„„Evaluierung und Validierung Evaluierung und Validierung

potenzieller molekulargenetischer potenzieller molekulargenetischer

Tumormarker in Urinproben von Tumormarker in Urinproben von

Patienten mit Verdacht auf Patienten mit Verdacht auf

Harnblasenkarzinom“Harnblasenkarzinom“

Labor-SeminarLabor-Seminar

07.02.200707.02.2007

Juliane SchmidtJuliane Schmidt

Und ganz viele Helfer!Und ganz viele Helfer!

EinführungEinführung

• Harnblasenkarzinom (BCa)Harnblasenkarzinom (BCa)

VierthäufigsterVierthäufigster Tumor beim Mann weltweit &Tumor beim Mann weltweit &

neunthäufigsteneunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Ursache eines tumorbedingten

TodesTodes

• Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie:Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie:

Standardmethoden zur Diagnose und ÜberwachungStandardmethoden zur Diagnose und Überwachung

• kein idealer BCa-Tumormarkerkein idealer BCa-Tumormarker zur zur

nichtinvasiven Diangostiknichtinvasiven Diangostik

ZielstellungZielstellung

• EtablierungEtablierung standardisierter Methoden zur standardisierter Methoden zur

quantitativen Transkriptmessung in Geweben quantitativen Transkriptmessung in Geweben

(TUR-Späne) und Urinproben(TUR-Späne) und Urinproben

• TargetvalidierungTargetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf)an Gewebeproben (Tu-Tf)

• EvaluierungEvaluierung verschiedener tumorassoziierter verschiedener tumorassoziierter

Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche

diagnostische und prognostische BCa-Markerdiagnostische und prognostische BCa-Marker

BCa-assoziierte GeneBCa-assoziierte Gene

• Survivin & XIAP: Survivin & XIAP: “inhibitor of apoptosis proteins” (IAP)“inhibitor of apoptosis proteins” (IAP)

• Ki67: Ki67: Proliferationsmarker, essential für ZellzyklusProliferationsmarker, essential für Zellzyklus

• selektiv selektiv überexprimiertüberexprimiert in vielen Tumorarten inkl. in vielen Tumorarten inkl. BCaBCa

• AssoziationAssoziation zwischen Überexpression und höherem zwischen Überexpression und höherem Tumorstadium & Grad sowie mit Tumorstadium & Grad sowie mit ungünstiger Prognoseungünstiger Prognose

(( SVV SVV+Ki67 )+Ki67 )

• geeignete geeignete MarkerMarker (Literatur: Gewebe und Urin) und (Literatur: Gewebe und Urin) und therapeutische Targetstherapeutische Targets für Antitumortherapien (z.B. für Antitumortherapien (z.B. Antisense-Studie)Antisense-Studie)

Material & Methoden 1Material & Methoden 1• prospektive Studie:prospektive Studie: Februar 2006 – Januar 2007 Februar 2006 – Januar 2007

• Einschlusskriterien:Einschlusskriterien:– Patienten mit Verdacht auf ein BCa (Neudiagnose oder Patienten mit Verdacht auf ein BCa (Neudiagnose oder

Rezidiv) die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) Rezidiv) die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT)

unterziehenunterziehen

• Ausschlusskriterien:Ausschlusskriterien:– Patienten mit zusätzlichem Prostata-CaPatienten mit zusätzlichem Prostata-Ca

– Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom )Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom )

– Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

Material & Methoden 2Material & Methoden 2

• Kontrollgruppen:Kontrollgruppen:– BPH-Patienten BPH-Patienten

– Cystitis-PatientenCystitis-Patienten

– GesundeGesunde

– Cystektomiepatienten ( Sammlung läuft noch )Cystektomiepatienten ( Sammlung läuft noch )

Material & Methoden 3Material & Methoden 3

• BCa-Patienten:BCa-Patienten:

– prä-operative Urinprobeprä-operative Urinprobe

– intra-operatives Gewebe (Tumor & scheinbar intra-operatives Gewebe (Tumor & scheinbar

normale Blasenmucosa)normale Blasenmucosa)

– post-operative Urinprobe (Sammlung ge-post-operative Urinprobe (Sammlung ge-

stoppt)stoppt)

für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.)für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.)

gleicher Zyklus auch bei Rezidivengleicher Zyklus auch bei Rezidiven

• KontrollenKontrollen:: 1 Urinprobe1 Urinprobe

Behandlungsverlauf eines Behandlungsverlauf eines BlasenkarzinompatientenBlasenkarzinompatienten

Primäre TURBT

CystektomieSekundäre TURBT

Tertiäre TURBT Cystektomie

ca. 6-8 Wochen

ca. 6-8 Wochen

Rezidiv

Rezidiv

Material & Methoden 4Material & Methoden 4

• Sedimentation der Zellen aus dem UrinSedimentation der Zellen aus dem Urin

• Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = 70-100%)Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = 70-100%)

• Isolation von total RNA und cDNA-SyntheseIsolation von total RNA und cDNA-Synthese

• quantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und quantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und

das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeprobendas Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben

• Korrelation der relative Expressionsniveaus von Korrelation der relative Expressionsniveaus von

Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung

auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspektenauf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

Bca-Patienten (N=106)Bca-Patienten (N=106)• BTBT= 89 ( 84% )= 89 ( 84% ) NT NT= 17 ( 16% )= 17 ( 16% )• Alter (median)Alter (median) = 70 Jahre (34 – 93)= 70 Jahre (34 – 93)• M:FM:F = 63 : 43 (59,4% : 40,6%)= 63 : 43 (59,4% : 40,6%)• Neudiagnose : RezidivNeudiagnose : Rezidiv = 92 : 14 (86,8% : 13,2%)= 92 : 14 (86,8% : 13,2%)• PSAPSA (median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91)(median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91)• TumorstadienTumorstadien:: NTNT= kein Tumor nachweisbar n=17 = kein Tumor nachweisbar n=17

pTa pTa n=56 n=56 pT1pT1 n=15 n=15 >PT1>PT1 n=17 n=17

NA n=1 NA n=1

ciscis:: 92 :14 (86,6% : 13,2%)92 :14 (86,6% : 13,2%)

• TumorgradeTumorgrade:: NT n=17NT n=17

LMP (low malignancy potential) n=6LMP (low malignancy potential) n=6

low grade n=17low grade n=17

high grade n=66high grade n=66

KontrollenKontrollen• BPH: n =34 n =34 67,5 Jahre (52-85J.)67,5 Jahre (52-85J.) PSA-Median 2,105ng/ml PSA-Median 2,105ng/ml

(0,28-21,58)(0,28-21,58)• Cystitis: n =6 Cystitis: n =6 49,5 Jahre (19-76J.)49,5 Jahre (19-76J.) M : F = 1:5 M : F = 1:5

• Gesunde: n =30 Gesunde: n =30 30 Jahre (18-59J.)30 Jahre (18-59J.) M : F=7:22M : F=7:22

Cytologie

36%92%75%78%

Negativ prädiktiver Wert

(npW)

Positiv prädiktiver Wert

(ppW)

SpezifitätSensitivität

Vergleich mit unseren Daten folgt

Ergebnisse 1Ergebnisse 1

• 2 Referenzgene getestet:2 Referenzgene getestet: TBPTBP besser als HPRTbesser als HPRT

• UrinprobenUrinproben: : negative Korrelation zw. Referenzgen-negative Korrelation zw. Referenzgen-Expression & Erythrozyten / Leukozyten Expression & Erythrozyten / Leukozyten

viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenzeviele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze

von 10 Transkriptmolekülenvon 10 Transkriptmolekülen

• GewebeprobenGewebeproben:: weniger Proben mit neg. Referenzgenweniger Proben mit neg. Referenzgen

• aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Genevollständige Messung aller Gene

Ki67/TBP in ungepaarten GewebeprobenKi67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

Tf Tu

Gewebe

0

5

10

15

20

Ki6

7/T

BP

64.0

35.0

59

55

33

30

71

97

66

42

68

83

53

XIAP/TBP in ungepaarten XIAP/TBP in ungepaarten GewebeprobenGewebeproben

Tf Tu

Gewebe

0

10

20

30

40

50

60X

IAP

/TB

P

64.035.0

55

97

4319

50

70

53

68

10

SVV/TBP in ungepaarten GewebeprobenSVV/TBP in ungepaarten Gewebeproben

Tf Tu

Gewebe

0

2

4

6

8

SV

V/T

BP

64.0

35.0

59

97

68

10

53

33

Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und KontrollenKontrollen

BT NT BPH Csytitis Gesunde

Urine

0

2

4

6

8

10

12

Ki6

7/T

BP

5.030.0

73.0

14.026.0

41

75

4

38

84

80

21

95

122

143

156

150

148

149

Verarbeitete Fälle

73 82,0% 16 18,0% 89 100,0%

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

26 76,5% 8 23,5% 34 100,0%

5 83,3% 1 16,7% 6 100,0%

30 100,0% 0 ,0% 30 100,0%

UrineBT

NT

BPH

Cystitis

Gesunde

Ki67/TBP

N Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

Gesunde:

fehlende Werte Null

gesetzt

XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und KontrollenKontrollen

BT NT BPH Cystitis Gesunde

Urine

0

100

200

300

400

XIA

P/T

BP

5.0

30.0

73.014.0

26.0

45

35

148

77

3

24

18

47

70

71

73

106

102

103

136

121

119

120

163

Verarbeitete Fälle

73 82,0% 16 18,0% 89 100,0%

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

26 76,5% 8 23,5% 34 100,0%

5 83,3% 1 16,7% 6 100,0%

30 100,0% 0 ,0% 30 100,0%

UrineBT

NT

BPH

Cystitis

Gesunde

XIAP/TBP

N Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und KontrollenKontrollen

BT NT BPH Cystitis Gesunde

Urine

0

10

20

30

SV

V/T

BP

3.030.0

65.013.0

16.0

39

4

154

56

70

40

34

47

31

71

73

103

155

Verarbeitete Fälle

65 73,0% 24 27,0% 89 100,0%

13 76,5% 4 23,5% 17 100,0%

16 47,1% 18 52,9% 34 100,0%

3 50,0% 3 50,0% 6 100,0%

30 100,0% 0 ,0% 30 100,0%

UrineBT

NT

BPH

Cystitis

Gesunde

SVV/TBP

N Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorstadiumTumorstadium

NT pTa pT1 >pT1

Stage

0

5

10

15

20K

i67

/TB

P

16.0

14.0

44.0 10.0

63

40

84

6

38

68

64

92

Verarbeitete Fälle

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

44 81,5% 10 18,5% 54 100,0%

10 66,7% 5 33,3% 15 100,0%

16 94,1% 1 5,9% 17 100,0%

StageNT

pTa

pT1

>pT1

Ki67/TBPN Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorstadiumTumorstadium

NT pTa pT1 >pT1

Stage

0

100

200

300

400

500

600

700

XIA

P/T

BP

16.014.043.0

10.0

34

67

58

17

13

14

37

36

60

18

43

59

80

102

Verarbeitete Fälle

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

43 81,1% 10 18,9% 53 100,0%

10 66,7% 5 33,3% 15 100,0%

16 94,1% 1 5,9% 17 100,0%

StageNT

pTa

pT1

>pT1

XIAP/TBP

N Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorstadiumTumorstadium

NT pTa pT1 >pT1

Stage

0

10

20

30

40

SV

V/T

BP

13.0

13.039.0

9.0

64

79

86

14

38

48

35

43

59

80

99

102

Verarbeitete Fälle

13 76,5% 4 23,5% 17 100,0%

39 73,6% 14 26,4% 53 100,0%

9 60,0% 6 40,0% 15 100,0%

13 76,5% 4 23,5% 17 100,0%

StageNT

pTa

pT1

>pT1

SVV/TBPN Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorgradTumorgrad

NT LMP low high

Grade

0

3

6

9

12

15K

i67

/TB

P

55.0

14.0

5.010.0

55

40

84

87

6

38

68

64

92

Verarbeitete Fälle

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

5 83,3% 1 16,7% 6 100,0%

10 66,7% 5 33,3% 15 100,0%

55 84,6% 10 15,4% 65 100,0%

GradeNT

LMP

low grade

high grade

Ki67/TBPN Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorgradTumorgrad

NT LMP low high

Grade

0

100

200

300

400

500

600

XIA

P/T

BP

55.014.05.0

10.0

35

17

13

14

61

18

76

74

44

103

81

60

Verarbeitete Fälle

14 82,4% 3 17,6% 17 100,0%

5 83,3% 1 16,7% 6 100,0%

10 66,7% 5 33,3% 15 100,0%

55 84,6% 10 15,4% 65 100,0%

GradeNT

LMP

low grade

high grade

XIAP/TBP

N Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom TumorgradTumorgrad

NT LMP low high

Grade

0

10

20

30

40

50S

VV

/TB

P

51.0

13.0

3.0

8.0

87

14

36

100

103

80

44

34

81

60

Verarbeitete Fälle

13 76,5% 4 23,5% 17 100,0%

3 50,0% 3 50,0% 6 100,0%

8 53,3% 7 46,7% 15 100,0%

51 78,5% 14 21,5% 65 100,0%

GradeNT

LMP

low grade

highgrade

SVV/TBPN Prozent N Prozent N Prozent

Gültig Fehlend Gesamt

Fälle

SchlussfolgerungenSchlussfolgerungen

• Eignung als TumormarkerEignung als Tumormarker: : Ki67,(SVV)Ki67,(SVV)

• Abhängigkeit vom TumorstadiumAbhängigkeit vom Tumorstadium: : Ki67,SVVKi67,SVV

• Abhängigkeit vom TumorgradAbhängigkeit vom Tumorgrad: : Ki67,(SVV)Ki67,(SVV)

• XIAPXIAP ungeeignet: Expression im Prostata-ungeeignet: Expression im Prostata-

gewebe => bei BPHgewebe => bei BPH

Expression in LeukozytenExpression in Leukozyten

=> bei Cystitis=> bei Cystitis

Ausblick 1Ausblick 1

• gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne

histologischen Tumornachweis (NT)histologischen Tumornachweis (NT)

• Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT?Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT?

• Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination

der Tumormarker ? der Tumormarker ? (Verweis auf Prostata-Krebs-(Verweis auf Prostata-Krebs-

Studie)Studie)

• Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 )Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 )

• Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)

Ausblick 2Ausblick 2

• Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH )Einfluss von BPH )

• Korrelation Tumormarker im Urin und Korrelation Tumormarker im Urin und korrespondierenden Gewebekorrespondierenden Gewebe

• Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt:Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt:

Bakterienzahl oder positive Urinkultur?Bakterienzahl oder positive Urinkultur?• Sammlung BPH- ,Cystitis-und Cystektomie-Sammlung BPH- ,Cystitis-und Cystektomie-

PatientenPatienten• Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?