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BIOspektrum | 06.13 | 19. Jahrgang

ANJA GRIEBEL1, CHRISTIAN OBERMAIER1, REINER WESTERMEIER1,

MARTIN MOCHE2, KNUT BÜTTNER2

1SERVA ELECTROPHORESIS GMBH, HEIDELBERG2INSTITUT FÜR MIKROBIOLOGIE, UNIVERSITÄT GREIFSWALD

Fluorescent pre-labelling of proteins prior to electrophoretic separationsis not only advantageous for multiplex detection strategies, like DIGE (difference gel electrophoresis), but also as a general protein visualizationprocedure. We introduce a fluorescent amino-reactive dye which is com-patible with all standard additives used for protein sample preparationincluding reductants. Fluorescent pre-labelling is less time-consumingand as sensitive as silver staining with additionally excellent quantifica-tion properties.

DOI: 10.1007/s12268-013-0375-0© Springer-Verlag 2013

Proteindetektion in Elektrophorese-Gelenó Üblicherweise erfolgt die Proteindetektionnach Gelelektrophoresen mit mehrschritti-gen Gelfärbemethoden, meist mit Coomas-sie®-Brillant-Blau, Silberfärbung oder Fluo-reszenzfärbungen [1]. Die Multiplexmetho-de DIGE (difference gel electrophoresis) ist eineAusnahme. Hier werden Proteinextrakte ausunterschiedlichen Proteom-Zuständen mit biszu vier verschiedenen Fluoreszenzfarben mar-kiert und als Gemisch mittels 2D-Elektro-phorese aufgetrennt [2]. Die Proteinmusterwerden gleich im Anschluss mit Fluores -zenzscannern oder -kameras bei unter-schiedlichen Anregungswellenlängen mit pas-senden Emissionsfiltern ausgelesen. DieHauptvorteile dieser Methode bestehen darin,dass die Quantifizierbarkeit und die statisti-schen Aussagen der komplexen Trennmusterdeutlich besser sind als nach Einzeltrennun-gen [3]. Die Vormarkierung von Proteinen hatnoch zusätzliche Vorteile: Man spart sich dieFärbebäder, Arbeit und Zeit, die Gele werdendirekt eingescannt, und die Proteine könnendanach auf eine Blot-Membran transferiertwerden. Trotzdem gibt es mehrere Gründe,warum das Markieren von Proteinen nochnicht die gängigen Färbemethoden abgelösthat: Die Ergebnisse sind nicht direkt mit demAuge sichtbar, man benötigt einen Fluores -zenz-Imager, die Farbstoffe sind teuer, unddie Markierung ist mit einigen Additiven imProbenpuffer nicht kompatibel. Außerdemmuss man bei der 2D-Elektrophorese beimMarkieren von Lysin mit den gebräuchlichen

Quantitative Proteinanalyse

Fluoreszenzmarkierung von Proteinenfür 1D- und 2D-PAGE

¯ Abb. 1: SDS-Elektrophoresen in SERVAGel™PRiME TG 4-20. Trennspuren 1–6: SERVA-Pro-teintestmischung 6: 5 μg, 1 μg, 0,2 μg, 40 ng,8 ng bzw. 1,6 ng. Trennspuren 7–12: E. coli-Lysat mit einem Proteingehalt von 25 μg, 5 μg,1 μg, 0,5 μg, 250 ng bzw. 125 ng. Die Proteinde-tektion erfolgt mittels: A, Färbung mit Coomas-sie-Brillant-Blau R 250; B, Silberfärbung; C, Fär-bung mit SERVA Purple; D, Vormarkierung mitSERVA Lightning Red, gescannt bei 532 nmAnregungswellenlänge mit 630 nm Bandpass -filter.

A B

C D

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Cyanfarbstoffen eine „Übermarkierung“ ver-meiden, weil dabei die Proteine so hydrophobwerden, dass sie teilweise ausfallen [2].

Unser Ziel war es, einen Farbstoff mit hoherNachweisempfindlichkeit zu finden, der die-se Einschränkungen nicht aufweist.

Fluoreszenzmarkierung für dieSDS-Elektrophorese (1D-PAGE)Bisher gibt es keinen sichtbaren Farbstoff,mit welchem man Proteine vor der Trennungeffektiv markieren kann. Es fand sich jedocheiner, der stark rot fluoreszierend wirkt, wennseine reaktive Seitengruppe an eine primäreProtein-Aminogruppe bindet [5]. Dieser Farb-stoff – SERVA Lightning Red – wird in Dime-thylformamid gelöst und in die SDS-Protein-Probe pipettiert. Die Bindungsreaktion funk-tioniert am effektivsten bei pH-Werten grö-ßer als 8, und wenn die Proteine komplettdenaturiert und reduziert sind. Sie dauert 30Minuten. Die Detektion erfolgt mit einem Flu-oreszenz-Kamerasystem oder einem -Scannermit einer Anregungswellenlänge von530 Nanometern und mit einem 610-Nano-meter-Bandpassfilter, wie z. B. bei den Pro-teinfarbstoffen SyproRuby® und Lava- oderSERVA Purple. Das Fluores zenz signal ist sehrstabil und bleibt auch in Essigsäure-fixiertenGelen erhalten. Im Folgenden ist ein Beispielfür die Eigenschaften des Farbstoffs gezeigt:

In vier SDS-Elektrophorese-Gelen wurdenVerdünnungsreihen einer Proteintestmi-schung und eines Escherichia coli-Extraktesaufgetrennt. Drei Gele wurden nach der Tren-nung angefärbt, mit Coomassie-Brillant-Blau,Silberfärbung und SERVA Purple. Auf dasvierte Gel wurden die gleichen Proben auf-getragen, nachdem sie mit dem Farbstoff

SERVA Lightning Red vormarkiert wurden.Abbildung 1 zeigt, dass die qualitativenElektrophoresemuster der Proteingemischein allen Gelen gleich sind. Beim Gel D mit denvormarkierten Proteinen wurde die höchsteNachweisempfindlichkeit erzielt. Beim Gel Bmit der Silberfärbung wird das Problem deslimitierten dynamischen Bereiches deutlich:Um zu verhindern, dass die Spur 7 noch stär-ker überladen wird, wurde die Färbung abge-stoppt, bevor in der Spur 4 eine Bande sicht-bar wurde. Fluoreszenzdetektionen habenneben der hohen Nachweisempfindlichkeitauch noch den Vorteil des weiten dynami-schen Bereiches [1], was für die Quantifizie-rung von Proteinen sehr wichtig ist.

In Abbildung 2 sind die Arbeitsabläufe undder jeweilige Zeitaufwand dieser vier Nach-weismethoden exemplarisch dargestellt. Aller-dings gibt es bei den drei Gelfärbemethodenjeweils mehrere unterschiedliche Variantenmit unterschiedlichen Schritten und Zeiten.Wenn die Proteine nach der Trennung nichtgeblottet werden sollen, empfiehlt es sich, dieGele mit zehnprozentiger Essigsäure zu fixie-ren, um ein Diffundieren der Banden zu ver-hindern.

Fluoreszenzmarkierung für diezweidimensionale ElektrophoreseBei der Fluoreszenzmarkierung für die zwei-dimensionale Elektrophorese (2D-PAGE) wirdder in Dimethylformamid gelöste Farbstoff indas mit hochmolarem Harnstoff, Thioharn-stoff und zwitterionischen Detergens dena-turierte Proteingemisch pipettiert. Bei derProbenvorbereitung für die 2D-PAGE von kom-plexen Proteingemischen sind Trägerampho-lyte und Reduktionsmittel wichtige Bestand-

teile des Lysepuffers zur Erhöhung der Pro-teinlöslichkeit und Auflösung von Proteinag-gregaten. Die Markierung mit SERVA Light-ning Red ist – im Gegensatz zu den bisherbekannten Farbstoffen – mit diesen Reagen-zien kompatibel. Der pH-Wert des denaturie-renden Lysepuffers muss bei der Markierunghöher als 8 sein, und das Markieren dauertauch hier 30 Minuten. Die Markierunggeschieht auf die Weise, dass sich das Lauf-verhalten der Proteine in beiden Trennrich-tungen nicht von unmarkierten Proteinenunterscheidet. Bei der isoelektrischen Fokus-sierung bleiben die pI-Werte der Proteineunverändert, weil das SERVA-Lightning-Red-Molekül eine positive Ladung enthält, welchedie blockierte Protein-Aminogruppe kom-pensiert. Des Weiteren ist das beim Markie-ren addierte Molekulargewicht so gering(288 Dalton), dass auch in der zweiten Dimen-sion, der SDS-PAGE, keine Laufverschiebungauftritt [4, 5].

Abbildung 3A zeigt das Ergebnis einer 2D-Elektrophorese von 20 Mikrogramm E. coli-Lysat in einem Mini-Vertikalgel. Auf der lin-ken Seite wurde das Trennmuster der vor-markierten Proteine mit einem Fluores -zenzscanner ausgelesen, das rechte Phero-gramm stammt von der Silberfärbung diesesGels. Man erkennt, dass die Silberfärbungmehrere überfärbte und gesättigte Spotserzeugt, während man mit der Fluoreszenz-markierung eine höhere Anzahl von Spotserhält und die Signalintensitäten den unter-schiedlichen Proteinmengen entsprechen.Dies wird durch die Auswertung der Trenn-muster mit der Delta2D-Software (Decodon,Greifswald) bestätigt: Im Fluoreszenzscanwurden 521 Spots detektiert, mit der Silber-

˚ Abb. 2: Arbeitsabläufe verschiedener Proteinnachweismethoden. CBB: Coomassie-Brillant-Blau; Ag-F: Silberfärbung; SP: SERVA Purple; SLR: SERVALightning Red.

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färbung nur 501. Die Falschfarbendarstellungder überlagerten Spotmuster (Abb. 3B) zeigtan, dass die meisten zusätzlichen Spots imniedermolekularen Bereich zu finden sind.Die Proteine sind zwar noch im Gel vorhan-den, werden aber mit Silber nicht detektiert.Außerdem sind typischerweise manche höherabundanten Proteinspots bei der Silberfär-bung ineinander gelaufen und können nichtmehr als Einzelspots erkannt werden.

FazitDie Vormarkierung von Proteinen vereinfachtund beschleunigt die PAGE-Methodik erheb-lich, dadurch wird auch die Reproduzierbar-keit der Ergebnisse verbessert. Es gibt keineHintergrundfärbungen und Sprenkel, diesonst bei Fluoreszenzfärbungen häufig auf-treten. Außerdem gibt es keine negativenEffekte durch Übermarkierung. Die Nach-

weisempfindlichkeit ist sehr hoch, die Quan-tifizierungseigenschaften sind ausgezeich-net. Und die Kosten für den Farbstoff sindmoderat, sodass sie mit denjenigen der Sil-berfärbung vergleichbar sind. Nur eine Her-ausforderung bleibt: Man benötigt ein Fluo-reszenz-Imagingsystem. ó

Literatur[1] Miller I, Crawford J, Gianazza E (2006) Protein stains forproteomic applications: which, when, why? Proteomics6:5385–5408[2] Ünlü M, Morgan ME, Minden JS (1997) Difference gelelectrophoresis: a single gel method for detecting changes inprotein extracts. Electrophoresis 18:2071–2077[3] Timms JF, Cramer R (2008) Difference gel electrophore-sis. Proteomics 8:4886–4897[4] Griebel A, Obermaier C, Westermeier R et al. (2013)Simplification and improvement of protein detection in two-dimensional electrophoresis gels with SERVA HPE™Lightning Red. Arch Physiol Biochem 119:94–99[5] Meier RJ, Steiner M-S, Duerkop A et al. (2008) SDS-PAGEof proteins using a chameleon-type of fluorescent prestain.Anal Chem 80:6274–6279

Reiner Westermeier, Anja Griebel und Christian Obermaier (v. l. n. r.)

Martin Moche (links) und Knut Büttner

Korrespondenzadresse:Dr. Reiner WestermeierSERVA Electrophoresis GmbHCarl-Benz-Straße 7D-69115 HeidelbergTel.: 06221-13840-0Fax: 06221-13840-54reiner.westermeier@serva.dewww.serva.de

˚ Abb. 3: Zweidimensionale Elektrophorese mit dem SERVA-Lightning-Red-Farbstoff. A, 2D-Elektrophorese von 20 μg E. coli-Lysat in einem Mini-Verti-kalgel, 8 × 8 cm SERVAGel™ TG PRiME, 14 %, Vergleich eines Fluoreszenzscans der mit SERVA Lightning Red vormarkierten Proteine (links) und der Sil-berfärbung des identischen Gels (rechts). B, Falschfarbendarstellung der zwei überlagerten Elektropherogramme, erzeugt mit dem Delta2D-Auswer -tungsprogramm. Im Fluoreszenzkanal sind 20 Spots mehr als bei der Silberfärbung zu finden. Mit freundlicher Genehmigung von Informa Healthcare,aus [4].

A B