L’analyse quantitative de lipides par

HPTLC, est-elle possible?

L’example des monoacylglycerides en EMAG-biodiesel

J. Vela1,2, L. Membrado1, M.P. Lapieza1, V.L. Cebolla1

1 Instituto de Carboquímica, CSIC; 2 Universidad de Zaragoza, Spain

20 Anniversaire Club CCM, Montpellier 2018

Tolerance maximale aux MG: 0.7 wt% (UNE EN14214:2013)

Les impuretés lipidiques (MG, DG, TG, acides gras..) affectent la performance du biodiesel EMAG dans les moteurs

Introduction

quelles informations quantitatives pouvons-nous obtenir en séparant les

mélanges de lipides en classes, et à partir des spectres de masse?

carburant renouvelable composé d’esters methyliques des acides gras, substituttotal ou partiel du diésel.

MG peuvent produire obstruction dans les filtres à carburant

Example des MG en biodiesel EMAG

EMAG < 98% conditions de réaction inappropriées

Qualité EMAG

Transesterification catalytique avec un alcool

Nature des lipides source (huiles végétales, graisses animales, etc.)

ATS4

Application

EMAG

AMDChromatogram

UV

Densitometrie

Fluorophore post-

impregnation

Fluorescence

(FDIC)

densitometrie

HPTLC-MS

Identification

espéces

HRMS

ESI-MS, MS2, MS3

Normalization

Semi-quantification

d’espèces

Quantification MG

comme classe:

-avec un étalon externe

-avec addition d’etalon

Primuline

Choix d’étalon

Séparation des MG

Détection des

MG insaturésDétection des

MG insaturés + saturés

Caractérisation des Monoacylglycerides (MG) des biodiesel type EMAG

Étalon: 1-oleoyl-rac-glycerol

Profil ESI-MS des ions

PL en bacteriasSéparation et détection des MG d’un biodiesel EMAG

+ polar - polar FDIC, 365/>400 nm

PRIMULINE

200 mg·L-1 en MeOH

MG

FA

DG

TG

ME

STANDARD

EMAG diéseldiesel

EMAG-diesel 50%Diesel pur

➢ Pas de traitement d’échantillon, pur EMAG

Impurités

lipidiques

EMAG

md (mm)

Steryl

glucoside

Esterified

Steryl

glucoside

1-Oleoyl-rac-glycerol

Stearic acid

Palmitic acid

Oleic acid

Linoleic acid Gly

ce

ryl

1,3

-dis

tea

rate

Cholesteryl Oleate

Methyl Oleate

Gly

ce

ryl T

riste

ara

te

Ch

ole

ste

rol

Steryl

glucoside

Esterified

Steryl

glucoside

1-Oleoyl-

rac-glycerol

Linoleic

acid

Oleic

acid

Cholesterol Methyl

Oleate

Cholesteryl

Oleate

ZONE 1

Steryl Glucoside

ZONE 2

Esterified

Steryl GlucosideZONE 3

Monoglycerides

ZONE 4

Fatty acids

UV (190nm)FDIC-365nm

100% Tert-Butyl Methyl Ether

80% Tert-Butyl Methyl Ether + 20%MeOH

90% Tert-Butyl Methyl Ether + 10%MeOH

60% Tert-Butyl Methyl Ether + 40%C7

50% Tert-Butyl Methyl Ether + 50%C7

1-stearoyl-rac-glycerol

??

?? ?

Détection UV versus FDIC

J. Chromatogr. A 2011, 1218, 2668-2675

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

0

0

50

100

150

57

911

13

15

17

19

21

23

25

0

50

100

150

200

250

300

57

911

1315

17

19

21

23

25

Étalonnage Externe de MG: UV and FDIC-primuline

UV 190 nm FDIC-Primuline

Bandes: 4 mm

19 tracks

Standard: 1-Oleoyl-rac-Glycerol,

0,978 mg · mL-1 (en MeOH)Y, m

m

De

ve

lop

pe

me

ntso

lva

nt

Échantillon: pure EMAG

36

912

1518

Bla

nk

run

(Me

OH

) (1

µL

)

0.2

μL

sta

nd

ard

0.5

µL

sta

nd

ard

1,0

µL

sta

nd

ard

1.5

μL

sta

nd

ard

2.0

µL

sta

nd

ard

1 µ

L E

MA

G

AMD 3-étapes

36

912

1518

3 6 9 12 15 18

X, mm

MG

MG

20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

20

40

60

80

100

0

Étalonnage par addition standard of MG: UV et FDIC-primuline

Bandes: 4 mm

19 tracks

Standard: 1-Oleoyl-rac-Glycerol,

0,978 mg · mL-1 (en MeOH)

Y, m

m

So

lve

ntD

eve

lop

me

nt

Échantillon: pur EMAG

36

912

1518

Bla

nk

run

(Me

OH

) (1

µL

)

0.3

µL

std

0.6

µL

std

0.9

μL

std

1.2

µL

std

36

912

1518

3 6 9 12 15 18

X, mm

0

50

100

150

57

911

13

15

17

19

21

23

25

0

50

100

150

200

250

300

57

911

1315

17

19

21

23

25

27

29

UV 190 nm AMD 3 étapes FDIC-Primuline

1 µ

L E

MA

G

1 µ

L E

MA

G

1 µ

L E

MA

G

+ +

1 µ

L E

MA

G+

1 µ

L E

MA

G+

1 µ

L E

MA

G

1.5

µL

std

Overspotting

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Are

a co

un

ts

Mass of O-RAC (µg)

FDIC-Primuline, 365 nmUltraviolet, 190 nm

Incertitude ±tS (95%)

Pente 856,5 29,6 94,3

O. Origine 38,8 35,6 113,2

Coef. Regr. 0,9982

Conc (µg · µL-1) Incertitude

Valeur 778,0 0,86 0,04

Incertitude ±tS (95%)

Pente 2730 70,4 224,1

O. Origine -40,1 84,6 269,2

Coef. Regr. 0,9990038

Conc (µg · µL-1) Incertitude

Valeur 3360,7 1,25 0,03

(n=3)

Étalonnage externe

FDIC-Primuline, 365 nm

UV, 190 nm

RSD% écart-type relatif; et incertitude comme (σn-1 / n)1/2

UV190

(n=5)

RSD% 6.9 (EMAG)

RSD% 8.2 (étalon)

FDIC 365/>400 nm

(n=5)

RSD% 5.2 (EMAG)

RSD% 7.3 (étalon)

Étalonnage par addition standard

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2

Are

a co

un

ts

Added mass of standard (µg)

FDIC-Primuline, 365 nmUltraviolet, 190 nm

Incertitude ±tS (95%)

Pente 928,8 61,1 169,5

O. Origine 742,8 54,2 150,6

Coef. corrl 0,9914

Conc (µg · µL-1) Incertitude

Valeur 0,80 0,11

Incertitude ±tS (95%)

Pente 1733 37,2 103,3

O. Origine 2032 33,0 91,7

Coef. corrl 0,9990

Conc (µg · µL-1) Incertitude

Valeur 1,17 0,04

(n=3)

FDIC-Primuline, 365 nm UV, 190 nm

√ Nous pouvons choisir un étalon répresentatif à partir de l’identification MS

√ Des résultats cohérents entre les deux méthodes d’étalonnage pourchaque technique de détection

Quantification en moyenne de la classe MG d’un EMAG par densitometrie

√ UV: dosage des MG insaturés. FDIC: dosage des MG saturés + insaturés(hypothèse vraisemblable)

External standard

UV 0.86 ± 0.04

FDIC 1.25 ± 0.03

Standard addition

UV 0.80 ± 0.11

FDIC 1.17 ± 0.04

(µg · µL-1)

Maximum MG tolerance en EMAG: 0.7 wt% (UNE EN14214:2013).Cette EMAG a 0.1 wt% in MG. Méthode de control.

√ On obtient des pourcentages quantitatives en moyenne, car ils dépendentde l’etalon

ESI(+)-MS

MS/MS

MS3

Profil des MG en EMAG par ESI(+)-MS, e identification par MS/MS et MS3 (ion-trap)

375.3

377.3

378.3

379.3

381.3

383.3 391.3

393.3

394.3

395.3

396.3399.3 401.3 407.3

409.3

411.3 413.3 421.3423.3

425.3

+MS, 0.6-1.2min #(32-63)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

6x10

Intens.

375 380 385 390 395 400 405 410 415 420 425 m/z

[C21H38O4+Na]+

C18:2

[C21H40O4+Na]+

C18:1

[C21H42O4+Na]+

C18:0 [C21H38O5+Na]+

C18:2 oxidé

[C21H40O5+Na]+

C18:1 oxidé[C23H46O4+Na]+

C20:0[C23H44O4+Na]+

C20:1 oxidé

i) les efficacités d'ionisation sont similaires pour les espècesmoléculaires appartenant à une classe donnée de lipides*, par example,les MG;

ii) En HPTLC, le solvant-gradient de développement est évaporé avant la détection;

iii) le solvant d'élution de l’interface (MeOH) a une composition constante et, de cette manière, des efficacités d'ionisation similaires sont obtenues pour les lipides individuels d'une classe.

Les spectres ESI (+)-MS présentent des profils représentatifs

d'espèces moléculaires individuelles MG dans un EMAG

* Han X. Lipidomics: Comprehensive mass spectrometry of lipids. Wiley & Sons, Inc.

New Jersey, 2016

Normalization des ions de la clase MG et analyse semiquantitative

des espèces moléculaires par densitometrie

m/z

377.3

379.3

381.3

393.3

395.3

409.3

425.3

[C21H38O4+Na]+

[C21H40O4+Na]+

[C21H42O4+Na]+

[C21H38O5+Na]+

[C21H40O5+Na]+

[C23H46O4+Na]+

[C23H44O4+Na]+

C18:2

C18:1

C18:0

C18:2 oxidé

C18:1 oxidé

C20:0

C20:1 oxidé

%

16

35

8

10

15

7

9

C (µg µL-1)

0.19

0.43

0.10

0.12

0.18

0.01

0.11

Utile pour distinguer le biodiesel de différentes origines (animale, végétale) ou issu de différents traitements

√

Une caractérisation analytique profonde des monoacyglicerides (MG) dans EMAG biodiesel par HPTLC-densitométrie-Tandem MS estpossible

1) une determination quantitative moyenne de monoacylglycerides comme

classe de lipides, par densitometrie UV (MG insaturés) ou fluorescence-

induite (MG saturés+ insaturés).

Conclusions

2) une identification structurelle directe, rapide and relevante des espèces

moléculaires individuelles par ESI(+)-MS/MS (trap d’ions)

3) obtention d’un profil réprésentatif des MG par ESI(+)-MS.

4) normalization des ions ESI-MS pour obténir la composition

semiquantitative des espèces moléculaires individuelles à partir des

pourcentages MG préalablement obtenus par densitometrie.

Merci de votre attention