Großes Hämatologisches Praktikum für Leistungskurse ... · Versuch 1B – Blutausstrich färben 3 Der Blutausstrich A) Blutausstrich anfertigen Der Blutausstrich dient ungefärbt

Großes Hämatologisches Praktikum für Leistungskurse Biologie

Skriptum

Skriptversion: 23.01.2006

Name: Datum:

Großes Hämatologisches Praktikum für Leistungskurse Biologie Als „Saft des Lebens“ wurde das Blut früher auch bezeichnet und mit der Seele gleichgesetzt. Auf welchen biologischen Tatsachen beruht aber der mystisch verklärte Ruf des Blutes? Ziel der Versuche in diesem großen, hämatologischen Praktikum ist es, den Schülerinnen und Schülern die Zusammensetzung, die Funktionen und die Leistungsfähigkeit des Blutes zu vermitteln und auf gesundheitsrelevante Bezüge wie Doping und Rauchen aufmerksam zu machen. Über die Bestimmung der Immunzellen führt die Diskussion direkt zur Geißel des 20. und 21. Jahrhunderts, der Krankheit AIDS. Experimente 1. Blutausstrich 2. Osmotische Erythrozytenresistenz 3. Hämatokritwertbestimmung 4. Kriminalistischer Nachweis von Blut 5. Sauerstoffaufnahmeminderung durch Kohlenstoffmonooxid 6. Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern (oder Antigenen) 7. Bestimmung von Immunzellen CD4 und CD8-Zellen per FACS (fluorescence activated cell sorting) Inhalte: Dr. Udo Kummer, Markus Förg, Dirk Stiebler, Melanie Odenigbo, Dr. Antje Brand Copyrights 2006: GSF-Forschungszentrum für Umw elt und Gesundheit GmbH, Neuherberg

Versuch 1B – Blutausstrich färben

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Der Blutausstrich A) Blutausstrich anfertigen

Der Blutausstrich dient ungefärbt zur mikroskopischen Untersuchung auf Parasiten. Gefärbt ermöglicht der Blutausstrich Gestalt und Aussehen der Leukozyten (der Begriff Leukozyt kommt aus dem griechischen: leukos = weiss; kytos = Zelle; Synonym: Weißes Blutkörperchen) gut sichtbar zu machen und sie den verschiedenen Gruppen zuzuordnen. Parallel dazu betrachtet man auch die Erythrozyten (der Begriff Erythrozyt kommt aus dem griechischen: erythros = rot; kytos = Zelle; Synonym: Rotes Blutkörperchen) und beurteilt sie nach Größe, Form und Farbe. Diese Basisuntersuchung des Blutes w ird als kleines Blutbild bezeichnet. Eine w eitere sehr wichtige Untersuchung des Blutes ist das Differentialblutbild. Mit dem Differentialblutbild w ird das Mengenverhältnis der verschiedenen Leukozyten ermittelt. Auf diese Weise lassen sich z.B. die Ursache und die Schw ere von Infektionen annäherungsw eise bestimmen.

Mater ial: entfettete und staubfreie Objektträger, Glasstab, Folienstif t zum Beschriften der Ausstriche, EDTA-Blut, Alkohol

Versuchsablauf Bemerkungen

Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!!

1. Legen Sie zwei Objektträger in einer Linie ausgerichtet nebeneinander

Unbedingt die Objektträger mit Alkohol reinigen!

2. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit dem Glasstab einen kleinen Bluttropfen auf das äußere Drittel eines Objektträgers

Den Glasstab dazu schräg an den Objektträger heranführen!

3. Platzieren Sie die schmale Kante des zweiten Objektträgers vor den Blutstropfen auf den liegenden Objektträger

4. Ziehen Sie den Objektträger langsam auf den Blutstropfen und warten Sie, bis sich das Blut entlang der Glaskante verteilt hat

5. Stoßen Sie das Blut mit Hilfe des Objektträgers in einem Winkel von etwa 30° langsam über den liegenden Objektträger

Kontrollieren Sie die Qualität des Ausstrichs durch Betrachten im Gegenlicht (vergleiche unten!)

6. Beschriften Sie sofort den Ausstrich am unteren Rand, um Verwechslungen vorzubeugen

7. Der Blutausstrich wird anschließend zum Trocknen ausgelegt

Die Trocknung des Ausstrichs lässt sich durch kurzes Wedeln beschleunigen

Qualität von Blutausstrichen

(1) Zu dünn und zu lang

(2) Richtig!! (3) Zu kurz (zu kleiner Blutstropfen?)

(4) Zu dick

Anleitung zur Anfertigung des Blutausstrichs


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B) Blutausstrich färben Ein w ichtiger Bestandteil der täglichen Laborarbeit ist das Färben biologischer Präparate. In der Hämatologie hat sich die May-Grünw ald-Giemsa-Färbung (Synonym: Pappenheim-Färbung oder panoptische Färbung) als Standardfärbung etabliert. Das Wesen der Pappenheim-Färbung ist durch eine Farbsalzbildung basischer Farbstoffbestandteile mit sauren Zelleiw eißanteilen bzw . sauren Farbstoffkomponenten mit basisch reagierenden Zellsubstanzen zu erklären. Mit dieser Färbemethode ist es möglich, Blutzellen so anzufärben, dass alle geformten Blutbestandteile eines getrockneten Blutausstrichs unterscheidbar w erden. Der Vorteil der Pappenheim-Färbung liegt in der sehr feinen morphologischen Differenzierung der Zellen, w as ein hohes Maß an diagnostischer Sicherheit gew ährleistet.

Mater ial: gut getrockneter Blutausstrich, Schnellfärbeset bestehend aus Fixierlösung, zw ei Färbelösungen und einem Becherglas mit Pufferlösung, Fliesspapier zum Trocknen der gefärbten Ausstriche, Mikroskop


1. Tauchen Sie den getrockneten Blutausst riche 5mal je eine Sekunde in die Fixierlösung (Reagenz 1). Lassen Sie die überschüssige Fixierlösung auf dem Fließpapier

Durch den in dieser Lösung vorhandenen Methylalkohol (giftig!)


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ablaufen. werden die Zellen fixiert.

2. Tauchen Sie den Objektträger 3mal je eine Sekunde in Färbelösung 1 (Reagenz 2). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 1 auf dem Fließpapier ablaufen.

3. Tauchen Sie den Objektträger nun 6mal je eine Sekunde in Färbelösung 2 (Reagenz 3). Lassen Sie die überschüssige Färbelösung 2 auf dem Fließpapier ablaufen.

Standardisierte und pH-eingestellte Färbelösungen mit Methylenblau (färbt saure Zellbestandteile blau), Methyl-Azur (färbt basische Zellbestandteile rot-violett) und Eosin (färbt basische Zellbestandteile orange-rot), wobei der pH-Wert der Lösung für das färberische Verhalten ausschlag-gebend ist. Da alle Zellbestandteile gefärbt werden, wird diese Färbung auch panoptisch genannt.

4. Geben Sie zum Abschluss den Objektträger für 45 Sekunden in das Becherglas mit der Pufferlösung.

Auswaschen der überschüssigen Färbelösungen

5. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen mit der Schichtseite nach oben auf das Fliesspapier. Die Auswertung erfolgt anschließend mit dem Mikroskop.

Anschauen und Auswerten Es gibt verschiedene Arten von weißen Blutkörperchen, die sich in ihrem Aussehen unterscheiden. Versuchen Sie mit Hilfe der ausgelegten Folie („Die Leukozyten“) und dem Mikroskop (400-fache Vergrößerung) mindestens drei verschiedene Formen w eißer Blutzellen zu unterscheiden und skizzieren Sie diese.

A B C

Versuch 2 – Osmotische Erythrozytenresistenz

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Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz Eine ausreichende Zeitspanne vorausgesetzt, w ird so gut w ie jedes Molekül durch eine Plasmamembran in Richtung seines Konzentrationsgradienten diffundieren. Die Geschw indigkeit, mit der dies geschieht, variiert jedoch enorm, in Abhängigkeit von der Größe des Moleküls, hauptsächlich aber von seiner relativen Löslichkeit in Öl (d.h. je hydrophober oder unpolarer es ist). So sind Plasmamembranen für Wasser 109-mal durchlässiger als selbst für solch kleine Ionen w ie Na+ und K+. Da die Plasmamembran für Wasser schw ach durchlässig ist, f ließt dies entsprechend seinem Konzentrationsgradienten langsam in die Zelle ein oder aus der Zelle heraus. Dieser Prozess w ird als Osmose bezeichnet. Wird die Solutkonzentration im äußeren Milieu (hypotonische Lösung) erniedrigt, bedingt dies eine Gesamtbew egung von Wasser in die Zelle (die Zelle schwillt!). Umgekehrt führt eine hypertonische Lösung zum Austritt von Wasser aus der Zelle (die Zelle schrumpft!). In Abhängigkeit von einer sich ändernden Osmolar ität der extrazellulären Flüssigkeit können solche Änderungen des Wasserflusses mikroskopisch sehr gut an Erythrozyten beobachtet w erden. Wie lange ein Erythrozyt einem Wassereinstrom standhält, bevor er schließlich platzt (osmotische Hämolyse), ist Ausdruck seiner physiologischen Funktionsfähigkeit und damit von großem diagnostischen Interesse, denn es gibt Krankheiten, bei denen die osmotische Widerstandskraft der Erythrozyten erhöht ist und solche, bei denen sie vermindert ist. Besonders um die letzteren zu erkennen, misst man die osmotische Erythrozytenresistenz.

Mater ial: Reagenzgläser, Reagenzglasständer, w eißer Papierstreifen, Tropfpipette, 1% NaCl (Kochsalz)-Lösung, destilliertes Wasser, Folienstif t, EDTA-Blut, Labortimer



1. Stellen Sie eine NaCl-Konzentrationsreihe von 0,2 – 0,9% her indem Sie die 1% NaCl-Lösung in Reagenzgläsern (beschriften nicht vergessen!!) mit destill iertem Wasser verdünnen. Ergänzen Sie dazu zuerst nebenstehendes Pipettierschema!

Endkonz. 1% NaCl dest. Wasser Endvolumen

0,9 2,7 ml 0,3 ml 3 ml

0,8 3 ml

0,7 3 ml

0,6 3 ml

0,5 1,5 ml 1,5 ml 3 ml

0,4 3 ml

0,3 3 ml

0,2 3 ml

2. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette je 2 Tropfen Blut in die Reagenzgläser.

3. Reagenzgläser schütteln und bei Raum-temperatur 10 min stehen lassen.

4. Danach Zentrifugation der Reagenzgläser für 5 min bei 1370 U/min (entspricht 280 g).

Wird von der Kursbetreuung durchgeführt!


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5. Direkt nach der Zentrifugation feststellen, in welchen Reagenzgläsern Hämolyse auftritt (s. nächste Seite).

Um eine evtl. auftretende Trübung besser beurteilen zu können, empfiehlt es sich hinter die aufgereihten Reagenzgläser einen weißen Papierstreifen zu halten

Auswertung:

• Man sucht das Röhrchen, in dem die Salzlösung nicht mehr ganz farblos sondern schon leicht rötlich ist. Das ist die Konzentration, bei der die ersten Erythrozyten zerplatzt sind. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.46% der Fall). • Dann sucht man das Röhrchen, in dem überhaupt keine Erythrozyten mehr am Boden des Röhrchens sind. In diesem Röhrchen sind offenbar alle Zellen zerplatzt. (Für normale menschliche Erythrozyten wäre das etwa bei einer NaCl-Konzentration von 0.3% der Fall). • Für normale menschliche Erythrozyten w ird der Referenzbereich für diese Methode daher mit 0.30 und 0.46 angegeben. • Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz

Beispiel für die Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz: Die Erythrozyten des Patienten w urden in ca. 20 Röhrchen mit ansteigender NaCl-konzentration gegeben, von fast reinem Wasser bis zu der Kochsalzkonzentration, die für rote Blutkörperchen ideal ist (0,9%ige NaCl-Lösung*). Die Reagenzgläser w urden für 24h stehen gelassen und dann visuell ausgew ertet. Der Übersichtlichkeit halber sind nur 4 Röhrchen dargestellt.

Erhöhung der Erythrozytenresistenz Bei einigen Krankheiten setzt die komplette Auflösung der Erythrozyten erst später als bei 0.30%, eventuell erst bei NaCl-Konzentrationen um 0.06% ein. Dazu zählen z.B. die:

• Thalassämie (Erbkrankheit) • Sichelzellen-Anämie (Erbkrankheit) • Eisenmangel-Anämie • Leberschäden • Gelbsucht durch Gallenabflussbehinderung

Eine Erhöhung der Erythrozytenresistenz ist keine große Hilfe für die Diagnose, denn für die damit assoziierten Krankheiten gibt es heute weit bessere Diagnosemöglichkeiten. Verminderung der Erythrozytenresistenz


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Bei einigen Krankheiten beginnt die Auflösung der Erythrozyten bereits bei Konzentrationen von 0.7%, die vollständige Auflösung der Erythrozyten bereits bei 0.4%. Dazu zählen z.B.:

• Kugelzellen-Anämie (Erbkrankheit) • andere hämolytische Anämien Da es für die Kugelzellen-Anämie nicht viele diagnostische Möglichkeiten gibt, hat die Messung der osmotischen Erythrozytenresistenz hier noch ihre Berechtigung.

Eine Lösung von 0,9% Kochsalz in Wasser entspricht 154 mMol pro Liter. Die Lösung w ird auch als „physiologische Kochsalzlösung“ oder „plasma-isotonische“ Lösung bezeichnet. Physiologisch oder plasma-isotonisch bedeutet, dass der osmotische Druck der Kochsalzlösung dem des Blutplasmas entspricht. Physiologische Kochsalzlösungen w erden in der Medizin eingesetzt, um kurzfristig den Verlust eines größeren Blutvolumens auszugleichen und zudem recht häufig als Trägerlösung für die Infusion von Medikamenten verwendet.

Aufgabe zur Messung der Osmotischen Erythrozytenresistenz

Überlegen Sie sich, w ie die Form der Erythrozyten in hypotonischer und hypertonischer NaCl-Lösung aussieht und stellen Sie dies zusammen mit der Bew egung der H2O-Moleküle durch die Zellmembran zeichnerisch dar.

hypotonisch isotonisch hypertonisch

Versuch 3 - Hämatokritwertbestimmung

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Plastikmasse

Erythrozyten

Plasmasäule

Leukozyten

Hämatokritwertbestimmung Was ist der Hämatokrit-Wert? Der Hämatokrit-Wert (der Begriff Hämatokrit kommt aus dem griechischen: haima = Blut und krinein= trennen, absondern) bezeichnet den Anteil der zellulären Bestandteile am Gesamtvolumen des Blutes und gibt Auskunft über die Fließeigenschaften des Blutes. Wie wird der Hämatokrit-Wert gemessen? Bestimmt w ird der Hämatokrit-Wert, indem man eine ungerinnbar gemachte Blutprobe in einem Mikro-Hämatokritröhrchen zentrifugiert. Die schw ereren Erythrozyten setzen sich dabei ab. Die so gebildete rote Blutsäule w ird gemessen und als prozentuales Verhältnis der Gesamtblutsäule angegeben. Den Anteil der Leukozyten (ca. 1%) an den zellulären Bestandteilen des Blutes kann man dabei vernachlässigen. Der Hämatokrit ist sow ohl von der Anzahl als auch vom Volumen der Erythrozyten abhängig. Mater ial: entfettete und staubfreie Objektträger, Tropfpipette, Mikro-Hämatokritröhrchen, Zentrifuge, EDTA-Blut


Sicherheitsvorschriften für den Umgang mit Blut beachten! Handschuhe tragen!! 1. Mischen Sie das Blut durch mehrmaliges Kippen des Blutröhrchens und geben Sie dann mit der Tropfpipette 2 große Bluttropfen auf einen Objektträger

2. Das Hämatokrit-Röhrchen waagrecht, mit der nicht markierten Seite an den Blutstropfen heranführen und durch Kapillarwirkung zu ca. ¾ füllen

Keine Luftblasen einsaugen!

3. Zentrifugation der so vorbereiteten Kapillaren für 15 min bei 9 000 U/min (entspricht 7 700 g)

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

4. Direkt nach der Zentrifugation mit Hilfe der Schablone die verschiedenen Fraktionen ausmessen

Auswertung:

• Die ausgemessenen Fraktionen in %-Anteile umrechnen • Den %-Anteil der festen Bestandteile berechnen

REFERENZWERTE BEREICH Männer 40-54 % Frauen 37-47 %

Auf dem Notebook finden Sie ein Lernmodul mit Fragen und Hintergrundwissen zum Hämatokrit!

Versuch 4 – Kriminalistik

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Kriminalistische Spurensicherung von Blut Um kleinste Spuren von Blut nachzuw eisen w ird heutzutage bei der Spurensicherung der Polizei Luminol eingesetzt. Luminol reagiert mit Oxidationsmitteln (z.B. Wasserstoffperoxid) unter Abgabe eines bläulichen Lichtes (Chemolumineszenz). Allerdings läuft diese Reaktion nur im vorhandensein geeigneter Katalysatoren (z.B. Eisenionen) ausreichend schnell ab. Zur Spurensicherung w ird Luminol mit Wasserstoffperoxid vermischt und auf verdächtige Flecken gesprüht. Wenn es sich bei dem Flecken um Blut handelt katalysiert das im Hämoglobin vorkommende Eisen die Reaktion und es kommt zu einem bläulichen Leuchten. Mater ial: Sprühflasche mit Luminol – Lösung

Dieser Versuch muss unter Lichtausschluss stattfinden – fragen Sie einen Kursbetreuer nach dem Tatort! In der Vorbereitung zu diesem Praktikum haben w ir einen Kanister Blut beim Metzger besorgt. Heute morgen w ar das Blut verschüttet und der Kanister leer. Es gibt drei Verdächtige, die mit dem Blut gearbeitet haben - glücklicherw eise haben w ir ihre Labormäntel. Im Nebenzimmer sind sie aufgehängt. Finden Sie heraus, w er der Täter w ar!


1. Sprühen Sie im völlig lichtfreien Raum mit Luminol – Lösung aus der Sprühflasche auf die Labormäntel.

Beobachtung: Wer w ar der Täter?

Versuch 5 – Sauerstoffminderung

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Sauerstoffaufnahmeminderung durch Kohlenstoffmonooxid Erythrozyten bestehen zu etw a 34% aus dem roten Blutfarbstoff Hämoglobin (der Begriff Hämoglobin kommt aus dem griechischen: haima = Blut und globus =Kugel, wobei mit Globinen kugelartige Eiweißstoffe gemeint sind), der große Bedeutung für den O2 und CO2-Transport und die Pufferfunktion des Blutes hat. Das Molekül setzt sich aus 4 Polypedtidketten mit je einer Farbstoffkomponente (Häm) zusammen, die zentral ein zw eiwertiges Eisenatom trägt. Die rote Farbe des Hämoglobins und damit auch des Blutes ist dadurch bedingt, dass kurzw elliges Licht (blau) relativ stark, langw elliges Licht (rot) von Hämoglobin kaum absorbiert w ir. Durch Anlagerung von O2 und CO2 verändert sich das Hb-Molekül, und damit sein charakteristisches Absorptionsspektrum, w as sich photometrisch quantif izieren lässt, aber auch mit dem bloßen Auge als Farbänderung zu beobachten ist. Der reversibel an das Hämoglobin gebundene O2 führt zu einer hellroten Färbung, w ohingegen desoxygeniertes Hämoglobin dunkelrot erscheint. Etw a 10% der aus dem Gew ebe aufgenommenen CO2-Menge bindet sich an die A minogruppe der Proteinkomponente des Hämoglobins, w odurch das Blut eine bläulich-dunkelrote Farbe annimmt. Aufgrund der größeren Aff inität des giftigen Kohlenmonoxids (CO) zu Hämoglobin w ird O2 aus der Bindung mit Hämoglobin verdrängt. Es entsteht das kirschrot aussehende CO-Hämoglobin. Der weitere O2-Transport w ird dabei blockiert w ird. Hierin liegt die Giftigkeit des farb- und geruchlosen CO-Gases begründet.

Mater ial: 2 Stative mit Muffen und Klammern, Messzylinder (50 mL), Gasw aschflasche, Mikroliterpipette, Schläuche, 2 Bechergläser, Tiegelzange, Pinzette, Stoppuhr, Photometer, Küvetten, Watte, Oxalatblut, 0,9%-NaCl-Lösung, Alkohol, Zigarette, Kohlenstoffdioxid



1. Die Gaswaschflasche mit 0,5 ml Oxalatblut und 50 ml 0,9%-NaCl-Lösung füllen.

Lassen Sie sich von einem Betreuer die Mikroliterpipette erklären, falls Sie dieser hier zum ersten Mal begegnen.

2. Geben Sie eine Pipette voll Alkohol in die Gaswaschflasche.

Durch Zugabe von Alkohol wird die Oberflächenspannung des Blutes und damit die Schaumbildung verringert.

3. Die Gaswaschflasche mit Hilfe des Stativs fixieren, über die Schlauchverbindung an die Vakuumpumpe anschließen und dann für 30 Sekunden Luft durch das Blut leiten. Dabei permanent die Schaumbildung beobachten und ggf. sofort die Pumpe ausschalten und weiteren Alkohol zugeben.

Vor Inbetriebnahme den jeweiligen Aufbau unbedingt von einem Betreuer kontrollieren lassen! Keinesfalls darf Blut in die Pumpe gelangen!

4. Die Schlauchverbindung der Vakuumpumpe lösen und die Gaswaschflasche an die CO2-Versorgung anschließen. Den linken, oberen Hahn ganz öffnen und am rechten, unteren den CO2-Strom dosieren.

Schaumbildung beachten!

5. Prüfen Sie die Reversibil ität der Vorgänge und bestimmen Sie die Zeit, die für die Oxygenierung notwendig ist.

6. Bestimmen Sie mit dem Photometer das Absorptionsspektrum des oxygenierten Blutes von 500 bis 600 nm. Notieren Sie die Maxima!

Die Bedienung des Photometers von einem Betreuer erklären lassen.


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7. Anschließend werden die gesamten Schwelgase dreier Zigaretten durch das Blut gesaugt. Das Kondensat (Teer) soll durch den Filter der Zigarette und die Wattefüllung (auf Luftdurchlässigkeit achten) des dicken Gummischlauchs von Blut und Pumpe fern gehalten werden. Mit wenig (!) Silikonkautschuk am Mundstück die Zigarette zum Schlauch abdichten. Die Pumpe wird in Dauerbetrieb genommen und mittels Hahn ein möglichst realistisches „Paffen“ simuliert.

Es darf kein Rauch in den Laborraum gelangen! Wasserbefülltes großes Becherglas unter die Zigarette!

8. Bestimmen Sie das Absorptionsspektrum des mit CO vergifteten Blutes. Notieren Sie die Maxima!

9. Leiten Sie eben so lange Luft durch das Blut, wie für die Oxygenierung des desoxygenierten Blutes nötig war. Bestimmen Sie mittels Absorptionsspektrum, ob Sauerstoff aufgenommen wurde.

Reinigen Sie gründlich alle mit Blut in Berührung gekommenen Gegenstände! Besonders auf die „Blubberfläche“ der Gaswaschflasche achten: Wasser durchleiten! Entsorgen Sie die verteerte Watte in eine Plastiktüte, die Sie sofort verschließen!

Auswertung Beschreiben und erklären sie die Veränderungen des Blutes !


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Was macht Rauchen so gefährlich? Zigarettenrauch ist ein chemischer Cocktail aus ca. 3.500 bis 4.000 verschiedenen Substanzen. Mehr als 40 Inhaltsstoffe, wie z.B. Teer, Arsen, Benzol und Cadmium , können Krebserkrankungen verursachen; andere Stoffe, wie z.B. Kohlenmonoxid, sind für ihre Giftigkeit bekannt. In der Schwangerschaft w ird das heranw achsende Baby über die Nabelschnur mit den lebensnotw endigen Nährstoffen versorgt. Die schädigenden Bestandteile des Rauchens erreichen auf diesem Weg das ungeborene Kind. Durch das Rauchen fällt ein beträchtlicher Teil der mütterlichen Erythrozyten für seine eigentliche Aufgabe als Sauerstoffträger aus. Als Folge kommt es zur Unterversorgung des Kindes mit Sauerstoff. Konsequenzen für das Ungeborene w urden bereits ab einem regelmäßigen Konsum von sieben Z igaretten/Tag beobachtet. Eine starke Reduzierung der Zigarettenmenge ist daher - zumindest w ährend Schwangerschaft und Stillzeit - unbedingt anzuraten. Am besten für Mutter und Kind w äre jedoch ein vollständiger Verzicht. Dies betrif f t natürlich auch den Partner, w eil Passivrauchen dem Ungeborenen ebenso schadet (denn der Tabakrauch in der Raumluft enthält die gleichen giftigen und Krebs erregenden Inhaltsstoffe wie der direkt inhalierte Rauch). Vorteile für das ungeborene Baby Vorteile für den Säugling

Wenn Schwangere aufhören zu rauchen, tragen sie entscheidend dazu bei, dass:

• das Risiko einer Fehlgeburt vermindert wird

• sich die Gefahr einer Frühgeburt um die Hälfte reduziert

• ihr Baby eine größere Chance hat, normal gewichtig auf die Welt zu kommen

• das Risiko einer Totgeburt um ein Drittel sinkt

Auch wenn das Kind geboren ist, sollte es nicht dem Zigarettenrauch ausgesetzt werden. Ohne Passivrauchbelastung kann das Risiko für eine Reihe von Krankheiten bei Ihrem Kind vermieden werden:

• akute Atemwegserkrankungen

• Bronchitis und Lungenentzündungen

• Chronische Mittelohrentzündungen

• Asthmatische Erkrankungen und allergische Reaktionen

• „Plötzlicher Kindstod“

Versuch 6 – ELISA-Verfahren

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Das ELISA-Verfahren: Diagnostischer Nachweis von Antikörpern (oder Antigenen)

Der Beitrag der B-Zellen zur Immunabw ehr besteht in der Bereitstellung von Antikörpern, die sich in der f lüssigen Phase des Blutes (Plasma) und in der extrazellulären Flüssigkeit der Gew ebe ansammeln und dort Krankheitserreger oder ihre toxischen Produkte zunächst binden um sie anschließend zu beseitigen (siehe dazu die Abbildungen und Erklärungen ab Seite 3). In vielen Bereichen nutzen heute Standardverfahren die Spezif ität (Spezif ität nennt man die Fähigkeit, das jew eilige Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden) und die Stabilität der Antigen-Antikörper-Bindung. So w erden z.B. in der Medizin Antikörper als molekulare Sonden zur Bestimmung von Hormonspiegeln in Blut und Gew ebeflüssigkeiten oder zum Nachw eis von zirkulierenden Antikörpern zur diagnostischen Abklärung von Infektionen (z.B. HIV) eingesetzt. Bei diesen diagnostischen Testverfahren handelt es in der Regel um ein sog. ELISA-Testsysteme (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzymgekoppelter Immunadsorptionstest), die leicht zu automatisieren und an internationalen Standards abgeglichen sind (siehe dazu die schematische Darstellung auf den nachfolgenden Seiten). Im Rahmen des Praktikums soll nur auf die die Grundzüge des ELISA-Verfahrens eingegangen werden. Eine Abw andlung des hier vorgestellten Testprinzips w ird im medizinischen Alltag für die Bestimmung der erzeugten Antikörper nach Impfungen verw endet. Durch diesen Antikörpernachw eis kann direkt auf den Immunschutz geschlossen bzw. Rückschlüsse für eine eventuelle Impfauffrischung gezogen w erden. Mater ial: Mikrotiterplatte beschichtet mit den Testproben, Pipette, Lösung mit enzymgekoppeltem Antikörper, Waschlösung, Substratlösung


1. Pro Testansatz werden 100 µl einer antigenhaltigen Lösung werden in die Vertiefung der Mikrotiterplatte eingefüllt

Grundsätzlich werden Doppel-bestimmungen durchgeführt!

2. Die so behandelten Mikrotiterplatte werden über Nacht stehen gelassen

Während dieser Zeit vollzieht sich der Prozess der Adsorption des Antigens an die Plastikoberfläche der Vertiefung. Dieser Vorgang ist rein physikalischer Natur!

3. Nicht adsorbiertes Antigen wird durch mehrfaches Waschen mit antigenfreiem Waschlösung aus der Vertiefung entfernt.

Der Prozess der Beschichtung (Adsorptionsphase) ist damit abgeschlossen

4. anschließend werden die Vertiefungen der Platte mit 1%iger Milchpulverlösung behandelt

Somit werden alle freien Bereich der Plastikoberfläche mit unspezifischen Milchproteine bedeckt und stören nicht beim Nachweis

In diesem Zustand werden Ihnen die Platten zur „Durchführung des ELISA-Verfahrens“ zur Verfügung gestellt!


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5. Sie haben zwei unterschiedliche Proben (A und B) mit spezifischem Antikörper, die Sie testen möchten. Dazu müssen Sie eine Verdünnungsreihe dieser Proben herstellen. Bereiten Sie sich für jede Reihe jeweils 11 Reaktionsgefäße vor und beschriften Sie diese von 2-12 (A, bzw. B). Pipettieren Sie in jedes Gefäß 100µl Antikörper-verdünnungslösung. Anschließend nehmen Sie aus dem Gefäß mit der Probe A 100 µl und pipettieren Sie es in Gefäß Nr.2, vermischen Sie gut (vortexen!!). Dann nehmen Sie 100 µl aus Gefäß Nr.2 und pipettieren Sie es in Gefäß Nr. 3. Wieder gut vermischen. Nun 100 µl aus Gefäß Nr. 3 in Gefäß Nr.4 usw. Verfahren Sie genauso mit der Probe B. Sie haben jetzt zwei Verdünnungsreihen hergestellt.

6. Aus jedem Reaktionsgefäß pipettieren Sie nun 100 µl der jeweiligen Antikörperlösung wird in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte (in die erste Vertiefung die pure Antikörperlösung, in Vertiefung 2 die erste Verdünnung usw.). Der Ansatz wird für mindestens 30 min bei Raumtemperatur stehen gelassen

Während der Inkubationsphase bindet der Enzym-markierte Antikörper an sein Antigen (spezifische Interaktion v on Antigen und Antikörper)

6. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen 5-mal mit 200 µl Waschlösung behandelt

Ungebunden Antikörper werden durch den Waschvorgang entfernt. In der Vertiefung verbleibt nur der gebundene Antikörper. Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

7. An den Waschvorgang schließt sich die enzymatische Nachweisreaktion an. Dazu werden jeweils 100 µl Substratlösung in die Vertiefungen gefüllt und etwa 5 min unter Lichtabschluss inkubiert

Enzymatische Nachweisreaktion! Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

Auswertung:

• Die Ausw ertung der Tests und die Besprechung der Ergebnisse erfolgt am Ende des Praktikums.


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Grundzüge des enzymgekoppelten Immunadorptionstests (ELISA)

Grundsätzliches: Die Basis jedes Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) stellen 3 chemisch-physikalische Prozesse dar: A: Adsorption von Antigen oder Antikörper an eine Festphase (Plastikoberfläche) B: spezif ische Interaktion (Bindung) von Antigen und Antikörper C: enzymatische Nachw eisreaktion Die Kombination dieser drei Prozesse bildet den immunchemischen Nachw eis „ELISA“, der heute eines der häufigsten Verfahren der medizinischen Diagnostik ist. Er f indet zudem eine breite Anw endung in der biologischen Forschung. Dazu trägt insbesondere die extrem geringe Nachw eisgrenze für Antigene bei, die häufig bei w enigen Picogramm (1 pg = 10-12 g) Antigen liegt. Die gute Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit ist ein w eiteres wesentliches Argument für die Verbreitung des ELISA-Verfahrens.

Zugabe von enzymgekoppelten Anti-A-Antikörpern

Beschichtung mit Antigen

Auswaschen nicht gebundener Antikörper

Enzym erzeugt farbiges Produkt aus farblosem Substrat

Probe 1 (Antigen A)

Probe 2 (Antigen B)


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Die Antikörper-vermittelte Immunität

– die Anheftung von Bakterien an Körperzellen verhindern

– bakterielle Toxine neutralisieren

– Infektionen durch Viren blockieren


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Die w ichtigsten Eigenschaften einer Antikörperantw ort sind die Spezifität, die Menge, die Klasse und die Bindungsstärke der erzeugten Antikörper. Spezifität nennt man die Fähigkeit, das jew eilige Immunogen von körpereigenen und anderen körperfremden Antigenen zu unterscheiden. So sind Antikörper in der Lage so eng verw andte Proteine w ie z.B. menschliches und Schw eineinsulin klar voneinander abzugrenzen. Die Menge ist ein Maß für die Zahl der reagierenden B-Zellen, die Geschw indigkeit der Antikörpersynthese und die Lebensdauer der Antikörper. Die Zusammensetzung der Klassen einer Antikörperantw ort bestimmt deren biologische Funktionen, sow ie die Körperregionen, in denen sie auftritt. Die Bindungsstärke ist von großer Bedeutung, denn je höher sie ist, umso weniger Antikörpermoleküle sind für die Beseit igung des Krankheitserregers oder seines toxischen Produktes erforderlich.

Schematische Darstellung der Antikörper-Klassen

IgG IgD

IgA

IgM

IgE


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IgG Die weitaus größte Menge der Antikörper ist mit ungefähr 75 P rozent das Immunglobulin G (IgG). IgG wird bei einer E rstinfektion erst nach ungefähr drei Wochen gebildet. T ritt dieselbe Infektion aber noch einmal auf, so werden IgG Antikörper sehr schnell und in sehr großer Menge produziert. Das verhindert in der Regel den erneuten Ausbruch einer E rkrankung. Eine weitere Besonderheit von IgG ist, dass es bei einer Schwangerschaft die schützende Plazenta durchdringen kann. So wird auch das Kind vor und auch nach der Geburt vor einer Infektion geschützt. Dieser Schutz hält aber nur etwa ein halbes Jahr an.

IgE Das Immunglobulin E (IgE) is t ebenfalls stark spezialisiert und spielt bei der Abwehr von Wurminfektionen und bei Allergien eine Rolle. IgE is t üblicherweise nur in winzigen Mengen nachweisbar. Nur rund 0 ,001 Prozent aller Immunglobuline sind IgE . Trotzdem spielt es bei über 90 Prozent aller allergischen P rozesse eine wichtige Rolle. IgE kann s ich leicht an bestimmte Immunzellen (z.B. Mastzellen) ankoppeln. Diese sind vor allem in der Haut und in den Schleimhäuten zu finden. Kommen Allergene mit dem Zell-gebundenen IgE in Berührung, bewirkt das eine Veränderung in der Funktion dieser Zellen. Diese Veränderungen führen zur Ausschüttung von Stoffen aus den Zellen, die in der Folge eine Entzündungsreaktion hervorrufen. Diese Stoffe werden Mediatoren oder M ittlersubs tanzen genannt. Der bekannteste Mediator ist das His tamin.

IgD Das Immunglobulin D (IgD) ist im Serum nur in sehr geringen Mengen nachweisbar. Über seine genaue Funktion und Bedeutung is t bisher nicht sehr viel bekannt. Da es auf der Oberfläche der B-Lymphozyten „sitzt“ , spielt es zumindest bei der Aktivierung der B-Zellen eine wesentliche Rolle.

IgA Das Immunglobulin A (IgA ) ist spezialisiert auf Abwehr von Antigenen an den Oberflächen der menschlichen Schleimhäute z. B. in Nase, Rachen und Darm. Ihr Anteil an der gesamten Antikörpermenge beträgt ungefähr 17 Prozent. Häufig werden Krankheitserreger und Allergene schon durch IgA abgefangen und neutralisiert. Dringen die E rreger aber tiefer ein, kommt es zu einer Immunreaktion. IgA gelangt in die Milch einer stillenden Mutter, die so ihre Abwehrstoffe auf den Säugling übertragen kann.

IgM Wenn ein fremder E rreger in den Organismus gelangt, reagiert der Körper als erstes mit der Produktion von Immunglobulin M (IgM). Weil IgM so schnell zur Verfügung steht, wird es gelegentlich auch als Frühantikörper bezeichnet. Is t die akute Phase einer Infektion überwunden, sinkt die Konzentration des IgM wieder. Handelt es sich um eine Zweitinfektion, dann bleibt die IgM Konzentration gering.

Notizen

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Immunität: Bestimmung der Helfer-T-Zellen im FACS Mit Hilfe des Mikroskops kann man die Leukozyten in Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterteilen. Man fand bald heraus, dass die im Mikroskop relativ einheitlich w irkenden Lympho-zyten aus verschiedenen Populationen bestehen: „Natürliche Killerzellen“ (15%), B-Lymphozyten (15%) und T-Lymphozyten (70%). Letztere unterteilen sich in zw ei Subgruppen, die CD4+ Zellen (Helferzellen; ca. 40% der Lymphozyten im peripheren Blut) und die CD8+ Zellen (zytotoxische T-Zellen; ca. 30%). Mit Hilfe von Fluorochrom-markierten Antikörpern und der Technik der Durchflusszytometrie (Fluorescence-Activated Cell-Sorting; FACS) gelingt es heute recht einfach diese Populationen im Blut eines Menschen qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Dabei w erden Zellen in einem Flüssigkeitsstrom nacheinander an einem Laserstrahl vorbei geleitet und die entstehende Licht-beugung und -streuung w ird von Detektoren aufgenommen und anschließend verrechnet. Werden Zellen eingesetzt, die mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert sind, lassen sich diese Zellen über die emittierte Fluoreszenz des Farbstoffes genauestens charakterisieren. Eine aktuelle Anw endung dieser Methode ist die Bestimmung des Immunstatus (Leistungsfähigkeit der Immunabw ehr) von HIV-infizierten Patienten an Hand der CD4+ und CD8+ posit iven T-Lymphozyten im peripheren Blut. Eine HIV-Infektion führt zum Verlust von CD4+ T-Lymphozyten. Unterhalb eines kritischen Wertes (<200 CD4+ T-Lymphozyten pro µl Blut) versagt die Immunabw ehr. Es kommt zu Infektionen mit einer Reihe opportunistischer Erreger* und schließlich zum Tod des Patienten. *Opportunistische Krankheitserreger führen nur bei Patienten mit eingeschränkter Immunabwehr zu Erkrankungen (Beispiel AIDS)

Mater ial: FACS-Röhrchen, Einzelzell-Suspension, Eppendorf-Pipette, Vortex-Mixer, CD4 FITC-konjugierter Antikörper und CD8-PE-konjugierter Antikörper, Zentrifuge, Durchflußzytometer


1. Die ausgegebenen FACS-Röhrchen nach Pipettierschema beschriften und auf Eis stellen.

2. Mischen Sie die bereitgestellte Zell-Suspension durch vortexen des Falconröhrchens und pipettieren Sie mit der Eppendorf-Pipette jeweils 50 µl Zellprobe in die Röhrchen.

Für jeden Versuchsansatz werden zwischen 5 x 105 und 106 Zellen eingesetzt

3. Je 50 µl der Antikörperlösungen bzw. der Pufferlösung nach Pipettierschema (auf den nachfolgenden Seiten) in die Röhrchen pipettieren und unter vorsichtigem Vortexen mischen.

Wichtig: Bei jedem Pipettiervorgang die Pipettenspitze wechseln!

4. Die Röhrchen im Dunkeln auf Eis 30 Minuten lang inkubieren.

Die Fluorochrom-konjugierten Antikörper sind lichtempfindlich und müssen im Dunkeln aufbewahrt werden

4. Zentrifugation der FACS-Röhrchen für 5 min bei 1370 U/min (entspricht 280 g).

Wird von der Kursassistenz durchgeführt!

5. Überstand absaugen, Röhrchen vortexen und das Pellet in 500 µl Pufferlösung resuspendieren. Die Auswertung erfolgt anschließend mit dem Durchflußzytometer.

Wird ebenfalls von der Kursassistenz durchgeführt!

Auswertung Bei der Ausw ertung soll der prozentuale Anteil der CD4- und CD8-positiven T- Lymphozyten an der gesamten Lymphozytenpopulation bestimmt w erden und das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ positiven T-Lymphozyten errechnet w erden. Auf dem Notebook finden Sie ein Lernmodul mit einer Einführung zur Durchflusszytometrie (FACS-Analyse).

Notizen

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Allgemeines zur Färbung von Zell-Oberflächenmolekülen Ursprünglich aus der Immunologie herausgew aschsen, w ird diese Methode heute w eit darüber hinaus verw endet, da man praktisch jeden zellulären Parameter, der sich in Fluoreszenzintensität ausdrücken lässt, damit erfassen kann. Grundsätzlich w ird Information pro Einzelzelle erfasst, die Gesamtpopulation der untersuchten Zellen ist die Summe dieser Einzelinformationen. Voraussetzung dafür ist, dass die gefärbten Zellen als Einzelzellen in Suspension vorliegen.

Generelles Vorgehen Die Durchführung der Durchflußzytometrie umfasst folgende Schritte:

Allgemeines zur Färbung Als Faustregel für eine Färbung rechnet man zw ischen 5 x 105 und 106 Lymphozyten. Die Färbung erfordert, dass ein Marker (Oberflächenmolekül) stabil exprimiert w ird. Deshalb w erden Färbungen mit vitalen Zellen am besten in der Kälte oder mit f ixierten Zellen durchgeführt (z.B. mit Paraformaldehyd). Die Bindung des Antikörpers an das Oberflächenmolekül erfolgt auch in der Kälte rasch (binnen w eniger Minuten). Die übliche Inkubationszeit von 30 Minuten enthält ein beträchtliche zeitliche Reserve. Die Zellen sollten am Ende der Inkubationszeit einmal gew aschen werden, um die nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Nach dem Wasch/Zentrifugationsschritt werden die Zellen im FA CS-Puffer resuspendiert, sofern sie noch am gleichen Tag gemessen werden. Es handelt sich um eine physiologische Pufferlösung mit speziellen Zutaten.

Für die durchflußzytometrische Analyse verwendeten Antikörperverdünnungen

Antikörper Fluorochrom Bemerkung

anti-Maus CD4 mit PE* konjugiert Phycoerythrin (PE) strahlt rotes Licht ab

Helfer-T-Zell-Marker, bindet an das CD4 Molekül

anti-Maus CD8

mit FITC-konjugiert Fluoresceinisothyocyanat (FITC) strahlt grünes Licht ab

Zytotoxischer T-Zell-Marker, bindet an das CD8 Molekül

Bereitstellen der Zellen

Markieren der Zellen mit spezifischen Fluorochrom-markierten Antikörpern

Messung der Proben

Auswertung der Messungen

Notizen

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Pippetierschema

Röhrchen Nr.: 1 2 3 4

Zellsuspension 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl

Pufferlösung 50 µl

Antikörper 1 50 µl

Antikörper 2 50 µl

Antikörpergemisch 50µl

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