Hemmung der Aldehyddehydrogenase durch Extrakt des Pilzes Lepiota aspera in vitro

Klinikum rechts der Isar - Abteilung für klinische Toxikologie und Giftnotruf München

Katrin Romanek

Toxikologie

Case report. Oktober 2013:

Pat: Herr und Frau H. (74J und 72J)Anamnese: zusammen selbst gesammeltes Pilzgericht gegessen (vermeintlich Riesenchampignon; weiße Lamellen, braune Kappe) weniger als 20 min gebraten, gut vertragen. 4 Stunden später genossen beide 0,5 Liter Bier.Symp: Kurz darauf Flush, Atemnot, Kopfschmerzen, Tachykardie, hypertensive Entgleisung (bei vorbekannter art. Hypertonie)Therapie: durch NA Diagnose eines ACS und Transport auf kardiologische Intensivstation. Dort äußerte die Patientin einen Zusammenhang mit Pilzgericht, daraufhin Verlegung Toxikologie mit V.a. Coprinus-Syndrom.Verlauf: unter symptomatischer Therapie rasch regrediente Symptome. Entlassung am Folgetag in beschwerdefreiem Zustand.Pilzreste wurden von Fr. Haberl als Lepiota aspera identifiziert.

Im Verlauf dann weitere 5 Fälle Zürich / München / Erfurt

Toxikologie

Coprinus Syndrom:

Beim Coprinus-Syndrom handelt es sich um eine besondere Form der Pilzvergiftung. Coprin hemmt den Alkoholabbau auf der Stufe des Acetaldehydes durch Inhibierung der Acetaldehyddehydrogenase (ALDH2). Reversible, lästige, Effekte des kombinierten Verzehrs von Pilzen zusammen mit Alkohol sind spätestens seit 1906 für den Faltentintling beschrieben.

Auslösende Pilze:Faltentintling (Coprinus atramentarius) Glimmertintling (Coprinus micaceus)V.a.Netzstieliger Hexenröhrling (Boletus luridus)V.a.Keulenfüßiger Trichterling (Clitocybe clavipes) V.a. Ochsen-Röhrling (Boletus torosus)

Symptome treten nur in Kombination mit Alkohol auf:starkes Herzrasen Blutdruckanstieg Schweißausbrüche Kreislaufstörungen Zittern KopfschmerzenPruritusÜbelkeit und ErbrechenGesichtsrötung, livide Färbung der Haut

Toxikologie

Acetaldehydsyndrom:

- Coprin Syndrom 1914 bei Arbeitern in Kalkstickstoff- Produktion beschrieben- 1937 bei Arbeitern in der Gummiindustrie: Disulfiram wurde als Antioxydans beim Vulkaniseren eingesetzt

- Disulfiram (Antabus ®). Inhibition von ALDH2; (gewünschter Effekt zur Alkoholentwöhnung)

- ebenso Cyanamid (Düngemittel, chemische Industrie)- Metronidazol- Cephalosporine- Sulfonylharnstoffe- Chloralhydrat- Daidizin aus Ginseng

- 46% der Japaner und 56% der Chinesen sind von einem Polymorphismus der ALDH2 betroffen. Sie sind Träger eines dominanten Allels des ALDH2-Gens, bei dem an Position 487 der Aminosäuresequenz das Glutamat gegen Lysin ausgetauscht ist. Das mutierte ALDH2 kann Acetaldehyd weniger effektiv verarbeiten als das Wildtyp-Protein und wird selbst schneller abgebaut. Dadurch kommt es leichter zu einer Anhäufung des Acetaldehyds im Körper und damit zu den mit Alkoholkonsum verbundenen Vergiftungserscheinungen (Flush-Syndrom). Die betroffenen Personen sind somit empfindlicher gegenüber den negativen Auswirkungen des Alkoholkonsums.

Disulfiram

Toxikologie

Aldehydehydrogenase (ALDH):

Aldehyddehydrogenasen sind Enzyme, die Aldehyde oxidieren

Sie spielen eine wichtig Rolle in vielen Metabolischen und Regulatorischen Prozessen

Beim Menschen existieren 3 Untergruppen und 19 Isoenzyme

Aldehyddehydrogenasen kommen hauptsächlich in der Leber vor. Dort findet man sie entweder im Zytosol (ALDH-1) oder in den Mitochondrien (ALDH-2). Innerhalb des Stoffwechsels wird Ethanol von Alkoholdehydrogenasen (ADH) in das toxische Acetaldehyd umgewandelt. Aldehyddehydrogenase wandelt das toxische Acetaldehyd zum nicht-toxischen Acetat (Essigsäure) um.

Metabolisch: - ALDH2: Leber: (Mitochondrien) Alkohol- Abbau Gehirn: Dopamin- Synthese

- ALDH1-3: viele Gewebe u.a. Cornea / LinseAbbau toxischer Aldehyd bei Lipid Peroxydation

Regulatorisch: - ALDH: Retinol- Synthese (essentieller Regulatorwährend Embroygenese)

ALDH2: Octamer-Komplex mit NAD-Molekülen

Tumortherapie: Tumorzellen und vor allem Tumor-Stammzellen zeigen eine Resistenz gegenüber Chemotherapie bei erhöhter ALDH-Aktivität. => Resensibilisierung durch Disulfiram; macht Tumor-Stammzellen sensibel für Chemotherapeutika.

Toxikologie

Hemmung durch Keulenfuß-Tricherling (Clitocybe clavipes):

Kawagishi H(1), Miyazawa T, Kume H, Arimoto Y, Inakuma T.Aldehyde dehydrogenase inhibitors from the mushroom Clitocybe clavipes.J Nat Prod. 2002 Nov;65(11):1712-4.

Toxikologie

Hemmung durch Durianfrucht (Durio zibethinus):

Toxikologie

Hemmung der ALDH durch Lepiota aspera / Echinoderma asperum(Spitzschuppiger Stachelschirmling) ?

Familie: ChampignonverwandteGattung: SchirmlingeVorkommen: häufig in Laub- und Nadelwäldern, an Wegrändern und in Gärten vor. Die Fruchtkörper erscheinen von Sommer bis Herbst.

Speisewert: keiner, Stachelschirmlinge sind giftig bis ungeniessbarVerwechslung: Champignons, Parasolpilze, Perlpilz

Toxikologie

Fragestellung: Hemmt Lepiota aspera ALDH in vitro ?

Acetaldehyd- Dehydrogenase aus Hefe

Bildung von NADH bei 340 nm im Photometer verfolgt

NADH = Nicotinamidadenindinukleotid

Toxikologie

Leerwert: NADH-Bildung bei 340 nm :

Diag Leerwert (Acetaldehyd 450 µmol/l; NAD 450 µmol/l; ALDH: 1887 U/l)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60

MW blank

NADH µmol/L

Minuten

Toxikologie

Chloroform Extrakt enthält wenig-, Wasser Extrakt viel Hemmsubstanz

Diag Lasp A7

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60

MW L asp A 7 WasserMW L asp A7 ChlrMW blank

NADH µmol/L

Minuten

Toxikologie

Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ?

E aspera extract Dilution: AcAld=450 mmol/l NADH=450 mmol/l yALDH=1887 U/l

0

50

100

150

200

0 10 20 30 40 50 60minutes

NA

DH

µm

ol/l

0 µl - E aspera extract

2 µl - E aspera extract

3 µl - E aspera extract

4 µl - E aspera extract

6 µl - E aspera extract 8 µl - E aspera extract 10 µl - E aspera extract

Toxikologie

Koppaka V, et alPharmacol Rev. 2012 Jul;64(3):520-39.

NA

DP

+

Zusatz von 2-Sulfanylethanol (Mercaptoethanol) Verhindert die Hemmung der ALDH durch L. aspera- Extrakt

Extrakt A + MeSH

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60

1-Leer-MW2-A-MS-10-MWx2-A-MS-50-MW1-Leer-MS-MW

mit Mercaptoethanol

Extrakt A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60

1-Leer-MW2-A-10-MW2-A-50-MW

ohne Mercaptoethanol

Mercaptoethanol hebt die Hemmung des Pilz-Extraktes auf, konkurriert möglicherweise um aktives Cystein des ALDH-Enzyms.

Toxikologie

13-Feb-15 NAD=666µM AcAld=456µM - L asp7 - Aufhebung d Hemmung durch Et-SH

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 10 20 30 40 50 60

Minuten

NA

DH

µm

ol/l

ohne Pilz

mit Pilz Mecaptoethanolzusatznach 32 Minuten

mit Pilz ohneMecaptoethanolzusatz

Toxikologie

Cephadex-Säule: trennt nach Molekülgröße

L asp. Trennung je 2 x 2 ml Fraktion zusammengefasst

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 20 40 60 80 100 120 140

ml Fraktion

OD

10 min M30 min M44,5 min M59,5 min M

Toxikologie

1. Ultra Performance Liquid Chromatography 2. Elektrospray- Ionisation Massenspektroskopie

Die Molmassen 201/203 konnte gefunden werden, zeigten aber eine zu Coprin verschiedene Summenformel. Damit ist Coprin definitiv auszuschließen.

C9 H19 O3 N2undC10 H17 O4

Toxikologie

Und die anderen Pilze?

A bisporus

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60

A bisporus 10 MW

ohne Pilz MW

P ostreatus

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60

ohne Pilz MWP ostreatus 10 µl MW

B edulis

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60

ohne Pilz MWB edulis 10µl MWB edulis 50 µl MW

B edulis

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60

ohne Pilz MWB edulis 10µl MW

Zuchtchampignon, Agaricus bisporus

Austernseitling, Pleurotus ostreatus

Steinpilz, Boletus edulis

sehr geringe Hemmung

sehr geringe Hemmung

??

Toxikologie

in vitro gewisse Hemmung bei hohen Konzentrationen – klinische Bedeutung unbekanntTeilweise erniedrigte Alkoholtoleranz beschrieben

BräunlicherStäubling (Lycoperdon umbrinum)

Toxikologie

Diag B lur wässr extrakt

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60

MW B lur 52 WasserMW blank

Diag Lycoperd umbr

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60

MW Lyc um 42 WasserMW Lyc um 42 ChlorfMW blank

Netzstieliger Hexen-Röhrling (Boletus luridus)

Hemmt in vitro

klinische Bedeutung:Einzelfälle in der mykologischen Literatur beschriebeneigene Erfahrung: keine Alkoholintoleranz (Menge ?)

Hemmt in vitro

Chloroform- undWasserextrakt(bisher nicht bekannt, Einzelfall in Schweiz)

Toxikologie

Diag B rhodop wässr extrakt

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 10 20 30 40 50 60

MW B rhodp Wasser

MW blank

B Rub 82 wasser

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000

MW BolRub82 WasserMW BLANK

Blaufleckender Purpur-Röhrling (Boletus rhodopurpureus)

Weinroter Purpur-Röhrling (Boletus rubrosanguineus)

hemmt

geringe Hemmung starke Eigenfärbung

Toxikologie

Keulenfußtrichterling, Clitocybe clavipes

Clitocybe clavipes Nr 50

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60

Zeit

OD

MW CliCla50 WasserMW CliCla50 ChlorMW BLANKMW BLANK

frische Extrakte Wasser u Chloroform

Keine Hemmung ?

Clitocybe clavipes Nr 51

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60

Zeit

OD

MW CliCla51 WasserMW CliCla51 ChlorMW BLANK

frischer Extrakt (Wasser)

frischer Extrakt (Chloroform)

hemmt doch!

Toxikologie

Fazit:

diverse Pilze enthalten Substanzen, die die ALDH in vitro hemmen

- Faltentintling: (C. atramentarius) – Coprin ; länger bekannt

- C. clavipes: in mykologischer Literatur beschriebenHemmstoff isoliertin vitro an Einzelexemplaren nachvollziehbar/nicht nachvollziehbar

- L. aspera: - bisher nur klinische Fälle - Von uns erstmals Nachweis einer in vitro Hemmung- Die Hemmung ist konzentrationsabhängig- Die Hemmung ist mit Sulfid (Mercaptoethanol) aufhebbar- Es konnten die Summenformeln C9H19O3N2 und C10H17O4als mögliche Hemmsubstanzen isoliert werden

Offene Fragen: Standort ? Subspezies ? Alter ? Lagerung ? Bioresorption?

Toxikologie

Danke!