Isolierung und in vitro-Kultivierung von undifferenzierten ... · Nervenimpuls zum Bulbus olfactorius, wird die Grenze von peripherem zu zentralem olfaktorischen System überschritten

Aus dem Institut für Anatomie der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. Westermann

In Kooperation mit dem Zentrum für Integrative Psychiatrie Kiel Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie

Direktor: Prof. Dr. Aldenhoff

Isolierung und in vitro-Kultivierung von undifferenzierten humanen

Vorläuferzellen aus Nasenmuschelbiopsien: Methodene tablierung und Charakterisierung im Vergleich zu standardisierten ZNS-Zelllinien

Inauguraldissertation zur

Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von Andreas Jeske aus Greifswald

2012

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät

der Universität Lübeck

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jürgen Westermann

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Andreas Dendorfer

Tag der mündlichen Prüfung: 12.08.2013

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 12.08.2013

Inhaltsverzeichnis

I

1 Einleitung und Fragestellung 1

1.1 Wissenschaftlicher Hintergrund 1

1.2 Die Riechschleimhaut 3

1.3 Ethmoidektomien vs. Riechepithelbiopsie 6

1.4 Einstellung neuronaler Bedingungen 7

1.5 Untersuchung der Zelldifferenzierung 8

1.6 Stimulationsbedingungen der in vitro-Zellkultur 9

1.7 Ziel der Doktorarbeit 12

2 Material und Methoden 13

2.1 Probanden 13

2.2 Materialien 14

2.3 Primärzellkultur 17

2.4 Mikroglia-Zelllinien-Kulturen 23

2.5 Inkubationen der Zelllinien und Primärzellen mit Antipsychotika 24

2.6 Immunhistochemische Nachweismethoden 25

2.7 Mikroskopie 29

2.8 Zellzählungen 29

3 Ergebnisse 30

3.1 Etablierung reproduzierbarer Kulturbedingungen 30

3.2 Identische Immunfluoreszenznachweise 33

3.3 Unterschiedliche psychotrope Effekte 37

4 Diskussion 47

5 Zusammenfassung 68

6 Abkürzungsverzeichnis 69

7 Literaturverzeichnis 70

8 Anhang 87

Einleitung und Fragestellung

1

1 Einleitung und Fragestellung

1.1 Wissenschaftlicher Hintergrund

Psychiatrische Erkrankungen sind im Hinblick auf ihre pathologischen

Erscheinungsformen im Wesentlichen mit dem zentralen Nervensystem (ZNS) in

Verbindung zu bringen. Diese sind mittlerweile beim lebenden Menschen auf der

Basis von Bildgebungsuntersuchungen einsehbar. Als großes Problem in der

Praxis der neuropsychiatrischen Forschung offenbart sich die Tatsache, dass aus

ethischen Gründen nicht ausreichend Hirnzellen in vivo aus Menschen gewonnen

werden können. In der jüngsten Vergangenheit wurden allerdings verschiedene

Wege beschritten, um auf entsprechendes Zellmaterial zurückzugreifen und

dieses unter Aspekten eines direkten Bezugs zu psychiatrischen Erkrankungen

untersuchen zu können.

Häufig wurden Zellen aus Vollblut verwendet, welches klinisch leicht von

psychiatrischen Patienten gewonnen werden kann. Die Vergleichbarkeit von

Blutzellen mit Hirnmaterial wird aber in vielen fachwissenschaftlichen Beiträgen in

Frage gestellt, und trotz vieler Übereinstimmungen sind Blutzellen keine

neuronalen Zellen (Banati, Hoppe et al. 1991; Banati, Rothe et al. 1991;

Andersson, Perry et al. 1992; Avellino, Hart et al. 1995). Dennoch haben mehrere

Arbeitsgruppen interessante Befunde an Blutzellen von psychiatrischen Patienten

erheben können (Hinze-Selch, Becker et al. 1998; Hinze-Selch and Pollmacher

2001; Koch, Kell et al. 2002; Koch, Kell et al. 2003). Außerdem existieren

Parallelen zwischen den myelo-monozytären Zellen im Blut und den residenten

Makrophagen des ZNS: Mikroglia-Zellen stammen vom selben Keimblatt, dem

Mesoderm, ab und weisen - wie auch alle anderen phagozytierenden Zellen des

Körpers - viele funktionelle Ähnlichkeiten mit diesen auf (Leone, Le Pavec et al.

2006). Neben dem Ento- und Ektoderm gilt das Mesoderm als sogenanntes

mittleres Keimblatt des Embryoblasten. Keimblätter beschreiben in der

Entwicklungsbiologie die erste Differenzierung eines Embryos in verschiedene

Zellschichten (Fioroni 1992; Greven 2004). Die zellgebundene Forschung an

peripheren Zellen aus dem Blut ist in vielen Belangen zwar hilfreich, kann jedoch

die Untersuchung zentralnervöser Zellen nicht ersetzen.

Eine weitere Quelle psychiatrisch relevanter Zellen stellt post-mortem

Hirnmaterial dar. In der Praxis ist es jedoch aus rechtlichen, ethischen und


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prozeduralen Gründen nahezu unmöglich, zeitnah an geeignetes menschliches

Hirngewebe von psychiatrischen Patienten zu gelangen, um noch lebende Zellen

zu isolieren. Außerdem gibt es Hirnbanken, von denen die international

akkreditierte „Stanley Brain Collection“ über sehr gut charakterisiertes Material

verfügt, auf das von Forschern weltweit zurückgegriffen werden kann (Minambres,

Ballesteros et al. 2008). Diese Banken bedeuten einen großen Fortschritt für die

neuropsychiatrische Forschung, dennoch beschränken sich diese aus logistischen

Gründen auf fixierte oder tief gefrorene Hirne, aus denen ebenfalls keine lebenden

Zellen mehr gewonnen werden können.

Zelllinien aus Mensch und Maus bieten eine weitere, jedoch limitierte

Möglichkeit für die Erforschung von Hirnzellen. In dieser Arbeit verwenden und

argumentieren wir mit den standardisierten ZNS generierten Zelllinien CHME3 und

BV2. Leider waren in unserem Labor keine neuronalen Zelllinien etabliert und

verlässlich benutzbar. Die humane fötale Mikroglia-Zelllinie CHME3 ist durch

Immortalisierung embryonaler Mikroglia-Zellen mit dem „SV40 large T-Antigen“

erzeugt worden (Janabi, Peudenier et al. 1995). Die murine Zelllinie BV2 wurde

durch Infektion einer mikroglialen Primärkultur mit dem Onkogen raf/v-myc,

welches den J2 Retrovirus trägt, generiert (Blasi, Barluzzi et al. 1990). Des

Weiteren wäre die Untersuchung von Zelllinien mit psychiatrischer Indikation

sinnvoll gewesen. Forscher an unserem Haus haben in Zusammenarbeit mit der

neurochirurgischen Abteilung des Universitätsklinikums Eppendorf neurale

Vorläuferzellen aus Resektaten, welche bei therapeutischer Amygdalo-

Hippocampektomie entstehen, isoliert (Muller, Laurent et al. 2008). Bei den 24

operierten Patienten mit Temporallappenepilepsie lag jedoch in keinem Fall

zusätzlich eine psychiatrische Störung vor (FJ. Müller, persönliche

Kommunikation).

Aus diesen bestehenden Möglichkeiten zur Untersuchung von Hirnzellen

wird seit über einem Jahrzehnt wesentlich daran gearbeitet, zentralneuronale

Zellen aus der Nasenschleimhaut zu isolieren und mittels in vitro-Zellkultur

weitergehend zu charakterisieren (Feron, Perry et al. 1998). Dabei macht man

sich die anatomische Besonderheit zu Nutze, dass in der Nasenschleimhaut

vereinzelt über das Riechepithel im engeren Sinne hinaus zentralnervöse Zellen

mit abnehmender Häufigkeit von oberer zu unterer Nasenmuschel vorhanden sind

(Buck 2004; Witt and Wozniak 2006). Aus humanem Nasenmuschelmaterial


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konnten bereits neuronale Vorläuferzellkulturen etabliert werden (Feron, Perry et

al. 1998; Zhang, Klueber et al. 2004). Gerade im Hinblick auf Befunde an

Menschen mit Schizophrenie, Depression, bipolarer Störung oder Demenz wurden

unter Nutzung von Hochdurchsatzverfahren in post-mortem Hirngewebe und

peripherem Blut eine Vielzahl von biologischen Auffälligkeiten beschrieben, die

von Veränderungen in Neurotransmittersystemen über Veränderungen in

metabolischen und Zytokinsystemen bis hin zu intrazellulären Signalstörungen

reichen (Prabakaran, Swatton et al. 2004; Tkachev, Mimmack et al. 2007). Diese

Aspekte in tatsächlich zentralneuronalen oder entsprechend aus Vorläufern

differenzierten Zellen von lebenden Patienten zu untersuchen, könnte einen

Meilenstein in der psychiatrischen Forschung darstellen, der weitere wesentliche

Erkenntnisse zur Pathophysiologie und Therapie dieser Erkrankungen liefern

könnte.

1.2 Die Riechschleimhaut

Die Bedeutung der Riechschleimhaut als ein spezialisiertes Neuroepithel liegt in

der Anbindung an das ZNS des Menschen (Asan 2004). In der Vergangenheit

wurde wissenschaftlich abgeleitet, dass unter dem Dach der Nasenhöhle

innerhalb eines etwa 5 cm2 großen flimmer- und becherzellenfreien

Schleimhautbezirks 5 - 7 Millionen kleinste Geruchsrezeptoren lokalisiert sind.

Diese Geruchsrezeptoren nehmen im Nasendach eine fein differenzierte Prüfung

der Luftzusammensetzung vor (Tittel 1994). Der Bereich der Riechschleimhaut,

wissenschaftlich Regio olfactoria bezeichnet, beherbergt die meisten

olfaktorischen Rezeptorneurone (Asan 2004).

1.2.1 Aufbau, Funktionsweise, Regeneration

Die humane Riechschleimhaut ist ein mehrreihiges Flimmerepithel, welches durch

die Lamina basalis von der Lamina propria, einer Bindegewebsschicht, getrennt

ist. Im mehrreihigen Flimmerepithel befinden sich Millionen primärer olfaktorischer

Rezeptorneurone, Basalzellen und Stützzellen. Duftstoffe können sich an

Rezeptoren der Plasmamembran der Zilien anheften. Eine Schleimschicht, von

den Bowman-Drüsen produziert, bedeckt die Zilien. Die Bowman-Drüsen


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entspringen der Lamina propria, die außerdem zahlreiche Blutgefäße und Axone

der olfaktorischen Rezeptorneurone führt. In der knöchernen Frontobasis des

Schädels befindet sich eine zarte Knochenlamelle, die Lamina cribrosa. Die

Lamina cribrosa besitzt im Bereich der Fossae olfactoriae auf jeder Seite etwa 40

kleine Perforationen, durch die die Fila olfactoria das Schädelinnere erreichen und

zum Bulbus olfactorius ziehen (Weismann, Yousry et al. 2001). Zur

Veranschaulichung dieser Ausführungen sei auf die Abbildung 1 verwiesen.

Abbildung 1: Darstellung der humanen Riechschleimhaut nach modifizierter Quelle

(http://emptynosesyndrome.org/nose.html)

Die olfaktorischen Rezeptorneurone sind bipolare Nervenzellen mit

apikalem Fortsatz und einer Auftreibung zahlreicher feiner Zilien (Asan 2004).

Diese Neurone stellen den Anfang der Riechbahn des Menschen dar, die aus

insgesamt drei verschalteten Neuronen besteht (Hick 2006). Binden nun

Geruchsstoffe spezifisch an die Plasmamembran der Zilien und die dort

lokalisierten Rezeptorproteine, breitet sich der durch den Duftstoff ausgelöste

Nervenimpuls über den Zellkörper auf das Axon des olfaktorischen

Rezeptorneurons aus, welches basal aus dem Zellkörper hervorgeht. Stützzellen

des mehrreihigen Flimmerepithels umgeben die Dendriten der olfaktorischen

Rezeptorneurone und sorgen so für eine elektrische Isolierung. Die Stützzellen

schützen die olfaktorischen Rezeptorneurone außerdem vor äußeren

Einwirkungen, deaktivieren Duftstoffe und beseitigen Zellreste untergegangener

Neurone. Zwischen den Stützzellen befinden sich verschiedene Arten mikrovillärer

Zellen, wie sie auch im gesamten Nasen-, Rachenraum und Magen-Darm-Trakt


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vorkommen. Auch diese besitzen möglicherweise chemorezeptive Funktionen

(Asan 2004).

Die Axone der olfaktorischen Rezeptorneurone sammeln sich zu Bündeln,

die Fila olfactoria bezeichnet werden. Diese Fila olfactoria sind von spezialisierten

Gliazellen, den olfaktorischen Hüllzellen, umgeben, welche zur elektrischen

Abschirmung beitragen. Für das Auswachsen der Axone sind wahrscheinlich die

olfaktorischen Hüllzellen von Bedeutung, indem sie Stoffe bilden, die das

Wachstum fördern (Asan 2004). In der Vergangenheit wurden olfaktorische

Hüllzellen aus dem Bulbus olfactorius verschiedener Tierspezies gewonnen. Diese

Zellart unterstützt die Axon-Regeneration, die erneute Myelinisierung und die

funktionelle Erneuerung von Rückenmarksverletzungen bei Tieren (Perry,

Mackay-Sim et al. 2002).

Der durch den Geruch ausgelöste Impuls gelangt weiter über die Fila

olfactoria, deren Gesamtheit Nervus olfactorius genannt wird, zum Nervengewebe

des Bulbus olfactorius. Damit gehören die olfaktorischen Rezeptorneurone

zumindest teilweise zum Gehirn (Perry, Mackay-Sim et al. 2002). Gelangt der

Nervenimpuls zum Bulbus olfactorius, wird die Grenze von peripherem zu

zentralem olfaktorischen System überschritten (Stern and McClintock 1998). Im

Bulbus olfactorius erfolgt die erste neuronale Umschaltung der Riechbahn auf die

Mitralzellen, deren Axone über den Tractus olfactorius zur Stria olfactoria medialis

und lateralis ziehen. Von der Stria olfactoria medialis verläuft das zweite Neuron

zum Riechhügel und von dort zu den Nuclei septales und zum Gyrus

hippocampalis und erreicht somit das limbische System. Hier erfolgt die

unbewusste Riechwahrnehmung. Von der Stria olfactoria lateralis zieht das dritte

Neuron zur Area periamygdalaris/praepiriformis und zum Frontallappen. Auf

diesem Wege erfolgt die bewusste Geruchswahrnehmung (Hick 2006).

Die durchschnittliche Lebensdauer olfaktorischer Rezeptorneurone beträgt

einige Monate. Danach sterben sie ab und werden durch Ausdifferenzierung von

neuronalen Stammzellen, in diesem Fall Basalzellen, ersetzt, welche der

Basalmembran aufliegen und auch im Erwachsenenalter noch zu regelmäßiger

mitotischer Teilung fähig sind (Beites, Kawauchi et al. 2005). Es werden zwei

Typen von Basalzellen unterschieden: die horizontalen und die kugelförmigen

Basalzellen. Mehrere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die kugelförmigen

Basalzellen proliferieren und ihrerseits die Entwicklung von Neuronen im


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Neuroepithel einleiten (Schwob, Farber et al. 1986; Calof and Chikaraishi 1989;

Schwartz Levey, Chikaraishi et al. 1991). Es gibt keinen Hinweis darauf, dass die

Riechschleimhaut in ihrer Größe und Dicke expandiert (Hinds and McNelly 1981).

Somit muss es eine Balance zwischen der Entstehung und dem Absterben von

Zellen in der Riechschleimhaut geben (Hinds, Hinds et al. 1984; Carr and

Farbman 1992).

1.2.2 Interindividuell vermischte Epithelzonen

In Föten ist der Aufbau der Riechschleimhaut als uniform zu bezeichnen, doch mit

zunehmendem Alter ändern sich die Grenzen, Dimensionen und die präzise

Lokalisation der Riechschleimhaut. Außerdem unterliegt die Riechschleimhaut

auch der Degeneration sowie morphologischen Änderungen in der Aufteilung von

unterstützenden sensorischen Elementen und Basalzellen. Im Erwachsenen

vermischen sich auf diese Weise verschiedenste Anteile der Riechschleimhaut mit

der respiratorischen Schleimhaut, die im Wesentlichen gleich aufgebaut ist. Die

respiratorische Schleimhaut verfügt über keine olfaktorischen Rezeptorneurone,

besitzt aber Becherzellen im mehrreihigen Flimmerepithel. Die bei der

Vermischung der Schleimhäute entstehenden Grenzen sind unscharf und weisen

eine hohe individuelle Ausprägung auf (Paik, Lehman et al. 1992). Allerdings

konnten bereits olfaktorische Zonen in den mittleren Nasenmuscheln und den

lateralen Wänden der Nase nachgewiesen werden (Perry, Mackay-Sim et al.

2002).

1.3 Ethmoidektomien vs. Riechepithelbiopsie

Eine potente Quelle zentralnervösen Zellmaterials stellt nach den Ausführungen

im vorhergehenden Abschnitt 1.2 die Riechschleimhaut dar. Eine Biopsie der

Riechschleimhaut ist heutzutage zwar eine Routinemethode, aber sie ist nicht

ungefährlich (Moran, Jafek et al. 1992). Das gründet darin, dass die

Riechschleimhaut weit oben im Nasendach in der Nähe der Siebplatte, der Lamina

cribrosa, lokalisiert ist. Die Hirnhaut ist hier an der Schädelbasis sehr dünn und mit

der Siebplatte verwachsen (Moran, Rowley et al. 1982; Lang, Bressel et al. 1988).

Somit ist auch bei sorgfältiger Durchführung der Biopsie das Risiko gegeben, die


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Hirnhaut ggf. an der Schädelbasis zu verletzen, was wiederum eine Meningitis-

Erkrankung auslösen kann. In diesem Zusammenhang stellen Ethmoidektomien

eine weitaus geringer riskante und problematische Quelle dar, um olfaktorisch

durchsetztes Gewebematerial zu erhalten. Dieses Zellmaterial ist typischerweise

Operationsabfall. Eine Ethmoidektomie wird routinemäßig zum Beispiel bei

obstruktiver Nasenatmung durchgeführt (Bolger, Keyes et al. 1999; Orlandi, Lanza

et al. 1999; Har-El and Swanson 2001). In Abschnitt 1.2.2 wurde erklärt, dass in

den mittleren Nasenmuscheln neben respiratorischer auch olfaktorische

Schleimhaut mit interindividueller Ausprägung vorhanden ist.

1.4 Einstellung neuronaler Kulturbedingungen

Frühere Kultivierungsversuche mit humaner, post-mortem gewonnener

Riechschleimhaut und Zellmaterial mittlerer Nasenmuscheln führten zu

heterogenen Zellpopulationen, die fraktionsweise negativ für neurale Marker und

nicht zwangsläufig nahezu ganzheitlich positiv oder negativ für ein Protein waren

(Murrell, Bushell et al. 1996; Roisen, Klueber et al. 2001; Hahn, Han et al. 2005).

Mit Hilfe der Erkenntnisse aus der Stammzellforschung ist es aber möglich, die

undifferenzierte Selbsterneuerung, die selektive Isolierung und Vermehrung

zentralnervöser Progenitoren aus heterogenem Gewebe zu fördern (Wachs,

Couillard-Despres et al. 2003). Nasenmuscheln enthalten beispielsweise auch

Bindegewebszellen und Nasenschleimhautepithelzellen, welche in eine neuronale

Progenitorkultur „kontaminieren“ können (Walton, Sutter et al. 2006; Belzunegui,

Izal-Azcarate et al. 2008; Xue, Qiao et al. 2008; Xue, Wei et al. 2009). Dazu

dienen komplex zusammengesetzte Medien wie zum Beispiel Neurobasal-A mit

einem Mediensupplement wie B27. Diese Kombination stellt eine serumfreie

Modifikation dar, die der idealen Kultivierung neuronaler Zellen des ZNS dient

(Brewer, Torricelli et al. 1993; Brewer 1997).

Zusätzlich sind aber Wachstumsfaktoren unabdingbar, da mit zunehmender

Kultivierungsdauer die Gefahr der Zelldifferenzierung besteht. Die rekombinanten

Wachstumsfaktoren EGF, FGF und LIF sind in eine Vielzahl von Funktionen der

Zelle involviert, insbesondere aber in die Signaltransduktion und adulte Neuro-

und Gliogenese (Tureyen, Vemuganti et al. 2005). Für neurale Stamm- und

Progenitorzellen ist bekannt, dass EGF die Regulierung der Proliferation, die


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Differenzierung und das Überleben von adulten Zellen der subventrikulären Zone

unterstützt (Herbst 2004; Grimm, Messemer et al. 2009; Lee, Hsu et al. 2009).

Darüber hinaus konnte an Mäusen gezeigt werden, dass die Identität neuraler

Progenitorzellen in Anwesenheit von EGF erhalten bleibt (Hulspas, Tiarks et al.

1997; Winkler, Fricker et al. 1998). Auch FGF reguliert an zentralnervösen

neuralen Progenitor- und Stammzellen - ähnlich wie EGF - während der

embryonalen Entwicklung die Proliferation, die Migration und die Differenzierung

der Zelle (Ornitz and Itoh 2001). Es ist bekannt, dass hohe Konzentrationen von

FGF die fortschreitende Neurogenese von Zellen blockieren (Nelson and

Svendsen 2006). LIF, ein Lymphoid-Faktor, unterbindet die spontane

Zelldifferenzierung und fördert zudem die Pluripotenz zur Langzeitkultivierung von

embryonalen Stammzellen (Pitman, Emery et al. 2004; Emery, Merson et al. 2006;

Oshima, Teo et al. 2007; Weible and Chan-Ling 2007).

1.5 Untersuchung der Zelldifferenzierung

Es gibt viele Proteinmarker, die den Differenzierungsstatus von Primärzellen,

gewonnen aus „oberen“ mittleren Nasenmuscheln, anzeigen könnten. Unsere

Entscheidung fiel auf sieben Neuralmarker, die zum Teil sehr aktuell diskutiert

werden. Dazu zählen zunächst die Proteine Nestin und GFAP. Nestin tritt im ZNS

auf und wird dort vor allen Dingen in multipotenten Stammzellen exprimiert. Nestin

gilt in der Literatur als wichtiger Marker für neurale Progenitor- und Stammzellen

(Tohyama, Lee et al. 1992; Quinones-Hinojosa, Sanai et al. 2006; Gilg, Tye et al.

2008; Johansson, Price et al. 2008; Smith, Vallier et al. 2008). Das Protein GFAP

wird generell als Marker für astrozytäre Zellen angesehen. Im menschlichen

adulten Nervensystem konnte kürzlich gezeigt werden, dass auch neurale

Stammzellen GFAP enthalten (Liem, Yen et al. 1978; Quinones-Hinojosa, Sanai et

al. 2006; Brillaud, Piotrowski et al. 2007; Johnston, Su et al. 2008).

Zur weiteren Bestimmung der Identität der Zelle können Beta-III-Tubulin,

Musashi, A2B5, Map2 und NeuN verwendet werden. Beta-III-Tubulin wird in

großer Menge während der fötalen und postnatalen Entwicklung im zentralen und

peripheren Nervensystem gebildet. In adultem Gewebe gilt die Expression von

Beta-III-Tubulin als Neuron-spezifisch (Erceg, Lainez et al. 2008; Johansson, Price

et al. 2008; Penalva, Tilburn et al. 2008). In Säugetieren spielt die Musashi-Familie


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eine wichtige Rolle bei der Erhaltung des Stammzellstadiums und der

Differenzierungskapazität von Zellen. Das Vorkommen von Musashi konnte

bereits in neuronalen Progenitor- und Stammzellen beobachtet werden (Glass,

Synowitz et al. 2005; Shin, Mitalipova et al. 2006). A2B5 ist ein Gangliosid,

welches typischerweise in der äußeren Zellmembran von oligodendrozytären

Progenitoren gefunden werden kann. Forschergruppen verwendeten A2B5 zur

selektiven Aufreinigung dieser Zellpopulationen (Silberberg, Poder et al. 1989;

Roy, Wang et al. 1999). Map2 ist ein mikrotubulus-assoziiertes Protein, welches

überwiegend im ZNS vorhanden ist. Map2 wird in Neuronen stärker als in anderen

Zellen gebildet, deswegen wird es häufig als neuronaler Marker für in vitro-Studien

eingesetzt. Es interagiert ebenfalls mit Neurofilamenten (Farah, Liazoghli et al.

2005; O'Hare, Kushwaha et al. 2005). Das Neuron-spezifische Kernprotein NeuN

kommt im peripheren und zentralen Nervensystem aller Wirbeltiere vor. NeuN ist

überwiegend in neuronalen Zellkernen exprimiert, weswegen es häufig zum

immunhistochemischen Nachweis von Nervenzellen in vitro und in vivo

nachgewiesen wird (Mullen, Buck et al. 1992; Benraiss, Chmielnicki et al. 2001).

1.6 Stimulationsbedingungen der in vitro-Zellkultur

Ausgehend von Untersuchungen an Blutzellen als Ersatz für Hirnzellen setzte sich

ein internationales Versuchsparadigma durch, das darauf abzielte, Effekte von

Lipopolysaccharid (LPS) und Antipsychotika auf Zellproliferation und Apoptose

mittels in vitro-Zellkultur darzustellen (Hinze-Selch, Becker et al. 1998; Hinze-

Selch and Pollmacher 2001; Koch, Kell et al. 2002; Koch, Kell et al. 2003). LPS ist

im Menschen in natürlicher Weise nicht vorhanden und induziert als Bestandteil

der äußeren Zellmembran gram-negativer Bakterien eine starke Immunantwort in

Tier- und Humanzellen. Passiert LPS die Blut-Hirn-Schranke, kann es an den

Membranrezeptor CD14 binden, was die Zytokinproduktion anregt, die wiederum

Fieber verursachen kann (Rivest, Lacroix et al. 2000). CD14 Rezeptoren sind in

Mikroglia-Zellen und auch in den mikroglialen ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2

vorhanden (Lacroix, Feinstein et al. 1998). Ebenfalls sind CD14 Rezeptoren in

Zellen der Nasenschleimhäute (Jahnsen, Gran et al. 2004) und in Monozyten und

Makrophagen der Säugetiere existent (Lacroix, Feinstein et al. 1998). Daher

stammt auch der gemeinsame experimentelle Ansatz in Zusammenhang mit LPS.


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In endothelialen Zellen besitzt CD14 zudem eine regulierende Funktion für das

Zellüberleben. Das Herauslösen des CD14 Rezeptors durch Makrophagen führt

zur Apoptose (Rivest, Lacroix et al. 2000).

Solch eine durch LPS ausgelöste artifizielle Entzündung der genannten

Zelltypen erlaubt die Simulation einer Therapie mit zum Beispiel einem

Antipsychotikum. Zwei Antipsychotika, die in der psychiatrischen in vitro-

Zellkulturforschung, ausgehend vom klinischen Alltag der medikamentösen

Behandlung von Patienten, immer wieder auf deren psychotropen Effekt in vitro

untersucht wurden, sind Clozapin und Haloperidol (Szuster-Ciesielska, Slotwinska

et al. 2004; Hou, Wu et al. 2006; Sugino, Futamura et al. 2009). Hier konnten auf

der Grundlage des atypischen Antipsychotikums Clozapin vielfältige Wirkungen

nachgewiesen werden (Hinze-Selch, Becker et al. 1998; Hinze-Selch and

Pollmacher 2001), die sich von den Effekten unterscheiden, die das typische und

weit verbreitete Antipsychotikum Haloperidol auslöste. Für in vitro-

Zellkulturexperimente mit Haloperidol existieren schon länger Befunde an

primären hippocampalen Neuronen, C6-Glioma und NCB20 Zellen, die eine

erhöhte Zytotoxizität auf diese psychotrope Substanz zeigen (Behl, Rupprecht et

al. 1995). Clozapin wird zwar in der in vitro-Zellkultur an PC12-, SH-SY5Y- und

U937-Zellen auch als toxisch beschrieben (Dwyer, Lu et al. 2003; Heiser, Enning

et al. 2007), aber im Vergleich mit Haloperidol ist es als geringer toxisch

einzuschätzen (Dwyer, Lu et al. 2003). Häufig wird in der Literatur diesbezüglich

vermutet, dass typische und atypische Antipsychotika andere zellbiologische

Effekte zur Folge haben, da sie an unterschiedliche Dopamin-Rezeptoren binden.

Somit kommt es in verschiedenen Zellmodellen konzentrationsabhängig zu

unterschiedlichen Auswirkungen, auch und insbesondere bezüglich Nekrose und

Apoptose (Behl, Rupprecht et al. 1995; Gardner, Zahid et al. 1998; Galili, Mosberg

et al. 2000). Gerade zur Überprüfung der Apoptoserate wird häufig aktivierte

Kaspase 3 nachgewiesen. Dieses Protein spielt eine Schlüsselrolle in der

Erkennung früher Apoptose und bei Entzündungsreaktionen von Zellen (Dai and

Krantz 1999). In Verbindung mit Zytotoxizität und Apoptose, hervorgerufen durch

LPS und Psychopharmaka, wurde an Zellen aber nur selten die Zellproliferation

untersucht. Durch den Nachweis der Marker Ki-S2, MCM6 und Ki-Mit können

Zellen allerdings in verschiedenen Phasen des Zellzyklus’ detektiert werden. Der

Antikörper gegen MCM6 ermöglicht die Detektion von Zellen in der G1-, S-, G2-


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und M-Phase des Zellzyklus’ (Heidebrecht, Buck et al. 2001). Im Gegensatz dazu

erkennt der Antikörper Ki-S2 alle Zellen in der S-, G2- und M-Phase (Rudolph, Alm

et al. 1999) und Ki-Mit ausschließlich die M-Phase (Pollmann, Parwaresch et al.

2006).

Es gibt auch myelo-monozytäre Zellen in der Nasenschleimhaut mit

phänotypischen und funktionellen Ähnlichkeiten mit zentralnervösen Mikroglia-

Zellen. Darüber hinaus scheint Mikroglia eine spezifische Rolle bei

neuropsychiatrischen Erkrankungen zu spielen (Ramon-Cueto, Perez et al. 1993;

McCann, O'Callaghan et al. 1996; Chang, Chien et al. 2003). Diese Arbeit

konzentriert sich auf den Vergleich von hirnnahen Zellen „oberer“ mittlerer

Nasenmuscheln mit den Zelllinien CHME3 und BV2. Die beiden Letztgenannten

sind zwar mikroglialer Herkunft, finden ihren Ursprung aber im ZNS des

Menschen. Die in vitro-Zellkultur mit LPS und Antipsychotikum zielt dabei auf

dieselbe Grundaktivierung dieser Zelltypen über den CD14 Rezeptor-Komplex ab.


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1.7 Ziel der Doktorarbeit

Es gibt nur wenige Möglichkeiten, Hirnzellen oder hirnnahe Zellen vom lebenden

Menschen zu untersuchen, dennoch liefern routinemäßig durchgeführte

Ethmoidektomien Zellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln, denen bereits

zentralnervöse Eigenschaften nachgewiesen werden konnten. Die vorgelegte

Pilotstudie setzte sich zur Aufgabe, diese heterogenen Gewebeproben in eine

reproduzierbare, neuronal-selektive Vorläuferzellkultur zu überführen. Von

höchster Bedeutung war die interindividuelle Vergleichbarkeit, die durch die Wahl

eines neural-spezifischen Markersets überprüft werden sollte.

Mit den aus Nasenmuscheln gewonnenen Zellen und den standardisierten

ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 führten wir ein erstes psychiatrisch relevantes

Experiment durch. Ziel war es, psychotrope Effekte, die durch Clozapin und

Haloperidol mit artifizieller Entzündungsreaktion durch LPS induziert werden,

darzustellen. Die Auswertung der psychotropen Effekte sollte im Hinblick auf die

Proliferations- und Apoptoseaktivität in diesen drei Zellsystemen erfolgen.

Zusammenfassend verfolgte diese Arbeit zwei wesentliche Ziele:

1) Ist es möglich, mit Zellmaterial der „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln eine neuronal-selektive in vitro-Vorläuferzellkultur

stabil und reproduzierbar zu etablieren? Sind die individuell

entnommenen Zellen verschiedener Patienten in Bezug auf die

Zelldifferenzierung vergleichbar?

2) Welche in vitro-Effekte lösen LPS/Clozapin und LPS/Haloperidol auf

Zellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln im Hinblick auf

Zellproliferation und Apoptose im Vergleich mit den standardisierten

ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 aus?

Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

2.1 Probanden

2.1.1 Ethikvotum

Die Ethik-Kommission der medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-

Universität zu Kiel hat die zu dem Versuchsplan eingereichten Unterlagen auf

mögliche berufsethische und berufsrechtliche Bedenken hin überprüft. Die

Kommission stimmte darin überein, dass gegen die Durchführung der Studie mit

dem Aktenzeichen A 169/07 keine Bedenken bestehen. Am 18.03.08 erfolgte das

positive Votum.

2.1.2 Aufklärung und Einwilligung

Bezüglich der Verwendung des bei der Ethmoidektomie anfallenden

Operationsabfallmaterials für die vorliegende wissenschaftliche Untersuchung klärt

der behandelnde Arzt, Herr Dr. med. Harald Wilms, über die Risiken der Ektomie

und die Verwendung des Zellmaterials zu Forschungszwecken auf. Außerdem holt

er bei Zustimmung das schriftliche Einverständnis der Patienten ein und informiert

über die mögliche erweiterte Studienteilnahme, die in der vorliegenden

Dissertation keine Rolle spielte.

2.1.3 Ethmoidektomien

Die Ethmoidektomien werden durch Dr. med. Harald Wilms, Facharzt für Hals-

Nasen-Ohrenheilkunde der Ostseeklinik Kiel, durchgeführt. Dabei wird das

Zellmaterial aus der mittleren bzw. die mittlere Nasenmuschel entfernt, wovon der

„obere“ Teil der mittleren Nasenmuschel zur Etablierung einer Zellkultur verwendet

werden soll. Bei Zustimmung der Patienten erhalten wir nach Abschluss aller

klinisch notwendigen Maßnahmen das anfallende Zellmaterial, welches sonst im

Regelfall entsorgt wird. Sämtliche Belange um den Eingriff der Ethmoidektomie,

wie z.B. Diagnostik, Indikationsstellung, Terminplanung, Operationsdurchführung,

folgen allein der HNO-ärztlich festgestellten medizinischen Notwendigkeit und sind

nicht Teil der vorliegenden wissenschaftlichen Studie.


14

2.2 Materialien

2.2.1 Bezugsquellen der Chemikalien

Bezugsquelle Bezeichnung

Biochrom AG, Berlin, Deutschland PBS

Chemicon, Hamburg, Deutschland Akkutase LIF

Dako, Hamburg, Deutschland Antibody Diluent Fluorescent Mounting Medium

Drogerie, Kiel, Deutschland Nagellack

Gibco, Karlsruhe, Deutschland B27 DMEM FCS Glutamax, L-Glutamin MEM Neurobasal-A PBS

Penicillin/Streptomycin

Invivogen, Toulouse, Frankreich Primocin

Merck, Darmstadt, Deutschland Aquatex Ethanol

Mayers Hämalaunlösung

MP Biomedicals, Dillenburg, Deutschland Haloperidol

PBS Tabletten

Molecular Probes, Karlsruhe, Deutschland DAPI

PAA Laboratories, Cölbe, Deutschland HBSS

Peprotech, Hamburg, Deutschland EGF

FGF

Roth, Karlsruhe, Deutschland Ethanol (96%)

Sandoz Pharmaceuticals GmbH, Clozapin Ismaning, Deutschland

Sigma-Aldrich, München, Deutschland DMSO Fibronektin Glucose Goat-Serum Heparin LPS Poly-L-Lysin Rabbit Serum

Thermo Scientific, Fremont, USA UltraVision LPValue-System


15

2.2.2 Bezugsquellen der Verbrauchsmaterialien

Bezugsquelle Bezeichnung Aesculab, Melsungen, Deutschland Skalpell

BD, Heidelberg, Deutschland Cellstrainer 50 ml Falcon's

Braun, Melsungen, Deutschland Spritzen 10 ml

FineScienceTools, Heidelberg, Deutschland Pinzette

Greiner Bio One, 6er, 24er Lochplatten Frickenhausen, Deutschland Kryoröhrchen

Zellkulturflaschen

Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland Deckgläser Objektträger

Nunc, Wiesbaden, Deutschland Well Chamber 96

Peha-Soft, Heidenheim, Deutschland Handschuhe

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Einweg-Pipetten 5, 10, 25 ml Pipettenspitzen 10,100,1000 µl Spitzröhrchen 15, 50 ml

Sartorius, Göttingen, Deutschland Sterilfilter 0,2 µm

2.2.3 Bezugsquellen der Geräte

Bezugsquelle Gerät Bezeichnung Canon, Krefeld, Deutschland Kamera Powershot A95

Chyo, Albstadt, Deutschland Waage JL-180

Chartbiomed, Ohio, USA Stickstofftank XC20

Eppendorf, Hamburg, Deutschland Zentrifuge Centrifuge5417R

Faster, Deutschland Bench BH48

Heraeus, Hanau, Deutschland HeraCell HeraCell 150

Megafuge Megafuge 1.0

Karl Hecht, Sondheim, Deutschland Cell Counter AC-8 Counter

Hirschmann, Eberstadt, Deutschland Pipettor Pipetus Akku

Julabo, Seelbach, Deutschland Wasserbad Julabo 90 A

Leica, Wetzlar, Deutschland Konfokales Laser- TCS SP Scanning-Mikroskop

Nalgene, Neerijse, Belgien Freezing Container Mr. Frosti

Zeiss, Hamburg, Deutschland Fluoreszenzmikroskop Axiovert 40CFL


16

2.2.4 Bezugsquellen der Antikörper

Bezugsquelle Bezeichnung Abcam, Cambridge, UK GFAP

MAP2 NeuN

BD, Heidelberg, Deutschland Aktivierte Kaspase 3

Chemicon, Hamburg Deutschland Beta-III-Tubulin Musashi Nestin

CAU Hämatopathologie, Kiel, Deutschland Ki-S2 Ki-Mit

Molecular Probes, Karlsruhe, Deutschland Alexa Flour 488 Alexa Flour 594

R&D, Wiesbaden Nordenstadt, Deutschland A2B5

Serotec, Düsseldorf, Deutschland MCM6

2.2.5 Probandendaten der Ethmoidektomien

PZ-ID Alter Geschlecht Bemerkungen PZ Pat 1 29 weiblich Raucherin, häufige Baldrian-Einnahme

PZ Pat 2 30 männlich keine weiteren Angaben

PZ Pat 3 46 männlich Leistungssportler


17

2.3 Primärzellkultur

2.3.1 Vorbereitungen der Kulturflaschen

Für die Kultivierung von Primärzellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln

werden 75 cm2 Kulturflaschen (Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland)

verwendet. Um die Zelladhäsion an den Kulturflaschenboden zu verbessern, ist es

nötig, die Flaschen mit Poly-L-Lysin und Fibronektin (beide Sigma-Aldrich,

München, Deutschland) zu benetzen bzw. zu „coaten“ (Iwanaga, Suzuki et al.

1978; Merck 1989).

Durchführung des „Coatings“:

→ Zugabe von 2 ml Poly-L-Lysin (c = 0,1 mg/ml verdünnt in PBS)

→ Kulturflaschenboden durch Schwenken gleichmäßig benetzen

→ Inkubationsphase für 5 Minuten bei Raumtemperatur

→ Abpipettieren von Poly-L-Lysin und 3-maliges Nachspülen mit PBS

► Zugabe von 2 ml Fibronektin (c = 0,01 mg/ml verdünnt in PBS)

► Kulturflaschenboden durch Schwenken gleichmäßig benetzen

► Inkubationsphase für 45 Minuten bei Raumtemperatur

► Abpipettieren von Fibronektin und dreimaliges Nachspülen mit PBS

► Kulturflaschen für mehrere Stunden trocknen lassen, bis sämtliche

Restfeuchtigkeit verdunstet ist

2.3.2 Neurobasal-A Komplett-Medium

Neurobasal-A (Gibco, Karlsruhe, Deutschland) ist ein etabliertes serumfreies

Basalmedium für die selektive Kultivierung von Neuronen des ZNS. Wir haben

entsprechend den Empfehlungen aus der internationalen Literatur (Brewer,

Torricelli et al. 1993; Brewer 1997) die folgenden Supplemente zugegeben: B27

ohne Vitamin-A 2% (Gibco, Karlsruhe, Deutschland), 1% Glutamax (Gibco,

Karlsruhe, Deutschland) und Heparin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland).


18

2.3.3 Medienbedingungen in den ersten 24 Stunden

Das Gesamtvolumen des Kulturmediums einer 75 cm2 Kulturflasche liegt bei

maximal 12 ml. Es besteht zu 10% aus nicht-hitzeinaktiviertem FCS (Gibco,

Karlsruhe, Deutschland), zu 45% aus Neurobasal-A Komplett-Medium und zu 45%

aus konditioniertem Medium früherer Kultivierungen.

2.3.4 Starten der Kultivierung

Nach der Ethmoidektomie eines Patienten wird das Operationsmaterial

unverzüglich in einen sterilen 50 ml Falcon mit Drehverschluss (BD Biosciences,

Heidelberg, Deutschland) überführt. Als Transportmedium ist in dem Falcon

sterilfiltrierte „Hanks Balanced Salt Solution“ (PAA Laboratories, Cölbe,

Deutschland) mit 5% Glucose (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) vorgelegt.

Der Transport erfolgt auf Eis. Unter der sterilen Arbeitsbank (BH48, Faster,

Deutschland) kann der Großteil des Transportmediums abpipettiert und das

Operationsmaterial in eine Glaspetrischale (Merck, Darmstadt, Deutschland) mit

Akkutase (Chemicon, Hamburg, Deutschland) überführt werden, welche die

enzymatische Digestion einleitet. Dabei lösen sich Zellen und Zellverbände

voneinander ab. Während das Operationsmaterial für 10 Minuten bei

Raumtemperatur in 3 ml Akkutase dissoziiert, erfolgt die zusätzliche leichte

mechanische Zerkleinerung mittels Skalpell. Nach Beendigung der

Inkubationsphase wird das gelöste Material in Akkutase aufgezogen und über

einen Zellfilter („Cellstrainer“, 40 µm; BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland)

gegeben, der große Materialstücke zurückhält. Mit 3 ml Neurobasal-A Komplett-

Medium erfolgt das Nachspülen des Filters. Der Durchlauf kann ohne Inhibierung

der Akkutase in die Kulturflaschen pipettiert werden, da deren Aktivität durch die

Verdünnung des zugegebenen Mediums endet.


19

2.3.5 Separate Zugaben von Wachstumsfaktoren

Für die Kultivierung von Primärzellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln

werden drei Wachstumsfaktoren eingesetzt: Es handelt sich dabei um EGF

(Epidermial Growth Factor; Peprotech, Hamburg, Deutschland), FGF (Fibroblast

Growth Factor; Peprotech, Hamburg, Deutschland) und LIF (Leucemia Inhibiting

Factor; Chemicon, Hamburg, Deutschland), die den Kulturflaschen separat

beigefügt werden können.

Zugabe der Wachstumsfaktoren:

→ 50 µl EGF (Aliquot mit c = 10 µg/ml)

→ 50 µl FGF (Aliquot mit c = 10 µg/ml)

→ 50 µl LIF (Aliquot mit c = 2,5 µg/ml)

2.3.6 Separate Zugaben des Antibiotikums Primocin

Innerhalb einer Stunde nach Entnahme der Nasenmuschelproben erfolgten die

sofortigen Inkulturnahmen derselbigen im Labor. Bereits initial erwies sich der

Einsatz der üblichen Kombination von Penicillin/Streptomycin und Amphoterizin B

als Zellkulturantibiose als nicht ausreichend, da damit alle primären Kulturen vor

allem mit Pilzen kontaminiert waren und eine weitere Passage unmöglich war.

Deswegen wurde in den folgenden Experimenten Primocin verwendet. Bereits

zwei Wochen nach Inkulturnahme mit Primocin als Antibiose konnte schließlich

auf alle Antibiotika in den Medien verzichtet werden. Primocin gilt als nicht toxisch

für sensible Primärzellen und verhindert Kontaminationen durch gram-positive

oder -negative Bakterien, Mykoplasmen und Pilze (Wachs, Couillard-Despres et

al. 2003; Weikert, Eppenberger-Eberhardt et al. 2003; Golaz, Vonlaufen et al.

2007). Diese Zusammensetzung erwies sich als sinnvoll für unsere Zwecke, da

das entnommene Nasenmuschelmaterial nicht steril ist bzw. steril entnommen

werden kann.

Zugabe von Primocin:

→ 100 µg/ml Primocin (gebrauchsfertig)


20

2.3.7 Nach den ersten 24 Stunden Kultivierung

Nach Ablauf der ersten 24 Stunden erfolgt die Entnahme des gesamten Mediums

aus den Kulturflaschen. Die Überführung in ein 15 ml Röhrchen (Sarstedt,

Nümbrecht, Deutschland) erlaubt im Anschluss eine Zentrifugation für 10 Minuten

bei 1.200 rpm. Das Zellpellet wird in frischem Neurobasal-A Komplett-Medium

resuspendiert. Die Zellen wachsen nach 24 h in einem Medium, das zu 50% aus

konditioniertem Medium und zu 50% aus Neurobasal-A Komplett-Medium besteht.

Die Zugabe von Wachstumsfaktoren und Primocin erfolgt separat.

2.3.8 Medienwechsel ohne Sphären

Zweimal pro Woche erfolgt der Austausch des Mediums. Dazu werden die

Kulturflaschen für zwei bis drei Minuten unter der Bench stehen gelassen, so dass

die Zellen sedimentieren. Nach Abpipettieren des Mediums und der Überführung

in ein 15 ml Röhrchen wird für 10 Minuten bei 1.200 rpm zentrifugiert. Der

Überstand kann als konditioniertes Medium weitere Verwendung finden und wird

bis zum Gebrauch bei -20°C eingefroren. In einer kleinen Menge frischem

Neurobasal-A Komplett-Medium wird das Zellpellet vorsichtig resuspendiert und

der ursprünglichen Kulturflasche zugeführt. Das Gesamtvolumen sollte auf

maximal 12 ml Kulturmedium eingestellt werden.

2.3.9 Medienwechsel und „Splitten“ von Sphären

Sind in der Kulturflasche nicht adhärente Sphären der Größe von 8 - 10 Zellen im

maximalen Querdurchmesser vorhanden, so wird „gesplittet“. Für das „Splitten“

der nicht adhärenten Sphären nimmt man einen Teil des Mediums aus der

Kulturflasche ab und überführt diesen in ein 15 ml Falcon. Das 15 ml Falcon wird

bei 1.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand kann als konditioniertes

Medium bei -20°C eingefroren werden. Durch Auf- und Abpipettieren mit einer 1

ml Pipette erfolgt die Resuspension der Zellpellets in Akkutase. Nach zwei

Minuten haben sich die noch nicht getrennten schwereren Sphären wieder am

Röhrchenboden abgesetzt, so dass jetzt oberflächlich 100-300 µl des

Zellsuspensats abpipettiert und erneut der ursprünglichen Kulturflasche


21

zugegeben werden kann. Dies wiederholt man, bis das Suspensat vollständig

überführt wurde. In der Kultur beginnt dann erneut die Sphärenbildung.

2.3.10 Passagieren

Sind die Zellen in einer Kulturflasche bodendeckend gewachsen, ist es notwendig

zu passagieren. Dazu kann für die nicht adhärenten Sphären so verfahren

werden, wie zuvor bereits dargestellt. Die resuspendierten Zellen werden in eine

neue, beschichtete Kulturflasche gegeben. Für die verbleibenden adhärenten

Zellen in der Kulturflasche wird für sieben Minuten bei 37°C 0,65 ml/ 25 cm2

Akkutase hinzugefügt, welches die Zellen schonend ablöst. Nach dieser

Inkubationsphase können unter leichtem Schwenken der Kulturflasche 3-4 ml

frisches Neurobasal-A Komplett-Medium zugegeben werden. Dieses zieht man

umgehend mit den Zellen wieder ab und überführt es in die neue Kultur.

2.3.11 Vorbereitungen von Deckgläsern

Die Deckgläser (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) werden mittels

99%igen Ethanols (Roth, Karlsruhe, Deutschland) unter der sterilen Arbeitsbank

entfettet, desinfiziert, getrocknet und je nach benötigter Menge in 24-Lochplatten

(Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland) gelegt. Das „Coaten“ erfolgt wie

zuvor beschrieben, nur beträgt die nötige Volumenzugabe pro Loch von Poly-L-

Lysin und Fibronektin jeweils 300 µl, so dass die Deckgläser vollständig benetzt

sind. Die Aussaat von Zellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln wird mit

20.000 Zellen/ml durchgeführt. Das maximale Mediengesamtvolumen pro Loch

beträgt 500 µl. Die separaten Zugaben von EGF, FGF, LIF und Primocin erfolgen

mit entsprechender Verhältnismäßigkeit zwischen 2-3 µl pro Faktor. Die auf diese

Weise in 24er Lochplatten präparierten Deckgläser dienen der Kultivierung, bis

eine Zelldichte von rund 70-80% erreicht ist. Im Anschluss erfolgt die Zugabe von

Clozapin/LPS und Haloperidol/LPS. Für die Zellfärbungen wurden Zellen der

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln verwendet, die zunächst nach Anreicherung in

der nullten Passage - das entspricht 5 - 7 Wochen Kultivierung - eingefroren

wurden. Die Aussaat erfolgte immer als einseitige neuronale Expansion in der

ersten Passage, um interindividuell ähnlich lange Kultivierungszeiten zu testen.


22

2.3.12 Konservierung von Primärzellen der Nasenschl eimhaut

Für die Primärzellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln richteten wir spezielle

Einfrier- und Auftauprozedere ein, um möglichst viele Zellen gleicher

Kultivierungsdauer konservieren zu können. Dabei orientierten wir uns an

Protokollen, die für neurale Vorläuferzellen aus adultem humanen Hirngewebe

etabliert wurden (J. F. Loring 2007). Weniger aufwändige Verfahren verminderten

die Anzahl der kultivierbaren nasalen Zellen derart drastisch, dass keine Zellkultur

mehr möglich war.

2.3.12.1 Einfrieren

Die Zellen werden aus der Kulturflasche abpipettiert. Zusätzlich können sich

adhärente Zellen durch leichtes Nachspülen und eine 10 minütige

Inkubationsphase mit Akkutase ablösen. Alle abgetrennten Zellen werden in ein

15 ml Spitzröhrchen überführt, welches bei 1.100 rpm für 10 Minuten zentrifugiert

wird. Der Überstand kann als konditioniertes Medium Verwendung finden. Das

Pellet wird in 1 ml Einfriermedium, siehe weiter unten, resuspendiert und in ein

Kryoröhrchen (Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland) überführt. Damit die

Zellen langsam und schonend gefrieren können, erfolgt eine Zwischenlagerung

der Proben für 24 Stunden in der -80°C Gefriertruhe. Wir verwendeten hierzu das

Behältnis „Mr. Frosti“ (Nalgene, Neerijse, Belgien), welches bis zur Markierung mit

Isopropanol (Merck, Darmstadt, Deutschland) befüllt wird. Am nächsten Tag kann

die Umlagerung der Kryoröhrchen in den Stickstofftank (Chartbiomed, Ohio, USA)

erfolgen.

Zusammensetzung des Einfriermediums:

60% konditioniertes Medium

30% FCS

10 % DMSO (Merck, Darmstadt, Deutschland)


23

2.3.12.2 Auftauen

Vor dem eigentlichen Auftauprozess erwärmt man ein 15 ml Spitzröhrchen mit 9

ml Neurobasal-A Komplett-Medium inklusive EGF, FGF, LIF und Primocin in

einem 37°C Inkubator (Heraeus, Hanau, Deutschland). Das erwärmte Medium

wird tropfenweise in die Kryoröhrchen gegeben. Bereits aufgetaute und gelöste

Zellen überführt man aus dem Kryoröhrchen zurück in das mit Medium erwärmte

Spitzröhrchen. Dieser Prozess wird solange wiederholt, bis alle Zellen des

Kryoröhrchens in das Spitzröhrchen übertragen sind, welches im Anschluss direkt

für 45 Minuten in den 37°C Inkubator gestellt wird. In dieser Ruhephase sinken die

Zellen im Spitzröhrchen ab. Nach Ablauf der Inkubationsphase kann bis auf einen

Milliliter das gesamte Medium abgenommen werden. Der verbleibende Milliliter

wird in eine mit Proteinen beschichtete Kulturflasche gegeben, wie in Punkt 2.3.1

beschrieben. Dann erfolgen die Kultivierung mit Neurobasal-A und auch die

Zugabe von Wachstumsfaktoren und Primocin.

2.4 Mikroglia-Zelllinien-Kulturen

2.4.1 Medienbedingungen für BV2 und CHME3

BV2 und CHME3 sind standardisierte ZNS generierte Mikroglia-Zelllinien, wobei

BV2 aus der Maus und CHME3 aus dem Menschen stammt. Diese Zelllinien

werden in unserem Labor routinemäßig kultiviert. Bei entsprechendem Bedarf

kann das Zellmaterial problemlos für die Kultivierung auf Deckgläsern genutzt

werden. Nachfolgend sind dafür die Medienbedingungen aufgeführt:

BV2 Medium → DMEM + 1% Penicillin/Streptomycin + 8% FCS

CHME3 Medium → MEM + 1% L-Glutamin + 1% Penicillin/Streptomycin + 10%

FCS

(alle Produkte von Gibco, Karlsruhe, Deutschland)


24

2.4.2 Kultivierung auf Deckgläsern

Die ZNS generierten Zelllinien BV2 und CHME3 wachsen problemlos adhärent auf

Glas und PVC, was das „Coating“ von Kulturflaschen und Deckgläsern überflüssig

macht. Die Zellen können mit 20.000 Zellen/ml direkt in die mit Deckgläsern

ausgestatteten 24 Lochplatten gegeben werden, in denen je nach Zelllinie die

zuvor aufgeführten Kulturbedingungen gelten.

2.5 Inkubationen der Zelllinien und Primärzellen mi t Antipsychotika

Die Stimulationskonzentrationen von Clozapin und Haloperidol mit jeweils LPS für

die standardisierten ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 wurden in unabhängigen

Vorversuchen im Hause der ZIP gGmbH Kiel als besonders günstig getestet und

im Labor etabliert. Die Evaluierung des Konzentrationsbereichs für Zellen der

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln sollte simultan erfolgen. Dies war aber nicht

möglich, da die Konzentrationen von LPS und Antipsychotika, angesetzt für die

Zelllinien, die nasal gewonnenen Zellen so stark schädigten, dass eine Färbung

und Zellzählung nach 48 h nicht mehr möglich war. Wir mussten uns daher

entscheiden, die LPS-Konzentration an den nasalen Zellen um eine Dekade zu

senken, um zumindest identische Antipsychotika-Konzentrationen beizubehalten.

LPS (Lipopolysaccharid; Sigma-Aldrich, München, Deutschland) und

Haloperidol (MP Biomedicals, Dillenburg, Deutschland) werden in destilliertem

Wasser gelöst, während Clozapin (Sandoz, Ismaning, Deutschland) in DMSO

angesetzt werden muss. Die Inkubation der Primärzellen und der Zelllinien BV2

und CHME3 mit LPS/Clozapin und LPS/Haloperidol erfolgt in 24 Lochplatten, die

mit Deckgläsern ausgestattet sind. Zur Kultivierung der Primärzellen auf

Deckgläsern ist ein „Coating“ unabdingbar. Ein „Coating“ für die Zelllinien ist nicht

notwendig. Sowohl die Zelllinien BV2 und CHME3 als auch die nasalen

Primärzellen werden mit jeweils zwei Konzentrationen von LPS/Clozapin und

LPS/Haloperidol nach zwei Inkubationszeiten von je 24 h und 48 h

immunhistochemisch gefärbt. Die genauen Konzentrationsbereiche von LPS,

Clozapin und Haloperidol sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Bei Clozapin enthalten

die Kontrollen nur die äquivalente Menge an destilliertem Wasser und DMSO


25

inklusive LPS. Die Kontrollen für Haloperidol enthalten anstelle des Haloperidols

die äquivalente Menge an destilliertem Wasser inklusive LPS.

Tabelle 1:

Übersicht der eingestellten Konzentrationen von LPS und Clozapin/DMSO bzw. LPS und

Haloperidol/destilliertes Wasser für die ZNS-Zelllinien BV2, CHME3 und die nasalen Primärzellen

des Individuums PZ Pat 1

Inkubation BV2 CHME3 nasale Primärzellen mit: PZ Pat 1

LPS [µg/ml] 0,2 0,2 0,02 * Clozapin/DMSO 0,1 0,1 0,1

[µg/ml] 1 1 1 Haloperidol/destilliertes Wasser 0,02 0,02 0,02

[µg/ml] 0,2 0,2 0,2 * Lediglich die LPS-Konzentration der nasalen Primärzellen unterscheidet sich. Die Messdaten für

diese Konzentrationsbereiche entstanden nach 24 bzw. 48 h Inkubationszeit. Die Zellanfärbung

erfolgte mittels des Ultravision LPValue-Nachweissystems. Die Auswertung wurde durch

anschließende Zellzählungen gewährleistet.

2.6 Immunhistochemische Nachweismethoden

2.6.1 Indirekte, sekundär markierte Fluoreszenzfärb ung

Die Spezifität der Primärantikörper wurde laborintern vor den eigentlichen

Fluoreszenzfärbungen an den Primärzellen der Nasenmuscheln untersucht. Dazu

waren Tests an weiteren Zellarten nötig, die diese Marker entsprechend der

Ergebnisse dieser Arbeit exprimieren oder nicht. Die humane, fötale und

mikrogliale Zelllinie CHME3 erwies sich negativ für die Marker Nestin und

Musashi. Mit Saos2, einer humanen Osteosarkom-Zelllinie, wurde die Spezifität

des GFAP Antikörpers überprüft, die in diesem Fall keine Anfärbung herbeiführte.

Die Spezifität des Beta-III-Tubulin Markers konnte mittels Peptid-Block-Inkubation

an den Primärzellen der Nasenmuscheln negativ getestet werden. Die Spezifität

von Map2 wurde an der Hela-Zelllinie getestet, die diesen Marker exprimiert. Am

Hippocampus adulter Mäuse konnte der Marker NeuN positiv nachgewiesen

werden. Ein positiver Nachweis von A2B5 erfolgte an der humanen

Teratokarzinom-Zelllinie 2102EP. Für alle Fluoreszenzfärbungen wurden die

Einsatzkonzentrationen der Primärantikörper in Tabelle 2 verwendet. Methodisch

sind alle in dieser Arbeit durchgeführten Fluoreszenzfärbungen mit einer Technik


26

etabliert worden, die dieselben wesentlichen Schritte beinhaltet, vgl. hierzu Tabelle

3.

Tabelle 2:

Einsatzkonzentration der verwendeten Primärantikörper für die Immunfluoreszenzfärbung

Antikörper Markierung Spezies Konzentration Verdünn ung

A2B5 Zelloberfläche Maus 500 µg/ml 1/50

Beta-III-Tubulin Zytoplasma Maus 1 mg/ml 1/500

GFAP Zytoplasma Kaninchen 0,1 mg/ml 1/100

MAP2 Zytoplasma Maus 2 mg/ml 1/1000

Musashi Zytoplasma und Zellkern Kaninchen 1 mg/ml 1/200

Nestin Zytoplasma Kaninchen 1 mg/ml 1/200

NeuN Zellkern Maus 1 mg/ml 1/1000

Tabelle 3:

Generelles Fluoreszenzfärbeprotokoll; Die Aufgabevolumen für jeden Schritt betragen 100 - 200 µl

pro Deckglas

Schritte Zelloberflächenmarker Kern und Zytoplasmamarker

1. Fixierung und nur Fixierung nötig, Aceton

Permeabilisierung 4% Paraformaldehyd 10 Minuten

2. Primärantikörper - Verdünnungen werden in PBS mit 1% BSA angesetzt - Inkubation über Nacht in feuchter Kammer

3. Sekundärantikörper - Alexa Flour 594 und 488 werden 1:100 in PBS angesetzt - Inkubationsdauer 60 Minuten, im Dunkeln

4. Kerngegenfärbung - DAPI wird 1:500 in PBS angesetzt - Inkubationsdauer 30 Sekunden - 1 Tropfen Fluorescent Mounting Medium auf Objekträger

5. Deckelung - Deckgläser vorsichtig auf Objektträger legen - Trocknung im Dunkeln - Deckgläser mit Nagellack umranden

Waschgänge - nach Schritt 1 bis 5 wird 3x mit PBS gespült bzw. gewaschen

Lagerung - bei 4°C im Kühlschrank, dunkel


27

2.6.2 UltraVision LPValue-Nachweissystem

UltraVision LPValue (Medac, Wedel, Deutschland) stellt eine moderne

Technologie in der Polymermarkierung dar. Die Polymermarkierung ermöglicht

eine erhöhte Sensitivität bei gleichzeitig vereinfachter Durchführung des

Nachweises. Alle verwendeten Primärantikörper und deren Einsatz-

konzentrationen sind in der Tabelle 4 vermerkt. Der spezifische Primärantikörper

wird durch einen universellen sekundären Antikörper lokalisiert, der an ein

enzymmarkiertes Polymer konjugiert ist, welches Immunglobuline aus Maus und

Kaninchen erkennt. Somit ist die Signalkopplungskaskade nach dem Auftragen

des Primärantikörpers identisch und stellt eine gut funktionierende

Zellfärbemethode dar. Die genaue Durchführung und die Inkubationszeiten sind in

Tabelle 5 erfasst. Die Auswertung der Zellfärbungen erfolgte mittels

Zellzählungen, die in Punkt 2.8 beschrieben sind.

Tabelle 4:

Einsatzkonzentration der verwendeten Primärantikörper für das UltraVision LPValue-System

Antikörper Markierung Spezies Konzentration Verdünn ung Ki-S2 Zellkern Maus unverdünnt keine Ki-Mit Zellkern Maus unverdünnt keine MCM6 Zellkern Kaninchen 1 mg/ml 1/500

Aktivierte Kaspase 3 Zellkern Kaninchen 0,1 mg/ml 1/100


28

Tabelle 5:

Generelles UltraVision Färbeprotokoll; die Aufgabevolumen in den Einsatzkonzentrationen

betragen 100 - 200 µl pro Deckglas

Schritte Kernmarker

1. Fixierung und Permeabilisierung - eiskaltes Aceton für 10 Minuten

2. Blocken unspezifischer - Auftragen des Ultra-V-Blocks für 5 Minuten Hintergrundfärbung bei Raumtemperatur

- alle Konzentrationen sind in der Tabelle 4 gelistet

3. Primärantikörper - Verdünnungen werden in PBS angesetzt - Inkubation über Nacht in feuchter Kammer

4. Signalverstärkung - Auftragen des Value Primary Antibody Enhancer für 20 Minuten bei Raumtemperatur

5. Sekundärantikörper - Auftragen von Value AP Polymer-Anti-Maus/Kaninchen IgG für 30 Minuten bei Raumtemperatur

6. Substrat/Chromogen - 1 Fast Red Tablette zu 5 ml Naphtholsubstrat geben - unter Schütteln die Tablette lösen lassen - Lösung für 10 Minuten auf Deckgläser auftragen

7. Kerngegenfärbung - Inkubation mit Hämalaun für 2-3 Minuten - Spülen mit Leitungswasser - 15 Minuten zum Nachbläuen in Leitungswasser stehen lassen

8. Deckelung - Deckelung erfolgt mit dem Eindeckmittel Aquatex

Waschgänge - nach Schritt 1 bis 6 wird 3x mit PBS gespült bzw. gewaschen

Lagerung - bei 4°C im Kühlschrank


29

2.7 Mikroskopie

2.7.1 Phasenkontrastmikroskopie

Das Phasenkontrastmikroskop (Axiovert 40CFL; Zeiss, Hamburg, Deutschland)

kann Zellen auf Deckgläsern, die mit der UltraVision-Methode gefärbt wurden,

darstellen. Ebenfalls können lebende Zellen in Zellkulturflaschen mikroskopiert

werden.

2.7.2 Fluoreszenzmikroskopie

Das Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 40CFL; Zeiss, Hamburg, Deutschland)

erlaubt es, die Immunfluoreszenzfärbungen sichtbar zu machen. In dieser Arbeit

ist das Fluoreszenzsignal immer an einen Sekundärantikörper gekoppelt (Alexa

488 und Alexa 594; Molecular Probes, Karlsruhe, Deutschland).

2.8 Zellzählungen

2.8.1 Unterscheidung von positiven und negativen Ze llfärbungen

Zellen, die mittels der Ultravision LP-Value-Methode gefärbt und mit den im Kern

bindenden Primärantikörpern Ki-S2, MCM6, Ki-Mit oder aktivierter Kaspase 3

inkubiert wurden, sind bei positivem Ereignis im Zellkern rot. Durch die

Zellkerngegenfärbung mittels Hämalaun wird gesichert, dass bei nicht

ausreichender Durchsetzung des Zellkerns mit dem entsprechenden Protein

derselbige blau bleibt.

2.8.2 Durchführung der Zellzählungen

Grundsätzlich werden bei den Zelllinien und den nasalen Primärzellen mindestens

5 * 100 Zellen pro Deckglas gezählt. Liegen dabei einzelne Zählungen um mehr

als 10% in der Anzahl positiver Zellen auseinander, so erfolgen weitere

Zählungen. Dementsprechend werden die Ausreißer aus der Gesamtzählung

herausgenommen. Die Zellzählungen wurden systematisch von oben nach unten

an mehreren Stellen des Deckglases durchgeführt. Damit sollte die doppelte

Zählung einzelner Areale umgangen werden.

Ergebnisse

30

3 Ergebnisse

3.1 Etablierung reproduzierbarer Kulturbedingungen

Die mittleren Nasenmuscheln enthalten nur wenig Riechepithel mit unterschiedlich

starker individueller Ausprägung. In Zusammenarbeit mit Dr. Harald Wilms,

Ostseeklinik Kiel, wurde deswegen vereinbart, Material der „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln für die Zellkultur dieser Pilotstudie zu erhalten und zu verwenden.

Routinemäßig durchgeführte Ethmoidektomien liefern dieses Zellmaterial, welches

sonst Operationsabfall wäre. Für diese Pilotstudie fanden Zellen dreier individuell

entnommener Nasenmuscheln Verwendung, die aufgrund obstruktiver

Nasenatmung entfernt wurden. Bereits zu Beginn der Kultivierung dieser nasal

gewonnenen Zellen stellten wir über das Medium Neurobasal-A, das Supplement

B27 und die Wachstumsfaktoren EGF, FGF, LIF Bedingungen ein, die aus dem im

Ursprung heterogenen Nasenmuschelmaterial die Selektierung zentralnervöser

neuronaler Progenitoren in adultem Gewebe fördern. Andere Zelltypen wurden in

den Medien-Ressourcen nicht ausreichend berücksichtigt und starben mit

zunehmender Kultivierung ab.

Außerdem war es ein wichtiges Ziel, die Primärzellen der Nasenmuscheln

möglichst früh in den Passagen zu untersuchen, da diese mit jeder weiteren

Passage vom nativen Urzustand entfernt zu betrachten sind. In diesem Sinne

erwies es sich als zweckmäßig, die Primärzellen der Nasenmuscheln der

Individuen nach Anreicherung in der 0. Passage zunächst einzufrieren, um

ausreichend Zellmaterial vergleichbarer Kultivierungsdauer zu konservieren. Alle

Zellfärbungen erfolgten dann mit nasalen Zellen, die in der 1. Passage nach dem

Auftauen weiterkultiviert wurden. Wir führten insofern vor jeder angestrebten

Zellfärbung dieser Studie eine einseitige neuronale Expansion dieser Zellen durch.

Die dafür etablierten Einfrier- und Auftauprozedere orientierten sich dabei stark an

Methoden für neurale Progenitor- und Stammzellen. Die zu Grunde liegende

Methodik kann auf den Seiten 22 und 23 nachgelesen werden. Zwei

herkömmliche Protokolle, die wir testeten und die lediglich prozentuale Variationen

des standardisierten Einfriermediums in Anteilen von konditioniertem Medium,

FCS und DMSO vorsahen, wie für die robusten ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2

angewendet, führten nicht zum Erfolg. Als Ergänzung sei erwähnt, dass die

verwendeten Zellen der Individuen PZ Pat 1, 2 und 3 bis mindestens Ende der 3.

Ergebnisse

31

Passage kultiviert wurden, um alle Untersuchungen durchführen zu können. Dabei

zeigten die drei individuell gewonnenen nasalen Zellkulturen, unter dem Mikroskop

- über die Passagen betrachtet - ein ähnliches morphologisches Erscheinungsbild.

Im nachfolgenden Punkt 3.2 berichten wir darüber, dass die nasalen

Primärzellen der Individuen als neuronale Progenitoren identifiziert werden

konnten. Entsprechend ist die nachfolgende Benennung der so gewonnenen

Zellen aus Nasenmuscheln als Synonym zu den neuronalen Progenitorzellen

bereits angepasst. Direkt nach den Inkulturnahmen von Zellen der „oberen“

mittleren Nasenmuscheln zeichnete sich die Kultur durch Millionen von

Erythrozyten aus, welche aber durch Medienwechsel, Waschen und Auflösung

innerhalb der ersten zwei Wochen eliminiert wurden. Die anfängliche Kultivierung

erfolgte mit wenigen isolierten Zellen der Nasenmuscheln. Daher war es

notwendig, die nullte Passage nasal gewonnener Zellen für mindestens 5 bis 7

Wochen zu kultivieren, um große Zellmengen zu produzieren. In der zweiten

Woche sind erstmalig runde neben adhärent wachsenden neuronalen

Progenitorzellen vorzufinden. Die erste Passage wird überwiegend vom

Wachstum der adhärenten und konfluenten runden neuronalen Progenitorzellen

dominiert. Die Dauer der ersten Kulturpassage mit nasal gewonnenen

Progenitorzellen dreier Individuen lag zwischen zwei und drei Wochen. Ab der

zweiten Passage entstehen durch Migration vieler konfluenter runder

Progenitorzellen so genannte Zellsphären, die sich im Verlauf dieser Passage

vermehren. Die Zellsphären wurden in dieser Studie keiner weiteren

Untersuchung unterzogen, da sie für die Argumentation unserer Ergebnisse keine

Rolle spielten. Ebenfalls liegen sehr viele adhärent wachsende Progenitorzellen in

zweiter Passage vor. Die dritte Passage zeichnet sich fast ausschließlich durch

konfluente runde Progenitorzellen und Zellsphären aus. Die adhärent wachsenden

Progenitorzellen sind ab dieser Passage mit fortlaufender Kultivierung nur noch

selten vorzufinden. Die zweiten und dritten Kulturpassagen von nasalen Zellen

dreier Individuen dauerten rund zwei Wochen. Die zuvor genannten Aspekte sind

in Abbildung 2 am Beispiel von PZ Pat 1 dargestellt.

Ergebnisse

32

Abbildung 2: Verlauf der selektiven Kultivierung von Zellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln

am Beispiel PZ Pat 1, die zwischen drei individuell nasal gewonnenen Zellpopulationen,

mikroskopisch betrachtet, eine ähnliche Zellmorphologie ergab. Ausgehend von heterogenem

Nasenmuschelmaterial „kontaminiert“ die Zellkultur beständig zu überwiegend neuronalen

Progenitorzellen und Sphären. Die Sphären wurden keiner weiteren Untersuchung unterzogen.

Ergebnisse

33

Bis sich allerdings zeigte, welche Kulturbedingungen routinemäßig zur

Anwendung kommen konnten, waren sechs individuelle Kultivierungsanläufe

nötig, die das Augenmerk auf weitere essentielle Faktoren richteten. Ein Faktor

stellte diesbezüglich das Transportmedium nach der Entnahme der Zellen dar. Nur

die sofortige Überführung der Resektate in HBSS, versetzt mit 5% Glucose,

erlaubte die anschließende längerfristige Kultivierung im Labor. Versuche mit

zunächst Neurobasal-A und B27-Supplement als verwendetes Transportmedium

erhöhten den pH-Wert auf über 8, was keine vermehrungsfähigen Zellen zwecks

weiterer Kultivierung überleben ließ (Ergebnisse nicht dargestellt). Unausweichlich

erwies sich ebenfalls die Verwendung von Akkutase zur enzymatischen Digestion,

die den herkömmlichen Einsatz von Trypsin ersetzte. Trypsin schädigte in den

Versuchen die Zellen so stark, so dass auch hier eine Fortführung der

Kultivierung der sensiblen Primärzellen nicht möglich war (Ergebnisse nicht

dargestellt). Des Weiteren war die Kombination zur Beschichtung der

Zellkulturplastik in der Reihenfolge mit zunächst Poly-L-Lysin und dann

Fibronektin essentiell. Ansonsten war nur eine unzureichende Anhaftung von

Primärzellen aus Nasenmuscheln an den Boden der Kulturflaschen zu

beobachten, was keine weiteren Passagen ermöglichte (Ergebnisse nicht

dargestellt). Anfängliche Probleme mit Kontaminationen des

Nasenmuschelmaterials bei Verwendung von Streptomycin/Penicillin erwiesen

sich als vermeidbar durch die dauerhafte Umstellung auf Primocin (siehe Seite

19).

3.2 Identische Immunfluoreszenznachweise

Unter dem Mikroskop beobachteten wir während der Kulturpassagen von Zellen

der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln dreier Individuen ein morphologisch

ähnliches Erscheinungsbild, worüber in Punkt 3.1 bereits berichtet wurde.

Ebenfalls interessierte uns der Zelldifferenzierungsstatus dieser nasal

gewonnenen Zellen. In diesem Sinne testeten wir mittels

Immunfluoreszenzfärbungen ein spezifisches neurales Markerset. Alle

Immunfluoreszenzfärbungen wurden nach drei Tagen Kultivierung in erster

Passage durchgeführt, um eine mindestens 70-80%ige optische Dichte der

nasalen Zellen zu erreichen. Sämtliche Färbungen sind mit derselben Methodik

entstanden, welche auf den Seiten 25 und 26 nachgelesen werden kann. Zu

Ergebnisse

34

unterscheiden sind die nachzuweisenden Proteine, wobei Nestin, GFAP, Map2

und Beta-III-Tubulin im Zytoplasma, Musashi im Kern und Zytoplasma, NeuN

lediglich im Kern und A2B5 lediglich auf der Zelloberfläche vorzufinden sind. Für

den Nachweis von A2B5 wurde eine Paraformaldehyd- und bei allen anderen

Markern eine Aceton-Fixierung verwendet. Alle Negativkontrollen entstanden

durch die identische Färbeprozedur ohne die Inkubation der Primärantikörper. Je

nach Herkunft des Primärantikörpers verwendeten wir Alexa 488 oder Alexa 594

als Sekundärantikörper zur Anbindung der Fluoreszenz. Die Spezifität der

verwendeten Antikörper wurde in weiteren Färbungen vorab geprüft.

Ausführungen hierzu sind auf Seite 25 zu Papier gebracht.

In unseren Ergebnissen zeigen sich die neuronalen nasalen Progenitoren

der Individuen als vollauf vergleichbar, denn für PZ Pat 1, 2 und 3 ermittelten wir

ein identisches Färbemuster mit positivem Nachweis für Nestin, GFAP, Musashi

und Beta-III-Tubulin und negativem Nachweis für NeuN, Map2 und A2B5.

Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse keine Fraktionen von Zellen, so dass eine

augenscheinlich gesamtheitlich positive oder negative Anfärbung auftrat. In der

Diskussion wollen wir diese Tatsache aufgreifen und erläutern. Mit diesem

Ergebnis wird der Erfolg der selektiven Kultivierung auf die von uns untersuchten

Marker bestätigt. Am Beispiel des Individuums PZ Pat 1 sind die Abbildungen 3

bis 5 zusammengestellt. Auch der Einsatz von 0,02 µg/ml LPS als Stimulans an

PZ Pat 1 veränderte die Markerexpression nicht. An dieser Stelle hätten wir uns

genauso für das Individuum PZ Pat 2 oder 3 entscheiden können. Die

Veränderung des neuralen Markersets, induziert durch LPS, hätte die Grundlage

für die Vergleichbarkeit der untersuchten Zyklusmarker Ki-S2, Ki-Mit, MCM6 und

des Apoptosemarkers aktivierte Kaspase 3 entzogen, worüber im folgenden

Kapitel 3.3 berichtet wird. Die Bilder der Immunfluoreszenznachweise von PZ Pat

1 inklusive LPS-Stimulierung, PZ Pat 2 und 3 sind im Anhang ab Seite 87 zu

finden.

Ergebnisse

35

Abbildung 3: IF-Färbungen an den neuronalen nasalen Progenitoren des Individuums PZ Pat 1 zu

Beginn der ersten Kulturpassage mit DAPI-Zellkernfärbung.

A) und B) zeigen die abgelichteten Negativkontrollen. Die nachfolgenden Bilder weisen deutlich

positive Zytoplasmafärbungen im Gesichtsfeld auf, wobei C) und D) für GFAP, E) und F) für

Musashi, der vereinzelt auch im Zellkern nachzuweisen war, und G) und H) für Nestin stehen. Die

linke Bildreihe wurde mit einem Breitbandfilter, der DAPI und Alexa 594 darstellen kann,

aufgenommen, während die rechte Bildreihe den Rotfilter abbildet, um Zytoplasma- und

Kernfärbung voneinander unterscheiden zu können.

Ergebnisse

36



A) und B) zeigen die abgelichteten Negativkontrollen. Die Bilder C) und D) zeigen deutlich positive

Zytoplasmafärbungen für Beta-III-Tubulin, E) und F) negative Zytoplasmafärbungen für MAP2 und

G) und H) NeuN negative Kernfärbungen im Gesichtsfeld. Die linke Bildreihe wurde mit einem

Breitbandfilter, der DAPI und Alexa 488 darstellen kann, aufgenommen, während die rechte

Bildreihe den Grünfilter abbildet, um Zytoplasma- und Kernfärbung voneinander unterscheiden zu

können.

Ergebnisse

37



A) und B) zeigen die abgelichteten Negativkontrollen. Die Bilder C) und D) weisen deutlich

negative Oberflächenfärbungen für A2B5 nach. Die linke Bildreihe wurde mit einem Breitbandfilter,

der DAPI und Alexa 488 darstellen kann, aufgenommen, während die rechte Bildreihe den

Grünfilter abbildet, um eine Oberflächenfärbung anzuzeigen.

3.3 Unterschiedliche psychotrope Effekte

Nachdem nun erfolgreiche selektive Kulturbedingungen (siehe 3.1) für neuronale

Progenitoren aus den „oberen“ mittleren Nasenmuscheln mit interindividuell

identischer Expression der Neuralmarker (siehe 3.2) eingestellt werden konnten,

interessierte sich diese Pilotstudie für psychotrope Effekte. Diese können durch

Clozapin und Haloperidol mit jeweiliger LPS-Stimulierung an Zellen, die den CD14

Oberflächen-Rezeptor aufweisen, hervorgerufen werden. Leider erwiesen sich die

Zeitbedingungen als limitierender Faktor dieser Dissertation. Aufgrund der

erheblichen Methodenvorarbeiten war es uns nicht möglich, die Ergebnisse zu

replizieren. Dennoch ist durch das Testen von zwei Konzentrationen für Clozapin

bzw. Haloperidol mit LPS-Stimulation zu jeweils zwei Zeitpunkten eine Kinetik

darstellbar. LPS und Antipsychotika entfalten ihre Wirkungen über Rezeptoren, auf

die alle in dieser Arbeit untersuchten Zelltypen ansprechen und die sich in

Ergebnisse

38

Zellproliferation und Apoptose niederschlagen. In diesem Zusammenhang sollte

ein Vergleich der hirnnahen neuronalen nasalen Progenitoren mit den ZNS

generierten Zelllinien CHME3 und BV2 erfolgen. Wir entschieden uns für die

neuronalen Progenitoren des Individuums PZ Pat 1, weil diese ebenfalls unter

LPS-Stimulation eine homogene neurale Markerexpression aufwiesen. Die von

uns gewählten Konzentrationsbereiche der Zelllinien CHME3 und BV2 beruhten

auf unabhängigen Vorarbeiten im Hause der ZIP gGmbH Kiel. Diese wurden als

günstigste Konditionen für diese Zelllinien erachtet. Die identische Anwendung

dieser Konzentrationen war für die neuronalen nasalen Progenitoren nicht

möglich, denn die Zellschädigung, verursacht durch die Kombination aus

Antipsychotikum und LPS, war so groß, so dass keine Anfärbung und Zellzählung

nach Ablauf der Inkubationszeiten von 24 und 48 Stunden mehr möglich waren.

Wir entschieden uns auf Grund dessen dafür, die LPS-Konzentration an den

neuronalen Progenitoren um eine Dekade von 0,2 auf 0,02 µg/ml zu senken, um

zumindest identische Antipsychotika-Konzentrationen beibehalten zu können. Die

neuronalen Progenitorzellen und die Zelllinien CHME3 und BV2 wurden mit

jeweils zwei Konzentrationen Clozapin, 0,1 und 1 µg/ml, und Haloperidol, 0,2 und

0,02 µg/ml, für 24 und 48 Stunden mit LPS-Stimulierung inkubiert. Nach Ablauf der

Inkubationszeiten untersuchten wir die drei Zellarten auf deren Apoptoserate

mittels aktivierter Kaspase 3. Zur Beurteilung der Zellzyklusaktivität setzten wir die

Marker Ki-S2, MCM6 und Ki-Mit ein. Bei Verwendung des Ultravision LPValue-

Nachweissystems und einer Hämalaun-Kerngegenfärbung unterscheidet man die

positiven Zellen für Ki-S2, Ki-Mit, MCM6 oder aktivierte Kaspase 3 durch eine rote

Kernfärbung von negativen Zellen mit blauer Kernfärbung. Für die murine Zelllinie

BV2 konnten Ki-S2 und Ki-Mit nicht ermittelt werden, da diese Antikörper aus der

Maus stammen. Nach der Färbung erfolgten Zellzählungen (siehe Anhang ab

Seite 96) von Verum- und Kontrollpräparaten, die im Verhältnis zueinander

dargestellt sind. Die Methodik ist auf der Seite 27 bis 29 beschrieben. Da

insbesondere bei Experimenten mit nativen Zellen die Streuung sehr hoch ist, wird

nachfolgend konsequenterweise nur innerhalb eines Versuchsansatzes mit

internen Kontrollen argumentiert.

Ergebnisse

39

3.3.1 Ki-S2

Für den Marker Ki-S2, der S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus’ detektiert, lassen

sich an den neuronalen nasalen Progenitoren und der Zelllinie CHME3

unterschiedliche Effekte, verursacht durch Clozapin und Haloperidol, feststellen,

die nicht miteinander vergleichbar sind. Für die nachfolgenden Ausführungen sei

auf die Abbildung 6 verwiesen.

An den neuronalen Progenitoren aus Nasenmuscheln induzierte Clozapin

für beide getesteten Konzentrationen eine Zellzyklushemmung. So bewirkten 0,1

µg/ml eine 40%ige und 1 µg/ml eine 80%ige Verringerung der Ki-S2 Expression

nach 24 h unter das Kontrollniveau. Im Zeitfenster von 24 weiteren Stunden

konnte zwar eine Erholung der Ki-S2 Expression beobachtet werden, die aber das

Kontrollniveau nicht mehr zu überschreiten vermag. Für Haloperidol zeigte sich an

den neuronalen nasalen Progenitoren nach 24 h für beide Konzentrationen eine

leichte Stimulierung der Zellzyklusaktivität, die dann aber in 24 weiteren Stunden

bis zur Hemmung mit 10-30% unter das Kontrollniveau fiel. Tendenziell kann

gesagt werden, dass 0,2 µg/ml im Gegensatz zu 0,02 µg/ml Haloperidol mit

zunehmender Zeit auch leicht hemmend auf den Zellzyklus wirkten.

An der ZNS-Zelllinie CHME3 stellten sich mit Clozapin widersprüchliche

Effekte ein. So wirkten 0,1 µg/ml im Zeitfenster von 24 h Zellzyklus hemmend,

während 1 µg/ml Clozapin eine 220%ige Steigerung, ausgehend vom

Kontrollniveau, hervorrief. Für Haloperidol konnten an der Zelllinie CHME3 die

stärksten Schwankungen dieser Arbeit nachgewiesen werden. 0,02 µg/ml

Haloperidol führten zu einer sehr geringen Ki-S2 Detektion für beide Zeitpunkte.

Im Gegensatz dazu führten 0,2 µg/ml zu einer 1300%igen Überexpression von Ki-

S2, die sich dann aber ebenfalls in 24 weiteren Stunden auf 80% unter das

Kontrollniveau verringerte.

Ergebnisse

40

Abbildung 6: Dargestellt sind die Effekte von Clozapin und Haloperidol nach zwei Konzentrationen

und Zeitpunkten auf neuronale Progenitoren, gewonnen aus den „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln, PZ Pat 1, und die ZNS generierte humane Zelllinie CHME3. Ki-S2 ist ein Marker

zur Erkennung der S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus’. Die Abbildung zeigt eine logarithmische

Skalierung als Verhältnis von Verum zu Kontrolle. Resultierend aus den unterschiedlichen

Stimulationsbedingungen ergeben sich für Werte = 1 eine unveränderte, für Werte < 1 eine

Verringerung und für Werte > 1 eine Erhöhung der Anzahl von Zellen in der S-, G2- oder M-Phase

des Zellzyklus’.

Ergebnisse

41

3.3.2 Ki-Mit

Für den Marker Ki-Mit, der Zellen in der Mitosephase detektiert, lassen sich

ebenfalls an den neuronalen nasalen Progenitorzellen und der Zelllinie CHME3

unterschiedliche Effekte, verursacht durch Clozapin und Haloperidol, feststellen,

die nicht miteinander vergleichbar sind. In diesem Zusammenhang sei auf die

Abbildung 7 verwiesen.

Bei Betrachtung der Effekte von Clozapin für beide Konzentrationen und

Zeitpunkte an den neuronalen Progenitorzellen aus Nasenmuscheln fällt eine

relativ homogene Markerexpression mit 40 bis 60% unter dem Kontrollniveau von

Ki-Mit auf, die weitere Schlüsse zwar nicht zulässt, aber eine grundsätzliche

Hemmung von Mitosen nahe legt. Bei Haloperidol ist diesbezüglich tendenziell

eine stimulierende Wirkung mit Zunahme von Mitosen um 40 bis 60% bei

steigender Konzentration und zunehmender Zeiteinheit an den neuronalen

Progenitoren, gewonnen aus Nasenmuscheln, zu beobachten.

An CHME3 wiesen wir nach, dass 0,1 µg/ml Clozapin zunächst eine

Erhöhung der Mitosen einleitet, die aber innerhalb von 24 weiteren Stunden um

70% unter das Kontrollniveau kippt. 1 µg/ml Clozapin hemmten für beide

Zeitpunkte nahezu vollständig die Mitose an der CHME3 Zelllinie. Für 0,02 µg/ml

Haloperidol konnten wir eine starke Stimulierung mit 450% über Kontrollniveau

nach 48 h an CHME3 feststellen. Für 0,2 µg/ml Haloperidol stellt sich ein anderes

Bild dar, denn ausgehend von einer großen Zahl mitotischer Zellen, 700% über

Kontrollniveau, verringert sich innerhalb der folgenden 24 h die Expression von Ki-

Mit um 80% unter das Kontrollniveau.

Ergebnisse

42


und Zeitpunkten auf neuronale Progenitoren, gewonnen aus den „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln, PZ Pat 1, und die ZNS generierte humane Zelllinie CHME3. Ki-Mit ist ein Marker

zur Erkennung von Zellen in der Mitosephase. Die Abbildung zeigt eine logarithmische Skalierung

als Verhältnis von Verum zu Kontrolle. Resultierend aus den unterschiedlichen


Verringerung und für Werte > 1 eine Erhöhung der Anzahl von Zellen in der Mitosephase des

Zellzyklus’.

Ergebnisse

43

3.3.3 MCM6

Auch für die Detektion von MCM6, der alle Phasen des Zellzyklus’ nachweist,

konnten wir keine Analogien in den neuronalen Progenitoren, gewonnen aus

Nasenmuscheln, und den ZNS generierten Zelllinien bei Inkubation mit Clozapin

oder Haloperidol feststellen. Auch die Zelllinien CHME3 und BV2 unterscheiden

sich in der MCM6 Expression deutlich. Lediglich die Höhe der Ausprägung der

Effekte ist in den neuronalen Progenitoren und der murinen Zelllinie BV2

vergleichbar. Für die nachfolgenden Ausführungen sei auf die Abbildung 8

verwiesen.

Für 0,1 µg/ml Clozapin konstatierten wir an den neuronalen Progenitoren,

gewonnen aus Nasenmuscheln, dass, ausgehend vom Kontrollniveau, eine

40%ige Steigerung der Zellanzahl in Phasen des Zellzyklus’ erfolgte. 1 µg/ml

Clozapin induziert, ausgehend von 30%iger Hemmung im Verhältnis zum

Kontrollniveau, innerhalb von 24 h eine 50%ige Steigerung der Zellzahl, die MCM6

als Protein aufweist. Für Haloperidol sind über die Konzentrationen und Zeitpunkte

sehr ausgeglichene MCM6 Expressionen an den neuronalen nasalen

Progenitoren zu beobachten. Dennoch ist tendenziell erkennbar, dass die höhere

Haloperidol-Konzentration die Gesamtzahl von Zellen im Zellzyklus mit

zunehmender Zeiteinheit geringfügig verringert.

Für CHME3 haben wir ermittelt, dass 0,1 und 1 µg/ml Clozapin nach den

ersten 24 h eine konzentrationsabhängige Erhöhung der MCM6 Expression

bewirken, die zwar nach 24 weiteren Stunden wieder sinkt, aber im Gegensatz zu

BV2 und den neuronalen Progenitoren aus Nasenmuscheln immer noch als stark

stimuliert einzuschätzen ist. Für Haloperidol hingegen bemerkten wir

widersprüchliche Effekte an CHME3. So verdrängten bereits 0,02 µg/ml

Haloperidol nach 24 h fast alle Zellen aus dem Zyklus. Dieser Zustand regeneriert

sich zwar wieder, bleibt aber im Zeitfenster von 24 h trotzdem 20% unter dem

Kontrollniveau und ist damit offensichtlich stark gehemmt. 0,2 µg/ml führten zu

einer steten Überexpression von MCM6 in einer Größenordnung von 450-470%.

An BV2 beobachteten wir unterschiedliche psychotrope Effekte, die durch

Clozapin und Haloperidol induziert wurden: Während 0,1 µg/ml Clozapin mit

zunehmender Zeit hemmend wirkte, führte 1 µg/ml zu einer Erhöhung der

Gesamtzellzahl im Zyklus. Bei Inkubation mit 0,02 und 0,2 µg/ml Haloperidol ist in

Ergebnisse

44

dem getesteten Zeitfenster tendenziell eine zunehmende Hemmung der MCM6

Expression festzustellen, die bei der höheren Konzentration aber aus einem leicht

stimulierten Zustand heraus erfolgte.


und Zeitpunkten auf neuronale Progenitoren, gewonnen aus „oberen“ mittleren Nasenmuscheln,

PZ Pat 1, und die ZNS generierte humane Zelllinie CHME3 bzw. die murine Zelllinie BV2. MCM6

erkennt G1-, S-, G2- und M-Phase des Zellzyklus’. Die Abbildung zeigt eine logarithmische

Skalierung als Verhältnis von Verum zu Kontrolle. Resultierend aus den unterschiedlichen


Verringerung und für Werte > 1 eine Erhöhung der Anzahl der Zellen in der G1-, S-, G2- oder M-

Phase des Zellzyklus’.

Ergebnisse

45

3.3.4 Aktivierte Kaspase 3

Bei der durch Haloperidol beeinflussten Untersuchung der Apoptose wiesen

lediglich die murine Zelllinie BV2 und die neuronalen Progenitoren aus

Nasenmuscheln Ähnlichkeiten auf, was für Clozapin nicht der Fall ist. Die Zelllinie

CHME3 unterscheidet sich deutlich von den neuronalen nasalen Progenitoren und

der Zelllinie BV2. Für die folgenden Ausführungen sei auf die Abbildung 9

verwiesen.

An den neuronalen Progenitoren der Nasenmuscheln kann Clozapin mit

zunehmender Zeit und Konzentration eine deutliche antiapoptotische Wirkung

entfalten. Dies trifft tendenziell auch für Haloperidol zu, nur sind die

Expressionsunterschiede von aktivierter Kaspase 3 nicht so deutlich, wie das bei

Clozapin der Fall ist.

An CHME3 konnte 0,1 µg/ml Clozapin auch zu einer Verringerung der

Apoptose um 30% führen, aber 1 µg/ml verstärkte diese um 50 bis 120% über das

Kontrollniveau. Haloperidol rief an CHME3 die höchsten Apoptoseraten dieser

Untersuchungsreihe hervor. 0,02 µg/ml Haloperidol erhöhen die Apoptose im

Zeitfenster von 24 Stunden auf 470%. 0,2 µg/ml weisen dagegen eine nahezu

gleich bleibende Überexpression von aktivierter Kaspase 3 um 700 bis 800% über

Kontrollniveau auf.

Die Apoptoseraten, die wir an BV2 dokumentieren konnten, sind sowohl für

Clozapin als auch für Haloperidol unauffällig und lassen keine weiteren Schlüsse

zu. Tendenziell scheint aber unter Einfluss von Clozapin eine gesamtheitlich

leichte Unterdrückung der Apoptose zu erfolgen. Die Haloperidol induzierte

Apoptose an BV2 ist in etwa vergleichbar mit den neuronalen Progenitoren aus

Nasenmuscheln.

Ergebnisse

46


und Zeitpunkten auf neuronale Progenitoren, gewonnen aus „oberen“ mittleren Nasenmuscheln,

PZ Pat 1, und auf die ZNS generierte humane Zelllinie CHME3 bzw. die murine Zelllinie BV2.

Aktivierte Kaspase 3 erkennt frühe Apoptose und wurde in logarithmischer Skalierung als

Verhältnis von Verum zu Kontrolle abgebildet. Resultierend aus den unterschiedlichen


Verringerung und für Werte > 1 eine Erhöhung der Anzahl apoptotischer Zellen.

Diskussion

47

4 Diskussion

Die für diese Pilotstudie verwendeten Zellen der „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln wurden im Rahmen routinemäßig durchgeführter

Ethmoidektomien zur Abwendung obstruktiver Nasenatmung gewonnen und

gelten typischerweise als Operationsabfall. Dabei besteht die besondere

Bedeutung der entnommenen Zellen aus Nasenmuscheln darin, sich an das ZNS

über den Bulbus olfaktorius anzubinden. Nach wie vor ist die Untersuchung

humaner Hirnzellen - insbesondere von lebenden Menschen - nur eingeschränkt

möglich. Die humane Riechschleimhaut ist mit Millionen von olfaktorischen

Rezeptorneuronen durchzogen, die nach einigen Monaten Lebensdauer

absterben und durch Ausdifferenzierung von neuronalen Progenitor- und

Stammzellen ersetzt werden (Beites, Kawauchi et al. 2005). Diese olfaktorischen

Rezeptorneurone sind direkt verknüpft mit dem zentralnervösen Bulbus

olfaktorius. Mit zunehmendem Alter eines Menschen verändern sich die Grenzen,

Dimensionen und die präzise Lokalisation der Riechschleimhaut, und eine

Vermischung mit den Schleimhäuten der Nasenmuscheln erfolgt (Paik, Lehman et

al. 1992). Die Häufigkeit dieser Verteilung nimmt von oberer zu mittlerer und

unterer Nasenmuschel ab und ist stark individuell geprägt (Buck 2004; Witt and

Wozniak 2006). Demnach würden die oberen Nasenmuscheln am häufigsten

olfaktorische Zonen aufweisen, eine Entnahme mittels invasiver Chirurgie wäre

aber sehr risikoreich und ethisch bedenklich. Ethisch vertretbar ist dagegen die

Entnahme der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln mittels routinemäßiger

Ethmoidektomie. Einen besonderen Stellenwert sollten dabei zukünftig Zellen der

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln erlangen, wenn diese von Patienten mit

psychiatrischer Erkrankung stammen. Der Vergleich von individuell gewonnenen

Zellen der Nasenmuscheln mit und ohne psychiatrische Indikation könnte dabei

wesentliche neue Erkenntnisse zur Therapie von Nervenkrankheiten erbringen.

Olfaktorische Zonen sind bereits in den mittleren Nasenmuscheln und tiefer an

den lateralen Wänden der Nase nachgewiesen worden (Perry, Mackay-Sim et al.

2002). Diese Pilotstudie stützt sich dabei insbesondere auf die Tatsache, dass

mehrere frühere in vitro-Zellkulturuntersuchungen an humanen Resektaten der

Nasenmuscheln Hinweise für die Existenz neuronaler Progenitorzellen in den

Schleimhäuten der Nase erbringen konnten (Graziadei and Graziadei 1979;

Diskussion

48

Mackay-Sim and Kittel 1991; Caggiano, Kauer et al. 1994; Mumm, Shou et al.

1996; Feron, Perry et al. 1998; Carter, MacDonald et al. 2004; Zhang, Klueber et

al. 2004; Witt and Wozniak 2006; Leung, Coulombe et al. 2007).

Diese Pilotstudie etablierte eine selektive in vitro-Zellkulturmethode zur

reproduzierbaren Gewinnung neuronaler Progenitoren aus Resektaten der

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln.

Da Zelllinien und insbesondere Primärzellen bei langwieriger Kultivierungsroutine

trotz unveränderter Zellkulturbedingungen ihre individuellen nativen Eigenschaften

stetig verlieren können, entschieden wir uns, die isolierten Zellen der

Nasenmuscheln in möglichst frühen Passagen zu untersuchen. In diesem Sinne

etablierte diese Pilotstudie sowohl Einfrier- als auch Auftauprozedere zur

Konservierung der neuronalen nasalen Progenitoren mit ähnlicher Kulturdauer.

Herkömmliche Einfrier- und Auftauprozedere, wie für die robusten standardisierten

ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 vorgesehen, ermöglichten allerdings keine

Fortführung einer Primärzellkultur aus Nasenmuscheln. Erst die Etablierung der

Auftau- und Einfrierprozedere in Anlehnung an Vorgehensweisen mit Progenitor-

und Stammzellen erlaubten dies. Das könnte ein Indiz dafür sein, dass es sich

auch bei den nasal gewonnenen Zellen um neuronal-selektierte Zellen handelt.

Außerdem führten wir vor jeder Färbung dieser Pilotstudie eine einseitige

neuronale Expansion nasaler Progenitoren von der nullten zur ersten

Kulturpassage durch. Das bedeutet, wir setzten nasale Zellen ein, die zunächst

am Ende der nullten Kulturpassage eingefroren und für die Färbungen bzw.

Versuche in der ersten Passage wieder ausgesät und verwendet wurden.

Zur reproduzierbaren und effizienten Selektierung neuronaler Progenitoren

aus Nasenmuschelproben waren das Kulturmedium und die Wachstumsfaktoren

im Laufe der Kultivierung von größter Bedeutung. Dabei legten wir besonderen

Wert darauf, eine Kulturmethode ohne Serum zu benutzen, da das Medium sonst

zu viele variable Bestandteile enthält. Daher stellte sich der Einsatz der

serumfreien Modifikation Neurobasal-A Medium mit B27-Supplement als

besonders geeignet heraus. Dieses komplex zusammengesetzte Medium ist ideal

zur Kultivierung neuronaler Zellen des ZNS (Brewer, Torricelli et al. 1993; Brewer

1997) und stellt eine klassische Methode dar, die die undifferenzierte

Diskussion

49

Selbsterneuerung zentralnervöser Progenitoren fördert und die selektive Isolierung

und Vermehrung in heterogenem Gewebe ermöglicht (Wachs, Couillard-Despres

et al. 2003). Nasenmuscheln enthalten beispielsweise auch Bindegewebs- und

Nasenschleimhautepithelzellen, die aber bei Einstellung selektiver Bedingungen in

eine neuronale Progenitorkultur „kontaminieren“ können (Walton, Sutter et al.

2006; Belzunegui, Izal-Azcarate et al. 2008; Xue, Qiao et al. 2008; Xue, Wei et al.

2009). Die von uns gewählten Medienbedingungen und Wachstumsfaktoren

erlaubten also keine Vermehrung der Bindegewebs- oder

Nasenschleimhautepithelzellen. Die spezifischen Bedürfnisse dieser Zelltypen

wurden nicht berücksichtigt, was sie mit zunehmender Kulturdauer aussterben

ließ.

Wir nahmen an, dass die neuronalen Progenitoren aus

Nasenmuschelmaterial zumindest zu Beginn der Kultur den entsprechenden

Zellen in vivo ähneln und die physiologischen Fähigkeiten in vitro nachahmen

können. In diesem Zusammenhang fanden wir heraus, dass die aus

Nasenmuscheln gewonnenen neuronalen Progenitoren nur eine begrenzte

Teilungsfähigkeit aufwiesen und die Kultivierung zudem nur über Tage bis

Wochen möglich war. Des Weiteren bestand mit zunehmender Kultivierung die

Gefahr der Zelldifferenzierung, was wir durch verschiedene Morphologien

mikroskopisch beobachten konnten. Wir setzten die rekombinanten

Wachstumsfaktoren EGF, FGF und LIF ein, um das Wachstum der neuronalen

nasalen Progenitoren zu fördern und eine Differenzierung zu verhindern. Diese

Wachstumsfaktoren sind in eine Vielzahl von Funktionen der Zelle involviert,

insbesondere aber in die Signaltransduktion und adulte Neuro- und Gliogenese

(Tureyen, Vemuganti et al. 2005). Für neurale Progenitor- und Stammzellen wurde

bereits beschrieben, dass EGF die Regulierung der Proliferation, die

Differenzierung und das Überleben von adulten Zellen der subventrikulären Zone

unterstützt (Herbst 2004; Grimm, Messemer et al. 2009; Lee, Hsu et al. 2009).

Außerdem konnte an Mäusen gezeigt werden, dass die Identität neuraler

Progenitorzellen in Anwesenheit von EGF erhalten bleibt (Hulspas, Tiarks et al.

1997; Winkler, Fricker et al. 1998). Auch FGF reguliert - ähnlich wie EGF - an

zentralnervösen neuralen Progenitor- und Stammzellen während der embryonalen

Entwicklung die Proliferation, die Migration und die Differenzierung der Zelle

(Ornitz and Itoh 2001). Es ist beschrieben, dass hohe Konzentrationen von FGF

Diskussion

50

die fortschreitende Neurogenese von Zellen blockieren, was wir uns auch für die

neuronalen Progenitoren aus Nasenmuschelmaterial erhofften (Nelson and

Svendsen 2006). Der Einsatz von EGF in Kombination mit FGF konnte schon

erfolgreich zur in vitro-Kultivierung an neuralen Progenitor- und Stammzellen des

ZNS mit anschließender Generierung von Neurosphären etabliert werden

(Reynolds and Weiss 1992). Dennoch entschieden wir uns dafür, die Kultivierung

noch um den rekombinanten Wachstumsfaktor LIF, einen Lymphoid-Faktor, zu

ergänzen, der die spontane Zelldifferenzierung unterbindet. Zudem ist bekannt,

dass LIF die Pluripotenz zur Langzeitkultivierung von embryonalen Stammzellen

fördert (Pitman, Emery et al. 2004; Emery, Merson et al. 2006; Oshima, Teo et al.

2007; Weible and Chan-Ling 2007).

Bevor sich jedoch feste Arbeitsabläufe für die Kultivierung von neuronalen

Progenitoren aus Nasenmuscheln einstellen konnten, spielten weitere

Einflussvariablen eine wichtige Rolle, insbesondere bei Entnahme-, Lagerungs-

und Transportbedingungen, der enzymatischen Digestion und der Beschichtung

der Zellkulturplastik. Jeder der zuvor genannten drei Schritte hätte bei Verzicht ein

Scheitern der Zellkultur bedeutet, wie uns das auch häufig widerfahren ist. Die

entnommenen Ethmoidgewebestückchen bedürfen einer sofortigen

Zwischenlagerung in Umgebungsbedingungen, die den osmotischen und CO2-

Veränderungen entgegenwirken, die Zellen versorgen und ihre Abfallprodukte

neutralisieren. Zunächst versuchten wir den Transport der Resektate in dem

Wachstumsmedium, bestehend aus Neurobasal-A mit B27-Supplement,

durchzuführen, was sich als nicht erfolgreich erwies: Es war keine Kultivierung von

lebens- und vermehrungsfähigen neuronalen Progenitorzellen möglich. Wir

schlossen daraus, dass Neurobasal-A zwar ein aufwendiges, mit vielen

Komponenten und einem geringen Anteil Glucose ausgestattetes Kulturmedium

ist, das sich aber nicht eignet, die Reduzierung von CO2 abzufangen. Die Folge

war ein basischer pH-Wert von bis zu 8,1 im Medium, der Neurone zum raschen

Zelltod führt (Brewer and Price 1996). Abhilfe hätte an dieser Stelle eine CO2

unabhängige Modifikation von Neurobasal-A geschaffen, das so genannte

Hibernate-A, welches aber nicht erhältlich war (Brewer and Price 1996). Wir

konnten hier zeigen, dass der Einsatz von Hibernate-A nicht zwingend erforderlich

ist, denn wir fanden heraus, dass die sofortige Lagerung der

Nasenschleimhautproben nach der Operation und der Transport in HBSS mit 5%

Diskussion

51

Glucose die spätere Isolierung von Kulturen aus den Resektaten reproduzierbar

ermöglichten. HBSS ist bekannt dafür, dass es den pH-Wert stabilisiert, CO2

unabhängig ist (Derelanko 2001) und es möglich macht, die Proben für wenige

Stunden bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung zu lagern (Brewer and Price 1996;

Derelanko 2001). Laut Hersteller besteht HBSS aus anorganischen Salzen, das

mit weiterer Glucose angereichert wurde. Insofern denken wir, dass der

wesentliche Vorteil die erhöhte Glucosekonzentration ist. Dies erscheint auch

plausibel angesichts der hohen Radikalempfindlichkeit und Glucoseabhängigkeit

neuraler Zellen (Walker, Donovan et al. 1988; Goldberg and Choi 1993; Shostak,

Wajsbrot et al. 2000; Plesnila, Zinkel et al. 2001; Ardizzone, Lu et al. 2002;

Gromada, Bark et al. 2005; Serra-Perez, Verdaguer et al. 2008), so dass hier

bereits vom ersten Zeitpunkt an die Berücksichtigung der spezifischen

Bedingungen wichtig ist.

Ebenfalls war es von Bedeutung, für eine erfolgreiche Kultivierung die

enzymatische Digestion der Nasenschleimhautproben mit Akkutase

durchzuführen. Trypsin, häufig für die enzymatische Digestion angewandt, lieferte

keine ausreichende Anzahl lebensfähiger Einzelzellen für die Kultivierung. Laut

Hersteller ist Akkutase ein Gemisch von Enzymen mit proteolytischer-,

kollagenolytischer- und DNAse-Aktivität, welches aus einer Insektenzelllinie

gewonnen wird. Über die genaue Zusammensetzung gibt es keine Auskunft, so

dass Akkutase als undefiniertes Reagenz angesehen werden muss. Dennoch war

Akkutase in unseren Händen vollständig definierten, rekombinanten Trypsin-

Präpärationen, z.B. TrpLE Select von Invitrogen, in der Zellisolierung weit

überlegen. Andere Forschergruppen publizierten bereits ähnliche Befunde

(Wachs, Couillard-Despres et al. 2003; Bajpai, Lesperance et al. 2008). Der Vorteil

von Akkutase gegenüber Trypsin liegt für unseren Verwendungszweck in der

zusätzlichen kollagenolytischen Aktivität, denn Nasenmuschelmaterial besteht

auch aus Bindegewebe, dessen Hauptbestandteil Kollagen ist. Somit ist es von

grundlegender Bedeutung, dass in der anatomisch komplex aufgebauten

Nasenschleimhaut eine schonende Isolierung der neuronalen Zellen aus dem

Kollagen erfolgt (Bajpai, Lesperance et al. 2008).

Weiterhin fanden wir heraus, dass nur die Beschichtung der Zellkulturplastik

mit Poly-L-Lysin und anschließend Fibronektin die Adhäsion und Proliferation von

neuronalen Progenitoren zu Beginn der Kultur einleiteten. Zellen, die sich nicht

Diskussion

52

anheften konnten, schienen nicht zu proliferieren und ließen sich auch nicht

erfolgreich passagieren. Laut Hersteller fördert Poly-L-Lysin die elektrostatische

Interaktion zwischen den negativ geladenen Ionen von Zellmembranen und den

positiv geladenen Oberflächen-Ionen des Bodens der Kulturflasche. Bindet Poly-L-

Lysin an den Boden der Kulturflasche, erhöht sich die Anzahl der positiven

Ladungen, die für die Zellbindung erforderlich sind. Poly-L-Lysin ersetzt die sonst

zur Anhaftung nötigen Serumproteine. Auf Grund dessen konnten wir uns

entscheiden, die Kultivierungseffizienz zu erhöhen und ab Tag 2 der Kultivierung

auf Serum zu verzichten, da es zu viele variable Bestandteile enthält. Poly-L-Lysin

fördert das Anhaften verschiedenster Zelltypen, aber eben auch neuronaler

Zelllinien, primärer Neurone und Gliazellen an Böden von Zellkulturflaschen

(Brewer, Espinosa et al. 2001; Brewer, Espinosa et al. 2003; Walton, Sutter et al.

2006; Murrell, Wetzig et al. 2008). Fibronektin ist ein Glykoprotein, das im

Blutplasma und in der extrazellulären Matrix vorkommt. Für die Optimierung der

Kultivierung von Neuronen, Progenitor- und Epithelzellen in vitro wird das

Vorhandensein Fibronektin-spezifischer Zelloberflächen-Moleküle, den Integrin-

Rezeptoren, genutzt. Den Zellen dient Fibronektin als eine dünne Substratschicht

auf der Kultivierungsfläche zur Adhäsionsausbildung. Außerdem unterstützt es die

Ausbreitung und das Wachstum von Zellen (Guller, Allen et al. 1992; Yoneda,

Sasaki et al. 1997; Shaw, McClatchey et al. 1998; Lavoie, Champagne et al. 2000;

Brewer, Espinosa et al. 2003; Schwartz, Bryant et al. 2003). Poly-L-Lysin oder

Fibronektin alleine erwiesen sich als nicht ausreichende Proteinbeschichtung zur

Anhaftung von neuronalen nasalen Progenitoren an den Zellkulturflaschenboden.

Diese Pilotstudie identifizierte die selektiv isoli erten neuronalen

Progenitorzellen aus den „oberen“ mittleren Nasenmu scheln und stellte eine

interindividuelle Vergleichbarkeit für 3 Individuen in Bezug auf 7

Neuralmarker fest. Die nasal gewonnenen neuronalen Progenitoren erwiesen

sich als positiv für die Proteine Nestin, GFAP, Mus ashi und Beta-III-Tubulin,

die Proteine A2B5, NeuN und Map2 konnten wir nicht nachweisen.

In den Ausführungen zuvor haben wir beschrieben, dass die Etablierung einer

Routine-Zellkultur für die neuronalen nasalen Progenitoren mit einem enormen

Zeit- und Arbeitskraftaufwand verbunden ist. In diesem Zusammenhang können

Diskussion

53

die von uns eingerichteten Einfrier- und Auftauprozedere verwendet werden, um

neuronale nasale Progenitoren, die nach ca. 5 - 7 Wochen ausreichende

Zellmengen in der nullten Kulturpassage erreichen, zu konservieren. Der

Zellkulturaufwand für die folgenden Hauptuntersuchungen verringert sich dadurch,

und es sind immer Zellen zur Reproduktion von Ergebnissen in eingefrorenem

Zustand vorhanden. Des Weiteren führten wir damit eine einseitige neuronale

Expansion durch. Für alle Zellfärbungen verwendeten wir neuronale Progenitoren

aus Nasenmuscheln, die in der nullten Passage vermehrt und schonend

eingefroren wurden. Die erneut ausgesäte erste Kulturpassage stand dann den

Hauptuntersuchungen zur Verfügung. Die selektive Zellkultur zur Produktion und

Erhaltung von neuronalen Progenitoren aus den „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln vermittelte uns unter dem Mikroskop einen sehr homogenen

morpholologischen Eindruck. Zur Untersuchung dieses Eindrucks auf

Proteinebene etablierten wir Immunfluoreszenzfärbungen für 7 Neuralmarker.

Diese Pilotstudie wies drei unabhängig bearbeiteten Zellproben „oberer“ mittlerer

Nasenmuscheln zu Beginn der ersten Kulturpassage ein identisches

Expressionsmuster nach, das positiv für die Proteine Nestin, GFAP, Beta-III-

Tubulin und Musashi war, während MAP2, NeuN und A2B5 nicht vorgefunden

wurden. Daraus folgerten wir, dass unsere Kulturmethode an psychiatrisch

gesundem Probandenmaterial über die Zeit stabil war und zudem homogene

Zellpopulationen fördert. Da wir nur visuelle Beobachtungen unter dem Mikroskop

wiedergeben können, ist eine konkrete Angabe zur tatsächlichen Prozentzahl

positiver Zellen nicht möglich. Wir nehmen aber an, dass es über 95% der Zellen

betrifft. An dieser Stelle müssten zukünftig Methoden greifen, die im Hinblick auf

prozentuale Angaben genaueren Aufschluss geben könnten, wie das beim

„Fluorescence Activated Cell Sorting“ der Fall ist. Typischerweise ist nämlich die

hundertprozentige Durchsetzung einer Zellkultur mit einem Protein sehr

unwahrscheinlich.

Vielfach sind in der Vergangenheit Zellproben aus mittleren und oberen

Nasenmuscheln und auch olfaktorisches Neuroepithel Verstorbener in der in vitro-

Zellkultur untersucht worden. Diese Studien mehrten die Erkenntnisse über die

mögliche zelluläre Komposition unter verschiedensten in vitro-Kulturbedingungen.

Eine Untersuchung bezieht sich auf in vitro-Experimente mit olfaktorischer

Schleimhaut Verstorbener und beschreibt dabei heterogene Zellpopulationen, die

Diskussion

54

aus Neuronen, Glia- und Epithelzellen bestehen. Im Gegensatz zu unserem

Ansatz mit Neurobasal-A ohne Serum und Wachstumsfaktoren erfolgte die

Kultivierung aber auch in DMEM/F12-Medium mit 10% Serum. Zudem wurde der

Transport des entnommenen Gewebes nur in HBSS ohne den Zusatz von

Glucose durchgeführt. Darüber hinaus wurde - abweichend zu unserer Methodik -

Trypsin anstelle von Akkutase zur enzymatischen Digestion eingesetzt (Roisen,

Klueber et al. 2001). Ergänzend sei angemerkt, dass bei der Verwendung von

Flüssigmedien wie DMEM und MEM mit Serum häufig eine Differenzierung von

isolierten Zellen in der Kultur vorangetrieben wird, was einen Vergleich dieser

Studien erschwert. Schon der Einsatz von Serum stellt eine variable Konstante

dar, die starken Einfluss auf die Genese von Zellpopulationen haben kann

(Murrell, Bushell et al. 1996; Zhang, Klueber et al. 2004; Hahn, Han et al. 2005;

Zhang, Cai et al. 2005). Erst die neueren Erkenntnisse der Stammzellforschung

erlaubten die Umsetzung mit den etablierten Zellkulturbedingungen in dieser

Pilotstudie. Dabei bietet die Produktion homogener gegenüber heterogenen

Zellpopulationen den Vorteil, dass keine weitere selektive Aufreinigung nötig ist.

Die Einschätzung, dass es sich in dieser Pilotstudie bei den selektierten

Zellen „oberer“ mittlerer Nasenmuscheln um neuronale Progenitoren handelt,

gründet nun auf die von uns nachgewiesene homogene Markerexpression, was im

Folgenden erläutert werden soll: Besonderen Stellenwert zur Deutung wiesen wir

dabei den Markern Nestin und GFAP zu. Nestin kommt transient während der

pränatalen Entwicklung von Zellen im ZNS vor. Es wurde bereits gezeigt, dass

embryonale Stammzellen der Maus, adulte Progenitoren der subventrikulären

Zone im Gehirn und multipotente Stammzellen aus adultem olfaktorischen

Neuroepithel Nestin enthalten (Doyle, Khan et al. 2001). Häufig gilt Nestin in der

Literatur als sicherer neuraler Marker für Progenitor- und Stammzellen (Tohyama,

Lee et al. 1992; Quinones-Hinojosa, Sanai et al. 2006; Gilg, Tye et al. 2008;

Johansson, Price et al. 2008; Smith, Vallier et al. 2008). GFAP wurde zunächst als

spezifischer Marker für Astrozyten und Astroglia des ZNS angesehen (Fuchs and

Weber 1994). Außerdem konnte GFAP bereits in unreifen Gliazellen sowie

Glioma-Zelllinien, aber nicht in reifen Astrozyten nachgewiesen werden (Reeves,

Helman et al. 1989). Besonders interessant erschien uns aber die jüngst

publizierte starke Expression von GFAP in neuralen Stammzellen des adulten

ZNS (Chen, Muckersie et al. 2008; Jiang, Yurke et al. 2008; Paintlia, Paintlia et al.

Diskussion

55

2008). Konträr zu unseren Ergebnissen stehen Veröffentlichungen an Zelllinien,

generiert aus olfaktorischem Neuroepithel Verstorbener, die eine Nestin-positive

und GFAP-negative Identität aufzeigen. Diese Gruppen verwendeten aber

abweichende Kulturmedienbedingungen wie MEM mit 10% Serum und

DMEM/F12 ohne Serum, aber mit B27-Supplement (Zhang, Klueber et al. 2004;

Zhang, Cai et al. 2005). Ebenfalls an Zelllinien olfaktorischer Herkunft ist die

Nestin-negative und GFAP-positive Identität von Zellen bekannt. Auch hier

unterschied sich das Medium mit DMEM/F12 von unseren gewählten

Bedingungen. Zwar wurden auch EGF und FGF zusammen und LIF einzeln

zugesetzt, aber nicht in Kombination der drei genannten Wachstumsfaktoren

(Pagano, Impagnatiello et al. 2000). Durch Untersuchungen an olfaktorischem

Neuroepithel Verstorbener konnte ebenfalls die Identität Nestin-negativer und

GFAP-positiver Zellen ermittelt werden. Diese Kultivierung erfolgte abweichend zu

unseren Bedingungen aber in DMEM/F12-Medium ohne Serum und weitere

Zusätze (Roisen, Klueber et al. 2001). Wir vermuten für diese abweichenden

Ergebnisse eine differenziertere Zelle, die in Abhängigkeit zu den

Kultivierungsbedingungen und fortschreitender Glio- und Neurogenese stand.

Interessanterweise wird bei weiterer Differenzierung die Menge an Nestin in der

Zelle heruntergeregelt und durch Gewebe-spezifische Neurofilamente wie z.B.

GFAP ersetzt (Michalczyk and Ziman 2005). Die Tatsache, dass die nasalen

Zellen sowohl Nestin als auch GFAP exprimieren, deutet an, das wir auf der Basis

der zuvor genannten Argumente neuronale Progenitoren kultivierten, die

möglicherweise am Anfang ihrer Neuro- und Gliogenese stehen. Der positive

Befund für Nestin und GFAP in Kombination wurde ebenfalls durch Kultivierung in

DMEM/F12-Medium mit 10% Serum unterscheidend zu unserer Methodik eruiert.

Diese Ergebnisse gründen auf Untersuchungen an Zellen, isoliert aus mittleren

und oberen Nasenmuscheln, sowie Zelllinien, die aus olfaktorischem Neuroepithel

Verstorbener gewonnen wurden (Murrell, Feron et al. 2005; Othman, Lu et al.

2005).

Die Proteinmarker Beta-III-Tubulin und Musashi sollten für uns eine weitere

Identitätsbestimmung der neuronalen Progenitoren aus Nasenmuschelmaterial

erlauben. Dabei erhärteten sich die Hinweise zu Gunsten einer neuronalen

Progenitorzelle, denn wir wiesen die Proteine Beta-III-Tubulin und Musashi positiv

nach. Beta-III-Tubulin ist bekannt für ein reichhaltiges Vorkommen im ZNS.

Diskussion

56

Darüber hinaus ist Beta-III-Tubulin ein wichtiger Marker zur Bestimmung von

Zellen neuronalen Ursprungs und wird insbesondere während der fötalen und

postnatalen Entwicklung exprimiert. Außerdem ist Beta-III-Tubulin transient in der

subventrikulären Zone des Gehirns vorhanden (Burgoyne, Cambray-Deakin et al.

1988). Aber gerade die jüngsten Befunde zeigen ebenfalls auf, dass Beta-III-

Tubulin außerdem neuronale- und/oder gliale Progenitorzellen markieren kann

(Head, Patel et al. 2008; Johansson, Price et al. 2008; Koh, Kim et al. 2008;

Theodorou, Dalembert et al. 2009). In der Literatur findet man viele Publikationen,

in denen auf das Vorhandensein von Beta-III-Tubulin im Septum der Nase, in

mittleren Nasenmuscheln und in post-mortem gewonnenem olfaktorischen

Gewebe verwiesen wurde (Mumm, Shou et al. 1996; Roisen, Klueber et al. 2001;

Hahn, Han et al. 2005; Marshall, Guo et al. 2005; Murrell, Feron et al. 2005;

Winstead, Marshall et al. 2005). Es gibt demgegenüber auch abweichende

Ergebnisse. Diese Arbeitsgruppen bedienten sich im Gegensatz zu uns anderer

Medienkompositionen mit DMEM und DMEM/F12 mit jeweils 10% Serum.

Außerdem wurden diese Untersuchungen nicht nur an mittleren Nasenmuscheln,

sondern auch an post-mortem Gewebe und daraus gewonnenen Zelllinien

durchgeführt (Roisen, Klueber et al. 2001; Hahn, Han et al. 2005). Musashi spielt

eine wichtige Rolle in Bezug auf die Erhaltung des Stammzellstadiums, der

Differenzierung und der Tumorgenese. Darüber hinaus wird Musashi selektiv in

neuralen Progenitor- und Stammzellen exprimiert (Nakamura, Okano et al. 1994;

Sakakibara, Imai et al. 1996; Kurihara, Nagata et al. 1997; Good, Yoda et al. 1998;

Cuadrado, Garcia-Fernandez et al. 2002; Battelli, Nikopoulos et al. 2006; Strojnik,

Rosland et al. 2007; Bussolati, Bruno et al. 2008). Auf der Basis unserer

fachliterarischen Nachforschungen sind wir die Ersten, die das Protein Musashi in

der Kultur mit Zellen der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln nachweisen konnten.

Basierend auf der Tatsache, dass wir bereits Nestin- und GFAP-positive Zellen

nachgewiesen haben, denken wir, dass unser Nachweis von zusätzlich Beta-III-

Tubulin und Musashi den Verdacht erhärtet, dass wir neuronale Progenitorzellen

kultivierten.

Die Proteine Map2 und NeuN sollten eine mögliche neuronale und A2B5

eine mögliche astrozytäre Differenzierung bzw. Identität der von uns untersuchten

neuronalen nasalen Progenitorzellen überprüfen. Keiner der drei Marker konnte

von uns detektiert werden. Das bestätigte unsere Annahme, dass wir neuronale

Diskussion

57

Progenitoren kultivierten, die positiv für die Proteine Nestin, GFAP, Beta-III-

Tubulin und Musashi waren. Map2 wird ausschließlich in Nervenzellen gefunden

und dient der Stabilisierung und dem Aufbau von Mikrotubuli, was einen

bedeutenden Schritt in der Neurogenese darstellt (Lim and Halpain 2000). Map2

zeigt insbesondere eine bereits vollzogene neuronale Entwicklung und damit eine

differenzierte Zellpopulation an (Sanchez, Diaz-Nido et al. 2000; Teng, Takei et al.

2001; Cristofanilli, Thanos et al. 2004; Bhat, Maddodi et al. 2006; Fifre, Sponne et

al. 2006; Liu, Chen et al. 2008; Gonzalez, Lopez-Costa et al. 2009). Im Gegensatz

zu unseren negativen Befunden an drei Individuen gibt es Publikationen, die

Map2-positive Zellen in post-mortem gewonnenem olfaktorischen Neuroepithel

und daraus produzierten Zelllinien ausfindig gemacht haben (Murrell, Bushell et al.

1996; Roisen, Klueber et al. 2001; Othman, Lu et al. 2005). Es sind aber auch

Map2-negative Ergebnisse an Resektaten mittlerer Nasenmuscheln bekannt

(Zhang, Klueber et al. 2004). Diese Arbeitsgruppen etablierten im Gegensatz zu

uns andere Kulturmedienbedingungen, basierend auf DMEM mit Monomed als

Supplement und dem Wachstumsfaktor FGF, DMEM/F12 mit 10% Serum, MEM

mit 10% Serum und DMEM/F12 ohne Serum, aber mit B27-Supplement (Murrell,

Bushell et al. 1996; Roisen, Klueber et al. 2001; Zhang, Klueber et al. 2004;

Othman, Lu et al. 2005). NeuN ist ein exzellenter Marker zur spezifischen

Identifizierung von Neuronen in Primärzellkulturen. In der Maus ist NeuN in fast

allen neuronalen Zelltypen vorhanden. NeuN kommt sowohl im peripheren als

auch zentralen Nervensystem vor. Es wird vor allen Dingen exprimiert, wenn die

zelluläre und morphologische Differenzierung einsetzt. Im Kontrast dazu ist NeuN

in proliferierenden Geweben nicht nachweisbar (Sarnat, Nochlin et al. 1998; Unal-

Cevik, Kilinc et al. 2004; Andres, Andre et al. 2005; Lind, Franken et al. 2005;

Shuangshoti, Mujananon et al. 2005; Van Nassauw, Wu et al. 2005; Collombet,

Masqueliez et al. 2006; Mensah-Brown and Garey 2006). Insgesamt betrachtet

wurde NeuN an humanen Nasenschleimhaut-Resektaten nicht häufig untersucht,

dennoch gibt es eine Forschergruppe, die ebenfalls NeuN-negative Zellen

nachwies. Diese Gruppe verwendete ein anderes Medium, DMEM/F12 ohne

Serum, aber auch das B27-Supplement, das wir ebenfalls benutzten. Der

Nachweis erfolgte an post-mortem gewonnenem olfaktorischen Neuroepithel und

den daraus erzeugten Zelllinien (Zhang, Cai et al. 2005). A2B5 ist ein

Zelloberflächenmarker, dessen Epitop vor allen Dingen auf Astro- und

Diskussion

58

Oligodendrozyten gefunden wurde. A2B5 kommt oft zum Einsatz, wenn das Ziel

der Untersuchung darin besteht, Zellen zu identifizieren, die sich in der Gliogenese

befinden und eine oligodendrozytäre Differenzierung beginnen (Bottenstein,

Hunter et al. 1988; Dubois-Dalcq and Armstrong 1990; Scolding, Rayner et al.

1999; Dietrich, Noble et al. 2002; Xia, Du et al. 2003; Baracskay, Kidd et al. 2007;

Ogden, Waziri et al. 2008; Tchoghandjian, Baeza et al. 2009). Im Kontrast zu

unseren negativen Befunden stehen Ergebnisse von Forschergruppen, die A2B5-

positive Zellen in mittleren Nasenmuscheln und olfaktorischem Neuroepithel

Verstorbener nachgewiesen haben. Im Unterschied zu unseren Untersuchungen

erfolgte die Kultivierung zum einen in DMEM/F12-Medium mit 5% Serum und zum

anderen in MEM mit 10% Serum (Zhang, Klueber et al. 2004; Winstead, Marshall

et al. 2005).

Abschließend vermuten wir, dass publizierte positive Nachweise der

Proteine Map2, NeuN und A2B5 in humanen Resektaten der Nasenschleimhaut

damit einhergehen, dass die Kultivierung einer neuronal und astrozytär

differenzierteren Zelle erfolgte. Wir gehen also davon aus, dass die selektierten

neuronalen Progenitoren der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln in dieser

Pilotstudie noch vermehrungsfähig sind, um sich entweder neuronal oder glial zu

differenzieren.

Diskussion

59

Diese Pilotstudie führte ein erstes psychiatrisch r elevantes in vitro-

Zellkultur-Experiment mit den nasal gewonnenen neur onalen Progenitoren

und den standardisierten ZNS-Zelllinien CHME3 und B V2 durch. Die

Auslösung einer artifiziellen LPS-Entzündungsreakti on in diesen

Zellsystemen erfolgte zur Simulation einer Hirnerkr ankung, die eine Therapie

mit einem Antipsychotikum, in unserem Fall Clozapin und Haloperidol,

rechtfertigen könnte. Im direkten Vergleich mit den ZNS-Zelllinien CHME3

und BV2 stellten wir aber fest, dass die neuronalen nasalen Progenitoren

eine höhere Empfindlichkeit auf LPS zeigten, so das s die Konzentration für

unsere Versuche im Gegensatz zu den beiden Zelllini ensystemen um eine

Dekade gesenkt werden musste.

LPS ist als Bestandteil gram-negativer Bakterien befähigt, die Blut-Hirn Schranke

zu passieren, um an den Membranrezeptor CD14 zu binden. Diese Bindung regt

die zelluläre Zytokinproduktion in einer Zelle an, welche wiederum Fieber

verursachen kann (Rivest, Lacroix et al. 2000). CD14 Rezeptoren sind allgemein

in Mikroglia-Zellen und in den standardisierten mikroglialen ZNS-Zelllinien CHME3

und BV2 vorhanden (Lacroix, Feinstein et al. 1998). Ebenfalls sind CD14

Rezeptoren in Zellen der Nasenschleimhäute (Jahnsen, Gran et al. 2004) und in

Monozyten und Makrophagen der Säugetiere existent (Lacroix, Feinstein et al.

1998). Darin gründet auch der gemeinsame experimentelle Ansatz in

Zusammenhang mit LPS. Zudem besitzt CD14 in endothelialen Zellen eine

regulierende Funktion für das Zellüberleben. Das Herauslösen des CD14

Rezeptors durch Makrophagen führt zur Apoptose (Rivest, Lacroix et al. 2000).

Die für diese Pilotstudie gewählten in vitro-Konzentrationsbereiche von Clozapin

(0,1 µg/ml und 1 µg/ml) und Haloperidol (0,02 µg/ml und 0,2 µg/ml) mit jeweils 0,2

µg/ml LPS für die ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 beruhten auf unabhängigen

Vorarbeiten im Hause der ZIP gGmbH Kiel. Diese Konditionen stellten sich als

besonders günstig heraus. Eine simultane Anwendung für die neuronalen nasalen

Progenitoren war aber nicht möglich. Die verursachte Zellschädigung durch LPS

war so groß, dass keine Anfärbung und Zellzählung auf Deckgläsern mehr

erfolgen konnte. Zum Erhalt der bestmöglichen Vergleichbarkeit entschieden wir

uns, die Konzentrationen von Clozapin und Haloperidol beizubehalten und

lediglich die LPS-Konzentration an den neuronalen nasalen Progenitoren um eine

Diskussion

60

Dekade von 0,2 µg/ml auf 0,02 µg/ml abzusenken. Die höhere Empfindlichkeit von

Primärzellen, induziert durch LPS als Bestandteil der äußeren Membran gram-

negativer Bakterien, ist bislang in der Literatur nicht belegt. Es gibt zwar viele

Studien, die primär gewonnene Zellen LPS aussetzten, aber meist nicht gezielt

den Vergleich mit einer Zelllinie anstrebten (Lieb, Engels et al. 2003; Hosoi,

Suzuki et al. 2005; Basta-Kaim, Budziszewska et al. 2006; Hou, Wu et al. 2006;

Mayo and Stein 2007). Für unsere Versuche müssen wir aber zur Kenntnis

nehmen, dass die standardisierten ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 in puncto LPS-

Konditionierung eine höhere Toleranz aufweisen, als das bei den sensibel

einzuschätzenden nasalen Primärzellen der Fall ist.

Wir fanden heraus, dass die psychotropen Substanzen Clozapin und

Haloperidol in den neuronalen nasalen Progenitoren und den etablierten

standardisierten ZNS-Zelllinien unterschiedliche in vitro-Immunantworten im

Hinblick auf Zellzyklus- und Apoptoseaktivität bewi rken. Auch die ZNS-

Zelllinien CHME3 und BV2 unterscheiden sich deutlic h voneinander.

Frühere in vitro-Zellkulturuntersuchungen hatten die Aufgabe, psychotrope

Wirkungen von Clozapin und Haloperidol im Hinblick auf Neurotoxizität,

insbesondere induzierte Apoptose, zu erforschen. Nur selten ist in diesem

Zusammenhang die Zellzyklusaktivität untersucht worden (Hinze-Selch, Becker et

al. 1998; Hinze-Selch and Pollmacher 2001; Koch, Kell et al. 2002; Koch, Kell et

al. 2003). Zwangsläufig ist auch die Zellzyklusaktivität bei induzierter Apoptose in

Zelllinien oder Primärzellen betroffen. Für das Testen der Zellzyklusaktivität

verwendeten wir die Proteinmarker Ki-S2, Ki-Mit und MCM6. Dabei markiert Ki-S2

Zellen in der S-, G2 und M-Phase (Rudolph, Alm et al. 1999), Ki-Mit Zellen in der

M-Phase, (Pollmann, Parwaresch et al. 2006) und MCM6 Zellen in allen Phasen

des Zellzyklus’ (Heidebrecht, Buck et al. 2001). Gerade zur Überprüfung der

Apoptoserate wird häufig aktivierte Kaspase 3 verwendet. Diese Kaspase spielt

eine Schlüsselrolle bei Entzündungsreaktionen und der Erkennung früher

Apoptose (Dai and Krantz 1999).

In dieser Pilotstudie war es aufgrund des Zeitrahmens und der erheblichen

Methodenvorarbeiten leider nicht möglich, die Ergebnisse der neuronalen nasalen

Progenitoren und ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 zu replizieren. Somit können wir

Diskussion

61

nicht mit mehreren Individuen argumentieren, sondern nur mit n = 1. Dadurch

aber, dass zwei Konzentrationen von Clozapin, 0,1 µg/ml und 1 µg/ml, und

Haloperidol, 0,02 µg/ml und 0,2 µg/ml, zu zwei Zeitpunkten, nämlich nach 24 h

und 48 h, untersucht wurden, deckten wir eine Kinetik auf, die Hinweise für

zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet geben könnte. Darüber hinaus ist für die

Interpretation unserer Experimente zu beachten, dass nicht Einzelansätze aus

verschiedenen Versuchsreihen miteinander quantitativ verglichen werden dürfen,

da die Streuung bei Zelllinien- und insbesondere bei Primärzellexperimenten sehr

hoch sein kann. Deswegen wurde konsequenterweise nur innerhalb kompletter

Ansätze mit internen Kontrollen argumentiert. Somit sind Verrechnungen von

Kontroll- und Verum-Präparaten verschiedener Konzentrationsansätze nicht

gerechtfertigt, und die Ergebnisse sind nicht beliebig. Aufgrund der genannten

vorangegangenen Argumente sind unsere Ergebnisse aber auch als vorläufig zu

betrachten. Unsere Nachweismethodik beruhte auf immunhistochemischen

Färbungen, die Zellzählungen und damit ein Verhältnis von Verum- zu

Kontrollpräparaten erlaubten. Die von uns angewandte Zellfärbung weist ihren

einzigen methodischen Unterschied in der Inkubation des spezifischen

Primärantikörpers auf. Ab dem Sekundärantikörper, der sowohl Maus- als auch

Menschantigene erkennt, ist die Methode im Ablauf identisch und damit gut

einsetzbar.

Ausgehend vom klinischen Alltag der medikamentösen Behandlung von

Patienten stand oftmals der psychotrope Effekt bezüglich Clozapin und

Haloperidol im Fokus der Diskussion (Szuster-Ciesielska, Slotwinska et al. 2004;

Hou, Wu et al. 2006; Sugino, Futamura et al. 2009). Bereits für das atypische

Antipsychotikum Clozapin sind vielfältige Wirkungen nachgewiesen worden

(Hinze-Selch, Becker et al. 1998; Hinze-Selch and Pollmacher 2001), die sich

allerdings von den Effekten unterscheiden, die das typische und weit verbreitete

Antipsychotikum Haloperidol auslöste. Auch für diese Pilotstudie müssen wir

unterschiedliche relative Wirkungen von Clozapin und Haloperidol in den drei von

uns getesteten Zellsystemen konstatieren. Für in vitro-Zellkulturexperimente mit

Haloperidol ist bekannt, dass es an primären hippocampalen Neuronen, C6-

Glioma und NCB20-Zellen zu erhöhter Zytotoxizität kommt (Behl, Rupprecht et al.

1995). Dies können wir in dieser Pilotstudie für die humane ZNS-Zelllinie CHME3

auch erkennen, die insbesondere bei 0,2 µg/ml Haloperidol zu drastischen

Diskussion

62

Apoptoseraten neigte. Die neuronalen nasalen Progenitoren und die murine

Zelllinie BV2 zeigten keine Erhöhung der durch Haloperidol induzierten Apoptose.

Ähnlich wie Haloperidol wird aber auch Clozapin in der in vitro-Zellkultur an PC12-,

SH-SY5Y- und U937-Zellen als toxisch beschrieben (Dwyer, Lu et al. 2003;

Heiser, Enning et al. 2007). Im Kontrast dazu zeigen unsere Versuche mit

Clozapin an den neuronalen nasalen Progenitoren sogar Tendenzen,

antiapoptotisch zu wirken. An CHME3 konnten wir zumindest für 1 µg/ml Clozapin

eine erhöhte und zunehmende Apoptose feststellen. Für die Zelllinie BV2 waren

die Apoptoseraten für Clozapin unauffällig bis leicht erniedrigt. In der Literatur wird

Clozapin eine geringere Zelltoxizität im Vergleich mit Haloperidol eingeräumt

(Dwyer, Lu et al. 2003). Für die Zelllinie CHME3 können wir dies bestätigen. Das

ist auch im Einklang mit Ergebnissen zu betrachten, die in humanen und murinen

Striatumproben nach Behandlung mit Haloperidol eine signifikante Zunahme von

Apoptose induzierendem Faktor feststellten, während dies bei der Behandlung mit

Clozapin nicht der Fall war (Skoblenick, Castellano et al. 2006). Dennoch sind

diese Ergebnisse nicht unwidersprochen (Jarskog, Gilmore et al. 2007). An

peripheren neutrophilen Blutzellen wurde auch für Clozapin eine Apoptose-

Induktion bei einem behandelten Patienten mit Schizophrenie festgestellt (Fehsel,

Loeffler et al. 2005). An PC12-Zellen rief Clozapin über MPP keine Apoptose

hervor. Haloperidol hingegen löste Apoptose aus (Qing, Xu et al. 2003). Natürlich

haben typische und atypische Antipsychotika andere zellbiologische Effekte zur

Folge, da sie an unterschiedliche Dopamin-Rezeptoren binden. Somit kommt es in

verschiedenen Zellmodellen konzentrationsabhängig zu unterschiedlichen

Auswirkungen, auch und insbesondere bezüglich Nekrose und Apoptose (Behl,

Rupprecht et al. 1995; Gardner, Zahid et al. 1998; Galili, Mosberg et al. 2000).

Der psychotrope Effekt von Clozapin und Haloperidol mit induzierter

Apoptose mittels in vitro-Zellkulturexperimenten ist vielfach beschrieben, aber

weitestgehend unerklärt blieb in diesem Zusammenhang die Zyklusaktivität. Wir

können nun erste Erkenntnisse in diesem Zusammenhang darbieten: Für alle drei

von uns getesteten Zellsysteme stellen wir eine Synthesesteigerung, induziert

durch Clozapin und Haloperidol, fest, deren Ausmaß sich aber deutlich

voneinander unterscheidet. Die neuronalen nasalen Progenitoren zeigen ähnlich

wie die murine ZNS-Zelllinie BV2 eine geringfügige Steigerung der

Syntheseleistung, induziert durch Clozapin und Haloperidol, während die humane

Diskussion

63

ZNS-Zelllinie CHME3 sehr starke Veränderungen der Expressionsraten von

MCM6 und Ki-S2 aufwies. Im Kontrast dazu stehen Untersuchungen, die keinen

Effekt von Clozapin und Haloperidol auf die Zellproliferation nachweisen konnten.

Allerdings wurde im Gegensatz zu unserer in vitro-Zellkultur Untersuchung keine

LPS-Stimulierung angewandt. Dafür wurden aber klinisch-relevante

Konzentrationen der Antipsychotika eingesetzt, deren Effekt mittels

Gesamtzellzahlbestimmung nach BrdU-Injektion im Dentate Gyrus von Ratten

erfolgte (Schmitt, Weber et al. 2004). Eine weitere Studie konnte ebenfalls keinen

Effekt mittels BrdU-Injektion im adulten Hippocampus von Ratten, ausgelöst durch

Clozapin oder Haloperidol, ermitteln (Halim, Weickert et al. 2004). Ansatzweise ist

eine nicht vorhandene Wirkung von Haloperidol mit einer Konzentration von 0,02

µg/ml an der Zelllinie BV2 erkennbar. Auch die unveränderte, aber gehemmte

Mitoseleistung der neuronalen nasalen Progenitoren bei Inkubation mit 0,1 µg/ml

Clozapin würde dafür sprechen. In sich kontrovers kristallisieren sich Befunde für

Clozapin heraus, die an schizophrenen Patienten ermittelt wurden. Hier wurden

unterschiedliche in vivo- und in vitro-Effekte für Clozapin festgestellt. Während die

in vivo-Behandlung mit Clozapin die Proliferation unterdrückte, zeigten die in vitro-

Experimente eine verstärkte Proliferation an humanen peripheren Monozyten des

Blutes. Diese Untersuchungen wurden ohne Stimulation durch LPS, aber ebenfalls

mit 0,1 und 1 µg/ml Clozapin durchgeführt. Anhand eines getesteten Thymidin-

Proliferationsassays zeigten die in vitro-Ergebnisse eine durch Clozapin induzierte

Proliferation (Hinze-Selch, Becker et al. 1998). Für die Syntheseleistung unserer

drei Zellsysteme bei Inkubation mit Clozapin können wir das bestätigen.

Kontrovers stellen sich aber die Effekte an der Zelllinie CHME3 dar, die starke bis

nahezu vollständige Limitierungen in der Mitoseaktivität aufwies. Dies ist im

Einklang mit einer Studie, die ebenfalls den inhibitorischen in vitro-Effekt von LPS

in Zusammenhang mit Clozapin und Haloperidol mittels Thymidin-

Proliferationsassay testete. Hier wurde die LPS induzierte Proliferation durch

Clozapin und Haloperidol an Monozyten der Maus inhibiert (Basta-Kaim,

Budziszewska et al. 2006). An den neuronalen nasalen Progenitoren können wir

dies weder für Clozapin noch Haloperidol in Bezug zur Mitoseleistung erkennen.

Auch CHME3 zeigte unter dem Einfluss von LPS und Haloperidol eine stark

erhöhte Mitoseleistung. Eine weitere Studie beschäftigte sich mit

oligodendrozytären Progenitorzellkulturen postnataler Ratten, um den direkten

Diskussion

64

Einfluss von Haloperidol zu untersuchen. Das Ergebnis belegte, dass Haloperidol

die Proliferation förderte. Erst die chronische Verabreichung von Haloperidol führte

zum umgekehrten Effekt (Niu, Mei et al. 2010). Nun verabreichten wir keine

chronischen Konzentrationen von Haloperidol, aber wir können für kleinere

Konzentrationen bestätigen, dass die Synthese- und Mitoseleistung in den

neuronalen nasalen Progenitoren und der ZNS-Zelllinie CHME3 gesteigert ist.

Auch die ZNS-Zelllinie BV2 zeigt unter Einfluss von Haloperidol leicht gesteigerte

Synthesefähigkeit.

Besonders auffällig sind die zum Teil sehr drastischen Expressionsraten,

die wir an der ZNS-Zelllinie CHME3 unter Einfluss von Haloperidol beobachteten:

Da sind zum einen die sehr geringen Expressionsraten von Ki-S2 bei Einsatz von

0,02 µg/ml, während bereits 0,2 µg/ml Haloperidol zu einer sehr starken

Überexpression führt, die nach 24 weiteren Stunden wieder stark unter das

Kontrollniveau kippt. Zum anderen ist das sehr geringe Expressionsaufkommen

von MCM6 bei 0,02 µg/ml Haloperidol auffällig. Für diesen Widerspruch sind

wahrscheinlich konzentrationsunabhängige Ereignisse verantwortlich, die in der

Literatur weder untersucht noch belegt sind. Dass aber starke Auswirkungen auf

Apoptose- und Zellzyklusaktivität entstehen können, ist in dieser Arbeit belegt. Wie

insgesamt auf dem Gebiet der Forschung um die zelluläre Wirkung von

Antipsychotika zeigt sich auch in unserem speziellen Fall, dass es bei so

vielfältigen Untersuchungsansätzen praktisch keine wirklich vergleichbaren

Studien gibt. Unsere Ergebnisse belegen außerdem, dass selbst bei gleichartigen

Mikroglia-Zelllinien, wie BV2 aus der Maus bzw. CHME3 aus dem Menschen,

unterschiedliche Wirkungsweisen eines Antipsychotikums auftreten. Tatsächlich

sind somit wahrscheinlich nur Bezüge im Vergleich innerhalb eines

Versuchssystems als Frage der relativen Wirkungen von Clozapin und Haloperidol

wirklich aussagekräftig. In unserem Versuchsansatz konnten wir deutlich machen,

dass Clozapin und Haloperidol vielfältig in den zellulären Stoffwechsel eingreifen,

wenn sie die Zellen unterschiedlich in Synthese-, Mitose- und Ruhephase

bewegen und in diesem Zusammenhang auch unterschiedlich Apoptose

aktivieren. Deutlich zu unterscheiden ist das Ausmaß der Wirkung von Clozapin

und Haloperidol auf die ZNS-Zelllinien CHME3 und BV2 und die neuronalen

nasalen Progenitoren. Am ähnlichsten sind sich die neuronalen Progenitoren,

gewonnen aus Resektaten der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln, und die murine

Diskussion

65

ZNS-Zelllinie BV2 in der Ausprägung der Effekte, gemessen an der Expression

von MCM6 und aktivierter Kaspase 3. CHME3 zeigte in dieser Pilotstudie die

drastischsten Reaktionen im Hinblick auf die Zellzyklusaktivität und die induzierte

Apoptose.

Ausblick

Die Möglichkeiten zur Erforschung von Hirnzellen, die aus dem lebenden

Menschen isoliert werden können, sind heutzutage immer noch stark limitiert.

Ebenso verhält es sich natürlich bei Hirnzellen, die in Verbindung mit

psychiatrischen Erkrankungen stehen. Schon seit über einem Jahrzehnt werden

deshalb die oberen und mittleren Nasenmuscheln als Quelle von Progenitor- und

Stammzellen avisiert. Im Hinblick auf die oberen Nasenmuscheln, die mittels

invasiver Chirurgie entnommen werden müssten, sind ethische Bedenken

berechtigt. Die Entnahme der „oberen“ mittleren Nasenmuscheln mittels

Ethmoidektomie ist im Vergleich dazu als ethisch unbedenklich einzustufen.

Diese Pilotstudie etablierte mit humanen Resektaten der „oberen“ mittleren

Nasenmuscheln eine selektive in vitro-Kulturmethode, die reproduzierbar

neuronale Progenitorzellen in der ersten Passage an gesunden Individuen

hervorbringt. Natürlich müsste sich unsere etablierte Kulturmethode zukünftig an

weiteren gesunden Individuen beweisen. In dieser Hinsicht sind auch Patienten

mit psychiatrischer Indikation von besonderer Bedeutung. Auf dem Gebiet der

Zellkultur bleibt noch zu überprüfen, ob die isolierten neuronalen nasalen

Progenitoren über die Plastizität verfügen, sich in neuronale, gliale oder

oligodendrozytäre Zelltypen zu differenzieren. Da die Stammzellforschung stetiger

Entwicklung unterliegt, wären auch andere Kulturbedingungen oder

Wachstumsfaktoren interessant, die eine selektive neurale Kultivierung

ermöglichen.

Unsere Schlussfolgerung, dass es sich bei den nasal gewonnenen Zellen

um neuronale Progenitoren handelt, beruhte auf dem Nachweis eines

Neuralmarkersets. Durch Immunfluoreszenzfärbungen ermittelten wir für drei

interindividuelle neuronale Progenitor-Zellkulturen positive Ergebnisse für die

Proteine Nestin, GFAP, Beta-III-Tubulin und Musashi, während Map2, NeuN und

A2B5 nicht nachgewiesen werden konnten. Da mikroskopische Betrachtungen

Diskussion

66

keine exakte Angabe zur tatsächlich positiven Zellzahl geben können, wäre hier

eine FACS-Analyse als Folgeuntersuchung sinnvoll. Das sogenannte

„Fluorescence Activated Cell Sorting“ erlaubt prozentuale Angaben zur

Proteinhäufigkeit in Zellpopulationen. Selbstverständlich setzt auch hier die

Stammzellforschung Akzente, denn Marker zur eindeutigen Benennung von

Zellentitäten bedürfen unter Berücksichtigkeit aktueller und innovativer Studien

einer kontinuierlichen Überprüfung. Das Hinterfragen von altbewährten Markern

bleibt natürlich auch relevant. Ein Protein, welches überwiegend für die

Charakterisierung neuraler Stammzellen nachgewiesen wird, ist Sox2. Dieses

konnte jüngst im adulten humanen Kleinhirn gefunden werden (Alcock, Lowe et al.

2009). Ebenso wären Hochdurchsatzverfahren, wie z.B. RNA- oder DNA-Arrays,

hilfreich, entnommenes Nasenmuschelmaterial von Gesunden mit dem von

psychisch Kranken in großen Datensätzen zu vergleichen und vor allen Dingen zu

unterscheiden.

Da die für diese Pilotstudie verwendeten drei individuellen neuronalen

nasalen Progenitor-Kulturen in Bezug auf die Zelldifferenzierung miteinander

vergleichbar waren, konnten wir ein erstes psychiatrisch relevantes Experiment

zum induzierten psychotropen Effekt von Clozapin bzw. Haloperidol mit simulierter

LPS-Entzündung an den hirnnahen Progenitoren und den etablierten ZNS-

Zelllinien CHME3 und BV2 durchführen. Dabei können wir sagen, dass die

neuronalen Progenitoren für diese Experimente eingesetzt werden können. Diese

Zellen stellen aufgrund ihres hirnnahen nativen Ursprungs eine sinnvolle

Ergänzung zu ZNS-Zelllinien dar. Wir stellten fest, dass die in vitro-Antwort

bezüglich Zellzyklus- und Apoptoseaktivität an den neuronalen nasalen

Progenitoren auf Clozapin und Haloperidol differentiell anders ist als bei den ZNS-

Zelllinien CHME3 und BV2, die sich ebenfalls unterscheiden. Somit sind

wahrscheinlich nur Bezüge im Vergleich innerhalb eines Versuchssystems

aussagekräftig, um die Frage zur relativen Wirkung von Clozapin und Haloperidol

zu klären. Dennoch sind Vergleiche in anderen Zellsystemen natürlich

unabdingbar. Im Interesse des Anwenders sind hier sämtliche Zellen mit ZNS-

Ursprung einsetzbar. Andere Konzentrationen der eingesetzten Antipsychotika

Clozapin und Haloperidol sowie weitere medizinisch relevante Substanzen, die

ebenfalls stark von dem Interesse des Forschungsanwenders abhängen, sind

denkbar. Außerdem könnten Inkubationen ohne LPS sowie weitere

Diskussion

67

Konzentrationen von LPS getestet werden. Weitere Auswertungsmodalitäten, wie

z.B. Untersuchungen zur Proteinproduktion, zu Neurotransmittersystemen und zur

Zytokinproduktion in diesen und anderen Zellsystemen, könnten helfen,

Erkenntnisse zur Therapie psychiatrischer Erkrankungen zu mehren.

Die jüngsten Ereignisse zeigen zudem, wie wichtig adulte Stammzellquellen

sein können, die die Nutzung ethisch umstrittener embryonaler Stammzellen

ersetzen können. Der Nobelpreis für Medizin wurde im Jahr 2012 zwei Forschern,

dem Japaner Shinya Yamanaka und Briten John Gurdon, verliehen. John Gurdon

zeigte bereits 1962, dass die meisten Zellen des menschlichen Körpers ihre

Fähigkeit behalten, in einen funktionellen Zelltyp zu differenzieren (Gurdon 1962).

Erst 2006 gelang es Yamanaka, vier Transkriptionsfaktoren, nämlich Oct-3/4,

Sox2, c-Myc, und KLF4, ausfindig zu machen, die eine Bindegewebszelle in eine

unreife Stammzelle zurückverwandeln können. Die modifizierten

Bindegewebszellen werden dann als so genannte induzierte pluripotente

Stammzellen bezeichnet (Takahashi and Yamanaka 2006; Yamanaka 2007). Der

Einsatz solcher Zellen offenbart zwei große Arbeitsgebiete für die Medizin: Bei

degenerativen Krankheiten - wie Parkinson, Diabetes oder Herzinfarkt - sterben

Zellen im betroffenen Patienten ab. Da die Gewinnung induzierter pluripotenter

Stammzellen aus körpereigenen Reservoirs erfolgen kann, ist eine Abstoßung,

wie bei fremdartigen Zellen der Fall, nicht möglich. Die damit verbundenen

Möglichkeiten zur Gentherapie und Züchtung von Ersatzgeweben sind natürlich

vielfältig, aber - realistisch gesehen - weit in der Zukunft anzusiedeln. Außerdem

lassen sich induzierte pluripotente Stammzellen zum Aufbau von Testsystemen,

die unterschiedliche Organe repräsentieren, nutzen, um Wirkungen und

Nebenwirkungen von Medikamenten an menschlichen Zellen zu untersuchen.

Inwieweit die aus einer adulten Quelle gewonnenen neuronalen nasalen

Progenitoren für Forschungsgebiete mit Stammzellen hilfreich sein können, bleibt

zukünftig noch zu beweisen. Die Anbindung dieser Zellen an das ZNS und die

zusätzliche Möglichkeit der Untersuchung einer psychiatrischen Erkrankung

steigern aber die Wichtigkeit dieses Zelltyps enorm. Für die genannten

Untersuchungsmöglichkeiten konnte diese Arbeit den Grundstein an Zellen der

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln legen.

Zusammenfassung

68

5 Zusammenfassung

Die Pathologie psychiatrischer Erkrankungen weist ihren Ursprung im ZNS des

Menschen auf, weswegen die in vitro-Zellkulturforschung an zentralnervösen

Zellen von größter Bedeutung ist. Bereits im letzten Jahrhundert wurde die

Riechschleimhaut im Nasendach als Quelle für Stammzellen, neuronale

Progenitoren und Rezeptorneurone avisiert. Die Gewinnung dieses Zellmaterials

ist am lebenden Menschen durch invasive Chirurgie möglich, aber problematisch

und ethisch bedenklich. Unbedenklich hingegen ist die Gewinnung von Zellen aus

„oberen“ mittleren Nasenmuscheln, die aus Ethmoidektomien, z.B. bei obstruktiver

Nasenatmung, anfallen. Auch in diesem nasalen Segment sind Stammzellen,

neuronale Progenitoren und Rezeptorneurone vorhanden.

Diese Pilotstudie etablierte eine reproduzierbare Methode zur

Inkulturnahme und selektiven Anzucht von neuronalen Progenitorzellen aus

Ethmoidektomien für den Einsatz in der in vitro-Zellkultur, die international bis dato

noch nicht untersucht und standardisiert einsetzbar war. Da die interindividuelle

Vergleichbarkeit dieses Zellmaterials von größter Bedeutung war, testeten wir

sieben neurale Proteinmarker mittels Immunfluoreszenz. Dabei ermittelten wir für

drei Individuen ein homogenes neurales Protein-Expressionsmuster, das positiv

für Nestin, GFAP, Beta-III-Tubulin und Musashi war, während Map2, NeuN und

A2B5 nicht existent waren. Dieses Expressionsmuster legte uns die Identität einer

nasal gewonnenen neuronalen Progenitorzelle nahe. Ein erstes in vitro-

Zellkulturexperiment mit Clozapin und Haloperidol bei induzierter artifizieller

Entzündungsreaktion mittels LPS zeigte, dass die nasalen Progenitoren in solchen

Experimenten eingesetzt werden können. Die Ergebnisse ergaben für die

gewählten in vitro-Bedingungen im Vergleich mit den ZNS-Zelllinien BV2 und

CHME3, dass Clozapin eher antiapoptotisch und synthesefördernd, während

Haloperidol eher proapoptotisch und mitosefördernd wirkte. Dies war im Trend

auch für die Zelllinien der Fall, wobei sich das Ausmaß deutlich unterschied:

CHME3 zeigte bei weitem die größten Ausprägungen dieser Pilotstudie.

Diese Pilotstudie muss sich zukünftig durch weitere Individuen mit und ohne

psychiatrische Indikation und Zellcharakterisierungen auf Protein- und RNA-Ebene

beweisen. Dabei könnten diese Vergleiche Quelle neuen Wissens sein, die

mögliche Therapieformen psychiatrischer Erkrankungen aufdeckt, verbessert oder

neu entwickeln hilft.

Abkürzungsverzeichnis

69

6 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung % Prozent °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter

AC3 aktivierte Kaspase 3 DAPI 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure EGF Epidermal Growth Factor et al. und andere (et alies) FCS Fötales Kälberserum FGF Fibroblast Growth Factor

g Gramm GFAP Glial Fibrillary Acidic Protein ggf. gegebenenfalls

h Stunde HBSS Hank's Balances Salt Solution inkl. inklusive

l Liter LIF Leucemia Inhibitory Factor LPS Lipopolysaccharid

MAP2 Microtubule-Associated Protein 2 MCM6 Minichromosome Maintenance Deficient 6 Gene MEM Minimum Essentiell Medium mg Milligramm min Minute ml Milliliter

Mmol Millimolar NeuN Neuronal Nuclei PBS Phopshat Buffered Saline PVC Polyvinylchlorid PZ Primärzellen

RNA Ribonukleinsäure u.a. unter anderem vgl. vergleiche vs. versus

ZNS zentrales Nervensystem

Literaturverzeichnis

70

7 Literaturverzeichnis

Alcock, J., J. Lowe, et al. (2009). "Expression of Sox1, Sox2 and Sox9 is

maintained in adult human cerebellar cortex." Neurosci Lett 450(2): 114-6.

Andersson, P. B., V. H. Perry, et al. (1992). "The acute inflammatory response to

lipopolysaccharide in CNS parenchyma differs from that in other body

tissues." Neuroscience 48(1): 169-86.

Andres, M., V. M. Andre, et al. (2005). "Human cortical dysplasia and epilepsy: an

ontogenetic hypothesis based on volumetric MRI and NeuN neuronal

density and size measurements." Cereb Cortex 15(2): 194-210.

Ardizzone, T. D., X. H. Lu, et al. (2002). "Calcium-independent inhibition of

glucose transport in PC-12 and L6 cells by calcium channel antagonists."

Am J Physiol Cell Physiol 283(2): C579-86.

Asan, E. (2004). Geruchssystem. München, Elsevier.

Avellino, A. M., D. Hart, et al. (1995). "Differential macrophage responses in the

peripheral and central nervous system during wallerian degeneration of

axons." Exp Neurol 136(2): 183-98.

Bajpai, R., J. Lesperance, et al. (2008). "Efficient propagation of single cells

Accutase-dissociated human embryonic stem cells." Mol Reprod Dev 75(5):

818-27.

Banati, R. B., D. Hoppe, et al. (1991). "A subpopulation of bone marrow-derived

macrophage-like cells shares a unique ion channel pattern with microglia." J

Neurosci Res 30(4): 593-600.

Banati, R. B., G. Rothe, et al. (1991). "Respiratory burst activity in brain

macrophages: a flow cytometric study on cultured rat microglia."

Neuropathol Appl Neurobiol 17(3): 223-30.

Baracskay, K. L., G. J. Kidd, et al. (2007). "NG2-positive cells generate A2B5-

positive oligodendrocyte precursor cells." Glia 55(10): 1001-10.

Basta-Kaim, A., B. Budziszewska, et al. (2006). "Inhibitory effect of antipsychotic

drugs on the Con A- and LPS-induced proliferative activity of mouse

splenocytes: a possible mechanism of action." J Physiol Pharmacol 57(2):

247-64.


71

Battelli, C., G. N. Nikopoulos, et al. (2006). "The RNA-binding protein Musashi-1

regulates neural development through the translational repression of

p21WAF-1." Mol Cell Neurosci 31(1): 85-96.

Behl, C., R. Rupprecht, et al. (1995). Haloperidol-induced cell death--mechanism

and protection with vitamin E in vitro. Neuroreport. 7: 360-4.

Beites, C. L., S. Kawauchi, et al. (2005). "Identification and molecular regulation of

neural stem cells in the olfactory epithelium." Exp Cell Res 306(2): 309-16.

Belzunegui, S., A. Izal-Azcarate, et al. (2008). "Striatal carotid body graft promotes

differentiation of neural progenitor cells into neurons in the olfactory bulb of

adult hemiparkisonian rats." Brain Res 1217: 213-20.

Benraiss, A., E. Chmielnicki, et al. (2001). "Adenoviral brain-derived neurotrophic

factor induces both neostriatal and olfactory neuronal recruitment from

endogenous progenitor cells in the adult forebrain." J Neurosci 21(17):

6718-31.

Bhat, K. M., N. Maddodi, et al. (2006). "Transcriptional regulation of human MAP2

gene in melanoma: role of neuronal bHLH factors and Notch1 signaling."

Nucleic Acids Res 34(13): 3819-32.

Blasi, E., R. Barluzzi, et al. (1990). "Immortalization of murine microglial cells by a

v-raf/v-myc carrying retrovirus." J Neuroimmunol 27(2-3): 229-37.

Bolger, W. E., A. S. Keyes, et al. (1999). "Use of the superior meatus and superior

turbinate in the endoscopic approach to the sphenoid sinus." Otolaryngol

Head Neck Surg 120(3): 308-13.

Bottenstein, J. E., S. F. Hunter, et al. (1988). "CNS neuronal cell line-derived

factors regulate gliogenesis in neonatal rat brain cultures." J Neurosci Res

20(3): 291-303.

Brewer, G. J. (1997). "Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons." J

Neurosci Methods 71(2): 143-55.

Brewer, G. J., J. Espinosa, et al. (2001). "Culture and regeneration of human

neurons after brain surgery." J Neurosci Methods 107(1-2): 15-23.

Brewer, G. J., J. A. Espinosa, et al. (2003). "Effect of Neuregen nutrient medium

on survival of cortical neurons after aspiration lesion in rats." J Neurosurg

98(6): 1291-8.

Brewer, G. J. and P. J. Price (1996). "Viable cultured neurons in ambient carbon

dioxide and hibernation storage for a month." Neuroreport 7(9): 1509-12.


72

Brewer, G. J., J. R. Torricelli, et al. (1993). "Optimized survival of hippocampal

neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium

combination." J Neurosci Res 35(5): 567-76.

Brillaud, E., A. Piotrowski, et al. (2007). "Effect of an acute 900MHz GSM

exposure on glia in the rat brain: a time-dependent study." Toxicology

238(1): 23-33.

Buck, L. B. (2004). "Olfactory receptors and odor coding in mammals." Nutr Rev

62(11 Pt 2): S184-8; discussion S224-41.

Burgoyne, R. D., M. A. Cambray-Deakin, et al. (1988). "Differential distribution of

beta-tubulin isotypes in cerebellum." Embo J 7(8): 2311-9.

Bussolati, B., S. Bruno, et al. (2008). "Identification of a tumor-initiating stem cell

population in human renal carcinomas." Faseb J 22(10): 3696-705.

Caggiano, M., J. S. Kauer, et al. (1994). "Globose basal cells are neuronal

progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a

replication-incompetent retrovirus." Neuron 13(2): 339-52.

Calof, A. L. and D. M. Chikaraishi (1989). "Analysis of neurogenesis in a

mammalian neuroepithelium: proliferation and differentiation of an olfactory

neuron precursor in vitro." Neuron 3(1): 115-27.

Carr, V. M. and A. I. Farbman (1992). "Ablation of the olfactory bulb up-regulates

the rate of neurogenesis and induces precocious cell death in olfactory

epithelium." Exp Neurol 115(1): 55-9.

Carter, L. A., J. L. MacDonald, et al. (2004). "Olfactory horizontal basal cells

demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype." J Neurosci

24(25): 5670-83.

Chang, C. Y., H. F. Chien, et al. (2003). "Microglia in the olfactory bulb of rats

during postnatal development and olfactory nerve injury with zinc sulfate: a

lectin labeling and ultrastrucutural study." Neurosci Res 45(3): 325-33.

Chen, M., E. Muckersie, et al. (2008). "Characterization of a spontaneous mouse

retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07." Invest Ophthalmol Vis Sci

49(8): 3699-706.

Collombet, J. M., C. Masqueliez, et al. (2006). "Early reduction of NeuN

antigenicity induced by soman poisoning in mice can be used to predict

delayed neuronal degeneration in the hippocampus." Neurosci Lett 398(3):

337-42.


73

Cristofanilli, M., S. Thanos, et al. (2004). "Neuronal MAP2 mRNA: species-

dependent differential dendritic targeting competence." J Mol Biol 341(4):

927-34.

Cuadrado, A., L. F. Garcia-Fernandez, et al. (2002). "Regulation of tau RNA

maturation by thyroid hormone is mediated by the neural RNA-binding

protein musashi-1." Mol Cell Neurosci 20(2): 198-210.

Dai, C. and S. B. Krantz (1999). "Interferon gamma induces upregulation and

activation of caspases 1, 3, and 8 to produce apoptosis in human erythroid

progenitor cells." Blood 93(10): 3309-16.

Derelanko (2001). Handbook of Toxicology Informa Healthcare.

Dietrich, J., M. Noble, et al. (2002). "Characterization of A2B5+ glial precursor

cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells." Glia 40(1): 65-

77.

Doyle, K. L., M. Khan, et al. (2001). "Expression of the intermediate filament

protein nestin by sustentacular cells in mature olfactory neuroepithelium." J

Comp Neurol 437(2): 186-95.

Dubois-Dalcq, M. and R. Armstrong (1990). "The cellular and molecular events of

central nervous system remyelination." Bioessays 12(12): 569-76.

Dwyer, D. S., X. H. Lu, et al. (2003). "Cytotoxicity of conventional and atypical

antipsychotic drugs in relation to glucose metabolism." Brain Res 971(1):

31-9.

Emery, B., T. D. Merson, et al. (2006). "SOCS3 negatively regulates LIF signaling

in neural precursor cells." Mol Cell Neurosci 31(4): 739-47.

Erceg, S., S. Lainez, et al. (2008). "Differentiation of human embryonic stem cells

to regional specific neural precursors in chemically defined medium

conditions." PLoS ONE 3(5): e2122.

Farah, C. A., D. Liazoghli, et al. (2005). "Interaction of microtubule-associated

protein-2 and p63: a new link between microtubules and rough endoplasmic

reticulum membranes in neurons." J Biol Chem 280(10): 9439-49.

Fehsel, K., S. Loeffler, et al. (2005). "Clozapine induces oxidative stress and

proapoptotic gene expression in neutrophils of schizophrenic patients." J

Clin Psychopharmacol 25(5): 419-26.


74

Feron, F., C. Perry, et al. (1998). "New techniques for biopsy and culture of human

olfactory epithelial neurons." Arch Otolaryngol Head Neck Surg 124(8): 861-

6.

Fifre, A., I. Sponne, et al. (2006). "Microtubule-associated protein MAP1A,

MAP1B, and MAP2 proteolysis during soluble amyloid beta-peptide-induced

neuronal apoptosis. Synergistic involvement of calpain and caspase-3." J

Biol Chem 281(1): 229-40.

Fioroni, P. (1992). Allgemeine und vergleichende Embryologie der Tiere Springer-

Lehrbuch.

Fuchs, E. and K. Weber (1994). "Intermediate filaments: structure, dynamics,

function, and disease." Annu Rev Biochem 63: 345-82.

Galili, R., Mosberg, et al. (2000). "Haloperidol-induced neurotoxicity--possible

implications for tardive dyskinesia." J Neural Transm 107(4): 479-90.

Gardner, I., N. Zahid, et al. (1998). "A comparison of the oxidation of clozapine

and olanzapine to reactive metabolites and the toxicity of these metabolites

to human leukocytes." Mol Pharmacol 53(6): 991-8.

Gilg, A. G., S. L. Tye, et al. (2008). "Targeting hyaluronan interactions in malignant

gliomas and their drug-resistant multipotent progenitors." Clin Cancer Res

14(6): 1804-13.

Glass, R., M. Synowitz, et al. (2005). "Glioblastoma-induced attraction of

endogenous neural precursor cells is associated with improved survival." J

Neurosci 25(10): 2637-46.

Golaz, J. L., N. Vonlaufen, et al. (2007). "Establishment and characterization of a

primary canine duodenal epithelial cell culture." In Vitro Cell Dev Biol Anim

43(5-6): 176-85.

Goldberg, M. P. and D. W. Choi (1993). "Combined oxygen and glucose

deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-

independent mechanisms of neuronal injury." J Neurosci 13(8): 3510-24.

Gonzalez, S. L., J. J. Lopez-Costa, et al. (2009). "Progesterone effects on

neuronal ultrastructure and expression of microtubule-associated protein 2

(MAP2) in rats with acute spinal cord injury." Cell Mol Neurobiol 29(1): 27-

39.


75

Good, P., A. Yoda, et al. (1998). "The human Musashi homolog 1 (MSI1) gene

encoding the homologue of Musashi/Nrp-1, a neural RNA-binding protein

putatively expressed in CNS stem cells and neural progenitor cells."

Genomics 52(3): 382-4.

Graziadei, P. P. and G. A. Graziadei (1979). "Neurogenesis and neuron

regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects

of differentiation and structural organization of the olfactory sensory

neurons." J Neurocytol 8(1): 1-18.

Greven, H. (2004). Spezielle Zoologie: Fortpflanzung und Entwicklung. München,

Spektrum.

Grimm, I., N. Messemer, et al. (2009). "Coordinate pathways for nucleotide and

EGF signaling in cultured adult neural progenitor cells." J Cell Sci 122(Pt

14): 2524-33.

Gromada, J., C. Bark, et al. (2005). "Neuronal calcium sensor-1 potentiates

glucose-dependent exocytosis in pancreatic beta cells through activation of

phosphatidylinositol 4-kinase beta." Proc Natl Acad Sci U S A 102(29):

10303-8.

Guller, S., D. L. Allen, et al. (1992). "Growth hormone and fibronectin expression in

3T3 preadipose cells." Endocrinology 130(5): 2609-16.

Gurdon, J. B. (1962). "Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells."

Dev Biol 4: 256-73.

Gurdon, J. B. (1962). "The developmental capacity of nuclei taken from intestinal

epithelium cells of feeding tadpoles." J Embryol Exp Morphol 10: 622-40.

Gurdon, J. B. (1962). "Multiple genetically identical frogs." J Hered 53: 5-9.

Gurdon, J. B. (1962). "The transplantation of nuclei between two species of

Xenopus." Dev Biol 5: 68-83.

Hahn, C. G., L. Y. Han, et al. (2005). "In vivo and in vitro neurogenesis in human

olfactory epithelium." J Comp Neurol 483(2): 154-63.

Halim, N. D., C. S. Weickert, et al. (2004). "Effects of chronic haloperidol and

clozapine treatment on neurogenesis in the adult rat hippocampus."

Neuropsychopharmacology 29(6): 1063-9.

Har-El, G. and R. M. Swanson (2001). "The superior turbinectomy approach to

isolated sphenoid sinus disease and to the sella turcica." Am J Rhinol 15(2):

149-56.


76

Head, B. P., H. H. Patel, et al. (2008). "Caveolin-1 expression is essential for N-

methyl-D-aspartate receptor-mediated Src and extracellular signal-

regulated kinase 1/2 activation and protection of primary neurons from

ischemic cell death." Faseb J 22(3): 828-40.

Heidebrecht, H. J., F. Buck, et al. (2001). "Ki-Mcm6, a new monoclonal antibody

specific to Mcm6: comparison of the distribution profile of Mcm6 and the Ki-

67 antigen." Lab Invest 81(8): 1163-5.

Heiser, P., F. Enning, et al. (2007). "Effects of haloperidol, clozapine and

olanzapine on the survival of human neuronal and immune cells in vitro." J

Psychopharmacol 21(8): 851-6.

Herbst, R. S. (2004). "Review of epidermal growth factor receptor biology." Int J

Radiat Oncol Biol Phys 59(2 Suppl): 21-6.

Hick, C. H. A. (2006). Intensivkurs Physiologie, Elsevier.

Hinds, J. W., P. L. Hinds, et al. (1984). "An autoradiographic study of the mouse

olfactory epithelium: evidence for long-lived receptors." Anat Rec 210(2):

375-83.

Hinds, J. W. and N. A. McNelly (1981). "Aging in the rat olfactory system:

correlation of changes in the olfactory epithelium and olfactory bulb." J

Comp Neurol 203(3): 441-53.

Hinze-Selch, D., E. W. Becker, et al. (1998). "Effects of clozapine on in vitro

immune parameters: a longitudinal study in clozapine-treated schizophrenic

patients." Neuropsychopharmacology 19(2): 114-22.

Hinze-Selch, D. and T. Pollmacher (2001). "In vitro cytokine secretion in

individuals with schizophrenia: results, confounding factors, and

implications for further research." Brain Behav Immun 15(4): 282-318.

Hosoi, T., S. Suzuki, et al. (2005). "LPS induces stefin A3 expression in mouse

primary cultured glial cells." Brain Res Mol Brain Res 140(1-2): 138-41.

Hou, Y., C. F. Wu, et al. (2006). "Effects of clozapine, olanzapine and haloperidol

on nitric oxide production by lipopolysaccharide-activated N9 cells." Prog

Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 30(8): 1523-8.

Hulspas, R., C. Tiarks, et al. (1997). "In vitro cell density-dependent clonal growth

of EGF-responsive murine neural progenitor cells under serum-free

conditions." Exp Neurol 148(1): 147-56.


77

Iwanaga, S., K. Suzuki, et al. (1978). "Bovine plasma cold-insoluble globulin: gross

structure and function." Ann N Y Acad Sci 312: 56-73.

J. F. Loring, P. H. S. u. R. L. W. (2007). Human Stem Cell Manual: A Laboratory

Guide. Amsterdam, Elsevier.

Jahnsen, F. L., E. Gran, et al. (2004). "Human nasal mucosa contains antigen-

presenting cells of strikingly different functional phenotypes." Am J Respir

Cell Mol Biol 30(1): 31-7.

Janabi, N., S. Peudenier, et al. (1995). "Establishment of human microglial cell

lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with

the SV40 large T antigen." Neurosci Lett 195(2): 105-8.

Jarskog, L. F., J. H. Gilmore, et al. (2007). "Caspase-3 activation in rat frontal

cortex following treatment with typical and atypical antipsychotics."

Neuropsychopharmacology 32(1): 95-102.

Jiang, F. X., B. Yurke, et al. (2008). "Neurite outgrowth on a DNA crosslinked

hydrogel with tunable stiffnesses." Ann Biomed Eng 36(9): 1565-79.

Johansson, S., J. Price, et al. (2008). "Effect of inflammatory cytokines on major

histocompatibility complex expression and differentiation of human neural

stem/progenitor cells." Stem Cells 26(9): 2444-54.

Johnston, L. C., X. Su, et al. (2008). "Human interleukin-10 gene transfer is

protective in a rat model of Parkinson's disease." Mol Ther 16(8): 1392-9.

Koch, J. M., S. Kell, et al. (2003). "Differential effects of fluoxetine and imipramine

on the phosphorylation of the transcription factor CREB and cell-viability." J

Psychiatr Res 37(1): 53-9.

Koch, J. M., S. Kell, et al. (2002). "Changes in CREB-phosphorylation during

recovery from major depression." J Psychiatr Res 36(6): 369-75.

Koh, S. H., K. S. Kim, et al. (2008). "Implantation of human umbilical cord-derived

mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in

rats." Brain Res 1229: 233-48.

Kurihara, Y., T. Nagata, et al. (1997). "Structural properties and RNA-binding

activities of two RNA recognition motifs of a mouse neural RNA-binding

protein, mouse-Musashi-1." Gene 186(1): 21-7.

Lacroix, S., D. Feinstein, et al. (1998). "The bacterial endotoxin lipopolysaccharide

has the ability to target the brain in upregulating its membrane CD14

receptor within specific cellular populations." Brain Pathol 8(4): 625-40.


78

Lang, J., S. Bressel, et al. (1988). "[The sphenoid sinus, clinical anatomy of

approaches to the pituitary region]." Gegenbaurs Morphol Jahrb 134(3):

291-307.

Lavoie, J. N., C. Champagne, et al. (2000). "Adenovirus E4 open reading frame 4-

induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases." J Cell Biol

150(5): 1037-56.

Lee, D. C., Y. C. Hsu, et al. (2009). "Isolation of neural stem/progenitor cells by

using EGF/FGF1 and FGF1B promoter-driven green fluorescence from

embryonic and adult mouse brains." Mol Cell Neurosci 41(3): 348-63.

Leone, C., G. Le Pavec, et al. (2006). "Characterization of human monocyte-

derived microglia-like cells." Glia 54(3): 183-92.

Leung, C. T., P. A. Coulombe, et al. (2007). "Contribution of olfactory neural stem

cells to tissue maintenance and regeneration." Nat Neurosci 10(6): 720-6.

Lieb, K., S. Engels, et al. (2003). "Inhibition of LPS-induced iNOS and NO

synthesis in primary rat microglial cells." Neurochem Int 42(2): 131-7.

Liem, R. K., S. H. Yen, et al. (1978). "Intermediate filaments in nervous tissues." J

Cell Biol 79(3): 637-45.

Lim, R. W. and S. Halpain (2000). "Regulated association of microtubule-

associated protein 2 (MAP2) with Src and Grb2: evidence for MAP2 as a

scaffolding protein." J Biol Chem 275(27): 20578-87.

Lind, D., S. Franken, et al. (2005). "Characterization of the neuronal marker NeuN

as a multiply phosphorylated antigen with discrete subcellular localization."

J Neurosci Res 79(3): 295-302.

Liu, S. Y., Y. T. Chen, et al. (2008). "Involvement of microtubule-associated protein

2 (MAP2) in oral cancer cell motility: a novel biological function of MAP2 in

non-neuronal cells." Biochem Biophys Res Commun 366(2): 520-5.

Mackay-Sim, A. and P. W. Kittel (1991). "On the Life Span of Olfactory Receptor

Neurons." Eur J Neurosci 3(3): 209-215.

Marshall, C. T., Z. Guo, et al. (2005). "Human adult olfactory neuroepithelial

derived progenitors retain telomerase activity and lack apoptotic activity."

Brain Res 1045(1-2): 45-56.


79

Mayo, L. and R. Stein (2007). "Characterization of LPS and interferon-gamma

triggered activation-induced cell death in N9 and primary microglial cells:

induction of the mitochondrial gateway by nitric oxide." Cell Death Differ

14(1): 183-6.

McCann, M. J., J. P. O'Callaghan, et al. (1996). "Differential activation of microglia

and astrocytes following trimethyl tin-induced neurodegeneration."

Neuroscience 72(1): 273-81.

Mensah-Brown, E. P. and L. J. Garey (2006). "The superior colliculus of the camel:

a neuronal-specific nuclear protein (NeuN) and neuropeptide study." J Anat

208(2): 239-50.

Merck (1989). The Merck Index.

Michalczyk, K. and M. Ziman (2005). "Nestin structure and predicted function in

cellular cytoskeletal organisation." Histol Histopathol 20(2): 665-71.

Minambres, E., M. A. Ballesteros, et al. (2008). "Cerebral apoptosis in severe

traumatic brain injury patients: an in vitro, in vivo, and postmortem study." J

Neurotrauma 25(6): 581-91.

Moran, D. T., B. W. Jafek, et al. (1992). "Ultrastructural histopathology of human

olfactory dysfunction." Microsc Res Tech 23(2): 103-10.

Moran, D. T., J. C. Rowley, 3rd, et al. (1982). "The fine structure of the olfactory

mucosa in man." J Neurocytol 11(5): 721-46.

Mullen, R. J., C. R. Buck, et al. (1992). "NeuN, a neuronal specific nuclear protein

in vertebrates." Development 116(1): 201-11.

Muller, F. J., L. C. Laurent, et al. (2008). "Regulatory networks define phenotypic

classes of human stem cell lines." Nature 455(7211): 401-5.

Mumm, J. S., J. Shou, et al. (1996). "Colony-forming progenitors from mouse

olfactory epithelium: evidence for feedback regulation of neuron

production." Proc Natl Acad Sci U S A 93(20): 11167-72.

Murrell, W., G. R. Bushell, et al. (1996). "Neurogenesis in adult human."

Neuroreport 7(6): 1189-94.

Murrell, W., F. Feron, et al. (2005). "Multipotent stem cells from adult olfactory

mucosa." Dev Dyn 233(2): 496-515.

Murrell, W., A. Wetzig, et al. (2008). "Olfactory mucosa is a potential source for

autologous stem cell therapy for Parkinson's disease." Stem Cells 26(8):

2183-92.


80

Nakamura, M., H. Okano, et al. (1994). "Musashi, a neural RNA-binding protein

required for Drosophila adult external sensory organ development." Neuron

13(1): 67-81.

Nelson, A. D. and C. N. Svendsen (2006). "Low concentrations of extracellular

FGF-2 are sufficient but not essential for neurogenesis from human neural

progenitor cells." Mol Cell Neurosci 33(1): 29-35.

Niu, J., F. Mei, et al. (2010). "Haloperidol promotes proliferation but inhibits

differentiation in rat oligodendrocyte progenitor cell cultures." Biochem Cell

Biol 88(4): 611-20.

O'Hare, M. J., N. Kushwaha, et al. (2005). "Differential roles of nuclear and

cytoplasmic cyclin-dependent kinase 5 in apoptotic and excitotoxic neuronal

death." J Neurosci 25(39): 8954-66.

Ogden, A. T., A. E. Waziri, et al. (2008). "Identification of A2B5+CD133- tumor-

initiating cells in adult human gliomas." Neurosurgery 62(2): 505-14;

discussion 514-5.

Orlandi, R. R., D. C. Lanza, et al. (1999). "The forgotten turbinate: the role of the

superior turbinate in endoscopic sinus surgery." Am J Rhinol 13(4): 251-9.

Ornitz, D. M. and N. Itoh (2001). "Fibroblast growth factors." Genome Biol 2(3):

REVIEWS3005.

Oshima, K., D. T. Teo, et al. (2007). "LIF promotes neurogenesis and maintains

neural precursors in cell populations derived from spiral ganglion stem

cells." BMC Dev Biol 7: 112.

Othman, M., C. Lu, et al. (2005). "Clonal analysis of adult human olfactory

neurosphere forming cells." Biotech Histochem 80(5-6): 189-200.

Pagano, S. F., F. Impagnatiello, et al. (2000). "Isolation and characterization of

neural stem cells from the adult human olfactory bulb." Stem Cells 18(4):

295-300.

Paik, S. I., M. N. Lehman, et al. (1992). "Human olfactory biopsy. The influence of

age and receptor distribution." Arch Otolaryngol Head Neck Surg 118(7):

731-8.

Paintlia, M. K., A. S. Paintlia, et al. (2008). "Modulation of peroxisome proliferator-

activated receptor-alpha activity by N-acetyl cysteine attenuates inhibition of

oligodendrocyte development in lipopolysaccharide stimulated mixed glial

cultures." J Neurochem 105(3): 956-70.


81

Penalva, M. A., J. Tilburn, et al. (2008). "Ambient pH gene regulation in fungi:

making connections." Trends Microbiol 16(6): 291-300.

Perry, C., A. Mackay-Sim, et al. (2002). "Olfactory neural cells: an untapped

diagnostic and therapeutic resource. The 2000 Ogura Lecture."

Laryngoscope 112(4): 603-7.

Pitman, M., B. Emery, et al. (2004). "LIF receptor signaling modulates neural stem

cell renewal." Mol Cell Neurosci 27(3): 255-66.

Plesnila, N., S. Zinkel, et al. (2001). "BID mediates neuronal cell death after

oxygen/ glucose deprivation and focal cerebral ischemia." Proc Natl Acad

Sci U S A 98(26): 15318-23.

Pollmann, M., R. Parwaresch, et al. (2006). "Human EML4, a novel member of the

EMAP family, is essential for microtubule formation." Exp Cell Res 312(17):

3241-51.

Prabakaran, S., J. E. Swatton, et al. (2004). "Mitochondrial dysfunction in

schizophrenia: evidence for compromised brain metabolism and oxidative

stress." Mol Psychiatry 9(7): 684-97, 643.

Qing, H., H. Xu, et al. (2003). "The ability of atypical antipsychotic drugs vs.

haloperidol to protect PC12 cells against MPP+-induced apoptosis." Eur J

Neurosci 17(8): 1563-70.

Quinones-Hinojosa, A., N. Sanai, et al. (2006). "Cellular composition and

cytoarchitecture of the adult human subventricular zone: a niche of neural

stem cells." J Comp Neurol 494(3): 415-34.

Ramon-Cueto, A., J. Perez, et al. (1993). "In vitro enfolding of olfactory neurites by

p75 NGF receptor positive ensheathing cells from adult rat olfactory bulb."

Eur J Neurosci 5(9): 1172-80.

Reeves, S. A., L. J. Helman, et al. (1989). "Molecular cloning and primary structure

of human glial fibrillary acidic protein." Proc Natl Acad Sci U S A 86(13):

5178-82.

Reynolds, B. A. and S. Weiss (1992). "Generation of neurons and astrocytes from

isolated cells of the adult mammalian central nervous system." Science

255(5052): 1707-10.

Rivest, S., S. Lacroix, et al. (2000). "How the blood talks to the brain parenchyma

and the paraventricular nucleus of the hypothalamus during systemic

inflammatory and infectious stimuli." Proc Soc Exp Biol Med 223(1): 22-38.


82

Roisen, F. J., K. M. Klueber, et al. (2001). "Adult human olfactory stem cells."

Brain Res 890(1): 11-22.

Roy, N. S., S. Wang, et al. (1999). "Identification, isolation, and promoter-defined

separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human

subcortical white matter." J Neurosci 19(22): 9986-95.

Rudolph, P., P. Alm, et al. (1999). "Immunologic proliferation marker Ki-S2 as

prognostic indicator for lymph node-negative breast cancer." J Natl Cancer

Inst 91(3): 271-8.

Sakakibara, S., T. Imai, et al. (1996). "Mouse-Musashi-1, a neural RNA-binding

protein highly enriched in the mammalian CNS stem cell." Dev Biol 176(2):

230-42.

Sanchez, C., J. Diaz-Nido, et al. (2000). "Phosphorylation of microtubule-

associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the

neuronal cytoskeleton function." Prog Neurobiol 61(2): 133-68.

Sarnat, H. B., D. Nochlin, et al. (1998). "Neuronal nuclear antigen (NeuN): a

marker of neuronal maturation in early human fetal nervous system." Brain

Dev 20(2): 88-94.

Schmitt, A., S. Weber, et al. (2004). "Hippocampal volume and cell proliferation

after acute and chronic clozapine or haloperidol treatment." J Neural

Transm 111(1): 91-100.

Schwartz Levey, M., D. M. Chikaraishi, et al. (1991). "Characterization of potential

precursor populations in the mouse olfactory epithelium using

immunocytochemistry and autoradiography." J Neurosci 11(11): 3556-64.

Schwartz, P. H., P. J. Bryant, et al. (2003). "Isolation and characterization of neural

progenitor cells from post-mortem human cortex." J Neurosci Res 74(6):

838-51.

Schwob, J. E., N. B. Farber, et al. (1986). "Neurons of the olfactory epithelium in

adult rats contain vimentin." J Neurosci 6(1): 208-17.

Scolding, N. J., P. J. Rayner, et al. (1999). "Identification of A2B5-positive putative

oligodendrocyte progenitor cells and A2B5-positive astrocytes in adult

human white matter." Neuroscience 89(1): 1-4.

Serra-Perez, A., E. Verdaguer, et al. (2008). "Glucose promotes caspase-

dependent delayed cell death after a transient episode of oxygen and

glucose deprivation in SH-SY5Y cells." J Neurochem 106(3): 1237-47.


83

Shaw, R. J., A. I. McClatchey, et al. (1998). "Regulation of the neurofibromatosis

type 2 tumor suppressor protein, merlin, by adhesion and growth arrest

stimuli." J Biol Chem 273(13): 7757-64.

Shin, S., M. Mitalipova, et al. (2006). "Long-term proliferation of human embryonic

stem cell-derived neuroepithelial cells using defined adherent culture

conditions." Stem Cells 24(1): 125-38.

Shostak, A., V. Wajsbrot, et al. (2000). "High glucose accelerates the life cycle of

the in vivo exposed mesothelium." Kidney Int 58(5): 2044-52.

Shuangshoti, S., S. Mujananon, et al. (2005). "Expression of neuronal nuclear

antigen (NeuN) in epithelial neuroendocrine carcinoma." Appl

Immunohistochem Mol Morphol 13(3): 265-7.

Silberberg, S. D., T. C. Poder, et al. (1989). "Endothelin increases single-channel

calcium currents in coronary arterial smooth muscle cells." FEBS Lett

247(1): 68-72.

Skoblenick, K. J., J. M. Castellano, et al. (2006). "Translocation of AIF in the

human and rat striatum following protracted haloperidol, but not clozapine

treatment." Apoptosis 11(5): 663-72.

Smith, J. R., L. Vallier, et al. (2008). "Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes

specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm." Dev Biol

313(1): 107-17.

Stern, K. and M. K. McClintock (1998). "Regulation of ovulation by human

pheromones." Nature 392(6672): 177-9.

Strojnik, T., G. V. Rosland, et al. (2007). "Neural stem cell markers, nestin and

musashi proteins, in the progression of human glioma: correlation of nestin

with prognosis of patient survival." Surg Neurol 68(2): 133-43; discussion

143-4.

Sugino, H., T. Futamura, et al. (2009). "Atypical antipsychotics suppress

production of proinflammatory cytokines and up-regulate interleukin-10 in

lipopolysaccharide-treated mice." Prog Neuropsychopharmacol Biol

Psychiatry 33(2): 303-7.

Szuster-Ciesielska, A., M. Slotwinska, et al. (2004). "Neuroleptics modulate

cytokine and reactive oxygen species production in blood leukocytes of

healthy volunteers." Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 52(1): 59-67.


84

Takahashi, K. and S. Yamanaka (2006). "Induction of pluripotent stem cells from

mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." Cell

126(4): 663-76.

Tchoghandjian, A., N. Baeza, et al. (2009). "A2B5 Cells from Human Glioblastoma

have Cancer Stem Cell Properties." Brain Pathol.

Teng, J., Y. Takei, et al. (2001). "Synergistic effects of MAP2 and MAP1B

knockout in neuronal migration, dendritic outgrowth, and microtubule

organization." J Cell Biol 155(1): 65-76.

Theodorou, E., G. Dalembert, et al. (2009). "A high throughput embryonic stem

cell screen identifies Oct-2 as a bifunctional regulator of neuronal

differentiation." Genes Dev 23(5): 575-88.

Tkachev, D., M. L. Mimmack, et al. (2007). "Further evidence for altered myelin

biosynthesis and glutamatergic dysfunction in schizophrenia." Int J

Neuropsychopharmacol 10(4): 557-63.

Tohyama, T., V. M. Lee, et al. (1992). "Nestin expression in embryonic human

neuroepithelium and in human neuroepithelial tumor cells." Lab Invest

66(3): 303-13.

Tureyen, K., R. Vemuganti, et al. (2005). "EGF and FGF-2 infusion increases post-

ischemic neural progenitor cell proliferation in the adult rat brain."

Neurosurgery 57(6): 1254-63; discussion 1254-63.

Unal-Cevik, I., M. Kilinc, et al. (2004). "Loss of NeuN immunoreactivity after

cerebral ischemia does not indicate neuronal cell loss: a cautionary note."

Brain Res 1015(1-2): 169-74.

Van Nassauw, L., M. Wu, et al. (2005). "Cytoplasmic, but not nuclear, expression

of the neuronal nuclei (NeuN) antibody is an exclusive feature of Dogiel

type II neurons in the guinea-pig gastrointestinal tract." Histochem Cell Biol

124(5): 369-77.

Wachs, F. P., S. Couillard-Despres, et al. (2003). "High efficacy of clonal growth

and expansion of adult neural stem cells." Lab Invest 83(7): 949-62.

Walker, P. S., J. A. Donovan, et al. (1988). "Glucose-dependent regulation of

glucose transport activity, protein, and mRNA in primary cultures of rat brain

glial cells." J Biol Chem 263(30): 15594-601.


85

Walton, N. M., B. M. Sutter, et al. (2006). "Derivation and large-scale expansion of

multipotent astroglial neural progenitors from adult human brain."

Development 133(18): 3671-81.

Weible, M. W., 2nd and T. Chan-Ling (2007). "Phenotypic characterization of

neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and

BMP4 to generate astrocytes." Glia 55(11): 1156-68.

Weikert, C., M. Eppenberger-Eberhardt, et al. (2003). "Cellular engineering of

ventricular adult rat cardiomyocytes." Cardiovasc Res 59(4): 874-82.

Weismann, M., I. Yousry, et al. (2001). "Functional magnetic resonance imaging of

human olfaction." Neuroimaging Clin N Am 11(2): 237-50, viii.

Winkler, C., R. A. Fricker, et al. (1998). "Incorporation and glial differentiation of

mouse EGF-responsive neural progenitor cells after transplantation into the

embryonic rat brain." Mol Cell Neurosci 11(3): 99-116.

Winstead, W., C. T. Marshall, et al. (2005). "Endoscopic biopsy of human olfactory

epithelium as a source of progenitor cells." Am J Rhinol 19(1): 83-90.

Witt, M. and W. Wozniak (2006). "Structure and function of the vomeronasal

organ." Adv Otorhinolaryngol 63: 70-83.

Xia, C. L., Z. W. Du, et al. (2003). "A2B5 lineages of human astrocytic tumors and

their recurrence." Int J Oncol 23(2): 353-61.

Xue, T., L. Qiao, et al. (2008). "Proliferation, multipotency and neuronal

differentiation of cryopreserved neural progenitor cells derived from the

olfactory neuroepithelium of the adult rat." Cell Biol Int 32(8): 950-8.

Xue, T., L. Wei, et al. (2009). "Effect of cryopreservation on proliferative features of

neural progenitor cells derived from olfactory bulb of embryonic rat." Int J

Pediatr Otorhinolaryngol 73(7): 969-73.

Yamanaka, S. (2007). "Strategies and new developments in the generation of

patient-specific pluripotent stem cells." Cell Stem Cell 1(1): 39-49.

Yoneda, T., A. Sasaki, et al. (1997). "Inhibition of osteolytic bone metastasis of

breast cancer by combined treatment with the bisphosphonate ibandronate

and tissue inhibitor of the matrix metalloproteinase-2." J Clin Invest 99(10):

2509-17.

Zhang, X., J. Cai, et al. (2005). "Induction of oligodendrocytes from adult human

olfactory epithelial-derived progenitors by transcription factors." Stem Cells

23(3): 442-53.


86

Zhang, X., K. M. Klueber, et al. (2004). "Adult human olfactory neural progenitors

cultured in defined medium." Exp Neurol 186(2): 112-23.

Anhang

87

7 Anhang

7.1 Immunfluoreszenznachweise

Abbildung 10: IF-Färbungen der neuronalen nasalen Progenitoren des Individuums PZ Pat 1 zu

Beginn der ersten Kulturpassage mit LPS-Stimulierung und DAPI-Zellkernfärbung.






Kernfärbung voneinander unterscheiden zu können

Anhang

88








können.

Anhang

89







Anhang

90


Beginn der ersten Kulturpassage ohne LPS-Stimulierung und mit DAPI-Zellkernfärbung.







Anhang

91








können.

Anhang

92







Anhang

93









Anhang

94








können.

Anhang

95







Anhang

96

7.2 Daten der Zellzählungen

Tabelle 6:

Ermittelte Zellzahlen der nasal gewonnenen neuronalen Progenitoren PZ Pat 1 bei Inkubation mit

0,1 µg/ml Clozapin/DMSO und 0,02 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.

Verum 24h 48h Kontrolle 24h 48h Ratio* 24h 48h Ki-S2** 12 16 S2 19 16 S2 0,6 1,0 MCM6** 12 13 MCM6 12 9 MCM6 1,0 1,4 Ki-Mit** 9 7 Mit 19 11 Mit 0,5 0,6 AC3** 5 3 AC3 5 4 AC3 1,0 0,8

Tabelle 7:

Ermittelte Zellzahlen der nasal gewonnenen neuronalen Progenitoren PZ Pat 1 bei Inkubation mit 1

µg/ml Clozapin/DMSO und 0,02 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.


Tabelle 8:


0,02 µg/ml Haloperidol und 0,02 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.


Tabelle 9:


0,2 µg/ml Haloperidol und 0,02 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.


*Die Quantifizierung der Zellzählung von Verum zu Kontrolle bildet das Ratio-Verhältnis.

**Ki-S2, MCM6 und Ki-Mit sind die nachgewiesenen Zellzyklusmarker und AC3, aktivierte Kaspase

3, ein Marker für Apoptose.

Anhang

97

Tabelle 10:

Ermittelte Zellzahlen der humanen mikroglialen ZNS-Zelllinie CHME3 bei Inkubation mit 0,1 µg/ml

Clozapin/DMSO und 0,2 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.


Tabelle 11:

Ermittelte Zellzahlen der humanen mikroglialen ZNS-Zelllinie CHME3 bei Inkubation mit 1 µg/ml



Tabelle 12:


Haloperidol und 0,2 µg/ml LPS nach 24 und 48 h.

Verum 24h 48h Referenz 24h 48h Ratio* 24h 48h Ki-S2** 9 4 S2 32 28 S2 0,3 0,1 MCM6** 4 34 MCM6 28 44 MCM6 0,1 0,8 Ki-Mit** 2 9 Mit 3 2 Mit 0,7 4,5 AC3** 1 14 AC3 1 3 AC3 1,0 4,7

Tabelle 13:



Verum 24h 48h Referenz 24h 48h Ratio* 24h 48h Ki-S2** 13 1 S2 1 5 S2 13,0 0,2 MCM6** 84 54 MCM6 47 91 MCM6 1,8 0,6 Ki-Mit** 14 1 Mit 2 5 Mit 7,0 0,2 AC3** 8 14 AC3 1 2 AC3 8,0 7,0


**Ki-S2, MCM6 und Ki-Mit sind die nachgewiesenen Zellzyklusmarker und AC3, aktivierte Kaspase

3, ein Marker für Apoptose.

Anhang

98

Tabelle 14:

Ermittelte Zellzahlen der murinen mikroglialen ZNS-Zelllinie BV2 bei Inkubation mit 0,1 µg/ml


Verum 24h 48h Kontrolle 24h 48h Ratio* 24h 48h MCM6** 64 54 MCM6 54 74 MCM6 1,2 0,7 AC3** 38 41 AC3 48 63 AC3 0,8 0,7

Tabelle 15:

Ermittelte Zellzahlen der murinen mikroglialen ZNS-Zelllinie BV2 bei Inkubation mit 1 µg/ml


BV2 24h 48h Kontrolle 24h 48h Ratio* 24h 48h MCM6** 76 79 MCM6 70 46 MCM6 1,1 1,7 AC3** 41 66 AC3 53 75 AC3 0,8 0,9

Tabelle 16:



BV2 24h 48h Referenz 24h 48h Ratio* 24h 48h MCM6** 47 33 MCM6 45 43 MCM6 1,0 0,8 AC3** 36 38 AC3 34 42 AC3 1,1 0,9

Tabelle 17:



BV2 24h 48h Referenz 24h 48h Ratio* 24h 48h MCM6** 66 46 MCM6 45 43 MCM6 1,5 1,1 AC3** 39 38 AC3 34 42 AC3 1,1 0,9


**MCM6 ist der nachgewiesene Zellzyklusmarker und AC3, aktivierte Kaspase 3, ein Marker für

Apoptose.

Danksagung

Danksagung

Besonders danken möchte ich PD‘in Dr. med. Dunja Hinze-Selch, die es mir

ermöglichte, im Rahmen des SFB654 „Plastizität und Schlaf“ diese Arbeit im

„Zentrum für integrative Psychiatrie“ in Kiel durchzuführen. Für anerkennenswert

erachte ich auch, dass Frau Dunja Hinze-Selch mich während der Anfertigung der

Dissertation fortwährend bestärkte, protegierte und unterstützte.

Dank bekunden möchte ich insbesondere auch meinem Doktorvater Prof. Dr.

Jürgen Westermann aus Lübeck, der so entgegenkommend war, sich für meine

externe Dissertation an der Universität zu Lübeck einzusetzen und diese zu

befürworten. Er stand mir stets mit Ratschlägen konstruktiv zur Seite.

Herrn Prof. Dr. med. Josef Aldenhoff bin ich insofern zu besonderem Dank

verpflichtet, als dass er mir meinen Arbeitsplatz an der ZIP gGmbH in Kiel

bereitstellte. Des Weiteren bleibt anerkennend zu vermerken, dass er mir die

Benutzung aller Geräte und Verbrauchsmaterialien im Rahmen dieses Projekts

ermöglichte.

Letztendlich bin ich meiner Familie - insbesondere meiner Lebensgefährtin Ragna

und meiner Tochter Lioba - dankbar dafür, dass sie mir während meiner

Dissertation kontinuierlich ermutigend zur Seite stand.

Lebenslauf

Andreas Jeske

► geboren am 13.07.1976 in Greifswald

Heidmühlenweg 33

25336 Elmshorn

E-Mail: [email protected]

Schulbildung

Bis 1991 55. POS Peter Stucka, Rostock

1991 - 1992 Thomas Morus Gymnasium, Rostock

1992 - 1996 Gymnasium Bismarckschule, Elmshorn

Studium

1998 – 2003 ► absolviert an der Hochschule für angewandte Wissenschaften

Hamburg im Studiengang Biotechnologie mit Kreditierung Mikro- und

Molekularbiologie zum Dipl. Ing. (FH) Biotechnologie

► Titel der Diplomarbeit: „Die Stromazelle des Riesenzelltumors des

Knochens (homo sapiens) – Identifizierung von Riesenzelltumor-Entitäten durch

erste Genexpressionsanalyse mit Hilfe mesenchymaler und hämatopoetischer

Marker“

Berufliche Praxis

2004 – 2010 ► angestellt in der ZIP gGmbH Kiel im zellbiologischen Labor

2010 – 2012 ► angestellt in der Atto-Lab GmbH Lübeck im Labor für

Proteinanalytik

Promotion

2007 – 2013 ► Promotion über die medizinische Fakultät zu Lübeck

► Beginn der Studie nach positivem Ethikvotum am 18.03.2008

Documents

Isolierung und in vitro-Kultivierung von undifferenzierten ... · Nervenimpuls zum Bulbus olfactorius, wird die Grenze von peripherem zu zentralem olfaktorischen System überschritten