GFE Blut Triple Target HIV-1 NAT für das Blutspenden-Screening

Silke De Zolt, Thorsten Bangsow, Ingo Schupp, Rolf Thermann, W. Kurt Roth

4. Sitzung der DGTI Sektion „Sicherheit von Blutprodukten“Travemünde, 28.03.2014

TRANSFUSION 2011

1. Fall

• im April 2007 wurde die Spende eines 44-jährigen männlichen Mehrfachspenders serologisch HIV-1 positiv getestet, die NAT im Roche Test CAP CTM v1 war negativ.

• die serologisch - und NAT negative Vorspende vom Januar 2007 wurde transfundiert und führte zu einer HIV-1 Infektion beim Empfänger.

• Untersuchungen zeigten, dass der CAP CTM v1 Test (Zielregion: gag) diese Variante stark unterquantifiziert.

2. Fall

• im Juli 2010 wurde bei einem 26-jährigen männlichen Mehrfachspender sowohl serologisch als auch mittels NAT (Virus Screening PCR Kit (VSPK v 1.1) der GFE Blut mbH) eine HIV-1 Infektion nachgewiesen.

• Die vorhergehende transfundierte Spende war ursprünglich im Screening im August 2009 und wiederholt aus der Rückstellprobe mit dem Roche CTS MPX Test (Zielregion: LTR) negativ auf HIV-1 getestet worden. Im Look Back wurde die Probe im VSPK v 1.1 PCR positiv getestet, serologisch war sie negativ.

HIV Mutationen in Deutschland

HIV Mutationen in Deutschland3. Fall

• Ein 42-jähriger männlicher Mehrfachspender wurde im Oktober 2010 das erste mal serologisch positiv auf HIV-1 getestet, in der Screening VSPK v1.1 PCR war er negativ.

• Im externen Testlabor am Pettenkofer-Institut war die Probe in der Abbott PCR positiv.

• Die Vorspende vom Juni 2010 war serologisch und in der GFE Blut PCR wie in der Abbott PCR negativ. Eine Übertragung auf den Empfänger konnte ausgeschlossen werden.

• Meldung vom Blutspendedienst am 03.11.2010.

• am 16.11.2010 lagen bei der GFE Blut erste Sequenzergebnisse vor, die das Testversagen erklärten.

4. Fall

• Ein 18-jähriger männlicher Erstspender wurde im Oktober 2010 serologisch positiv getestet, in der VSPK v1.1 Screening PCR war er negativ, ebenso im GFE Blut Bestätigungstest. Im externen Testlabor wurde er PCR positiv getestet.

• Meldung vom Blutspendedienst erfolgte am 16.11.2010.

• am 19.11.2010 konnte die identische Mutation wie im Isolat des 3. Falls im Bereich der Primerbindungsstelle identifiziert werden.

LTR Sequences From Recent HIV-1 Break-through Cases in Germany

6

(1) Clinical Isolate, Prof. Eberle, Pettenkofer Institut

(2) Consensus sequence

2. Fall --------CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTAAAGTAGTGTGTGCCC 3. Fall GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC 4. Fall GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC klin. Probe (1) GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAACTGTGCTTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC HXB2 (2) GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCC ******************* *** ********** *************** 2. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCTTTATAGTCAGTGTGGAAAA 3. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACACTTTTAGTCAGTGTGGAAAA 4. Fall GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACACTTTTAGTCAGTGTGGAAAA klin. Probe (1) GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAA HXB2 (2) GTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAA *************************************** ** **************** 2. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGTGAAAATAAGACCAGAGGAGCTCTC 3. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAACGAAAGTAAGACCAGAGAAGATCTC 4. Fall TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAACGAAAGTAKGACCASAGAAGTTCTC klin. Probe (1) TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGTAAGACCAGAGAAGTTCTC HXB2 (2) TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTC **************************** ***** **** **** ** ** ****

Philogenetic Analysis of the LTR Regions of HIV-1 Isolates

7

http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/treemaker/treemaker.html

2. Fall

klin. Isolat4. Fall

3. Fall

Phylogenetic Analysis of the gag Region

Ref

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Isolat1

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MEGA5

Phylogenetic relationship of the New Isolates with the M Group (A-K) pol Region

http://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/treemaker/treemaker.html

Phylogenetic Analysis of pr rt Region

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.TH

.90.

CM

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995

Ref

.36

cpx.

CM

.00.

00C

MN

YU

830.

EF0

8799

4

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.37

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CM

.00.

00C

MN

YU

926.

EF1

1659

4

Ref

.37

cpx.

CM.9

7.C

M53

392.

AF37

7957

Ref

.19

cpx.

CU.9

9.CU

7.AY

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94

Ref

.19

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CU.9

9.CU

29.A

Y5889

71

Ref.1

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x.C

U.99.

CU38.A

Y5889

70

Ref.35

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F.05

.05AF026

.EF1

5804

3

Ref.35

AD.AF.0

5.05

AF094.E

F1580

40

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U.03.P

S1044 D

ay0.D

Q67687

2

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UG037.A

B253429

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Ref.23 B

G.C

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900574

Ref.24 B

G.C

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B471.AY

900575

Ref.J.S

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F082394

Re

f.J.SE

.94.SE7022.A

F0823

95

Ref.J.C

D.97

.J 97D

C K

TB1

47.EF6

14151

Ref.11 cpx.C

M.9

5.1816.A

F4926

24

Ref.11

cpx.CM

.96.4496.A

F49

2623

Ref.11 cpx.C

M.9

7.MP

818.A

J291718

Isol

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Isol

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Re

f.B.N

L.0

0.6

71 0

0T3

6.A

Y42

338

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ef.B

.US

.98

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58 1

1.A

Y3

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5R

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.FR

.83.

HX

B2

LA

I IIIB

BR

U.K

034

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132.

AY

17 3

951

Ref

.42

BF

.LU

.03.

luB

F 0

5 03

.EU

1701

55

Ref

.29

BF

.BR

.01

.BR

EP

M1

6704

.DQ

085

876

Ref

.29

BF

.BR

.99.

BR

EP

M11

948

.DQ

085

871

Re

f.28

BF

.BR

.99.

BR

EP

M12

313.

DQ

0858

72

Ref

.28

BF

.BR

.99.

BR

EP

M12

609

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085

873

Ref

.28

BF

.BR

.99.

BR

EP

M12

817

.DQ

085

874

Ref

.03

AB

.BY

.00.

98B

Y10

443.

AF

4140

06

Ref

.03

AB.R

U.9

7.K

AL1

53 2

.AF

1932

76

Ref

.21

A2D

.KE

.91.

KN

H12

54.A

Y94

5737

Ref

.21

A2D

.KE.

99.K

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03.A

F457

051

Ref

.D.C

D.8

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4

Ref

.D.C

M.0

1.01

CM

441

2HA

L.A

Y371

157

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.D.T

Z.01

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Y253

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4.U

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4

Ref.1

0 CD

.TZ.

96.9

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48

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Z.96

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Ref

.K.C

D.97.

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11C.A

J2492

35

Ref.K

.CM

.96.

MP535

.AJ2

4923

9

Ref.F2.

CM.0

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1158

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Ref.N

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0131.AY532635

Ref.N

.CM

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J271370

Ref.C

PZ.C

D.90.AN

T.U42720

Ref.O

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.91.MVP

5180.L20571

Ref.O

.BE.87.AN

T70.L20587

Ref.O

.CM

.98.98CM

U290

1.AY

169812

Ref.O

.SN

.99.SE

MP

1300.A

J302647

0.05

MEGA5

Phylogenetic Analysis of the Whole Genome of the New Variants

B-Clade

http://www.hiv.lanl.gov/cgi-bin/phyloplace

Genetic Relationship with HIV-1 Subtype B

http://www.hiv.lanl.gov/cgi-bin/phyloplace

Genetic Relationship with Subtype B

More HIV-1 Break-through Cases

5. Case• In September 2011 a 30-years old repeat donor tested HIV-1 serology and NAT (GFE

Blut VSPK v 1.2) positive.• The preceding donation from May 2011 had been tested negative in serology and NAT

screening tests. The archive sample of this donation was thawn and newly tested in the more sensitive GFE Blut HIV-1 confirmatory NAT test. The result was weakly positive.

• Quantification of the sample resulted in viral load of 23,4 copies/ml.

• The 15-days old red cells of the donation from May 2011 had been transfused to a 71-years old male recipient.

• In September 2011 the recipient was tested and turned out to be HIV-1negative in serology and NAT testing.

6. Case• In July 2012 a 31-years old female first time donor tested HIV-1 serology positive; in

GFE Blut NAT screening and confirmation testing she was negative.• Sequencing of the isolate identified a large deletion in the LTR region at the probe

binding site . Several other screeening tests were affected: artus-HI-Virus-1 RT-PCR-Kit (Qiagen GmbH) and Roche CTS/MPX (Roche, Molecular Systems)

CAP CTM v1

HPS CTM v1

CAS v1.5

CAM v1.5

CTS MPX

VSPK v1.1

artus DRK Abbott RT

VSPK v1.2

CAP CTM v2

Ultrio plus

Case nb.

gag gag gag gag LTR LTR LTR LTR pol LTRgag + LTR

pol + LTR

1CAP

CTM V1((+)) - + + + + + + + + (+) +

2CTS MPX

(wd) + + + - + + + + + (+) +

3VSPK V1.1

(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)

4VSPK V1.1

(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)

5VSPK

V2(wd) - + (wd)

240 IU/ml

<70 IU/ml

-23

cp/ml+

6VSPK

V2(wd)

+ - (wd) -19387 IU/ml

-3760 cp/ml

(+)

HIV-1 Break-through Cases

PEI 2012

+ consistent detection efficiency(+) moderately reduced (factor < 10) detection efficiency

((+)) highly reduced (factor >10) detection efficiency

wd withdrawn

HIV-1 NAT Failures: Consequences

• Phased Plan initiated by the PEI in 2010• Official hearing in 2011• 06/15/2012: official notification of the manufacturers of blood

components by the PEI:– Starting from 01/01/2015 all blood components must be tested

by HIV-1 NAT systems that are able to exclude or compensate for the potential underestimation or non-recognition of the respective target region

– A potential approach could be dual-taget NAT tests with two or more different target regions

– For each individual target region the LOD must meet the minimal requirements of 10,000 IU/ml per individual donation.

CAP CTM v1

HPS CTM v1

CAS v1.5

CAM v1.5

CTS MPX

VSPK v1.1

artus DRK Abbott RT

VSPK v1.2

CAP CTM v2

Ultrio plus

Case nb.

gag gag gag gag LTR LTR LTR LTR pol LTRgag + LTR

pol + LTR

1CAP

CTM V1((+)) - + + + + + + + + (+) +

2CTS MPX

(wd) + + + - + + + + + (+) +

3VSPK V1.1

(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)

4VSPK V1.1

(wd) + + + + - ((+)) + + + + (+)

5VSPK

V2(wd) - + (wd)

240 IU/ml

<70 IU/ml

-23

cp/ml+

6VSPK

V2(wd)

+ - (wd) -19387 IU/ml

-3760 cp/ml

(+)

HIV-1 Break-through Cases

PEI 2012

+ consistent detection efficiency(+) moderately reduced (factor < 10) detection efficiency

((+)) highly reduced (factor >10) detection efficiency

wd withdrawnfactor 5.1

factor 3.4

factor 5.2

Analytische NWG des Pol-Amplikons auf Plasmid-Ebene

8 Kopien

Nachweisgrenzen mit Konfidenzgrenzen

Wahrscheinlichkeit

95%-Konfidenzgrenzen für VAR00001

Schätzer Untergrenze Obergrenze0,950 3,303 2,212 10,145

1,6 Kopien: 50 % NWG

LTR: Genotypenerkennung - Plasmide

Diese Genotypen werden von der pol-PCR sehr gut detektiert

Übersicht gBlocks®: Einzelamplikons

GenotypCt dRn 95% NWG

LTR Pol Gag LTR Pol Gag LTR Pol Gag

B2

29,971

26,100

23,21 165.821 1.452.691 1.373.146 4,8 7,0 1,51 0 00 0 0

C1

25,680

23,280

22,94 1.628.090 1.841.849 1.379.215 2,0 7,0 1,00 1 00 0 1

A10

23,320

23,272

24,66 1.987.185 2.263.904 1.120.573 5,1 2,2 2,60 0 20 0 0

01AE0

23,360

24,712

25,45 1.389.418 889.339 1.230.931 2,6 2,4 2,60 2 00 0 0

02AG0

23,780

24,842

25,31 1.742.500 926.166 1.179.805 2,2 0,8 2,60 2 21 0 2

06cpx0

23,830

24,512

24,46 1.717.613 1.065.496 1.233.858 3,4 2,2 3,11 1 10 0 0

G0

23,840

22,950

24,25 1.897.044 1.976.783 944.853 4,8 3,3 2,30 1 30 0 0

N0

25,200

26,643

1.874.800 352.972 2,0 3,50 4 43 0 7

O0

26,210

25,026

1.863.910 727.335 2,6 2,00 3 50 0 4

P1

24,260

24,255

1.651.085 893.267 1,3 2,00 2 53 0 6

Fall10

23,121

25,971

26,78 1.899.116 2.029.010 1.247.679 2,4 2,0 3,10 0 00 0 0

Sensitivität für einzelne PCRs, Dual und Triple bei In Vitro Transkripten

Gesamt LTR pol gag dual triple

HIV-1 Moleküle/PCR

IST SOLL IST SOLL IST IST IST SOLL IST SOLL

50 12 12 12 12 12 12 18 18 18 1825 12 12 12 12 11 12 18 18 18 18

12,5 11 12 12 12 11 12 18 18 18 186,25 9 12 12 12 9 12 17 18 18 18

3,125 8 12 12 12 4 12 18 18 17 18

1,5625 2 12 9 12 3 12 14 18 13 180,78125 1 12 6 12 1 12 9 18 10 18

0 0 12 0 12 0 12 0 18 2 1895% NWG 10,75 2,02 18,57 3,79 2,66

Dual versus Triple Target PCR

Vergleich der Sensitivität bei Ausfall einer Sonde

In IU/ml bei 100µl In-put Volumen entsprechend IVD Validierung

dualdual ohne

LTR

dual ohne

poltriple

triple

ohne gag

triple

ohne LTR

triple

ohne polHIV-1 v2

95%

NWG257 695 702 274 266 240 300 455

Faktor max. 2.7 Faktor max. 1.1

Dual versus Triple mit Testversagern

Extrahiertes Material: Testversager und Zellkulturmaterial im Vergleich

MW CP HIV-1 BRK 2010

MW CP HIV-1 West 2010

MW CP HIV-1 West 2012

MW CP HIV-1 ZKÜ

LTR 26,05 32,87 30,34

pol 31,13 41,00 30,10 32,25

gag 31,30 40,36 32,72 31,76

LTR-pol 27,87 33,56 29,98 31,00

LTR-gag 26,19 32,50 32,66 30,04

pol-gag 30,84 35,45 29,78 31,32

triple 28,42 34,09 29,90 31,17

GFE Blut Triple Target HIV-1 PCR

Sensitivität LC 480 ABI 7500

96er Pool 100 µl Einzel 96er Pool 100µl Einzel

95% NWG 730 351 800 378

KI 544 - 1261 263 - 619 556 - 1860 319 - 481

50% NWG 303 150 326 176

KI 189 - 455 82 - 223 154 - 585 141 - 213

Spezifität: 99,91%

- Nachweisgrenze (NWG) in IU bezogen auf 1ml Einzelspender Plasma- Einsatz jeweils 100µl Probenvolumen - Effektives Probenvolumen in PCR: 12,5 µl

KI: Konfidenzintervall

Danke für die Aufmerksamkeit

FIZ Frankfurt