Arch. expor. Path. u. PharmakoL, Bd. 210, S. 393--398 (1950).

Aus der NIedizinischen Klinik Kie].

Kinetik der II~imiglobinbildung. IV. Mitteilung*.

Die Hiimiglobinbildung durch Phenylhydroxylamin und Nitrosobenzol in roten Zellen in vitro.

Von ~ANFRED KIESE~ DANKWART REINWEIN und HANs°DIERCK WALLER.

Mit 5 Text~bbildungen.

(Eingegangen am 21. Januar 1950.)

In zellfreien LSsungen reagiert phenylhydroxylamin mit H~moglobin nur einmal unter Bildung etwa eines ~quivalentes tt~miglobin je Mol Phenylhydroxy]amin. Nitrosobenzol bildet unter gleichen Bedingungen

f

I .kein Z~tsotz 0 ZO 40 60 80 rain 700

t ...-...

Abb. 1. H~imiglobinbildung in roten Zellen dutch Phenylhydroxylamin und Sauerstoff. H b = 10-~.~q./1; Phenylhydroxylamin = 10 -41~Iol/1. Hundezellen in Karbonat-RzNOER-Li~sung

unter Sauerstoff m i t 5% CO~. pH = 7,4 Temp. 37 ° C.

mit H~moglobin Nitrosobenzol-Hi~m~globin, das ziemlich best~ndig ist. Werden rote Zellen vom Plasma getrennt, nach Verg~run8 des ihnen noch verfiigbaren Substrates gewaschen und dann mit Phenylhydroxyl- amin oder Nitrosobenzol versetzt, so reagieren beide ebenfalls nur einmal in gleicher Weise wie in LSsungen. Wird jedoch solchen Zellen Glukose gegeben, so beginnt eine Reihe yon Reaktionen, in 4enen jede Molekel Phenylhydroxylamin un4 Nitrosobenzol ebenso wie in vivo eine Vielzahl yon ~quiv~lenten H~miglobin bildet (Abb. 1). Phenylhydroxylamin und

* I I I . Mitt. siehe Arch. exper. Path. u. Pharmako]. 210~ 305 (1950).

394 MANFRED KIESE, DANKWART REINWEIlV U. I'~ANs-DIERCK WALLER:

N i t r o s o b e n z o l s i n d d a n n g l e i ch w i r k s a m . L a k t a t u n d M a l a t v e r m S g e n

die R e a k t i o n e n , d ie zu r m e h r i ~ c h e n ~ e a k t i o n des P h e n y l h y d r o x y l a m i n s

e r f o r d e r l i c h s ind , n u t u n v o l l k o m m e n in G a n g zu b r i n g e n . W i r h a b e n d e n

A b l ~ u f d i e se s V o r g a n g s g e m e s s e n .

1. Versuche. a) Methoden.

Die Messungen wurden an roten Zellen yore Rinde, Hunde und Menschen durchgefiibrt. Nach niehrmaligem Waschen mi t isotoner ~Natriumch]oridl6sung auf der Zentrifuge wurden in einer Versuchsreihe die Zel]en in eirmr Phosphat-RI~OER- LSsuDg yore PH 6,8, bzw. 7,0 suspendiert (4 Teile karbonatfreie RINGER-LSsung -t- 1 Toil isotone Phosphatl6sung) und in einem Kolben im Wasserbad yon 37 ° langsam geschiit~e]t. Die Zellkonzentrat ion wurde so eingestellt, dab die Gesamt- b iut farbs toffkonzentra t ion der Suspensionen etwa 17 g/100 ml betrug. Ober die Zellsuspensionen wurde Luft geleitet, die bei 37 ° C mi t Wasserdampf gesiittigt war. In einer anderil Versuchsreihe wurden die Zellen ill Bikarbonat-RI~G~l~-L6sung (0,6 g NaCI, 0,02 KCL, 0,03 CaC12, 0,01 MgCI~, 0,2 NaHCO a je 100 ml) suspendiert und mit einem Gemisch yon Sauerstoff mi t 5~o CO 2 im Gleichgewicht geha]ten. Das PH dieser L6sungen betrug 7,4. Glukose wurcle den Zelien in einer Konzen- t ra t ion yon 0,2 gl l00 m] zugegeben. Vor und in best immtell Zeitabst~inden nach dem Zusatz yon Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol wurden Proben ent- nommen zur Best immung des Gehaltes an Hamiglobin und Gesamtblutfarbstoff mi t der Zy~nidmethode ~ oder der Kohlenoxydmethode 2.

b) Ergebnisse.

N a c h Z u g a b e y o n P h e n y l h y d r o x y l a m i n o d e r N i t r o s o b e n z o l in K o n -

z c n t r a t i o n e n , d ie 1/100 o b i s 1/10 d e r H i ~ m o g l o b i n k o n z e n t r a t i o n d e r Zel l-

s u s p e n s i o n e n b e t r u g e n , b e g a n n s o f o r t d ie H ~ m i g l o b i n b i l d u n g . I h r e A n -

f a n g s g e s c h w i n d i g k e i t w a r v o n d e r K o n z e n t r a t i o n des P h e n y l h y d r o x y l a -

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Mol. Phenylh#o'foxyl~,min b~ ~osoben~l,/ I,

Abb. 2. Anfangsgeschwindigkeit der H~traiglobinbildung (g RbIiI/100 ml/min) in roten Zellen in Abhiingigkeit yon der Phenylhydroxylamin- bzw. Nitrosobenzolkonzentration. HundezeUen in Karbonat-Ri~loER-LSsung unter Sauerstoff mit 5% CO~. H~moglobingehalt der Suspensionen 17 g/100 nil. pit -- 7,4. Temp. 37 o C. Abszisse und Ordinate logarif0hmisch geteilt. I)ie einzelnen

Marken sind Mittel aus mehreren Versuchen. × × × Phenylhydroxylamin, ooo Nitrosobenzol.

K i n e t i k d e r H i m i g l o b i n b i l d u n g . I V . 395

mins bzw. Nitrosobenzols abhingig. Die Beziehungen zwischen Anfangs- geschwindigkeit und Konzentration des Phenylhydroxylamins sind in Abb. 2 dargestellt. Aus ihr ergibt sieh, dab die Geschwindigkeit der H~miglobinbildung in Zellsuspensionen in Gegem~'art yon Glukose c °.~ proportional ist (c ~ Mole Phenylhydroxylamin oder Nitrosobenzol/1).

7,0

/ iLL

) z o, e s s ~ f s z s4~ s 8 7 0 -~ o, J ~ er '8~0- ~, 3 ¢ ~ 8 , ~ -z

Mol. Phenldhl~dPoxylamin b~ #~sbenzoll/t

Abb. 3. Maximal erreichte H~miglobinkonzentrat ion in roten Zellen in Abh~ngigkei t yon der Phenyl - hydroxylaminkonzentra t ion. Kurve A : × × × Phenylhydroxylaminwirkung auf :Rinder- und Hunde- zellen in Phosphat-RINGER-LSsung pH = 6,8 unter Luft . ~-t--t- Phenylhydroxylamin, ooo Nitro- sobenzol, Mensehenzellen in Phosphat-RTNoER-L6sung pH = 7,0. Kurve /~: × × X Phenylhydroxyl - amin, ooo :Nitrosobenzol. Hundezellen in Karbonat-RTN0:ER-LSsung unter O~ m i t 5% CO2 PH = 7,4. Die Ziffern neben den Marken geben die Zahl der Messungen an, links neben der Marke: :Nitro- sobenzol, rechts neben der Marke Phenylhydroxylamin. Temp. 370 C. I n align Ans~ttzen 200 m g

Glukose]100 nil.

7,0

~s

t

~ 5 6

1

8 70 ZO 30 ~ 60 ~g~O 2 = rain

Abb. 4. Ann~iherung der H~imiglobinkonzentration in roten Zellen an ihren HSehstwert unter Ein- wirkung versehiedener :Nitrosobenzolkonzentrationen. Hundezellen in Karbonat-RINOER-LSsung unter Sauerstoff m i t 5% COs PH = 7,4. Temp. 370 C. Kurve A : 3 × 1 0 -b Mol Nitrosobenzol/L

/~: 1,2 × 10 -~ Mol :Nitrosobenzol/1; C: 1,2 × 10 -3 :lYIol :Nitrosobenzol/l.

Logari thmisch geteilte Abszisse: Zeit in Minuten.

Hbt~ x

Ordinate: - - - Hb m

m a x

Hb ~I~ = Hb m - Konzentrat ion zur Zeit t, Hb m = maximal erreichte Hbm-Konzent ra t lon° t max

396 MANFRED KIESE, DANKWART REINWEII~ 11. HANs-DIEI~CK ~¢VALLER:

I m einzelnen Ansatz nahm die H~miglobinkonzentration nicht pro- portional der Zeit zu bis das gesamte Hiimoglobin oxydiert war, sondern tier Anstieg der H~miglobinkonzentration klang mit der Zeit ab, noch bevor das gesamte H~moglobin oxydiert war. Die maximal erreichte H~miglobinkonzentration war yon der einwirkenden Phenylhydroxyl- amin- bzw. Nitrosobenzolkonzentration abh~ngig in der in Abb. 3 dar- gestellten Weise. 'Die beiden Kurven (B mehr als A) entsprechen for- mal etwa Massenwirkungsgleichgewichten. Die in den Kurven A und B ausgewerteten Versuchsgruppen unterscheiden sich in der Wasserstoff- ionenkonzentration und dem Sauerstoffdruck in den Zellsuspensionen. In den Ans~tzen der Gruppe A war die Wasserstoffionenkonzentration pg ---- 6,8 bzw. 7,0 und der Sauerstoffdruck 150 Torr, in den Ans~tzen der Gruppe B die Wasserstoffionenkonzentration p H - - 7 , 4 und der Sauerstoffdruck 680 Torr. Kontrollversuche ergaben, da6 diesen Fak- toren die Unterschiede der Hi~miglobinkonzentration zuzuschreiben sind, weniger der Tierart, der die roten Zellen entnommen wurden. Die An- n~herung der H~miglobinkonzentration an den bei einer best immten Phenylhydroxy]amin- oder Nitrosobenzolkonzentration erreiehten t tSchstwert erfolgte, nachdem die Reaktion 10 min gelaufen war, linear mi t dem Logarithmus der Zeit, vorher etwas schneller (Abb. 4).

2. Besprechung. Die Versuche zeigen, dai~ die im Tier beobachtete Oxydation vieler

_~quivalente yon H~moglobin zu Hiimiglobin bezogen auf eine Molekel Phenylhydroxylamin durch Beteiligung enzymatischer Reaktionen in den roten Zellen ermSglicht wird, welehe die Energie zur Unterhaltung eines Kreisprozesses aus dem Abbau yon Glukose gewinnen. Wie im Tier bildet auch Nitrosobenzol in roten Zellen, denen Glukose verftigbar ist, mi t gleicher Geschwindigkeit und in gleiehem Ausma[~e wie Phenyl- hydroxylamin H~miglobin. Werden aus der maximalen ErhShung der I-I~miglobinkonzentration - - ohne Beriicksichtigung der in den bis dahin verstreichenden 1--2 Std reduzierten H~miglobinmengen - - die yon jeder Phenylhydroxylaminmolekel im Mittel umgesetzten Aquivalente H~moglobin berechnet, so ergeben sieh ffir niedrige Phenylhydroxyl- aminkonzentrat ionen Zahlen yon mehreren Hunder t , wie in vivo 3. Ffir die h5chsten untersuehten Konzentrationen von Phenylhydroxylamin (10 -3 Mol/1) sind diese Zahlen naturgem~6 klein, da bei einer H~mo- globinkonzentration yon 10-~Aquivalent je Liter fiir jede Molekel Phenyl- hydroxylamin iiberhaupt nur 10~quivalente Hi~moglobin vorhanden sind.

Aus der Geschwindigkeit der Hi~miglobinbildung ist die Wechselzah] des Phenylhydroxylamins zu errechnen, die angibt, wie oft eine Molekel Phenylhydroxylamin in der roten Zelle im Mittel je Minute zu Nitroso- benzol oxydiert und wieder zu Phenylhydroxylamin reduziert wird.

Kine$ik der ~amiglobinbildung. IV 397

Fiir die niedrigsten Phenylhydroxylaminkonzentrat ionen (3 X 10-°Mol/1) ergeben sich Zahlen yon etwa 6. Mit steigender Phenylhydroxylamin- konzentration wird die Wechselzahl kleiner und betr/~gt bei einer Kon- zentration yon 10 -~ ~ol /1 nur noch 1--2.

Die beschriebenen Beziehungen zwischen Phenylhydroxylamin- bzw. Nitro- sobenzolkonzentration und der Geschwindigkeit der H/~miglobinbildung sowie der maximal erreichten H~miglobinkonzentration sollen sparer erSrtert werden, wenn in weiteren Mitteilungen die einzelnen an dem Kreisprozelt beteiligten Reaktionen beschrieben worden sind.

Es sei hier lediglich noch untersucht, wie weir die Geschwindigkeit der H~miglobinbildung in roten Zellen in Gegenwart yon Glukose der in vivo beobaehteten entspricht. Dazu vergleichen wir die nach intravenSser Injektion yon Phenylhydroxylamin maximal erreichte H~miglobin-

, ~I 1 I IIIIII I

l ~ I I I I I ] I I I i ~ . - ~ . ~ 4o~ " l l l l l . . ; ' r ,~ n,9~l I ] I I L.H~"- I I " ~ " I I J . 2 ~ T I I I ~o4L_. -~ 'q l l l l l l I I

10 "~ Z z/ 6' 810 -~ Z

lllIll I I IIIIII I I]I]I I~ I IIIIII

I I:L LIJl l I I ] t l l . - ~ . . ~ I r ; I t l l I I I I L I f . d " I [ I I I I l l

' i i i i i i ~ " ~ IIitl I IIIIIII It11] I I r l l l l l II]11 I IIIIII III]l I I IIII]1

0~810 -~ Z 4~ 6 8 , ~ Mol. PhenylhfdPoxflom/n/t

Abb. 5. Maximale H~miglobinkonzentration im Blute yon Hunden (nach Daten yon KI~sv, u n d SO~STBV.V.R s) (Kurve A) und bis zum gleichen Zeitpunkt erreichte HRmiglobinkonzentration in roten Zcl len in v i t ro (Kurvc B) in AbhRngigkeit yon dcr Phenylhydroxylaminkonzentration. Abszisse

und Ordinate logarithmisch getcilt.

konzentration mit der Konzentration, die in vitro in diesem Zei tpunkt erreicht ist. Die Phenylhydroxylaminkonzentrat ion im Blute des Tieres wurde errechnet unter der Annahme, dal3 Phenylhydroxylamin aus- schliel31ich im Blute vorhanden ist 3. Das ist sicher nicht ganz richtig, doch wird durch die Bildung yon Nitrosobenzolh~moglobin ein verhKlt- nism/~Big groBer Teil des Phenylhydroxylamins im Blute gehalten. In Abb. 5 sind die so gewonnenen Werte aufgezeiehnet. Die Daten fiir die H/~miglobinbildung in vivo wurden den Messungen yon KI]~S~ und SOET- B~ER 3 entnommen. Die Abbildung zeigt eine auff~llige ~bere ins t immung der H~miglobinbildung in vi tro uncl in vivo, die wohl zuf~llig ist, da wir die Phenylhydroxylaminkonzentrat ion in vivo sicher zu hoch ange- nommen haben und die Kurve der HKmiglobinkonzentrationen im Hunde etwas welter im Bereich niederer Phenylhydroxylaminkonzentrat ionen gelegen sein muB. Immerhin entsprechen die Abh~ngigkeit der H/~- miglobinkonzentration yon der Phenylhydroxylaminkonzentrat ion

Arch. exper. Path. u. Pharmakol,, Bd. 210. 27

398 M. KIESE, D. REINWEn~ u. tt.-D. WALLER: Kinetik der Hi~miglobinbildung.

e inander , und die yon uns in v i t ro beobaeh te t e Geschwindigkei t der H~tmiglobinbi ldung is t s icher n ich t viel ger inger als die in vivo.

Zusammen/assung. I n gewaschenen und an S u b s t r a t v e r a r m t e n ro ten Zellen reag ie r t

P h e n y l h y d r o x y l a m i n nu r e inmal mi t H~moglobin und Sauers to f f un t e r Bi ldung eines J (quivalentes H~miglobin . Nach Zusatz yon Glukose l~ui t die H~mig lob inb i ldung weiter , und es wi rd eine Vielzahl yon Aquiva - l en ten Hi~moglobin yon P h e n y ] h y d r o x y l a m i n oxydie r t .

I n ro ten Zellen, denen Glukose verff igbar ist, b i ldet Ni t rosobenzol mi t gleicher Geschwindigkei t u~d in gle ichem Ausmal]e H~miglobin wie P h e n y l h y d r o x y l a m i n .

Die Abh~,ngigkeit der Geschwindigkei t und des Ausmal3es der H~mi- g lob inb i ldung yon der P h e n y l h y d r o x y l a m i n - bzw. Ni t rosobenzolkonzen- t r a t i o n wird beschrieben.

L i t e r a t u r .

1 HAVEMAN~, R., F. JVNG, U. B. V. ISSEKUTZ JUN. : Biochem. Z. 801, 116 (1939). _ _ 2 KI~SE, M. : Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 204, 190 (1947). - - a KIEsE, M., u. M. SOETBEER: Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 207, 426 (1949).