Aus dem Universitatsinstitut fiir Lebensmittelchemie, Frankfurt am =-~ahl.

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. Ihr EinfluB auf die Pepsin- und Magensaftwirkung.

3. Mitteflung.

Von W. DIEMAIR und K. BOEKHOFF.

Mit 5 Textabbildungen.

(Eingegangen am 18. Mdrz 1953.)

In den vorausgegangenen Mitteilungen 1 wurde fiber die Einwirkung kfinstlicher Farbstoffe auf Pepsin, Lipase und Diastase beriehtet und gezeigt, dal~ kfinstliche Farbstoffe diese zu hemmen vermSgen. Es wurde gefunden, dal~ samtliche angewandten Farbstoffe die proteolytische Wirkung des Pepsins mehr oder weniger stark beeinflussen. Besonders auffallend ist die Hemmwirkung der Farbstoffe Orange GG und Ponceau 6R. Gegeniiber der Lipase erweisen sie sich alle, mit Ausnahme yon Rhodulinorange NO und Rhodamin B, als unwirksam, dagegen iiben sie einen auffallend untersehiedliehen Einflu2 gegeniiber Diastase aus. Die Hemmwirkung auf die Verfliissigung und Verzuekerung ist annahernd gleieh stark. Besonders wirksam sind hier iYigrosin, Erythrosin, Orange GG, Rhodamin B und Lichtgriin. Die iibrigen Farbstoffe beeinflussen den Diastaseabbau nur in ganz geringfiigigem Mal~e, beziehungsweise fiber- haupt nicht. In der vorliegenden Arbeit sollte der EinfluB der Farbstoffe auf Magensaft, Trypsin und auf die Oxydationsenzyme: Katalase und Peroxydase studiert werden; sie sollte auch der Aufk]~irung dienen, inwieweit bestimmte konstitutionelle Gruppen ffir die Hemmwirkung verantwortlich gemacht werden kSnnen.

Experimenteller Teil. Die in den nachfolgenden Tabellen aufgeffihrten Farbstoffe wurden in

die Untersuchungen einbezogen, also Farbstoffe, die als unbedenklich angesehen werden (Schweiz, Ostzone, Westdeut:schland).

1. Farbsto//e und eiwei[3spaltende Enzyme (Magensa/t).

Die Bestimmung der Aktivit~t erfolgte mit der yon W. DIEMAm und H. HXUSSER 1 angegebenen Methode, die etwas abge~ndert werden mul3te. Als Fermentl5sung diente 0,1 ml Magensaft. Diese trfibe, farblose Fliis- sigkeit wurde zur Entfernung yon Speiseresten nnd Sehleimpartikel- ehen durch ein grobes Ffltrierpapier bzw. Glaswolle filtriert. Nach

26 W. DIEMAIt~ und K. BOEKHOFF:

Zugabe y o n 1 - - 2 Thymolk r i s t a l l en bl ieb die E n z y m a k t i v i t ~ t be im Auf- bewahren im Ki ih l s ch rank fiber 3 - - 4 W o c h e n k o n s t a n t . F i i r die Ver- suche w u r d e n jewefls 3--41V[agenausheberungen gemischt , u m Ungle ich- m ~ i g k e i t e n im F e r m e n t g e h a l t auszuschal ten .

Tabelle 1. Azo[arb~to//e.

Lfd. 1 f t . Handelsnamen Wissenschaftliche Bezeiehnung

5

6

7

8

9 10

11

12

13 14

Bordeaux R bes. rein

Briltantschwarz bes. rein

Coehenillerot A bes. rein

Echtgelb extra bes. rein

Echtrot E bes. rein

Gelb 27175 bes. rein

I~aphtholrot S bes. rein

Orange GG conc. bes. rein

Orange SXX bes. rein Ponceau 6R bes. rein

Tartrazin XX bes. rein

Thiazinbraun R bes. rein

Buttergelb bes. rein Ceresorange bes. rein

1-Naphthylamin-2-naphthol-3,6- disuffonsaure (Na-Salz)

1-Naphthytamin-3,6~ (3,7)disulfon- s~ured-naphthylamin-2-naph~hol- 3,6-disuffons~ure (Na-Salz)

Naphthionsi~ure-2-naphthol-6,8- disulfons~ure (Na-Salz)

Aminoazobenzoldisuffons~ure mit nieht mehr als 3% Aminoazobenzol- monosulfons~ure (I~a-Salz)

1Naphthionsi~ure-2-nalohthol-6-sulfon- saure (Na-Salz)

Anilin-2-naphthylamin-3,6-disulfon- saure (Na-Salz)

Naphthions~ure-2-naphthol-3,6-di- sulfons~ure (Na-Salz)

Anilin-2-naphthol-6,8-disulfons~ure (Na-Salz)

Suffanilsaure-l-naphthol (Na- Salz) Naphthionsi~ure-2-nuphthol-3,6,8-tri-

sutfonsaure (Na-Salz) Sulfanils~ure-azo- 1 -p-suffophenyl- 5-

pyrazolon-3-carbons~ure (Na-Salz) Primulinsuffons~ure-resorcin-2-naph-

thylamin-5(8)-sulfons~ure (Na-Salz) Dimethylaminoazobenzol 1-Aminobenzol-resorcin

Tabelle 2. Heterocyclische Chinon-, Triphenylmethan/arbsto//e und Nigrosin.

Lfd. Nr. tIandelsnamen Wissenschaftliche Bezeichnung

Erythrosin bes. rein

Rhodamin B bes. rein

Rhodulinorange NO bes. rein

Liohtgriin SF gelblich bes. rein

Patentblau AE bes. rein

NigrosinLt~

Tetraj odphenoloxy-fluoron-o-earbon- saures I(alium oder Natrium

TetraAthyldiamino-o-earboxyphenyl- xanthenchlorid

Tetramethylaminoacridinchlorhydrat

Dii~thyldi-p-sulfobenzyl-p-amino- fuehsonimonium

Dii~thyidisulfobenzyl-o-sulfo- fuehsonimonium

Sulfurierte Nigrosinbasen

Kfinstliehe Farbstoffe und Fermentreakt ionen. 3. 27

Arbeitsgang. In eine Reihe yon 50 ml-ERLENMEYER-K61behen werden je 10 m[ einer klar filtrierten 1~/o igen AlbuminlSsung (Albumin ex ovo sicc., Merck) pipet t ier t , l0 min lang in kochendem Wasserbad erhitzt , wobei das EiweiB un te r Ausbildung einer bestgndigen Trfibung denatur ier t wird, and hierauf auf 50 ~ C abgekiihlt. Zu dieser LSsung ffigt man je K6lbehen 1 ml 0,5 n Salzs~iure (pa 2) hinzu, schfittelt um und versetzt mi t 0,1 ml des wie oben angegebenen pr~parier ten Nagensaftes. Nach abermaligem Schtit teln wird dann je 1 ml der FarbstofflSsungen verschiedener Konzent ra t ionen zugegeben. Nach nochmaligem Dtlrchsehfitteln l~Bt man die LSsung 30rain Iang bei 45~ im Bru t sehrank stehen, un terbr ieh t dana die Pepsin- einwirkung durch 5 rain langes Erhi tzen im kochenden Wasserbad. Die dureh die peptische Verdauung erreichte Aufhellung ist ein MaB ftir die s tat tgefundene proteolytische Spal tung und kann nephelometrisch ohne Schwierigkeit aus- gewertet werden.

Die angewendete Magensaftmenge wird so gewghlt, dab bei 45 ~ C innerhalb yon 30 min eine Aufhelinng der koagulierten EiweiB16sung ohne Farbstoffzusatz bis zur Opalescenz eintr i t t . Als Bezugsl6sung f/ir eine 100~oige t l e m m u n g dient eine naeh obigen Angaben hergestellte, gepufferte Eiweil316sung mi t Farbstoff und Magensaft (LSsung I), die ohne Aufbewahrung im Brutschrank sofort nach Zugabe der einzelnen Farbstoffl6sungen dureh 5 rain langes Erh i t zea auf dem Wasserbad inakt iv ier t wird. Zur Messung der noeh nach 30 min langem Stehenlassen (Brut- schrank) vorhandenen nnverdau ten EiweiBmenge wird eine L6sung (L6sung II) ohne Farbstoffzusatz ve rdau t und der Farbstoff kurz vor der Unterbrechung der Enzymwirkung zugesetzt. Dieser muB erfolgen, um einheit]iehe Megbedingungen zu haben. Der Versuch mug genau bei p a 2 durehgefi ihrt werden.

B e i d e r n e p h e l o m e t r i s e h e n M e s s u n g d i e n t e a ls V e r g l e i e h s l S s u n g e ine

w ~ g r i g e F a r b s t o f f l S s u n g g l e i e h e r K o n z e n t r a t i o n .

F i i r j e d e n F a r b s t o f f w u r d e d a s F i l t e r m i t d e r m a x i m a l e n E x t i n k t i o n

g e w a h l t .

F o l g e n d e F i l t e r w u r d e n v e r w e n d e t f t i r :

Bordeaux 1~ . . . . S 61 Ponceau 6R . . . . S 75 Bri l lantschwarz . . . S 75 T a r t r a z i n X X . . . S 75 Cochenillerot A . . . S 66 T h i a z i n b r a n n R . . . S 66 Echtgelb extra . . . S 72 Erythros in . . . . . S 75 E ch t r o t E . . . . . . S 72 Rhodamin B . . . . S 66 Gelb 27 175 . . . . . S 66 Rhodulinorange NO S 72 Naphtho l ro t S . . . . S 75 Liehtgriin SF gelbl. . S 75 Orange GG cone. . . $ 7 2 P a t e n t b l a u A E . . . $ 7 5 Orange SX X . . . . S 72 Nigrosin LR . . . . . S 53

D ie b e r e e h n e t e n W e r t e , i n P r o z e n t e n v o l t s ~ g n d i g e r H e m m u n g aus -

g e d r f i e k t , s i n d M i t t e l w e r t e a u s je 3 B e s t i m m u n g e n ( T a b . 3 u n d 4, A b b . i ,

2 u n d 3).

D ie F a r b s t o f f e Gelb 27175 u n d Thiazinbraun h e m m e n d ie P r o t e o l y s e

des P r o t e i n s e b e n s o s t a r k wie d i e j e n i g e des M a g e n s a f t e s . W g h r e n d Mle

F a r b s t o f f e die l ~ { a g e n s a f t w i r k u n g h e m m e n , r u t d a s d a s Rhodulinorange NO n i e h t . B e s o n d e r s s t a r k i s t d ie W i r k u n g be i d e n A z o f a r b s t o f f e n

Orange GG, Brillantsehwarz, 2Vaphtholrot S u n d Poneeau 6R, die s e h o n be i

e i n e r K o n z e n t r a t i o n y o n 8 0 - - 1 0 0 mg/1 h e m m e n d w i r k e n . Bordeaux R, Cochenillerot A, EchtgeIb extra, Gelb 27175, Orange SX X u u d Tartrazin X X

28 W . I)IEMAIR u n d K . BOEKIIOFF:

Tabel le 3. Hemmung des Pepsins im Magensa]t durch Azo/arbsto]]e.

bei einer Farbstoffmenge yon Lfd. Farbstoff ]~r. 3 mg 5 mg 8 mg 10 mg

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12

B o r d e a u x 1% Br i l l an t schwarz Cocheni l lerot A Ech tge lb e x t r a E c h t r o t E Gelb 27 175 N a p h t h o l r o t S Orange G G conc. Orange S X X P o n c e a u 6 l~ T a r t r a z i n X X T h i a z i n b r a u n R

1)rozentuale Hemmun

0,5rag 0,8rag l ing

0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 3 4 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0

4 15 15 40

9 40 5 25 1 16

10 22 10 43 20 42

5 16 4 35 3 16 0 0

51 85 65 68 24 32 89 78 45 70 50

6

75 100

50 85 43 51

100 100

78 100

79 13

besitzen einen hemmenden Einflui3 bei einer Konzentrat ion yon 250 mg/1, was einer zehnfachen Menge des bei normaler F/~rbung zugesetzten Farb- stoffs (25--50 mg nach G o ~ ) wirken erst ab 500--600 rag/1. Diese Ergebnisse stimmen im wesentlichen mit denj enigen yon W. I)IEMAII~ und H. I-IXussEI~ 1 fiber die Wirkung der kfinstli- ehenFarbstoffe aufdasproteoly- tische Ferment Pepsin (Merck) fiberein. Bei einigen Farbstoffen wie Orange SXX, Tartrazin XX , Higrosin, Eehtrot E und Licht- gri~n SF ist eine etwas gcringere Hemmung der enzymatischen Wirkung des Magcnsaftes gegen- fiber reiner PcpsinlSsung zu be- obachten. Bei der Anwendung yon 10 mg Farbstoff in der ange- wandtcnVersuchsanordnung be- tr~gt der Unterschied der Hem- mung ungefi~hr 20%. Wahr-

entspricht. Die restlichen Farbstoffc

i

I i ,

0 / 2 3 ~ 5 6 7 8 .9 long FarDslofF

Abb.1. JIemmung des Pepsins im 3Zagensaft dutch Azofarbstoffe. 1 Bordeaux ~ ; 2 Brfllantschwarz; 3 Coehenillerot A; 4 Echtgelb extra; 5 Echtrot E ;

6 Gelb 27175.

scheinlich sind die noch im Magensaft vorhandenen Sehleimstoffe hierfiir verantwortlieh zu machen, die als Schutzkolloide wirken. Damit hi~ngt auch zusammen, da$ Rhodulinorange NO die enzymatische Wirkung des Magensaftcs nicht hemmt, w/khrend es bei dcr Farbstoffmenge yon 10 mg einen hemmenden Einflul3 yon 17 % auf die Pepsinwirkung verursacht. AuffMlend ist, dab basische Farbstoffe eine geringe Hemmung zeigen,

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreakt ionen. 3. 29

Tabelle 4. Hemmung des Pepsins im Magensa/t durch heterocyclische Chinon-, Triphenylmethan]arbstoMe und Nigrosin.

Lfd. ] f i r .

Farbstoff

Erythros in Rhodamin B Rhodulinorange NO Lichtgrtin SF Pa ten tb lau AE Nigrosin Lt~

Prozentuale Hemmung einer Farbstoffmenge yon

0,5 mg 0,8 mg 1 mg 3 mg 5 mg 8 lllg 10 mg

L 0 0 0 0 2 12 22 0 0 0 0 5 17 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 29 38 0 0 0 0 2 5 20 0 0 0 0 9 19 30

w/~hrend saute F a r b s t o f f e d u r c h w e g d ie p r o t e o l y t i s c h e W i r k u n g de s

~ a g e n s a f t e s u n d des P e p s i n s s t /~rker h e m m e n .

2. Der Ein/lufl der methylierten Farbsto//e au/ Pepsin (1V[erck).

U m n u n f e s t z u s t e l l e n , w e l c h e G r u p p e n o d e r K o m p o n e n t e n d e r F a r b -

s tof fe d ie H e m m u n g d e r P e p s i n w i r k u n g v e r u r s a c h e n k S n n t e n , w u r d e n

e in ige A z o f a r b s t o f f e e i n g e h e n d e r u n t e r s u c h t . D ie h e t e r o c y c l i s c h e n

7OO

% I 90

80

70

40

30

20

70

0

I

E

y 2 3 ~ s G Y 8 9 70 mg 0 7 2 3 +; 5 G 7 8 ForDstoff t~rDstoff

Abb. 2. Abb. 3. Abb. 2. Hemmung des Pepsins im 1Vfagensaft durch Azofarbstoffe. 7 Naphtholrot S; 8 Orange SXX;

9 Orange GG; 10 Ponceau 6]~; 11 Tartrazin XX; 12 Thiazinbraun R. Abb. 3. Hemmung des Pepsins im ~:agensaft durch heterocyclische Chinon-, Triphenylmethan- farbstoffe und ~igrosin. 1 Erythrosin; 2 l~hodamin B; g Lichtgrl/n SF gelbL; 5 Patentblau AE;

6 Nigrosin LI~.

C h i n o n - u n d T r i p h e n y l m e t h a n f a r b s t o f f e w e r d e n zun /~chs t n i c h t be r f i ck -

s i c h t i g t , d e a n i h r e W i r k u n g i s t ve rh /~ l tn i sm/ iB ig ge r ing .

D a die A z o f a r b s t o f f e alle, aul~er Gelb 27175, Thiazinbraun u n d Echtgelb m i t N a p h t h o l s u l f o n s i ~ u r e o d e r wie Orange S X X m i t g - N a p h t h o l a ls

K u p p e l u n g s k o m p o n e n t e h e r g e s t e l l t w e r d e n , ] i eg t d ie F r a g e b i e r s e h r

I I !

i !

~rr~9

30 W DI]~AI~, und K. BOE~HOFF:

nahe, ob nicht eine der beiden Substituenten, die phenolische Hydroxyl- oder d ie Sulfogruppe, diese Hemmung bewirkt. Zun~chst wurde die Wirkung der t tydroxylgruppe n~her untersucht. Aus diesem Grunde wurde der Einflul~ yon ~- und fl-lq~phthol auf Pepsin (Merck) verfolgt. Sie kamen in 1% iger w~Briger LSsung zur Anwendung. HShere Konzen- t rat ionen w~ren wegen der sehlechten WasserlSslichkeit nicht mSglieh. Bei dieser Versuchsanordnung kann als LSsungsmittel nur Wasser ver- wendet werden, da schon geringe Mengen yon verdfinntem Alkohol eine so starke Trfibung hervorrufen, da~ beim Blindversueh ungenaue Mel~- werte erhalten werden. Andere organische LSsungmittel, wie Aeeton, ~ the r und Benzol, erwiesen sich ebenfa]ls als ungeeignet. Die Versuchsan- ordnung war die gleiche wie oben angegeben. Als Ferment diente 0,5 ml 1 ~/o ige PepsinlSsung (Pepsin-Merck). Die iNaphthole wurden bis zu 2 nag in der angewandten Versuehsanordnung einwirken gelassen. Die Ergeb- nisse zeigten, dal~ beide 1Naphthole bis zu 2 mg keine Hemmung nach 30 min hervorrufen. Zur weiteren Untersuchung des Einflusses der Hydroxylgruppe wurden zwei Farbstoffe Orange GG und Orange S X X mit ~therischer Diazomethan]Ssung methyliert 1,

Um die Gew~hr zu haben, da{~ eine etwa nach der Methylierung beob- achtete ~nderung in der Hemmung nut auf die Methylierung des pheno- lischen I~xdroxyls und nicht etwa auf e~ne dureh die ~ehandlung mit Alkohol und Ather eingetretene Ver~nderung in der Farbstoffzusammen- setzung zuriiekgeht, wurden beide Farbstoffe auch noch mit den gleichen L5sungsmitteln wie bei der Methy]ierung aber ohne DiazomethanlSsung behandelt. Die dabei aus der klaren L6sung gewonnenen Farbstoffe wurden in einem Parallelversuch neben den methylierten Farbstoffen auf ihre hemmende Wirkung untersucht.

Die berechneten Werte, in Prozenten ausgedriickt, sind in Tab. 5 fest- gehalten.

Tabe]le 5. Hemmung des Pepsins dutch die methylierten Earbsto/]e Orange GG und Orange 2XX.

Farbstoff

P~rallelversuch (nur mit LSsungsmittel behandelt) . . . . Orange GG methyliert . . . . . . . . . . . . . . . . Orange GG (unbehandelt) . . . . . . . . . . . . . . Parallelversuch (nur mit LSsungsmittel behandelt) . . . Orange SXX methyliert . . . . . . . . . . . . . . . Orange SXX (unbehandelt) . . . . . . . . . . . . . .

Prozentuale Hemmung bei einer ~Farbstoffmenge

VOl~ lO mg 5 mg

42 ]00 40 97 47 100 33 90 29 83 37 100

Die Tab, 5 zeigt, da~ die Versuche mit Orange GG keine groSen Unter- schiede in der Hemmung ergeben haben. Der Einflul~ des methylierten

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. 3. 3i

Farbstoffes, des mit L6sungsmitteln behandelten, sowie des unbehandel- ten Farbstoffes auf den proteolytischen Abbau ist fast gleich grog. Die geringen Abweiehungen der Werte liegen in der Fehlergrenze der Methode.

Da ~- und fl-Naphthol bis zu 2 mg in der angewandten Versuchs- anordnung die Pepsinwirkung nicht hemmen und die Methylierung der beiden Azofarbstoffe Orange GG und Orange S X X keine nennenswerte Verminderung der Hemmung erbrachte, kann angenommen werden, dab das phenolische Hydroxyl der Azofarbstoffe die Hemmung des Eiwei6- abbaues nicht verursacht.

3. Der Ein/lufl der Farbsto//komponenten an/Pepsin (Merck) und Magensa/t.

Die Tab. 3 und 4 zeigen deutlich, dab die basisehen Farbstoffe eine geringe Hemmung bewirken, wghrend die sauren Azofarbstoffe durchweg den enzymatischen Eiweigabbau des Pepsins (Merck) und des Magen- saftes stgrker hemmen. So liegt der Gedanke sehr nahe, dag vielleicht die Sulfogruppen diese Hemmung verursachen k6nnten, zumM das pheno- lische Hydroxyl sich auf Grund der Untersuchung mit g- und •-NaphthoI und der Methylierung als unwirksam erwiesen hat.

Es wurden daher verschiedene Naphtholsulfonsguren (Na-Salz) und Komponenten, wie Sulfanilsgure (Na-SMz), Naphthionsgure (Na-Salz), Anflin und l~esorcin, die die Az6farbstoffe in ihrem Aufbau enthalten, auf ihre hemmende Wirkung auf den Eiweigabbau untersucht. Es konnten nicht alle Komponenten untersucht werden, da sie zum Tell wasserunlSs- lich sind.

Die Substanzen kamen in wgBriger L6sung verschiedener Konzen- t rat ionen zur Anwendung. Als Ferment diente 0,5 ml 1% ige PepsinlSsung (Pepsin-Merck). Der pg-Wert wurde wieder nach jedem Versuch gemessen.

Die angegebenen Werte sind Mittelwerte yon 3 Best immungen nnd in Tab. 6 und Abb. 4 festgehalten.

Tabelle 6. Hemmung des Pepsins (ME~e~) durch Farbsto//komponenten.

r P r o z e n t u a l e t t e m m u n bei e iner ~Ienge yon Farbstoffkomponente I

0,5 mg 5 mg

Suffanilsgure: p-Aminobertzolsulfon- sgure (Na-Salz) . . . . . . . . .

Naphthionsgure: 1,4-Naphthyl- aminsulfonsgure (Na-Salz) . . . .

2-Naphthol-6-sulfonsi~ure (Na-Salz) . R-Si~ure: 2 Naphthol-3,6-disulfon-

saure (Na-Salz) . . . . . . . . G-S/~ure: 2-Naphthol-6,8-disulfon-

s~ure (Na-Salz) . . . . . . . . , A~filin . . . . . . . . . . . . . . Resorcin . . . . . . . . . . . . . i

1 m g 3 mg

0

0 0 0 2

2 6

3 8 0 0 0 0

0 0

4 8 10 21

23 37

20 35 0 0 0 0

8 mg 10 m g

0 0

14 17 32 40

97 100

95 100 0 0 0 0

32 W . DIEMAIR u n d K . BOEKI-IOFF:

% 9o

8o

7o

40

.70

20

lO

0

Die Versuchsergebnisse zeigen, dag Ani l in u n d Resore in ke inen h e m m e n d e n Einf lug ausi iben. DaB das Resore in n ieh t Ms I n h i b i t o r wirkt , is t eine wei tere S t i i tze fiir die Annahme , d a b die phenol i sehen H y d r o x y l - g r u p p e n n ieh t s tSrend au f den p ro t eo ly t i s ehen A b b a u wirken. Die Sulf- ani ls~ure h e m m t ebenfal ls nieht , w/~hrend die Naphthionsi~ure ab 3 mg

wi rk t (Abb. 4). Die Naph tho l -

J

//I / 2 3 4- 5 6 7 8 9 78mg

FarbstoFfkomponen~e Abb. 4. ttemmung des Pepsins (M~ROK) dutch ]Farb- stoffkom!0onenten. 1 Na!Dhtions~ure (Na- 8alz); 2 2-1gaphthol-6-sulfons~ure (Na-Sa]z); 3 ]R,-S~ure

(Na-Salz); 4 G-S~ure (Na-Salz).

sulfons~iuren ru fen eine Hem- mung hervor (Abb.4). Den stKrk- s ten Einf lug zeigen die R- S~iure (2 -Naph tho l -3 ,6 -d i su l fonsaures N a t r i u m ) u n d die G-S~ure (2- Naphthol -6 ,8-d isu l fonsauresNa- t r ium) , die sehon ab 0,5 mg h e m m e n u n d be i 10 mg in der a n g e w a n d t e n Ver suehsano rd - hung eine 100%ige H e m m u n g aufweisen. Die 2 - N a p h t h o l - 6 - sulfons~iure is t in K o n z e n t r a t i o n yon 1 mg wi rksam u n d h e m m t bei 10 mg deut l ich (40%).

U m zu pri i fen, ob die pro teo- ly t i sche W i r k u n g des Magen- saftes dureh d i e s e K o m p o n e n t e n in gle ichem MaBe g e h e m m t wird , wurde ihr h e m m e n d e r EinfiuB

auch au f das Peps in des Magensa f t e s un t e r suc h t (Tab. 7, Abb. 5). W i e die Tab. 7 zeigt, h e m m e n auch hier Anilin, Resorcin u n d die

Sul/anilsi~ure die p ro teo ly t i sche W i r k u n g des Magensaf tes nicht. 2-Naph- thol-6-sullonsaures Natrium a n d besonders die 2gaphthionsi~ure h e m m e n ganz geringfi igig, w~thrend die R-Siiure u n d G-Si~ure eine st~irkere

Tabelle 7. Hemmung des Pepsins

Farbstoffkomponente

Sulfanilsgure: p-Aminobenzolsulfon- s~ure (Na-Salz) . . . . . . . .

Naphthions~ure: 1,4-Naphthyl- i

aminsulfonsaure (Na-Salz) . . . . I 2-Naphthol-6-sulfonsaure (Na-Salz) . R-S~ure: 2-Naphthol-3,6-disulfon-

saure (Na-Salz) . . . . . . . . G-S~ure: 2-Naphthol-6,8-disulfon- i

s~ure (Na-Salz) . . . . . . . . Anilin . . . . . . . . . . . . . ] l~esorein . . . . . . . . . . . . . i

im Magensa/t dutch Earbsto//komponenten. Prozentuale Hemmun bei einer 1Kenge yon

0,5 mg 1 mg 8 mg 5 mg 8 mg 10 mg

0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 4 10

0 3 8 0 0 0 0 0 0

0 0 0

0 0 5 2 10 1 8

20 70 98

18 60 95 0 0 0 0 0 0

Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. 3. 33

Wirkung hervorrufen (Abb. 5). Letztere bewirken bei Anwendung yon 10 mg eine Hemmung yon 95--98O/o .

Beim Vergleich derWerte (Abb. 4 und Abb. 5) ist festzustellen, dab der Kurvenverlauf der gleiche ist. Auffallend ist nur, dab die vier Stoffe eine etwas geringere Hemmung auf den lVfagensaft (Abb. 5) als auf Pepsin

Abb. 5. t Iemmung des Pepsins ira l~Iagen- sal t du tch Farbstoffkomponenten.

1 Naphthions~ure (~a-Salz); 2 2 -~aph- thoI-6-sulfons~ure (h~a-Salz); 3 ~-S~ure

(Na-Salz); 4 G-S~ure (Na-Salz).

(Merck) (Abb. 4) ausiiben; Un- t erschicde, wie sic auch bei den 1oo Farbstoffen beim Eiweil3abbau % durch Magensaft und Pepsin

8O (~erck) beobachtet wurden. Wahrseheinlieh wird dies ver- zo ursacht durch die noch im 31Ia- gensaft vorhandenen Schleim- ~Go sl)offe, die eine gewisse schutz- _~ so kolloide Wirkung ausfiben. ~4o

3O

20

10

I 7 2 3 ,~ 5" G 7 8 ,9 lOm.g

t-#r/>sfoff2omponen/e

Zusammenfassung der Ergebnisse. Die angewendeten kiinstlichen Lebensmittelfarbstoffe vermSgen die

proteolytische Wirkung des Magensaftes mehr oder weniger stark zu hemmen. Besonders auffallend ist, was fiir eine Mitwirknng funktioneller Gruppen spricht, dab die basischen Farbstoffe eine geringe Hemmung bewirken, w/~hrend die sauren Azofarbstoffe durchweg stiirker hemmen.

Die Itydroxylgruppe der Azofarbstoffe scheint diese Hemmung nicht zu verursaehen; denn eine Methylierung brachte keine nennenswerte Verminderung der Hemmung, weiterhin erwiesen sich ~-, fl-Naphthol sowie Resorcin nicht als Inhibitoren.

Das naphthylaminsulfonsaure Natrium (Naphthionsgure) hemmt ge- ringfiigig. Den stgrksten~Einflul~ besitzen die 2-Naphtholsul/onsi~ureu (Abb. 4, 5). Hier sind a ~ wirksamsten die R-S5ure und G-Si~ure (Na- Salz), dann folgt das 2-Naphthol-6-sul/onsaure Natrium. Ob die GrSBe der Hemmung der lqaphthoisulfons~turen yon der Zahl der Sulfogruppen abhi~ngig ist, ist fraglich. Die l%-S~nre und G-S~ure mit 2 Sulfogruppen zeigen zwar eine st~rkere hemmende Wirkung als die 2-iNaphthol-6- sulfons~ure mit einer Sulfogruppe. Offenbar scheinen aber auch andere Einflfisse mitzusprechen, denn bei der Untersuchung der Farbstoffe wurde keine Korrelation zwischen der Gr5Be der I-Iemmwirkung und der Zahl der Sulfogruppen beobachtet. Es scheint, als ob eine Aminogruppe

Z. anal. Chem., Bd .189 . 3

34 DIEMAm U. BOEKHOFF: Kiinstliche Farbstoffe und Fermentreaktionen. 3.

die Wirkul~g der Sulfogrffppe abschwi~che, denn die Sulfanilsiiure und Naphthions/~ure zeigen fiberhaupt keine oder nur eine geringfiigige Hemmung. Die angefiihrten Ergebnisse sprechen fiir die Annahme, dal~ die hemmenden Farbstoffe eine Bindung mit Eiweig eingehen, wodurch die Wirkungsspezifitgt des Enzyms gestSrt wird. Cm WUNDE~Lu 3 ver- t r i t t neuerdings die Ansicht, dab eine Eiweigfarbstoffbindung besser durch kolloidchemische Uberlegungen gekl~rt werden kSnnte als dutch strukturehemische.

Die beobachtete hemmende Wirkung kSnnte auf eine Beeinflussung des Substrates zurfickgeffihrt werden. Nach A. TILESIUS und H. HE~SCHEN 4 ist das Pepsin eine homogene Proteinkomponente, die mit einer negativen Ladung, also anodisch, wandert. Das Pepsinanion verbindet sich mit dem Eiweigkation, entsprechend der positiven Ladung von EiweigkSrpern im sauren Medium. Bei Zugabe einer Azofarbstoffl5sung ergeben sich somit folgende reagierende Xomponenten: das Proteaseanion, das S/~ureanion der Farbstoffe (oder der Naphtholsulfons/~uren) und das Eiweigkation. Es stellt sich ein Gleichgewicht ein, das bei iiberwiegender Konzentrat ion der Farbstoffe (oder der Naphtho]sulfons~uren) zu Ungnnsten der Magen- protease ausfallen mug, die das Eiweigkation nicht mehr angreifen kann. Die Hemmung der Pepsineinwirkung durch die Azofarbstoffe kSnnte als eine B]oekierung. des EiweiBkations durch das S~ureanion der Farbstoffe gedeutet werden.

Aus den vorliegenden Befunden kann der Schlug gezogen werden, dag die hemmenden Farbstoffe mit 80--100 rag/1 (doppelte Menge des bei norma]er FKrbung zugesetzten Farbstoffes) sich aueh bei den Ver- dauungsvorg/s im Magen ungfinstig auswirken kSnnten. Dies sind die Farbstoffe: Orange GG, Brillantschwarz, Naphtholrot S und Ponceau 6 R.

Die anderen angewendeten Farbstoffe sind erst bei hSheren Xonzen- trationen (300--500 rag/l) wirksam, die wohl bei norma]er Lebensmittel- fi~rbung kaum in Frage kommen.

Literatur. 1 DIEM~m, W., u. H. HXUSER: Z. Unters. Lebensmittel 92, 165, 403 (1951). - -

2WE~N~n, E.A.: J. chem. Soc. (London) 115, 1098 (1919); ARNDT, F., u. J. .~ENDE: ~lgew. Chem. 43, 444 (1930). - -8 WVN1)ERLY, CH.: Experientia (Basel) 7, 296 (1951); 8, 199 (1952). - - 4 TISELIVS, R., u. H. HE~SC~E~: Biochemic. J. 1988, 1814.

Prof. Dr. Dr. W. DIE,AIR, Frankfurt a. M., Panl-Ehrlich-Str. 40.