Identifizierung und Charakterisierung der Ribohydrolase ... · Purin-bevorzugende RH, die neben dem Hauptsubstrat Inosin auch Aktivität an Adenosin, Guanosin, Xanthosin sowie dem

Identifizierung und Charakterisierung der Ribohydrolase-(RH)-Familie aus dem Laubmoos

Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. und ihr funktioneller knockout

Dissertation im Department Biologie der Fakultät Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften

an der Universität Hamburg

von Hanna Turčinov

Hamburg im April 2011

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

ZUSAMMENFASSUNG 1

SUMMARY 3

1 EINLEITUNG 5

1.1 Purin/Pyrimidin-Stoffwechsel 5 1.1.1 De novo Synthese von Purin-Nukleotiden 6 1.1.2 Recycling von Purinen 6 1.1.3 Purin-Katabolismus 8 1.1.4 Molekulare Studien zum Purin-Metabolismus 9 1.1.5 Transport von Purinen 10 1.1.6 Physiologische Rolle des Purin/Pyrimidin-Metabolismus bei Pflanzen 11

1.2 Ribohydrolasen 12

1.3 Cytokinine 15

1.4 Der Modellorganismus Physcomitrella patens 16

1.5 Zielsetzung der Arbeit 19

2 MATERIAL UND METHODEN 20

2.1 Chemikalien 20

2.2 Pflanzenmaterial 20 2.2.1 Physcomitrella Kultivierung unter Standardbedingungen 20 2.2.2 Kultivierungsbedingungen zur Bestimmung endogener Purine und Pyrimidine 22 2.2.3 Gewebeernte aus Physcomitrella Flüssigkulturen und Gewichtsbestimmung 22 2.2.4 Extraktion intrazellulärer Purin-, Pyrimidin- und Cytokinin-Metabolite mit Bieleski-Reagenz 23 2.2.5 Herstellung von Gewebeextrakten für die LC-MS/MS-basierte Purin/Pyrimidin-Analytik 23 2.2.6 Protoplasten-Isolierung aus Physcomitrella Flüssigkulturen 24 2.2.7 Transformation von Physcomitrella 24 2.2.8 In vivo Markierungsexperimente mit radioaktiv-markierten Substanzen 25

2.3 Molekularbiologie 26 2.3.1 E. coli-Stämme 26 2.3.2 DNA-Plasmide 27 2.3.3 Primer 27 2.3.4 PCR 29 2.3.5 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- und RNA-Fragmenten 29 2.3.6 Aufreinigung und Isolierung von PCR-Produkten aus Agarose-Gelen 30 2.3.7 Isolierung von Plasmid-DNA 30 2.3.8 Restriktionsverdau von DNA 30 2.3.9 Herstellung und Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen 30 2.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten 31 2.3.11 TOPO®cloning 31 2.3.12 Kryokonservierung von Bakterienstämmen 31 2.3.13 Isolierung genomischer DNA aus Physcomitrella 32 2.3.14 Isolierung von RNA aus Physcomitrella 32 2.3.15 DNase-Behandlung und reverse Transkription (RT) von RNA 33 2.3.16 Sequenzierung 33 2.3.17 Gensynthese 33

2.4 Proteinbiochemie 33 2.4.1 Herstellung von Proteinextrakten aus Physcomitrella 33 2.4.2 Überexpression rekombinanter RH in E. coli 34 2.4.3 Aufreinigung rekombinanter RH aus E. coli über Affinitätschromatografie 35 2.4.4 Expression von PpRH3 im Champion™ pET SUMO Protein Expression System 35

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2.4.5 Bestimmung der Proteinkonzentration 35 2.4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 36 2.4.7 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Native PAGE) 36 2.4.8 Colloidal-Coomassie-Färbung 37 2.4.9 Western Blot 37 2.4.10 Gelfiltration über FPLC 38 2.4.11 Enzym-Assays 38

2.5 RP-HPLC zur Trennung von Purin-Ribosiden und -Basen sowie Cytokinin-Ribosiden und -Basen 39

2.6 Quantifizierung von Tritium-markierten Metaboliten 40

2.7 LC-MS/MS-basierte Messungen zur Bestimmung von Purinen und Pyrimidinen 40

2.8 Kristallisierungsansätze 41

2.9 Durchlicht- und Fluoreszenz-Mikroskopie 41

2.10 Biolistische Transformation 41

2.11 Durchflusszytometrie 41

2.12 Sequenzanalysen 42 2.12.1 Sequenzsuche und -vergleiche 42 2.12.2 Bestimmung von Proteineigenschaften 42 2.12.3 Multiple Alignments und Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen 42

3 ERGEBNISSE 44

3.1 In vivo RH-Aktivität bei Physcomitrella 44

3.2 Identifizierung und Charakterisierung der RH-Genfamilie aus Physcomitrella 45 3.2.1 Aminosäure-Sequenzvergleiche von PpRH1, -2 und -3 47

3.3 Herstellung rekombinanter PpRHs in E. coli 48 3.3.1 Klonierung von PpRH1 48 3.3.2 Gensynthesen von PpRH2 und -3 48 3.3.3 Heterologe Expression von PpRH1, -2 und -3 in E. coli 49

3.4 Charakterisierung rekombinanter PpRHs 50 3.4.1 Quartärstruktur von PpRH1 50 3.4.2 Ansätze zur Kristallisierung von PpRH1 51 3.4.3 Aktivitätsnachweis rekombinanter PpRHs 52 3.4.4 Ermittlung enzymkinetischer Parameter rekombinanter PpRHs 54

3.5 Studien zur subzellulären Lokalisierung von PpRHs 59

3.6 Gezielter knockout von PpRH1, -2 und -3 in Physcomitrella 61 3.6.1 Herstellung von PpRH-knockout Linien 61 3.6.2 Molekulare Analyse der PpRH-knockout Linien 62 3.6.3 In vitro RH-Aktivität bei PpRH1-KO #29 67 3.6.4 Analyse des Purin- und Cytokinin-Metabolismus bei PpRH-knockout Linien 68 3.6.5 Analyse der Gehalte von Purinen und Pyrimidinen in Wildtyp und PpRH-knockout Linien 76

4 DISKUSSION 81

4.1 In vivo und in vitro RH-Aktivität in Physcomitrella 81

4.2 Phylogenie von RHs 82

4.3 Validierung des Genmodells von PpRH3 85

4.4 Genomische Organisation von pflanzlichen RHs 86

4.5 Funktioneller Nachweis für PpRH1 und PpRH2 als RHs 88 4.5.1 Methodendiskussion der eingesetzten Enzym-Assays - Spektrophotometrischer Assay versus HPLC-basierter Assay 88 4.5.2 Charakterisierung von PpRH1 89 4.5.3 Charakterisierung von PpRH2 93

4.6 Sequenz-basierte Klassifizierung von RHs aus Physcomitrella 94

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4.7 Hypothetische 3D-Struktur von PpRH1 und Hinweise auf katalytisch wichtige Aminosäuren 95

4.8 Charakterisierung des Purin-Metabolismus beim Wildtyp 99 4.8.1 In vivo Metabolismusstudien 99 4.8.2 Vorkommen von Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp 101

4.9 Subzelluläre Lokalisierung von PpRHs 103

4.10 Funktionelle Untersuchungen zu RHs anhand von knockout Mutanten 103 4.10.1 Veränderungen der RH-Aktivität nach PpRH1-knockout 104 4.10.2 Beeinflussung des Purin- und Cytokinin-Stoffwechsels nach PpRH-knockout 104

4.11 Zusammenfassende Schlüsse auf mögliche Funktionen von RHs bei Physcomitrella 108 4.12 Perspektiven 114

5 LITERATURVERZEICHNIS 115

6 ANHANG 125

6.1 Abkürzungsverzeichnis 125

6.2 Ergänzende Daten 127 6.2.1 Aminosäure-Sequenz von PpRH1 127 6.2.2 Aminosäure-Sequenzen von PpRH2 127 6.2.3 Aminosäure- und Nukleotid-Sequenzen von PpRH3 127 6.2.4 Ergänzende Daten zum Markierungsexperiment mit

3H-iPR 129

6.2.5 Ergänzende Daten zu den LC-MS/MS Messungen endogener Gehalte an Purinen und Pyrimidinen 131

Zusammenfassung

1

Zusammenfassung

Der Metabolismus von Purinen und Pyrimidinen ist von zentraler Bedeutung für das pflanzliche

Wachstum und die Entwicklung, da die zugehörigen Nukleotide Bestandteile und Vorstufen

zahlreicher wichtiger Substanzen sind. Hierzu zählen u.a. Nukleinsäuren, Energieträger wie ATP,

Co-Enzyme wie NAD sowie Alkaloide und Cytokinine. Ein Schlüsselenzym des Purin- und Pyrimidin-

Metabolismus ist das Enzym Ribohydrolase (RH), das die hydrolytische Spaltung von Ribosiden in

Basen und Ribose katalysiert und darüber den Übergang von Recycling zum Katabolismus von Purin-

und Pyrimidin-Metaboliten kontrolliert. In Mikroorganismen wurden RHs detailliert charakterisiert,

RHs aus Pflanzen sind hingegen in der Literatur kaum beschrieben.

Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Charakterisierung und Funktionsanalyse von RHs aus der

basalen Landpflanze Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.. In vivo und in vitro Messungen von RH-

Aktivität sowie Markierungsexperimente mit 3H-Purin-Ribosiden zeigten, dass Physcomitrella

RH-Aktivität besitzt. Über bioinformatische Methoden wurde die RH-Genfamilie identifiziert, die aus

drei Mitgliedern besteht (PpRH1, -2 und -3). Phylogenetische Analysen zur Erstellung eines

Stammbaumes ergaben zwei Hauptgruppen für pflanzliche RHs, wobei die meisten Spezies je einen

Vertreter in beiden Gruppen besitzen. Vergleiche der genomischen Organisation zeigten, dass PpRHs

eine hoch konservierte Intron/Exon-Struktur mit den meisten pflanzlichen RHs teilen. Für einen

funktionellen Nachweis und die Untersuchung der enzymkinetischen Parameter von PpRHs erfolgte

die heterologe Expression in E. coli. Messungen der Substratspezifität identifizierten PpRH1 als eine

Purin-bevorzugende RH, die neben dem Hauptsubstrat Inosin auch Aktivität an Adenosin, Guanosin,

Xanthosin sowie dem Pyrimidin Uridin und dem Cytokinin Isopentenyladenosin (iPR) zeigt. Die

optimalen Reaktionsbedingungen für PpRH1 für den Umsatz von Inosin waren bei 35 °C und einem

pH von 7,5-8,0 gegeben. Gelfiltration über FPLC zeigte, dass PpRH1 als Quartärstruktur Dimere bildet,

aber bei hohen Konzentrationen auch als Tetramer vorliegen kann. PpRH2 weist eine insgesamt

niedrigere katalytische Aktivität als PpRH1 auf und setzt vorrangig das Pyrimidin Uridin um. Versuche,

rekombinantes PpRH3 Protein zu erhalten blieben trotz zahlreicher experimenteller Varianten

erfolglos. Zur Entschlüsselung der 3D-Struktur von PpRH1 wurden erste Kristallisierungsansätze mit

rekombinantem Protein realisiert. Die Bedeutung katalytisch wichtiger Aminosäuren wird anhand

von site directed mutagenesis Experimenten diskutiert. Studien zur Expression von PpRH-GFP-

Fusionsproteinen in Physcomitrella Protoplasten zeigten übereinstimmend eine cytoplasmatische

Lokalisierung für PpRH1, -2 und -3 auf.

Um Gehalte von Purinen und Pyrimidinen im Gewebe von Physcomitrella zu erfassen, wurden

LC-MS/MS-basierte Messungen vorgenommen. Das hierbei erstellte Purin/Pyrimidin-Profil umfasst

15 verschiedene Purin- und Pyrimidin-Metabolite, die in nmolaren Mengen im Gewebe detektiert

wurden. Darüberhinaus konnten Purine und Pyrimidine auch im Kulturmedium nachgewiesen

werden.

Zur Untersuchung der physiologischen Relevanz von RHs wurden single-knockout Linien von PpRH1,

-2 und -3 hergestellt. Knockout Linien von PpRH1 zeigten in in vitro Enzym-Assays keine Rest-Aktivität

an Inosin. Die Inosin-Hydrolyse erfolgt demnach in Physcomitrella mit hoher Wahrscheinlichkeit

ausschließlich PpRH1-abhängig. Anhand von HPLC-basierten in vivo Metabolismusstudien mit

Zusammenfassung

2

radioaktiv-markierten Purinen und Cytokininen, sowie LC-MS/MS-basierten Messungen von steady

state Gehalten von Purinen und Pyrimidinen, wurden die Folgen der verschiedenen RH-knockouts

analysiert: Während der knockout von PpRH3 kaum Auswirkungen zeigte, wurde nach dem knockout

von PpRH2 intrazellulär eine Akkumulation des Ribosids Uridin festgestellt. Beim PpRH1-KO waren

die KO-bedingten Effekte am stärksten ausgeprägt: Hier führte der knockout zu einer beschleunigten

Aufnahme von extern applizierten Ribosiden (Inosin, Adenosin, iPR) aus dem Kulturmedium. Die

LC-MS/MS-basierten Messungen wiesen außerdem eine generelle Akkumulation von Ribosiden im

Gewebe nach (vorrangig Xanthosin, Inosin, Uridin, Guanosin). Zur Aufklärung der Bedeutung von

PpRH3 sind weitere Experimente nötig. Aus den zu PpRH1 und PpRH2 erhobenen Daten werden

folgende Schlüsse abgeleitet: PpRH2 repräsentiert eine RH-Nebenaktivität, die vorrangig auf die

Hydrolyse von Pyrimidinen einwirkt und vermutlich hauptsächlich im Entwicklungsstadium des

Gametophors von Bedeutung ist. PpRH1 übernimmt hingegen eine essentielle Funktion im Purin- und

Pyrimidin-Stoffwechsel, da es die RH-Hauptaktivität zum Abbau von Purin- und Pyrimidin-Ribosiden

darstellt. Für einen funktionierenden Katabolismus von Ribosiden und der damit verbundenen

Rückführung von Stickstoff ist Physcomitrella auf PpRH1-Aktivität angewiesen. Neben der Beteiligung

am Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel wird auch eine Rolle von PpRHs beim Cytokinin-Stoffwechsel

diskutiert.

Die vorliegenden Daten liefern einen Beitrag zur der bisher kaum untersuchten physiologischen

Funktion von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel und unterstreichen die Bedeutung von RHs für die

Balance zwischen Katabolismus und Recycling von Purinen und Pyrimidinen. Aufgrund der

phylogenetischen Stellung von Physcomitrella werden die bei der Charakterisierung der PpRH-

Genfamilie erhobenen Daten genutzt, die physiologische Rolle von RHs unter evolutionsbiologischen

Aspekten zu beleuchten.

Summary

3

Summary

Purine and pyrimidine metabolism is of central importance for the growth and development of plants

since the corresponding nucleotides represent building blocks of nucleic acids, major energy carriers,

and are components of essential coenzymes such as NAD, as well as being precursors of alkaloids and

cytokinins. A key enzyme associated with purine and pyrimidine metabolism is ribohydrolase (RH)

that catalyzes the hydrolytic cleavage of nucleosides to the corresponding bases and ribose, and

thereby balances salvage and catabolism of purines and pyrimidines. RHs have been well

characterized in microorganisms but relatively little is known about their contributions to plant

metabolism.

This work aimed to comprehensively characterize RHs in the basal land plant Physcomitrella patens

(Hedw.) B.S.G. In vivo and in vitro measurement of RH activity as well as feeding studies with

radiolabeled purines demonstrated that Physcomitrella exhibits RH activity. The three member RH

gene family of Physcomitrella, PpRH1, -2 and -3, was identified using bioinformatic tools.

Phylogenetic analysis of plant RHs revealed that they mainly cluster in two groups; for those species

with multiple RHs genes, at least one resided in each group. Comparison of the genomic organization

of PpRHs with other plant RHs demonstrated that they share a highly conserved intron/exon

structure. The biochemical characteristics of PpRHs were estimated using recombinant protein

produced in E. coli. Measurements of substrate specificity revealed PpRH1 to be a purine-preferring

RH with the highest affinity for inosine. In addition, PpRH1 accepted adenosine, guanosine and

xanthosine as well as the pyrimidine uridine and the cytokinin isopentenyladenosine (iPR) as

substrates; however, the efficiency of substrate conversions varied widely. Optimal reaction

conditions for the conversion of inosine were achieved at pH 7,5-8,0 and 35°C. Gel filtration using

FPLC indicated dimer formation and at higher concentrations tetramer formation of PpRH1. PpRH2

possessed a much lower catalytic activity as compared to PpRH1. The highest catalytic activity of

PpRH2 was measured for uridine as a substrate. Preliminary crystallization experiments with PpRH1

supported the conclusion that it forms homodimers; site-directed mutagenesis studies provided

insight into key amino acids responsible for substrate specificity. The localization of PpRHs was

studied by expression of GFP fusion proteins in protoplasts of Physcomitrella and consistently

showed a cytoplasmic localization for PpRH1, -2 and -3.

A complementary study involved the measurement of purines and pyrimidines in Physcomitrella

tissue using LC-MS/MS. The established profile comprised 15 different purine and pyrimidine

metabolites each occurring in the nmolar range. Furthermore, purines and pyrimidines were

detected in culture media.

To elucidate the physiological relevance of RHs, single knockouts for PpRH1, -2 and -3 were

generated. In vitro enzyme assays using PpRH1 knockout lines showed no residual activity for inosine

leading to the conclusion that inosine hydrolysis is mainly mediated by PpRH1. HPLC-based in vivo

metabolism studies with tritiated purines and cytokinins as well as LC-MS/MS based measurements

of steady state levels of purines and pyrimidines were used to analyze the impact of each RH

knockout. Whereas the knockout of PpRH3 caused only slight changes, knockout of PpRH2 led to an

intracellular accumulation of the riboside uridine. The knockout of PpRH1 had the strongest

Summary

4

physiological impact showing an accelerated uptake of external supplied ribosides from the culture

media (inosine, adenosine, iPR). In addition, LC-MS/MS based measurements revealed an overall

accumulation of ribosides in PpRH1-KO tissue, with particular increases in xanthosine, inosine,

uridine and guanosine. Although the role of PpRH3 was not resolved, the data obtained from the

PpRH1 and PpRH2 knockout lines led the following conclusions: PpRH2 represents a minor RH activity

mainly involved in the hydrolysis of pyrimidines and is most probably primarily active at the

gametophore stage. In contrast, PpRH1 has an essential function in cellular metabolism by providing

the main activity for hydrolysis of purine and pyrimidine ribosides. Physcomitrella relies on PpRH1

activity for the maintenance of riboside catabolism and the associated nitrogen recycling. Besides

their contribution to purine and pyrimidine metabolism PpRHs may also be involved in cytokinin

metabolism.

These data contribute to the understanding of the physiological role of RHs in plant metabolism and

underline their significance for the balancing of purine and pyrimidine catabolism and salvage. The

physiological significance of RHs in plants is interpreted with respect to the phylogenetic position of

Physcomitrella in the plant kingdom.

Einleitung

5

1 Einleitung

1.1 Purin/Pyrimidin-Stoffwechsel

Purin- und Pyrimidin-Nukleotide besitzen vielfältige Funktionen im Stoffwechsel von Pflanzen. Daher

sind Biosynthese und Metabolismus von Purinen und Pyrimidinen von essentieller Bedeutung für

pflanzliches Wachstum und Entwicklung. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide setzen sich aus einer

heterozyklischen Purin- oder Pyrimidin-Base zusammen, die über eine N-glykosidische Bindung mit

dem C1-Atom der Ribose verknüpft ist. Je nach Energiezustand erfolgt die Veresterung der Hydroxy-

Gruppe am C5-Atom der Ribose mit ein bis drei Phosphatgruppen. Durch Abspaltung der

Phosphatgruppen durch Phosphatasen bzw. Nukleotidasen entstehen die korrespondierenden

Nukleoside, auch Riboside genannt. Wird die N-glykosidische Bindung gespalten, liegt die freie Base

vor. Zentrale Vertreter der Purin-Basen sind Adenin, Hypoxanthin, Xanthin und Guanin, wichtige

Pyrimidin-Basen stellen Uracil, Cytosin und Thymin dar.

Zu den Nukleotid-Derivaten mit einer wichtigen Funktion im pflanzlichen Stoffwechsel zählen unter

anderem Desoxyribonukleotide und Ribonukleotide, die die Grundbausteine für Nukleinsäuren

bilden. Das Adenosin-Derivat Adenosintriphosphat (ATP) stellt einen universellen Energieüberträger

bei biochemischen Reaktionen dar. ATP wird darüberhinaus genutzt, um aktivierte Vorstufen zur

Synthese vieler Makromoleküle zu bilden. So werden Adenosinmonophosphat-(AMP)-aktivierte

Aminosäuren zur Proteinbiosynthese benötigt und aktivierte Adenosindiphosphat-(ADP)-Glucose

wird bei der Synthese von Polysacchariden wie Saccharose oder Stärke eingesetzt. Desweiteren wird

angenommen, dass extrazelluläres ATP (eATP) bei Pflanzen eine Rolle als Signalmolekül bei

Stressreaktionen und Wachstumsprozessen übernimmt (Song et al. 2006). Auch Pyrimidin-

Nukleotide übernehmen in Pflanzen wichtige Funktionen. UTP, UDP und UDP-Glukose stellen Co-

Substrate bzw. energiereiche Vorstufen für den Sucrose-Metabolismus und die Bildung von Cellulose

sowie anderen Matrixkomponenten der Zellwand dar. Nukleotide bilden außerdem die direkten

Vorstufen zur Synthese von essentiellen Co-Enzymen wie Nikotinamiddinukleotid (NAD),

Flavinadeninnukleotid (FAD) oder S-Adenosylmethionin (SAM). Diese spielen eine entscheidende

Rolle bei zahlreichen biochemischen Reaktionen wie beispielsweise der Synthese von

Phospholipiden. Auch für die Bildung von Vitaminen der B-Gruppe wie Thiamin, Riboflavin werden

Nukleotide als Vorstufen benötigt. Eine weitere wichtige Aufgabe kommt den Nukleotiden als

Vorläufermolekülen von Sekundärmetaboliten wie Alkaloiden sowie den Phytohormonen Cytokinine

zu, die einen entscheidenden Einfluss auf Wachstum und Entwicklung der Pflanzen haben.

Berücksichtigt man die Anzahl und Vielfalt der Reaktionen an denen Nukleotide beteiligt sind, so

repräsentieren sie nach Kohlehydraten, Proteinen und Lipiden die nächstgrößte Gruppe an wichtigen

zellulären Komponenten.

Grundlegende Kenntnisse zum Nukleotid-Stoffwechsel wurden vor allem durch Studien an

Mikroorganismen und Tieren gewonnen (Rolfes 2006, Zalkin und Nygaard 1996, Henderson und

Paterson 1973). Bei Pflanzen sind trotz der zentralen Bedeutung von Nukleotiden viele biochemische

Aspekte des Nukleotid-Stoffwechsels noch unklar. Dies hängt vermutlich mit der Komplexität der

zahlreichen biochemischen Reaktionen zusammen, die zur de novo Synthese, zum Katabolismus und

zum Recycling von Nukleotiden, Ribosiden und Basen nötig sind. Die meisten Arbeiten zum

Einleitung

6

pflanzlichen Nukleotid-Metabolismus beschäftigen sich vorrangig mit den enzymatischen Reaktionen

zur Verstoffwechselung von Nukleotiden (Moffatt und Ashihara 2002, Wagner und Backer 1992).

Weitere Arbeiten befassen sich mit angrenzenden Themen wie dem Stoffwechsel von Nukleinsäuren

(Sugiura und Takeda 2000) oder dem Caffein-Metabolismus (Ashihara und Suzuki 2004).

Physiologische und biochemische Zusammenhänge sowie molekulare Details des Nukleotid-

Stoffwechsels wurden bisher nur in geringem Umfang untersucht (Zrenner et al. 2006, Stasolla et al.

2003). Im Folgenden werden die verschiedenen Aspekte des Nukleotid-Stoffwechsels dargestellt,

wobei vorrangig auf den Stoffwechsel von Purinen eingegangen wird.

1.1.1 De novo Synthese von Purin-Nukleotiden

In Pflanzen erfolgt die Bereitstellung von Nukleotiden auf unterschiedlichen Wegen (Abb. 1.1).

Einerseits können Nukleotide de novo hergestellt werden, andererseits ist eine Rückgewinnung von

Nukleotiden aus Ribosiden und Basen über Recycling-Reaktionen möglich. Die de novo Synthese von

Purinen erfolgt ausgehend von der aktivierten Ribose-Vorstufe 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat

(PRPP), den Aminosäuren Glutamin, Glycin und Aspartat sowie 10-Formyltetrahydrofolat und

Hydrogencarbonat (HCO3-). Aus diesen Grundbausteinen wird in einer 10stufigen Reaktionsfolge

unter Verbrauch von mehreren Molekülen ATP das erste Purin, Inosinmonophosphat (IMP), gebildet.

Nach der Bildung von IMP spaltet sich die de novo Synthese in zwei Wege auf, der eine Weg führt zur

Bildung von AMP, der andere zur Bildung von GMP. Die enzymatischen Reaktionen der de novo

Synthese laufen hauptsächlich in den Plastiden ab. In der Literatur existieren aber auch Nachweise

der entsprechenden Enzym-Aktivitäten in Mitochondrien (Wagner und Backer 1992, Le Floc'h und

Lafleuriel 1983) wie beispielsweise für einige in den Tropen vorkommende Stickstoff-fixierende

Fabaceen beschrieben wurde (Atkins et al. 1997).

1.1.2 Recycling von Purinen

Neben der zuvor beschriebenen de novo Synthese von Nukleotiden können Pflanzenzellen auch

anfallende Nukleotid-Abbauprodukte wie Riboside und Basen über Recycling-Reaktionen zu

Nukleotiden umwandeln. Die für das Recycling erforderlichen Reaktionen werden auch unter dem

Begriff Salvage zusammengefasst. Freie Riboside und Basen entstehen bei verschiedenen

katabolischen Prozessen in der Zelle wie beispielsweise beim Abbau von Nukleinsäuren oder bei der

Mobilisierung von Speicherprodukten während der Keimung. Adenin und Adenosin werden

außerdem bei der Methionin- und Ethylen-Synthese freigesetzt. Die Rückführung von Ribosiden und

Basen ist energetisch für die Pflanze deutlich günstiger als die de novo Synthese von Nukleotiden.

Während die de novo Synthese von Purinen fünf Moleküle ATP verbraucht, wird für das Recycling

lediglich in einem enzymatischen Schritt Energie in Form von ATP benötigt (Moffatt und Ashihara

2002). Im Gegensatz zu den Reaktionen der de novo Synthese, die einen hohen Konservierungsgrad

in verschiedenen Eukaryoten aufweisen, sind die Reaktionen des Recyclings von Purinen weitaus

komplexer und bisher noch nicht vollständig verstanden (Möhlmann et al. 2010, Katahira und

Ashihara 2006, Sugiura und Takeda 2000).

Zum Recycling werden Purin-Riboside durch Kinasen unter ATP-Verbrauch in das korrespondierende

Nukleosidmonophosphat überführt (Abb. 1.1). Analog hierzu werden die Purin-Basen dem

Nukleosidmonophosphat-Pool durch Aktivität von Phosphoribosyltransferasen wieder zugeführt.

Einleitung

7

Einleitung

8

Abb. 1.1 Schematischer Überblick über den pflanzlichen Purin-Stoffwechsel. PRPP – 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat; Gln – Glutamin; Gly – Glycin, 10-Formyl THF – 10-Formyltetrahydrofolat; Asp – Aspartat; FAIRCAR – 5-Formaminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid; AMP, (d)ADP, (d)ATP - (Desoxy-)Adenosinmono-, -di- und -triphosphat; GMP, (d)GDP, (d)GTP – (Desoxy-)Guanosinmono-, -di- und -triphosphat; IMP – Inosinmonophosphat; XMP – Xanthosinmonophosphat; NDP – Nukleosiddiphosphat. Beteiligte Enzyme: 1 – 5‘-Nukleotidase; 2 – Adenosinkinase (ADK); 3 – Inosin/Guanosinkinase; 4 – Nukleosid-Phosphotransferasen; 5 – Ribonukleotid-Reduktase; 6 – Nukleosiddiphosphatkinase; 7 – Purin-Nukleosid-Phosphorylase; 8 – Adeninphosphoribosyltransferase (APRT); 9 – Hypoxanthin/Guaninphosphoribosyltransferase; 10 – Xanthinphosphoribosyltransferase; 11 – AMP-Deaminase; 12 – Guanosin-Deaminase; 13 – Guanin-Deaminase; 14 – Ribohydrolase (RH)/Nukleosid-Hydrolase; 15 – Xanthin-Dehydrogenase (XDH); 16 – Uricase; 17 – Allantoinase; 18 – Allantoicase; 19 – Urease; 20 – Ureidoglykolat-Lyase; 21 – Allantoinsäure-Deaminase; 22 – Ureidoglycinamidohydrolase; 23 – Ureidoglykolat-Hydrolase; 24 – IMP-Dehydrogenase; 25 – GMP-Synthase. Schema modifiziert nach Katahira und Ashihara (2006) und Zrenner et al. (2006).

5‘-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP) dient dabei als Quelle für Ribose-1-phosphat. Weitere an

Recycling-Reaktionen beteiligte Enzyme sind Ribohydrolasen (siehe auch 1.2), die die Basen in

Riboside überführen. Diesen Enzymen kommt insofern eine Schlüsselrolle zu, als dass die

katalysierten Reaktionen am Übergang zwischen Recycling und Katabolismus der Purin-Metabolite

stehen. Purin-Nukleosid-Phosphorylasen, die Basen unter Verbrauch von Ribose-1-phosphat in

Riboside umwandeln sowie Nukleosid-Phosphotransferasen, die Riboside in Nukleotide überführen,

scheinen in Pflanzen eine eher untergeordnete Rolle zu spielen (Wagner und Backer 1992).

Einige der in das Purin-Recycling involvierten Enzyme aus Pflanzen wurden bereits auf molekularer

Ebene charakterisiert (Stasolla et al. 2003). Hierzu zählen u.a. Adenosinkinase (ADK, Moffatt et al.

2000), Adeninphosphoribosyltransferase (APRT, Moffatt et al. 1994) sowie Hypoxanthin/

Guaninphosphoribosyltransferase (Liu et al. 2007). Die enorme Wichtigkeit eines funktionierenden

Recyclings von Purinen wurde an entsprechenden Arabidopsis Mutanten demonstriert. ADK-

knockout-Mutanten waren in ihrer Fähigkeit Methylierungsreaktionen vorzunehmen limitiert und

zeigten in der Folge eine verminderte Fertilität sowie ein stark reduziertes Blattwachstum (Moffatt et

al. 2002). Arabidopsis Pflanzen mit verminderter APRT-Aktivität verloren hingegen die Fähigkeit

fertile Pollen zu produzieren (Moffatt und Somerville 1988). Neben der zentralen Bedeutung im

Purin-Recycling wurde darüber hinaus nachgewiesen, dass ADK und APRT auch bei der

Interkonversion von Cytokininen eine wichtige Rolle spielen. Diese Enzyme scheinen also durch ihre

Beteiligung im Purin- und Cytokinin-Stoffwechsel eine duale Funktion zu übernehmen (Allen et al.

2002, Moffatt et al. 2000).

1.1.3 Purin-Katabolismus

Der Abbau von Purinen spielt eine wichtige Rolle im Stickstoff-Metabolismus der Pflanzen. Während

bei vielen Tieren, insbesondere höheren Primaten, Harnsäure das Endprodukt des Purin-

Katabolismus bildet und exkretiert wird, sind Pflanzen auf eine effiziente Stickstoff-

Wiederverwertung angewiesen. In den meisten Pflanzen erfolgt daher die oxidative Degradierung

von Purinen über Allantoin und Harnstoff zu CO2 und NH3, das dann über den GS/GOGAT-Zyklus

reassimiliert werden kann. Eine Schlüsselkomponente des Purin-Katabolismus stellt Xanthin dar (Abb.

1.1). Alle abzubauenden Purin-Metabolite werden daher zunächst zu Xanthin umgewandelt bevor

der eigentliche Abbau des Purin-Rings stattfindet. Hierzu erfolgen Deaminierung,

Dephosphorylierung sowie die Spaltung von glykosidischen Bindungen. Ausgehend von AMP wird

zunächst die Amino-Gruppe durch AMP-Deaminase entfernt, wodurch IMP gebildet wird. Der

Einleitung

9

anschließende Abbau von IMP kann auf zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen: Entweder wird IMP

über eine 5‘-Nukleotidase (oder Phosphatase) zu dem entsprechenden Ribosid Inosin umgesetzt oder

IMP wird durch eine IMP-Dehydrogenase zu XMP umgewandelt, das im Anschluss zu Xanthosin

dephosphoryliert wird. Von den entstandenen Ribosiden, Inosin bzw. Xanthosin, wird durch Aktivität

einer Ribohydrolase (siehe auch 1.2) die Ribose abgespalten, so dass die Basen Hypoxanthin bzw.

Xanthin entstehen. Diese werden spezifisch von Xanthin-Dehydrogenase über Xanthin zu Harnsäure

oxidiert. Harnsäure wird über Uricase in Allantoin umgewandelt, welches wiederum zu

Allantoinsäure via Allantoinase umgesetzt wird. Allantoin und Allantoinsäure stellen wichtige

Stickstoff-Speicher- und -Transportkomponenten bei einigen tropischen Fabaceen dar (Smith und

Atkins 2002). Für die weitere Verstoffwechselung von Allantoinsäure zu CO2 und NH3 wurden

verschiedene Wege in Pflanzen beschrieben (Zrenner et al. 2006, Stasolla et al. 2003, Moffatt und

Ashihara 2002). Über den klassischen „Allantoicase-Weg“ wird Allantoinsäure über Harnstoff und

Ureidoglykolat zu CO2, NH3 und Glyoxylat abgebaut. Der „Allantoinsäure-Deaminase-Weg“ führt

hingegen zur Hydrolyse von Allantoinsäure zu CO2, NH3 und Ureidoglycin (Zrenner et al. 2006,

Moffatt und Ashihara 2002, Winkler et al. 1988). Ureidoglycin ist instabil und wird in Ureidoglykolat

umgewandelt. Das entstandene Ureidoglykolat wird anschließend zu Glyoxylat, CO2 und NH3

umgesetzt. Das gebildete Ammonium kann wieder in Aminosäuren eingebaut werden.

Die bei Tieren wichtigen Enzyme des Purin-Katabolismus Adenin-/Adenosin-Deaminasen konnten in

Pflanzen bisher nicht eindeutig nachgewiesen werden (Zrenner et al. 2006). Pospísilová et al. (2008)

konnten zwar ein homologes Gen mit putativer Funktion in Arabidopsis identifizieren, die Aktivität an

Adenosin und Adenin war aber sehr gering. Der Abbau von Adenin-Nukleotiden erfolgt in Pflanzen

somit hauptsächlich über die Aktivität von AMP-Deaminase. Guanosin-Deaminase-Aktivität wurde

hingegen in Pflanzen nachgewiesen (Ashihara et al. 1997). Der Katabolismus von Guanin-Nukleotiden

ist somit auch über eine Dephosphorylierung zu Guanosin, das zu Xanthosin deaminiert wird,

möglich.

Neben dem Recycling von Stickstoff spielen Teile des Purin-Katabolismus auch eine wichtige Rolle bei

der Synthese von Alkaloiden, da diese ausgehend von Xanthosin gebildet werden (Ashihara und

Suzuki 2004).

Für einen optimalen Energiehaushalt ist ein ausbalanciertes Gleichgewicht zwischen den zuvor

beschriebenen Abbau- und Recycling-Prozessen von enormer Bedeutung für Pflanzen. Wie wichtig

diese Möglichkeit zur Regulation ist, konnte eindrucksvoll von Geigenberger et al. (2005) an Solanum

tuberosum demonstriert werden: Die reduzierte Expression von UMP-Synthase, einem wichtigen

Enzym aus der Pyrimidin de novo Synthese, führte zu einer kompensatorischen Stimulation von den

energetisch günstigeren Recycling-Prozessen.

1.1.4 Molekulare Studien zum Purin-Metabolismus

Zu den molekularen Mechanismen die den Purin-Nukleotid-Metabolismus in Pflanzen regulieren,

liegen bis heute nur wenige Informationen vor. In letzter Zeit wurde aber eine immer größere Zahl an

beteiligten Enzymen auf molekularer Ebene identifiziert und hinsichtlich ihrer Funktion

charakterisiert, wobei dies hauptsächlich an Arabidopsis erfolgte.

Aus der Purin de novo Synthese wurde beispielsweise die Genfamilie der PRPP-Synthetase aus

Arabidopsis von Boldt und Messutat (2003) beschrieben. Die Genfamilie besteht aus drei Isoformen

Einleitung

10

die eine differentielle Expression in verschiedenen Geweben zeigen. Senecoff und Meagher (1993)

identifizierten ein 5-Aminoimidazolribonukleotid-(AIR)-Synthetase-kodierendes Gen in Arabidopsis.

Weiterhin wurde aus Arabidopsis von Senecoff et al. (1996) eine für 5-Aminoimidazol-4-N-

succinocarboxyamidribonukleotid-(SAICAR)-Synthetase kodierende cDNA kloniert. In das Recycling

involvierte Enzyme wurden hauptsächlich aus den am Adenin-Recycling beteiligten Prozessen

charakterisiert, da diese u.a. auch eine wichtige Rolle im Cytokinin-Stoffwechsel spielen (Mok und

Mok 2001). Für die beiden zentralen Enzyme des Adenin-Recyclings, APRT und ADK, wurden

umfangreiche Studien mit Arabidopsis durchgeführt (Moffatt und Ashihara 2002). APRT wird von

einer Multigenfamilie mit fünf Isoformen repräsentiert, wobei die zugehörigen Transkripte nicht für

alle Isoformen nachgewiesen werden konnten (Moffatt und Ashihara 2002). ADK wird in Arabidopsis

durch zwei Gene kodiert, die beide konstitutiv exprimiert sind. Daten aus Microarray-Analysen

weisen darauf hin, dass ADK auch an Transmethylierungsreaktionen zur Pektin-Synthese beteiligt ist.

Gene, die für Enzyme kodieren, die am Abbau von Purinen beteiligt sind, wurden erst kürzlich

identifiziert. Hierzu zählen AMP-Deaminase, Xanthin-Dehydrogenase, Uricase und Allantoinase

(Zrenner et al. 2006). Anhand von T-DNA-Insertionsmutanten sowie der Mutagenese des AMP-

Deaminase-kodierenden Gens wurde gezeigt, dass dieses Protein unter anderem wichtig für die

Entwicklung der Zygote bei Arabidopsis ist (Xu et al. 2005). Die Familie der Xanthin-Dehydrogenase

aus Arabidopsis besteht aus zwei Mitgliedern. Während XDH2 konstitutiv exprimiert wird, scheint die

Expression von XDH1 unter Stressbedingungen aktiviert zu werden (Yesbergenova et al. 2005). Für

Allantoinase wurde lediglich ein Gen in Arabidopsis nachgewiesen (Yang und Han 2004). Das

korrespondierende Protein enthält ein N-terminales Signalpeptid zum Eintritt in den sekretorischen

Weg. Biochemische Daten weisen auf eine Lokalisierung der Allantoinase in Peroxisomen oder im

endoplasmatischen Retikulum hin. Eine eindeutige subzelluläre Lokalisierung aller Komponenten des

Purin-Katabolismus steht allerdings noch aus.

1.1.5 Transport von Purinen

Die Reaktionen des Purin-Metabolismus erfolgen in unterschiedlichen Zellkompartimenten, so dass

die Pflanze ein effizientes Transportsystemen benötigt, um beispielsweise in den Plastiden

synthetisierte Purin-Metabolite ins Cytoplasma zu überführen, wo eine weitere Verstoffwechselung

der Substanzen erfolgt. Darüberhinaus muss das beim Recycling entstehende Grundgerüst von Purin-

oder Pyrimidin-Nukleotiden in andere Gewebe transportiert werden, um beispielsweise den

erhöhten Nukleotidbedarf von Kotyledonen oder embryonalem Gewebe decken zu können (Stasolla

et al. 2003). In Arabidopsis wurden verschiedene Transporter-Familien zum Transport von Purin-

Ribosiden und -Basen identifiziert (zusammengefasst von Möhlmann et al. 2010).

Purin-Permeasen (PUP) vermitteln den Transport von Purin- und Pyrimidin-Basen entlang eines

Protonengradienten (Gillissen et al. 2000). Darüberhinaus wurde auch der Transport von strukturell

verwandten Substanzen wie Cytokininen und dem Alkaloid Koffein für die PUP Proteine

nachgewiesen (Bürkle et al. 2003, Gillissen et al. 2000). Weitere Nukleobasen-Transporter stellen die

Ureid-Permeasen (UPS, Desimone et al. 2002) und die Nukleobase-Ascorbat-Transporter (NAT,

Maurino et al. 2006) dar, deren detaillierte Charakterisierung allerdings noch aussteht.

Die erste Beschreibung eines pflanzlichen Nukleosid-Transporters erfolgte 2001. Möhlmann et al.

(2001) identifizierten in Arabidopsis ein zur equilibrative nucleoside transporter-(ENT)-Familie

gehörendes Transportprotein. ENTs kommen weit verbreitet in allen Organismen vor. Die Familie der

Einleitung

11

ENT Proteine aus Arabidopsis wurde nach heterologer Überexpression in Hefe und Xenopus-Oocyten

eingehend charakterisiert (Wormit et al. 2004, Li et al. 2003, Möhlmann et al. 2001). Für alle

analysierten ENT-Proteine wurde ein breites Substratspektrum gemessen, da sowohl Purine als auch

Pyrimidine über einen Protonen-gekoppelten Mechanismus transportiert werden. Hirose et al.

(2005) identifizierten ENT-Homologe in Oryza sativa und konnten zeigen, dass auch ein Transport

von Cytokininen durch diese Transportproteine vermittelt wird. Eine weitere Gruppe von

Transportern, die concentrative nucleoside transporters (CNTs), wurden in Säugetieren, Bakterien,

Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans identifiziert, scheinen in Pflanzen jedoch nicht

vorzukommen.

Welche Transportsysteme den intrazellulären Transport von Purin- und Pyrimidin-Metaboliten

übernehmen, ist bisher nur vereinzelt beschrieben worden. Für den Nukleosid-Transporter AtENT1

wurde eine Lokalisierung in der Vakuolenmembran nachgewiesen, was eine mögliche Funktion von

AtENT1 im Transport von beim RNA-Abbau entstehenden Ribosiden aus der Vakuole ins Cytoplasma

nahelegt (Möhlmann et al. 2010). Dem Brittle 1 Transportprotein aus Arabidopsis (AtBT1), einem

plastidären Nukleotid-Carrier, wurde von Kirchberger et al. (2008) eine Rolle beim Export von

Adenylaten aus der de novo Synthese vom Plastiden ins Cytoplasma zugeordnet.

1.1.6 Physiologische Rolle des Purin/Pyrimidin-Metabolismus bei Pflanzen

Neben der Beschreibung von Synthesewegen und Abbau- oder Recycling-Prozessen zielen einige

Studien auch auf die Aufklärung der physiologischen Bedeutung des Nukleotid-Metabolismus bei

Pflanzen (zusammengefasst von Stasolla et al. 2003).

Untersuchungen des Nukleotid-Metabolismus während der Embryogenese von Picea glauca zeigten,

dass während der Embryonalentwicklung sowohl die Stoffwechselwege des Recyclings als auch des

Katabolismus aktiv sind. Zu Beginn der Embryo-Entwicklung, die von einer ausgeprägten

Zellproliferation begleitet wird, werden große Mengen an Nukleotiden für die Nukleinsäure-Synthese

benötigt. Diese werden über Recycling-Reaktionen bereitgestellt. Mit fortschreitender Embryo-

Entwicklung nimmt die Zellproliferation zusammen mit der Recycling-Aktivität deutlich ab. Die

Reaktionen des Katabolismus scheinen hingegen keinen zeitlichen Änderungen zu unterliegen

(Ashihara et al. 2001).

Auch während der Keimung und dem damit verbundenen erhöhten Bedarf an Nukleotiden zur

Nukleinsäure-Synthese spielt der Purin- und Pyrimidin-Metabolismus eine entscheidende Rolle. Die

effektive Regulation von de novo Synthese, Recycling und Abbau von Purinen und Pyrimidinen stellt

daher einen kritischen Faktor dar. Das dem Purin-Metabolismus während der Keimung zugrunde

liegende Muster kann bei Phaseolus mungo laut Ashihara (1983) in drei Phasen unterschieden

werden: (1) Unmetabolische Phase, (2) Recycling Phase, (3) Phase der Ureid-Bildung. Zu Beginn der

Keimung, wenn das Gewebe noch nicht vollständig hydriert ist, ist der Purin-Metabolismus noch

nicht funktional und extern applizierte Purine werden kaum metabolisiert. Nach Hydratisierung des

Gewebes steigt der Bedarf an Nukleotiden, die über das Recycling von Ribosiden und Basen

gewonnen werden. Für Enzyme des Recyclings wie ADK und APRT konnte daher bei verschiedenen

Spezies während dieser Phase eine erhöhte Aktivität nachgewiesen werden (Stasolla et al. 2001,

Guranowski und Barankiewicz 1979, Price und Murray 1969). Während der anschließenden

Einleitung

12

metabolischen Phase werden dann hauptsächlich Ureide gebildet, die eine wichtige Stickstoff-Quelle

insbesondere während der frühen Phase der Keimung darstellen.

Einige Pflanzenspezies durchlaufen während ihres Vegetationszyklus Ruhephasen. Die Aufhebung

dieser Ruhephasen wird von einer erhöhten Recycling-Aktivität für Adenosin und Adenin begleitet.

Nach externer Applikation von Adenosin konnten dementsprechend hohe Konzentrationen an

Nukleotiden wie ATP, GTP gemessen werden (Robert et al. 1997).

In wachsenden Kartoffelknollen konnte eine hohe de novo Synthese-Aktivität für Purin- und

Pyrimidin-Nukleotide festgestellt werden. Parallel dazu wurde eine hohe Recycling-Aktivität

vermutlich aufgrund des schnellen turnovers von Nukleotiden gemessen. De novo Synthese und

Recycling tragen demnach beide dazu bei, genügend Bausteine zur Synthese von

Zellwandbestandteilen und Stärke sowie einen ausreichenden Energievorrat in Form von ATP

bereitzustellen (Katahira und Ashihara 2002).

Der Einfluss von Salzstress auf die Nukleotid-Biosynthese wurde von Ashihara et al. (2003)

beschrieben: Die Autoren untersuchten den Adenosin-Stoffwechsel bei einigen Mangrovearten und

konnten eine hohe Adenosin-Recycling-Aktivität als Grundlage für die ATP-Regeneration nachweisen.

Generell ist bekannt, dass hohe Salzkonzentrationen einen Einfluss auf den Nukleotid-Stoffwechsel

haben: Salzstress führt zu einer Reduktion des Gesamtpools an Nukleotiden, der endogene ATP-Pool

wird hingegen erhöht. Große Mengen an ATP werden benötigt, um die aufgenommenen Salze zu

entfernen oder - zusammen mit anderen als kompatible Solute fungierenden Substanzen - in die

Vakuole zu transportieren. Weretilnyk et al. (2001) beobachteten einen weiteren Einfluss von hohen

Salzkonzentrationen auf den Purin-Stoffwechsel: Eine Aktivierung von ADK und Adenosin-

Ribohydrolase erfolgte als Antwort auf Salzstress bei Spinacia oleracea und Beta vulgaris parallel mit

der Synthese von Glycinbetain als ein kompatibles Solut. Die Glycinbetain-Synthese beinhaltet drei

Methylierungsschritte, die S-Adenosylmethionin als Methyldonor verwenden. Die Entfernung von

Adenosin scheint zwingend nötig für die Aufrechterhaltung der SAM-abhängigen Methyltransferase-

Aktivität und damit der Glycinbetain-Synthese zu sein.

Auch wenn das Verständnis des Nukleotid-Metabolismus bei Pflanzen stetig zunimmt, sind nach wie

vor viele Zusammenhänge unklar. Messungen der de novo Synthese- und Recycling-Raten zusammen

mit Genexpressionstudien der beteiligten Enzyme könnten neue Einblicke in die Regulation des

Nukleotid-Metabolismus während der pflanzlichen Entwicklung geben. Darüber hinaus wären

Bestimmungen der Gehalte von Nukleotiden, Ribosiden und freien Basen und des Fluxes zwischen

den verschiedenen Pools von Interesse, um diese bei verschiedenen Spezies, in unterschiedlichen

Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Umweltbedingungen zu vergleichen. Versuche zur

Erstellung eines Purin- und Pyrimidin-Profils des Laubmooses Physcomitrella patens wurden im

Rahmen dieser Arbeit realisiert. Außerdem wurde der Einfluss von Ribohydrolasen, die eine

Schlüsselposition am Übergang von Katabolismus und Recycling von Purinen und Pyrimidinen

besitzen, auf das Purin- und Pyrimidin-Profil untersucht.

1.2 Ribohydrolasen

Wie in den vorherigen Abschnitten beschrieben sind Pflanzen in der Lage, Riboside und Basen

entweder zu recyceln oder abzubauen. Eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Ratio zwischen

Ribosid-Abbau und -Recycling wird dabei von den im Zentrum dieser Arbeit stehenden

Einleitung

13

Ribohydrolasen (RHs) eingenommen. In der Literatur finden sich verschiedene Bezeichnungen für

diese Enzymklasse. In einer aktuellen Publikation von Jung et al. (2011) wird der Begriff Nukleosid-

Hydrolase (NSH) verwendet, in der vorliegenden Arbeit werden diese Enzyme mit dem Synonym

Ribohydrolase bezeichnet. RHs katalysieren die hydrolytische Spaltung von Ribosiden zu den jeweils

korrespondierenden Basen und Ribose (EC 3.2.2.x, Abb. 1.2).

Abb. 1.2 Reaktionsmechanismus von Ribohydrolasen (RH, EC 3.2.2.x) am Beispiel von Inosin. Durch Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung wird das Ribosid Inosin in die Base Hypoxanthin und Ribose gespalten.

RHs kommen weit verbreitet in der Natur vor: Sie wurden in Bakterien (Petersen und Møller 2001),

Hefe (Kurtz et al. 2002), Pilzen, Protozoen (Parkin 1996), Pflanzen (Jung et al. 2009), Insekten (Ribeiro

und Valenzuela 2003) und Mesozoen (Versées et al. 2003) nachgewiesen. Das meiste Verständnis

über RHs stammt aus Arbeiten über parasitische Protozoen (Shi et al. 1999, Degano et al. 1996,

Parkin 1996). Protozoen wie z.B. die humanpathogenen Vertreter Trypanosoma brucei, Crithidia

fasciculata und Leishmania major sind obligat auf die Aktivität einer RH angewiesen, da sie die nötige

enzymatische Ausstattung zur de novo Synthese von Purinen nicht besitzen (Parkin et al. 1991). Die

aus dem Wirtsorganismus importierten Purin-Derivate werden daher zur Versorgung des Nukleotid-

Stoffwechsels dem Recycling zugeführt. Aus diesem Grund können RHs in Protozoen als potentielle

Targets für die Chemotherapie genutzt werden und die entsprechenden Enzyme wurden daher

eingehend hinsichtlich ihrer Struktur und Substratspezifität untersucht. Alle bisher beschriebenen

RHs besitzen ein N-terminales Sequenzmotiv bestehend aus vier Aspartat-Resten (DXDXXXDD), das

als ein wichtiges Kennzeichen für RH-Aktivität gilt (Versées und Steyaert 2003). Kristallstrukturen

wurden beispielsweise für RHs aus den Protisten C. fasciculata und L. major sowie dem Bakterium

E. coli aufgeklärt (Giabbai und Degano 2004, Shi et al. 1999, Degano et al. 1996). Außerdem wurde

eine Uridin-RH aus Saccharomyces cerevisiae hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer Funktion im

Nukleotid-Recycling charakterisiert (Kurtz et al. 2002, Magni et al. 1975).

Da RHs bei Säugetieren nicht vorkommen, erfolgt der Abbau der Riboside hier über Nukleosid-

Phosphorylasen, wobei neben der freien Base zusätzlich Ribose-1-phosphat entsteht. Unklarheit

besteht hinsichtlich des Vorkommens von Nukleosid-Phosphorylasen bei Pflanzen. Eine der wenigen

Veröffentlichungen über Nukleosid-Phosphorylasen bei Pflanzen stammt von Chen und Petschow

(1978) und beschreibt Phosphorylase-Aktivität bei Weizenkeimlingen in Syntheserichtung anhand der

Bildung von Adenosin bzw. dem Cytokinin N6-(Δ2-Isopentenyl)adenosin (iPR) aus den entsprechenden

Basen. Der Großteil der Publikationen zum Purin-Metabolismus schließt jedoch die Existenz von

Nukleosid-Phosphorylasen bei Pflanzen aus oder schreibt ihnen nur eine untergeordnete Bedeutung

zu (Deng und Ashihara 2010, Katahira und Ashihara 2006, Stasolla et al. 2003).

Einleitung

14

Zu RHs bei Pflanzen sind bisher nur wenige Details bekannt. Die Aktivität dieser Enzyme wurde

bereits für zahlreiche Pflanzenspezies nachgewiesen. Hierzu zählen beispielsweise Weizen (Chen und

Kristopeit 1981), Gerste (Guranowski und Schneider 1977), Gelbe Lupine (Abusamhadneh et al.

2000), Jerusalem-Artischocke (Le Floc'h und Lafleuriel 1981), Tomate (Burch und Stuchbury 1986),

Tee (Imagawa et al. 1979) und Kaffee (Campos et al. 2005). Die in diesen Arbeiten beschriebenen

Enzyme unterschieden sich zumeist hinsichtlich ihrer Substratspezifität. Die physiologische

Bedeutung von RHs für den pflanzlichen Stoffwechsel konnte bislang nicht eindeutig aufgeklärt

werden. Durch die Beteiligung am Purin-Recycling wird RHs unter anderem eine Bedeutung bei der

Mobilisierung der Stickstoff-Reserven in katabolisch-aktiven Geweben wie Kotyledonen beigemessen

(Guranowski und Pawelkiewicz 1978). Leszczynska et al. (1984) wiesen für Hochleistungssorten

einiger Baumarten (z.B. Malus-Arten) sogar eine dreifach höhere Adenosin-RH-Aktivität als im

entsprechenden Wildtyp nach. Koshiishi et al. (2001) beschreiben einen neuen Synthese-Weg für

Caffein in Blättern von Camellia sinensis, bei dem eine in Chloroplasten lokalisierte Adenosin-RH eine

Rolle spielen soll.

Wie bereits erwähnt, kann der gesamte Purin-Metabolismus während der pflanzlichen Entwicklung

starken Änderungen unterworfen sein oder zwischen verschiedenen Gewebetypen stark variieren

(Deng und Ashihara 2010). In Übereinstimmung damit wurden auch veränderte RH-Aktivitäten

beobachtet: Burch und Stuchbury (1986) wiesen beispielsweise in den Wurzeln von Tomatenpflanzen

eine höhere RH-Aktivität als in Blättern nach. Leszczynska et al. (1984) konnten zeigen, dass bei

einigen Baumarten wie z.B. Fraxinus excelsior die Adenosin-RH-Aktivität während der vegetativen

Entwicklungsphase besonders hoch ist. Ferner wurden gesteigerte RH-Aktivitäten in Lupinensamen

während der Keimung nachgewiesen, was als eine Folge des erhöhten Bedarfs an Purinen,

insbesondere Adenin anzusehen ist. Im Gegensatz dazu wiesen getrocknete Samen keine Aktivität

dieses Enzyms auf (Guranowski und Pawelkiewicz 1978).

Eine Beteiligung von RHs am Hormon-Stoffwechsel der Pflanzen wurde ebenfalls mehrfach postuliert.

Bisherige Studien zur Substratspezifität zeigten, dass einige RHs in der Lage sind, neben Adenosin

auch Cytokinin-Riboside umzusetzen (Jung et al. 2009, Chen und Kristopeit 1981). Für ADK

beispielsweise wurde eine solche duale Funktion bereits nachgewiesen (Schwartzenberg et al. 2003,

Moffatt et al. 2000, Schwartzenberg et al. 1998).

Trotz der zentralen Bedeutung von RHs und den zahlreichen Nachweisen der Enzym-Aktivität in

Pflanzen, waren lange keine molekularen Daten zu pflanzlichen RHs bekannt. Erst kürzlich wurde

erstmals die zugehörige RH-Genfamilie aus Arabidopsis beschrieben und charakterisiert (Jung et al.

2011, 2009). Neben der Charakterisierung von rekombinantem RH Protein, wurden auch

entsprechende Mutanten analysiert, um Einblicke in die physiologische Bedeutung dieser Enzyme zu

erhalten. Die drei identifizierten Isoformen scheinen in Arabidopsis unterschiedliche Funktionen zu

übernehmen: Während AtNSH1 die RH-Hauptaktivität im Purin- und Pyrimidin-Katabolismus

darstellt, spielt AtNSH2 eine wichtige Rolle in der späten Phase der Seneszenz und ist an der

Hydrolyse von Inosin beteiligt. AtNSH3 hingegen wurde als eine extrazelluläre, Purin-spezifische RH

identifiziert und ist vermutlich in den extrazellulären Abbau von Nukleotiden involviert und scheint

außerdem eine Rolle bei der Pathogenantwort zu spielen. Um die physiologische Rolle von RHs unter

evolutiven Gesichtspunkten zu charakterisieren, wurde in der vorliegenden Arbeit eine RH-

Einleitung

15

Genfamilie in der basalen Landpflanze Physcomitrella patens identifiziert und funktionell

beschrieben.

1.3 Cytokinine

Wie im vorherigen Kapitel erwähnt, wurde auch der Umsatz von Cytokinin-Ribosiden durch RHs

beschrieben (1.2). Cytokinine sind eine Klasse von Phytohormonen die eine Schlüsselrolle bei der

Regulation der Differenzierung von Pflanzenzellen spielen und außerdem zahlreiche Wachstums- und

Entwicklungsprozesse bei Pflanzen kontrollieren (Sakakibara 2006). Beeinflusste Prozesse und

Phänomene sind die Zellteilung, die Apikaldominanz und die Verzögerung von Seneszenz, das

Wurzelwachstum sowie die Etablierung von Sink/Source-Geweben. Cytokinine sind Adenin-Derivate,

bei denen das N6-Stickstoffatom einen unterschiedlich modifizierten Substituenten trägt. Natürlich

vorkommend sind Isoprenoid- und aromatische Cytokinine, wobei in zahlreichen Pflanzen

vornehmlich Isoprenoid-Cytokinine zu finden sind. Hierzu zählen N6-(Δ2-Isopentenyl)adenin (iP),

trans-Zeatin (tZ), cis-Zeatin (cZ) und Dihydrozeatin (DHZ). Die Verteilung der Cytokinin-Formen kann

je nach Pflanzenart, Gewebe oder Entwicklungsstufe variieren. Für das Laubmoos Physcomitrella

wurden Cytokinine des cZ- und iP-Typs als vorherrschend identifiziert (Schwartzenberg et al. 2007).

Aromatische Cytokinine wie Benzyladenin (BA) oder ortho-Topolin (oT) wurden bisher nur in einigen

wenigen Pflanzenarten nachgewiesen (Strnad 1997).

Perzeption und Biosynthese von Cytokininen

Die Perzeption von Cytokininen erfolgt über einen, dem bakteriellen Zwei-Komponenten-System

ähnlichen Mechanismus, mittels sogenannter multi step phosphorelays. Der erste Cytokinin-Rezeptor

AHK4/CRE1 wurde von Inoue et al. (2001) in Arabidopsis identifiziert. Die mittlerweile bekannten

Cytokinin-Rezeptoren weisen eine hohe Ähnlichkeit auf und bestehen aus einer N-terminalen

Transmembrandomäne, einer Histidinkinase-Domäne, einer Receiver-Domäne sowie einer CHASE-

Domäne, an die die Cytokinine binden. Downstream von den Cytokinin-Rezeptoren sind

Histidinphosphotransferproteine (HPTs, Suzuki et al. 2002) sowie Cytokinin Response Regulatoren

(RRs) in die Signalweiterleitung involviert. Auch wenn das Verständnis zur Cytokinin-Perzeption in

den letzten Jahren enorm erweitert wurde, sind viele Mechanismen der Signaltransduktion noch

unverstanden (zusammengefasst von Pils und Heyl 2009, Heyl und Schmülling 2003).

Zur Biosynthese von Isoprenoid-Cytokininen sind zwei Wege beschrieben: Zum einen können

Cytokinine über den sogenannten Adenylat-Isopentenyltransferase-Weg synthetisiert werden und

zum anderen wurde ein tRNA-abhängiger Biosyntheseweg für Cytokinine beschrieben

(zusammengefasst von Sakakibara 2006). Die Biosynthese von aromatischen Cytokininen ist hingegen

in ihren Einzelheiten nicht verstanden.

Metabolisierung und Inaktivierung von Cytokininen

Die natürlich vorkommenden Cytokinine sind in Pflanzen neben der Basen-Form auch in Form ihrer

korrespondierenden Riboside, Nukleotide und Glykoside zu finden, wobei sich die genannten Formen

hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität unterscheiden. Ein weiterer Einfluss auf die Aktivität geht von

der Art der Seitenkette aus. Allgemein gelten die Basen als die physiologisch aktivsten Formen. Die

Regulierung der Level biologisch aktiver Cytokinine in Anpassung an externe und interne Faktoren

trägt damit maßgeblich zur Steuerung der pflanzlichen Entwicklung bei.

Einleitung

16

Bei der Inaktivierung von Cytokininen werden hauptsächlich zwei Wege unterschieden: Während die

reversible Inaktivierung von Cytokininen durch Umwandlung zu bestimmten Glykosiden erfolgt, kann

auch eine irreversible Inaktivierung durch Abspaltung der Seitenkette durch

Cytokininoxidasen/dehydrogenasen (CKX) erfolgen (Sakakibara 2007). Als Hauptsubstrate der CKX

wurden die Cytokinin-Basen und -Riboside des iP- und Z-Typs identifiziert, wobei die

Substratspezifität je nach Isoform variieren kann (Galuszka et al. 2007).

Interkonversionsreaktionen werden durch Enzyme des Purin-Stoffwechsels katalysiert. Diese

besitzen zwar eine höhere Affinität für die entsprechenden Adenin-Metabolite, können aber auch

Cytokinine als Adenin-Derivate umsetzen. Über 5‘-Nukleotidasen wird die Umwandlung der

Cytokinin-Monophosphate in Riboside katalysiert; Adenosinkinasen katalysieren die umgekehrte

Reaktion. Adeninphosphoribosyltransferasen phosphoribosylieren die Basen direkt zu den

entsprechenden Nukleotiden. Außerdem wurde aus Weizen eine Phosphorlyase isoliert, die die Base

ins Ribosid überführt (Chen und Petschow 1978). Die generelle Existenz dieses Enzymes in Pflanzen

ist allerdings umstritten.

Für die „Aktivierung“ von Cytokininen, d.h. die Bildung der physiologisch aktiveren Basen sind bisher

zwei Wege für Pflanzen beschrieben worden: Zum einen kann die Bildung von Cytokinin-Basen aus

den entsprechenden Ribosiden erfolgen. Dieser Weg wird vermutlich über RHs katalysiert, die in

einem vorherigen Abschnitt bereits beschrieben wurden (1.2). Aktivität von RHs an Cytokininen

wurde bereits nachgewiesen (z.B. Jung et al. 2009). Inwieweit dieser Weg in planta eine Rolle spielt,

wurde bisher noch nicht untersucht. Ob möglicherweise bei Physcomitrella RHs in den Cytokinin-

Stoffwechsel involviert sind, soll im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Neben der Bildung der

Cytokinin-Basen aus -Ribosiden via RH wurde in neueren Publikationen eine „Cytokinin-Aktivierung“

durch die direkte Umwandlung des Nukleotids in die aktive Basen-Form via 5´-Monophosphat-

Phosphoribohydrolase (LOG) beschrieben (Kurakawa et al. 2007). Für Arabidopsis konnte von Kuroha

et al. (2009) anhand von Überexpressionsmutanten gezeigt werden, dass der von LOG-katalysierte

Weg zur Aktivierung von Cytokininen eine zentrale Rolle für Wachstum und Entwicklung bei

Arabidopsis spielt. Die Gewichtung der beiden Cytokinin-Aktivierungswege über RHs und LOGs in

planta ist bisher noch nicht eindeutig geklärt.

1.4 Der Modellorganismus Physcomitrella patens

Der in dieser Arbeit verwendete Modellorganismus, das Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.)

B.S.G., gehört zur Familie der Funariaceae. Es handelt sich um einen monözischen, selbst-fertilen

Organismus, der überwiegend in der nördlichen Hemisphäre auf nährstoffreichen Böden, bevorzugt

auf trockengefallenen, offenen Flächen vorkommt (Frahm und Frey 2007). Vereinzelt wurden auch

Vorkommen auf der Südhalbkugel beschrieben (http://www.cosmoss.org/ ecomap.content).

Entwicklungszyklus

Physcomitrella zeigt den für Laubmoose typischen heteromorphen, heterophasischen

Generationswechsel, bei dem die haploide Phase dominiert (Cove 2005, 2000). Der

Entwicklungszyklus beginnt mit der Auskeimung der haploiden Spore in Anwesenheit von Licht und

Wasser (Abb. 1.3). Diese wächst unter apikaler Zellteilung zum zweidimensionalen fädigen

Protonema aus, das aus zwei Zelltypen besteht, dem Chloronema und dem Caulonema. Die

Chloronemazellen enthalten zahlreiche Chloroplasten und besitzen senkrecht zur Achse stehende

Einleitung

17

Zellwände. Subapikale Chloronemazellen können sich teilen und Chloronemaverzweigungen bilden

oder es kann unter Einfluss von Auxin (Ashton et al. 1979) das Caulonema entstehen. Die Zellen des

Caulonemas sind im Vergleich zum Chloronema länger und dünner, enthalten wenige Chloroplasten

und die Zellzwischenwände sind schräg zur Achse ausgerichtet. Unter Stress-Bedingungen oder durch

die Applikation von ABA können weitere Zelltypen entstehen, die Brachyzyten und Tmema-Zellen.

Abb. 1.3 Heteromorpher, heterophasischer Lebenszyklus von Physcomitrella patens: A: Auskeimende Spore (1n); B: Protonema mit Chloronemazellen; C: Protonema mit Caulonemazellen; D: Gametophor; E: Archegonien (lange Pfeile) und Antheridien (kurze Pfeile); F: Sporophyt (2n). Aus Prigge und Bezanilla (2010).

Bei den Brachyzyten handelt es sich um vegetative Dauersporen, die mit Hilfe der Tmema-Zellen

verbreitet werden. Letztere dienen als Sollbruchstellen zur Fraktionierung des Chloronemafadens

(Decker et al. 2006). Unter günstigen Umweltbedingungen und unter Einwirkungen von Cytokininen

(Reski und Abel 1985) bilden sich dreidimensionale Knospen an Chloronema und Caulonema. Diese

entwickeln sich weiter zu den Gametophoren, die aus Phylloid, Cauloid und Rhizoiden bestehen. Die

Ausbildung der Gametophoren ist ebenfalls durch Cytokinine gesteuert. An der Spitze des

Gametophoren bilden sich dann die männlichen und weiblichen Geschlechtsorgane (Antheridien und

Archegonien). Nach Befruchtung der Eizelle entwickelt sich die Zygote zum diploiden Sporophyten, in

dem unter Meiose die haploiden Sporen gebildet werden, die den 8 bis 10 wöchigen Lebenszyklus

erneut einleiten.

Einleitung

18

Physcomitrellas Eigenschaften als Modellorganismus

Der gesamte Generationszyklus von Physcomitrella kann in vitro kontrolliert werden. Zur Kultivierung

werden Mineralmedien verwendet, die in der Regel weder Zucker noch andere organische

Komponenten enthalten. Eine Addition von Hormonen ist nicht nötig. Physcomitrella wächst sowohl

auf Fest- als auch in Flüssigmedium und zeichnet sich außerdem durch eine hohe

Regenerationsfähigkeit aus, die ebenfalls unabhängig von der Zugabe von Wachstumshormonen

erfolgt. Aufgrund dieser Eigenschaften kann Physcomitrella relativ einfach im Labor kultiviert

werden.

Die dominierende haploide Phase bei Physcomitrella macht den Organismus außerdem interessant

für genetische Studien, da sich rezessive Genmutationen direkt auf den Phänotyp auswirken, ohne

dass aufwändige Kreuzungen nötig sind (Cove et al. 2006). Die Einbringung rekombinanter DNA

erfolgt standardgemäß durch PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Schaefer et al.

1991). Transgene Physcomitrella Pflanzen können aber auch über biolistische Transformation

(Sawahel et al. 1992) oder Agrobacterium-vermittelte Transformation (Schaefer 2002) erzeugt

werden. Ein weiteres besonderes Charakteristikum von Physcomitrella und möglicherweise weiteren

Bryophyten ist, dass homologe Rekombination mit einer außerordentlich hohen Frequenz stattfindet,

wie sie bisher für keine andere Pflanze beschrieben wurde (Schaefer 2001). Dies erlaubt das gezielte

Ausschalten bzw. Regulieren von Genen und die Herstellung von entsprechenden knockout Pflanzen

(gene targeting).

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einzelne Gene oder Genfamilien auch über RNA Interferenz

(RNAi) ausgeschaltet oder herunter reguliert werden können (Bezanilla et al. 2003). Khraiwesh et al.

(2008) konnten nachweisen, dass eine Regulation der Genexpression ebenfalls über die Verwendung

artifizieller microRNAs (amiRNAs) erfolgen kann, womit eine weitere Technik zur Modulation von

Genexpression zur Verfügung steht.

Das haploide Physcomitrella Genom wurde als eines der ersten beiden von Nicht-Samenpflanzen

vollständig sequenziert und veröffentlicht (Rensing et al. 2008). Es umfasst 480 Mbp, die auf 27

Chromosomen verteilt liegen. Die Sequenz beinhaltet 35938 vorhergesagte und annotierte

Genmodelle (Rensing et al. 2008). Außerdem steht eine EST-Datenbank zur Verfügung, die mehr als

95 % des Transkriptoms umfasst (www.cosmoss.org, Rensing et al. 2002). Auch die Genome von

Mitochondrien und Plastiden wurden sequenziert (Terasawa et al. 2007, Sugirua et al. 2003).

Analysen des Genoms und der EST-Kollektionen zeigten, dass vor 45 Millionen Jahren mindestens

eine Duplikation des Genoms erfolgte, Physcomitrella somit eine paleopolyploide Spezies darstellt

(Rensing et al. 2008, 2007).

Als vor etwa 450 Millionen Jahren die Entwicklung der Landpflanzen begann, waren die Bryophyten

die erste Gruppierung, die sich vor der Entwicklung zu den Gefäßpflanzen abspaltete (Rensing et al.

2008). Der Übergang vom Wasser- zum Landleben führte auf genomischer Ebene zum Verlust von

Genen, die mit der aquatischen Lebensweise in Verbindung stehen. Gleichzeitig wurden neue Gene

erworben, die die Toleranz gegenüber abiotischem Stress wie Hitze, Kälte und Trockenheit sowie die

Entwicklung von Signalwegen zur Koordination von zellulären, physiologischen und regulatorischen

Prozessen ermöglichen (Lang et al. 2008). Der Metabolismus von Physcomitrella stellt somit mit

seiner Komplexität eine Besonderheit dar und enthält viele Stoffwechselwege, die in Samenpflanzen

Einleitung

19

nicht vorhanden sind (Rensing et al. 2007, Lang et al. 2005). Aufgrund der phylogenetischen Stellung

wird Physcomitrella auch genutzt, um evolutionäre Veränderungen, die bei dem Übergang vom

Wasser- zum Landleben erfolgten, zu untersuchen. Durch das Vorliegen des vollständig

sequenzierten Physcomitrella Genoms können vergleichende Studien unter Einbeziehung der

genomischen Daten von Samenpflanzen wie Arabidopsis, dem Moosfarn Selaginella moellendorffii

und Grünalgen wie Chlamydomonas reinhardtii vorgenommen werden, um die evolutiven Prozesse

während der Entwicklung der Landpflanzen zu rekonstruieren.

Aufgrund der zuvor genannten Eigenschaften ist das Laubmoos Physcomitrella mittlerweile zu einem

gut etablierten Modellorganismus geworden, an dem evolutionäre Aspekte der pflanzlichen

Entwicklung ebenso wie physiologische und metabolische Prozesse untersucht werden.

1.5 Zielsetzung der Arbeit

Wie bereits erwähnt liegen bisher nur in geringem Umfang Daten zu pflanzlichen Ribohydrolasen vor.

Auf molekularer Ebene wurde bisher nur eine Genfamilie von RHs in der Samenpflanze Arabidopsis

beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die RH-Genfamilie aus Physcomitrella identifiziert und

eingehend charakterisiert. Hierfür wurden molekularbiologische, biochemische und physiologische

Aspekte bearbeitet, die zur Beantwortung der folgenden Fragen dienen sollten:

- Wie ist die Genfamilie der RHs bei Physcomitrella beschaffen und wie unterscheidet sie sich

von der Genfamilie aus Arabidopsis?

- In welche Gruppe der RHs gliedern sich RHs aus Physcomitrella ein?

- Welches sind die biochemischen Eigenschaften der RHs aus Physcomitrella und in wieweit

unterscheiden sie sich voneinander?

- Welche Purine und Pyrimidine kommen bei Physcomitrella vor? Wie sieht das Profil des

Purin-Stoffwechsels bei Physcomitrella aus und mit welchen Methoden kann dieser erfasst

werden?

- Welche Folgen hat der knockout eines RH-Gens auf den Purin- und Cytokinin-Stoffwechsel

sowie den Ablauf von Entwicklungsprozessen?

Die erhaltenen Ergebnisse sollen einen Beitrag zur Charakterisierung der bisher kaum beschriebenen

Gruppe der RHs leisten und Rückschlüsse auf mögliche Funktionen von RHs ermöglichen.

Material und Methoden

20

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien

Chemikalien wurden, soweit nicht anders angeführt, von den Firmen Fluka (Neu-Ulm, D), Merck

(Darmstadt, D), Roth (Karlsruhe, D) Serva (Heidelberg, D) und Sigma-Aldrich (Taufkirchen, D)

bezogen.

Folgende Isotopen-markierte Substanzen wurden in dieser Arbeit verwendet:

- Tritium-markiert: [2,8-3H]-Adenosin (Spezifische Aktivität: 15 Ci/mmol), [2,8-3H]-Inosin (Spezifische

Aktivität: 29,3 Ci/mmol) (beide Hartmann Analytik, Braunschweig, D) und N6-Isopentenyl[2-3H]adenosin (Spezifische Aktivität: 32 Ci/mmol) (Institut für Experimentelle Botanik, Isotopen Labor,

Prag, CZ).

- Deuterium-markiert: [D3]S-Sulfocystein (S-Sulfo-DL-Cystein-2,3,3-D3, C/D/N Isotopen über Dr.

Ehrenstorfer, Augsburg, D) und [D4]Thymin ([Methyl-D3,6-D1]-Thymin, Sigma-Aldrich).

- 15N-markiert: [15N5]Desoxyadenosin, [15N2]Harnsäure ([1,3-15N]-Harnsäure), [15N4]Inosin und

[15N2]Orotsäure ([1,3-15N2]-Orotsäure, alle von Cambridge Isotope Laboratories über EURISO-TOP,

Saarbrücken, D), [15N2]Uracil ([1,3-15N]-Uracil, Sigma-Aldrich).

Alle verwendeten Lösungen wurden mit MilliQ Wasser (Millipore, Schwarbach, D) angesetzt. Für

RNA-Experimente verwendete Lösungen wurden mit DEPC-behandeltem Wasser (Roth) angesetzt.

Die Sterilisierung aller Lösungen erfolgte für 20 min bei 121 °C, 1,2 bar. Alternativ erfolgte die

Sterilisierung über einen Filter mit 0,22 µM Porengröße (Volumen < 50 ml, Roth; Volumen > 50 ml

Nalgene, Rochester, USA). Der pH-Wert aller Lösungen wurde mit dem pH-Meter 211 der Firma

Hanna Instruments (Kehl am Rhein, D) eingestellt.

2.2 Pflanzenmaterial

In dieser Arbeit wurde Pflanzenmaterial des Laubmooses Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

benutzt. Der verwendete Wildtypstamm, WTL6, stammt aus der 6. Sporen-Generation des

ursprünglich in Gransden Wood, Huntingdonshire (GB) von H.L.K Whitehouse 1968 gesammelten

Stammes 16/14.

2.2.1 Physcomitrella Kultivierung unter Standardbedingungen

Zur in vitro Kultivierung von Physcomitrella wurden die folgenden Nährmedien verwendet:

A’BCD(N)TV, flüssig (modifiziert nach Wang et al. 1980) A‘: 59 mg/l Ca(NO3)2 B: 250 mg/l MgSO4*7H2O C: 250 mg/l KH2PO4 D: 1040 mg/l KNO3 (N: 920 mg /l di-NH4-Tartrat) T: 1 ml/l TES Lösung (siehe unten) V: 1 ml/l je Vitamin (siehe unten) 12,5 mg/l FeSO4*7H2O Die pH-Einstellung auf 6,5 erfolgte mit KOH.

http://www.cdnisotopes.com/


21

ABC(N)TV, fest (modifiziert nach Knight et al. 1988) A: 1118 mg/l Ca(NO3)2*4H2O B: 250 mg/l MgSO4*7H2O C: 250 mg/l KH2PO4 (N: 920 mg /l di-NH4-Tartrat) T: 1 ml/l TES Lösung (siehe unten) V: 1 ml/l je Vitamin (siehe unten) 12,5 mg/l FeSO4*7H2O 13 g/l Agar Die pH-Einstellung auf 6,5 erfolgte mit KOH. Die Zugabe von di-Ammoniumtartrat erfolgte nur in solchen Experimenten, wo keine Ausdifferenzierung des Gewebes gewünscht wurde. TES (Spurenelement-Stammlösung) (1000x) (modifiziert nach Ashton und Cove 1977) H3BO3 614 mg/l MnCl2*4H2O 389 mg/l NiCl2*6H2O 59 mg/l CoCl2*6H2O 55 mg/l CuSO4*5H2O 55 mg/l ZnSO4*7H2O 55 mg/l Al(SO4)3*18H2O 38,6 mg/l KBr 28 mg/l KI 28 mg/l LiCl 28 mg/l SnCl2*2H2O 28 mg/l Vitamin-Stammlösungen (1000x) p-Aminobenzoesäure 0,25 g/l Nicotinsäure 1 g/l Thiamin/HCl 5 g/l

Physcomitrella wurde in Klimaschränken (RUMED Typ 1602+, Rubarth Apparate, Laatzen) bei

25 ±1 °C unter Weißlicht (Leuchtstoffröhren Philips TLM 18W/840) mit einer Beleuchtungsstärke von

ca. 50 µmol m-2 s-1 unter Langtag-Bedingungen (16 h Licht, 8 h Dunkel) kultiviert.

Sterile Flüssigkulturen wurden in A’BCD(N)TV-Medium in 500 ml oder 1 l-Flaschen, die mit einem mit

Aluminiumfolie umwickelten Wattestopfen abgedichtet waren, kultiviert. Die Belüftung und

Durchmischung der Kulturen erfolgte über sterile, wasserdampfgesättigte Druckluft (ca. 600 ml/min),

die über einen Glasstab in der Mitte des Wattestopfens, verbunden mit einen Silikonschlauch mit

Filter (0,22 µm Porengröße, Roth), in die Kulturen gepumpt wurde. Zur Aufrechterhaltung von

optimalen Wachstumsbedingungen, wurden die Kulturen alle 7 bis 10 Tage mit einem

Dispergiergerät zerkleinert (Ultra-Turrax T25 basic, Typ S 25 N-18 G, IKA, Staufen, D). Das Gewebe

wurde anschließend über ein Nylonsieb mit einer Porengröße von 50-100 µm (Wilson Siebe,

Nottingham, GB) vom Medium getrennt, gründlich mit Medium gewaschen und mit frischem

Kulturmedium versetzt.


22

Zur sterilen Kultivierung von Physcomitrella auf Festmedium wurden kleinere Gewebemengen aus

Flüssigkulturen auf Agarplatten mit ABC(N)TV-Medium transferiert.

Für die sterile Anzucht von Flüssigkulturen wurde, ausgehend von einer auf Festmedium

gewachsenen Kultur, Gewebe in frisches A’BCD(N)TV-Medium überführt, mechanisch mit einem

Dispergiergerät zerkleinert und in CultiFlasks® (Sartorius AG, Göttingen, D) oder 100 ml

Erlenmeyerkolben verschlossen mit einem Silikonstopfen, überführt. Zur Durchmischung wurden die

Kulturen im Klimaschrank auf einem Schüttler bei ca. 100 rpm gehalten.

Die Sterilität der Flüssigkulturen wurde regelmäßig überprüft, indem kleine Mengen einer

Flüssigkultur auf LB-Agarplatten (2.3.9) appliziert und dann bei 22 °C für 3 bis 5 Tage inkubiert

wurden.

2.2.2 Kultivierungsbedingungen zur Bestimmung endogener Purine und Pyrimidine

Zur Bestimmung von endogenen Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp sowie den Transformanten

PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 wurde das Gewebe zunächst unter

Standardbedingungen (2.2.1) in A‘BCDNTV-Medium bei 25 °C herangezogen. Drei Tage vor

Versuchsbeginn wurde die Kultur in A’BCDTV-Medium überführt. Für den Start des Versuchs wurde

das Gewebe nochmals mit reichlich A’BCDTV-Medium gewaschen (ca. 400 ml), um im Medium

vorhandene Purine und Pyrimidine zu entfernen. Die angesetzten Flüssigkulturen, bestehend aus 5 g

Gewebe (FG) in 1 l frischem A’BCDTV-Medium, wurden bei 25 °C unter Standardbedingungen (2.2.1)

für 21 Tage kultiviert. Die Probennahme erfolgte am Tag des Versuchsstarts (T0) und nach 21 Tagen

(T21). Bei jeder Probenname wurde ein Aliquot von ca. 100 ml Kultur für die Purin/Pyrimidin-

Bestimmung abgewogen. Zur Trennung von Medium und Gewebe wurden die Proben über zwei

Siebe (100 µm und 50 µm, Wilson-Siebe) filtriert. Das Gewebe wurde wie unter 2.2.3 beschrieben

getrocknet und bis zur Gefriertrocknung bei -20 °C gelagert.

Die Gefriertrocknung der Gewebeproben erfolgte in der Alpha I-6 Anlage (Christ, Osterode am Harz,

D). Nach der vollständigen Trocknung des Gewebes wurde das Gewicht bestimmt. Die lyophilisierten

Proben wurden bis zu ihrer weiteren Aufarbeitung bei -20 °C gelagert. Zur Messung endogener

Gehalte ausgewählter Purine und Pyrimidine mittels LC-MS/MS wurden die Proben zunächst mit

Bieleski-Reagenz extrahiert (2.2.4) und wie in 2.2.5 beschrieben weiter behandelt.

2.2.3 Gewebeernte aus Physcomitrella Flüssigkulturen und Gewichtsbestimmung

Das Pflanzenmaterial wurde durch Filtration über ein Nylonsieb (Wilson-Siebe) mit 50-100 µm

Maschenweite geerntet. Anschließend erfolgte die Entfernung des Mediums über eine

Filtrationseinheit mit Celluloseacetat-Membranfiltern (0,45 µm Porengröße, Whatmann, Dassel, D)

angeschlossen an eine Wasserstrahlpumpe. Das Gewicht wurde mittels Analysenwaage bestimmt.

Zur Herstellung von Proteinextrakten (2.4.1) erfolgte die Weiterverarbeitung des Gewebes direkt im

Anschluss. Zur RNA-Extraktion verwendetes Gewebe (2.3.14) wurde vor der Weiterverarbeitung

zunächst in flüssigem Stickstoff gefroren.


23

2.2.4 Extraktion intrazellulärer Purin-, Pyrimidin- und Cytokinin-Metabolite mit Bieleski-

Reagenz

Der Aufschluss von Gewebeproben zur Extraktion von Purinen, Pyrimidinen und Cytokininen erfolgte

mit Bieleski-Reagenz (Bieleski 1964). Hierfür wurde das zu analysierende Gewebe in ein 1,5 ml

Reaktionsgefäß mit 500 µl Bieleski-Reagenz (zur Fixierung der Metabolite und Inhibierung von

Phosphatasen) sowie optional 50 µg Seesand überführt. Mit einem Plastikpistill (schuett-biotec,

Göttingen, D) wurde das Gewebe mechanisch zerkleinert und anschließend nochmals mit 500 µl

Bieleski-Reagenz versetzt. Alternativ wurden zum Gewebeaufschluss 3-5 Glasperlen (Ø 1,7-2 mm)

zugefügt und die Proben im FastPrep FP120 Homogenizer (Savant Instruments, New York, USA) für

3 x 20 s bei einer Intensität von 5 homogenisiert. Zur vollständigen Extraktion wurden die Proben

anschließend für mindestens 12 Stunden bei -20 °C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert.

Die in Bieleski-Reagenz gelagerten Gewebeproben wurden zunächst zur Abtrennung von Gewebe-

Resten bei 15.000 x g für 10 min zentrifugiert (Biofuge pico, Heraeus über Kendro, Hanau, D). Das

Pellet wurde 1-2 Mal mit 500 µl Bieleski-Reagenz re-extrahiert und die vereinigten Überstände mit

ca. 600 µl Wasser versetzt. Nach erneuter Zentrifugation, 15.000 x g, 10 min, entstand eine

Phasentrennung. Der wässrige Überstand, der die zu untersuchenden Metabolite enthält, wurde zur

weiteren Aufarbeitung eingesetzt (2.2.5 für LC-MS/MS-basierte Messungen bzw. 2.2.8.1 für HPLC-

basierte Messungen).

Bieleski-Reagenz nach Bieleski (1964), modifiziert nach Schwartzenberg et al. 2003 Methanol:Chloroform:Ameisensäure:Wasser, 12:5:1:2 (v/v) vor Verwendung gut mischen, haltbar max. 3 Monate (-20 °C)

2.2.5 Herstellung von Gewebeextrakten für die LC-MS/MS-basierte Purin/Pyrimidin-

Analytik

Die Gewebeproben wurden nach ihrer vollständigen Trocknung zunächst in Bieleski-Reagenz

aufgeschlossen (2.2.4). Um mögliche Verluste bei der Extraktion erfassen zu können, wurde den

Proben vor der Extraktion neben Bieleski-Reagenz ein interner Standard zugefügt (100 µl je Probe).

Dieser enthielt [15N5]Desoxyadenosin, [15N4]Inosin, [15N2]Orotsäure, [D3]S-Sulfocystein, [D4]Thymin

und [15N2]Uracil (jeweils 5 µM) sowie [15N2]Harnsäure (20 µM) (vgl. 2.1). Zur Reduktion von

Matrixeffekten durch im Extrakt vorhandene Sekundärstoffe, wurde der nach Extraktion mit Bieleski-

Reagenz erhaltene wässrige Überstand weiter aufgearbeitet. Zunächst wurde der zu reinigende

Extrakt über eine mit PVPP gefüllte Säule (aufgeschwemmt in 0,1 M Essigsäure/Natriumacetatpuffer

pH 5,6; Säulenvolumen ca. 2 ml) gegeben. Der Durchfluss wurde auf einen Ethanolgehalt von 50 %

gebracht und über eine mit 50 % Ethanol vorequilibrierte C18-Säule (Sep-Pak® Plus C18 Säulen, 55-

105 µm, Waters, Eschborn) gegeben. Nach vollständiger Trocknung im Rotations-

Vakuumkonzentrator (Speed Vac SC110, Savant Instruments, New York, USA) wurden die Proben bis

zur LC-MS/MS-Analytik (2.7) bei 4 °C gelagert.

0,1 M Essigsäure/Natriumacetatpuffer, pH 5,6 48 ml/l Essigsäure (0,2 M) 452 ml/l Natriumacetat (0,2 M)


24

2.2.6 Protoplasten-Isolierung aus Physcomitrella Flüssigkulturen

Pflanzenmaterial (4-5 g) einer 4-5 Tage alten A’BCDNTV-Flüssigkultur wurde über ein Nylonsieb mit

100 µm Maschenweite (Wilson-Siebe) geerntet, mit 0,5 M Mannitol gründlich gewaschen und in eine

Petrischale (Ø 9 cm) überführt. Zum Zellwand-Verdau wurden 20 ml einer steril filtrierten

0,5 % Driselase Lösung zugegeben und für 2 Stunden im Dunklen unter vorsichtigem Schütteln

(100 rpm, IKA) inkubiert. Zur Abtrennung der Protoplasten von noch unverdautem Material wurde

die Protoplastenlösung nacheinander über ein Nylonsieb mit 100 und 50 µm Porengröße filtriert und

im Anschluss bei 50 x g für 5 min zentrifugiert (Universal 16 A, Hettich, Tuttlingen, D). Die

sedimentierten Protoplasten wurden 2 Mal mit 0,5 M Mannitol gewaschen (25 und 5 ml). Zur

Bestimmung der Protoplastenanzahl wurde eine Neubauer-Zählkammer verwendet. Die Protoplasten

wurden dann erneut zentrifugiert und in einem entsprechenden Volumen von 3M Medium (2.2.7)

aufgenommen, dass eine Dichte von 1,2*106 Protoplasten/ml ergab.

0,5 M Mannitol Lösung 0,5 % Driselase Lösung (w/v) 550-560 mOs in 0,5 M Mannitol Lösung frisch angesetzt, steril filtriert

2.2.7 Transformation von Physcomitrella

Die Transformation von Physcomitrella Protoplasten erfolgte nach einer leicht modifizierten

Methode von Schaefer et al. (1991). Der Transformationsansatz setzte sich aus 300 µl

Protoplasten Suspension in 3M Medium (entspricht 4*106 Protoplasten), 300 µl PEG Lösung und

25 µg DNA zusammen. Während für stabile Transformationsansätze lineare DNA verwendet wurde,

wurde bei angestrebter transienter Expression zirkuläre DNA eingesetzt. Nach einer 5 minütigen

Inkubation bei Raumtemperatur, wurden die Ansätze einem Hitzeschock bei 45 °C für 5 min

ausgesetzt und nochmals für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss erfolgte die

Aufnahme in 3M Medium, wobei nach 5 min zunächst 1, 2, 3 und dann 4 ml 3M Medium vorsichtig

zugegeben wurden. Die Protoplasten wurden nochmals bei 50 x g für 5 min zentrifugiert, in 2,5 ml

REG Medium aufgenommen und in eine Petrischale (Ø 3 cm) überführt. In dieser erfolgte die

Regeneration zunächst für 24 Stunden im Dunklen und anschließend unter Standardbedingungen für

weitere 10 Tage.

Zur Abschätzung der Transformationseffizienz, wurde bei jeder Transformation parallel ein

transienter Transformationsansatz mit dem Vektor pBAS-GFP (Tab. 2.2) durchgeführt. Nach 2 bis

3 Tagen Regeneration unter Standardbedingungen wurde dem Transformationsansatz ein Aliquot zur

Beobachtung der GFP-Fluoreszenz entnommen (2.9). Transiente Transformationsansätze zur

Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von PpRH1-3 wurden nach 6 Tagen am Konfokal-

Lasermikroskop Leica TCS SPE ausgewertet (2.9).

Zur Selektion stabiler Transformaten wurden die regenerierenden Protoplasten auf festes ABCNTV-

Medium mit einem entsprechend dem Transformationskonstrukt ausgewähltem Antibiotikum (G418:

25 µg/ml, Hygromycin: 30 µg/ml, Zeocin: 100 µg/ml) auf eine sterile Cellophanfolie (Schütt,

Hamburg, D) transferiert. Je nach Wachstumsrate erfolgte der Transfer nach 10 bis 14 Tagen. Auf

diesem Medium wurden die Protoplasten für 2 bis 3 Wochen kultiviert. Im Anschluss an die erste

Selektionsrunde, folgte eine etwa 2 bis 3 wöchige Wachstumsperiode unter nicht-selektiven

Bedingungen (ABCNTV-Medium ohne Antibiotikum) durch Überführung kleiner Mengen an


25

Pflanzenmaterial auf das neue Medium. Dieser Wechsel von selektiven und nicht-selektiven

Wachstumsbedingungen wurde insgesamt 3 Mal wiederholt. Pflanzen, die alle 3 Zyklen überlebten,

wurden als stabile Transformanten angesehen.

3M Medium PEG Lösung REG Medium 15 mM MgCl2 40 % (w/v) PEG 4000 5 % (w/v) Glucose 0,1 % MES 0,1 M Ca(NO3)2 3 % (w/v) Mannitol 0,5 M Mannitol gelöst in 3M Medium gelöst in ABCTV pH 5,6; 580-590 mOs pH 5,6 pH 5,8; 540-580 mOs Nach der Einstellung des pHs mit KOH wurden alle Lösungen steril filtriert.

2.2.8 In vivo Markierungsexperimente mit radioaktiv-markierten Substanzen

Zur Charakterisierung des Purin- und Cytokinin-Metabolismus von Physcomitrella Wildtyp und

PpRH-knockout Mutanten, wurden in vivo Markierungsexperimente in Anlehnung an Schwartzenberg

et al. (2007, 2003) durchgeführt. Pflanzengewebe wurde mit radioaktiv-markierten Purinen

(3H-Adenosin, 3H-Inosin) bzw. Cytokininen (3H-Isopentenlyadenosin) inkubiert und der Metabolismus

über die Analyse entnommener Proben mittels HPLC-online-LSC (2.5) verfolgt. In Tab. 2.1 sind die

durchgeführten Markierungsexperimente angegeben.

Tab. 2.1: Übersicht über die durchgeführten in vivo Metabolismusstudien mit radioaktiv-markierten Substraten.

Konzentration Inkubation Probennahme Medium

Probennahme Gewebe

Genotypen

3H-Adenosin 1 µM* 60 min 0; 10; 20; 30;

40; 50; 60 min 60 min WT; PpRH1-KO #29

3H-Inosin 1 µM* 60 min 0; 10; 20; 30;

40; 50; 60 min 60 min WT; PpRH1-KO #29

3H-iPR 30 nM 25 h 0; 7; 20; 25 h 20; 25 h WT; PpRH1-KO #29;

PpRH2-KO #56; PpRH3-KO #7

* isotopische Verdünnung, ⅟10 radioaktiv-markiertes Substrat

Die Experimente fanden bei Raumtemperatur unter konstanter Belichtung (ca. 30 μmol m-2 s-1,

Leuchtröhre Osram L, 15 W) statt. Jeweils 1 g Gewebe (FG) wurde über ein Nylonsieb (Wilson-Sieb,

Maschenweite 50-100 µm) aus einer Flüssigkultur gewonnen, mit frischem A’BCDNTV-Medium

gewaschen (ca. 20 ml) und in einem 50 ml-Falcontube mit 4 ml frischem A’BCDNTV-Medium versetzt.

Alle Ansätze wurden über eine mit Watte gestopfte Pasteurpipette, die an eine Pumpe

angeschlossen war, mit befeuchteter Luft versorgt und durchmischt. Der Versuch wurde durch

Zugabe des Substrates gestartet (T0). In regelmäßigen Abständen wurden Proben aus dem

Kulturmedium entnommen (50 µl, Tab. 2.1), die bis zur HPLC Vermessung (2.5) bei -20 °C gelagert

wurden. Parallel wurden ebenfalls Mediumproben (2 x 5 µl) zur Bestimmung der

Gesamtradioaktivität (2.6) entnommen.

Zur Analyse der intrazellulären Metabolite wurde das Gewebe zu den in Tab. 2.1 angegebenen

Zeitpunkten geerntet. Über eine Vakuum-Filtrationseinheit (Vaccum Filtration Manifold, Model 1225,

Millipore) mit Glasfaserfiltern (Porengröße 0,45 µm, Whatmann) erfolgte die Trennung des Gewebes

vom Medium. Zur Entfernung extern anhaftender Metabolite wurde das Gewebe 3 x mit 20 ml MilliQ

Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Frischgewicht (FG) der Gewebeproben ermittelt. Für die


26

Extraktion der intrazellulären Metabolite wurde das Gewebe wie unter 2.2.4 beschrieben mit

Bieleski-Reagenz aufgeschlossen und anschließend wie in 2.2.8.1 angegeben weiterbehandelt.

2.2.8.1 Herstellung von Gewebeextrakten zur Extraktion radioaktiv-markierter

Metabolite

Der nach Extraktion mit Bieleski-Reagenz erhaltene, wässrige Überstand (2.2.4) wurde mit

100 µM ATP (Absättigung von Phosphatasen) versetzt und am Rotationsverdampfer (Labo Rota SE

320, resona technics, Gossau, D) auf ca. 20-50 µl eingeengt. Die Resuspendierung der Metabolite

erfolgte in 1 ml des entsprechenden Laufmittels A (Tab. 2.5). Die Messung der Gesamtradioaktivität

in den Gewebeextrakten erfolgte anhand von Aliquots (2 x 10 µl) wie unter 2.6 beschrieben. Zur

Bestimmung der intrazellulären Metabolite wurden die Proben wie unter 2.5 beschrieben direkt

mittels HPLC analysiert. Bei den Experimenten bei denen zusätzlich eine Phosphatase-Behandlung

vorgenommen wurde, um phosphorylierte Metabolite zu bestimmen, wurde die Hälfte des

Gewebeextraktes aufbewahrt und wie unter 2.2.8.2 beschrieben weiterbearbeitet.

2.2.8.2 Phosphatase-Behandlung

Zunächst wurden die aus 2.2.8.1 erhaltenen Gewebeextrakte am Rotationsverdampfer erneut auf

ca. 20-50 µl eingeengt und anschließend in 450 µl Wasser aufgenommen. Mit 1 M Tris-HCl pH 7,5

wurde der pH auf 7,5-8,0 eingestellt (Überprüfung mit pH-Papier, Macherey-Nagel, Düren, D). Zur

Phosphatase-Behandlung wurden 5 U Alkalische Phosphatase (FastAP Thermosensitive Alkaline

Phosphatase, Fermentas, St. Leon-Rot, D) mit entsprechendem Puffer eingesetzt und der Ansatz für

3-5 Stunden bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Analyse der Proben via HPLC (2.5).

2.3 Molekularbiologie

2.3.1 E. coli-Stämme

Die folgenden E. coli-Stämme wurden für Klonierungen und Expressionsexperimente genutzt:

BL21(DE3) (Novagen über Merck) F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 *lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL F- ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte *argU proL Camr+ *argU ileY leuW Strep/Specr+

BL21(DE3)pLysS (Novagen über Merck) F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB

- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)

C41 (DE3) (Lucigen, Middleton, USA) F- ompT gal dcm hsdSB(rB

- mB-)(DE3)

DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK

-

mK+), λ-

ER2566 (NEB, Ipswich, USA) F- λ- fhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene 1 gal sulA11 Δ(mcrC-mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-TetS)2

R(zgb-210::Tn10)(TetS) endA1 [dcm]


27

Rosetta(DE3)pLysS F- ompT hsdSB(RB- mB-) gal dcm λ(DE3 *lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) pLysSRARE (CamR)

TOP10 (Invitrogen, Karlsruhe, D) F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697

galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-

XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, USA) endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[::Tn10 proAB+ lacIqΔ(lacZ)M15+ hsdR17(rK- mK+)

2.3.2 DNA-Plasmide

Die folgenden Plasmide wurden für Klonierungen und Expressionsexperimente verwendet:

Tab. 2.2: Verwendete Plasmide.

Plasmid Resistenz Verwendung Bezugsquelle

pCR®4Blunt TOPO® Ampicillin Klonierung von PpRH1 (3.3.1) Invitrogen

pET28a Kanamycin Heterologe Expression rekombinanter PpRHs (3.3.3)

Novagen über Merck

pET-SUMO Kanamycin Heterologe Expression rekombinanter PpRH3 (3.3.3)

Invitrogen

pBAS-GFP Ampicillin Kontrollplasmid für Transformationen (2.2.7)

Zeidler et al. 1999

pLNU-GFP Ampicillin Lokalisierung von PpRHs (3.5) DNA Cloning Service (Hamburg, D)

pBNR Ampicillin Knockout von PpRH1 (3.6.1) Fabien Nougé (INRA, Versailles, F)

pBHR Ampicillin Knockout von PpRH2 (3.6.1) Fabien Nougé (INRA)

pBZR Ampicillin Knockout von PpRH3 (3.6.1) Fabien Nougé (INRA)

2.3.3 Primer

Oligonukleotide wurden über die Firma Metabion (Martinsried, D) bezogen (Standard-Aufreinigung).

Die in der PCR jeweils verwendeten Annealing-Temperaturen (Ta) wurden anhand der vom Hersteller

angegebenen Schmelz-Temperaturen der jeweiligen Primer (Tm, Tab. 2.3) zunächst mit Hilfe des

Programmes Clone Manager “ (SCI ED Software, Carry NC, USA) sowie des online-Programmes

OligoAnalyzer (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) bestimmt und eventuell

experimentell noch optimiert.

In Tab. 2.3 sind die in dieser Arbeit verwendeten Primer einschließlich ihrer Schmelz-Temperaturen

angeben.

Tab. 2.3: Verwendete Primer.

Bezeichnung Sequenz 5‘-3‘ Tm [°C] Verwendung

235 TATAGCGGCCGCATGGCGGTGCCTGAG 69,6

Klonierung PpRH1 239 CTTCCCAGATCTTCCAAATCCTTCCC 59,0

238 ATATATGGCGACCCTGAAGC 54,5

236 ATCCGCCGGCGCGATCAGGTTTACAG 66,5

312 GTTGAGCTCCTATGGGGCTGTAA 58,6 Klonierung PpRH1 in pET28a 314 TCAGTGCTAGCATGGCGGTGCCTG 65,6

326 ATGGACGTGAAAGCTGCTG 55,7 Klonierung PpRH3 in pET-SUMO 423 TCATTTCAGTCGAGAGCTGC 54,9

424 TCACTAGTACATGGCGGTGCCTGAG 62,1 PpRH1 Lokalisierungsvektor 425 TCCAAAGCTTCTGGGGCTGTAAGTCGTTCTTTG 64,3


28

Bezeichnung Sequenz 5‘-3‘ Tm [°C] Verwendung

426 TCATCTAGAACATGGCGGAGTATGTTGAGG 60,9 PpRH2 Lokalisierungsvektor 427 TCCAAAGCTTCAGGGCTGCACAGGAGTTTCTTC 65,8

428 TCATCTAGAACATGGACGTGAAAGCTGCTGGC 64,3 PpRH3 Lokalisierungsvektor 429 TCCAAAGCTTCTTTCAGTCGAGAGCTGCAAAG 63,2

389 CGCAGACCTTCGTCAGACTC 57,6

PpRH1-knockout-Konstrukt

390 GGCTGAGCATGTCACTTGTGTAAGA 59,0

391 CCTTACGCGTGACGGGGACGAAT 63,3

392 CCCTGACTAGTGTAAGAGGAATCTTCCGT 60,5

393 GCCCTGAGTCCTGTAATCTT 54,0

394 CATAACTCTGACGCATGGAATGA 55,0

395 CCTACGTACGAATGCTGTGGCAATTTGA 60,9

396 CCCTTCTAGAGTGTGAGGCCCTT 60,2

407 CCTGCACTTAGTCTTCTCAGGAT 56,1


408 GAACATGACGGTACTCTGCATCT 56,7

409 CCCTTCAAAGCTTACCACCTGCTGCTA 62,4

410 CCCTTGACTCGAGCAATACAGAACGGAA 61,7

411 CAGAACCGTAGGTTGAATGGTGTTT 57,5

412 CGAATTGCGCTGGAGGGATAA 57,6

413 CCCTGGATCCGTAGGTTGAATGGT 60,5

414 CCTTACGCGTTGGCAGCAAAGA 60,5

415 GTGGACTCATGGTTGTCCTCAAGAT 58,6


416 GCAGTGGATTAGGCCCTAAGAATAC 57,1

417 CCCACTGCATGCTCATCAAGCTAGTTTGT 62,4

418 CCCTGACTCGAGAAGATTTGCGAGGTA 61,4

419 GTCAAGTGTTCGCCCGAAGA 57,6

420 CGAGAGCTGCAAAGGAGTTTC 56,2

421 CCTTCGGCCGCAAGGGCAGTCTT 66,3

422 CCCTACGCGTTTCGAACGCCATCAG 63,7

436 AATCCCAACCACGACGACAA 56,9

Analyse PpRH1-KO genomische Ebene

82 ACTGTCGGCAGAGGCATCTT 58,9

438 CCTTTGTAGAGGTAAAAGCTATATGGT 54,5

80 GCTGCATACGCTTGATCC 54,0

496 GTATCCTGCACTTAGTCTTCTCA 53,8


497 GGTTCTTATAGGGTTTCGCTCAT 54,6

498 GTATGAACTGTTCGCCAGTCTT 55,0

499 GTGAGGTTCCTCAGATGTTAACT 54,2

501 GCTGCTTCACTTCATCGAATTCA 55,8


502 CCATCTGTGGGTTAGCATTCTTT 55,3

503 CAGAGCCATGAATAGGTCTATGA 53,7

504 CATATCCTCTAATGCTGCCATCT 54,3

214 CGGAGAGGAAGTACAGTGTGTGGA 59,9 PpACT3 Expression

215 ACCAGCCGTTAGAATTGAGCCCAG 61,2

536 GAACGGATCGCTGATTTTGT 53,4 Analyse PpRH1-KO Transkript-Ebene 537 TAATCTGGCCCACCTTCTTG 54,6

488 TGCGTATTTTGTGCATGGTT 53,5 Analyse PpRH2-KO Transkript-Ebene 489 TGCCCAATGTTCTTGACAAA 52,9

404 GCCGCAGAAGCTAATGTAAG 53,8 Analyse PpRH3-KO Transkript-Ebene 405 GGTCAAGTCTATGCCTATTGC 53,5


29

2.3.4 PCR

2.3.4.1 Standard-PCR

PCR-Ansätze wurden in 0,2 oder 0,5 ml Reaktionsgefäßen in den PCR-Cyclern TRIO Thermoblock

(Biometra, Göttingen, D) und Primus 96advanced PCR Cycler (Peqlab, Erlangen, D) durchgeführt.

Standard-PCR-Ansätze wurden in einem Volumen von 25 µl mit dem nachfolgend stehenden

Reaktionsansatz unter Anwendung des Standard-PCR-Protokolls durchgeführt. Zur Amplifikation

wurde zumeist die Taq DNA-Polymerase DSC DNA Polymerase (DNA Cloning Service) verwendet. Zur

fehlerfreien Vermehrung von Nukleotid-Sequenzen oder zur Amplifikation von Fragmenten

> 2000 bp wurde entweder eine Mixtur (10:1) aus Taq DNA-Polymerase und proof reading

Polymerase (Pfu DNA Polymerase, Fermentas) verwendet oder eine spezielle Pfu-Polymerase

(Phusion High Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes) nach Angaben des Herstellers eingesetzt. dNTPs

wurden von der Firma Fermentas bezogen. Die Menge an eingesetztem Template variierte je nach

Anwendung (10 pg bis 100 ng). Für jedes eingesetzte Primerpaar wurden Kontrollreaktionen mit

MilliQ Wasser anstelle von Template durchgeführt.

Standard-Reaktionsansatz für PCR (25 µl):

2,5 µl 10x Reaktionspuffer 2 µl MgCl2 (25 mM) 0,25 µl 5‘-3‘ Primer (50 µM) 0,25 µl 3‘-5‘ Primer (50 µM) 0,25 µl dNTPs (je 25 mM) 1 U DNA-Polymerase oder Polymerasen-Mixtur x µl Template x µl MilliQ Wasser Standard-PCR-Protokoll 94 °C 3 min initiale Denaturierung 94 °C 30 s Denaturierung Ta °C 30 s Annealing 25-30 Zyklen 72 °C 1 min/kb Elongation 72 °C 10 min finale Elongation

2.3.4.2 Kolonie-Screening via PCR

Zur Identifikation positiver E. coli-Klone nach Transformation von Ligationsansätzen (2.3.10) wurde

ein Kolonie-PCR-Verfahren durchgeführt. Hierfür wurde die zu untersuchende E. coli-Kolonie mit

einem Zahnstocher zunächst gepickt, in 5 µl MilliQ Wasser suspendiert und 3-5 µl der

Bakteriensuspension direkt als Template in die PCR eingesetzt. Die PCR wurde nach dem Standard-

Protokoll durchgeführt (2.3.4.1), mit der Ausnahme einer verlängerten, initialen Denaturierung von

5 min.

2.3.5 Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA- und RNA-Fragmenten

Die Auftrennung von DNA- oder RNA-Fragmenten in Abhängigkeit von ihrer Größe erfolgte über

horizontale Gelelektrophorese (Gelkammer: Wide Mini-Sub Cell GT, Bio-Rad, München, D).


30

1x TAE-Gele mit einer Agarose-Konzentration von 0,8-2,0 % Agarose und 0,5 µg/ml Endkonzentration

an Ethidiumbromid wurden hierfür verwendet. Die aufzutrennenden DNA- oder RNA-Proben wurden

mit Ladepuffer versetzt und bei 70-80 V in 1x TAE als Laufpuffer aufgetrennt. Als Marker diente mit

PstI verdaute Lambda DNA. Zur Visualisierung und Dokumentation der DNA- oder RNA-Fragmente

wurde ein UV-Transilluminator zusammen mit der Dokumentationssoftware BioPrint 96.07 (Vilbert

Lourmat, Eberhartzell, D) verwendet.

5x Ladepuffer 10x TAE Puffer 50 % (v/v) Glycerol 400 mM Tris 60 mM EDTA pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 0,25 % (w/v) Bromphenolblau 200 mM Eisessig

2.3.6 Aufreinigung und Isolierung von PCR-Produkten aus Agarose-Gelen

Die Aufreinigung von PCR-Produkten aus Agarose-Gelen erfolgte mit dem Gel/PCR DNA Fragments

Extraction Kit (Avegene über DNA Cloning Service). Alle Schritte wurden nach Herstellerangaben

durchgeführt.

2.3.7 Isolierung von Plasmid-DNA

Zur Isolierung geringer Mengen an Plasmid-DNA (bis zu 30 µg) aus E. coli, wurde das High-Speed

Plasmid Mini Kit (Avegene über DNA Cloning Service) verwendet. Die Elution der DNA erfolgte mit

50 µl TE Puffer oder MilliQ Wasser. Für die Präparation größerer Mengen Plasmid-DNA (bis zu

500 µg) wurde das Plasmid Maxi Kit von Qiagen (Hilden, D) benutzt. Alle Schritte wurden nach

Angaben des Herstellers durchgeführt und die DNA in 300-400 µl sterilem MilliQ Wasser

aufgenommen. Die isolierte DNA wurde bei -20 °C aufbewahrt.

DNA-Konzentrationen wurden am Photometer (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech, München, D)

mittels der Extinktion der verdünnten DNA bei 260 nm bestimmt, wobei 1 OD260 ca. 50 µg

doppelsträngiger DNA/ml entspricht. Anhand der Ratio von E260/E280 konnte die Reinheit der

isolierten DNA abgeschätzt werden.

2.3.8 Restriktionsverdau von DNA

Zur qualitativen Überprüfung von Plasmid-DNA oder PCR-Fragmenten sowie zum quantitativen

Verdau größerer Mengen DNA, wurde die DNA enzymatisch bei 37 °C unter Verwendung von

Restriktionsenzymen von Fermentas verdaut. Zum analytischen Verdau wurde bis zu 1 µg DNA in

20 µl Reaktionsvolumen mit 1 U Enzym für 1 Stunde inkubiert. Bei Verwendung von Fast digest

Enzymen (Fermentas) wurden entsprechend kürzere Inkubationszeiten und Enzymmengen nach

Angabe des Herstellers angewendet. Größere Mengen an DNA wurden in einem entsprechend

größeren Volumen mit größeren Enzymmengen und längeren Reaktionszeiten verdaut. Die Effizienz

der Reaktion wurde anhand von Gelelektrophorese überprüft (2.3.5). Die Inaktivierung des Enzymes,

zumeist durch Erhitzen, erfolgte nach Angaben des Herstellers. Zur Präzipitierung der DNA wurde das

Reagenz SureClean (Bioline, Luckenwalde, D) verwendet.

2.3.9 Herstellung und Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen

Chemisch-kompetente E. coli-Zellen wurden nach einem leicht modifizierten Protokoll nach Hanahan

(1985) hergestellt. Hierfür wurde zunächst eine 3 ml-Vorkultur des entsprechenden E. coli-Stammes


31

in LB Medium angesetzt und über Nacht bei 37 °C im Wasserbad bei 220 rpm geschüttelt. Im

Anschluss wurden 2 ml dieser Vorkultur zu 100 ml LB Medium zugegeben und bis zu einer OD600 von

0,4-0,6 bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Danach wurden die Zellen in vorgekühlten

Zentrifugengefäßen durch eine Zentrifugation (3000 x g, 5 min, 4 °C, Beckmann Coulter Avanti J-E,

Krefeld, D) sedimentiert und das Pellet vorsichtig in 0,4 Volumen kaltem Tfb I Puffer resuspendiert.

Nach einer 5 minütigen Inkubation auf Eis, folgte erneut eine Zentrifugation bei 3000 x g für 5 min

bei 4 °C. Die Zellen wurden vorsichtig in 0,04 Volumen Tfb II Puffer aufgenommen und für 15 min auf

Eis inkubiert. Nach Aliquotierung (50-100 µl) in vorgekühlte Reaktionsgefäße wurden die Zellen

zunächst in flüssigem Stickstoff und dann bei -80 °C eingefroren und bis zur Transformation gelagert.

Zur Transformation von E. coli mit isolierter Plasmid-DNA oder Ligationsansätzen (entsalzt) wurden

Aliquots der chemisch-kompetenten Zellen langsam auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe der DNA

(1-80 ng) und vorsichtigem Mixen, wurde der Transformationsansatz für 20 min auf Eis inkubiert. Im

Anschluss folgte ein Hitzeschock für 45 s bei 42 °C und dann eine Inkubation auf Eis für 2 min. Zur

Regeneration wurden 500 µl LB Medium zugegeben und der Ansatz für 1 Stunde bei 37 °C, 220 rpm

geschüttelt. Danach wurde ein Teil des Transformationsansatzes (30-500 µl) auf LB-Platten mit dem

entsprechenden Antibiotikum ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert.

LB Medium Tfb I Puffer Tfb II Puffer 5 g/l Hefeextrakt 30 mM K-Acetat 10 mM MOPS 10 g/l Pepton 100 mM RbCl 75 mM CaCl2 10 g/l NaCl 10 mM CaCl2 10 mM RbCl (7,5 g/l Agar) 50 mM MnCl2 15 % Glycerol pH 7,0 15 % Glycerol pH 6,5 pH 5,8 Alle Lösungen wurden nach der pH-Einstellung autoklaviert. Konzentrationen der Antibiotika Ampicillin 100 μg/ml Kanamycin 50 μg/ml

2.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten in einen Vektor erfolgte über sticky end Ligation mit Hilfe der

T4 DNA Ligase (Fermentas). Die Reaktion wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt und

durch eine Hitzeinaktivierung gestoppt. Vor der Transformation in E. coli wurden die Ligationsansätze

mit dem Reagenz SureClean (Bioline) gefällt.

2.3.11 TOPO®cloning

Das Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit (Invitrogen) wurde verwendet, um PCR-Produkte in den

Vektor pCR®4Blunt-TOPO® zu klonieren. Alle Reaktionen wurden nach Herstellerangaben

durchgeführt.

2.3.12 Kryokonservierung von Bakterienstämmen

Zur längerfristigen Aufbewahrung von Bakterienstämmen mit/ohne Plasmid, wurden Kryostocks

angelegt. Hierfür wurde die Bakterienkultur 1:1 mit der Glycerolstock Lösung gemischt, sofort in

flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei -80 °C aufbewahrt.


32

Glycerolstock Lösung nach Mülhardt (2009) 65 % Glycerol 0,1 M MgSO4 0,025 M Tris pH 8,0

2.3.13 Isolierung genomischer DNA aus Physcomitrella

Zur Isolierung genomischer DNA aus Physcomitrella wurde eine vereinfachte CTAB-Methode

angewendet (http://moss.nibb.ac.jp/). Das Moosgewebe (aus Flüssigkultur oder von Festmedium)

wurde in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 400 µl 2x CTAB Puffer überführt und mechanisch mit einem

kleinen Plastikpistill (schuett-biotec) zerkleinert. Das Homogenat wurde anschließend für 1 Stunde

bei 60 °C inkubiert, dann mit 400 µl Chloroform:Isoamylalkohol (25:1) extrahiert und bei 16.000 x g

für 10 min bei 4 °C zentrifugiert (Universal 320R, Hettich). Die DNA, enthalten in der oberen

wässrigen Phase, wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit einem gleichen Volumen

Isopropanol präzipitiert und erneut zentrifugiert (16.000 x g, 10 min, 4 °C). Das DNA-Pellet wurde mit

70 % Ethanol gewaschen und in 50 µl TE Puffer mit 1 µl RNaseA (1 mg/ml) gelöst. Für anschließende

PCR-Ansätze wurden 2-5 µl DNA je Reaktionsansatz als Template eingesetzt (2.3.4.1).

2x CTAB TE Puffer 2 % (w/v) CTAB 10 mM Tris-HCl pH 8,0 100 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA pH 8,0 1,4 M NaCl 20 mM EDTA pH 8,0

2.3.14 Isolierung von RNA aus Physcomitrella

Zur RNA-Isolierung aus Physcomitrella nach einer leicht modifizierten Methode von Danyluk und

Sarhan (1990) wurde 10-100 mg Pflanzenmaterial aus Flüssig- oder Festkulturen verwendet. Nach

der Ernte des Gewebes und anschließender Entfernung des Mediums über eine Wasserstrahlpumpe

(2.2.3, nur bei Verwendung von Flüssigkulturen) wurde das Material in ein 2 ml Reaktionsgefäß, zu

¼ gefüllt mit Glasperlen (Ø 1,7-2 mm), überführt und direkt in flüssigem Stickstoff gefroren. Nach

Zugabe von 1 ml kaltem TLES Puffer wurden die Proben im FastPrep FP120 Homogenizer (Savant

Instruments) für 2 x 20 s bei einer Intensität von 5 homogenisiert. Das Homogenat wurde dann zur

Entfernung der Zellrückstände bei 13.000 x g, 5 min, 4 °C (Universal 320R, Hettich) zentrifugiert und

der Überstand (max. 1 ml) in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Nach Versetzung des

Überstandes mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) folgte eine

erneute Zentrifugation bei 13.000 x g, 10 min, 4 °C. Der Überstand wurde abgenommen, in ein 2 ml

Reaktionsgefäß transferiert und ein gleiches Volumen an Chloroform:Isoamylalkohol (24:1)

zugegeben. Die nach der Zentrifugation, 13.000 x g, 10 min, 4 °C, abgetrennte obere Phase, die die

RNA enthält, wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und zur Fällung der RNA mit LiCl,

Endkonzentration 2 M, versetzt. Für eine optimale Ausbeute erfolgte die Fällung bei 4 °C über Nacht,

mindestens aber für 1 Stunde bei 4 °C. Zur Präzipitation wurde die RNA im Anschluss bei 13.000 x g,

1 Stunde, 4 °C zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und in 50-100 µl

DEPC Wasser resuspendiert. Die Qualität der RNA wurde mittels Gelelektrophorese (2.3.5) überprüft


33

und zur Messung der Quantität wurde die RNA im Photometer (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech)

bei 260 nm vermessen, wobei 1 OD260 ca. 40 µg RNA/ml entspricht.

TLES Puffer 100 mM Tris-HCl pH 8,0 100 mM LiCl 10 mM EDTA pH 8,0 1 % SDS

2.3.15 DNase-Behandlung und reverse Transkription (RT) von RNA

Vor dem Umschreiben der RNA in cDNA wurde die RNA zunächst mit DNase I (Fermentas) nach

Angaben des Herstellers behandelt. Nach Zugabe von EDTA und Hitzeinaktivierung der DNase I

wurde die RNA mit Ethanol (2,5 Volumen) und Ammoniumacetat (⅟10 Volumen) präzipitiert,

gewaschen und anschließend in DEPC-behandeltem MilliQ Wasser aufgenommen. Qualität und

Konzentration wurden wie unter 2.3.14 beschrieben, bestimmt.

Der Reaktionsansatz zur reversen Transkription setzte sich folgendermaßen zusammen

(Gesamtvolumen 20 µl):

3-5 µg RNA 1 µl Oligo(dT) Primer anchored, 0,5 µg/µl (Sigma-Aldrich) bis 12,5 µl DEPC Wasser 4 µl 5x Puffer 0,5 µl RiboLock RNase Inhibitor, 40 U/µl (Fermentas) 2 µl dNTPs, je 10 mM (Fermentas) 1 µl RevertAid M-MuLV, 200 U/µl (Fermentas) Der Ansatz wurde zunächst bei 42 °C für 60 min inkubiert. Durch eine 10 minütige Inkubation im

Anschluss bei 70 °C erfolgte die Inaktivierung der reversen Transkriptase. Die hergestellte cDNA

konnte danach direkt in die PCR (0.1) eingesetzt werden (1-5 µl). Neben einer Effizienz-Kontrolle der

RT unter Verwendung von TMV-RNA in Kombination mit random nonamer Primern (50 µM, Sigma-

Aldrich) anstelle von Oligo(dT) Primern, wurde auch die Kontamination der RNA mit Resten von

genomischer DNA überprüft. Hierfür wurden sogenannte „RT minus“-Reaktionen von jeder RNA

angesetzt, die einer reversen Transkription allerdings ohne Zugabe der reversen Transkriptase

entsprechen. Per PCR konnten eventuelle Reste von genomischer DNA nachgewiesen werden.

2.3.16 Sequenzierung

Sequenzierungen von PCR-Produkten oder Plasmiden erfolgten durch den DNA Cloning Service.

2.3.17 Gensynthese

Gensynthesen wurden bei der Firma DNA Cloning Service in Auftrag gegeben.

2.4 Proteinbiochemie

2.4.1 Herstellung von Proteinextrakten aus Physcomitrella

Moosgewebe (0,5-1 g) aus Flüssigkulturen wurde wie zuvor beschrieben (2.2.3) geerntet und in

einem Mörser unter Zugabe von flüssigem Stickstoff zerkleinert. Nach Überführung des


34

entstandenen Gewebepulvers in 10-20 ml kalten 4x TMD Puffer und einer 25 minütigen Inkubation

auf Eis, wurden die Ansätze für 20 min bei 13.000 x g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde zum

Abfangen kleiner Partikel über einen Spritzenvorsatzfilter (Porengröße 0,45 µm, Roth) gegeben und

anschließend bis zur 100 %igen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Zur Fällung aller löslichen

Proteine folgte im Anschluss eine Inkubation bei 4 °C für mindestens 1 Stunde, idealerweise über

Nacht. Nach einer Zentrifugation bei 13.000 x g, 30 min, 4 °C (Beckmann Coulter Avanti J-E) wurde

das Pellet in 750 µl 1x TMD Puffer gelöst. Zur Entfernung von Salzen und niedermolekularen

Substanzen erfolgte die Entsalzung über illustra™ NAP™ 10 Säulen (GE Healthcare, München, D). Zur

Elution der Proteine wurden 1,2 ml 1x TKD Puffer auf die Säule geben. Die Proteinkonzentration der

Gewebeextrakte wurde entweder über Bradford (2.4.5) bestimmt oder es erfolgte eine UV-basierte

Vermessung im Photometer und eine Berechnung der Konzentration nach folgenden Gleichungen

(Ergebnisse der drei Gleichungen wurden gemittelt):

Protein Konzentration (mg/ml) = (1,55 x A280) – (0,76 x A260)

= A205/[27 + 120 (A280/A205)]

= (A235 - A280)/2,51

4x TMD Puffer 4x TKD Puffer 200 mM Tris-HCl pH 7,5 200 mM Tris-HCl pH 7,5 20 mM MgCl2 400 mM KCl 2 mM DTT 2 mM DTT

2.4.2 Überexpression rekombinanter RH in E. coli

Zur Herstellung rekombinanter RH wurden E. coli-Zellen verwendet (2.3.1), die ein entsprechendes

Plasmid (Tab. 2.2) zur Expression rekombinanter RH tragen. Hierfür wurde zunächst mit einer

Einzelkolonie eine 3 ml-Vorkultur (LB Medium mit entsprechendem Antibiotikum, 2.3.9) inokuliert

und über Nacht bei 37 °C, 220 rpm im Schüttelwasserbad herangezogen. Zur Inokulation der

Hauptkultur (2YT Medium mit entsprechendem Antibiotikum) wurde 1/100 der Vorkultur verwendet.

Außerdem wurde 0,6 % Glycerol als zusätzliche Kohlenstoffquelle zugegeben. Die Hauptkultur wurde

in 1 l-Erlenmeyerkolben bei 37 °C im Wasserbad bei 175 rpm bis zu einer OD600 von 1 herangezogen

und dann bei Raumtemperatur unter Schütteln weiter inkubiert. Nach ca. 1 Stunde bzw. einer OD600

von 1,5-2,0 erfolgte die Induktion der Genexpression mit 1 mM IPTG. Die Kultur wurde für weitere

15-20 Stunden bei 175 rpm herangezogen und dann die Zellen durch eine Zentrifugation bei 5000 x g,

20 min, 4 °C (Beckmann Coulter Avanti J-E) geerntet. Die Zellpellets wurden entweder direkt weiter

verarbeitet oder bis zur Aufreinigung bei -20 °C gelagert.

2YT Medium 10 g/l Hefeextrakt 16 g/l Pepton 5 g/l NaCl Nach Einstellung des pH mit NaOH auf 7,0 wurde das Medium autoklaviert.


35

2.4.3 Aufreinigung rekombinanter RH aus E. coli über Affinitätschromatografie

Alle Aufreinigungsschritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Zunächst wurden die Zellpellets (2.4.2) in

1 Volumen 2x Lysis Puffer je Gramm Pellet resuspendiert, optional mit EDTA-freiem Protease-

Inhibitor Cocktail (complete Mini EDTA-free, Roche, Mannheim, D). Nach Zugabe von Lysozym mit

einer Endkonzentration von 100 µg/ml, folgte eine 15 minütige Inkubation der Zellsuspension bei

Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln. Zur vollständigen Zelllyse wurde die Zellsuspension

einer Ultraschall-Behandlung unterzogen (Ultraschallstab Labsonic 2000, B. Braun Biotech

International über Satorius), wobei das Zelllysat in 10 Zyklen à 20 s den Ultraschallwellen ausgesetzt

wurde. Zwischen den einzelnen Zyklen wurde die Suspension kurz auf Eis gehalten. Zur Abtrennung

von Zelltrümmern und unlöslichem Material folgte eine Zentrifugation bei 13.000 x g, 4 °C für 30 min

(Beckmann Coulter Avanti J-E). Im Anschluss wurde der Überstand über einen Filter mit 0,45 µm

Porengröße (Roth) filtriert und dann auf eine vorgepackte His•bind® Column (Novagen über Merck)

geladen. Die Aufreinigung des rekombinanten Proteins mit His-Tag über Säulenchromatografie

erfolgte nach Angaben des Herstellers. Die Elution des Proteins wurde mit 5 ml Elutionspuffer

erreicht. Von jedem Aufreinigungsschritt wurden Proben genommen und später per SDS-PAGE

analysiert (2.4.6), um einerseits den Aufreinigungsprozess zu kontrollieren und um andererseits die

Elutionsfraktionen zu identifizieren, die ausreichend rekombinantes Protein enthielten.

Elutionsfraktionen mit rekombinanter RH wurden vereinigt und in 20 mM Tris-HCl Puffer pH 7,5

dialysiert. Hierfür wurden die entsprechenden Fraktionen in einen Dialyseschlauch (Visking, Zellulose

Typ 27/32, Roth) überführt und in 1 l 20 mM Tris-HCl Puffer pH 7,5 zunächst für 2 Stunden bei 4 °C

dialysiert. Nach Austausch des Puffers wurde die Dialyse über Nacht fortgesetzt. Zur Bestimmung der

Proteinkonzentration wurde der Bradford Assay (2.4.5) sowie die unter 2.4.1 beschriebene

photometrische Methode angewendet. Falls eine Aufkonzentrierung des Proteins gewünscht war,

wurde diese nach Herstellerangaben über eine Ultrafiltrationseinheit (Amicon® Ultra, MWCO 10 kDa,

Millipore) durchgeführt. Das Protein wurde bei 4 °C aufbewahrt und war dort für ca. 2 bis 3 Wochen

stabil (Daten nicht gezeigt).

2x Lysis Puffer Elutionspuffer 0,04 mM Tris-HCl pH 7,9 20 mM Tris-HCl pH 7,9 1 M NaCl 500 mM NaCl 10 mM Imidazol 150 mM Imidazol

2.4.4 Expression von PpRH3 im Champion™ pET SUMO Protein Expression System

Das Champion™ pET SUMO Protein Expression System (Invitrogen) wurde verwendet, um eine

Verbesserung der Löslichkeit von PpRH3 zu erzielen. Alle Reaktionen wurden laut Herstellerangaben

durchgeführt.

2.4.5 Bestimmung der Proteinkonzentration

Proteinkonzentrationen wurden nach Bradford (1976) im Mikroplattenansatz mit BSA als Standard

bestimmt. Hierfür wurde das Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent (Bio-Rad) nach Hersteller-Angaben

verwendet. Zu vermessende Proteinproben wurden typischerweise in einer 1:10 Verdünnung

eingesetzt. Alle Proben wurden bei 595 nm im Mikrotiterplatten-Reader (Dynatech MR 5000 von

Dynex Technologies, Chantilly, USA) vermessen.


36

2.4.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Proteine wurden über SDS-PAGE (Laemmli 1970) nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die

Separierung erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in einem vertikalen Elektrophorese-System

(Mini Protean II, Bio-Rad). Standardmäßig wurde ein 5 %iges Sammelgel mit einem 12,5 %igen

Trenngel eingesetzt. Alle aufzutrennenden Proben wurden zur Denaturierung zunächst mit 5x SDS

Ladepuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C inkubiert. Zur Analyse von Zellpellets bzw. von

unaufgereinigten Zellextrakten wurden abweichend davon ca. 50 µl des Zellpellets bzw. des

Zellextraktes 1:1 mit 5x SDS Ladepuffer und 25 µl 1x SDS Laufpuffer versetzt und für 30 min bei 95 °C

inkubiert. Als Marker wurde der Unstained Protein Molecular Weight Marker von Fermentas

verwendet. Die Auftrennung erfolgte bei konstanten 120 V für ca. 1 Stunde unter Verwendung von

1x SDS Laufpuffer.

5x SDS Ladepuffer 10x SDS Laufpuffer 375 mM Tris-HCl pH 6,8 250 mM Tris 10 % (w/v) SDS 1 % (w/v) SDS 50 % (v/v) Glycerol 1,92 M Glycin 0,5 M DTT 0,01 % (w/v) Bromphenolblau SDS Sammelgel (5 %) 2,88 ml MilliQ Wasser 1,25 ml Sammelgelpuffer (0,5 M Tris-HCl pH 6,8) 0,624 ml Acrylamid/Bisacrylamid 37:5:1 (Rotiphorese® Gel 40, Roth) 50 μl SDS Lösung (10 %) 25 μl Ammoniumpersulfat Lösung (10 %) 5 μl TEMED (AppliChem, Darmstadt, D) SDS Trenngel (12.5 %) 4,22 ml MilliQ Wasser 2,5 ml Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl pH 8,8) 3,13 ml Acrylamid/Bisacrylamid 37:5:1 (Rotiphorese® Gel 40, Roth) 100 μl SDS Lösung (10 %) 50 μl Ammoniumpersulfat Lösung (10 %) 5 μl TEMED (AppliChem)

2.4.7 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Native PAGE)

Zur Identifizierung der Quartärstrukturen von Proteinen, wurden Proben unter nicht-

denaturierenden Bedingungen im Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Separierung erfolgte unter

nativen Bedingungen in einem vertikalen Elektrophorese-System (Mini Protean II, Bio-Rad). Es wurde

ein 4 %iges Sammelgel mit einem 8 %igen Trenngel verwendet. Alle aufzutrennenden Proben wurden

mit 2x Nativem Ladepuffer versetzt. Bis zu 200 µg Protein wurden auf das Gel aufgetragen. Als

Marker wurde der HMW-Native Marker (GE Healthcare) verwendet. Die Trennung erfolgte bei 4 °C

bei konstanten 15 mA für 1,5 Stunden in 1 x Laufpuffer.

2x Nativer Ladepuffer 10x Nativer Laufpuffer 125 mM Tris-HCl pH 6,8 25 mM Tris 20 % (v/v) Glycerol 1,92 M Glycin 0,01 % (w/v) Bromphenolblau


37

SDS Sammelgel (4 %) 3,08 ml MilliQ Wasser 1,25 ml Sammelgelpuffer (0,5 M Tris-HCl pH 6,8) 0,65 ml Acrylamid/Bisacrylamid 37:5:1 (Rotiphorese® Gel 40, Roth) 20 μl Ammoniumpersulfat Lösung (10 %) 5 μl TEMED (AppliChem) SDS Trenngel (8 %) 4,77 ml MilliQ Wasser 2,5 ml Trenngelpuffer (1,5 M Tris-HCl pH 8,8) 2,67 ml Acrylamid/Bisacrylamid 37:5:1 (Rotiphorese® Gel 40, Roth) 50 μl Ammoniumpersulfat Lösung (10 %) 5 μl TEMED (AppliChem)

2.4.8 Colloidal-Coomassie-Färbung

Zur Visualisierung der Proteinbanden im Polyacrylamid-Gel wurde eine Colloidal-Coomassie-Färbung

vorgenommen, die deutlich sensitiver als die herkömmliche Coomassie Färbung ist (Detektion von

50-500 ng statt 100-1000 ng Protein). Hierzu wurden die Gele unter Schwenken in Colloidal-

Coomassie Färbelösung für 6 Stunden inkubiert und anschließend für 1 Stunde entfärbt.

Colloidal-Coomassie Färbelösung Entfärberlösung 5 % Aluminiumsulfat-(14-18)-Hydrat 10 % Ethanol (96 %) 10 % Ethanol (96 %) 2 % ortho-Phosphorsäure (100 %) 0,02 % Coomassie Brilliant BlueG-250 2 % ortho-Phosphorsäure (100 %) vor Verwendung für mind. 6-8 h rühren

2.4.9 Western Blot

Western Blots wurden nach Towbin et al. (1979), modifiziert nach Richter (2008), durchgeführt.

10x PBS Transfer Puffer NBT/BCIP Puffer 80 g/l NaCl 48 mM Tris 0,1 M NaHCO3 2 g/l KCl 39 mM Glycin 1 mM MgCl2 26,8 g/l Na2HPO4*7H2O 0,0375 % (w/v) SDS pH 9,8 2,4 g/l KH2PO4 20 % (v/v) Methanol pH 7,4 pH 8,3 NBT (Nitroblau-Tetrazolium) Lösung 75 mg/ml in 70 % N,N-Dimethylformamid (DMF) BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) Lösung 50 mg/ml in 100 % DMF Primärer Antikörper Sekundärer Antikörper Anti His-tag® monoklonaler Antikörper Anti mouse IgG-alkaline phosphatase (Novagen) (Sigma-Aldrich) Verdünnung 1: 1000 Verdünnung 1: 5000


38

2.4.10 Gelfiltration über FPLC

Gelfiltrationen wurden mit einer Bio-Prep SE-100/17-Säule (Bio-Rad), angeschlossen an eine FPLC-

Anlage (AKTA mit 200 µl Superloop, GE Healthcare) durchgeführt. Als Puffersystem wurde ein

Phosphatpuffer verwendet. Die Flussrate betrug konstant 0,5 ml/min. Die Equilibrierung erfolgte mit

5 Säulenvolumina des Phosphatpuffers. Zur Kalibrierung wurde der Gel Filtration Standard von Bio-

Rad (1,3-670 kDa) benutzt. Die Proben (maximal 200 µl, mit unterschiedlichen Proteinmengen)

wurden über eine Mikroliterspritze (Hamilton, Bonaduz, CH) aufgetragen.

Phosphatpuffer 0,05 M NaH2PO4 0,15 M NaCl pH 8,0

2.4.11 Enzym-Assays

Zur Messung von RH-Aktivität wurden zwei verschiedene Enzym-Assays angewendet: Der

spektrophotometrischer Ansatz nach der Methode von Parkin (1996), der zur Bestimmung von

kinetischen Parametern der rekombinanten Proteine angewendet wurde, basiert auf einer Änderung

der Absorption durch den Verbrauch von Substrat. Bei der alternativen Messung der Enzym-Aktivität

mittels eines HPLC-basierten Assays können hingegen Substrat und Produkt eindeutig anhand von

Chromatogrammen identifiziert und quantifiziert werden. Das eventuelle Auftreten von

Nebenreaktionen könnte gegebenenfalls auch erfasst werden. Dieser Assay wurde verwendet, (1) um

die Korrektheit der im Photometer gemessenen Reaktion zu überprüfen, (2) um einige kinetische

Parameter der rekombinanten Proteine zu bestimmen, (3) um RH-Aktivität in inhomogenen

Lösungen wie Zellextrakten und intaktem Moosgewebe zu messen und (4) um Enzym-Assays unter

Verwendung radioaktiv-markierter Substrate auszuwerten.

2.4.11.1 Spektrophotometrischer Assay nach Parkin (1996)

Zur photometrischen Bestimmung der RH-Aktivität wurden UV-Küvetten (Quarzküvetten, Hellma

Analytics, Müllheim, D) zusammen mit dem Cary 50 Scan UV-Vis Spectrometer von Varian

(Darmstadt, D, optional mit einem PCB 150 Peltier Water System) verwendet, wobei je nach Substrat

die entsprechende Wellenlänge für die Messung gewählt wurde (Tab. 2.4). Die Assays wurden bei

Raumtemperatur durchgeführt. Der 1 ml Reaktionsansatz enthielt das Substrat in gewünschter

Konzentration sowie 1 x TKD Puffer (2.4.1) als Reaktionspuffer. Die Reaktion wurde durch Zugabe des

rekombinanten Proteins gestartet (5-20 µg) und die Änderung der Absorption bei der

entsprechenden Wellenlänge über einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten aufgezeichnet. Die

Umsetzung einer 1 mM Lösung des entsprechenden Ribosids führte zu der in Tab. 2.4 angegebenen

Änderung der Absorption (∆εX). Die Berechnung der Enzym-Aktivität erfolgte anhand folgender

Gleichung:

wobei ∆Ax die Änderung der Absorption bei der Substrat-spezifischen Wellenlänge, s die Zeit in

Sekunden, V das Reaktionsvolumen in ml, ∆εx die Änderung des molaren Extinktionskoeffizienten in


39

µM-1 cm-1 für das jeweilige Substrat, v das zugegebene Volumen an Enzym-Lösung in µl und [E] die

Enzym-Konzentration in mg/ml darstellt.

Tab. 2.4: Messwellenlänge und Änderung des molaren Extinktionskoeffizienten von ausgewählten Purinen und Pyrimidinen, die im spektrophotometrischen Assay eingesetzt wurden.

Substrat Λ *nm+ ∆εX [mM-1 cm-1]*

Quelle für ∆εX

Adenosin 276 -1,40 Parkin (1996)

Cytidin 280 3,42 Liang et al. (2008) Hansen und Dandanell (2005)

Guanosin 308 0,16 Parkin (1996)

Inosin 280 -0,92 Parkin et al. (1991)

Thymidin 265 -1,70 Hansen und Dandanell (2005)

Uridin 280 -1,80 Hansen und Dandanell (2005)

2.4.11.2 HPLC-basierter Enzym-Assay

Zusätzlich zu dem zuvor beschriebenen, spektrophotometrischen Assay, wurde RH-Aktivität auch

mittels HPLC gemessen. Der Standardansatz (1 ml) enthielt ähnlich wie der spektrophotometrische

Ansatz 1 x TKD Puffer (2.4.1) als Reaktionspuffer, das Substrat (radioaktiv-markiert oder unmarkiert)

in gewünschter Konzentration sowie 5-20 µg rekombinantes Protein bzw. 100-150 µg Proteinextrakt

aus Physcomitrella. Die Inkubation der Assays erfolgte bei 35 °C für mehrere Stunden. Anschließend

wurde die Reaktion durch Hitzeeinwirkung gestoppt (70 °C für 10 min), mit Laufmittel A versetzt

(Tab. 2.5, in der Regel 1:3 bis 1:5, je nach Konzentration) und über einen Spritzenvorsatzfilter

(Porengröße 0,45 µm, Macherey-Nagel) filtriert, um präzipitiertes Protein und andere Partikel zu

entfernen. Die Analyse der Proben per HPLC erfolgte nach der unter 2.5 beschriebenen Methode.

2.5 RP-HPLC zur Trennung von Purin-Ribosiden und -Basen sowie Cytokinin-

Ribosiden und -Basen

HPLC-Messungen wurden nach dem reverse Phase-Prinzip auf einer Bio-TEK Anlage mit Diodenarray-

Detektor DAD 540+ (beides Kontron, Neufahrn, D) durchgeführt. Bei Vermessung von radioaktiv-

markierten Proben wurde zusätzlich ein online-Flüssigkeitsszintillationszähler angeschlossen (LSC,

Radiomatic 500 TR Series, Canberra-Packard, Dreieich, D; Verwendeter Szintillationscocktail: Ultima-

Flow M, PerkinElmer, Rodgau, D). Die Flussrate betrug konstant 0,8 ml/min bei einem

durchschnittlichen Druck von 70 bar. Je nach aufzutrennenden Substanzen wurden stationäre Phase

und Laufmittelgradient sowie Wellenlänge zur Vermessung des HPLC-Effluenten nach Tab. 2.5

ausgewählt. Alle Proben wurden vor ihrer Injektion zunächst in Laufmittel A aufgenommen und

anschließend filtriert (0,45 µm Porengröße, Filtergröße je nach Probenvolumen, Macherey-Nagel).

Für die Vermessung radioaktiv-markierter Proben, wurden den Proben unmarkierte

Standardsubstanzen zwecks Erfassung der Retentionszeiten (UV) zugefügt. Die Datenaufnahme und

-auswertung erfolgte mit der Software Geminyx (Goebel Instrumentelle Analytik, Ludwigshafen, D).


40

Tab. 2.5: Übersicht über die verwendeten HPLC-Analyseverfahren.

Trennung von Inosin/Hypoxanthin*

Trennung von Adenosin/Adenin

Trennung von Cytokinin-Ribosiden (iPR) und -basen (iP)

Stationäre Phase

Säule: LiChroCART 250-4 mit LiChrospher 60, RP-Select B (5 μm); Vorsäule: LiChrospher 100 RP-18 (5 µm) (beides Merck)



Laufmittel (Lm)

Lm A: 10 mM Ammonium-formiat pH 3,7 Lm B: 100 % Acetonitril

Lm A: 10 mM Ammonium-formiat pH 3,7 Lm B: 100 % Acetonitril

Lm A: 10 mM Triethylamin, 10 % Methanol Lm B: 100 % Methanol

Laufmittel-gradient

Zeit [min] 0 3

16 17 21 30

Laufmittel A [%] 99 99 94 0

99 99

Zeit [min] 0 3

16 17 19 21 30

Laufmittel A [%] 96 96 87 0 0

96 96

Zeit [min] 0 5

10 12 31 33 34 36

Laufmittel A [%] 100 80 79 64 60 53 0

100

Daten-aufnahme

Minute 1-20 (250 nm) Minute 1-20 (260 nm) Minute 1-35 (269 nm)

* kann ebenfalls zur Trennung von Guanosin/Guanin sowie Xanthosin/Xanthin verwendet werden

2.6 Quantifizierung von Tritium-markierten Metaboliten

Zur Messung der Gesamtradioaktivität im Kulturmedium und in Gewebeextrakten wurden jeweils

Proben (5 µl Kulturmedium, 10 µl Gewebeextrakt) entnommen, mit 3 ml Szintillationscocktail

Optiphase HiSafe 2 (PerkinElmer) versetzt und die Zerfälle pro Minute (dpm) für 5 Minuten im

Flüssigszintillationsanalyser Tri-Carb 2800 TR (PerkinElmer) gezählt.

2.7 LC-MS/MS-basierte Messungen zur Bestimmung von Purinen und Pyrimidinen

Die LC-MS/MS-basierten Messungen zur Bestimmung und Quantifizierung endogener Purine und

Pyrimidine beim Wildtyp sowie bei PpRH-KO Transformanten wurden in Kooperation mit Dr. J. Klein

(Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D) durchgeführt. Flüssigkulturen der zu

untersuchenden Genotypen wurden, wie unter 2.2.2 beschrieben, kultiviert und beprobt. Die

Herstellung der Gewebeextrakte für die anschließenden LC-MS/MS-Analysen erfolgte wie in 2.2.5

beschrieben.

LC-MS/MS Messungen wurden an einem 4000 QTRAP (AB Sciex, Foster City, USA) Instrument

vorgenommen, das an eine reverse Phase HPLC gekoppelt war (UFLC Prominence, Shimadzu,

Duisburg, D). Die Trennung von Purin- und Pyrimidin-Metaboliten erfolgte über eine Luna PFP (2)

Säule (Phenomenex, Aschaffenburg, D) bei einer Flussrate von 300 µl/min in einem Methanol-

Gradienten (Laufmittel A: 0,2 % Essigsäure; Laufmittel B: 100 % Methanol; Gradient: min 0: 5 %

Laufmittel B; min 4: 40 % Laufmittel B; min 4,5: 100 % Laufmittel B; min 6,5: 5 % Laufmittel B). Die

Ionisierung erfolgte über Elektrospray-Ionisation, die anschließende Analyse der Ionen wurde im

negativen Modus durchgeführt. Quantifizierungen wurden anhand der mit stabilen Isotopen

markierten Standards vorgenommen, die den Proben vor der Aufbereitung zugefügt wurden (2.2.5).


41

2.8 Kristallisierungsansätze

Für Kristallisierungsansätze, die in Kooperation mit Dr. D. Kopečný (Palacký Universität, Olomouc, CZ)

durchgeführt wurden, wurden die zu kristallisierenden Proteine nach Überexpression in E. coli (2.4.2)

zunächst über Co-Agarose (HisPur Cobalt Spin Columns, Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)

nach Herstellerangaben aufgereinigt. Anschließend erfolgte eine zusätzliche Aufreinigung über

Gelfiltration (BioLogic Duo Flow Liquid Chromatograph, Bio-Rad) auf einer Superdex 200 HR 10/30

Säule (Amersham Biosciences über GE Healthcare). Als Puffer wurde der unten stehende HEPES

Puffer verwendet. Zur Entsalzung und Aufkonzentrierung auf ca. 12-18 mg/ml wurde eine

Ultrafiltrationseinheit (Centricon®, MWCO 10 kDa, Millipore) verwendet.

Die Kristallisierung erfolgte nach der hanging-drop Dampfdiffusionsmethode bei einer konstanten

Temperatur von 20 °C. Zum Auffinden der optimalen Kristallisierungsbedingungen wurden die

folgenden Screening Kits verwendet: Crystal Screen I und II von Hampton Research (Laguna Niguel,

USA) sowie Classic und PEG Suite (Qiagen). Vor der Vermessung im flüssigen Stickstoff-Strahl wurden

die Kristalle in die mit PEG4000 versetzte Mutterlauge als Gefrierschutzmittel überführt. Die

Vermessung im Röntgendiffraktometer erfolgte an der Synchrotronanlage SOLEIL (Proxima 1

Beamline, Saclay, F).

HEPES Puffer 100 mM HEPES pH 7,5 100 mM NaCl

2.9 Durchlicht- und Fluoreszenz-Mikroskopie

Zur mikroskopischen Dokumentation von Proben wurde das Lichtmikroskop Olympus BH-2 mit

integrierter Digitalkamera (Olympus, Software: analySIS, Software Imaging Systems, Münster, D)

verwendet. Für Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahmen von Transformationsansätzen (2.2.7) wurde

zusätzlich eine Quecksilberlampe angeschlossen und die Filter BP-545 (Anregungsfilter) und Y-455

(Sperrfilter) verwendet. Aufgrund der besseren Auflösung, wurden Fluoreszenzsignale außerdem mit

Hilfe des Konfokal-Lasermikroskop Leica TCS SPE aufgenommen (Software: LAS AF Lite, beides Leica

Microsystems, Wetzlar, D).

2.10 Biolistische Transformation

Zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von PpRH1-3 wurden die entsprechenden

Lokalisierungskonstrukte (pLNU-GFP, Tab. 2.2) über biolistische Transformation nach Herrmann et al.

(2006) transient in Epidermiszellen von Allium cepa eingebracht (Partikelkanone PDS 1000/HE, Bio-

Rad). Fluoreszenzsignale wurden nach einer 24 stündigen Inkubation im Dunkeln am Konfokal-

Lasermikroskop beobachtet (2.9).

2.11 Durchflusszytometrie

Zur Messung des Ploidiegrades der regenerierten Transformanten wurde Moosgewebe von Kulturen

auf Festmedium oder aus Flüssigkulturen geerntet und in 2 ml DAPI Färbelösung (CyStain UV Ploidy,

Partec, Münster, D) in einer Petrischale resuspendiert. Nach mechanischer Zerkleinerung des

Gewebes mit einer Rasierklinge und anschließender Filtration über eine Sieb (30 µm Porengröße),

wurde die UV-Fluoreszenz der Proben vermessen. Hierfür wurde der Ploidie Analyser der Firma

Partec verwendet (verwendete Einstellungen: Gain 390; Speed 0,9 µl/s). Je Probe wurden ca. 1000

http://de.wikipedia.org/wiki/R%C3%B6ntgendiffraktometer


42

Zellkerne ausgezählt. Die Ploidie konnte anhand der Histogramme abgeleitet werden: Bei haploiden

Pflanzen lag der Hauptpeak bei ca. 50, während für diploide Pflanzen die stärkste Fluoreszenz bei 100

gemessen wurde.

2.12 Sequenzanalysen

2.12.1 Sequenzsuche und -vergleiche

Für Sequenzanalysen von Physcomitrella wurde die BLAST-Funktion unter Verwendung der

Standardeinstellungen auf dem cosmoss Server (http://www.cosmoss.org/) zum Screening des

Genoms sowie des Transkriptoms (V1.2 und V1.6, Rensing et al. 2008) verwendet. Sequenzen aus

dem Genom von S. moellendorffii, C. reinhardtii und Volvox carteri wurden über BLAST-Analysen auf

dem JGI Server identifiziert (http://genome.jgi-psf.org/ und http://www.phytozome.net/). Die Suche

von Sequenzen in anderen Genomen als den zuvor genannten erfolgte über die GenBank® Datenbank

des NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Blast.cgi) oder über die DFCI Datenbank

(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html).

Sequenzvergleiche auf Nukleotid-Ebene wurden unter Verwendung der Funktion Align 2 or more

sequences auf dem NCBI Server vorgenommen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=megaBlast&SHOW_DEFAU

LTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq). Global pairwise alignments von Aminosäure-

Sequenzen wurden mit dem EMBOSS::needle pairwise alignment algorithm vorgenommen

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html).

2.12.2 Bestimmung von Proteineigenschaften

Berechnungen von Proteineigenschaften wie Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt etc. wurden

mit Hilfe des ProtParam Tools auf dem ExPASy Proteomics Server (http://expasy.org/tools/

protparam.html) getroffen.

In silico Analysen zur subzellulären Lokalisierung der Proteine wurden mit den Anwendungen TargetP

(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/, Emanuelsson et al. 2007) und MultiLoc (http://www-

bs.informatik.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc, Höglund et al. 2006) durchgeführt.

Angaben zur EST-Frequenz wurden über den cosmoss Server (http://www.cosmoss.org/) erhalten.

2.12.3 Multiple Alignments und Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen

Multiple Alignments wurden mit Hilfe des Programms ClustalW

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, Larkin et al. 2007) erstellt und mit Jalview

Version 2.4 (http://www.jalview.org/, Waterhouse et al. 2009) visualisiert.

Die Erstellung von phylogenetischen Stammbäumen erfolgte in Kooperation mit Dr. D. Kopečný

(Palacký Universität, Olomouc, CZ). Das Alignment der Aminosäure-Sequenzen wurde mit Hilfe des

Programmes MUSCLE Version 3.8 (http://www.drive5.com/muscle/, Edgar 2004) erstellt. Aufgrund

der stark von den anderen Aminosäure-Sequenzen abweichenden Sequenz von AtNSH3 wurde im

Anschluss das Programm Gblocks (http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks.html,

Castresana 2000) angewendet, um schwer alignbare Bereiche zu entfernen und das Alignment auf

Positionen mit ausreichend phylogenetischer Information zu kürzen (verbleibende Positionen: 260


43

von 918 Aminosäuren). Unter Anwendung des maximum likelihood-Kriteriums mit bootstrap-Analyse

wurde die Phylogenie mit dem Programm PhyML Version 3.0 (http://www.atgc-

montpellier.fr/phyml/, Guindon und Gascuel 2003) unter Verwendung des LG-Models der Evolution

(Le und Gascuel 2008) berechnet. Zur Darstellung des Stammbaumes wurde das Programm TreeView

(http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html, Page 1996) verwendet.

Ergebnisse

44

3 Ergebnisse

Pflanzliche Ribohydrolasen (RHs) und ihre zugehörigen Genfamilien sind bisher nur für Arabidopsis

beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde die RH-Genfamilie aus Physcomitrella

identifiziert und eingehend charakterisiert. An rekombinanten Proteinen wurden biochemische

Charakteristika wie Temperatur- und pH-Optimum sowie Substratspezifität einzelner

Familienmitglieder bestimmt. Ebenso wurde die subzelluläre Lokalisierung der PpRHs untersucht. In

einem weiteren Abschnitt wurden single-knockout Pflanzen für PpRH1, PpRH2 und PpRH3 hergestellt

und auf molekularer Ebene analysiert. Anhand von in vivo Markierungsexperimenten mit

verschiedenen Ribosiden sowie LC-MS/MS-basierten Messungen von Purin- und Pyrimidin-Gehalten

wurden die Auswirkungen der jeweiligen RH-knockouts auf den pflanzlichen Stoffwechsel untersucht.

3.1 In vivo RH-Aktivität bei Physcomitrella

In der Literatur wurde RH-Aktivität bereits mehrfach für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben.

Hierzu zählen beispielsweise Gerste (Guranowski und Schneider 1977), Weizen (Chen und Kristopeit

1981), Tomate (Burch und Stuchbury 1986), Gelbe Lupine (Abusamhadneh et al. 2000) und Kaffee

(Campos et al. 2005). Für das Laubmoos Physcomitrella war bisher nicht bekannt, ob es diese Enzym-

Aktivität besitzt. Zur Messung von in vivo RH-Aktivität wurde daher eine unter Standardbedingungen

kultivierte Wildtyp Kultur (1,5 g Gewebe (FG), 20 ml A’BCDNTV-Medium) mit Adenosin (80 µM)

versetzt und nach 24 stündiger Inkubation beprobt. Hierfür wurde eine Probe aus dem Medium

entnommen und per HPLC (2.5) analysiert.

Abb. 3.1 In vivo RH-Aktivität beim Wildtyp von Physcomitrella. Zur Messung von RH-Aktivität wurde einer unter Standardbedingungen gewachsenen Wildtyp Kultur Adenosin (Endkonzentration 80 µM) zugesetzt. Unmittelbar nach Applikation von Adenosin (A.) sowie nach 24 stündiger Inkubation (B.) wurden Proben aus dem Medium entnommen und mittels HPLC analysiert. Die leichte Verschiebung der Retentionszeiten zwischen (A.) und (B.) ist darauf zurückzuführen, dass die beiden Proben in einem größeren zeitlichen Abstand voneinander vermessen wurden. Die Substanzen wurden anhand des jeweiligen UV-Spektrums eindeutig identifiziert.

Ergebnisse

45

Wie aus Abb. 3.1 deutlich wird, konnte die Bildung von Adenin gemessen werden. Aus der

Umwandlung von Adenosin zu Adenin konnte unter diesen Bedingungen eine in vivo

Metabolisierungsrate von 19 nmol h-1 g-1 (FG) für Adenosin bestimmt werden. Ob die Deribosylierung

von Adenosin durch Nukleosid-Phosphorlyase-Aktivität (in Anwesenheit von Phosphat) oder durch

RH-Aktivität erfolgt, kann an dieser Stelle nicht eindeutig bestimmt werden. Aufgrund der Datenlage

in der Literatur wird davon ausgegangen, dass die Bedeutung der Nukleosid-Phosphorylase in

Pflanzen untergeordnet ist (1.1.2). Die beobachtete Umwandlung von Adenosin zu Adenin weist

somit auf eine mögliche RH-Aktivität hin. In vitro Messungen von RH-Aktivität unter Verwendung

eines Puffers ohne Phosphat zeigten ebenfalls eine Umwandlung des Ribosids Inosin zur

korrespondierenden Base Hypoxanthin (3.6.3). Die Existenz von RH-Aktivität in Physcomitrella wird

daher als sehr wahrscheinlich angesehen. In einem nächsten Schritt wurde daher im Genom von

Physcomitrella nach putativen RH-Genen gesucht.

3.2 Identifizierung und Charakterisierung der RH-Genfamilie aus Physcomitrella

Zur Identifizierung von RH-kodierenden Genen im Genom von Physcomitrella wurden Aminosäure-

Sequenzen von bereits bekannten RHs aus Protozoen (C. fasciculata, Accession Q27546; L. major,

Accession P83851; T. vivax, Accession AAG38561) verwendet. Zum damaligen Zeitpunkt waren keine

RH-Sequenzen aus Pflanzen bekannt. Unter Verwendung der BLAST-Funktion wurde mit den oben

genannten Sequenzen das Transkriptom von Physcomitrella (http://www.cosmoss.org/,

Assemblierung V1.2) nach homologen Sequenzen durchsucht. Sowohl die Suche BLASTp (Datenbank

P. patens V1.2_proteins) als auch tBLASTn (Datenbank P. patens V1.2_transcripts) unter Verwendung

der Standardeinstellungen lieferten die folgenden drei Loci als Kandidaten: Pp1s357_22,

Pp1s140_172 und Pp1s5_276 (Tab. 3.1). Diese wurden als PpRH1, -2 und -3 bezeichnet. In Tab. 3.1

sind die wichtigsten Merkmale dieser Loci bzw. der ausgewählten Genmodelle sowie der

korrespondierenden Aminosäure-Sequenzen aufgeführt.

Die insgesamt sehr geringe Homologie der putativen RHs aus Physcomitrella zu RHs aus Protozoen

(10-28 %) lässt sich mit der phylogenetischen Distanz zwischen diesen Organismen erklären.

Die zur Assemblierung V1.2 gehörenden Genmodelle wurden hingehend ihrer Intron/Exon-Struktur,

der Übereinstimmung mit vorhandenen Transkripten sowie dem Vorhandensein des RH-typischen

Sequenzmotives DXDXXXDD (Versées und Steyaert 2003, Pfam ID PF01156) analysiert und als korrekt

bewertet. Keines der drei Genmodelle wird allerdings über die gesamte Länge des Gens durch ESTs

gestützt.

Auch nach Veränderung der verwendeten Parameter zur Reduktion der Stringenz lieferte die BLAST-

Suche keine weiteren Kandidaten. Die Genfamilie der RHs in Physcomitrella scheint demnach mit drei

putativen Mitgliedern relativ klein zu sein.

Ergebnisse

46

Tab. 3.1 Eigenschaften der RH-Genfamilienmitglieder aus Physcomitrella, die nach einer BLAST-Suche im Physcomitrella Genom mit den Sequenzen protozoischer RHs (Crithidia fasciculata, Accession Q27546; Leishmania major, Accession P83851; Trypanosoma vivax, Accession AAG38561) selektiert wurden. (a)

Homologie über http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html (b)

Genmodelle und die Anzahl der ESTs stammen von https://www.cosmoss.org/mgb2/gbrowse/physcome

(c) Parameter der Proteine wurden über

http://expasy.org/tools/protparam.html bestimmt.

PpRH1 PpRH2 PpRH3

Sequenz Nr. Pp1s357_22 Pp1s140_172 Pp1s5_276

Identität zu protozoischen RHs

(a) [%]

17-27 12-28 10-24

Genmodell/ Position

(b)

Pp1s357_22V2.1 (Phypa_226360)

scaffold_357: 158771..162989

(+ strand)

Pp1s140_172V2.1 (Phypa_137777)

scaffold_140: 1015516..1019756

(- strand)

Pp1s5_276V2.1 (Phypa_55133)

scaffold_5: 1889219..1893898

(+ strand)

Anzahl an ESTs(b)

14 3 5

ORF [bp] 1002 987 1047

Abgeleitete Protein-Sequenz [aa]

334 329 349

MW(c)

[kDa] 36,08 35,46 37,67

pI(c)

4,96 4,90 4,97

Sequenzmotiv (Pfam ID PF01156)

DXDXXXDD DXDXXXDD DXXXXXXDD

In Abb. 3.2 ist die zugehörige Intron/Exon-Struktur der zur Genom-Assemblierung V1.2 gehörenden

Genmodelle für PpRH1, -2 und -3 schematisch dargestellt. Alle drei Genmodelle weisen acht Introns

auf, wobei das 1. Intron immer das längste ist (692 bp bei PpRH1, 1454 bp bei PpRH2 und 1466 bp bei

PpRH3). Darüberhinaus lassen sich Ähnlichkeiten hinsichtlich der Anordnung und Länge der Exons

zwischen den selektierten Genmodellen erkennen. Das zuvor erwähnte Sequenzmotiv ist bei allen

drei Genmodellen am Übergang vom 1. zum 2. Exon lokalisiert (gelb markiert in Abb. 3.2).

Abb. 3.2 Schematische Darstellung der Intron/Exon-Struktur von PpRH1, -2 und -3. In grau sind untranslatierte Bereiche in der 5‘- und 3‘-Region dargestellt, blaue Boxen stellen die kodierenden Abschnitte (Exons) dar, die von Introns unterbrochen sind. Das für RHs typische Sequenzmotiv (DXDXXXDD, Pfam ID PF01156) befindet sich am Übergang zwischen 1. und 2. Exon (gelbe Boxen).

Die RH-Genfamilie mit den Mitgliedern PpRH1, -2 und -3 wurde zunächst in silico hinsichtlich der

Eigenschaften der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen detailliert analysiert.

Außerdem wurde eine heterologe Überexpression aller drei PpRHs angestrebt, um Untersuchungen

am rekombinanten Protein vorzunehmen. Aufgrund der zahlreichen EST-Evidenzen wurde PpRH1 für

eine umfassende Charakterisierung auf proteinbiochemischer Ebene ausgewählt (3.4).

Ergebnisse

47

3.2.1 Aminosäure-Sequenzvergleiche von PpRH1, -2 und -3

Die wichtigsten Charakteristika der PpRH1, -2 und -3 zugrunde liegenden Aminosäure-Sequenzen

sind in Tab. 3.1 aufgeführt. Die abgeleiteten Protein-Sequenzen variieren von 329 (PpRH2) über 334

(PpRH1) bis 349 (PpRH3) Aminosäuren mit Molekulargewichten (MW) von 35,46 (PpRH2) über 36,08

(PpRH1) bis 37,67 (PpRH3) kDa. Der isoelektrische Punkt wurde mit 4,90 (PpRH2), 4,96 (PpRH1) und

4,97 (PpRH3) berechnet.

Für Vergleiche der Aminosäure-Sequenzen wurde der ClustalW Algorithmus verwendet. Zur

Ermittlung der prozentualen Identität der Sequenzen im paarweisen Alignment wurde der

EMBOSS::needle Algorithmus eingesetzt, der die folgenden Identitäten berechnete: PpRH1 zu PpRH2

51 %; PpRH1 zu PpRH3 43 % und PpRH2 zu PpRH3 76 %. PpRH2 und -3 sind sich demnach deutlich

ähnlicher als PpRH1 und -2 bzw. -3

Wie bereits erwähnt, liegen bisher nur sehr wenige Informationen zu RHs aus Pflanzen vor. Details zu

Sequenzeigenschaften wie Aminosäure-Resten, die die Substratspezifität beeinflussen, sind derzeit

nur für RHs aus Protozoen bekannt. In Abb. 3.3 ist ein Alignment von RHs aus Protozoen mit der

putativen RH-Familie aus Physcomitrella unter Markierung katalytisch wichtiger Aminosäuren

dargestellt.

Abb. 3.3 Multiples Alignment der Aminosäure-Sequenzen von RHs aus Protozoen (TvIAGRH: Trypanosoma vivax, Accession AAG38561, CfIURH: Crithidia fasciculata, Accession Q27546, LmIURH: Leishmania major, Accession P83851) und putativen RHs aus Physcomitrella (PpRH1, PpRH2, PpRH3). Das Alignment wurde mit ClustalW berechnet, manuell editiert und mit Jalview graphisch dargestellt. Gelb umrahmt ist das typische Sequenzmotiv DXDXXXDD für RHs, blaue Rahmen markieren Aminosäuren, die nach Angaben von Versées et al. (2001) bei der RH aus T. vivax eine Interaktion mit dem Purin eingehen (N12, D40, W83, N173, Y257 und W260), während rote Rahmen auf Aminosäure-Reste hinweisen, die mit der Ribose interagieren (D14, N173, E184, N186 und D261).

Ergebnisse

48

Es zeigt, dass das N-terminale Motiv aus Aspartat-Resten – DXDXXXDD (Pfam ID PF01156, gelb

umrahmt in Abb. 3.3) -, das von Versées und Steyaert (2003) als charakteristisch für RHs beschrieben

wurde, auch in zwei der selektieren Kandidaten aus Physcomitrella vorhanden ist. In der Sequenz von

PpRH3 hingegen ist das Motiv in der abgewandelten Form DXXXXXXDD statt DXDXXXDD vorhanden.

Es ist unbekannt, ob die Modifikation des Sequenzmotivs Einfluss auf die Aktivität hat. Versées et al.

(2001) identifizierten Aminosäure-Reste, die mit dem Purin-Rest des Ribosids interagieren (blaue

Rahmen, Abb. 3.3) bzw. solche, die an der Bindung des Ribose-Anteils (rote Rahmen, Abb. 3.3)

beteiligt sind. Wie aus Abb. 3.3 deutlich wird, zeigen mit der Nukleobase interagierende Aminosäure-

Reste insgesamt eine höhere Divergenz als solche, die spezifisch für die Bindung der Ribose sind.

Putative RHs aus Physcomitrella zeigen eine hohe Homologie mit protozoischen RHs in Regionen, die

für die Interaktion mit der Ribose wichtig sind, während Aminosäuren zur Interaktion mit dem Basen-

Rest sich stärker unterscheiden. Dies deutet möglicherweise auf eine andere Substratspezifität hin.

3.3 Herstellung rekombinanter PpRHs in E. coli

Nach Identifizierung der RH-kodierenden Gene PpRH1, -2 und -3 über eine entsprechende BLAST-

Suche, wurde die Klonierung der zugehörigen cDNA-Sequenzen angestrebt. Während PpRH1 aus

einer cDNA-Bank amplifiziert wurde, wurden die Sequenzen von PpRH2 und -3 über Gensynthese

erhalten.

3.3.1 Klonierung von PpRH1

Das mittels BLAST-Suche im Genom von Physcomitrella selektierte Gen PpRH1 (Genmodell:

Pp1s357_22V2.1) weist einen ORF von 1002 bp auf, der für ein Protein mit einer Länge von 334

Aminosäuren kodiert (Tab. 3.1, Aminosäure-Sequenz siehe Anhang, 6.2.1). Versuche, den gesamten

ORF aus einer cDNA-Bank aus Protonemagewebe (Reski et al. 1995) in einem Schritt zu amplifizieren,

waren nicht erfolgreich. Daher wurden zunächst zwei sich überlappende Teilfragmente amplifiziert

(Primer 235/239, 238/236, Tab. 2.3). Die Teilfragmente wurden dabei so gewählt, dass im

Überschneidungsbereich eine BglII-Schnittstelle liegt, die später zur Ligation der beiden Fragmente

genutzt wurde. Mit einer proof reading Polymerase wurden die Teilfragmente aus der cDNA-Bank

amplifiziert und anschließend aufgereinigt. Nach einem Restriktionsverdau mit BglII, erfolgte die

Ligation der Fragmente. Das so erhaltene Fragment wurde als Template in die PCR eingesetzt und

unter Verwendung der terminalen Primer 235/236 nochmals reamplifiziert. Die gesamte kodierende

Sequenz von PpRH1 wurde dann in den Vektor pCR®4Blunt-TOPO® kloniert, in E. coli transformiert

und das erhaltene Konstrukt sequenziert. Die via PCR amplifizierte cDNA-Sequenz bestätigte die dem

Genmodell Pp1s357_22V2.1 zugrunde liegende Nukleotid-Sequenz.

3.3.2 Gensynthesen von PpRH2 und -3

Zum Erhalt der kodierenden Sequenzen von PpRH2 und -3 wurde die Firma DNA Cloning Service mit

Gensynthesen beauftragt. Die hierfür verwendeten Sequenzen wurden von den entsprechenden

Genmodellen aus der Assemblierung V1.2 abgeleitet (Genmodell PpRH2: Pp1s140_172V2.1;

Genmodell PpRH3: Pp1s5_276V2.1, Aminosäure-Sequenzen siehe Anhang, 6.2.2, 6.2.3). Die zum

damaligen Zeitpunkt veröffentlichten ESTs bestätigten die entsprechenden Genmodelle und es

bestand kein Grund zur Annahme, dass die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen fehlerhaft sein

könnten. Für spätere Klonierungen wurden die synthetisierten Gen-Sequenzen am N-Terminus mit

Ergebnisse

49

einer NheI-, am C-Terminus mit einer XhoI-Schnittstelle versehen. Eine Codon-Optimierung wurde

nicht vorgenommen.

3.3.3 Heterologe Expression von PpRH1, -2 und -3 in E. coli

Zum Nachweis der Funktionalität der aus Physcomitrella selektierten RH-Gene, wurde eine

heterologe Expression aller drei Proteine in E. coli angestrebt. Hierfür wurde eine N-terminale

Histidin-Markierung der Proteine nach Expression im Vektor pET28a ausgewählt.

Die kodierende Sequenz von PpRH1 wurde mit den Primern 312/314 (Tab. 2.3) aus dem Vektor

pCR®4Blunt-TOPO®_PpRH1 mittels proof reading Polymerase amplifiziert. Über NheI und SalI erfolgte

die in frame-Klonierung mit einem N-terminalen Polyhistidin-Tag in den Vektor pET28a. PpRH2

und -3 wurden über Gensynthese erhalten und die angefügten, terminalen Schnittstellen von NheI

und XhoI zur in frame-Klonierung in den Vektor pET28a verwendet. Auch hier wurde der Polyhistidin-

Tag an den N-Terminus angefügt.

Die Expression der rekombinanten PpRH Proteine wurde in dem E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS

vorgenommen (2.4.2). Nach Herstellung der Proteinextrakte erfolgte die Aufreinigung über Ni-

Agarose wie unter 2.4.3 bzw. 2.4.4 beschrieben. Für PpRH1 und PpRH2 wurde, wie Abb. 3.4 A. zeigt,

erfolgreich rekombinantes Protein mit der erwarteten Größe (38,6 kDa bzw. 38,0 kDa) gewonnen.

Die erhaltene Proteinpräzipitation wurde nach Entsalzung über Dialyse und Aufnahme in 1 x TKD

Puffer (2.4.1) für die enzymkinetische Charakterisierung, insbesondere die Messung des jeweiligen

Substratspektrums eingesetzt. Aktivitätstests wiesen für beide Proteine eindeutig Aktivität nach

(3.4.3).

Abb. 3.4 Heterologe Expression von PpRH1, -2 und -3 im E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS. (A.): SDS-Polyacrylamid-Gel mit rekombinantem PpRH1 und -2 Protein nach Expression in E. coli. Proteinextrakte aus E. coli-Kulturen nach 15 stündiger, IPTG-induzierter Expression von His-getagtem PpRH1 bzw. -2 Protein wurden nach Aufreinigung auf einem 12,5 %igem SDS-Gel aufgetrennt. (B.): SDS-Polyacrylamid-Gel mit rekombinantem SUMO-PpRH3 Protein nach Expression in E. coli. Die lösliche und unlösliche Fraktion des Proteinextraktes wurde nach 6 stündiger, IPTG-induzierter Expression auf einem 12,5 %igem SDS-Gel aufgetrennt. Färbung der Gele in (A.) und (B.) mit Colloidal-Coomassie.

Ergebnisse

50

Die Expression von PpRH3 in dem E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS lieferte unlösliches Protein, das nur

mittels eines Western Blots unter Verwendung eines anti His-Tag-Antikörpers im Pellet

nachzuweisen war (Daten nicht gezeigt). Um die Löslichkeit des Proteins zu verbessern, wurden

verschiedene Strategien getestet. Zunächst erfolgte die Expression des Proteins bei niedrigen

Temperaturen (16-18 °C), die aber keine Verbesserung brachte. Im Anschluss wurden

unterschiedliche E. coli-Stämme (BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL, Rosetta(DE3)pLysS, C41 (DE3), ER2566,

2.3.1) zur Expression verwendet, die die Expression verbessern und/oder die Löslichkeit von

Proteinen erhöhen sollen. Auch auf diesem Weg konnte im löslichen Überstand kein PpRH3 Protein

in nennenswerter Menge erhalten werden. Es waren lediglich geringe Mengen im Western Blot unter

Verwendung eines anti His-Tag-Antikörpers detektierbar (Daten nicht gezeigt). Als weitere

Möglichkeit zur erfolgreichen Expression unlöslicher Proteine bietet sich die Co-Expression mit einem

löslichen Protein an. In diesem Fall wurde das Champion™ pET SUMO Protein Expression System

verwendet, dass die Expression eines Fusionsproteins aus SUMO-Tag und PpRH3 erlaubt (zur

Klonierung verwendete Primer 326/423, Tab. 2.3; Größe des Fusionsproteins 51 kDa). Die Analyse

der Proteinextrakte zeigte jedoch, dass auch das SUMO-Tag zu keiner Verbesserung der Löslichkeit

von PpRH3 führte (Abb. 3.4 B.). Daher konnte keine weiterführende Charakterisierung von PpRH3

hinsichtlich des Substratspektrums etc. vorgenommen werden.

3.4 Charakterisierung rekombinanter PpRHs

3.4.1 Quartärstruktur von PpRH1

Von RHs aus Protozoen sowie aus einigen Pflanzen ist bereits bekannt, dass diese häufig nicht als

Monomer, sondern als Di- oder Tetramere auftreten (z.B. Campos et al. 2005, Abusamhadneh et al.

2000). Ob das auch für RHs aus Physcomitrella zutrifft, sollte am Beispiel von PpRH1 untersucht

werden. Hierfür wurde das rekombinante Protein zunächst auf einem nativen Polyacrylamid-Gel

analysiert. Da die Oligomerisierung häufig konzentrationsabhängig erfolgt, wurden 100, 50 und 25 µg

rekombinantes PpRH1 auf ein natives Gel aufgetragen. Wie Abb. 3.5 C. zeigt, liegt PpRH1 demnach zu

einem Großteil als Dimer (77,2 kDa) vor. Ein geringer Anteil des Proteins konnte zudem als Tetramer

(154,4 kDa) nachgewiesen werden. Das Monomer (38,6 kDa) konnte nicht detektiert werden.

Neben nativer-PAGE wurde außerdem zur Bestimmung der Quartärstruktur von PpRH1 eine

Gelfiltration über FPLC vorgenommen. Für die Kalibrierung wurde der Gel Filtration Standard von Bio-

Rad eingesetzt, der den Molekulargewichtsbereich von 1,3-670 kDa abdeckt (Abb. 3.5 A.). Zur

Untersuchung der Quartärstruktur von PpRH1 wurden 1-7 mg an rekombinantem PpRH1 Protein

verwendet. Zunächst wurden FPLC-Läufe mit 1 bzw. 3 mg PpRH1 vorgenommen. Aus diesen konnte

mit Hilfe des Standards ein Molekulargewicht von 77-83 kDa für PpRH1 berechnet werden. Dies

Ergebnis weist auf das Vorliegen von PpRH1 in Form eines Dimers hin (Abb. 3.5 B.). Peaks, die der

Molekülmasse des Monomers entsprachen, konnten ebenso wie bei der nativen-PAGE nicht

nachgewiesen werden. Bei höheren Konzentrationen (> 7 mg) wurde ein Molekulargewicht von

132 kDa berechnet, das darauf schließen lässt, dass PpRH1 bei hoher Konzentration auch zur

Tetramer-Bildung neigt (Abb. 3.5 B.).

Somit wurde über native-PAGE und Gelfiltration übereinstimmend nachgewiesen, dass das

rekombinante PpRH1 Protein vorrangig als Dimer auftritt. Außerdem wurde die Bildung eines

Tetramers bei hohen Konzentrationen beobachtet

Ergebnisse

51

3.4.2 Ansätze zur Kristallisierung von PpRH1

Die Versuche zur Kristallisierung von PpRH1 wurden in Zusammenarbeit mit Dr. D. Kopečný (Palacký

Universität, Olomouc, CZ) durchgeführt. Die Kristallisationsansätze mit rekombinantem, über Co-

Agarose aufgereinigtem PpRH1 Protein erfolgten nach der Dampfdiffusionsmethode mit hängendem

Tropfen. Zum Auffinden von geeigneten Kristallisierungsbedingungen wurden verschiedene

screening kits verwendet (2.8). Wie die Abb. 3.6 zeigt, wurden erste Kristalle für PpRH1 erhalten.

Diese wurden über Reservoiren gebildet, die 0,1 M HEPES pH 7,5 mit 100 mM NaCl und 18 % (w/v)

PEG 4000 enthielten. Bei der anschließenden Vermessung im Röntgendiffraktometer in der

Synchrotronanlage SOLEIL (Saclay, F) wurde eine nur sehr geringe Auflösung von 4,1 Å bestimmt. Die

Analyse der Kristalle zeigte, dass die asymmetrische Einheit vier oder sechs Monomere enthält, die in

Form von zwei oder drei Dimeren auftreten. Weiterführende Experimente zur Kristallisierung von

PpRH1 zum Erhalt von Strukturdaten von Kristallen mit einer deutlich besseren Auflösung (< 2,5 Å)

sind derzeit in Vorbereitung. Unter anderem soll rekombinantes PpRH1 Protein erzeugt werden, dass

keinen Tag am N-Terminus besitzt, da dieses sich störend auf die Kristallisierung auswirken kann.

A.

B.

C.

Abb. 3.5 Bestimmung der Quartärstruktur von rekombinantem PpRH1 Protein; (A.) und (B.): Gelfiltrationschromatografie unter Verwendung einer Bio-Prep SE-100/17-Säule (Bio-Rad); (A.): Gel Filtration Standard von Bio-Rad mit Angabe der entsprechenden Molekulargewichte. Die rote Linie zeigt die Auftragung des Logarithmus des Molekulargewichtes gegen das Elutionsvolumen. (B.): Elutionsprofil von 1 mg (in 15 µl, pink), 3 mg (in 35 µl, grün) und 7 mg (in 100 µl, blau) PpRH1; (C.): Natives Polyacrylamid-Gel (8 %) mit 100, 50 und 25 µg PpRH1 nach Färbung mit Colloidal-Coomassie.

http://de.wikipedia.org/wiki/R%C3%B6ntgendiffraktometer

Ergebnisse

52

Abb. 3.6 Kristalle des rekombinanten PpRH1 Proteins. Kristalle wurden in Reservoiren erhalten, die 0,1 M HEPES pH 7,5 mit 100 mM NaCl und 18 % (w/v) PEG 4000 enthielten. Die Untersuchung der Kristalle im Röntgendiffraktometer (Auflösung 4,1 Å) lieferte die folgenden Daten: Die Kristalle gehören zu einer primitiven, tetragonalen Raumgruppe P42212. Für die Elementarzelle wurden die folgenden Parameter ermittelt:

a = 126,08; b = 126,08; c = 255,11; α = 90°; β = 90°; = 90°. Die asymmetrische Einheit enthielt vier oder sechs Monomere die in Form von zwei oder drei Dimeren vorlagen und einem Matthews-Koeffizienten (Matthews 1968) von 3,37 (entspricht einem Flüssigkeitsgehalt von ca. 63 %) bzw. 2,25 Å

3 Da

-1 (entspricht einem

Flüssigkeitsgehalt von ca. 45 %) aufwiesen. In Kooperation mit Dr. D. Kopečný (Palacký Universität, Olomouc, CZ).

3.4.3 Aktivitätsnachweis rekombinanter PpRHs

Für die Messung von RH-Enzym-Aktivität, wurden wie in 2.4.11 beschrieben zwei unterschiedliche

Assays angewendet. Der spektrophotometrische Assay nach Parkin (1996) beruht auf der Messung

einer Absorptionsänderung bei einer bestimmten Wellenlänge. Die Änderung der Absorption nach

der vollständigen Umwandlung einer 1 mM Lösung eines Ribosids zur korrespondierenden Base wird

als Δε beschrieben und kann experimentell ermittelt und zur Berechnung der spezifischen Aktivität

eingesetzt werden. In Abb. 3.7 A. ist das Prinzip des spektrophotometrischen Assays am Beispiel von

Adenosin dargestellt. Links ist das Spektrum von Adenosin gezeigt. Erfolgt ein Umsatz von Adenosin

zu Adenin, ist eine Abnahme der Absorption bei 276 nm messbar (Abb. 3.7 A., rechts). Wird eine

1 mM Lösung von Adenosin vollständig zu Adenin umgesetzt, kann zwischen den beiden Spektren

Δε276 nm= -1,4 gemessen werden.

Ergebnisse

53

Abb. 3.7 Messgrundlagen der verwendeten Enzym-Assays zur Bestimmung von RH-Aktivität. (A.): Spektrophotometrischer Enzym-Assay nach Parkin (1996). Links ist das Spektrum von Adenosin im Bereich von 240-290 nm gezeigt; Rechts sind die Spektren von Adenosin und Adenin im Vergleich gezeigt, wobei der Bereich von 265-285 nm vergrößert dargestellt wurde. Als Messwellenlänge wurde 276 nm ausgewählt, da die beiden Spektren hier eine deutliche Differenz aufweisen (roter Pfeil). Aus Absorptionsänderungen wurde RH-Aktivität errechnet. (B.): HPLC-basierter Enzym-Assay. Links ist ein HPLC-Chromatogramm von Adenosin, rechts von Adenosin und Adenin dargestellt. Die chromatografische Auftrennung von Ribosid und Base ermöglicht die Messung von RH-Aktivität.

Abschnitt B. der Abb. 3.7 veranschaulicht das dem HPLC-basierten Enzym-Assay zugrunde liegende

Prinzip. Die durch RH-Aktivität auftretende Umwandlung des Ribosids zur korrespondierenden Base –

hier am Beispiel von Adenosin und Adenin gezeigt – wird durch die chromatografische Auftrennung

von Substrat und Produkt via HPLC sichtbar gemacht. Substrat und Produkt sowie mögliche

Nebenprodukte können eindeutig anhand von Retentionszeit und UV-Spektrum identifiziert und

quantifiziert werden.

Je nach Anwendung wurde einer der beiden Assays zur Messung der RH-Aktivität eingesetzt. Die

parallele Vermessung von Enzym-Assays mit beiden Methoden zeigte, dass vergleichbare Werte

erhalten werden.

Für Aktivitätstests wurden die rekombinanten Proteine von PpRH1 und -2 in Enzym-Assays nach den

zuvor beschriebenen Methoden eingesetzt. Für beide RH-Proteine wurde eindeutig Aktivität

nachgewiesen. In den folgenden Abschnitten werden die ermittelten kinetischen Parameter im Detail

beschrieben.

Ergebnisse

54

3.4.4 Ermittlung enzymkinetischer Parameter rekombinanter PpRHs

Nach erfolgreicher Gewinnung von heterolog exprimiertem PpRH1 und -2 Protein wurden die

rekombinanten Proteine hinsichtlich ihrer enzymatischen Charakteristika analysiert. Hierfür wurden

zunächst am Beispiel von PpRH1 die bevorzugten Reaktionsbedingungen bestimmt. Im Anschluss

folgten Messungen zur Ermittlung des Substratspektrums für PpRH1 und -2.

3.4.4.1 Bestimmung der optimalen Reaktionsbedingungen für PpRH1

Zur genaueren Charakterisierung von PpRH1 wurde zunächst ermittelt, welches die bevorzugten

Temperatur- und pH-Bedingungen darstellen.

3.4.4.1.1 Temperatur-Optimum von PpRH1

Das Temperatur-Optimum des rekombinanten PpRH1 Proteins wurde unter Verwendung des Parkin-

Assays ermittelt. Inosin wurde als bevorzugtes Substrat von PpRH1 bestimmt und daher als Substrat

für das Experiment ausgewählt (3.4.4.2). Jeder Reaktionsansatz enthielt ca. 6 µg rekombinantes

PpRH1 Protein sowie Inosin mit einer Konzentration von 400 µM und wurde in Triplikaten

vermessen. Die höchste Aktivität für PpRH1 wurde bei 35 °C gemessen (Abb. 3.8). Bei 40 °C waren

noch 91 % der Aktivität vorhanden, während das Enzym bei 50 °C bereits 95 % seiner Aktivität

verloren hatte. Eine Minderung der Temperatur auf 20 °C führte zu einer verbleibenden Aktivität von

46 % und bei nur 16 °C Reaktionstemperatur waren noch 30 % der Aktivität erhalten.

Abb. 3.8 Einfluss der Temperatur auf die katalytische Aktivität von PpRH1. Enzym-Assays nach Parkin (1996) wurden mit Inosin (400 µM) als Substrat bei einem konstanten pH von 7,5 in 1x TKD Puffer durchgeführt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an (n= 3).

3.4.4.1.2 pH-Optimum von PpRH1

Zur Messung der optimalen pH-Bedingungen für PpRH1 wurden Enzym-Assays mit Inosin als Substrat

bei unterschiedlichen pH-Werten durchgeführt. Hierfür wurden zwei verschiedene Puffersysteme

0

20

40

60

80

100

15,8 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 53,0

Re

lati

ve A

ktiv

ität

[%]

Temperatur [° C]

Ergebnisse

55

verwendet, um einen weiten pH-Bereich abzudecken: Für den Bereich von pH 3,5-8,0 wurde ein

Citrat/Phosphatpuffer, für den Bereich von pH 7,5-10,0 ein Glycin/NaOH-Puffer verwendet. Die

Ansätze (ca. 5 µg rekombinante PpRH1, Inosin 70 µM) wurden nach 10 minütiger Inkubation bei

Raumtemperatur mittels HPLC-Analyse ausgewertet (2.5). Der Parkin-Assay wurde für diesen Versuch

nicht angewendet, da der molare Extinktionskoeffizient pH-abhängig ist und es daher zu Fehlern bei

der anschließenden Auswertung kommen würde. Anhand der Menge an umgesetztem Inosin bzw.

gebildetem Hypoxanthin wurde die spezifische Aktivität unter den jeweiligen pH-Bedingungen

berechnet. Wie die Abb. 3.9 zeigt, liegt das pH-Optimum des rekombinanten PpRH1 Proteins bei

7,5-8,0 je nach verwendetem Puffer. Bei pH 5,5 konnte ein Aktivitätsminimum gemessen werden,

dass vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass hier der isoelektrische Punkt des rekombinanten

PpRH1 Proteins liegt (pI: 5,56). Bei pH 6,5 sind noch ca. 60 % der Aktivität zu messen wohingegen bei

pH 8,5 ca. 90 % der Aktivität vorliegen. Geringe Aktivität konnte auch im sauren Bereich (pH < 5,5)

gemessen werden (max. 30 %, Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.9 Einfluss des pH-Wertes auf die katalytische Aktivität von PpRH1. Unter Verwendung von Inosin als Substrat (70 µM) wurden HPLC-basierte Enzym-Assays bei verschiedenen pH-Bedingungen, pH 3,5-8,0 Citrat/Phosphatpuffer und pH 7,5-10,0 Glycin/NaOH-Puffer, bei einer konstanten Temperatur von 20 °C durchgeführt. Daten für pH 3,5-5,5 sind nicht gezeigt.

3.4.4.2 Ermittlung des Substratspektrums von PpRH1 und -2

Zur Charakterisierung der RHs aus Physcomitrella und um erste Hinweise auf eine mögliche

Bedeutung dieser Enzyme im pflanzlichen Stoffwechsel zu erhalten, wurde zunächst die

Substratspezifität von PpRH1 und -2 am rekombinanten Protein untersucht. Hierfür wurde der

spektrophotometrische Assay nach Parkin (1996) angewandt, bei dem die Änderung der Absorption

bei einer Substrat-spezifischen Wellenlänge gemessen wird (2.4.11.1). Da für PpRH3 kein lösliches

rekombinantes Protein erhalten wurde, blieb dieses von der Messung ausgeschlossen.

Die Bestimmung der apparenten Affinitätskonstante, des Km Wertes, erfolgte durch Vermessung der

initialen, über einen Zeitraum von 5-10 Minuten konstanten Geschwindigkeit bei

15-25 verschiedenen Substratkonzentrationen. Die Tab. 3.2 zeigt die kinetischen Konstanten, die für

0

20

40

60

80

100

5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11

Re

lati

ve A

ktiv

ität

[%

]

pH

Citrat/Phosphatpuffer

Glycin/NaOH-Puffer

Ergebnisse

56

PpRH1 und -2 ermittelt wurden. In Abb. 3.10 sind die resultierenden, hyperbolischen Michaelis-

Menten-Kinetiken für PpRH1 am Beispiel der Substrate Inosin, Adenosin, Guanosin und Uridin

gezeigt. Anhand eines Lineweaver-Burk-Diagramms, die reziproke Darstellung von

Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit, wurden die Werte für Km und Vmax abgeleitet.

Zur Überprüfung der erhaltenen Werte wurde außerdem die Software GraFit Data Analysis Software

Version 4.0 (Erithacus Software Ltd., East Grinstead, GB) verwendet.

Folgende Ergebnisse wurden dabei erhalten (Tab. 3.2): Inosin ist eindeutig das bevorzugte Substrat

von PpRH1 mit einer maximalen katalytischen Aktivität von 100 nmol s-1 mg-1 und einer apparenten

Affinitätskonstante von 82 µM. Danach folgen die Purine Adenosin und Guanosin, die eine geringere

Affinität besitzen (101 bzw. 166 µM) und mit einer deutlich gesenkten Maximalgeschwindigkeit

hydrolysiert werden (12 bzw. 5 nmol s-1 mg-1). Ein weiteres, allerdings nur sehr schwach umgesetztes

Substrat ist Uridin (Km 1485 µM, Vmax 53 nmol s-1 mg-1). Für weitere Pyrimidine, Cytidin und Thymidin,

wurde kein Umsatz gemessen. Letztere scheinen also keine Substrate für PpRH1 zu sein. Für

Xanthosin sowie das Cytokinin Isopentenyladenosin (iPR) wurde ebenfalls Aktivität mittels eines

HPLC-basierten Assays nachgewiesen (2.4.11.2).

Tab. 3.2 Kinetische Konstanten von PpRH1 und -2, die am rekombinanten Protein aus E. coli mittels eines spektrophotometrischen Assays nach Parkin (1996) ermittelt wurden.

Substrat PpRH1 PpRH2

Km

[µM]

Vmax [nmol s

-1 mg

-1]

Vmax/Km [relativ]

Km

[µM]

Vmax [nmol s

-1 mg

-1]

Vmax/Km

Inosin 82 100 1,21 [100] Aktivität n. d.

Adenosin 101 12 0,11 [9,1] Aktivität n. d.

Guanosin 166 6 0,04 [3,3] Aktivität n. d.

Uridin 1485 53 0,03 [2,9] 1015 27 0,02

Xanthosin* aktiv, Km und Vmax nicht bestimmt aktiv, Km und Vmax nicht bestimmt

iPR* aktiv, Km und Vmax nicht bestimmt aktiv, Km und Vmax nicht bestimmt

Cytidin Aktivität n. d. Aktivität n. d.

Thymidin Aktivität n. d. Aktivität n. d. * über einen HPLC-basierten Assay gemessen (2.4.11.2) n. d. = nicht detektierbar, Aktivität entweder gar nicht zu messen oder < 0,1 nmol s

-1 mg

-1

aktiv = Aktivität > 0,1 nmol s-1

mg-1

Für Vmax/Km [relativ] wurde der für Inosin berechnete Wert = 100 % gesetzt

Die vorliegenden Daten zum Substratspektrum zeigen, dass es sich bei PpRH1 eindeutig um eine

Purin-bevorzugende RH handelt, die aber auch in der Lage ist Pyrimidine sowie das Purin-Derivat iPR

umzusetzen.

Für PpRH2 wurde insgesamt eine schwächere katalytische Aktivität gemessen. Für das Pyrimidin

Uridin wurde ein Km von 1015 µM zusammen mit einer maximalen katalytischen Aktivität von

27 nmol s-1 mg-1 gemessen (Tab. 3.2). Schwache Aktivität wurde auch für das Purin Xanthosin sowie

das Cytokinin iPR gemessen. Für alle weiteren, in Tab. 3.2 aufgeführten potentiellen Substrate wurde

keine Aktivität gemessen. Nach dem dargestellten Datenstand handelt es sich somit bei PpRH2 - im

Gegensatz zu PpRH1 - um eine Pyrimidin-bevorzugende RH.

Ergebnisse

57

A.

B.

C.

D.

Abb. 3.10 Michaelis-Menten-Kinetik der PpRH1-Aktivität unter Verwendung der Substrate Inosin (A.), Adenosin (B.), Guanosin (C.) und Uridin (D.), eingefügt sind die zugehörigen Lineweaver-Burk-Diagramme. Rekombinantes PpRH1 Protein wurde durch Expression in E. coli erhalten und anschließend aufgereinigt. Mittels eines Enzym-Assays nach Parkin (1996) wurde der Effekt der Substratkonzentration auf die Hydrolyse der verwendeten Substrate gemessen. V = Reaktionsgeschwindigkeit [nmol s

-1 mg

-1], S =

Substratkonzentration [µM]. Es wurden drei unabhängige Bestimmungen durchgeführt, wobei hier ein repräsentatives Experiment dargestellt ist.

3.4.4.3 Einfluss von CaCl2 auf die Enzym-Aktivität

Aus der Literatur ist bekannt, dass einige RHs Calcium-Bindungsstellen besitzen und zur Ausprägung

ihrer Aktivität Calcium als Co-Faktor benötigen (z.B. Szuwart et al. 2006, Versées und Steyaert 2003).

Aus diesem Grund wurden mit rekombinantem PpRH1 Protein Enzym-Assays unter Calcium-Zugabe

durchgeführt (Substrat: Inosin, 150 µM) um zu testen, ob dieses einen Einfluss auf die Hydrolyse des

Substrates hat. Die Auswertung der Assays erfolgte via HPLC (2.4.11.2). In Enzym-Assays wurde

Calciumchlorid in Konzentrationen von 10, 100 sowie 1000 µM verwendet. Dies entsprach einem

molaren Verhältnis von Ca2+-Ionen zu Protein-Molekülen von 5000, 50.000 bzw. 500.000. Es konnte

weder eine Steigerung noch eine Minderung der Aktivität nach Calcium-Addition gemessen werden

(Abb. 3.11). Allerdings konnte eine Reduktion der Aktivität nach Zugabe von EDTA bzw. EGTA

festgestellt werden, wobei die Reduktion unabhängig von der Konzentration stärker nach Addition

von EDTA war (ca. 10 % Rest-Aktivität bei Zugabe von EDTA, ca. 30 % Rest-Aktivität bei Zugabe von

EGTA). EDTA und EGTA sind beides Komplexbildner, die Chelatkomplexe mit 2-wertigen Kationen

Ergebnisse

58

eingehen. Die Reduktion der Aktivität nach Zugabe dieser Substanzen lässt vermuten, dass PpRH1

Co-Faktoren in Form von 2-wertigen Kationen zur Erlangung der vollständigen Aktivität benötigt. Ob

es sich dabei um Calcium oder andere 2-wertige Kationen wie Magnesium handelt, kann anhand

dieser Daten nicht festgestellt werden.

Abb. 3.11 Einfluss von Calcium, EDTA und EGTA auf die Aktivität von PpRH1 unter Verwendung von Inosin als Substrat. Enzym-Assays wurden per HPLC vermessen. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an (n=3).

3.4.4.4 Test auf Heterodimerbildung

Aufgrund der - im Vergleich zu PpRH1 - relativ schwachen Aktivität von PpRH2 an den getesteten

Substraten, wurde die Möglichkeit einer Heterodimerbildung aus PpRH1 und PpRH2 in Betracht

gezogen. Hierfür wurden die Aktivität von PpRH1 und PpRH2 an den Substraten Inosin, Adenosin,

Guanosin und Uridin zunächst einzeln und dann im Mischungsverhältnis 1:1, 1:2 und 2:1 mittels des

Parkin-Assays verglichen. Außerdem wurden Kontrollreaktionen mit BSA durchgeführt, bei denen

PpRH1 mit BSA statt mit PpRH2 in den zuvor genannten Mischungsverhältnissen gemischt wurde

(Daten nicht gezeigt). Auf diesem Weg sollte eine unspezifische Beeinflussung der Aktivität

ausgeschlossen werden. Für keines der genannten Substrate konnte eine gesteigerte Aktivität bei

Verwendung der Enzym-Mixtur aus PpRH1 und PpRH2 gemessen werden (Abb. 3.12). Allerdings

konnte eine schwache Reduktion der PpRH1-Aktivität nach Mischung mit PpRH2 beobachtet werden.

Diese Hemmung war bei den Kontrollansätzen mit BSA nicht zu beobachten. Demnach kann eine

Aktivitätssteigerung durch Heterodimerbildung aus PpRH1 und -2 unter diesen Bedingungen als

unwahrscheinlich angesehen werden. Dennoch deuten die Ergebnisse auf eine mögliche Interaktion

zwischen PpRH1 und -2 hin, die sich nicht aktivitätssteigernd sondern aktivitätshemmend auf PpRH1

auswirkt.

0 20 40 60 80 100 120

10 mM EGTA

10 mM EDTA

1 mM EGTA

1 mM EDTA

1000 mM CaCl2

100 mM CaCl2

10 mM CaCl2

ohne Zusatz

Relative Aktivität [%]

ohne Zusatz

10 mM CaCl2

100 mM CaCl2

1000 mM CaCl2

1 mM EDTA

10 mM EDTA

1 mM EGTA

10 mM EGTA

Ergebnisse

59

A. B.

Abb. 3.12 Test auf Aktivitätsänderung bei Mischung von rekombinantem PpRH1 und PpRH2 Protein. Heterolog überexprimierte RH Proteine wurden hinsichtlich ihrer Aktivität an den Purinen Inosin, Adenosin, Guanosin und dem Pyrimidin Uridin einzeln und in den molaren Mischungsverhältnissen 1:1; 1:2 sowie 2:1 getestet. Für Aktivitätsmessungen wurde ein spektrophotometrischer Assay nach Parkin (1996) verwendet. (A.): Spezifische Aktivität je mg Protein. (B.): Spezifische Aktivität je mg PpRH1. Dargestellt sind Mittelwerte, die Werte der beiden Einzelmessungen sind als Punkte dargestellt.

3.5 Studien zur subzellulären Lokalisierung von PpRHs

Vorhersagen zur Lokalisierung der selektierten RHs aus Physcomitrella wurden mit den Programmen

TargetP und MultiLoc getroffen (2.12.2). Die Ergebnisse zeigen, dass eine Lokalisierung im

Cytoplasma für alle PpRH Proteine am wahrscheinlichsten ist. Das Programm TargetP berechnete für

alle PpRHs sehr geringe Wahrscheinlichkeiten für das Vorhandensein von Signalsequenzen zur

Einschleusung in Chloroplasten, Mitochondrien oder in den sekretorischen Weg und gibt als

Zuordnung „Anderes Kompartiment“ an. Über MultiLoc wurden Scores von 0,95 (PpRH3), 0,96

(PpRH1) und 0,98 (PpRH2) für eine Lokalisierung im Cytoplasma erhalten, die nach bioinformatischen

Kriterien eindeutig für eine Lokalisierung im Cytoplasma sprechen.

Die in planta Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der RHs aus Physcomitrella erfolgte in

Protoplasten, die aus Physcomitrella isoliert wurden. Der für die Lokalisierungsstudien ausgewählte

Vektor pLNU-GFP enthält GFP unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors aus Zea mays. Die ORFs

von PpRH1, -2 und -3 wurden mit Pfu-Polymerase mit den Primern 424/425, 426/427 bzw. 428/429

(Tab. 2.3) amplifiziert und über die Schnittstellen von XbaI und HindIII in den Vektor pLNU-GFP in

frame mit GFP ligiert. Nach Transformation in E. coli, Selektion der positiven Klone und

anschließender Sequenzierung der Konstrukte, erfolgte die transiente Expression in Physcomitrella.

Hierfür wurden Protoplasten aus Physcomitrella Wildtyp isoliert (2.2.6) und nach dem unter 2.2.7

beschriebenen Protokoll transformiert. Als Kontrolle wurde der „leere“ Vektor pLNU-GFP verwendet.

Die Auswertung erfolgte nach sechs Tagen am Konfokal-Lasermikroskop (2.9). Die Fluoreszenzsignale

der PpRH-GFP-Fusionsproteine waren hauptsächlich im Cytoplasma zu finden (Abb. 3.13). In silico

Ergebnisse

60

Vorhersagen und experimentelle Daten zeigen somit übereinstimmend, dass PpRH1, -2 und -3 im

Cytoplasma lokalisiert sind.

Abb. 3.13 GFP-Lokalisierungsstudien von PpRH1, -2 und -3 durch transiente Expression in Protoplasten von Physcomitrella. (A.). Kontrolle (pLNU-GFP); (B.): pLNU-GFP_PpRH1; (C.): pLNU-GFP_PpRH2; (D.): pLNU-GFP_PpRH3. Links ist die GFP-Fluoreszenz, in der Mitte die Autofluoreszenz des Chlorophylls und rechts die Überlagerung beider Fluoreszenz-Signale abgebildet. Aufnahmen wurden am Konfokal-Lasermikroskop sechs Tage nach der Transformation gemacht.

Ergebnisse

61

Parallel durchgeführte Lokalisierungsstudien in Epidermiszellen von A. cepa (2.10) bestätigten

ebenfalls, dass PpRH1, -2 und -3 im Cytoplasma lokalisiert sind und kein Signalpeptid zum Transport

in ein anderes Zellkompartiment besitzen (Daten nicht gezeigt).

Die in silico vorhergesagte cytoplasmatische Lokalisierung von PpRH1, -2 und -3 wurde somit in zwei

Modellsystemen auch in planta bestätigt.

3.6 Gezielter knockout von PpRH1, -2 und -3 in Physcomitrella

Zur Aufklärung von Funktion und Bedeutung von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel, wurden single-

knockout Pflanzen für alle drei Mitglieder der RH-Genfamilie generiert. Der knockout der

betreffenden RH wurde auf genomischer Ebene nachgewiesen, sowie die Abwesenheit des jeweiligen

RH-Transkriptes bestätigt. Außerdem wurden einzelne knockout Linien hinsichtlich der verbleibenden

RH-Aktivität analysiert. In vivo Markierungsexperimente wurden durchgeführt, um Auswirkungen auf

den Purin- und Cytokinin-Stoffwechsel zu messen. Anhand von LC-MS/MS-Analysen wurden

Veränderungen im Profil von Purinen und Pyrimidinen untersucht.

3.6.1 Herstellung von PpRH-knockout Linien

Gene targeting über den Mechanismus der homologen Rekombination erfolgt in Physcomitrella mit

ungewöhnlich hoher Frequenz (Kamisugi und Cuming 2005). Die hierfür verwendeten knockout-

Vektoren müssen dafür einen Resistenzmarker enthalten, der von zwei ca. 1000 bp großen

genomischen Fragmenten des zu treffenden Lokus flankiert wird, über die mittels homologer

Rekombination dann die Integration der „Resistenzkassette“ und der damit verbundene knockout

des betreffenden Gens erfolgt.

Zum knockout der RH-Gene wurden zunächst entsprechende knockout-Vektoren konzipiert und

kommerziell hergestellt. Für PpRH1 wurde der Vektor pBNR (Tab. 2.2) ausgewählt, der später in

Pflanzen eine Selektion über Geneticin (G418) erlaubt. Aus genomischer DNA vom Wildtyp wurde mit

den Primern 389/390 (Tab. 2.3) ein 1057 bp-Fragment aus dem 5‘-Bereich, mit den Primern 393/394

(Tab. 2.3) ein 1014 bp-Fragment aus dem 3‘-Bereich des Lokus amplifiziert. Die erhaltenen

Fragmente wurden nach ihrer Aufreinigung per PCR mit den für die Klonierung in pBNR benötigten

Schnittstellen versehen (Fragment aus 5‘-Bereich: MluI und SpeI, Primer 391/392; Fragment aus 3‘-

Bereich: BsiWI und XbaI, Primer 395/396, Tab. 2.3) und in den entsprechend vorbereitenden Vektor

nacheinander ligiert. Der durch Sequenzierung überprüfte Vektor pBNR_PpRH1-KO wurde dann zur

Transformation in Physcomitrella verwendet.

Die Vektoren pBHR bzw. pBZR (Tab. 2.2), die für den knockout des PpRH2- bzw. PpRH3-Gens

ausgewählt wurden, vermitteln Resistenz gegenüber Hygromycin bzw. Zeocin. Analog wie für PpRH1

zuvor beschrieben, wurden zunächst die genomischen Fragmente amplifiziert. Für PpRH2 wurden

hierfür die Primer 407/408 (Tab. 2.3) für das Fragment aus dem 5‘-Bereich (1127 bp), Primer 411/412

(Tab. 2.3) für das Fragment aus dem 3‘-Bereich (1045 bp) verwendet. In einer anschließenden PCR

mit den Primern 409/410 bzw. 413/414 (Tab. 2.3) wurden die Schnittstellen zur Klonierung in den

Vektor pBHR an die Fragmente angehängt (Fragment aus dem 5‘-Bereich: HindIII und XhoI; Fragment

aus dem 3‘-Bereich: BamHI und MluI) und anschließend in den präparierten Vektor ligiert. Für PpRH3

wurden genomische Fragmente mit den Primern 415/416 (5‘-Bereich, 1082 bp, Tab. 2.3) bzw.

419/420 (3‘-Bereich, 1005 bp) amplifiziert. Die erhaltenen Fragmente wurden nach Aufreinigung

Ergebnisse

62

über eine zweite PCR mit den für die Klonierung in pBZR benötigten Schnittstellen versehen (Primer

417/418 mit SphI- und XhoI-Schnittstelle bzw. Primer 421/422 mit EagI- und MluI-Schnittstelle, Tab.

2.3) und anschließend in den entsprechend vorbereitenden Vektor nacheinander ligiert. Die

erhaltenen Konstrukte, pBHR_PpRH2-KO und pBZR_PpRH3-KO, wurden für die PEG-vermittelte

Transformation von Physcomitrella Protoplasten genutzt.

Zur Transformation in Protoplasten wurde lineare DNA aller drei Konstrukte verwendet, wobei aus

pBNR_PpRH1-KO mit XbaI und MluI und aus pBHR_PpRH2-KO und pBZR_PpRH3-KO mit HindIII und

MluI die „RH-knockout-Kassette“ aus dem Vektor ausgeschnitten wurde. Die Transformation und

anschließende Selektion von RH-knockout Pflanzen erfolgte nach der unter 2.2.7 beschriebenen

Methode. Für jeden Lokus wurden ca. 15-20 stabile Linien, d.h. solche die drei Selektionszyklen

überlebten, erhalten.

3.6.2 Molekulare Analyse der PpRH-knockout Linien

Zur Identifizierung von RH-single-knockout Linien auf molekularer Ebene wurde genomische DNA aus

stabilen Transformanten isoliert und per PCR analysiert. Details zum Nachweis der Transgenese

werden im Folgenden für PpRH1-, PpRH2- und PpRH3-knockout Pflanzen beschrieben.

3.6.2.1 Identifizierung von PpRH1-knockout Linien auf genomischer Ebene

Aus 12 stabilen PpRH1-knockout Pflanzen wurde genomische DNA isoliert und mittels PCR das

Vorhandensein der Resistenzmarkers im genomischen Lokus nachgewiesen. Mit der

Primerkombination 436/82 (Tab. 2.3) wurde die erfolgreiche 5‘-, mit den Primern 80/438 (Tab. 2.3)

die erfolgreiche 3‘-Integration der Resistenzkassette in den PpRH1 Lokus gezeigt. Das PCR-Ergebnis

für die Linien PpRH1-KO #23, #26, #28 und #29 ist in Abb. 3.14 zu sehen. Für alle gezeigten Linien

wurden die PCR-Produkte 1 und 2 erhalten, die die vollständige Integration der NPTII-

Resistenzkassette in den genomischen Lokus von PpRH1 belegen. Die Sequenzierung der erhaltenen

PCR-Produkte bewies außerdem, dass die Amplifikate die erwarteten Sequenzabschnitte aus dem

genomischen PpRH1 Lokus sowie Teile des NPTII-Gens enthielten. Die Linien PpRH1-KO #23, #26, #28

und #29 wurden als bestätigte PpRH1-knockout Linien eingestuft und für weitere Analysen

verwendet.

Ergebnisse

63

Abb. 3.14 Schematische Integration der NPTII-Resistenzkassette in den PpRH1 Lokus und molekulare Analyse von PpRH1-knockout Mutanten. (A.): Mechanismus der homologen Rekombination zur Zerstörung des genomischen PpRH1 Lokus über die Integration des NPTII-Gens in PpRH1. (B.): Schematische Rekonstruktion des PpRH1 Lokus in PpRH1-knockout Mutanten. (C.): PCR-Ergebnisse der genomischen DNA-Analyse zum molekularen Nachweis der erfolgreichen 5‘- und 3‘-Integration des PpRH1-knockout-Konstruktes in vier Mutanten Linien. Der genomische Lokus von PpRH1 ist in grün, Sequenzabschnitte von PpRH1, die zur homologen Rekombination verwendet wurden, sind in blau, die NPTII-Resistenzkassette in braun dargestellt.


Zum Nachweis der genetischen Veränderung in PpRH2-knockout Mutanten, wurde genomische DNA

aus 10 stabilen Linien isoliert und diese über PCR analysiert. Die angewandte PCR-Strategie ist in Abb.

3.15 zu sehen. Über zwei verschiedene PCR-Produkte wurde die Integration des Resistenzmarkers

(HPH) in den genomischen Lokus von PpRH2 überprüft; PCR-Produkt 1, erhalten mit den Primern

496/497 (Tab. 2.3), zeigte die erfolgreiche Integration im 5‘-Bereich von PpRH2, während das mit den

Primern 498/499 (Tab. 2.3) amplifizierte PCR-Produkt 2 den Nachweis für die Integration im 3‘-

Bereich lieferte. Wie aus Abb. 3.15 deutlich wird, wurden für die Linien PpRH2-KO#3, #13, #52 und

#56 beide PCR-Produkte erhalten. Die im Anschluss vorgenommene Sequenzierung der PCR-Produkte

bestätigte ebenfalls die genetische Veränderung des PpRH2 Lokus. Die Linie #27 zeigte hingegen

lediglich eine erfolgte Integration im 3‘-Bereich von PpRH2. Daher wurde davon ausgegangen, dass in

diesem Fall kein vollständiger Austausch des Genes erfolgte, sondern die PpRH2-knockout-Kassette

lediglich im 3‘-Bereich in den Lokus integriert wurde. Diese Linie wurde von der weiteren

Charakterisierung ausgeschlossen. Die Mutanten PpRH2-KO#3, #13, #52 und #56 können hingegen

als verifizierte PpRH2-KO Linien eingestuft werden und wurden daher in die folgenden Analysen

einbezogen.

Ergebnisse

64

Abb. 3.15 Schematische Integration der HPH-Resistenzkassette in den PpRH2 Lokus und molekulare Analyse von PpRH2-knockout Mutanten. (A.): Mechanismus der homologen Rekombination zur Zerstörung des genomischen PpRH2 Lokus über die Integration des HPH-Gens in PpRH2. (B.): Schematische Rekonstruktion des PpRH2 Lokus in PpRH2-knockout Mutanten. (C.): PCR-Ergebnisse der genomischen DNA-Analyse zum molekularen Nachweis der erfolgreichen 5‘- und 3‘-Integration des PpRH2-knockout-Konstruktes in fünf Mutanten Linien. Der genomische Lokus von PpRH2 ist in gelb, Sequenzabschnitte von PpRH2, die zur homologen Rekombination verwendet wurden, sind in blau, die HPH-Resistenzkassette in rosa dargestellt.


Nach Selektion putativer PpRH3-knockout Linien sollte ebenfalls der Nachweis der Transgenese auf

molekularer Ebene erfolgen. Hierfür wurde genomische DNA aus 10 stabilen PpRH3-KO Linien isoliert

und mittels PCR überprüft. Über die PCR-Produkte 1 (Primer 501/502, Tab. 2.3) und 2 (Primer

503/504, Tab. 2.3) sollte zum einen die Anwesenheit der BLE-Resistenzkassette, zum anderen die

erfolgreiche 5‘- bzw. 3‘-Integration im PpRH3 Lokus nachgewiesen werden (Abb. 3.16). Die

dargestellte PCR-Analyse der Linien PpRH3-KO #7, #8, #13, #23 sowie #25 zeigte, dass bei diesen

fünf Linien die 5‘- sowie die 3‘-Integration erfolgreich war und der native PpRH3 Lokus durch die

Insertion der Resistenzkassette zerstört wurde. Durch Sequenzierung der erhaltenen Amplifikate

wurde die Transgenese nochmals bestätigt. Für den Lokus PpRH3 wurden somit die Linien PpRH3-KO

#7, #8, #13, #23 sowie #25 als bestätigte knockout Linien eingestuft.

Ergebnisse

65

Abb. 3.16 Schematische Integration der BLE-Resistenzkassette in den PpRH3 Lokus und molekulare Analyse von PpRH3-knockout Mutanten. (A.): Mechanismus der homologen Rekombination zur Zerstörung des genomischen PpRH3 Lokus über die Integration des BLE-Gens in PpRH3. (B.): Schematische Rekonstruktion des PpRH3 Lokus in PpRH3-knockout Mutanten. (C.): PCR-Ergebnisse der genomischen DNA-Analyse zum molekularen Nachweis der erfolgreichen 5‘- und 3‘-Integration des PpRH3-knockout-Konstruktes in fünf Mutanten Linien. Der genomische Lokus von PpRH3 ist in hellblau, Sequenzabschnitte von PpRH3, die zur homologen Rekombination verwendet wurden, sind in blau, die BLE-Resistenzkassette in orange dargestellt.

3.6.2.4 Messungen des Ploidiegrades und morphologische Vergleiche von PpRH-knockout

Linien

Wie von Schween et al. (2005) beschrieben, kommt es bei Physcomitrella regelmäßig nach der

Transformation von Protoplasten durch Protoplastenfusionen bei einem Teil der regenerierenden

Pflanzen zu einer Änderungen des Ploidiegrades. Die Änderung des Ploidiegrades kann als Folge auch

zu morphologischen Veränderungen führen. Daher bestand die Notwendigkeit vor der weiteren

Charakterisierung, die Ploidie der generierten knockout Pflanzen zu messen.

Mittels Durchflusszytometrie wurden die Haploidie aller analysierten knockout Pflanzen eindeutig

nachgewiesen (Abb. 3.17). Haploide Pflanzen, wie der Wildtyp sowie die knockout Linien PpRH1-

KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7, zeigten einen Hauptpeak bei 50, während bei diploiden

Pflanzen der Hauptpeak bei 100 lag (nicht gezeigt). Knockout Linien mit einem veränderten

Ploidiegrad wurden von der weiteren Charakterisierung ausgeschlossen.

Ergebnisse

66

Außerdem wurden die Transformanten hinsichtlich möglicher morphologischer Veränderungen

untersucht. Mikroskopische Untersuchungen des Protonemas sowie der Gametophoren von unter

Standardbedingungen gewachsenen Kulturen zeigten aber keine erkennbaren Veränderungen (Abb.

3.17, Gametophoren nicht gezeigt).

Abb. 3.17 Ploidie-Messung und morphologische Untersuchung von PpRH-knockout Pflanzen. Links sind Durchflusszytometrie-Histogramme von Wildtyp, PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 gezeigt. Auf der x-Achse ist die relative Fluoreszenzintensität, auf der y-Achse sind die gezählten Fluoreszenzereignisse dargestellt. Rechts sind lichtmikroskopische Aufnahmen des Protonemas von Wildtyp, PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 gezeigt. Die Aufnahmen wurden von fünf Tage alten, unter Standardbedingungen gewachsenen Kulturen gemacht. Die eingefügten Maßstabbalken entsprechen 100, 50 bzw. 20 µm (von links nach rechts).

3.6.2.5 Molekulare Analyse der PpRH-knockout Linien auf Transkript-Ebene

Neben dem Nachweis der Transgenese auf genomischer Ebene sollte außerdem die Abwesenheit des

jeweiligen RH-Transkriptes bestätigt werden. Dazu wurde aus sieben Tage alten unter

Standardbedingungen gewachsenen Kulturen der knockout Linien RNA isoliert und in cDNA

umgeschrieben. RT-PCR Experimente wurden unter Verwendung von PpRH spezifischen Primern

(PpRH1: 536/537; PpRH2: 488/489; PpRH3: 404/405, Tab. 2.3) durchgeführt. Als Kontrolle der RNA-

Extraktion sowie der durchgeführten RT-Reaktion wurde parallel die Anwesenheit des konstitutiv

exprimierten PpACT3 Gens mit den Primern 214/215 (Tab. 2.3) untersucht. Das Primerpaar 488/489,

das zur Transkript-Analyse der PpRH2-knockout Linien verwendet wurde, bindet in einem Bereich

von PpRH2, der in den knockout Linien durch Insertion der HPH-Resistenzkassette ersetzt wurde.

Daher wurden für diese Ansätze keine „RT minus“-Reaktionen durchgeführt.

Ergebnisse

67

Wie Abb. 3.18 zeigt, wurde die erwartete Abwesenheit des jeweiligen PpRH-Transkriptes für die

PpRH1-knockout Linien #29, #26, #28 und #23, für die PpRH2-knockout Linien #52 und #56 sowie für

die PpRH3-knockout Linien #7, #8 und #13 über RT-PCR mit PpRH-spezifischen Primern

nachgewiesen. Dies bestätigt den knockout für die genannten Linien auch auf der Ebene des

jeweiligen RH-Transkriptes.

Abb. 3.18 Expressionsanalyse der PpRH-KO Linien. RT-PCR Experimente wurde mit spezifischen Primern für das jeweilige RH-Gen durchgeführt (oben, PpRH1: 536/537; PpRH2: 488/489; PpRH3: 404/405, Tab. 2.3). Als Positivkontrolle wurde parallel die Expression des konstitutiv exprimierten PpACT3-Gens analysiert (Mitte). „RT minus“-Reaktionen zeigten, dass keine Kontamination mit genomischer DNA vorlag (Daten nicht gezeigt). Banden im unteren Bereich der Gele sind durch Primerdimerbildung verursacht.

3.6.3 In vitro RH-Aktivität bei PpRH1-KO #29

Zur Bestätigung einer veränderten RH-Aktivität bei der Mutante PpRH1-KO #29 wurden in vitro

Enzym-Assays mit Inosin, dem Hauptsubstrat von PpRH1, durchgeführt. Hierfür wurden zunächst

Proteinextrakte aus Moosgewebe hergestellt (2.4.1). Das verwendete Gewebe des Wildtyps sowie

der Transformante PpRH1-KO#29 stammte aus vier Tage alten, unter Standardbedingungen

kultivierten Mooskulturen. RH-Aktivität wurde mit dem HPLC-basierten Enzym-Assay (2.4.11.2)

gemessen, wobei 70 µg Proteinextrakt mit 3H-Inosin (30 nM) für 19 bzw. 24 Stunden bei 35 °C

inkubiert wurden. Außerdem wurde den Assays Calciumchlorid (100 mM) zugesetzt, da dieses

möglicherweise als Co-Faktor eine Bedeutung hat (3.4.4.3).

Beim Wildtyp entfielen nach 19 Stunden 16 % der Radioaktivität auf Hypoxanthin und 63 % auf das

zugefügte Substrat Inosin; 21 % entfielen auf andere Metabolite (Abb. 3.19). Nach 24 stündiger

Inkubation waren 18 % des applizierten Substrates zu Hypoxanthin umgesetzt worden und es lagen

noch 64 % Inosin vor. Die übrigen 18 % repräsentieren nicht näher identifizierte Metabolite. Die

Mutante PpRH1-KO #29 hingegen zeigte eine drastisch reduzierte RH-Aktivität für das Substrat

Inosin: Nach 19 stündiger Inkubation wurden noch 77 % der applizierten Radioaktivität als Inosin

nachgewiesen; es konnte aber kein Hypoxanthin gemessen werden. Nach 24 Stunden wurden 73 %

der Radioaktivität in Form von Inosin und 1 % als Hypoxanthin detektiert. Auch hier traten außerdem

weitere, nicht näher analysierte Metabolite auf (23 bzw. 26 % nach 19 bzw. 24 Stunden). Während

für den Wildtyp Umsatzraten für Inosin von 0,6-0,8 pmol h-1 mg-1 Protein gemessen wurden, konnte

bei PpRH1-KO #29 nur eine minimale Rest-Aktivität (< 0,02 pmol h-1 mg-1 Protein) gemessen werden.

Diese Daten belegen eindeutig, dass im Fall von PpRH1-KO #29 eine fast vollständige Reduktion der

durch RH-Aktivität katalysierten Metabolisierung von Inosin durch den knockout von PpRH1 erreicht

Ergebnisse

68

wurde. Anhand der nicht näher identifizierten Metabolite wird außerdem sichtbar, dass neben der

RH auch noch andere konkurrierende Enzym-Aktivitäten vorhanden sind, die Inosin ebenfalls als

Substrat verwenden.

Abb. 3.19 In vitro RH-Aktivität beim Wildtyp und der knockout Mutante PpRH1-KO #29. Enzym-Assays wurden mit Proteinextrakten aus Kulturen von Wildtyp und PpRH1-KO#29 und

3H-Inosin als Substrat (30 nM)

durchgeführt. Die Vermessung der Ansätze erfolgte nach 19 und 24 Stunden per HPLC-online-LSC. Dargestellt sind Mittelwerte, die Werte der beiden Einzelmessungen sind als Punkte dargestellt.

3.6.4 Analyse des Purin- und Cytokinin-Metabolismus bei PpRH-knockout Linien

Wie in 3.4.4.2 beschrieben, zählen Purine, Pyrimidine und Cytokinine zum Substratspektrum der

charakterisierten, rekombinanten PpRH Proteine. Um die Auswirkungen des knockouts eines RH-

Gens auf den Purin- bzw. Cytokinin-Stoffwechsel zu analysieren, wurden in vivo Metabolismusstudien

mit dem Wildtyp und ausgewählten PpRH-KO Transformanten unter Verwendung der Purine

Adenosin und Inosin sowie dem Cytokinin iPR durchgeführt.

Zum Purin-Stoffwechsel bei Physcomitrella existieren in der Literatur bisher kaum Daten. Weder die

beteiligten Enzyme sind näher charakterisiert noch lagen vor dieser Arbeit Daten zum Vorkommen

der einzelnen Substanzen vor. Die in dieser Arbeit durchgeführten Metabolismusstudien ermöglichen

somit erste Einblicke in den Purin-Stoffwechsel bei Physcomitrella. Der Cytokinin-Stoffwechsel bei

Physcomitrella ist hingegen in weiten Teilen bereits charakterisiert worden (Schwartzenberg et al.

2007, Schwartzenberg 2006). Über eine Beteiligung der hier beschriebenen RHs am Cytokinin-

Stoffwechsel in planta ist aber derzeit nichts bekannt. Für das rekombinante Protein von PpRH1 und

von PpRH2 wurde Aktivität an iPR gemessen (Tab. 3.2). Daher wurden in vivo Metabolismusstudien

mit 3H-iPR durchgeführt, um die Vermutung der Beteiligung von PpRH1, -2 und -3 am Cytokinin-

Metabolismus zu überprüfen.

3.6.4.1 In vivo Metabolismusstudien mit den Purin-Ribosiden 3H-Adenosin und 3H-Inosin

In vivo Markierungsexperimente mit Adenosin und Inosin als Substrat wurden mit Tritium-markierten

Substanzen durchgeführt.

Ergebnisse

69

Flüssigkulturen (1 g Gewebe (FG), 4 ml A’BCDNTV-Medium) des Wildtyps und der Transformante

PpRH1-KO #29 wurde 3H-Adenosin bzw. 3H-Inosin mit einer Endkonzentration von 1 µM (in

isotopischer Verdünnung mit ca. ⅟10 3H-Purin-Ribosid) zugefügt und der Metabolismus über einen

Zeitraum von 60 Minuten durch Entnahme von Proben aus dem Kulturmedium verfolgt. Nach

60 Minuten wurde außerdem das Gewebe geerntet und zur Analyse der intrazellulären Metabolite

aufgeschlossen (2.2.4). Zur Bestimmung der radioaktiv-markierten Metabolite wurden die Medium-

und Gewebeproben per HPLC-online-LSC analysiert (2.5).

3.6.4.1.1 Kinetik der 3H-Adenosin- und 3H-Inosin-Konzentration im Medium

Die Kinetik der Verteilung des applizierten 3H-Adenosins im Kulturmedium ist in Abb. 3.20 A.

dargestellt. Mit zunehmender Inkubationszeit nimmt die Menge an radioaktiv-markiertem Adenosin

bei beiden Genotypen ab. Bei der Transformante PpRH1-KO #29 erfolgt die Verarmung des Mediums

an Adenosin jedoch deutlich schneller: Nach 30 Minuten sind beim Wildtyp noch 62 %, bei der

Transformante nur noch 37 % der zum Zeitpunkt T0 applizierten Gesamtmenge an Adenosin

vorhanden. Auch nach 60 minütiger Inkubation besteht ein deutlicher Unterschied zwischen beiden

Genotypen: Beim Wildtyp liegen noch 47 %, bei PpRH1-KO #29 lediglich 21 % der Gesamtmenge an

Adenosin im Kulturmedium vor. Hieraus lässt sich eine Abnahmerate für Adenosin unter

Initialbedingungen von 10 pmol min-1 g-1 für den Wildtyp und 16 pmol min-1 g-1 für PpRH1-KO #29

ermitteln (Tab. 3.3). Nach 60 Minuten wurden ähnliche Abnahmeraten für beide Genotypen

berechnet, 4 bzw. 5 pmol min-1 g-1 für Wildtyp bzw. PpRH1-KO #29. Die Kinetik der Adenosin-

Konzentration unterscheidet sich demnach bei den beiden Genotypen hauptsächlich innerhalb der

ersten 10 Minuten.

Der Befund, dass nach 60 minütiger Inkubation nur noch 47 (Wildtyp) bzw. 21 % (PpRH1-KO #29) der

zum Zeitpunkt T0 applizierten Gesamtmenge an Adenosin im Medium detektiert wurden, deutet bei

beiden Genotypen auf eine rasche Aufnahme und/oder eine starke Metabolisierung von Adenosin

hin, wobei diese beim PpRH1-knockout im Vergleich zum Wildtyp noch gesteigert ist.

Die Analyse der Proben aus dem Kulturmedium des Markierungsexperimentes mit 3H-Inosin ergab

folgendes Bild (Abb. 3.20 B.): Auch die Abnahme von Inosin erfolgt bei beiden Genotypen sehr rasch.

Bereits nach 10 Minuten sind nur noch 60 % des applizierten Inosins im Kulturmedium des Wildtyps

und der Transformante PpRH1-KO #29 nachzuweisen. Dies entspricht einer Abnahmerate unter

Initialbedingungen von 20 pmol min-1 g-1 (identisch für beide Genotypen, Tab. 3.3). Ab

Minute 20 erfolgt dann die Abnahme von Inosin bei PpRH1-KO #29 schneller als beim Wildtyp. Nach

30 Minuten liegen beim Wildtyp noch 48 %, bei der Transformante lediglich 33 % des zugefügten

Inosins im Medium vor. Nach 60 Minuten sind lediglich 14 % des applizierten Inosins bei

PpRH1-KO #29 im Medium nachzuweisen, während beim Wildtyp noch 35 % der Ausgangsmenge an

Inosin im Medium verblieben sind. Hieraus wurden Abnahmeraten von 6 bzw. 9 pmol min-1 g-1 für

den Wildtyp bzw. die Transformante PpRH1-KO #29 ermittelt.

Die Transformante PpRH1-KO #29 zeigt somit übereinstimmend für beide durchgeführten

Markierungsexperimente eine gegenüber dem Wildtyp beschleunigte Abnahme für das applizierte

Substrat im Kulturmedium. Während für Adenosin eine schnellere Abnahme im Medium bereits

innerhalb der ersten 10 Minuten beobachtet wurde, sinkt nach Applikation von Inosin die Inosin-

Konzentration erst nach 10 Minuten auf einen niedrigeren Wert als beim Wildtyp ab.

Ergebnisse

70

A.

B.

Abb. 3.20 In vivo Metabolismusstudien mit

3H-Adenosin und

3H-Inosin von Kulturen des Wildtyps und der

Transformante PpRH1-KO #29. Die Substrate wurden den Kulturen (1 g Gewebe (FG), 4 ml A’BCDNTV-Medium) mit einer Konzentration von 1 µM (isotopische Verdünnung, ⅟10

3H-Substrat) zugefügt. Über 60 Minuten

wurden Proben aus dem Kulturmedium entnommen und per HPLC-online-LSC analysiert. (A.): Kinetik der 3H-Adenosin- (B.): Kinetik der

3H-Inosin-Abnahme im Medium beim Wildtyp und der Transformante

PpRH1-KO #29.

Tab. 3.3 Abgeleitete Abnahmeraten für 3H-Adenosin und

3H-Inosin im Medium beim Wildtyp und PpRH1-KO

#29 nach in vivo Markierung.

Abnahmeraten für 3H-Adenosin [pmol min-1 g-1]

Abnahmeraten für 3H-Inosin [pmol min-1 g-1]

Minute 0-10 Minute 10-60 Minute 0-10 Minute 10-60

WT 10 4 20 6 PpRH1-KO #29 16 5 20 9

3.6.4.1.2 Analyse der 3H-Adenosin- und 3H-Inosin-Metabolite in Gewebeextrakten

Zur detaillierten Charakterisierung des Adenosin- bzw. Inosin-Metabolismus wurde nach

60 minütiger Inkubation mit radioaktiv-markiertem Substrat das Gewebe geerntet und analysiert.

Nach Extraktion der intrazellulären Metabolite aus dem Gewebe wurden zunächst die Bilanzen für

die Gesamtradioaktivität ermittelt (Tab. 3.4). Hierbei wurde festgestellt, dass der Hauptanteil der

Radioaktivität im Medium verblieb (58 bzw. 68 % bei Markierung mit 3H-Adenosin, 81 bzw. 77 % bei

Markierung mit 3H-Inosin). Auffallend ist, dass sich intrazellulär bei beiden Genotypen eine drastische

Differenz zwischen der extrahierbaren und der errechneten (bezogen auf die im Medium verbliebene

Radioaktivität) intrazellulären Radioaktivität ergab. Diese Differenz betrug beim

Markierungsexperiment mit 3H-Adenosin 35 % beim Wildtyp und 29 % bei PpRH1-KO #29

(Berechnung: errechnete minus extrahierbare intrazelluläre Radioaktivität). Nach Markierung mit 3H-

Inosin betrug der Anteil an aufgenommener aber nicht mehr extrahierbarer intrazellulärer

Radioaktivität 18 % (Wildtyp) bzw. 22 % (PpRH1-KO #29). Bereits der für beide Genotypen hohe

Anteil der nicht mehr aus dem Gewebe extrahierbaren Radioaktivität deutet auf eine rasche

Metabolisierung der eingesetzten Substrate hin.

Ergebnisse

71

Tab. 3.4 Vergleichende Darstellung der Bilanzen der Radioaktivität während der 60 minütigen in vivo Markierung mit

3H-Adenosin (links) und

3H-Inosin (rechts) beim Wildtyp und PpRH1-KO #29. Angegeben ist die

nach 60 Minuten im Medium verbliebene Radioaktivität, die sich hieraus ergebende errechnete, intrazelluläre Radioaktivität sowie die aus dem Gewebe extrahierbare Radioaktivität.

Markierung mit 3H-Adenosin Markierung mit

3H-Inosin

Im Medium verbliebene

Radioaktivität pmol/Ansatz

[%]

Extrahierbare, intrazelluläre Radioaktivität pmol/Ansatz

[%]

Errechnete, intrazelluläre Radioaktivität pmol/Ansatz

[%]



[%]


[%]


[%]

WT 209 [58]

24 [7]

151 [42]

443 [81]

3 [1]

104 [19]

PpRH1-KO #29 239 [68]

12 [3]

112 [32]

400 [77]

3 [1]

119 [23]

Prozentangaben beziehen sich auf die zum Zeitpunkt T0 applizierte Gesamtradioaktivität

Zur Identifizierung der intrazellulären Metabolite wurden die Gewebeextrakte per HPLC-online-LSC

analysiert (Abb. 3.21). Hierbei wurden Basen, Riboside und Nukleotid-Monophosphate direkt nach

der Extraktion per HPLC-online-LSC detektiert (obere Chromatogramme in A. und B.). Nukleotid-Di-

und -Triphosphate waren erst nach Dephosphorylierung zusammen mit den Nukleotid-

Monophosphaten als Riboside zu identifizieren (untere Chromatogramme in A. und B.).

Abb. 3.21 Beispielchromatogramme von Gewebeextrakten aus Markierungsexperimenten mit 3H-Adenosin (A.)

und 3H-Inosin (B.). Die dargestellten Chromatogramme zeigen die HPLC-online-LSC-Analyse der

Gewebeextrakte des Wildtyps vor (oben) und nach (unten) Dephosphorylierung nach 60 minütiger Markierung. Vor Dephosphorylierung werden Basen, Riboside und Nukleotid-Monophosphate, nach Dephosphorylierung Nukleotid-Di- und -Triphosphate zusammen mit Nukleotid-Monophosphaten in Form von Ribosiden erfasst. Die in B. zu sehende Verschiebung der Retentionszeiten ist darauf zurückzuführen, dass die beiden Proben in einem größeren zeitlichen Abstand voneinander vermessen wurden. Anhand des jeweiligen UV-Spektrums wurden die Substanzen eindeutig identifiziert.

Ergebnisse

72

Die Analyse der Protonemaextrakte nach Markierung mit 3H-Adenosin ist in Abb. 3.22 A. dargestellt.

Im Gewebe beider Genotypen konnte weder das applizierte Adenosin noch Adenin nachgewiesen

werden. Lediglich die Nukleotide AMP, ADP und ATP sowie weitere, nicht näher bestimmte

Metabolite waren detektierbar. Die Nukleotide ADP/ATP machten dabei den Hauptanteil aus

(7 pmol/100 mg, Wildtyp) bzw. 4 pmol/100 mg, PpRH1-KO #29). Für AMP wurde beim Wildtyp eine

Menge von 3 pmol/100 mg und bei der Transformante von 1 pmol/100 mg bestimmt. Alle weiteren

Metabolite ergaben zusammen eine Menge von 4 pmol/100 mg (Wildtyp) bzw. 2 pmol/100 mg

(PpRH1-KO #29). Die Tatsache, dass weder Adenosin noch Adenin intrazellulär detektiert werden

konnten, spricht für eine schnelle Umwandlung oder Verwertung von Adenosin bzw. Adenin.

Auch nach 60 minütiger Markierung mit 3H-Inosin wurden radioaktiv-markierte Metabolite aus dem

Gewebe extrahiert und per HPLC-online-LSC analysiert (Abb. 3.22 B.). Hier zeigte sich, dass auch

Inosin ebenso wie zuvor für Adenosin beschrieben, einer schnellen Metabolisierung unterlag. Im

Gewebe des Wildtyps war eine sehr geringe Menge an Inosin (0,03 pmol/100 mg) vorhanden. Bei

PpRH1-KO #29 konnte hingegen kein Inosin mehr im Gewebe nachgewiesen werden. Hypoxanthin

konnte im Gewebe beider Genotypen zwar gemessen werden, aber die vorliegenden Daten lassen

vermuten, dass weitere Substanzen mit Hypoxanthin koeluierten und daher korrekterweise von

Hypoxanthin-koeluierenden Substanzen (Hypoxanthin + X in Abb. 3.22 B.) gesprochen werden muss.

Die Menge an gebildetem Hypoxanthin war daher nicht zu quantifizieren. Die nicht näher

klassifizierten Metabolite („Andere“) traten beim Wildtyp und Mutante PpRH1-KO #29 in ähnlichen

Mengen auf (0,4 pmol/100 mg).

A.

B.

Abb. 3.22 Darstellung der

3H-Metabolite in Gewebeextrakten von Wildtyp und PpRH1-KO #29 nach

Markierungsexperimenten mit 3H-Adenosin (A.) und

3H-Inosin (B.). Zu beachten ist die unterschiedliche

Skalierung der y-Achsen.

Zusammenfassend läßt sich sagen, dass die rasche Metabolisierung beider Purine eine Messung der

RH-katalysierten Reaktion unter diesen experimentellen Bedingungen im Gewebe nicht zuläßt.

Unterschiede zwischen Wildtyp und den KO-Mutanten werden daher nicht deutlich sichtbar. Weder

Substrat noch Produkt der RH-Reaktion konnten sowohl nach Markierung mit Adenosin als auch mit

Inosin nicht oder nur in sehr geringen Mengen im Gewebe detektiert werden.

Ergebnisse

73

3.6.4.2 In vivo Metabolismusstudien mit dem Cytokinin-Ribosid 3H-iPR

Zur Untersuchung des Cytokinin-Metabolismus wurden in vivo Markierungsexperimente mit Tritium-

markiertem iPR durchgeführt. Hierfür wurden Flüssigkulturen (1 g Gewebe (FG), 4 ml A’BCDNTV-

Medium) des Wildtyps und der Transformanten PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 mit 3H-iPR in einer Endkonzentration von 30 nM versetzt. Aus dem Kulturmedium wurden über einen

Zeitraum von 25 Stunden Proben entnommen. Nach 20 bzw. 25 Stunden wurde außerdem auch das

Gewebe geerntet und zur Extraktion radioaktiv-markierter Metabolite, wie in 2.2.4 beschrieben,

aufgeschlossen. Alle Proben wurden anschließend mittels HPLC-online-LSC ausgewertet.

3.6.4.2.1 Kinetik der 3H-iPR-Metabolite im Medium

Wie aus Abb. 3.23 ersichtlich, war bei allen Genotypen eine Metabolisierung des applizierten 3H-iPRs

zu messen. Übereinstimmend für alle Genotypen erfolgte einerseits eine Verarmung des

Kulturmediums an 3H-iPR, andererseits wurde die Bildung von 3H-iP sowie nicht näher bestimmten

Abbauprodukten gemessen. Die Abnahme von 3H-iPR erfolgte bei PpRH1-KO #29 unerwarteterweise

schneller, bei PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 hingegen geringfügig langsamer als beim Wildtyp.

Nach 25 stündiger Markierung waren beim Wildtyp noch 29 %, bei PpRH1-KO #29 nur 14 %, bei

PpRH2-KO #56 36 % und bei PpRH3-KO #7 noch 39 % der ursprünglich applizierten Gesamtmenge an 3H-iPR im Kulturmedium zu messen. Die Bildung von 3H-iP erfolgte für alle Genotypen in einer

ähnlichen Größenordnung (nach 25 Stunden ca. 2 pmol/ml). Ein Vergleich der iP-Mengen zu

unterschiedlichen Zeitpunkten des Experimentes zeigt, dass diese sich zeitabhängig stark verändern.

Möglicherweise spielen hier auch Transporteffekte eine Rolle. Die Menge im Medium vorhandener

Abbauprodukte lag für alle Genotypen ebenfalls in einer ähnlichen Größenordnung (6-9 pmol/ml).

Die abgeleiteten Abnahmeraten von 3H-iPR innerhalb der ersten 7 Stunden unterschieden sich nur

geringfügig bei den verschiedenen Genotypen. Sie betrug beim Wildtyp 12 pmol h-1 g-1, bei PpRH1-KO

#29 15 pmol h-1 g-1, bei PpRH2-KO #56 10 pmol h-1 g-1 und bei PpRH3-KO #7 11 pmol h-1 g-1.

Die Konzentration von 3H-iPR nahm bei den knockouts zum Teil schneller (PpRH1-KO #29) und zum

Teil etwas langsamer (PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7) ab als beim Wildtyp. Über den gesamten

Versuchszeitraum konnten ähnliche Abnahmeraten für alle Genotypen ermittelt werden. Anhand

dieser Daten ist es somit schwierig, einen für alle Transformanten zutreffenden knockout-

gebundenen Effekt auf den 3H-iPR-Stoffwechsel abzuleiten.

Ergebnisse

74

A.

B.

C.

D.

Abb. 3.23 Kinetik von

3H-iPR und -Metaboliten im Kulturmedium beim Wildtyp (A.) und den Transformanten

PpRH1-KO #29 (B.), PpRH2-KO #56 (C.) und PpRH3-KO #7 (D.) nach in vivo Markierung mit 3H-iPR (30 nM,

Kultur: 1 g Gewebe (FG), 4 ml A’BCDNTV-Medium). Über einen Zeitraum von 25 Stunden wurden Proben aus dem Kulturmedium entnommen und per HPLC-online-LSC analysiert.

3.6.4.2.2 Analysen der 3H-iPR-Metabolite in Gewebeextrakten

Zur Bestimmung der intrazellulären Metabolite wurden die Protonemaextrakte nach 20 und nach

25 Stunden mit Bieleski-Reagenz aufgeschlossen (2.2.4). Die HPLC-online-LSC-Analyse dieser Ansätze

erlaubte die Bestimmung der Menge an Basen, Ribosiden sowie dem Nukleotid iPRMP. Für die

Erfassung von Nukleotid-Di- und -Triphosphaten mussten die Gewebeextrakte zunächst einer

Dephosphorylierung unterzogen werden. In der anschließenden HPLC-Analyse wurden diese dann

zusammen mit den Nukleotid-Monophosphaten als Riboside erfasst. Im Gewebe aller Genotypen

wurden die folgenden Metabolite detektiert: Das applizierte Substrat iPR, die durch Deribosylierung

entstandene Base iP, die nach Phosphorylierung gebildeten iP-Nukleotide iPRMP, iPRDP und iPRTP

sowie nicht näher bestimmte, durch Abspaltung der Isopentenyl-Seitenkette entstandene,

Abbauprodukte (siehe Anhang, Tab. 6.1). Außerdem wurden auch nach Markierung mit 3H-iPR hohe

Differenzen zwischen der extrahierbaren intrazellulären Radioaktivität und der aufgrund der im

Medium verbliebenen Radioaktivität berechneten intrazellulären Radioaktivtät gemessen (24-50 %,

siehe Anhang, Tab. 6.2). Diese Differenzen lassen auf eine rasche Verstoffwechselung des

applizierten 3H-iPRs schließen. Drastische Unterschiede zwischen den einzelnen Genotypen wurden

nicht beobachtet.

Ergebnisse

75

Auswirkungen des RH-knockouts auf das Base-Ribosid-Verhältnis

Zur Messung des Effekts des RH-knockouts auf den Metabolismus von 3H-iPR, wurde zunächst das

Verhältnis von Produkt und Substrat der RH-katalysierten Reaktion bei allen Genotypen nach 20 und

25 Stunden berechnet - iP zu iPR -, dargestellt in Abb. 3.24. Es zeigte sich, dass die verschiedenen

PpRH-knockouts im Vergleich zum Wildtyp unterschiedlich reagierten. Während PpRH1-KO #29 zu

beiden Zeitpunkten unerwarteterweise ein höheres iP/iPR-Verhältnis als der Wildtyp aufwies, 3,0

bzw. 2,0 gegenüber 1,8 bzw. 1,0 (Wildtyp), wurde für PpRH2-KO #56 zunächst ein niedrigeres (1,3

nach 20 h) und fünf Stunden später ein höheres iP/iPR-Verhältnis berechnet (1,5). PpRH3-KO #7 wies

für beide Zeitpunkte übereinstimmend ein im Vergleich zum Wildtyp niedrigeres iP/iPR-Verhältnis

auf (1,0 bzw. 0,7). Ob dieser Befund als eine direkte Folge der veränderten RH-Aktivität zu sehen ist

oder ob es sich um eine indirekte Folge handelt, ist Gegenstand der anschließenden Diskussion.

A.

B.

Abb. 3.24 Darstellung des intrazellulären Verhältnisses von der Base iP zum Ribosid iPR nach 20 (A.) bzw. 25 (B.) stündiger in vivo Markierung mit

3H-iPR (30 nM) von Wildtyp und den Transformanten PpRH1 KO #29,

PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7.

Auswirkungen des RH-knockouts auf den Gesamt-Cytokinin-Status

Zur Abschätzung der Folgen eines RH-knockouts auf den Gesamtstatus an Cytokininen wurde die

Menge an Metaboliten mit Isopentenyl-Seitenkette den gebildeten Abbauprodukten gegenüber

gestellt (Abb. 3.25). Sowohl nach 20 als auch nach 25 stündiger Inkubation ergibt sich ein ähnliches

Bild: Übereinstimmend für alle Genotypen konnte zunächst ein deutlich höherer Anteil an

Abbauprodukten als an Metaboliten mit Isopentenyl-Seitenkette detektiert werden. PpRH1-KO #29

bildet aber im Vergleich zum Wildtyp (jeweils 3,8 pmol/100 mg) eindeutig mehr Abbauprodukte (6,5

bzw. 6,2 pmol/100 mg). Die Linien des PpRH2- und PpRH3-KO hingegen weisen eine geringere Menge

an Abbauprodukten als der Wildtyp auf (PpRH2-KO #56: 3,0 bzw. 3,3 pmol/100 mg; PpRH3-KO #7 2,6

bzw. 3,4 pmol/100 mg). Betrachtet man das Verhältnis von Abbauprodukten zu Metaboliten mit

Isopentenyl-Seitenkette wurde übereinstimmend beim Wildtyp, PpRH2- und PpRH3-KO die 2fache

Menge an Abbauprodukten gegenüber Metaboliten mit Isopentenyl-Seitenkette gebildet. Der

knockout PpRH1-KO hingegen bildet die 5fache Menge an Abbauprodukten gegenüber Metaboliten

mit Isopentenyl-Seitenkette.

Ergebnisse

76

A.

B.

Abb. 3.25 Darstellung der intrazellulären Mengen an

3H-Metaboliten mit Isopentenyl-Seitenkette und an

Abbauprodukten nach 20 (A.) bzw. 25 (B.) stündiger in vivo Markierung mit 3H-iPR (30 nM) von Wildtyp und

den Transformanten PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der knockout der RHs nach Markierung mit 3H-iPR deutlich

einen metabolischen Phänotyp erkennen lässt. Für PpRH1-KO #29 wurde ein gegenüber dem Wildtyp

erhöhtes Base/Ribosid-Verhältnis gemessen. Das Verhältnis von Metaboliten mit Isopentenyl-

Seitenkette und Abbauprodukten ist zugunsten der Abbauprodukte verschoben, d.h. es findet im

Vergleich zum Wildtyp eine verstärkte CKX-vermittelte Cytokinin-Inaktivierung statt. Bei

PpRH2-KO #56 wurde nach 20 Stunden ein niedrigeres, nach 25 Stunden ein höheres Base/Ribosid-

Verhältnis im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen. PpRH3-KO #7 zeigt hingegen zu beiden

Zeitpunkten ein niedrigeres Base/Ribosid-Verhältnis. Die Menge an gebildeten Abbauprodukten ist

bei PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 übereinstimmend nach 20 und 25 Stunden geringer als beim

Wildtyp. Somit konnte bei allen analysierten knockout Mutanten eine Beeinflussung des Cytokinin-

Metabolismus festgestellt werden. Der beobachtete Effekt auf den Stoffwechsel variiert leicht, je

nach dem welche RH ausgeschaltet wurde. Inwieweit das Fehlen einer RH direkte oder indirekte

Auswirkungen auf den Metabolismus haben kann, wird später diskutiert werden.

3.6.5 Analyse der Gehalte von Purinen und Pyrimidinen in Wildtyp und PpRH-knockout

Linien

Zur Bestimmung der Gehalte von in planta vorhandenen Purinen und Pyrimidinen sowie zur Klärung

der Frage, ob der knockout einer RH Veränderungen im Gehalt an endogenen Purinen bzw.

Pyrimidinen verursacht, wurden LC-MS/MS-basierte Messungen in Kooperation mit Dr. J. Klein

(Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D) durchgeführt. Hierfür wurden

Kulturen des Wildtyps und der Mutanten PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 wie unter

2.2.2 beschrieben kultiviert und Gewebeproben nach 0 und 21 Tagen entnommen. Nach einer

Aufbereitung der Gewebeproben (2.2.5) wurden diese anschließend per LC-MS/MS zur Bestimmung

der Purine und Pyrimidine vermessen (2.7). Für die Quantifizierung der detektierten Substanzen

wurden die zugefügten Standards ([15N5]Desoxyadenosin, [15N4]Inosin, [15N2]Orotsäure, [D3]S-

Sulfocystein, [D4]Thymin und [15N2]Uracil, jeweils 5 µM sowie [15N2]Harnsäure, 20 µM) verwendet,

wobei die meisten Substanzen (Ausnahme Thymin und Uracil) anhand des [15N4]Inosin-Standards

quantifiziert wurden. Hierfür wurde davon ausgegangen, dass sowohl extraktionsbedingte Verluste

als auch Ionisierung für Standard und Analyt ähnlich sind. Korrekterweise sollte daher bei den

anhand von [15N4]Inosin quantifizierten Analyten von Äquivalenten der jeweiligen Substanz

Ergebnisse

77

ausgegangen werden. In Abb. 3.26 sind die LC-MS/MS Chromatogramme ausgewählter Substanzen

dargestellt.

Abb. 3.26 LC-MS/MS Chromatogramme ausgewählter Substanzen. Gezeigt ist in (A.) Standard [15

N4]Inosin (270,9 Da), in (B.) Inosin (266,9 Da), in (C.) Adenosin (265,9 Da) und in (D.) Xanthosin (282,9 Da). In Kooperation mit Dr. J. Klein (Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D).

3.6.5.1 Gehalte von Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp

Informationen zu den Gehalten von Purinen oder Pyrimidinen in Pflanzen liegen bisher kaum vor. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals ein Purin- und Pyrimidin-Profil für das Laubmoos

Physcomitrella erstellt.

Folgende 15 Substanzen konnten anhand der LC-MS/MS Messungen im Gewebe des Wildtyps sicher

identifiziert werden (Abb. 3.27): Xanthosin, Xanthin, Inosin, Hypoxanthin, Desoxyinosin, Adenosin,

Adenin, Desoxyadenosin, Guanosin, Desoxyguanosin, Uridin, Uracil, Desoxyuridin, Thymidin sowie

Thymin. Cytidin-Metabolite und Nukleotide wurden bei den Messungen nicht analysiert. Für die

nachgewiesenen Purine und Pyrimidine konnten Konzentrationen im Bereich von 0,7 bis

81 nmol/g TG gemessen werden. Durch die Quantifizierung anhand der Standards ergab sich eine

Reihung der Substanzen je nach ihrem quantitativen Vorkommen nach 21 tägiger Kultivierung:

Xanthosin kommt demnach in der höchsten Konzentration im Gewebe vor, dann folgen in lediglich

etwas geringeren Mengen das Purin Adenosin sowie die Pyrimidine Uridin und Uracil. In bis zu 3fach

niedrigeren Konzentrationen wurden die Purin-Basen Adenin und Xanthin sowie die -Riboside

Guanosin und Inosin nachgewiesen. Die geringsten Mengen wurden für Hypoxanthin, Thymidin,

Thymin und die Desoxy-Formen von Adenosin, Inosin, Guanosin und Uridin gemessen.

Neben der Erstellung eines Profils von Purinen und Pyrimidinen wurde außerdem der zeitliche

Verlauf der Konzentrationen für die Substanzen analysiert. Die Abb. 3.27 zeigt die Mengen an

ausgewählten Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp zu Beginn des Experimentes (T0, oben) und

nach 21 Tagen (T21, unten). Zu Beginn des Experimentes und dem damit verbundenen Wechsel des

Kulturmediums wurden für nahezu alle Substanzen niedrigere Konzentrationen als zu späteren

Zeitpunkten gemessen. Dies deutet auf eine Sekretion oder passive Freisetzung der Substanzen hin.

Mit Zunahme der Kultivierungsdauer erfolgte daher bei den meisten Substanzen eine Zunahme der

Ergebnisse

78

Konzentration. Erste Messungen zum extrazellulären Vorkommen von Purinen und Pyrimidinen

bestätigen, dass diese im Kulturmedium in nmolaren Mengen vorkommen (Daten nicht gezeigt).

Abb. 3.27 Konzentrationen endogener Purine und Pyrimidine im Wildtyp nach 0 (oben) und 21 tägiger (unten) Kultivierung angegeben in nmol/g TG. Daten wurden mittels LC-MS/MS Messungen erhoben, [

15N4]Inosin

wurde als interner Standard zur Quantifizierung verwendet. Dargestellt sind die Mittelwerte von Messungen aus drei unabhängigen Kulturen eines Experimentes. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. In Einzelfällen wurden stark abweichende Werten von der Berechnung ausgeschlossen. In Kooperation mit Dr. J. Klein (Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D).

Während zu Beginn des Experimentes Adenosin den Hauptanteil aller analysierten Substanzen

ausmacht (55,4 ± 13,0 nmol/g TG), ist nach 21 Tagen die Akkumulation von Xanthosin im Vergleich zu

den übrigen Substanzen am höchsten (80,8 ± 26,0 nmol/g TG). Die meisten der detektierten Purine

und Pyrimidine zeigen eine deutliche Tendenz zu steigenden Konzentrationen während des

gesamten Messzeitraumes, die Konzentration von Adenosin nach 21 Tagen hingegen sinkt um den

Ergebnisse

79

Faktor 1,4 ab. Die stärkste Zunahme bei den Purinen wurde für Desoxyguanosin (4,8fach), Xanthin

(4,5fach) und Hypoxanthin (4,4fach) gemessen, wobei Desoxyguanosin im Vergleich zu den anderen

Purinen insgesamt in nur sehr geringen Konzentrationen vorkommt (3,4 ±1,8 nmol/g TG nach 21

Tagen). Von den Pyrimidinen nimmt Thymidin im zeitlichen Verlauf am stärksten zu (5,3fach).

3.6.5.2 Gehalte von Purinen und Pyrimidinen bei PpRH-knockouts

Zur Erfassung des Einflusses von RHs auf die Konzentrationen von intrazellulär vorhandenen Purinen

und Pyrimidinen wurden analog zu den Wildtyp-Proben auch LC-MS/MS Messungen an

Gewebeproben von den RH-KO Pflanzen PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 sowie PpRH3-KO #7

vorgenommen. Der Status der intrazellulär vorkommenden Purine und Pyrimidine nach 21 Tagen ist

in Abb. 3.28 dargestellt. Wie im Wildtyp wurden auch im Gewebe der Transformanten die Purine

Xanthosin, Xanthin, Inosin, Hypoxanthin, Desoxyinosin, Adenosin, Adenin, Desoxyadenosin, Guanosin

und Desoxyguanosin sowie die Pyrimidine Uridin, Uracil, Desoxyuridin, Thymidin und Thymin

eindeutig nachgewiesen. Unterschiede im Gehalt der einzelnen Metabolite zwischen den Genotypen

werden im Anschluss beschrieben. Desoxyinosin war der einzige Metabolit der übereinstimmend bei

allen Mutanten in einer erhöhten Konzentration im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen wurde.

PpRH1-KO #29

Für die Transformante PpRH1-KO #29 wurde ein gegenüber dem Wildtyp deutlich verändertes Purin-

und Pyrimidin-Profil gemessen (Abb. 3.28 A.). Nahezu alle analysierten Substanzen zeigten

übereinstimmend höhere Konzentrationen. Besonders auffällig waren hierbei die deutlich erhöhten

Niveaus von den Ribosiden Xanthosin (17fach), Inosin (14fach), Uridin (10fach) und Guanosin (2fach)

sowie der Base Adenin (3fach). Der knockout von PpRH1 führt somit zu einer teilweise drastischen

Akkumulation von Ribosiden und Basen.

PpRH2-KO #56

Bei der Transformante PpRH2-KO #56 waren im Vergleich zum Wildtyp keine drastischen

Veränderungen der intrazellulären Konzentrationen von Purinen und Pyrimidinen zu verzeichnen

(Abb. 3.28 B.). Nur für das Ribosid Uridin wurde ein deutlicher Anstieg gemessen (3fach mehr als

beim Wildtyp), alle anderen Purin- bzw. Pyrimidin-Vertreter zeigten keine signifikanten

Veränderungen.

PpRH3-KO #7

Im Gewebe von PpRH3-KO #7 war eine um den Faktor 5 niedrigere Guanosin-Konzentration als beim

Wildtyp zu messen (Abb. 3.28 C.). Die übrigen Substanzen blieben ähnlich wie bei PpRH2-KO #56

nahezu unbeeinflusst.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der Verlust der RHs PpRH1, -2 und -3 unterschiedliche

Effekte zeigt. Eine Beeinflussung des Purin- und Pyrimidin-Profils wurden für alle Genotypen

nachgewiesen, im Fall des PpRH1-KO #29 war diese aber deutlicher ausgeprägt, da eine Anhebung

der Gehalte von nahezu allen analysierten Purinen und Pyrimidinen gemessen wurde.

Ergebnisse

80

Abb. 3.28 Konzentrationen endogener Purine und Pyrimidine in den Transformanten PpRH1-KO #29 (A.), PpRH2-KO #56 (B.) und PpRH3-KO #7 (C.) im Vergleich zum Wildtyp nach 21 tägiger Kultivierung angegeben in nmol/g TG. Daten wurden mittels LC-MS/MS Messungen erhoben, [

15N4]Inosin wurde als interner Standard zur

Quantifizierung verwendet. Dargestellt sind die Mittelwerte von Messungen aus drei unabhängigen Kulturen eines Experimentes. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. In Einzelfällen wurden stark abweichende Werten von der Berechnung ausgeschlossen. Zu beachten ist die unterschiedliche Skalierung der y-Achsen. In Kooperation mit Dr. J. Klein (Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D).

Diskussion

81

4 Diskussion

Der Metabolismus von Purinen besitzt eine zentrale Bedeutung im pflanzlichen Stoffwechsel.

Biochemischen Aspekte zum Purin-Stoffwechsel wurden in der Vergangenheit bereits detailliert

untersucht, molekulare Studien wurden hingegen nur in begrenztem Umfang vorgenommen. Auch

Gene für Ribohydrolasen, die die hydrolytische Spaltung von Ribosiden in die korrespondierende

Base katalysieren, wurden erst kürzlich identifiziert. Hierbei wurde die RH-Familie in Arabidopsis

hinsichtlich ihrer physiologischen Rolle beschrieben. In dieser Arbeit wurde in vivo und in vitro RH-

Aktivität in dem Bryophyten Physcomitrella gemessen sowie molekulare, biochemische und

physiologische Aspekte zur RH-Familie aus Physcomitrella untersucht. Mögliche Funktionen und die

physiologische Rolle von RHs im Purin-und Cytokinin-Stoffwechsel bei Physcomitrella werden

diskutiert.

4.1 In vivo und in vitro RH-Aktivität in Physcomitrella

Zu Beginn der Studien sollte zunächst festgestellt werden, ob der Modellorganismus Physcomitrella

generell RH-Aktivität besitzt, d.h. ob nach Applikation eines Ribosids die Bildung der

korrespondierenden Base beobachtet werden kann. Allgemein liegen bisher nur wenige Daten zu

RHs in Pflanzen vor (1.2). Die zugehörige Enzym-Aktivität wurde für einige Pflanzen beschrieben (z. B.

(Abusamhadneh et al. 2000, Burch und Stuchbury 1986) und kürzlich wurde eine RH-Genfamilie aus

Arabidopsis identifiziert (Jung et al. 2011, 2009). Zu RHs in Moosen sind bisher keinerlei

Informationen veröffentlicht. Die physiologische Bedeutung von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel

konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden. Als eine Komponente des Purin- und Pyrimidin-

Stoffwechsels kommt RHs vermutlich eine Schlüsselfunktion bei der Kontrolle der Ratio zwischen

Recycling und Katabolismus von Purin- und Pyrimidin-Metaboliten zu. Außerdem wurde immer

wieder eine Beteiligung von RHs an der Kontrolle von Cytokininlevels diskutiert (Mok und Mok 2001,

Chen und Kristopeit 1981), so dass sich die vorliegende Arbeit ebenfalls mit dieser Fragestellung

befasst.

Physcomitrella besitzt RH-Aktivität

Wie in 3.1 beschrieben, wurde in vivo RH-Aktivität nach Applikation des Purin-Ribosids Adenosin zu

einer Physcomitrella Kultur gemessen. Hierfür wurden Proben aus dem Kulturmedium nach

24 Stunden entnommen und per HPLC analysiert. Die Bildung der Base Adenin konnte eindeutig

nachgewiesen werden. Dies stellt die erste Beschreibung von RH-Aktivität in einer

Nicht-Samenpflanze dar. Die errechnete in vivo Metabolisierungsrate für Adenosin betrug

19 nmol h-1 g-1 (FG). Bisherige Studien an RHs enthalten zumeist keine Angaben zu in vivo

Hydrolysierungsraten dieses Enzyms. Lediglich bei S. tuberosum wurden an Scheiben der Knolle in

vivo Messungen der RH-Aktivität mit Adenosin durchgeführt. Riewe et al. (2008) ermittelten eine

Aktivität von 0,6 µmol h-1 g-1 (FG), die somit um den Faktor 30 höher liegt als die für Physcomitrella

bestimmte in vivo Umsatzrate.

Wie bereits zuvor erwähnt, wird in der Literatur die Existenz einer Nukleosid-Phosphorylase in

Pflanzen kritisch diskutiert (1.2). Nukleosid-Phosphorylasen sind hauptsächlich aus Tieren bekannt

und katalysieren hier die reversible Phosphorolyse von Ribosiden. In Pflanzen erfolgte eine

Diskussion

82

Beschreibung dieser Enzym-Aktivität bisher nur für Weizenkeimlinge (Chen und Petschow 1978). Das

in der Veröffentlichung von Chen und Petschow beschriebene Enzym bevorzugt die Synthese-

Richtung, d.h. die Ribosid-Bildung aus der Base und Ribose-1-phosphat gegenüber der umgekehrten

Reaktion (Basen-Bildung aus Ribosiden). Ganz ausgeschlossen werden kann nicht, dass die bei

Physcomitrella beobachtete Deribosylierung von Adenosin zu Adenin durch eine Nukleosid-

Phosphorylase und nicht durch eine RH erfolgte. Allerdings ist aufgrund der wenigen Beschreibungen

des Enzyms das Vorkommen von pflanzlichen Nukleosid-Phosphorylasen als sehr fraglich anzusehen

(z.B. Deng und Ashihara 2010). Für den Fall, dass Nukleosid-Phosphorylasen bei Pflanzen

vorkommen, steht außerdem der Nachweis der Basen-Bildung aus Ribosiden noch aus. Die bei

Physcomitrella beobachtete Bildung der Base aus einem Ribosid wird daher der Aktivität von RHs

zugeordnet.

Neben in vivo Untersuchungen wurden außerdem auch in vitro Messungen zur RH-Aktivität in

Physcomitrella vorgenommen (3.6.3). Proteinextrakte wurden mit Tritium-markiertem Inosin

inkubiert und der Umsatz zur Base Hypoxanthin per HPLC vermessen. Für Inosin wurden in vitro eine

spezifische Aktivität von etwa 0,6-0,8 pmol min-1 mg-1 Protein berechnet. Diese erscheinen sehr

niedrig, wenn man sie mit Literaturangaben zur RH-Aktivität an Adenosin bei Kaffee

(84 nmol min-1 mg-1, Campos et al. 2005), Gelber Lupine (45 nmol min-1 mg-1, Abusamhadneh et al.

2000), Weizen (63 nmol min-1 mg-1, Chen und Kristopeit 1981) oder Gerste (90 nmol min-1 mg-1,

Guranowski und Schneider 1977) vergleicht. Für Arabidopsis wurde von Jung et al. (2011) eine in

vitro Umsatzrate für Inosin an entsalzten Blattextrakten von 17 nmol min-1 mg-1 berechnet.

Da der für die in vitro Messungen von RH-Aktivität bei Physcomitrella verwendete Puffer keinen

Phosphat-Zusatz enthielt, kann die bei Physcomitrella gemessene Umwandlung des Ribosids zur Base

nicht durch die zuvor erwähnte Phosphat-abhängige Nukleosid-Phosphorylase erfolgt sein. Die in

vitro Messungen stützen daher die Annahme, dass auch die in vivo beobachtete Umwandlung von

Adenosin zu Adenin durch RHs verursacht wurde.

Bei Physcomitrella ist demnach sowohl in vivo als auch in vitro RH-Aktivität nachweisbar, obgleich

beide Aktivitäten im Vergleich zu bisher gemessenen RH-Aktivitäten sehr niedrig sind. Nicht

auszuschließen ist, dass die schwachen in vitro Aktivitäten beispielsweise durch das Vorliegen eines

Inhibitors verursacht werden bzw. bei in vivo Messungen andere Enzym-Aktivitäten deutlich stärker

ausgeprägt sind und die zu messende RH-Aktivität überlagern.

4.2 Phylogenie von RHs

Phylogenetische Analysen wurden durchgeführt, um einen Überblick über die Verbreitung und die

Evolution von RHs im Pflanzenreich zu erhalten und um die aus Physcomitrella identifizierten RHs in

den Stammbaum von RHs einzuordnen.

Zunächst wurde eine detailierte BLAST-Suche durchgeführt, bei der in den Datenbanken des NCBI,

TIGR (http://blast.jcvi.org/euk-blast/plantta_blast.cgi, TA Accession-Nummern) und DFCI

(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html, TC Accession-Nummern) nach homologen RH-

Sequenzen in anderen pflanzlichen Genomen gesucht wurde. Darüberhinaus wurden über das JGI die

Genome der Grünalgen C. reinhardtii und V. carteri sowie das Genom des Moosfarns S. moellendorffii

gescreent. Bei der Auswahl der Aminosäure-Sequenzen wurde nur solche berücksichtigt, die das RH-

spezifische Aspartat-Motiv (Versées und Steyaert 2003) vollständig oder zumindest nahezu

Diskussion

83

vollständig enthielten. Die in die phylogenetische Stammbaum-Analyse miteinbezogenen Sequenzen

finden sich in der Abbildungsunterschrift von Abb. 4.1.

Pflanzliche RHs clustern in zwei Gruppen

Die Homologie-basierte Suche nach RH-Genen zeigte, dass diese im Pflanzenreich weit verbreitet

sind (Abb. 4.1). In Algen, Moosen, Moosfarnen und höheren Pflanzen wurden putative RH-Sequenzen

gefunden. Ihre Entstehung scheint somit nicht an bestimmte Bedingungen wie den Übergang vom

Wasser- zum Landleben angepasst zu sein. Es ist vielmehr davon auszugehen, dass RHs eine

grundlegende Funktion in allen pflanzlichen autotrophen Organismen übernehmen.

Die RH-Familien in den verschiedenen Organismen weisen ein bis fünf Mitglieder auf, RHs werden

somit durch relativ kleine Genfamilien repräsentiert. Der Großteil der Spezies verfügt über mehr als

ein putatives RH-Gen. Für viele der Spezies mit nur einer angeführten putativen RH-Sequenz sollte

angemerkt werden, dass hierbei häufig noch kein vollständig sequenziertes Genom vorliegt und

daher auf unvollständige Datenbanken zugegriffen werden musste.

Wie anhand des erstellten Stammbaumes (Abb. 4.1) deutlich wird, clustern pflanzliche RHs

hauptsächlich in zwei Gruppen. Somit gibt es größere Sequenzähnlichkeiten zwischen den

Gruppenmitgliedern verschiedener Spezies als innerhalb der RH-Familien einer Art. Alle Spezies, die

über mehr als eine putative RH-Sequenz verfügen, haben jeweils mindestens einen Vertreter in

beiden Gruppen. Dies deutet auf eine frühe Duplikation von RHs während der Evolution hin. Es ist

davon auszugehen, dass Mitglieder einer Gruppe ähnliche Eigenschaften aufweisen. Das weit

verbreitete Vorkommen von mindestens zwei RH-Genen im Genom vieler Pflanzen wirft die Frage

nach ihrer unterschiedlichen physiologischen und funktionellen Rolle auf.

Die im Rahmen dieser Arbeit beschriebenen RHs aus Physcomitrella gruppieren sich ebenfalls in

beide Gruppen ein. Während sich PpRH1 in einem Cluster mit AtNSH2, einer Inosin-bevorzugenden

RH aus Arabidopsis (Jung et al. 2011), sowie weiteren, nicht genauer charakterisierten RHs befindet,

clustern PpRH2 und -3 in einer Gruppe mit der zweiten, bisher genauer charakterisierten RH, einer

Uridin-bevorzugenden RH aus Arabidopsis (AtNSH1, Jung et al. 2009).

Diskussion

84

Abb. 4.1 Phylogenetischer Stammbaum für pflanzliche RHs nach maximum likelihood-Analyse (PhyML) mit bootstrap-Analyse (100 Replikate). Es wurde das LG-Model der Evolution benutzt. Das zugrunde gelegte Alignment wurde mit dem Programm MUSCLE erstellt; 260 von 918 Positionen (Aminosäuren) wurden nach Bearbeitung mit dem Programm Gblocks verwendet. Die Darstellung erfolgte mit dem Programm TreeView. In rot sind RHs aus Physcomitrella dargestellt. Die Berechnung des Stammbaumes erfolgte in Kooperation mit Dr. D. Kopečný (Palacký Universität, Olomouc, CZ). Folgende Sequenzen wurden in die phylogenetische Stammbaum-Analyse miteinbezogen (in Klammern ist jeweils die Anzahl an selektierten Sequenzen je Spezies angegeben): Physcomitrella patens (3): PpRH1 (XM_001783178), PpRH2 (XP_001771662), PpRH3 (XP_001752621); Arabidopsis thaliana (3): AtNSH1 (At2g36310), AtNSH2 (At1g05620), AtNSH3 (At5g18860); Brassica napus (5): BnRH1 (TC127999), BnRH2 (TA33831_3702), BnRH3 (TC115477), BnRH4 (TC117081), BnRH5 (TC114619); Chlamydomonas reinhardtii (1): CrRH1 (XM_001696168); Citrus sinensis (1): CsRH1 (TA21560_2711, TC12058); Coffea canephora (1): CcRH1 (TC9316); Gossypium raimondii (2): GrRH1 (TA12637_29730) GrRH2 (TC202453); Helianthus exilis (1): HeRH1 (TA415_400408); Hordeum vulgare (3): HvRH1 (AK250537, TA35689_4513, TC200794), HvRH2 (TA35406_4513), HvRH3 (AK250050); Medicago truncatula: MtRH1 (TA19359_3880, TC145232); Nicotiana tabacum (2): NtRH1 (TC81540), NtRH2 (TC91311); Oryza sativa (3): OsRH1 (TA42244_4530, NM_001056937), OsRH2 (TA38865_4530, TC331193, NM_001069024), OsRH3 (NM_001070501, TA38865_4530, TC331193); Phaseolus vulgaris (1): PvRH1 (TC22894); Picea sitchensis (2): PsRH1 (EF676318, TA23414_3332, TC99137), PsRH2 (EF676318, TC109203); Pinus taeda (1): PtRH (TA8237_3352); Populus trichocarpa (2): PtRH1 (XM_002310348, TA16113_3694), PtRH2 (XM_002309011); Prunus persica (1): PpRH (TC14314); Selaginella moellendorffii (2): SmRH1 (XM_002974764), SmRH2 (XM_002984237); Solanum lycopersicum (2): SlRH1 (AK325443, TA38623_4081, TC226478), SlRH2 (AK322170, TA39295_4081, TC244487); Solanum tuberosum (1): StRH1 (TA30129_4113, TC221989); Sorghum bicolor (3): SbRH1 (XM_002455315, TA24750_4558, TC119327), SbRH2 (TA26675_4558, TC116519), SbRH3 (XM_002461943, TA25109_4558, TC113907); Saccharum officinarum (1): SoRH1 (TA43292_4547); Triticum aestivum (3): TaRH1 (TA56209_4565), TaRH2 (TA76228_4565), TaRH3 (TA76014_4565, TC310758); Vigna unguiculata (1): VuRH1 (TC12589); Vitis vinifera (1): VvRH1 (XM_002280235); Volvox carteri: VcRH1 (XP_002945850); Zea mays (4): ZmRH1A (HQ825159), ZmRH1B (HQ825160), ZmRH2 (HQ825161), ZmRH3 (HQ825162).

Diskussion

85

4.3 Validierung des Genmodells von PpRH3

Wie bereits erwähnt, findet sich in der aus dem Genmodell Pp1s5_276V2.1 abgeleiteten

Aminosäure-Sequenz von PpRH3 eine leicht abgewandelte Form des RH-typischen Sequenzmotivs,

DXXXXXXDD statt DXDXXXDD (3.2). Bisher wurden keine RHs funktionell beschrieben, die dieses

Motiv in modifizierter Form aufweisen, so dass unklar ist, ob bei PpRH3 die Fähigkeit zur Hydrolyse

von Ribosiden ausgeprägt ist.

Bei der Expression von PpRH3 in verschiedenen E. coli-Stämmen unter variierenden Bedingungen

konnte kein bzw. nur minimale Mengen an löslichem Protein erhalten werden. Auch die Co-

Expression mit einem die Löslichkeit-verbessernden-Tag erbrachte keinen Erfolg (3.3.3). Die

Verwendung eukaryotischer Expressionssysteme wie Pichia pastoris oder S. cerevisiae könnte

möglicherweise zur richtigen Faltung des Proteins und damit zu Produktion von löslichem Protein

führen.

Vor kurzem wurde mit V1.6 eine neue Assemblierung des Physcomitrella Genoms publiziert (V1.6,

http://cosmoss.org/). Für PpRH3 wird hierbei ein neues Genmodell vorgeschlagen, aus dem eine

veränderte Protein-Sequenz hervorgeht (Pp1s5_276V6.1). Diese enthält das vollständige

Sequenzmotiv DXDXXXDD und ist außerdem in seinen Intronpositionen ähnlicher zu den anderen

PpRH-Familienmitgliedern (Daten nicht gezeigt). Daher wurde angenommen, dass das ursprüngliche

Genmodell aus der Assemblierung V1.2 möglicherweise fehlerhaft ist. Zur Überprüfung der cDNA-

Sequenz wurde PpRH3 daher aus einer cDNA-Bank (Reski et al. 1995) über PCR amplifiziert und die

erhaltenen Produkte sequenziert. Als Primer wurde jeweils ein spezifischer Primer sowie ein Primer

aus dem die cDNA-Bank enthaltenen Vektor verwendet. Die erhaltenen Amplifikate bestätigten das

neuere Genmodell in großen Teilen. Im 3‘-Bereich scheint allerdings keines der zum derzeitigen

Zeitpunkt veröffentlichen Genmodelle zutreffend zu sein. Die in Version 1.6 der Genom-

Assemblierung mit aufgeführten Sequenzierungsdaten in Form von illumina reads

(https://www.cosmoss.org/mgb2/gbrowse/physcome/) deuten auf eine Translation des in den

Genmodellen aus V2.1 und V6.1 als 8. Intron markierten Bereichs hin. Auf Grundlage der über PCR

erhaltenen cDNA-Sequenzen wurde daher ein neues Genmodell etabliert (Abb. 4.2, PpRH3 VPCR).

Die aus der cDNA-Bank erhaltene Sequenz deutet darauf hin, dass PpRH3 acht statt neun Exons

enthält und dass ein Großteil des in vorherigen Versionen des Genmodells als 8. Intron markierten

Bereichs zur kodierenden Sequenz gehört. Sowohl die auf PCR-Analysen gestützte, neu

rekonstruierte cDNA-Sequenz als auch die korrespondierende Protein-Sequenz finden sich im Anhang

(6.2.3). Es wäre außerdem auch denkbar, dass es sich bei der erhaltenen cDNA lediglich um eine

splicing-Variante von PpRH3 handelt. Zur Analyse des 5‘- und 3‘-UTRs sowie zum möglichen

Auffinden weiterer splicing-Varianten, müssten weitere PCR gestützte Analysen vorgenommen

werden. Nach gründlicher Verifizierung der cDNA-Sequenz von PpRH3 könnte die abgeleitete

Protein-Sequenz dann erneut zur Herstellung von rekombinantem Protein eingesetzt werden.

Außerdem sollten nach Verifizierung der cDNA-Sequenz die in dieser Arbeit vorgenommenen

Lokalisierungsexperimente für PpRH3 wiederholt werden (vgl. 4.9). Kinetische Parameter wurden

aufgrund der geringen Löslichkeit von PpRH3 nicht bestimmt. Die Validität der knockout-Experimente

ist von der Korrektur des PpRH3-Genmodells nicht betroffen, da hierfür auf genomische Sequenzen

zurückgegriffen wurde.

http://cosmoss.org/bm/retrieval?db=P.patens.V1.6_proteins&state=link&acc=Pp1s5_276V6.1

Diskussion

86

Abb. 4.2 Vergleich verschiedener Genmodells für PpRH3. Schematische Darstellung der Intron/Exon-Struktur des Genmodells von PpRH3 aus der Assemblierung V1.2 und V1.6. (Pp1s5_276V2.1, Pp1s5_276V6.1) sowie der über PCR erhaltenen neuen cDNA-Sequenz (PpRH3 VPCR). In grau sind untranslatierte Bereiche in der 5‘- und 3‘-Region dargestellt, farbige Boxen stellen die kodierenden Abschnitte (Exons) dar, die von Introns unterbrochen sind. * Da zu Beginn der Arbeit nur das Genmodell PpRH3 V2.1 zur Verfügung stand, wurde die daraus abgeleitete cDNA-Sequenz für diese Arbeit verwendet.

4.4 Genomische Organisation von pflanzlichen RHs

Die Untersuchung der genomischen Organisation von RH-Genen aus Physcomitrella zeigte, dass eine

konservierte Intron/Exon-Struktur innerhalb der Gruppe vorliegt. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit

werden zunächst die Genmodelle von PpRH1 und -2 verglichen, wobei folgende Überstimmungen

gefunden wurden (Abb. 4.3): Die Gene enthalten beide neun Exons und dementsprechend acht

Introns. Die größte Länge wurde für das 1. Intron bestimmt (> 692 bp). Das 3. Exon weist mit 59 bp

die geringste Anzahl an Basenpaaren auf, wohingegen das 4. Exon die höchste Anzahl an

Basenpaaren (> 182 bp) besitzt. Alle Exons stimmen in ihrer Länge nahezu vollständig überein. Im Fall

von PpRH3 wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues Genmodell etabliert, da PCR-Experimente

zeigten, dass keines der bisher veröffentlichten Genmodelle richtig ist (4.3). Das neue Genmodell

PpRH3 VPCR weicht wie bereits erwähnt in seiner genomischen Organisation leicht von PpRH2 und -

3 ab: Es enthält acht statt neun Exons, wobei das 8. Exon mit 488 bp das längste Exon darstellt. Das

kürzeste Exon bildet auch hier das Exon 3 mit einer Länge von 60 bp. Die Positionen der weiteren

Exons sind nahezu identisch mit den Positionen der Exons in den Genmodellen von PpRH1 und -2.

Eine derart übereinstimmende Anordnung von Exons und Introns stützt die Annahme, dass die

selektierten RH-Gene zu einer hochkonservierten Genfamilie in Physcomitrella gehören.

Die Intron/Exon-Struktur ist bei pflanzlichen RHs hoch konserviert

Um einen Überblick über die generelle genomische Organisation von RHs im Pflanzenreich zu

bekommen, wurden RH-Gene aus Physcomitrella mit den korrespondierenden Genen der bereits

charakterisierten RHs AtNSH1 und AtNSH2 aus Arabidopsis (Loci At2g36310 (AtNSH1) und At1g05620

(AtNSH2), vgl. Jung et al. 2011) sowie putativen RH-Sequenzen aus Z. mays (ZmRH1), dem Moosfarn

S. moellendorffii (SmRH1) und den Grünalgen V. carteri (VcRH1) und C. reinhardtii (CrRH1) verglichen

(Abb. 4.3). Im Genom von Z. mays und S. moellendorffii wurden insgesamt vier bzw. zwei putative

RH-Gene gefunden, von denen hier jeweils nur ein Gen exemplarisch dargestellt ist, da sich die

Genstrukturen innerhalb einer Spezies ähnelten.

Wie aus Abb. 4.3 hervorgeht, ist die Intron/Exon-Struktur bei allen untersuchten Sequenzen in ihrer

Grundanordnung sehr ähnlich. Lediglich bei den Vertretern von Grünalgen fällt auf, dass die

Genarchitektur eine geringere Ähnlichkeit zu den übrigen Sequenzen aufweist. RHs aus Dikotylen,

Diskussion

87

Monokotylen, Moosfarnen und Moosen zeigen hingegen eine hoch konservierte genomische

Organisation: Die Gene weisen acht Introns auf, wobei das 1. Intron das längste ist (Ausnahme

PpRH3, ZmRH1). Darüberhinaus sind die Intronpositionen zwischen den Organismen hoch

konserviert: Außer dem 1. und letzten Exon weisen die übrigen sieben Exons nahezu die gleiche

Anzahl an Basenpaaren auf; Exon 4 besitzt die höchste Anzahl an Basenpaaren (Ausnahme PpRH3).

Die 5‘- und 3‘-terminalen Exons scheinen entweder grundsätzlich divergenter zu sein oder es handelt

sich bei den Längenangaben um fehlerhafte computerbasierte Vorhersagen der entsprechenden

Genmodelle. Die Wahrscheinlichkeit, dass Positionen und Länge aller neun Exons hoch konserviert

sind, wird aufgrund der Datenlage als relativ hoch eingestuft.

Neben den hohen Überstimmungen hinsichtlich der genomischen Organisation der analysierten RH-

Gene fällt auf, dass die Introns bei Physcomitrella (und Z. mays) generell länger als bei Arabidopsis

sind. Während bei Physcomitrella die Intronlängen der RH-Gene von 154-1454 bp variieren, weisen

Introns von RH-Genen bei Arabidopsis nur 81-276 bp auf. Die bei Physcomitrella im Vergleich zu

Arabidopsis generell größere Intronlänge wurde bereits von Rensing et al. (2005) beschrieben.

Die hohe Ähnlichkeit der Intron/Exon-Struktur der RH-Gene legt nahe, dass diese aus einem

gemeinsamen Vorläufer durch Duplikation entstanden sind. Grünalgen, die sich bereits früher in der

Evolution unabhängig von der Linie der Landpflanzen getrennt haben, weisen dementsprechend eine

höhere Divergenz auf. Die beschriebene Ähnlichkeit zwischen der Genstruktur bei Bryophyten und

Gefäßpflanzen könnte auf eine basale und somit ebenfalls ähnliche Funktion dieser Enzyme im

pflanzlichen Stoffwechsel hindeuten. Mögliche Funktionen von RHs werden in 4.11 diskutiert.

Abb. 4.3 Schematische Darstellung der Intron/Exon-Struktur von ausgewählten RH-Genen: AtNSH1 und -2 aus Arabidopsis (Genmodelle: At2g03652.1 (AtNSH1) und At1g05620.1 (AtNSH2) aus TAIR Datenbank), ZmRH1 aus Zea mays (Genmodell: GRMZM2G029845_T01 aus JGI Datenbank), SmRH1 aus Selaginella moellendorffii (Genmodell: 80581 (e_gw1.3.1381.1) aus JGI Datenbank), PpRH1, -2 und -3 aus Physcomitrella (Genmodelle: Pp1s357_22V2.1 (PpRH1), Pp1s140_172V2.1 (PpRH2) aus cosmoss genome browser sowie für PpRH3 das validierte Genmodell PpRH3 VPCR), VcRH1 aus Volvox carteri (Genmodell: 55637 (e_gw1.1.580.1) aus JGI-Datenbank) sowie CrRH1 aus Chlamydomonas reinhardtii (Genmodell: Cre06.g271050.t1.1 aus JGI Datenbank). AtNSH3 wurde aufgrund der grundsätzlich anderen Sequenz und seiner Charakterisierung als extrazelluläre RH (Jung et al. 2011) nicht in die Analyse miteinbezogen. Aus Z. mays und S. moellendorffii wurde jeweils nur ein exemplarisches RH-Gen dargestellt. Exons sind farbig entsprechend ihrer Länge dargestellt. Die Länge der durchgehenden schwarzen Linie korreliert nicht mit der Länge der Introns. Angegeben sind die jeweiligen Größen in Basenpaaren. * Diese Genmodelle wurden über PCR-Experimente mit cDNA als Template überprüft.

Diskussion

88

4.5 Funktioneller Nachweis für PpRH1 und PpRH2 als RHs

Rekombinante Proteine von PpRH1 und PpRH2 wurden in E. coli hergestellt und über

Affinitätschromatografie aufgereinigt. Diese wurden im Anschluss zur Bestimmung der kinetischen

Parameter eingesetzt.

4.5.1 Methodendiskussion der eingesetzten Enzym-Assays - Spektrophotometrischer

Assay versus HPLC-basierter Assay

Bevor auf die Ergebnisse zu den gemessenen enzymkinetischen Konstanten der untersuchten RHs

eingegangen wird, sollen zunächst die angewandten Enzym-Assays unter methodischen

Gesichtspunkten verglichen und diskutiert werden.

Zur Messung von RH-Aktivität wurde zum einen ein spektrophotometrische Assay nach Parkin (1996),

und zum anderem ein HPLC-basierter Assay angewendet. Während beim spektrophotometrischen

Assay der Substratverbrauch online verfolgt werden kann, ist mit dem HPLC-basierten Assay nur eine

Endpunktbestimmung möglich. Daher eignet sich der spektrophotometrische Assay besser, um

kinetische Konstanten unter definierten Bedingungen zu messen. Während der Parkin-Assay keine

Informationen zur Produktidentität liefert, können sowohl Substrat und Produkt per HPLC eindeutig

identifiziert und quantifiziert werden. Daher ist das Anwendungsspektrum des HPLC-basierten Assays

größer, da RH-Aktivität auch in inhomogenen Systemen wie Zellextrakten oder Proteinextrakten

gemessen werden kann. Ein weiterer Unterschied zwischen den angewandten Methoden besteht

darin, dass beim spektrophotometrischen Assay nicht beliebig hohe Substratkonzentrationen

eingesetzt werden können bzw. bei hohen Substratkonzentrationen und damit hohen Absorptionen

mit einer Limitierung seitens der Photometer-Messtechnik gerechnet werden muss, die dann zu

fehlerhaften Messwerten führt. Für Substrate, die eine nur geringe Affinität zum Enzym besaßen und

daher in hohen Konzentrationen eingesetzt werden mussten, konnten mittels Parkin-Assay daher

teilweise keine kinetischen Parameter ermittelt werden (z.B. Xanthosin). Zur Messung des pH-

Optimums wurde der HPLC-basierte Assay verwendet, weil der Anwendung des Parkin-Assays in

diesem Fall ebenfalls Grenzen gesetzt sind, da die Differenz der molaren Extinktionskoeffizienten

zwischen Substrat und Produkt je nach pH variiert.

Beide Methoden eignen sich prinzipiell, um RH-Aktivität zu messen. Je nach Anwendung wurde daher

entschieden, welche Methode besser geeignet erschien und zum Einsatz kam.

Diskussion

89

4.5.2 Charakterisierung von PpRH1

Zur genaueren Charakterisierung von PpRH1 wurden zunächst einige biochemische Eigenschaften am

rekombinanten Protein bestimmt, die zusammenfassend in Box 4.1 dargestellt sind.

Eigenschaften von PpRH1

Quartärstruktur: Dimer bzw. Tetramer

Temperatur-Optimum: 35 °C

pH-Optimum: 7,5-8,0

Co-Faktor: 2-wertige Kationen, vermutlich Ca2+

Lokalisierung: Cytoplasma

Substratspezifität: Inosin > Adenosin > Guanosin > Uridin

Maximale spezifische Aktivität: 100 nmol Inosin s-1

mg-1

Weitere Substrate: iPR, Xanthosin

Keine Aktivität an Cytidin, Thymidin

Box 4.1 Zusammenfassung der für PpRH1 in dieser Arbeit ermittelten biochemischen Charakteristika.

PpRH1 bildet im Gegensatz zu anderen pflanzlichen RHs neben Dimeren auch Tetramere

Für die Monomere von PpRH1 und PpRH2 wurden anhand der Aminosäure-Sequenzen

Molekülmassen von ca. 35 kDa berechnet und via SDS-PAGE bestätigt. Die Monomere von bisher

beschriebene RHs aus Prokaryoten, Protozoen und verschiedenen Pflanzen weisen Molekülmassen in

der Größenordnung von 30-40 kDa auf (z.B. Campos et al. 2005, Atkins et al. 1989). Insofern fügen

sich die RHs aus Physcomitrella mit ihrer Molekülmasse in die Reihe der bereits beschriebenen RHs

ein.

Hinsichtlich ihrer Quartärstruktur bilden die bisher charakterisierten RHs zumeist Dimere, Trimere

oder Tetramere aus. Die Bildung von Oligomeren scheint demnach ein wichtiges generelles Merkmal

von RHs zu sein. Daher wird ein Zusammenhang zwischen der Oligomerisierung und der Funktion

oder Regulation dieser Proteine angenommen. Für PpRH1 aus Physcomitrella wurden zur

Bestimmung des Oligomerisierungsgrades native PAGE und Gelfiltration mit rekombinantem Protein

durchgeführt (3.4.1). Die anschließend kalkulierten Molekulargewichte zeigen, dass PpRH1 als

natives Protein vornehmlich als Homodimer vorliegt, aber auch Tetramere bilden kann. Auch die

Katalytische Effizienzen (Inosin = 100%)

Diskussion

90

vorgenommenen Ansätze zur Aufklärung der Kristallstruktur zeigten, dass PpRH1 als Dimer vorliegt

(3.4.2). Während derzeit bekannte pflanzliche RHs nur als Homodimere vorkommend beschrieben

wurden (z.B. Campos et al. 2005, Abusamhadneh et al. 2000), wurden in E. coli (z.B. Giabbai und

Degano 2004) und einigen Protozoen (z.B. Parkin et al. 1991) RHs identifiziert, die in ihrer nativen

Form ebenfalls Tetramere bilden. Für die erst kürzlich beschriebenen RHs aus Arabidopsis (Jung et al.

2011, 2009) ist nicht bekannt, welche Quartärstruktur sie ausbilden. PpRH1 bildet insofern eine

Besonderheit, da es die erste pflanzliche RH ist, für die neben der Dimerisierung auch die

Tetramerisierung unter nativen Bedingungen beschrieben werden konnte. Allerdings ist zu

berücksichtigen, dass die Quartärstruktur von PpRH1 an einem heterolog exprimierten Protein

bestimmt wurde, während alle anderen pflanzlichen RHs aus Pflanzenmaterial aufgereinigt und

angereichert wurden. Es besteht also die Möglichkeit, dass PpRH1 in planta eine andere

Quartärstruktur einnimmt. Zur Bestätigung der Quartärstruktur von nativem PpRH1 Protein könnte

man PpRH1 homolog in Physcomitrella exprimieren (vgl. z.B. Bauer et al. 2005) und nach

Aufreinigung eine Bestimmung des Oligomerisierungsgrades des Proteins vornehmen.

Das pH-Optimum von PpRH1 ist kompatibel zur cytosolischen Lokalisierung

Als optimale Reaktionsbedingungen für die Aktivität von PpRH1 - getestet anhand des Substrates

Inosin - wurde eine Temperatur von 35 °C und ein pH von 7,5-8,0 ermittelt. Diese gemessenen

Optima werden im Folgenden mit aus der Literatur bekannten Werten verglichen.

Für das Temperatur-Optimum von RHs existieren nur wenige Daten in der Literatur. Eine aus Gerste

isolierte RH weist mit 58 °C ein ungewöhnlich hohes Temperatur-Optimum auf (Guranowski und

Schneider 1977). Aus Tee aufgereinigte RHs besitzen ebenfalls relativ hohe Temperatur-Optima von

45-50 °C (Imagawa et al. 1979). Da es sich hierbei jeweils um natives und nicht wie bei PpRH1 um

rekombinantes Protein handelte, könnten die Unterschiede auch auf die verschiedene Herkunft der

Proteine zurückzuführen sein. Das rekombinante AtNSH1 Protein aus Arabidopsis besitzt hingegen

mit 35 °C das gleiche Temperatur-Optimum wie PpRH1 (Engel und Moffatt, persönliche Mitteilung).

Bezüglich ihres pH-Optimums variieren die bisher beschriebenen RHs sehr stark. Viele RHs scheinen

tolerant gegenüber Änderungen des pHs zu sein, weisen also kein eng gefasstes pH-Optimum auf.

Eine aus Kaffee isolierte RH beispielsweise besitzt ein pH-Optimum bei pH 6,0, behält aber 50 % der

maximalen Aktivität auch bei pH 4,5 und pH 7,7 (Campos et al. 2005). Die meisten pflanzlichen RHs

entfalten ihre höchste Aktivität in niedrigeren pH-Bereichen. Das pH-Optimum einer aus Weizen

isolierten RH (Chen und Kristopeit 1981) liegt beispielsweise im sauren Bereich bei pH 4,7, ähnlich

wie das einer aus Rosenkohl isolierten RH (pH-Optimum: 4,0; Mazelis und Creveling 1963). Andere

RHs bevorzugen einen pH von 6,0 (z. B. Tomate, Burch und Stuchbury 1986). Nur wenige RHs weisen

wie PpRH1 ein noch höheres pH-Optimum auf. Hierzu zählt eine aus Gelber Lupine isolierte RH mit

einem pH-Optimum von 7,5 (Abusamhadneh et al. 2000 bzw. Guranowski 1982), die aus Arabidopsis

isolierte AtNSH1 mit einem pH-Optimum von pH 7,5-8,0 (Engel und Moffatt, persönliche Mitteilung)

sowie viele der aus Mikroorganismen isolierten RHs (z.B. Magni et al. 1975, Parkin 1996).

Lokalisierungsstudien auf zellulärer Ebene wiesen eine cytoplasmatische Lokalisierung für PpRH1

(sowie PpRH2 und -3) nach (3.5), was im Einklang mit dem gemessenen pH-Optimum steht, dass

offenbar auf die im Cytoplasma vorherrschenden pH-Bedingungen (pH 7) abgestimmt ist.

Diskussion

91

Calcium könnte als Co-Faktor von PpRH1 fungieren

Für einige RHs wurde eindeutig nachgewiesen, dass Calcium als Co-Faktor fungiert (z.B. T. vivax,

Versées et al. 2001). Szuwart et al. (2006) beschreiben beispielsweise für eine RH aus Gelber Lupine

eine Stimulation der Enzym-Aktivität durch Zugabe von Calcium. Die Anwesenheit von Calcium in

einer Konzentration von 2 mM führte zu einer 6fach gesteigerten Enzym-Aktivität. Für alle weiteren

isolierten RHs aus Pflanzen liegen entweder keine Messungen hierzu vor oder es konnte keine

positive Auswirkung von Calcium auf die Aktivität gemessen werden (z.B. Imagawa et al. 1979,

Guranowski und Schneider 1977). Die enzymatische Charakterisierung von RHs aus Prokaryoten und

Protozoen ist in der Literatur weitaus umfassender beschrieben als für RHs aus Pflanzen.

Insbesondere durch die Aufklärung der Kristallstrukturen von protozoischen RHs (z.B. Giabbai und

Degano 2004, Shi et al. 1999) liegen viele Daten zur strukturellen Basis der Substratspezifität und

dem katalytischen Mechanismus der RH-Reaktion vor (z.B. Giabbai und Degano 2004, Versées und

Steyaert 2003). Verschiedene Autoren bestätigen, dass im aktiven Zentrum von RHs Ca2+ als 2-

wertiges Kation gebunden ist, welches in die Bindung und Umsetzung des Substrates involviert ist

(Versées et al. 2001, Degano et al. 1998). Das bereits genannte RH-typische Sequenzmotiv

DXDXXXDD ist hierbei sowohl für die richtige Koordination des Calcium-Ions als auch für die

Interaktion mit dem Substrat verantwortlich. Dass Calcium als Co-Faktor von RHs fungiert, wurde

außerdem auch experimentell beispielsweise für eine RH aus C. fasciculata über spektroskopische

Elementanalyse bestätigt (Degano et al. 1998). Während das Vorhandensein von Calcium als Co-

Faktor für mikrobielle RHs als gesichert angesehen werden kann, bleibt die Frage nach dem Co-

Faktor bei pflanzlichen RHs noch offen. Diese Frage ist vermutlich erst zu beantworten, wenn die

erste Kristallstruktur einer pflanzlichen RH aufgeklärt ist. Die mit rekombinantem PpRH1 Protein

vorgenommenen Enzym-Assays konnten nicht eindeutig bestätigen, dass Calcium als Co-Faktor

fungiert, da eine Addition von Calcium nicht zu einer Aktivitätssteigerung führte (3.4.4.3).

Möglicherweise war das PpRH1 Protein bereits vor der Ca2+-Zugabe gesättigt. Da aber nach

Inkubation mit EDTA und EGTA eine Minderung der RH-Aktivität zu messen war, ist es als sehr

wahrscheinlich anzusehen, dass Ca2+ oder andere 2-wertige Kationen von PpRH1 als Co-Faktoren

benötigt werden.

PpRH1 kodiert für eine Purin-bevorzugende RH

Die Messung des Substratspektrums von PpRH1 am rekombinanten Protein aus E. coli erfolgte unter

Anwendung des spektrophotometrischen Enzym-Assays. Als bevorzugtes Substrat wurde eindeutig

Inosin (Km 82 µM, Tab. 3.2) identifiziert. Als weitere Substrate wurden Adenosin (Km 101 µM),

Guanosin (Km 166 µM), Uridin (Km 1485 µM) sowie Xanthosin und das Cytokinin iPR bestimmt.

Basierende auf der katalytischen Effizienz (Vmax/Km) ergibt sich folgende Reihung für die PpRH1-

Substrate Inosin > Adenosin > Guanosin > Uridin. Keine Aktivität wurde an den Pyrimidinen Cytidin

und Thymidin gemessen. Die gemessenen Km-Werte zeigen, dass PpRH1 Purin-Riboside eindeutig mit

höherer Affinität als Pyrimidin-Riboside bindet. Die Maximalgeschwindigkeit für Uridin ist zwar

deutlich höher als für einige Purine, führt aber durch den hohen Km insgesamt nicht zu einer hohen

katalytischen Effizienz (Vmax/Km = 0,03).

Vergleicht man die katalytischen Effizienzen der Substrate von PpRH1, so fällt auf, dass diese im

Vergleich zu Inosin bei allen anderen Substraten deutlich niedriger sind. Bereits für das 2. beste

Substrat - Adenosin - reduziert sich die katalytische Effizienz um den Faktor 10. Das ist insofern

Diskussion

92

bemerkenswert, als dass sich die beiden Substanzen strukturell lediglich geringfügig unterscheiden.

Für Guanosin und Uridin wurde sogar eine Reduktion um Faktor 42 bzw. 125 gemessen. PpRH1

scheint somit in hohem Maße spezifisch für Inosin zu sein.

Für Vergleiche mit anderen pflanzlichen RHs hinsichtlich des Substratspektrums sowie der

katalytischen Effizienz des rekombinanten Proteins liegen derzeit nur Daten aus Arabidopsis vor (Jung

et al. 2011, 2009). Das Substratspektrum von AtNSH1 umfasst das Pyrimidin Uridin, sowie die Purine

Inosin, Adenosin, Xanthosin und iPR mit Km-Werten von 0,8; 1,4; 0,7; 1,7 und 0,4 mM. Berücksichtigt

man die maximale katalytische Aktivität für die genannten Substrate, ergibt sich für AtNSH1 die

folgende Reihung: Uridin > Xanthosin > Inosin > Adenosin > iPR. AtNSH1 und PpRH1 unterscheiden

sich somit hinsichtlich ihres Hauptsubstrates: Während AtNSH1 das Pyrimidin Uridin bevorzugt, setzt

PpRH1 bevorzugt das Purin Inosin um. Die gemessenen Km-Werte liegen außerdem im Fall von PpRH1

im µmolaren Bereich, während für AtNSH1 Werte im mmolaren Bereich gemessen wurden. Daraus

lässt sich ableiten, dass PpRH1 eine deutlich höhere Affinität zu seinen Substraten besitzt bzw. an

deutlich geringere Substratkonzentrationen angepasst ist. In der Literatur wurde bisher nur

fragmentarisch beschrieben, in welchen Konzentrationen Purine und Pyrimidine in planta auftreten.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher auch LC-MS/MS-basierte Messungen der Gehalte an Purinen

und Pyrimidinen im Gewebe von Physcomitrella durchgeführt (3.6.5). Berechnet man anhand dieser

Daten näherungsweise die intrazellulären Konzentrationen bezogen auf das Frischgewicht

(Annahmen: 1 g TG entspricht ca. 90 g FG; 1 g FG entspricht ca. 1 ml Zellvolumen), ergeben sich

nmolare Gewebe-Konzentrationen für die gemessenen Purin- und Pyrimidin-Riboside (3.6.5.1). Die

µmolaren Km-Werte für PpRH1 liegen somit deutlich oberhalb der gemessenen Gewebe-

Konzentration.

Inosin-umsetzende RHs sind aus Bakterien (Petersen und Møller 2001), Hefe (Kurtz et al. 2002),

Pilzen (Abdel-Fatah et al. 2003) und Protozoen (Shi et al. 1999, Parkin et al. 1991) bekannt. Für

Pflanzen sind einige Purin-bevorzugende RHs beschrieben, wobei es Adenosin-spezifische RHs gibt,

d.h. solche die Inosin nicht umsetzen (Riewe et al. 2008, Le Floc'h und Lafleuriel 1981, Imagawa et al.

1979) und andere RHs, die auch geringe Aktivität an Inosin zeigen (Abusamhadneh et al. 2000).

Inosin-bevorzugende RHs aus Pflanzen wurden in der Literatur bisher nur drei beschrieben. Von Jung

et al. (2011) wurde in Arabidopsis eine Inosin-bevorzugende RH (AtNSH2) durch die

Charakterisierung entsprechender Überexpressionsmutanten identifiziert. Nach Überexpression von

AtNSH2 wurden deutlich gesteigerte Hydrolyse-Raten für Inosin gemessen, während die Hydrolyse-

Raten für andere Purin- und Pyrimidin-Riboside weitestgehend unbeeinflusst blieben. Da kein

rekombinantes AtNSH2 Protein erhalten wurde, können keine Vergleiche mit den kinetischen Daten

von PpRH1 gezogen werden. Eine weitere Inosin-bevorzugende RH wurde von Le Floc'h und Lafleuriel

(1981) aus Jerusalem-Artischocke isoliert. Der gemessene Km-Wert für Inosin von 2,5 µM spiegelt

eine hohe Inosin-Affinität wider, die noch über der des rekombinanten PpRH1 Proteins liegt. Als

weiteres Substrat dieser RH wurde zusätzlich Guanosin identifiziert. Außerdem wurde aus Gelber

Lupine eine Inosin-bevorzugende RH aufgereinigt (Guranowski 1982) und ein Km von 65 µM für Inosin

ermittelt. Neben Inosin wurden von dieser RH auch Adenosin und Guanosin umgesetzt. Zumindest

hinsichtlich der Substratspezifität scheinen sich dieses Enzym und PpRH1 sehr zu ähneln. Da keine

weiteren Daten zu kinetischen Parametern oder zur Aminosäure-Sequenz der RH aus Gelber Lupine

vorliegen, können keine weiteren Vergleiche zwischen den beiden Proteinen gezogen werden.

Diskussion

93

4.5.3 Charakterisierung von PpRH2

PpRH2 besitzt schwach ausgeprägte RH-Aktivität und bevorzugt Pyrimidine

Für das rekombinante Protein von PpRH2 wurde eine insgesamt nur sehr geringe Aktivität in Relation

zur Menge an eingesetztem Protein festgestellt (Tab. 3.2). Dieses Ergebnis wurde anhand

unterschiedlicher Expressions- und Aufreinigungsansätze mehrfach bestätigt. Schwache Umsätze

wurden für Xanthosin und iPR gemessen, für das Pyrimidin Uridin wurde ein Km von 1015 µM

zusammen mit einer maximalen katalytischen Aktivität von 27 nmol s-1 mg-1 bestimmt. Die Purine

Inosin, Adenosin und Guanosin wurden nicht umgesetzt, ebenso wie die Pyrimidine Cytidin und

Thymidin.

Derart geringe enzymatische Aktivitäten von PpRH2 könnten damit zu erklären sein, dass die

Expression in einem prokaryotischen System zu einer inkorrekten Faltung des Proteins und damit zu

einer reduzierten Aktivität führt. Außerdem wäre denkbar, dass das getestete Substratspektrum für

PpRH2 nicht weit genug gewählt wurde. Die Protein-Sequenzen von PpRH1 und PpRH2 stimmen zwar

in den Aminosäuren an katalytisch wichtigen Positionen nach Versées et al. (2001) überein (Abb. 3.3),

die vorgenommenen phylogenetischen Analysen gruppieren PpRH1 und -2 allerdings in zwei

verschiedene Gruppen ein (Abb. 4.1). Ob ein ähnliches Substratspektrum für PpRH1 und PpRH2 zu

erwarten ist, kann daher zu diesem Zeitpunkt nicht eindeutig bestimmt werden (vgl. 4.6). Auch Kim

et al. (2006) stellten bei der Charakterisierung zweier RHs aus dem Bakterium Corynebacterium

ammoniagenes fest, dass die Enzyme trotz der Übereinstimmung von katalytisch wichtigen

Aminosäuren ein unterschiedliches Substratspektrum aufwiesen.

Hinsichtlich der schwachen Aktivität von PpRH2 konnten Jung et al. (2011) eine ähnliche

Beobachtung für eine RH aus Arabidopsis machen: Für AtNSH2 konnte zwar heterolog exprimiertes

Protein erhalten werden, jedoch wurde weder nach Expression in einem prokaryotischen noch nach

Expression in einem eukaryotischen System Aktivität des Proteins nachgewiesen. Da PpRH2 bisher

nur in einem prokaryotischen Organismus exprimiert wurde, besteht die Möglichkeit, dass durch die

Expression von PpRH2 in einem Eukaryoten, z.B. P. pastoris, lösliches Protein mit einer höheren

Aktivität erhalten werden kann. Eine methodische Alternative wäre es, PpRH2 in seinem

Ursprungsorganismus Physcomitrella zu überexprimieren (vgl. z.B. Bauer et al. 2005), um auf diesem

Weg eventuell funktionelles PpRH2 Protein zu erhalten.

Die kürzlich veröffentlichte neue Assemblierung des Physcomitrella Genoms (V1.6,

http://cosmoss.org/) enthält ein leicht verändertes Genmodell für PpRH2 (Pp1s140_172V6.1). Die

abgeleitete Protein-Sequenz enthält am N-Terminus 13 zusätzliche Aminosäuren (MVGEETMDRSADL)

und weist einen veränderten C-Terminus auf (siehe Anhang, 6.2.2). Es wäre daher auch denkbar, dass

die verwendete Aminosäure-Sequenz von PpRH2 (basierend auf dem Genmodell Pp1s140_172V2.1)

nicht vollständig bzw. inkorrekt war und das Protein daher nur geringe Aktivität zeigte. Das neue

Genmodell der Assemblierung V1.6 wird zumindest im 5‘-Bereich durch neue Sequenzierungsdaten

in Form von illumina reads gestützt (https://www.cosmoss.org/mgb2/gbrowse/physcome/). Bei

durchgeführten PCR-Ansätzen zur Amplifikation von PpRH2 aus verschiedenen cDNA-Templates

(Daten nicht gezeigt) konnte das neue Genmodell im 5‘-Bereich allerdings nicht bestätigt werden. Für

den 3‘-Bereich wurden keine eindeutigen Ergebnisse erhalten. Zur Verifizierung der cDNA-Sequenz

von PpRH2 sollten daher weitere PCR-basierte Experimente vorgenommen werden. Die erhaltene

https://www.cosmoss.org/mgb2/gbrowse_details/physcome?name=Pp1s140_172V6.1;class=Sequence;ref=scaffold_140;start=1015516;end=1019756

Diskussion

94

cDNA-Sequenz könnte dann erneut zur Herstellung von rekombinantem Protein in einem pro- oder

eukaryotischen System verwendet werden.

Aus der Literatur ist bekannt, dass einige Proteine zur Erlangung ihrer Funktionalität Heterodimere

ausbilden. Auch wenn bisher das Auftreten eines Heterodimers für RHs nicht beschrieben wurde,

wäre es denkbar, dass PpRH2 zur vollständigen Ausprägung der Aktivität ein Heterodimer mit einem

anderen Protein bildet. Versuche zur Formung eines Heterodimers aus PpRH2 und PpRH1 konnten

dies weder eindeutig bestätigen noch widerlegen (3.4.4.4). Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf

eine mögliche Interaktion von PpRH1 und -2 hin, die allerdings in einer Hemmung der Aktivität von

PpRH1 resultiert. Weitere Experimente sind nötig, um diese Annahme zu verifizieren.

Die sehr hohe Sequenzähnlichkeit (67 %) zwischen den Aminosäure-Sequenzen von PpRH2 und

PpRH3 könnte auch für die Bildung eines Heterodimers aus diesen beiden Proteinen sprechen. Leider

konnten Versuche hierzu nicht durchgeführt werden, da kein lösliches Protein von PpRH3 erhalten

wurde (3.3.3). Eine Co-Expression von PpRH2 und PpRH3 beispielsweise im pETDuet™-

Expressionssystem (Novagen) könnte zum einen die Löslichkeit von PpRH3 verbessern und zum

anderen die Frage nach der Heterodimerbildung beantworten.

4.6 Sequenz-basierte Klassifizierung von RHs aus Physcomitrella

Bisher charakterisierte RHs lassen sich aufgrund ihrer Substratspezifität in drei Gruppen einteilen

(Tab. 4.1). Die erste Gruppe umfasst RHs die als Substrate Purine bevorzugen, die zweite solche, die

als Substrate Pyrimidine bevorzugen und zur dritten Gruppe gehören RHs, die in ihrer

Substratspezifität Basen-unspezifisch sind, d.h. sowohl Purine als auch Pyrimidine umsetzen können.

Diese Klassifizierung wurde auf Grundlage der aus Protozoen charakterisierten RHs eingeführt

(Versées et al. 2001). Aufgrund ihrer Substratspezifität gruppieren sich pflanzlichen RHs aus

Physcomitrella und Arabidopsis wie folgt ein: PpRH1, AtNSH2 und AtNSH3 gehören zu der ersten

Gruppe, den Purin-bevorzugenden RHs. PpRH2 hingegen bevorzugt Pyrimidine und bei AtNSH1

handelt es sich um eine Basen-unspezifische RH.

Tab. 4.1 Eingruppierung mikrobieller und pflanzlicher RHs aufgrund ihrer Substratspezifität nach (Versées et al. 2001).

Purin-bevorzugende* RHs Pyrimidin-bevorzugende* RHs Basen-unspezifische* RHs

IAG-RH aus Trypanosoma brucei brucei (Parkin 1996) - IG-RH aus Crithidia fasciculata (Estupiñán und Schramm 1994) - IAG-RH aus Trypanosoma vivax (Versées et al. 2001) - AtNSH2 aus Arabidopsis (Jung et al. 2011) - AtNSH3 aus Arabidopsis (Jung et al. 2011)

- CU-RH aus E. coli (RihA und RihB) (Giabbai und Degano 2004, Petersen und Møller 2001)

- IU-RH aus Crithidia fasciculata (Parkin et al. 1991) - IU-RH aus Leishmania major (Shi et al. 1999) - IU-RH aus E. coli (RihC) (Petersen und Møller 2001) - AtNSH1 aus Arabidopsis (Jung et al. 2011, 2009)

- PpRH1 aus Physcomitrella (diese Arbeit)

- PpRH2 aus Physcomitrella (diese Arbeit)

*auf die zwei Hauptsubstrate bezogen

Diskussion

95

Zusätzlich zu den Ähnlichkeiten bezüglich der Substratspezifität werden auch immer wieder

Zusammenhänge zwischen Substratspezifität und Sequenzhomologien beschrieben (Versées und

Steyaert 2003). Hierbei geht es zum einen um die Homologie über die gesamte Protein-Sequenz und

zum anderen um die Übereinstimmung einzelner Aminosäuren an katalytisch wichtigen Positionen.

Vergleicht man die Sequenzen von PpRHs über ihre gesamte Länge mit bereits klassifizierten RHs so

kann die höchste Ähnlichkeit auf Aminosäure-Ebene für PpRH1 mit einer Pyrimidin-bevorzugenden

RH aus E. coli (RihA, Petersen und Møller 2001) gefunden werden (34 %), während PpRH2 und -3

Ähnlichkeit mit RihC (Petersen und Møller 2001), einer Basen-unspezifischen RH aus E. coli,

aufweisen (jeweils 33 %).

Versées et al. (2001) identifizierten anhand der 3D-Struktur einer RH aus T. vivax katalytisch wichtige

Aminosäure-Reste (in Abb. 3.3 markiert), die mit dem Ribose-Anteil und/oder der Base des

Substrates interagieren. Während die mit dem Zucker-Anteil interagierenden Aminosäuren relativ

konserviert bei den verschiedenen mikrobiellen RHs sind, treten Varianzen bei den mit der Base

interagierenden Resten auf. Laut den Autoren kann sogar lediglich anhand der An- oder Abwesenheit

eines Histidins bzw. Tryptophans an einer bestimmten Position innerhalb des aktiven Zentrums

zwischen Purin-bevorzugenden und Basen-unspezifischen Enzymen unterschieden werden. Basen-

unspezifische RHs weisen einen Histidin-Rest innerhalb des Sequenzmotives VHDP auf, während bei

Purin-bevorzugenden RHs an der gleichen Position ein Tryptophan-Rest zu finden ist (Sequenzmotiv

YAWD). Demnach würden alle drei RHs aus Physcomitrella in die Gruppe der Basen-unspezifischen

RHs clustern, was nach bisheriger Kenntnis der Substratspezifität zumindest für PpRH1 jedoch nicht

zutreffend ist. Auch Versées und Steyaert (2003) äußerten bereits die Vermutung, dass die bisher

angenommene Korrelation zwischen Aminosäure-Sequenz und Substratspezifität und die damit

verbundene Klassifizierung der RHs nicht mehr zutreffend ist. So gruppieren sich beispielsweise auch

die aus E. coli identifizierten RHs RihA und RihB aufgrund ihrer Sequenz in die 3. Gruppe (Basen-

unspezifische RHs) ein, zählen aber aufgrund ihrer experimentell ermittelten Substratspezifität

(Petersen und Møller 2001) zu den Pyrimidin-bevorzugenden RHs.

Demnach ist es nach bisherigem Kenntnisstand nicht möglich, lediglich aufgrund der vorliegenden

Aminosäure-Sequenz zutreffende Vorhersagen zur Substratspezifität von RHs zu machen.

Wie erwähnt, wurden pflanzliche RHs bisher nur im Detail aus Arabidopsis und Physcomitrella

beschrieben. Zur Erstellung eines RH-Stammbaumes wurde in pflanzlichen Genomen nach RH-

Sequenzen gesucht. Wie die Abb. 4.1 zeigt, gibt es in Pflanzen zwei Gruppen von RHs, von denen

anzunehmen ist, dass sie sich in ihren biochemischen Eigenschaften wie der Substratspezifität

unterscheiden. Erste Daten zu katalytisch wichtigen Aminosäuren in pflanzlichen RHs wurden im

Rahmen dieser Arbeit erhoben (4.7). Die Entschlüsselung der 3D-Struktur einer RH aus Pflanzen

würde sicherlich einen entscheidenden Beitrag zu einem besseren Verständnis des Zusammenhangs

zwischen Aminosäure-Sequenz und biochemischen Eigenschaften von pflanzlichen RHs liefern.

4.7 Hypothetische 3D-Struktur von PpRH1 und Hinweise auf katalytisch wichtige

Aminosäuren

Wie bereits erwähnt, besitzen die RHs aus Physcomitrella nur eine sehr geringe Homologie mit

bereits im Detail charakterisierten RHs aus Protozoen und Bakterien (< 33 %). Über ein Homologie-

Diskussion

96

basiertes-Modelling wurde die mögliche Struktur des aktiven Zentrums von PpRH1 etabliert, um

solche Aminosäure-Reste zu identifizieren, die an der Bindung des Substrates beteiligt sein könnten.

A.

B.

C.

Abb. 4.4 Hypothetische 3D-Strukturen von (A.) PpRH1 Monomer, (B.) Aktives Zentrum von PpRH1, (C.) Übereinanderlegung der Monomere von PpRH1 und PpRH2. Als Template diente die Struktur einer Pyrimidin-bevorzugenden RH aus E. coli (PDB 1YOE, Ähnlichkeit zu PpRH1 33 %). In (A.) ist das Monomer von PpRH1 aus zwei verschiedenen Ansichten dargestellt. Die flexible Schleife ist blau, in rot sind die Sauerstoff-Atome der Ribose zu sehen. In (B.) ist das hypothetische Modell zum katalytischen Zentrum von PpRH1 dargestellt. In Schwarz ist die flexible Schleife, in violett die mit der Ribose interagierenden Aminosäure-Reste und in pink die mutagenisierten Aminosäure-Reste dargestellt. Im aktiven Zentrum ist der Inhibitor Immucillin-H gebunden (in braun), der aus dem PDB-File einer RH aus T. vivax übertragen wurde (PDB 2FF2, Versées et al. 2006). (C.) zeigt eine Superposition von PpRH1 (gelb) und PpRH2 (schwarz). Die Position der flexiblen Schleife fehlt in den meisten 3D-Strukturen. Die 3D-Strukturmodelle wurden mit den Programmen Swiss-Model und ESyPred3D, Abbildungen wurden mit PyMOL (DeLano Scientific LLC, http://www.pymol.org/) erstellt. In Kooperation mit Dr. D. Kopečný (Palacký Universität, Olomouc, CZ).

Diskussion

97

Neben einem Beitrag zum besseren Verständnis der Substratspezifität wurde außerdem die

Erzeugung einer inaktiven Form des PpRH1 Proteins angestrebt. Diese wäre besonders gut für Co-

Kristallisierungsansätze geeignet, bei dem zusammen mit dem Protein kristallisiertes Substrat nicht

umgesetzt und im aktiven Zentrum gebunden vorliegen würde und somit Einblicke in die

Mechanismen der Substratbindung liefern könnte.

Als Template für das Homologie-basierte Modelling wurde die Kristallstruktur einer Pyrimidin-

bevorzugenden RH aus E. coli (PDB 1YOE) ausgewählt, da diese von allen vorliegenden RH-

Kristallstrukturen die höchste Ähnlichkeit mit PpRH1 (33 %) besaß. Die Berechnung der 3D-

Strukturen erfolgte unter Verwendung des Programes Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org,

Arnold et al. 2006) und ESyPred3D (http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/

esypred/, Lambert et al. 2002). Basierend auf dem in Abb. 4.4 gezeigten Modell, wurden

angenommene katalytisch wichtige Aminosäure-Reste für eine site directed mutagenesis ausgewählt,

um deren Beteiligung an der Substratbindung zu überprüfen. Nach heterologer Überexpression in

E. coli wurden die biochemischen Eigenschaften der erzeugten Mutanten Proteine untersucht und

mit denen des nativen Proteins verglichen. Diese Arbeiten wurden in Kooperation mit Dr. D. Kopečný

und Dr. M. Tylichová (Palacký Universität, Olomouc, CZ) durchgeführt und werden an dieser Stelle

auszugsweise diskutiert.

Die folgenden Mutanten Proteine von PpRH1 wurden mit Hilfe des QuikChange® Site-Directed

Mutagenesis Kits von Stratagene hergestellt: D25A, Y241A, H245A, Y249A, D252A und Y255A (pink in

Abb. 4.4 B.). Während D25 anhand der hypothetischen 3D-Struktur eine Funktion bei der Ausbildung

des katalytischen Zentrums zugeschrieben wird, könnten die anderen Aminosäure-Reste eine

Interaktion über Wasserstoffbrückenbindungen mit der 6-Oxo bzw. 6-Amino-Gruppe von Inosin bzw.

Adenosin eingehen. Bei D252 handelt es sich um eine Aminosäure die innerhalb einer flexiblen

Schleife lokalisiert ist. Da die Positionierung der flexiblen Schleife nur schwer vorherzusagen ist, ist

eine Interaktion mit dem Substrat nicht auszuschließen.

Nach Überexpression in E. coli (Vektor pCDFDuet, Novagen) wurden die kinetischen Parameter, wie

bereits für PpRH1 beschrieben (3.4.4.2), ermittelt (Tab. 4.2, Abb. 4.5). Hierbei wurden zunächst

kinetische Konstanten mit dem Substrat Inosin gemessen und dann die Aktivität an weiteren

Substraten (Adenosin, Guanosin, Uridin und iPR) getestet. Von allen oben aufgeführten Mutanten

wies die Mutante D25A die stärksten Veränderungen auf: Für keines der getesteten Substrate wurde

Aktivität nachgewiesen (< 0,01 nmol s-1 mg-1). Die vermutete Beteiligung dieser Aminosäure an der

Ausbildung des aktiven Zentrums von PpRH1 konnte somit bestätigt werden. Die Mutanten D252A

und H245A zeigten keine nennenswerten Änderungen hinsichtlich der Substratspezifität. Die

Aktivität war insgesamt aber deutlich niedriger. Es wurde somit gefolgert, dass die mutierten

Aminosäuren an der Ausbildung des aktiven Zentrums beteiligt sind, aber nicht unbedingt einen

entscheidenden Einfluss auf die Substratspezifität haben. Für Y241A hingegen wurden auffällige

Änderungen hinsichtlich der Substratspezifität gemessen: Anders als beim Wildtyp werden Guanosin

und Uridin effektiver hydrolysiert als Adenosin. Ähnliche Veränderungen bezogen auf die

Substratspezifität, lediglich schwächer ausgeprägt, wurden auch für die Mutanten Y255A und D252A

festgestellt. Nach Mutierung von Y249 zu Alanin wurde ebenfalls eine Veränderung der

Substratspezifität nachgewiesen: Die Spezifische Aktivität für Inosin reduzierte sich, während die für

iPR deutlich erhöht war. Interessanterweise wurde aber wie beim Wildtyp Protein für alle Mutanten

Diskussion

98

Proteine Inosin als bevorzugtes Substrat nachgewiesen. Möglicherweise gibt es daher noch weitere,

katalytisch wichtige Aminosäure-Reste, die die Substratspezifität beeinflussen und die im Rahmen

dieser Experimente nicht mutiert wurden.

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass D25 eine für die Enzym-Aktivität entscheidende

Aminosäure darstellt. Als weitere wichtige, die Substratspezifität beeinflussende Aminosäuren bei

PpRH1, konnten Y241, D252A, Y255 sowie Y249 identifiziert werden. Die hergestellte Mutante D25A

kann aufgrund ihres nahezu vollständigen Verlustes der Aktivität für Kristallisierungsexperimente

eingesetzt werden.

Tab. 4.2 Enzymkinetische Parameter für das Substrat Inosin von rekombinantem Protein von PpRH1 Wildtyp und verschiedenen Mutanten Proteinen, bei denen über site directed mutagenesis eine Aminosäure ausgetauscht war. Enzym-Assays wurden unter Verwendung des spektrophotometrischen Assays (Parkin 1996) durchgeführt. In Kooperation mit Dr. M. Tylichová (Palacký Universität, Olomouc, CZ).

Km [µM]

Vmax [nmol s

-1 mg

-1]

Vmax/Km [relativ]

WT 87 176 100,0 D252A 220 81 18,2 H245A 810 26 1,6 Y249A 1190 18 0,7 Y255A 761 14 0,9 Y241A 630 1,8 0,1 D25A n. d. n. d. n. d. n. d. nicht detektierbar (< 0,1 nmol s

-1 mg

-1)

Für Vmax/Km [relativ] wurde der für das Wildtyp Protein berechnete Wert = 100 % gesetzt

Abb. 4.5 Relative Aktivität von rekombinantem Protein von PpRH1 Wildtyp und verschiedenen Mutanten Proteinen, bei denen über site directed mutagenesis eine Aminosäure ausgetauscht war. Die spezifische Aktivität an Inosin wurde gleich 100 gesetzt (für alle untersuchten Proteine das bevorzugtes Substrat). Enzym-Assays wurden unter Verwendung des spektrophotometrischen Assays (Parkin 1996) durchgeführt. In Kooperation mit Dr. M. Tylichová (Palacký Universität, Olomouc, CZ).

Diskussion

99

4.8 Charakterisierung des Purin-Metabolismus beim Wildtyp

4.8.1 In vivo Metabolismusstudien

Bevor auf die Charakterisierung des Purin-Metabolismus eingegangen wird, soll zunächst die zur

Untersuchung des Purin-Metabolismus angewandte Methode der Markierungsexperimente kritisch

betrachtet werden.

4.8.1.1 Methodendiskussion zur in vivo Markierung mit 3H-Adenosin und 3H-Inosin

Zur Untersuchung des Purin-Stoffwechsels bei Physcomitrella wurden Markierungsexperimente

sowohl mit 3H-Adenosin als auch mit -Inosin durchgeführt. Diese wurden Physcomitrella

Flüssigkulturen zugefügt und der Metabolismus über 60 Minuten durch Analyse von Proben mittels

HPLC-online-LSC verfolgt (3.6.4.1). Aufgrund der Position der Tritium-Markierung am C2- und C8-

Atom der verwendeten Purine Adenosin und Inosin können theoretisch eine Vielzahl an Metaboliten

aus dem Purin-Stoffwechsel detektiert werden. Hierzu zählen u.a. Hypoxanthin, Adenin, Xanthosin,

Xanthin, Guanosin, Guanin und Harnsäure. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeiten sind diese

jedoch mittels der zur Verfügung stehenden reverse Phase HPLC nur schwer voneinander zu trennen.

Die erhaltenen Chromatogramme sowohl der Medium- als auch der Gewebeproben zeigten deutlich,

dass insbesondere nach Markierung mit 3H-Inosin viele Substanzen ko-eluierten und die Peaks somit

nicht mehr eindeutig einer Substanz zuzuordnen waren. Es konnten bei der Auswertung der Daten

daher nicht alle gebildeten Metabolite erfasst und quantifiziert werden. Außerdem wurde

festgestellt, dass das zugegebene Ribosid sowie die durch RH-Aktivität gebildete Base nicht oder nur

in sehr geringen Mengen während des Experimentes nachzuweisen war. Dies deutet auf eine sehr

rasche Metabolisierung von Adenosin und Inosin hin. Bei zukünftigen Markierungsexperimenten

sollten daher kürzere Inkubationszeiten und/oder geringere Gewebemengen verwendet werden, um

die Metabolisierung von Adenosin und Inosin verfolgen zu können.

Deng und Ashihara (2010) untersuchten in ihren Experimenten an Sämlingen von C. sinensis den in

vivo Metabolismus von verschiedenen Purinen durch Applikation von 14C-markierten Substanzen zu

Blatt- und Wurzelsegmenten. Auch hier wurde eine rasche Verstoffwechselung der zugegebenen

Substrate gemessen. Allerdings wurden nach 10 stündiger Inkubation noch geringe Mengen der

applizierten Substanzen nachgewiesen. Außerdem war durch die Verwendung eines TLC-basierten

Systems zur Proben-Analyse eine hohe Anzahl an Metaboliten nachweisbar. Im Vergleich zu der hier

angewandten HPLC-basierten Methode scheint das TLC-basierte System aufgrund seiner

Trenneigenschaften besser geeignet zu sein, die zahlreichen, strukturell sehr ähnlichen Substanzen

voneinander zu trennen. Für zukünftige Studien des Purin-Metabolismus in Physcomitrella sollte

daher ebenfalls ein TLC-basiertes System zur Analyse der Proben erprobt werden.

Diskussion

100

4.8.1.2 Metabolisierung von Purinen beim Wildtyp

RH-Aktivität scheint eine untergeordnete Enzym-Aktivität im Purin-Stoffwechsel zu repräsentieren

Wie anhand von in vivo und in vitro Messungen nachgewiesen wurde, besitzt Physcomitrella

RH-Aktivität (4.1). Die errechneten Umsatzraten deuten allerdings auf eine eher schwach

ausgeprägte RH-Aktivität hin (in vivo 19 nmol Adenosin h-1 g-1 (FG), in vitro 0,6-0,8 pmol

Inosin min-1 mg-1 Protein). Nach Markierung mit 3H-Adenosin und -Inosin konnten, wie bereits

erwähnt, das applizierte 3H-Ribosid und die durch RH-Aktivität entstandene Base im Gewebe nicht

oder nur in sehr geringen Mengen detektiert werden. Es wird daher davon ausgegangen, dass die

Enzym-Aktivität der RH im Purin-Stoffwechsel bei Physcomitrella gegenüber anderen Enzymen eine

untergeordnete Aktivität darstellt. In vivo RH-Aktivität ist folglich kaum zu messen, da die durch RHs

katalysierte Reaktion durch die Aktivität anderer Enzyme überlagert wird.

Möglicherweise stellt die rasche Metabolisierung von Adenosin und Inosin zusammen mit einer nur

schwach ausgeprägten RH-Aktivität eine Besonderheit von Physcomitrella dar. In der Literatur finden

sich zahlreiche Hinweise, dass der Purin-Metabolismus bei verschiedenen Pflanzenarten sehr stark

variiert (z.B. Deng und Ashihara 2010).

Purin-Recycling dominiert über Purin-Katabolismus

Nach Applikation von 3H-Adenosin zu Physcomitrella Kulturen wurden im Gewebe lediglich die

Adenin-Nukleotide AMP, ADP und ATP detektiert sowie weitere nicht näher bestimmte Metabolite

(Abb. 3.22). Weder Adenosin noch Adenin konnten im Gewebe nachgewiesen werden. Die

gebildeten Adenin-Nukleotide können entweder zum Einbau in Nukleinsäuren verwendet werden

oder in den Purin-Katabolismus eingeschleust werden, der u.a. der Rückgewinnung von reduziertem

Stickstoff in Form von NH3 dient (vgl. Abb. 1.1 bzw. Abb. 4.6). Adenosin kann direkt durch ADK in

AMP umgewandelt oder zunächst durch RH in Adenin und dann über APRT in AMP umgesetzt

werden. Während in einigen Pflanzen der indirekte Weg über Adenin bevorzugt wird (z.B. P. glauca,

Ashihara et al. 2001), scheint in anderen Arten die durch ADK-katalysierte Reaktion zu dominieren,

da keine oder nur sehr geringe RH-Aktivität messbar ist (z.B. Helianthus tuberosus, Le Floc'h und

Lafleuriel 1981, Arabidopsis, Moffatt et al. 2000)).

Markierungsexperimente mit 3H-Inosin zeigten dessen Metabolisierung zu Hypoxanthin und

weiteren, aufgrund von methodischen Einschränkungen nicht näher identifizierte Substanzen (Abb.

3.22). Inosin wird über RH-Aktivität in Hypoxanthin umgewandelt, dass entweder über Xanthin in den

Purin-Katabolismus eingeschleust wird und zur Bildung von NH3 und CO2 führt oder durch die Bildung

von IMP über Kinasen für den Einbau in Nukleinsäuren in Form von ATP und GTP zur Verfügung steht

(vgl. Abb. 1.1, Abb. 4.6). Ebenso wie für 3H-Adenosin beschrieben, konnte auch nach Markierung mit 3H-Inosin im Gewebe keine oder nur sehr geringe Mengen des Substrates nachgewiesen werden. Das

durch RH-Aktivität gebildete Hypoxanthin wurde zwar nachgewiesen, war aber mit den angewandten

chromatografischen Methoden nicht zu quantifizieren.

Die vorliegenden Daten lassen somit keine direkten Schlüsse zu, in welchen Stoffwechselweg die

extern applizierten 3H-Riboside eingegangen sind. Auch liegen keine Literaturdaten zur Aktivität der

beteiligten Enzyme in Physcomitrella vor, die Rückschlüsse auf den bevorzugten Stoffwechselweg in

Physcomitrella zulassen würden.

Diskussion

101

Anhand des enorm hohen Anteils an Radioaktivität die zwar während der Inkubation aufgenommen,

aber anschließend nicht aus dem Gewebe extrahiert werden konnte (> 80-95 % der gesamten

intrazellulären Radioaktivität, Tab. 3.4), kann man schließen, dass der Hauptanteil der Radioaktivität

in Form von Nukleotiden in Nukleinsäuren eingebaut wurde. In Physcomitrella scheint unter den

gegebenen Bedingungen daher sowohl bei Adenosin als auch bei Inosin das Recycling über den

Katabolismus zu dominieren. Hätte der Katabolismus dominiert, wäre der Großteil der Radioaktivität

gebunden in niedermolekulare Substanzen extrahierbar gewesen. Im Fall von Adenosin konnte in

Übereinstimmung mit diesem Ergebnis bei Markierungsexperimenten mit Sämlingen von C. sinensis

(Deng und Ashihara 2010), Knollescheiben von S. tuberosum (Katahira und Ashihara 2006) und

Zellsuspensionskulturen von Catharantus roseus (Yabuki und Ashihara 1991) ebenfalls gezeigt

werden, dass bei diesen Arten der überwiegende Anteil des applizierten Adenosins in Recycling-

Produkten wie Nukleotiden und Nukleinsäuren zu finden ist. Studien zum Inosin-Metabolismus bei

somatischen Embryonen von P. glauca beschreiben, dass nach externer Applikation von radioaktiv-

markiertem Inosin der Hauptanteil der Radioaktivität in Ureiden und CO2 gefunden wurde, der

Katabolismus somit hier über das Recycling dominiert (Ashihara et al. 2001). Wie bereits zuvor

erwähnt, ist bekannt, dass der Purin-Metabolismus in verschiedenen Pflanzenarten und teilweise

sogar in verschiedenen Gewebetypen innerhalb einer Pflanze sehr unterschiedlich ausgeprägt sein

kann (z.B. Deng und Ashihara 2010).

Die zügige Abnahme von Adenosin und Inosin im Medium sowie das fehlende Auftreten von

Adenosin und Inosin im Gewebe, deuten auf einen sehr aktiven Purin-Stoffwechsel bei

Physcomitrella hin. Vergleicht man die Abnahmeraten für Adenosin und Inosin kann man feststellen,

dass Inosin schneller als Adenosin aufgenommen und/oder metabolisiert wird. Das Gegenteil

konnten Katahira und Ashihara (2006) bei Markierungsexperimenten von Kartoffelknollescheiben

beobachten; 14C-markiertes Adenosin wurde schneller aufgenommen als 14C-markiertes Inosin.

Bei zukünftigen Experimenten zum Purin-Stoffwechsel sollten neben der Analyse des Metabolismus

der extern applizierten Purine auch Messungen der in vitro Aktivitäten der zugehörigen Enzyme (vgl.

Abb. 1.1, Abb. 4.6) vorgenommen werden. Um den Purin-Stoffwechsel bei Physcomitrella genauer zu

charakterisieren, könnte außerdem die bereits erwähnte, von Katahira und Ashihara (2002)

beschriebene, TLC-basierte Methode angewandt werden, um eine größere Anzahl an Metaboliten

nach Markierungsexperimenten identifizieren zu können. Insbesondere der Vergleich der Menge an

inkorporierter Radioaktivität in Nukleinsäuren gegenüber der Freisetzung von CO2 bzw. anderen

Metaboliten des Purin-Katabolismus würden helfen, ein genaueres Profil des Purin-Metabolismus bei

Physcomitrella zu erstellen und zu bestätigen, dass in diesem Organismus das Purin-Recycling über

den -Katabolismus dominiert.

4.8.2 Vorkommen von Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp

Zur Bestimmung der Gehalte von Nukleotiden, Ribosiden und Basen in pflanzlichen Geweben wurden

bisher nur wenige Arbeiten veröffentlicht, wobei hauptsächlich Bestimmungen der Nukleotid-

Poolgrößen vorgenommen wurden (zusammengefasst von Wagner und Backer 1992). Ein

umfassendes profiling für Purine und Pyrimidine in Pflanzen wurde bisher nicht beschrieben. Für

Physcomitrella wurden im Rahmen dieser Arbeit LC-MS/MS Messungen zur Bestimmung der

intrazellulär vorhandenen Purine und Pyrimidine durchgeführt (3.6.5.1). 15 Purin/Pyrimidin-

Metabolite wurden dabei im Gewebe nachgewiesen. Xanthosin war über den gesamten

Diskussion

102

Messzeitraum am stärksten vertreten (bis zu 80 nmol/g TG). Gruppiert man die Substanzen in

Familien ein, so waren die Xanthosin-Familie (ca. 99 nmol/g TG, bestehend aus Xanthosin, Xanthin),

die Uridin-Familie (ca. 73 nmol/g TG, bestehend aus Uridin, Uracil) und die Adenosin-Familie (ca.

60 nmol/g TG, bestehend aus Adenosin, Adenin) am stärksten vertreten. Darüberhinaus zeigten

Messungen zum Vorkommen von Purinen und Pyrimidinen im Kulturmedium bei Physcomitrella, dass

eine Sekretion der Substanzen erfolgt (Daten nicht gezeigt). Extrazellulär wurden nmolare

Konzentrationen für ausgewählte Purine und Pyrimidine nachgewiesen. Zur Quantifizierung und für

einen Vergleich der intra- und extrazellulären Gehalte dieser Metabolite müssen allerdings noch

weitere Messungen erfolgen.

Für Vergleiche mit in der Literatur vorhandenen Angaben zu Purin- oder Pyrimidin-Gehalten im

pflanzlichen Gewebe sind die Mengen ausgewählte Metabolite einiger Pflanzenspezies in Tab. 4.3

dargestellt. Sawert et al. (1987) bestimmten die Mengen an Inosin, Adenosin, Adenin, Guanosin und

Uridin in verschiedenen Getreidearten. Die ermittelten Konzentrationen dieser Substanzen liegen

deutlich höher als die für Physcomitrella bestimmten Konzentrationen. Übereinstimmend mit

Physcomitrella ist Adenosin der Vertreter mit der höchsten Konzentration und Inosin der Vertreter

mit der niedrigsten Konzentration. In Blättern von Arachis hypogaea und Nicotiana sp. wurden weder

Inosin noch Adenin nachgewiesen (Wagner und Backer 1992, Meyer und Wagner 1985). Uridin war

mit 2 nmol/g (FG) das häufigste Ribosid bei Nicotiana sp. (Meyer und Wagner 1985). Für Arabidopsis

beschreiben Möhlmann et al. (2010) eine Adenosin-Konzentration von 2,6 nmol/g (FG) in Blättern. Im

Vergleich zu den Gehalten bei Monokotylen sind also die Konzentrationen an Ribosiden (und Basen)

bei Dikotylen deutlich niedriger. Der Vergleich von Literaturdaten mit den in dieser Arbeit ermittelten

Werten für Purin- und Pyrimidin-Konzentrationen lässt darauf schließen, dass in Physcomitrella

Purine und Pyrimidine in deutlich niedrigeren Konzentrationen als bei Mono- und Dikotylen

vorkommen.

Tab. 4.3 Konzentrationen ausgewählter Purine und Pyrimidine in pflanzlichen Geweben.

Inosin Adenosin Adenin Guanosin Uridin Quelle

in nmol/g (FG)

Triticum sp. 15 42 13 22 15

Sawert et al. 1988 Secale cereale 0 40 9 5 4

Hordeum vulgare 3 69 43 27 56

Nicotiana sp. - - - - 2 Meyer und Wagner 1985

Arachis hypogaea - 9 - k. A. - Wagner und Backer 1992

Arabidopsis k. A. 3 k. A. k. A. k. A. Möhlmann et al. 2010

Physcomitrella* 0,11 0,44 0,25 0,21 0,30 diese Arbeit - nicht detektiert; k. A. keine Angabe in der Literatur * aus LC-MS/MS Daten abgeleitet (Annahme: 1 g TG entspricht ca. 90 g FG)

Zur Erstellung eines Gesamtprofils von Purinen und Pyrimidinen beim Wildtyp von Physcomitrella

sollten ebenfalls die Gehalte von Nukleotiden in zukünftige Analysen miteinbezogen werden. Die

vorgenommene Vermessung von Triplikaten zeigte außerdem, dass die einzelnen Werte teilweise

stark schwankten, so dass zur Bestätigung der berechneten Konzentrationen das Experiment

Diskussion

103

wiederholt und die Methodik nochmals validiert bzw. gegebenenfalls optimiert werden sollte (z.B.

durch Verwendung von weiteren mit stabilen Isotopen markierten Standards).

4.9 Subzelluläre Lokalisierung von PpRHs

Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung von PpRH1, -2 und -3 erfolgte anhand der

Expression von PpRH-GFP-Fusionsproteinen. Für alle drei PpRHs ließ sich sowohl durch transiente

Transformation von Zwiebelepidermiszellen als auch von Physcomitrella Protoplasten eine

Lokalisierung im Cytoplasma eindeutig nachweisen (Abb. 3.13). Auch vorherige bioinformatische

Analysen der Aminosäure-Sequenz ergaben keine Hinweise auf ein Signalpeptid für den Transport in

ein anderes Kompartiment. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit der Lokalisierung

weiterer Enzyme aus dem Purin-Recycling bzw. -Abbau im Cytoplasma (z.B. ADK, Moffatt et al. 2000)

oder APRT (Allen et al. 2002). Die RHs AtNSH1 und AtNSH2 aus Arabidopsis sind ebenso im

Cytoplasma lokalisiert (Jung et al. 2011, 2009). Ein weiteres Familienmitglied dieser Genfamilie,

AtNSH3, wurde hingegen als eine extrazelluläre RH charakterisiert. Außerdem wurde eine

extrazellulär lokalisierte RH für S. tuberosum beschrieben (Riewe et al. 2008). BLAST-Analysen unter

Verwendung der Aminosäure-Sequenz von AtNSH3 lieferten keine Kandidaten die auf das Vorliegen

einer extrazellulär-lokalisierten RH im Genom von Physcomitrella hinweisen. Allerdings konnten in

anderen höheren Pflanzen wie Vitis vinifera, Populus trichocarpa sowie O. sativa putative Homologe

zu AtNSH3 gefunden werden (Daten nicht gezeigt). Dies deutet darauf hin, dass diese Gruppe von

RHs möglicherweise in Stoffwechselwege eingebunden ist, die erst in der Linie der höheren Pflanzen

entstanden sind.

Die Validierung des Genmodels für PpRH3 (4.3) zeigte, dass die für PpRH3 vorhergesagten

Genmodelle vom cosmoss Server nicht zutreffend sind. Anhand von PCR-Experimenten wurde ein

neues Genmodell etabliert (PpRH3 VPCR). Vorhersagen zur Lokalisierung der aus PpRH3 VPCR

abgeleiteten Protein-Sequenz bestätigten ebenfalls die cytoplasmatische Lokalisierung (Daten nicht

gezeigt). Die Verifizierung in planta steht noch aus. Es ist derzeit davon auszugehen, dass mit hoher

Wahrscheinlichkeit alle drei PpRH Proteine im Cytoplasma lokalisiert sind.

4.10 Funktionelle Untersuchungen zu RHs anhand von knockout Mutanten

Um Einblicke in die Bedeutung der RH-Genfamilie in Physcomitrella zu erhalten, wurden single-

knockout Mutanten für alle drei RH-Gene generiert. Aus mehreren Transformationsexperimenten

wurden zunächst Antibiotika-resistente Linien selektiert, die per PCR auf die vollständige Integration

der Resistenzkassette in den betreffenden Lokus analysiert wurden (3.6.2.1). Durchschnittlich

wurden aus 10 bis 15 stabilen Transformanten fünf knockout Linien mit einer vollständigen

Integration des Transgens im jeweiligen RH-Lokus identifiziert. Die für Physcomitrella beschriebene

hohe Frequenz der homologen Rekombination (Schaefer 2001) ist eng korreliert mit der Länge der

eingesetzten homologen DNA-Fragmente. Laut Kamisugi et al. (2005) reicht die Verwendung von 1 kb

langen homologen DNA-Fragmenten aus, um eine Rekombinationssrate von ca. 50 % zu erreichen.

Bei den in dieser Arbeit verwendeten knockout-Konstrukten wurde die jeweilige Resistenzkassette

von ca. 1 kb langen, homologen Sequenzabschnitten auf jeder Seite flankiert (3.6.1). Die beobachtete

Frequenz der homologen Rekombination (fünf verifizierte knockout Linien aus 10 bis 15 stabilen

Linien) liegt demzufolge in einer ähnlichen Größenordnung wie die von Kamisugi et al. (2005)

beschriebene Rate der homologen Rekombination.

Diskussion

104

Morphologische Veränderungen konnten an den generierten RH-knockout Mutanten unter

Standardbedingungen nicht beobachtet werden (3.6.2.4). Auch für RH-Mutanten aus Arabidopsis

wurden keine morphologischen Veränderungen nach Kultivierung unter Standardbedingungen

beschrieben (Jung et al. 2011, 2009).

4.10.1 Veränderungen der RH-Aktivität nach PpRH1-knockout

Nach Selektion von PpRH1-knockout Pflanzen wurde deren Fähigkeit zur Hydrolyse von Inosin im

Vergleich zum Wildtyp gemessen. Während entsalzte Proteinextrakte aus Wildtypgewebe

0,6-0,8 pmol Inosin h-1 mg-1 Protein hydrolysierten, konnte für PpRH1-KO #29 praktisch keine Inosin-

Hydrolyse mehr gemessen werden (< 0,02 pmol h-1 mg-1 Protein, 3.6.3). Diese nahezu 100 %ige

Reduktion der RH-Aktivität bestätigt PpRH1-KO #29 als einen eindeutigen PpRH1-knockout.

Außerdem deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass es keine weiteren RHs in Physcomitrella gibt, die in

der Lage sind Inosin zu hydrolysieren. Mit den PpRH1-knockout Pflanzen steht somit ein effektives

Werkzeug zur Verfügung, um die Rolle von PpRH1 im Stoffwechsel von Purinen, Pyrimidinen und

Cytokininen bei Physcomitrella in planta zu analysieren.

Jung et al. (2011) untersuchten in ihrer Arbeit knockout Mutanten der RH-Genfamilie aus

Arabidopsis. T-DNA-Insertionsmutanten von AtNSH1 zeigten nach Fütterung von 14C-markiertem

Uridin eine deutlich verminderte Freisetzung von markiertem CO2 im Vergleich zum Wildtyp. Da

keine vollständige Reduktion der Freisetzung des aus Uridin hervorgegangenen CO2 erfolgte, gehen

die Autoren von der Existenz einer weiteren Uridin-hydrolysierenden Enzym-Aktivität aus. Für

AtNSH3, eine weitere putative RH aus Arabidopsis, wurden von den zuvor genannten Autoren

ebenfalls T-DNA-Insertionsmutanten charakterisiert. Aufgrund einer postulierten extrazellulären

Lokalisierung von AtNSH3 wurde die Hydrolyse von Inosin und Adenosin in apoplastischen

Flüssigkeiten dieser Mutanten gemessen. Während beim Wildtyp die Umwandlung von Inosin und

Adenosin zur korrespondierenden Base detektiert wurde, fand bei den Mutanten keine Hydrolyse

dieser Purine mehr statt. Für den extrazellulären Raum bei Arabidopsis kann daher davon

ausgegangen werden, dass AtNSH3 die Hauptaktivität zur Hydrolyse von Inosin und Adenosin

darstellt. Wie in 4.9 beschrieben, scheint in Physcomitrella keine extrazelluläre RH zu existieren.

4.10.2 Beeinflussung des Purin- und Cytokinin-Stoffwechsels nach PpRH-knockout

Die Charakterisierung von PpRH-KO Mutanten anhand von in vivo Metabolismusstudien unter

Verwendung von Tritium-markiertem Adenosin, Inosin und iPR sowie LC-MS/MS Messungen zur

Bestimmung der Gehalte von Purinen und Pyrimidinen zeigten deutlich, dass nach RH-knockout

Veränderungen im Purin- und Pyrimidin- sowie im Cytokinin-Stoffwechsel zu beobachten sind (3.6.4,

3.6.5). Da die KOs der einzelnen RH-Gene unterschiedliche Effekte zeigten, werden diese im

Anschluss separat diskutiert.

4.10.2.1 Effekte des PpRH1-knockout

Gesteigerte Aufnahme von extern applizierten Ribosiden aus dem Kulturmedium

Die durchgeführten Markierungsexperimente mit 3H-Adenosin, -Inosin und -iPR zeigten

übereinstimmend, dass die Abnahme des applizierten Ribosids bei der Transformante PpRH1-KO #29

deutlich schneller erfolgt als beim Wildtyp (Abb. 3.20, Abb. 3.23). Eine gesteigerte Aufnahme der

Riboside aus dem Medium könnte als die Folge einer gesteigerten Metabolisierung gedeutet werden.

Diskussion

105

Eine extrazelluläre Metabolisierung wird nahezu ausgeschlossen, da es keine Hinweise auf eine

extrazelluläre Lokalisierung von Ribosid-metabolisierenden Enzymen gibt. Intrazellulär können die

aufgenommenen Riboside entweder durch andere RHs zu den korrespondierenden Basen oder durch

Kinasen zu den korrespondierenden Nukleotiden umgesetzt werden, was zu erhöhten Base- bzw.

Nukleotid-Konzentrationen führen würde. Messungen der steady state Level ausgewählter Purine

und Pyrimidine bei den Transformanten zeigten keine signifikant erhöhten Base-Gehalte (3.6.5.2.).

Nukleotid-Gehalte wurden nicht bestimmt, so dass anhand der vorliegenden Daten eine gesteigerte

Kinase-Aktivität als Ursache für die erhöhte Abnahmekinetik weder bestätigt noch ausgeschlossen

werden kann. Messungen der Größe der Nukleotid-Pools sowie die Erstellung von Purin/Pyrimidin-

Profilen nach Applikation von Ribosiden könnten zeigen, ob Veränderungen der Nukleotid-Level und

möglicherweise Substrat-induzierte Verschiebungen des Purin/Pyrimidin-Profils vorliegen.

Die schnellere Abnahme extrazellulärer Riboside kann darüberhinaus auch durch eine erhöhte

Durchlässigkeit der Zellmembran oder durch vermehrten Carrier-gestützten Transport verursacht

werden. Eine generelle Beeinflussung der Purin-Transportraten durch externe Applikation von

Purinen wurde z.B. bei dem Pilz Aspergillus nidulans beschrieben: Die Expression von Purin-

Transporter-Genen konnte durch Applikation von Purinen zum Kulturmedium deutlich stimuliert

werden (Amillis et al. 2004). Für Pflanzen sind verschiedene Transporter für Stickstoff-Metabolite

bekannt, deren Transport-Raten vom Stickstoff-Angebot beeinflusst werden. Bei Gerste wurden

erhöhte Transkript-Level von high affinity Nitrat-Transportern (HATS) nach Behandlung mit NO3-

zusammen mit einer erhöhten NO3--Aufnahme gemessen (Vidmar et al. 2000). Die Applikation von

Aminosäuren wie Glutamin führte hingegen zu einer Reduktion des Influx von NO3-. Einstimmigkeit

besteht darüber, dass die Aufnahmeraten für anorganischen Stickstoff wie Nitrat über einen

Feedback-Mechanismus über die Menge an akkumuliertem Stickstoff reguliert werden. Anhand von

welchen Stickstoff-enthaltenden Substanzen Pflanzen ihren Stickstoff-Status messen, ist allerdings

noch unbekannt (Vidal und Gutiérrez 2008). Hierfür kämen beispielsweise Ammonium, Glutamin

oder Glutamat in Frage. Der knockout von PpRH1 könnte zu einer Blockade im Ribosid-Abbau und

damit zu einem verminderten Recycling von Stickstoff geführt haben. Die reduzierten Stickstoff-

Gehalte könnten in der Folge die Expression von Ribosid-Transporter-Genen auslösen und zu einer

gesteigerten Aufnahme dieser u.a. extern vorliegenden Stickstoff-Verbindungen führen.

Zur Prüfung dieser Hypothese könnten Purin-Transporter in Physcomitrella identifiziert und deren

Expression in PpRH-KOs über Microarray-Analysen untersucht werden. Vergleichbare Messungen von

Aufnahmeraten von Purinen oder Pyrimidinen bei pflanzlichen RH-Mutanten oder anderen Purin-

Stoffwechsel-Mutanten waren in der Literatur nicht zu finden.

Multiple Effekte auf die Metabolit-Verteilung im Gewebe

Nach Markierung mit 3H-Adenosin und -Inosin konnte in den Gewebeextrakten von PpRH1-KO #29

bezüglich der RH-Aktivität keine KO-gebundenen Effekte nachgewiesen werden (Abb. 3.22). Falls der

knockout von PpRH1 zu Verschiebungen des intrazellulären Profils der markierten Metabolite führte,

wurden RH-Effekte durch andere Enzym-Aktivitäten überlagert. Weder Substrat noch Produkt der

RH-katalysierten Reaktion konnten intrazellulär nachgewiesen werden.

Nach Markierung mit dem Cytokinin 3H-iPR wurde für PpRH1-KO #29 intrazellulär eine veränderte

Verteilung der Cytokinin-Metabolite im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen. Neben einem

Diskussion

106

unerwarteterweise gesteigerten Base/Ribosid-Verhältnis wurde außerdem ein gegenüber dem

Wildtyp erhöhter Anteil an Cytokinin-Abbauprodukten bestimmt (Abb. 3.24, Abb. 3.25). Beide

Beobachtungen können keine direkte Folge des RH-knockouts darstellen, sondern repräsentieren

vermutlich sekundäre Effekte, die die primären Auswirkungen überlagern. Der beobachtete höhere

Gehalt an iP gegenüber iPR kann beispielsweise dadurch zustande kommen, dass iPR verstärkt durch

Aktivität der ADK zur Bildung von Cytokinin-Nukleotiden verbraucht wird, da diese nur vermindert

aus der reduzierten Menge an iP über APRT gebildet werden können. Somit wäre ein RH-gebundener

Effekt, die Akkumulation von iPR, nicht mehr nachzuweisen. Die gesteigerte Aufnahme von 3H-iPR

aus dem Kulturmedium sowie die erhöhte Menge an Abbauprodukten im Gewebe können ebenfalls

auf einen gesteigerten Cytokinin-Katabolismus, durch erhöhte CKX-Aktivität, als eine sekundäre Folge

des PpRH1-knockouts hinweisen.

Neben in vivo Markierungsexperimenten wurden auch LC-MS/MS Messungen von Purin- und

Pyrimidin-Konzentrationen im Gewebe von PpRH1-KO #29 vorgenommen. Diese ergaben eine

deutliche Verschiebung des Gesamtprofils der analysierten Purin- und Pyrimidin-Metabolite (Abb.

3.28). Ein Großteil der untersuchten Purin- und Pyrimidin-Vertreter wurde in höheren

Konzentrationen als beim Wildtyp nachgewiesen. Ein Vergleich der Gesamtmengen von Ribosiden zu

Basen zeigte, dass bei PpRH1-KO eine deutliche Erhöhung der Ribosid-Konzentrationen vorlag.

Während der Wildtyp ein Ribosid/Base-Verhältnis von 1,9 aufwies, wurde für PpRH1-KO #29 ein

Ribosid/Base-Verhältnis von 13,3 berechnet (nach 21 Tagen Kultivierungsdauer). Der enorme Anstieg

des Ribosid/Base-Verhältnisses ist vorrangig auf die Konzentrationszunahme der Riboside Xanthosin,

Inosin, Guanosin und Uridin zurückzuführen. Diese Riboside wurden interessanterweise auch als

Substrate des rekombinanten PpRH1 Proteins identifiziert (Tab. 3.2). Die Ergebnisse der LC-MS/MS

Messungen nach PpRH1-KO stehen somit in Einklang mit den am rekombinanten Protein erhoben

Daten zum Substratspektrum von PpRH1.

Bei transgenen Mäusen denen das Gen für Uridin-Phosphorylase fehlte, die die reversible

Phosphorolyse von Uridin zu Uracil katalysiert, konnten ähnliche Beobachtungen gemacht werden:

Die Konzentration an Uridin nahm nach Deletion der Uridin-Phosphorylase je nach Gewebetyp auf

eine bis zu 6fach höhere Menge im Vergleich zum Wildtyp zu (Cao et al. 2005).

Auch an Xanthin-Dehydrogenase-(XDH)-Mutanten wurden vergleichbare Beobachtungen gemacht.

XDH katalysiert sowohl die Umwandlung von Hypoxanthin zu Xanthin als auch die von Xanthin zu

Harnsäure. XDH-Mutanten von Arabidopsis mit reduzierter XDH-Aktivität zeigten eine starke

Akkumulation großer Mengen von Xanthin (Brychkova et al. 2008). Pérez-Vicente et al. (1991)

führten Markierungsexperimente mit radioaktiv-markierten Hypoxanthin und Xanthin an

C. reinhardtii durch. Hierbei wurde eine Stimulation der Transporter-vermittelten Aufnahme der

Purin-Basen durch die extrazellulär applizierten Purine gemessen. Neben dem Wildtyp wurden auch

XDH-Mutanten in die Experimente miteinbezogen. Für XDH-Mutanten konnte eine verstärkte

intrazelluläre Akkumulation der extern zugefügten Purin-Basen gemessen werden, da durch die

fehlende XDH-Aktivität vermutlich der Abbau der Purine zu Harnsäure blockiert war. Welche Schlüsse

sich für Physcomitrella aus den Ergebnissen der Markierungsexperimente und LC-MS/MS Messungen

auf die Bedeutung von PpRH1 ableiten lassen, wird in 4.11 diskutiert.

Diskussion

107

4.10.2.2 Effekte eines PpRH2- bzw. PpRH3-knockouts

Bei der Untersuchung der RH-KO-Effekte konnten bei PpRH2- und PpRH3-knockout Linien gewisse

Ähnlichkeiten gemessen werden. Insgesamt wurde im Vergleich zum PpRH1-KO ein deutlich

schwächer ausgeprägter metabolischer Phänotyp nachgewiesen.

In vivo Markierungsexperimente zur Charakterisierung von PpRH2- und PpRH3-KOs wurden mit 3H-iPR vorgenommen und zeigten eine nahezu dem Wildtyp identische Abnahmekinetiken für das

Substrat im Medium. Intrazellulär wurde eine leichte Abnahme des Base/Ribosid-Verhältnisses

bestimmt. Außerdem wurden bei beiden Genotypen etwas niedrigere Mengen an Abbauprodukten

als beim Wildtyp detektiert. Interessanterweise stehen diese Beobachtungen im Gegensatz zu den

bei PpRH1-KO beobachteten Effekten, da dort eine Zunahme des Base/Ribosid-Verhältnisses

zusammen mit einer größeren Menge an Abbauprodukten im Vergleich zum Wildtyp gemessen

wurde. Dieser Befund deutet auf eine andere Bedeutung von PpRH2 und -3 im Cytokinin-

Stoffwechsel hinweisen.

Die vorgenommenen LC-MS/MS Messungen an Gewebeextrakten aus Kulturen von PpRH2-KO #56

und PpRH3-KO #7 zur Bestimmung der Menge an Purinen und Pyrimidinen zeigten ebenfalls

gegenüber dem Wildtyp nur geringfügige Veränderungen (Abb. 3.28). Die meisten der analysierten

Purine und Pyrimidine blieben unbeeinflusst. Bei PpRH2-KO #56 war lediglich die Zunahme des

Ribosids Uridin auffällig, das auch das einzige bisher bekannte Substrat des rekombinanten PpRH2

Proteins darstellt (Tab. 3.2). Die Analyse der intrazellulären Verhältnisse von Purinen und Pyrimidinen

bei der Mutante PpRH3-KO #7 zeigte keine deutlichen Verschiebungen der Konzentrationen

einzelner Metabolite. Bildet man allerdings das Verhältnis von Ribosiden zu Basen, ergibt sich für

beide knockouts ebenfalls ein im Vergleich zum Wildtyp zugunsten des Ribosids verschobenes

Ribosid/Base-Verhältnis: 3,5 (PpRH2-KO #56) bzw. 3,2 (PpRH3-KO #7) gegenüber 1,9 beim Wildtyp.

Eine Erhöhung der endogenen Ribosid-Gehalte scheint somit ein für PpRH1-, PpRH2- und PpRH3-KO

gemeinsamer Effekt des RH-knockouts zu sein, der beim PpRH1-KO allerdings weitaus deutlicher

ausgeprägt ist. Dieser Befund bestätigt die Funktion aller drei PpRHs als Ribosid-hydrolysierende

Enzyme.

Darüberhinaus wurden übereinstimmend bei allen PpRH-knockouts Änderungen der Gehalte an

Desoxy-Formen von Ribosiden gemessen. Für die meisten bisher beschriebenen RHs bilden die

Desoxyriboside keine Substrate, da wie von Degano et al. (1996) angenommen wird, vermutlich alle

drei Hydroxyl-Gruppen der Ribose für eine effiziente Katalyse benötigt werden. Bei bisherigen

Bestimmungen der Substratspezifität von PpRHs wurden Desoxyriboside nicht getestet. Aufgrund der

Daten aus den LC-MS/MS-Analysen sollten diese aber in zukünftige Messungen der Substratspezifität

miteinbezogen werden.

Diskussion

108

4.11 Zusammenfassende Schlüsse auf mögliche Funktionen von RHs bei

Physcomitrella

Die physiologische Rolle von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel wurde bisher kaum untersucht. Erst

die Identifizierung der RH-Genfamilie aus Arabidopsis lieferte - vorrangig anhand der Analyse von

Mutanten mit veränderter RH-Aktivität - Hinweise auf mögliche Rollen dieser Enzyme bei der

Samenpflanze Arabidopsis. Die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur Substratspezifität, zur

Lokalisierung und vor allem die Charakterisierung der hergestellten knockout Mutanten von

Physcomitrella lassen Schlüsse auf mögliche Rollen der RHs beim Laubmoos Physcomitrella zu.

Wie bereits anhand der Bestimmung des Substratspektrums deutlich wurde, weisen PpRH1 und -2

ein unterschiedliches Substratspektrum auf (Tab. 3.2). PpRH3 konnte heterolog nicht in löslicher

Form erhalten werden. Die erzeugten RH-single-knockouts zeigten unterschiedliche metabolische

Phänotypen. Übereinstimmend zu der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den Aminosäure-

Sequenzen von PpRH2 und -3 (76 %) wurden nach dem knockout von PpRH2 und PpRH3 ähnliche

Effekte beobachtet. Es wird somit ein direkter Zusammenhang zwischen dem jeweiligen

ausgeschalteten RH-Familienmitglied und den beobachteten Auswirkungen angenommen. Im

Anschluss an die Frage nach einer Beteiligung von RHs am Cytokinin-Stoffwechsel, werden mögliche

Funktionen der einzelnen RHs aus Physcomitrella diskutiert.

Sind RHs in den Cytokinin-Stoffwechsel involviert?

Neben dem Nachweis des Umsatzes des Cytokinin-Ribosids iPR (Tab. 3.2) durch rekombinante PpRH1

und PpRH2 Proteine wurden Vorversuche zur Cytokinin-Ribosid-Toleranz der Mutanten

vorgenommen. Cytokinine, insbesondere die Basen, gelten prinzipiell als wachstumsfördernd, wirken

aber in hohen Konzentrationen (> 250 nM) hemmend auf das Wachstum. Ein RH-vermittelter Umsatz

des Ribosids Benzyladenosin (BAR) zur Base Benzyladenin (BA) resultiert somit in einer höheren

Konzentration an wachstumshemmendem BA. Eine Reduktion der RH-Aktivität würde

dementsprechend zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber extern appliziertem BAR führen. Für

einige der PpRH-KO Mutanten wurde in der Tat eine höhere Toleranz gegenüber BAR festgestellt,

was eine Beteiligung von PpRHs am Cytokinin-Metabolismus impliziert (Daten nicht gezeigt).

Anhand der Markierungsexperimente konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass der knockout

von RHs zu Verschiebungen des intrazellulären Profils markierter Cytokinine führt. Neben

Verschiebungen des Base/Ribosid-Verhältnisses, änderte sich auch das Verhältnis von

Abbauprodukten zu Metaboliten mit Isopentenyl-Seitenkette (Abb. 3.24, Abb. 3.25). Aufgrund der

starken Aktivität anderer Enzyme, vornehmlich vermutlich CKX, war es nahezu unmöglich, den

Einfluss der reduzierten/fehlenden RH-Aktivität direkt zu messen und eine Vorhersage zur Rolle von

PpRH1, -2 und -3 im Cytokinin-Stoffwechsel zu treffen. In zukünftigen Studien könnte durch in vivo

Markierung mit BAR, einem schlechten Substrat der CKX (Armstrong 1994), eine Reduktion des

Katabolismus erreicht werden, um den durch Minderung der RH-Aktivität entstandenen Effekt auf

das Base/Ribosid-Verhältnis besser sichtbar zu machen.

Jung et al. (2009) konnten ebenfalls iPR-Hydrolyse-Aktivität des rekombinanten AtNSH1 Proteins aus

Arabidopsis messen und postulierten daher eine mögliche Funktion für AtNSH1 im Cytokinin-

Diskussion

109

Stoffwechsel. Bei der Analyse von AtNSH1-Mutanten wurden dafür allerdings keine Hinweise

gefunden.

Eine Beeinflussung des Cytokinin-Profils durch RH-knockout könnte auch als Folge eines Stickstoff-

Mangels erfolgen. Möglicherweise führte der knockout von PpRHs aufgrund der Blockade im Purin-

Abbau und der damit verbundenen verminderten Rückführung von reduziertem Stickstoff zu der

Auslösung einer Stickstoff-Mangel-Kaskade. Eine Beeinflussung der Isopentenyltransferase-(IPT)-

abhängigen Cytokinin-Biosynthese durch Nitrat wurde anhand einer gesteigerten Expression von

AtIPT3 nach Nitrat-Applikation von Miyawaki et al. (2004) für Arabidopsis beispielsweise

beschrieben.

Zur Beantwortung der Frage, ob PpRHs in den Cytokinin-Stoffwechsel bei Physcomitrella involviert

sind, wurden außerdem analog zu den LC-MS/MS Messungen von Purinen und Pyrimidinen bei PpRH-

KOs (2.7) auch Experimente zur Untersuchung des Cytokinin-Spektrums vorgenommen. Die

entsprechenden LC-MS/MS Daten wurden in Kooperation mit Prof. M. Strnad (Palacký Universität,

Olomouc, CZ) erhoben und lagen zum Abschluss der Arbeit noch nicht vor.

Wie eingangs erwähnt (1.3) sind für die „Aktivierung“ von Cytokininen (Bildung der physiologisch

aktiveren Basen) zwei Wege in Pflanzen beschrieben: Die Bildung von Cytokinin-Basen aus -Ribosiden

über RHs sowie die Bildung von Cytokinin-Basen ausgehend von -Nukleotiden über

Phosphoribohydrolasen (LOG). Inwieweit der letztgenannte von Kuroha et al. (2009) und Kurakawa et

al. (2007) beschriebene Weg zur Bildung der Basen aus Nukleotiden in Physcomitrella Bedeutung hat,

konnte anhand der in dieser Arbeit erhobenen Daten nicht festgestellt werden. Zur Untersuchung

des „Cytokinin-Aktivierungsweges“ in Physcomitrella könnte zukünftig folgender Ansatz gewählt

werden: Schwartzenberg et al. (2003) konnten zeigen, dass die Bildung von Cytokinin-Nukleotiden via

APRT in Physcomitrella einen untergeordneten Stoffwechselweg darstellt. Die Bildung der Nukleotide

erfolgt daher hauptsächlich über die ADK-katalysierte Reaktion aus den Ribosiden. Durch

Verwendung eines Inhibitors für ADK wie beispielsweise (Iodo-)Tubercidin oder den Einsatz von ADK-

knockout Mutanten könnte eine Reduktion des Gehalts an Cytokinin-Nukleotiden erreicht werden.

Anschließende Messungen der Konzentration an Cytokinin-Basen würden zeigen, ob ausreichend

Basen über eine RH-katalysierte Reaktion gebildet werden. Außerdem würden Expressionsanalysen

von PpRHs und LOGs Aufschluss darüber geben, welches die bevorzugten Stoffwechselwege zur

„Aktivierung“ von Cytokininen bei Physcomitrella sind.

Für Arabidopsis wurde von Kuroha et al. (2009) anhand von Überexpressionsmutanten eine zentrale

Bedeutung der LOG-Gene im „Cytokinin-Aktivierungsmechanismus“ nachgewiesen. Möglicherweise

scheint dieser Weg zur „Aktivierung“ von Cytokininen in Arabidopsis vorherrschend zu sein. Im

Physcomitrella Genom konnten anhand von BLAST-Analysen ebenfalls putative Kandidaten für LOG-

Gene selektiert werden (Daten nicht gezeigt). Grundsätzlich wäre eine parallele Existenz von zwei

verschiedenen Aktivierungswegen für Cytokinine in Physcomitrella denkbar. Die Vielfalt von

unterschiedlichen Stoffwechselwegen in Physcomitrella wurde bereits mehrfach beschrieben (z.B.

(Rensing et al. 2007). Die Frage nach den Einzelheiten der möglichen Beteiligung von PpRHs am

Cytokinin-Stoffwechsel kann anhand der vorliegenden Daten nicht abschließend beantwortet

werden.

Diskussion

110

Die Rolle von PpRH3 kann nicht eindeutig bestimmt werden

Im Fall von PpRH3 ist es nahezu unmöglich, Aussagen über mögliche Funktionen zu machen. Zum

einen konnte kein rekombinantes Protein hergestellt werden, so dass keine Daten zur

Substratspezifität vorliegen. Zum anderen lieferte die Analyse von PpRH3-knockout Mutanten nur

wenige Einblicke in die Bedeutung von PpRH3, weswegen PpRH3 nach derzeitigem Datenstand eher

eine untergeordnete Rolle beigemessen wird. EST-Datenbanken zu verschiedenen

Entwicklungsstufen zeigen, dass eine Expression von PpRH3 auch im Sporophyten erfolgt (40 % der

ESTs). Zur Bedeutung von PpRH3 sollte zunächst rekombinantes Protein auf Grundlage der

verifizierten cDNA-Sequenz (4.3) hergestellt und für Untersuchungen der Substratspezifität

eingesetzt werden. Außerdem sollten Expressionsstudien für PpRH3 mit sporophytischem Gewebe

vorgenommen werden, um die entwicklungsspezifische Expression von PpRH3 zu analysieren.

PpRH2 übernimmt möglicherweise Rolle im Pyrimidin-Abbau im Entwicklungsstadium des

Gametophoren

Am rekombinanten Protein vorgenommene Messungen der Substratspezifität identifizierten PpRH2

als eine Pyrimidin-bevorzugende RH mit einer im Vergleich zu PpRH1 schwach ausgeprägten

katalytischen Aktivität. Neben Uridin wurden auch Xanthosin und iPR umgesetzt, wobei für die

letzten beiden Substrate keine kinetischen Parameter bestimmt wurden. LC-MS/MS Messungen von

intrazellulären Purinen und Pyrimidinen beim PpRH2-knockout zeigten leichte Verschiebungen des

Profils von Purinen und Pyrimidinen, wobei das Ribosid Uridin der größten Änderung unterlag (3fach

mehr als beim Wildtyp). Die Uridin-Akkumulation erfolgte aufgrund der fehlenden PpRH2-Aktivität

zur Hydrolyse von Uridin, die offenbar nicht durch PpRH1-Aktivität (Uridin ist ebenfalls Substrat von

PpRH1) kompensiert werden konnte. Der „Uridin-Anstau“ war erst nach 21 Tagen Kultivierungsdauer

zu messen, wenn auch die Entwicklung von Gametophoren bereits begonnen hatte. Die auf dem

cosmoss Server publizierten ESTs sowie eigene real time-PCR Experimente (Daten nicht gezeigt)

deuten auf eine Expression von PpRH2 im Gametophoren hin. Für PpRH2 wird aufgrund der bislang

vorliegenden Daten daher eine Rolle im Abbau des Pyrimidin-Ribosids Uridin während der späten

Entwicklung bei Physcomitrella angenommen. Für ein breiteres Verständnis der Bedeutung von

PpRH2 sind zunächst detaillierte Expressionsstudien am Gametophoren anvisiert.

PpRH1 übernimmt Schlüsselrolle im Ribosid-Abbau

Wie Messungen der Substratspezifität zeigten, handelt es sich bei PpRH1 um eine

Purin-bevorzugende RH. Inosin wurde als Hauptsubstrat des rekombinanten PpRH1 Proteins

identifiziert, dann folgen Adenosin, Guanosin und Uridin mit abnehmender katalytischer Effizienz.

Ebenso wurde Aktivität an Xanthosin und iPR nachgewiesen, wobei für diese Substrate keine

kinetischen Parameter bestimmt wurden. Das Substratspektrum von PpRH1 umfasst somit alle

wichtigen Vertreter der Purin-Riboside sowie das Pyrimidin-Ribosid Uridin und das Cytokinin-Ribosid

iPR. Das breit gefasste Substratspektrum in Verbindung mit der exponierten Stellung von RHs im

Stoffwechsel als Schnittstelle zwischen Katabolismus und Recycling, weisen auf eine zentrale

Bedeutung von PpRH1 hin. Der knockout von PpRH1 führte zu einem vollständigen Verlust der

Fähigkeit der Inosin-Hydrolyse. Daher wird angenommen, dass mit großer Wahrscheinlichkeit kein

weiteres Enzym in Physcomitrella den Abbau von Inosin zu Hypoxanthin katalysiert. Da Inosin

zusammen mit Xanthosin das Haupt-Zwischenprodukt im Purin-Katabolismus repräsentiert (Zrenner

Diskussion

111

et al. 2006), kommt PpRH1 vermutlich eine wichtige Funktion im Katabolismus zu. Neben dem

Verlust zur Inosin-Hydrolyse wurde beim PpRH1-KO eine drastische Akkumulation von Purin- und

Pyrimidinen, insbesondere der Riboside Xanthosin, Inosin, Uridin und Guanosin gemessen. Dies steht

im Einklang mit den Messungen der Substratspezifität und bestätigt die am rekombinanten Protein

erhobenen Daten zur Substratspezifität. Da für Xanthosin die höchste Akkumulation (17fach höher

als beim Wildtyp) gemessen wurde, könnte dies auch ein Hinweis darauf sein, dass Xanthosin in

planta ein besseres Substrat für PpRH1 als Inosin darstellt.

Die generelle Akkumulation von Ribosiden als Folge des PpRH1-knockouts unterstreicht die zentrale

Bedeutung von PpRH1 im Ribosid-Abbau mit einer übergreifenden Rolle im Purin- und Pyrimidin-

Stoffwechsel. In Abb. 4.6 ist ein hypothetisches Schema der veränderten Stoffwechsel-Situation für

Purine und Pyrimidine nach PpRH1-KO dargestellt. Bei der Mutante resultiert die fehlende Aktivität

von PpRH1 in einem drastischen „Ribosid-Anstau“. Da die Rückführung von Nukleosid-gebundenem

Stickstoff nicht erfolgen konnte, wird folglich von der Pflanze eine reduzierte Menge an Stickstoff

zum Einbau in Aminosäuren perzipiert. Dies wiederum führte zu einer Stimulation der Aufnahme von

extrazellulär vorhandenen Stickstoff-Quellen, wie anhand der gesteigerten Ribosid-Aufnahme aus

dem Kulturmedium bei Markierungsexperimenten beobachtet wurde.

Abb. 4.6 Hypothetisches, stark vereinfachtes Schema zur veränderten Stoffwechsel-Situation im Purin- und Pyrimidin-Metabolismus nach knockout von PpRH1. Wichtige Enzyme: 1 – 5‘-Nukleotidase; 2 – Phosphoribosyltransferase; 3 – Ribohydrolase; 4 – Kinase. Rote Pfeile weisen auf eine Akkumulation der Substanzen hin. Schema modifiziert nach Deng und Ashihara (2010).

Diskussion

112

PpRH1 repräsentiert demnach eine Hauptaktivität im Katabolismus von Ribosiden. Daten zur

Expression von PpRH1 stützen die Annahme, dass PpRH1 eine zentrale Funktion innerhalb der PpRH-

Genfamilie besitzt: Real time-PCR Experimente zeigten eine höhere Expression von PpRH1 im

Vergleich zu PpRH2 und -3 (Daten nicht gezeigt), was in Übereinstimmung mit der höchsten Anzahl

an publizierten ESTs innerhalb der PpRH-Genfamilie steht (Tab. 3.1).

Die bereits mehrfach betonte Schlüsselfunktion von RHs als Schnittstelle am Übergang zwischen

Katabolismus und Recycling von Purinen und Pyrimidinen, konnte anhand der erhobenen Daten für

RHs aus Physcomitrella bestätigt werden: Die Produkte der PpRH-Genfamilie, insbesondere PpRH1,

stellen gewissermaßen ein Nadelöhr dar, dass die Riboside „durchlaufen“ müssen, um in den

Katabolismus einzutreten. Da der Abbau von Ribosiden auch der Rückführung von Stickstoff dient,

kommt den RHs möglicherweise eine bedeutende Rolle im Stickstoff-Stoffwechsel zu.

Von Vlietland-Nowotny (2010) wurden im Rahmen einer Masterarbeit Vorversuche zur Testung der

Hypothese der Beteiligung von PpRHs am Stickstoff-Recycling durchgeführt. Hierfür wurden Wildtyp

und PpRH1-, PpRH2- und PpRH3-KO Mutanten auf Medium angezogen, dass Purin-Riboside als

einzige Stickstoff-Quelle enthielt. Einige PpRH1-, PpRH2- und PpRH3-KO Mutanten zeigten eine

Reduktion des Wachstums im Vergleich zum Wildtyp wenn Adenosin oder Xanthosin als einzige

Stickstoff-Quelle angeboten wurde. Zusammen mit der gemessenen Ribosid-Akkumulation deuten

diese Ergebnisse eine Rolle von PpRHs bei der Stickstoff-Rückgewinnung an. Kim et al. (2006)

beschreiben Versuche, bei denen bakterielle Deletionsmutanten von RHs auf Medium mit Purinen

bzw. Pyrimidinen als einziger Stickstoff-Quelle angezogen wurden. In Übereinstimmung mit dem

Substratspektrum der deletierten RH zeigten die Mutanten reduziertes Wachstum. Daher wurde den

charakterisierten RHs von den Autoren eine Beteiligung am Recycling von Purin- und Pyrimidin-

Ribosiden zugeordnet. Zur Verifizierung der Annahme, dass PpRHs tatsächlich am Stickstoff-Recycling

beteiligt sind, sind weitere Tests zur Kultivierung der Transformanten unter Stickstoff-Mangel-

Bedingungen anvisiert. Außerdem sollen Markierungsexperimente mit 14C-markierten Purinen und

anschließender Messung der 14CO2-Freisetzung vorgenommen werden, um die durch PpRH-KO

verursachte Blockade im Katabolismus zu bestätigen.

Neben Experimenten zur detaillierten Erfassung der veränderten Stoffwechsel-Situation nach

knockout von PpRHs, wären zukünftig auch Kenntnisse über gewebespezifische Expressionsmuster

von PpRHs in Physcomitrella von Interesse. Das Vorkommen größerer Mengen an Ribosiden wie

Adenosin, Guanosin, Uridin im Boden wurde von Phillips et al. (1997) beschrieben (µmol je kg

Boden). Über equilibrative Nukleosid-Transporter (1.1.5) könnte eine Aufnahme dieser

extrazellulären Riboside erfolgen, die von in den Wurzelzellen lokalisierten RHs abgebaut werden

können. Für AtNSH1 aus Arabidopsis konnte anhand von Promotor-GUS-Studien gezeigt werden,

dass diese vornehmlich in Wurzeln von Arabidopsis exprimiert wird, während RHs aus anderen

Pflanzen wie beispielsweise Kaffee (Campos et al. 2005) und Gelber Lupine (Abusamhadneh et al.

2000) aus Blättern isoliert wurden. Ob RHs aus Physcomitrella in Rhizoiden exprimiert werden,

könnte anhand von Promotor-GUS-Studien untersucht werden.

Diskussion

113

Funktionelle Rückschlüsse aus dem Vergleich von RHs aus Physcomitrella und Arabidopsis

Die RH-Genfamilie aus Arabidopsis, die von Jung et al. (2011, 2009) beschrieben wurde, stellt zum

jetzigen Zeitpunkt die einzige pflanzliche RH-Genfamilie dar, die neben der in dieser Arbeit

untersuchten RH-Genfamilie aus Physcomitrella, charakterisiert wurde. In Arabidopsis wurden wie in

Physcomitrella drei Isoformen von RHs beschrieben, die sich hinsichtlich ihrer biochemischen

Eigenschaften und ihrer postulierten Funktion voneinander unterscheiden. In beiden Organismen

wurde neben einer Purin-bevorzugenden RH (PpRH1 bzw. AtNSH2) auch eine Pyrimidin-

bevorzugende RH (PpRH2 bzw. AtNSH1) identifiziert. Die experimentell ermittelten

Substratspezifitäten dieser RHs sind kompatibel mit den Ergebnissen der phylogenetischen Analysen,

nach denen pflanzliche RHs in zwei Hauptgruppen clustern. PpRH1 und AtNSH2 gruppieren sich in die

eine, PpRH2 und AtNSH1 in die andere Gruppe von RHs ein.

AtNSH3, als extrazelluläre RH, konnte keiner der beiden Gruppen zugeordnet werden, da sich seine

Aminosäure-Sequenz grundlegend von den anderen RH-Aminosäure-Sequenzen unterscheidet.

PpRH3 gruppiert sich in die gleiche Gruppe wie PpRH2 und AtNSH1 ein, es liegen jedoch hier keine

experimentellen Daten zur Substratspezifität vor, da kein rekombinantes PpRH3 Protein erhalten

werden konnte (3.3.3).

Vergleicht man die physiologische Rolle der verschiedenen RHs auf der Grundlage der vorhandenen

Daten, so wurde in Physcomitrella und in Arabidopsis übereinstimmend jeweils eine RH mit stark

ausgeprägter katalytischer Aktivität (PpRH1 bzw. AtNSH1) nachgewiesen. Es ist davon auszugehen,

dass PpRH1 und AtNSH1 mit hoher Wahrscheinlichkeit eine essentielle Funktion im Katabolismus von

Ribosiden und dem damit verbundenen Recycling von Stickstoff übernehmen. Ohne RH-Aktivität

kann der von der Basen-Form ausgehende Katabolismus von Purinen und Pyrimidinen nicht

stattfinden. Obwohl sich PpRH1 und NSH1 hinsichtlich ihres Hauptsubstrates deutlich voneinander

unterscheiden (PpRH1: Inosin, AtNSH2: Uridin), kommt beiden Enzymen möglicherweise eine

übergreifende Rolle im Stoffwechsel von Purinen und Pyrimidinen zu, da für beide Enzyme sowohl an

Purinen als auch an Pyrimidinen Aktivität nachwiesen wurde. Sowohl in Physcomitrella als auch in

Arabidopsis existieren zweite RHs (PpRH2 bzw. AtNSH2) die jeweils in beiden Organismen vermutlich

RH-Nebenaktivität besitzen und vorrangig während einer bestimmten Entwicklungsphase eine Rolle

spielen. Während PpRH2, die bevorzugt das Pyrimidin Uridin umsetzt, laut EST Evidenzen

höchstwahrscheinlich insbesondere im Gametophor von Physcomitrella exprimiert wird, setzt

AtNSH2 bevorzugt das Purin Inosin um und ist in den Ribosid-Abbau während der späten Phase der

Seneszenz involviert. Arabidopsis besitzt zusätzlich, wie bereits zuvor erwähnt, eine weitere Isoform

(AtNSH3), die sich aufgrund ihrer extrazellulären Lokalisierung von den anderen RHs abhebt.

Physcomitrella, als eine basale Landpflanze, verfügt nach derzeitigem Kenntnisstand über keine

extrazelluläre RH.

RHs scheinen somit in beiden, phylogenetisch weit voneinander entfernten Organismen, eine

grundlegende zelluläre Funktion durch ihre Beteiligung am Katabolismus von Nukleosiden und der

damit verbundenen Rückführung von Stickstoff zu übernehmen. Neben den genannten

Übereinstimmungen zwischen RHs aus Physcomitrella und Arabidopsis bestehen ebenfalls

Unterschiede hinsichtlich der bevorzugenden Substrate sowie der gewebe- oder

entwicklungsspezifischen Expression der jeweiligen Haupt- und Neben-RHs. Weitere Untersuchungen

Diskussion

114

sind notwendig um zu einem detaillierteren Kenntnisstand bezüglich der Funktionen von RHs zu

gelangen.

4.12 Perspektiven

Im Rahmen der vorgelegten Arbeit wurde die RH-Genfamilie aus Physcomitrella identifiziert und

funktionell beschrieben. Neben der biochemischen Charakterisierung von rekombinanten

RH Proteinen lag ein Hauptschwerpunkt der Arbeit auf der Generierung und Charakterisierung von

PpRH-knockout Mutanten, anhand derer Einblicke in die physiologische Rolle von RHs erhalten

wurden. Die folgenden Experimente könnten dazu beitragen das Verständnis zu RHs noch weiter zu

vertiefen:

* Generierung von triple-knockout Mutanten bzw. triple knockdown Linien via RNAi. Transgene

Pflanzen zum gleichzeitigen knockdown von PpRH1, -2 und -3 wurden bereits hergestellt. Nach

Charakterisierung dieser Linien könnte anhand von Markierungsexperimenten mit 14C-markierten

Purinen und der anschließenden Messung der Produktion von 14CO2 zusammenfassend die

Bedeutung der gesamten PpRH-Genfamilie für den Katabolismus von Purinen (und Pyrimidinen)

erfasst werden. Außerdem könnten anhand von verbleibenden Rest-Aktivitäten zur Ribosid-

Hydrolyse Hinweise auf das mögliche Vorhandensein weiterer RHs im Physcomitrella Genom erhalten

werden.

* Anhand von Expressionsstudien von PpRH- und LOG-Genen in Wildtyp und PpRH-KOs sowie

Bewertungen der LC-MS/MS Messungen von Cytokininen bei PpRHs könnte die Frage nach der

Bedeutung von RHs im Cytokinin-Stoffwechsel und nach der Gewichtung der „Cytokinin-

Aktivierungswege“ bei Physcomitrella geklärt werden.

* Über Kristallisierungsansätze unter Verwendung von PpRH1 ohne N-terminalen Tag bzw. der

PpRH1 Mutante D25A könnten geeignete Kristalle zur Entschlüsselung der ersten 3D-Struktur einer

pflanzlichen RH sowie Einblicke in die Substratbindung erhalten werden.

Eine genaue Kenntnis der Funktionen und Rollen von RHs eröffnet Möglichkeiten der

biotechnologischen Nutzung dieser Enzyme sowie der Verbesserung von Nutzpflanzen.

Literaturverzeichnis

115

5 Literaturverzeichnis

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Anhang

125

6 Anhang

6.1 Abkürzungsverzeichnis

Chemische Symbole und Internationale SI Einheiten sind nicht aufgeführt.

3H-Ado Tritium-markiertes Adenosin 3H-Ino Tritium-markiertes Inosin 3H-iPR Tritium-markiertes Isopentenyladenosin 35 S Prom Cauliflower mosaic virus 35S Promoter 35 S Term Cauliflower mosaic virus 35S Terminator aa Aminosäure(n) ABA Abscisinsäure ACT Actin ADK Adenosinkinase AMP, ADP, ATP Adenosinmono-, -di- und -triphosphat APRT Adeninphosphoribosyltransferase BA Benzyladenin BAR Benzyladenosin BLAST Basic Local Alignment Search Tools BLE Zeocin Resistenz Gen (M)bp (Mega)Basenpaar(e) BSA Bovine Serum Albumin CaMV Cauliflower mosaic virus cDNA komplementäre DNA CKX Cytokininoxidase/dehydrogenase CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid cZ cis-Zeatin (k)Da (Kilo)Dalton DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DHZ Dihydrozeatin DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat dpm Zerfälle pro Minute DTT Dithiothreitol eATP Extrazelluläres ATP EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure EST Expressed sequence tag FG Frischgewicht FPLC Fast protein liquid chromatography G418 Geniticin GFP Green fluorescent protein GMP, GDP, GTP Guanosinmono-, -di- und -triphosphat GUS ß-Glucuronidase HPH Hygromycin-Phosphotransferase HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie IMP Inosinmonophosphat

Anhang

126

iP Isopentenyladenin iPR Isopentenyladenosin iPRMP, iPRDP, iPRTP Isopentenyladenosinmono-, -di- und -triphosphat IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid JGI Joint Genome Institute kb Kilobasenpaar(e) KO Knockout LC-MS Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung LSC Flüssigszintillationszählung Lm Laufmittel M Marker MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure MW Molekulargewicht NCBI National Center for Biotechnology Information NPTII Neomycinphosphotransferase II NSH Nukleosid-Hydrolase OD Optische Dichte ORF Open reading frame Os Osmolarität PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglycol pI Isoelektrischer Punkt PRPP 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat PVPP Polyvinylpolypyrrolidon RH Ribohydrolase RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen per Minute RT Reverse Transkriptase/Transkription SDS Natriumdodecylsulfat SUMO Small ubiquitin-like modifier TAE Tris/Essigsäure/EDTA TE Tris/EDTA TEA Triethylamin TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TES Spurenelement-Lösung TG Trockengewicht TLC Dünnschichtchromatografie Tris Trihydroxymethylaminoethan tRNA transfer-RNA tZ trans-Zeatin UMP, UDP, UTP Uridinmono-, -di- und -triphosphat UTR Untranslatierter Bereich UV Ultraviolett v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen WT Wildtyp XMP Xanthosinmonophosphat

Anhang

127

6.2 Ergänzende Daten

6.2.1 Aminosäure-Sequenz von PpRH1

Aminosäure-Sequenz von PpRH1 basierend auf der durch PCR-Experimente erhaltenen cDNA-

Sequenz (übereinstimmend mit der Aminosäure-Sequenz des Genmodell: Pp1s357_22V2.1)

MAVPENVVGTIKQSSPPKKVIIDTDPGIDDAMAIFFALKSPELDVIALTTIYGNVRTPTATVNALHLLEFAGREDIPVSE

GFRTSLRGELKERIADFVHGADGLGNTYPTLSDRKPIDTFAPDYLIQKVNEFPGEITIVALGPLTNLAAAVECDPTFAK

KVGQIIILGGAFQVNGNVNPAAEANIYGDPEAADIIFTCGADILVVGINITHQVYWTGKDLEDLGRSDSKFGKYLYAA

SHFYATYHREAYDIDAIYLHDPATMVAAVDPSLMTYATGAVRVQKDGICKGLTLFNNSNKVWHDPTDWCGIPPVK

VAVTVDRERVASLLKERLTAP

6.2.2 Aminosäure-Sequenzen von PpRH2

Für die Gensynthese verwendete Aminosäure-Sequenz von PpRH2 (basierend auf dem Genmodell

Pp1s140_172V2.1)

MAEYVEVSKNPARKRVIIDTDPGIDDMMAIFMAFEAPGIEVIGLTTIFGNVDIDLATKNALHLCEMTGHPEIPVAEG

PSEPLKRVKPRIAYFVHGSDGLGNTFQANPKGQKSSKSAADFLLEKVAEFPGEVTVVALGPLTNIALAIQKDPNFVKN

IGQLVVLGGAFNASGNVNPAAEANIFGDPEAADLVFTSGMDTLVIGISLTTQVIFNDQDLSEIRDSGGKYGKYIYDCC

RFYHDFHLESDHFDGIFLHDPTCMAALLDPSLFTYRKGAVRVETEGLCVGYTLLDMGLKNWVGKNHWTGVPLIDV

GMTVDADGVRSLVKKLLCSP*

Aminosäure-Sequenz von PpRH2 basierend auf dem Genmodell Pp1s140_172V6.1 MVGEETMDRSADLMAEYVEVSKNPARKRVIIDTDPGIDDMMAIFMAFEAPGIEVIGLTTIFGNVDIDLATKNALHL

CEMTGHPEIPVAEGPSEPLKRVKPRIAYFVHGSDGLGNTFQANPKGQKSSKSAADFLLEKVAEFPGEVTVVALGPLT

NIALAIQKDPNFVKNIGQLVVLGGAFNASGNVNPAAEANIFGDPEAADLVFTSGMDTLVIGISLTTQVIFNDQDLSEI

RDSGGKYGKYIYDCCRFYHDFHLESDHFDGIFLHDPTCMAALLDPSLFTYRKGAVRVETEGLCVGYTLLDMGLKKYV

DMHNLCDSDSALLSLLPT*

6.2.3 Aminosäure- und Nukleotid- Sequenzen von PpRH3

Für die Gensynthese verwendete Aminosäure-Sequenz von PpRH3 (basierend auf dem Genmodell

Pp1s5_276V2.1)

MDVKAAGSVAQDQFSKHADDMMAILMAFQAPEIEVIGLTTIFGNVNTDLATINALHLCEMAGHPEIPVAEGPSEP

LKRVKPRIAYFEHGSDGLGETYQAKPNFQKLSKDAADFLIENVTEFPGEVTVVGLGPLTNLALAIQKDSNFAKNVGQ

LVVLGGSFNASGNVNPAAEANVSLKRQKSHSRNLFGDPEAADIVFTSGMNTLAIGIDLTTQVIFNEDDLCEIRDSGG

DYGKYIYDCCRFYHDWHLSSDHLDVMGLTYLPMVTGIFLHDPTCMAALLDPTLFTFKNGAVRVETEGPCLGHTILG

MGLKNWVKETSWTGVPPIDVAITVDADGVRNLVKKLLCSSRLK*

Aminosäure-Sequenz von PpRH3 basierend auf der durch PCR-Experimente erhaltenen cDNA-

Sequenz

MDVKAAGSVAQDQFSKHAGRRKVIIDTDPGIDDMMAILMAFQAPEIEVIGLTTIFGNVNTDLATINALHLCEMAG

HPEIPVAEGPSEPLKRVKPRIAYFEHGSDGLGETYQAKPNFQKLSKDAADFLIENVTEFPGEVTVVGLGPLTNLALAIQ

KDSNFAKNVGQLVVLGGSFNASGNVNPAAEANLFGDPEAADIVFTSGMNTLAIGIDLTTQVIFNEDDLCEIRDSGG

Anhang

128

DYGKYIYDCCRFYHDWHLSSDHLDGIFLHDPTCMAALLDPTLFTFKNGAVRVETEGPCLGHTILGMGLKKYVNIHTL

CLAQLPSKLYLLSSSLRCIEEHLLLYQTFISVPSAYQSIYITCSETNQWLCSSKFEIEDAHYRVLNFIAT

cDNA-Sequenz von PpRH3 basierend auf PCR-Experimenten (mit 3’UTR, vgl. 4.3)

ATGGACGTGAAAGCTGCTGGCTCAGTGGCGCAGGACCAGTTTTCCAAGCATGCAGGTCGAAGGAAAGTTATT

ATCGACACGGATCCCGGCATTGATGATATGATGGCAATTTTAATGGCTTTTCAAGCCCCTGAAATTGAAGTTAT

AGGACTCACCACCATTTTTGGCAACGTAAACACCGATTTAGCGACAATCAACGCCCTCCATCTGTGCGAGATGG

CAGGTCATCCGGAGATACCGGTTGCGGAAGGCCCATCAGAACCATTAAAGCGGGTGAAGCCTCGAATTGCGT

ATTTTGAACACGGATCAGATGGACTTGGAGAAACTTACCAAGCCAAACCTAACTTCCAAAAGTTATCTAAAGAT

GCAGCAGACTTTCTTATTGAGAATGTAACTGAATTCCCAGGCGAAGTAACCGTGGTTGGTCTGGGCCCCCTCAC

CAATCTTGCACTGGCTATTCAAAAGGACTCAAACTTTGCCAAAAATGTTGGGCAACTGGTAGTCCTTGGGGGTT

CATTCAATGCCAGTGGAAATGTGAATCCCGCCGCAGAAGCTAATCTATTTGGCGATCCCGAAGCTGCAGACAT

CGTATTCACTAGTGGAATGAACACTCTTGCAATAGGCATAGACTTGACCACTCAGGTGATTTTTAATGAAGATG

ACTTGTGTGAAATAAGGGATTCTGGTGGAGATTACGGCAAATATATCTATGACTGTTGTCGCTTTTATCACGAT

TGGCATTTATCGTCTGATCATTTGGATGGGATTTTTCTTCACGATCCTACATGCATGGCAGCACTGCTTGACCCA

ACTCTTTTTACCTTTAAAAACGGAGCTGTGCGAGTTGAAACTGAGGGGCCTTGCTTGGGCCACACTATCCTAGG

TATGGGACTGAAAAAGTACGTAAATATTCACACCCTATGTCTCGCTCAGTTACCCAGTAAACTGTACTTGCTATC

TAGCAGCTTGAGATGCATTGAGGAGCACCTCTTGCTCTACCAAACATTTATCTCAGTTCCAAGTGCATATCAAA

GCATCTACATTACTTGTTCAGAAACTAATCAGTGGCTTTGTTCTTCAAAATTTGAAATTGAGGACGCTCACTACC

GGGTACTAAATTTCATTGCTACATAGTTGGGTGAAGGAAACTTCCTGGACAGGCGTGCCCCCTATTGACGTTGC

AATTACAGTTGATGCTGATGGCGTTCGAAACCTTGTCAAGAAACTCCTTTGCAGCTCTCGACTGAAATGA

Anhang

129

6.2.4 Ergänzende Daten zum Markierungsexperiment mit 3H-iPR

Tab. 6.1 Intrazelluläre Verteilung der radioaktiv-markierten Metabolite nach in vivo Markierung mit

3H-iPR (30 nM) beim Wildtyp,

PpRH1-KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 nach 20 (oben) bzw. 25 (unten) Stunden. Während Riboside, Basen, Nukleotid-Monophosphate und Abbauprodukte unmittelbar nach Extraktion der Metabolite aus dem Gewebe per HPLC-Analyse erfaßt wurden, konnten die Nukleotid-Di- und -Triphosphate erst nach Dephosphorylierung zusammen mit den Nukleotid-Monophosphaten in Form von Ribosiden erfasst werden. Bei Nukleotid-X handelt es sich um ein nicht näher bestimmtes Nukleotid. Prozentangaben beziehen sich auf die aus dem Gewebe extrahierbare Gesamtradioaktivität.

T20 iPR

pmol/100 mg [%]

iP pmol/100 mg

[%]

iP-Nukleotide pmol/100 mg

[%]

iPRMP pmol/100 mg

[%]

iPRDP, iPRTP pmol/100 mg

[%]

Nukleotid-X pmol/100 mg

[%]

Abbauprodukte pmol/100 mg

[%]

WT 0,2 [4]

0,4 [7]

1,2 [21]

0,5 [9]

0,4 [8]

0,2 [4]

3,8 [68]

PpRH1-KO #29 0,1 [1]

0,2 [3]

1,1 [14]

0,2 [3]

0,9 [11]

0 [0]

6,5 [82]

PpRH2-KO #56 0,1 [3]

0,2 [4]

1,2 [27]

0,3 [7]

0,8 [18]

0,1 [2]

3,0 [66]

PpRH3-KO # 7 0,1 [2]

0,1 [2]

1,4 [33]

0,4 [10]

0,9 [21]

0,1 [2]

2,6 [63]

T25 iPR

pmol/100 mg [%]

iP pmol/100 mg

[%]

iP-Nukleotide pmol/100 mg

[%]

iPRMP pmol/100 mg

[%]

iPRDP, iPRTP pmol/100 mg

[%]

Nukleotid-X pmol/100 mg

[%]

Abbauprodukte pmol/100 mg

[%]

WT 0,3 [6]

0,3 [6]

1,3 [22]

0,5 [8]

0,6 [11]

0,2 [3]

3,8 [66]

PpRH1-KO #29 0,1 [1]

0,1 [2]

1,0 [14]

0,2 [3]

0,8 [11]

0 [0]

6,2 [83]

PpRH2-KO #56 0,1 [2]

0,2 [3]

1,6 [30]

0,5 [9]

1,1 [21]

0 [0]

3,3 [65]

PpRH3-KO # 7 0,2 [3]

0,1 [2]

1,6 [30]

0,6 [12]

0,8 [16]

0,1 [2]

3,4 [65]

Anhang

130

Tab. 6.2 Vergleichende Darstellung der Bilanzen der Radioaktivität während der in vivo Markierung mit

3H-iPR beim Wildtyp, PpRH1-

KO #29, PpRH2-KO #56 und PpRH3-KO #7 nach 20 (links) bzw. 25 Stunden (rechts). Angegeben sind die im Medium verbliebene Radioaktivität, die sich hieraus ergebende errechnete, intrazelluläre Radioaktivität sowie die aus dem Gewebe extrahierbare Radioaktivität.

T20 T25



[%]


[%]


[%]



[%]


[%]


[%]

WT 93 [62]

10 [7]

47 [38]

88 [60]

11 [10]

47 [40]

PpRH1-KO #29 70 [58]

14 [12]

36 [42]

60 [41]

13 [9]

34 [59]

PpRH2-KO #56 103 [68]

9 [6]

39 [32]

93 [65]

10 [7]

40 [35]

PpRH3-KO #7 99 [67]

8 [5]

41 [33]

105 [70]

9 [6]

36 [30]

Anhang

131

6.2.5 Ergänzende Daten zu den LC-MS/MS Messungen endogener Gehalte an Purinen und Pyrimidinen

Tab. 6.3 Konzentrationen endogener Purine und Pyrimidine beim Wildtyp (A.) und den Transformanten PpRH1-KO #29 (B.), PpRH2-KO #56 (C.) und PpRH3-KO #7 (D.) nach 0 und 21 Tagen Kultivierungsdauer. Daten wurden mittels LC-MS/MS Messungen erhoben, [

15N4]Inosin wurde als interner Standard zur Quantifizierung verwendet. Angegeben

sind die Mittelwerte von Messungen aus drei unabhängigen Kulturen eines Experimentes in nmol/g TG sowie die jeweilige Standardabweichung. In Einzelfällen wurden stark abweichende Werten von der Berechnung ausgeschlossen. In Kooperation mit Dr. J. Klein (Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D).

A. Wildtyp

T0

[nmol/g]

T21

[nmol/g]

Xanthosin 22,00 ±9,57 80,83 ±26,05

Xanthin 4,18 ±0,29 18,57 ±3,39

Inosin 6,93 ±2,09 10,17 ±2,17

Hypoxanthin 1,44 ±0,10 6,29 ±2,37

Desoxyinosin 0,32 ±0,13 2,83 ±0,19

Adenosin 55,41 ±13,09 37,75 ±22,71

Adenin 7,06 ±1,20 21,94 ±13,85

Desoxyadenosin 1,67 ±0,71 3,28 ±1,29

Guanosin 6,93 ±1,84 18,12 ±3,11

Desoxyguanosin 0,73 ±0,30 3,41 ±1,87

Uridin 13,97 ±1,64 30,24 ±12,52

Uracil 34,49 ±18,72 43,21 ±35,99

Desoxyuridin 0,05 ±0,02 0,73 ±0,27

Thymidin 0,74 ±0,21 3,94 ±2,14

Thymin 2,30 ±1,78 1,70 ±1,15

B. PpRH1-KO #29

T0

[nmol/g]

T21

[nmol/g]

Xanthosin 445,24 ±58,12 1364,37 ±535,21

Xanthin 1,65 ±0,82 20,68 ±0,42

Inosin 12,96 ±3,37 139,40 ±25,44

Hypoxanthin 0,60 ±0,12 14,50 ±0,60

Desoxyinosin 0,35 ±0,11 15,55 ±5,01

Adenosin 24,07 ±8,24 58,37 ±34,63

Adenin 4,26 ±2,06 59,32 ±16,82

Desoxyadenosin 0,49 ±0,33 5,59 ±1,10

Guanosin 3,98 ±1,12 31,35 ±26,14

Desoxyguanosin 0,54 ±0,29 3,68 ±2,27

Uridin 67,46 ±11,91 283,66 ±44,02

Uracil 11,00 ±1,91 101,48 ±83,43

Desoxyuridin 0,04 ±0,01 1,38 ±0,77

Thymidin 0,35 ±0,16 5,33 ±0,90

Thymin 0,98 ±0,81 4,39 ±0,54

Anhang

132

Fortsetzung Tab. 6.4 Konzentrationen endogener Purine und Pyrimidine beim Wildtyp (A.) und den Transformanten PpRH1-KO #29 (B.), PpRH2-KO #56 (C.) und PpRH3-KO #7 (D.) nach 0 und 21 Tagen Kultivierungsdauer. Daten wurden mittels LC-MS/MS Messungen erhoben, [

15N4]Inosin wurde als interner Standard zur Quantifizierung verwendet.

Angegeben sind die Mittelwerte von Messungen aus drei unabhängigen Kulturen eines Experimentes in nmol/g TG sowie die jeweilige Standardabweichung. In Einzelfällen wurden stark abweichende Werten von der Berechnung ausgeschlossen. In Kooperation mit Dr. J. Klein (Stoffwechsellabor, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin, D).

C. PpRH2-KO #56

T0

[nmol/g]

T21

[nmol/g]

Xanthosin 89,19 ±40,78 72,28 ±23,72

Xanthin 12,62 ±4,06 14,85 ±3,43

Inosin 14,46 ±4,57 7,63 ±4,53

Hypoxanthin 4,07 ±2,14 4,70 ±2,07

Desoxyinosin 1,09 ±0,22 4,34 ±0,72

Adenosin 71,47 ±5,01 54,31 ±4,93

Adenin 15,05 ±6,21 47,20 ±18,70

Desoxyadenosin 4,01 ±0,96 5,04 ±1,85

Guanosin 18,87 ±5,15 7,34 ±6,01

Desoxyguanosin 4,14 ±1,56 2,31 ±1,79

Uridin 38,14 ±5,21 90,98 ±16,54

Uracil 161,57 ±86,40 45,39 ±16,62

Desoxyuridin 0,28 ±0,27 0,52 ±0,12

Thymidin 1,58 ±0,98 3,69 ±0,98

Thymin 9,86 ±2,37 2,44 ±0,38

D. PpRH3-KO #7

T0

[nmol/g]

T21

[nmol/g]

Xanthosin 42,69 ±38,11 85,05 ±83,14

Xanthin 5,64 ±2,67 7,54 ±6,77

Inosin 5,16 ±2,69 5,84 ±4,40

Hypoxanthin 1,72 ±0,43 2,77 ±2,34

Desoxyinosin 1,86 ±1,32 7,79 ±2,01

Adenosin 92,65 ±44,09 44,55 ±1,39

Adenin 13,09 ±1,69 26,76 ±16,20

Desoxyadenosin 5,00 ±5,26 1,86 ±0,80

Guanosin 9,43 ±3,94 3,92 ±3,41

Desoxyguanosin 2,17 ±1,82 6,46 ±5,64

Uridin 12,44 ±1,83 27,89 ±7,89

Uracil 21,03 ±12,80 38,75 ±30,74

Desoxyuridin 0,20 ±0,24 0,55 ±0,28

Thymidin 0,98 ±0,55 3,17 ±1,57

Thymin 2,36 ±1,67 3,54 ±2,03

Anhang

133

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei PD Dr. Klaus von Schwartzenberg bedanken für seine

hervorragende Betreuung meiner Arbeit, für zahlreiche spannende Diskussionen, für Ratschläge,

Tipps und kreative Ideen und für viele Bastel-Stunden an der HPLC. Darüberhinaus danke ich ihm für

das mir entgegengebrachte Vertrauen, seine Zuversicht und für seinen Optimismus, die es mir in

manchen schwierigen Phasen leichter gemacht haben.

Bei Herrn Prof. Dr. Reinhard Lieberei möchte ich mich für die Übernahme des Zweitgutachtens und

für die Schaffung einer angenehmen Arbeitsatmosphäre bedanken.

Aus dem Biozentrum Klein Flottbek danke ich besonders folgenden Mitarbeitern und

Arbeitsgruppen: der Arbeitsgruppe Pflanzenschutz, insbesondere Dr. Conny Heinze und Dr. Peter

Willigmann für ihre große Hilfsbereitschaft und zahlreichen Tipps und der Arbeitsgruppe von PD

Dr. René Lorbiercke und Dr. Reinhold Brettschneider für die Möglichkeit, die Lokalisierungsstudien in

ihrem Labor durchzuführen.

Bei der gesamten Arbeitsgruppe der Nutzpflanzenbiologie möchte ich mich für die angenehme und

produktive Arbeitsatmosphäre bedanken. Vor allem Susanne Bringe und Vera Schwekendiek danke

ich für die Aufrechterhaltung des Laborbetriebes und für ihre enorme Hilfsbereitschaft. Bei Detlef

Böhm, Dr. Helmut Kassner und Thomas Thumforde bedanke ich mich für die Beantwortung all

meiner technischen Fragen. Danke, dass ihr immer ein offenes Ohr hattet.

Ann-Cathrin Lindner danke ich für viele gemeinsame Stunden im Labor, für ihr Interesse an meiner

Arbeit und zahlreichen endlosen Diskussionen über Methoden, Ergebnisse und was uns sonst noch so

beschäftigt hat. Außerdem danke ich ihr für ihr enormes Wissen rund ums Formatieren.

Dr. Hanna Richter danke ich für eine lange und schöne gemeinsame Zeit im Labor und für noch mehr

viele gute Stunden außerhalb.

Auch allen anderen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe, insbesondere Peggy Vlietland-Nowotny und

Florian Gehlhaar, danke ich für ihre Unterstützung und für viele schöne Stunden im Institut.

Die LC-MS/MS Messungen wurden in Kooperation mit Dr. Jeannette Klein (Charité Berlin)

durchgeführt. Vielen Dank für die Bereitschaft und das Interesse, Purine und Pyrimidine in Pflanzen

zu analysieren.

Dr. Martina Tylichová und Dr. David Kopečný haben mit ihrem Wissen und Können dazu beigetragen,

die biochemische Charakterisierung und Phylogenie der Ribohydrolasen voranzubringen. Danke dafür

und für die Beantwortung zahlreicher Fragen rund um Proteine.

Mit Prof. Dr. Barbara Moffatt und Katja Engel habe ich eine schöne Zeit innerhalb und außerhalb

unserer Labore verbracht. Euch danke ich für die herzliche Aufnahme in Kanada, die spannende

Kooperation und alles andere was dabei entstanden ist.

Der Appuhnstiftung, dem DAAD und der DFG danke ich für die finanzielle Förderung meiner Arbeit.

Meiner Familie und meinen Freunden bin ich für all ihre Unterstützung und Zuversicht, ihre Geduld

und ihre Ablenkungsmanöver in guten und schlechten Zeiten von ganzem Herzen dankbar.

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Identifizierung und Charakterisierung der Ribohydrolase ... · Purin-bevorzugende RH, die neben dem Hauptsubstrat Inosin auch Aktivität an Adenosin, Guanosin, Xanthosin sowie dem