Installation und Messung an einem Tag: MassTox TDM Serie A ... · steht insbesondere die patientenspezifische Pharmakokinetik im Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang dürfen Arzneimit

ChromSystemS ®

2014/2 DIALOGInstallation und Messung an einem Tag: MassTox® TDM Serie A für die LC-MS/MS Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems GmbH

Zugang zum kompletten Testmenü im Therapeutischen Drug Monitoring

Die Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen von Arzneimit-teln im Blut/Serum/Plasma sowie Urin (Therapeutisches Drug Monitoring, TDM) ist fester Bestandteil der Laboranalytik und gibt dem Arzt Anhaltspunkte für die geeignete Dosierung dieser Substanzen. Das TDM ist immer dann besonders sinnvoll, wenn Arzneistoffe nur eine geringe therapeutische Breite aufweisen, wie manche Antiepileptika, Antiarrhythmika oder bestimmte Psychopharmaka, und daher Unterversorgungen sowie Überdosierungen vermieden werden müssen. Dabei steht insbesondere die patientenspezifische Pharmakokinetik im Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang dürfen Arzneimit-telinteraktionen nicht vergessen werden, die gerade in der Geriatrie eine erhebliche Rolle spielen, da solche Patienten häufig gleichzeitig mit einer Vielzahl von Medikamenten behandelt werden müssen. Zur Quantifizierung von Arzneimitteln aus den eingangs erwähnten Matrices stehen verschiedene Techniken zur Verfügung, wobei sich auch hier die Massenspektrometrie inzwischen als „Goldstandard“ etabliert hat und von der Fachwelt als solcher anerkannt ist. In der Praxis können meistens nur wenige Medikamente bzw. Arzneistoffe mit einer Probenvorbereitung isoliert und massenspektrometrisch erfasst werden.Darüber hinaus muss gerade bei Polypharmazie, bei der eine große Anzahl von Metaboliten auftreten, mit Interferenzen gerechnet werden. Sie sind zwar bei der hochspezifischen Massenspektrometrie deutlich minimiert, vollständig aus-schließen kann man sie jedoch nicht. So kann es zu Fehl-einschätzungen der Arzneimittelkonzentrationen in der zu untersuchenden Matrix und letztlich zu Fehlbehandlungen von Patienten kommen.

Um einem pharmakotherapeutischen Gesamtkonzept gerecht zu werden, sollte eine universelle Methode für Routinemes-sungen von Wirkstoffkonzentrationen zur Verfügung stehen, die folgende Maßgaben erfüllt:

1) Die allermeisten in einem Labor zu bestimmenden Arznei-mittel müssen mit einer allgemeingültigen Probenvorbe-reitung aufgearbeitet und in der Folge mit der gleichen Methode analysiert werden können, die sich am „Gold-standard“ orientieren sollte. Aufgrund der Einhaltung gleicher Bedingungen wird das Laborpersonal maximal entlastet.

2) Die verwendete Methode muss gemäß den IVD-Richtlinien verschiedener Länder verifiziert und validiert sein. Dabei werden auch die Robustheit und Verlässlichkeit der Metho-de überprüft. Wenn möglich, sollte die Validierung extern erfolgen. Eigene Arbeiten der Kunden zur Überprüfung der Leistungsfähigkeit können somit auf ein Mindestmaß, wenn überhaupt notwendig, reduziert werden.

3) Durch Verwendung von auf Humanbasis hergestellten Mehrpunkt-Kalibratoren und -Kontrollen sowie isotopen-markierten internen Standards können die messbedingten Fehler durch interferierende Bestandteile so weit wie möglich ausgeschlossen werden [1]. Ergänzend dienen Ringversuche externer Anbieter und interne sowie externe Methodenvergleiche der Einschätzung von Genauigkeit und Präzision – wenn möglich, sollte zur Wertefestlegung und Leistungsbewertung der Methode zertifiziertes Re-ferenzmaterial verwendet werden.

4) Die Weiterentwicklung der Methodik, also die Integration weiterer neuer Parameter, muss ebenfalls gewährleistet sein. Dabei dürfen sich das Gesamtsystem und allgemein die Leistungsfähigkeit der angewendeten Methode nicht verschlechtern. Eine Betreuung der Methodik und der Technologie muss zu jedem Zeitpunkt und mit geringer Reaktionszeit erfolgen können.

Fazit

Das oben geforderte Konzept erfüllt zurzeit nur eine einzi-ge massenspektrometrische Messmethode, die weltweit in verschiedenen Privat- und Krankenhauslaboren verwendet wird und mit der 158 Medikamente verschiedener Wirkstoff-klassen gemessen werden können. Die MassTox® TDM Serie A, das Dreikomponenten-System von Chromsystems, besteht aus dem sogenannten BASIC-Kit A, der alle notwendigen Materialien und Reagenzien für die Probenvorbereitung beinhaltet wie auch die mobilen Phasen, einer einzigen analytischen Säule (MasterColumn® A) für die Chromato-graphie und schließlich den Parameter-Sets, welche die zu messenden Arzneimittel spezifizieren (Abb. 1).

Jedes Parameter-Set, von denen es 13 gibt, besteht aus Mehrpunkt-Kalibratoren, Kontrollen und internen Standards. Messtechnisch treten nur marginale Änderungen bei den unterschiedlichen Analyten auf – so muss in manchen Fäl-len das Einspritzvolumen oder der Gradient bezogen auf das spezifische Parameter-Set einmalig verändert werden und bleibt danach bestehen. Einzigartig ist auch, dass bei der Installation und Einrichtung der Methode Experten des Scientific Supportteams der wissenschaftlichen Abteilung zur Verfügung stehen, deren Erfolgsquote bezogen auf Installationen und Fehlerbehebungen nahezu bei 100 % liegt. Außerdem ist erwähnenswert, dass wir bereits be- gonnen haben, unsere erst kürzlich eingeführten Parameter-Sets weiterzuentwickeln, um Kundenwünsche zu erfüllen und die Leistungsfähigkeit der Methode weiter zu verbes-sern. Gerade erscheint eine neue Version des Parameter-Sets Neuroleptika 2, das wir zu Neuroleptika2/EXTENDED (NL2/XT) umbenannt haben, damit es zu keinen Verwechs-lungen kommen kann. Das NL2/XT-Set wurde um sechs neue Analyte auf 13 erweitert und durch die Implementierung von 9 weiteren isotopenmarkierten internen Standards auf jetzt 11

5 E-Book-Reader zu gewinnen

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Installation und Messung an einem Tag: MassTox® TDM Serie A für die LC-MS/MS

Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems GmbH

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Therapeutisches Drug Monitoring von Antiepileptika während der Schwanger-schaft

Prof. Dr. James C. Ritchie, Emory University School of Medicine, Atlanta, USA, Dr. habil. Richard Lukačin, Chromsystems GmbH

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Methylphenidat- und Ritalinsäurebe-stimmung im Serum und Speichel bei Patienten mit ADHS

Cand. med. Sophie Studer, Prof. Dr. Hans-Willi Clement, Prof. Dr. Christian Fleischhaker, Prof. Dr. Eberhard Schulz, Universitätsklinikum Freiburg, Neuropharma- kologisches Forschungslabor, Freiburg

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TDM auf einem Shimadzu 8040 LC-MS/MS: Ein Installationsbericht Assist. Prof. Željko Debeljak, Universitätsklinikum Osijek, Kroatien, Fakultät für Medizin, J. J. Strossmayer Universität Osijek, Kroatien Seite 11

Produktneuheit: MassChrom® Steroid Kit

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Aktuelles/Termine/Gewinnspiel/ Impressum

Dialog 2014/2_d_Druck.indd 1 06.11.14 11:18

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statt bisher 2 eine deutliche Erhöhung der Sicherheit für die Quantifizierung erreicht (Abb. 2). Weitere Ergänzungen und Erweiterungen der Parameter-Sets sind geplant, und zurzeit werden die Sets Antidepressiva 1 und Neuroleptika 1 um wichtige Metabolite ergänzt. In diesem Zusammenhang sind wir auch auf Informationen unserer Kunden angewiesen, die uns die Möglichkeit geben, das Konzept immer weiter

zu verfeinern. Hierzu gehört selbstverständlich auch eine Automatisierungslösung für die MassTox® TDM Serie A, die für die Parameter-Sets Antiepileptika und die Mycophenolsäure bereits verwirklicht wurde. Auf den folgenden Seiten finden Sie Berichte einiger unserer Kunden, die ihre Erfahrungen mit dem beschriebenen System näher erläutern.

Literatur

[1] Yüksekdağ N, Lukačin R. (2013) Labor: Tierisches Ausgangsmaterial ist nur zweite Wahl. Dtsch Ärztebl 110(18): A–856.

Abbildung 1: MassTox® TDM Serie A. Das System funktioniert nach dem Prinzip eines dreiteiligen Baukastens. Der BASIC-Kit A liefert alle grundlegenden Bestandteile für die Probenvorbereitung, zusätzlich mobile Phasen für die Chromatographie, die an einer analytischen Säule, der MasterColumn® A, stattfindet und die die Trennung aller 158 Analyte ermöglicht. Die 13 einzelnen Parameter-Sets komplettieren das System. Sie definieren letztendlich die zu messenden Arzneimittel durch Auswahl der spezifischen Mehrpunkt-Kalibratoren, Kontrollen und internen Standards.

Abbildung 2: Chromatogramme des Parameter-Sets Neuroleptika 2/EXTENDED. Das spezifische Set umfasst die 13 Analyte Amisulprid, Chlorprothixen, Levomepromazin, Melperon, Perazin, Pipamperon, Promethazin, Sertindol, Sulpirid, Thioridazin, Ziprasidon, Zotepin und Zuclophenthixol. Die beiden Chromatogramme zeigen beispielhaft alle 13 Analyte sowie die 11 internen Standards.

Analytische Säule:äquilibriert, mit Testchromatogramm• Mobile Phase 1

• Mobile Phase 2• Precipitation Reagent• Extraction Buffer

• Dilution Buffer 1• Dilution Buffer 2• Rinsing Solution• Reaktionsgefäße

Im BASIC-Kit A sind enthalten:

BASIC-Kit A MasterColumn®A

In jedem PARAMETER-Set enthaltene Komponenten: Multilevel Plasma Calibrator Set (3PLUS1® oder 6PLUS1®)+ MassCheck® Plasma Control, Level I und Level II+ Internal Standard

Antidepressiva 2/Psychostimulantien

TricyclischeAntidepressiva TCA 2

Antiarrhythmika Anti-HIV-Medikamente Benzodiazepine 1 Mycophenolsäure Neuroleptika 2/EXTENDED

Antidepressiva 1 Antiepileptika Antimykotika Benzodiazepine 2 Neuroleptika 1 TricyclischeAntidepressiva TCA 1

Einzelne PARAMETER-Sets

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Neuroleptika 2/EXTENDED Gruppe 1

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Neuroleptika 2/EXTENDED Gruppe 2


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Einleitung

Die Epilepsie ist weltweit die häufigste neurologische Erkran-kung, mit einer Prävalenz von ca. 0,5 % in den westlichen Ländern. Bei etwa einem Viertel aller von Epilepsie Betrof-fenen handelt es sich um Frauen im gebärfähigen Alter, wobei der Großteil der neuropsychiatrischen Erkrankungen bereits vor einer Familienplanung auftritt. In den USA gibt es jedes Jahr über 4.000.000 Entbindungen. Dabei wird angenommen, dass über 50 % dieser Geburten die Folge einer ungeplanten Schwangerschaft sind. Hieraus lässt sich ableiten, dass jährlich über 20.000 Schwangere an Epilepsie leiden, von denen die meisten Antiepileptika (Antikonvul-siva, AEDs) einnehmen, um Krampfanfälle zu vermeiden. Im Allgemeinen ist die Fruchtbarkeit von Frauen mit Epi-lepsie aufgrund eines geringeren Hypophysen- und Ova-rialhormonspiegels, eines erhöhten LH/FSHα-Spiegels bei unzureichender ovarieller Antwort und steigenden SHBGβ-Konzentrationen infolge der enzyminduzierenden Wirkung einiger AEDs eingeschränkt [1]. Paradoxerweise können einige AEDs aber die Wirkung oraler Kontrazeptiva herab-setzen und so das Risiko einer ungewollten Schwangerschaft erhöhen, da der Ethinylestradiol- und Levonorgestrelspiegel gesenkt, die Bindung an SHBG erhöht und Hyperandroge-nismus bei Frauen gesenkt werden (Tab. 1).

Medikamente sind in der Schwangerschaft generell kontrain-diziert. Dennoch können schwangere Frauen die Behandlung mit AEDs häufig wegen des erhöhten Risikos für Krampf-anfälle, Selbstverletzungen und Fehlgeburten, kognitiver Beeinträchtigung und möglichem Verlust der Fahrerlaubnis nicht absetzen. Der Status epilepticus geht mit einer 30%igen Müttersterblichkeit und einer 50%igen Fötussterblichkeit einher [2, 3]. Andererseits ist bekannt, dass bei Exposition des Fötus mit manchen älteren AEDs (z. B. Valproinsäure) das Risiko für angeborene Missbildungen erhöht ist. AEDs können darüber hinaus das Wachstum des Fötus beeinträch-tigen, zu Blutungen und verminderter Lebensfähigkeit beim Neugeborenen und zu erhöhtem Risiko von Totgeburten und Säuglingssterblichkeit sowie zu Entwicklungsverzögerungen führen. Aufgrund dieser Aspekte ist die Therapietreue bei der medikamentösen Behandlung oft nicht mehr gegeben, woraufhin vermehrt Krampfanfälle auftreten können und das Leben der Mutter gefährdet ist [4]. Daher sehen sich werdende Mütter und deren Ärzte einem klinischen Dilemma gegenüber: Bei schwangeren Frauen mit Epilepsie muss Krampfanfällen vorgebeugt werden, da diese für Mutter und Fötus ein hohes Risiko darstellen. Gleichzeitig muss die AED-Exposition des Fötus minimiert werden.Zusätzlich ist zu bedenken, dass AEDs auch für die Be-handlung einer Vielzahl weiterer Erkrankungen eingesetzt werden, darunter u. a. bei bipolarer Störung, Krebs, neu-

ropathischen Schmerzen, Angststörungen und Migräne.Junge Frauen mit solchen Erkrankungen sind im Falle einer Schwangerschaft mit ähnlichen Abwägungen konfrontiert. Bekanntermaßen kommt es in der Schwangerschaft zu vielen physiologischen Veränderungen, die das ADMEγ-Profil von Arzneimitteln verändern können. Veränderungen des Ge-samtkörperwasser- und extrazellulären Flüssigkeitsvolumens können zu einer veränderten Arzneimittelverteilung führen. Außerdem kann eine verminderte Serumalbuminkonzent-ration in der Schwangerschaft Veränderungen der freien Arzneimittelkonzentrationen und eine erhöhte hepatische Extraktion verursachen. Das in der Schwangerschaft erhöhte Herzminutenvolumen kann den hepatischen Blutfluss erhöhen und so zu einer verstärkten Arzneimittelausscheidung führen. Darüber hinaus kann die gesteigerte Nierendurchblutung eine höhere glomeruläre Filtrationsrate und somit eine verstärkte Ausscheidung des unveränderten Arzneimittels über die Nieren nach sich ziehen. Auch kann sich in der Schwangerschaft die Aktivität von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) verändern, was die systemische Absorption und/oder die hepatische Aus-scheidung von Arzneimitteln um bis zu 50 % verändern kann. In kürzlich durchgeführten klinischen Studien hat sich in der Tat gezeigt, dass physiologische Veränderungen im Verlauf der Schwangerschaft zu einer veränderten Pharmakokinetik (insbesondere zu einer veränderten Clearance) von AEDs führen können; u.a. mit einer von Patient zu Patient hohen individuellen Varianz. Hierdurch lässt sich die angemessene Arzneimitteldosis während der Schwangerschaft recht schwie-rig prognostizieren (Abb. 1) [5]. Aus allen oben genannten Gründen sollte die Überwachung von AEDs bei der Behand-lung von Patientinnen, die solche Medikamente einnehmen müssen und schwanger werden, eine wichtige Rolle spielen. Hier beschreiben wir die Analyse eines breiten Spektrums an AEDs bei zwei Gruppen schwangerer Frauen (Frauen mit Epilepsie und Frauen mit bipolarer Störung) anhand des modularen Systems der MassTox® TDM Serie A von Chromsystems [6].

Methodik

Im Verlauf der Schwangerschaft wurde einmal pro Monat bei beiden Gruppen der AED-Serumspiegel bestimmt. Dazu wurde der kommerziell erhältliche Kit (MassTox® TDM Serie A)

von Chromsystems verwendet. Mit diesem Assay-System ist es möglich, mit einem einzigen Set an internen Standards und einem gemeinsamen Extraktionsprotokoll 26 verschie-dene AEDs mittels LC-MS/MS zu bestimmen. Der Assay wurde sowohl auf einem Waters TQD als auch einem AB Sciex 4000 Q Trap LC-MS/MS installiert. Die Methode ist gekennzeichnet durch eine 4-Punkt-Kalibrierungskurve für jeden Analyten sowie zwei Massenübergänge für jedes Arzneimittel (bis auf 2 Ausnahmen). Es sind 18 stabil mar-kierte interne Standards und drei Gradientenprotokolle mit einer Laufzeit von je 3,5 Minuten vorhanden. Basierend auf ihren chromatographischen Eigenschaften und Ionisie-rungscharakteristika werden die Arzneimittel in fünf verschie-dene Gruppen unterteilt (Abb. 2). Für alle Verbindungen werden 50 µl Probe verwendet sowie ein gemeinsames Extraktionsverfahren und gemeinsame mobile Phasen. Darüber hinaus wurde ein Assay-Vergleich mit fünf kom-merziell erhältlichen Immunassays durchgeführt (Abb. 3). Zuletzt wurden für jedes Arzneimittel die Dosis/Plasma-Konzentrationskurve bestimmt und die apparente und die relative Clearance berechnet. Beispiele für Lamotrigin und Topiramat finden sich in Abbildung 4. Ergebnisse

Die Zuverlässigkeit der LC-MS/MS-Methode von Chrom-systems wurde in unserem Labor untersucht (Tab. 2). Dabei war es nicht möglich, Proben für alle AEDs zu gewinnen, da einige in unserer Klinik in der Regel nicht verschrieben werden oder keine vergleichbaren Assays kommerziell erhältlich wa-ren. Bei allen überprüften Verbindungen befanden sich die Intra- und Inter-Assay-Varianz innerhalb eines akzeptablen Bereichs. Abbildung 3 zeigt den Vergleich der Ergebnisse des LC-MS/MS-Assays für Levetiracetam, Lamotrigin, 10-OH-Carbazepin, Topiramat und Lacosamid mit denen unseres Referenzlabors, das verschiedene kommerzielle Immunassays verwendet. Die Korrelationskoeffizienten (R2) lagen in einem für uns akzeptablen Bereich, und keiner der Werte lag unter 0,8. Es gab einige konstante Abweichungen beim Vergleich der Messwerte für 10-OH-Carbazepin und Topiramat, was aller Wahrscheinlichkeit nach auf Unterschiede bei der Standardisierung der jeweiligen Assays zurückzuführen ist. Die Dosis (mg/Tag)/Serum-Konzentrationskurven für Lamo-

Therapeutisches Drug Monitoring von Antiepileptika während der SchwangerschaftProf. Dr. James C. Ritchie1, Dr. habil. Richard Lukačin2 1Emory University School of Medicine, Department of Pathology & Laboratory Medicine, Atlanta, USA; 2Chromsystems GmbH

Abbildung 1: Mütterliche apparente Clearance von Lamotrigin in der Schwangerschaft. Die Daten zeigen eine progressive Steigerung der Lamotrigin-Clearance im Verlauf der Schwangerschaft, wobei bei einem Gestationsalter von 32 Wochen eine Spitze von über 330 % über der Baseline-Clearance erreicht wird. Die Clearance nimmt sodann wieder ab und kehrt nach der Entbindung rapide zu den Basiswerten vor der Empfängnis zurück [5].

0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10

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mg/

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Schwangerschaft –––––––––– Wochen –––––––––– Nach der Geburt

Erniedrigt den Hormon- spiegel• Phenobarbital • Phenytoin • Carbamazepin • Primidon • Topiramat (> 200 mg) • Oxcarbazepin (> 1200 mg)

AED-Effekte bei hormonellen Kontrazeptiva

Keine signifikanten Effekte• Ethosuximid • Gabapentin • Valproat • Lamotrigin • Levetiracetam • Zonisamid

Tabelle 1: Mehrere AEDs beeinflussen die Wirkung hormoneller Kontrazeptiva.


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Abkürzungen αLH = luteinisierendes HormonFSH = follikelstimulierendes HormonβSHBG = Sex hormone-binding globulin: ein Glycoprotein, das an Androgen und Östrogen bindetγADME = Absorption, Distribution, Metabolismus und ExkretionδUGT1A4 = ist ein Isozym der UDP-Glucuronosyltransferase-1-Familie, Polypeptid A4

trigin und Topiramat scheinen trotz interindividueller Un-terschiede einigermaßen linear zu sein (Abb. 4). Darüber hinaus zeigt Abbildung 4 die Kurven der relativen Clearance dieser beiden Verbindungen je nach Schwangerschaftswo-che. Deutlich wird, dass bei manchen Personen die relative Clearance von Lamotrigin ab ca. der 25. Gestationswoche anzusteigen beginnt und kurz nach der Entbindung den Höchstwert erreicht. Neueste Untersuchungen zeigen, dass in der Schwangerschaft bei ca. 28 % der Frauen nur eine geringfügige oder gar keine Veränderung der Clearance von Lamotrigin erfolgt [7]. Bei der Mehrzahl der Frauen kann es in der Schwangerschaft jedoch zu einer Erhöhung der Clearance von bis zu 234 % kommen. Die Autoren gehen davon aus, dass genotypische Unterschiede in der Aktivität oder Induktion von UGT1A4δ die variierenden Grade einer erhöhten Clearance bei den beiden Populationen teilweise erklären könnten. Obgleich bei Topiramat eine geringere Anzahl an Probanden zur Verfügung stand, scheint auch hier die relative Clearance im zweiten und dritten Trimester anzusteigen. Dieser Befund bestätigt den von Westin et al. [8]. Die norwegischen Forscher stellten unter Einsatz eines kommerziellen Immunassays einen erheblichen Rückgang

der dosiskorrigierten Topiramat-Serumkonzentrationen im Verlauf der Schwangerschaft fest. Schlussfolgerungen

Dieses Projekt stützt sich auf frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer Forscher und zeigt, dass schwangere Frauen im Hinblick auf die therapeutische Medikamentenüberwachung eine besondere Population darstellen. Es wird deutlich, dass Veränderungen der Clearance während der Schwangerschaft in Bezug auf AEDs zu subtherapeutischen Plasmaspiegeln führen können. Ferner hat das Interesse an AEDs seitens der Pharmaindustrie in der letzten Zeit stark zugenommen, und die Zahl solcher Arzneimittel steigt rapide an. Daher eignet sich ein Multiplex-Assay wie das modulare System der MassTox® TDM Serie A von Chromsystems bestens für eine zuverlässige und rasche Bestimmung dieser wichtigen therapeutischen Wirkstoffe.

Zuverlässigkeit

Konzentration (µg/ml) Intra-Assay (% Vk) Inter-Assay (% Vk)

Gruppe 1

Carbamazepin 3,20 2,50 4,00

Carbamazepin-10,11-Epoxid 0,95 4,50 7,20

Carbamazepin-diol 1,10 6,90 8,30

10-OH-Carbamazepin 8,25 4,00 7,50

Oxcarbazepin 0,30 6,25 15,10

Gruppe 2

Lacosamid 1,98 7,20 11,00

Lamotrigin 3,05 3,10 6,80

Levetiracetam 16,00 3,60 6,65

Gruppe 3

Gabapentin 4,30 2,52 5,20

Topiramat 3,28 4,60 6,85

Gruppe 5

Zonisamid 9,30 2,50 5,10

Tabelle 2: Intra- und Inter-Assay. Zuverlässigkeit des AED-Assays von Chromsystems. Arzneimittel der Gruppe 4 des MassTox® TDM Parameter-Sets Antiepileptika wurden nicht untersucht.

Abbildung 2: Das spezifische Parameter-Set für AEDs der MassTox® TDM Serie A um-fasst 26 Arzneimittel in fünf Gruppen. Die Chromatogramme zeigen die Peaks für jeden Analyt sowie die 18 internen Standards.

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Epilepsie, ein komplexes Ungleichgewicht im GehirnEpilepsie ist ein Sammelbegriff für Funktionsstörungen im Gehirn mit anfallsweise erscheinenden Spontanentladungen zentraler Nervenzellen [1] und ist eine der häufigsten neu-rologischen Erkrankungen. Neben Diabetes mellitus oder Rheuma gehört diese chronische Erkrankung des ZNS zu den Volkskrankheiten und tritt in jeder menschlichen Popu-lation und jeder Altersgruppe auf. Weltweit leidet etwa 1 % der Gesamtbevölkerung an Epilepsie. Dabei wird geschätzt, dass pro Jahr 2,4 Mio. neue Fälle hinzukommen [2].Speziesübergreifend ist die Epilepsie auch bei Hunden, Kat-zen und weiteren Säugetieren beschrieben. Die Gründe für die Erkrankung sind vielfältig und bisher nicht gut verstan-den. Es sind sowohl genetische Ursachen beschrieben wie auch unfallbedingte Hirnschäden, die trotz äußerer Heilung epileptische Krämpfe nach sich ziehen können.Unabhängig von der tatsächlichen Ursache kann ein be-stehendes Ungleichgewicht zwischen neuronaler Erregung und Hemmung im Gehirn zu einer der mannigfaltigen For-men von Epilepsie führen. Allgemein wird die Krankheit als ein dysfunktionales Zusammenspiel zwischen neuronaler Membran und den Neurotransmittern, die für die Signal-übertragung verantwortlich sind, gesehen. Verschiedene Prozesse im Nervensystem können vom „Normalen“ ab-weichen und damit beispielsweise die neuronalen Ionen-kanäle oder die Konzentrationen von endogenen Trans-

mittern und Modulatoren beeinflussen. Die Ausbreitung wie auch die Dauer der Erregung können nicht mehr kontrolliert werden und machen sich meist als exzessive Entladung und damit als epileptischer Anfall bemerkbar. Um den Über-schuss an elektrischer Aktivität im Gehirn zu dämmen bzw. zu vermeiden, werden mittlerweile verschiedene Medika-mente verschrieben, die für die unterschiedlichen Formen der Epilepsie eingesetzt werden und so vielen Patienten ei-nen normalen Alltag ermöglichen. Dabei werden zum einen Medikamente eingesetzt, die Ionenkanäle blockieren, um so die Neuronen am Abfeuern hochfrequenter Aktionspotentia-le zu unterbinden. Andere Medikamente dagegen hemmen z. B. die γ-Aminobuttersäure-(GABA-)Rezeptoren, indem sie die Öffnungsfrequenz der Kanäle erhöhen. Dies bewirkt eine Hyperpolarisation der neuronalen Rezeptoren, wodurch die Erregung der postsynaptischen Zellen gehemmt wird. Eine Monotherapie versagt jedoch bei mindestens einem Drittel der Patienten, was die Anwendung von einem oder mehre-ren zusätzlichen Therapeutika erforderlich macht. Dies gilt vor allem für schwere und besonders ausgeprägte Formen der Epilepsie sowie bei Kindern.

Literatur[1] http://www.gesundheit.de/lexika/medizin-lexikon/epilepsia [2] http://www.who.int/mental_health/neurology/epilepsy/en/


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Literatur [1] Kaplan PW. (2004) Reproductive health effects and teratogenicity of antiepileptic drugs. Neurology 63(10 Suppl 4): S13–23. [2] Teramo K, Hiilesmaa V, Bardy A, Saarikoski S. (1979) Fetal heart rate during a maternal grand mal epileptic seizure. J Perinat Med 7(1): 3–6. [3] Vajda FJ, O‘brien TJ, Hitchcock A, Graham J, Cook M, Lander C, Eadie MJ. (2004) Critical relationship between sodium valproate dose and human teratogenicity: results of the Australian register of anti-epileptic drugs in pregnancy. J Clin Neurosci 11(8): 854–8. [4] Barrett C, Richens A. (2003) Epilepsy and pregnancy: Report of an epilepsy research foundation workshop. Epilepsy Res 52(3): 147–87. [5] Pennell PB, Newport DJ, Stowe ZN, Helmers SL, Montgomery JQ, Henry TR. (2004) The impact of pregnancy and childbirth on the metabolism of lamotrigine. Neurology 62(2): 292–5. Erratum in: Neurology 2010, 74(24): 2028. [6] Chromsystems Instruction Manual. (2013) MassTox® TDM Series A Modular System. [7] Polepally AR, Pennell PB, Brundage RC, Stowe ZN, Newport DJ, Viguera AC, Ritchie JC, Birnbaum AK. (2014) Model-based lamotrigine clearance changes during pregnancy: clinical implication. Ann Clin Transl Neurol 1(2): 99–106. [8] Westin AA, Nakken KO, Johannessen SI, Reimers A, Lillestølen KM, Brodtkorb E. (2009) Serum con- centration/dose ratio of topiramate during pregnancy. Epilepsia 50(3): 480–5.

Abbildung 3: Assay-Vergleiche. Regressionsanalyse von fünf AEDs zum Vergleich der von einem Referenzlabor durchgeführten kommerziellen Immunassays mit der von Emory-Laboratorium durchgeführten Methode von Chromsystems. Die Korrelations-koeffizienten (R2) lagen in einem akzeptablen Bereich. Für 10-OH-Carbazepin und Topiramat wurden konstante Abweichungen der Messergebnisse festgestellt, was höchstwahrscheinlich auf Unterschiede bei der Assay-Standardisierung zurückzuführen war.

y = 0,8779x + 1,2942R² = 0,9813

0

5

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0 5 10 15 20

Lacosamid

y = 1,0495x + 0,8619R² = 0,8182

5

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20

25

Topiramat

0 10 20 30 40 50 600

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50

60y = 1,1265x + 0,3817

R² = 0,9523

10-OH-Carbazepin

y = 1,0612x + 0,4766R² = 0,9479

0

5

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15

20

0 5 10 15 20

Lamotrigin

y = 0,9724x + 1,0297R² = 0,9901

0

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60

70

0 10 20 30 40 50 60 70

Levetiracetam

y = 0,0121x + 1,4448R² = 0,2124

0

10

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30

40

0 500 1000 1500

Lamotrigin

y = 0,0341x + 2,1317R² = 0,5651

0,0

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0 200 400 600 800 1000

Topiramat

y = 0,0679x 2 + 0,2381x + 1,1512R² = 0,0479

0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0

0 1 2 3 4 5

Topiramat-Clearance

y = 0,1007x + 2,9226R² = 0,0505

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Lamotrigin-Clearance

Abbildung 4: Veränderungen der Clearance von Lamotrigin und Topiramat während der Schwangerschaft. Die Dosis/Plasma-Konzentrationen sind trotz interindividu-eller Unterschiede einigermaßen linear. Die relative Clearance von Lamotrigin steigt bei manchen Personen ab ca. Woche 25 an und erreicht kurz nach der Entbindung den Höchstwert.

Dosis (mg/Tag)

Referenzlabor (µg/ml) Referenzlabor (µg/ml)

Referenzlabor (µg/ml)Referenzlabor (µg/ml) Referenzlabor (µg/ml)

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Schwangerschaftswochen Trimester

Dosis (mg/Tag)


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Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS)

Was haben der Zappelphilipp und Hans-Guck-in-die-Luft gemeinsam mit Alexander dem Großen, Winston Chur-chill oder Benjamin Franklin? Bei allen würde heutzutage eine Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) diagnostiziert werden [1]. Erste Hinweise auf Verhaltensauffäl-ligkeiten im Kindesalter stammen aus der Mitte des 19. Jahr-hunderts. Eindeutige Beschreibungen des Krankheitsbildes finden sich allerdings erst um 1902 in den Aufzeichnungen des englischen Kinderarztes George Still. Als Merkmale erwähnt er extreme motorische Unruhe und die „abnorme Unfähigkeit die Aufmerksamkeit aufrecht zu erhalten“, was zu Leistungsversagen in der Schule führe. 1932 beschreiben die beiden Nervenärzte der Charité Berlin, Kramer und Pollnow, die Symptome des von ihnen als „hyperkinetische Erkrankung“ bezeichneten Leidens unter anderem mit der Unfähigkeit des Abschätzens von Gefahren, des Befolgens von Regeln, der Kontrolle von Impulsen und des planerischen Handelns [2]. Hinzu kommen eine leichte Ablenkbarkeit und motorische Hyperaktivität. Damit beschrieben sie erstmals in deutscher Sprache die noch heute geltenden ADHS-Leitsymptome Hyperaktivität, Unaufmerksamkeit und Im-pulskontrollstörung. Um diese Eigenschaften standardisiert bewerten zu können, entwickelte Conners Ende der 60er- Jahre Eltern- und Lehrerfragebögen, die nach wie vor der Erhebung hyperaktiver Symptome dienen [3].Eine Vielzahl neurophysiologischer und neuropsychologischer Forschungsergebnisse zur Ätiologie und Pathogenese der ADHS sind bis heute publiziert worden. Allerdings beschrän-ken sich die meisten wissenschaftlichen Abhandlungen lediglich auf Erklärungsversuche zum Ursprung und Verlauf der geschilderten Erkrankung. Diese Hyperaktivitätssympto-matik wird vielmehr als Zusammenspiel bereits bei Geburt vorliegender morphologischer Veränderungen und extern auf den Organismus einwirkender Faktoren gewertet. Methylphenidat (Ritalin®)

Heutzutage stellen Stimulantien wie Ritalin® in Kombination mit einer Psychotherapie und Psychoedukation das Mittel der

Wahl bei der Behandlung hyperkinetischer Störungen dar. Eine Pharmakotherapie ist bei gesicherter Diagnose immer dann indiziert, wenn die ADHS-Symptomatik ausgeprägt und situationsübergreifend auftritt und es an der Wirksamkeit bzw. Umsetzbarkeit der psychoedukativen und verhaltensthera-peutischen Maßnahmen mangelt. Auch dürfen keine Kontra-indikationen für die jeweiligen Psychostimulantien vorliegen. Methylphenidat (MPH) ist eines der am besten erforschten pädiatrischen Psychopharmaka mit einer langen klinischen Erfahrungszeit und verbessert nachweislich die Kernsympto-matik der ADHS [4]. Dennoch ist „die Pille für den Störenfried“ eines der am meisten kritisierten und kontrovers diskutierten Präparate in der Pharmakologie. Einen häufig erörterten Punkt stellt das mögliche Suchtpotential von Ritalin® dar, weshalb dieses Medikament auch dem Betäubungsmittelgesetz un-terliegt. Doch gilt es hier zu differenzieren zwischen oralem Konsum in therapeutischer Dosis und dem „Schnupfen“ oder

der intravenösen Anwendung in übermäßigen Mengen, welche zu suchterzeugenden Zuständen wie Euphorie und Halluzinationen führen können. Die Geschichte des Ritalin® beginnt in der Schweizer Firma Ciba, wo die Synthese des Psychostimulans erfolgreich durchgeführt und die Wirksamkeit der Substanz im Selbst-versuch bestätigt wurde. Nach Einnahme des Wirkstoffs durch Leandro Panizzons Ehefrau Marguerite („Rita“) machte diese deutliche Fortschritte. Nach ihr ist das heute wohl be-kannteste MPH Ritalin® benannt. Die Firma Ciba brachte es 1954, zehn Jahre nach seiner Entwicklung, zur Behandlung von Psychosen, chronischer Müdigkeit und Lethargie auf den Markt [5]. Kurze Zeit später konnten mit zahlreichen Studienergebnissen Metaanalysen erstellt werden. Es zeigte sich bei etwa 75 % aller behandelten Kinder mit ADHS eine deutliche Symptomlinderung. Dabei nahm neben der

Methylphenidat- und Ritalinsäurebestimmung im Serum und Speichel bei Patienten mit ADHSCand. med. Sophie Studer, Prof. Dr. Hans-Willi Clement, Prof. Dr. Christian Fleischhaker, Prof. Dr. Eberhard Schulz Universitätsklinikum Freiburg, Klinik für Psychiatrie, Psychotherapie und Psychosomatik im Kindes- und Jugendalter Neuropharmakologisches Forschungslabor, Freiburg

Abbildung 1a: Strukturformeln von Methylphenidat [2-Phenyl-2-(2-piperidyl)essigsäure-methylester],Ritalinsäure [2-Phenyl-2-(2-piperidyl)essigsäure] und (R)-Amphetamin.

(R)-Amphetamin

NH2

H CH3

Ritalinsäure

OH

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NH

Methylphenidat

(2S,2‘R)-Methylphenidat

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2 OCH3

ONHH

H

(2S,2‘S)-Methylphenidat

2'

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O NHH

H

(2R,2‘R)-Methylphenidat

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NH

(2R,2‘S)-Methylphenidat

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2OCH3

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H

Abbildung 1b: Methylphenidat besitzt zwei chirale Zentren (C2, C2‘). Daraus ergibt sich die Möglichkeit zur Bildung von vier Konfigurationsisomeren.


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Verminderung von Hyperaktivität und Impulsivität in der genannten Gruppe die Fähigkeit zur Konzentration und Aufmerksamkeit erheblich zu, was sich unter anderem in verbesserten Schulleistungen äußerte [6–8]. Struktur und Metabolismus von Methylphenidat

MPH leitet sich von Amphetamin ab. Dabei stellt das Phe-nylethylaminskelett die Grundstruktur des Methylphenidats dar (Abb. 1a). Beide Substanzen weisen keine Hydroxyl-gruppen am Phenylring auf, sodass deren Diffusion in das Zentralnervensystem erleichtert ist. Das MPH weist zwei chirale (Asymmetrie-)Zentren auf, folglich gibt es vier Kon-figurationsisomere (Abb. 1b). In der Praxis finden bei der Behandlung von ADHS lediglich die beiden D- und L-threo-Formen Verwendung. In den USA und der Schweiz ist das reine D-threo-Isomer Dexmethylphenidat (Focalin®), das als die hauptsächlich pharmakologisch aktive Form gilt, zuge-lassen. Im Vergleich dazu besteht das ursprüngliche Ritalin aus einem Enantiomergemisch der D- und L-threo-Formen. MPH wird stets in der protonierten Form als Hydrochlorid-Salz produziert [5]. Die orale Bioverfügbarkeit von MPH beträgt ca. 30 % (D-Enantiomer > L-Enantiomer), wobei Nahrungsmittel keinen relevanten Einfluss auf die Resorption haben. Die üblichen Präparate erreichen ihre maximalen Plasmaspiegel innerhalb von 1,5–2 Stunden. Die Wirkung zeigt sich bereits nach 15–30 Minuten und erreicht nach 2–3 Stunden ihren Höhepunkt. Im Gegensatz dazu haben Retardpräparate wie beispielsweise Concerta® eine wesent-lich längere Wirkdauer, die bei 10–12 Stunden liegen kann.MPH wird renal durch die Carboxylesterase CES1A1 schnell zur pharmakologisch inaktiven Phenyl-2-piperidinessigsäure (Ritalinsäure, RA) abgebaut. Die maximalen Plasmaspie-gel des Metaboliten sind 30–50 Mal höher als die des ursprünglichen Medikaments, und die Halbwertszeit ist etwa doppelt so lang. Da die RA aber nur geringe oder gar keine pharmakodynamische Aktivität besitzt, ist dieser Sachverhalt von untergeordneter Bedeutung.

Therapeutisches Drug Monitoring für Ritalin bei Kindern Zur Kontrolle der Pharmakotherapie mittels Spiegelbestim-mung sind Blutentnahmen bisher unvermeidbar, jedoch stellen invasive Verfahren besonders für Kinder eine Com-pliancehürde dar. Deshalb wäre es zur Gewährleistung einer hohen Arzneimittelsicherheit sinnvoll, alternative Körperflüssigkeiten für das TDM einsetzen zu können. Speichel gewinnt dabei immer mehr an Bedeutung und wird bereits routinemäßig in der Immun- und Infektionsdi-agnostik, dem Medikamenten- bzw. Drogenscreening und der Hormonspiegelbestimmung von Cortisol untersucht [9]. Die Speicheldiagnostik von MPH und RA mittels LC-MS/MS gelang bereits der Arbeitsgruppe um Marchei et al. [10]. Hierbei konnten in weiterführenden Untersuchungen nahezu parallele Zeitverläufe für die Konzentration von MPH und RA sowohl im Serum als auch im Speichel gezeigt werden [11].

Diese Tatsachen und die Verfügbarkeit des MassTox® TDMSerie A Kit von Chromsystems, das die Bestimmung des Psycho-stimulans Methylphenidat und seiner Metaboliten aus Serum/Plasma erlaubt, waren der Ausgangspunkt zur Überprüfung der LC-MS/MS-Methode von Chromsystems auf ihre mögli-che Verwendbarkeit zur Bestimmung der Analyte im Speichel. Dabei wurden die Serum- und Speichelproben von 19 ADHS-Patienten (neun Kinder, eine Jugendliche und neun Erwachsene), die MPH einnahmen, gesammelt und un-tersucht. Die Studienteilnehmer nahmen überwiegend langwirkende Retardpräparate wie Medikinet retard® oder Ritalin LA® ein. Dabei schwankte die tägliche Ein-nahmedosis zwischen 5 und 60 mg MPH, dies entspricht einer Dosierung von 0,11 bis 1,43 mg MPH pro Kilo-gramm Körpergewicht. Zur Serumgewinnung erfolgte die Blutentnahme mittels einer Serum-Monovette im Rahmen der Routine-Kontrollbestimmungen unter MPH-Therapie, möglichst zwei Stunden nach Medikamenteneinnahme. Parallel dazu wurde der Speichel der Patienten über das Salivette-System gewonnen. Dabei kauten die Probanden während der Blutentnahme für etwa 2–5 Minuten auf einer Watterolle. Anschließend wurden die Proben sofort zentrifugiert, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockge-froren, um den Abbau der zu untersuchenden Substanzen zu vermeiden. Material und Methoden

Reagenzienkit für die LC-MS/MS-Analytik: MassTox® TDM Antidepressiva 2/Psychostimulantien (Atomoxetin, Methyl-phenidat, Mianserin, Reboxetin, Ritalinsäure, Trazodon; Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH), Methyl-phenidate hydrochloride C-II (Sigma-Aldrich), Speichel (IBL-Hamburg). Die Serum- und Speichelproben wurden nach kurzer Zwi-schenlagerung bei -80 °C mit dem Reagenzienkit zur LC-MS/MS-Analytik für Antidepressiva 2/Psychostimulantien nach Anleitung des Herstellers aufgearbeitet (Tab. 1). Kali- bratoren und Kontrollmaterialien für die Bestimmung von MPH aus Serum/Plasma waren ebenfalls von Chromsystems.

Zur Herstellung von MPH-Standardreihen im Speichel wurde Speichel der Firma IBL-Hamburg mit MPH Hydrochlorid von Sigma-Aldrich gespiked.Nach Probenvorbereitung wurden die dabei gewonnenen Eluate chromatographisch an einer analytischen Säule bei ei-ner Flussrate von 0,6 ml/min aufgetrennt (MasterColumn® A, Chromsystems) und anschließend im Massenspektrometer (Thermo TSQ Quantum Ultra) nach Masse- zu Ladungsver-hältnis quantifiziert (Abb. 2). Der Test von Chromsystems ist zur Bestimmung der Psychosti-mulantien aus Serum und Plasma zugelassen. Abbildung 3a zeigt das Chromatogramm eines Patienten, der Medikinet adult® mit einer Dosierung von 30 mg pro Tag eingenom-men hatte. Die Bestimmung des Serumspiegels ergab einen Wert von 5,5 ng/ml für MPH und 195 ng/ml für RA. Wie aus Literaturangaben nicht anders zu erwarten war, lagen die Werte für MHP-Bestimmungen aus Speichel deutlich höher – hier Faktor 4, wohingegen wesentlich geringere Werte für RA bestimmt wurden (Abb. 3b) [12]. Eine umfangreiche Verifizierung für die Bestimmung von MPH und seines Säuremetaboliten steht noch aus. Allerdings wurden bereits erste Versuche zur Varianz innerhalb eines vorläufigen Inter-Assays durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengefasst.Die für Speichel gemessenen Werte waren lediglich gering- fügig ungenauer als die für MPH im Serum ebenfalls mit dem Rea- genzienkit MassTox® TDM PARAMETER-Set Antidepressiva 2/ Psychostimulantien ermittelten Werte.

Fazit

Für die Durchführung einer nebenwirkungsarmen und effek-tiven Pharmakotherapie ist die Etablierung wenig invasiver TDM-Methoden notwendig. Dies gilt vor allem für sensible Patientengruppen wie Kinder und Jugendliche, die im Ver-gleich zu Erwachsenen deutlich unterschiedliche pharma-kokinetische Charakteristika aufweisen, was eine strengere Überwachung der Compliance indiziert [13]. Ähnliche Verhältnisse in Bezug auf veränderte metabolische Eigenschaften finden sich auch bei Patienten mit Leber- oder Niereninsuffizienz wieder, und auch diese würden von einer weniger invasiven und schmerzhaften Probenentnahme profitieren.Zusammenfassend eignet sich der MassTox® TDM PARAMETER- Set Antidepressiva 2/Psychostimulantien im Serum/Plasma für LC-MS/MS von Chromsystems methodisch und analy-tisch zur Bestimmung von MPH und seinem Metaboliten RA sowohl im Serum/Plasma als auch im Speichel mittels LC-MS/MS und ermöglicht somit eine deutlich vereinfachte Form der Arzneimittelüberwachung bei dieser speziellen Pharmakotherapie.

> Rekonstitution des Internal Standard Mix > Zugabe von 800 µl Internal Standard Mix zu 12 ml Precipitation Reagent (= Mixture A). > 50 µl Probe/Kalibrator/MassCheck® Kontrolle in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß geben. > 25 µl Extraction Buffer dazupipettieren. > Kurz mischen und 2 min bei RT inkubieren (nicht zentrifugieren). > 250 µl der Mixture A dazugeben, mindestens 30 s mischen (vortexen). > 5 min bei 15000 x g zentrifugieren. > Überstand mit Dilution Buffer je nach Geräteemp- findlichkeit verdünnen.

Tabelle 1: Probenaufarbeitung.

Abbildung 2: Beispiel-Chromatogramm einer LC-MS/MS-Messung. Die Eluate wurden mit dem MassTox® TDM Serie A PARAMETER-Set Antidepressiva 2/Psychostimulantien im Serum/Plasma gewonnen. MPH eluiert bei einer Retentionszeit von etwa 1,25 min und RA bei etwa 1,15 min.

Tabelle 2: Speichel wurde mit 25, 30 und 40 ng/ml MPH gespiked. Folgende Werte wurden dabei im Intra-Assay ermittelt.

Soll (ng/ml)

MW (n = 10)

STABW Vk (%)

25 25,4 1,2 4,89

30 30,0 1,7 5,69

40 40,8 2,5 6,08


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Serum-Methylphenidat, 5,50 µg/l3A

Serum-Ritalinsäure, 195 µg/l

Abbildung 3: (A) Chromatogramm einer Serum-Probe eines Patienten unter Methylphenidat-Medikation. (B) Chromatogramm einer Speichel-Probe des gleichen Patienten.

0,4 0,6 2,2 2,40

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3BSpeichel-Methylphenidat, 19,9 µg/l Speichel-Ritalinsäure, 5,68 µg/l

Literatur

[1] Krause J, Krause KH. ADHS im Erwachsenenalter. Die Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstörung bei Erwachsenen. 3. Aufl, Schattauer Verlag Stuttgart (2009). [2] Kramer F, Pollnow H. (1932) Über eine hyperkinetische Erkrankung im Kindesalter. Monatsschrift für Psychiatrie und Neurologie 82(1–2): 1–40. [3] Steinhausen HC. Der Verlauf hyperkinetischer Störungen. In: Steinhausen HC (Hrsg). Hyperkinetische Störungen im Kindes- und Jugendalter. Kohlhammer Verlag Stuttgart (1995). [4] Riederer P, Batra A. Neuro-Psychopharmaka. Ein Therapie-Handbuch. 2. neu bear- beitete Aufl, Springer Verlag Berlin, Heidelberg (2006). [5] Kappeler T. (2007) Methylphenidat: Basics für die Apotheke. pharmaJournal 10: 4–7. [6] Kavale K. (1982) The efficacy of stimulant drug treatment for hyperactivity: a meta- analysis. J Learn Disabil 15(5): 280–9. [7] Schachter HM, Pham B, King J, Langford S. (2001) How efficacious and safe is short- acting methylphenidate for the treatment of attention-deficit. CMAJ 165(11): 1475–88. [8] Spencer T, Biederman J, Wilens T, Harding M, O‘Donnell D. (1996) Pharmacotherapy of attention-deficit hyperactivity disorder across the life cycle. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry 35(4): 409–32. [9] Chiappin S, Antonelli G, Gatti R, De Palo EF. (2007) Saliva specimen: A new laboratory tool for diagnostic and basic investigation. Clin Chim Acta 383(1–2): 30–40. [10] Marchei E, Farrè M, Pellegrini M, Rossi S, García-Algar Ó, Vall O, Pichini S. (2009) Liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry determination of methylphenidate and ritalinic acid in conventional and non-conventional biological matrices. J Pharm Biomed Anal 49(2): 434–9.

[11] Marchei E, Farrè M, Garcia-Algar O, Pardo R, Pellegrini M. (2010a) Correlation between methylphenidate and ritalinic acid concentrations in oral fluid and plasma. Clin Chem 56(4): 585–92. [12] Marchei E, Farrè M, Pellegrini M, Rossi S, García-Algar Ó, Vall O, Pacifici R, Pichini S. (2010b) Pharmacokinetics of methylphenidate in oral fluid and sweat of a pediatric subject. Forensic Sci Int 196(1–3): 59–63. [13] van den Anker JN, Schwab M, Kearns GL. (2011) Developmental pharmacokinetics. Handbook of experimental pharmacology 205: 51–75.

Erweitertes Parameter-Set für die Bestimmung von Neuroleptika

Chromsystems hat das PARAMETER-Set Neuroleptika 2 der MassTox® TDM Serie A erweitert. Ab sofort sind nahezu alle Analyte durch maßgeschneiderte interne Standards abgesichert. Weiterhin wurde die Zahl der Analyte von 6 auf insgesamt 13 erhöht. Das PARAMETER-Set Neuroleptika 2/EXTENDED (Bestell-Nr. 92914/XT) umfasst die folgenden Analyte:Amisulprid, Chlorprothixen, Levomepromazin, Melperon, Perazin, Pipamperon, Promethazin, Sertindol, Sulpirid, Thioridazin, Ziprasidon, Zotepin und Zuclophenthixol.

Das Parameter-Set ist Teil des modularen Systems MassTox® TDM Serie A, das aus den folgenden 3 Komponenten besteht:> MasterColumn® A für die Analyse aller 158 Parameter,> BASIC Kit A mit mobilen Phasen und Material für die Proben- vorbereitung,> den spezifischen Parameter-Sets.

Eine sorgfältige Optimierung aller Kit-Reagenzien sowie der chromatographischen Trennung sorgt für eine hohe Robustheit der Methode und minimierte Matrixeffekte („Ion Suppression“).Die Verwendung von 11 isotopenmarkierten co-eluieren- den internen Standards und 3PLUS1® Multilevel-Kalibra-toren gewährleistet eine reproduzierbare und zuverläs-sige Bestimmung der Analyte.


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EinleitungDie Entwicklung bioanalytischer Methoden stellt für La-boratorien je nach Instrument und den Eigenschaften von Analyten und Matrizes eine große Herausforderung dar. Eine Alternative dazu sind kommerzielle Kits wie beispielsweise die MassTox® TDM Serie A von Chromsystems (Gräfelfing, Deutschland) für die LC-MS/MS, die sich zur Bestimmung von über 150 Arzneistoffen und Metaboliten eignet. Sie setzt sich aus einem Basis-Kit (BASIC-Kit A), einer analytischen Säule (MasterColumn® A) und den individuellen TDM-Parameter-Sets mit den spezifischen Kalibratoren, Kontrollen und internen Standards zusammen. Darüber hinaus sind Arbeitsvorschriften mit Protokollen zu analytischen Methoden und Berichten zu Verifizierungs- und Validierungsleistungs-merkmalen enthalten [1–7]. Klinische Laboratorien benutzen eine Reihe von LC-MS/MS-Instrumenten verschiedener Hersteller, darunter AB Sciex (Framingham, MA, USA), Thermo Scientific (Waltham, MA, USA), Waters (Milford, MA, USA) oder Agilent (Santa Clara, CA, USA), um nur einige wenige zu nennen. Es sind Dutzende von LC-MS/MS- Instrumenten in diversen Ausführungen erhältlich, die sich in ihren Leistungsmerkmalen deutlich unterscheiden. Deshalb ist es aufgrund des Einsatzes von verschiedenen HPLC-Front-End-Systemen schwierig, analytische Methoden zu entwickeln, die zu jeder LC-MS/MS-Instrumentenkonfiguration passen.Das LC-MS/MS 8040-Modell von Shimadzu (Kyoto, Japan) ist seit 2012 auf dem Markt [8] und wurde im Juni 2013 in der Abteilung für klinische Chemie im Universitätsklini-kum in Osijek/Kroatien (UCHC Osijek) installiert. Ziel war es, den LC-MS/MS-TDM Kit mit der etablierten Methode von Chromsystems darauf einzurichten. Durch die große Anzahl an Tuning-Parametern für das LC-MS/MS-System und die zahlreichen Analyte ist die Installation des TDM-Kits ein komplexes Unterfangen, wobei die Arbeitsvor-schriften von Chromsystems bereits durch grundlegende Informationen den Prozess vereinfachen. Dazu gehören u. a. der nominelle Massenübergang für jeden Analyten, der jeweilige Quantifier und Qualifier sowie die nominel-len Massenübergänge für alle internen Standards. In der Praxis erfordern die verschiedenen LC-MS/MS-Konzepte unterschiedliche instrumentenspezifische Einstellungen, die nicht bis in jedes Detail beschrieben werden können. Daher bietet Chromsystems bei der Installation umfassende Unterstützung und Hilfestellung vor Ort an. Dabei wird mithilfe der Scientific-Support-Abteilung die Methode für das jeweilige im Labor verwendete Instrument etabliert. Neben der von einem Massenspektrometrie-Experten von Chromsystems durchgeführten Standardinstallation waren im UCHC Osijek davor und danach noch einige zusätzliche Schritte zur Methodenoptimierung nötig, um die erforderli-chen Leistungskriterien für die TDM-Parameter-Sets auf dem Shimadzu 8040-Instrument zu erreichen. Das generelle Installationsverfahren sowie einige bei der Installation der TDM-Kits aufgetretenen Hürden und die entsprechenden Lösungen werden im Folgenden beschrieben. Installation des LC-MS/MS-Instruments Shimadzu 8040Bei der Installation eines LC-MS/MS-Instruments ergeben sich einige spezielle Anforderungen. Dabei sollte insbe-sondere auf die Stabilität in Stromversorgung, Versorgung mit Nebulizer- und Kollisionsgasen sowie generell auf eine gute Laborinfrastruktur geachtet werden. Obgleich jede Installation eines Instruments mit einer betrieblichen Qualifikations-/Leistungsverifizierung (OQ/PV) abschließt, kommen selbst bei bestandener Verifizierung leider nicht

immer sofort akzeptable und für Routinemessungen in der klinischen Chemie adäquate Leistungsmerkmale zustande. Tatsächlich war dies bei der Installation des MassTox® -Kits der Serie A auf dem Shimadzu 8040-Instrument am UCHC in Osijek der Fall. Das Instrument bestand vom Hersteller etablierte standardmäßige Sensitivitätstests nicht, wäh-rend andere OQ/PV-Tests zu akzeptablen Ergebnissen führten. Die Sensitivität war etwa fünf Mal niedriger als erwartet, obgleich eine hohe Sensitivität eine der wesent-lichen Eigenschaften für ein LC-MS/MS-Instrument ist. Im beschriebenen Fall hätte die so verminderte Sensitivität die Anzahl der Analyte erheblich reduziert, die mit dem TDM-Kit von Chromsystems analysiert werden können. In Zusammenarbeit mit den Spezialisten von Chromsystems und Shimadzu wurden die potenziellen Ursachen systema-tisch überprüft, und es zeigte sich, dass die verminderte Sensitivität aufgrund einer instabilen Stromversorgung mit Spannungsschwankungen hervorgerufen wurde. Durch eine stabile Stromversorgung konnte daher das Hinter-grundrauschen um das Fünffache reduziert werden, was die erfolgreiche Messung von Analyten mit niedrigen Kon-zentrationen ermöglichte. Tuning und MethodeninstallationIdealerweise sollte ein auf einer bestimmten MS-Plattform stattfindender Massenübergang auch auf alle anderen MS-Plattformen übertragbar sein. Hersteller von LC-MS/MS-Systemen haben jedoch eine Reihe verschiedener Bauweisen für ihre jeweiligen Instrumente entwickelt. Leider ergeben sich dadurch auch eine Reihe von Unterschieden zwischen diesen Systemen, wie z. B. bei der Ionisierung, der Ionenführung durch das System, der Kollision mit dem Inertgas sowie bei der Ionenerfassung am Detektor. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Massenachse von einer „ide-alen“ Massenkalibrierung abweicht. Es ist daher praktisch unmöglich, eine auf einem bestimmten Instrument etablierte Methode direkt auf ein anderes Instrument ohne weitere Modifikationen zu übertragen. Massenachsen müssen an-gepasst, Quellenparameter optimiert und Kollisionsenergien bestimmt werden. Ferner kommen bei verschiedenen Herstel-lern verschiedene Kollisionsgase zum Einsatz, die zu einer Veränderung der Gasphasenchemie in der Kollisionszelle führen können, sodass unmöglich generelle Kollisionsener-gien für alle verfügbaren Kollisionszellen festgelegt werden können. Dies macht eine sorgfältige Installation erforderlich, vorzugsweise durch ein manuelles Tuning und Installation der Methode. In der Arbeitsvorschrift der MassTox® TDM Serie A bietet Chromsystems je nach TDM-Parameter-Set

zwei oder drei MRM-Optionen an, die je nach Bedarf des Benutzers installiert werden können. Dabei ist die Verwen-dung der Quantifier-MRM zu bevorzugen. In den meisten Fällen bietet der erste vorgegebene Massenübergang die höchste Intensität. Falls ungünstigerweise durch eine Kon-tamination des Instruments eine Störung entsteht, sollte ein Wechsel von der Quantifier-MRM zu einem anderen – einer sogenannten Qualifier-MRM – in Betracht gezogen wer-den. Hier am UCHC in Osijek erfolgte ein solcher Wechsel während der Installation von Phenytoin. Bei dem ersten MRM von Phenytoin war das Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf dem 8040-Instrument ungenügend. Um dieses Problem zu lösen, wurde der zweite vorgegebene Massenübergang erfolgreich zur Quantifizierung eingesetzt. Kollisionsenergien, Q1- und Q3-BiasDas Shimadzu 8040 Instrument bietet eine automatische Optimierung der Kollisionsenergien, der Q1- und der Q3-Bias an, was einen Vorteil dieses Instruments und seiner Software gegenüber anderen Instrumenten darstellen kann. Neben dieser Option ist eine schnelle Optimierung dieser drei Faktoren durch den Einsatz von Tuningmixes möglich. Bei einem automatischen Tuning ist es jedoch stets schwerer, die Ergebnisse der Abstimmung des Instruments direkt zu beeinflussen. Ist die Signalintensität zu niedrig, kann das Ergebnis der Optimierung zweifelhaft ausfallen oder sogar völlig falsch sein. Eine zu hohe Signalintensität hingegen kann zu einer Sättigung des Detektors und als Resultat zu falschen Geräteeinstellungen führen. Daher ist eine genaue Überprüfung der optimierten Instrumenteneinstellungen zwingend erforderlich.

Flussrate des Stickstoffs und Auswahl der ESI-SpannungDas LC-MS/MS-Instrument 8040 nutzt Stickstoff als Trock-nungs- und Vernebelungsgas für eine angemessene Desol-vatisierung der Ionen und für die Entfernung aller Moleküle der mobilen Phase in der ESI-Quelle. Die Flussrate des Trocknungs- und Vernebelungsgases beeinflusst direkt die Sensitivität und Präzision. Während mit der größtmöglichen Flussrate eine gute Vernebelung und Trocknung sichergestellt wird, kann diese auch zu einem turbulenten Gasfluss und so zu einer geringeren Sensitivität und Präzision führen. Daher ist die Auswahl der optimalen Stickstoff-Flussrate ein wesentlicher Bestandteil des routinemäßigen Tunings, welches von den Chromsystems-Spezialisten durchgeführt wird. Bei der Installation des TDM-Kits an der UCHC in Osijek wurde die bestmögliche Leistung mit einer Fluss-

TDM auf einem Shimadzu 8040 LC-MS/MS: Ein InstallationsberichtAssist. Prof. Željko Debeljak, Abteilung für klinische Labordiagnostik, Universitätsklinikum Osijek, Kroatien, Abteilung für Pharmakologie, Fakultät für Medizin, J. J. Strossmayer Universität Osijek, Kroatien

Arzneimittelklassen Kits von ChromsystemsAntidepressiva MassTox® TDM PARAMETER-Set Antidepressiva 1

Antiepileptika (AED) MassTox® TDM PARAMETER-Set Antieptileptika

Benzodiazepine MassTox® TDM PARAMETER-Set Benzodiazepine 1 & 2

Mycophenolsäure MassTox® TDM PARAMETER-Set Mycophenolsäure

Neuroleptika MassTox® TDM PARAMETER-Set Neuroleptika 1

Material und Methoden

Wo immer möglich, wurden die Ergebnisse der LC-MS/MS-TDM-Kits mit den bereits auf einer HPLC (LC-10-Serie von Shimadzu) installierten HPLC-TDM-Methoden (ebenfalls von Chromsystems) verglichen. Ein direkter Vergleich war hierbei für Benzodia-zepine, trizyklische Antidepressiva und Antiepileptika möglich.

Alle hier aufgeführten Ergebnisse beziehen sich auf das LC-MC/MS-Instrument Shimadzu 8040 unter Einsatz der Elektrospray-Ionisation (ESI). Dabei wurden von einer Reihe bei Chromsystems erhältlicher TDM-Kits die folgenden auf dem Shimadzu 8040-Modell installiert.


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rate des Vernebelungsgases zwischen 2 und 3 l/min und einer Flussrate des Trocknungsgases zwischen 5 und 10 l/min erzielt. Eine niedrigere Flussrate des Vernebe-lungsgases kann, auch wenn dies vom Hersteller zuge-lassen ist, zum Verschwinden des Analytsignals führen. Ein weiterer Prozess, der bei der Installation des TDM-Kits optimiert werden muss, ist die Ionisierung selbst. Eine zu niedrige Ionisierungsspannung kann zu einem Signalverlust führen, während ein zu hoher Wert elektrische Überschläge und je nach Polarität des Ionisierungsmodus eine ungewollte chemische Reduktion oder Oxidation mancher Analyte nach sich ziehen kann. Langfristig kann eine zu hohe Kapillar-spannung außerdem zu einer Zerstörung der ESI-Kapillare und damit zu einem Signalverlust aufgrund verminderter Ionisierungseffizienzen führen. Die Kapillarspannung, mit der sich beim LC-MS/MS 8040 die bestmögliche Leistung für die verschiedenen TDM-Kits von Chromsystems erzielen lässt, liegt im Bereich von 1 bis 4 kV. Dwell timeBei der LC-MS/MS werden eine kontinuierliche (LC) und eine diskontinuierliche (MS/MS) Methode kombiniert. Während die mobile Phase kontinuierlich durch die Säule strömt und diese gemeinsam mit den Analyten am Säulenende verlässt, ist ein standardmäßiges Triple-Quadrupol-Massenspek-trometer nicht in der Lage, jede einzelne Masse – und noch viel weniger jeden einzelnen Massenübergang – genau zur gleichen Zeit zu messen. Triple-Quadrupol-Massenspek-trometer teilen ihre Messzeit daher in einzelne Zeitfenster. Während eines solchen Zeitfensters werden alle Instru-mentenparameter auf bestimmte Werte eingestellt, damit ein bestimmter Massenübergang gemessen werden kann. Diese sogenannte Dwell time muss bei der Installation des Kits justiert werden. Während kurze Dwell times die Abfolge einer Vielzahl von MRMs in kürzester Zeit ermöglichen, reduzieren sie gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis des Peaks eines Analyten. Längere Dwell times führen zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis, begrenzen jedoch auch die Anzahl der MRMs, die gemessen werden können. Je nach Elutionszeit der Analyte muss daher die richtige Balance zwischen zu kurzen und zu langen Dwell times gefunden werden. Verdünnungen und InjektionsvoluminaNach der Installation einer neuen Methode sollte besonders auf die richtige Wahl des Injektionsvolumens und der Ver-dünnung der Eluate für die einzelnen Parameter der MassTox® TDM-Serie A geachtet werden. Die verschiedenen Analyte liegen in unterschiedlichen Konzentrationen vor und besitzen darüber hinaus unterschiedliche Ionisierungseffizienzen. Daher sollten Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben so verdünnt werden, dass sich die Response eines jeden Ana-lyten innerhalb des linearen Bereichs des Detektors befindet. Die Sensitivität eines Instruments wird über die Detektions-grenze (limit of detection, LOD) und die Bestimmungsgrenze (limit of quantification, LOQ) für jeden einzelnen Analyten bestimmt; eine starke Response – zum Beispiel eines hoch-dosierten Kalibrators – könnte jedoch zur Detektorsättigung führen. Daher muss das richtige Gleichgewicht zwischen Verdünnungsgrad und Injektionsvolumen gefunden werden. Eine starke Verdünnung kann mögliche Matrixeffekte redu-zieren und so die Sensitivität erhöhen [9], jedoch geht dies in der Regel mit hohen Injektionsvolumina einher. Die Injek-toren von Shimadzu sind bei Standardbedingungen auf ein oberes Injektionsvolumen von 50 µl beschränkt, was den möglichen Verdünnungsgrad limitiert. Außerdem ist es nicht empfehlenswert, über 50 µl in die TDM MasterColumn® A von Chromsystems zu injizieren, da dies zu einer Überladung der Säule und somit zu einer schlechteren chromatographischen Trennung führen könnte. Ein Tailing bzw. schlechte Trennung des Peaks könnte daher das Resultat eines zu großen In-jektionsvolumens sein. Ist bei einem Analyten eine geringe Verdünnung erforderlich, können die Beeinträchtigungen einer solchen Verdünnung mit einem niedrigeren Injektions-volumen ausgeglichen werden. Je nach Injektorsystem ist es selbst bei sehr geringen Injektionsvolumina (z. B. 0,5 µl) möglich, eine hohe Injektionspräzision zu erzielen. Angesichts der großen Anzahl an Analyten des MassTox® TDM Serie A

Antiepileptika-PARAMETER-Sets und des breiten Spektrums an Konzentrationen bei Realproben wurde schnell klar, dass es mit dem Shimadzu 8040 nicht möglich sein würde, alle Analyte mit einem einzigen Verdünnungsgrad und einem einzigen Injektionsvolumen im linearen Detektionsbereich ab- zudecken. Obgleich die Arbeitsvorschriften von Chrom-systems eine „Verdünnungsrichtlinie“ enthalten, wurde das individuelle Verdünnungs- und Injektionsvolumenschema speziell für dieses Instrument ermittelt (Tab. 1). Hersteller von Massenspektrometern bieten zwar Hilfestellung beim Vergleich eines Instruments mit dem eines anderen Herstel-lers, bei dem beispielsweise die Sensitivität eines AB Sciex API 4000 prinzipiell mit dem eines Shimadzu 8040 ver-gleichbar sein sollte. Allerdings zeigt ein direkter Vergleich oft unterschiedliche Ergebnisse, die sich beim Vergleich der Eluat-Verdünnungen widerspiegelt. Peak-Integration und DatenanalyseAuch wenn eine automatisierte Integration, Quantifizierung und Ergebnisaufarbeitung nützlich sein mag, sollte die Datenanalyse vom Benutzer stets genau überprüft werden. Die automatische Peak-Integration sollte auf jede einzelne Methode bzw. jedes Kit angepasst werden. Sobald eine beständige Funktion des Kits sichergestellt ist, müssen die Integrationseinstellungen im Allgemeinen nicht mehr regelmä-ßig geändert werden. Die Integrationseinstellungen, die bei

der Installation des TDM-Parameter-Sets auf dem Shimadzu 8040 manuell angepasst werden mussten, sind u. a. Slope, Mindestbereich/-höhe, Peakbreite und Bandbreite. Sobald ein Satz von funktionierenden Integrationsparametern eta-bliert wurde, wird die Datenanalyse immer effizienter und die manuelle Peak-Integration seltener.

Methodenvergleich als Teil einer laborinternen Vali-dierung: LC-MS/MS vs. HPLCAm UCHC in Osijek können manche Analyte, wie AEDs und Benzodiazepine, entweder mittels LC-MS/MS oder HPLC bestimmt werden. Die erzielten Ergebnisse von HPLC und LC-MS/MS mit externen Qualitätskontrollmaterialien von RIQAS (Belfast, UK) wurden miteinander verglichen, wobei keine wesentlichen Unterschiede festgestellt werden konnten. In manchen Fällen wurden bei der LC-MS/MS-Analyse Interferenzen festgestellt, die vermutlich auf verschiedene Additive in den externen HPLC-Qualitätskontrollmaterialien zurückzuführen sind. Angesichts der weniger kostspieligen Instrumente erscheint die HPLC auf den ersten Blick attrak-tiver. Allerdings lassen sich nicht alle mittels LC-MS/MS be-stimmbaren Analyte auch mit der HPLC messen. Abgesehen

davon ist der Spezifitäts- und Selektivitätsgrad der LC-MS/MS-Analysen erheblich höher als bei standardmäßigen HPLC-Analysen. Des Weiteren ist ein analytischer Lauf bei der LC-MS/MS wesentlich schneller, was sich in einem höheren Durchsatz im Labor bemerkbar machen kann.

FazitDie beschriebene Methode wurde in unserem Labor nach Durchführung aller Installationsschritte erfolgreich etabliert. Diese Schritte waren erforderlich, um einige Hindernisse bei unserem Instrument zu überwinden, da es nicht möglich war, die Methode direkt aus den beiliegenden Arbeitsvorschriften zu „kopieren“, was zum Teil auf unterschiedliche Bauweisen der LC-MS/MS-Hersteller zurückzuführen war. Im Labor mussten mehrere Voraussetzungen zunächst geschaffen werden, wie z. B. eine stabile Spannung und Gasversorgung, um letztlich eine geeignete Sensitivität, stabile Signale und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Es wurde eine sorg-fältige Methodenoptimierung inklusive aller erforderlichen Tuning- und Anpassungssschritte des Instruments durchgeführt. Beim Einsatz von unserem LC-MS/MS Shimadzu 8040 für die TDM-Parameter-Sets von Chromsystems gab es auch keinerlei Probleme mit der Sensitivität. Daher konnten alle geplanten TDM-Parameter-Sets von Chromsystems auf un-serem LC-MS/MS Shimadzu 8040 im Krankenhaus Osijek erfolgreich installiert werden.

Literatur

[1] Chromsystems. (2013) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A BASIC Kit.

[2] Chromsystems. (2012) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Antidepressants 1 in Serum/Plasma.

[3] Chromsystems. (2013) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Antiepileptic Drugs and Metabolites in Serum/Plasma.

[4] Chromsystems. (2012) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Benzodiazepines 1 in Serum/Plasma.

[5] Chromsystems. (2012) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Benzodiazepines 2 in Serum/Plasma.

[6] Chromsystems. (2013) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Mycophenolic Acid in Serum/Plasma.

[7] Chromsystems. (2012) Instruction Manual for the LC-MS/MS Analysis of MassTox® TDM Series A Neuroleptics 1 in Serum/Plasma.

[8] Shimadzu Corporation. (2012) Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LCMS-8040.

[9] Li M, Alnouti Y, Leverence R, Bi H, Gusev AI. (2005) Increase of the LC–MS/MS sensitivity and detection limits using on-line sample preparation with large volume plasma injection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 825(2): 152–60.

Gemessener Faktor Akzeptanzgrenze Zusätzliche Information

Wiederfindung 80–120 % 2 Kontrollen*

Regressionskoeffizient > 0,99 4 Kalibrierungsstufen

Relative Standardabweichung der Peak-Bereiche der internen Standards

< 20 % isotopenmarkierte interne Standards

* Sämtliche Kalibrierungs- und Kontrollmaterialien wurden für jedes Parameter-Set von Chromsystems bereitgestellt.

Analytische Leistung: Ein Schnelltest

Die in der Tabelle aufgeführten Messungen stellen nicht die kompletten Validierungskriterien der bioanalytischen Methode dar. Vielmehr sollten sie als Systemeignungstest betrachtet werden. Im Allgemeinen wird empfohlen, einen solchen Test nicht nur nach der Installation eines neuen Parameter-Sets oder einer neuen Methode, sondern jedes Mal nach den täglichen Mes-sungen durchzuführen. Abgesehen von diesen grundlegenden Qualitätskennzahlen sollten die Signal-Rausch-Verhältnisse, die Peakformen und die Stabilität der Retentionszeiten der Analyte stets überwacht werden.

AED-Kit von Chromsystems Empfohlene Verdünnung für AB Sciex API 4000 bei 10 µl Injektionsvolumen [3]

Optimale Verdünnungen und Injektions-volumina für Shimadzu 8040

Gruppe 1 1:20 1:5 bei 10 µl

Gruppe 2 1:20 1:5 bei 10 µl*



Gruppe 5 1:2.5 1:3 bei 50 µl

*Die Analyse von Theophyllin erfordert eine Verdünnung von 1:3 und ein Injektionsvolumen von 50 µl.

Tabelle 1: Vergleich von Verdünnungsreihen und Injektionsvolumina mit dem TDM-AED-Parameter-Set von Chromsystems auf einem AB Sciex API 4000 und auf unserem Shimadzu 8040.



Steroide sind eine Gruppe von Verbindungen, die bei Tieren, Pflanzen und Pilzen gleichermaßen zu finden sind. Sie besitzen eine bestimmte chemische Struktur, deren Grundgerüst vom Cholesterin abgeleitet ist. Das Cholesterinmolekül findet sich daher im menschlichen Organismus als Vorläufer von Lipoproteinen und Steroidhormonen, den Hormonen der Nebennierenrinde (Corticosteroide) bzw. der Fortpflanzungsorgane (Androgene, Östrogene). Außerdem gibt es mehre-re als Anabolika bezeichnete Dopingmittel, die synthetische Produkte des männlichen Geschlechtshormons Testosteron sind. Häufig werden anabole Steroide missbräuchlich verwendet, um den Aufbau von Muskel- und Knochenmasse zu beschleunigen.Steroidhormone erfüllen verschiedenste Funktionen im Organismus und sind somit auch in eine Vielzahl von Erkrankungen involviert. Angeborene oder erworbene Leiden im Steroidhormonstoffwechsel wie zum Beispiel das Cushing-Syndrom, Nebennierentumore, Hyperaldosteronismus und viele andere zeigen daher die klinische Bedeutung einer Steroidbestim-mung auf. Zwar können verschiedene Methoden dazu eingesetzt werden, jedoch besitzt die Tandem-Massenspektrometrie erhebliche Vorteile. So wird die LC-MS/MS gerade für die Analyse von Steroiden als Goldstandard betrachtet und ermöglicht zudem die Analyse mehrerer Hormone in einem einzigen Messvorgang (Multiplexing). Weiterhin weist das Verfahren auch eine höhere Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu anderen Methoden auf.Chromsystems hat eine Komplettlösung entwickelt, die Kunden eine effiziente Steroidanalyse ohne High-End-Massenspek-trometer ermöglicht. Mit dem neuen Kit MassChrom® Steroide im Plasma/Serum (Bestell-Nr. 72000) können 13 Steroide mit nur einer Säule und einer Probenvorbereitung über die LC-MS/MS bestimmt werden. Das Kit umfasst die klinisch wichtigsten Steroide. Die Probenvorbereitung ist für beide Steroidpanele identisch und erfolgt unter Verwendung eines optimierten und effizienten Verfahrens in 96 SPE-Well-Platten. Der Einsatz von stabilen isotopen-markierten internen Standards für jeden einzelnen Analyten gewährleistet eine reproduzierbare und zuverlässige Quan-tifizierung der Steroide. Das MassChrom® Steroid Kit ist verfügbar mit der analytischen Säule zur Messung aller Parameter sowie mit den 6PLUS1® Multilevel-Kalibratoren und MassCheck® -Kontrollen

PRODUKTNEUHEIT

Steroidpanel 1Linearität: mind. doppelter Bereich Bestimmungsgrenze: 10–200 ng/l Intra-Assay: Vk = 1–7 % Inter-Assay: Vk = 4–9 % Analysendauer: 10,5 min Steroidpanel 2Linearität: mind. doppelter Bereich Bestimmungsgrenze: 10–10000 ng/l Intra-Assay: Vk = 1–10 % Inter-Assay: Vk = 2–17 % Analysendauer: 12,5 min

Spezifikationen Äquilibrierung → Äquilibrierung der Steroid 96-SPE-Platte mit je 0,8 ml Equilibration Reagent 1 in jedes Well. → 1 min bei 200 x g zentrifugieren. → Mit 0,8 ml Equilibration Reagent 2 wiederholen. SPE Aufreinigung→ Zugabe von 500 μl Probe/Kalibrator/MassCheck® Kontrolle, 50 μl Internal Standard Mix und 450 μl Extraction Buffer in jedes Well der Steroid 96-SPE- Platte. → 2 min bei 600 rpm vortexen. → 1 ml Wash Buffer in jedes Well hinzufügen, für 1 min bei 200 x g zentrifugieren und wiederholen.

→ 2 min bei 2000–3000 x g zentrifugieren. → Platte auf Steroid-Auffangplatte platzieren. → 500 μl Elution Buffer hinzufügen und 1 min bei 200 x g zentrifugieren. Aufreinigung und Injektion→ Steroid-Auffangplatte unter Stickstoff bei 45°C inkubieren und die Eluate eindampfen. → 100 μl Reconstitution Buffer in jedes Well pipettieren. → Auffangplatte für 2 min bei 900 rpm vortexen. → 5 min bei 3000 x g zentrifugieren. → Auffangplatte verschließen und zum Autosampler transferieren. → Injektion von 10–40 μl in das LC-MS/MS-System.

Probenvorbereitung

Neues MassChrom® Kit für die Steroid-Bestimmung mittels Tandem-Massenspektrometrie

Androstendion Aldosteron Cortisol 11-Deoxycortisol Cortison Corticosteron Estradiol Progesteron 17-OH-Progesteron Testosteron Dihydrotestosteron (DHT) Dehydroepiandrosteron (DHEA) Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEA-S)

Parameter, die mit dem MassChrom® Steroid Kit bestimmt werden können.

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Die 13 Analyte des MassChrom® Steroid Kits sind in 2 Panels unterteilt.



Besuchen Sie Chromsystems auf folgenden nationa- len und internationalen Kongressen und Messen:

> 26.–29. Januar 2015 ArabHealth, Dubai, Vereinigte Emirate > 4.–6. März 2015 APS 29. Jahrestagung 2015, Fulda, Deutschland > 16.–18. April 2015 GTFCh Symposium, Mosbach, Deutschland

Für weitere Termine besuchen Sie bitte unsere Website: www.chromsystems.de

TERMINE

Auf über 180 Seiten haben wir unser gesamtes Produktportfolio der klinischen HPLC in einem Katalog zusammengestellt. Dazu gehören natürlich auch die neuesten Produkte wie die kombinierte UHPLC-Methode zur Bestimmung von Vitamin A und E, Automati-onslösungen sowie Methoden, die mittels Pre-mixed Tubes eine vereinfachte Proben-vorbereitung ermöglichen. Der Katalog liefert darüber hinaus wertvolle und praktische Informationen wie Chromatogramme, HPLC-Parameter, Bestellinformationen, LOQs, Wiederfindungsraten und Analysenzeiten sowie wichtige Daten über alle unsere ver-fügbaren HPLC-Kontrollen.Ebenfalls verfügbar ist ein separater Katalog, der unser Portfolio an LC-MS/MS Pro-dukten umfasst.

Bestellen Sie per E-Mail Ihre persönlichen Exemplare der HPLC- und LC-MS/MS-Kataloge: [email protected]

AKTUELLES

GEWINNSPIEL

Herausgeber:ChromsystemsInstruments & Chemicals GmbHAm Haag 1282166 Gräfelfing

Telefon: +49 89 18930-210/-255Telefax: +49 89 18930-399E-Mail: [email protected]

Redaktion:Dr. Marc EgelhoferDr. habil. Richard LukačinDr. Nihâl Yüksekdağ

Gestaltung:Fred Lengnick Print- & Mediendesign Ausgabe November 2014

IMPRESSUM

Beantworten Sie 5 Fragen zu dieser Ausgabe des DIALOGs, und gewinnen Sie einen von 5 E-Book-Reader. Einsendeschluss ist der 15. Januar 2015. Senden Sie uns Ihre Lösungen per Fax: +49 89 18930-399, E-Mail: [email protected], oder per Post: Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH, Am Haag 12, 82166 Gräfelfing.

Frage 1: Aus welchen 3 Bestandteilen setzt sich die MassTox® TDM Serie A zusammen?

Frage 2: Wie viele Analyte können mit dem MassTox® TDM Serie A PARAMETER-Set Antiepileptika gemessen werden?

Frage 3: Wie viele chirale Zentren besitzt Methylphenidat?

Frage 4: Was bedeutet die Abkürzung „ESI“ ausgeschrieben?

Frage 5: Nennen Sie mindestens 3 PARAMETER-Sets der MassTox® TDM Serie A, die in diesem Preisrätsel noch nicht erwähnt wurden.

TeilnahmebedingungenDer Rechtsweg ist ausgeschlossen. Die Preise können nicht bar ausgezahlt werden. Mitarbeiter von Chromsystems und ihre Partnerfirmen/ Lieferanten sind von der Teilnahme am Gewinnspiel ausgeschlossen.

5 E-Book-Reader zu gewinnen

Der neue HPLC-Katalog ist da!


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Installation und Messung an einem Tag: MassTox TDM Serie A ... · steht insbesondere die patientenspezifische Pharmakokinetik im Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang dürfen Arzneimit