Naunyn-Schmiedeberg's Areh. exp. Path. u. Pharmak., Bd. 235, S. 373--380 (1959)

Aus den Pharmakologischen Instituten der Universitäten Marburg und Tübingen

Hämiglobinbildung durch Benzoylphenylhydroxylamin Von

MANFRED KIESE und KARL-HEINZ PLATTIG

Mit 6 Textabbildungen

(Eingegangen am 10. November 1958)

KIESE, REINWEIN u. WALLER (1950a, b,c) und DANNENBERG U. KIESE (1950a,b) haben gezeigt, daß Phenylhydroxylamin mi t t tämo- globin und Sauerstoff nur in einer einmaligen Umsetzung zu Hämiglobin und Nitrosobenzol reagiert und daß die ,ka ta ly t i sche" Hämiglobin- bildung durch Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol in roten Zellen auf einer enzymischen t tydr ierung des Nitrosobenzols zu Phenyl- hydroxylamin beruht. HSUB~E~ hat als Mechanismus der ,ka ta ly - tischen" Hämiglobinbildung das Auftreten eines Radikals C«I-I 5 • NHO angenommen. In der Prüfung N-acylierter Phcnylhydroxylamine auf Hämiglobinbildung sah er eine Möglichkeit, die Mitwirkung des Radikals wahrscheinlich zu machen (HEu]3~ER, WAELE~ U. ZI]~GLE~).

Wir haben die Hämiglobinbfldung durch Benzoylphenylhydroxyl- amin in vitro und in vivo untersucht. Benzoylphenylhydroxylamin reagiert mi t Hämoglobin und Sauerstoff nur sehr langsam, eine , k a t a - lytische" Wirkung des Benzoylphenylhydroxylamins wurde nicht beob- achtet. Nach i.v. Injekt ion von Benzoylphenylhydroxylamin wurden in Hnnden die gleichen Hämiglobinkonzentrat ionen erreicht und die gleichen Mengen Hämiglobin gebildet wie nach i.v. Injekt ion äqni- molarer Dosen von Phenylhydroxylamin; lediglich die Anfangsgeschwin- digkeit der Hämiglobinbildung war etwas geringer. Es war daher wahr- scheinlich, dal3 Benzoylphenylhydroxylamin im Organismus sehr schnell zerfällt. Wir fanden, daß Leberhomogenat und eine Protein-Frakt ion aus Leber Benzoylphenylhydroxylamin sehr schnell spalten. Nach der Spaltung war die Wirkung auf rote Zellen in vitro gleich der einer äquivalenten ~¢[enge Phenylhydroxylamin.

Versuche A. Methoden

Phenylhydroxylamin wurde nach dem Verfahren von U~ZI~(~ER hergestellt. Benzoylphenylhydroxylamin wurde von Merck bezogen. Die Bestimmung von Benzoylphenylhydroxylamin erfolgte mit Hilfe des von

B~B~RGER entdeckten rotvioletten Eisenkomplexes. Je nach Benzoylphenyl- hydroxylamingehalt wurden 0,5--3 ml der Ansätze von Benzoylphenylhydroxyl- amin mit Leberhomogenat oder Leberprotein in 5 ml Aceton unter kräftigem

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Schütteln eingetropft. Ausgefallene Proteine wurden abzentrifugiert. Zu 5 ml Überstand wurden 2 ml 10°/0ige Trichloressigsäure gegeben. Trübungen, die da- nach auftraten, wurden ebenfalls abzentrifugiert. Nach Zusatz von 0,5 ml einer 0,05 mol Lösung von Ferrichlorid in 10°/0iger Trichloressigsäure wurde die Ex- t inktion der Lösung bei 520 m/~ gemessen.

Rote Zellen von Hunden und Menschen wurden mehrmals mit 0,9°/+iger Na- triumchloridlösung auf der Zentrifuge gewaschen und für die Versuche in einer Phosphat-Ringer-Lösung (9 Teile einer Lösung von 8,5 g I~TaCI, 0,23 g KC1, 0,25 g CaC12 in 1 1 und 1 Teil Phosphat 0,067 Mol/1 PH 7,4) suspendiert. Den Zellsuspen- sionen wurden 0,2°/0 Glucose zugesetzt.

Hämoglobinlösungen wurden teils aus Pfcrdehämoglobin, das nach TA¥LOR U. HASTI•GS kristallisiert und nmkristallisiert war, hergestellt, teils aus roten Zellen von Hundert und Menschen. Die roten Zellen wurden durch wiederholtes Gefrieren und Auftauen hämolysiert, zur Entfernung von Enzymen mit Aluminiumhydroxyd y (WILLSW-4WWE~ u. KRA[TT) verrührt und hochtourig zentrifugiert.

Hämiglobin wurde durch die Zunahme der Extinktion bei 550 m/~ nach Zu- satz von Cyanid bestimmt. Hämoglobin wurde nach Oxydation durch Ferricyanid ebenfalls als Hämiglobin bestimmt.

Extinktionsmessungen wurden mit dem Spektralphotometer von Zeiss durch- geführt.

=~Ianometrische Bestimmungen der Atmung wurden in der Apparatur von WAI~BURG durchgeführt. Der Sauerstoffverbraueh wurde aus den Druckänderungen unter Berücksichtigung des durch Hämiglobinbildung aus Oxyhämog]obin frei- gesetzten Sauerstoffs berechnet.

Leberhomogenat wurde aus frischen Rattenlebern durch Homogenieren mit der 3lachen Menge l°/0iger Natriumchloridlösung im Homogenator von POTTER hergestellt.

Eine Leberprotein-Fraktion, die Benzoylphenylhydroxylamin spaltete, fiel bei der Isolierung eines anderen Leberproteins an. Sehweincleber wurde mit der 5 fachen Menge Wasser, das mit But~nol gesättigt war, homogeniert. Nach dem Zentri- fugieren wurden aus dem Überstand Proteine an Calciumphosphat-Gel adsorbiert. Mit 3°/0igem primärem Kaliumphosphat wurde das wirksame Protein aus dem Calciumphosphat eluiert und durch Zugabe des gleichen Volumens Alkohol bei - -10~C gefällt. Der Niederschlag wurde in Wasser aufgenommen, gegen Wasser dialysiert, nach Abtrennung ausgefallener Proteine eingefroren und in gefrorenem Zustand getrocknet. Bei + 2 ° C war das trockene Protein viele Monate haltbar.

Hunden wurde Benzoylphenylhydroxylamin i.v. injiziert. Da Benzoylphenyl- hydroxylamin in Wasser schlecht löslich ist, wurde die verabreichte Menge Benzoyl- phenylhydroxylamin in 1--2 ml Aeeton gelöst injiziert. Wegen des Schmerzes, den die i.v. Injektion von Aceton verursacht, wurde den Hunden unmittelbar vor der Injektion des Acetons Evipan-Natrium bis zum Eintri t t der Seitenlage i.v. injiziert.

B. Ergebnisse

1. Hämiglobinbildung in Hunden

D u r c h D o s e n v o n 0 , 5 - - 1 0 m g B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n je Ki lo - g r a m m w u r d e die H ä m i g l o b i n k o n z e n t r a t i o n i m B l u t a u f die g l e i chen W e r t e e r h ö h t wie d u r c h ä q u i m o l a r e D o s e n v o n P h e n y l h y d r o x y l a . m i n . A u c h die u n t e r B e r ü c k s i c h t i g u n g der H ä m i g l o b i n r e d u k t i o n (Kn~s]~) er- r e c h n e t e n M e n g e n H ä m i g l o b i n , die w ä h r e n d de r D a u e r de r W i r k u n g

i n s g e s a m t g e b i l d e t w u r d e n , w a r e n gleich. I n Abb . 1 s ind die M e s s u n g e n

Hämiglobinbildung durch Bcnzoylphenylhydroxy]amin 375

der durch verschiedene Dosen Benzoylpheny]hydroxylamin maximal erreichten Hämiglobinkonzentration und der je Volumeneinheit Blut gebildeten Hämiglobinmenge wiedergegeben. Zum Vergleich sind die entsprechenden Werte für die Wirkung von Phenylhydroxylamin als Mittelwerte der Messungen von K]]~SF~ u. SOETBE~~ eingetragen.

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Mol Benzoßlphenzl»zdrox#lam/n óz~. fhenylhvdroxBlam/n/k~

Abb. 1. I t ämig lob inb i ]dung (lurch Benzoy lpheny lhydroxy lamin i m H u n d e nach i .v. In jek t ion . Abhäng igke i t der m a x i m a l erreichten Hämig lob inkonzen t r a t ion von der Dosis. K u r v e A : Hämig lob in - konzen t ra t ion g/100 tal ; K u r v e B : in 100 ta l Blut gebildete Hämig lob inmenge . K u r v e C:

Hämig lob in Gesamtb lu t fa rbs to f f " 100; , Benzoy lpheny lhydroxy lamin ; o P h e n y l h y d r o x y l a m i n (Da ten von

~[~IESE u. SOETBEER)

Unterschiede zwischen der Hämiglobinbildung durch Benzoylphenyl- hydroxylamin und durch /~quimolare Dosen von Phenylhydroxylamin bestanden im Ablauf der Wirkung. Die Hämiglobinbildung durch Bcnzoylphenylhydroxylamin verlief anfangs etwas langsamer als die durch Phenylhydroxylamin und hielt ein wenig länger an. Bis die maximale H/£miglobinkonzentration erreicht war, verstrich nach der Injektion von Benzoylphenylhydroxylamin etwa 50°/0 mehr Zeit als nach der Injektion einer äquimolaren Dosis von Phenylhydroxylamin. In Abb. 2 ist der Verlauf der Hämiglobinbildung und die Änderung der Hämiglobinkonzentration nach i.v. Injektion von 2,5mg (1,17, 1 0 - S M o l )

~ a u n y n - Schmiedeberg ' s Areh. exp. P a t h . P h a r m a k . , Bd. 235 2 6

376 M. KIESE und K.-H. PLATTm:

Benzoylphenylhydroxylamin je Kilogramm nach einem einzelnen Ver- such wiedergegeben. In die Abbilclung sind auBerdem die Daten eines in der Arbeit yon KI~,s~ u. SOET]~]~ER wiedergegebenen Versuchs, in dem 1,5 nag (1,37 • 10 -5 Mol) Phenylhydroxylamin je Kilogramm injiziert wurden, /ibernommen.

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0 / 2 3 b- G 7 Sid. #

Abb. 2. Ver lauf tier EI~tmiglobinbildung im Blute des I~undes naoh i .v. In jekt ion yon 2,5 mg ( = 1,17-10 -~ ~[ol) Benzoylphenylhydroxylamin je Kilogramm und yon 1,5 mg (= 1,37.10 -~ 5Iol) Phenylhydroxylamin je Kilogramm. Kurve K: H~tmiglobinkonzentration; Kurve M: in 100 ml Blur gebildete I~miglobinmenge. Benzoylphenylhydroxylamiu; - - -Phenylhydroxylamin

(Daten yon KXESE u. SOETBEER)

2. H~imiglobinbildung in vitro

a) In H~imoglobinl6sungeu. In LSsungen yon kristallinem Pferde- h/tmoglobin oder in H~molysaten, die mit Aluminiumhydi 'oxyd be- handelt worden waren, bildete Benzoylphenylhydroxylamin nur sehr langsam H£miglobin. In LSsungen yon etwa 17 g l-I~moglobin/100 ml wurden im Laufe yon 2- -3 Std 0,5--1 ~quivalent H~miglobin je Mol Benzoylphenylhydroxylamin gebildet. Danach stand die Reaktion still. In Abb. 3 ist der Ablauf der tt~miglobinbildung durch 2 verschiedene Konzentr~tionen yon Benzoylphenylhydroxylamin wiedergegeben.

Wit haben nicht untersucht, ob diese langsame tt~miglobinbildung nur durch Benzoylphenylhydroxylamin selbst erfolgte oder ob in unseren tt/£moglobinlSsungen Enzyme vorhanden waren, die Benzoylphenyl- hydroxylamin langsam spalteten. Zunitchst genfigte die Feststellung, dal3 die Reaktion yon Phenylhydroxylamin mit It/imoglobin und Sauer- stoff (KIESE u. I~EINWEI~') mehrere tausendmal schneller verli~uft als die H~miglobinbiidung durch Benzoylphenylhydroxylamin in unseren It/~moglobinlSsungen unter Luft, und dal~ die Geschwindigkeit der

HämiglobinbiIliung durch Benzoylphenylhydroxylamin 377

Hämiglobinbildung durch Benzoylphenylhydroxylamin in Hämoglobin- lösungen die hohe Geschwindigkeit der Hämiglobinbildung durch Benzoylphenylhydroxylamin in vivo nicht erklären kann.

b) I n roten Zellen. Wurden roten Zellen, die in Phosphat-Ringer- Lösung mit 0,20/0 Glucose suspendiert waren, 2 • 10 -4 oder 3,5 • 10 -4 Mol Benzoylphenylhydroxylamin je Liter zugesetzt, so wurden bei 37°C im Laufe von 4 Std 1 bis 4/~quivalent Hämiglobin je Mol Benzoylphenyl- hydroxylamin gebildet.

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: 2 Std. 3 Abb. 3

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0 0 1 2 3 « 5 Std. 6" Abb. 4

Abb.3. Hämiglobinbi ldung durch Benzoylphenylhydr oxylamin in Lösung von kr is ta l l inem Hämoglobin des Pferdes in 0,01 mol Phosphat PH 7,4 bei 37 ° G. Hämoglobin 16,7 g / 1 0 0 m l . - - Kurve A : 2,35" 10 -« ~IoI Benzoylphenylhydroxylamin je Liter. Kurve .B: 2,0 • 10-3Mol Benzoylphenylhydroxylamin je Li te r

Abb. 4. Einfluß von , a k t i v i e r e n d e m " Leberprotein auf die Hämig lob inb i ldung durch Benzoyl- phenylhydroxyIamin in roten Zeilen vom Hunde in v i t ro . - - Ro te Zeilen in Phosphat- l~inger-Lösung mi t 0,2'/o Glueose; 25 g Blut farbs tof f je 100 ta l ; Tempera tur 37 ° C. - - Kurve A : ohne Leberprotein; Kurve B : 20 mg Leberprotein je Li te r ; K u r v e G: 50 mg Leberprotein je Li te r ; Kurve D : 500 mg Leberprotein je Li ter . - - * Benzoylphenylhydroxylamln 2 - 1 0 -4 M o l ' 1-~; o Phenylhydroxylamin

2 • 10 -4 NIol • 1 - '

Durch Zusatz von Leberhomogenat oder ,akt ivierendem" Leber- protein wurde die Geschwindigkeit der Hämiglobinbildung durch Benzoylphenylhydroxylamin in roten Zellen in vitro beschleunigt und die innerhalb 4 Std erreichte Hämiglobinkonzentration erhöht.

Die Geschwindigkeit der Hämiglobinbildung durch Benzoylphenyl- hydroxylamin nahm mit der Konzentrat ion des ,akt ivierenden" Leber- proteins zu, bis sie der Geschwindigkeit der Hämiglobinbildung durch Phenylhydroxylamin gleich war. In Abb. 4 ist eine Reihe von Messungen der Hämiglobinbildung in roten Zellen vom Hunde durch 2 • 10 -« Mol Benzoylphenylhydroxylamin je Liter nach Zusatz verschiedener Kon- zentrationen Leberprotein wiedergegeben.

Zur weiteren Prüfung der Ubereinstimmung der Wirkung des durch Leberprotein ,akt iv ier ten" Benzoylphenylhydroxylamins mit der

26*

378 M. KIEs~. und K.-H. PI~TTIG:

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Wirkung von Phenylhydroxylamin wurde die Sauerstoffaufnahme roter Zellen unter der Einwirkung von Benzoylphenylhydroxylamin und Benzoylphenylhydroxylamin ~- ,akt iv ierendem" Leberprotein ge- messen. In Abb. 5 sind die Ergebnisse eines Versuches wiedergegeben. Durch 2 . 1 0 -4 Mol Benzoylphenylhydroxylamin je Liter wurde die

Hi~miglobinkonzentration nur sehr langsam erhöht und die Sauerstoffaufnahme der Zoll- suspension nur sehr wenig gesteigert. Wurde den roten Zellen mit dem Benzoyl- phcnylhydroxylamin auch Leberprotein zugesetzt, so

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I 2 3 q s Std. 6" 0 20 «0 5"0 80min

Abb. 5 Abb. 6

Abb. 5. Sauerstoffaufnahme und Hämiglobinbf ldung in roten Zellen vom t~uade unter der Wirkung von Benzoylphenylhydroxylamin und Benzoylphenylhydroxylamin mi t , ak t i v i e r endem" Leber- protein. Suspenslon roter Zeilen in Phosphat-:Binger-Lösung mi t 0,2% Glucose und 16 g Blutfarbstoff je 100 mi. - - Kurven I : ohne Benzoylphenylhydroxylamin; Kurven 2: mi t 2 . 1 0 -« l~Iol Benzoylphenyl- hydroxylamin je Li te r ; Kurven 3: mi t 2 • 10 -4 5~ol Benzoylphenylhydroxylamin und 500 mg Leber-

protein je Liter. 0 Sauerstoffaufnahme; H t tämig lob in Abb. 6. Spa l tung von Benzoylphenylhydroxylamin durch , ak t iv ie rendes" Leberprotein unter Luft . 2 • 10 -« Mol Benzoylphenylhydroxylamin je Li ter 0,06 mol Phosphat p~~ 7,4, TemperatUr 37 ° C. - -

A ohne Leberprotein; • mi t 500 mg Leberproteia je Li te r

t ra ten zugleich Hämiglobinbildung und Steigerung der Sauerstoff- aufnahme in dem für die Wirkung von Phenylhydroxylamin bekannten Verhältnis (KIES~ u. WALL~R) ein. Die Anfangsgesehwindigkeit der Sauerstoffaufnahme war etwas geringer als näeh Zusatz von 2 .10 .4 Mol Phenylhydroxylamin je Liter.

8. Spaltung vo~ Benzoylphenylhydroxylamin durch Leberproteine Bestimmungen von Benzoylphenylhydroxylamin in Ansätzen von

Ber~oylphenylhydroxylamin mit Leberhomogenat oder Leberprotein ergaben, daß Benzoylphenylhydroxylamin in diesen umgesetzt wurde,

Hämiglobinbildung durch Benzoylphenylhydroxylamin 379

und zwar u m so schneller, je s t ä rke r die betreffende K o n z e n t r a t i o n des Lebe rhomogena t s oder Lebe rp ro te ins das Benzoy lpheny lhych 'oxy lamin für die Hämig lob inb i l dung in ro t en Zellen in v i t ro , a k t i v i e r t " ha t t e .

I n Abb. 6 is t die A b n a h m e der B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n k o n z e n - t r a t i on in e inem Ansa tz von 2 . 1 0 -« Mol B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n und 500 mg Lebe rp ro t e in je L i t e r wiedergegeben. I n den ers ten 5 min nach Reak t ionsbeg inn wurden bere i ts 35°/0 des Be nz oy lphe ny lhyd roxy l - amins gespa l t en und nach wei teren 25 min waren schon über 80°/0 des B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n s umgese tz t .

Die A b n a h m e der K o n z e n t r a t i o n des B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n s durch die W i r k u n g des Lebe rp ro te ins ver l ie f un t e r St icks toff ebenso schnell wie un te r Luf t .

Zusammenfassung B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n reag ie r t m i t H ä mog lob in und Sauer-

s toff in Lösungen von Hämog lob in und in ro ten Blu tze l len nur sehr langsam.

I m Organismus wi rk t B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n - - mi t ger ingen Abweichungen im A b l a u f - - ebenso wie P h e n y l h y d r o x y l a m i n .

B e n z o y l p h e n y l h y d r o x y l a m i n wird durch L e b e r h o m o g e n a t gespal ten .

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung der Deutschen Forschungs- gemeinschaft durchgeführt.

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380 KIESE u. PLATTIO: Hämiglobinbfldung durch Benzoylphenylhydroxylamin

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Prof. Dr. MANFRED KIESE, Pharmakologisches Insti tut der Universität Tübingen, Wilhelmstraße 56