Institut für medizinische &molekulare Diagnostik AG

Falkenstrasse 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 250 50 20

Identifikation humanpathogener Pilze (ITS1/ITS2 rRNA-Gen)

1. Bedeutung

Pilzinfektionen haben in den letzten Jahren markant zugenommen. Man hrt dies auf

den Anstieg der Zahl von Personen mit Immunabwehrschw e z ck, der zum

grossen Teil dem erh hten Risiko r schwere Erkrankungen infolge l erer

Lebenserwartung zugeschrieben wird. Diese verlangen oft invasive diagnostische und

therapeutische Eingriffe wie Chemo- oder Strahlentherapie bei Malignomen,

Organtransplantation oder Breitspektrumantibiose, um nur die ufigsten zu nennen.

Das klinische Bild und der Verlauf der Infektion werden weitgehend von der

Immunkompetenz des Wirts bestimmt. Die wichtigsten humanpathogenen Pilze sind

Dermatophyten, Hefen und Schimmelpilze. Das Spektrum der Erkrankungen reicht von

den quoad vitam harmlosen Dermatomykosen

ber Infektionen von Haut und Schleim uten durch Hefepilze, die bereits als Hinweis

auf reduzierte Abwehr gelten, bis hin zu systemischen Infektionen durch Hefen oder

Aspergillen mit hoher Letalit t beim Immunkompromittierten. Das Bed nis, die

uate Therapie so rasch wie m glich einleiten zu nnen, hat dazu veranlasst,

nach alternativen Methoden zu der in klinischen Laboratorien blichen

otypisierung zu suchen. Die schon in den 1980er Jahren r phylogenetische

Studien erarbeiteten molekularen Techniken [1] erwiesen sich bei verschiedenen

Untersuchungen auch als erfolgreich bei

der Charakterisierung klinisch relevanter, humanpathogener Pilze [2,3,4,5,6, bersicht und

Referenzen in 7].

2. Nachweismethoden

Die Identifikation von Pilzen mit klassischen Methoden ist anspruchsvoll, zeitraubend

und verlangt viel Erfahrung vom Untersucher. Dabei werden Merkmale wie

Wachstums- verhalten, rbodenansp che, Koloniemorphologie, Produktion von

Pigmenten, mikroskopische Strukturen, biochemische Aktivit ten etc. in die Beurteilung

einbezogen. In manchen llen ist ein befriedigendes Ergebnis wegen otypischer

Varianten nicht m glich. Bei derartigen Isolaten kann die molekularbiologische Analyse

einen wichtigen Beitrag leisten. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass die volle

Auspr ung aller otypischen Merkmale nicht abgewartet werden muss, d.h., die

Untersuchung kann auch an einer jungen Pilzkultur erfolgen.

F r die molekularbiologische Analyse wird die DNA aus dem Pilzisolat mit geeigneten

Methoden extrahiert und gereinigt. Mit Hilfe der PCR wird die nternal transcribed

spacer (ITS)-Region 1 oder 2 des rRNA Gens zwischen 18S, 5.8S und 28S

amplifiziert und das Produkt direkt sequenziert. Die erhaltene Sequenz wird

anschliessend mit den in on line- Datenbanken hinterlegten Referenzsequenzen

verglichen [1].

Das Resultat liegt in 1 bis 2 Tagen vor, was vor allem bei invasiven Infektionen, die

Institut für medizinische &molekulare Diagnostik AG

Falkenstrasse 14 · CH-8008 Zürich · Telefon 0041 44 250 50 20

rasch aggressiv behandelt werden

m ssen, von entscheidender Bedeutung sein kann.

Wie bei der molekularen Identifikation von Bakterien (16S rRNA Gen) wird das

Resultat von der V gbarkeit und der Qualit t von Referenzsequenzen in den

Datenbanken beeinflusst. Daher ist die Charakterisierung des Isolates bis zur

Spezies nicht immer m glich. Die Kombination der Resultate der molekularen

Analyse mit kulturellen Merkmalen hrt in solchen llen meist zur definitiven

Identifizierung des Stammes. Gewisse Arten von Pilzen innerhalb einer Gattung

sind, wie dies auch von einzelnen Bakterien bekannt ist, auf molekularer Ebene so

nahe verwandt, dass sie sich kaum unterscheiden lassen wie etwa einige

Trichophyton-Arten, mlich T. rubrum, T. kanei, T. raubitschekii, T. fischeri und T.

fluviomuniense, die man darum als Trichophyton rubrum- Komplex bezeichnet [6,8].

3. Untersuchungsmaterialien

Zur Untersuchung geeignet sind Reinkulturen auf Festmedien oder in Suspension im

PCR Standard Transportmedium (PCR STM).

Nicht geeignet sind Patientenproben wegen mangelnder Sensitivi t und m licher

Kontamination durch Pilze aus der Umwelt.

Literatur: [1] T.J. White, T. Bruns, S. Lee, J. Taylor. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for

phylogenetics, p. 315-322. In: M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White (ed.), PCR protocols - a guide to methods and applications. Academic Press, Inc., San Diego, California, 1990.

[2] D.E. Ciardo, G. Sch r, E.C. B ger, M. Altwegg, P.P. Bosshard. Internal transcribed spacer sequencing versus biochemical profiling for identification of medically important yeasts. J. Clin. Microbiol. 2006, 44:77-84.

[3] H.P. Hinrikson, S.F. Hurst, T.J. Lott, D.W. Warnock, C.J. Morrison. Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2, internal transcribed spacer 1, and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species. J. Clin. Microbiol. 2005, 43:2092-2103.

[4] C. Coignard, S.F. Hurst, L.E. Benjamin, M.E. Brandt, D.W. Warnock, C.J. Morrison. Resolution of discrepant results for Candida species identification by using DNA probes. J. Clin. Microbiol. 2004, 42:858-861.

[5] Y.C. Chen, J.D. Eisner, M.M. Kattar, S.L. Rassoulian-Barrett, K. LaFe, U. Bui, A.P. Limaye, B.T. Cookson. Polymorphic internal transcribed spacer region 1 DNA sequences identify medically important yeasts. J. Clin. Microbiol. 2001, 39:4042-4051.

[6] R.C. Summerbell, R.A. Haugland, A. Li, A.K. Gupta. rRNA gene internal transcribed spacer 1 and 2 sequences of asexual, anthropophilic dermatophytes related to Trichophyton rubrum. J. Clin. Microbiol. 1999. 37:4005-4011.

[7] J.L. Rakeman, U. Bui, K. LaFe, Y.-C. Chen, R.J. Honeycutt, B.T. Cookson. Multilocus DNA sequence comparisons rapidly identify pathogenic molds. J. Clin. Microbiol. 2005, 43:3324-3333.

[8] Y. Gr ser, A.F.A. Kuijpers, W. Presber, G.S. De Hoog. Molecular taxonomy of the Trichophyton rubrum complex. J. Clin. Microbiol. 2000, 38:3329-33