


Wiegen Sedation Narkose-einleitung OP-Vorbereitung prä-anästhetische

Untersuchung


Behandlung

Homogenisierung des Lungengewebes

pathologisch-makroskopische Untersuchung der Lunge + Entnahme histologischer Proben

Verschluss des Thorax Ausleitung

der Narkose

Entnahme Mikrodialysat (alle 20 min bis 8 h nach Behandlung) und Blut (20 min, 1, 2, 4, 6,

8 h nach Behandlung) von wachen TierenBehandlung


Leerwertentnahme Mikrodialysat, Blut

Spülen Katheter

Eröffnung Thorax

74


Ablauf bei Einschläfern 2, 3, 4 oder 5 d nach Behandlung

3.5.2 Narkose, Aufwachphase und post-anästhetische Überwachung

Die prä-anästhetische Untersuchung und Sedation, die Narkoseeinleitung und die Aufrechter-

haltung der Narkose, sowie die Überwachung der Tiere während der Narkose wurden in Versuch

3 mit Ausnahme der im Folgenden beschriebenen Abweichungen analog zu Versuch 1 und 2

durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.2). Den Schweinen wurde kein Muskelrelaxans appliziert. Nach

Verschluss des Thorax wurde die Narkose ausgeleitet. Um eine lückenlose peri- und postope-

rative Analgesie zu gewährleisten wurde den Tieren nach Unterbrechung der intravenösen Ap-

plikation der Fentanyl-Injektioslösung ein Fentanyl-Pflaster am Ohrgrund aufgeklebt. Während

der Aufwachphase wurden die folgenden Parameter alle 15 Minuten bestimmt: Sauerstoffsätti-

gung, Blutdruck, Herzfrequenz und Herzrythmus, Frequenz und Qualität der Atmung, Körper-

temperatur, sowie Farbe, Feuchtigkeit und kapilläre Rückfüllzeit der Schleimhäute. Nach der

Aufwachphase wurden die Tiere bis zur letzten Probennetnahme (8 Stunden nach Behandlung)

alle 30 Minuten klinisch untersucht. Die Untersuchung umfasste die Bestimmung von Herzfre-

quenz und Herzrythmus, Frequenz und Qualität der Atmung, der Körpertemperatur, sowie Far-

be, Feuchtigkeit und kapillärer Rückfüllzeit der Schleimhäute. Diejenigen Tieren, welche nicht

Wiegen Sedation Narkose-einleitung OP-Vorbereitung prä-anästhetische

Untersuchung

BehandlungLeerwertentnahme Mikrodialysat, Blut


Spülen Katheter

Eröffnung Thorax

Einschläfern2, 3, 4 oder 5 d

nach Behandlung

Homogeni-sierung des

Lungengewebes

pathologisch-makroskopische Untersuchung der Lunge +

Entnahme histologischer Proben

Überwachung der Tiere

Verschluss des Thorax Ausleitung

der Narkose

Entnahme Mikrodialysat (alle 20 min bis 8 h nach Behandlung) und Blut (20 min, 1, 2, 4, 6,

8 h nach Behandlung) von wachen Tieren

Entfernung des Katheters 8 h

nach Behandlung

75


8 Stunden nach Behandlung eingeschläfert wurden, wurden weiterhin alle 4 Stunden bis 12

Stunden nach Entfernung des Katheters (8 Stunden nach Behandlung) und dann zweimal täglich

bis zur Euthanasie klinisch untersucht.

Zur postoperativen Analgesie verwendetes Medikament

Fentanyl-Pflaster Fentanyl-Pflaster 100 µg/h®

(Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel)

3.5.3 Thorakotomie und Implantation des Mikrodialysekatheters

Die Eröffnung der Brusthöhle, die Implantation des Katheters in das Lungengewebe und der Ver-

schluss des Thorax wurde analog zu Versuch 2 durchgeführt (siehe Kapitel 3.3.3 und 3.4.3). Nach

Verschluss des Thorax, Ausleitung der Narkose und Extubation wurden die Schweine bis zur letz-

ten Probenentnahme in einen modifizierten Metabolismuskäfig verbracht (siehe Abbildung 17).


Die Applikation von Cefrom® erfolgte analog zu Versuch 1 und 2, wie in Kapitel 3.3.4 beschrie-

ben. In Tabelle 6 sind die Applikationsvolumina der einzelnen Tiere aufgelistet.


KG = Körpergewicht


Dosierung(mg/kg KG)



13 männlichkastriert 26 11,05 11,1




17 weiblich 42,0 26 10,92 10,9

18 weiblich 45,0 26 11,70 11,7

19 weiblich 40,5 26 10,53 10,5

20 weiblich 48,0 26 12,48 12,5

42,5

76


3.5.5 Entnahme und Verarbeitung von Lungen-Mikrodialysat und Blut

Lungen-Mikrodialysat

Die Entnahme von Lungen-Mikrodialysat wurde mit Ausnahme der folgenden Abweichungen

analog zu Versuch 1 und 2 (siehe Kapitel 3.3.5 und 3.4.5) durchgeführt: Die Baseline-Sammel-

periode und die Probenentnahme 20 Minuten nach Behandlung erfolgte zeitgleich mit dem Ver-

schluss des Thorax und Ausleitung der Narkose und wurde demnach in narkotisierten Schweinen

durchgeführt. Die folgenden Proben (40 Minuten bis 8 Stunden nach Behandlung) wurden von

wachen Schweinen entnommen. Die beabsichtige Flussrate des Perfusats von 1,5 Mikroliter pro

Minute wurde während des Probenentnahmezeitraumes bei den Tieren Nr. 13, 16, 17, 18 und 20

auf Grund variierender Probenvolumina (unter 30 Mikroliter) zeitweise adaptiert. Die Flussraten

wurden während der Probenentnahmezeiträume der einzelnen Tiere wie folgt eingestellt:

• Tiere Nr. 14, 15, 19:

1,5 µl/min während des gesamten Probenentnahmezeitraumes

• Tier Nr. 13:

bis 100 min nach Behandlung 1,5 µl/min, 100 bis 480 min nach

Behandlung 3,2 µl/min

• Tier Nr. 16:


Behandlung 4,1 µl/min, 220 bis 240 min nach Behandlung 3,5 µl/

min, 240 bis 380 min nach Behandlung 2,6 µl/min, 380 bis 480 min

nach Behandlung 1,5 µl/min

• Tier Nr. 17:


Behandlung 2,6 µl/min, 140 bis 200 min nach Behandlung 3,2 µl/

min, 200 bis 280 min nach Behandlung 2,6 µl/min, 280 bis 300 min

nach Behandlung 3,2 µl, 300 bis 440 min nach Behandlung 2,6

µl/min, 440 bis 480 min nach Behandlung 1,5 µl/min

• Tier Nr. 18:


Behandlung 2,6 µl/min, 140 bis 220 min nach Behandlung 3,2 µl,

220 bis 240 min nach Behandlung 2,6 µl/min, 240 bis 300 min

nach Behandlung 3,2 µl/min, 300 bis 380 min nach Behandlung

77


2,6 µl/min, 380 bis 420 min nach Behandlung 3,2 µl/min, 420 bis

480 min nach Behandlung 2,6 µl/min

• Tier Nr. 20:


Behandlung 2,6 ml/min, 220 bis 480 min nach Behandlung

1,5 µl/min

Nach den letzten Probenentnahmen 8 Stunden nach Behandlung wurde der Mikrodialysekathe-

ter aus Lunge und Thorax der Tiere Nr. 13, 15, 18 und 19 herausgezogen und die Tiere wurden

in Einzelbuchten verbracht.

Blut

Die Entnahme von Blut erfolgte in wachen Schweinen, aber abgesehen davon analog zu Versuch

1 und 2 (siehe Kapitel 3.3.5).

Abb. 17: Mikrodialyseversuch im wachen Schwein

78


3.5.6 Pathologisch-makroskopische Untersuchung und Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben

Pathologisch-makroskopische Untersuchung

Die Überprüfung des Sitzes des Katheters im Lungengewebe, sowie die makroskopische Unter-

suchung des Brustkorbs und der Lunge der Tiere Nr. 14, 16, 17 und 20 nach Einschläfern durch

Blutentzug 8 Stunden nach Behandlung erfolgte analog zu Versuch 1 (siehe Kapitel 3.4.6). Die

Tiere Nr. 19, 15, 18 und 13 wurden jeweils 2, 3, 4 oder 5 Tage nach Behandlung schmerzfrei

durch Blutentzug getötet und auch hier wurde eine makroskopische Untersuchung durchge-

führt.

Entnahme, Bearbeitung und Untersuchung von Gewebeproben

In Versuch 3 wurden bei allen 8 Tieren histologische Proben analog zu Versuch 2 entnommen,

verarbeitet und untersucht (siehe Kapitel 3.4.6).


Die in tiefer Narkose befindlichen Tiere Nr. 14, 16, 17 und 20 wurden nach den letzten Proben-

entnahmen von Mikrodialysat und Blut (8 Stunden nach Behandlung mit Cefrom®) schmerzfrei

durch Blutentzug getötet. Die Tiere Nr. 19, 15, 18 und 13 wurden jeweils 2, 3, 4 oder 5 Tage

nach Behandlung mit Cefrom® mit einer Elektrozange betäubt und ebenfalls schmerzfrei durch

Blutentzug getötet.

79


3.6 Aufarbeitung und Analyse der Proben

3.6.1 Analytische Methode

Alle Proben, das heißt Mikrodialysat-Proben und Proben der Stammlösungen aus den In-vitro-

Wiederfindungsversuchen, Lungen-Mikrodialysat-Proben, Blutplasma-Proben, ELF-Proben und

Lungenhomogenat-Proben aus den In-vivo-Versuchen, wurden qualitativ und quantitativ mittels

online-SPE gekoppelt mit HPLC und MS/MS (SPE-HPLC-MS/MS) unter Verwendung eines

internen Standards (Cefquinom) analysiert. Zur isokratischen Elution der HPLC wurden Metha-

nol (HPLC-Grade) und Essigsäure (0,1 Prozent) als Fließmittel eingesetzt. Die Injektion erfolgte

mit einem Probenschleifen-System. Die Füllung der Trennsäule bestand aus unpolar modifiziertem

Kieselgel (Reversed-Phase-Material). Die Detektion erfolgte mittels MS/MS; Tripelquad-System

mit Eletrospray-Ionisation und Selected Reaction Monitoring (SRM). Für jede analytische Se-

quenz wurde eine Kalibrierkurve (Mikrodialysat-Proben) beziehungsweise eine Matrixkalibrier-

kurve (Blutplasma-, ELF-, Lungenhomogenat-Proben) erstellt. Die Analyse wurde kontrolliert

und überwacht durch Verwendung von 6 Qualitätskontrollproben (3 Konzentrationslevel mit je

2 Kontrollproben) innerhalb jeder analytischen Sequenz. Für die Qualitätskontrollproben wurde

eine Abweichung von ± 30 Prozent akzeptiert. Mindestens 4 der 6 Qualitätskontrollproben muss-

ten innerhalb dieses Bereichs liegen, wobei die beiden Qualitätskontrollproben, welche außerhalb

des festgelegten Bereichs liegen, nicht denselben Konzentrationslevel haben durften.

Verwendete Geräte, Chemikalien und Lösungsmittel

Online-SPE Prospekt® (Spark, Emmen, Niederlande)

HPLC Surveyor® (Thermo Fisher Scientific, Reinach)

MS TSQ 7000 Triple Quadrupol® (Thermo Fisher Scientific, Reinach)

Cefquinom Cefquinom Sulfat (ACS Dobfar, Tribiano, Italien)

Methanol (Fisher Scientific, Schwerte)

Essigsäure Suprapur® (Merck, Darmstadt)

Reinstwasser Milli-Q-Wasser® (Fisher Scientific, Schwerte)

80


3.6.2 Mikrodialysat-Proben und Proben der Stammlösungen aus den Wiederfindungs- versuchen und Lungen-Mikrodialysat-Proben

Die Aufarbeitung der Proben wurde wie folgt durchgeführt: Den im Probensammelgefäß be-

findlichen Mikrodialysat-Proben aus den Wiederfindungsversuchen und den Lungen-Mikrodi-

alysat-Proben aus den Versuchen 1 und 2 (Probenvolumen 30 Mikroliter) wurden je 125 Mi-

kroliter interne Standardlösung 1 (ISL 1) zugegeben. Dann wurde das gesamte Volumen in ein

Mikro-HPLC-Vial überführt und mittels Vortex kurz durchmischt. Von den Lungen-Mikrodia-

lysat-Proben aus Versuch 3 wurden je 10 Mikroliter in ein Mikro-HPLC-Vial überführt. In eini-

gen Fällen war das Probenvolumen sehr gering, so dass lediglich 5 Mikroliter überführt werden

konnten; hier wurden dann 5 Mikroliter entgaste Ringerlösung zugegeben. Nach Zugabe von

150 Mikroliter ISL 1 wurden die Proben ebenfalls durchmischt. Den Proben der Stammlösungen

im Mikro-HPLC-Vial (Probenvolumen 30 Mikroliter) wurden je 125 Mikroliter ISL 1 zugege-

ben und auch diese wurden kurz durchmischt. Die Kalibrierkurve wurde im Bereich von 0,01

bis 50 Mikrogramm Cefpirom je Milliliter erstellt, indem Cefpirom zunächst in Reinstwasser

gelöst wurde und nach entsprechender Verdünnung 30 Mikroliter einer Verdünnungsstufe je 125

Mikroliter ISL 1 (Versuch 1 und 2), beziehungsweise 10 Mikroliter einer Verdünnungsstufe je

150 Mikroliter ISL 1 (Versuch 3) zugegeben wurden. Die Konzentrationen der Qualitätskont-

rollproben betrugen 0,1, 2 und 40 Mikrogramm Cefpirom je Milliliter. Die Qualitätskontroll-

proben wurden ebenfalls hergestellt durch Lösen von Cefpirom in Reinstwasser, entsprechender

Verdünnung und Zugabe von 30 Mikroliter einer Verdünnungsstufe zu je 125 Mikroliter ISL

1 (Versuch 1 und 2), beziehungsweise Zugabe von 10 Mikroliter einer Verdünnungsstufe zu je

150 Mikroliter ISL 1 (Versuch 3). Das Injektionsvolumen in der HPLC betrug 70 Mikroliter bei

einem Eluentenfluss von 300 Mikroliter pro Minute. Die untere Quantifizierungsgrenze lag bei

0,01 Mikrogramm pro Milliliter für die Proben aus den Wiederfindungsversuchen und für die

Lungen-Mikrodialysat-Proben aus den Versuchen 1 und 2; für die Lungen-Mikrodialysat-Proben

aus Versuch 3 lag die untere Quantifizierungsgrenze bei 0,05 Mikrogramm pro Milliliter.

Verwendete Geräte und Lösungen

Vortex Reaxtop®

(Heidolph, Schwabach)

ISL 1 5 µg Cefquinom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,01; 0,1; 0,5; 2,5; 10; 50 Matrixkalibrierkurve µg Cefpirom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,1; 2; 40 µg Cefpirom/mlQualitätskontrollproben Reinstwasser

81


3.6.3 Blutplasma-Proben

Die Aufarbeitung der Proben (A Aliquote) wurde wie folgt durchgeführt: Jeweils 200 Mikroliter

einer Plasma-Probe wurden in ein Plastikröhrchen überführt und es wurden 20 Mikroliter inter-

ne Standardlösung 1 (ISL 1) zugegeben. Es folgte eine kurze Durchmischung mittels Vortex. Nun

wurden je 400 Mikroliter Acetonitril und Reinstwasser zugegeben. Es folgte erneut eine kurze

Durchmischung mittels Vortex. Dann wurden die Proben bei 10 Grad Celsius und 3300 RZB

circa 10 Minuten lang zentrifugiert. Je 100 Mikroliter des Überstandes wurden in ein HPLC-Vial

überführt und in 900 Mikroliter Essigsäure (0,1 Prozent) gelöst und mittels Vortex durchmischt.

Die Matrixkalibrierkurve wurde im Bereich von 0,15 bis 100 Mikrogramm Cefpirom je Millili-

ter Plasma erstellt, indem Cefpirom zunächst in Reinstwasser gelöst und entsprechend verdünnt

wurde und jeweils 20 Mikroliter einer Verdünnungsstufe und 20 Mikroliter ISL 1 je 200 Mikroli-

ter Blank-Plasma zugegeben wurden. Die Konzentrationen der Qualitätskontrollproben betrugen

0,5, 10 und 80 Mikrogramm Cefpirom je Milliliter Plasma. Die Qualitätskontrollproben wurden

ebenfalls hergestellt durch Lösen von Cefpirom in Reinstwasser, entsprechender Verdünnung und

Zugabe von 20 Mikroliter einer Verdünnungsstufe zu je 20 Mikroliter ISL 1 und 200 Mikroliter

Blank-Plasma. Die Proben der Matrixkalibrierkurve und die Qualitätskontrollproben wurden

analog zu den Blutplasma-Proben aus den Versuchen aufgearbeitet. Das Injektionsvolumen in

der HPLC betrug 250 Mikroliter bei einem Eluentenfluss von 300 Mikroliter pro Minute. Die

untere Quantifizierungsgrenze für Blutplasma lag bei 0,015 Mikrogramm pro Milliliter.

Verwendete Geräte, Reagenzien und Lösungen

Zentrifuge Rotana 46R® (Hettich, Tuttlingen)

Acetonitril (Fisher Scientific, Schwerte)

Lösungen der 0,15; 0,3; 0,5; 1; 5; 10; 20; 40; 100Matrixkalibrierkurve µg Cefpirom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,5; 10; 80 µg Cefpirom/ml Qualitätskontrollproben Reinstwasser

82


3.6.4 Proben von Sekret des Bronchialepithels

Vor der Probenaufarbeitung und Analyse wurde, wie bereits in Kapitel 3.4.5 beschrieben, die

Menge an ELF aus 2 Blättchen pro Behälter durch Wiegen jedes Behälters und Subtraktion

des vor der Entnahme protokollierten Gewichts bestimmt. Die Aufarbeitung der Proben wurde

wie folgt durchgeführt: 2 Blättchen in 1 Behälter wurden jeweils 20 Mikroliter interne Stan-

dardlösung 2 (ISL 2), 20 Mikroliter Reinstwasser und je 2 Milliliter Acetonitril und Essigsäure

(0,1 Prozent) zugegeben. Es folgte eine kurze Durchmischung mittels Vortex. Dann wurden die

Proben bei 10 Grad Celsius und 3300 RZB circa 10 Minuten lang zentrifugiert. Je 75 Mikroliter

des Überstandes wurden in ein HPLC-Vial überführt und in 1425 Mikroliter Essigsäure (0,1

Prozent) gelöst und mittels Vortex durchmischt. Die Matrixkalibrierkurve wurde im Bereich

von 0,15 bis 100 Mikrogramm Cefpirom je Gramm ELF erstellt, indem Cefpirom zunächst in

Reinstwasser gelöst und entsprechend verdünnt wurde und jeweils 20 Mikroliter einer Verdün-

nungsstufe und 20 Mikroliter ILS 2 2 Blank-ELF-Blättchen zugegeben wurden. Die weitere

Aufarbeitung erfolgte analog zu den Blättchen aus den Versuchen. Die Konzentrationen der

Qualitätskontrollproben betrugen 0,4, 4 und 40 Mikrogramm Cefpirom je Gramm ELF. Die

Qualitätskontrollproben wurden ebenfalls hergestellt durch Lösen von Cefpirom in Reinstwasser,

entsprechender Verdünnung und Zugabe von jeweils 20 Mikroliter einer Verdünnungsstufe und

20 Mikroliter ILS 2 zu 2 Blank-Blättchen. Auch hier erfolgte die weitere Aufarbeitung analog zu

den Blättchen aus den Versuchen. Das Injektionsvolumen in der HPLC betrug 250 Mikroliter

bei einem Eluentenfluss von 300 Mikroliter pro Minute. Die untere Quantifizierungsgrenze für

ELF lag bei 0,015 Mikrogramm pro Milliliter.

Verwendete Lösungen

ISL 2 7,5 µg Cefquinom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,15; 0,3; 0,5; 1; 5; 10; 20; 40; 100Matrixkalibierkurve µg Cefpirom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,4, 4, 40 µg Cefpirom/ml Reinst-

Qualitätskontrollproben wasser

83


3.6.5 Lungenhomogenat-Proben

Die Aufarbeitung der Proben (A und B Aliquote) wurde wie folgt durchgeführt: 1 Gramm jeder

Probe wurde in je ein Glasröhrchen überführt. Nun wurden 100 Mikroliter interne Standard-

lösung 1 (ISL 1), 3 Milliliter Acetonitril und 2 Milliliter Reinstwasser zugegeben. Das Gemisch

wurde circa 45 Sekunden lang mittels Ultra Turrax homogenisiert, wobei der Ultra Turrax nach

jeder Probe mit Wasser und Ethanol gereinigt wurde. Es folgte eine Durchmischung mittels Vor-

tex für 15 Minuten. Dann wurden die Proben bei 10 Grad Celsius und 3300 RZB circa 15 Mi-

nuten lang zentrifugiert. Anschließend wurden 2 Milliliter des Überstandes in ein Glasröhrchen

überführt und bei 50 Grad Celsius und 5 bis 6 Psi mittels Nitrogen-Druckstrom getrocknet. Die

getrocknete Matrix wurde mit 2 Milliliter Essigsäure (0,1 Prozent) versetzt und es folgte eine

Durchmischung mittels Vortex. Nun wurden die Proben durch einen Spritzenfilter (Porengröße

0,45 Mikrometer) in eine HPLC-Vial gefiltert. Die Matrixkalibrierkurve wurde im Bereich von

0,15 bis 100 Mikrogramm Cefpirom je Gramm Lungengewebe erstellt, indem Cefpirom zu-

nächst in Reinstwasser gelöst und entsprechend verdünnt wurde und jeweils 100 Mikroliter einer

Verdünnungsstufe und 100 Mikroliter ISL 1 je 1 Gramm Blank-Lungenhomogenat zugegeben

wurden. Die Konzentrationen der Qualitätskontrollproben betrugen 0,5, 10 und 80 Mikrogramm

Cefpirom je Gramm Lungengewebe. Die Qualitätskontrollproben wurden ebenfalls hergestellt

durch Lösen von Cefpirom in Reinstwasser, entsprechender Verdünnung und Zugabe von 100

Mikroliter einer Verdünnungsstufe und je 100 Mikroliter ISL 1 zu 1 Gramm Blank-Lungenho-

mogenat. Die Proben der Matrixkalibrierkurve und die Qualitätskontrollproben wurden analog

zu den Lungenhomogenat-Proben aus den Versuchen aufgearbeitet. Das Injektionsvolumen in

der HPLC betrug 500 Mikroliter bei einem Eluentenfluss von 300 Mikroliter pro Minute. Die

untere Quantifizierungsgrenze für Lungenhomogenat lag bei 0,015 Mikrogramm pro Milliliter.

Verwendete Geräte und Lösungen

Ultra Turrax TH® (Omni, Marietta, U.S.A.)

Evaporator Zymark Turbovap® (GenTech Scientific, New York, U.S.A.)

Lösungen der 0,15; 0,3; 0,5; 1; 5; 10; 20; 40; 100Matrixkalibierkurve µg Cefpirom/ml Reinstwasser

Lösungen der 0,5; 10; 80 µg Cefpirom/ml Reinst- Qualitätskontrollproben wasser

84


3.7 Berechnungen und statistische Auswertung

3.7.1 Relative Wiederfindung der Mikrodialysekatheter

Die relative Wiederfindung wurde für jeden Katheter für 3 verschiedene bekannte Konzentratio-

nen zu je 3 Zeitpunkten (nach 20, 40 und 60 Minuten) bestimmt. Um die exakte Konzentration

von Cefpirom in den Stammlösungen zu erhalten, wurden von jeder der 3 Stammlösungen 2

Proben entnommen, der Gehalt an Cefpirom bestimmt und ein Mittelwert (n=2) aus den ge-

messenen Konzentrationen einer Stammlösung gebildet. Dann wurde die relative Wiederfindung

für jeden Zeitpunkt und jede Konzentration (3 Konzentrationen mit je 3 Zeitpunkten) mit Hilfe

der Cefpirom-Konzentrationen in den Stammlösungen und den im Mikrodialysat gemessenen

Konzentrationen wie folgt berechnet:

Die relative Wiederfindung eines Katheters wurde durch Bildung des arithmetischen Mittelwerts

(n=9) bestimmt.

3.7.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe

EZF

Mit Hilfe der für jeden Mikrodialysekatheter bestimmten relativen Wiederfindung und den im

Lungen-Mikrodialysat gemessenen Konzentrationen konnten die Konzentrationen von Cefpi-

rom in der EZF der Lunge wie folgt berechnet werden:

rW = × 100

[rW] = %

[Cefpirom - KonzentrationMikrodialysat

] = µg/ml

[Cefpirom - KonzentrationStammlösung

] =

µg/ml

Cefpirom - KonzentrationMikrodialysat

Cefpirom - KonzentrationStammlösung

85


Cefpirom - KonzentrationEZF

= × 100

[rW] = %

[Cefpirom - KonzentrationEZF

] = µg/ml

[Cefpirom - KonzentrationLungen-Mikrodialysat

] =

µg/ml

Cefpirom - KonzentrationLungen-Mikrodialysat

rW

Für jeden Versuch (Versuch 1, 2 und 3) wurden pro Probenentnahmezeitpunkt der arithmetische

Mittelwert (MW) und die Standardabweichung (Standard Deviation [SD]) der im jeweiligen

Versuch bestimmten Cefpirom-Konzentrationen in der EZF berechnet. Für die Versuche 2 und 3

wurden pro Probenentnahmezeitpunkt zusätzlich der Maximal- und Minimalwert, sowie 1. und

3. Quartil und der Medianwert berechnet.

Blutplasma

Für jeden Versuch (Versuch 1, 2 und 3) wurden pro Probenentnahmezeitpunkt der arithmetische

Mittelwert und die Standardabweichung der im jeweiligen Versuch gemessenen Cefpirom-Kon-

zentrationen im Blutplasma berechnet. Für die Versuche 2 und 3 wurden pro Probenentnahme-

zeitpunkt zusätzlich der Maximal- und Minimalwert, sowie 1. und 3. Quartil und der Median-

wert berechnet.

ELF

Bezüglich der ELF-Proben aus Versuch 2 wurde für jeden Probenentnahmezeitpunkt der arith-

metische Mittelwert aus den gemessenen Cefpirom-Konzentrationen der Blättchen von Behälter

A und B gebildet. Des Weiteren wurde pro Probenentnahmezeitpunkt der arithmetische Mittel-

wert und die Standardabweichung, sowie der Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und

der Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Mittelwert aus Behälter A und B)

berechnet.

Lungengewebe

Bezüglich der Lungenhomogenat-Proben aus Versuch 2 wurde für jeden Probenentnahmezeit-

punkt der arithmetische Mittelwert aus den in Aliquot A und B gemessenen Cefpirom-Kon-

zentrationen gebildet. Des Weiteren wurden pro Probenentnahmezeitpunkt der arithmetische

Mittelwert und die Standardabweichung, sowie der Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quar-

til und der Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen im Lungenhomogenat (Mittelwert aus

Aliquot A und B) berechnet.

Die Berechnungen und die Erstellung von Graphiken erfolgten mit Hilfe des Computerpro-

gramms Microsoft Office Excel 2003.

86


3.7.3 Statistische Testverfahren

Die statistischen Testverfahren wurden mit Hilfe des Computerprogramms SAS (Version 9.1.3)

durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf α=0,05 festgesetzt. Zum Vergleich der Konzen-

trations-Zeitprofile von Cefpirom in den einzelnen Matrices und Versuchen wurde eine Vari-

anzanalyse mit wiederholten Beobachtungen durchgeführt. Miteinander verglichen wurden die

Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lunge aus Versuch 1 und 2, sowie die

Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lunge aus Versuch 2 und 3. Bei diesen

paarweisen Vergleichen waren die Zeit und die Interaktion Zeit/ Versuch die Intra-Subjekt-Fak-

toren und der Versuch war der Inter-Subjekt-Faktor. Zusätzlich wurde für die Konzentrationen

von Cefpirom in der EZF der Lunge, im Blutplasma und in der ELF aus Versuch 2 (eingeschränkt

auf die Probenentnahmezeitpunkte 20, 60, 120, 240, 360 und 480 Minuten nach Behandlung) ein

globaler Vergleich der Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in den 3 Matrices durchgeführt.

Hierbei waren die Zeit und die Interaktion Zeit/ Matrix die Intra-Subjekt-Faktoren und die

Matrix war der Inter-Subjekt-Faktor. Da hierbei alle Effekte mit einem p-Wert von p <0,0001

hochsignifikant waren, wurden anschließend die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in

den einzelnen Matrices paarweise miteinander verglichen (Vergleich der Konzentrations-Zeit-

profile von Cefpirom in der EZF der Lunge und im Blutplasma, in der EZF und in der ELF, im

Blutplasma und in der ELF). Weiterhin wurden die Konzentrationen von Cefpirom in der EZF

der Lunge, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe am Probenentnahmezeitpunkt

8 Stunden (480 Minuten) nach Behandlung (Versuch 2) mittels eines multiplen Testverfahrens

(Step-Down-Verfahren von Ryan-Einot-Gabriel-Welsch, Signifikanzniveau α=0,05) paarweise

miteinander verglichen.

3.7.4 Pharmakokinetische Parameter

Die pharmakokinetische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Pharsight

WinNonlin Professional (Version 5.2.1), wobei die pharmakokinetischen Parameter mittels

nicht-kompartimenteller Analyse (Non Compartemental Analysis [NCA] Model 201 – Bolus

IV Input für Plasma Daten) berechnet wurden. Eine pharmakokinetische Auswertung wurde für

Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma (Versuch 1, 2, 3) der einzelnen Versu-

che, sowie für Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Versuch 2) durchgeführt. Die folgenden

pharmakokinetischen Parameter wurden berechnet:

• Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve bis zum letzten Probenentnah-

mezeitpunkt, an dem die gemessene Konzentration über der Detektionsgren-

ze lag (AUClast

)

• beobachtete Zeitspanne bis zum Erreichen der maximalen Konzentration (Tmax

)

• beobachtete maximale Konzentration (Cmax

).

87

Ergebnisse

4Ergebnisse

88

Ergebnisse

4.1 Versuch 1

4.1.1 Relative Wiederfindung der Katheter Nr. 1 bis 4

Für die Katheter Nr. 1, 2, 3 und 4 wurden die folgenden relativen Wiederfindungen ermittelt:

• Katheter Nr. 1: 90,16 Prozent (Einsatz in die Lunge von Tier Nr. 1)




4.1.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von narkotisierten Schweinen

Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Lunge (nicht-proteingebundene Fraktion)

Alle analytischen Sequenzen erfüllten die festgelegten Akkzeptanzkriterien (siehe Kapitel 3.6.1).

Die untere Quantifizierungsgrenze lag bei 0,01 Mikrogramm pro Milliliter.

Die gemessenen Cefpirom-Konzentrationen im Lungen-Mikrodialysat und die mit Hilfe der

jeweiligen relativen Wiederfindung der verwendeten Katheter berechneten Cefpirom-Kon-

zentrationen in der EZF der Lunge der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnah-

mezeitpunkten sind in Tabelle 7 aufgelistet. Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Lunge

der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten, Mittelwerte (n=4) und

Standardabweichungen sind in Tabelle 8 aufgelistet. In Abbildung 18 sind die Werte aus Tabelle

8 graphisch dargestellt.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) stieg von

6,20 Mikrogramm pro Milliliter (20 Minuten nach Behandlung) auf 8,22 Mikrogramm pro Mil-

liliter (40 Minuten nach Behandlung) an und fiel dann kontinuierlich auf 0,59 Mikrogramm pro

Milliliter (480 Minuten [8 Stunden] nach Behandlung) ab.

89

Ergebnisse

Tab. 7: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

LM = Lungen-MikrodialysatEZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,01 µg/ml)

Tiere Nr. 2, 3, 4 Abdeckung des Thorax mit TupfernTier Nr. 1 Verschluss des Thorax durch Nähte

*während der Baseline-Sammelperiode (1 h vor Behandlung) wurden nach 20, 40 und 60 min Leerwert-Proben entnommen. Die Behandlung mit Cefrom® begann 10 min und endete 5 min vor Entnahme von Leerwert 3, da das Dialysat exakt 4,8 min benö-tigte, um von der Membran zum Probensammelgefäß zu gelan-gen. Da auf 5 min gerundet wurde, wurden in Leerwert 3 niedrige Konzentrationen gemessen.0

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF(µg/ml)

Tier Nr. 1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr. 4

LM EZF LM EZF LM EZF LM EZF

Leerwert 1 NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ


Leerwert 3 0,11* 0,12* NQ NQ NQ NQ 0,11* 0,11*

20 8,65 9,59 3,65 3,27 2,64 3,37 8,33 8,57

40 10,56 11,72 6,85 6,14 3,49 4,45 10,28 10,58

60 9,87 10,95 6,77 6,07 3,22 4,11 9,83 10,12

80 8,73 9,69 6,45 5,79 2,69 3,43 8,43 8,68

100 7,72 8,57 3,37 3,02 2,33 2,97 7,53 7,75

120 6,91 7,66 4,56 4,09 2,10 2,68 6,67 6,86

140 6,23 6,91 4,52 4,05 1,74 2,22 6,17 6,35

160 5,54 6,15 3,97 3,56 1,51 1,92 5,43 5,59

180 4,99 5,53 3,30 2,96 1,22 1,55 4,88 5,02

200 4,80 5,33 2,91 2,61 1,03 1,31 4,63 4,76

220 4,00 4,44 2,58 2,31 0,93 1,18 3,93 4,04

240 3,49 3,87 2,16 1,93 0,81 1,04 3,47 3,57

260 3,19 3,54 1,87 1,68 0,69 0,89 3,13 3,22

280 2,86 3,18 1,59 1,43 0,60 0,76 2,78 2,86

300 2,57 2,85 1,36 1,22 0,49 0,63 2,53 2,60

320 2,32 2,57 1,05 0,94 0,42 0,53 2,28 2,35

340 2,04 2,26 1,06 0,95 0,35 0,44 2,03 2,09

360 1,90 2,10 0,89 0,80 0,32 0,41 1,89 1,95

380 1,55 1,71 0,80 0,72 0,28 0,35 1,55 1,59

400 1,46 1,62 0,68 0,61 0,24 0,31 1,46 1,50

420 1,25 1,39 0,59 0,53 0,23 0,29 1,26 1,29

440 1,19 1,32 0,53 0,48 0,19 0,24 1,19 1,23

460 1,01 1,12 0,54 0,48 0,17 0,21 1,02 1,05

480 0,84 0,94 0,42 0,38 0,14 0,18 0,83 0,86

90

Ergebnisse

Tab. 8: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standardabweichungen in der EZF (nicht- proteingebundene Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen in der EZF(µg/ml)

Tier Nr. 1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr. 4 MW SD

Leerwert 1 NQ NQ NQ NQ NQ NQ

Leerwert 2 NQ NQ NQ NQ NQ NQ

Leerwert 3 0,12 NQ NQ 0,11 0,06 0,07

20 9,59 3,27 3,37 8,57 6,20 3,35

40 11,72 6,14 4,45 10,58 8,22 3,48

60 10,95 6,07 4,11 10,12 7,81 3,26

80 9,69 5,79 3,43 8,68 6,90 2,84

100 8,57 3,02 2,97 7,75 5,58 3,00

120 7,66 4,09 2,68 6,86 5,32 2,33

140 6,91 4,05 2,22 6,35 4,88 2,16

160 6,15 3,56 1,92 5,59 4,31 1,94

180 5,53 2,96 1,55 5,02 3,77 1,85

200 5,33 2,61 1,31 4,76 3,50 1,87

220 4,44 2,31 1,18 4,04 2,99 1,52

240 3,87 1,93 1,04 3,57 2,60 1,35

260 3,54 1,68 0,89 3,22 2,33 1,26

280 3,18 1,43 0,76 2,86 2,06 1,15

300 2,85 1,22 0,63 2,60 1,83 1,08

320 2,57 0,94 0,53 2,35 1,60 1,01

340 2,26 0,95 0,44 2,09 1,44 0,88

360 2,10 0,80 0,41 1,95 1,31 0,84

380 1,71 0,72 0,35 1,59 1,09 0,66

400 1,62 0,61 0,31 1,50 1,01 0,65

420 1,39 0,53 0,29 1,29 0,88 0,55

440 1,32 0,48 0,24 1,23 0,82 0,54

460 1,12 0,48 0,21 1,05 0,72 0,44

480 0,94 0,38 0,18 0,86 0,59 0,37

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeMW = MittelwertSD = StandardabweichungNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,01 µg/ml)

91

Ergebnisse

020

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

0

Cefpirom (µg/ml)

1 023456789101112

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Tier

Nr.1

Tier

Nr.2

Tier

Nr.3

Tier

Nr.4

Abb

. 18:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

(nic

ht-p

rote

inge

bund

ene

Frak

tion)

nac

h ei

nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on 2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

1)

92

Ergebnisse

Tab. 9: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standardabweichungen im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma(µg/ml)

Tier Nr. 1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr. 4 MW SD

Leerwert NQ NQ NQ NQ NQ NQ

20 13,58 46,13 40,36 51,07 37,79 16,72

60 39,60 33,06 31,58 37,72 35,49 3,79

120 23,91 26,38 18,07 22,89 22,81 3,48

240 9,61 6,70 4,45 9,66 7,60 2,52

360 2,97 2,99 1,85 4,14 2,99 0,94

480 1,23 1,25 0,74 1,77 1,25 0,42

MW = MittelwertSD = StandardabweichungNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,015 µg/ml)

Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Gesamt-Fraktion)



Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenent-

nahmezeitpunkten, Mittelwerte (n=4) und Standardabweichungen sind in Tabelle 9 aufgelistet.

In Abbildung 19 sind die Werte aus Tabelle 9 graphisch dargestellt.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration im Blutplasma (proteingebundene und nicht-proteinge-

bundene Fraktion [= Gesamt-Fraktion]) fiel von 37,79 Mikrogramm pro Milliliter (20 Minuten

nach Behandlung) kontinuierlich auf 1,25 Mikrogramm pro Milliliter (8 Stunden nach Behand-

lung) ab.

93

Ergebnisse

Abb

. 19:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n im

Blu

tpla

sma

(Ges

amt-

Frak

tion)

nac

h ei

nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefo

rm®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on

26

mg/

kg K

G ( V

ersu

ch 1

)

5 0101520253035404550

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

020

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

0

Tier

Nr.1

Tier

Nr.2

Tier

Nr.3

Tier

Nr.4

94

Ergebnisse

Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im

Blutplasma (Gesamt-Fraktion), sowie das Verhältnis der mittleren Konzentrationen zueinander

zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten sind in Tabelle 10 aufgelistet. In Abbildung

20 sind die Werte aus Tabelle 10 graphisch dargestellt.

Das Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene

Fraktion) zu Blutplasma (Gesamt-Fraktion) stieg von 0,16 (20 Minuten nach Behandlung) auf

0,47 (8 Stunden nach Behandlung) an.

Das Verhältnis der individuellen Cefpirom-Konzentrationen in der EZF zu Blutplasma der ein-

zelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten ist in Tabelle 33 (siehe Kapitel

7.1) aufgelistet.

Tab. 10: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im Blutplasma (Gesamt- Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

Zeit nachBehandlung

(min)

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen (µg/ml) Verhältnis

EZF Blutplasma EZF / Blutplasma

20 6,20 37,79 0,16

60 7,81 35,49 0,22

120 5,32 22,81 0,23

240 2,60 7,60 0,34

360 1,31 2,99 0,44

480 0,59 1,25 0,47

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der Lunge

95

Ergebnisse

Abb

. 20:

Mitt

lere

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

und

im B

lutp

lasm

a na

ch e

inm

alig

er in

trav

enös

er A

pplik

atio

n vo

n Ce

from

®

in

eine

r Dos

ieru

ng v

on 2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

1)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

020

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

0

5 010152025303540

Blut

plas

ma

(Ges

amt-

Frak

tion

)

EZF

(nic

ht-p

rote

inge

bund

ene

Frak

tion

)

96

Ergebnisse


Die pharmakokinetischen Parameter für Cefpirom in der EZF der Lunge und im Blutplasma

wurden basierend auf den individuellen Cefpirom-Konzentrationen der einzelnen Tiere be-

stimmt. Ausgewählte pharmakokinetische Parameter der einzelnen Tiere, Mittelwerte und Stan-

dardabweichungen sind in Tabelle 11 (EZF) und 12 (Blutplasma) aufgelistet.

Nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® betrug die mittlere Cmax

8,22 Mikro-

gramm pro Milliliter in der EZF und 44,29 Mikrogramm pro Milliliter im Blutplasma. In der

EZF wurde eine mittlere Tmax

von 40 Minuten beobachtet. Die AUClast

betrug 3948 Minuten

mal Mikrogramm pro Milliliter für die EZF und 6740 Minuten mal Mikrogramm pro Milliliter

für Blutplasma. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion)

zur mittleren AUClast

von Blutplasma (Gesamt-Fraktion) betrug 0,59.

Tab. 12: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom im Blutplasma nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

MW = MittelwertSD = Standardabweichung

AUClast = Fläche unter der Konzentrations-ZeitkurveCmax = Maximale KonzentrationTmax = Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentration

Parameter Einheit Tier Nr. 1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr. 4 MW SD

AUClast min*µg/ml 6259 7194 5672 7835 6740 962

Cmax µg/ml 39,60 46,13 40,36 51,07 44,29 5,38

Tmax min 60 20 20 20 30 20

Tab. 11: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der EZF nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 1)

Parameter Einheit Tier Nr. 1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr. 4 MW SD

AUClast min*µg/ml 5763 3047 1739 5242 3948 1885

Cmax µg/ml 11,72 6,14 4,45 10,58 8,22 3,48

Tmax min 40 40 40 40 40 0



97

Ergebnisse

4.2 Versuch 2


Für die Katheter Nr. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12 wurden die folgenden relativen Wiederfindungen

ermittelt:









4.2.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe von narkotisierten Schweinen




Die gemessenen Cefpirom-Konzentrationen im Lungen-Mikrodialysat und die mit Hilfe der

jeweiligen relativen Wiederfindung der verwendeten Katheter berechneten Cefpirom-Konzent-

rationen in der EZF der Lunge der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeit-

punkten sind in Tabelle 13 und 14 aufgelistet. Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Lunge

der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten, Mittelwerte (n=8) und

Standardabweichungen sind in Tabelle 15 aufgelistet. In Abbildung 21 sind die Werte aus Tabelle

15 graphisch dargestellt. In Abbildung 22 sind pro Probenentnahmezeitpunkt Maximal- und Mi-

nimalwert, 1. und 3. Quartil und der Medianwert mittels Boxplots graphisch dargestellt.

98

Ergebnisse


*während der Baseline-Sammelperiode (1 h vor Behandlung) wurden nach 20, 40 und 60 min Leerwert-Proben entnommen. Die Behandlung mit Cefrom® begann 10 min und endete 5 min vor Entnahme von Leerwert 3, da das Dialysat exakt 4,8 min benötig-te, um von der Membran zum Probensammelgefäß zu gelangen. Da auf 5 min gerundet wurde, wurden in Leerwert 3 niedrige Kon-zentrationen gemessen.

Zeit nachBehandlung

(min)






Leerwert 3 NQ NQ 0,38* 0,49* 0,02* 0,02* 0,02* 0,02*

20 6,39 7,48 20,76 26,84 5,74 8,69 9,37 10,85

40 13,28 15,54 19,18 24,80 10,69 16,19 11,36 13,14

60 12,47 14,59 14,55 18,82 12,86 19,47 10,55 12,21

80 10,71 12,54 12,13 15,69 14,12 21,38 10,21 11,82

100 9,62 11,26 11,35 14,68 15,67 23,72 9,11 10,54

120 7,46 8,73 9,76 12,62 15,60 23,63 7,68 8,88

140 6,48 7,58 8,88 11,49 14,71 22,28 6,77 7,84

160 5,62 6,58 7,78 10,06 13,35 20,21 7,11 8,22

180 4,90 5,74 7,49 9,69 11,42 17,29 6,19 7,16

200 4,13 4,84 7,06 9,12 10,37 15,70 5,70 6,60

220 3,70 4,33 6,15 7,95 9,29 14,06 5,21 6,02

240 3,26 3,82 5,43 7,03 8,65 13,09 4,71 5,45

260 3,00 3,51 4,83 6,24 8,03 12,16 4,23 4,90

280 2,19 2,57 4,24 5,49 7,37 11,15 4,12 4,77

300 2,47 2,90 4,07 5,26 6,60 9,99 3,73 4,31

320 2,27 2,66 3,65 4,72 5,55 8,41 3,32 3,85

340 2,08 2,44 3,21 4,15 5,04 7,63 3,08 3,57

360 1,85 2,16 2,95 3,81 4,39 6,64 2,67 3,09

380 1,62 1,89 2,46 3,18 4,26 6,45 2,70 3,13

400 1,46 1,71 2,40 3,10 3,70 5,60 2,49 2,88

420 1,33 1,56 2,50 3,23 3,43 5,19 2,33 2,70

440 1,27 1,49 2,34 3,03 3,14 4,75 2,49 2,88

460 1,15 1,34 2,02 2,61 2,77 4,19 2,37 2,74

480 1,01 1,18 1,73 2,23 2,45 3,70 1,96 2,27

Tab. 13: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 5 bis 8) (Versuch 2)

99

Ergebnisse



*während der Baseline-Sammelperiode (1 h vor Behandlung) wurden nach 20, 40 und 60 min Leerwert-Proben entnommen. Die Behandlung mit Cefrom® begann 10 min und endete 5 min vor Entnahme von Leerwert 3, da das Dialysat exakt 4,8 min benötig-te, um von der Membran zum Probensammelgefäß zu gelangen. Da auf 5 min gerundet wurde, wurden in Leerwert 3 niedrige Kon-zentrationen gemessen.

Zeit nachBehandlung

(min)






Leerwert 3 0,70* 0,96* 0,16* 0,22* 0,44* 0,50* 0,44* 0,61*

20 9,97 13,72 7,99 11,00 13,16 14,94 16,52 22,95

40 8,50 11,70 8,91 12,27 16,06 18,23 18,95 26,32

60 8,14 11,21 7,52 10,35 15,64 17,75 12,72 17,67

80 8,20 11,28 6,61 9,09 12,70 14,42 13,37 18,58

100 6,92 9,52 4,71 6,48 11,81 13,40 12,29 17,07

120 5,48 7,55 5,01 6,89 9,67 10,97 7,24 10,05

140 5,03 6,92 4,56 6,27 9,49 10,76 9,20 12,77

160 4,77 6,56 3,53 4,86 8,58 9,74 8,10 11,25

180 4,02 5,54 3,00 4,13 7,46 8,46 10,27 14,27

200 3,91 5,38 2,93 4,03 6,93 7,87 9,29 12,90

220 3,41 4,69 2,68 3,69 6,49 7,37 8,61 11,96

240 2,96 4,07 2,35 3,24 5,66 6,43 7,33 10,18

260 2,69 3,70 1,96 2,70 5,11 5,80 6,92 9,61

280 2,28 3,14 1,80 2,47 3,84 4,36 5,27 7,32

300 2,10 2,90 1,55 2,14 3,59 4,07 5,83 8,10

320 1,85 2,55 1,39 1,91 3,32 3,77 5,00 6,94

340 1,09 1,50 1,24 1,70 3,19 3,62 4,44 6,17

360 1,36 1,87 1,11 1,53 2,87 3,26 4,31 5,99

380 1,42 1,95 0,96 1,32 2,58 2,93 3,92 5,44

400 1,14 1,57 0,87 1,20 2,36 2,68 3,50 4,24

420 1,09 1,50 0,76 1,04 1,97 2,24 2,92 4,05

440 0,78 1,08 0,69 0,95 1,98 2,24 2,59 3,60

460 0,71 0,97 0,59 0,82 1,82 2,06 2,45 3,41

480 0,60 0,83 0,54 0,74 1,70 1,93 2,10 2,91

100

Ergebnisse


Zeit nachBehandlung

(min)


Tier Nr. 5

Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

Leerwert 1 NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ


Leerwert 3 NQ 0,49 0,02 0,02 0,96 0,22 0,50 0,61 0,35 0,35

20 7,48 26,84 8,69 10,85 13,72 11,00 14,94 22,95 14,56 6,90

40 15,54 24,80 16,19 13,14 11,70 12,27 18,23 26,32 17,27 5,57

60 14,59 18,82 19,47 12,21 11,21 10,35 17,75 17,67 15,26 3,64

80 12,54 15,69 21,38 11,82 11,28 9,09 14,42 18,58 14,35 4,07

100 11,26 14,68 23,72 10,54 9,52 6,48 13,40 17,07 13,33 5,31

120 8,73 12,62 23,63 8,88 7,55 6,89 10,97 10,05 11,17 5,36

140 7,58 11,49 22,28 7,84 6,92 6,27 10,76 12,77 10,74 5,22

160 6,58 10,06 20,21 8,22 6,56 4,86 9,74 11,25 9,69 4,75

180 5,74 9,69 17,29 7,16 5,54 4,13 8,46 14,27 9,04 4,58

200 4,84 9,12 15,70 6,60 5,38 4,03 7,87 12,90 8,31 4,11

220 4,33 7,95 14,06 6,02 4,69 3,69 7,37 11,96 7,51 3,74

240 3,82 7,03 13,09 5,45 4,07 3,24 6,43 10,18 6,66 3,42

260 3,51 6,24 12,16 4,90 3,70 2,70 5,80 9,61 6,08 3,26

280 2,57 5,49 11,15 4,77 3,14 2,47 4,36 7,32 5,16 2,92

300 2,90 5,26 9,99 4,31 2,90 2,14 4,07 8,10 4,96 2,75

320 2,66 4,72 8,41 3,85 2,55 1,91 3,77 6,94 4,35 2,27

340 2,44 4,15 7,63 3,57 1,50 1,70 3,62 6,17 3,85 2,14

360 2,16 3,81 6,64 3,09 1,87 1,53 3,26 5,99 3,55 1,88

380 1,89 3,18 6,45 3,13 1,95 1,32 2,93 5,44 3,29 1,79

400 1,71 3,10 5,60 2,88 1,57 1,20 2,68 4,24 2,87 1,48

420 1,56 3,23 5,19 2,70 1,50 1,04 2,24 4,05 2,69 1,42

440 1,49 3,03 4,75 2,88 1,08 0,95 2,24 3,60 2,50 1,32

460 1,34 2,61 4,19 2,74 0,97 0,82 2,06 3,41 2,27 1,19

480 1,18 2,23 3,70 2,27 0,83 0,74 1,93 2,91 1,97 1,04

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeMW = MittelwertSD = StandardabweichungNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,01 µg/ml)

101

Ergebnisse

Abb

. 21:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

(nic

ht-p

rote

inge

bund

ene

Frak

tion)

nac

h ei

nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

D

osie

rung

von

26

mg/

kg K

G (V

ersu

ch 2

)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

51015

2040

6080

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

2025 0

0

Tier

Nr.5

Tier

Nr.6

Tier

Nr.7

Tier

Nr.8

Tier

Nr.9

Tier

Nr.1

0Ti

er N

r.11

Tier

Nr.1

2

102

Ergebnisse

Abb. 22: M

aximal- und M

inimalw

ert, 1. und 3. Quartil und M

edianwert der Cefpirom

-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) pro

Probenentnahmezeitpunkt nach einm

aliger intravenöser Applikation von Cefrom

® in einer Dosierung von 26 m

g/kg KG (Versuch 2)

2040

6080

100120

140160

180200

220240

260280

300320

340360

380400

420440

460480

Zeit nach Behandlung (min)

0 5 10 15 20 25 30 35

Cefpirom (µg/ml)

Maxim

um

3.Quartil

Median

1.Quartil

Minim

um

103

Ergebnisse

Die mittlere Cefpirom-Konzentration in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) stieg von

14,56 Mikrogramm pro Milliliter (20 Minuten nach Behandlung) auf 17,27 Mikrogramm pro

Milliliter (40 Minuten nach Behandlung) an und fiel dann kontinuierlich auf 1,97 Mikrogramm

pro Milliliter (8 Stunden nach Behandlung) ab.






In Abbildung 23 sind die Werte aus Tabelle 16 graphisch dargestellt. In Abbildung 24 sind pro

Probenentnahmezeitpunkt Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und der Medianwert

mittels Boxplots graphisch dargestellt.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) fiel von 65,61 Mikro-

gramm pro Milliliter, (20 Minuten nach Behandlung ) kontinuierlich auf 2,75 Mikrogramm pro

Milliliter (8 Stunden nach Behandlung) ab.


Zeit nachBehandlung

(min)


Tier Nr. 5

Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

Leerwert NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ

20 56,87 45,90 85,36 67,25 69,73 77,21 60,76 61,81 65,61 12,23

60 29,88 36,52 47,20 40,24 37,52 42,14 36,67 37,74 38,49 5,00

120 23,28 25,66 31,42 27,85 21,84 22,55 25,05 20,77 24,80 3,50

240 8,38 11,30 16,14 11,25 8,97 8,13 13,86 10,44 11,06 2,78

360 3,70 6,23 8,36 5,39 3,79 2,97 8,23 5,08 5,47 2,03

480 1,81 3,21 4,90 2,60 1,69 1,19 3,87 2,73 2,75 1,23


104

Ergebnisse

Abb

. 23:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n im

Blu

tpla

sma

(Ges

amt-

Frak

tion)

nac

h ei

nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on

2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

2)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

2040

6080

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

01020

0

304050607080

Cefpirom (µg/ml)

Tier

Nr.5

Tier

Nr.6

Tier

Nr.7

Tier

Nr.8

Tier

Nr.9

Tier

Nr.1

0Ti

er N

r.11

Tier

Nr.1

2

105

Ergebnisse

Abb

. 24:

Max

imal

- un

d M

inim

alw

ert,

1. u

nd 3

. Qua

rtil

und

Med

ianw

ert

der C

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rom

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ratio

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nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on 2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

2)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

20

102030405060708090100

6012

024

036

048

0

0

Cefpirom (µg/ml)

Max

imum

3.Q

uart

il

Med

ian

1.Q

uart

il

Min

imum

106

Ergebnisse

Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Gesamt-Fraktion)


Die untere Quantifizierungsgrenze lag bei 0,015 Mikrogramm pro Gramm.

Cefpirom-Konzentrationen in der ELF der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnah-

mezeitpunkten (jeweils Mittelwert aus Behälter A und B), Mittelwerte (n=8) und Standardab-

weichungen sind in Tabelle 17 aufgelistet. Cefpirom-Konzentrationen in der ELF der einzelnen

Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten in Behälter A und B sind in Tabelle 34

und 35 (siehe Kapitel 7.1) aufgelistet. In Abbildung 25 sind die Werte aus Tabelle 17 graphisch

dargestellt. In Abbildung 26 sind pro Probenentnahmezeitpunkt Maximal- und Minimalwert, 1.

und 3. Quartil und der Medianwert mittels Boxplots graphisch dargestellt.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration in der ELF (Gesamt-Fraktion) fiel von 37,08 Mikrogramm

pro Gramm (20 Minuten nach Behandlung) kontinuierlich auf 3,60 Mikrogramm pro Gramm (8

Stunden nach Behandlung) ab.

Tab. 17: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standardabweichungen in der ELF (Gesamt- Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 2)

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen in der ELF(µg/g)

Tier Nr. 5

Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

Leerwert 0,09* 0,06* 0,27* 0,03* 0,02* 0,01* 0,14* NQ 0,08* 0,09

20 42,76 30,33 33,57 38,77 33,95 38,42 41,74 NV 37,08 4,59

60 25,00 23,92 21,47 24,04 30,63 20,47 28,95 26,55 25,13 3,48

120 17,33 14,86 13,00 18,62 14,25 10,47 16,23 19,20 15,49 2,95

240 9,97 9,05 11,30 10,29 7,11 4,63 10,93 11,39 9,34 2,36

360 6,46 4,44 5,25 7,79 2,66 1,50 6,69 6,74 5,19 2,19

480 5,46 5,56 3,94 2,94 1,14 0,51 3,66 5,61 3,60 1,98

ELF = Sekret des BronchialepithelsMW = MittelwertSD = StandardabweichungNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,015 µg/g)NV = Nicht vorhanden, dieser Wert wurde als Ausreißer betrachtet, da die Probe stark mit Blut kontaminiert war

*Auf Grund von Kontamination während der Probeentnahme oder -aufarbeitung wurden niedrige Cefpirom-Konzentrationen in den Leerwert-Proben gemessen

107

Ergebnisse

Abb

. 25:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

ELF

(Ges

amt-

Frak

tion)

nac

h ei

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iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on

2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

2)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Tier

Nr.5

Tier

Nr.6

Tier

Nr.7

Tier

Nr.8

Tier

Nr.9

Tier

Nr.1

0Ti

er N

r.11

Tier

Nr.1

2

Cefpirom (µg/g)

20

051015202530354045

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

00

108

Ergebnisse


20

5 10 15 20 25 30 35 40 45

60120

240360

480

0

Cefpirom (µg/g)

Abb. 26: M

aximal- und M

inimalw



-Konzentrationen in der ELF (Gesamt-Fraktion) pro Probenentnahm

ezeitpunkt nach einm



g/kg KG (Versuch 2)

Maxim

um

3.Quartil

Median

1.Quartil

Minim

um

109

Ergebnisse

Tab. 18: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standardabweichungen im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 2)

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe(µg/g)

Tier Nr. 5

Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

480 1,78 2,12 2,92 2,04 1,68 1,08 2,68 2,33 2,08 0,58


Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion)


Die untere Quantifizierungsgrenze lag bei 0,015 Mikrogramm pro Gramm.

Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe der einzelnen Tiere 8 Stunden nach Behandlung

(jeweils Mittelwert aus Aliquot A und B), der Mittelwert (n=8) und die Standardabweichung

sind in Tabelle 18 aufgelistet. Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe der einzelnen Tiere

8 Stunden nach Behandlung in Aliquot A und B sind in Tabelle 36 und 37 (siehe Kapitel 7.1)

aufgelistet.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) betrug 2,08 Mikro-

gramm pro Gramm 8 Stunden nach Behandlung.

110

Ergebnisse

Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion), im Blutplas-

ma (Gesamt-Fraktion), in der ELF (Gesamt-Fraktion) und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion),

sowie das Verhältnis der mittleren Konzentrationen zueinander zu den verschiedenen Proben-

entnahmezeitpunkten sind in Tabelle 19 aufgelistet. In Abbildung 27 sind die Werte aus Tabelle

19 graphisch dargestellt. In Abbildung 28 sind der Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil

und der Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und

im Lungengewebe 8 Stunden nach Behandlung mittels Boxplots graphisch dargestellt.



0,72 (8 Stunden nach Behandlung) an. Das Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen

in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zu ELF (Gesamt-Fraktion) stieg von 0,39 (20

Minuten nach Behandlung) auf 0,72 (2 Stunden nach Behandlung) an und fiel dann auf 0,55 (8

Stunden nach Behandlung) ab. Das Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentration in der EZF

(nicht-proteingebundene Fraktion) zu Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) betrug 8 Stunden nach

Behandlung 0,95.

Das Verhältnis der individuellen Cefpirom-Konzentrationen in der EZF zu Blutplasma, ELF und

Lungengewebe der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten ist in

Tabelle 38 bis 45 (siehe Kapitel 7.1) aufgelistet.

Tab. 19: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 2)

Zeit nachBehandlung

(min)

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen Verhältnis

EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)

Lungen-gewebe(µg/g)

EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

ELF/Blut-

plasma

Lungen-gewebe/

Blut-plasma

20 14,56 65,61 37,08 KP 0,22 0,39 NB 0,57 NB

60 15,26 38,49 25,13 KP 0,40 0,61 NB 0,65 NB

120 11,17 24,80 15,49 KP 0,45 0,72 NB 0,64 NB

240 6,66 11,06 9,34 KP 0,60 0,71 NB 0,84 NB

360 3,55 5,47 5,19 KP 0,65 0,68 NB 0,95 NB

480 1,97 2,75 3,60 2,08 0,72 0,55 0,95 1,31 0,76

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeELF = Sekret des BronchialepithelsKP = Keine ProbeNB = Nicht berechenbar

111

Ergebnisse

Abb

. 27:

Mitt

lere

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

, im

Blu

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26

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Lung

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web

e (G

esam

t-Fr

akti

on)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

20

5 0101520253035404550556065

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

00

112

Ergebnisse

Abb. 28: M

aximal- und M

inimalw



-Konzentrationen in der EZF, im B

lutplasma, in der ELF und im

Lungengewebe

480 Minuten nach einm



g/kg KG (Versuch 2)

Maxim

um

3.Quartil

Median

1.Quartil

Minim

um

0

Cefpirom (µg/ml)

1 2 3 4 5 6 7

EZFBlutplasm

aELF

Lungengewebe

113

Ergebnisse


Die pharmakokinetischen Parameter für Cefpirom in der EZF der Lunge, im Blutplasma und in

der ELF wurden basierend auf den individuellen Cefpirom-Konzentrationen der einzelnen Tie-

re bestimmt. Ausgewählte pharmakokinetische Parameter der einzelnen Tiere, Mittelwerte und

Standardabweichungen sind in Tabelle 20 (EZF), 21 (Blutplasma) und 22 (ELF) aufgelistet.


18,72 Mikro-

gramm pro Milliliter in der EZF, 65,61 Mikrogramm pro Milliliter im Blutplasma und 35,76

Mikrogramm pro Gramm in der ELF. In der EZF wurde eine mittlere Tmax

von 42,5 Minuten und

in der ELF von 25 Minuten beobachtet. Die mittlere AUClast

betrug 3608 Minuten mal Mikro-

gramm pro Milliliter für die EZF, 9138 Minuten mal Mikrogramm pro Milliliter für Blutplasma

und 6154 Minuten mal Mikrogramm pro Gramm für die ELF. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) betrug 0,39 zur mittleren AUClast

von Blutplasma

(Gesamt-Fraktion) und 0,59 zur mittleren AUClast

der ELF (Gesamt-Fraktion). Das Verhältnis der

mittleren AUClast

der ELF zur mittleren AUClast

von Blutplasma betrug 0,67.


Parameter Einheit Tier Nr. 5

Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

AUClastmin*

µg/ml 2557 4295 5994 2974 2426 2009 3566 5046 3608 1399

Cmax µg/ml 15,54 26,84 23,72 13,14 13,72 12,27 18,23 26,32 18,72 6,06

Tmax min 40 20 100 40 20 40 40 40 42,5 24,93



114

Ergebnisse

Tab. 22: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der ELF nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 2)




Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

AUClastmin*

µg/ml 6951 5738 5893 6879 5430 4411 6996 6935 6154 947

Cmax µg/ml 42,76 30,33 33,57 38,77 33,95 38,42 41,74 26,55 35,76 5,28

Tmax min 20 20 20 20 20 20 20 60 25 14,14




Tier Nr. 6

Tier Nr. 7

Tier Nr. 8

Tier Nr. 9

Tier Nr. 10

Tier Nr. 11

Tier Nr. 12 MW SD

AUClastmin*

µg/ml 7638 8324 9558 8516 8903 9576 8458 9138 1370

Cmax µg/ml 56,87 45,90 85,36 67,25 69,73 77,21 60,76 61,81 65,61 12,23

Tmax min 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0

12131


4.2.4 Pathologische Untersuchung

Makroskopische Untersuchung

Nach Einschläfern der Tiere wurde der Sitz des Mikrodialysekatheters in der Lunge überprüft

(siehe Abbildung 29), wobei sich bei allen Tieren die gesamte Länge der Membran im Lungen-

gewebe befand. Während der pathologisch-makroskopischen Untersuchung der Lunge circa 9

Stunden nach Einsatz des Katheters in das Lungengewebe (8 Stunden nach Behandlung) wurden

die folgenden Veränderungen beobachtet:

115

Ergebnisse

Abb. 29: Sitz des Katheters im Lungengewebe circa 9 Stunden nach Einsatz in die Lunge (Versuch 2)

• Auf der pulmonalen Pleura fanden sich Hämorrhagien und Fibrinauflagerun-

gen im Bereich der Einstichstelle des Katheters (siehe Abbildung 30). Diese

waren bei den einzelnen Tieren unterschiedlich stark ausgeprägt.

• Bei Anschnitt der Einstichstelle wurden Hämorrhagien entlang des Stich-

kanals des Katheters beobachtet (siehe Abbildung 31). Diese waren bei den

einzelnen Tieren unterschiedlich stark ausgeprägt.

• Im Bereich um die Einstichstelle zeigte das Lungeninterstitium ödematöse

Veränderungen (siehe Abbildung 30).

• Im Lungengewebe der Tiere Nr. 7, 8, 10 und 11 wurden Areale chronischer

Pneumonie gefunden.

Die Befunde der einzelnen Tiere sind in Kapitel 7.2 aufgelistet.

116

Ergebnisse

Abb. 31: Anschnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 2)

Abb. 30: Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der Pleura pulmonalis im Bereich der Einstichstelle des Katheters, interstitielles Ödem im Bereich um die Einstichstelle (Versuch 2)

Histologische Untersuchung

Von der Einstichstelle des Katheters und gegebenenfalls von anderen auffälligen Arealen der Lun-

ge wurden Gewebeproben entnommen und nach Anfertigung histologischer Schnitte wurden

diese mikroskopisch untersucht. Dabei wurden in den histologischen Schnitten, der im Bereich

der Einstichstelle des Katheters entnommenen Gewebeproben, die folgenden Veränderungen be-

obachtet:

117

Ergebnisse

• Im Gewebe der pulmonalen Pleura fanden sich fibrinöse Adhäsionen mit

Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Fibrinbildung und Hä-

morrhagien (siehe Abbildung 33).

• Das interlobuläre Interstitium war verbreitert. Hier wurden Neutrophile und

Makrophagen, sowie Fibrinbildungen und Hämorrhagien beobachtet. Bei

einigen Tieren waren die Lymphgefäße des interlobulären Interstitiums dila-

tiert, selten fanden sich auch fibrinöse Thromben.

• Das Lumen des Bronchialsystems war mit Neutrophilen, Makrophagen, Ery-

throzyten, abgeschilferten Epithelzellen und manchmal auch mit Ödemflüs-

sigkeit partiell gefüllt (siehe Abbildung 32).

• Das Lumen der Alveolen war mit aktivierten Alveolarmakrophagen, Neutro-

philen, Erythrozyten, Fibrin und manchmal auch mit Ödemflüssigkeit gefüllt.

In einigen Fällen war das interalveoläre Interstitium durch Aggregation von

Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt.

In den histologischen Schnitten, der im Bereich der Areale chronischer Pneumonie entnomme-

nen Gewebeproben (Tiere Nr. 8, 11, 12), wurden die folgenden Veränderungen beobachtet:

• Im Gewebe der pulmonalen Pleura fanden sich aktivierte Epithelzellen, Neu-

trophile und einzelne Eosinophile, sowie dilatierte Gefäße.

• Das interlobuläre Interstitium war verbreitert. Hier wurden Neutrophile und

Makrophagen, Lymphozyten und Fibroblasten, sowie Fibrin-Exsudation beo-

bachtet. Die Lymphgefäße waren teilweise dilatiert (siehe Abbildung 34).

• Das Lumen des Bronchialsystems war teilweise mit Neutrophilen, Makro-

phagen, abgeschilferten Epithelzellen und mit Ödemflüssigkeit gefüllt (siehe

Abbildung 34).

• Das Lumen der Alveolen war mit aktivierten Alveolarmakrophagen, Neu-

trophilen, Erythrozyten, Fibroblasten, einzelnen Eosinophilen und teilweise

mit Ödemflüssigkeit gefüllt. Das interalveoläre Interstitium war in einzelnen

Fällen durch Aggregation von Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten

verdickt. Weiterhin zeigten sich dilatierte Gefäße, Hyperämien und nicht oder

schlecht ventilierte Bereiche.


118

Ergebnisse

1 Veränderungen im Lobus caudalis sinister

Abb. 34: Histologischer Schnitt des Lobus caudalis sinister (Tier Nr. 8), Mikroskop-Vergrößer- ung 200-fach (Versuch 2)

Abb. 33: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Tier Nr. 12), Mikroskop- Vergrößerung100-fach (Versuch 2)

1 Veränderte Pleura pulmonalis1 Bronchus mit Ödemflüssigkeit

Abb. 32: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Tier Nr. 6), Mikroskop-Vergrößer- ung100-fach (Versuch 2)

119

Ergebnisse

4.3 Versuch 3


Für die Katheter Nr. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 wurden die folgenden relativen Wiederfin-

dungen ermittelt:









4.3.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blutplasma von wachen Schweinen




Die gemessenen Cefpirom-Konzentrationen im Lungen-Mikrodialysat und die mit Hilfe der je-

weiligen relativen Wiederfindung der verwendeten Katheter berechneten Cefpirom-Konzentratio-

nen in der EZF der Lunge der einzelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten

sind in Tabelle 23 und 24 aufgelistet. Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Lunge der einzel-

nen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten, Mittelwerte (n=8) und Standardab-

weichungen sind in Tabelle 25 aufgelistet. In Abbildung 35 sind die Werte aus Tabelle 25 graphisch

dargestellt. In Abbildung 36 sind pro Probenentnahmezeitpunkt Maximal- und Minimalwert, 1.

und 3. Quartil und der Medianwert graphisch mittels Boxplots graphisch dargestellt.

120

Ergebnisse

Zeit nachBehandlung

(min)






Leerwert 3 0,20* 0,26* 0,20* 0,26* NQ NQ 0,86* 1,18*

20 18,53 24,70 5,87 7,42 5,44 9,62 18,52 25,48

40 18,41 24,54 4,66 5,89 5,92 10,46 12,80 17,61

60 NV NV 5,09 6,43 7,45 13,17 7,98 10,98

80 NV NV 4,09 5,16 NV NV NV NV

100 NV NV 3,49 4,40 NV NV NV NV

120 2,982 3,972 NV NV 3,55 6,27 NV NV

140 2,382 3,172 2,63 3,32 4,22 7,45 NV NV

160 1,982 2,642 2,35 2,96 1,04 1,84 NV NV

180 1,652 2,202 NV NV 3,36 5,93 NV NV

200 1,322 1,762 1,51 1,90 2,61 4,62 4,68 6,43

220 1,062 1,412 1,15 1,46 2,27 4,01 2,064 2,844

240 0,832 1,102 1,11 1,31 2,13 3,77 1,643 2,263

260 0,742 0,992 1,04 1,31 1,78 3,14 1,921 2,641

280 0,602 0,792 1,01 1,27 1,39 2,46 1,671 2,291

300 0,472 0,632 0,86 1,09 1,11 1,97 1,261 1,741

320 NV NV 0,73 0,92 1,01 1,78 0,761 1,041

340 0,382 0,502 0,65 0,81 0,95 1,67 0,841 1,151

360 NV NV 0,55 0,70 0,79 1,39 0,901 1,241

380 NV NV 0,63 0,80 0,75 1,33 0,741 1,021

400 0,172 0,222 0,61 0,77 0,55 0,97 0,82 1,13

420 0,202 0,272 0,53 0,67 0,40 0,71 1,00 1,38

440 0,152 0,202 0,38 0,48 0,40 0,71 0,96 1,24

460 0,172 0,232 0,34 0,43 0,28 0,49 0,90 1,24

480 0,132 0,172 0,26 0,33 0,26 0,46 0,74 1,01

LM = Lungen-MikrodialysatEZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,05 µg/ml)NV = Nicht vorhanden auf Grund zu geringer Probenvolumina1 = Flussrate 2,6 µl/min2 = Flussrate 3,2 µl/min3 = Flussrate 3,5 µl/min4 = Flussrate 4,1 µl/min

*während der Baseline-Sammelperiode (1 h vor Behandlung) wurden nach 20, 40 und 60 min Leerwert-Proben entnommen. Die Behandlung mit Cefrom® begann 10 min und endete 5 min vor Entnahme von Leerwert 3, da das Dialysat exakt 4,8 min benötigte, um von der Membran zum Probensammelgefäß zu gelangen. Da auf 5 min gerundet wurde, wurden in Leerwert 3 niedrige Konzentrationen gemessen.


121

Ergebnisse

LM = Lungen-MikrodialysatEZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,05 µg/ml)NV = Nicht vorhanden auf Grund zu geringer Probenvolumina1 = Flussrate 2,6 µl/min2 = Flussrate 3,2 µl/min3 = Flussrate 3,5 µl/min4 = Flussrate 4,1 µl/min

*während der Baseline-Sammelperiode (1 h vor Behandlung) wurden nach 20, 40 und 60 min Leerwert-Proben entnommen. Die Behandlung mit Cefrom® begann 10 min und endete 5 min vor Entnahme von Leerwert 3, da das Dialysat exakt 4,8 min benötigte, um von der Membran zum Probensammelgefäß zu gelangen. Da auf 5 min gerundet wurde, wurden in Leerwert 3 niedrige Konzentrationen gemessen.

Zeit nachBehandlung

(min)






Leerwert 3 0,51* 0,55* 0,48* 0,62* 0,19* 0,25* 0,63* 0,77*

20 27,98 30,05 14,95 19,32 15,47 20,55 20,57 25,27

40 25,48 27,36 15,571 20,131 17,99 23,89 NV NV

60 15,311 16,441 8,311 10,741 13,23 17,58 NV NV

80 8,721 9,371 5,501 7,111 11,87 15,77 15,581 19,141

100 7,131 7,661 4,491 5,801 9,57 12,71 12,981 15,941

120 7,051 7,571 3,041 3,931 7,39 9,81 9,901 12,161

140 NV NV NV NV 6,36 8,45 10,351 12,711

160 5,752 6,172 2,342 3,032 5,14 6,83 7,691 9,451

180 4,502 4,832 2,512 1,952 3,95 5,24 5,731 7,031

200 4,092 4,392 1,302 1,682 3,41 4,52 5,521 6,791

220 NV NV 0,932 1,202 2,89 3,84 4,931 6,061

240 2,781 2,981 0,731 0,951 2,06 2,73 3,98 4,89

260 NV NV 0,692 0,892 1,83 2,43 NV NV

280 NV NV 0,602 0,782 1,54 2,04 4,19 5,15

300 1,812 1,942 0,692 0,892 1,24 1,65 3,16 3,89

320 1,801 1,931 NV NV 1,11 1,48 1,51 1,85

340 1,711 1,841 0,361 0,461 0,93 1,23 2,03 2,50

360 1,631 1,751 0,301 0,391 0,76 1,00 1,57 1,93

380 1,761 1,891 0,251 0,321 0,70 0,93 1,28 1,57

400 1,511 1,621 0,152 0,192 0,51 0,68 0,41 0,50

420 1,381 1,481 0,122 0,152 0,38 0,51 1,02 1,25

440 1,231 1,331 0,121 0,161 0,47 0,62 0,76 0,93

460 1,03 1,11 0,121 0,151 0,27 0,36 0,80 0,98

480 0,82 0,88 0,111 0,141 0,23 0,30 0,50 0,62


122

Ergebnisse

Zeit nachBehandlung

(min)


Tier Nr. 13

Tier Nr. 14

Tier Nr. 15

Tier Nr. 16

Tier Nr. 17

Tier Nr. 18

Tier Nr. 19

Tier Nr. 20 MW SD



Leerwert 3 0,26 0,26 NQ 1,18 0,55 0,62 0,25 0,77 0,49 0,37

20 24,70 7,42 9,62 25,48 30,05 19,32 20,55 25,27 20,30 7,99

40 24,54 5,89 10,46 17,61 27,36 20,13 23,89 NV 18,55 7,28

60 NV 6,43 13,17 10,98 16,44 10,74 17,58 NV 12,72 4,10

80 NV 5,16 NV NV 9,37 7,11 15,77 19,14 11,31 5,92

100 NV 4,40 NV NV 7,66 5,80 12,71 15,94 9,30 4,87

120 3,97 NV 6,27 NV 7,57 3,93 9,81 12,16 7,29 3,27

140 3,17 3,32 7,45 NV NV NV 8,45 12,71 7,02 3,97

160 2,64 2,96 1,84 NV 6,17 3,03 6,83 9,45 4,70 2,81

180 2,20 NV 5,93 NV 4,83 1,95 5,24 7,03 4,53 2,04

200 1,76 1,90 4,62 6,43 4,39 1,68 4,52 6,79 4,01 2,04

220 1,41 1,46 4,01 2,84 NV 1,20 3,84 6,06 2,97 1,79

240 1,10 1,31 3,77 2,26 2,98 0,95 2,73 4,89 2,50 1,39

260 0,99 1,31 3,14 2,64 NV 0,89 2,43 NV 1,90 0,95

280 0,79 1,27 2,46 2,29 NV 0,78 2,04 5,15 2,11 1,50

300 0,63 1,09 1,97 1,74 1,94 0,89 1,65 3,89 1,72 1,01

320 NV 0,92 1,78 1,04 1,93 NV 1,48 1,85 1,50 0,43

340 0,50 0,81 1,67 1,15 1,84 0,46 1,23 2,50 1,27 0,70

360 NV 0,70 1,39 1,24 1,75 0,39 1,00 1,93 1,20 0,55

380 NV 0,80 1,33 1,02 1,89 0,32 0,93 1,57 1,12 0,52

400 0,22 0,77 0,97 1,13 1,62 0,19 0,68 0,50 0,76 0,48

420 0,27 0,67 0,71 1,38 1,48 0,15 0,51 1,25 0,80 0,51

440 0,20 0,48 0,71 1,24 1,33 0,16 0,62 0,93 0,71 0,44

460 0,23 0,43 0,49 1,24 1,11 0,15 0,36 0,98 0,62 0,42

480 0,17 0,33 0,46 1,01 0,88 0,14 0,30 0,62 0,49 0,32

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeNQ = Nicht quantifizierbar (< 0,05 µg/ml)NV = Nicht vorhanden auf Grund zu geringer Probenvolumina


123

Ergebnisse

Abb

. 35:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

(nic

ht-p

rote

inge

bund

ene

Frak

tion)

nac

h ei

nmal

iger

intr

aven

öser

App

likat

ion

von

Cefr

om®

in e

iner

Dos

ieru

ng v

on 2

6 m

g/kg

KG

(Ver

such

3)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

2040

6080

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

0

0 51015202530

Tier

Nr.1

3Ti

er N

r.14

Tier

Nr.1

5Ti

er N

r.16

Tier

Nr.1

7Ti

er N

r.18

Tier

Nr.1

9Ti

er N

r.20

124

Ergebnisse

Abb. 36: M

aximal- und M

inimalw



-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) pro

Probenentnahmezeitpunkt nach einm



g/kg KG (Versuch 3)


Cefpirom (µg/ml)M

aximum

3.Quartil

Median

1.Quartil

Minim

um

2040

6080

100120

140160

180200

220240

260280

300320

340360

380400

420440

460480

0 5 10 15 20 25 30 35

125

Ergebnisse


Zeit nachBehandlung

(min)


Tier Nr. 13

Tier Nr. 14

Tier Nr. 15

Tier Nr. 16

Tier Nr. 17

Tier Nr. 18

Tier Nr. 19

Tier Nr. 20 MW SD

Leerwert NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ NQ

20 86,23 88,47 57,05 88,43 90,47 81,87 71,72 87,68 81,49 11,54

60 32,37 34,32 38,10 49,56 57,99 39,63 48,36 47,38 43,46 8,76

120 24,29 19,80 18,32 31,11 27,68 25,57 27,64 23,54 24,74 4,24

240 6,50 5,90 6,14 8,28 14,59 7,69 6,41 8,62 8,02 2,84

360 1,93 1,67 1,33 3,32 6,54 2,31 1,39 2,77 2,66 1,71

480 0,49 0,60 0,40 1,22 1,94 0,71 0,50 0,92 0,85 0,51


Die mittlere Cefpirom-Konzentration in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) fiel von

20,30 Mikrogramm pro Milliliter (20 Minuten nach Behandlung) kontinuierlich auf 0,49 Mi-

krogramm pro Milliliter (8 Stunden nach Behandlung) ab.






In Abbildung 37 sind die Werte aus Tabelle 26 graphisch dargestellt. In Abbildung 38 sind pro

Probenentnahmezeitpunkt Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und der Medianwert

mittels Boxplots graphisch dargestellt.

Die mittlere Cefpirom-Konzentration im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) fiel von 81,49 Mikro-

gramm pro Milliliter (20 Minuten nach Behandlung) kontinuierlich auf 0,85 Mikrogramm pro

Milliliter (8 Stunden nach Behandlung) ab.

126

Ergebnisse

Abb

. 37:

Indi

vidu

elle

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n im

Blu

tpla

sma

(Ges

amt-

Frak

tion)

nac

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nmal

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öser

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Cefr

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iner

Dos

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on

26

mg/

kg K

G (V

ersu

ch 3

)

Tier

Nr.1

3Ti

er N

r.14

Tier

Nr.1

5Ti

er N

r.16

Tier

Nr.1

7Ti

er N

r.18

Tier

Nr.1

9Ti

er N

r.20

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

2040

6080

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380

400

420

440

460

480

0

10203040 05060708090

127

Ergebnisse

Abb

. 38:

Max

imal

- un

d M

inim

alw

ert,

1. u

nd 3

. Qua

rtil

und

Med

ianw

ert

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mg/

kg K

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ersu

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)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

20

102030405060708090100

6012

024

036

048

0

0

Cefpirom (µg/ml)

Max

imum

3.Q

uart

il

Med

ian

1.Q

uart

il

Min

imum

128

Ergebnisse

Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im

Blutplasma (Gesamt-Fraktion), sowie das Verhältnis der mittleren Konzentrationen zueinander

zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten sind in Tabelle 27 aufgelistet. In Abbildung

39 sind die Werte aus Tabelle 27 graphisch dargestellt.



0,58 (8 Stunden nach Behandlung) an.

Das Verhältnis der individuellen Cefpirom-Konzentrationen in der EZF zu Blutplasma der ein-

zelnen Tiere zu den verschiedenen Probenentnahmezeitpunkten ist in Tabelle 46 und 47 (siehe

Kapitel 7.1) aufgelistet.

Tab. 27: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Versuch 3)

Zeit nachBehandlung

(min)

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen (µg/ml) Verhältnis

EZF Blutplasma EZF / Blutplasma

20 20,30 81,49 0,25

60 12,72 43,46 0,29

120 7,29 24,74 0,29

240 2,50 8,02 0,31

360 1,20 2,66 0,45

480 0,49 0,85 0,58


129

Ergebnisse

Abb

. 39:

Mitt

lere

Cef

piro

m-K

onze

ntra

tione

n in

der

EZF

und

im B

lutp

lasm

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6 m

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KG

(Ver

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3)

Blut

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EZF

(nic

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rote

inge

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Frak

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)

Zeit

nac

h Be

hand

lung

(min

)

Cefpirom (µg/ml)

020

4060

8010

012

014

016

018

020

022

024

026

028

030

032

034

036

038

040

042

044

046

048

0

5 0101520253035404550556065707580

130

Ergebnisse


Die pharmakokinetischen Parameter für Cefpirom in der EZF der Lunge und im Blutplasma

wurden basierend auf den individuellen Cefpirom-Konzentrationen der einzelnen Tiere be-

stimmt. Ausgewählte pharmakokinetische Parameter der einzelnen Tiere, Mittelwerte und Stan-

dardabweichungen sind in Tabelle 28 (EZF) und 29 (Blutplasma) aufgelistet.


21,26 Mikro-

gramm pro Milliliter in der EZF und 81,49 Mikrogramm pro Milliliter im Blutplasma. In der

EZF wurde eine mittlere Tmax

von 30 Minuten beobachtet. Die mittlere AUClast

betrug 2435

Minuten mal Mikrogramm pro Milliliter für die EZF und 8176 Minuten mal Mikrogramm pro

Milliliter für Blutplasma. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene

Fraktion) zur mittleren AUClast

von Blutplasma (Gesamt-Fraktion) betrug 0,30.





Tier Nr. 14

Tier Nr. 15

Tier Nr. 16

Tier Nr. 17

Tier Nr. 18

Tier Nr. 19

Tier Nr. 20 MW SD

AUClastmin*

µg/ml 2270 1119 2069 2689 2953 1689 2900 3794 2435 832

Cmax µg/ml 24,70 7,42 13,17 25,48 30,05 20,13 23,89 25,27 21,26 7,45

Tmax min 20 20 60 20 20 40 40 20 30 15,12





Tier Nr. 14

Tier Nr. 15

Tier Nr. 16

Tier Nr. 17

Tier Nr. 18

Tier Nr. 19

Tier Nr. 20 MW SD

AUClastmin*

µg/ml 7433 7096 6186 9396 7982 8023 8539 8176 1415

Cmax µg/ml 86,23 88,47 57,05 88,43 90,47 81,87 71,72 87,68 81,49 11,53

Tmax min 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0

10756

131

Ergebnisse

4.3.4 Pathologische Untersuchung

Makroskopische Untersuchung

Nach Einschläfern der Tiere Nr. 14, 16, 17 und 20 (8 Stunden nach Behandlung) wurde der Sitz

des Mikrodialysekatheters in der Lunge überprüft, wobei sich bei allen 4 Tieren die gesamte Län-

ge der Membran im Lungengewebe befand. Während der pathologisch-makroskopischen Unter-

suchung der Lunge der Tiere Nr. 14, 16, 17 und 20 circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters

in das Lungengewebe wurden die folgenden Veränderungen beobachtet:

• Auf der pulmonalen Pleura fanden sich Hämorrhagien und Fibrinauflagerun-

gen im Bereich der Einstichstelle des Katheters. Diese waren bei den einzel-

nen Tieren unterschiedlich stark ausgeprägt.

• Bei Anschnitt der Einstichstelle wurden Hämorrhagien entlang des Stichka-

nals des Katheters beobachtet. Diese waren bei den einzelnen Tieren unter-

schiedlich stark ausgeprägt.

• Im Bereich um die Einstichstelle zeigte das Lungeninterstitium ödematöse

Veränderungen.

Während der pathologisch-makroskopischen Untersuchung der Lunge der Tiere Nr. 19, 15, 18

und 13 2, 3, 4 oder 5 Tage nach Einsatz des Katheters in das Lungengewebe, wobei der Katheter

circa 9 Stunden nach Einsatz wieder aus der Lunge entfernt wurde, wurden die folgenden Ver-

änderungen beobachtet:

• Bei allen 4 Tieren wurden lediglich geringgradige Hämorrhagien und Fibri-

nauflagerungen auf der pulmonalen Pleura gefunden.

• Nach 2 (Tier Nr. 19) und 3 Tagen (Tier Nr. 15) waren noch Hämorrhagien

entlang des Stichkanals vorhanden. Nach 4 (Tier Nr. 18) und 5 Tagen (Tier

Nr. 13) wurden keine Hämorrhagien mehr entlang des Stichkanals beobach-

tet (siehe Abbildung 40).

• 2 und 3 Tage nach Entfernung des Katheters war das interstitielle Ödem im

Bereich um die Einstichstelle noch deutlich sichtbar, nach 4 und 5 Tagen war

es lediglich noch in der direkten Umgebung der Einstichstelle zu sehen.


132

Ergebnisse

Abb. 40: Anschnitt der Einstichstelle des Katheters (lamelliert) 3 Tage nach Entfernung des Katheters (Versuch 3)

Histologische Untersuchung

Von der Einstichstelle des Katheters wurden Gewebeproben entnommen und nach Anfertigung

histologischer Schnitte, wurden diese mikroskopisch untersucht. Dabei wurden bei den Tieren

Nr. 14, 16, 17 und 20 (Entnahme der Gewebeproben circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters

in das Lungengewebe) die folgenden Veränderungen beobachtet:

• Im Gewebe der pulmonalen Pleura fanden sich fibrinöse Adhäsionen mit

Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Fibrinbildung und Hä-

morrhagien.

• Das interlobuläre Interstitium war verbreitert. Hier wurden Neutrophilen

und Makrophagen, sowie Fibrinbildungen und Hämorrhagien beobachtet.

Bei einigen Tieren waren die Lymphgefäße des interlobulären Interstitiums

dilatiert, selten fanden sich auch fibrinöse Thromben.

• Das Lumen des Bronchialsystems war mit Neutrophilen, Makrophagen, Ery-

throzyten, abgeschilferten Epithelzellen und manchmal auch mit Ödemflüs-

sigkeit partiell gefüllt.

• Das Lumen der Alveolen war mit aktivierten Alveolarmakrophagen, Neutro-

philen, Erythrozyten, Fibrin und manchmal auch mit Ödemflüssigkeit gefüllt.

In einigen Fällen war das interalveoläre Interstitium durch Aggregation von

Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt.

Bei den Tieren Nr. 19, 15, 18 und 13 (Entnahme der Gewebeproben 2, 3, 4 oder 5 Tage nach

Einsatz des Katheters in das Lungengewebe) wurden die folgenden Veränderungen beobachtet:

133

Ergebnisse

Abb. 41: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters 4 Tage nach dessen Entfernung (Tier Nr. 18), Mikroskop-Vergrößerung 40-fach (Versuch 3)

1 Granulationsgewebe mit Neovaskularisation

Abb. 42: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters 5 Tage nach dessen Entfernung (Tier Nr. 13), Mikroskop-Vergrößerung 200-fach (Versuch 3)

1 Granulationsgewebe mit Neovaskularisation

• Im Gewebe der pulmonalen Pleura fanden sich nach 2 und 3 Tagen noch

fibrinöse Adhäsionen mit Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen,

Fibrinbildung und Hämorrhagien. Nach 3 Tagen wurde bereits Granulations-

gewebe mit Neovaskularisation beobachtet. Nach 4 und 5 Tagen zeigten sich

Neutrophile, Makrophagen und Fibroblasten, sowie große Areale mit Granu-

lationsgewebe und Neovaskularisation (siehe Abbildung 41 und 42).

• Im Lumen des Bronchialsystems fanden sich nach 2 und 3 Tagen noch einige

Erythrozyten, nach 4 und 5 Tagen waren lediglich noch einzelne Eosinophile

und abgeschilferte Epithelzellen sichtbar.

• Das Lumen der Alveolen war nach 2 Tagen noch mit Neutrophilen, Erythro-

zyten, Fibrin und Ödemflüssigkeit gefüllt, nach 3, 4 und 5 Tagen fanden sich

lediglich noch einige Erythrozyten. Das interalveoläre Interstitium war nur

an einzelnen Stellen durch Aggregation von Neutrophilen, Makrophagen und

Fibroblasten verdickt.


134

Ergebnisse

4.4 Vergleichende Betrachtung der Versuche 1, 2 und 3

4.4.1 Auswirkung der Operation und Katheter-Implantation auf die Tiere

Bei allen 20 Tieren traten im Verlauf der Narkose keine Komplikationen auf. Diejenigen Tiere, bei

denen die Narkose nach Verschluss des Thorax ausgeleitet wurde (Tiere Nr. 13 bis 20), standen

aufrecht und fraßen spätestens 2 Stunden nach der Extubation (siehe Abbildung 43). Die Schwei-

ne Nr. 19, 15, 18 und 13, welche erst nach 2, 3, 4 oder 5 Tagen nach der Operation eingeschlä-

fert wurden, zeigten ungestörtes Fress- und Bewegungsverhalten (siehe Abbildung 44) und die

während der klinischen Untersuchungen bestimmten Parameter (siehe Kapitel 3.5.2) waren ohne

besonderen Befund. Weiterhin traten zu keiner Zeit Reaktionen an der Operationsnarbe auf.

Abb. 43: Schwein circa 2 Stunden nach Narkoseausleitung Abb. 44: Schwein 1 Tag post OP

135

Ergebnisse

Tab. 30: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) der Versuche 1 (n=4 [siehe Tab. 8]), 2 (n=8 [siehe Tab. 15]) und 3 (n=8 [siehe Tab. 25]) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG

Zeit nachBehandlung

(min)

Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF(µg/ml)

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3

(narkotisierte Tiere, Thorax mit Tupfern abgedeckt)

(narkotisierte Tiere, Thorax lege artis verschlossen)

(wache Tiere, Thorax lege artis verschlossen)

20 6,20 14,56 20,30

40 8,22 17,27 18,55

60 7,81 15,26 12,72

80 6,90 14,35 11,31

100 5,58 13,33 9,30

120 5,32 11,17 7,29

140 4,88 10,74 7,02

160 4,31 9,69 4,70

180 3,77 9,04 4,53

200 3,50 8,31 4,01

220 2,99 7,51 2,97

240 2,60 6,66 2,50

260 2,33 6,08 1,90

280 2,06 5,16 2,11

300 1,83 4,96 1,72

320 1,60 4,35 1,50

340 1,44 3,85 1,27

360 1,31 3,55 1,20

380 1,09 3,29 1,12

400 1,01 2,87 0,76

420 0,88 2,69 0,80

440 0,82 2,50 0,71

460 0,72 2,27 0,62

480 0,59 1,97 0,49


4.4.2 Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge

Die mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) der

Versuche 1 (n=4), 2 (n=8) und 3 (n=8) sind in Tabelle 30 zusammenfassend aufgelistet. In Abbil-

dung 45 sind die Werte aus Tabelle 30 graphisch dargestellt.

Tabelle 31 bietet einen Überblick über das Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen

in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zu Blutplasma (Gesamt-Fraktion) der einzelnen

Versuche.

136

Ergebnisse

Abb. 45: M

ittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) der Versuche 1 (n=4 [siehe Tab. 8]), 2 (n=8 [siehe Tab. 15]) und 3 (n=8

[siehe Tab. 25]) nach einm



g/kg KG


2040

6080

100120

140160

180200

220240

260280

300320

340360

380400

420440

460480

0

Cefpirom (µg/ml)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Versuch 1 (narkotisierte Tiere, Thorax mit Tupfern abgedeckt)

Versuch 2 (narkotisierte Tiere, Thorax lege artis verschlossen)Versuch 3 (w

ache Tiere, Thorax lege artis verschlossen)

137

Ergebnisse

Tab. 31: Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zu Blutplasma (Gesamt-Fraktion) der Versuche 1, 2 und 3 nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG

Zeit nachBehandlung

(min)

Verhältnis EZF / Blutplasma

Versuch 1 Versuch 2 Versuch 3

20 0,16 0,22 0,25

60 0,22 0,40 0,29

120 0,23 0,45 0,29

240 0,34 0,60 0,31

360 0,44 0,65 0,45

480 0,47 0,72 0,58


4.4.3 Auswertung der statistischen Testverfahren

Die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lunge aus Versuch 1 (narkotisierte

Tiere, Thorax mit Tupfern abgedeckt) und aus Versuch 2 (narkotisierte Tiere, Thorax lege artis

verschlossen) waren bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Versuch“ signifikant unterschiedlich

(p=0,022). Die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lunge aus Versuch 2

(narkotisierte Tiere, Thorax lege artis verschlossen) und aus Versuch 3 (wache Tiere, Thorax lege

artis verschlossen) waren bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Versuch“ nicht signifikant un-

terschiedlich (p=0,059). Die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lunge

und im Blutplasma (Versuch 2) waren bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Matrix“ signifikant

unterschiedlich (p <0,0001). Die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Lun-

ge und in der ELF (Versuch 2) waren bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Matrix“ signifikant

unterschiedlich (p <0,0001). Die Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom im Blutplasma und

in der ELF (Versuch 2) waren bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Matrix“ signifikant unter-

schiedlich (p <0,0001). Die Konzentrationen von Cefpirom in der EZF der Lunge, im Blutplas-

ma, in der ELF und im Lungengewebe am Probenentnahmezeitpunkt 8 Stunden nach Behand-

lung (Versuch 2) waren nicht signifikant unterschiedlich (p=0,069).

138

Ergebnisse

Tab. 32: Mittelwerte der pharmakokinetischen Parameter von Cefpirom in der EZF und im Blutplasma der Versuche 1 (n=4 [siehe Tab. 11 und 12]), 2 (n=8 [siehe Tab. 20 und 21]), und 3 (n=8 [siehe Tab. 28 und 29]) nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG

Parameter EinheitVersuch 1 Versuch 2 Versuch 3

EZF Blutplasma EZF Blutplasma EZF Blutplasma

AUClast

min*µg/ml 3948 6740 3608 9138 2435 8176

Cmax µg/ml 8,22 44,29 18,72 65,61 21,26 81,49

Tmax min 40 30 42,5 20 30 20

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeAUClast = Fläche unter der Konzentrations-ZeitkurveCmax = Maximale KonzentrationTmax = Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentration


In Tabelle 32 sind der mittlere Cmax

, Tmax

und die mittlere AUClast

in der EZF und im Blutplasma

der Versuche 1 (n=4), 2 (n=8) und 3 (n=8) zusammenfassend aufgelistet.

Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zur mittleren

AUClast

von Blutplasma (Gesamt-Fraktion) betrug 0,59 in Versuch1, 0,39 in Versuch 2 und 0,30

in Versuch 3.

139

Diskussion

5Diskussion

140

Diskussion

5.1 Auswahl des Mikrodialysezubehörs, Bedingungen und Bestimmung der relativen Wiederfindung

In Anlehnung an HERKNER et al. (2002), die für ihren Mikrodialyseversuch zur Messung von

Cefpirom-Konzentrationen in der menschlichen Lunge einen flexiblen Katheter mit einer 0,6

mal 50 Millimeter großen Membran aus Polyethersulfon (Cut-off 15.000 Dalton) verwendeten,

wurde für die Durchführung der Mikrodialyse in der Lunge von Schweinen in den Versuchen 1

bis 3 ebenfalls ein flexibler, konzentrisch aufgebauter Mikrodialysekatheter mit einer 0,6 mal 30

Millimeter großen Membran aus Polyarylethersulfon mit einem Cut-off von 20.000 Dalton (Mi-

krodialysekatheter CMA 61) gewählt. Sowohl die Eigenschaften des Mikrodialysekatheter CMA

61 als auch dessen Handhabung erfüllten die in der Literatur angegebenen Empfehlungen für

die Anwendung in der Lunge. Für den Einsatz in die Lunge als Weichteilgewebe wurde ein fle-

xibel geformter Katheter gewählt, da ein starrer Katheter Läsionen während der Atembewegung

verursacht hätte (JOUKHADAR u. MÜLLER 2005). Wie von JOUKHADAR und MÜLLER

(2005) empfohlen, wurde die Membran, um Schäden zu vermeiden, mit Hilfe einer Führungs-

kanüle in die Lunge der Schweine eingesetzt. Bei genauer Betrachtung aller in den Versuchen 1

bis 3 verwendeten Katheter nach deren Entfernung aus den Tieren konnten makroskopisch keine

Schäden an den Membranen festgestellt werden. Der Verlauf der Konzentrations-Zeitkurven von

Cefpirom in den EZF bestätigt die Unversehrtheit der verwendeten Membranen während der

Probenentnahmezeiträume. Ein weiteres wichtiges Kriterium für die Auswahl eines Mikrodialy-

sekatheters, nämlich der Ausschluss einer Interaktion der zu untersuchenden Substanz mit dem

Membranmaterial, wurde ebenfalls erfüllt. Auf Grund der Molekülstruktur und geringen Lipo-

philie von Cefpirom kann eine Interaktion mit dem verwendeten Membranmaterial, Polyaryle-

thersulfon, ausgeschlossen werden. Des Weiteren verhinderte die Wahl des Cut-offs von 20.000

Dalton einerseits den Durchtritt von großen Molekülen wie Proteinen, war aber andererseits

groß genug, um die von PLOCK u. KLOFT (2005) beschriebene Voraussetzung für eine akzep-

table relative Wiederfindung (das Molekulargewicht der Substanz sollte höchstens ein Viertel des

Cut-offs der Membran betragen) zu erfüllen (Molekulargewicht von Cefpirom = 514,57 Dal-

ton). Die Größe der Membran beeinflusst sowohl das Gewebe, in welches sie eingesetzt wird, als

auch die relative Wiederfindung. Der kleine Durchmesser der Membran des Katheters CMA 61

(0,6 Millimeter) verursachte lediglich ein geringes Gewebetrauma in der Lunge und die Länge

der Membran (30 Millimeter) schuf gute Voraussetzungen für eine hohe relative Wiederfindung.

141

Diskussion

Um eine hohe relative Wiederfindung zu erzielen, ist es grundsätzlich wichtig, alle Faktoren, die

diese beeinflussen können, zu berücksichtigen. Da die Beschaffenheit der Membran Einfluss auf

die relative Wiederfindung nimmt, wurde eine Membran ausgewählt, die wie oben beschrieben

auf Grund ihrer Größe und ihres Cut-offs gute Voraussetzungen für eine möglichst hohe relative

Wiederfindung schuf. Auch die Größe und die physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu

untersuchenden Substanz wirken sich auf die relative Wiederfindung aus. Gemäß CHAURASIA

(1999) und PLOCK u. KLOFT (2005) sind lipophile und größere Substanzen mit einem Mole-

kulargewicht größer als 1000 Dalton für herkömmliche Mikrodialyseversuche eher ungeeignet.

Cefpirom dagegen besitzt auf Grund seiner geringen Lipophilie und des relativ niedrigen Mole-

kulargewichts ideale Eigenschaften zur Konzentrationsbestimmung mittels Mikrodialyse. Weiter-

hin kann, wie von DE LANGE et al. (2000) beschrieben, die Zusammensetzung des Perfusats die

relative Wiederfindung beeinflussen. Das Perfusat sollte sich isoosmotisch zur der den Katheter

umgebenden Flüssigkeit verhalten. Auch dieses Kriterium wurde erfüllt, indem die Katheter

mit Ringer-Lösung perfundiert wurden. Auch die Flussrate hat großen Einfluss auf die relative

Wiederfindung. Je niedriger die Flussrate, desto höher ist die relative Wiederfindung. Das Her-

absetzen der Flussrate wird allerdings durch die untere Quantifikationsgrenze der analytischen

Methode limitiert. HERKNER et al. (2002) bestimmten die relative Wiederfindung in vitro. Bei

einer Flussrate von 1,5 Mikroliter pro Minute ermittelten sie eine relative Wiederfindung von 78

Prozent; bei einer Flussrate von 4 Mikroliter pro Minute betrug die relative Wiederfindung 43

Prozent. Die In-vitro-Wiederfindungsversuche und In-vivo-Versuche dieser Arbeit wurden bei ei-

ner Flussrate von 1,5 Mikroliter pro Minute durchgeführt (in Versuch 3 wurde die Flussrate zeit-

weise erhöht [siehe Kapitel 5.4]). Somit wurden einerseits gute Voraussetzungen für eine hohe

relative Wiederfindung geschaffen und andererseits waren die Probenvolumina groß genug, um

sie valide analysieren zu können. Weitere Einflussfaktoren bezüglich der relativen Wiederfindung

sind die Temperatur und die Beschaffenheit der Matrix (PLOCK u. KLOFT 2005). Alle genann-

ten Faktoren sollten bei der Bestimmung der relativen Wiederfindung berücksichtigt werden.

Wie in Kapitel 2.1.8 erläutert, sind in der Literatur verschiedene Methoden zur Ermittlung der

relativen Wiederfindung beschrieben. Von den genannten In-vivo-Methoden wird die Retrodia-

lyse am häufigsten verwendet. Dies war in den Versuchen 1 bis 3 allerdings aus Tierschutzaspek-

ten nicht möglich, denn die Bestimmung der relativen Wiederfindung mittels Retrodialyse hätte

nach Einsatz des Katheters, vor der Behandlung mit Cefpirom erfolgen müssen. Dies hätte eine

Verlängerung der Narkosedauer (etwa 10 Stunden) um mindestens 2 Stunden bedeutet. Somit

wurde die relative Wiederfindung in vitro bestimmt, wobei jedoch alle oben genannten Einfluss-

faktoren berücksichtigt wurden. Um möglichst ähnliche Bedingungen bezüglich der Temperatur

im Vergleich zur In-vivo-Situation zu schaffen, wurden die In-vitro-Versuche bei einer konstanten

Temperatur von 37 Grad Celsius durchgeführt. Der Einfluss der Beschaffenheit der Matrix wur-

de durch ständiges Umrühren der Stammlösungen mit einem Magnetrührer berücksichtigt. Ge-

mäß BRUNNER und LANGER (2006) können Schwankungen der relativen Wiederfindung

(zwischen 10 und 20 Prozent) auch zwischen einzelnen Kathetern der gleichen Art auftreten, da

142

Diskussion

diese handgefertigt werden. Deshalb empfiehlt es sich, wie auch für die in den Versuchen 1 bis 3

verwendeten Katheter durchgeführt, jeden Katheter von Einsatz im Tier einzeln zu kalibrieren.

Der Mittelwert und die Standardabweichung der relativen Wiederfindungen der 20 verwendeten

Katheter betrugen 80,43 Prozent und 11,99 Prozent.

143

Diskussion

5.2 Auswirkungen der Thorakotomie und der Katheter- implantation

In den Versuchen 2 und 3 wurde nach Einschläfern der Tiere der Sitz des Katheters im Lun-

gengewebe überprüft. Um die Auswirkungen des Katheters auf das Lungengewebe zu untersu-

chen, wurden pathologisch-makroskopische und -histologische Untersuchungen durchgeführt.

Auf Grund der Atembewegung und der damit einhergehenden Gefahr eines instabilen Sitzes

des Katheters im Gewebe gilt die Lunge eigentlich als ein schwieriges Organ zur Durchführung

eines Mikrodialyseversuchs. In den hier durchgeführten Versuchen befand sich jedoch die gesam-

te Länge der Membran bei allen 16 Tieren, bei welchen der Sitz des Katheters während (Tiere

Nr. 2 bis 4 Versuch 1) oder direkt nach Beendigung der 8-stündigen Sammelperiode (Tier Nr. 1

Versuch 1; alle 8 Tiere Versuch 2; Tiere Nr. 14, 16, 17, 20 Versuch 3) kontrolliert werden konnte,

sicher im Lungengewebe. Auch bei den restlichen 4 Tieren aus Versuch 3, bei denen der Sitz des

Katheters nach Beendigung der Sammelperiode nicht überprüft werden konnte, da diese erst 2,

3, 4 oder 5 Tage nach Entfernung des Katheters eingeschläfert wurden, muss sich der Katheter

auf Grund der konsistenten Ergebnisse sicher im Lungengewebe befunden haben. Während der

pathologisch-makroskopischen Untersuchung zeigte sich, dass Fibrinauflagerungen auf der Pleu-

ra pulmonalis im Bereich der Einstichstelle den Katheter zusätzlich fixierten.

Circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters (8 Stunden nach Behandlung) wurden bei allen Tie-

ren, bei welchen zu diesem Zeitpunkt eine pathologisch-makroskopische Untersuchung durch-

geführt wurde (alle 8 Tiere Versuch 2; Tiere Nr. 14, 16, 17, 20 Versuch 3), Fibrinauflagerungen

und meist auch Hämorrhagien im Bereich der Einstichstelle des Katheters beobachtet. Des Wei-

teren zeigten sich bei Anschnitt Hämorrhagien entlang des Stichkanals. Diese Veränderungen

waren bei den einzelnen Schweinen unterschiedlich stark ausgeprägt. Es konnte jedoch kein

Unterschied zwischen denjenigen Schweinen, welche sich während des gesamten Probeentnah-

mezeitraumes unter Narkose befanden (alle Tiere Versuch 2) und denjenigen Schweinen, die sich

während des Probeentnahmezeitraumes in wachem Zustand in einem modifizierten Metabolis-

muskäfig befanden (alle Tiere Versuch 3), festgestellt werden. Somit zeigt sich, dass durch Bewe-

gung und eigenständige Atmung der Tiere keine zusätzlichen Veränderungen im Gewebe her-

vorgerufen werden. Dies bestätigt die Aussage von HANSEN et al. (1999), dass die Mikrodialyse

in wachen, sich bewegenden Individuen durchgeführt werden kann. Weiterhin konnten während

der makroskopischen Untersuchung ödematöse Veränderungen des Interstitiums im Bereich um

die Einstichstelle beobachtet werden. Dies steht im Widerspruch zu AULT et al. (1994), die nach

144

Diskussion

Durchführung eines Mikrodialyseversuchs in der Haut keine Ödembildung feststellen konnten.

Allerdings unterscheidet sich Lungengewebe in seinem Aufbau stark von dermalem Gewebe;

unter anderem ist die Lunge weitaus stärker vaskularisiert. Des Weiteren wurden bei der makro-

skopischen Untersuchung im Lungengewebe von einigen Schweinen Areale chronischer Pneu-

monie gefunden. Mittels histologischer Untersuchung von Gewebeproben dieser Areale konn-

te eine interstitielle Pneumonie diagnostiziert werden. Während der Akklimatisationsphase und

im Verlauf der prä-anästhetischen Untersuchung zeigten diese Schweine jedoch keine klinische

Symptome. Die Ergebnisse der histologischen Untersuchung bestätigten die makroskopischen

Befunde im Bereich der Einstichstelle. Im Gewebe der Pleura pulmonalis konnten oberflächlich fi-

brinöse Adhäsionen mit Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, sowie Fibrinbildung

und Hämorrhagien beobachtet werden. In einigen Fällen waren die Blut- oder Lymphgefäße

dilatiert. Bei fast allen Tieren war das interlobuläre Interstitium verbreitert und auch hier wurden

Neutrophile, Makrophagen, Fibrin und Hämorrhagien gefunden. In einigen Fällen waren die

Lymphgefäße dilatiert, selten fanden sich auch fibrinöse Thromben. Das Lumen der Bronchi und

Bronchuli war partiell gefüllt mit Neutrophilen, Makrophagen, Erythrozyten, abgeschilferten Epi-

thelzellen und manchmal auch mit Ödemflüssigkeit. Im Lumen der Alveolen fanden sich eben-

falls Neutrophile, Erythrozyten, Fibrin und teilweise Ödemflüssigkeit. Zusätzlich waren aktivier-

te Alveolarmakrophagen sichtbar und in einigen Fällen war das interalveoläre Interstitium durch

Aggregation von Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt. In der Literatur finden

sich keine Untersuchungen bezüglich der Auswirkung des Einsatzes von Mikrodialysekathetern

in Lungengewebe. Nach Einsatz von Mikrodialysekathetern in Haut-, Muskel-, und Leberge-

webe wurden akute inflammatorische Reaktionen mit initialer Infiltration von Lymphozyten,

Neutrophilen und Makrophagen beobachtet (AULT et al. 1994; DAVIES 1999). Nach PLOCK

und KLOFT (2005) hat die Infiltration des Gewebes mit Lymphozyten jedoch keinen Einfluss

auf die Funktion des Katheters. Auch wurde durch Messung von Gewebetrauma-Markern ge-

zeigt, dass das initiale Gewebetrauma eine halbe Stunde nach Einsatz des Katheters abklingt. Es

wird deshalb empfohlen, den Katheter für diese Zeitspanne vor der Behandlung zu perfundieren

(CHAURASIA et al. 2007). In den Versuchen 1, 2 und 3 wurde die Baseline-Sammelperiode

sogar auf 1 Stunde ausgedehnt.

Gemäß CHAURASIA et al. (2007) ruft der Katheter bei einer Implantationszeit von unter 24

Stunden keine Fremdkörperreaktion im Gewebe hervor. In den histologischen Schnitten der

Versuche 2 und 3 konnte ebenfalls kein Hinweis auf eine Fremdkörperreaktion gefunden wer-

den. Das Lungengewebe der Tiere Nr. 19, 15, 18 und 13 wurde 2, 3 ,4 beziehungsweise 5 Tage

nach Entfernung des Katheters pathologisch-makroskopisch und -histologisch untersucht. Bei

allen 4 Tieren wurden noch geringgradige Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der Pleu-

ra pulmonalis gefunden. 2 (Tier Nr. 19) und 3 Tage (Tier Nr. 15) nach Entfernung des Katheters

trat das interstitielle Ödem im Bereich der Einstichstelle noch deutlich hervor; nach 4 (Tier

Nr. 18) und 5 Tagen (Tier Nr. 13) war es lediglich direkt um die Einstichstelle sichtbar. Auch die

nach 2 und 3 Tagen noch vorhandenen Hämorrhagien entlang des Einstichkanals in der Tiefe des

145

Diskussion

Gewebes traten nach 4 und 5 Tagen nicht mehr auf. Die Hämorrhagien waren somit nach 4 Ta-

gen resorbiert. Bei der histologischen Untersuchung der Gewebeproben zeigten sich im Bereich

der Pleura pulmonalis nach 2 und 3 Tagen noch fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche mit Ag-

gregation von Neutrophilen und Makrophagen, sowie Fibrinbildung und Hämorrhagien. Nach

3 Tagen war bereits Granulationsgewebe mit Neovaskularisation sichtbar. Nach 4 und 5 Tagen

fanden sich Neutrophile, Makrophagen und Fibroblasten, sowie große Areale mit Granulations-

gewebe und Neovaskularisation. Im Lumen der Bronchi und Bronchuli befanden sich nach 2 und

3 Tagen noch Erythrozyten; nach 4 und 5 Tagen waren lediglich noch einzelne Eosinophile und

abgeschilferte Epithelzellen sichtbar. Das Lumen der Alveolen wies nach 2 Tagen Neutrophile,

Erythrozyten, Fibrin und Ödemflüssigkeit auf; nach 3, 4 und 5 Tagen war noch geringgradige

Hämorrhagien sichtbar und das interalveoläre Interstitium war durch Aggregation von Neutro-

philen, Makrophagen und Fibroblasten lediglich an einzelnen Stellen verdickt.

Auf Grund der geschützten anatomischen Lage der Lunge innerhalb des Thorax ist ein invasiver

chirurgischer Eingriff notwendig, bevor der Mikrodialysekatheter im Lungengewebe platziert

werden kann. Da der Einsatz des Katheters durch die Brustwand mittels Trokar fast immer zur

Entstehung eines Pneumothorax führt, ist eine Thorakotomie Voraussetzung für die Durchfüh-

rung eines erfolgreichen Mikrodialyseversuchs in der Lunge (ZEITLINGER et al. 2005). Aller-

dings sind fast alle Methoden, die zur Konzentrationsbestimmung von Arzneimitteln in der Lun-

ge eingesetzt werden können, mehr oder weniger invasiv. Von den in Kapitel 2.1 aufgeführten

Untersuchungsmodellen können Antiinfektiva-Konzentrationen im Respirationstrakt, neben der

Mikrodialyse, durch die Entnahme von Gewebeproben, die BAL, die Entnahme von ELF mittels

Blättchenmethode oder durch bildgebende Verfahren bestimmt werden. Von den genannten Me-

thoden sind einzig die bildgebenden Verfahren nicht-invasiv, allerdings können mit diesen Me-

thoden nur Konzentrationen einiger antibakterieller Substanzen bestimmt werden. Des Weiteren

sind sie auf spezielle Zentren beschränkt und mit einem enormen Kosten- und Arbeitsaufwand

verbunden. Die BAL und die Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode sind semiinvasive

Methoden, wobei die BAL für quantitative Konzentrationsbestimmungen nicht geeignet ist. Mit

der Entnahme von ELF ist es nicht möglich, die nicht-proteingebundene, das heißt pharmakolo-

gisch aktive Arzneimittelfraktion zu bestimmen. Zusätzlich ist die Anzahl der Probenentnahmen

von einem Tier begrenzt. Die Entnahme von Gewebeproben ist eine invasive Methode und es

muss pro Probenentnahmezeitpunkt mindestens 1 Tier getötet werden. Des Weiteren ist auch mit

dieser Methode keine separate Bestimmung der nicht-proteingebundenen Arzneimittelfraktion

möglich. Da mittels Mikrodialyse keine biologische Flüssigkeit entnommen wird und daher Pro-

benentnahmen in kurzen Zeitintervallen über längere Zeiträume von einem Tier möglich sind,

können vollständige Konzentrations-Zeitprofile mit Daten von einem Individuum erstellt wer-

den. Im Vergleich zur Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode oder zur Entnahme von Ge-

webeproben können die Tierzahlen somit erheblich reduziert werden. Auch ist die Mikrodialyse

von den oben genannten Untersuchungsmodellen, neben MRS, die einzige Methode, mit der

die nicht-proteingebundene Arzneimittelfraktion direkt bestimmt werden kann. Weiterhin ist es

146

Diskussion

allein mittels Mikrodialyse möglich, Konzentrationen in der EZF der Lunge, also direkt am Ort

des infektiösen Geschehens zu bestimmen (LIU u. DERENDORF 2003). In Versuch 3 zeigten

die Schweine Nr. 19, 15, 18 und 13 nach der Operation, trotz der Invasivität der durchgeführ-

ten Thorakotomie, ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Nach Ausleitung der Narkose standen

die Tiere aufrecht und fraßen nach spätestens 2 Stunden. In dem 8-stündigen Probenentnah-

mezeitraum zeigten sie keinerlei Beeinträchtigung durch den im Lungengewebe befindlichen

Mikrodialysekatheter. Dies bestätigt die in Mikrodialysestudien in der menschlichen Lunge ge-

sammelten Erfahrungen, dass nach Implantation des Katheters in das Lungengewebe keine durch

den Katheter verursachten Nebenwirkungen oder Komplikationen auftreten (ZEITLINGER et

al. 2005). Auch nach Entfernung des Katheters am Ende des Probenentnahmezeitraumes zeigten

die Schweine bis zu ihrer schmerzfreien Tötung 2, 3, 4 oder 5 Tage nach der Operation ein un-

gestörtes Fress- und Bewegungsverhalten.

147

Diskussion

5.3 Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazellulären Flüssigkeit der Lunge und im Blut- plasma von Menschen und Schweinen

Auf Grund ähnlicher Bedingungen (Entnahme der Mikrodialysat-Proben von wachen Indivi-

duen) sollen die Ergebnisse aus Versuch 3 mit von HERKNER et al. (2002) in einer Mikrodi-

alysestudie in der menschlichen Lunge erzielten Ergebnissen (siehe Kapitel 2.2.4) verglichen

werden. Den Menschen und Schweinen wurde Cefpirom intravenös in einer ähnlichen Dosie-

rung von 26 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht (Schwein) und 2 Gramm pro Mensch

(entspricht bei einem Gewichtsbereich der 5 Probanden von 60 bis 94 Kilogramm im Mittel

etwa 26 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht) verabreicht. In der menschlichen Lunge

wurde eine mittlere Cmax

von 74 Mikrogramm pro Milliliter mit einer zugehörigen mittleren

Tmax

von 49 Minuten beobachtet (n=5). In der EZF der Lunge von Schweinen betrug die mitt-

lere Cmax

21,26 Mikrogramm pro Milliliter und die zugehörige mittlere Tmax

30 Minuten (n=8).

Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zur mittleren

AUClast

von Blutplasma (Gesamt-Fraktion) betrug 0,67 beim Mensch und 0,30 beim Schwein.

Demnach wurde für Cefpirom in der EZF der Lunge der Menschen und Schweine eine ähnliche

Tmax

beobachtet. Deutliche Unterschiede zeigen sich bezüglich der Cmax

, welche in der EZF der

Schweine etwa nur die Hälfte der beobachteten Konzentration beim Menschen beträgt. Auch das

Verhältnis der AUClast

der EZF zu Blutplasma ist beim Menschen fast doppelt so hoch wie beim

Schwein. Allerdings müssen bei diesem Vergleich Unterschiede bezüglich der Versuchsdurchfüh-

rung in Betracht gezogen werden. In dem von HERKNER et al. (2002) durchgeführten Ver-

such wurden die Mikrodialysat- und Blutplasma-Proben mittels mizellarer elektrokinetischer

Chromatographie analysiert, wogegen die Proben aus Versuch 3 mittels SPE-HPLC-MS/MS

analysiert wurden. Auch wurde Cefpirom bei Mensch und Schwein etwas unterschiedlich do-

siert, denn jeder Mensch wurde unabhängig von seinem Körpergewicht mit 2 Gramm Cefpirom

behandelt; den Schweinen jedoch wurde Cefpirom in einer Dosierung von 26 Milligramm pro

Kilogramm Körpergewicht verabreicht. Des Weiteren gab es Unterschiede bei der Bestimmung

der relativen Wiederfindung. Zwar wurde die relative Wiederfindung in beiden Versuchen mit

der gleichen Methode in vitro bestimmt, allerdings wurde in Versuch 3 im Gegensatz zu dem von

HERKNER et al. (2002) durchgeführten Versuch jeder Katheter einzeln kalibriert. Auch war

die Baseline-Sammelperiode unterschiedlich lang; 30 Minuten bei HERKNER et al. (2002)

148

Diskussion

und 60 Minuten in Versuch 3. Weiterhin wurden bei Mensch und Schwein Mikrodialysekatheter

mit unterschiedlichen Membranen verwendet. Die für den Einsatz in der menschlichen Lunge

verwendeten Katheter wiesen eine Membranlänge von 50 Millimeter und einen Cut-off von

15.000 Dalton auf, die in der Lunge der Schweine eingesetzten Katheter eine Membranlänge

von 60 Millimeter und einen Cut-off von 20.000 Dalton. Ein weiterer wichtiger Unterschied

betrifft die Flussrate, denn in Versuch 3 ist von einer Flussrate im Bereich von 1,5 Mikroliter pro

Minute an der Membran auszugehen (siehe Kapitel 5.4), wogegen in dem von HERKNER et

al. (2002) durchgeführten Versuch bei 3 Probanden ebenfalls eine Flussrate von 1,5 Mikroliter

pro Minute verwendet wurde, bei 2 Probanden wurde die Flussrate jedoch auf 4,0 Mikroliter

pro Minute eingestellt. Zusätzlich muss bei einem Vergleich zwischen Mensch und Schwein in

Betracht gezogen werden, dass es sich hierbei um 2 unterschiedliche Spezies handelt, bei welchen

sich eine Substanz bezüglich der Absorption, Verteilung, Metabolisierung und Exkretion unter-

schiedlich verhalten kann.

149

Diskussion

5.4 Analyse der Lungen-Mikrodialysat-Proben und Ver- gleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extrazel- lulären Flüssigkeit der Lunge der Versuche 1, 2 und 3

Der Ausschluss von großen Molekülen wie Proteinen aus dem Dialysat ermöglicht neben der

direkten Messung der nicht-proteingebundenen Arzneimittelfraktion eine schnelle Aufarbeitung

der Proben zur Analyse (BRUNNER u. LANGER 2006). Dies zeigte sich besonders deutlich

in Versuch 2, da hier Mikrodialysat-, Blutplasma-, ELF- und Lungenhomogenat-Proben aufgear-

beitet wurden. Während zur Aufarbeitung der Mikrodialysat-Proben lediglich bis zu 4 Arbeits-

schritte nötig waren, mussten die Blutplasma- und ELF-Proben in 9 und die Lungenhomogenat-

Proben sogar in 13 Arbeitsschritten aufgearbeitet werden (siehe Kapitel 3.6). In der Literatur wird

die Analyse von Mikrodialysat-Proben auf Grund der geringen Probenvolumina und niedrigen

Konzentrationen als schwierige Aufgabe beschrieben (DE LANGE et al. 2000; BRUNNER

u. LANGER 2006; CHAURASIA et al. 2007). Die Mikrodialysat-Proben aus den Versuchen

1 bis 3 wurden mittels SPE-HPLC-MS/MS analysiert. Die verwendete analytische Methode

war ausreichend sensitiv, da mit einer unteren Quantifizierungsgrenze von 0,01 Mikrogramm

pro Milliliter (Versuch 1 und 2) beziehungsweise 0,05 Mikrogramm pro Milliliter (Versuch 3)

selbst niedrige Konzentrationen sicher bestimmt werden konnten. In Versuch 3 zeigte sich, dass

auch ein geringes Probenvolumen von 10 Mikroliter zur Analyse ausreichte (in diesem Versuch

wurden pro Probenentnahmezeitpunkt jeweils 10 Mikroliter analysiert, da das Probenvolumen

zeitweise unter 30 Mikroliter lag).

Ein Vorteil der Mikrodialyse ist die Erstellung vollständiger engmaschiger Konzentrations-Zeit-

profile mit Daten von einem Individuum und folglich eine hohe Reproduzierbarkeit bezie-

hungsweise eine geringe Variabilität (DAVIES 1999; CHAURASIA et al. 2007). Dies wurde in

den Versuchen 1 bis 3 bestätigt, denn Proben konnten in kurzen Zeitabständen (20 Minuten) ent-

nommen werden und innerhalb der einzelnen Versuche zeigten die Konzentrations-Zeitprofile

von Cefpirom in der EZF eine geringe Variabilität zwischen den einzelnen Tieren. In Versuch 3

musste die Flussrate bei einigen Tieren zeitweise adaptiert werden, da die Volumina der von den

wachen, selbstständig atmenden Tieren gewonnenen Proben zeitweise weniger als 30 Mikroliter

betrugen. Da die außerhalb des Thorax verlaufenden Schläuche durchgängig waren und auch

kein Defekt der Pumpe vorlag, ist zu vermuten, dass die Bewegung der Atemmuskulatur eine

Kompression des Schlauchsystems innerhalb des Thorax auslöste, und somit der Fluss des Perfu-

sats verlangsamt wurde. Aus Mikrodialyseversuchen in der Lunge des Menschen ist ein derartiges

150

Diskussion

Phänomen nicht bekannt. Allerdings befinden sich die Menschen während des Probenentnahme-

zeitraumes in liegender Position. Ruckartige oder heftige Bewegungen können hier vermieden

werden. Die Schweine in Versuch 3 dagegen wurden nach Ausleitung der Narkose in einen mo-

difizierten Stoffwechselkäfig verbracht, wo ihre Bewegungsfreiheit zwar teilweise, jedoch nicht

völlig eingeschränkt war. Um trotz der verlangsamten Flussrate Probenvolumina in Bereich von

30 Mikroliter zu erreichen, wurde die Flussrate zeitweise erhöht. Der relativ konstante Verlauf der

Konzentrations-Zeitkurven für Cefpirom zeigt, dass, obwohl an der Mikrodialysepumpe höhere

Flussraten eingestellt wurden, die Flussrate an der Membran höchstwahrscheinlich weiterhin im

Bereich von 1,5 Mikroliter pro Minute lag. Vergleicht man die mittleren Konzentrationen in der

EZF der Versuche 1 (Probenentnahme von narkotisierten Tieren, Thorax mit Tupfern abgedeckt),

2 (Probenentnahme von narkotisierten Tieren, Thorax lege artis verschlossen) und 3 (Probenent-

nahme von wachen Tieren, Thorax lege artis verschlossen) (siehe Abbildung 45), wurden initial

(zwischen 20 und 40 Minuten nach Behandlung) die höchsten Konzentrationen in Versuch 3

beobachtet. Die mittlere Konzentrations-Zeitkurve von Versuch 3 zeigte ab 40 Minuten nach

Behandlung einen steiler abfallenden Verlauf als die Konzentrations-Zeitkurve von Versuch 2, so

dass sie ab 220 Minuten nach Behandlung etwa gleich mit der Kurve aus Versuch 1 verlief. Bei

einem Vergleich der Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Versuche 2 und

3 mittels statistischer Testverfahren konnte gezeigt werden, dass die Konzentrations-Zeitprofi-

le bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Versuch“ nicht signifikant unterschiedlich waren. Die

Narkose hat also offenbar keinen Einfluss auf die Konzentrationen von Cefpirom in der EZF der

Lunge. Die mittleren Konzentrations-Zeitkurven der Versuche 1 und 2 verliefen in etwa parallel,

wobei die Werte aus Versuch 2 die Werte aus Versuch 1 um das zwei- bis dreifache überstiegen.

Bei einem Vergleich der Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der Versuche 1

und 2 mittels statistischer Testverfahren konnte gezeigt werden, dass die Konzentrations-Zeit-

profile bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Versuch“ signifikant unterschiedlich waren. Der

Verschluss des Thorax hat also einen Einfluss auf die Konzentrationen von Cefpirom in der EZF.

Die höchste mittlere Cmax

in der EZF wurde mit 21,26 Mikrogramm pro Milliliter in Versuch 3

beobachtet. Die mittlere Cmax

in Versuch 2 lag mit 18,72 Mikrogramm pro Milliliter nur etwas

niedriger. In der EZF in Versuch 1 wurde eine mittlere Cmax

von 8,22 Mikrogramm pro Milliliter

beobachtet; diese betrug somit weniger als die Hälfte der mittleren Cmax

von Versuch 2 und 3.

In Versuch 1, 2 und 3 wurde jeweils eine Tmax

von 40, 43 und 30 Minuten beobachtet. Dies lässt

auf eine schnelle Verteilung von Cefpirom aus dem vaskulären Kompartiment in die EZF der

Lunge schließen. Für die Konzentrations-Zeitkurven der EZF der Versuche 1 und 2 wurde eine

ähnliche mittlere AUClast

von 3948 (Versuch 1) und 3608 Minuten mal Mikrogramm pro Mil-

liliter (Versuch 2) ermittelt; die in Versuch 3 berechnete mittlere AUClast

von 2435 Minuten mal

Mikrogramm pro Milliliter war etwas kleiner.

151

Diskussion

Die Ausführungen in den Kapiteln 5.3 (Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der EZF

der Lunge von Menschen und Schweinen) und 5.4 (Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen

in der EZF der Lunge der Versuche 1, 2 und 3) zeigen, dass es bei einem Vergleich von mittels

Mikrodialyse gemessenen Antiinfektiva-Konzentrationen in der Lunge von Bedeutung ist, die

Bedingungen der Versuchsdurchführung zu berücksichtigen. Aus den Ergebnissen der Versuche

1 bis 3, sowie aus den Ergebnissen, die im Versuch von HERKNER et al. (2002) erzielt wurden,

kann abgeleitet werden, dass für zukünftige Versuche eine vollständiger Verschluss des Thorax

durch Nähte nach Einsatz des Katheters in die Lunge zu empfehlen ist, da dies der klinischen

Situation entspricht. Die Narkose hat offenbar keinen Einfluss auf die Konzentrationen von

Cefpirom in der Lunge, deshalb könnten bei zukünftigen Versuchen Proben von narkotisierten

Tieren entnommen werden, um eine Kompression des Schlauchsystems durch die Bewegung

der Atemmuskulatur auszuschließen. Weiterhin empfiehlt sich die Wahl einer niedrigen Flussrate

(z. B. 1,5 Mikroliter pro Minute), um eine möglichst hohe relative Wiederfindung zu erzielen.

Aus den resultierenden niedrigen Probenvolumina ergibt sich der Anspruch an eine sensitive

analytische Methode (z. B. SPE-HPLC-MS/MS). Faktoren wie geeignete Membranlängen zur

Anwendung in der Lunge verschiedener Spezies lassen sich nicht standardisieren.

152

Diskussion

5.5 Vergleich der Cefpirom-Konzentrationen in der Extra- zellulären Flüssigkeit der Lunge, im Blutplasma, Sekret des Bronchialepithels und Lungengewebe

Plasmakonzentrationen und Konzentrationen in Zielgeweben können stark voneinander abwei-

chen. Zunächst kann nur die nicht an Plasmaproteine gebundene Fraktion einer Substanz die sys-

temische Zirkulation verlassen (PLOCK u. KLOFT 2005). Zudem ist die Anreicherung in einem

Gewebe einerseits von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz und anderer-

seits von Volumen, Oberfläche und Vaskularisation des jeweiligen Gewebes sowie von den Eigen-

schaften der begrenzenden biologischen Membranen abhängig (BERGOGNE-BEREZIN 1995;

FICHTL 2001). Weiterhin können entzündliche Prozesse die Penetration von Arzneimitteln in

Zielgewebe verstärken oder behindern. Bei Infektionen werden Entzündungsherde jedoch immer

durch Areale gesunden Gewebes begrenzt und die im gesunden Gewebe erreichten Arzneimittel-

konzentrationen sind entscheidend, um eine Ausbreitung der Erreger zu verhindern (BALDWIN

et al. 1992; BERGOGNE-BEREZIN 1995). Die Versuche 1, 2 und 3 wurden daher mit klinisch

gesunden Tieren durchgeführt. In allen 3 Versuchen waren im Blutplasma gemessene Cefpirom-

Konzentrationen (Gesamt-Fraktion) vergleichsweise höher als Cefpirom-Konzentrationen in der

EZF (nicht-proteingebundene Fraktion). Bei einem Vergleich der Konzentrations-Zeitprofile von

Cefpirom in der EZF der Lunge und im Blutplasma (Versuch 2) mittels statistischer Testverfahren

konnte gezeigt werden, dass die Konzentrations-Zeitprofile bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors

„Matrix“ signifikant unterschiedlich waren. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-

proteingebundene Fraktion) zur mittleren AUClast

von Blutplasma (Gesamt-Fraktion) betrug 0,59

(Versuch 1), 0,39 (Versuch 2) und 0,30 (Versuch 3). Der Unterschied zwischen den Cefpirom-

Konzentrationen im Blutplasma und in der EZF war, wie bei einer intravenösen Applikation zu

erwarten, an den frühen Entnahmezeitpunkten besonders deutlich. 20 Minuten nach Behandlung

betrug das Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebun-

dene Fraktion) zu Blutplasma (Gesamt-Fraktion) 0,16 (Versuch 1), 0,22 (Versuch 2) und 0,25

(Versuch 3). Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma nahmen schneller ab als Cefpirom-Kon-

zentrationen in der EZF. Dies zeigen die Konzentrations-Zeitkurven, sowie der Anstieg des Ver-

hältnisses der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion)

zu Blutplasma (Gesamt-Fraktion) im Verlauf des Probenentnahmezeitraumes, welches 8 Stunden

nach Behandlung 0,47 (Versuch 1), 0,72 (Versuch 2) und 0,58 (Versuch 3) betrug. Cefpirom wird

also aus dem vaskulären Kompartiment schneller eliminiert als aus der EZF der Lunge.

153

Diskussion

Die mittleren Konzentrations-Zeitkurven der EZF und ELF (Versuch 2) zeigten mit Ausnahme

der Zeitspanne zwischen den Probenentnahmezeitpunkt 20 und 60 Minuten nach Behandlung

einen parallelen Kurvenverlauf (siehe Abbildung 27). Die mittels Blättchenmethode bestimmten

Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Gesamt-Fraktion) waren vergleichsweise höher als die

mittels Mikrodialyse bestimmte Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebunde-

ne Fraktion). Bei einem Vergleich der Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom in der EZF der

Lunge und in der ELF mittels statistischer Testverfahren konnte gezeigt werden, dass die Kon-

zentrations-Zeitprofile bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors „Matrix“ signifikant unterschied-

lich waren. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zur

mittleren AUClast

der ELF (Gesamt-Fraktion) betrug 0,59. Das Verhältnis der mittleren Cefpirom-

Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) zu ELF (Gesamt-Fraktion) stieg

von 0,39 (20 Minuten nach Behandlung) auf 0,72 (2 Stunden nach Behandlung) an und fiel dann

wieder leicht ab (auf 0,55 [8 Stunden nach Behandlung]). Die im Vergleich zur EZF höheren

Konzentrationen von Cefpirom in der EFL erscheinen zunächst überraschend, da Beta-Laktam-

Antibiotika auf Grund ihrer geringen Lipophilie das Alveolar- und Bronchialepithel schlecht

passieren können und sich überwiegend in der EZF anreichern (BARZA u. CHUCHURAL

1985; CRUZIANI et al. 1996). Die pathologische Untersuchung der Lungen zeigte, dass das

Lungengewebe der Tiere Nr. 7, 8, 10, 11 und 12 teilweise entzündlich verändert war. Gemäß

CRUZIANI et al. (1996) können Entzündungen die Permeabilität des Alveolar- und Bronchi-

alepithels und somit die Konzentrationen in der ELF erhöhen. Des Weiteren setzen sich die in

der ELF gemessenen Konzentrationen aus nicht-proteingebundenen und proteingebundenen

Anteilen zusammen, da nicht nur im Blut, sondern auch in anderen Flüssigkeiten und Geweben

Substanzen zu einem gewissen Grad an Proteine und Membranphospholipide gebunden sind

(BARZA u. CHUCHURAL 1985). Bei den in der EZF bestimmten Konzentrationen dagegen

handelt es sich um die nicht-proteingebundene, pharmakologisch aktive Fraktion.

Nach CRUZIANI et al. (1996) unterschreiten Konzentrationen von Beta-Laktam-Antibiotika

in der ELF Konzentrationen im Blutplasma in der Regel deutlich. An den frühen Entnahmezeit-

punkten stimmen die Ergebnisse aus Versuch 2 mit dieser Aussage überein, denn das Verhältnis

der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der ELF zu Blutplasma betrug 20 Minuten, 1 und

2 Stunden nach Behandlung 0,57, 0,65 und 0,64. Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma

nahmen jedoch schneller ab als Cefpirom-Konzentrationen in der ELF, denn 4, 6 und 8 Stunden

nach Behandlung betrug das Verhältnis 0,84, 0,95 und 1,31. Cefpirom wird also aus dem vasku-

lären Kompartiment schneller eliminiert als aus der ELF. Bei einem Vergleich der Konzentrati-

ons-Zeitprofile von Cefpirom im Blutplasma und in der ELF mittels statistischer Testverfahren

konnte gezeigt werden, dass die Konzentrations-Zeitprofile bezüglich des Inter-Subjekt-Faktors

„Matrix“ signifikant unterschiedlich waren. Das Verhältnis der mittleren AUClast

der ELF zur

mittleren AUClast

von Blutplasma betrug 0,67. Ähnliche Werte wurden von HALSTEAD et al.

(1992) in einer Studie mit Kälbern (n=4) ermittelt, in welcher nach intramuskulär Applikation

des Beta-Laktam-Antibiotikums Ceftiofur (in einer Dosierung von 2,2 und 4,4 Milligramm pro

154

Diskussion

Kilogramm Körpergewicht) Blutproben (30 Minuten, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 und 12 Stunden

nach Behandlung) und ELF-Proben (stündlich bis 12 Stunden nach Behandlung) entnommen

wurden. Nach Applikation von Ceftiofur in einer Dosierung von 2,2 Milligramm pro Kilo-

gramm Körpergewicht betrug das Verhältnis der mittleren AUClast

der ELF zur mittleren AUClast

von Blutplasma 0,69; nach Applikation in einer Dosierung von 4,4 Milligramm pro Kilogramm

Körpergewicht 0,54. Generell nachteilig bei der Entnahme von ELF mittels Blättchenmethode

ist, dass Konzentration und Zeit nicht immer exakt korreliert werden können, da es sich bei der

entnommenen Probe nicht zwangsläufig um frisch sekretierte Flüssigkeit handelt, sondern dass

diese sich über längere Zeit auf dem Bronchialepithel angesammelt haben kann. Des Weiteren

ist keine Differenzierung zwischen proteingebundener und nicht-proteingebundener Arzneimit-

telfraktion möglich und mit den Blättchen wird nicht nur epitheliale Flüssigkeit, sondern auch

Mucus und verschiedene Zellen entnommen, wodurch die epitheliale Flüssigkeit verdünnt wird

(CRUZIANI et al. 1996).

In Versuch 2 wurde 8 Stunden nach Behandlung eine mittlere Konzentration von 1,97 Mikro-

gramm pro Milliliter in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und eine mittlere Konzen-

tration von 2,08 Mikrogramm pro Gramm im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) ermittelt. Das

Verhältnis betrug 0,95. Da sich Beta-Laktam-Antibiotika überwiegen in der EZF anreichern,

Gewebeproben jedoch neben extrazellulärer Flüssigkeit auch intraluminale Komponenten wie

Bronchialmucus und eine Vielfalt an Zellen enthalten, werden extrazelluläre Konzentrationen

von Beta-Laktam-Antibiotika auf Grund von Verdünnung der EZF mit diesen anderen Kompo-

nenten häufig unterschätzt (NIX 1998). Die in Versuch 2 erzielten Ergebnisse scheinen zunächst

einmal im Widerspruch zu dieser Aussage zu stehen. Jedoch ist es auch bei fachgerechter Entblu-

tung insbesondere bei gut durchbluteten Geweben wie der Lunge nicht möglich, das Gewebe

komplett von Blut zu befreien. Da der Anteil von Blut im Homogenat nicht quantifizierbar ist,

besteht die Gefahr einer Verfälschung der Konzentrationen (WISE 1986). Deshalb überschätzen

die in den Gewebeproben bestimmten Konzentrationen in Versuch 2, obwohl die Tiere sorgfältig

entblutet wurden, möglicherweise die tatsächlichen Konzentrationen von Cefpirom im Lungen-

gewebe. Des Weiteren handelt es sich bei den im Lungengewebe gemessenen Konzentrationen

um nicht-proteingebundene und proteingebundene Anteile, die in der EZF bestimmten Kon-

zentrationen dagegen bestehen lediglich aus der nicht-proteingebundenen Fraktion.

Gemäß CRUZIANI et al. (1996) ist das Gewebe-Blutplasma-Verhältnis von Beta-Laktam-An-

tibiotika in der Regel kleiner als 1. Beispielsweise in einer Studie im Mensch wurde nach in-

travenöser Applikation von Amoxicillin ein Gewebe-Blutplasma-Verhältnis von 0,8 ermittelt

(BERGOGNE-BEREZIN 1995). In Versuch 2 betrug das Verhältnis der mittleren Cefpirom-

Konzentration im Lungengewebe zu Blutplasma 8 Stunden nach Behandlung 0,76. Ein generel-

ler Nachteil bei der Konzentrationsbestimmung von Antiinfektiva in Gewebeproben ist, dass mit

dieser Methode im Gegensatz zur Mikrodialyse keine Differenzierung zwischen proteingebun-

dener und nicht-proteingebundener Arzneimittelfraktion möglich ist.

155

Diskussion

5.6 Einsatz der Mikrodialyse für Pharmakokinetik- Pharmakodynamik-Korrelationen

Ziel der antibakteriellen Therapie sollte eine vollständige klinische und bakteriologische Heilung

sein, denn die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen gegenüber antibakteriellen Wirk-

stoffen nimmt stetig zu. Deshalb ist es von großer Bedeutung, mit einer antibakteriellen Therapie

nicht nur die klinischen Symptome zu heilen, sondern auch die Bakterien vollständig abzutöten.

Bei lebensmittelliefernden Tieren ist der Verbraucher zusätzlich um Rückstände von Antiinfekti-

va im Fleisch besorgt (FRIENDSHIP 2007). Bei der Dosierung von Antiinfektiva muss deshalb

der Grundsatz gelten: so wenig wie möglich, aber so viel wie nötig, um eine klinische und bak-

teriologische Heilung zu gewährleisten. Dies ist nur durch adäquate, auf wissenschaftlicher Basis

ausgearbeitete Dosierungsschemata möglich.

Hierbei gewinnen PK-PD-Korrelationen immer mehr an Bedeutung. Die Pharmakokinetik

beschreibt die Exposition der Erreger gegenüber der antibakteriellen Substanz am Ort der in-

fektiösen Geschehens (TOUTAIN et al. 2002; TOUTAIN 2003). Dabei ist es wichtig, dass die

pharmakokinetischen Parameter, statt sie von im Blutplasma gemessenen Konzentrationen abzu-

leiten, basierend auf direkt im Zielgewebe gemessenen Konzentrationen bestimmt werden; denn

wie auch in den Versuchen 1, 2 und 3 gezeigt wurde, können Konzentrationen im Blutplasma

und Zielgewebe stark voneinander abweichen (MOUTON et al. 2008). Zielraum der antibak-

teriellen Therapie ist meist die EZF, da hier viele Erreger lokalisiert sind (CHAURASIA et al.

2007). Beispielsweise befinden sich wichtige bakterielle Erreger von Lungenerkrankungen beim

Schwein, z. B. Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis und Bordetella bronchiseptica, in

der EZF des Lungeninterstitiums. Deshalb sollten die pharmakokinetischen Parameter basierend

auf in der EZF gemessenen Konzentrationen berechnet werden.

Die Mikrodialyse kann genau diese Anforderungen erfüllen, da sie die Bestimmung der nicht-

proteingebundenen, pharmakologisch aktiven Fraktion antibakterieller Substanzen in der EZF,

das heißt direkt am Ort des infektiösen Geschehens, ermöglicht (PLOCK u. KLOFT 2005).

Prinzipiell kann die Mikrodialyse zur Konzentrationsbestimmung einer Vielzahl von Substanzen

in fast jedem Gewebe beziehungsweise jeder biologischen Flüssigkeit angewendet werden (DA-

VIES 1999). In der humanmedizinischen Forschung wurde die Mikrodialyse bereits in zahlrei-

chen pharmakokinetischen Untersuchungen in einer Reihe von Geweben sowohl im Mensch

als auch in Versuchstieren eingesetzt (BRUNNER et al. 2005). Auch im Rahmen humanmedi-

zinischer Zulassungsverfahren gewinnt die Mikrodialyse zur Bestimmung pharmakokinetischer

Parameter bereits zunehmend an Bedeutung (CHAURASIA et al. 2007).

156

Diskussion

5.7 Schlussfolgerungen

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung der Mikrodialyse zur Bestimmung der nicht-proteinge-

bundenen Fraktion des Beta-Laktam-Antibiotikums Cefpirom in der extrazellulären Flüssigkeit

der Lunge von Schweinen, sowie der Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der extrazel-

lulären Flüssigkeit der Lunge, im Sekret des Bronchialepithels, Lungengewebe und Blutplasma.

Bereits in Versuch 1 konnten vollständige engmaschige Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom

in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von 4 narkotisierten Schweinen durch Anwendung

der Mikrodialysetechnik erstellt werden. Dies wurde in Versuch 2 durch Konzentrationsbestim-

mungen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von weiteren 8 Schweinen bestätigt. Versuch

3 gibt einen Ausblick auf die Anwendung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Wirkstoffkon-

zentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von wachen Schweinen. Die in diesem

Versuch erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Thorakotomie bei adäquater Analgesie keine Aus-

wirkungen auf das Allgemeinbefinden der Tiere hat, und dass sich das Lungengewebe innerhalb

von 4 Tagen weitgehend von der Implantation des Mikrodialysekatheters erholt. Auch in Versuch

3 konnten trotz schwankender Probenvolumina valide Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom

in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von 8 Schweinen erstellt werden. In den Versuchen

1, 2 und 3 konnte gezeigt werden, dass sich die Mikrodialyse zur Konzentrationsbestimmung

des nicht-proteingebundenen Wirkstoffanteils hydrophiler Antiinfektiva in der extrazellulären

Flüssigkeit der Lunge eignet und häufige Probenentnahmen in kurzen Zeitabständen erlaubt.

Der Vergleich von Cefpirom-Konzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge, im

Sekret des Bronchialepithels, im Lungengewebe und im Blutplasma verdeutlicht, dass einerseits

Wirkstoffkonzentrationen im Blutplasma und der Lunge als Zielgewebe und andererseits auch

Konzentrationen innerhalb der verschiedenen Lungenmatrices, das heißt in der extrazellulären

Flüssigkeit der Lunge, im Sekret des Bronchialepithels und im Lungengewebe voneinander ab-

weichen. Somit zeigt sich, dass es für die Entwicklung adäquater Dosierungsschemata von großer

Bedeutung ist, Wirkstoffkonzentrationen direkt dort zu messen, wo sie zur Eradikation der Bak-

terien benötigt werden, nämlich in der extrazellulären Flüssigkeit. So kann neben der klinischen

auch eine vollständige bakteriologische Heilung erzielt werden und die Entstehung und Verbrei-

tung von Resistenzen gegenüber antibakteriellen Wirkstoffen verhindert werden.

157

Zusammenfassung / Summary

6Zusammenfassung /

Summary

158


6.1 Zusammenfassung Ann-Sophie Croneberger

Etablierung der Mikrodialyse zur Messung von Antiinfektiva-Konzentrationen in der Lunge von Schweinen und Vergleich mit anderen Untersuchungsmodellen

Um die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen zu verhindern, sollte die Behandlung von

respiratorischen bakteriellen Infektionen neben der klinischen auch eine vollständige bakterio-

logische Heilung zum Ziel haben. Dies kann nur durch adäquate Dosierungsschemata erreicht

werden. Bei der Entwicklung von Dosierungsschemata gewinnen Pharmakokinetik-Pharmako-

dynamik-Korrelationen zunehmend an Bedeutung. Dabei werden pharmakokinetische Parame-

ter jedoch häufig, statt von direkt im Zielgewebe gemessenen Konzentrationen, von Blutplas-

ma-Konzentrationen abgeleitet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Untersuchungsmodell,

die Mikrodialyse, zur direkten Bestimmung der nicht-proteingebundenen Fraktion eines Beta-

Laktam-Antibiotikums in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von Schweinen etabliert. Des

Weiteren wurden die Wirkstoffkonzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge mit

jenen im Sekret des Bronchialepithels, im Lungengewebe oder im Blutplasma verglichen.

Insgesamt wurden 3 Versuche durchgeführt. In allen 3 Versuchen wurde als Testsubstanz das

hydrophile Beta-Laktam-Antibiotikum Cefpirom in einer Dosierung von 26 Milligramm pro

Kilogramm Körpergewicht intravenös verabreicht. In Versuch 1 wurden - nach Eröffnung des

Thorax, Einsatz des Mikrodialysekatheters in das Lungengewebe und Applikation von Cefpirom

- Lungen-Mikrodialysat-Proben (alle 20 Minuten bis 8 Stunden nach der Behandlung), sowie

Blutproben (20 Minuten, 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Behandlung) von 4 narkotisierten

Schweinen entnommen, wobei der Thorax mit Tupfern abgedeckt wurde. In Versuch 2 wurden

Lungen-Mikrodialysat-Proben und Blutproben von 8 narkotisierten Schweinen zu denselben

Zeitpunkten wie in Versuch 1 entnommen, wobei der Thorax durch Nähte verschlossen wurde.

Zusätzlich wurden an den Blutentnahme-Zeitpunkten Proben vom Sekret des Bronchialepi-

thels mittels Blättchenmethode entnommen. Des Weiteren wurde nach Einschläfern der Tiere 8

Stunden nach Behandlung Lungengewebe entnommen. In Versuch 3 wurde die Narkose nach

Verschluss des Thorax ausgeleitet und Lungen-Mikrodialysat-Proben sowie Blutproben von 8

wachen Schweinen zu denselben Zeitpunkten wie in Versuch 1 und 2 entnommen. In Versuch

2 und 3 wurde das Lungengewebe nach Einschläfern der Tiere hinsichtlich Auswirkungen der

Katheterimplantation pathologisch-makroskopisch und –histologisch untersucht.

159


In allen 3 Versuchen konnten vollständige engmaschige Konzentrations-Zeitprofile von Cefpirom

in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge von Schweinen mittels Mikrodialyse erstellt werden.

Bei einem Vergleich der mittleren Konzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge

der 3 Versuche wurden initial die höchsten Konzentrationen in Versuch 3 und die niedrigsten in

Versuch 1 beobachtet. Die mittleren Konzentrations-Zeitprofile von Versuch 1 und 3 verliefen

ab 220 Minuten nach Behandlung etwa gleich. Die mittleren Konzentrations-Zeitprofile von

Versuch 1 und 2 zeigten einen parallelen Kurvenverlauf, wobei die Werte aus Versuch 2 die Werte

aus Versuch 1 um das zwei- bis dreifache überstiegen. Mittels statistischer Testverfahren konnte

gezeigt werden, dass die Narkose keinen Einfluss auf die Konzentrationen von Cefpirom in der

extrazellulären Flüssigkeit der Lunge zu haben scheint, wogegen der Verschluss des Thorax die

Konzentrationen offenbar erhöht. Im Blutplasma (Versuche 1 bis 3) und im Sekret des Bronchi-

alepithels (Versuch 2) gemessene Cefpirom-Konzentrationen (Gesamt-Fraktion) waren höher als

Konzentrationen in der extrazellulären Flüssigkeit der Lunge (nicht-proteingebundene Fraktion).

8 Stunden nach Behandlung wurden im Lungengewebe und in der extrazellulären Flüssigkeit der

Lunge ähnliche Konzentrationen gemessen. Das Allgemeinbefinden der Tiere in Versuch 3 wurde

bei adäquater Analgesie durch die vorausgegangene Thorakotomie nicht gestört. Die pathologi-

sche Untersuchung der Lunge zeigte, dass sich das Gewebe innerhalb von 4 Tagen weitgehend

von der Implantation des Mikrodialysekatheters erholt.

Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen, dass Wirkstoffkonzentrationen im Blut-

plasma und der Lunge, sowie Konzentrationen innerhalb der verschiedenen Lungenmatrices

voneinander abweichen. Somit ist die direkte Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen im

Zielgewebe für die Entwicklung adäquater Dosierungsschemata von großer Bedeutung. Die Er-

gebnisse zeigen weiterhin, dass sich die Mikrodialyse zur Konzentrationsbestimmung des nicht-

proteingebundenen Wirkstoffanteils hydrophiler Antiinfektiva in der extrazellulären Flüssigkeit

der Lunge von Schweinen eignet und häufige Probenentnahmen in kurzen Zeitintervallen er-

laubt.

160


6.2 Summary Ann-Sophie Croneberger

Establishment of microdialysis for the measurement of concentrations of anti-infectives in the lung of pigs and comparison with other methods

To avoid the emergence and distribution of resistance, antibacterial therapy of respiratory diseases

should guarantee clinical as well as bacteriological cure. This can only be achieved by application

of appropriate dose regimens. In the development of dose regimens pharmacokinetic-pharma-

codynamic-correlation gains in importance. Pharmacokinetic parameters are still often calcula-

ted based on blood plasma concentrations instead on concentrations directly measured in target

tissues. In the studies described microdialysis was established for the direct measurement of the

non-proteinbound fraction of a beta-lactam antibiotic in the extracellular fluid of the lung of

pigs. Furthermore concentrations measured in the extracellular fluid of the lung were compared

with bronchial secretions, lung tissue or blood plasma.

3 studies were conducted, in which the hydrophilic beta-lactam antibiotic cefpirome (test item)

was administered intravenously at a dose of 26 milligram per kilogram bodyweight. In study 1,

samples of lung-microdialysate (every 20 minutes until 8 hours after treatment) and blood (20

minutes, 1, 2, 4, 6 and 8 hours after treatment) were collected from 4 anesthetized pigs after ope-

ning of the thorax, insertion of the microdialysis catheter into lung tissue and administration of

cefpirome. During the sampling period the thoracic opening was covered with swabs. In study

2, samples of lung-microdialysate and blood were collected from 8 anesthetized pigs at the same

sampling time points as in study 1. After insertion of the microdialysis catheter, the thorax was

closed by sutures. Additionally, samples of bronchial secretions were collected at the same samp-

ling time points as blood. After having euthanized the animals 8 hours after treatment, lung tissue

was collected. In study 3, the infusion of the anesthetic agent was discontinued after closure of the

thorax, and samples of lung-microdialysate as well as blood were collected from non-anesthetized

pigs at the same sampling time points as in study 1 and 2. After having euthanized the animals,

a pathologic-macroscopical and –histological examination of the lung tissue was performed in

order to examine the impact of the insertion of the microdialysis catheter in study 2 and 3.

Applying microdialysis, complete time-versus-concentration-profiles of cefpirome in the extracel-

lular fluid of the lung of pigs could be generated in all studies. Comparing the mean concentrati-

ons in the extracellular fluid of the lung in the 3 studies, initially the highest concentrations were

161


measured in study 3 and the lowest in study 1. The mean time-versus-concentration-profiles

of study 1 and 3 showed an analogous curve progression after 220 minutes after treatment. The

mean time-versus-concentration-profiles of study 1 and 2 showed a parallel curve progression

with mean concentrations of study 2 being two- to threefold higher than mean concentrations of

study 1. Statistical analysis of the data showed that anesthesia does not influence concentrations of

cefpirome in the extracellular fluid of the lung, whereas closure of the thorax obviously increases

the concentration. Concentrations of cefpirome measured in blood plasma (total fraction; studies

1, 2, 3) and bronchial secretions (total fraction; study 2) were higher than concentrations in the

extracellular fluid of the lung (non-proteinbound fraction). 8 hours after treatment similar con-

centrations were measured in lung tissue and extracellular fluid. In study 3, adequately analgized

animals showed no abnormal signs in general behavior. The pathological examination of the lung

showed that lung tissue recovered from the insertion of the microdialysis catheter within 4 days.

Results generated in this study demonstrate that concentrations in blood plasma and the lung, as

well as concentrations within the different matrices of the lung differ from each other. Therefore,

the direct measurement of concentrations in target tissues is important for the development of

appropriate dose regimens. The results further more show that microdialysis is a feasible method

for the determination of the non-proteinbound fraction of hydrophilic anti-infectives in the

extracellular fluid of the lung of pigs and allows frequent serial sampling with short sampling

intervals.

162

Anhang

Anhang

163

7Anhang

164

Anhang

Tab. 33: Versuch 1 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG

Zeit nachBehandlung

(min)

Tier Nr.1 Tier Nr. 2 Tier Nr. 3 Tier Nr.4

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

20 9,6 13,6 0,7 3,3 46,1 0,1 3,4 40,4 0,1 8,6 51,1 0,2

60 11,0 39,6 0,3 6,1 33,1 0,2 4,1 31,6 0,1 10,1 37,7 0,3

120 7,7 23,9 0,3 4,1 26,4 0,2 2,7 18,1 0,2 6,7 22,9 0,3

240 3,9 9,6 0,4 1,9 6,7 0,3 1,0 4,5 0,2 3,6 9,7 0,4

360 2,1 3,0 0,7 0,8 3,0 0,3 0,4 1,9 0,2 2,0 4,1 0,5

480 0,9 1,2 0,8 0,4 1,3 0,3 0,2 0,7 0,3 0,9 1,8 0,5

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der Lunge (µg/ml)BP= Blutplasma (µg/ml)V = Verhältnis

Tab. 34: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Gesamt-Fraktion), Konzentrationen in Behälter A und B und Mittelwert, nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 5 bis 8)

Zeit nachBehandlung

(min)



A B MW A B MW A B MW A B MW

20 48,9 36,7 42,8 36,9 23,8 33,3 37,5 29,7 33,6 50,9 26,6 38,8

60 29,1 20,9 25,0 31,4 16,4 23,9 25,0 17,9 21,5 29,2 18,9 24,0

120 19,9 14,7 17,3 21,5 8,2 14,9 15,5 10,5 13,0 21,7 15,6 18,6

240 13,1 6,9 10,0 13,2 5,8 9,1 13,1 9,5 11,3 11,3 9,3 10,3

360 8,3 4,6 6,5 6,0 2,9 4,4 6,0 4,5 5,3 8,6 7,0 7,8

480 5,7 5,2 5,5 7,7 3,4 5,6 4,1 3,7 3,9 4,0 1,9 2,9

ELF = Sekret des BronchialepithelsMW = Mittelwert

7.1 Nicht im Text aufgeführte Tabellen

Anhang

165

Tab. 35: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Gesamt-Fraktion), Konzentrationen in Behälter A und B und Mittelwert, nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 9 bis 12)

Zeit nachBehandlung

(min)




20 39,0 28,9 34,0 38,0 38,9 38,4 46,5 37,0 41,7 NV NV NV

60 38,9 22,4 30,6 22,1 18,9 20,5 33,3 24,6 29,0 31,2 21,9 26,6

120 14,9 13,6 14,3 11,2 9,8 10,5 17,6 14,8 16,2 26,2 12,2 19,2

240 6,9 7,4 7,1 5,0 4,2 4,6 11,9 10,0 10,9 15,3 7,5 11,4

360 2,2 3,1 2,7 1,6 1,4 1,5 7,3 6,1 6,7 4,7 8,7 6,7

480 1,3 1,0 1,1 0,6 0,4 0,5 3,9 3,4 3,7 4,4 6,9 5,6

NV = Nicht vorhanden, dieser Wert wurde als Ausreißer betrachtet, da die Probe stark mit Blut kontaminiert warELF = Sekret des BronchialepithelsMW = Mittelwert

Tab. 36: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion), Konzentrationen in Aliquot A und B und Mittelwert, nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 5 bis 8)

Zeit nachBehandlung

(min)




480 1,7 1,8 1,8 2,1 2,1 2,1 3,0 2,8 2,9 2,0 2,0 2,0

MW = Mittelwert

166

Anhang

Tab. 37: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion), Konzen- trationen in Aliquot A und B und Mittelwert, nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 9 bis 12)

Zeit nachBehandlung

(min)




480 1,7 1,7 1,7 1,1 1,1 1,1 2,7 2,7 2,7 2,3 2,3 2,3

MW = Mittelwert

Tab. 38: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion), im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tier Nr. 5)

Zeit nachBehandlung

(min)

Cefpirom-Konzentrationen Verhältnis

EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 7,5 56,9 42,8 KP 0,1 0,2 NB

60 14,6 29,9 25,0 KP 0,5 0,6 NB

120 8,7 23,3 17,3 KP 0,4 0,5 NB

240 3,8 8,4 10,0 KP 0,5 0,4 NB

360 2,2 3,7 6,5 KP 0,6 0,3 NB

480 1,2 1,8 5,5 1,8 0,6 0,2 0,7


Anhang

167

Tab. 39: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion), im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach ein maliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tier Nr. 6)

Tab. 40: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion), im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tier Nr. 7)

Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 8,7 85,4 33,6 KP 0,1 0,3 NB

60 19,5 47,2 21,5 KP 0,4 0,9 NB

120 23,6 31,4 13,0 KP 0,8 1,8 NB

240 13,1 16,1 11,3 KP 0,8 1,2 NB

360 6,6 8,4 5,3 KP 0,8 1,3 NB

480 3,7 4,9 3,9 2,9 0,8 0,9 1,3


Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 26,8 45,9 30,3 KP 0,6 0,9 NB

60 18,8 36,5 23,9 KP 0,5 0,8 NB

120 12,6 25,7 14,9 KP 0,5 0,8 NB

240 7,0 11,3 9,1 KP 0,6 0,8 NB

360 3,8 6,2 4,4 KP 0,6 0,9 NB

480 2,2 3,2 5,6 2,1 0,7 0,4 1,0


168

Anhang


Tab. 42: Versuch 2 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion), im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tier Nr. 9)

Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 13,7 69,7 34,0 KP 0,2 0,4 NB

60 11,2 37,5 30,6 KP 0,3 0,4 NB

120 7,6 21,8 14,3 KP 0,3 0,5 NB

240 4,1 9,0 7,1 KP 0,5 0,6 NB

360 1,9 3,8 2,7 KP 0,5 0,7 NB

480 0,8 1,7 1,1 1,7 0,5 0,7 0,5


Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 10,9 67,3 38,8 KP 0,2 0,4 NB

60 12,2 40,2 24,0 KP 0,3 0,5 NB

120 8,9 27,9 18,6 KP 0,3 0,5 NB

240 5,5 11,3 10,3 KP 0,5 0,5 NB

360 3,1 5,4 7,8 KP 0,6 0,4 NB

480 2,3 2,6 2,9 2,0 0,9 0,8 1,1


Anhang

169



Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 14,9 60,8 41,7 KP 0,2 0,4 NB

60 17,8 36,7 29,0 KP 0,5 0,6 NB

120 11,0 25,1 16,2 KP 0,4 0,7 NB

240 6,4 13,9 10,9 KP 0,5 0,6 NB

360 3,3 8,2 6,7 KP 0,4 0,5 NB

480 1,9 3,9 3,7 2,7 0,5 0,5 0,7


Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 11,0 77,2 38,4 KP 0,1 0,3 NB

60 10,4 42,1 20,5 KP 0,2 0,5 NB

120 6,9 22,6 10,5 KP 0,3 0,7 NB

240 3,2 8,1 4,6 KP 0,4 0,7 NB

360 1,5 3,0 1,5 KP 0,5 1,0 NB

480 0,7 1,2 0,5 1,1 0,6 1,5 0,7


170

Anhang


Zeit nachBehandlung

(min)


EZF(µg/ml)

Blut-plasma(µg/ml)

ELF(µg/g)


EZF/Blut-

plasmaEZF/ELF

EZF/Lungen-gewebe

20 23,0 61,8 NV KP 0,4 NB NB

60 17,7 37,7 26,6 KP 0,5 0,7 NB

120 10,1 20,8 19,2 KP 0,5 0,5 NB

240 10,2 10,4 11,4 KP 1,0 0,9 NB

360 6,0 5,1 6,7 KP 1,2 0,9 NB

480 2,9 2,7 5,6 2,3 1,1 0,5 1,3

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der LungeELF = Sekret des BronchialepithelsKP = Keine ProbeNB = Nicht berechenbarNV = Nicht vorhanden

Tab. 46: Versuch 3 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 13 bis 16)

Zeit nachBehandlung

(min)

Tier Nr.13 Tier Nr. 14 Tier Nr. 15 Tier Nr. 16

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

20 24,7 86,2 0,3 7,4 88,5 0,1 9,6 57,1 0,2 25,5 88,4 0,3

60 NV 32,4 NB 6,4 34,3 0,2 13,2 38,1 0,4 11,0 49,6 0,2

120 4,0 24,3 0,2 NV 19,8 NB 6,3 18,3 0,3 NV 31,1 NB

240 1,1 6,5 0,2 1,3 5,9 0,2 3,8 6,1 0,6 2,3 8,3 0,3

360 NV 1,9 NB 0,7 1,7 0,4 1,4 1,3 1,1 1,2 3,3 0,4

480 0,2 0,5 0,3 0,3 0,6 0,6 0,5 0,4 1,1 1,0 1,2 0,8

EZF= Extrazelluläre Flüssigkeit der Lunge (µg/ml)BP = Blutplasma (µg/ml)V = VerhältnisNV = Nicht vorhanden auf Grund zu geringer ProbenvoluminaNB = Nicht berechenbar

Anhang

171

Tab. 47: Versuch 3 - Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (nicht-proteingebundene Fraktion) und im Blutplasma (Gesamt-Fraktion) und deren Verhältnis nach einmaliger intravenöser Applikation von Cefrom® in einer Dosierung von 26 mg/kg KG (Tiere Nr. 17 bis 20)

Zeit nachBehandlung

(min)

Tier Nr.17 Tier Nr. 18 Tier Nr. 19 Tier Nr. 20

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

EZF BPV

EZF/BP

20 30,1 90,5 0,3 19,3 81,9 0,2 20,6 71,7 0,3 25,3 87,7 0,3

60 16,4 58,0 0,3 10,7 39,6 0,3 18,6 48,4 0,4 NV 47,4 NB

120 7,6 27,7 0,3 3,9 25,6 0,2 9,8 27,6 0,4 12,2 23,5 0,5

240 3,0 14,6 0,2 1,0 7,7 0,1 2,7 6,4 0,4 4,9 8,6 0,6

360 1,8 6,5 0,3 0,4 2,3 0,2 1,0 1,4 0,7 1,9 2,8 0,7

480 0,9 1,9 0,5 0,1 0,7 0,2 0,3 0,5 0,6 0,6 0,9 0,7

EZF = Extrazelluläre Flüssigkeit der Lunge (µg/ml)BP = Blutplasma (µg/ml)V = VerhältnisNV = Nicht vorhanden auf Grund zu geringer ProbenvoluminaNB = Nicht berechenbar

172

Anhang

7.2 Ergebnisse der pathologischen Untersuchungen der einzelnen Tiere

Makroskopische Untersuchung Versuch 2

Tier Nr. 5• geringgradige Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der pulmonalen

Pleura im Bereich der Einstichstelle des Katheters

• interstitielles Ödem im Bereich um die Einstichstelle

• bei Anschnitt der Einstichstelle Hämorrhagien bis 1 Zentimeter in die Tiefe

des Gewebes mit einem Durchmesser von 4 Millimeter






Tier Nr. 7• Fibrinauflagerungen auf der pulmonalen Pleura im Bereich der Einstichstelle

des Katheters




• Areale chronischer Pneumonie in der gesamten Lunge

Tier Nr. 8• mittelgradige Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der pulmonalen





• Areale chronischer Pneumonie im linken und rechten Kaudallappen

Anhang

173




• bei Anschnitt der Einstichstelle Hämorrhagien bis 1,5 Zentimeter in die Tiefe







• Areale chronischer Pneumonie im kaudalen Teil des linken Kraniallappens






• Areale geringgradiger Pneumonie in der linken Lunge



• hochgradiges interstitielles Ödem im Bereich um die Einstichstelle

• schlechte Belüftung des gesamten Lungengewebes



174

Anhang

Histologische Untersuchung Versuch 2

Tier Nr. 5• Einstichstelle des Katheters

– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche mit Aggregation

von Neutrophilen, Makrophagen, einzelnen Eosinophilen, Fibrin, Hämor-

rhagien und Dilatation der Gefäße

– Interlobuläres Interstitium: hochgradige Verbreiterung, Hämorrhagien,

Fibrin, Neutrophile, Makrophagen

– Bronchialsystem: Lumen partiell gefüllt mit Erythrozyten, Neutrophilen,

Makrophagen und abgeschilferten Epithelzellen

– Alveolen: Lumen gefüllt mit Erythrozyten, Ödemflüssigkeit, Fibrin, Neutro-

philen, aktivierte Alveolarmakrophagen ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie


– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche, Fibrin-

Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Dilatation

der Gefäße, Hyperämie, Hämorrhagien

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Dilatation der Gefäße, Ödem,

Fibrin-Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen

– Bronchialsystem: Erythrozyten, Neutrophile, Makrophagen, Lumen partiell

gefüllt mit Ödemflüssigkeit und abgeschilferten Epithelzellen

– Alveolen: Fibrin, geringgradiges Ödem, Aggregation von Neutrophilen,

Hyperämie, aktivierte Alveolarmakrophagen, Fibroblasten, interalveoläres

Interstitium teilweise verdickt

‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie

Anhang

175


– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen mit Aggregation von Neutrophilen,

punktuelle Kalizifikationen an der Oberfläche, Dilatation der Lymphgefäße

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Dilatation der Lymphgefäße,

Fibrin-Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen

– Bronchialsystem: Lumen partiell gefüllt mit Erythrozyten, Neutrophilen

und abgeschilferten Epithelzellen

– Alveolen: teilweise Fibrin und Ödemflüssigkeit, intraluminale Hämorrha-

gien, Neutrophile, aktivierte Alveolarmakrophagen, interalveoläres Inter-

stitium teilweise verdickt ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie


– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche, Erythrozyten,

Neutrophile, Makrophagen, Hämorrhagien, Dilatation der lymphatischen

Gefäße

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Ödem, Fibrin-Exsudation, Neu-

trophile, Makrophagen, Dilatation der Lymphgefäße, Hämorrhagien

– Bronchialsystem: Lumen partiell gefüllt mit Erythrozyten, Ödemflüssigkeit,

abgeschilferte Epithelzellen

– Alveolen: Hämorrhagien, Ödem, intraalveolär lokalisiertes Fibrin, aktivierte

Alveolarmakrophagen, Neutrophile, interalveoläres Interstitium teilweise

verdickt, Fibroblasten ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Pneumonie, interstitielle Pneumonie

• Linker Kaudallappen

– Interlobuläres Interstitium: einzelne Makrophagen

– Bronchialsystem: einzelne Neutrophile

– Alveolen: Hyperämie, aktivierte Alveolarmakrophagen, Neutrophile, Fibro-

blasten, einzelne Eosinophile, Dilatation der Gefäße, nicht-ventilierte Lobuli ‣ Diagnose: interstitielle Pneumonie

176

Anhang

Tier Nr. 9• Einstichstelle des Katheters:

– Pulmonale Pleura: Dilatation der Lymphgefäße, massive Aggregation von

Neutrophilen und Makrophagen, teilweise fibrinöse Adhäsionen mit zellu-

lärem Debris


Fibrin-Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen,

Hämorrhagien

– Bronchialsystem: partiell gefüllt mit Erythrozyten, Neutrophilen und abge

schilferten Epithelzellen

– Alveolen: Hämorrhagien, Ödem, Nekrose, Fibrin, Hyperämie, interalveoläres

Interstitium teilweise verdickt, Hämorrhagien, Makrophagen, Neutrophile ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie


– Pulmonale Pleura: fibrinös-hämorrhagische Adhäsionen an der Oberfläche,

Aggregation von Neutrophilen, Dilatation der Lymphgefäße, punktuelle

Kalizifikationen


Fibrin-Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen,

Hämorrhagien

– Bronchialsystem: partiell gefüllt mit abgeschilferten Epithelzellen, Erythro-

zyten, Neutrophilen

– Alveolen: Hämorrhagien, Ödem, Nekrose, Fibrin, Hyperämie, interalveoläres

Interstitium durch Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen ver-

dickt, Fibroblasten, abgeschilferte Epithelzellen ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie

Anhang

177


– Pulmonale Pleura: teilweise fibrinös-hämorrhagische Adhäsionen an der

Oberfläche, Neutrophile, Makrophagen, Dilatation der Gefäße, einzelne

Eosinophile, partiell fibrinöse Thromben

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Fibrin-Exsudation, Dilatation der

Gefäße, Neutrophile, Makrophagen

– Bronchialsystem: partiell gefüllt mit abgeschilferten Epithelzellen, Erythrozy-

ten, Neutrophilen, Makrophagen

– Alveolen: Hämorrhagien, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen,

teilweise emphysematöse Veränderungen ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, interstitielle Pneumonie, hämorrhagisch-

eitrige Bronchopneumonie

• Linker Kaudallappen:

– Bronchialsystem: abgeschilferte Epithelzellen, Makrophagen

– Alveolen: Hyperämie, Makrophagen, Neutrophile, Fibroblasten, schlecht

ventilierte Bereiche, einzelne Eosinophile, aktivierte Alveolarmakrophagen ‣ Diagnose: interstitielle Pneumonie


– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen mit Aggregation von Neutrophilen

und Makrophagen, Ödemflüssigkeit, Dilatation der Lymphgefäße, Fibrin-

Exsudation, Hämorrhagien

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Fibrin-Exsudation, Dilatation der

Lymphgefäße, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen

– Bronchialsystem: partieller Verlust der Kontinuität des Bronchialepithels,

Lumen gefüllt mit zellulärem Debris

– Alveolen: teilweise perivaskuläre Ödeme, Hämorrhagien, Aggregation von

Neutrophilen, Hyperämie, aktivierte Alveolarmakrophagen, interalveoläres

Interstitium durch Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen ver-

dickt, Fibroblasten ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, interstitielle Pneumonie

178

Anhang

• Linker Kaudallappen:

– Interlobuläres Interstitium: einzelne Neutrophile und Makrophagen

– Bronchialsystem: Ödemflüssigkeit, abgeschilferte Epithelzellen, Neutrophile,

Makrophagen

– Alveolen: Hyperämie, interalveoläres Interstitium durch Aggregation von

Neutrophilen und Makrophagen verdickt, einzelne Eosinophile, Makropha-

gen, Fibroblasten, Ödemflüssigkeit, große Bereiche nicht ventiliert ‣ Diagnose: interstitielle Pneumonie

• Rechter Kaudallappen:

– Pulmonale Pleura: teilweise aktivierte Epithelzellen, Aggregation von Neu-

trophilen, einzelne Eosinophile, Dilatation der Gefäße

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Dilatation der Gefäße, Fibrin-

Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Lymph-

ozyten, Fibroblasten

– Bronchialsystem: etwas zellulärer Debris


Neutrophilen und Makrophagen verdickt, einzelne Eosinophile, Fibro-

blasten, aktivierte Alveolarmakrophagen ‣ Diagnose: geringgradige purulente Pleuritis, interstitielle Pneumonie

Anhang

179

Makroskopische Untersuchung Versuch 3

Tier Nr. 14 (makroskopische Untersuchung circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters)

• Fibrinverklebungen der rechten Lunge mit der Thoraxwand

• Fibrinauflagerungen auf der pulmonalen Pleura der gesamten rechten Lunge

• mittelgradige Hämorrhagien im Bereich der Einstichstelle des Katheters



des Gewebes mit einem Durchmesser von 1 Zentimeter


• geringgradige Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der pulmonalen



• bei Anschnitt der Einstichstelle Hämorrhagien bis 3 Zentimeter in die Tiefe des

Gewebes mit einem Durchmesser von 1 Millimeter










• interstitielles Ödem im Bereich des gesamten rechten Kaudallappens



180

Anhang

Tier Nr. 19 (makroskopische Untersuchung 2 Tage nach Entfernung des Katheters)







• hochgradige fibrinöse Pleuritis (bereits intraoperativ vor Einsatz des Katheters

sichtbar)



• 3 Zentimeter von der Einstichstelle entfernt kirschkerngroße Hämorrhagien


• bei Anschnitt der Einstichstelle keine Veränderungen sichtbar




• geringgradiges interstitielles Ödem im Bereich der Einstichstelle





• geringgradiges interstitielles Ödem im Bereich der Einstichstelle


Anhang

181

Histologische Untersuchung Versuch 3

Tier Nr. 14 (Entnahme der Gewebeprobe circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters)

• Einstichstelle des Katheters

– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche mit Hämorrha-

gien, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, einzelne Eosino-

phile, Kalizifikation, Dilatation der Gefäße

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Dilatation der Gefäße, fibrinöse

Thromben, Fibrin-Exsudation, Hämorrhagien, Aggregation von Neutro-

philen und Makrophagen

– Bronchialsystem: Erythrozyten, Fibrin, abgeschilferte Epithelzellen, Neutro-

phile und Makrophagen

– Alveolen: Fibrin, Hämorrhagien, Neutrophile, aktivierte Alveolarmakro-

phagen, interalveoläres Interstitium durch Aggregation von Neutrophilen,

Makrophagen und Fibroblasten verdickt, Hyperämie ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie

• Rechter Mittellappen

– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche mit Hämorr-

hagien, Neutrophile, Makrophagen, Dilatation der Gefäße mit fibrinösen

Thromben

– Interlobuläres Interstitium: teilweise Dilatation der Gefäße, fibrinöse Throm-

ben, Migration von Neutrophilen in das Interstitium

– Bronchialsystem: abgeschilferte Epithelzellen


Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt, einzelne Eosinophile ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, interstitielle Pneumonie

182

Anhang



– Pulmonale Pleura: pleurale Adhäsionen, Neutrophile, Makrophagen,

Kalizifi kation

– Interlobuläres Interstitium: Fibrin-Exsudation, Neutrophile, Makrophagen

– Bronchialsystem: Erythrozyten, abgeschilferte Epithelzellen, partieller Verlust

der Kontinuität des Bronchialepithels

– Alveolen: Hämorrhagien, Neutrophile, aktivierte Alveolarmakrophagen ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, hämorrhagisch-eitrige Pneumonie



– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche, Hämorrhagien,

Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Dilatation der Gefäße,

Fibrin-Exsudation

– Interlobuläres Interstitium: Fibrin-Exsudation, Hämorrhagien, Aggregation

von Neutrophilen und Makrophagen

– Bronchialsystem: Hämorrhagien, abgeschilferte Epithelzellen, Neutrophile

– Alveolen: Hämorrhagien, Fibrin-Exsudation, Neutrophile, aktivierte

Alveolarmakrophagen, interalveoläres Interstitium durch Aggregation von

Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie, interstitielle

Pneumonie

Anhang

183

Tier Nr. 20 (Entnahme der Gewebeprobe circa 9 Stunden nach Einsatz des Katheters)• Einstichstelle des Katheters

– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche, Fibrin- Exsudation, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Dilatation der Gefäße, geringgradige Kalzifikation an der Oberfläche – Interlobuläres Interstitium: Dilatation der Gefäße, fibrinöse Thromben, Fibrin-Exsudation, Ödemflüssigkeit, Aggregation von Neutrophilen und Makrophagen, Hämorrhagien – Bronchialsystem: Erythrozyten, abgeschilferte Epithelzellen – Alveolen: Hämorrhagien, Ödemflüssigkeit, Fibrin, Neutrophile, Makrophagen ‣ Diagnose: fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Pneumonie

Tier Nr. 19 Entnahme der Gewebeprobe 2 Tage nach Entfernung des Katheters)• Einstichstelle des Katheters

– Pulmonale Pleura: fibrinöse Adhäsionen an der Oberfläche, Hämorrhagien, Neutrophile, Makrophagen, Dilatation der Gefäße, partiell Thromben – Interlobuläres Interstitium: geringgradige Hämorrhagien – Bronchialsystem: Erythrozyten, einzelne Neutrophile – Alveolen: Hämorrhagien, Ödeme, Fibrin, Neutrophile, Makrophagen ‣ Diagnose:fibrinöse Pleuritis, fibrinöse Bronchopneumonie

Tier Nr. 15 (Entnahme der Gewebeprobe 3 Tage nach Entfernung des Katheters)• Einstichstelle des Katheters

– Pulmonale Pleura: großflächige fibrinöse Adhäsionen, Hämorrhagien, Neu- trophile, Makrophagen, Dilatation der Gefäße mit fibrinösen Thromben, Granulationsgewebe mit Neovaskularisation (Ausdehnung auf das inter- lobuläre Interstitium) – Interlobuläres Interstitium: Fibrin-Exsudation, Neutrophile, Markophagen, Granulationsgewebe, Hämorrhagien – Bronchialsystem: Erythrozyten – Alveolen: Gewebe gut ventiliert, teilweise perivaskuläre oder intravaskuläre Hämorrhagien, interalveoläres Interstitium durch Aggregation von Neutro- philen, Makrophagen und Fibroblasten verdickt ‣ Diagnose:fibrinöse Pleuritis, Granulationsgewebe, interstitielle Pneumonie

184

Anhang

Tier Nr. 18 (Entnahme der Gewebeprobe 4 Tage nach Entfernung des Katheters)


– Pulmonale Pleura: große Areale mit Granulationsgewebe, Neovaskulari-

sation, Aggregation von Neutrophilen, Markophagen und Fibroblasten

– Bronchialsystem: einzelne Eosinophile und abgeschilferte Epithelzellen

– Alveolen: teilweise Hämorrhagien, interalveoläres Interstitium durch Aggre-

gation von Neutrophilen, Makrophagen und Fibroblasten teilweise verdickt ‣ Diagnose: Granulationsgewebe, interstitielle Pneumonie

Tier Nr. 13 (Entnahme der Gewebeprobe 5 Tage nach Entfernung des Katheters)


– Pulmonale Pleura: große Areale mit Granulationsgewebe, Neovaskularisa-

tion, Neutrophile, Markophagen, Fibroblasten

– Interlobuläres Interstitium: Verbreiterung, Fibrin-Exsudation, Hämorrhagien

– Bronchialsystem: geringgradige peribronchiale Hämorrhagien

– Alveolen: perivaskuläre und alveoläre Hämorrhagien, interalveoläres Inter

stitium durch Aggregation von Neutrophilen, Makrophagen und Fibro-

blasten teilweise verdickt ‣ Diagnose: Granulationsgewebe, interstitielle Pneumonie

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201

Verzeichnisse

202

Verzeichnisse

8.2 Abkürzungsverzeichnis

A MembranoberflächeAUC Fläche unter der Konzentrations-ZeitkurveAUC/MHK Verhältnis der Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve zur minimalen HemmkonzentrationAUC

last Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve bis zum letzten

Probenentnahmezeitpunkt mit einer Konzentration über der DetektionsgrenzeaW Absolute WiederfindungBAL Bronchoalveoläre LavageBP BlutplasmaC KonzentrationC

max Maximale Konzentration

Cmax

/MHK Verhältnis der maximalen Konzentration zur minimalen HemmkonzentrationD DialysatEDTA EthylendiamintetraessigsäureELF Sekret des BronchialepithelsEZF Extrazelluläre FlüssigkeitF FlussrateGLP Gute LaborpraxisHPLC HochdruckflüssigkeitschromatographieILS Interne StandardlösungK

0 Massentransportfaktor

KG KörpergewichtKP Keine ProbeL LösungLM Lungen-MikrodialysatMD MikrodialyseMHK Minimale HemmkonzentrationMHK

90 Niedrigste Konzentration, die die Vermehrung von

mindestens 90% der getesteten Stämme hemmtMRS Magnetresonanzspektroskopie

203

Verzeichnisse

MS/MS Tandem-MassenspektrometrieMW Mittelwertn Anzahl der SchweineNB Nicht BerechenbarNCA Nicht-kompartimentelle AnalyseNMR KernspinresonanzNQ Nicht QuantifizierbarNV Nicht VorhandenP PerfusatPBP Penicillin-bindende ProteinePD PharmakodynamikPET Positronen-Emissions-TomographiePGS Planare Gamma-SzintigraphiePK PharmakokinetikrW Relative WiederfindungRZB Relative ZentrifugalbeschleunigungSD StandardabweichungSOP StandardarbeitsanweisungSPE FestphasenextraktionSPECT Single-Photon-Emissions-ComputertomographieSRM Selected Reaction MonitoringT

max Zeit bis zum Erreichen der maximalen Konzentration

T>MHK Zeitspanne in welcher die Konzentration der antibakteriellen Substanz die minimale Hemmkonzentration übersteigt V VerhältnisZNS Zentrales Nervensystem

204

Verzeichnisse

8.3 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Aufbau eines MikrodialysesystemsAbb. 2: Dialyseprozess an der MembranAbb. 3: KatheterformenAbb. 4: Konzentrisch aufgebauter flexibler Katheter zur Anwendung in der LeberAbb. 5: Oberflächliche und mittlere Muskelschichten des seitlichen Thorax des SchweinsAbb. 6: Tiefe Muskelschichten des seitlichen Thorax des SchweinsAbb. 7: Rechte Lunge des SchweinsAbb. 8: Struktur der 7-Amino-CephalosporansäureAbb. 9: Struktur von CefpiromAbb. 10: Syringe Pump CMA 402®

Abb. 11: Hepatic Microdialysis Catheter CMA 61®

Abb. 12: Aufbau der NarkoseapparaturAbb. 13: Lokalisation Einsatz Katheter in der LungeAbb. 14: Entfernung des perkutanen TrokarsAbb. 15: Mikrodialysekatheter in der LungeAbb. 16: Endoskopische Fasszange und Tupfer zur Reinigung des TubusAbb. 17: Mikrodialyseversuch im wachen SchweinAbb. 18: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Versuch 1)Abb. 19: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Versuch 1)Abb. 20: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma (Versuch 1)Abb. 21: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Versuch 2)Abb. 22: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Versuch 2)Abb. 23: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Versuch 2)Abb. 24: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Versuch 2)Abb. 25: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Versuch 2)Abb. 26: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der ELF (Versuch 2)

205

Verzeichnisse

Abb. 27: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Versuch 2)Abb. 28: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe (Versuch 2)Abb. 29: Sitz des Katheters im Lungengewebe circa 9 Stunden nach Einsatz in die Lunge (Versuch 2)Abb. 30: Hämorrhagien und Fibrinauflagerungen auf der Pleura pulmonalis im Bereich der Einstichstelle des Katheters, interstitielles Ödem im Bereich um die Einstichstelle (Versuch 2)Abb. 31: Anschnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 2)Abb. 32: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 2)Abb. 33: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 2)Abb. 34: Histologischer Schnitt des Lobus caudalis sinister (Versuch 2)Abb. 35: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Versuch 3)Abb. 36: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen in der EZF (Versuch 3)Abb. 37: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Versuch 3)Abb. 38: Maximal- und Minimalwert, 1. und 3. Quartil und Medianwert der Cefpirom-Konzentrationen im Blutplasma (Versuch 3)Abb. 39: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma (Versuch 3)Abb. 40: Anschnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 3)Abb. 41: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 3)Abb. 42: Histologischer Schnitt der Einstichstelle des Katheters (Versuch 3)Abb. 43: Schwein circa 2 Stunden nach NarkoseausleitungAbb. 44: Schwein 1 Tag post OPAbb. 45: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Versuche 1, 2 und 3

206

Verzeichnisse

8.4 Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Mikrodialyseversuche in verschiedenen Geweben und SpeziesTab. 2: Charakteristika der genannten Methoden zur Konzentrations- bestimmung in ZielgewebenTab. 3: Antibakterielle Aktivität von CefpiromTab. 4: Applikationsvolumina Versuch 1Tab. 5: Applikationsvolumina Versuch 2Tab. 6: Applikationsvolumina Versuch 3Tab. 7: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (Versuch 1)Tab. 8: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen in der EZF (Versuch 1)Tab. 9: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen im Blutplasma (Versuch 1)Tab. 10: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma und deren Verhältnis (Versuch 1)Tab. 11: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der EZF (Versuch 1)Tab. 12: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom im Blutplasma (Versuch 1)Tab. 13: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (Tiere Nr. 5 bis 8) (Versuch 2)Tab. 14: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (Tiere Nr. 8 bis 12) (Versuch 2)Tab. 15: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen in der EZF (Versuch 2)Tab. 16: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen im Blutplasma (Versuch 2)Tab. 17: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen in der ELF (Versuch 2)Tab. 18: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen im Lungengewebe (Versuch 2)Tab. 19: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Versuch 2)

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Tab. 20: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der EZF (Versuch 2)Tab. 21: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom im Blutplasma (Versuch 2)Tab. 22: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der ELF (Versuch 2)Tab. 23: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (Tiere Nr. 13 bis 16) (Versuch 3)Tab. 24: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in Lungen-Mikrodialysat und EZF (Tiere Nr. 17 bis 20) (Versuch 3)Tab. 25: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen in der EZF (Versuch 3)Tab. 26: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen, Mittelwerte und Standard- abweichungen im Blutplasma (Versuch 3)Tab. 27: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blutplasma und deren Verhältnis (Versuch 3)Tab. 28: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom in der EZF (Versuch 3)Tab. 29: Pharmakokinetische Parameter von Cefpirom im Blutplasma (Versuch 3)Tab. 30: Mittlere Cefpirom-Konzentrationen in der EZF der Versuche 1, 2 und 3Tab. 31: Verhältnis der mittleren Cefpirom-Konzentrationen in der EZF zu Blutplasma der Versuche 1, 2 und 3Tab. 32: Mittelwerte der pharmakokinetischen Parameter von Cefpirom in der EZF und im Blutplasma der Versuche 1, 2, und 3Tab. 33: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blut- plasma und deren Verhältnis (Versuch 1)Tab. 34: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der ELF; Konzentra- tionen in Behälter A und B und Mittelwert (Tiere Nr. 5 bis 8) (Versuch 2)Tab. 35: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der ELF; Konzentra- tionen in Behälter A und B und Mittelwert (Tiere Nr. 9 bis 12) (Versuch 2)Tab. 36: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe, Konzen- trationen in Aliquot A und B und Mittelwert (Tiere Nr. 5 bis 8) (Versuch 2)Tab. 37: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen im Lungengewebe, Konzen- trationen in Aliquot A und B und Mittelwert (Tiere Nr. 9 bis 12) (Versuch 2)Tab. 38: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 5) (Versuch 2)Tab. 39: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 6) (Versuch 2)

208

Verzeichnisse

Tab. 40: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 7) (Versuch 2)Tab. 41: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 8) (Versuch 2)Tab. 42: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 9) (Versuch 2)Tab. 43: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 10) (Versuch 2)Tab. 44: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 11) (Versuch 2)Tab. 45: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF, im Blutplasma, in der ELF und im Lungengewebe und deren Verhältnis (Tier Nr. 12) (Versuch 2)Tab. 46: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blut- plasma und deren Verhältnis (Tiere Nr. 13 bis 16) (Versuch 3)Tab. 47: Individuelle Cefpirom-Konzentrationen in der EZF und im Blut- plasma und deren Verhältnis (Tiere Nr. 17 bis 20) (Versuch 3)

209

Verzeichnisse

Danksagung

• Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Kietzmann für die

Überlassung des interessanten Themas, sowie für seine groß-

zügige und konstruktive Unterstützung.

• Ein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. A. Ehinger für seine

stete Hilfsbereitschaft und seinen konstruktiven fachlichen Rat.

• Herrn Dr. M. Nürnberger danke ich für seine stets freundliche

und großzügige Unterstützung.

• Bei Herrn M. Allan bedanke ich mich für anregende Diskus-

sionen und neue Ideen, sowie die Schaffung der nötigen Frei-

räume zur Anfertigung der Dissertation.

• Für ihr außerordentliches Engagement und ihre unermüdliche

Hilfsbereitschaft während der Versuche danke ich ganz herz-

lich Herrn H. Müller, Herrn W. Rüter und Herrn B. Sander.

• Weiterhin danke ich Frau Dr. B. Ehinger, Herrn S. Schnabel,

Herrn J. M. Louro-Garcia, Frau B. Weinmann, Herrn S. Grieb

und Frau E. Zschiesche für ihre konstruktive Unterstützung.

• Bei Silke Sczesny, Monika Menge, Karlheinrich Schmid und

Susanne Kilp bedanke ich mich für ihre fachliche und mora-

lische Unterstützung, sowie die herzliche Aufnahme im

Arbeitsleben.

• Herrn M. Kuhlisch, Herrn K. Fachinger, Herrn H. Ickstadt,

Herrn F. Bayer, Frau N. Fröb, sowie allen weiteren beteiligten

Tierpflegern danke ich für ihre zuverlässige Unterstützung

im Umgang mit den Tieren.

• Ein herzlicher Dank gilt allen weiteren beteiligten Mitarbeitern der Intervet

Innovation GmbH.

• Bei Herrn H. Winklmaier, Herrn Dr. A. Theisen und Frau C. Tandi möchte

ich mich für die Einführung in die Grundlagen der Thoraxchirurgie und

Narkosetechnik bedanken.

• Der Neonatologischen und Pädiatrischen Intensivstation der Johann Wolfgang

Goethe-Universität Frankfurt a. M., insbesondere Frau K. Schnabel, sei für die

großzügige Leihgabe der Narkoseapparaturen gedankt.

• Ein ganz besonderer Dank gilt Nina Häfner für ihre kreative & engagierte Hilfe.

• Meiner Familie danke ich von Herzen für ihre unermüdliche Hilfsbereitschaft

und ihre moralische Unterstützung während meines Studiums und der Anfer-

tigung der Dissertation.

Der größte Dank gilt Frank Häfner für seine unendliche Geduld, seine liebe-

volle Unterstützung und seinen unverzichtbaren Rat während des Studiums

und danach.

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ETABLIERUNG DER MIKRODIALYSE ZUR MESSUNG VON … · Bei der Entwicklung von Dosierungsschemata gewinnen Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Korrelationen zunehmend an Bedeutung. Hierbei