Acta histochem. 80, 29-34 (1986)

VEB Gustav Fischer Verlag Jena

Institut fur Anatomie (Direktor: Prof. Dr. Se". med. W. LINss) und Institut fUr Pathologische Anatomiel ) (Direktor: Prof. Dr. met!. habil. G. WALDMANN) des Bereiches Medizin der Friedrich.

Schiller-Universitiit Jena, DDR

Intermecliarfilamente in den Zellen des hyalinen Knorpels2)

Intermediate filaments in chondrocytes of the hyaline cartilage

Mit :1 _"" bbildungen

(Eillgegungen alll 24. J annar 1986)

Zusammenfassung

In elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Knorpelzellen aus dem Processus xiphoideus der Ratte, aus dem Gelenkknorpel ,les Kaninchens sowie ans Knorpelzellkulturen vom Gelenk­knorpel des Kaninchens wurden naeh unterschiedliehen Fixierungsverfahren in groJ3er Zahl Bundel aus 10 nm dieken intermediiiren ZytofiIamenten beobachtet. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikorpern konllten sie eindentig als Vimentin charakteri­siert werden.

Summary

After different fixation procedures great numbers of bundles of intermediate cytofilaments, 10 nm in tickness, could be detected in electron micrographs of chondrocytes from Processus xiphoideus of the rat, from the articular cartilage of the rabbit and from chondrocyte cultures from the articular cartilage of the rabbit. By means of the indirect immunofluorescence technique with monoclonal antibodies they could be ("learly defined as vimentin.

Zur Struktur des hyalin en Knorpels liegen zahlreiche Arbeiten vor. Eine Vielzahl beschaftigt sich mit der Interzellularsubstanz, wobei unter anderem die Fragen der opt imalen Erhaltung aller Komponenten eine groBe Rolle spielen. Aber auch der Allfhau der Chondrozyten stand haufig illl Mittelpunkt. Besondere Beachtung wurde dahei den Veranderungen der Zellstruktur in Ahhangigkeit vom Reifegrad dieser Zellen geRchenkt. N ie-ht zuletzt werden dureh das klinisehe Interesse an dieselll lie­webe neue Untersuchungen zur Struktur und Funktion ausgelOst, obwohl eine Reihe guter t'bersichten vorliegt, von denen stellvertretend die von FREEMAN (197:l), K)[ESE (1979) und HALL (198:l) genannt werden sollen.

Oberraschend wenige Aussagen findet man ZUlll Vorkolllmen und zur Anordnung des Zytm;keletts in den hyalinen Knorpelzellen. Zumeist wird nur sehr pausehal von intrazytoplaslIIatisl'hen oder Mikrofilamenten gesproe-hen (ANN]~FELn 1985; BRICHl­TON et al. 1984), und nm selten werden Mikrotllbuli oder Interlllediarfilamente er­,yiihnt (SHELDON H))-l:1).

2) Herrn Prof. Dr. se. med. Dr. reI'. nat. Dr. h. c. J .-H. SCHAR~' mit herzliehem Gluckwullseh ZUlll 65. Ckburtstag.

30 \V. LIXSS, G. ~E{;PERT und L. LAXGBEIN

Bei elektronenmikroskopisrhen enterslIl'hungen zur Produktion und Anordnung der Proteoglykane (GEYER und I,INSS 19S1: LINSS 1984) oder zur Charakterisierung der in den Chondrozyten vorkommenden \'akuolen (FISCHER und LINSS 1986) war uns das reichliehe Yorkommen von Filamenten in diesen Zellen aufgefallen. Mit Hilfe elektronenoptisrher und il11lllunologisrher Methoden hahen wir versucht, diese intra­zytoplaslllatisrhen Filalllente niiher zu rharakterisieren.

Material und Methoden (iewe hekult ur

Von Gelenkfliichen 4 bis 6 \Vochen alter Kaninchen Wllrde unter sterilen Bedingungen Knorpel­gewebe abprapariert. Ein Tei! des Gewebes wurde zerkleinert, mit 0,2%igem Trypsin in phosphat­gepufferter NaCI-Losung (PBS) pH = 7,4 angeclaut und in 0,05%iger Kollagenase in PBS Einzel­zellen dissoziiert. Die isolierten Chondrozyten wurden in Glasflaschen unter Verwendung von ::\{inimal Essential Medium (ME)I) nach EAGLE unter Zusatz von 10 % foetalem und 10 % neonata­lem Kalberserum bei 37 DC als )ionolayer tiber mehrere Subkultllren kultiviert. In dreitiigigen Jntervallen wurde das :\redium gewechselt.

.Fl u ore sz enz III ikro s kopie Eingesetzt wurden unfixierte 10 bis 15/!m dicke Kryostatschnitte vom Gelenkknorpel 4 bis

6 Wochen alter Kaninchen odeI' vom Processus xiphoideus 6 Wochen alter Ratten des Stammes Uje:Wist sowie in Methunolullli Azeton fUr 10 min bei 20 DC fixierte Monolayen:ellen auf Deck­glaschen von den beschriebenen Knorpelzellkulturen. Nach einem kurzen Eintauchenin 0,05%iges Triton X 100 in PBS wurden die Praparate 10 min in Normalserum (Ziege) vorinkubiert. An­schlie13end tiberschiehteten wir mit einem gegen Araus-:\:-Vimentin gerichteten monoklonalem Anti­ki:irper fur 30 min bei 20 DC. (Fur die Bereitstellung monoklonaler Antikorper danken wir herz­lich Herrn Dr. U. KARSTEX, Zentralinstitut fUr Krebsforschung del' Akademie del' Wissenschaften del' DDR, Bereich Immunologie, Berlin-Buch.) Auf eine PBS-Waschung folgte eine 30miniitige Inkubation in Fllloresceinisothiozyanat (FITC)-markiertem Anti-Maus-Gammaglobulin. In den Kontrollen wurden monoklonale Antikorper gegen Zytokeratine (KARSTEN et al. 1983) anstelle des Anti-Vimentins eingesetzt. Nuch griindlichem Sptilen in PBS wurden die Praparate in Gly­zerol-PBS mit p-Phenylendiamin (PPD)-Zusatz nach STORZ und JELKE (1984) eingeschlossen unci mit dem Fluoreszenzmikroskop .Jenulumar (VEB Carl Zeiss JENA) mit HBO 202-Lampe und Blaulichtanregung fotografiert.

Elcktronen III i kroskopi e Die Fixierung von kultivierten Knorpelzellen und von Gelenkknorpel des Kaninchens erfolgte

mit 3%igem Glutaraldialdehyd in 0,1 mol Cacodylatpuffer bei pH = 7,2 fUr 60 min mit Nach­fixierung fiir 60 min in 1 %igem OS04; Blocknachkontrastierung mit Uranylazetat. Knorpel­stiickchen yom J"'ocessus xiphoidells 6 Wochen alter Uje:Wist-Ratten wurcien in einem Gemisch au8 4 ~:) Formol, 2 ~o G1utaraldialdehyd unrl 0,2 % Tanninsaure in 0,05 mol Cacodylatpuffer pH = 7,4 fiir 30 min fixiPl't, die N achfixierllng erfolgte fiir 60 min in 1,5 % 0804 une! 2 % Kalium­ferrocyanid im gleichen Puffer. Nach Entwasserung iiber clie Azetonreihe wurde in Mikropal odeI' linter Zwischenschaltung von Propylenoxid in Durcupan AG.M eingebettet. Die DUnn­schnitte kontrastierten wir mit Bleizitrat. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen ftirtigten wir mit dem Elektronenmikroskop JE::vr 100 B (JEOL, Japan) in del' Abtei!ung fUr Elektronen­mikroskopie (Leitung: Doz. Dr. habi!. H. W. MEYER) des Bereiches Medizin der Friedrich-Schiller­Universitiit an.

Befunde

Sowohl illl Gelenkknorpel des Kaninchens als auch illl Processus xiphoideus cler Ratte liiBt sich nach Inkubation in Anti-Vimentin und FITC-markiertem Anti­Malls-Galllillagiohulin in den Knorpelzellen cine starke Fluoreszenz beohachten, die ihre hoehste Intensitiit lllll den Kern erreil'ht, letzterer ers(·heint gewohnlieh als Aus-

Intermediarfilamente in den ZeBen des hyalinen Knorpels 31

Abb. 1. Mit indirekter Immllnflnoreszen z nach Inkubation mit monoklonalen Antikorpel'n gegen Vimentin ist in allen Chondrozyten dieser 1. Subkuitur aus Gelenkknorpel ein gut ausgebildetes Netzwerk von Intermediiirfilamenten zu erkennen. VergroI3erung: 500 : 1.

sparung. Besonders in den Uhondrozyten der Primiirkultur und in den fruhen Sub­kulturen wird deut.lieh (Abb. 1), da B die reagierenden Anteile Strange ausbilden, die einerseits den Kern ulllgeben, sieh jedoeh andererseits auch in die Zellausla llfer hineinerstrecken lind so ein Netz aufhauen, welches die gesamte Zelle durchzieht. In den Chondrozyten des Gelenkknorpels lind des Processus xiphoideus werden aueh die Vakuolen von dieselll fluoreszierenden Netzwerk um schlossen. In den Kontroll­praparaten konnten keinerlei flu oresz ierende Zellstrllkturen beobaehtet werden, Zyto­keratine waren also nicht nachzuweisen.

1m elektronenoptischen Bild sind in den kllltivierten Chondrozyten zahlreiche Biindel von Filamenten anzutreffen. Hie Iiegen in del' Umgebung des Zellkernes ge­hiiuft lind strahlen in die Peripherie aus, wohei sie Zellorganellen zwischen sieh ein­Rc hlieBen. Aue-h in den Chondrozyten des nelenkknorpels vom Kaninehen find en sich vor aHem perinukleiir (Ahh. 2), aher aueh in der Umgebung des Golgi-l1'eldes oder von Vakuolen Illassenhaft gehiindelte Zytofilalllente. Die perinukleare Anordnung dOllliniert aueh in den Chondrozyten des Proeessus xiphoideus der Ratt,e, gleiehzeitig werden hei dieser Hpezies Reziehungen ZIl Vakuolen und ZUlli Ciolgifeld deutlich. RegeIrlliiBig finden sieh aneh suhplasllIalenlillal Anhanfungen von Zytofilamenten (Abb. 3). Die .Filamente liegen in den verschiedensten Ansehnittriehtungen vor. An Quersehnitten haben wir den Dllrl'hlllcsser mit etwa 10 nlll hestimlllen konnen. Da­nehen fanden wir ane-h dtinnere Filalllente von 5 his 7 nm Dieke vor aHem sub­plasmalem mal. Relat iv selten waren M ikrotll huli zu heohachten.

,V. LINSS, G. XElTERT und L. LAI\GBEIN

Abb. 2. Chondrozyt aus dem Gelenkknorpel vom Caput femoris eines K ani nchens. Der Zellkern ist von einem krilftig ausgebildeten flaum von unterschiedlich angeschnittenen Intermediar. filamenten umgeben. Vergroflerung: 9400: I, Inset: 29000: 1.

Diskussion

Zytofilamente konnen in liberraschend groDer Anzahl in den Zellen des hyalinen Knorpels beobachtet werden. Es c10minieren c1abei dicke Zytofilamente mit einem Durchmesser von 10 nm, die also ;m den Intermediarfil amenten gehoren (f:lTEINERT et a!. 1984). Mit Hilfe monoklonaler Antikorper gegen [( ·Vimentin gelingt in der imlirekten Immunfluoreszenz ihre eindeutige Zuord· nung zum Vimentintyp. EJektronenmikroskopisch tritt d as Vimentingerlist bei sehr unterschied. lichen Fixierungen (GEYER und LINSS 1981; LIl\ss 1984, 1985 ; FISCHER und LCNSS 1986) deutJich hervor.

In vielen Publikationen WI' Struktllr der Chondrozyten find en sich keine Hinweise auf das Zytoskelett. In anderen Arl>eitell, so bei GHADIALLY (1973), KOSTOVIC et al. (1981), SIIELDON (1983), BRIGHTON et a!. (1984) und ANNEFELD (1985) wertlen Zytofilamente nul' am R a nde odeI' gar nicht erwiihnt, sind jedoch im jeweils beigegebenen Bildmaterial gut zu erkennen. Hingegen finden bei STOCKWELL and MEACHIM (1973) intrazytoplasmatische Filamente mit einem Durch· me sseI' VOll 7 bis 10 nm, diE' in groBer Zahl perinllkle;,r angE'ordnet sind, allsrlriicklich Erwahnung, und bereits 1 !!63 verweiRcn REVEL and HAY a uf das Vorkommen von intrazellularen Filamenten und vergleichen diese mit den Tonofilamf'nten der Epithelzellen, obwohl weder in den elektronen.

1nterrnediiirfilarnente in den ZeIIpn des hyalinen Knorpels 33

Abb.3. Abschnitt eines Chondrozyten allR clern Processus xiphoideus einer 6 Wochen alten Ratte. Unterschiedlich angeschnittene Biimjpj von 1nterrnediiirfilarnenten urngeben clen ZeIIkern (N), urnschliel3en Vakuolell (V) uwI tretell gehiiuft subplasmalemrnal auf. Sie urngeben Areale, in denen die Golgifelder (G) una andere ZelIorganeIIen wie Mitoehondrien und endoplasmatisches Retikulurn sowie Glykogenallhaufungen zu finden sind. 1m zeIInahen 1nterzeIIularraum (+) ist die Grundsubstanz relativ gut erhaIten. Vergrol3erung: 49000: 1.

mikroskopischen Aufnahmen eine Messung der Filamente vorgenommen wurde noeh zu diesem Zeitpunkt der Begriff der intermediiiren Filamente bekannt war. Eindeutig werden von "VILS· MAN et al. (1981) unterschiedlich dicke Zytofilamente beschrieben, von denen die dickeren mehr perinukleiir unci die diinneren subplasmalemmal angeordnet sind. Ein Hinweis auf intermediiire Filamente im elastischen Knorpel findet sich auch bei OSBORN und 'WEBER (1983).

Unsere Befllnde erlauben auf Grund der Grol3e der Filamente und des eindeutigen Nachweises YOIl Vimentin die Zliordllllllg ZlI dell "intermediate filaments". Damit wird das Vorkommen von

:; Acta Iiistoehelll. Btl. HI)

34 ,V. LINSS, G. NEUPERT und L. LANGBEIN, Intermecliarfilamente in den Zellen . . .

Aktinfilamenten keineswegs in Abrede gestellt, wmal wir diinnere Zytofilamente mit einem Durch· messer urn 5 bis 7 nm in allen Zellen reichlich beobachten konnten.

Das sehr reichliche Vorkommen der intermediaren Filamente vom Vimentintyp und ihre netz· artige Anorclnung urn den Zellkern, urn die Golgifelder und die Vakuolen mit Beziehungen zum Plasmalemm liiJ3t claran denken, daJ3 auch innerhalb der Chondrozyten mit dem Zytoskelett ein System aufgebaut wird, das mechanische Verformungen sehr gut kompensieren kann. Es scheint also nicht nur die Anordnllng der Fasersysteme und der Grundsubstanz im Interzellularrallm zu sein, die den hyalinen Knorpel in die Lage versetzt, als druckaufnphmendes Gewebe zu fungieren.

Literatur

ANNEFELD, M., A new test method for the standardized evaluation of changes in the ultrastructure of chondrocytes. Intern. Tiss. Reac. 7, 273-289 (1985).

BRIGHTON, C., KITAJIMA, T., and HUN'!', R. 1\I., Zonal analysis of cytoplasmic components of articular cartilage chondrocytes. Arthrit. Rheum. 27, 1290-1299 (1984).

FISCHER, B., und LINSS, ",'., Ultrahistuehemische Charakterisierung von Vakuolen in Knorpel­zellen. In: ModemI' Methoden in der Histochemie und ihre Anwendung. Wiss. Z. Friedrich­Schiller-Univ. Jena, Math.-nat.wiss. Reihe 35, 405-406 (1986).

FREEMAN, 1\1. A. R., Adult articular cartilage. Grune and Stratton, New York 1973. GEYER, G., und LINSS, ",'., Produktion und extrazelluliire Anordnung von Proteoglykanen im

wachsenden hyalinen Knorpe!. Gegenbaurs morpho Jahrb. 127, 625-628 (1981). GHADIALLY, F. N., Ultrastructural pathology of the cell. Butterworths, London and Boston

1975. HALL, B. K., Cartilage. Vol. I: Structure, function, and biochemistry; Vol. 2: Development,

differentiation, and growth; Vol. 3: Biomedical aspects. Academic Press, New York 1983. KARSTEN, U., ""IDMAIER, R., and KUNDE, D., Monoclonal antibody against antigens of the human

mammary carcinoma cell line MCF-7. Arch. Geschwulstforsch. 53,529-536 (1983). KOSTOVIC, L., BRADAMANTE, Z., and SVAJGER, A., Ultrastructure of elastic cartilage in the rat

external ear. Cell Ti8s. Res. 218,149-160 (1981). LINSS, "V., Feinstrukturelle Untersuchungen an Chondrozyten des wachsenden hyalinen Knorpels

der Ratte. Acta anat. 120, 44 (1984). - Struktur der Zellen des hyalinen Knorpels. VerOffentlichungen zur 6. Gemeinschaftstagung

der Gesellschaft fiir Experimentelle Medizin der DDR, 19.-22. 11. 1985 in Berlin, Bd. I, 255. OSBOR:-r, M., and ""EBER, K., Biology of disease. Tumor diagnosis by intermediate filament typ­

ing: a novel tool for surgical pathology. Lab. Invest. 48 372-394 (1983). REVEL, J. P., and HAY, E. D., An autoradiographic and electron microscopy study of collagen

synthesis in differentiating cartilage. Z. Zellforsch. 61, 110-144 (196:J). SHELDON, H., Transmission electron microscopy of cartilage. In: HALL, B. K. (ed.): Cartilage. Vol.

1: Structure, function and biophemistry. Academic Press, New York 1983, pp. 87-104. STEINERT, P. M., JONES, J. C. R., ami GOLDMAN, R. D., Intermediate filaments. J. Cell BioI. 99,

228-27s (1984). STOCKWELL, R. A., and MEACHlM, G., The chondrocytes. In: FREEMAN, M. A. R. (ed.): Adult

articular cartilage. Grune and Stratton, New York 197:3, p. 51-99. STORZ, R., and JELKE, E., Photomicrography weakly fluorescent objects employment of p.

phenylene diamine as a blocker of fading. Aeta histochem. 75, 133-139 (1984). WrLsMAN, N. J., FARNFM, C. E., and REED-AKSAMIT, D. K., Caveolar system of the articular

chondrocyte. J. Ultrastruct. Res. 74, 1-10 (1981).

Adresse der Autoren: Prof. Dr. sc. med. W. LINSS, Institut fUr Anatomie der Friedrich-Schiller­Universitiit, Teichgraben 7, DDR - 6900 Jena; Dr. rer. nat. G. NEUPERT, Institut fiir Patholo­gisehe Anatomie der Friedrich-Sehiller-Universitiit, Ziegelmiihlenweg 1, DDR - 6900 Jena.