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KIT – Universität des Landes Baden-Württemberg undnationales Forschungszentrum in der Helmholtz-Gemeinschaft

KIT Sicherheitsmanagement, Abt. Zentrale Beauftragte und Technische Beratung, Genehmigungen

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Euthanasie, Anästhesie und Analgesie

Literaturübersicht für Laborfische

Almut Köhler, Ph.D.

SUM1 19.11.2015 Versuchstierkundliches Kolloquium der Universität Tübingen

Gründe für das Töten von Fischen

Vermeidung von Schmerzen, Leiden, Schäden

Nahrungsgewinnung

Artenschutz/Ökologie

Gewinnung von Blut, Gewebe für Versuche

Ausmerzung aus Zuchtgründen

Versuchsende


Tod ohne Anzeichen von Panik, Schmerz, Leid

minimale Zeit bis zum Eintritt der Bewusstlosigkeit

verlässlich, reproduzierbar

einfache, wartungsfreie Apparatur

sicher für Durchführenden

keine Kontamination der Umwelt

geringe emotionale Effekte auf Durchführenden

Kriterien für das humane Töten von Fischen


Methoden der Euthanasie

Physikalisch Pistolenschuss Bolzenschuss zervikale Dislokation Dekapitation Mikrowelle Elektroschlag Betäubungsschlag mit Ausbluten

Chemisch Injektion

Barbiturate, (Cloralhydrat, Ethanol, Ketamin, MgSO4, KCl, neuromuskuläre Blocker)

Inhalation/ImmersionMS-222, Eugenol, Benzocain, (Halothan, Isofluran, Enfluran, Chloroform, NO, CO2, CO, Argon, HCN, Methoxyfluran)


Euthanasie/Anästhesie bei Fischen

sehr große Tiergruppe (> 30000 Arten; Säuger 5500 Arten) sehr heterogene Tiergruppe (ca. 500 Familien; Säuger: ca. 130 Familien) andere Physiologie andere Sinnesorgane keine Mimik keine Laute


Anzeichen für Bewusstlosigkeit / Tod bei Fischen

Bewusstlosigkeit:

Verlust des Stellreflexes Verlust des VOR

Tod:

Stillstand Operkulum Verlust des Herzschlages EEG (Kestin et al., 1991; Lambooij et al., 2002 ; Robb et al.; 2000b Van de Vis et al., 2003)

Rigor mortis Livor mortis


Rechtliche Grundlagen

TierSchVersV 2013 (identisch mit Annex 4 der Direktive EU 2010/63)

Zugelassene Tötungsmethoden im Rahmen von Tierversuchen:

Gehirnerschütterung / stumpfer Schlag auf den Kopf

Elektrische Betäubung (Zusatz: geeignete Anlagen / Geräte erforderlich)

Überdosis eines Betäubungsmittels (unter vorheriger Sedierung, wenn nicht unangemessen)

Andere Methoden, wenn das Tier zuvor wahrnehmungs- und empfindungslos ist und auch bleibt bis zum Eintritt des Todes

Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn wissenschaftlich nachgewiesen werden, kann, dass die Methode nicht zu mehr Schmerzen, Leiden oder Schäden führt.

Andere Methoden können durch die Behörden erlaubt werden, wenn es experimentelle Gründe gibt und die Methode ethisch vertretbar und unerlässlich ist.



Training nötig ästhetisch schwierig Kombination mit anderen Methoden

European Food Safety Authority- AHAW/04-027




AVMA-Guide 2013; Lines et al., 2003, 2004, 2005

Elektro-Euthanasie

Tod durch Kammerflimmern, Herzstillstand zerebrale Hypoxie epileptische Anfälle mit tonisch-klonischen Krämpfen gefährlich für Anwender unästhetisch


Immersionsbäder

direkter Übergang von Sedation und Narkose in den Tod

Substanz wird meist vornehmlich über die Kiemen aufgenommen, zirkuliert im Blut und wird unverändert oder nach Abbau über Kiemen, Niere, Haut wieder ausgeschieden

einfach anzuwenden, schnell, relativ billig

Probleme:

Metaboliten können sich im Wasser anreichern.

Notatmung einiger Fischarten kann den Effekt reduzieren.

Chemikalien können für Umwelt oder Anwender giftig sein.

Stress vs. Exzitationsphase


Anästhesie und Stress

Das gilt für jede Form der Anästhesie!

Anästhesie bedeutet Stress für den Fisch: Atemdepression reduzierter Gasaustausch Hypoxie respiratorische Azidose (CO2 Akkumulation) Anstieg von Adrenalin und Cortisol


Auswahlkriterien für eine gute Narkose

Anästhesie in weniger als 3 min, Wiedererwachen in weniger als 5 min!

Keine toxischen Nebenwirkungen für Fisch bzw. Anwender Keine langanhaltenden Auswirkungen auf Physiologie,

Immunsystem oder Verhalten Effizienz abhängig von Spezies, Größe, Dichte im Tank,

Wasserqualität Vortests mit kleiner Fischzahl! (Dosis, Wirkzeit) Anästhesie-Überwachung

Es gibt keinen Standard für alle Spezies und alle Zwecke!


Narkose bei Fischen - Hinweise

Schleimschicht nicht verletzen, Fisch feucht halten Fütterung aussetzen (spezies-abhängig!) immer Fischwasser verwenden (inkl. Temperatur) Sauerstoffzufuhr sicherstellen


Narkose-StadienStadium Beschreibung Symptome0 normal Aktives Schwimmen, Reaktion auf externe Reize, normales Gleichgewicht,

normaler Muskeltonus

I.1 Leichte Sedation Leichter Reaktionsverlust auf Reize (visuell, Berührung); normale Atemfrequenz, normales Gleichgewicht; normaler Muskeltonus; freiwilliges Schwimmen

I.2 Tiefe Sedation Verlangsamung; Einstellung freiwilliges Schwimmen; unkontrollierte Bewegungen, Verlust Reaktionsfähigkeit (visuell, Berührung) ; leichte Abnahme der Atemfreq.; Gleichgewicht normal, Muskeltonus leicht reduziert; Reaktion auf Positionsreize

II.1 Leichte Narkose Exitationsphase ggf. vor Anstieg der Atemfrequenz, Verlust der Körperspannung; Reaktion auf Positionsreize

II.2 Tiefe Narkose (Toleranzstadium)

Ausfall der Positionsantwort; Abnahme der Atemfrequenz wieder auf Normalmaß, Verlust des Gleichgewichts; Muskeltonus vermindert; leichte Reaktion auf starke Reize (Berührung, Vibration); äußere Probennahme; Flossenbiopsien; Kiemenbiopsien

III.1 Leichte Anästhesie völliger Verlust des Muskeltonus; Reaktion auf starken Druck; weiterer Abfall der Atemfrequenz; kleinere chirurgische Manipulationen

III.2 ChirurgischesStadium

Völliger Verlust von Reaktivität und Nozizeption; komplette Muskelrelaxation; langsame Atmung und Herzfrequenz; völliger Verlust der Reizantwort; (→ Druck auf Schwanzansatz); Chirurgische Eingriffe

IV MedullärerKollaps

Totaler Verlust des Muskeltonus, Reaktion auf starken Druck, weiterer Abfall der Atemfrequenz; irreversibel


(AVMA-Guide 2013 ; Matthews und Varga, 2012, Rombough, 2007)

MS-222 (Tricain)

am weitesten verbreitet

Pulver, in gelöster Form sauer, daher puffern

Wirkungsweise:

blockiert die Na+- (und K+)-Kanäle in NervenzellmembranenAusbleiben von Aktionspotentialen; Muskelrelaxation, Lokalanästhesie, Signalunterbrechung Peripherie – Gehirn

Blockade der Kiemenventilation Hypoxie

Blockade der Herz-Kontraktion Herzstillstand

wirkt besser in warmem Wasser mit geringerer Härte


MS-222

Probleme mit MS-222:

sehr unterschiedliche Konzentrationsangaben, was effektiv ist, Speziesunterschiede (Carter et al., 2011; Neiffer und Stamper 2009)

Indizien für Stress obwohl deutliche Anzeichen für Anästhesie (Carter et al., 2011; Matthews

und Varga, 2012)

aversiv (Readman et al., 2013; Wong et al., 2014)

dauert teilweise bis 3 h, dass Herzschlag aufhört (Veterinary Office, University of California,

Riverside)

werden teilweise wieder wach (4/23 Fischen) (Wilson et al., 2009)

retinotoxisch (Carter et al., 2011, Neiffer und Stamper 2009)

Steigerung von Hämatopoese-Faktoren mRNA (stärker als bei Benzocain, CO2, ZD) (Bowen et al., 2011)


MS-222

Dosierung von MS-222 im Zebrabärbling:

Sedierung: 0.01 mg/ml (Trevarrow, 2007, 2011)

Anästhesie: 0.168 mg/ml (Westerfield, 2007)

Euthanasie: 0.2 - 0.3 mg/ml (Wilson et al., 2009)


Benzocain

sehr ähnlich zu MS-222

schlecht löslich, daher letale Dosis schwer zu erreichen (AFMA, 2013)

nicht sauer, weniger empfindlich gegenüber Wasserhärte (Neiffer und Stamper, 2009)

schlechtere Sicherheitsspanne bei höheren Temperaturen (Gilderhus, 1989)

nach 15 min letal (Gilderhus, 1989)

Bewusstlosigkeit setzt teilweise erst sehr spät ein (Zahl et al, 2009)

aktiviert Hämatopoese-Faktoren nicht so sehr wie MS-222 (Bowen et al., 2011)

unterdrückt signifikant zelluläre und humorale Immunantwort (Bressler und Ron 2004)


Eugenol / Nelkenöl

bekannt aus der Zahnmedizin als Lokalanästhetikum, riecht gut

blockiert wahrscheinlich auch Na+-Kanäle (AFMA, 2013)

in USA nicht zur Euthanasie zugelassen (AFMA, 2013)

schnellere Bewusstlosigkeit als mit MS-222, als Narkose aber längere Erholung (AFMA, 2013)

vermutlich karzinogen (AFMA 2013), beeinflusst Hormonsynthese (Cytochrom P450) (Jayashree und Subramanyam, 1999); lebertoxisch?(Matthews und Varga, 2012)

Stressantwort weniger gesenkt (Goldelritze) (Palić et al., 2006)

löst sich schlecht in kaltem Wasser (Neiffer und Stamper, 2009)

kein analgetischer Effekt nachgewiesen (Sladky et al., 2001)

Dosierung von Eugenol im Zebrabärbling: Sedierung: 2 - 5 mg/l (Grush & Noakes, 2004)

Anästhesie: 60 - 100 mg/ml (Grush & Noakes, 2004)


Benzocain, Eugenol / Nelkenöl

MS-222 Benzocaine Nelkenöl / EugenolLöslichkeit gut schlecht schlecht in kaltem

WasserAzidität, Pufferung nötig + (+) -

Wasserhärte sensitiv nicht sensitiv ?

Wirkung bei höherenTemperaturen

gut reduziert ?

Bewusstseinsverlust (verglichen mit MS-222)

sehr spät schneller

Nachteile aversivTod nicht zuverlässigretinotoxischverändert TranskriptionZeichen von Stress

während der Anästhesie

letal nach 15 minstarker Einfluss auf die

zelluläre und humorale Immunantwort

kein Nachweis für einen analgetischen Effekt

kaum Verminderung der Stressantwort

karzinogenlebertoxischhemmt

Hormonsynthese (Cytochrome P450)

AVMA –Guide 2013; EMEA;2001; Matthews und Varga; Meinertz et al., 1999; Neiffer und Stamper, 2009; Sladky et al., 2001


Probleme mit Embryonen / Larven

1-2 dpf (Embryo): keine Kiemen-Atmung reagieren nur schlecht auf MS-222 o.ä.

5-6 dpf (Larven): nicht empfindlich Larven werden dann zunehmend empfindlich gegenüber MS-222

reagieren auch auf letale Dosen nicht gut, bes. < 1 h brauchen teilw. 10-20fach höhere Dosen (RBF) für LD50

kein Herzschlag ≠ tot 14 dpf: Herz schlug auf auch nach > 30 min (teilweise -75 min) noch wenn 20 min nach Ende des Herzschlags zurückgesetzt: 100% wieder erholt!

(Matthews und Varga, 2012; Rombough, 2007; Strykowski und Schech, 2015)


Hypothermie / „rapid chilling“

oft nicht akzeptiert als Methode

Ablehnung:

- zu langsam

- verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)

- stressig

- Eiskristallbildung ist schmerzhaft

- vielleicht nur immobilisiert

- keine anästhetische Wirkung

Quelle: American Veterinary Medical Association (2001) und Zitate davon

aber: in Ausgabe von 2013 ist es zugelassen




Ablehnung: - zu langsam, verzögert Eintritt des Todes (Fische brauchen kalt weniger O2)

Todeseintritt meist nach 10-20 s (oft schneller)

AVMA-Guide 2013; Wilson et al., 2009; Shine et al., 2015




Ablehnung:

- zu langsam

- stressig

Shine et al., 2015

Literatur: Plasma-Cortisol steigt; gestörte Plasma-Osmolarität, pH-Wert im Muskel gesenkt

Lachse, hohe Dichte, 1°C, 1 h

Vergleich mit Benzocain (Süßwasser-Hering): weniger Muskelreaktionen, schnellerer Gleichgewichtsverlust; Operkulum-Bewegung endet schneller, keine Anzeichen von Stress, abhängig von Körpergröße (linear) [Blessing et al., 2010)

(Donaldson, 1981; Rorvik et al., 2001; Skjervold et al., 2001)




Ablehnung:

- zu langsam

- stressig


MS-222 Eisbad

Gefrierschrank

Wilson et al., 2009

Fische haben keine Kälte-sensitiven Nozizeptoren (RBF, Ashley et al. 2006, 2007).




Ablehnung:

- zu langsam

- stressig



Keine Erholung nach Todeszeichen + 10 min (MS-222 4/23)(Wilson et al., 2009)




Ablehnung:

- zu langsam

- stressig



- keine anästhetische Wirkung

Nervenleitfähigkeit nimmt bei Kälte ab (Analgesie, Anästhesie?)(Wilson et al., 2009)



mit physikalischer Methode kombinieren (Mazeration o.ä.)

entscheidend: Körpergröße, Leitfähigkeit des Gewebes, große Körperoberfläche im Verhältnis zur Größe

Temperatur: 2-4° C; letale Temperatur des Fisches muss > 4°C sein

anwendbar bei kleinen tropischen-subtropischen Fischen

Adulte + 10 min nach scheinbarem Tod, 4-7 Tage: + 20 min

Nicht anwenden < 3 dpf: keine Effekt; teilw. > 14 h behandelt und trotzdem überlebt, sehr Hypoxie-resistent Bleichlösung o.ä.

nicht Einfrieren bei Bewusstsein, nicht langsam abkühlen

nicht gut: moderate Kühlung zusammen mit Anästhetikum, weil das Anästhetikum dann langsamer wirkt und die Tiere weniger O2 benötigen

Euthanasie dauert oft länger (Matthews und Varga, 2012)


Zusammenfassung Euthanasie / Anästhesie

chemisch physikalisch

MS-222 Benzocain Eugenol Bleich-Lösung Eisbadadult

++ / +++ + / ++ - / + - / - +++ / -Larve

+ / ++ + / ++ ? / ? - / - ++ / -Embryo

- / - - / - - / - +++ / - - / -


Anästhesie und Analgesie beim Fisch im Labor

Anästhesie Analgesie

Empfindungslosigkeit

(ggf. zusammen mit Narkose = reversibler Zustand der Bewusstlosigkeit)

Schmerzausschaltung

Unterdrückung des Schmerzempfindens ohne Auswirkung auf Bewusstsein,

Sinneswahrnehmung oder andere primäre ZNS-Funktionen

≠


Analgesie bei Fischen

Rezeptorenproteine der Nozizeptoren sind nachgewiesen; Funktionsweise unklar

Schmerz wird auf absteigenden Bahnen moduliert, Efferenzen bisher nicht beschrieben; viele Analgetika (u.a. Opioide) setzen an diesen Synapsen an

keine Opioidrezeptoren im RM nachgewiesen, an diesen bindet Morphin beim Säuger als Analgetikum

Modulatoren-Funktion (s. Aspirin auf Prostglandine): nichts bekannt

Opioide bisher nur als Hungerregulatoren oder Funktion bei Entzündung, Hormonsynthese, Verhalten etc. untersucht, nicht wirklich als Analgetika

Pharmakodynamik Morphin: -, keine dosisabhängigen Informationen vorhanden

Ehernsink (1982) hat Morphin am optischen Tektum appliziert: Reaktion auf Elektroschock beim Goldfisch vermindert; Naloxon als Antagonist wirksam



Morphin: Dosisangaben schwanken zwischen 10 und 3000 mg/kg (Säuger: 2-5 mg/kg)

Studie von Sneddon: 0,3 g / 1 ml i.m. (0,1 ml/ 10 g) = 3000 mg/kg; angeblich Rechenfehler (nie offiziell): 300 mg/kg (LD50 Maus: 200 mg/kg)

keinerlei Nebenwirkungen (?) andere Wirkung oder Pathways?

5

5

5

2

0,2

0,06

300

0 50 100 150 200 250 300 350

Maus

Ratte

Kaninchen

Hund

Pferd

Elephant

Regenbogenforelle (Sneddon)

Morphin mg/kg i.m.



Gabe ins Wasser: sehr langsame Wirkung, große Mengen nötig; andere Applikationen: zusätzlicher Stress

Eliminations-Halbwertszeit sehr spezies-abhängig

Verteilung im Fisch: 10x langsamer als bei Säugern (Temperatur) SneddonsDosis noch höher (32 Tage statt 4-6 h)

Morphin wirkt anziehend (Sucht?)

manche Analgetika sind tödlich im Fisch (Sidnophen, Analgin)

Einsatz und Nutzen von Analgetika bei Laborfischen sehr unklar; analgetisches Potential von MS-222, Benzocain



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