Aus dem Universit~tsinstitut ffir Lebensmittelchemie, Frankfurt a. M.

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. Der Einflul~ auf die Peroxydase (KartoffelpreBsaft).

6. Mitteflung 1.

Von W. DIEMAIR und K. BOEKHOFF.

Mit 4 Textabbildungen.

(Eingegangen am 22. April 1953.)

Die Peroxydase ist im Pfianzen- und Tierreich sehr welt verbreitet. Im TierkSrper ist sie besonders in den Leukocyten enthalten, ferner in den Lymphdrfisen, in der Milz und im Knochenmark. Als Sauerstoff- lieferant kommt ffir sie in der lebenden Zelle nur das Wasserstoffperoxyd in Frage. Organische Peroxyde, auch Pers~uren k6nnen verwertet wer- den, kommen aber in der Zelle nicht vor. Die Peroxydasewirkung er- streckt sich im wesentlichen auf aromatische Stoffe, aus denen durch Dehydrierung Chinone gebfldet werden kSnnen; der dabei mobflisierte Wasserstoff wird auf den Sauerstoff fibertragen. Zum Unterschied gegen- fiber der Katalase l~I~t also die Peroxydase den Sauerstoff gar nicht erst frei werden, sondern verwendet ihn sofort zur Oxydation.

Die Peroxydase ist ~hnlich wie die Katalase ein tt~minderivat, und zwar ist ihre wirksame Gruppe anscheinend ebenfalls mit dem Blut- hamin identisch; ihr p~-Optimum ]iegt etwa zwischen 5--6.

I m folgenden sollte der EinfluB der kfinstlichen Farbstoffe auf die Wirkung der Peroxydase untersucht werden. Zur Peroxydasebestim- mung existieren zahlreiche Methoden. Die Purpurogallinmethode 2, die Malachitgrfinmethode a, die Jodmethode nach R. KVHN u. L. Bl~VN ~ und andere Methoden yon A. I~. B ~ L s ~, M. F. J~YLE 6, W. B. DAvis 7, H. G. DF~aX s und A. p v ~ 9 . Orientierende Vorversuche ergaben, dab die Methode nach W. DIEMAI~ u. H. Hs 1~ ffir die vorliegenden Zwecke am geeignetsten war. Die Eigenfarbe der Farbstoffe wirkt bier durch ihre J~therunl6slichkeit am wenigsten st6rend.

Aus/i~hrung. In einen 100 ml fassenden Scheidetrichter, der bei 50 ml eine Marke tragt, werden 4 ml 0,05%ige AscorbinsaurelSsung gegeben, die in 100 ml 1 ml einer 20~ Essigsaurel6sung enthalt. Dazu wird zur Pufferung 0,5 ml ge- sattigte Natriumacetatl6sung geffigt und die AscorbinsaurelSsung mit 0,001 n 2,6-DichlorphenolindophenollSsung bis zum Auftreten des mausgrauen Farbtons titrier~. Dazu gibt man die gleichfalls bis zum Auftreten des schmutziggrauen Farb- tons mit 2,6-DichlorphenolindophenollSsung austitrierte PeroxydaselSsung, fiillt bis zur 50 ml-Marke mit destilliertem Wasser auf und versetzt die LSsung nach

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentre~ktionen. 6. Mittlg. 353

Tabelle 1. Eichtabelle ]i~r die 0,001 n 2,6-DichlorphenolindophenollSsung.

2, 6-Dichlorphenol- indophenol 0,001 n K

m l

1 2 3 4 5 6 8

10 12

d D in in cm %

2 63,0 1 62,5 1 48,5 1 37,2 1 29,6 0,50 48,7 0,50 38,0 0,25 55,0 0,25 48,7

0,101 0,205 0,314 0,430 0,529 0,630 0,840 1,041 1,248

d Schichtdicke; D Lichtdurchl/~ssigkeit; K Extinktionskoeffizient.

krgftigem Umschwenken mit 2ml 0,5~iger Wasserstoffperoxydl6sung. Nach 30 see wird das Reaktionsgemisch mit 50 ml saurem Ather, der in 100 ml 0,1 ml 20~oige Essigsi~ure enthi~lt, iiberschichtet and ~aeh weiteren 7 see krs dureh- geschtittelt, bis der ges~mte Farbstoff im Ather gelSst ist. Die ~therische Farbstoff- 15sung wird in ein 50 ml fassendes MeB- k61behen gebracht und hier auI 50 ml er- g/~nzt. Die Messung wird im PVLr~Ic~- S,2 Photometer mit Filter S 53 vorgenommen. Aus der beobachteten Extinktion wird auf eine noch n~her besehriebene Weise 1,5 die Peroxydase~ktivit/~t erreehnet. Als VergleiohslSsung dient eine reine J~ther- o,~ 15sung, die mit Essigs~ure versetzt ist.

2~estlegung der Eichkurve. Zun~chst war die Festlegung einer Eichkurve und o,5 einer Eiehtabelle ffir die 2,6-Dichlorphe- nolindophenollSsung notwendig. Zu die- o,r sere Zweck wurden jeweils 50 ml mit doppelt destflliertem Wasser hergestellte ~2 Farbl5sungen verschiedener Konzentra- tionen mit 50 ml essigsaurem Ather aus- gesehiittelt und mit Filter S 53 im PULF- RIc~-Photometer gemessen. Die gefunde- nen Werte sind Mittelwerte mehrerer Be- stimmungen und aus der Tab. 1 u. Abb. 1 zu ersehen.

l

!

i

L / /

S I i i i I r

2 ~ 6 8 70 /2 0, 001 ~ 2, 6 - O / ~ ' h l o r f h e n o l i n d o p h e n o l l b Y u n , , u

Abb. 1. E i c h k u r v e ffir 0,001 n 2,6-Diehlor- phenol indophenol l5sung.

Die E ichkurve u n d -tabelle beweisen die Giil t igkeit des LAMBERT- B n s n s c h e n Gesetzes ffir reine 2,6-Dichlorphenolindophenol]Ssungen.

Die Bestimmung des Peroxydasegehaltes eines verdi~nnten Kartof/elpre/3sa/tes.

Fiir die folgenden U n t e r s u c h u n g e n wurde als Ferment lSsu~g ein ver- df innter Kartoffelprel3saft verwendet . Zu dessen t t e r s te l lung werden 10 g gewaschene, gesch~lte Kar toffe ln auf einer Glusreibe gerieben, mi t

Z. anal . Chem. , ]3d. 139. 23

354 W. DIEMAII~ und K. BO]~KHOFF:

Tabelle 2. Der Peroxydasegehalt des Karto//etpre[38a/tes.

~:artoffel- d D ~ /~a p reBsaf t K

in cm in % in ml in ml

0,5 1 2 3

90 49 68 43 30

0,020 0,103 0,168 0,362 0,523

0,20 1,05 1,60 3,50 5,05

0,85 1,40 3,30 4,85

d Schichtdicke; D Lichtdurchl~tssigkeit; K Extinktionskoeffizient; F neu- gebfldete Farbstoffmenge in ml 0,001 n 2,6 Dichlorphenolindopheno]lOsung; _Fa Blindversuch = Farbstoffzahl = Mall fiir die absolute loeroxydatische Wirksam- keit.

ungef~hr 60 ml Wasser in ein KSlbchen gesch]~mmt, 1 Std lang unter 5fterem Umschiit teln extrahiert und dann zentrifugiert. Nach dem Fil-

trieren ffigt man ges~ttigte lqatriumacetat-

/ / J

5

~3

~ 2

'///r 0

1 2 3 /(uP/ofPe l2eeRscrf/ /n m L

Abb. 2. Peroxydasegehalt des ver- dfinnten XartoffelpreBsaftes.

lSsung hinzu und ti tr iert die LSsung mit 2,6-DiehlorphenolindotohenollSsnng bis zum Anftreten des mausgrauen l%rbtons. Je tz t wird auf 100 ml aufgeffillt und die L6sung unter Eis-Kochsalzkfihlung aufbewahrt .

Der Peroxydasegehalt dieser Kartoffel- preBsaftl5sung wurde nach obiger Vorschrift best immt. Der Versuch wurde bei p~ = 6 durchgefiilu't, da bier eine maximale Farb- stoffbildung stattfindet. Die Werte sind in Tab. 2 und Abb. 2 festgehalten.

Aus Tab. 2 und Abb. 2 ist zu ersehen, dab die Best immmung zur Prii- lung der Peroxydasewirksamkeit im Kartoffelprel~saft geeignet ist.

Der Ein]lu[3 der Farbsto/]e au] Peroxydase (Karto]]elprel3sait).

Bei der Durchffihrung der Best immung kamen die Azo-, die hereto- cycl~schen Chinon-, die Triphenylmethanfarbstoffe und Nigrosin in w~l~- riger LSsung zur Anwendung. Der Einflul3 der fettlSslichen Farbstoffe Buttergelb und Ceresorange konnte wegen ihrer ~therlSslichkeit nicht untersucht werden. Als Versuchsanordnung diente die oben beschriebene Methode nach W. DI]~NAIR u. H. t tXvssE~ n. Die FarbstofflSsung wurde zu der austi tr ierten Ascorbins~urelSsung hinzugegeben und dann die PeroxydaselSsung hinzugeffigt, lkTach Auffiillen auf 50 ml mit desti]]ier- tern Wasser wurde wie iiblich weiter behandelt. Als Ferment]5sung wur- den 3 m] des wie oben angegeben hergestellten KartoffelpreBsaftes ver- wendet, der jeden Tag frisch hergestellt werden muBte, weft die L6sung nicht hal tbar war.

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. 6. Mittlg. 355

Fiir den Fall , dab sich vielleicht noch geringe Mengen Farbs tof f im Ather ]6sen k6nn ten , muBte neben der eigent l ichen Versuehsreihe stets

t i n Leerversuch un t e r den g]eichen Bed ingungen mit denselben Farb- s toffmengen ]aufen, aber ohne Zusatz yon Enzym. Die Versuehe wurden wieder bei pE = 6 durchgeffihrt.

Zum besseren Verg]eich wurden die Wer te in Prozente umgerechnet , da die peroxydat isehe W i r k u n g der Kartoffelpregs~fte immer etwas schwankt.

Die sich ergebenden Werte sind Mittelwerte ans 3 Bestimmungen und in den Tab. 3 und 4 festgehalten.

Tabelle 3. Der Einflufi der Azo/arbsto/]e au] die Peroxydase.

m g Farb- H e m m u n g Farbs to f f s toff in K in

50 ml Prozent

Blindversuch ohne Farb- stoff . . . . . . . . .

Bordeaux R . . . . . . . Brillantschwarz . . . . . Cochenillerot A . . . . . Echtgelb extra. . : . . . Echtrot E . . . . . . . . Gelb 27175 . . . . . . .

Blindversueh ohne Farb- stoff . . . . . . . . .

Naphthalrot S . . . . . . Orange GG conc . . . . . . Orange SXX . . . . . . Ponceau 6 ~ . . . . . . . Tartrazin XX . . . . . . Thiazinbraun t~ . . . . .

0,535 30 0,535 30 0,528 30 0,538 30 0,535 30 0,530 30 0,535

0,666 30 0,666 30 0,670 30 0,675 30 0,670 30 0,666 30 0,666

K Extinktionskoeffizient; F ausgeschiedene stoffzahl in ml.

F /~a in in ml ml

5,15 4,95 5,15 4,95 5,10 4,90 5,20 5,00 5,]5 4,95 5,10 4,90 5,15 4,95

6,40 6,20 6,40 6,20 6,42 6,22 6,50 6,30 6,42 6,22 6,40 6,20 6,40 6,20

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

Farbstoffmenge in ml; Fa Farb-

Ans diesen exper imente l len Befunden geht hervor, dab bei Rhod- amin B u n d Rhodulinorange NO bei steigender Farbs to f fkonzen t ra t ion eine H e m m u n g der Peroxydasereak t ion zu beobaeh ten ist, w~hrend sgmtliche anderen Farbstoffe ke inen EinfluB ausiiben. Die prozentuale g e m m u n g dieser be iden Farbstoffe ist in Abb. 3 wiedergegeben. Rhod- amin B h e m m t ab 2 mg in der angewand ten Versuehsanordnung ent- sprechend 40 mg/l u n d Rhodulinorange 250 ab 3 rag, entsprechend 60 rag/1. Dies k o m m t etwa der Fa rbs to f fkonzen t ra t ion gleich, die zur F ~ r b u n g yon Lebensmi t t e ln angewendet wird.

Erythrosin u n d Rhodulinorange NO zeigen eine erh6hte Ex t ink t ion , die, wie der Bl indversuch zeigt, dureh eine geringe LSs]ichkeit des Farb- stoffes in Xther verursaeht wird.

23*

356 W. DIEi'CIAIB und K. BO]~KHOFF:

Tabelle 4. Der Ein/lu[3 der heterocyclischen Chinon., der Triphenylmethan/arbsto/]e und des Nigrosin8 au] die Peroxydase.

m g F a r b - /~ i r a H e m m u n g F a r b s t o f f scoff in K i n i n i n

50 m l m l m l Y r o z e n t

Blindversuch ohne Farb- stoff

EryChrosin . . . . . . .

Blindversuch ohne Farb- scoff . . . . . . . . .

gbod~min B . . . . . . .

ghodulinorange ~ 0 . . .

, , , , - . .

Blindversuch ohne Farb- scoff . . . . . . . . .

Lichtgrfin SF . . . . . . Patentblau AE . . . . . . ~Nigrosin . . . . . . . .

l0 2O

1 2 5 8 0

0,666 0,740 0,841

0,646 0,646 0,541 0,402 0,301 0,311 0,646 0,629 0,561 0,520

0,786 0,780 0,780 0,786

K ExCinkCionskoeffizient; F ausgeschiedene stoffz~hl in ml.

6,40 7,10 8,00

6,20 6,20 5,20 3,85 2,90 3,00 6,20 6,00 5,40 5,00

7,52 7,50 7,50 7,52

6,20 6,30 6,20

6,00 6,00 5,00 3,65 2,70 2,40 6,00 4,90 3,95 3,00

7,32 7,30 7,30 7,32

Farbstoffmenge

0 0

0 16 39 55 60 0

18 34 50

0 0 0

in ml; _Fa Farb-

Der Einflu[3 der redulctiven Spaltsti~cke und Komponenten au/ Peroxydase.

W e n n auch die Fa rbs to f f e als solche zum grSl~ten Tell n ich t hemmen, so l ieg t doch der V e r d a c h t nahe, dal~ die e inze lnen Komponen~en, aus denen die Fa rb s to f f e zusammengese t z t s ind, u n d die be i der r eduk- t i v e n S p a l t u n g im Organ i smus en t s t e he nde n Amine die P e r o x y d a s e hemmen .

Aus d iesem Grunde wurden einzelne K o m p o n e n t e n und Spal t s t f icke der Fa rb s to f f e au f ihre inh ib ie rende W i r k u n g un te r such t .

Die Ver suchsano rdnung war die beschr iebene. Die Subs t anzen k a m e n in w~Griger oder a lkohol i seher L5sung versch iedener K o n z e n t r a t i o n e n zur Anwendung . Die Ergebn i s se s ind Mi~telwerte yon 3 B e s t i m m u n g e n und in den Tab. 5 u n d 6 fes tgehal ten .

Die Tab . 5 zeigt, dab be im Zusa tz y o n Dimethyl-p.phenylendiamin, welches be i der r e d u k t i v e n S p a l t u n g yon Bu t t e rge lb en t s t eh t , e ine ge- r ingere F a r b s t o f f b i l d u n g s ta t t f inde t . Dies brauch~ nich~ u n b e d i n g t als eine t I e m m u n g des F e r m e n t s gedeu te t zu werden, sondern is t wahr- scheinl ich d u t c h die K o n k u r r e n z des D i m e t h y l - p - p h e n y l e n d i a m i n s zu er- kl~tren, das ja auch als S u b s t r a t ffir dig P e r o x y d a s e Verwendung finder.

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreakt ionen. 6. Mittlg. 357

Tabelle 5. Der Einflu[3 der Spaltsti~clce auf die Peroxydase.

Hemmung Spaltstiicke der ~arbs~offe mg in K in

50 ml Prozent

Blindversuch . . . . . . Anilin . . . . . . . . . Dimethyl-p-phenylen-

d i a m h a . . . . . . . . Dimethyl-p-phenylen-

diamin . . . . . . . . c~-Naphthy]amin . . . . . 1-Amino-2-naphthol-6-

su]fons~iure (Na-SMz) . . 1 -Amino-2-naphthol- 6,8 -

disulfonsiiure (Na-SMz) . 1-Amino-2-naphthol-3,6-

disulfonsi~ure (Na-SMz) . 1 - A m i n o - 2 - n a p h t h o l - 3 , 6 , 8 -

trisulfons~ure (Na-Sa]z) Naphthions~ure (Na-SMz) Sulfanilsaure (Na-SMz) . .

K Extinklbionskoeffizient stoffzahl in ml.

30

10

3O 3O

30

30

30

30 30 30

0,786 0,780

0,560

0,316 0,780

0,780

0,786

0,770

0,772 0,780 0,775

F s in in rnl ml

7,52 7,32 7,50 7,30

5,40 5,20

3,50 2,85 7,50 7,30

7,50 7,30

7,52 7,32

7,40 7,20

7,41 7,21 7,50 7,30 7,45 7,25

0 0

29

61 0

0

0

0

0 0 0

F ausgeschiedene Farbstoffmenge in ml; F a Farb-

Tabelle 6. Der Einflufi der Komponenten au/ die Peroxydase.

Hemmung Komponente der Farbstoffe mg in K in

50 ml Prozent

Blindversuch . . . . . . ~.-Naphthol . . . . . . . f l-Naphthol . . . . . . . 2 -Naphthol-6-sulfonsgure

(Na-SMz) . . . . . . . 2-Naphthol-6,8-disulfon-

sgure (Na-SMz) . . . . 2-Naphthol-3,6 -disulfon-

s~ure (Na-SMz) . . . . 2-Naphthol-3,6,8-trisulfon-

s/~ure (Na-SMz) . . . . 1,4 Aminon~phthol . . . Blindversueh . . . . . . Aeridin . . . . . . . . .

Azol~enzol: : : : : : : : PhthMs~ure . . . . . . .

K Extinktionskoeffizient stoffzahl in ml.

m

3O 30

30

3O

3O

0,821 0,820 0,815

0,815

0,815

0,820

30 0,820 30 0,821 - - 1,186

1 1,184 2 1,060 5 0,952

10 0,520 20 0,218 30 0,177 30 1,182 30 1,180

]F Fa in in ml ml

7,90 7,70 7,90 7,70 7,81 7,61

7,81 7,61

7,81 7,61

7,90 7,70

7,90 7,70 7,90 7,70

11,40 11,20 11,40 11,20 10,20 10,00

9,15 8,95 5,00 9,80 2,10 1,90 1,70 1,50

11,30 11,10 11,40 11,20

F ausgeschiedene

0 0

0

0

0

i 0

0 11 20 56 80 87

0 0

Farbstoffmenge in ml; Fa Farb-

358 W. DIE~IAm u. K. BoE~c~oy~: Kiinstliche Farbstoffe u. Fermentreaktionen.

%

~4xO

2~

Das Dimethyl-p-phenylendiamin wird daher wahrscheinlich oxydiert zum WvRsw]~uschen Rot. Dadurch t r i t t eine geringere l~fickbfldung des 2,6-Dichlorphenolindophenols aus dem Leukofarbstoff durch die Per. oxydasewasserstoffper oxydwirkung ein.

Welter ist aus Tab. 6 zu ersehen, dal~ das Acridin einen inhibieren- den EinfluB zeigt. Die prozentuale I-Iemmung ist in Abb. 4 festgehalten. Sie betr~gt bei 2 mg 11% und bei 10 mg 56~o.

f

k I

m 0, 10

I

i

2 '/ 6 8 2 ~ 8 g ~g 70 Forths/off f~zrbJoff

Abb. 3. Abb. 4.

Abb. 3. Kemmung 4er Peroxydase durch heterocyclisch~ Chinonfarbstoffe. 1 l~hodamin B, 2 ~hodulinorange ~O.

Abb. 4. Hemmung der Peroxydase durch Acridin.

Vergleicht man die Abb. 4 mit der Kurve yon Rhodulinorange NO in Abb. 3, so k~nn man feststellen, dab die beiden Kurven in ihrem Verlauf fast fibereinstimmen; Rhodulinorange NO ist ein Tetramethylacridin- chlorhydrat .

Alle anderen untersuchten Komponenten und Spaltstiicke zeigen in dieser Versuchsanordnung keinen hemmenden EinfluB.

Zusammenfassnng der Ergebnisse. Rhodulinorange NO, sein GrundkSrper, das Acridin und Rhodamin B

hemmen die peroxydat!sche Wirksamkeit des Kartoffelprel~s~ftes. Eben- so fiben die beiden Farbstoffe nach W. D I V , ~ u. H. H ~ v s s ~ einen hemmenden Einfiu• auf die Tributyrinspal tung mitte]s Pankreaslipase aus, w~hrend auch bier alle anderen Farbstoffe sich als unwirks~m er- wiesen haben. Rhodamin B hemmt ferner noch den diastatischen Abbau der Kartoffelst~rke. Ob sich diese Farbstoffe auch im Organismus un- gfinstig auswirken, ist noch nicht erwiesen. Auf jeden Fall w~re es auf Grund der experimentellen Ergebnisse ratsam, sie zun~chst als Lebens- mittelfarbstoffe zuriickzustellen, zumal sie bei den vorliegenden Unter- suchungen schon bei einer Konzentra t ion yon 40 rag/1 wirksam sind. Dies entspricht etwa der Farbstoffkonzentr~tion, die zur F~rbung yon Lebensmitte]n angewendet wird.

W. DEW~kLD U. ~-I. SCItlV[IDT: Bestimmung der Phosphate nebenein~nder. L 359

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Prof. Dr. Dr. W. DIE~r~II~, Frankfurt a. ~I., P~ul-Ehrlich-Stra~e 40.

Aus dem Anorganiseh-gnalytischen Forschungslaboratorium der Chemischen Werke Albert, Wiesbaden-]~iebrich.

Erg~tnzung zu der Arbeit:

Beitr~ige zur analytischen Bestimmung der verschiedenen Phosphate nebeneinander I. u zur u der Pyrophosphatbes t immung

naeh BRITSKE-DRAGUNOW,

Von W. DEWALD und H. SCHMIDT o

(Eingegangen am 8. JuIi 1953.)

I n der v o r g e n a n n t e n Arbei~ 1 wurde ein Vorschlag zur Verbesserung der Pyrophospha tbes~immung nach BaITSKE-DRAGUNOW 2 gemacht . Es wurde dort die Anwendung eines vom Ti t ra t ioasverbrauch abh/ingigen Korrek tur fak tors ( , ,Potent iometr ierfaktors") empfohlen, der entweder aus e inem Schaubfld abzulesen oder jeweils durch 2 T i t r a t ionen yon 0,1 n Salzsi~ure in An- u n d Abwesenhei t yon Zinksul fa t zu e rmi t te ln ist.

Die Methode ha t 2 SchSnheitsfehler: 1. Der Faktor , mi t dem der un t e r Verwendung des , ,Potent iometr ier-

faktors '~ korrigierte T i t ra t ionsverbrauch mul t ip l iz ier t werden so]lte, u m die vorliegende IVIenge NaaP207 zu erhalten, ist n icht der stSchiometrische.

2. Die Notwendigkei t , fiir jede T i t r a t ion e inen Kor rek tu r fak to r aus e inem Diag ramm abzulesen, bzw. sich ihn experimentel l zu ermit telu, bed ingt ffir ~ e i h e n a n a l y s e n e inen gewissen Zeitverlust .

Wi t ha l t en es deshalb ffir giinstiger, an Stel]e des var iab len , ,Potentio- metr ier faktors" u n d eines weiteren empirischen Fak tors e inen einzigen, al lerdings ebenfalls vom Ti t ra t ionsverbrauch abh~ingigen Fak to r ein- zuftihren, der in Tab. 2 (S. 360) angegeben ist.