Experimcntelle and theoretische Untersuchnngen zur Abbildung nichtabsorbierender Objekte

Vcin H a n s Wolter

(Mit 1 2 Ahbildungen)

Inhalteiibrrsicht Die Abbildung von Phasengittern und einzelnen Phasenstreifen mit dem

Phasenkontrastverfahren, mehreren Dunkelfeldverfahren, dem Toeplerschcn und dem Gegenfeldschlierenverfahren wird theoretisch und experimentell auf .Objekttreue untersucht. An Aufnahmen bekannter und sehr einfacher Objekte (Zaponlackstreifen rechteckigen Querschnitts) und durch theoretische Kurven werden die von den Verfahren, insbesondere auch dem Phasenkontrastverfahen vorgetauschten Strukturen veranschaulicht.

1. Einleitung Seit Zernike das Pbasenkontrastverfahrenl) zur Beobachtungnicht absorbieren-

der - also bei gewohnlicher Abbildung unsichtbarer - Objekte schuf, sind die groDen Vorzuge dieses Verfahrens in vielen Veroffentlichungen dargelegt worden. Dabei wurde der Eindruck erweckt, als gabe das Verfahren die Objekte vollig treu wieder, und die aus Phasenkontrastbeobachtungen gewonnenen D a t a und Strukturbilder galten als unbedingt zuverlassig.

DaB dieses nicht der Fall ist, bemerkte Verfasser zuerst an Aufnahmen von Erythrocyten in der grundlegenden Arbeit von Kohler und Laos*); die Autoren hatten aus den Aufnahmen geschlossen, daD die Durchmesser der Erythrocyten 10 bis 15% kleiner seien, a19 es im Hellfeld erschien. Das stand im Widerspruch zu eigenen Beugungsmessungen und machte es wahrscheinlich, daD auch Phasen- kontrastbeobachtungen gelegentlich zu falschen Werten fuhren konnen. Weitere Aufnahmen verschiedener Autoren und schliefllich die eigenen mikroskopischen Messungen zeigten, daB eine kritische Deutung der Phasenkontrastbilder notig ist.

Um dafiir eine sichere Grundlage zu gewinnen, stellte Verfasser genau bekannte kiinstliche Objekte her und untersuchte die verschiedenen Abbildungsverfahren damn auf Objekttreue. Die vorliegende Arbeit gibt den experimentellen Befund und die Ergebnime einer entsprechenden theoretischen Behandlung des Problems, soweit es sich um Objekte rechteckigen Querschnitts handelt ; Objekte anderer Gestalt - insbesondere die sehr wichtigen zylindrischen - wurden analog unter- sucht; docb empfahl sich eine getrennte Veroffentlichung.

1) Zernike; Physica 1, 689 (1934). *) A. Kohler u. W. LOOS, Naturwiw. 29, 61 (1941). Ann. Physik. 6. Folge, Ed. 7 3 A

34 A n n a h der Phyeik. 6. Folqe. Band Y. 1950

Diese Arbeit stellt also eine Weiterfiihrung der von Zerii ike und C. u. E. Menzela) in Angriff genommenen Untersuchungen dar. Wenn hier zum ersten Male von Mangeln des Phasenkontrastverfahrens die Rcde ist, so sol1 das Ansehen des Verfahrens dadurch nicht geschmalert sondcrn seiner erfolgreichcn Anwendung ein - wenn auch nur bescheidener - Dienst erwiescn werden.

2. dbbildring periodiseher Objokte, spezidl (f.itt.er a) Gemeinseme Zuge der Verfahren zur Abbildung niclitnbsorbierender Objekte

Lebende ungefarbte Baktcrien, Chromosomen und Zcllcn, ferncr Kristallt? in ihrer Mutterlauge, Luftschlieren, Schlieren in Gllscrii, Mlngel von Planparallel-

platten oder anderen optischcn Hilfs-

die Phase und nicht die Intensitat des hindurchtrctcridcn (oder reflcktierten). Lichtes anders bchandcln, sls ihrc Umgebung es tut, sind in einem durch ideale optischc Abbildung cntstehen- den Bilde fiir unser Auge unsichtbar. Mehrere Mcthodcii, sic sichthar zu macheii (Dunkclfcldverfahren, Schlie- renverfahrcii, Ph:iseiikontrastver- fahren), greifcn veriindernd in den Strahlengang ein, und zwar dort, wo das Bild dcr Lichtquclle oder des als solche wirkenden Lichtquellendia- phragmas clurch die nbhildendcn Mittel crzcugt wird.

Tm Mikroskop (siehe Abb. l!) liegt- das Lichtquelleiidiaphragina (die Be- leuchtungsblcnde) in der uiiteren

K0"de"5uf Brennebcnc dcs Kondensors und sci II

Bild daher in tlcr obcren Hrennebenc: iich/que//en- des Objcktivs. Ungcstort ist dieses

Bild freilich iiur so lange, wic kein Abb. 1. Strahlengsng im Mikroskop Objckt auf dcm Objekttisch liegt.

Wird heispielswcise ein Gitter als Objekt bet,rachtct und . benutzt man als Lichtrluellendiaphra~nla einen linearen Spalt (urn der Einfachheit willen wiiihlen wir dicscn Fall bier vorzugsweise), so, entstehcn in der hinteren Brennebene des Objcktivs die elemeiitar bekannten Gitterspcktren. Konnen alle Spcktren sich ungchindert auswirkeii, so intcr- ferieren die von ihnen ausgchenden Wcllcn auf der Bcobachtungsehenc gerade so niiteinander, daD dort ein getreues Bild des Objcktgitters entsteht. Greiferi wir abcr in die Spektren verlndernd ein, so konnen wir das Bild selbst andern und z. B. von cinem an sich unsichtbaren Gitter (das ctwa in eine diinne Zaponlack- schicht mf Glas eingeschnitten sci) eiri Bild erzeugen, das im Gegensatz ziim unge- storten Bild Helligkeitsuntcrschiede aufweist und durch sie AufschluD iibcr dart Objckt in hiilicrem MaBe giht, als das idc;tle Bild ex k:inii. D i c . \-(.r.schi(xlenen Ver-

c X mitteln - kurz alle Objekte, die iiur Bddebene

Mintere Brennedene

5 ~ / f

E. 11. (1. Menzel, Optik 4, 22 (1948).

H. Wolter: Unlerauchungen mr Abbildung nicW-r&r Objek4e 36

fahren, die wir hier untersuchen wollen, unterscheiden sich nur durch die Art des Eingriffs in die Spektren ; eine theoretische Untersuchmg ihrer Wirkungsweise mu13 von dem Zusammenhange zwischen Spektren und resultiereudem Bild aus- gehen.

b) Zussmmcnbang zwischen periodisehen Objekten und ihren Spektren Die Beleuchtungsblende sei ein enger h e a r e r Spalt ; das Objekt sei eindimen-

sional, zeige also in einer zur Spaltrichtung parallelen Koordinatenrichtung keine hderungen. In der d a m senkrechten Koordinatenrichtung sei die Rirkung des Objekts auf das Licht durch die komplexe Funktion O(s) beschrieben. Diese ,,Objektfunktion" gebe die Lichterregung in ciner Ebene unmittelbar hinter dem ,Objelct, nach Amplitude und Phase; sic sei in diesem Paragraphen als periodisch niit der Periodenliinge g vorausgesetzt. Die ,,Bildfunktion" B(z) (Lichtenegung in der Bildebene) ist mit der Objektfunktion O(z) identisch, wenn wir Orientierung und MaSstab der s-Koordinate iin Bilde entsprechend wahlen. Die diskreten Spektren En (n = . . .--2, -1, 0, 1, 2, . . .) in der hinteren Brennebene stehen dann mit O(s) und B(s) in der einfachen Beziehung der Fourierreihe ZII ihreii Koeffizienten

0 i -

f!:,, = -- I II

das folgt elementar aus den bekannten Uesetzen der Beugung fur d'en idealisierten Fall, daS Objekt und Spektren unbegreiizt seien, ferner alle auftretenden ,,Strahlen" kleine Winkel 01 mit der optischen Achsc bilden und der Abstand der hinteren Brennebene vom Bilde groS gellug sei. Die durch Abweichung von diesem Ideal- falle auftretenden Modifikationen interessieren fur die Klarung prinzipieller Fragen ZII den hier in Rede stehenden Vcrfahren nic1.t.

Diis Spelitrum nullttv Ortlniiiig

Y c-

. I 9

I: , : (3) 0 _ -

hat eine besoiiders einfache Bedeutung ; es ist der Mittelwert der Objektfunktion

1st das Objekt speziell ein ,,Phasengitter", besteht es also z. B. aus durch- sichtigen Zaponlackstreifen auf einer Glasplatte, und hat die Objektfunktiou hinter den Streifen den Wert 0, und hinter den Zwischenraumen den Wert O,, so ist das Spektrum nullter Ordnung E,, der Schwerpunkt der beiden Punkte 0, und 0, in der GauDschen Zahlenr1)ene; dahei ist jedenl Punkte ein ,,Gewicht"

O(X).

3*

36 Annalen der Physik. 6. Folge. Band 7. 1950

entsprechend der Breite des zugehorigen Streifens bzw. Zwjschenraums im Objekt zu erteilen. Wegen der vollstandigen Durchllssigkeit der Zaponlackstreifen haben die zu 0, und 0, gehorigen komplexen Vektoren zwar verschiedene Richtung, aber gleiche Lange (siehe Abb. 2). Der Schwerpunkt Eo liegt auf der Verbindungs- linie und naher an 0,, wenn die Zwischenriiume brciter als die Gitterstreifen sind.

6 C

Abb. 2. Lichtrektoren im Bilde eines Glitters, 0, fur die Gitte-trei'en, 0, f i k d ie Zwirchenrliurne. ,To = S p k t r u m nullter O r b u n g (Mittelwert).

a) fur ein Phascngitter b ) Schwenkung dej Spektrumy nnllter Ordnung urn 90' h i dem FhasrnkontrastvcrfahI.en c) I-ichtvektoren bei negativem Phasenkontrast d ) Lichtvektoren bei positivem Phasenkontrast e) Dashelbe lur Gin Amplitudengitter

c) Strenges nunkelfeldrerfaliren bei Uitterii Diese gegenseitige Lage zeigt nun, wie BUS den1 Idealbildc ein Bild erzeugt

werden kann, in deiii sich die Streifen von den Zwisrhenr6umen in der Helligkeit unterscheiden. Entfernen wir namlich beipsielswcise das Spektruni iiullter Ord- nung &us dern Lichte, indem wir es durch einen diinnen Drnht in dcr hinteren Brenneberie des Objektivs verdecken,- wir nennen das ,,strenges Dunkelfeldver- fahren" -, so geht die new Rildfiniktion nach G1. (2)'aus O ( r ) durch Suhtraktion von Eo hervor

B.qu (2)' O ( r ) - go. (4)

Gleichwertig ist in Abb. 2 cine Verleguiig des Nullpuiiktcs nuch ldo; die Vek-. toren XOO, bzw. E,O, stcllen also die Amplitude des Lichtes im lieuen Bilde dar und untcrscheiden sich in ihrer Liinge, wenn Streifen und Zwischenraumo ver- schiedene Breitr hahen. Der schinalere Teil wird jewcils hcller als der breitere dargestcllt.

4 . 2 P h C n x

Abb. 3. Amplituden (oben) und Tnteneitiiten (rnten) bei stmngem Drnkelfeldrerfahren, links fur ein Gittcr a\lb eohmalen Streifen und hreiten %wi.chenritumen, rechts bei gleicher

Breitc der Streifen und Zwischenriiumc

11. Wolter: Uv&rsuchuryen iu r dbbildusig niehtubsorbiereiider Objekte 37

Experimentell wird das belegt durch die strenge Dunkelfeldaufnahiiie Abb. 611

rechts, in der die Zaponlackstreifen 4, hell auf duiikleni Grunde erscheineii.

Leider kann nicht allgeinein entschiedeii werden, was Zwischenraunie oder Lackstreifen sind. Auch versagt die Methode bei gleicher Breite der Streifen und Zwischenraume. Dann lie@ E, in der Mitte der Strecke O,O,, uiid die Bildfunktion verlauft nach Abb. 3c statt nach 3a. Die Intensitat (Abb. 3d) zeigt keiiie Uilter- schiede mehr bis auf die Nullstellen an den Kanten, die auch iiur unnlerklich schmal waren, wenii nicht in der Praxis -4b~eichuiigen von den strengen Voraus- setzungen stets eine Verbreiterung ergiben.

Dieses Verhalten steht zwar im Widerspruch zu den landlaufigeii Vorstellungen voiii Dunkelfeldverfahren, wird aber durch den experiinentellen Befuiid bestatipt. In der Aufnahme 6 b links eines Gitters mit gleich breiten Streifen und Zwischen- raumen sind nur dort ausnahmsweise einige Streifen dunkler. die zufallig etn-as zu breit geraten waren.

Ob ein Phasengitter oder ein ,,Ainplitudengitter" ails undurchsichtigen Lack- streifeii vorliegt, ist nach Abb. 2 fur den Erfolg des strengeii Dunkelfeldverfahrens offenbar gleichgiiltig; denn iiur die Laiige der Strecke 010, und die Lage von E',, darauf (d. h. die relative Breite der Streifen zu den Zwischenrauinen) wirkeli sich aus. Abb. 6 b zeigt ganz links die strenge Dunkelfeldaufnahme eiiies dmnplituden- gitters; Abb. 6a gibt dasselbe Objekt ini Hellfeld.

d) Strenges PhasenkontraYtverfahr~ii bei Gittern Der weiter oben genannte Nachteil des strengen Dunkelfeldverfahreiis wiirde

vermieden, wenn der Nullpunkt nicht nach E, sondern etwa nach einem Punkte der Geraden 010, auBerhalb der Strecke O,O, verlegt werden konnte; deiin daiiii miiljten Phasenunterschiede zwischeil 0, und 0, sich stets in Intensitatsunter- schiedeii auswirken. Man miiBte zur naherungsweisen Durchfiihruug dieses Planes das Spektrum nullter Ordnung zunachst entfernen nnd dann um 90' phasen- gedreht wieder hinzufiigen. Der Nullpunkt wiirde d a m nach N+ oder N- (Abb. 2 b) verlegt und die voii dort nach 0, uiid 0, gezogeiien Vektoren wiirden sich in der Lange, die Zwischenraume und Streifen ini Bilde also in ihrer Intensitat unter- scheiden - gleichgiiltig wie breit jeweils Streifen oder Zwischenrauine waren.

Dieses Programm trifft das Wesen des Phasenkontrasti-erfahrens nach Ze r - i i ike; bei ihm liegt in der hinteren Brennebeiie des Objektivs eine Platte, die am SOrte des Spektrums nullter Ordnung einen zum Bilde des Lichtquelleiidiaphragmas kongruenten Phasenstreifen (Lack oder Rille in einer Lackschicht) tragt und durch ihn das Spektrum nullter Ordnung uin 90" phasendreht. Mit einer solchen Vor- richtung aufgenommene Bilder unsichtbarer Zapoiilackgitter zeigt die Abb. 6c ; es sind die gleichen Gitter, die dariiber mit dem strengen Dunkelfeldverfahren und uiiter a im gewohnlichen Hellfeld photographiert waren.

Abb. 6c zeigt links zuin Vergleich wieder ein Stuckchen eines Aruplituden- gitters, bei dem der Lack midurchsichtig war. Wahrend dieses im Hellfeld 6a iiatiirlich besonders gut abgebildet wird, ist es im Phasellkontrastbilde unkennt- lich. Das ist zwangslaufig; denn nach Abb. 2e werden aus reiiien Amplitudeii- unterschiedeii durch das Phasenkontrastverfahrell fast reine Phaseiiunterschiede.

4 ) Technisehe Date11 wurclen in den Anhaiig ve-erniesen.

Aiiu. Physik. 6. Folar, nd. 7 3 B

38 Annalen der Physik. 6. Folge. Band 7. 1950

Ob die Lackstreifeii eiiies Phaseiigitters duiikel auf helleiil Gruiide (sogeiiaiiiites positives Phaseiikoiitrast~-erfahren) oder hell auf duiiklern Gruiide (negatives P- Verfahreii) erscheiuen sollen, kaiiii bei der Herstelluag des fur die hititere Brenn- ebeiie ctes Objektivs bestimiiiten Zeriii k e -Phasenplattchens frei gewahlt werdeii. Dreht der Phaseiistreifeii (siehe Abb. 2) das Licht urn 90" voraus, so wird der Null- punkt nach N- verlegt uiid der zu deli Zwischeiiraumen gehorige Pfeil N-0 , wird der kiirzere, d. 11. es resultiert der negative Phaseiikontrast; dreht der Ze r - iiicke-Streifen 11111 90" zuriick (das Zernike-Plattchen besteht danii z. B. aus eiiier Lackschicht init eiiier Rille am Orte des Spektruiiis nullter Ordiiung), so wird der Nullpuiikt iiach N+ verlegt, und der zu den Streifeii gehorige Pfeil N+O, ist i i u der kiirzere, wir haben also positiven Phasenkoiitrast.

Das Verfahren ist offeiibar darauf aiigewieseij, dslj 0, uiid 0, iiicht allzu weit voiieinaiider eiitferiit sind. Wiirdcii sich 0, uiid 0, um 180" in Phase vorieiiiaiider unterscheideii, so wurde das Phaseiikoiitrastverfahreii keiiie Ainplitudenuiiter- schiede niehr bewirken. Fur diinnste Objekte eigrlet sich das Verfahren sehr gut, weiin arich freilieh bei abriehineiider Dicke die HelligIreitsnnterschiede iin Bjlclc schlieBlieh eritsprecheud abiiehmeii.

Bur duniiste Objekte kaiin das Verhaltiiis der Helligkeiteii koiitrastreicher ge- staltet werden, wenn das Spektruin nullter Ordiiuiig iiicht iiur phaseiigedreht sonderii auch in geeigiieteiii Malje geschwacht wird, so daf3 der iieue Nullpunkt (Abb. 2 ) von N,. oder iV- naher an eiiieii der Punkte 0, oder 0, herangeriickt wird. Bei der zu den Aufnahmen 6c benutzten Vorrichtung war der Phaseiistreifeii des Ze rn ike -Plattchens iiiit Tusche etwas aiigefarbt worden; das erleichterte zii- gleich sehr wesentlich die Justierung, da der Phasenstreifeii iiaturlich sehr geiinu rnit den1 Bilde des Lichtquelleiidiaphragnlas zur Deckuiig gebracht werden niuf3.

Brcilich richtet sich die wiiiischenswerte Schwachuiig des Spektrunis nullter Ordiiuiig ersichtlich iiach dern Objekt selbst ; daher wurden Methoden zur koiitr- iiuierlich E\-ahlbaren Sehwlehuiig vorgesehlagen 5 ) . Bei der eirigehenderen Theorie des iiachsten Parsgrapheii vierdeu wir dies bereits iiii eiiizeliien berucksichtigeii.

e) Kicht stronges Pliascnkontrastrerfahreii Biiher setzteii wir als Lichtquelleiidiaphragma eiiieii extreiii schiiialen Spalt

roraus; praktisch verlangt eiii helles Bild eiiieii nicht zu schnialen Spalt, da die Spekfren Flachenhelligkeit der Lichtquelle

der Urdnung derO,.dnung iiicht nach Beliebeii gesteigert + 7 1 D 1 - 7 D I -7 werdeii kaiiii. Fur die Auf-

nahinen 6 c war der Lichtquelleii- spalt (uiid der zu seinem Bilde koiigrueiite 90"-Phasenstreifeii des Zernike-Plattchens) so bc- messeii wordeii, daB die Seiten- spektreii uiid das Spektruiii

I Pbmen-1 Ifbusen I d l t e r Ordiiuiig entsprecheiicl Abb. 4a voneiiiaiider noch ge-

1----1 I treniit lageii, ihre unterschiedliche L7 b Phaseiidrehuiig also noch inoglich

5j Siehe unter andercm P. Ice c k

Spek fren

q! I ip eiB!d I , Is/re/&n I +/fin, l

I

dbb. -1. Lage der Spektren Luin Pbatenstreifeii, u liei ctrengeni, b bei nicht strengeni Phasen-

lrontrastrerfahren

_ _ ~ ~

11. A . Brice, Optilr 5, 31 (1949).

Ii. Volter: Untersuch ungen zur Abbildwig ,2.ichtubsorbirrender ObjeXte 39

war. Das galt freilich iiur fiir die Gitter der Abb. 6 links bis Mitte uncl erst recht feininaschigere Gitter.

Grobere Gitter dagegeii haben iiotweiicligerweise eiiger liegeiide Spektren ; bei gleicher Apparatur la& sich die nullte Ordiiung daher nicht 1-011 den Seitenspek- treu vollig absondern, und die Spektren erster Ordnung werden niehr oder weiiiger stark ron der Phaselidrehung niit betroffeii (Abb. 4b).

Die Auswirkung zeigt Abb. 6c rechts, die Mitten der Zwischenraume sind dunkel abschattiert ; siiid auch die Larkstreifen selbst breiter, so erscheinen sie in ihrer Mitte aufgehellt. Uiese vorgetauscbteii Schattierungen, deneii nichts irn Objekt ent- spricht, werden verstand- lich, w-enn niau bedenkt, daB die Spektren erster Ordiiung nach GI. (2) wie eine cos-Funktjoii (Kurve b in Abb. 5 ) zuiii stren- gcii Phasenkontrastbilde

J L J L R b T---- ' d

(Kurve a in Abb. 5 ) bei- > ._ tragen. Beseitigt inan die Spektren erster Ordnung, so bleibt iiii Bilde nur die Differenz beider Kurveii (c in Abb. 5). Durch Qua- drieren erhalt man die Intensitat (Kurve d). Fiigt inan die Spektren erster Ordnung uin 90" phasen- verkehrt wieder hinzu, so erhalt inan einen Inteii- sitatsverlauf nach Abb. e , der qualitativ den Beob- ach tungen eutspricht .

Abb. 5 . liurve a Strenges Phasenkontratsbild, Kilrre b Interferenzbild der Spektren eister Ordnung im Bilde, Kurve c Phasenkontrastbild nach Entfernung der Spek- tren erster Ordnung, Kurve d IntensitLt nsch Entfernung der Spektren erster Ordnung, Knrve e Intensitiit nach phasenverkehrter Zufiigung der Spektren erste Ordnung = Bild bei nicht streiig durchgefuhrteni Phasenkontrast-

verfahren

Die quantitative Untersuchung uncl clie Vrrall#eiiieiiier~~ig auf iioch grobere Objekte und andere Abbildungsverfahren koiniten an Hand der Spektreil ebenfalls leicht durchgefiihrt werden; doch sei anf einen Abdruck hier rerzichtet, da wir die elitspreeheliden Frageli an tuiperiodischell Objekten wegen ihrer uri1fasseudereli praktischen Bedeutung ohnehin iioch iui iiackisteii Paragraphen bearlttrorten u i d damit auch die Erscheiilungell bri Gittern ausrejchencl beleuchten werden.

3. Nichtperiodische Objekte, spezitll Einzelstreife~~

a) Eingriffe verschiedener Akbildungsverfallren in die Spektren

Wircl ein Ohjekt niit einer nnperioclischen eiiidiilleiisioiialeii Objektfunktion O(z) iin Mikroskop (Abb. 1) abgebildet, so cntsteht in cler hinteren Brennebene

40 Amalert dcr Physik. 6. Folge. Urcnd 7'. 1950

des Objekt,im eiii koiitiiiuicrliches Spektruiii

C

_ - d

Uui iiicht niit mieigeiitlicheii Funktionen (&Piinktion oder dgl.) rechiien zu miisseii, gebeii wir den1 ausgeleuchteteii Objektfeldc dic eiidlichc Breite G ; sic

Abb. 6. 3Iilcroskopische Aufualimen voii Gittern; von oben nach unten gleichbleibende Objekte, ron links nach rechts gleichbleibende Abbildungsverfahren: rc Hellfefd, b strenges Durike feld, c Phasenkontrast, .I Gegenfeld, e nicht strenges, aber noch

spmmetrisclies Dunkelfeld, f T o ep 1 e r sches Schlierenverfahren

sei stcta grol3 gegeniiber allcii ,,rStruktiireii" des Olijekts. Nach Fkrechiiuiig der Bildfuiiktion

03

(6) B (z) = E (7) $rt? 'z dy -03

kiiniieii wir G + 00 geheii lassen. Wic das Fourierache Iiitegraltheorein a s - cngt, ist daiin die Bddfiiiiktioii iiiit der Ohjektfunktion ideiiti,wh. h d e n i wir die

Spektren E(y) zu Q (y) . E ( y ) ah, so erhalteii wir das geanderte Bild 03

B, (x) = J Q ( y ) . E ( y ) . e e n i y z 4J * (7) -00

Q (7) heiIJe die Eiiigriffsfuiiktioi1; die voii uiis zu dishtierenden rnikroskopischeii Verfahren iiehmeu jeweils bestiniinte Eiiigriffe in die Spektren vor ; sie lassen sich clurch folgende Eiiigriffsfmiktioneii beschreibeii :

fur

Abb. 7. Blikroskopische Aufnaiimen voii unpericdisehen Objekten. Anord~mng und Verfahrrn entsprerhend Abh. G

100 (9)

Ii-4 fiir jyl< ; - 1 < A < + 1 strenges Zernike-Verfahrell

Zeriii ke -Verfahren

42 Annalen der Physik. 6. Eblge. Band 7 . 1950

f 0 fur jyj < y i I 1 sonst symmetrisches Dunkelfeldv. Qo ( y ) =

J 1 fiir y > yi > 0 eiiiseitiges Dunkelfeldr. Q,u(y) = I solist

1 f u r y > 0 Gegeiifelclrerfa hren Qu ( y ) = 0 fiir y = 0

1-1 fiir y < o

0 fiir y < 0

I 1 fiir y > 0 . Toep le r s Schliereii~. QT ( y ) = fiir y = 0

Die ,4l)ert-~irbegreiizuiig (8) ist iiaturlich kein ,,iiiikroskopisches Verfahreii", vielmehr eine uiiermiinschte Zugabe, durch die sich schoii das gewohiiliche Hell- feldbild BA (2) coin 1dea.lbilde 0 (x) uiiterscheidet uiid die wir auch bei deiii Phn- senkoiitrast,rerfahreii usw. iiicht cerineideii konneii. Wir wollen daher den Aus- fall aller Spektreii init I y 1 > yo such bei den Funktionen Qsz in GI. (9) bis QF in G1. (15) stillschweigeiid zusatzlich aiinehineii ; doch iiiteressiert die Wirkung der Aperturbegrenzuiig dort irn Zusaiiiiiieiihaiig init uliserer Pragestelluiig wenig uiid wir begniigen uiis daher vorwiegeiid mit deni Greiizfall yo + 00.

100 Bei (9) hat die Angabe 1 y I S F folgenden Sinn. Das direkte Licht ist. auch

bei schirialstern Lichtquellenspalthild groBeaordnungsma8ig 7'011 der Breitc 6y w - .

Die Forderung Qsz ( y ) = i A fiir [ y 1 5 - in (9) sol1 dafiir sorgen, daB init

Sicherheit das gesamte direkte Licht von der 90°-Phaseiiclrehung (Faktor i) uiid der Schrviichuiig (Faktor A ) betroffen wird. Da G als sehr groIj gegeiiiiber alleii jnteressierenden Teileii des Objekts angenoinmen wird, wercleii bei (9) die spezielleii Spektreii cler Objekte von der Phasendrehung und Schwachuiig iiicht Tesentlich

bertihrt, ; denn djese Spektreii habeii gegeniiber der geringeii Breite eiiie sehr

grol3e Ausdehnung. Bei (10) wird dem Zern i ke-Phasenstreifen eiiic beliebig groIje Breite (festgelegt dnrch 1 y I < yi) gegeben .

1 G

100 . c:

In allen Fallen setzeii wir uin der einfachereii Rechiiung willen deli Lichtquelleii- spalt als extrein eng voraus. Freilich zwingt gerade der zur Erzielung eiiies helleii Rildes in der Praxis verbreiterte Lichtquelleiispalt erst ZU eineni breitereii Ze r - ni k e -Streifen und dainit zum Verlassen des streiigen Phaseiikontrastverfahreiis. Deniioch ist unsere Vereinfachuiig berechtigt, da eine iiacht.ragliche Verenguiig des Spaltes, wie unsere Theorie das vorsieht, experimentell bei gleich bleibentleni Zernike-St,reifen keiiie wesent,lichen hde rungen des Bildes bewirkt ; eiiie theo- retische Uiitersuchuiig bestatigte das. Quantitatkes iiber die Wirkung eiiies be- liebig breiten Lichtqiiellenspaltes auf die Abbilduiig wird iin Zusamineiihang init einer Arbeit iiber Selbstlenchter und Nichtselbstleuchter bei iiiikroskopischer Beoh- achtuii g niitget,eilt1 wcrdcii.

H. TVolter: Uiitersuchungen zur dbbildung Izichtnbsorbielaiicr Objekte 43

h) Spektren ukld Bilder eines Streifens 1s t das Objekt ein symmetrisch zum Nullpunkt des Koordinate-usystems ge-

legener Btreifen der Breite b, charakterisiert durch die Objektfunktion

Da iiuii das bei der Integration (7) irieist auftreteiide Iiitrgral

bei beliebigein y l , so erhalt mail nach kurzer Zwischenrechnung die entsprechend deli Eingriffsfuiiktioneii Q (7) iiidizierten Bildfuiiktioneii fiir die verschiedeiieii Ver- fahren

B-4 (x) = 1 + (B- 1) .17 (uo; w) (19)

B , Z (x) = iA + (B- 1) *IT(u0; V ) = B-4 (x)- 1 + i A (20)

B Z (2) = i A + (B-I)*IT(u,;w) + ( i A - 1) * (B-1) * n ( U i ; w) (21) Bsu (x) = (B- 1) *IT(uo; U) == BA (2)- 1 (22) Bo (x)= ( B - l ) . { 1 7 ( u o ; V ) - ~ ( ( 2 1 . i ; V ) ) (23)

6) Die Bezeichnungen IZ und rwurden wegen der mnemotechllisch giinstigen Form ge- wghlt. So lmnn aus den Gln. (19) bis (26) bereits ohne weitere Rechnung quditativ daa Anssehen des Bil-les hei den verschieclenen Verfaliren abgelesen xerden.

44 Annakn der Physik. 6. Folge. Band 7. 1950

Die iiberall regulare Fuiiktion di (x) ist fur die iiuinerische Rechnung angenehiner als der ubliche Iiitegralcosinus, der wegeii seiner logarithiiiischeii Singularitat am Nullpunkt gelegentlich Differenzbildung groller und iiur wenig sich voneinander ilnterscheidender Zahlen niitig macht und daher bei maSiger Eiidgenauigkeit unbequem hohe Zwischenrechiiungsgenauigkeit verlangt. Abb. 8 gibt diese Funk- tion 8i (x); Abb. 9 zeigt die wichtigen Funktionen I7 und l' fur eiuige besonders charakteristische Werte voii u. Die Bedeutung dieser Funktionen fur das Aus- seheii der Bilder unseres Objekts werden wir fur die verschiedeiieii Abbildungs- 1-erfahreu getrennt behnndelii.

a t

AMJ. 8. Hilfsfunktion c*i (z) zur Bereclinung der Bildaniplituden

o) Rellfeldbild eines Streifens bei a4perti~rbegrenzi~ng Das Hellfeldbild eines dunklen Streifens mit B 0 ist bei Aperturbegrenzung

iiach G1. (19) durch

B A ( Z ) = 1--17(u,;v) (31)

gegeben. Eiii anschauliches Bild hiervon erhalt man, wenn iiiaii die Abb. 9a auf den Kopf stellt. Wahrend bei yo = 00 der Streifeii scharf abgebildet wird, bedingt die Aperturbegrenzung eine Unscharfe der Konturen und ejne Art ,,Beugungs- fraasen"; bei der sehr starken Aperturbeschneiduiig n 6 yo = u, = 0,05 ist das Objekt nur noch durch eine leichte Abnahme der Amplitude auf eineni stark ver- breiterteii Bereich angedeutet.

Bei den1 uns vorwiegend in dieser Arbeit interessierenden Fall grol3er Apertur ist ganz allgemein fur alle Objekte B (x) = 0 (x) und daher ein Phasenobjekt un- sichtbar. Wean in den Hellfeldabbildungen 7 a, 6 a die Ksnten der Phaseiistreifeu deiinoch duiikel erscheinen, so liegt das daran, daB die Kanten eiii wenig schrag nusgebildet waren und das Licht totalreflektierten (entgegen uiiserer Theorie).

H. Wdter: Untemhungen mr Ab?Aiung nicMabeozbierender Objekte 45

Die zur Frage nach dem Auflosungsvermogen gehorigen Betrachtungen werden in einer anderen Arbeit behandelt werden. Dort wird auch die Verallgemeinerung auf beliebig groBe Beleuchtungsapertur geschehen, die hier wegen der nochmaligen Integration nur eine Komplizierung ergeben wiirde. Fur die hier zu untersuchenden prinzipiellen Fragen ware das ohne groBen EinfluO.

00

I

0

Ahb. 9. Hilfsfunktionen 11 (u, ( 9 ) und r ( u , v) zur Beredmung der Bildamplituden

d) Strenges Phasenkontrastverlshren nseh 2 ern i k e

Die GI. (20) fiir das strenge Phasenkontrastbild zeigt in ihrem Aufbau noch deutlich den Eingriff des Verfahrens. Statt des direkten Lichtes der Stiirke 1 tritt hier das um 90' demgegenuber phasengedrehte und geschwachte Licht iA. Bei groBer Apertur ~t b yo >> 1 ist

b ( B - I ) + i A fur I X ~ < ~ iA sonst.

46 Annalen der Physik. 6.Folge. Band?'. 1950

1st daR Objekt eiu reines Phasenobjekt mit R = e is , so wird

Fur A = - 1 bzw. A = j- 1 liegt das klassiselie positive bzw. negative Phasrti- kontrast,verfahren iiach Zcrn i k e vor. 1111 ersteii Falle erscheint, eiti Streifen niit b > 0 dunkler a19 die Unigcbung. Aus der Helligkeitsdifferenz kaiin in beidcn Verfahren unmittelbar auf den Phasenwinkel geschlossen werden ; diese sind in erster Niiherurig einaitder proportional. Bei bekannteili Brechungsiridex kann man so z. 13. die Dicke sehr diinrier Folien messen, die keine Interfcrenzfarben tnehr zeigen. Doch ha t das etwa bei b = 0,05, d. 11. z. B. fur %al)bnlackschichteii (in Luft) bei einer Dicke von 0,015;1, also rund 8 inp, seine Grrnze, da die Photo- nictrie kleiner Helligkeitsunterschiede iiicht, mit hoher rdativcr Grniiuigkeit g ( ~ - lingt.

Diinnste Objekte lassen sich nach GI. (33) kontrastreicher crkenneii, wetin r i i i t i i

das direkte Licht whwaeht : zweckmaflig wahlt inan nach GI. (33)

A = - sin 6 ; (34)

danu erscheiiit der Streifeti extreni dunkel auf hellcni Grunde. Die Ht4ntensitiit (cos 6- 1 ) 2 hangt in rierter Potenz von b all und wird fiir sehr diinnt. Sr~hichteii bald unirierklich.

Die voii verschiedeiien Automi") vorgcsch1agenc.n Verfahreii zur kontinuier- lichen Regelung der Schwachung A inncrhalb dcr Grenzen -1 und +1 getwn auflcr kontrastreicherer Bcobaclitung auch eiric verbesserte Rliiglichkeit, deli Phaseti- winkel (und bei bekauntein Brechungsindex auch die Dicke) schr tliiiiiicr Folieii zu messen. Man hat die Scliwachung A nur so einzustellen, dafl dns ins Gesichts- feld gelegte Stiickchen der Folic schware auf helleni Grunde rrscheint ; rlann ist der Pharrcnwinkel 6 = -arcsin A. Der Polarisator der Schwachungsrcgelutig kanri geradczu in Phasenwinkeln odcr in mp Foliendicke geeicht werdcn. 111 nianchcii Fallen ist, es zweckniiifiiger, i n die Foiic ein Loch zu schneideti litid dieses i d s

Phasenobjekt gegenubcr dcr Uingebung zii beohacliten. Abcr auch diese blethode hat bei diinnsten Objekt,en cine Schivic.ri,nkcit,. Dort

ist A sehr klein, und die Polarisatorstellriiig wird luaerst kritisch : die Ablew- genauigkeit niiiBte in der Niihe der Stellung A = 0 rxtrcni gesteigert worden. Zu- dem geben die Polarisatorfolien oft Intensitatsrestc, die hier die MeIJgenauigkeit, stark beeinflussen, zumal sich die Helligkeit der Unigebung such init A iindert. Das Rlininium der Streifetiltelligkeit wiirde iiur d a m ohnc wescntliche systerttit- tische Fehler eingestellt, wenn es praktisch auf Null ginge.

Ein besscres und einfaches Verfa.hren zur Dickenniessung xi1 tlunnstrti Folic.ii, tlas Verfasscr benutzte, wird unter f beschricben wcrden.

Die Phasenkontrastaufiiahiiieii der Abb. 7c und 6c kurden niit Lichtschwiichuiig hergestellt (siehe technischen Anhang) uud zeigen grob betrachtet das von dcr Theorie her zu erwartcnde Verhalten. J e breiter die 0bjcktst.reifcn jcdoch sirid, desto unifaugreicher wird die Aufhellung in der Mitte, und statt eines gleichmaBip hellen Gesiehtsfeldes umgibt ein heller Hof das Objekt. Das hat seiiicn Grund in der Schwierigkeit, das Phaseiikoutrastverfahren vollig st,reng durchzufuhren, wic das bei detn cntsprechenden Phanomen an Gittern schon besproclicn wurde. Die Ahweichitngen sollen hirr quantitativ aus der Theorie berechnet nwden.

I€. 1Vdter: Untercruchungen zur AbbiMung niclclabewbierender O b j e h 47

e) PhasenkontrastverDahrcn mit breiterem Z e r n i k e - Phasenstreifcn Eine ausreichende Bildhelligkeit verlangt wcgcii der begrenzten Flachen-

helligkeit aller Lichtquellen ein nicht zu schmalcs Lichtquellendiaphragma ; da der Zernike-Streifen nun mindestens die Breitc des Diaphragmenbildes in der hinteren Brennebene des Objektivs haben muS, wird zugleich niit dem direkten Licht auch ein weseiitlicher Teil des Spektrums der Ob- jekte (besonders der grode - ren) phasengedreht. Wir wollen die Wirkung aus GI. (21) quantitativ fur den Fall hohen Auflosungs- vermogens fn byo >> 1) und fur einen Phasenstreifen mit B = e i ' O p l berechnen. Dabei wird die optimale Lichtschwachung des posi- tiven Phasenkontrastes d = -0,l angewendet. Fur verschieden breite Ob- jekte wird die Intensitiits- verteilung im Phasen- kontrastbilde durch die Kurven der Abb. 10 dar- gestellt '). DieKOordinate 2 im Bilde ist dabei in bezug

1 2 . anf die GroBe - = : - ;ti sin ai

angegeben. yi bedeutete [siehe GI. (lo)] bis auf die Konstante A die Apertur des Ze rn ike - Streifens. 1st z die volle Hreite des Ze rn ike - Streifens in em und f die Hrennweite des Objektivs, so ist a , L;j und - w

";cf

1 Y i

I

Aus deli Kurven liest niltn ab, dal3 der Objekt- streifen noch einiaermaBen

I I I U I

1 I w

I I I I I

I I I

- X

Kooru'inate /mB//d Abb. 10. Theoretiecher Intensitiitsverlauf im Phasen- kontrastbilde x crschieden hreitcr Zaponlackstreifen kei gleicher Apparatur. Nur cchrnalste Objekte werden un- verfiilacht wicdergegeben. Vergleicb experimentelle Er-

gebnisse Abb. 7 c

unverfalscht schwarz auf gleichmlBig hclleni Grunde wiedergegeben wird, solange seine Breite b < 0,l ist; brciterc Objekte zeigen auch nach der Theorie die " A f

7) Verfasser dankt Herr. W. Klein und H e m J. Greve f i i r ihre wertvolle Hilfe bci numerischen Rechnungen und bci dcr Anfertigung der Zeichnungen.

48 A n m b der Phyeik. 6. Folge. Band 7. 1950

am Ende des vorhergehenden Abschnitts aus den Aufnahmen 7c abgelesenen Er- scheinungen. Eine storende Innenstruktur wird merklich, wenn b > 0,5 * %' ist.

Dennoch ist das Phasenkontrastverfahrcn auch noch fur breitere Objektc brauchbar. Die Zaponlackstreifen scheinen auch in der Aufnahme 7 c rechts noch deutlich dunkel auf hellem Grunde zu liegen. Hier koinmt ein physiologisches Moment dem Phasenkontrastverfahren. zu Hilfe ; tatsiichlich sind die ,,dunklen" Streifen in ihrer Mitte nicht dunkler als die ,,hellen" Zwischenraume. Man er- kennt das sehr einfach, wenn man das Blatt so knifft, daB die zu vergleichenden Mitten eines Streifens und eines Zwischenraumes unmittelbar nebeneinander zu liegen kommen. Auf wirkliche Strukturen im Objekt entsprechend den au Bak- terien, Erythrocyten, Chromosomen u. a. beobachteteii Schattierungen im Phasen- kontrastbild darf aber nicht ohne weiteres geschlossen werden.

t) Strenges Dunkelfeldverfahren

Bei der so bezeichneten Methode wird das direkte Bild des sehr engeu Licht- quellenspaltes in der hinteren Brennebene abgedeckt. Der abdeckendc Draht oder dgl. (siehe den technischen Anhang!) muB dabei so dunn sein, daB von den Spektren des Objekts ein nur unwesentlicher Anteil ausgeloscht wird; das ist um SO

leichter, je kleiner das Objekt ist. Unter diesen Voraussetzungeil ist das Uild cines Streifens nach GI. (22) un-

mittelbar durch die Kurven der Abb. 9 a bei verschicdeneu Aperturbegrenzungen gegeben. In dem von uns vorwiegend betrachteten Falle groBen Auflosmgsver- mogens b y o n > 1 gibt das strenge Dunkelfeld also stets ein getreues Abbild des Objekts, wenn dicses sich von der Umgebung nur irgendwie (gleichgiiltig ob durch Phasen- oder Amplitudenauderung) unterscheidet (d. h. B $: 1). Das strenge Dunkelfeldverfahren erscheint hiernach als geradezu ideal, ist es praktisch jedoch nur unter den Voraussetzungen unserer Rechnung, insbesondere also nur dann, wenn der Objektstreifen allein in einem sehr vie1 breiteren Objektfelde vorliegt. Unsere Betrachtungen an Gittern zeigten bereits (S. 34 u. f f . und Aufnahmen 6b), daB bei gleich .breiten Streifen und Zwischenriiumen kein wesenthher AufschluB iiber das Objekt zu erhalten ist. Entsprechend stehen den guten Aufnahmen 7 b links die wenig befriedigenden 7 b rechts gegenuber, in denen Objektstreifen und Zwischenraunie nicht deutlich unterschieden werden konnen, wahrend z. B. Zerni kcs Phasenkontrastverfahren in allen diesen Fallen dic Objekte deutlich dunkel auf hellem Grunde zeigt (Abb. 7c).

Die Abb. 7 b zeigen aber bereits auch die auDerordeiitliche Empfindlichkeit des Verfahrens gegenuber geringfugigen Dickenunterschieden der die Objekte tragenden Glasplatte. Orientierende Versuche erwiesen in Verfolg dieser Er- scheinung die wesentlich bessere Eignung des btrengen Dunkelfeldverfahrens zur Dickenmessung s e h dunner Folien im Vergleich zu den Phasenkontrastverfahren. Streifen von Zaponlackfolien (B = dd) mit einer Dicke von nur wenigen mp waren deutlich als gleichmiiaig helle Streifen auf dunklem Grunde erkennbar. Die Intensitat ist nach G1. (22) im Bilde des Streifens

I Bso (2) ( 2 = [ B- 1 18 = (cos S- I)2 + sin2 6. (36)

Freilich geht sie bei kleinem Phasenwinkel 6 hier quadratisch mit 6, wiihrend bei dem strengen Zerni ko -Verfahren nach G1. (33) der Intensitiitsunterschied

H. W&: UnlersueJ~ungen zur A W u n g nielrtabmbierender Objekte 49

erscheinen sollten. Diese Vorstellung 1 06- hat in der meist nicht korrekten 349- Durchfiihrung des Verfahrens ihre $02 Ursache. Wird namlich statt eines .$ 0 iiurjerst schmalen Mittelteiles der -02 Spektren ein breiteres Stuck -04- -yt < y < + yi entfernt, so erhalt -46- man entsprechend G1. (23) ein Bild,

gegeniiber der Umgebung proportional 6 selbst war. Dennoch ist fiir die Dicken- messung dem Dunkelfeldverfahren der Vorzug zu geben, da man durch photo- graphische Photometrie leicht Intensitatsverhaltnisse 104: 1, aber nicht Intensi- ttitadifferenzen wie 0,999 gegeniiber 1 messen kann. Dem Phasenkontrastverfahren mit kontinuierlich veranderlicher Amplitudenschwachung ist das Dunkelfeld- verfahren bei Dickenmessungen schon deshalb iiberlegen, weil es frei von den oben genannten systematischen Fehlern ist und die erforderliche Prazision vie1 leichter erreicht werden kann. I m technischen Anhang finden sich nahere Angaben.

-

I -

- -- A A - -

- -

- - U

entsteht. Fiir zwei verschiedene ' Werte von yo und yi wurde diese 3 Rechnung durcbgefuhrt (Abb. 11). 3 44

h) Einseitiges Dunkelfcldverfahren Die iiblichen Dunkelfeldverfahren entfenen auder den1 direkten Licht auch

eine ganze Seite des zum Objekt gehorigen Spektrums. Fiir einen solchen Eingriff (siehe die Eingriffsfunktion& nach GI. (13)!) erhalt man ein Bild nach G1. (24). Zu dem von Abb. 11 her bekannten Anteil der Intensitat addiert sich jetzt noch ein von dem Imaginiirteil herriihrender Anteil, der als Differenz zweier Kurven voni F-Typ an jeder Kante des Objektstreifens ein hohev Maximum hat. Dieses fiillt das Minimum so vollig aus, da8 null die bekannten hellen Kanten der Objekte entstehen.

Experimentell gewinnt man einen ahnlichen Anblick wie in den Aufnahnien i'd, 6d. Doch sind diese mit dem im nachsten Abschnitt zu besprecbenden Gegenfeld- verfahren bergestellt worden und unterscheiden sich von den mit dem einseitigen Dunkelfeldverfahren gewonnenen durch groBere Scharfe der Kantenmaxima.

Ann. Physlk. 6. Folge. Bd. 7 4

- b

60 Banalen der Physik. 6. F O ~ . &md 7. 1950

I) Gegenleldverfahren Kerbei wird in die bintere Brennebene des Objektivs eine Phasenplatte gelegt,

die das Licht der einen Spektrenhalfte (7 > 0) urn 180' dreht gegeniiber dem der anderen Haute. Die Integration nach

"i I I I I I I I -; !r 0 ? 2

v- Abb. 12. 1ntensit;itsvelacf im Bilde eines Zapnlackrtreifens, a mit Gegenleld, 1, mit To ep 1 e r schem Schlierenvcrfuhi en (theo-

retisch). \ gl. Abb. 'I d Lnd f

- G1. (7) mit der entsprechenden Ein- griffsfunktion Qo (y) (siehe G1. (la)!) fuhrte. zu der Bildfunktion nach G1. (15); nach ihr wird offenbar das Bild durch einer-Funktion dargestcllt, die fi ir zwci verschiedene Gesamt- aperturen (yo = 00 und yo = 272) in Abb. 9 b mitgeteilt wurde. Da durch Quadrieren die Maxima sehr pie1 aus- gesprochener in Erscheinung treten, hat diehtensitat (Abb. 12a) an den Objekt- kanten schr scharfe (,,logarithmische") Maxima. Man bcachte, daf3 furyo -+ 03, also sehr hohes Auflosungsvermogen, zwar die Intensitat an den Kanten un- begrenzt steigt, aber auch in ihrer Um- gebung von Null verschieden bleibt-

Das Integral

bleibt iihrigens cndlich auch dann, wenn es iiber ein die Objektkante (v = 1' oder v = - 1) enthaltendes Interval1 erstreckt wird.

Mit diesem Verfahren wurden die Aufnahmen 7d, 6d hergestellt. Die Be- deutung des Gegenfeldverfahrens, das Verfasser als Schlierenverfahren einfiihrte, tritt erst bei komplizierteren Objckten hervor.

j) T o e p 1 e r 8 Schlierenverfahren Hierzu justiert man bekanntlich in der hinteren Brennebene des Objektivs

cine Blendenkante (klsssisch eine ,,Messerschncide") so, daR die Hiilfte des di- rekkn Lichtes und alle Spektren der einen Seite (z. B. fury < 0) verdeckt wcrdcn. 80 wurden die Aufnahmen 7f, 6f hergestellt. Denkt man sich die Objekte von links her beleuchtet, so scheinen sie durch ,,Korper-" und ,,Schlagschatten" pla- stisch vor der Unterlage zu liegen.

Theoretisch hat man mit der Eingriffsfunktion QT (siehe GI. (15)) nach G1. (7) zu integrieren und erhalt die GI. (26) fur das Bild des Objektstreifens. Wir interes- sieren uns nur fur hohes Auflosungsvermogen (yo -+ 00) und ein diinnes Phasen- objekt mit B = Pd; 6 = 0, l ; dann ist

Abb. 12b zeigt das Ergcbnis der Rechnung. An der linken Kante des Ob- jektstreifens liegt ein ,,logarithmiEches" Maximum (das Rich bei endlicher Apertur

natiirlich in ein endliches umwandelt); genau in der Mitte des Objektstreifens

gleicht die Intensitat der in grol3er Entfernung. Niihern wir uns der rechten Kante des Objekts, so fallt die Intensitat, erreicht den Wert Null bei

-z. loge v = 1- 2.10 6 = 1 -2.10-w

und steigt dann anl3erst steil zu einem logarithmischen Maximum auf, fallt von dort erneut auf Null (bei v = 1 + 2 - 10-ls*e und steigt dann schliel3lich wieder auf den Durchschnittawert ).

Die beiden Nullstellen und das Maximum an der rechten Kante lassen sich praktisch nicht nachweisen ; dam ware ein unerreichbar hohes Auflosungsvermogen und ein Lichtqnellenspalt von technisch nicht hentellbarer Feinheit notig. Schiebt man die Kurve ein wenig (z. B. um f 10-10 Einheiten beziiglich v) hin und her und nimmt aus allen so entstehenden Kurven das Mittel, so verschwinden das rechte logarithmische Maximum nnd die Nullstellen; an ihre Stelle tritt ein scharfes; aber nicht auf Null heruntergehendes Minimum.

Dem entspricht der experimentelle Befund Abb. 6f und 7f. Das Verfahren eignet sich zur Darstellung von Phasenobjekten, ist jedoch dem Phasenkontrast- verfahren beziiglich Objekttreue unterlegen.

Bei einem Amplitudenobjekt mit z. B. B = 0 gibt GI. (26) 2 4 B* (z) = 1 - 17 (00, v) - i * T (03; v). (38)

Das Bild zeigt dann einen in der Mitte dunklen und zum Rande heller werdenden Streifen auf bellem Grunde. Am Rande liegt je. ein logarithisches Maximum, von dern aus die Intensitat nach innen zu auf Null und nach a d e n auf 4 fallt. Das Bild ist streng symmetrisch im Gegensrttz zu deln Bilde eines Phasenobjektes. Erwahnt sei nur, da13 ein heller Objektstreifen auf dunklem Grunde im Toepler- schen Schlierenbild entsprechend hell auf dunklem Grunde erscheint ; wieder zeigen die Riinder logarithmiscbe Maxima.

h d e r t man die Breite des Objekts, so bleibt die relative Intensitiitsverteilung in dem Toeplerschen Schlierenbilde unverindert, sofern das Auflosungsvermogen grol3 genug ist ; denn in G1. (26) tritt f i i r yo 3 00 die Breite nur in der Kombination - auf. Entaprechendes gilt fiir das Gegenfeld, das strenge Ze r n i ke -Verfahren b nnd das strenge Dunkelfeldverfahren. Wahrend aber bei dem Zernike -Verfahren und bei den Dunkelfeldverfahren die strenge Form nur einen kaum zur Anwendung lrommenden Grenzfall bildet, stellt die strenge Durchfiihrung des Toeplerschen und des Gegenfeldverfahrena keine schwer realisierbare technische Forderung.

X

4. Zusammedassung einiger Ergebnisse a) Unter den zur verdeutlichten Abbildung von Phasenobjekten geeigneten

Verfahren (Dunkelfeld-, Phasenkontrast- und Schlierenverfahren) gibt ein streng durchgefuhrtes Phasenkontrastverfahren nach Zerni ke bei hinreichend diinnen Objekten das objekttreueste Bild. Amplitudenobjekte werden unkenntlich.

b) Das strenge Dunkelfeldverfahren (das nur das direkte Bild des schmalen Licbtquellendiaphragmas ausloscht) ist gleichwertig, wenn nur vereinzelte Ob- jekte in grol3en Abstanden voneinander in einem relativ groDen Objektfelde liegen. Zur Dickenmessung an diinn,aten Folien durchsichtigen Materials und zum Nachweis allerfeinster Objekte ist es den anderen Verfabren iiberlegen ; durchsichtige und absorbierende Objekte werden gleich gut dargestellt.

4*

62 Annalen &r Phy~k. 6. F'dge. Band 7. 1960

c) Der Wunsch nach erhohter Lichtstarke im Bilde zwingt zu breiterem Licht- quellendiaphragma und Abgehen von den strengen Forderungen des Dunkel- feld- und Phasenkontrastverfahrens. Das Dunkelfeldbild verliert dann die Ob- jekttreue vollig und gibt nur noch helle Rander der Objekte; doch werden die Objektkanten bei symmetrisch liegender Dunkelfeldblende durch scharfe Minima gekennzeichnet, die GroBenmessungen erleichtern.

Das Phasenkontrastverfahren verliert die Objekttreue in geringerem MaBe ; zwar erhalten die Objekte helle Hofe und eine Aufhellung des Innern, denen in1 Objekt nichts Wirkliches entspricht, aber eine physiologische Kontrastbildung wirkt diesen Fehlern entgegen.

d) Toeple rs Schlierenverfahren gibt anschauliche ,,Schattenbilder", steht aber beziiglich Objekttreue den anderen Verfahren nach.

Anhang : Tcchnischo Da!en 1. Die a l s Objekte b e n u t z t e n Zaponlackschich ten wurden durch Auf-

bringen stark mit Amylacetat verdunnten Zaponlacks auf Glasplatten nach fol- gender Vorschrift hergestellt.

8) Verdunnen der Losung. 2 Tage unter gelegentlichem Schutteln stehen lassen ! b) Ein Becherglas, in dem die ,zu begieaende Glasplatte aufrecht stehen kann,

wird etwa 1 cm hoch mit der Losung beschickt und zugedeckt. c) Die Glasplatte wird mit der verdunnten Losung aus der Vorratsflasche

(nicht aus dem Becherglase) begossen und sofort aufrecht in das Becherglas ge- stellt ; dieses ist schnell wieder zu verschlieben.

d) Nach 10 Minuten wird die Platte aus dem Becherglase genommen und auf Filtrierpapier schrag an eine Wand gelehnt ; die Schichtseite liege zur Wand.

Die so hergestellten Schichten haben gleichmiiBige Dicke uber groBe Fliichen. Die Dicke ist in weiten Grenzen der Konzentration proportioml. Die Propor- tionalitatskonstante kann aus einer interferometrischen Messung an einer dicken Schicht entnommen werden; dies geschah nach zwei Methoden: 1. mittels Hai- dingerringcn bei Hg-Licht ; ein Teil der Schicht wurde zum Vergleich zuvor ent- fernt. 2. Statt auf Glas wurde unter Einhaltung aller anderen Verfahrensregeln die Schicht auf eine durchlassig versilbertc Platte gegossen ; die Interferenzfarbcn lassen eine Schatzung der Dicke zu.

Die Dicke der in Abb. 6 und 7 gezeigten Schichten betrug 55 mp f 10%. 2. Die Aufnahmen 6 und 7 wurden rnit einem Modellmikroskop hcrgestellt,

wie Verfasser es fur die Vorlesungsdemonstrationen benutzt hatte. Als Kondensor diente eine ZeiB-Protwlinse VII rnit 59 cm Brennweite, als Objektiv ein Helio- stigmat 1 : 2,5 rnit 33,5 cm Brennweite von Voigt lander . Die Abbildungen zeigcn die Objekte in l0facher VergroBerung.

3. Zur Dickenmessung mit dem strengen Dunkelfeldverfahren diente unter anderem dasselbe Modellmikroskop mit einem 0,05 mm dicken Draht als Dunkel- feldblende und einem entsprechend schmalen Spalt als Lichtqucllendiaphragma.

Bei weiteren Versuchen wurde statt der optisch nicht befriedigenden Konden- soren verfiigbarer Mikroskope ein Meyer-Trioplan 1 :2,8 (f = 5 cm) als Kondensor benutzt; dabei war die groBere Linse dem Objekt zugewandt, um den gunstigsten Korrektionszustand fur die Abbildung des Lichtquellendiaphragmas auszunutzen. Verwendet man ein zweites Trioplan als Mikroskop-Objektiv, so ist ebenfalls die grolere Linse dem Objekt zuzukehren. Die dadurch entstehenden Abbildungs-

H . Wolkr: DnLersuehungen zur AbbiMung nichlabsorbierender Objekte 53

fehler bei der Abbildung des Objekts sind weniger kritisch a19 die bei der Abbil- dung des Lichtquellendipbragmas auf die Dunkelfeldblende. Die Hauptschwierig- keit bei allen diesen Verfahren liegt darin, daa die Objektive nicht fiir einen, son- dern stets fiir zwei extrem weit voneinander entfernte Punkte des Bildraumes korrigiert sein muaten.

4. Zernike-Pla t tchen wurden nach folgenden Verfahren hergestellt. a) In Zaponlackschichten auf Glas wurden mit der Teilmaschine ,,Zernike-

Streifen" geschnitten. b) Von einer Zaponlackschicht blieb nur ein schmaler Streifen stehen; der

Rest wurde mit der Teilniaschine nach und nach abgehoben. c) Sehr d k n e Gelatinelosung wurde mit chinesischer Tusche oder Skriptol

versetzt. Mit einer in diese Losung getauchten Stahlfeder wurde am Lineal ein Strich auf cine Glasplatte gezogen. Auf Eignung wurden die Streifen im Phasen- kontrastmikroskop selbst gepriift. Dieses primitiv erscheinende Verfahren fiihrt dennoch in ganz kurzer Zeit zu brauchbaren Ze rn i ke-Streifen. Zu Demonstrations- versuchen ist diese Methode am meisten zu empfehlen. Die Herstellung eines solchen Zerni ke-Plattchens im Praktikum durch die Studenten selbst ist sicher ein- pragsamer a19 die Verwendung kostbarer kauflicher Gerate.

d) Eine dunne Gelatinelosung wurde auf cine Glasplatte gegossen; bis auf einen schmalen Streifen wurde nach Erstarren des Gels alles mit der Teilmaschine abgehoben. Hierbei muD achnell gearbeitet werden, da die diinne Gelatineschicht gelegentlich schnell trocknet und dann sehr fest am Glase haftet.

e) Bei Benutzung einer Drehbank oder eines kleinen Drehtischchens, wie Verfasser es fruber zum Anlegen cler Lackringe um mikroskopische Praparate be- nutzte, kann man statt hearer Streifen auch kreisformige herstellen. Gut ist auch die photogrnphische Hartung von Chromatgelatine durch das Bild des Licht- quellendiaphragmas selbst. Naheres hierzu wird auf Anfrage gern mitgeteilt.

CI

Verfasser dankt dem Direktor des Instituts, Herrn Professor Dr. Lochte- Hol tgreven , fiir seine immer bewiihrte Hilfsbereitschaft.

Kie 1, Tnstitut fur Experimentalphysik der Universitab.

(Bei der Redaktion eingegangen am 5. November 1949.)