Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultt fr Chemie und Pharmazie

der Ludwig-Maximilians-Universitt Mnchen

MADER: Biochemische Eigenschaften und Regulation

eines humanen Transkriptionskorepressors

von

Daniel Kramer

aus Deggendorf

2000

Erklrung

Diese Dissertation wurde im Sinn von 13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung

vom 29. Januar 1998 von Prof. Dr. Judith Johnson betreut.

Ehrenwrtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbstndig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.

Mnchen, am 19. 07. 2000

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(Daniel Kramer)

Disseration eingereicht am 19. 07. 2000

1. Gutachter: Prof. Dr. Judith Johnson

2. Gutachter: Prof. Dr. Horst Domdey

Mndliche Prfung am 28. 11. 2000

Herzlichen Dank,

Frau Prof. Dr. Judith Johnson fr die Mglichkeit dieses interessante und heraus-

fordernde Thema am Institut fr Immunologie bearbeiten zu drfen. Whrend

der letzten vier Jahre lernte ich insbesondere ihre Fachkenntnis, Professionali-

tt und stete Diskussionsbereitschaft zu schtzen. Besondere Anerkennung

verdient ihre Toleranz, die stets fr eine lockere und entspannte Arbeitsatmo-

sphre sorgte.

Herrn Prof. Dr. Horst Domdey fr seine Hilfsbereitschaft, die wertvollen Hin-

weise und die bernahme der Vertretung dieser Arbeit vor der Fakultt fr

Chemie und Pharmazie

allen Mitarbeitern des J.J. Labors, insbesondere Edith, Andrea, Anja und Rdi-

ger, mit deren Humor und Kollegialitt so manche Niederlage im Labor

leichter zu verdauen war.

Frau Ina Contag, die sich stets bemhte Ordnung in das Chaos zu bringen und

damit einen aussichtslosen Kampf gegen den zweiten Hauptsatz der Thermo-

dynamik fhrte.

meiner Freundin Michaela, die auch in unserer Freizeit niemals mde wurde mit

mir erschpfende Diskussionen ber MADER zu fhren. Ein besonderer

Dank gebhrt ihr fr das geduldige Korrekturlesen dieser Arbeit.

vorallem meinen Eltern fr die fortwhrende Untersttzung und Motivation wh-

rend des Studiums und der Promotion.

Abkrzungen

A AmpereAA AminosureAPS AmmoniumperoxodisulfatATCC American Type Culture CollectionATP Adenosintriphosphatbp Basenpaar(e)BSA Bovines SerumalbuminCD Konservierte DomnecDNS Zur mRNS komplementre DesoxyribonukleinsureCi Curie (1Ci = 3,7 x 1010 Zerflle pro Minute)cpm Radioaktive Zerflle pro MinuteDa Dalton (atomare Masseneinheit = 1,660 x 10-24 g)dATP Desoxy-AdenosintriphosphatdCTP Desoxy-CytosintriphosphatDEPC DiethylpyrocarbonatdGTP Desoxy-GuanosintriphosphatDMSO DimethylsulfoxidDNase DesoxyribonukleaseDNS DesoxyribonukleinsuredNTP Desoxy-RibonukleotidtriphosphatDTT DithiothreitoldTTP Desoxy-ThymidintriphosphatE.coli Escherichia coliEDTA EthylendiamintetraacetatELISA Enzyme linked immunosorbant assayFACS Fluorescence activated cell sortingFCS Ftales KlberserumFITC Fluoresceinisothiocyanatg Erdfeldbeschleunigung (g = 9,81 m/s2)G-Phase Gap-PhaseGAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenaseh StundenHEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethansulfonsurekb Klobase(n)kDa KilodaltonLB Luria-BertoniM Molar (mol/l)mAb Monoklonaler Antikrpermg Milligramm

g Mikrogrammmin Minutenl Mikroliterml MilliliterMOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsureMrel relative elektrophoretische BeweglichkeitmRNS Boten-Ribonukleinsureng NanogrammNLS Kernlokalisations-Signalnmol NanomolNonidet nichtionisches DetergenzOD Optische DichtePAGE PolyacrylamidgelelektrophoresePBS Phosphatgepufferte SalzlsungPCR PolymerasekettenreaktionPMSF PhenylmethylsulfonylfluoridRNase RibonukleaseRNS RibonukleinsureRT Reverse Transkriptases SekundenS-Phase Synthese-PhaseSDS SodiumdodecylsulfatSSC Natriumchlorid-Natriumcitrat-PufferSV40 Simian Virus 40TBE Tris-Borsure-EDTA-PufferTE Tris-EDTA-PufferTEMED N,N,N,N-TetramethylethylendiaminTRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanU Unit (enzymatische Einheit)UV Ultraviolettes LichtV Volt

Nukleotide:

A AdeninC CytosinG GuaninT ThyminN A, C, G oder T

Aminosuren:

A Ala AlaninC Cys CysteinD Asp AsparaginsureE Glu GlutaminsureF Phe PhenylalaninG Gly GlycinH His HistidinI Ile IsoleucinK Lys LysinL Leu LeucinM Met MethioninN Asn AsparaginP Pro ProlinQ Glu GlutaminR Arg ArgininS Ser SerinT Thr ThreoninV Val ValinW Trp TryptophanY Tyr Tyrosin

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung...........................................................................................1

2 Einleitung..........................................................................................................4

3 Material............................................................................................................12

3.1 Chemikalien .......................................................................................................123.2 Verbrauchsmaterial.............................................................................................153.3 Gerte ................................................................................................................153.4 Radiochemikalien ...............................................................................................173.5 Grenstandards ................................................................................................173.6 Kommerzielle Analysesysteme und vorgefertigte Lsungen ................................173.7 Biologisches Material .........................................................................................18

3.7.1 Zelllinien....................................................................................................183.7.2 Polyklonale Seren und Antikrperkonjugate...............................................193.7.3 Monoklonale Antikrper............................................................................193.7.4 Enzyme .....................................................................................................203.7.5 Bakterien...................................................................................................203.7.6 Plasmide ....................................................................................................213.7.7 Stabile Transfektanten ...............................................................................223.7.8 Nukleinsuren............................................................................................223.7.9 Oligonucleotide .........................................................................................22

3.8 Medien, Puffer, Lsungen ..................................................................................233.8.1 Grundstoffe fr Kulturmedien....................................................................233.8.2 Kulturmedien fr Bakterien........................................................................233.8.3 Zellkulturmedien........................................................................................243.8.4 Allgemeine Puffer und Lsungen ...............................................................24

4 Methoden ........................................................................................................25

4.1 Zellkultur ...........................................................................................................254.1.1 Einfrieren und Auftauen.............................................................................254.1.2 Transfektion von Eukaryontenzellen ..........................................................264.1.3 PMA Stimulation von adhrenten Zellen ....................................................274.1.4 Hemmung der Transkription mit Actinomycin D ........................................284.1.5 Hemmung des Proteasoms mit Lactacystin.................................................29

4.2 Molekularbiologische Methoden.........................................................................304.2.1 Verwendung von Bakterien .......................................................................30

4.2.1.1 Vermehrung von E. coli ....................................................................304.2.1.1.1 Plattenkultur ............................................................................304.2.1.1.2 Flssigkultur ............................................................................304.2.1.1.3 Glycerinkultur ..........................................................................30

4.2.1.2 Herstellung kompetenter Bakterien ...................................................30

Inhaltsverzeichnis II

4.2.1.3 Transformation kompetenter Bakterien .............................................314.2.2 Prparation und Analyse von DNS.............................................................32

4.2.2.1 Isolierung von Plasmid DNS .............................................................324.2.2.2 Messung der Nukleinsure Konzentration .........................................334.2.2.3 Verdau der DNS mit Restriktionsendonukleasen ...............................344.2.2.4 Elektrophoretische Auftrennung von DNS ........................................344.2.2.5 Isolation von DNS aus Agarosegelen ................................................354.2.2.6 Southern Blot ...................................................................................36

4.2.3 Prparation und Analyse von RNS.............................................................374.2.3.1 Isolierung von Gesamt RNS..............................................................37

4.2.3.1.1 Isolierung mit Phenol-Chloroform ............................................374.2.3.1.2 Isolierung durch Ionenaustausch-Chromatografie .....................38

4.2.3.2 Denaturierende RNS Gelelektrophorese ..................