Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen … · 2005. 8. 30. · Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Frings und Dr

Isolierung und Charakterisierung

von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte

Nicole Ungerer

Heidelberg, August 2005



Nicole Ungerer


Diplomarbeit im Fachbereich Biologie

an der Fakultät für Biowissenschaften

der Ruprecht-Karls-Universität

Heidelberg



Vorgelegt von Nicole Ungerer


Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

in der Zeit vom 7. Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Frings

und Dr. Frank Möhrlen angefertigt.

Referent: Prof. Dr. Stephan Frings

Korreferent: PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen als

die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Heidelberg, den 07. August 2005

________________________________________

Nicole Ungerer

Danksagung

Diese Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut für Zoologie der

Universität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei allen für die

freundschaftliche Atmosphäre innerhalb der Arbeitsgruppe bedanken, die sehr zum Erfolg dieser

Arbeit beigetragen hat.

Mein besonderer Dank gilt:

• Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des Themas und für das große Interesse an

dieser Arbeit

• Priv.-Doz. Dr. Harald Herrmann-Lerdon (DKFZ, Heidelberg) für die Übernahme des

Korreferats

• Dr. Frank Möhrlen für die tadellose Betreuung und Beratung bei der Durchführung

biochemischer Experimente

• Dipl.-Biol. Ulrich Mayer für die gute Zusammenarbeit und seine Diskussionsbereitschaft

• Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck für viele kreative Ideen und Korrekturlesearbeiten

• Dr. Uwe Warnken (DKFZ, Heidelberg) für die Durchführung der ESI-Massenspektrometrie

und die große Hilfsbereitschaft

• Dr. Tore Kempf (DKFZ, Heidelberg) für die praktische Hilfestellung beim Protein-Verdau

und für viele nützliche Ratschläge

• Dr. Martina Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) für das große Interesse an diesem Projekt

• Priv.-Doz. Dr. Ingrid Boekhoff für ihre nützlichen Tipps bei der Cilien-Präparation

• Meinem Lebensgefährten Thomas und meinen Kindern Sebastian und Valerian für ihre

große Geduld und ihr humorvolles Wesen.

Inhaltsverzeichnis

i

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis………………………………………………………………………………i

Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………………....I

1 Einleitung .......................................................................................................................... 1

1.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels............................................................................ 1

1.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade ................................................................... 3

1.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion........................................... 5

1.4 Protein-Analytik ......................................................................................................... 6

1.4.1 Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese ............................. 7

1.4.2 Massenspektrometrie.......................................................................................... 8

1.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik.............. 8

1.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung ....................... 10

1.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF ............................... 12

1.5 Ziel dieser Arbeit...................................................................................................... 15

2 Material und Methoden ................................................................................................. 16

2.1 Chemikalien und Material ........................................................................................ 16

2.2 Lösungen .................................................................................................................. 17

2.2.1 Lösungen für die Präparation ........................................................................... 17

2.2.1.1 Lösungen für die Cilien-Präparation ............................................................ 17

2.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel............................ 17

2.2.1.3 Verwendete Protease-Inhibitoren................................................................. 18

2.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode ................................... 19

2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase ................................... 20

2.2.4 Lösungen für die SDS PAGE........................................................................... 20

2.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE ....................................................... 21

2.2.6 Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung ............................................. 22

2.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung............................................. 22

2.2.8 Lösungen für die Western Blot-Analyse .......................................................... 23

2.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine.......................................... 23

2.3 Größenstandards und Antikörper ............................................................................. 24

2.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese ..................................................... 24

Inhaltsverzeichnis

ii

2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGE............................................................. 24

2.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE............... 25

2.3.2 Antikörper für die Western Blot-Analyse ........................................................ 26

2.3.2.1 Primäre Antikörper....................................................................................... 26

2.3.2.2 Sekundäre Antikörper .................................................................................. 26

2.4 Tiere ......................................................................................................................... 27

2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel ........................................................ 27

2.5.1 Präparation und Isolierung des Gesamtepithels ............................................... 27

2.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode ................................. 28

2.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999) ........................... 30

2.6 PNGaseF-und Benzonase-Behandlung .................................................................... 30

2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-Methode................ 31

2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese................................................... 32

2.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli

(1970)….. ......................................................................................................................... 32

2.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (verändert

nach Navarre et al, 2002) ................................................................................................. 33

2.8.2.1 Vorbereitung der Gele.................................................................................. 33

2.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGE........................................................................ 34

2.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGE ............................................................................ 35

2.9 Färbung der Proteine im Gel .................................................................................... 35

2.9.1 Reversible MS-kompatible Silberfärbung........................................................ 35

2.9.2 Colloidale Coomassie-Färbung ........................................................................ 36

2.10 Western Blot-Analyse .............................................................................................. 36

2.10.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen .................................................. 36

2.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-

Aktivität............................................................................................................................ 36

2.11 Massenspektrometrie................................................................................................ 38

2.11.1 Ausschneiden der Proteine ............................................................................... 38

2.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“) ............................. 39

2.11.3 Nano-LC und interne Kalibrierung .................................................................. 40

2.11.4 Extraktion der Proben....................................................................................... 41

Inhaltsverzeichnis

iii

3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 42

3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen ........................... 42

3.2 Qualitative Analyse der Präparation ........................................................................ 44

3.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE .................. 44

3.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse..... 45

3.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals ....................... 45

3.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III) ...................... 46

3.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins

(Gα olf)….. ..................................................................................................................... 47

3.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse ............ 47

3.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen Trennverfahrens................... 49

3.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese............................................................................................................. 49

3.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung ......................... 50

3.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung 51

3.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis cilien-spezifischer

Markerproteine ..................................................................................................................... 53

3.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit ................... 53

3.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von Gα olf.............................................. 54

3.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der Proteine ........ 55

3.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus Datenbanken .. 56

3.5.2 Tabellarische Auflistung der Resultate ............................................................ 60

4 Diskussion ....................................................................................................................... 64

5 Zusammenfassung.......................................................................................................... 73

6 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 74

A Anhang ............................................................................................................................ 83

Abkürzungsverzeichnis

I


Abkürzung Erklärung

α anti-

AC III Adenylatcyclase Typ III

AMP Adenosin-5'-monophosphat

API atmospheric pressure ionization

ATP Adenosin-5'-Triphosphat

APS Ammoniumpersulfat

BAC Benzyldimethylhexadecyl-ammonium chlorid

CaBP calcium binding protein

cAMP zyklisches AMP

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-

sulfonat

cm Zentimeter

CNG cyclic nucleotide gated channel

CTAB Cetidyltrimethylammoniumbromid

D dimensional

Da Dalton

DTT Dithiothreithol

ECL enhanced chemiluminescence

EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure

EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessig-

säure

ER Endoplasmatisches reticulum

ESI electrospray ionization

eV Elektronenvolt

Fa Firma

FAB fast atom bombardment

FAD Flavinadenindinucleotid

Gαolf α-Untereinheit des olfaktorisches G-Protein

Glu Glutamat

gt goat

GTP Guanosin-5'-Triphosphat


II

h Stunde

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-Sulfonsäure

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

HRP horseradish-peroxidase

IEF isoelektrische Fokussierung

IgG Immunglobulin G

InsP3 Inositol 1,4,5-trisphosphat

IP isoelektrischer Punkt

kDa Kilodalton

kHz Kilohertz

kV Kilovolt

LC Liquid Chromatography

LP Lamina propria

M Molar

mA Milliampère

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

MHz Megahertz

ml Milliliter

mm Millimeter

mM milli-Molar

Mr relative Molekülmasse

ms milli-Sekunde

MS Massenspektrometrie

m/ z Masse über Ladung

nL Nanoliter

OD Optische Dichte

OE Olfaktorisches Epithel

ORN Olfaktorische Rezeptor-Neurone

p probability

p.a pro analysi

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS phosphate buffered saline

PHB Prohibitin

PI isoelektrischer Punkt


III

PMF Peptidmassen-Fingerprint

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PLC-β2 Phospholipase C-β2

PVDF Polyvinylidenfluorid

Q Quadrupol

rb rabbit

rpm rounds per minute

rt rat

SDS Sodium-Dodecylsulfat

SH- Sulfhydryl-

ToF Time of flight

Tris 2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol

TRPC transient receptor potential channel

u Unit

UDP Uridin-Diphosphat

µg Microgramm

µl Microliter

µm Micrometer

v/ v volume per volume

w/ v weight per volume

1 Einleitung

1

1 Einleitung

Membranproteine verleihen den Membranen von Zellen ihre charakteristischen Eigenschaften

und gestatten den Zellen eine gewisse Dynamik. Sie ermöglichen den Transport von

Substanzen über die Membran, wirken katalytisch, z.B. bei der ATP-Synthese, oder haben

strukturelle Funktionen, indem sie das Cytoskelett der Zelle mit der extrazellulären Matrix

oder mit benachbarten Zellen verknüpfen. Als Rezeptoren dienen sie der Weitergabe von

Signalen aus der Umgebung in die Zelle. In Riechsinneszellen verwandeln Membranproteine

chemische Signale in elektrische Signale, ein Vorgang, den man als chemoelektrische

Transduktion bezeichnet.

1.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels

Das Riechepithel der Landwirbeltiere liegt als Verbund einzelner Zellschichten in der

Nasenhöhle. Es besteht aus Riechsinneszellen (Riechzellen, olfaktorische Rezeptor-Neurone,

ORN), Stützzellen, Basalzellen und in geringerem Umfang aus Phospholipase C-β2 positiven

Zellen (PLC-β2-Zellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005). Seine Oberfläche wird von einer

dünnen wässrigen Schleimschicht, dem Mukus, feucht gehalten und geschützt.

Abb. 1.1 Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels. OE:

Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien der

Riechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2

positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ:

Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt, 1993).

1 Einleitung

2

Der Mukus wird von unterhalb des Epithels liegenden Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen,

sezerniert. Er enthält die für den Riechvorgang notwendigen Elektrolyte und hydrophile,

olfaktorische Bindeproteine (Pelosi, 1994), die die Diffusion der überwiegend hydrophoben

Duftmoleküle zu den Riechsinneszellen erleichtern (Ache und Restrepo, 2000).

Die Lebensdauer von Riechzellen ist auf etwa 4 Wochen begrenzt (Breipohl et al., 1986;

Farbman, 1990). Basalzellen, die unterhalb der Stützzellen liegen, dienen als Stammzellen,

aus denen zeitlebens neue Riechzellen hervorgehen (Breipohl et al, 1986; Carr und Farbman,

1993). Olfaktorische Neurone liefern somit ein Beispiel für die adulte Neurogenese von

Stammzellen, ein interessantes, aber noch wenig erforschtes Gebiet.

Die palisadenartig angeordneten Stützzellen halten die Neurone in einer stabilen Position und

begrenzen das Riechepithel zur Nasenhöhle hin. Die lateralen Membranen der am apikalen

Pol gelegenen Mikrovilli sind durch tight junctions mit den Membranen der Cilienknöpfe

verknüpft und verhindern so eine Durchmischung des Mukus mit der interstitiellen

Flüssigkeit. Stützzellen besitzen ähnliche Eigenschaften wie die Gliazellen des

Zentralnervensystems (ZNS). Sie phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone, puffern

das extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell,

1982) und besitzen elektrische Eigenschaften, messbar als Ionenstrom über der Membran

(Vogalis et al., 2004).

Bei den PLC-β2-Zellen handelt es sich vermutlich um einen zweiten Typ chemosensorischer

Zellen, dessen Existenz und Beteiligung am olfaktorischen Prozess bereits 1975 durch F.

Jourdan postuliert wurde. Morphologisch ähneln diese Zellen, die zu etwa 5% zum

Abb. 1.2 Isolierte

Riechzelle aus Rana

pipiens. Differential-

Interferenz Kontrast-

bild 1:100; (S.J.Kleene,

R.C. Gesteland, 1981).

Riechzellen sind primäre, bipolare Neurone. Vom Zellkörper

ausgehend entsenden sie einen Dendriten zur Oberfläche des

olfaktorischen Epithels. Die Axone der Riechzellen münden

gebündelt im Riechkolben (Bulbus olfactorius), der ersten

Station zentralnervöser Verarbeitung. Jeder Dendrit ist an

seinem apikalen Ende knopfartig erweitert und trägt 10-20

Cilien (Menco, 1983), eine Struktur, die man als dendritischen

Knopf bezeichnet. Die Cilien der Säuger besitzen eine Länge

von etwa 50µm (Finger et al., 2000). Ihre Membranen sind die

Träger der Duftstoff-Rezeptoren und bilden im Mukus eine

große chemosensorische Fläche (Menco, 1980; Buck und Axel,

1991).

1 Einleitung

3

Riechepithel beitragen, mehr den Stützzellen. Möglicherweise handelt es sich aber um

sekundäre bipolare Neurone (Elsässer et al., 2005), deren Axone wahrscheinlich über

afferente Neurone mit dem Gehirn in Verbindung stehen. Die PLC-β2-Zellen münden an

ihrem anterioren Ende in einem Mikrovilli-Saum mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einen

zum kanonischen Signalweg der Riechzellen alternativen Mechanismus in Gang setzen (Sklar

et al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al., 1993; Elsässer et al., 2005).

1.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade

Die olfaktorische Transduktionskaskade (Abb. 1.3) beginnt, wenn Geruchsstoffe aus der

Atemluft an die Duftstoff-Rezeptoren der Cilienmembranen binden (Buck und Axel, 1991;

Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild und Restrepo, 1998). Bei

Säugern repräsentieren die Duftstoff-Rezeptoren mit etwa 1000 Vertretern die größte Familie

der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Firestein, 2001). Die nach Aktivierung des

olfaktorischen G-Proteins (Golf; Jones und Reed, 1989) dissoziierte α-Untereinheit stimuliert

eine membranständige Typ III-Adenylatzyklase (AC III; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al.,

1989; Bakalyar und Reed, 1990). Diese verstärkt das Signal, indem sie die Produktion von

cyclischem AMP (cAMP) aus ATP katalysiert. Durch den schnellen Anstieg der

intrazellulären cAMP-Konzentration (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe und Gold,

1993) öffnen cyclisch-Nukleotid gesteuerte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in der

Plasmamembran (Nakamura und Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992) und

leiten neben Natrium-Ionen verstärkt Calcium-Ionen in das ciliäre Lumen (Dzeja et al., 1999).

Die höhere Leitfähigkeit des CNG-Kanals spielt eine untergeordnete Rolle bei der

Depolarisierung der Membran, entscheidender ist der resultierende Anstieg der intrazellulären

Calcium-Konzentration [Ca2+

]i. Im mikromolaren Bereich bewirkt dieser die Öffnung Ca2+

-

aktivierter Chlorid-Kanäle (Kleene und Gestland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi und Yau,

1993; Hallani et al., 1998) und den Ausstrom von Chlorid-Ionen. In isolierten ORNs trägt

dieser Auswärtsstrom bis zu 80% des Rezeptor-Potentials (Lowe und Gold, 1993; Kleene,

1997). Dies ist insofern ungewöhnlich, da Chlorid-Kanäle normalerweise in Nervenzellen

durch Einstrom von Cl- inhibitorisch wirken. Die Ursache für den ungewöhnlichen Cl

--Efflux

in ORNs liegt in der hohen intrazellulären Cl--Konzentration im Bereich der Cilien (Reuter et

al., 1998). Die Depolarsierung der Cilienmembran durch das Öffnen der CNG-Kanäle wird

also zusätzlich durch den Ausstrom von Chlorid verstärkt und führt schließlich zur Auslösung

von Aktionspotentialen (Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999).

1 Einleitung

4

Bei der Abschaltung des Signals erfüllt Ca2+

erneut mehrere Funktionen: Im Komplex mit

Calmodulin inhibiert Ca2+

die Signalkaskade durch negative Rückkopplung, indem es den

Abbau von cAMP durch die Aktivierung der Ca2+

/ Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase

(PDE) stimuliert (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Zusätzlich führt die Aktivierung der

CaM-Kinase II zur Phosphorylierung der Adenylatzyklase, die dadurch inaktiviert wird

(Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Ca2+

/ Calmodulin bindet außerdem mit hoher

Affinität an Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle, deren Empfindlichkeit für cAMP

dadurch um ein Vielfaches reduziert wird (Chen und Yau, 1994; Liu et al., 1994;

Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004). Überschüssiges Ca2+

wird durch Na+/ Ca

2+-Austauscher entfernt. Das Zusammenwirken dieser Mechanismen

bewirkt zunächst eine Adaption der Riechzelle, bis anschließend das Ruhepotential

wiederhergestellt ist.

In dem zur olfaktorischen Signaltransduktion der Cilien alternativen Mechanismus der

PLC-β2-Zellen wird kein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration beobachtet (Sklar

et al., 1986). Stattdessen steigt die Konzentration an Inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP3) stark

Abb. 1.3 Schematische Darstellung der Signaltransduktion in olfaktorischen

Rezeptor-Neuronen der Maus. (R): G-Protein gekoppelter Riechrezeptor;

(Golf): olfaktorisches G-Protein; (CaMK): CaM-Kinase II; (AC):

Adenylatzyklase Typ III; (A2, A4, B1b): Kanalproteine des CNG-Kanals;

(grün): Ca2+

-gesteuerter Cl--Kanal; (PDE): Phosphodiesterase; (grüne

Pfeile): excitatorische Wege; (rote Pfeile): inhibitorische Wege (siehe Text);

(NKCC1): Chloridionen-Transporter; (NCX): Ca2+

/Na+-Antiporter; (siehe

Text; verändert nach: Frings, 2001).

1 Einleitung

5

an (Restrepo et al., 1990; Fadool und Ache, 1992; Schild et al., 1995; Bruch, 1996;

Kashiwayanagi et al., 1996; Kaur et al., 2001; Spehr et al., 2002). Es konnten verschiedene

Proteine des InsP3-vermittelten Signalwegs in den Mikrovilli-tragenden Zellen innerhalb der

Stützzellschicht kolokalisiert werden. Dazu gehören die Phospholipase C (PLC-β2), der

InsP3-Rezeptor Typ III (InsP3R-III) und ein TRP-Kanal (TRPC6, transient receptor potential

channel 6). Der Anstieg von [Ca2+

]i nach Bindung von Duftstoffen an die Rezeptoren in den

Mikrovilli-Membranen wurde durch Ca2+

-Imaging gezeigt. Es ist bisher noch nicht geklärt, ob

bestimmte Duftstoffe nur durch diesen Signalweg rezipiert werden oder ob diese so genannten

PLC-β2-Zellen modulatorisch wirken (Elsässer et al., 2005).

1.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion

Molekulare Details und funktionelle Zusammenhänge, die in der Vergangenheit zum

Verständnis zellphysiologischer Abläufe beim Riechvorgang beigetragen haben, stammen

hauptsächlich aus elektrophysiologischen und molekularbiologischen Untersuchungen. Die

Entdeckung, dass Geruchsstoffe cAMP-vermittelte Signalwege in Gang setzen (Pace et al.,

1985), lenkte die Aufmerksamkeit auf das olfaktorische System. Homologe Sequenzen zu den

molekularen Komponenten dieses Transduktionsweges waren für die Durchmusterung von

cDNA-Banken längst verfügbar. Golf, AC III und die CNG A2-Untereinheit des CNG-Kanals

konnten mit dieser Strategie erfolgreich kloniert werden (Jones und Reed, 1989; Bakalyar und

Reed, 1990; Dhallan et al., 1990). Analog wurden 1991 die Gene der Geruchsrezeptoren

durch Linda Buck und Richard Axel kloniert, wofür beide 2004 mit dem Nobel-Preis

ausgezeichnet wurden.

Es scheint, als seien die Hauptkomponenten der olfaktorischen Transduktionskaskade

identifiziert und durch Anwendung der Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) an

isolierten ORNs konnten bereits viele Eigenschaften der beteiligten Kanalproteine studiert

werden. Eine Reihe ungeklärter Fragen bleibt dennoch bestehen und Erkenntnisse werfen

erneut Fragen auf. Zum Beispiel ist es auf Grund fehlender Homologien noch nicht gelungen,

eine Aussage über die molekulare Struktur des Ca2+

-gesteuerten Cl--Kanals zu treffen (Frings,

1999; Eggermont, 2003). Auch die räumliche Anordnung aller Interaktionspartner entlang der

Cilienmembran ist nur ansatzweise geklärt (Reisert et al., 2003). Regulatorische Prozesse und

die beteiligten Proteine, die bei der Adaptation eine Rolle spielen, sind ebenfalls nur teilweise

bekannt. Über die Beteiligung alternativer Transduktionsmechanismen am Riechprozess kann

bisher nur auf Grund lückenhafter Identifikation vorhandener Proteine gemutmaßt werden

(Boekhoff et al., 1990; Steinlen et al., 1990; Breer und Boekhoff, 1991; Fülle et al., 1995;

1 Einleitung

6

Schild et al., 1995; Leinders-Zufall et al., 1996; Juilfs et al., 1997; Gold, 1999; Lischka et al.,

1999; Meyer et al., 2000; Elsässer et al., 2005; eine Übersicht gibt Frings, 2001).

Die Durchführung einer umfassenden Proteom-Studie, die auch die Identifizierung

unbekannter Proteine ermöglicht, kann viel dazu beitragen, fehlende Glieder der

Signaltransduktionskette aufzuspüren und ein detaillierteres Bild aller beteiligten Prozesse zu

entwerfen.

1.4 Protein-Analytik

Die massenspektrometrische Identifizierung (MS) von Proteinen, die zuvor durch ein- oder

zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt wurden, ist mittlerweile eine etablierte

Vorgehensweise in Proteom-Studien. Dabei werden die Proteine zunächst im Gel

proteolytisch gespalten und die daraus eluierten Peptide anschließend massenspektrometrisch

analysiert. Abbildung 1.4 zeigt im Überblick die unterschiedlichen MS-Strategien, die zur

Identifizierung und Charakterisierung der Proteine eingesetzt werden.

1 Einleitung

7

Analyse-Zeiten konnten im Vergleich zur davor üblicherweise durchgeführten Edman-

Sequenzierung (Edman, 1967), bei der Proteine schrittweise durch Modifikation und

Abspaltung der N-terminalen Aminosäure abgebaut und die einzelnen Aminosäuren

schließlich chromatographisch analysiert werden, erheblich verkürzt werden.

1.4.1 Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese

Aufgrund der besseren Auflösung sind zweidimensionale Verfahren bei der

gelelektrophoretischen Auftrennung komplexer Proteingemische zu bevorzugen. Die

klassische Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei der Proteine in der ersten

Dimension entlang eines pH-Gradienten bis zur Stelle ihres isoelektrischen Punktes (IP)

wandern (O´Farrell, 1975), ist jedoch zur Analyse von Membranproteinen meistens nicht

geeignet (Hartinger et al., 1996; Santoni et al., 2000; Navarre et al., 2002; Rais et al., 2004).

Ursache dafür ist, dass viele Membranproteine aufgrund der Hydrophobizität ihrer trans-

membranen Regionen nur schwer löslich sind und deshalb insbesondere bei ihrem IP

präzipitieren. Eine Möglichkeit, Membranproteine dennoch quantitativ im Gel darzustellen,

eröffnet sich durch die Wahl geeigneter Detergenzien. Im denaturierenden System hat sich

besonders der Einsatz kationischer Detergenzien in saurem Milieu bewährt (Macfarlane,

1983; Macfarlane, 1989; Hartinger et al., 1996; Navarre et al., 2002). Auf Grund des sauren

pH-Wertes (pH 3 - 4) werden einige lösliche Proteine noch im Probenpuffer gefällt und

Membranproteine können neben ihrer verbesserten Löslichkeit angereichert werden.

Im nativen System kann die Auftrennung ganzer Proteinkomplexe, inklusive aller

Interaktionspartner, durch Einsatz nichtionischer Detergenzien erreicht werden (Hames,

1990). Schägger und Jagow konnten diese Methode auch erfolgreich für die Aufreinigung von

Membranprotein-Komplexen etablieren (Schägger und Jagow, 1991; Schägger, 2003). Bei

dieser Methode ist zu berücksichtigen, dass der Trennerfolg wesentlich von der Art des

Detergenz und dem Detergenz-zu-Protein-Verhältnis abhängt und nicht für alle Komplexe

eines Proteingemischs eine Wahl gleichermaßen geeignet ist.

Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Proteinidentifizierung

(Erläuterungen im Text).

1 Einleitung

8

1.4.2 Massenspektrometrie

Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Detektion von Molekülmassen im

Hochvakuum. Im Massenspektrometer werden die zu analysierenden Probe-Moleküle durch

Ionisierung geladen und in einem Massenanalysator gemäß ihres Quotienten aus Masse zu

Ladung aufgetrennt. Der Detektor verstärkt in der Regel das Signal und liefert ein

Massenspektrum, das die Massen der unterschiedlichen Ionen abbildet. Abbildung 1.5 zeigt

die grundlegenden Funktionseinheiten eines Massenspektrometers.

1.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik

J.J. Thomson hat nach seiner Entdeckung des Elekrons, Voraussetzung für die Anwendung

der Elektronenstoß-Technik, bereits 1899 den ersten Massenspektrometer entwickelt. Es

handelt sich also um ein recht altes Verfahren. Die Analyse von Makromolekülen, zu denen

auch die Proteine gehören, gelang allerdings erst ab 1976 nach Einführung

massenspektrometrischer Desorptionsmethoden (MacFarlane, Torgerson, 1976), bei denen

Analyte schonender durch Beschuss mit beschleunigten Primärteilchen (z.Bsp Cäsium-Ionen,

Argon, Photonen) ionisiert werden. Vorher standen keine geeigneten Ionisierungstechniken

zur Verfügung. Die Chemische- oder Elektronenstoß-Ionisation konnte erfolgreich nur auf

Moleküle bis 400Da angewendet werden, Makromoleküle jedoch zerfielen unter diesen

Bedingungen.

Mit der Einführung der Fast Atom Bombardment-Technik (FAB, Barber, 1981) wurden bei

der Ionisation erstmals Matrizes in kristalliner oder schwerflüchtiger flüssiger Form

Abb. 1.5 Funktionseinheiten eines Massenspektrometers mit Anwendungsmöglichkeiten

(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).

1 Einleitung

9

eingesetzt. Die Proben werden mit einer Matrix-Substanz (z. B. Glycerin,

4-Nitrobenzylalkohol) gemischt. Die hohe kinetische Energie beim Beschuss dieser Mischung

mit Primärteilchen führt zu einer Kollisionskaskade der Moleküle. Dabei werden

Sekundärpartikel erzeugt, die in die Gasphase diffundieren. Unter diesen Sekundärpartikeln

befinden sich unter anderem Protonen und die zu analysierenden Probe-Ionen. Die Matrix

unterstützt bei diesem Vorgang einerseits die effektive Energieübertragung und stellt die zur

Ionisierung notwendigen Protonen zur Verfügung, andererseits absorbiert sie einen Großteil

der kinetischen Energie der Primärpartikel und verhindert dadurch die Zersetzung der Probe.

Ihren Höhepunkt fand diese Art der schonenden Ionisierungstechnik mit der Etablierung der

Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI, Abb. 1.6) 1988 durch Tanaka und

gleichzeitig unabhängig durch Karas und Hillenkamp.

MALDI bildete zusammen mit der durch Fenn et al. 1989 eingeführten Electrospray

Ionisation (ESI) großer Biomoleküle die Voraussetzung für die Etablierung der

Massenspektrometrie als eine der wichtigsten Analyse-Methoden in der Peptid- und

Proteinanalytik.

Bei der ESI (Abb. 1.7), der zur Zeit mildesten Ionisierungstechnik (Cole, 1997), können

Analyte bis 100kDa ionisiert werden. Die sanfte Ionisierung konnte besonders deutlich bei

der Detektion nichtkovalenter Wechselwirkungen durch Ganem, 1991 und Katta, 1991

demonstriert werden. Die Methode zeichnet sich durch eine erhöhte Sensitivität aus, da im

Gegensatz zu MALDI keine einfach, sondern mehrfach geladenen Ionen erzeugt werden, die

Abb. 1.6 Schematische Darstellung der MALDI-Technik, bei

der die Probemoleküle fest in das Kristallgitter der Matrix

integriert werden. Durch die Energie eines gepulsten Lasers

werden Matrix- und Probemoleküle in die Gasphase überführt,

in der schließlich die Ionisation stattfindet.

1 Einleitung

10

leichter analysiert werden können (Westermeier, 2002). Substanzen können auch aus

komplexen Gemischen in sehr geringer Konzentration nachgewiesen werden.

Bei der Ionisierung befindet sich die gelöste Probe in einer wenige µm dicken Kapillare. Die

Ionenbildung erfolgt bei Atmosphärendruck direkt aus der Lösung. Dazu wird zwischen der

Spitze der Kapillare und dem Eingang zum Massenanalysator eine Hochspannung von etwa

3,5 kV angelegt. Gelangt die Analyt-Lösung in dieses starke elektrische Feld, dispergiert sie

in kleine geladene Tröpfchen, ein Vorgang, der durch einen scherenden Gasstrom aus

Stickstoff oder synthetischer Luft, der kontinuierlich aus einer koaxialen Stahlkapillare

austritt, zusätzlich unterstützt wird. Ein zweiter wärmender Gasstrom, meist Stickstoff, dient

als Trocknungsgas. Um die Spitze der Kapillare beobachtet man einen konusförmig

erweiterten Teilchenstrom, eine Erscheinung, die "Taylor cone" bezeichnet wird. Die

eigentliche Ionenbildung ist noch nicht vollständig verstanden und beginnt, wenn die

geladenen Tröpfchen des Aerosols auf dem Weg zum Massenanalysator durch Verdampfung

des Lösemittels zunehmend an Größe verlieren. Dadurch steigt die Ladungsdichte an der

Oberfläche. Die abstoßenden Coulomb-Kräfte zwischen gleichnamigen Ladungen bewirken

den Zusammenbruch der Oberflächenspannung. Dieser explosionsartige Prozeß führt dazu,

dass Ionen austreten.

1.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung

Als besonders schnell und weitgehend automatisierbar hat sich der heute häufig gebrauchte

"Peptidmassen-Fingerprint" (PMF) herausgestellt (Henzel et al.,1993; Mann et al., 1993;

Yates et al., 1993). Nach dem tryptischen Verdau werden die erhaltenen Peptide durch

Abb. 1.7 Vereinfachte Darstellung der Ionenbildung durch die Electrospray-Methode

(ESI). Die Ionisierung erfolgt bei Atmosphärendruck ("atmospheric pressure

ionization", API), die Massenanalyse im Vakuum. Detailierte Beschreibung, der

Abläufe: siehe Text.

1 Einleitung

11

Uezvm ⋅⋅=⋅⋅2

2

1∩

T

Lv =

z

m

Ue

LT ⋅

⋅⋅

=

2

2

eFlugstreckL

unggungsspannBeschleuniU

adungElementarle

LadungIonenz

gkeitGeschwindiv

Massem

=

=

=

−=

=

=

MALDI-MS analysiert. Die experimentell ermittelten Massen werden dann mit den

theoretischen Massen tryptischer Fragmente von Proteinen aus Datenbanken verglichen.

Allerdings können nur bekannte Proteine mit dieser Methode zuverlässig identifiziert werden.

Ein weiterer Nachteil ist, dass möglichst viele Peptide eines Proteins analysiert werden

müssen, um eine genügend hohe Treffsicherheit bei der Datenbank-Recherche zu

gewährleisten. Dies setzt voraus, dass die Probe möglichst rein und nicht zu komplex ist, da in

einem Gemisch mengenmäßig unterrepräsentierte Proteine hinter den starken Signalen

prominenter Proteine verschwinden. MALDI-Ionenquellen sind mehrheitlich an Time of

Flight (ToF) Analysatoren (Stephens, 1946) gekoppelt. Die Ionen werden durch Anlegen

einer Hochspannung in den Massenanalysator beschleunigt. Die Geschwindigkeit eines Ions

bei einer konstanten Beschleunigungsspannung ist umgekehrt proportional zu der Masse des

Ions. Die Flugzeit T ergibt sich aus dem einfachen Zusammenhang:

Die Ursache für die vergleichsweise geringe Sensitivität bei der ToF-Analyse liegt in der

geringen Ladung der Fragmente (vgl. 1.4.3.1) und in der beschränkten Detektionskapazität

aller gleichzeitig eintreffenden Signale.

Wie in Abbildung 1.5 bereits angedeutet, werden nicht nur Flugzeit-Analysatoren zur

Ionentrennung verwendet. Auch Massenfilter, so genannte Quadrupole (Paul, Steinwedel,

1953) können eingesetzt werden. Ein Quadrupol (Q) besteht aus vier parallelen, zylindrischen

Metallstäben (Abb. 1.8a). An den Stäben liegt eine Gleichspannung und eine

Wechselspannung im Hochfrequenz-Bereich (3kHz- 300MHz) an, wobei gegenüberliegende

Stäbe die gleiche Polarität der Gleichspannung und die gleiche Phase der Wechselspannung

besitzen. Ionen gleicher Masse und gleicher Ladung, so genannte resonante Ionen,

beschreiben auf der feldfreien z-Achse eine komplizierte oszillatorische Flugbahn und

passieren die Öffnung der Quadrupollinse. Nichtresonante Ionen dagegen kollidieren mit den

Quadrupol-Stäben. Ob ein Ion resonant oder nichtresonant ist, hängt von seiner Masse und

von der angelegten Gleich- und Wechselspannung ab. Durch Variation der Wechsel-

Spannung können verschiedene Ionen auf die richtige Flugbahn in Richtung Detektor

1 Einleitung

12

Abb. 1.8a Darstellung eines Quadrupol-Massenanalysators mit der Flugbahn eines resonanten und nichtre-

sonanten Ions. Resonante Ionen passieren die Quadrupollinse (blau) und werden detektiert.

Abb. 1.8b Betriebsmodi eines Quadrupols: Im mass scanning-Modus wird das ganze Ionenspektrum

(verschiedenfarbig) dargestellt. Im single mass transmission-Modus erreicht nur ein Ionen-Typ (mint) den

Detektor.

gebracht werden. Je nach Betriebsmodus (Abb. 1.8b) können diese Ionen gleicher oder

verschiedener Massen sein.

Kombiniert mit ToF-Analysatoren werden Quadrupole zusammen mit ESI-Quellen zur

Sequenzierung von Proteinen genutzt. Die Ionenbildung aus der Lösung (1.4.3.1) ermöglicht

zudem eine Vortrennung durch HPLC (High Performance oder High Pressure Liquid

Chromatography). Kapitel 1.4.3.3 beschreibt eine besonders effiziente massenspektro-

metrische Methode, die es ermöglicht, unbekannte Proteine auch in geringen Mengen aus

komplexen Gemischen zu identifizieren.

1.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF

Bei der Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Analyse wird die gelöste Probe bei besonders niedrigen

Flussraten im Nanoliter-Bereich (20 -250nL/ min) der Ionenquelle zugeführt, man spricht

deshalb auch von Nanospray-Ionisation (Wilm, Mann, 1996). Durch die verlängerte Messzeit

können Probenmengen im µl-Bereich analysiert werden. Auch Proteine, die nur in geringen

Mengen im Gemisch vertreten sind, werden durch Streckung des Messvolumens in einem

ausreichend großen Zeitfenster erfasst. Die Sensitivität der Messung ist im Vergleich zur

Peptidmassen-Fingerprint-Methode deutlich erhöht (Emmett, Caprioli, 1994).

Die niedrigen Flussraten werden durch das Pumpensystem einer vorgeschalteten HPLC-

Anlage gewährleistet (Nano-LC). Zur Vortrennung der Protein-Gemische werden Reverse

Phase-Säulen mit apolarem Füllmaterial benutzt. Das Füllmaterial, die so genannte stationäre

a b

1 Einleitung

13

Phase, besteht üblicherweise aus porösen Silica-Kugeln (Silicagele), die an ihrer Oberfläche

aliphatische C18-Ketten tragen und deren Porenweite zur Protein-Aufreinigung idealerweise

30nm beträgt. Das Lösemittel der Probe wird bei chromatographischen Trennverfahren als

mobile Phase bezeichnet. Üblich sind Wasser/ Acetonitril-Gradienten mit steigender

Hydrophobizität. Zu Beginn werden also apolare Proteine von der stationären Phase

zurückgehalten, während polare Proteine in der mobilen Phase verbleiben. Ein Anstieg der

Hydrophobizität in der mobilen Phase bewirkt, dass zunehmend hydrophobe Proteine von der

Säule eluiert werden, so dass apolare Proteine zuletzt den Massenspektrometer erreichen.

Die Sequenzierung von Proteinen kann nur in so genannten Tandem-Massenspektrometern

durchgeführt werden. Solche Massenspektrometer besitzen mehrere Analysatoren und eine

interponierte Kollisionszelle, die mit einem inerten Stoß-Gas, meist Argon, befüllt ist.

Abbildung 1.9 zeigt den Aufbau des Tandem-Massenspektrometers, wie er in dieser Arbeit

zur Protein-Identifizierung verwendet wurde.

Abb. 1.9 Schematische Darstellung des Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Spektrometers. Die Ionen

werden zur Kathode am Eingang des Spektrometers beschleunigt und gelangen in den

Massenanalysator Q0 und dann in Q1, wo bestimmte Ionen herausgefiltert werden, die dann in der

Kollissionszelle Q2 fragmentiert werden. Die Fragmente werden erneut beschleunigt und treten

durch eine Quadrupollinse in den ToF-Analysator ein, der mit einem Reflektor ausgestattet ist und

die Ionen vor der Detektion umlenkt (Erläuterung: Text). L/s: Sog-Leistung der Vakuum-Pumpe;

(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).

1 Einleitung

14

Die Ionen gelangen aus der ESI-Quelle durch eine Öffnung im Zentrum der Gegenelektrode

in den Analysatorteil des Massenspektrometers. Durch Q0, der ausschließlich im mass

scanning-Modus (Abb 1.8b) arbeitet, werden die Ionen kollisionsfrei auf die richtige Bahn

zum eigentlichen Massenfilter Q1 weitergeleitet. Q1 filtert im single mass transmission-

Modus Ionen mit einem konstanten Masse zu Ladungs-Quotienten heraus. Nur diese

Vorläufer-Ionen ("Precursor") werden zu einem bestimmten Zeitpunkt in die Kollisionszelle

beschleunigt, wo sie durch Kollision mit Argon-Atomen in viele verschiedene "Tochter-

Ionen" fragmentiert werden (Abb. 1.10).

Bei einer Kollisions-Energie von 10 - 100eV dissoziieren die Vorläufer-Ionen vorrangig

zwischen Carbonyl-Kohlenstoff und Amid-Stickstoff entlang des Peptidrückgrats und bilden

sequenzspezifische Ionenserien (Roepstorff und Fohlman 1984).

Die meisten Ionen sind vom b-oder y-Typ. Verbleibt nach der Spaltung die Ladung am N-

terminalen Ende des Fragmentions, entsteht ein b-Typ Ion. Verbleibt sie am C-Terminus,

wird ein y-Typ Ion gebildet.

Die so gebildeten Fragment-Ionen werden erneut beschleunigt und gelangen in den vertikal

zur Kollisionszelle angeordneten ToF-Analysator, wo sie durch ein elektrisches Pulsfeld

umgelenkt werden. Da die Ionen nicht auf gleicher Höhe in den Analysator gelangen, werden

sie nach halber Flugstrecke von einem Reflektor (Abb. 1.9) gespiegelt, der als

„Ionensammler“ dient, so dass Fragmente gleichen Typs von dort aus zur gleichen Zeit in

Richtung Detektor aufbrechen und gemäß ihres Masse zu Ladungs-Quotienten auch zur

gleichen Zeit dort eintreffen. Durch diese Fokussierung wird die Auflösung des

Abb. 1.10 Mögliche Bruchstellen des Peptid-Rückgrats

der Precursor-Ionen; (rot) am häufigsten betroffen, es

resultieren Ionen des b-oder y-Typs; (a, c, x, z) Ionen-

typen, die seltener entstehen (verändert nach:

www.matrixscience.com).

1 Einleitung

15

ToF-Analysators deutlich verbessert und dadurch auch die Genauigkeit der Messung, da sogar

gleiche Ionen verschiedener Isotope im Spektrum durch einen separaten Peak dargestellt

werden. Die Genauigkeit der Messung liegt im Bereich von +/- 0,1 Da.

Zur Detektion wird ein Mehrkanal-Detektor verwendet. Beim Auftreffen geladener Teilchen

auf die unter Hochspannung stehenden Platten des Detektors werden Elektronenströme

erzeugt, die sich lokal fortpflanzen und das Signal verstärken.

1.5 Ziel dieser Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist die Isolierung ciliärer Membranen vom olfaktorischen

Gesamtepithel der Ratte und die Etablierung einer gelelektrophoretischen Trennmethode um

die dort lokalisierten Membranproteine vollständig und in hoher Auflösung darzustellen. Mit

dieser Methode soll es im Anschluss durch MS-Analyse möglich sein, unbekannte Proteine zu

identifizieren und dadurch ein verfeinertes Bild aller beteiligten Prozesse der

Signaltransduktionskaskade zu entwerfen.

2 Material und Methoden

16


2.1 Chemikalien und Material

Die Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, in p.a.-Qualität von den Firmen

Amersham Biosciences (Freiburg), AppliChem (Darmstadt), Carl Roth GmbH (Karlsruhe),

Fluka Chemie GmbH (Buchs, CH), Grüssing (Filsum), J.T. Baker (Deventer, NL), MBI

Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), Merck KGaA (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), Serva

Electrophoresis GmbH (Heidelberg) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) bezogen.

Zum Ansetzen der Lösungen wurde ausschließlich Wasser aus der Milli-Q UF Plus-Anlage

der Fa. Millipore verwendet, für die nano-HPLC und Massenspektrometrie Wasser in HPLC-

Qualität.

Die Gelelektrophorese wurde in den Kammern PerfectBlueTM

Vertical Electrophoresis

System, Model Twin S und Twin M der Fa. peqLab Biotechnologie GmbH (Erlangen)

durchgeführt. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren mit der Blot-Apparatur SV20-

SDB der Fa. Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim) auf porablot®

PVDF-Membranen mit einer

Porengröße von 0,2µm der Fa. MACHEREY-NAGEL (Düren).

Die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase wurde durch EClTM

Plus detektiert und die Filme

(HyperfilmTM

ECl TM

) im HyperprocessorTM

Automatic Film Processor, sofern nicht anders

angegeben, entwickelt. Das Detektionssystem, die Filme und die Entwickler-Maschine

stammen von der Fa. Amersham Biosciences (Freiburg).


17

2.2 Lösungen

2.2.1 Lösungen für die Präparation

2.2.1.1 Lösungen für die Cilien-Präparation

Stamm-Lösung P 120mM NaCl

5mM KCl

1,6mM K2HPO4

25mM NaHCO3

7,5mM D-Glucose

pH 7,4

Calciumchlorid-Stammlösung 2M CaCl2 x 2H2O

Lösung A Protease Inhibitor M (Tab. 2.1):

1/ 100 des Gesamtvolumens in Stamm-Lösung P

kurz vor Gebrauch angesetzt

Lösung B 10mM CaCl2 x 2H2O in Lösung A


Saccharose-Lösung 45% (w/ v) Saccharose

2.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel

Puffer A 20mM NaCl

1mM EDTA

0,1mM EGTA

1mM DTT

20mM HEPES

pH 7,4

Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)

1Tablette/ 50ml

0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin


18

Puffer B 500mM NaCl

1mM EDTA

0,1mM EGTA

1mM DTT

20mM HEPES

pH 7,4


1Tablette/ 50ml


Puffer C (M) 150mM NaCl

1mM EDTA

0,1mM EGTA

1mM DTT

20mM HEPES

pH 7,4


1Tablette/ 50ml


2.2.1.3 Verwendete Protease-Inhibitoren

Die bei den Präparationen verwendeten Lösungen (2.2.1.1 und 2.2.1.2) enthielten Protease-

Inhibitoren um den proteolytischen Abbau von Proteinen durch freiwerdende endogene

Proteasen zu verhindern.

Bei der Cilienpräparation wurde der EDTA- und EGTA-freie Protease-Inhibitor Mix M

(Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Tab. 2.1) verwendet um die Chelatierung von

Calcium-Ionen auszuschließen. Der Complete Protease Inhibitor Cocktail in Tablettenform

stammte von der Fa. Roche Diagnostics (Penzberg). Metalloproteasen wurden zusätzlich

durch o-Phenanthrolin gehemmt, das bevorzugt bivalente Schwermetall-Ionen (u.a. Zn2+

)

komplexiert.


19

Inhibitor Zielproteasen

AEBSF-HCl viele Serin-Proteasen (u.a. Thrombin)

Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)

Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)

E-64 Papain (Cystein-Protease)

Leupeptin u.a. Phospholipase D

Pepstatin A Aspartat-Proteasen (u.a. Pepsin, Renin)

Tab. 2.1 Inhibitoren und Zielproteasen des Protease Inhibitor Mix M (Serva Electrophoresis GmbH,

Heidelberg).

Inhibitor Zielproteasen

APMSF-HCl Serin-Proteasen (u.a. Trypsin)

Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)

Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)

3,4-Dichloroisocumarin viele Serin-Proteasen (u.a. Elastase)

E-64 Papain (Cystein-Protease)

Leupeptin u.a. PhospholipaseD

Pefabloc SC Serin-Proteasen (u.a. Thrombin)

Phosphoramidon Thermolysin, Collagenase

Tab. 2.2 Inhibitoren und Zielproteasen des Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Penzberg).

2.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode

Tris/ SDS-Lösung 1M Tris/ HCl

pH 7,5

1% (w/ v) SDS

Färbe-Lösung 0,5% (w/ v) Amidoschwarz B10

45% (v/ v) Methanol

10% (v/ v) Essigsäure

Entfärbe-Lösung 90% (v/ v) Methanol


Elutions-Lösung 50% (v/ v) Ethanol

25mM NaOH

50µl EDTA


20

2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase

PB-Puffer 10mM Tris

100µM PMSF

10mM β-Mercaptoethanol

3mM MgCl2 x 6H2O

pH 8,0

Puffer C 10mM Tris

3mM MgCl2 x 6H2O

2mM EGTA

pH 7,4

2.2.4 Lösungen für die SDS PAGE

5x-Probenpuffer 10% (v/v) Glycerol

2% (w/v) SDS

0,01% (w/v) Bromphenolblau

62,6mM Tris pH6.8

20x DTT 2M DTT

Lagerung: -20°C

Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-

Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1

Sammelgelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 6,8

Trenngelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 8.8

SDS-Lösung 10% (w/v) SDS

APS-Lösung 10% (w/v) Ammoniumperoxodisulfat

Gebrauchsfertige 99% Tetramethylendiamin-Lösung (TEMED)

10x Elektrodenpuffer 0,25M Tris

1,92M Glycin

2% (w/v) SDS

pH 8.3


21

2.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE

2x Probenpuffer 6M Harnstoff

0,2% (w/v) CTAB

10% (v/v) Glycerol

75mM DTT

0,05% (w/v) PyroninY


Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-

Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1

Stabilisierte, gebrauchsfertige, 2%ige N,N´-Methylenbisacrylamid-Stammlösung

Sammelgelpuffer 0,3M KH2PO4

pH 4.1

Trenngelpuffer 0,3M KH2PO4

pH 2.1

Ascorbinsäure-Lösung 80mM Ascorbinsäure


CTAB-Lösung 250mM CTAB


Eisensulfat-Lösung 25mM Fe(II)SO4 x 7H2O


H2O2-Lösung 0,03% (v/v) Wasserstoffperoxid

1x Elektrodenpuffer (CTAB) 150mM Glycin

0,1% (w/v) CTAB

50mM H3PO4

SDS-Lyse-Puffer 1/ 5 des Endvolumens 5x Probenpuffer (2.2.3)

37,5mM DTT

1mM PMSF

18mM Tris, pH 6.8



22

SDS-PAGE-Lösungen (siehe 2.2.3)

2.2.6 Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung

Fixier-Lösung 30% (v/v) Ethanol

10% (v/v) Essigsäure

Sensitisationslösung 9,9mM K2O6S4

0,5M Kaliumacetat

30% (v/v) Ethanol

Silbernitrat-Lösung 11,8mM AgNO3

Entwickler-Lösung 0,22M K2CO3

5µM Na2S2O3 x 5H2O

0,011% (v/ v) Formaldehyd

Stopp-Lösung 0,33M Tris


2.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung

Fixier-Lösung 50% (v/v) Methanol

2% (v/v) Essigsäure

Inkubationslösung 34% (v/v) Methanol

2% (v/v) H3PO4

17% (w/v) (NH4)2SO4

Färbe-Lösung 34% (v/v) Methanol

2% (v/v) H3PO4

17% (w/v) (NH4)2SO4

0,066% (w/v) Coomassie G-250


23

2.2.8 Lösungen für die Western Blot-Analyse

Transferpuffer 25mM Tris

0,19M Glycin

20% (v/v) Methanol

pH 8,3 - 8,4

1x PBS 8,1mM Na2HPO4 x 2H2O

1,9mM NaH2PO4 x H2O

0,13M NaCl

pH 7,4

Milchpulver-Blocklösung 5% (w/v) Milchpulver

in 1x PBS

Lagerung: 4 - 8°C; 0,02% NaN3

Milchpulver-Verdünnungslösung 1% (w/v) Milchpulver

in 1x PBS


Wasch-Puffer 0,1% (v/v) Triton X-100

in 1x PBS

ECL-Plus Detektionslösung Lösung A zu Lösung B im Verhältnis 40:1

kurz vor Gebrauch angesetzt,

lichtempfindlich

2.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine

Acetonitril/ H2O 50% (v/v) Acetonitril

Bicarbonat-Puffer 40mM NH4HCO3

DTT 10mM DTT

Iodacetamid 55mM Iodacetamid

in Bicarbonat-Puffer

kurz vor Gebrauch angesetzt,

lichtempfindlich


24

Trypsin-Stocklösung Lyophilisat + 40µl 1mM HCl

1Woche bei -20°C haltbar

Trypsin-Gebrauchslösung 10µl Trypsin-Stocklösung

290µl Bicarbonat-Puffer

2.3 Größenstandards und Antikörper

2.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese

2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGE

Für Gele der Größe 5,5 x 8,5cm wurde ein Volumen von 5µl eingesetzt, 7µl bei einer

Gelgröße von 11 x 14cm. Die Dicke der Gele in beiden Kammersystemen TwinS und TwinM

(2.1) betrug 1,5mm.

Sowohl für die eindimensionale als auch für die zweite Dimension

der zweidimensionalen Gelelektrophorese dienten rekombinante, in

E.coli exprimierte Farbstoff-gekoppelte Proteine des PageRulerTM

Protein Ladder (ready to use) SM0671 mit Molekulargewichten von

~ 10 000 bis 180 000Da (Dalton) der MBI Fermentas GmbH (St.

Leon-Rot). Die Konzentrationen der einzelnen Proteine liegen

zwischen 0,1 - 0,2mg/ ml.

Abb. 2.1 SM0671


25

2.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE

Für die CTAB-PAGE wurde der „High MolecularWeight Marker“ (HMW-Größenstandard)

SDS-6H der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet. Die Proteine des

Lyophilisats wurden in 0,75ml H2O gelöst und mit 0,75ml 2x Probenpuffer (2.2.4) versetzt.

Die Gesamtkonzentration der Lösung betrug 2mg/ ml.

Molekulargewicht (Da) Protein

205 000 Myosin

116 000 beta-Galactosidase

97 000 Phosphorylase B

66 000 Rinderserum Albumin

45 000 Ovalbumin

29 000 Carboanhydrase

Tab. 2.3 Proteine und Molekulargewichte HMW-Größenstandards SDS-6H.

Vor dem Einsatz wurde der Marker 5min bei 70°C im Heizblock erwärmt, gevortext und mit

13.000g zentrifugiert. Ein Volumen von 8µl aus dem Überstand pipettiert erwies sich als ideal

bei einer Gelgröße von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm.


26

2.3.2 Antikörper für die Western Blot-Analyse

Die verwendeten Antikörper dienten ausschließlich dem immunologischen Nachweis von

Markerproteinen („Präparationsmarkern“) bei der Western Blot-Analyse (2.10).

2.3.2.1 Primäre Antikörper

Name Antigen Größe Spender Isotyp Spezifität Hersteller

α- ACIII

C-Terminus

Adenylatcyclase

III der Ratte

128,9kDa

Glykosylierung

möglich

Kaninchen

Polyklonale,

affinitätsgereinigte

IgG

rt, ms,

hm

Santa Cruz

Biotechn.

Inc.,Heidelberg

α-CNG

A2

C-terminal

R643-660

CNG- A2 der

Ratte

76,2kDa

Glykosylierung

möglich

Kaninchen

Polyklonale,


IgG

rb, ms, rb

Sigma-Aldrich

Chemie GmbH,

Steinheim

α-CNG

A4

C-Terminus

CNG- A4 der

Ratte

65,6kDa Maus Monoklonal rt

California

Institute of

Technology,

Pasadena

α-Gα s/ olf

C-Terminus

αs-UE

olfaktorisches

G- Protein der

Ratte

44,2kDa Kaninchen

Polyklonale,


IgG

rt, ms,

hm

Santa Cruz

Biotechn.

Inc.,Heidelberg

α-

Occludin

N-Terminus

Occludin des

Menschen

65kDa

Phosphorylierung

möglich

Ziege

Polyklonale,


IgG

rt, ms,

hm

Santa Cruz

Biotechnologies

Inc., heidelberg

α-

Prohibitin

Mitochondriales

Gesamtprotein

der Ratte

~30kDa Kaninchen Polyklonale IgG

rt, ms,

pg, ch,

hm

Abcam

Limited,

Cambridge

Tab. 2.4 Spezifikation der Erst- Antikörper für die Western Blot-Analyse.

2.3.2.2 Sekundäre Antikörper

Die Antigen-Antikörper Komplexe wurden mit Zweit-Antikörpern nachgewiesen, die an

Meerrettich-Peroxidase gekoppelt waren.

Name Antigen Spender Isotyp Spezifität Hersteller

α-rb IgG

HRP

konjugiert

Kaninchen

IgG Ziege

Polyklonale

IgG,gereinigt durch

Ionenaustausch-

Chromatographie

Kaninchen

IgG

Sigma-Aldrich

Chemie GmbH,

Steinheim

α-gt IgG

HRP

konjugiert

Ziegen IgG Kaninchen

Polyklonale,


IgG

Ziege IgG

Sigma-Aldrich

Chemie GmbH,

Steinheim

α-ms IgG

HRP

konjugiert

Maus IgG Ziege

Polyklonale,


IgG

Maus IgG

Sigma-Aldrich

Chemie GmbH,

Steinheim

Tab. 2.4 Spezifikation der Meerrrettich-Peroxidase konjugierten Zweit-Antikörper für die Western Blot-

Analyse.


27

2.4 Tiere

Für die Präparation des olfaktorischen Epithels wurden 8 - 12 Wochen alte weibliche Wistar-

Ratten (Rattus norvegicus) verwendet. Die Ratten stammten aus dem Zentralen Tierlabor

(ZTL) der Universität Heidelberg, wo sie unter standardisierten Bedingungen bei einem

künstlichen Tag-Nacht-Rhytmus gehalten werden. Lieferant des ZTL ist die Fa. Charles River

Laboratories Inc. (Bad Königshofen).

2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel

Die in der nachfolgend beschriebenen Methode verwendeten Lösungen und Gefäße wurden

stets eisgekühlt oder vor Beginn der Präparation im Kühlraum bereitgestellt.

2.5.1 Präparation und Isolierung des Gesamtepithels

Zur Charakterisierung ciliärer Proteine musste zunächst das Gesamtepithel isoliert werden.

Dazu wurden die Ratten in CO2 getötet und anschließend dekapitiert.

Die Köpfe wurden kurz in eiskalter Stamm-Lösung P gekühlt und von Blut befreit. Das Fell

wurde mit der Präparier-Schere entfernt. Durch das Hinterhauptsloch wurde entlang der

koronalen Naht ein Schnitt vom posterioren Ende nach anterior (Abb. 2.2) bis knapp vor das

Stirnbein geführt und die Nase sagittal in der Ebene des Septums aufgebrochen.

Das Riechepithel liegt scheibchenförmig im Dach der Nasenhöhle und hebt sich auf Grund

seiner gelbbraunen Pigmentierung und seiner stapelartigen Anordnung in den Konchen gut

Abb. 2.2 Schädel der Ratte. Mit der Präparier-Schere

wurde ein Schnitt entlang der koronalen Naht geführt.


28

von seiner Umgebung ab (Abb. 2.3). Die Scheibchen wurden direkt mit einer feinen Pinzette

entnommen, in Stamm-Lösung P durch kurzes Eintauchen gewaschen und so von eventuell

noch anhaftenden Haaren und Blutresten befreit. Dann wurden sie in ein 8ml Schnappdeckel-

Glas (neoLab, Heidelberg) mit Lösung A überführt.

2.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode

Die Decilierung der Riechzellen wurde durch die Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967)

erreicht. Der Calcium-Schock ist eine von mehreren Methoden (Sandoz, 1988), die durch

mechanischen Stress die Abschnürung ciliärer Membranen verursacht. Es ist unbekannt, ob

der Einfluss von Calcium-Ionen den Zusammenbruch der Cilienstruktur direkt durch

Depolymerisation der Mikrotubuli bewirkt. Möglich ist auch die Aktivierung spezifischer

Proteasen, die durch Hydrolyse Bestandteile des tubulären Systems destabilisieren (Sandoz,

1988).

Pro Schnappdeckel-Glas wurden die Epithelien von fünf Ratten in 3ml Lösung A gewaschen.

Der Überstand wurde vorsichtig und möglichst vollständig mit einer 5ml Gilson-Pipette

abgenommen und das Epithel in 4ml Lösung B, die 10mM Calcium-Ionen enthält,

aufgenommen. Die Herstellung von Lösung B gehört zu einem der kritischen Schritte der

Präparation: Die Zugabe der Calcium-Stammlösung zu einem Teil von Lösung A sollte sehr

langsam und unter heftigem Rühren erfolgen, da sonst schwerlösliches (Ca)3(PO4)2

präzipitiert und freies Ca2+

nicht mehr für den Calcium-Schock zur Verfügung steht.

Abb. 2.3 Sagittalschnitt durch den Kopf der Ratte. Das

olfaktorische Epithel (OE) hebt sich mit seiner gelb-

bräunlichen Pigmentierung deutlich von der Umgebung

ab. Rechts davon befinden sich Bulbus olfactorius (BO)

und Siebbein (SB). Davor respiratorisches Epithel (RE).


29

Anschließend wurde 30min bei 4°C und Stufe 4 (IKAMAG RH, Janke und Kunkel KG,

Staufen) Rührfisch, Grösse 12 x 5mm (neoLab, Heidelberg) gerührt (Abb. 2.4).

Danach wurde der gesamte Ansatz in ein 10ml Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen (neoLab)

überführt und mit 7700g 5min bei 4°C zentrifugiert (Hermle-Kühlzentrifuge, HERMLE-

Labortechnik, Wehingen). Der Überstand mit den Cilien wurde in ein 15ml Falcon-Röhrchen

überführt und das Pellet erneut in 2ml Lösung B resuspendiert und mit 7700g 5min bei 4°C

zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Überstand der vorherigen Zentrifugation vereint.

Der letzte Zentrifugationsschritt wurde noch einmal wiederholt, die Gewebepellets wurden

bei -20°C gelagert.

Die vereinten Überstände wurden in einem 12ml Ultrazentrifugen-Röhrchen (Beckman

Coulter GmbH, Krefeld) auf 4ml 45% Saccharose-Lösung geschichtet und mit 100 000g

30min bei 4°C ultrazentrifugiert (Beckman L-70 Ultra-Zentrifuge, SW40 Ti-Rotor).

Abb. 2.4 Calcium-Schock der Olfaktorischen

Epithelien unter Rühren im Schnappdeckel-Glas.

Die Cilienbande befindet sich nach der Ultrazentrifugation sichtbar als

dichter, dunkler Nebel auf der Saccharose des Stufengradienten.

Abb. 2.5 Die dunkle Cilienbande befindet sich auf der Saccharose des

Stufengradienten.


30

Die Cilienbande wurde mit der 1ml Gilson-Pipette abgenommen und im UZ-Röhrchen mit

dem zehnfachen Volumen Lösung B verdünnt und erneut 30min bei 100 000g und 4°C

ultrazentrifugiert. Das als weisser Fleck mit gelblichem Ring deutlich sichtbare Cilienpellet

wurde bei -20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Grösse des Pellets und somit die

Ausbeute an Protein richtet sich nach dem Alter der Ratten. Ratten im Alter von acht Wochen

erzielen nur 50% der Proteinausbeute 12-wöchiger Ratten.

2.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999)

Die Isolation des Gesamtepithels entspricht der in 2.5.1 beschriebenen Vorgehensweise. Die

Riechepithelien von 2 Ratten wurden in einem 15ml Falcon-Röhrchen in flüssigem Stickstoff

schockgefroren. Nach dem Auftauen wurde das Gewebe in einen 20ml Glashomogenisator

überführt und in 10ml Puffer A (hypoton) homogenisiert. Anschließend wurde mit 300g 5min

bei 4°C in der Hermle-Kühlzentrifuge (2.5.2) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 10ml

UZ-Röhrchen überführt und 30min bei 100 000g (Beckman L-70 Ultrazentrifuge, SW40 Ti-

Rotor) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10ml Puffer A resuspendiert und erneut 30min bei

100 000g (SW40 Ti) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10ml Puffer B

(hyperton) resuspendiert und nochmals unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Das

Protein-Pellet aus Gesamtgewebe wurde in 100µl Puffer C(M) aufgenommen.

2.6 PNGaseF- und Benzonase-Behandlung

Zur Entfernung von N-Glykosiden wurde PNGaseF (500Units/ml, Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, Steinheim) verwendet. Benzonase®

(25000Units/ml, Merck KgaA, Darmstadt) ist eine

rekombinant in E.coli exprimierte Endonuklease aus Serratia marcescens, die alle Formen

von Nukleinsäuren abbaut.

Behandelt wurden die Cilien-Präparationen, deren Proteine für Gele mit anschließender

Massenspektrometrie (2.10) verwendet wurden. Je nach Größe des Cilienpellets wurde dieses

mit Hilfe des Ultraschallbades (Transsonic 460, neoLab, Heidelberg) in einem Volumen von

120-300µl PB-Puffer resuspendiert und mit jeweils 4µl PNGaseF und 4µl Benzonase versetzt,

gemischt und 30min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in ein

UZ-Röhrchen überführt, mit Puffer C auf 10ml aufgefüllt und 30min bei 100 000g und 4°C

pelletiert. Das Pellet wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C gelagert.


31

2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-

Methode

Die Amidoschwarz-Methode, auch Schaffner/ Weissman-Methode (Schaffner und Weissman,

1973) genannt, zeichnet sich gegenüber gängigen Methoden der Protein-Bestimmung dadurch

aus, dass gelöstes Protein durch Zugabe von Säure ausgefällt und das Präzipitat mit dem

Farbstoff Amidoschwarz angefärbt wird. Dies hat den Vorteil, dass Störsubstanzen, wie

Detergenzien oder Lipide, durch die Säurefällung entfernt werden und macht die Methode in

zweierlei Hinsicht besonders für die Bestimmung der Konzentration von Membranproteinen

wertvoll: Zum einen enthalten Lösungen von Membranproteinen stets Lipide der

Herkunftsmembranen. Da diese außerdem auf Grund ihrer oftmals ausgedehnten

hydrophoben Bereiche nur schwerlöslich sind, ist der Einsatz von Detergenzien unverzichtbar

um Membranproteine möglichst quantitativ in Lösung zu bringen.

Als Proteinstandard wurde 1mg/ ml BSA in 0,02M Na3PO4-Puffer verwendet. Die für die

Gelelektrophorese (2.8) in Puffer C (2.2.3) aufgenommenen Proben und die Standards (1 -

10µg) wurden mit H2O auf ein Endvolumen von 200µl gebracht, mit 20µl 10% (w/ v) SDS

versetzt und gründlich gemischt um die Proteine zu solubilisieren. Anschließend wurden 30µl

1M Tris/ HCl mit 1% SDS zugegeben. Nach dem Mischen wurden die Proteine durch Zugabe

von je 60µl 100% (w/ v) TCA gefällt. Dazu wurden die Proben 30min bei Raumtemperatur

inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Membranfilter (Nitrocellulose,

Porengröße 0,45µm, Millipore, Schwalbach) aufgetragen, der zuvor mit 3ml 6% (w/ v) TCA

gewaschen worden war. Der Membranfilter befindet sich dazu auf einer speziellen Filterfritte

(Millipore), die über einen Gummikonus auf einer Saugflasche sitzt, so dass während des

Auftragens mit Hilfe des Vakuums eine zu starke Dispersion der Probe vermieden werden

kann. Der Filter wurde anschließend 3min in eine 9cm Petrischale mit Färbe-Lösung gelegt,

danach kurz mit H2O gespült und schließlich dreimal je 2min mit Entfärbe-Lösung behandelt.

Der Filter wurde an der Luft getrocknet, die gefärbten Bereiche ausgeschnitten und in ein 2ml

Eppendorf-Gefäß, das 1ml Elutions-Lösung enthält, gegeben. Anschließend wurde 20min bei

Raumtemperatur zur Elution der gefärbten Proben rotiert. Dazu wurde ein mechanischer

Rührer, wie er in der präparativen Chemie verwendet wird, vertikal an einem Stativ

angebracht. An dessen Drehrührer wurde ein Ständer für Eppendorf-Gefäße befestigt. Nach

der Elution wurde die optische Dichte bei λ=630nm (OD630) gemessen. Im linearen Bereich

der Eichkurve (1 - 10µg) entspricht eine OD630 von 0,03 etwa 1µg Protein.


32

2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese

Proteine wurden durch ein- und zweidimensionale Gelektrophorese getrennt. Je nach Größe

des Pellets wurden die Cilienmembranen vor der Elektrophorese in 120 - 300µl Puffer C

(2.2.3) aufgenommen.

2.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli

(1970)

Zur Identifikation ciliärer Markerproteine, zur Durchführung der Negativkontrollen

(Ausschluss von Proteinen des decilierten olfaktorischen Restepithels) und zur Darstellung

verschiedener Bandenmuster wurde in modifizierter Form das klassische eindimensionale

System nach Laemmli verwendet. Anstelle von β-Meraptoethanol als Reduktionsmittel im 5x

Probenpuffer wurde 2M Dithiotreithol (2M) eingesetzt. Als Kammersystem diente das Modell

Twin S (2.1) mit einer Gelgröße von 5,5 x 8,5cm und einer Geldicke von 1,5mm. Es wurden

10%ige Trenn- und 3,8%ige Sammelgele verwendet.

Bei der Probenvorbereitung wurde das entsprechende Volumen von 10µg Probe mit 1/ 5 des

Endvolumens 5x Probenpuffer und 1/ 20 des Endvolumens 20x DTT versetzt. Nach dem

Mischen wurden die Proben 10min bei 90°C im Heizblock erhitzt, anschließend gründlich

gevortext und 1min bei 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge (Modell 5415D, Eppendorf

AG, Wesseling-Berzdorf) zentrifugiert. Die Proben wurden aus dem Überstand pipettiert. Die

bei der Präparation der Cilien nach der sequentiellen Zentrifugation anfallenden

Gewebepellets wurden in 0,5ml Puffer C auf Eis homogenisiert, bei 13 000g und 4°C 5min in

der Hermle-Kühlzentrifuge abzentrifugiert und das entsprechende Volumen des protein-

haltigen Überstands analog mit Probenpuffer versetzt und weiterbehandelt.

Zur Durchführung der Negativkontrollen diente als positive Referenz die Protein-Präparation

aus Gesamtgewebe (2.5.3). Ein entsprechendes Volumen, das 10µg Protein entspricht, wurde

analog behandelt. Bei einer Stromstärke von 20mA im Sammel- und 35mA im Trenngel

betrug die Elektrophoresedauer etwa 3h. Die Gele wurden anschließend geblottet (2.9). Zur

Darstellung colloidal Coomassie-gefärbter Cilienproteine im Gel wurde das Kammersystem

Twin M (2.1), mit einer Gelgrösse von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm, verwendet.

Dazu wurden etwa 80µg Protein wie oben beschrieben behandelt.


33

2.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(verändert nach Navarre et al, 2002)

Um im Gel eine bessere Auflösung zu erzielen, wurde insbesondere im Hinblick auf die

massenspektrometrische Analyse (2.11) zusätzlich ein zweidimensionales Trennverfahren

eingesetzt. Für beide Dimensionen wurden 1,5mm dicke Gele der Grösse 11 x 14cm und das

Kammersystem Twin M verwendet. Um eine zu starke seitliche Diffusion der Proben im Gel

zu vermeiden, wurde sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension bei 18°C

gekühlt. Arbeitsflächen, Glasplatten, Spacer, Probenkämme und Glasgeräte zum Ansetzen der

Gel-Lösungen beider Dimensionen wurden mit Aceton und 1% (w/ v) SDS vorgereinigt um

Fette und Protein-Verunreinigungen, wie Keratine, die auf Grund ihrer Menge in der

Massenspektrometrie (2.10) andere Proteine vollständig überlagern können, zu entfernen.

2.8.2.1 Vorbereitung der Gele

Bei der Vorbereitung der Gel-Lösungen für das Sammel- und Trenngel der CTAB-PAGE

(Tab.2.5) wurde zuerst Harnstoff in der angegebenen Menge H2O gelöst. Um Luftblasen im

Gel zu vermeiden, wurde im Exsikkator mit einer Vakuumpumpe (Vacuubrand PC101,

Brandtech Scientific, Essex, USA) entgast. 25mM FeSO4 x 7H2O und 0,03% H2O2 wurden

erst nach dem Entgasen, kurz vor dem Gießen zugegeben, da diese Substanzen den

Polymerisationsvorgang einleiten. Die Polymerisationsdauer betrug 16h.

Sammelgel (8%) Trenngel (8%)

Harnstoff

Acrylamid/ Bisacrylamid (30/0,8)

Bisacrylamid (2%)

300mM KH2PO4 pH 2.1

300mM KH2PO4 pH 4.1

80mM Ascorbinsäure

250mM CTAB

H2O

1,66M

5,34ml

1,87ml

-

8,30ml

1,00ml

0,22ml

3,27ml

3M

10,68ml

434µl

10ml

-

2,00ml

0,45ml

14,80ml

ENTGASEN

25mM FeSO4 x 7H2O

0,03% (v/ v) H2O2

Gesamtvolumen

0,01ml

0,80ml

20,00ml

0,02ml

1,60ml

40,00ml

Tab. 2.5 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels der CTAB-PAGE.


34

In der zweiten Dimension wurden die in 2.8.1 beschriebenen 10%igen Trenn- und 3,8%igen

Sammelgele verwendet. Im Sammelgel wurde anstelle des Probenkamms ein speziell

angefertigter Präparativer Kamm (Abb. 2.6 ), dessen große Tasche in der Breite der Gel-

Länge von 11cm entspricht, verwendet. Zu beiden Seiten der grossen Tasche befinden sich

für den Marker (2.3.1) noch zwei kleinere Taschen von 5mm Breite.

2.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGE

Bei der Probenvorbereitung für die erste Dimension wurde ein Volumen das etwa 150µg

Protein entspricht mit dem gleichen Volumen 2x Probenpuffer versetzt. Der 2x Probenpuffer

wurde zunächst ohne Harnstoff hergestellt, da das anschließende Erhitzen der Probe in

Anwesenheit von Harnstoff zur Carbamoylierung von Lysinen führt, die als Schnittstelle von

Trypsin dienen. Die Maskierung würde den vollständigen tryptischen Verdau der Proteine für

die massenspektrometrische Analyse verhindern.

Die Proben wurden 15min bei 70°C im Heizblock erhitzt. Währenddessen wurde in separate

Eppendorf-Gefäße, die dem Probevolumen entsprechende Menge Harnstoff (3M) eingewogen

und im 30°C Wasserbad erwärmt. Anschließend wurden die Proben gevortext und quantitativ

in das Eppendorf-Gefäß mit dem Harnstoff überführt. Harnstoff erhöht die Löslichkeit von

Proteinen. Die Proben wurden nach Zugabe erneut gründlich gevortext und dann für 5min bei

30°C im Heizbad belassen, 1min mit 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert

und aus dem Überstand pipettiert. Überschritt das Probevolumen inklusive 2x Probenpuffer

die Menge von 150µl, musste die Probentasche des Sammelgels mit einem Micro-Spatel

trichterförmig erweitert werden (Abb. 2.7).

Bei einer Stromstärke von 25mA im Sammel- und 45mA im Trenngel dauerte die

Elektrophorese etwa 6,5h. Die Elektroden wurden so gepolt, dass die Elektrophorese in

Richtung Kathode abläuft, da CTAB als kationisches Detergenz den Proteinen eine positive

Ladung verleiht.

Abb. 2.6 Präparativer Kamm. In die lange Tasche wird

nach der ersten Dimension der Gelstreifen geschoben.


35

Nach der ersten Dimension wurde das Sammelgel entfernt und das Gelstück mit der Probe

und die Markerbanden als ca 1,5cm breiter Streifen mit dem Skalpell ausgeschnitten. Der

Gelstreifen wurde 4 x 5min in H2O gewaschen und 4 x 15min in SDS-Lyse-Puffer

äquilibriert. Die Markerbanden wurden in Fixier-Lösung (2.2.6 und 2.2.7) überführt.

2.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGE

Der Gelstreifen wurde nach der Äquilibrierung in die Aussparung des Sammelgels geschoben.

Ein Teil der zweiten Dimension wurde über Nacht bei einer Stromstärke von 10mA

durchgeführt. Erst nach etwa 11h passierten die Proben die Trenngelgrenze. Am nächsten Tag

konnte die Stromstärke deshalb im Trenngel auf 45mA erhöht werden. Insgesamt dauerte die

Elektrophorese etwa 16h.

2.9 Färbung der Proteine im Gel

Es wurden reversible Färbeverfahren mit möglichst niedriger Nachweisgrenze gewählt.

2.9.1 Reversible MS-kompatible Silberfärbung

Arbeitsschritt Lösung (2.2.6) Dauer

Fixierung

Sensitisation

Wässerung

Imprägnation

Spülen

Entwicklung

Stoppen

Waschen

Fixier-Lösung

Sensitisationslösung

Bidest

Silbernitrat-Lösung

Bidest

Entwickler-Lösung

Stopp-Lösung

Bidest

1 - 3d

45min

6x 10min

1 - 2h

max 15s

5 - 40min

45min

2x 30min

Tab. 2.6 Protokoll für die reversible, MS-kompatible Sillberfärbung.

Abb. 2.7 Elektrophoresekammer "Twin M", wie sie zur Durchführung der

Gelelektrophorese verwendet wurde. Die Probentasche wurde mit dem

Mikrospatel trichterförmig erweitert (siehe Text).


36

2.9.2 Colloidale Coomassie-Färbung

Arbeitsschritt Lösung (2.2.7) Dauer

Fixierung

Wässerung

Inkubation

Färbung

Entfärbung

Fixier-Lösung

Bidest

Inkubationslösung

Färbe-Lösung

Bidest

1 - 3d

3x 30min

60min

3 - 5d

6h - 3d

Tab. 2.6 Protokoll für die colloidale Coomassie-Färbung.

2.10 Western Blot-Analyse

2.10.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen

Die Proteine wurden eindimensional durch SDS-PAGE (2.8.1) und zweidimensional durch

CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) aufgetrennt und in Anlehnung an Towbin et al. (1979) auf PVDF-

Membranen (2.1) transferiert. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren.

Dazu wurden pro Gel 16 Whatman®

-Papiere (3mm Chromatography paper, Whatman®

International Ltd.,Brentford, UK) und eine Membran auf die Größe des Trenngels

zugeschnitten. Das Gel und die Whatman®

-Papiere wurden 5min in Transfer-Puffer

äquilibriert. Die PVDF-Membran wurde zunächst 5min in Methanol aktiviert, anschließend

ebenfalls in Transfer-Puffer äquilibriert. Auf die Anode der Blot-Apparatur (2.1) wurden dann

8 Filterpapiere, die Membran, das Gel und abschließend 8 Filterpapiere in dieser Reihenfolge,

blasenfrei, zum sogenannten „Blot-Sandwich“ aufgetürmt. Für einen optimalen Stromfluss

wurde die Anodenplatte um das Sandwich getrocknet.

Pro cm2 Gelfläche wurde mit 2,0mA, jedoch insgesamt mit nicht mehr als 450mA, 90min

geblottet.

2.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-

Aktivität

Nach dem Transfer wurden zunächst unspezifische Bindestellen auf der Membran durch

Inkubaton mit Milchpulver-Blocklösung besetzt. Geblockt wurde über Nacht bei 4°C oder

60min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 90min mit Erst-Antikörper (2.3.2.1) in

Milchpulver-Verdünnungslösung inkubiert. Für Blots von Gelen der Größe 5,5 x 8,5cm waren

2ml Antikörper-Verdünnung ausreichend, wohingegen für Blots der Größe 11 x 14cm 4ml

Lösung benötigt wurden. Die Inkubation erfolgte in 15ml bzw 50ml Falcon-Röhrchen, die mit


37

dem Falcon-Ständer an einem mechanischen Rührer, wie er in der präparativen Chemie

verwendet wird, angebracht wurden. Der Rührer wurde vertikal an einem Stativ befestigt.

Danach wurden die Membranen 3 x 5min auf dem Schüttler mit Wasch-Puffer und 1 x 5min

mit 1x PBS gewaschen. Die Inkubation mit Zweit-Antikörper (2.3.2.2) erfolgte 60min in

10ml Antikörper-Verdünnung mittels der gleichen apparativen Vorrichtung. Dann wurde

wieder 3 x 5min in Wasch-Puffer gewaschen, dann 1 x 5min mit Wasser. Die Membranen

wurden anschließend in einer Film-Entwicklerkassette (Hypercassette™, Amersham

Biosciences, Freiburg) in feuchte Frischhalte-Folie eingeschlagen.

Die Aktivität der Zweit-Antikörper-gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde mit

dem EClTM

Plus-System (Amersham Biosciences, Freiburg) detektiert. Das Detektions-

reagenz enthält zyklisches Diacylhydrazid (Lumigen PS-2), das in Gegenwart von

Wasserstoffperoxid (H2O2) und mit Hilfe der Meerrettich-Peroxidase, die als Katalysator der

Reaktion fungiert, zu einem Acridinium Ester umgesetzt wird (Abb. 2.9). Durch die weitere

Umsetzung des Esters (Oxidation) werden Teilchen energetisch angeregt, die eine Weile auf

höheren Energie-Niveaus verweilen und schließlich ihre Energie durch Abgabe von

Lichtquanten (Photonen) verlieren. Man bezeichnet diesen Vorgang als Chemilumineszenz.

Im Falle des EClTM

Plus-Systems dient der Acridinium Ester als eine Art „Lichtspeicher“ und

so können Lichtquanten noch 24 Stunden nach Beginn der Reaktion detektiert werden.

Abb. 2.9 Oxidation von Lumigen PS-2. Die Reaktion wird von der

an Zweit-Antikörper gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP)

katalysiert.


38

Pro cm2 Membran wurden 40µl Detektionsreagenz angesetzt. Dazu wurden die Reagenzien A

(enthält Lumigen PS-2) und B (enthält H2O2) des EClTM

Plus- Systems im Verhältnis 40 : 1

(A : B) gemischt. Die Membranen wurden dünn betropft und danach 5min im Dunkeln

inkubiert. Die Lösung wurde anschließend vom Rand der Membranen mit einem Papiertuch

weggesaugt. Die Frischhalte-Folie wurde faltenfrei eingeschlagen, die Filme (2.1) bei

geeignetem Rotlicht auf den Blots platziert und die Entwicklerkassette geschlossen.

Anschließend wurden die exponierten Filme in der Entwickler-Maschine (2.1) entwickelt.

2.11 Massenspektrometrie

Proteine, die massenspektrometrisch analysiert wurden, wurden zuvor durch

zweidimensionale CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) getrennt und anschließend colloidal

Coomassie-gefärbt (2.9.2). Für die Protein-Identifizierung wurde der Massenspektrometer Q-

Tof Ultima API der Firma Waters (Massachusetts, USA) verwendet. Das Gerät ist

standardmäßig mit einer HPLC-Anlage ausgestattet. Es wurde die Kapillarsäule Modell

„Atlantis“ der Firma Waters benutzt, mit den Maßen 150mm (Länge) x 75µm (Durchmesser).

Der Durchmesser der Silica-Kugeln betrug 3µm, die Porengröße 300Å (30nm). Der Aufbau

(Abb. 1.9) und das Funktionsprinzip des ESI-Tandem-Massenspektrometers wurde

ausführlich in Kapitel 1.4.3.3 beschrieben. Für die Datenbank-Recherche wurde das

Programm "MASCOT" von www.matrixscience.com verwendet.

Die Probenvorbereitung wurde unter einer Plexiglas-Scheibe durchgeführt um Ver-

unreinigungen, insbesondere durch Keratine, zu vermeiden.

2.11.1 Ausschneiden der Proteine

Die gefärbten proteinhaltigen Bereiche wurden mit dem Skalpell ausgeschnitten, in kleine

Stücke zerteilt und die Gelstückchen anschließend in ein 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt.

Dazu wurde das Gel auf einer Glasplatte platziert. Auf Papier wurde ein Raster angefertigt

und unter die Glasplatte gelegt. Unter dieser Anordnung befand sich eine Leuchtplatte, so

dass das Raster deutlich durch das Gel hindurch zu erkennen war (Abb. 2.10). Den

ausgeschnittenen Gelstückchen konnten deshalb eindeutige Nummern zugeteilt werden, die

den Tetragonen des Rasters entsprachen.


39

2.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“)

Vor der massenspektrometrischen Analyse müssen die Proteine entfärbt und proteolytisch

gespalten werden. Als Protease wurde Trypsin verwendet, das Proteine C-Terminal hinter

Lysin (K) und Arginin (R) hydrolysiert, sofern es sich bei der darauf folgenden Aminosäure

nicht um Prolin (P) handelt. Die meisten Proteine besitzen genügend Spaltstellen, so dass die

tryptischen Fragmente eine optimale Größe aufweisen. Ein weiterer Vorteil bei der

Verwendung von Trypsin ist, dass alle Autolyse-Produkte bekannt sind und bei der

MS-Analyse deshalb von vornherein ausgeschlossen werden können.

Die Gelstückchen wurden nach dem Auftauen mit 400µl H2O versetzt und 5min bei 37°C und

600rpm im Thermomixer (Modell Compact, Eppendorf AG, Wesseling-Berzdorf) inkubiert.

Um organische Verunreinigungen zu entfernen, wurde 5min bei 600rpm und 37°C in 50%

(v/ v) Acetonitril gewaschen. Zur Reduktion der Disulfidbrücken wurden die Gelstückchen

mit 250µl 10mM DTT 1 Stunde bei 56°C und 600rpm behandelt. Anschließend wurde 5min

auf einem zweiten Thermomixer bei 600rpm und 25°C mit 400µl H2O gewaschen. Danach

wurden die Proben mit etwa 250µl 55mM Iodacetamid versetzt und 30min bei 600rpm

inkubiert. Iodacetamid maskiert durch Alkylierung die nach der Reduktion freiwerdenden

SH-Gruppen der Cysteine und verhindert so deren erneute Oxidation. Um die zusätzliche

Alkylierung der Methionine zu verhindern, sollte diese Reaktion unbedingt im Dunkeln und

bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Anschließend wurde im Wechsel je dreimal 10min

bei 37°C und 600rpm mit 400µl H2O und 50% (v/ v) Acetonitril gewaschen. Die ersten

beiden Male wurden die Proben dabei abgedunkelt. Die Gelstückchen wurden dann zweimal

mit jeweils 400µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur etwa 1min dehydratisiert. Der

Endpunkt dieses Vorgangs ist deutlich erkennbar, da die Gelstückchen nach Abschluss eine

Abb. 2.10 Anordnung beim Ausschneiden der gefärbten Bereiche des Gels. Das

Raster (vergrößert dargestellt) wurde in 3 Bereiche A, B, C untergliedert, die

Tetragone des Rasters durchnummeriert (nicht dargestellt). Auf dem Raster

befindet sich eine Glasplatte (dunkelblau) auf der das Gel (türkis) liegt.


40

schneeweiße Farbe annehmen. Das Acetonitril wurde anschließend abgenommen und die

Gelstücke bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurde zunächst in je 20µl

Trypsin-Gebrauchslösung verdaut. Die Proben wurden dazu etwa 10min bei 37°C inkubiert.

Dabei quellen die Gelstückchen auf. Teilweise sind diese nicht mehr bedeckt und fehlendes

Volumen wurde deshalb durch die erneute Zugabe von etwa 10µl Trypsin-Gebrauchslösung

ergänzt. Nach weiteren 10min wurden die Proben ein zweites Mal überprüft und eventuell

durch die Zugabe von Bicarbonat-Puffer vollständig bedeckt. Danach wurden sie über Nacht

im Inkubator bei 37°C verdaut.

2.11.3 Nano-LC und interne Kalibrierung

Die Peptid-Proben befinden sich nach dem Verdau in der Flüssigkeit, die die Gelstückchen

umgibt. Die Injektion der Proben erfolgte automatisiert über eine Dosierschleife, die das

reproduzierbare Einbringen von definierten Injektionsvolumina in das HPLC-System

ermöglicht. Kleinste Mengen der Proben (20nl/ min) wurden so in den konstanten

Volumenstrom (5µl/ min) der mobile Phase (1.4.3.3) gebracht. Als mobile Phase wurde ein

konvexer Hochdruck-Gradient aus H2O/ Acetonitril (Tab. 2.7) verwendet. Der Pumpendruck

betrug 3600psi („parts per square inch“, entspricht 248,2bar).

Zeit (min) H2O (%) Acetonitril (%) Fließgeschwindigkeit

(µl/ min)

0,01 95 5 5

5,00 95 5 5

10,00 85 15 5

35,00 60 40 5

45,00 40 60 5

50,00 5 95 5

55,00 5 95 5

56,00 95 5 5

Tab. 2.7 Zeitprofil des konvexen Gradienten der mobilen Phase.

Für die Kalibrierung des Massenspektrometers wurde der Fibrinogen B [Glu1]-Standard der

Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet.


41

2.11.4 Extraktion der Proben

Proben, die sich nach der Analyse im Spektrum als sehr komplex herausgestellt hatten,

wurden ein zweites Mal gemessen. Dazu mussten die Peptide aus den Gelstückchen extrahiert

werden. Mit Acetonitril wurden die Gelstückchen erneut dehydratisiert. Die austretende

Flüssigkeit wurde abgenommen, in ein neues 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt und in der

Savant SpeedVac™ (Selby Biolab, Australien) eingeengt. Das resultierende Volumen wurde

in 15µl Bicarbonat-Puffer aufgenommen, 5µl wurden für die Analyse verwendet, das restliche

Volumen bei -20°C gelagert.

3 Ergebnisse

42

3 Ergebnisse

In dieser Arbeit sollten ciliäre Membranproteine aus dem Riechepithel der Ratte isoliert und

in hoher Auflösung durch 2D-Gelelektrophorese dargestellt werden. Das Ziel war dabei die

Etablierung einer Methode, die die massenspektrometrische Analyse des gesamten ciliären

Proteoms ermöglicht.

Der folgende Ergebnisteil gliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 3.1 beschreibt die

Isolation ciliärer Membranen aus dem Riechepithel der Ratte. Der immunologische Nachweis

von Markerproteinen, die Aufschluss über die Qualität der Präparation geben, ist Bestandteil

von Abschnitt 3.2. Die zweidimensionale gelelektrophoretische Trennmethode der

solubilisierten Membranproteine ist in Abschnitt 3.3 beschrieben und deren qualitative

Analyse in Abschnitt 3.4. Abschließend werden die Ergebnisse der massenspektrometrischen

Analyse in Abschnitt 3.5 vorgestellt.

3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen

Die Präparation von Cilien-Membranen wurde bereits von mehreren Autoren beschrieben

(z.B. Bönigk et al., 1999; Delgado et al., 2002; Washburn et al., 2002). Die dort

beschriebenen Vorgehensweisen lieferten, bezogen auf die Reinheit und Protein-Ausbeute,

jedoch keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Es war deshalb zunächst notwendig, diese

Präparationstechniken im Hinblick auf die 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie

zu optimieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun eine Präparation ausgearbeitet werden,

die durch die Kombination der verschiedenen Beschreibungen eine neue Methode darstellt,

die diesen Anforderungen genügt.

Dazu wurde das Riechepithel aus jeweils 15-20 Ratten präpariert. Für den nachfolgenden

Calcium-Schock zur Ablösung der Cilien vom Epithel erwies sich das 30minütige Rühren im

Schnappdeckel-Glas gegenüber dem Taumeln im 15ml Falcon-Röhrchen als viel effektiver,

so dass die Ausbeute an Cilien-Membranen wesentlich gesteigert werden konnte.

Bei 7700g bewirkte die Anwendung der sequenziellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen

Zentrifugationsschrittes eine zusätzliche Anreicherung ciliärer Membranen. Dabei erscheinen

die Cilien nach dem ersten Zentrifugationsschritt noch als gelber Ring (Abb. 3.1, links) um

das decilierte Restepithel, der im Zuge der folgenden Zentrifugationsschritte verschwindet.

Zur besseren Abtrennung gelöster Proteine und nicht-ciliärer Membranen anderer Organellen,

wie von Mitochondrien oder Zellkernen, wurde zudem ein Saccharose-Stufengradient

3 Ergebnisse

43

eingeführt. Die Cilienbande erscheint nach der Ultrazentrifugation deutlich sichtbar als

dunkler Nebel an der Phasengrenze des Gradienten (Abb. 2.5).

Die Ausbeute an isolierten Membranen wurde für jeden Reinigungsschritt indirekt über die

Proteinmenge bestimmt. Da Membranproteine für eine quantitative Bestimmung zunächst aus

der Membran gelöst und solubilisiert werden müssen, ist der Einsatz von Detergenzien

unumgänglich. Die Bestimmung der Proteinmenge musste deshalb über die Amidoschwarz-

Methode erfolgen.

Die Abbildung 3.1 (rechts) zeigt das Cilienpellet nach der zweiten Ultrazentrifugation am

Ende der Präparation. Die hier etablierte Methode lieferte jetzt im Vergleich eine deutlich

höhere Ausbeute.

Abb. 3.1 Links dargestellt ist das Pellet der Riechepithelien von 5

Ratten nach der ersten Zentrifugation bei 7700g. Der gelbliche Rand

(Pfeil) um das decilierte Restepithel besteht aus den Cilien der ORNs.

Rechts: Membranpellet am Ende der Präparation.

3 Ergebnisse

44

3.2 Qualitative Analyse der Präparation

Kennzeichnend für die hohe Qualität der Präparation ist die vorherrschende Präsenz ciliärer

Proteine. Für die Praxis bedeutet dies, dass analysiert werden muss, ob folgende

Voraussetzungen erfüllt sind:

� Der gelelektrophoretische Vergleich der Cilienproteine mit den Proteinen des

olfaktorischen Gesamtepithels zeigt, dass cilienspezifische Proteine angereichert

werden

� In der Präparation können ciliäre Markerproteine nachgewiesen werden

� Epitheliale oder mitochondriale Markerproteine werden nicht oder in geringer Menge

in der Cilienpräparation nachgewiesen

3.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE

Um sich einen groben Überblick zu verschaffen, ob bestimmte Proteine in der Präparation

besonders stark angereichert werden, wurden etwa gleiche Mengen der Cilienproteine und des

olfaktorischen Gesamtepithels (OE; 2.5.3) durch denaturierende SDS-PAGE (2.8.1) getrennt

und anschließend colloidal Coomassie (2.9.2) gefärbt.

Abb. 3.2 Vergleich des

Bandenmusters ciliärer

Proteine mit dem von

Proteinen des decilierten

Restepithels.

Links im Bild: Molekular-

gewichte in kDa. (I): 20µg

Cilienproteine; (II): 20µg

Proteine des olfaktorischen

Gesamtepithels.

Abbildung 3.2 zeigt das Ergebnis der Färbung: In der

Tat scheinen einige Proteine durch die Präparation stark

angereichert zu werden. Besonders deutlich ist dies etwa

im Bereich von 55kDa zu erkennen. Im oberen Drittel

sind im Größenbereich zwischen 70 und 120kDa viele

Banden erst nach der Anreicherung erkennbar.

Möglicherweise handelt es sich um cilienspezifische

Proteine, die in der großen Proteinvielfalt des gesamten

olfaktorischen Epithels nicht als Banden sichtbar

werden. Insgesamt ist die Auflösung der Banden viel zu

gering um die Komplexität der Präparation vollständig

zu erfassen. In einer Bande können zahlreiche Proteine

enthalten sein.

3 Ergebnisse

45

Ersichtlich ist, dass es sich bei den Proteinen der Präparation um ein komplexes Gemisch

handelt. Ob es sich dabei ausschließlich um ciliäre Proteine handelt, kann erst beurteilt

werden, nachdem die Anwesenheit anderer Proteine experimentell widerlegt wurde und

Cilienproteine nachgewiesen wurden.

3.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse

Adenylatcyclase Typ III (AC III), das olfaktorische G-Protein (Golf) und die Untereinheiten

des cyclisch-Nukleotid gesteuerten Kationenkanals (CNG-Kanal) sind heute anerkannte

cilienspezifische Markerproteine, für die Antikörper für immunologische Nachweis-

Verfahren im Handel erhältlich sind.

Cilienproteine, Proteine des decilierten Restepithels und des olfaktorischen Gesamtepithels

wurden nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen immobilisiert. Zum immunologischen

Nachweis der Markerproteine wurden Antikörper gegen die A2-Untereinheit des CNG-

Kanals (α-CNG-A2), gegen die A4-Untereinheit des CNG-Kanals (α-CNG-A4), gegen AC III

(α-AC III) und gegen die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (α-Gαs/olf) verwendet.

3.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals

Abbildung 3.3 zeigt den immunologischen Nachweis von CNG-A4 (linker Blot) und CNG-

A2 (rechter Blot). Beide Untereinheiten wurden in der Cilien-Präparation (I) nachgewiesen,

aber nicht im decilierten Restepithel (II) und nicht im olfaktorischen Gesamtepithel (III).

Deutlich sichtbar ist bei CNG-A2 nur die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa. Die

unscharfe Bande lässt auf unterschiedliche Glykosylierungszustände schließen, die

überwiegend während der Präparation entstehen. Die nicht glykosylierte Variante bei 76kDa

ist nur sehr schwach erkennbar, möglicherweise deutet dies auf ein schonendes

Präparationsverfahren hin, da das Protein überwiegend in seiner höhermolekularen Form

auftritt und das, obwohl große Proteine im Vergleich zu kleineren erfahrungsgemäß schwerer

auf Membranen zu transferieren sind. Bei etwa 58kDa ist schwach ein wiederholt auftretendes

Abbauprodukt der CNG-A2 Untereinheit zu erkennen.

3 Ergebnisse

46

Die CNG-A4 (linker Blot) Untereinheit ist ebenso wie CNG-A2 nur in den Cilien

nachweisbar. Sie ist nicht glykosyliert und erscheint in nur einer Variante bei 66kDa.

Da beide Untereinheiten nicht im decilierten Restepithel nachgewiesen werden, ist eine hohe

Ausbeute an Cilienmembranen bei der Präparation anzunehmen. Der Anteil an CNG-

Proteinen bezogen auf die gesamte Protein-Vielfalt des olfaktorische Epithels ist zu gering um

CNG-A2 und CNG-A4 in den aufgetragenen Mengen noch nachweisen zu können. Beide

Untereinheiten werden demnach stark bei der Präparation angereichert.

3.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III)

Bei der Analyse der AC III (Abb. 3.4) wurden nicht nur in der Cilienpräparation (I) Signale

detektiert, sondern schwach auch im decilierten Restepithel (II) und im olfaktorischen

Gesamtepithel (III). Prominent ist auch hier die glykosylierte Form des Proteins, die

typischerweise bei etwa 220kDa erscheint. Ein Abbauprodukt, das häufig detektiert wird,

erscheint in mittlerer Intensität in der Cilien- Präparation bei etwa 72kDa (zum Vergleich

siehe Bönigk et al., 1999).

Abb. 3.3 Western Blot-Analyse von CNG-A4 (linker Blot)

und CNG-A2 (rechter Blot). Pro Spur wurde 10µg Protein

aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. (I):

Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungen

der Antikörper: α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; α-

CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der

Membranen: 12min.

3 Ergebnisse

47

3.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (Gα olf)

3.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse

Die Reinheit der Präparation wurde durch Ausschluss mitochondrialer und epithelialer

Markerproteine überprüft. Als Marker dienten Occludin der tight junctions und Prohibitin, das

in der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist.

AC III scheint sehr stark in den ORNs exprimiert zu werden und

ist deshalb auch im decilierten Restepithel noch schwach

nachweisbar. Ersichtlich ist aber, dass AC III, ebenso wie die

CNG-Untereinheiten, durch die angewandte Präparationstechnik

deutlich angereichert wird.

Abb. 3.4 Western Blot-Analyse der AC III. (Zahlen): Molekulargewichte in

kDa. Pro Spur wurde 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes

Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-AC III, 1: 200; α-rb

IgG, 1: 80000; Exposition: 3min.

Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins besitzt eine

Größe von 44,2kDa und wird in allen Spuren sehr stark detektiert,

jedoch besteht immer noch eine Tendenz zur Anreicherung in der

Cilien- Präparation (I), wohingegen im decilierten Restepithel (II)

eine Abreicherung zu beobachten ist. Möglicherweise bestehen

die Signale aus zwei Banden, da häufig auch die etwas kleinere

Spleiß-Variante α2 (40kDa) detektiert wird.

Abb. 3.5 Western Blot- Analyse von Gα olf. (Zahlen): Molekulargewichte in

kDa. Pro Spur wurden 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes

Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-Gα olf, 1: 2000; α-rb

IgG, 1: 80000; Exposition: 20s.

3 Ergebnisse

48

Zur Durchführung der Kontrollen wurden die Cilienproteine und die Proteine des

olfaktorischen Gesamtepithels nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen transferiert und

mit Antikörpern gegen Occludin (α-Ocn) und Prohibitin (α-PHB) behandelt.

Die Markerproteine Occludin (linker Blot) und Prohibitin (rechter Blot) wurden sowohl in der

Präparation der Cilien (Spur I) als auch im olfaktorischen Gesamtepithel nachgewiesen (Spur

II). Auffällig ist, dass die nicht phosphorylierte Variante von Occludin (65kDa) nur in Spur I

detektiert wird. Möglicherweise wird diese Form auf Grund ihrer schlechteren Löslichkeit am

Ende der Präparation mit den Cilienmembranen pelletiert. In der Proteinpräparation des OE

kann man erkennen, dass diese Variante bezogen auf das Gesamtepithel eher eine

untergeordnete Rolle spielt. Prominent ist hier die phosphorylierte Form bei etwa 82kDa, die

in den Cilien wesentlich schwächer detektiert wurde. Das mitochondriale Markerprotein

Prohibitin liefert ein eindeutiges Signal im OE (30kDa) und ist ebenso wie Occludin in der

Cilienpräparation mengenmäßig stark reduziert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle verwendeten ciliären Markerproteine in der

Präparation nachgewiesen und angereichert wurden. In Bezug auf die Signalstärken wird

deutlich, dass AC III und Golf im Vergleich mit den CNG-Untereinheiten mengenmäßig in der

Präparation überwiegen, was auf eine stärkere Expression schließen lässt, da diese auch im

olfaktorischen Gesamtepithel und decilierten Restepithel noch nachweisbar sind. Die nicht-

Abb. 3.6 Western Blot-Analyse von Occludin (links)

und Prohibitin (rechts). (Zahlen): Molekulargewichte in

kDa. Pro Spur wurden 20µg Protein aufgetragen. (I):

Cilien-Proteine; (II): OE; Verdünnungen der Antikörper:

α-Ocn, 1: 200; α-rb IgG, 1: 30000; α-PHB, 1: 200; α-rb

IgG, 1: 30000; Exposition: jeweils 30s.

3 Ergebnisse

49

ciliären Proteine Occludin und Prohibitin hingegen wurden in der Cilienpräparation in

deutlich geringerer Menge als im olfaktorischen Epithel nachgewiesen.

3.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen

Trennverfahrens

In Abschnitt 3.2.1 wurde gezeigt, dass es sich bei den Proteinen der Cilien-Präparation um ein

sehr komplexes Gemisch handelt. Die Kontrollen bewiesen zudem, dass darin auch nicht-

ciliäre Proteine, zwar in einem geringeren Umfang, aber dennoch enthalten sind. Es war

deshalb notwendig, ein gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren zu etablieren, das gegenüber

der klassischen, eindimensionalen SDS-PAGE eine höhere Auflösung der Proteine erzielt.

Diese Methode sollte darauf ausgelegt sein, die schlecht löslichen und im Gegensatz zu den

löslichen Proteinen in wesentlich geringerer Konzentration in der Zelle vorhandenen

Membranproteine quantitativ darzustellen.

3.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese

Bei der 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-CTAB/ SDS-PAGE) werden

Proteine in beiden Dimensionen nach ihren Molekulargewichten getrennt. Die Verwendung

der CTAB-PAGE in der ersten Dimension erwies sich in vielfacher Hinsicht als sehr

vorteilhaft: Das kationische Detergenz Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) stabilisiert

die positiven Ladungen der außerhalb der hydrophoben Regionen überwiegend basischen

Membranproteine, erhöht somit deren Löslichkeit und verdrängt gleichzeitig die benachbarten

Phospholipide. Der saure pH-Wert unterstützt diesen Prozess durch Bereitstellung von

Protonen und sorgt dafür, dass lösliches Protein noch vor dem Auftragen der Probe teilweise

gefällt wird. Eine zweite Methode, die nach den gleichen Prinzipien die Trennung von

Membranproteinen ermöglicht, ist die häufiger angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE, die im

Rahmen dieser Arbeit ebenfalls getestet wurde (nicht dargestellt), aber vergleichsweise eine

schlechte Auflösung erzielte.

In der zweiten Dimension wurden die Proteine durch klassische SDS-PAGE getrennt. Dazu

wurde der Gelstreifen mit der Probe ausgeschnitten und in SDS-Lyse-Puffer äquilibriert. Die

Proteine erhalten durch das anionische Detergenz SDS eine negative Ladung.

3 Ergebnisse

50

3.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung

Zunächst wurden Cilienproteine und olfaktorisches Gesamtepithel getrennt und anschließend

durch Silberfärbung im Gel dargestellt (Abb. 3.7). Im Hinblick auf die massenspektro-

metrische Analyse wurde die MS-kompatible Variante der Silberfärbung mit einer

Nachweisgrenze von 2ng Protein verwendet.

Abb. 3.7 Ergebnis der Silberfärbung der durch 2D-CTAB/ SDS-PAGE getrennten Cilienproteine (links) und der

Proteine des OE (rechts). Es wurde jeweils 80µg Protein verwendet. (1D, 2D): Die Richtung der ersten und

zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. In beiden Dimen-

sionen wurden die Proteine gemäß ihrer Masse getrennt.

Erwartungsgemäß ist auch hier das Proteinmuster der Cilienproteine weniger komplex als das

der Proteine des OE. Die starke Abweichung der Proteine von der Diagonalen ist ein

erwünschter Effekt, da Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten andernfalls in der zweiten

Dimension genauso weit wie in der ersten Dimension wandern würden und deshalb keine

zusätzliche Trennung zu beobachten wäre. Der zusätzliche Trenneffekt in der Horizontalen

wird hauptsächlich durch das unterschiedliche Detergenz-zu-Protein-Verhältnis in beiden

Dimensionen verursacht. Dasselbe Protein wird von etwas mehr CTAB-Molekülen besetzt als

von SDS-Molekülen und wandert in der ersten Dimension etwas weiter. Unterstützt wird

dieser Effekt durch unterschiedliche Acrylamid-Konzentrationen in den Gelen.

Die horizontale Streifenbildung („Streaking“) ist eine häufige und unerwünschte Erscheinung

zweidimensionaler Trennverfahren. Sie hat vielfältige Ursachen, wie zum Beispiel zu hohe

Salzkonzentrationen (>10mM) in der Probe, Überladung des Gels oder Verunreinigungen mit

Nukleinsäuren. Das vertikale streaking in den höhermolekularen Bereichen des Gels kann ein

Hinweis auf Degradation der Proteine sein.

3 Ergebnisse

51

3.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung

Die Gele mussten für die weitere Anwendung optimiert werden: Das streaking sollte

minimiert werden. Ein höherer Kontrast war wünschenswert, nicht zuletzt deshalb um die

später massenspektrometrisch analysierten Proteine besser im Gel zuordnen zu können. Aus

diesem Grund wurden die Gele alternativ colloidal Coomassie gefärbt. Mit dieser

Färbemethode können 5 - 10ng Protein nachgewiesen werden. Trotz der etwas geringeren

Sensitivität hatte dieses Verfahren im Vergleich zur massen-kompatiblen Silberfärbung

mehrere Vorteile: Bei großen Proteinmengen steigt die Intensität der Silberfärbung nur bis zu

einem nicht näher bestimmten Wert an und nimmt danach wieder ab. Bei der colloidal

Coomassie-Färbung hingegen besteht eine größere Linearität zwischen Proteinmenge und

Farbtiefe. Das Stoppen der Entwicklung ist bei der Silberfärbung ein kritischer Schritt, da das

Gel in der Stopp-Lösung noch nachfärbt und es deshalb häufig zu Überfärbungen kam. Ein

Nachfärben der Gele während des Entfärbe-Vorgangs wurde bei der colloidal

Coomassie-Färbung nicht beobachtet. Auch die Hintergrund-Färbung war deutlich reduziert.

Die Cilienproteine wurden zur Reduktion des streakings vor dem Auftragen zudem mit

Benzonase und PNGaseF behandelt. Um die geringere Sensitivität im Vergleich zur Silber-

färbung auszugleichen, wurde etwa die doppelte Menge der Probe aufgetragen.

Abbildung 3.8 zeigt das Ergebnis dieser 2D-CTAB/ SDS-PAGE. Eine gleich behandelte

Probe wurde zusätzlich durch eindimensionale SDS-PAGE getrennt. Bei der Interpretation

der Ergebnisse sollte berücksichtigt werden, dass die Mengenverhältnisse der beiden

Methoden nicht direkt miteinander vergleichbar sind, da bei zweidimensionalen Verfahren

mit Verlusten während der Äquilibrierung und beim Übergang der Probe von der ersten in die

zweite Dimension gerechnet werden muss.

3 Ergebnisse

52

Abb. 3.8 Ergebnis der colloidal Coomassie-Färbug. (Links): Eindimensionales SDS-Gel mit 80µg Cilienprotein;

(Rechts): 2D-CTAB/ SDS-Gel mit 100µg Cilienprotein; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die

Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.

Die Proteinflecken sind im Vergleich zur Silberfärbung wesentlich schärfer voneinander

abgrenzbar und die Hintergrund-Färbung ist deutlich reduziert. Das vertikale streaking konnte

nicht vollständig unterdrückt werden. Das horizontale streaking wurde erfolgreich reduziert,

allerdings sollte bedacht werden, dass durch colloidal Coomassie möglicherweise schwach

vorhandene Streifen nicht so deutlich dargestellt werden. Vergleicht man hier die

Bandenmuster beider Gele miteinander, so erscheint in der 2D-Gelelektrophorese vor allem

der Bereich von etwa 40 - 70kDa wesentlich besser aufgelöst.

Nachdem für die Darstellung der cilienspezifischen Membranproteine auf dem

eindimensionalen Gel gezeigt werden konnte, dass alle wichtigen Markerproteine

nachweisbar sind, war es nun unerlässlich zu überprüfen, ob diese auch auf dem 2D-Gel

identifiziert werden können. Durch die Anwendung des kationischen Detergenz CTAB

anstelle von SDS in der ersten Dimension könnten nämlich nicht alle Membranproteine

solubilisiert worden sein. Der Nachweis aller Markerproteine erhöht die Wahrscheinlichkeit,

dass die Mehrzahl der Cilienproteine auch durch das 2D-Gel erfasst werden und später

massenspektrometrisch identifiziert werden können.

3 Ergebnisse

53

3.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis

cilienspezifischer Markerproteine

Zum Nachweis cilienspezifischer Markerproteine wurden die Proben nicht mit PNGaseF

behandelt, um auch die glykosylierten Formen der AC III und CNG-A2-Untereinheit

nachzuweisen. Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE wurden die Proteine auf PVDF-Membranen

transferiert und wie bei der eindimensionalen Gelelektrophorese mit α-CNG-A2, α-CNG-A4,

α-AC III und α-Gαs/ olf (siehe Abschnitt 3.2.2) behandelt.

3.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit

Abbildung 3.9 zeigt den Nachweis der CNG-A2-Untereinheit (linker Blot) und CNG-A4-

Untereinheit (rechter Blot) des CNG-Kanals. Beim Vergleich mit Abbildung 3.3 fällt auf,

dass nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE auch die unglykosylierte Variante der CNG-A2-

Untereinheit nachgewiesen wurde. Diese wurde deutlich bei 76kDa detektiert. Ein etwas

stärkeres Signal liefert die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa, das häufig zu

beobachtende Abbauprodukt von 58kDa wurde nicht nachgewiesen (vgl. Abb. 3.3, rechts).

Das CNG-A4-Signal ist wie im eindimensionalen System deutlich bei 66kDa zu erkennen.

Abb. 3.9 Western Blot-Analyse von CNG-A2 (linker Blot) und CNG-A4 (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-

PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die

Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-

CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der Mem-

branen: jeweils 15min.

3 Ergebnisse

54

3.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von Gα olf

Beim immunologischen Nachweis der AC III (Abb. 3.10, links) nach der 2D-CTAB/ SDS-

PAGE wurde nur das Abbauprodukt bei etwa 72 kDa detektiert. Möglicherweise ist dies auf

eine Degradation des Proteins zurückzuführen, eine Annahme, die durch die Erscheinung des

vertikalen streakings (3.3.1.1 und 3.3.1.2) bestärkt wird. In Abbildung 3.8 ist deutlich zu

erkennen, dass das streaking hauptsächlich im hochmolekularen Bereich auftritt, also dort, wo

sowohl die glykosylierte (um 212kDa) als auch die deglykosylierte Variante (128kDa) der

AC III im Gel lokalisiert ist.

Abb. 3. 10 Western Blot-Analyse von AC III (linker Blot) und Gα olf (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-

PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die

Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-

AC III, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-Gαs olf, 1: 2000; α-rb IgG, 1: 80000; Expositionsdauer der Membranen:

jeweils 15min.

Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins wurde klar bei 44kDa nachgewiesen. Die

qualitativen Analysen der Präparation und der Trenntechnik konnten somit als

zufriedenstellend eingestuft werden. Für die massenspektrometrische Identifizierung der

Cilienproteine wurde erneut ein 2D-CTAB/ SDS-Gel angefertigt und anschließend colloidal

Coomassie gefärbt.

3 Ergebnisse

55

3.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der

Proteine

Die Proteine wurden für die massenspektrometrische Analyse mit dem Skalpell

ausgeschnitten. Um möglichst alle Proteine des Gels zu erfassen, wurden nicht einzelne

Proteinflecken ausgewählt, sondern ein Raster angefertigt, dessen Tetragone sich mit allen

gefärbten Bereichen des 2D-Gels deckten. Die Gelstückchen wurden einzeln zerkleinert und

in 0,5ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die Proteine wurden anschließend entfärbt, reduziert,

alkyliert und schließlich tryptisch verdaut. Die Peptide befanden sich nach dem Verdau in der

Flüssigkeit, die die Gelstückchen umgibt und wurden bis zur Injektion in das HPLC-System

bei -20°C aufbewahrt. Die Injektion der Proben und die Kalibrierung des

ESI-Tandem-Spektrometers wurde von Herrn Dr. Uwe Warnken, Zentrale Proteinanalytik des

DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum), Heidelberg durchgeführt. Von der HPLC-

Anlage aus gelangten die Peptide direkt in die ESI-Ionenquelle und von dort ionisiert in den

Analysatorteil des Tandem-Massenspektrometers (Abb. 1.9).

In Abbildung 3.11 ist das Raster auf dem letztlich für die MS-Analyse verwendeten 2D-Gel

dargestellt, das im Rahmen des Projekts von Herrn Ulrich Mayer angefertigt wurde. Das

Raster wurde von links oben nach rechts unten fortlaufend durchnummeriert.

Abb. 3.11 2D-CTAB/ SDS-Gel mit Raster (2D-CTAB/ SDS-Gel:

Ulrich Mayer). Die Tetragone des Rasters wurden nummeriert, um die

analysierten Proben ihrem Herkunftsort im Gel zuordnen zu können.

Es wurden 150µg Cilienproteine aufgetragen. (Zahlen): Molekular-

gewichte in kDa; (1D, 2D): Die Richtung der ersten und zweiten

Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.

3 Ergebnisse

56

5252/21048/ =+=zm

3.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus

Datenbanken

Die Identifizierung der Proteine erfolgte durch den Vergleich der experimentell ermittelten

Peptid-Massen mit theoretischen Massen aus Protein-Datenbanken. Dazu wurde das speziell

auf die Datenbanksuche mit Peptidmassen ausgerichtete Programm „MASCOT“ verwendet.

Die MASCOT-Datenbankrecherche wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Uwe Warnken,

Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, durchgeführt.

Die Analyse mit dem Tandem-Massenspektrometer lieferte zunächst zwei Arten von

Massenspektren (Abb. 3.12): Das im ersten Quadrupol des Massenanalysators generierte

Vorläufer-Ionen Spektrum (Precursor Ion Spectrum) eines Peptids und das Fragment-Ionen

Spektrum dieses Peptids.

Die Masse ist mit dem m/z-Quotienten über folgenden Zusammenhang korreliert: Ein

zweifach protoniertes (m=2u) Fragment mit der Masse m=1048u und der positiven Ladung

+2 erscheint im Spektrum bei

ESI-Ionenquellen in Kombination mit Tandem-Massenspektrometern liefern Spektren mit

einer Auflösung von +/- 0,1Da, das heißt selbst unterschiedliche Isotope eines Fragment-Ions

werden dargestellt. Zur Datenbank-Analyse wurde jeweils die monoisotopische Masse eines

Fragment-Ions verwendet (Abb. 3.13). In der Regel wurde diese durch den ersten Peak des

Abb. 3.12 Vorläufer-Ionen Spektrum (A) und zugehöriges Fragment-Ionen Spektrum (B) eines Peptids. (I):

Relative Intensität des Signals in %; die Intensität von 100% entspricht der relativen Intensität des größten

Peaks („Basispeak“); (m/z): Masse zu Ladungs-Quotient; (M+2H)2+

: Masse eines zweifach protonierten

Fragmentions; (y): Signale der y-Typ-Ionen (vgl Abb. 1.10). (verändert nach Chernushevich et al., 2001).

3 Ergebnisse

57

Isotopenspektrums reflektiert, sofern das Rauschen des Detektors (vergrößert dargestellt)

dessen Intensität nicht überdeckte.

Die Intenstät des Detektor-Rauschens ist abhängig von der Sensibilität des Digitalwandlers,

der die Stärke der durch das auftreffende Ion erzeugten Elektronenströme auf der

Mehrkanal-Platte in ein verwertbares digitales Signal verwandelt.

Die über ihren m/z-Wert errechneten monoisotopischen Massen der Fragment-Ionen wurden

direkt durch Verwendung des Programms MASCOT einer Datenbanksuche unterzogen. Das

Erscheinungsbild und Ausgabeformat der Ergebnisse einer solchen Datenbank-Recherche

wird im Folgenden an einem Beispiel erläutert:

Abb. 3.13 Isotopenspektrum eines Fragmentions. Jeder Peak reflektiert die

Masse dieses Fragmentions unter Berücksichtigung verschiedener

Kohlenstoff-Isotope. Zur Bestimmung der monoisotopischen Masse

verwendet man üblicherweise den ersten Peak des Spektrums, sofern dessen

Intensität nicht durch die Intensität des Detektor-Rauschens überdeckt wird.

In diesem Fall würde der größte monoisotopische Peak des Spektrums zur

Massenanalyse verwendet. (verändert nach Chernushevich et al., 2001).

3 Ergebnisse

58

3 Ergebnisse

59

)log(10 PScore ∗−=

Die Kopfzeilen im oberen Drittel des Formblatts enthalten Daten wie Benutzername und

interne Analysennummer, die es dem Anwender des Programms ermöglichen, eine Suche

eindeutig einer analysierten Probe zuzuordnen. Außerdem ist dort die der Suche zu Grunde

liegende Datenbank vermerkt, die der Benutzer bereits in den Voreinstellungen festlegt. In

unserem Fall wurde die Datenbank von NCBI (National Center for Biotechnology

Information, www.ncbi.nlm.nih.gov) verwendet. Im Vorfeld wurden außerdem nur solche

Ergebnisse zugelassen, die gemäß ihrer Herkunft aus der Ratte den Säugetieren zugeordnet

werden konnten (im Formular nicht ersichtlich). Die Option signifikante Treffer bereits in der

Kopfzeile einsehen zu können, wurde ebenfalls in Anspruch genommen.

MS/ MS-Daten liefern eine große Zahl an Spektren, deshalb ist es sinnvoll ein überschaubares

Ausgabeformat zu wählen, das dennoch vollständig ist. Es wurde die tabellarische Auflistung

von maximal 50 („Maximum number of hits“) gefundenen Massen und identifizierten

Peptiden („Peptide Summary Report“) pro Vorläufer-Ion gewählt, die das Programm den

Fragment-Ionen Spektren zuordnen konnte. Der Grad der Übereinstimmung der experimentell

ermittelten Peptidmassen mit den theoretischen Peptidmassen der Datenbank definiert in der

Massenspektrometrie einen als „Score“ bezeichneten Wert, der als Maß der Übereinstimmung

fungiert. Bei der MS/ MS trägt auch die Übereinstimmung des Fragment-Ionen Spektrums

mit dem Muster theoretischer Fragment-Ionen Spektren eines Vorläufer-Peptids gleicher

Masse zum Score der Peptide bei. Ein Score größer 30 (p<0,05) reflektiert mit hoher

Wahrscheinlichkeit die Identität oder starke Homologie des Peptids mit dem

Datenbank-Eintrag. Dieser Wert wurde mathematisch ermittelt und ergibt sich aus dem

einfachen Zusammenhang:

Wobei P die Wahrscheinlichkeit definiert, dass es sich bei der Übereinstimmung der

experimentell ermittelten Massen mit den theoretischen Massen um ein zufälliges Ereignis

handelt.

3 Ergebnisse

60

Im Vorfeld wurde die Option des „Standard-Scorings“ gewählt, das heißt es wurden auch

solche Ergebnisse bei der Ausgabe berücksichtigt, deren Score-Wert kleiner als 30 ist. Es

kann erst nach der Sichtung der tabellarischen Auflistung endgültig entschieden werden, ob

ein identifiziertes Peptid, das einen niedrigen Score erzielt hat, als nicht signifikant bewertet

werden muss.

Das im Beispiel aufgelistete Hitzeschockprotein hat in der Summe seiner Einzelscores einen

hohen Gesamt-Score von 677, obwohl einige der Peptide einen Score<30 erzielten. Die

m/z-Werte sind in der Spalte „observed“ dargestellt, die Spalte Mr (expt) enthält die

experimentell ermittelten Massen, Mr (calc) die theoretischen Massen der Peptide. Eine

Differenz „Delta“ von -0,01 bedeutet, dass die experimentell ermittelte Masse eines Peptids

0,01Da geringer ist als die theoretische Masse dieses Peptids. In der Spalte „Miss“ (missed

cleavage sites) ist die Zahl intakter tryptischer Spaltstellen vermerkt, „Expect“ („expectation“)

bezeichnet einen Erwartungswert der Übereinstimmung mit theoretischen Massen, der vom

generellen Auftreten dieser Aminosäure-Sequenz in Proteinen abhängt. Ein kleiner

„Expect“-Wert reflektiert eine hohe Signifikanz des Score-Werts.

3.5.2 Tabellarische Auflistung der Resultate

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind noch nicht alle 63 Einzel-Proben (Abb. 3.11)

massenspektrometrisch analysiert. Die tabellarische Auflistung der bisherigen Ergebnisse ist

deshalb exemplarisch. Die ermittelten Massen wurden bei der NCBI-Datenbanksuche von

MASCOT den Proteinen zugeordnet, die den signifikantesten Score erzielten.

Informationen, die notwendig waren um die Proteine tabellarisch zu kategorisieren, wurden

der Pfam-Datenbank (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml) und iHOP

(„Information Hyperlinked Over Proteins“, www.pdg.cnb.uam.es/UniPub/iHOP) entnommen.

Die Originaltabellen, wie sie von Herrn Dr. Uwe Warnken, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ,

übergeben wurden, sind dem Anhang beigefügt und enthalten weitere Angaben, wie

isoelektrische Punkte (PI), Anzahl der analysierten Fragment-Ionen (n) und score-Werte.

Kategorie 1: Proteine mit Transmembran-Domänen, membran-assoziierte Proteine

Tetragon

Nr.

Protein

Nr.

Identifikations

Nr.

Masse

(Da) Protein-Information

1 3 gi6978743 56645 cytochrome P450, subfamily IIA (pheno-barbital-

inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus

norvegicus]

1 4 gi112467 S 60279 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat

1 13 gi55391497 56857 ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 2

[Mus musculus]

3 Ergebnisse

61

1 14 gi34856646 57538 PREDICTED: similar to Expressed sequence

AI505034 [Rattus norvegicus]

2 7 gi62652134 50688 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus

norvegicus]

2 12 gi60688595 63682 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus]

2 14 gi19924182 57012 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1)

[Rattus norvegicus]

2 15 gi51259250 56480 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus

norvegicus]

2 17 gi57732 49734 potential ligand-binding protein [Rattus rattus]

3 1 gi6978543 114293 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide

[Rattus norvegicus]

3 5 gi|34856103 134442 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus

norvegicus]

3 9 gi9506531 56195 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2

[Rattus norvegicus]

3 12 gi34880876 60761

PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline

monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-

containing

4 10 gi6978671 76584 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus]

4 11 gi30387859 44734 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus

norvegicus]

4 12 gi13928780 77313 P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattus

norvegicus]

4 15 gi16758174 60606 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus

norvegicus]

4 20 gi6978549 35610 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide

[Rattus norvegicus]

4 21 gi62641851 109846 PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alpha

subunit [Rattus norvegicus]

4 22 gi38303937 58150 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus]

4 33 gi38181831 52719 Ephx1 protein [Rattus norvegicus]

4 34 gi71911 Sc 40568 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain,

splice form alpha-2 [validated] - rat

6 2 gi57303 111093 sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattus

norvegicus]

6 3 gi8393755 121369 membrane bound C2 domain containing protein

[Rattus norvegicus]

6 6 gi23397411 59411 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1

[Rattus norvegicus]

6 10 gi4079645 47755 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus]

9 1 gi25282419 67612 calnexin [Rattus norvegicus]

9 5 gi62647031 95860 PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunit

a4 [Rattus norvegicus]

30 1 gi114523 58904 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor

30 2 gi8393322 57010 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus]

30 3 gi56899 62390 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus

norvegicus]

30 9 gi58865414 54468 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus]

30 10 gi23397411 59411 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1

[Rattus norvegicus]

30 14 gi6978813 47853 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus]

30 22 gi13929028 54503 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2

[Rattus norvegicus]

30 23 gi16758758 58206 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus]

30 25 gi220659 47668 dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattus

norvegicus]

30 26 gi55741424 51383 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1,

51kDa [Rattus norvegicus]

30 28 gi62664168 307188 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus

3 Ergebnisse

62

norvegicus]

30 31 gi62664021 86917 PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattus

norvegicus]

31 17 gi1408198 58059 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus]

31 18 gi6978847 60427 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus

norvegicus]

31 22 gi62654875 57215 PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattus

norvegicus]

31 40 gi54792127 56318 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1

complex, beta subunit [Rattus norvegicus]

32 10 gi117206 S 56240 Cytochrome P450 2B1 (CYPIIB1) (P450-B) (P450b)

(P450-PB1 and P450-PB2) (P450-LM2)

35 7 gi51948476 53500 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I

[Rattus norvegicus]

35 11 gi184268 50332 annexin A7 [Rattus norvegicus]

35 12 gi13929186 47543 flotillin 2 [Rattus norvegicus]

35 15 gi57539 47398 ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattus

rattus]

37 10 gi58865476 45207 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)

[Rattus norvegicus]

Tab. 3.1 Tabellarische Liste der bis dato MS-identifizierten Membranproteine. Aufgelistet wurden Proteine,

deren Sequenz mindestens einmal die Membran durchspannt und solche, die mit einem Lipidanker in der

Membran befestigt oder indirekt über nichtkovalente Wechselwirkungen mit anderen Membranproteinen mit der

Membran assoziiert sind.

Kategorie 2: Lösliche Proteine, Proteine des Cytoskeletts und der Extrazellulären

Matrix

Tetragon

Nr.

Protein

Nr.

Identifikations

Nr.

Masse


1 1 gi11560133 50788 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus]

1 2 gi21245098 50711 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus]

1 5 gi71620 42066 actin beta - rat

1 7 gi45737866 56079 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor

[Rattus norvegicus]

1 9 gi62645766 36065 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-

like [Rattus norvegicus]

1 16 gi11693172 48137 calreticulin [Rattus norvegicus]

2 6 gi34856626 38067 PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattus

norvegicus]

2 9 gi587518 S 16950 keratin 18 [Rattus norvegicus]

2 18 gi19424338 51667 hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattus

norvegicus]

2 20 gi59808742 46632 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus]

3 3 gi|20302024 111448 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus]

3 5 gi34856103 134442 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus

norvegicus]

3 7 gi62641274 56609 PREDICTED: similar to Tu translation elongation

factor, mitochondrial [Rattus norvegicus]

3 19 gi56605938 47248 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic

reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus]

4 2 gi27465535 50095 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus]

4 14 gi62644345 41430 PREDICTED: similar to secretory protein precursor

[Rattus norvegicus]

4 18 gi|7437838 77149 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat

4 19 gi57012354 65190 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus]

3 Ergebnisse

63

4 27 gi11072106 50173 NEFA precursor [Rattus norvegicus]

4 30 gi420265 S 2891 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat

(fragment)

4 36 gi62660728 46453 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus]

4 37 gi1945471 38660 paraoxonase [Rattus norvegicus]

5 5 gi57114290 69484 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus]

5 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]

6 4 gi12018304 201240 KPL2 protein [Rattus norvegicus]

9 11 gi125296 S 42970 Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain)

(B-CK)

30 6 gi62078513 62399 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus]

30 7 gi6981324 57228 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus

norvegicus]

30 16 gi27465561 64287 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus]

30 18 gi38494348 54994 Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1

[Rattus norvegicus]

30 19 gi18266692 53069 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus]

30 20 gi54261608 32532 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus]

30 33 gi6678471 50612 tubulin, alpha 7 [Mus musculus]


[Rattus norvegicus]


[Rattus norvegicus]

32 8 gi488838 S 47590 CaBP1 [Rattus norvegicus]

34 5 gi15805031 50460 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2

[Rattus norvegicus]

34 7 gi8393057 46602 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H,

member 1 [Rattus norvegicus]

34 11 gi62641274 56609 PREDICTED: similar to Tu translation elongation

factor, mitochondrial [Rattus norvegicus]

34 13 gi62656848 14811 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35

[Rattus norvegicus]

35 13 gi66730294 45666 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus]

35 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]

35 18 gi18543177 52176 citrate synthase [Rattus norvegicus]

37 7 gi58865778 49093 dolichyl-di-phosphooligosaccharide-protein

glycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus]

37 10 gi58865476 45207 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)

[Rattus norvegicus]

Tab. 3.2 Liste der löslichen, extrazellulären und cytoskelettalen Proteine.

Kategorie 3: Proteine mit unbekannten Funktionen

Tetragon

Nr.

Protein

Nr.

Identifikations

Nr.

Masse


1 10 gi38014578 50225 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus

norvegicus]

4 16 gi56737 Sc 95398 unnamed protein product [Rattus norvegicus]

4 29 gi56107 Sc 47428 unnamed protein product [Rattus norvegicus]

30 30 gi56198 61719 unnamed protein product [Rattus norvegicus]

Tab. 3.3 Auflistung von Proteinen, die noch nicht näher beschrieben oder unbekannt sind.

4 Diskussion

64

4 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden etabliert, die es in einem hohen Maß

ermöglichen, Membranproteine olfaktorischer Rezeptor-Neurone (ORN) für die

massenspektrometrische Analyse zu gewinnen. Durch die Optimierung bestehender

Protokolle zur Präparation von Cilien-Membranen konnte deren Ausbeute und somit indirekt

die Protein-Ausbeute wesentlich gesteigert werden. Anschließend wurde ein

zweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren angewandt, um die isolierten

Proteine möglichst quantitativ und in hoher Auflösung im Gel darzustellen.

Das Ablösen ciliärer Membranen von den dendritischen Knöpfen der ORNs wurde durch die

etablierte Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967) erreicht. Es ist allerdings bis heute

unbekannt, wie Calcium-Ionen (Ca2+

) den Zusammenbruch des tubulären Systems bewirken.

Es ist ebenfalls umstritten, ob die Anwendung dieses Verfahrens die calcium-sensitiven

Signaltransduktions-Prozesse im Bereich der Cilien wesentlich beeinflusst und deshalb für

physiologische Untersuchungen ungeeignet ist (Washburn et al., 2002). Biochemische

Untersuchungen bleiben durch den Einsatz von Ca2+

jedoch unbeeinflusst.

Für die Isolation ciliärer Membranen mit dem Ziel, Membranproteine für weiterführende

Experimente möglichst quantitativ zu gewinnen, wurde diese Methode in modifizierter Form

mit Erfolg eingesetzt. Die Riechepithelien mussten während des Calcium-Schocks im

Schnappdeckel-Glas gerührt werden. Möglicherweise wirken sich die dabei entstehenden

Scherkräfte positiv auf den Zusammenbruch der ciliären Struktur aus. Bei der sequentiellen

Zentrifugation konnte im Anschluß das Verschwinden der gelblichen Cilien-Membranen am

äußeren Rand des decilierten Epithels beobachtet werden. Durch den Einsatz der

sequentiellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen Zentrifugationsschrittes, konnte die

Ausbeute an Cilien-Membranen zwar deutlich gesteigert werden, aber möglicherweise

wurden durch die zweimalige zusätzliche Resuspendierung des Gewebes, neben den

Cilien-Membranen auch andere Membranen, lösliche Proteine oder sogar Organellen in den

Überstand gebracht. Die anschließende Anreicherung der Cilien-Membranen durch

Anwendung des Saccharose-Stufengradienten ist deshalb auch als Reinigungsschritt zu

betrachten.

Die cilien-spezifischen Transduktionsmoleküle AC III, Gαolf , CNG-A2 und CNG-A4 wurden

als Marker verwendet, deren immunologischer Nachweis in der Präparation als positiv

4 Diskussion

65

bezüglich der Isolations-Methode zu bewerten ist. Dazu wurden die Proteine eindimensional

durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen transferiert. CNG-A2 und CNG-A4

stellen dabei zwei von insgesamt drei verschiedenen Untereinheiten des CNG-Kanals dar

(Dhallan et al., 1990; Goulding et al., 1992; Bradley et al., 1994, 2001; Liman und Buck,

1994; Sautter et al., 1998; Bönigk et al., 1999; Munger et al., 2001; Zheng et al., 2004), der

als Tetramer, bestehend aus zwei CNG-A2, CNG-A4 und CNG-B1b, in der Cilienmembran

eine zentrale Pore formt, durch die nach Bindung von cAMP hauptsächlich Ca2+

einströmt

(Dzeja et al., 1999). Die Markerproteine eigneten sich in zweifacher Hinsicht zur

Durchführung der Qualitätskontrolle: Sie sind die maßgeblichen Komponenten der

olfaktorischen Signaltransduktion und werden deshalb hauptsächlich in den Cilien exprimiert.

Bei den CNG-Untereinheiten handelt es sich außerdem um Membranproteine, deren

Anwesenheit in der Präparation neben der Proteinbestimmung zusätzlich als Maßstab dafür

diente, ob Membranen beziehungsweise Membranproteine in ausreichender Menge durch die

Methode erfasst werden.

Diese Aussage gilt ensprechend auch für die AC III. Zusätzlich wurde Gαolf als

membran-assoziiertes Protein der Signaltransduktionskaskade nachgewiesen. Damit ist auch

gezeigt, dass unter den gegebenen Präparationsbedingungen Membrankomplexe zunächst

erhalten bleiben.

AC III und Gαolf zeigten an dieser Stelle bei der Western Blot-Analyse allerdings deutlich

stärkere Signale als CNG-A2 und CNG-A4. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen,

dass den Proteinen AC III und Gαolf bei der olfaktorischen Signaltransduktion direkt eine

verstärkende Funktion des Rezeptorsignals zugesprochen wird (Jones und Randall, 1989).

CNG-Kanäle verstärken das Signal nur indirekt über den Anstieg von [Ca2+

]i, welche die

Öffnung Ca2+

-aktivierter Chlorid-Kanäle bewirkt. Sie sind deshalb möglicherweise weniger

stark in Cilien exprimiert als AC III und Gαolf. Möglich ist aber auch die größere Affinität der

Erst-Antikörper gegen AC III und Gαolf im Vergleich zu den CNG-Antikörpern.. Diese Frage

kann jedoch letztlich nur durch eine vergleichende Expressions-Analyse beantwortet werden.

Die in dieser Arbeit vorgestellte Präparationstechnik wurde mit dem Ziel entwickelt, ciliäre

Membranproteine zweidimensional durch Gelelektrophorese zu trennen. Diese Trenntechnik

sollte so optimiert werden, dass es im Anschluß möglich war, die im 2D-Gel dargestellten

Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Diese Strategie entspricht der heute am

häufigsten angewandten methodischen Vorgehensweise zur Analyse komplexer

Protein-Gemische. Als zweidimensionales Trenn-Verfahren dient üblicherweise die

4 Diskussion

66

isoelektrische Fokussierung (IEF) der Proteine (O´Farrell, 1975) in der ersten Dimension,

gefolgt von der klassischen SDS-PAGE in der zweiten Dimension (IEF/ 2D-SDS-PAGE). Die

Einführung dieser Methode in die Protein-Analytik ermöglichte erstmals die Darstellung von

bis zu 10 000 Proteinen in einem Gel (Übersicht: Westermeier, 2002). Dies entspricht einer

100fach höheren Trenn-Kapazität als bei der eindimensionalen SDS-PAGE, die im Gegensatz

zur IEF/ 2D-SDS-PAGE auch nicht geeignet ist, leicht unterschiedliche Modifikationen eines

Proteins aufzulösen. So kann zum Beispiel in einer vergleichenden Proteom-Studie nur durch

Anwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE das veränderte Expressionsmuster einer krankhaft

veränderten Zelle im Vergleich zu einer gesunden Zelle im Gel dargestellt werden.

Obwohl die IEF/ 2D-SDS-PAGE in weiten Bereichen der Forschung seit Jahren erfolgreich

angewendet wird, ist es trotzdem nie gelungen, diese Technik so zu optimieren, dass auch

Membranproteine zuverlässig dargestellt werden konnten (Rais et al., 2004). Ursache dafür

sind zwei generelle Eigenschaften der Membranproteine: Die Hydrophobizität ihrer

transmembranen Regionen und die Basizität der außerhalb dieser Regionen liegenden

Bereiche (Lehner et al., 2003). Membranproteine lassen sich deshalb nur schwer in gängigen

Puffersystemen lösen und präzipitieren häufig an ihrem isoelektrischen Punkt (Patton, 1999).

Ansätze, die in der Vergangenheit eine verbesserte Löslichkeit der Membranproteine während

der isoelektrischen Fokussierung anstrebten, beruhen hauptsächlich auf der Zugabe

zwitterionischer Detergenzien, wie CHAPS (Chevallet et al., 1998), chaotroper Substanzen,

wie Rhodanidsalz, Harnstoff und Thioharnstoff (Rabilloud, 1996; Rabilloud, 1998) oder

verschiedener anderer Detergenzien. Eine verbesserte Zugänglichkeit der Membranproteine

für die IEF/ 2D-SDS-PAGE konnte nur im Einzelfall erreicht werden und ist nie auf alle

Membranproteine einer Probe gleichermaßen anwendbar. Die Kombination und der Einsatz

dieser Substanzen ist außerdem nur begrenzt möglich, so fallen beispielsweise nicht-ionische

Detergenzien bei Zugabe von Guanidinchlorid aus (Rehm, 2004) oder Membranproteine

werden durch den Einsatz großer Harnstoff/ Thioharnstoff-Mengen irreversibel modifiziert.

Hohe Salzkonzentrationen stören außerdem die Trenn-Eigenschaften des Systems erheblich

und können Proteine stark denaturieren.

Die meisten Membranproteine, insbesondere stark basische, tauchen deshalb nach der

isoelektrischen Fokussierung im 2D-SDS-Gel nicht auf (Rais et al., 2004).

Für die Etablierung einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Methode zur Trennung

der ciliären Membranproteine wurde deshalb die 2D-CTAB/ SDS-PAGE (Navarre et al.,

2002) eingesetzt, ein Verfahren, das sich bezüglich seiner physikalisch-chemischen

4 Diskussion

67

Eigenschaften wesentlich von der IEF/ 2D-SDS-PAGE unterscheidet. Die Proteine werden

bei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE in beiden Dimensionen auf Grund ihrer Molekulargewichte

getrennt. Zwei wichtige Aspekte machen diese Methode besonders geeignet um

Membranproteine darzustellen: Die Verwendung des kationischen Detergenz

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), das auf Grund seiner positiven Ladung die

gleichfalls positiven Ladungen basischer Regionen der Membranproteine stabilisiert, diese

deshalb in Lösung hält und gleichzeitig benachbarte Phospholipide (das ursprüngliche

„Lösemittel“) verdrängt. Außerdem bewirkt der saure pH-Wert des Probenpuffers, dass

lösliche Proteine mit „sauren“ isoelektrischen Punkten, noch vor dem Auftragen der Probe

abgetrennt werden.

Eine Reduktion der Komplexität der Protein-Zusammensetzung war aus mehreren Gründen

wünschenswert. Durch die Präparation allein konnte diese zugunsten der Ausbeute nicht

erreicht werden. Dies wurde durch den eindimensionalen gelelektrophoretischen Vergleich

der Cilienproteine mit Proteinen des olfaktorischen Gesamtepithels gezeigt (Abb. 3.2) und im

Anschluss durch Western Blot-Analyse zum Nachweis nicht-ciliärer Markerproteine bestätigt

(Abb. 3.6). Man konnte also davon ausgehen, dass auch lösliche Proteine in der

Cilien-Präparation noch vorhanden sind. Diese sind im Gegensatz zu den Membranproteinen

besser in pH-neutralen Puffern, wie sie beispielsweise bei der IEF/ 2D-SDS-PAGE eingesetzt

werden, löslich und wandern deshalb zu Beginn der Elektrophorese bevorzugt in das Gel der

ersten Dimension. Die hydrophoben und deshalb schlechter löslichen Membranproteine

hingegen aggregieren und präzipitieren in der Probentasche. Ein weiterer Punkt ist, dass bei

der 2D-CTAB/ SDS-PAGE die Trenn-Kapazität im Vergleich zur IEF/ 2D-SDS-PAGE

deutlich reduziert ist, da die Proteine nur auf einer Diagonalen dargestellt werden können.

Aus diesen Gründen begünstigt das Abtrennen löslicher Proteine bei der

2D-CTAB/ SDS-PAGE die Darstellung von Membranproteinen. Eine andere Methode, die

nach den gleichen Prinzipien die Trennung von Membranproteinen ermöglicht, ist die

ebenfalls angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE (Hartinger et al., 1996; Dreger et al., 2005).

Diese wurde im Rahmen dieser Arbeit getestet (nicht dargestellt), erzielte aber im Vergleich

zur 2D-CTAB/ SDS-PAGE eine wesentlich schlechtere Auflösung.

Das 2D-CTAB/ SDS-Gel konnte im weiteren Verlauf dieser Arbeit für die

massenspektrometrische Analyse in mehrerer Hinsicht erfolgreich optimiert werden. Die stark

Hintergrund-lastige Silberfärbung wurde durch die colloidal Coomassie-Färbung ersetzt,

welche zudem für die MS-Analyse besser geeignet ist. Die Proben wurden außerdem zur

4 Diskussion

68

Schärfung des Proteinmusters deglykosyliert und Nuclease-behandelt. Dies erzielte in

Kombination mit einer geeigneten Probenmenge eine optimale Auflösung und das horizontale

streaking, häufig eine Folge von Nukleinsäure-Verunreinigungen oder zu hohen

Probenmengen, konnte reduziert werden.

Die Protein-Identität bei Anwendung dieser Trenn-Technik wurde nachfolgend auf zwei

Ebenen überprüft: Durch Western Blot-Analyse der Markerproteine AC III, Gαolf , CNG-A2

und CNG-A4 und letztlich durch die massenspektrometrische Identifizierung

cilienspezifischer Proteine.

Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten erneut alle ciliären Markerproteine detektiert

werden. Interessant ist hier, dass im Gegensatz zur eindimensionalen SDS-PAGE auch die

unglykosylierte Variante der CNG-A2-Untereinheit bei 76kDa nachgewiesen wurde (Abb.

3.9, links), obwohl die Proben für Gele zur anschließenden Western Blot-Analyse nicht

deglykosyliert wurden. Da Glykoside die Löslichkeit eines Proteins erhöhen, ist die

nicht-glykosylierte Variante mit hoher Wahrscheinlichkeit im SDS-Probenpuffer unlöslich

und kann deshalb nach der 1D-SDS-PAGE nicht detektiert werden.

Im Gegensatz dazu konnte von der AC III nur das häufig auftretende Abbauprodukt (vgl.

Bönigk et al., 1999) bei 72kDa nachgewiesen werden. Hierfür können mehrere Ursachen

verantwortlich sein: Hochmolekulare Varianten der AC III sind im CTAB-Probenpuffer

unlöslich, Degradation durch Proteasen, Verlust des Proteins während der Äquilibrierung im

SDS-Lyse Puffer oder eine mangelhafte Äquilibrierung. Eine Degradation durch Proteasen ist

unwahrscheinlich, da durch den konsequenten Einsatz von Inhibitoren viele Proteasen noch

während der Präparation irreversibel gehemmt wurden und alle anderen Markerproteine

eindeutig detektiert werden konnten. Der Verlust von kleineren Proteinen durch Auswaschen

während der Äquilibrierung ist sowohl bei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE als auch bei der

IEF/ 2D-SDS-PAGE möglich (Berkelman et al., 2000), aber bei großen Proteinen wie der

AC III eher unwahrscheinlich. Eine mangelhafte Äquilibrierung deckt sich mit dem Auftreten

des vertikalen streakings im höhermolekularen Bereich des 2D-Gels (Abb. 3.8). Proteine, die

nicht ausreichend äquilibriert werden, tragen entweder einen Überschuß an positiver Ladung

durch das CTAB der ersten Dimension oder werden nur uneinheitlich durch SDS mit einer

negativen Ladung versehen. Ersteres führt dazu, dass die Proteine in der zweiten Dimension

nicht in das Gel, sondern aus ihm heraus in den Elektrodenpuffer wandern. Dies würde

erklären, warum die üblicherweise glykosylierte Variante der AC III nicht nachgewiesen

wurde. Bei ungleicher negativer Ladung wandern gleiche Proteine verschieden weit in das

4 Diskussion

69

Gel und hinterlassen vertikale Spuren, die nach der Färbung sichtbar werden. Die Dauer der

Äquilibrierung kann jedoch nicht beliebig ausgedehnt werden, da kleine Moleküle sonst

ausgewaschen würden. Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle sagen, dass die

Äquilibrierung einen kritischen Schritt zweidimensionaler gelelektrophoretischer

Trenn-Verfahren darstellt, dass dabei aber mögliche Verluste durch die höhere

Trenn-Kapazität toleriert werden können.

Das Ziel bei der Präparation ciliärer Membranen und der Etablierung der

2D-CTAB/ SDS-PAGE war die hochauflösende, aber auch quantitative Darstellung ciliärer

Membranproteine für die massenspektrometrische Analyse. Ob das Detergenz CTAB in

Verbindung mit Harnstoff geeignet ist um hauptsächlich Membranproteine zu lösen und ob

durch die Präparationstechnik überwiegend ciliäre Membranen isoliert werden konnten, kann

schließlich eindeutig nur durch die massenspektrometrische Identifizierung der im 2D-Gel

dargestellten Proteine beantwortet werden.

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind etwa ein Viertel der Proben analysiert worden. Die

Diskussion der Ergebnisse muss deshalb exemplarisch bleiben. Die NCBI-Daten wurden mit

Hilfe von Datenbanken zunächst in drei Kategorien eingeteilt. Dabei konnten 50 der 99

Proteine beziehungsweise Protein-Untereinheiten als Membranproteine oder

membranassoziierte Proteine identifiziert werden. Ein nicht unerheblicher Anteil dieser

Proteine besitzt einen theoretisch ermittelten isoelektrischen Punkt (PI, siehe Anhang), der

weit im Basischen liegt. Offensichtlich konnten also durch die 2D-CTAB/ SDS-PAGE auch

stark basische Proteine dargestellt werden. 45 der 99 Proteine konnten löslichen,

cytoskelettalen oder Matrix-Proteinen zugeordnet werden. 4 der 99 Proteine wurden als

unbekannt oder unbenannt deklariert und entsprechend eingeordnet.

Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse zeigen, dass die Trenn-Methodik der

2D-CTAB/ SDS-PAGE in hohem Maße geeignet ist, Membranproteine darzustellen. Über

50% der identifizierten Proteine konnten dieser Kategorie zugeordnet werden. Unter diese

Kategorie fällt auch die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins und ihre Spleiß-Variante

α2. Auch die CNG-A2-Untereinheit des CNG-Kanals wurde identifiziert, deren glykosylierte

Variante im analysierten Bereich des A-Feldes (Abb. 3.11) lokalisiert ist. Offensichtlich

konnte durch die PNGaseF-Behandlung der Proben keine vollständige Deglykosylierung

erreicht werden.

CNG-A4 und das Abbauprodukt der AC III liegen im 2D-Gel außerhalb der bisher

analysierten Regionen und wurden deshalb erwartungsgemäß noch nicht nachgewiesen. Dies

4 Diskussion

70

gilt auch für die höhermolekulare Form der AC III. Deren unglykosylierte Variante liegt mit

einem Molekulargewicht von etwa 128kDa allerdings innerhalb der analysierten Region.

Dieses Ergebnis deckt sich mit der Hypothese, dass AC III beim Übergang von der ersten in

die zweite Dimension der 2D-CTAB/ SDS-PAGE möglicherweise nur unzureichend

äquilibriert wurde.

Es würde im Rahmen dieser Arbeit zu weit führen, jedes Protein, das massenspektrometrisch

analysiert wurde, im Einzelnen zu diskutieren. Deshalb werden die Ergebnisse im Folgenden

so zusammengefasst, dass eine Aussage über die Qualität der Präparations- und Trenntechnik

getroffen werden kann.

Unter den Proteinen der Kategorie 1 und 2 (vgl. Tab. 1 und 2) befindet sich eine auffallend

hohe Zahl von Enzymen, die am Duftstoffwechsel und an der Verstoffwechslung toxischer

Substanzen beteiligt sind (so genannte xenobiotic metabolizing enzymes). Darunter befinden

sich auch solche, deren verminderte Expression im Alter, mit neurodegenerativen

Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (siehe z.B. Poon et al., 2005). Einige

dieser Enzyme sind in den ER- oder Mitochondrien-Membranen der Stützzellen lokalisiert.

Andere werden in den olfaktorischen Mukus sezerniert. So wurden beispielsweise unter den

Membranproteinen mehrere Isoformen des Cytochroms P450 identifiziert. Nach der Leber ist

das olfaktorische Epithel das Gewebe mit der zweithöchsten Cytochrom P450-Konzentration

(Hines et al., 2001). Die bräunliche Farbe des Epithels ist somit sicherlich auf die

Häm-Gruppe der Cytochrome zurückzuführen und möglicherweise ist die gelbliche Färbung

des Cilien-Rings (Abb. 3.1) ein Zeichen für Verunreinigungen durch Cytochrom P450-haltige

Membranen.

Andere Enzyme, die massenspektrometrisch identifiziert wurden und zur Gruppe der

xenobiotic metabolizing enzymes gehören, sind: Epoxid-Hydrolase, UDP-

Glucuronyltransferase, Isoformen der Aldehyd-Dehydrogenasen, Isoformen der FAD-

Monooxygenasen und Hydroxyacyl-Dehydrogenase.

Ebenfalls zu Proteinen der Kategorie 1 und 2 gehören Calcium-Bindeproteine, wie Calnexin,

CaBP1 und Calreticulin, das beispielsweise im ER-Lumen lokalisiert ist und

Calcium-abhängige Proteine wie der Nodal modulator 1, Annexin A11 der äußeren Membran

und Annexin A7, eine Calcium-abhängige GTPase.

Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch eine Reihe von

Transportproteinen, wie zum Beispiel die H+-ATPase der Lysosomen und die Na

+/K

+-ATPase

der Plasmamembran. Hierzu zählt auch die ATP-Synthase der inneren

4 Diskussion

71

Mitochondrienmembran, die zusammen mit Ubiquinon zusätzlich als Beispiel für ein Protein

des Energiestoffwechsels dient.

Von den 99 Proteinen wurden vier als unbekannt beziehungsweise unbenannt deklariert.

Durch die Suche nach homologen Sequenzen in Datenbanken konnten drei dieser Proteine mit

hoher Wahrscheinlichkeit identifiziert werden. Es handelt sich dabei um das Tubulin β2

(gi38014578), die α-Kette von Enolase1 (gi56107 Sc) und die Glutamat Dehydrogenase 1

(gi56198). Für das Protein gi56737 konnten keine Homologien zu bekannten Proteinen

gefunden werden. Zukünftige Experimente, wie die heterologe Expression oder die

subzelluläre Lokalisierung durch Antikörper, können helfen, die Funktion dieses Proteins

aufzuklären.

Nach Auswertung aller Daten sollte es im Anschluss möglich sein, weitere Proteine der

Signaltransduktion in den Cilien der olfaktorischen Rezeptor-Neurone zu charakterisieren und

ein verfeinertes Bild dieser Prozesse zu entwerfen. Dies gilt vor allem für den molekular

bisher noch nicht identifizierten Ca2+

-aktivierten Chlorid-Kanal (Frings, 1999; Eggermont,

2003).

Ausgehend von der Tatsache, dass die exemplarische Diskussion der bisherigen MS-Analyse

als repräsentativ für die noch ausstehenden Ergebnisse anzusehen ist, kann an dieser Stelle

abschließend gesagt werden, dass durch die Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE erreicht

wurde, dass mehrheitlich Membranproteine im 2D-Gel dargestellt werden konnten. Eine

solche Dimension konnte durch die Anwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE bisher noch nicht

erreicht werden. Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch solche, deren

theoretisch ermittelte isoelektrische Punkte weit im Basischen liegen. Es konnte also ein

zweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren etabliert werden, mit dem auch

basische Proteine im Gel dargestellt werden können.

Die Identifikation ciliärer Marker-Proteine beweist zudem, dass die angewandte

Präparationstechnik durchaus geeignet ist um Cilien-Membranen zu gewinnen, allerdings

waren darin auch Proteine anderer Herkunftsmembranen enthalten. Durch

Datenbank-Recherche allein kann jedoch nicht in jedem Fall eine genaue Aussage über die

zelluläre und subzelluläre Herkunft eines Proteins getroffen werden, da sich die

Datenbank-Beschreibungen oft nicht auf Proteine identischer Gewebe beziehen.

Eine Verunreinigung der Präparation durch lösliche oder cytoskelettale Proteine konnte nicht

vollkommen unterdrückt werden. Da Cilien-Strukturen aber im Wesentlichen durch ein

4 Diskussion

72

Mikrotubuli-Gerüst aufrecht erhalten werden, muss die Präsenz tubulärer Proteine immer

toleriert werden.

Eine Verbesserung der Reinheit der Präparation könnte zukünftig durch die zusätzliche

Anwendung eines kontinuierlichen Saccharose-Gradienten erreicht werden. Damit würden

zum Beispiel Mitochondrien, deren Membranen zu einem nicht unerheblichen Anteil für die

Verunreinigung der Präparation verantwortlich sind, im Vorfeld abgetrennt werden. Von

Vorteil wäre außerdem, dass die Komplexität der Probe weiter reduziert werden könnte.

Neuere Untersuchungen zur olfaktorischen Signaltransduktion zeigten, dass die Mehrzahl der

Prozesse von Ca2+

/ Calmodulin vermittelt werden. Dies gilt für die Aktivierung der

Ca2+

/ Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995) und

der CaM-Kinase II und für die Regulation durch Bindung der CNG-Kanäle (Chen und Yau,

1994; Liu et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004).

Für den Ca2+

-aktivierten Chlorid-Kanal ist die Ca2+

/ Calmodulin-vermittelte Regulation noch

hypothetisch (Kaneko, H., unveröffentlicht). Ein vielversprechender Ansatz zur spezifischen

Anreicherung von Proteinen der Signaltransduktion ist deshalb eine Vorreinigung durch

Calmodulin-Affinitäts-Chromatographie.

5 Zusammenfassung

73

5 Zusammenfassung

Der Prozess der olfaktorischen Signaltransduktion bei Säugetieren ist in seinen Abläufen

bereits gut verstanden (Firestein, 2001). Dennoch konnten bisher noch nicht alle molekularen

Details der Komponenten identifiziert werden. Dies gilt im Besonderen für den

Ca2+

-aktivierten Chlorid-Kanal, der den Hauptteil der Erregungsbildung in Riechneuronen

trägt. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb ein geeignetes Verfahren zu entwickeln, durch das

neue Kandidaten der Signaltransduktionskaskade massenspektrometrisch identifiziert werden

können. Diese sind hauptsächlich in den Cilienmembranen olfaktorischer Rezeptor-Neurone

lokalisiert und es wurde deshalb eine Präparationstechnik auf Basis der Calcium-

Schock-Methode etabliert, mit der die Cilienmembranen der Riechsinneszellen vom

olfaktorischen Gesamtepithel isoliert werden konnten. Die Präsenz cilien-spezifischer

Markerproteine in der Präparation wurde nach eindimensionaler Gelelektrophorese durch

Western Blot-Analyse bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Präparationsmethode

geeignet ist um Proteine der Signaltransduktion für zukünftige Experimente zu gewinnen.

Durch Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten die ciliären Membranproteine

anschließend quantitativ und mit guter Auflösung im 2D-Gel dargestellt werden. CTAB ist als

kationisches Detergenz geeignet selbst die hydrophoben und somit schwerlöslichen

Membranproteine zu lösen. Dies wurde durch den immunologischen Nachweis der ciliären

Markerproteine erneut bewiesen und durch die Ergebnisse der MS-Analyse bestätigt.

Für die massenspektrometrische Identifizierung wurde ein Nano-ESI MS/ MS-Gerät mit

vorgeschalteter HPLC-Anlage verwendet. Mit dieser Anordnung konnten aus komplexen

Protein-Proben geringe Mengen eines Proteins analysiert werden. Neben ciliären

Membranproteinen wurden auch Proteine innerer Membranen, lösliche Proteine,

cytoskelettale Proteine und Proteine der extrazellulären Matrix identifiziert. Darunter befindet

sich auch ein Protein, dem bisher noch keine Funktion zugeordnet werden konnte.

Möglicherweise handelt es sich hier um eines der bisher noch nicht näher molekular

charakterisierten Proteine der olfaktorischen Signaltransduktion.

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A Anhang

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A Anhang

UM1031_1

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 178 62 0 gi|21245098 50711; 4.88 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 93 23 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 35 44 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 30 35 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 28 1

UM1031_2

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 243 92 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 390 143 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 76 24 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 41 55 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 38 2

UM1031_3

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 321 92 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 158 73 0 gi|20302024 111448 5.11 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus] 133 64 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 86 55 0 gi|34856103 134442 5.73 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus norvegicus] 78 46 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 37 27 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 37 28 0 gi|57429 Sc 50387; 4.79 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 28 29 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 82 1

A Anhang

84

UM1031_4

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 876 232 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 591 193 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]430 164 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 421 135 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 390 146 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 331 107 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 257 108 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 237 109 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 234 9

10 0 gi|6978671 76584; 6.25 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus] 192 811 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 154 312 0 gi|13928780 77313; 5.30 P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattus norvegicus] 98 413 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 71 314 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 68 215 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 61 116 0 gi|56737 Sc 95398; 4.83 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 57 217 0 gi|984553 S 38167; 5.47 G protein beta 1 subunit [Rattus norvegicus] 49 218 0 gi|7437838 77149; 7.44 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat 44 119 0 gi|57012354 65190; 8.00 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus] 39 120 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 39 1

UM1031_4ff

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62641851 109846 5.76 PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alpha subunit [Rattus norvegicus] 35 12 0 gi|38303937 58150; 5.19 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus] 31 1

A Anhang

85

UM1031_5

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 213 72 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 160 83 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 75 44 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 49 15 0 gi|57114290 69484; 7.58 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus] 40 1

UM1031_6

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 185 92 0 gi|57303 Sc 111093 5.27 sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattus norvegicus] 146 73 0 gi|8393755 121369 5.47 membrane bound C2 domain containing protein [Rattus norvegicus] 48 14 0 gi|12018304 201240 5.55 KPL2 protein [Rattus norvegicus] 46 1

UM1031_9

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|25282419 67612; 4.49 calnexin [Rattus norvegicus] 246 132 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 98 33 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 82 24 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 70 65 0 gi|62647031 95860; 5.93 PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunit a4 [Rattus norvegicus] 62 26 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 37 37 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 34 2

A Anhang

86

UM1031_30

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 882 192 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 874 213 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 569 144 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 535 175 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 522 136 0 gi|62078513 62399; 5.90 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus] 460 97 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 360 118 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 258 79 0 gi|58865414 54468; 7.53 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus] 221 5

10 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 209 611 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 190 612 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing142 313 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 137 414 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 126 515 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 125 416 0 gi|27465561 64287; 9.26 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus] 123 517 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 96 418 0 gi|38494348 54994; 7.94 Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1 [Rattus norvegicus] 95 219 0 gi|18266692 53069; 6.10 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus] 80 320 0 gi|54261608 32532; 5.92 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus] 76 2

A Anhang

87

UM1031_30ff

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|55391497 56857; 5.57 ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 2 [Mus musculus] 75 42 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 71 13 0 gi|16758758 58206; 5.92 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus] 66 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 59 15 0 gi|220659 S 47668; 8.17 dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattus norvegicus] 56 16 0 gi|55741424 51383; 8.37 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1, 51kDa [Rattus norvegicus] 47 17 0 gi|11072106 50173; 5.02 NEFA precursor [Rattus norvegicus] 46 18 0 gi|62664168 307188 8.65 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus norvegicus] 42 29 0 gi|60688595 63682; 8.50 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus] 41 1

10 0 gi|56198 Sc 61719; 8.05 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 39 311 0 gi|62664021 86917; 5.54 PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattus norvegicus] 37 112 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 36 113 0 gi|6678471 50612; 4.97 tubulin, alpha 7 [Mus musculus] 34 114 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 34 1

A Anhang

88

UM1031_31

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 1090 262 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 988 213 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 986 194 0 gi|117148 S 58599; 8.99 Cytochrome P450 1A2 (CYPIA2) (P450-D) (P-448) 689 155 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 623 146 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]561 167 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 560 118 0 gi|34856315 57214; 5.24 PREDICTED: similar to ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 1 [Rattus norvegicus] 497 109 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing481 11

10 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 446 1011 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 399 1012 0 gi|56107 Sc 47428; 6.16 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 304 613 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 300 614 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 267 815 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 252 616 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 248 617 0 gi|1408198 58059; 8.93 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus] 187 618 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 160 419 0 gi|11693172 48137; 4.33 calreticulin [Rattus norvegicus] 95 320 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 93 2

UM1031_ff

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 90 22 0 gi|62654875 57215; 9.31 PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattus norvegicus] 82 13 0 gi|14485281 55038; 7.10 aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 [Rattus norvegicus] 65 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 60 15 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 53 16 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 48 17 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 44 1

A Anhang

89

UM1031_32

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]457 322 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 314 263 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 242 224 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 237 215 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 915 226 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 631 137 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 628 198 0 gi|488838 S 47590; 4.95 CaBP1 [Rattus norvegicus] 490 79 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing259 6

UM1031_34

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 900 282 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 174 73 0 gi|19424338 51667; 9.50 hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattus norvegicus] 145 74 0 gi|4079645 47755; 6.71 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus] 136 55 0 gi|15805031 50460; 9.10 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2 [Rattus norvegicus] 118 46 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 90 47 0 gi|8393057 46602; 8.88 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H, member 1 [Rattus norvegicus] 70 18 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 68 19 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 64 2

10 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 62 411 0 gi|62641274 56609; 8.50 PREDICTED: similar to Tu translation elongation factor, mitochondrial [Rattus norvegicus] 56 412 0 gi|62646586 18334; 8.65 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 42 113 0 gi|62656848 14811; 10.34 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35 [Rattus norvegicus] 37 114 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 28 1

A Anhang

90

UM1031_35

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 205 332 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 165 253 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 483 144 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]347 105 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 280 106 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 242 57 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 169 68 0 gi|59808742 46632; 7.07 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus] 135 69 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 112 3

10 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 98 311 0 gi|18426844 50332; 5.91 annexin A7 [Rattus norvegicus] 85 212 0 gi|13929186 47543; 5.18 flotillin 2 [Rattus norvegicus] 73 313 0 gi|66730294 45666; 8.90 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus] 72 214 0 gi|62079055 51391; 8.88 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus] 71 115 0 gi|57539 Sc 47398; 8.72 ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattus rattus] 60 116 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 53 217 0 gi|125296 S 42970; 5.33 Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain) (B-CK) 50 118 0 gi|18543177 52176; 8.53 citrate synthase [Rattus norvegicus] 40 119 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 35 120 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 31 1

A Anhang

91

UM103_37

Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 490 182 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]331 113 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 245 84 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 229 85 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 209 76 0 gi|34856626 38067; 4.67 PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattus norvegicus] 162 67 0 gi|58865778 49093; 5.62 dolichyl-di-phosphooligosaccharide-protein glycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus] 153 48 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 106 59 0 gi|587518 S 16950; 4.66 keratin 18 [Rattus norvegicus] 89 3

10 0 gi|58865476 45207; 5.66 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted) [Rattus norvegicus] 52 211 0 gi|1945471 38660; 5.05 paraoxonase [Rattus norvegicus] 24 1

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Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen … · 2005. 8. 30. · Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Frings und Dr